JP4198735B2

JP4198735B2 - パピローマウイルス腫瘍および感染を治療するための医薬組成物

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Publication number: JP4198735B2
Application number: JP2007092639A
Authority: JP
Inventors: ジャン‐マルク、バルー; ナディーヌ、ビズアルヌ; マリー‐ポール、キニー
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Priority date: 1996-07-30
Filing date: 2007-03-30
Publication date: 2008-12-17
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Description

発明の詳細な説明

本発明の主題は、パピローマウイルスと関連する病変の治療または予防を意図した医薬組成物、一層具体的にはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６、１８、３１、３３および４５と関連する病変の処置または予防を意図した医薬組成物にある。
パピローマウイルスはタンパク質キヤプシドにより取り囲まれた塩基対約７９００の環状ゲノムを有するＤＮＡウイルスである。多数のウシ（ＢＰＶ）およびヒト（ＨＰＶ）パピローマウイルスタイプが同定され、かつこれらのゲノム配列が決定されている［Pfister, 1987, The papovaviridae: The Papillomaviruses (Salzmanおよび Howley 著）Plenum Press, New York, 1-38頁］。このものは初期領域と後期領域を含んでいる。後期領域は、このキヤプシドの主成分をコードする二つの読み枠（reading frame ）Ｌ1 およびＬ2 を含む。初期領域は少なくとも読み枠Ｅ1 、Ｅ2 、Ｅ4 、Ｅ5 、Ｅ6 およびＥ7 を含む。Ｅ１およびＥ2 発現産物はウイルス複製およびウイルス遺伝子の発現を制御するが、一方Ｅ5 、Ｅ6 およびＥ7 領域のものは感染細胞の発がん性形質転換の諸工程に関与する。事実、ＢＰＶ−１Ｅ5 タンパクは in vitro で細胞を形質転換できることが実験的に見い出されている（Schlegelら、1986, Science 233, 464-467）。ＢＰＶ−１Ｅ6 およびＨＰＶ−１６Ｅ7 タンパク質は発がん性形質転換の誘発および保存に関係する。Ｅ7 の形質転換力はＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８の場合について実証されている（Kanda ら、1988, J. Virol. 62, 610-613; Vousden ら、1988, Oncogene Res. 3, 1-9; Bedellら、1987, J. Virol. 61, 3635-3640 ）。Ｅ4 の場合にはなんらの機能も実証されていない。

ヒトの場合、ＨＰＶは皮膚いぼへの良性感染から悪性腫瘍までの範囲の病変と関連がある。これらのウイルスは生殖器管、口腔管および呼吸器管表面の外層に対して高度な特異性を示す。疫学データによると、ある種の株特にＨＰＶ−１６および−１８が低級の病状の、またＨＰＶ−３１、−３３および−４５がより少ない程度で子宮頚部がんにおいて演ずる役割を強く暗示している。世界的にみて子宮頚部がんは女性がん中２位を占める。ＷＨＯによれば毎年４６０，０００件に及ぶ新規ケースが記録され、このうち少なくとも２００，０００ケースは明らかにＨＰＶと関連がある。一連の研究は、これらのウイルスの形質転換における役割、新生物形成細胞ゲノムへのこれらの特異的組み込み、がん細胞中におけるこれらの遺伝子活性および、ＨＰＶ−ポジテイブ新生物形成細胞の悪性表現型保存におけるＥ6 およびＥ7 初期遺伝子の発現の重要性を実証している（Monsenego, J. Impact Medecin, March 11, 1994）。

ＨＰＶウイルスと関係する病的状態は、これらが永続性で再発性であるという理由で治療的問題を引き起こしている。これら疾病の処置には手術、化学療法、抗ウイルス剤および免疫療法等、既に多くのアプローチが採用されている。

この観点で欧州特許ＥＰ第 0,462,187号公報は、細胞性ＤＮＡ中へのＨＰＶゲノムの組み込みに由来する腫瘍に対する免疫を確立するための、パピローマウイルス初期遺伝子を用いるワクチン接種アプローチを記載しており、ここではキヤプシドタンパク質はもはや発現されない。出願ＷＯ第 93/02184 号公報は、免疫原性剤としてのキヤプシド抗原の使用に基ずく処置的アプローチを教示している。これらの文献では、ＨＰＶにより引き起こされる重い病的状態のすべてに適する組成物を生じさせるために、初期ポリペプチドにより提供される予防効果とパピローマウイルスの後期ポリペプチドにより授けられる治療効果とを併合することの可能性については暗示がない。その上、過去数年間Ｔ細胞活性化の目的で免疫刺激活性を有するポリペプチドの使用が提案され、目標とする病的状態の大小に応じて有益な結果を生じている（例えばＷＯ 96/11279 号公報参照）。

さらに詳しくは本発明は、感染細胞に対する持続的免疫確立を目的にした製剤であって、パピローマウイルスの初期および後期領域からの抗原の混合物、またはこれらを同時に発現するベクターに基ずく製剤に関する。本発明の枠組み以内で提供される候補的ワクチンはウイルス感染の隣接組織への進行または伝播を制限する予防目的（免疫予防）、または感染患者の腫瘍進行を防止または軽減する治療目的（免疫治療）のために使用できる。このキヤプシド抗原を使用するとウイルス粒子表面に位置する抗原エピトープに対する抗体の生産が誘発されて、感染が長期間持続するのを妨げる。この初期タンパク質の使用により、ウイルスＤＮＡの組み込み後に感染した細胞に対する免疫性を誘発させることが可能になる。
また本発明は、パピローマウイルスからのポリペプチドと免疫刺激分子との組み合わせによる製剤を提供する。かかる組成物の利点の一つは、ウイルス抗原により誘発される特異的免疫性と、特異的応答を強化するように設計された免疫刺激分子により誘発される特異的免疫性とが併合されることにある。

本発明の目的は、従来技術の組成物に較べて改良された効能を有し、ＨＰＶ感染および一層具体的には子宮頚部がん等の特に一層重大な病変の治療を可能にする医薬組成物の公の提供にある。

したがって本発明の主題は、パピローマウイルス感染または腫瘍の治療または予防を意図した医薬組成物にあり、この組成物は治療剤として：
（１）パピローマウイルスの初期領域からの少なくとも一種のポリペプチドおよびパピローマウイルスの後期領域からの少なくとも一種のポリペプチド、
（２）パピローマウイルスの初期領域からの少なくとも一種のポリペプチド、パピローマウイルスの後期領域からの少なくとも一種のポリペプチドおよび免疫刺激活性を有する少なくとも一種のポリペプチド、または
（３）パピローマウイルスの初期または後期領域からの少なくとも一種のポリペプチドおよび免疫刺激活性を有する少なくとも一種のポリペプチド
を含有する。

一般的にポリペプチドなる用語は、未変性（native）ポリペプチドの全てまたは一部、起源を異にする配列の融合に起因するキメラポリペプチド、またはアミノ酸の少なくとも一つの突然変異（欠失、挿入および／または置換）により特徴ずけされる変異体を指す。一層具体的には、本発明の枠組み以内で用いるポリペプチドは、特に、未変性タンパクの配列と較べた際の相似度（degree of similarity）が７５％より大きい、有利には８５％より大きい、好ましくは９５％より大きいアミノ酸配列を有する。この相似度は、適当なコンピユータプログラムを用いて、またはホモロジーの最高度合いが得られるように配列を整列させ、位置全数に関して２つの配列のアミノ酸が同一であると認められる位置数を数え上げることにより容易に計算できる。ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８ゲノムの配列はそれぞれ受託番号（accession number）Ｋ０２７１８およびＸ０５０１５としてGenebankに開示されている。

パピローマウイルス系列（family）のウイルスゲノム特にＢＰＶおよびＨＰＶのゲノムは、ウイルスキヤプシドを含む２つの後期ポリペプチドＬ1 およびＬ2 、ならびにウイルスゲノムの調節と保存および感染細胞の形質転換に関与する６つの初期ポリペプチド（Ｅ1 、Ｅ2 、Ｅ4 、Ｅ5 、Ｅ6 およびＥ7 ）の少なくとも８つのポリペプチドをコードする。

パピローマウイルスの初期タンパク質はいずれも本発明の枠組み以内で使用できるが、Ｅ6 タンパク質から誘導される（もしくは由来する）ポリペプチド、Ｅ7 タンパク質から誘導されるポリペプチドまたはＥ6 とＥ7 タンパク質から誘導されるポリペプチドから選択して使用するするのが好都合である。感染細胞の形質転換プロセスに関与する領域のレベルで突然変異した非発がん性変異体を使用するのが有利であろう。かかる変異体については文献に記載がある（Mungerら、1989, EMBO J. 8, 4099-4105; Crook ら、1991, Cell 67, 547-556; Heckら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4442-4446; Phelpsら、1992, J. Virol. 66, 2418-2427 ）。

パピローマウイルスの後期領域からの好ましいポリペプチドはＬ1 タンパク質、Ｌ2 タンパク質、またはＬ1 とＬ2 タンパク質から誘導される。

特に有利な実施態様（２）および（３）によれば、本発明の組成物はまた、免疫刺激活性を有するポリペプチドを含む。”免疫刺激”とは、パピローマウイルス抗原に対する抗体の生産を増幅するようにＢリンパ球を活性化して体液性免疫応答を刺激する能力、または腫瘍細胞もしくはパピローマウイルス感染細胞に対する有意細胞毒性応答を引き起こすようにＴリンパ球を活性化することにより細胞媒介免疫応答を刺激する能力を意味する。一つの指針として、この免疫刺激性は動物モデルで評価できる（免疫刺激剤の存在および不在下、ターゲット抗原発現腫瘍を移植した動物の拒絶レベルの比較による）。一層一般的は、免疫刺激を実証するための方法が Roitt（Immunology, 4th edition, Moby Ltd ）により示されている。

哺乳動物特にヒト中に見い出されるような未変性免疫刺激分子、その一部、各種起源の配列の融合から得られるキメラ分子または突然変異体の使用も可能であるが、免疫刺激機能が保存されることが前提である。想定できるすべての分子のなかでも、インターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１２ならびに共付着（co-adhesion ）分子Ｂ７．１およびＢ７．２からなる、またはこれらから誘導されるポリペプチドの使用が好ましいが、本発明の枠組以内ではインターロイキン−２および上記分子Ｂ７．１が特に好ましい。

本発明の好ましい組成物は：
（１）パピローマウイルスの、Ｅ6 領域からのポリペプチド、Ｅ7 領域からのポリペプチド、Ｌ1 領域からのポリペプチドおよびＬ2 領域からのポリペプチド、
（２）パピローマウイルスのＥ6 領域からのポリペプチド、Ｅ7 領域からのポチペプチド、およびインターロイキン−２から誘導されるポリペプチド、
（３）パピローマウイルスのＥ6 領域からのポリペプチド、Ｅ7 領域からのポチペプチド、および上記分子Ｂ７．１から誘導されるポリペプチド、
（４）パピローマウイルスのＥ6 領域からのポリペプチド、Ｅ7 領域からのポチペプチド、上記分子Ｂ７．１から誘導されるポリペプチド、およびインターロイキン−２から誘導されるポリペプチド、
（５）パピローマウイルスの、Ｅ6 領域からのポリペプチド、Ｅ7 領域からのポチペプチド、Ｌ1 領域からのポリペプチド、Ｌ2 領域からのポリペプチド、およびインターロイキン−２から誘導されるポリペプチド、
（６）パピローマウイルスのＥ6 領域からのポリペプチド、Ｅ7 領域からのポチペプチド、Ｌ1 領域からのポリペプチド、Ｌ2 領域からのポリペプチド、および上記分子Ｂ７．１から誘導されるポリペプチド、または
（７）パピローマウイルスのＥ6 領域からのポリペプチド、Ｅ7 領域からのポチペプチド、Ｌ1 領域からのポリペプチド、Ｌ2 領域からのポリペプチド、上記分子Ｂ７．１から誘導されるポリペプチド、およびインターロイキン−２から誘導されるポリペプチド
を含んでいる。

いくつかのＨＰＶタイプによる子宮頚部がんでの感染の上記発生を考慮して、本発明の組成物はＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３および／またはＨＰＶ−４５タイプの危険なパピローマウイルスからのポリペプチド、および特にＨＰＶ−１６ウイルスからのポリペプチドを含む。当然ながら、この組成物が各種パピローマウイルス抗原を含有している場合には、これらは共通または異なった起源のものである。

一般には、パピローマウイルスからのポリペプチドまたは免疫刺激活性を有するポリペプチドは、化学合成による公知方法、または別法として組み換えＤＮＡ技術（例えば、Maniatisらの、1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Sprng Harbor, NY 参照）により生産できる。一層具体的に一つの調製法は、問題ポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを用いて形質転換した細胞を培養して生産性細胞を生じさせる行為、および上記ポリペプチドを培養物から収集する行為を含む。考慮されるＤＮＡフラグメントがそのゲノム中に組み込まれるか、または複製し得る適当な発現ベクター中に組み込まれるかのいずれかである限りは、この生産性細胞の起源は問わず、また制限はなく、バクテリア、酵母または別法として哺乳動物細胞のものであってもよい。当然ながらＤＮＡフラグメントは、転写および翻訳シグナルの統制下に置いて生産性細胞におけるその発現を可能にさせる。発現ベクターおよび制御シグナルは当業者に公知である。

また本発明はパピローマウイルス感染または腫瘍の治療もしくは予防を意図した医薬組成物にも関し、この組成物は治療剤として次の：
（１）パピローマウイルスの初期領域からの少なくとも１種のポリペプチドおよびパピローマウイルスの後期領域からの少なくとも１種のポリペプチド、
（２）パピローマウイルスの初期領域からの少なくとも１種のポリペプチド、パピローマウイルスの後期領域からの少なくとも１種のポリペプチド、および免疫刺激活性を有する少なくとも１種のポリペプチド、または
（３）パピローマウイルスの初期または後期領域からの少なくとも１種のポリペプチド、および免疫刺激活性を有する少なくとも１種のポリペプチド；
をコードするＤＮＡフラグメントが挿入される１種または２種以上の組み換えベクターを含有し、上記ＤＮＡフラグメントは宿主細胞または生物体中でのそれら発現に要する諸要素の支配下に置かれる。

実際上好ましい別法によれば、上記治療剤はベクターであって、その中にパピローマウイルスからのポリペプチドまたは上記定義の免疫刺激剤をコードするＤＮＡフラグメントが挿入される。このタイプの組成物は安価に生産でき、多様な環境条件下で高度に安定である利点がある。特に、保管条件には制約が少ない。

パピローマウイルスからのポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントは、クローニング、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）または化学合成により、患者もしくはコレクションから得られるパピローマウイルス陽性の細胞から出発する、通常使用される公知技術により得られる。

免疫刺激活性を示すポリペプチドをコードする遺伝子は標準技術に従って細胞（ゲノムタイプ）のゲノムから、またはそれが発現される細胞のメッセンジャーＲＮＡ（相補的ＤＮＡタイプ）から単離することもできる。その上、問題の遺伝子は、（ｉ）細胞内、もしくは外部媒体中のいずれかに分泌される可溶性分子、または（ｉｉ）膜に固定された分子、したがってそれを発現する細胞の表面に存在する分子をコードすることができる。

本発明の枠組み以内での好ましい組み換えベクターはウイルスベクターであって、そのゲノム中に上記ＤＮＡフラグメントが、宿主細胞もしくは生物体中でのそれらのトランスフアーおよび発現を可能にするように挿入されている。本発明の枠組み以内で使用できるウイルスベクターは、特にポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルス関連ウイルスから誘導できる。弱毒化病原性を有する非組込み性ベクターも有利である。かかるベクターならびにそれらの調製技術は当業者にとり公知である。

アデノウイルスベクターを使用する場合、複製に必須の領域の欠失、特に宿主生物または環境中でその増殖を回避し得るように大部分のＥ1 領域の欠失のために非複製性であるようなベクターの使用が好ましい。いうまでもなく、アデノウイルスゲノムの他の領域は、欠陥必須機能がトランス補足（trans-complemented）される限りにおいて修飾もしくは欠失されてもよい。本発明における好ましいアデノウイルスベクターはエンカプシデーションに必須の配列、すなわち５’および３’ＩＴＲ（逆方向末端反復）（Inverted Terminal Repeat）およびエンカプシデーション領域を保持している。各種アデノウイルスベクターならびにそれらの調製技術は公知であり、かつ Graham および Prevect (1991, Methods in Molecular Biology, vol 7, 109-128頁；Ed: E.J. Murey, The Human Press Inc.）中に、および出願ＷＯ第 94/28152 号公報中に記載がある。もしレトロウイルスが用いられても、ＬＴＲ（Long Terminal Repeat）およびエンカプシデーション配列は保持されるはずである（例えば、Naviaux および Vermaら、1992, Current Opinion in Biotechnology 3, 540-547 参照）。

有利な実施態様によると、本発明の組換えウイルスベクターはポックスウイルス、特にカナリアポックスウイルス、鶏痘（もしくは禽痘）ウイルス、またはワクシニアウイルス等のトリポックスウイルスから誘導され、後者が好ましい。本発明の枠組以内で想定し得るすべてのワクシニアウイルスの中では、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｗｙｅｔｈおよび修飾Ａｎｋａｒａ（修飾ワクシニア症アンカラウイルス）（Modified Vaccinia Ankara Virus の略ＭＶＡ）株が特に好ましく選択される。

異型遺伝子を発現し得るワクシニアウイルスを得るための一般的条件は、ＥＰ特許第83 286号公報およびＥＰ出願第 206 920号中に教示されている。ＭＶＡウイルスについては、一層具体的には（Mayrら、1975, Infection 3, 6-14; Sutter および Moss ら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851）中に記載がある。

当然ながら本発明の枠組み以内では、上記ＤＮＡフラグメントはそれら発現に要する諸要素の統率下に置かれる。これらの中には、翻訳の開始および終結のためのシグナルはもとより、転写制御のための適当な諸要素が包含される。プロモーターは特に重要である。

一般的には、処置（treat ）が望まれ、かつ使用ベクターに適した宿主生物もしくは細胞中で機能するプロモーターが使用される。その上、このものは調節配列例えば転写活性化用要素、またはある種細胞性シグナルに応答する配列を含むように修飾できる。この観点で、パピローマウイルスが関与する病変は生殖器管のレベルに位置するので組織特異性プロモーターの使用、または腫瘍細胞のみに発現を限定するための腫瘍特異性シグナルに応答するプロモーター（例えば、このものは腫瘍細胞により一般的に過剰発現される成長因子の存在下で活性化される）の使用が有利である。

本発明の枠組み以内で想定されるプロモーターのなかでは、ＳＶ４０（Simian Virus 40 ）プロモーター、ＨＭＧ（Hydroxy-Methyl-Glutaryl-coenzyme A）プロモーター、ＴＫ（Thymidine Kinase）プロモーター、ＣＭＶ（cytomegalovirus ）プロモーター、ＲＳＶ（Rous Sarcoma Virus）プロモーター、アデノウイルスベクターに適するアデノウイルスＭＬＰ（Major Late Promoter）プロモーター、およびレトロウイルスベクターに対して一層特異的なＭｏ−ＭＬＶ（Moloney Murine Leukemia Virus)ＬＴＲプロモーターが挙げられる。このベクターがポックスウイルス由来である場合のプロモーターは、使用ポックスウイルスの遺伝子のプロモーター例えばワクシニアウイルスのタンパク質７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ、ＴＫもしくはＫ１Ｌをコードする遺伝子のプロモーターが好ましい。これらは文献に記載があり、かつ通常技術によりウイルスゲノムからクローン化できる。

その上、発現に要する上記諸要素も、宿主細胞中での発現性や保存性を増強する配列［イントロン、シグナル配列、転写終結配列、翻訳開始部位、宿主免疫系の細胞にポリペプチドの提示（プレゼンテーション）を修飾する配列その他］を含んでいてもよい。しかし、ポックスウイルス由来のベクターの場合は、イントロンの使用は避ける。

本発明組成物は、所定ポリペプチドをそれぞれが発現する各種組み換えベクター、または独立もしくは共通諸要素の統制下に置かれた選択ポリペプチドに対応するＤＮＡフラグメントを発現する単一ベクターのいずれかを用いて得ることができる。後者オプションによれば、内部的に翻訳を開始させ得る配列（IRES）または同位相で異なった遺伝子の融合を開始し得る配列を使用できる。

本発明で使用する組み換えベクターを得るための一般的条件は、当分野の文献中に広く記載されている。ポックスウイルスベクターに関しては、欧州特許ＥＰ第83 286号公報を挙げることができ、その内容をここに引用によって含める。これらの条件はベクターとして許容し得る他のウイルスにも適用でき、このものは非必須ゲノム領域を有しており、この中に上記発現ユニットを組み込める。当然ながら、これらは同一遺伝子座または異なった遺伝子座中に挿入できる。例えば、ワクシニアウイルスのＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株を使用する場合、挿入に好ましい部位はＴＫ遺伝子座および／またはＫ１Ｌ遺伝子座である。ウイルスＴＫ遺伝子のレベルでの挿入は、それを不活性化する効果があり、したがって組み換え体の選択を容易にする効果がある。ワクシニアウイルスのＭＶＡ株と関連させた場合、免疫刺激およびパピローマウイルス遺伝子の挿入は切除帯域ＩからＶＩまでの１つの範囲内、好ましくは切除帯域ＩＩまたはＩＩＩ（Meyer ら、1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038;Sutter ら、1994、Vaccine 12,1032-1040）のいずれか以内で実施できる。

本発明で追求する諸目的によれば、組み換えベクター中には、組み換えウイルスの単離および精製のための諸工程を容易にするための選択可能マーカー遺伝子の発現用ユニットを追加的に含ませることもできる。これらとしては特に、抗生物質Ｇ418 に対する抵抗性を授けるネオ遺伝子（Neo gene）、ピユーロマイシンに対する抵抗性のための pac 遺伝子、ガンシクロバー（ganciclovir ）もしくはアサイクロバー（acyclovir ）等の、ある種ヌクレオシド類似体に対して感受性を授ける単純ヘルペスウイルスタイプ１（ＨＳＶ−１）ＴＫ遺伝子、β−ガラクトシダーゼをコードするバクテリア遺伝子ＬａｃＺ、およびβ−グルクロニダーゼをコードするｇｕｓＡが挙げられる。後の方の２つの酵素マーカーは、基質Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）およびＸｇｌｃＡ（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−グルコロニド）それぞれの存在下で染色することにより、組み換えウイルスの選び出しを可能にする。

パピローマウイルス感染または腫瘍の処置もしくは予防するための、本発明医薬組成物は、ワクシニアウイルスのＣｏｐｅｎｈａｇｅｎまたはＭＶＡ株から誘導された１種または２種以上の組み換えベクターを含み、この中に次の：
（１）パピローマウイルスのＥ6 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、パピローマウイルスのＥ7 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、および分子Ｂ７．１をコードするＤＮＡフラグメント、
（２）パピローマウイルスのＥ6 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、パピローマウイルスのＥ7 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、およびインターロイキン−２をコードするＤＮＡフラグメント、
（３）パピローマウイルスのＥ6 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、パピローマウイルスのＥ7 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、分子Ｂ７．１をコードするＤＮＡフラグメント、およびインターロイキン−２をコードするＤＮＡフラグメント、
（４）パピローマウイルスのＥ6 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、パピローマウイルスのＥ7 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、パピローマウイルスのＬ1 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、およびパピローマウイルスのＬ2 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、
（５）パピローマウイルスのＥ6 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、パピローマウイルスのＥ7 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、パピローマウイルスのＬ1 タンパク質をコードするＤＮＡフラグンメント、パピローマウイルスのＬ2 タンパク質をコードするＤＮＡフラグンメント、および分子Ｂ７．１をコードするＤＮＡフラグメント、
（６）パピローマウイルスのＥ6 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、パピローマウイルスのＥ7 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、パピローマウイルスのＬ1 タンパク質をコードするＤＮＡフラグンメント、パピローマウイルスのＬ2 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、およびインターロイキン−２をコードするＤＮＡフラグメント、または
（７）パピローマウイルスのＥ6 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、パピローマウイルスのＥ7 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、パピローマウイルスのＬ1 タンパク質をコードするＤＮＡフラグンメント、パピローマウイルスのＬ2 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、分子Ｂ７．１をコードするＤＮＡフラグメント、およびインターロイキン−２をコードするＤＮＡフラグメント、
が挿入される。

一方で、一層具体的に免疫予防を意図する本発明医薬組成物は、ワクシニアウイルスのＣｏｐｅｎｈａｇｅｎまたはＭＶＡ株から誘導された１種または２種以上の組み換えベクターを含み、この中に次の；
（１）パピローマウイルスのＬ1 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、パピローマウイルスのＬ2 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、および分子Ｂ７．１をコードするＤＮＡフラグメント、
（２）パピローマウイルスのＬ1 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、パピローマウイルスのＬ2 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、およびインターロイキン−２をコードするＤＮＡフラグメント、または
（３）パピローマウイルスのＬ1 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、パピローマウイルスのＬ2 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、インターロイキン−２をコードするＤＮＡフラグメント、および分子Ｂ７．１をコードするＤＮＡフラグメント、
が挿入される。

本発明組成物は、ワクチン分野で公知の方法に従って調製でき、かつ用量は広い範囲以内で変更可能である。特にこれらは、用いたポリペプチドおよびウイルス、処置されるべき病変状態、患者の状態および臨床医が評価し得る他のパラメータに依存性がある。しかし一般的には、この治療剤がウイルスベクターである場合、キロ当りのウイルス用量は１０^４から１０^１１、有利には１０^６から１０^１０、および好ましくは１０^７から１０^９プラーク形成ユニット（ｐｆｕ）であり、この治療剤がポリペプチド由来であれば０．０５から５００ｍｇ、有利には０．５から２００ｍｇ、好ましくは１から１００ｍｇである。

本発明組成物は通常投与ルートのいずれによっても投与でき、特に静脈内、筋肉内、皮下または上皮下ルート、または別法として乱切法によっても投与できる。接近可能な腫瘍の場合、その部位中または腫瘍近辺への直接注射の使用も可能であり、または局所的適用を採用することもできる。本発明組成物はワクチンとして、１回投与量または一定時間を隔てた１回もしくは数回の繰り返し投与量として等、この分野で通常の実践法に従って投与することができる。一方、治療的処置という状況下では、有効な処置に十分である期間に亙って頻繁に投与することもできる。この処置剤がウイルスベクターである場合には、このウイルスは生の形態（live form ）であることが好ましい。ポックスウイルスベクターの場合、チミジンキナーゼネガテイブＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株またはＭＶＡ株等の弱毒化株の使用が好ましい。最後に、組み換えウイルスベクターは当業者にとり公知の適当な化学処理により弱毒化できる。しかし、殺死組み換えベクターの注射も想定できる。

好ましい実施態様の１例によると、本発明医薬組成物は組み換えベクターの治療有効量を、薬剤的に許容できる担体と組み合わせで含んでいる。この担体は、ヒトまたは動物中への注射によりその投与が可能になるように選択される。またこの組成物中には、賦形剤、希釈剤および／またはアジュバントを含有してもよく、液状または凍結乾燥形態で供給することもできる。

また本発明は、子宮頚部がんの治療または予防、低等級の頚部形成異常（もしくは異形成）の処置または予防、およびパピローマウイルス感染の処置および予防の場合の医薬物としての、医薬組成物にも関する。

最後に本発明はまた、上記病変状態の治療および予防の方法にも関し、これによれば本発明に用いるポリペプチドの混合物または組み換えベクターの医薬的有効量を、かかる処置を必要とする個体に投与する。

以下、図面を参照しながら本発明を説明する。
図１は、プロモーターｐ７．５Ｋの統制下に置かれたＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアのＴＫ遺伝子座、ＨＰＶ−１６後期遺伝子Ｌ1 およびＬ2 のＴＫ遺伝子座へのトランスフアーを可能にするベクターｐＴＧ５０２１を示す略図であり、この２つのカセットは互いに関し反対配向をなしている。

図２は、プロモーターｐＨ５Ｒ（この２つのカセットは互いに関し反対配向をなしている）の統制下に置かれたＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアのＫ１Ｌ遺伝子座、ＨＰＶ−１６初期遺伝子Ｅ6 およびＥ7 のＫ１Ｌ遺伝子座、プロモーターｐ７．５ｋのコントロール下に置かれたヒトＩＬ−2 （ＩＬ２ｈ）遺伝子のＫ１Ｌ遺伝子座、およびプロモーターｐＫ１Ｌの統制下に置かれたマーカー遺伝子ＬａｃＺ（ｂｔａＧＡＬ）のＫ１Ｌ遺伝子座へのトランスフアーを可能にするベクターｐＴＧ５０６５を示す略図である。

図３は、ＨＰＶ−１６後期遺伝子Ｌ1 およびＬ2 をＭＶＡワクシニアウイルスの排除帯域ＩＩ中に導入するのに使用できる戦略の略式説明図であり、左および右の組み換えアーム（ＢＲＧ2 とＢＲＤ2 ）がそれぞれ示されている。

実施例を参照しながら次に本発明をさらに詳しく説明するが、結果として制限を意図するものではない。

次に記載の構築（constructions ）は、一般的遺伝子工学および Maniatis ら（1989、上記）が詳述している分子クローニング手法、または市販キット使用の場合はメーカーの指示に従って実施される。In vitro での合成オリゴヌクレオチド・部位特異的突然変異誘発はＡｍｅｒｓｈａｍ社市販のキットを用いて実施される。ＰＣＲ増幅手法は当業者に公知である（例えば、PCR Protocols − A guide to methods and applications, 1990, Innis, Gelfand, Sninsky および White著、Academic Press Inc. 刊行）。制限部位の修復についての使用手法は、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメント（Klenow）を用いて突出５’末端を充填することからなる。

クローニング段階、組み換え体Ｍ13バクテリオフアージは寒天ベースの最少培地（７．５％寒天）中、または液体に富むＬＢＭ培地中でのＥ．ｃｏｌｉＮＭ５２２株（Stratagene）上で増殖される。アンピシリン抵抗性遺伝子を運搬する組み換えプラスミドは１００μｇ／ｍｌの抗生物質を補充した寒天または液体培地上のＥ．ｃｏｌｉ株Ｃ６００ (Stratagene）、ＢＪ５１８３ (Hanahan, 1983 J. Mol. Bio. 166, 557-580 ）およびＮＭ５２２中で複製される。このＢＪ５１８３株は相同的組み換えによりクローニングを行う場合に好ましく使用される（Bubeckら、1993, Nucleic Acid Res. 21, 3601-3602 ）。

組み換えワクシニアウイルスの構築は、上記引用文献中に開示され、かつ Mackettら（1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415-7419) および Mackettら（1984, J. Virol. 49, 857-864 ）により開示された、当分野で通常の技術に従って実施される。

実施例１：ＨＰＶ−１６Ｅ6 、Ｅ7 、Ｌ1 およびＬ2 遺伝子ならびにヒトＩＬ−２遺伝子を発現するＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルスＶＶＴＧ５０２１＆５０６５の構築
Ａ．ＨＰＶ１６Ｌ1 およびＬ2 遺伝子の単離
Ｌ1 およびＬ2 タンパク質をコードするフラグントは従来の一般的手法に従ってＣａｓｋｉ細胞（ＡＴＣＣ１５５０）のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより単離する。このＬ1 配列を保有する増幅用フラグメントを、ベクターＭ１３ＴＧ１３０（Kieny ら、1983, Gene 26, 91-99）へとサブクローニングすると、構築体Ｍ１３ＴＧ８１７１を与える。クローン化Ｌ1 遺伝子配列は、Genebank（届出番号（accession ）Ｋ０２７１８号）中に含まれた配列と比較すると、いくつかの突然変異を現す：位置２４８でのＡに代えてＣ、位置２５３でのＡに代えてＣ、位置５３７でのＡに代えてＧ、位置６８２でのＣに代えてＧ、位置８７４でのＡに代えてＧ、位置１３９３におけるトリプレットＡＣＴの挿入、位置１３９０におけるトリップレットＧＡＴの欠失。

Ｌ2 配列を運搬するＰＣＲフラグメントのベクターＭ１３ＴＧ６１３１への挿入はＭ１３ＴＧ９１２６へと導かれる。Genebankに開示された配列と比較すると、５ポイントの突然変異が観察される：位置３７８のＴに代えてＣ、位置６９１のＧに代えてＡ、位置７０２のＧに代えてＡ、位置９９０のＡに代えてＧおよび位置１０９２のＡに代えてＣ。参考までにベクターＭ１３ＴＧ６１３１は多重クローンニング部位外側に位置する内部Ｂｇ 1II部位の突然変異によりＭ１３ＴＧ１３１（Kieny ら、1983, 上記）から誘導される。

Ｂ．ワクシニアウイルスのゲノムのＴＫ遺伝子座へのＬ1 およびＬ2 遺伝子のトランスフアーの場合のベクターｐＴＧ５０２１の構築
イニシエーターＡＴＧの上流にＢｇ1 ＩＩ部位を創ることにより、Ｌ1 タンパク質をコードする遺伝子が修飾される。この突然変異遺伝子をＢｇ1 ＩＩ−ＳａｃＩ消化により先行のベクター（Ｍ１３ＴＧ８１８５）から切除し、ｐＴＧ１８６−ポリのＢａｍＨＩとＳａＣＩ部位の間に挿入する。得られた構築体をｐＴＧ４０１９と呼称する。このトランスフアーベクターｐＴＧ１８６−ポリの詳細はフランス特許第 2,583,429号公報中に記載がある。トランスフアーされる遺伝子およびその発現を制御するプロモーターｐ７．５Ｋの挿入に対する制限部位は１０箇所ある。

Ｌ2 タンパク質をコードする遺伝子はＢｇ1 ＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化によりＭ１３ＴＧ９１２６から単離し、次いでこの７．５Ｋプロモーターの３’におけるＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にクローン化される。Ｍ１３ＴＧ９１２７が得られ、この中にＳａ1 Ｉ部位が、局在突然変異誘発により、プロモーター上流に導入される。発現ユニット”ｐ７．５Ｋ−Ｌ2 遺伝子”は突然変異ベクターＭ１３ＴＧ９１２９から単離され、２つのカセットｐ７．５Ｋ−Ｌ1 およびｐ７．５Ｋ−Ｌ2 が反対配向するようにトランスフアーベクターｐＴＧ４０１９のＳａｃＩ部位中にクローン化される。得られるｐＴＧ５０２１構築体を図１に示す。この発現ユニットは相同的組み換えによりワクシニアウイルスのＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株ゲノム中にトランスフアーされる。ＶＶＴＧ５０２１と呼称するこの組み換えウイルスは５−ブロモデオキシウリジン（５ＢＵＤＲ）を用いた選択により単離される。

Ｃ．ＨＰＶ１６Ｅ6 およびＥ7 遺伝子の単離
Ｅ6 およびＥ7 遺伝子は欧州特許ＥＰ第 0,462,187号の実施例２および３記載のようにＣａｓｋｉ細胞ラインから単離する。２つの構築体は、次のクローニグ段階を容易にするように、ＨＰＶ−１６Ｅ6 とＥ7 遺伝子とを含むクローンＭ１３Ｅ7 ／Ｅ6 から誘導された。第１の命名Ｍ１３ＴＧ８１８８は、Ｅ7 遺伝子の上流と下流それぞれに、部位指向性突然変異誘発によりＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ部位を導入することにより得られ、第２のＭ１３ＴＧ８１８９はＥ6 遺伝子の上流でＰｓｔＩ部位を含んでいる。イニシエーターＡＴＧの上流および停止コドンの下流への点突然変異の導入は当業者の通常能力以内のものである。網膜芽腫遺伝子の産物とＨＰＶ−１６Ｅ7 タンパク質との組み合わせは多くの著者により実証（例えば、Mungerら、1989, EMBO J. 8, 4099-4105 参照）され、その形質転換力と関係ずけられている。明らかな安全性の理由で、形質転換機能に関与する未変性Ｅ7 タンパク質のアミノ酸２１から２６をコードする配列が削除されている非発がん性突然変異体は、オリゴヌクレオチドｏＴＧ５１１８（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）を用いたベクターＭ１３ＴＧ８１８８の部位指向性突然変異誘発により生じる。Ｍ１３ＴＧ９１０４が得られる。この突然変異体Ｅ7 遺伝子を以後Ｅ7 ^＊と呼称する。

同様に、ＨＰＶ−１６タンパク質は、腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ５３の発現の産物と相互作用し得ることが実証されている（Crook ら、1991, Cell 67, 547-556）。この相互作用に関与するドメインは輪郭が明瞭にされており、かつ未変性タンパク質の残基１１１〜１１５に位置している。ベクターＭ１３ＴＧ９１２５はオリゴヌクレオチドｏＴＧ５３７７（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を用いたＭ１３ＴＧ８１８９の突然変異誘発により生ずる。突然変異体Ｅ6 遺伝子を以後Ｅ6 ^＊と呼称する。

Ｄ．Ｋ１Ｌ遺伝子座中に組み込まれるＨＰＶ−１６Ｅ6 とＥ7 遺伝子およびヒトＩＬ−２遺伝子を有するトランスフアーベクターｐＴＧ５０６５の構築
Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルスゲノム（Guillard ら、1985, J. Virol. 53, 316-318 ）の左末端の５．２ｋｂＥｃｏＲＩＫフラグメントを、ＥｃｏＲＩで線形化したプラスミドｐＵＣ8 （Gibco BRL ）中にクローン化する。得られたベクターをＢｇ1 ＩＩを用いる制御消化に処し、次いでＫ１Ｌ宿主制限遺伝子（Guillardら、1986, Proc.Natl. Acad. Sci., USA 83, 5573-5577）をコードする８５５ｂｐフラグメントが削除されるように連結させる。この３．４ｋｂＢｇ1 ＩＩフラグメントをｐＵＣ８Ｋｈｒと呼称する中間構築体から単離し、次いでプラスミドｐＵＣ7 （Gibco BRL)のＢａｍＨＩ部位中にクローン化する。ｐＢＡＣ１が生じ、この中にＸｈｏＩアダプターがユニークＢｇ1 ＩＩ部位の左側に導入される。ＸｈｏＩとＢｇ1 ＩＩによる消化後、ｐ７．５Ｋワクシニアプロモーターを有するＳａ1 Ｉ−Ｂｇ1 ＩＩフラグメントを挿入する。この２つのＥｃｏＲＩ部位はＥｃｏＲＩ消化に続くＫｌｅｎｏｗ処理および再連結により除去される。このベクターｐＴＧ２１４７は、Ｂｇ１ＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの形で単離されたベクターｐポリＩＩ（Lathe ら、187, Gene 57, 193-201 ）から単離される多重クローニング部位をユニークＢｇ１ＩＩ部位中に導入して得られる。したがってこのものは、制限部位が続くｐ７．５Ｋプロモーターを取り囲むＫ1 Ｌ遺伝子座中への挿入を可能にする組み換えアームを含んでいる。上記Ｅ6 ^＊およびＥ7 ^＊遺伝子はベクターＭ１３ＴＧ９１３２中に含まれるワクシニアプロモーターｐＨ５Ｒの下流にクローン化され、Ｍ１３ＴＧ９１３８およびＭ１３ＴＧ９１３９をそれぞれ与える。参考までに、ベクターＭ１３ＴＧ９１３２はウイルスゲノムからＰＣＲにより単離されたＨ５Ｒ遺伝子のプロモーターをフアージＭ１３ＴＧ６１３１へ挿入することにより得られる。

その上、ヒトインターロイキン−２をコードするｃＤＮＡは、プラスミドｐＴｇ３６（フランス特許第 2,583,770号公報）から単離され、中間ベクター中に導入され、かつ遺伝子座Ｋ１ＬをターゲットとするトランスフアーベクターｐＴＧ２１４７中に挿入されるように再度Ｓａ1 Ｉ−ＢａｍＨＩ消化により取り出される。この挿入はクローニングアダプターを用いて、プロモーターｐ７．５Ｋの下流に位置するＰｓｔＩとＸｂａＩのレベルで行われる。ｐＴＧ５０５６が得られる。

発現ユニットｐＨ５Ｒ−Ｅ6 ^＊はベクターｐＴＧ５０５６のＢａｍＨＩ部位中に導入されるＢｇ1 ＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメンの形でベクターＭ１３ＴＧ９１３９から単離される。ベクターｐＴＧ５０６０が生ずる。発現ユニットｐＨ５Ｒ−Ｅ7 ^＊はＭ１３ＴＧ９１３８から精製され、かつベクターｐＴＧ５０６０のＢａｍＨＩ部位で挿入されてｐＴＧ５０６２を与える。Ｋ1Ｌ遺伝子座における挿入は、ある種の細胞タイプでは減少したり破壊されたりする複製能力を有する組み換えウイルスに導かれることが判る。これらの理由でポジテイブ選択性マーカーが、この組み換えウイルスの確認を容易にするために導入される。ベクターｐＴＧ５０６５は、Ｂｇ1 ＩＩ−ＢａｍＨＩ開裂によるプラスミドｐＩＶ７５（Chenら、1993, Virology 196, 682-693 ）から単離された発現カセット”ｐＫ1 Ｌ−Ｌａｃｚ遺伝子”の、ｐＴＧ５０６２のＢａｍＨＩ部位へのクローニングにより得られる。図２から判るように、これがワクシニアウイルスのＫ1 Ｌ遺伝子座へのＥ6 ^＊、Ｅ7 ^＊およびＩＬ−２ユニットのトランスフアーを可能にする。

ＶＶＴＧ５０６５と呼称する組み換えワクシニアウイルスは、野生型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアで感染させたチキン胚細胞中にベクターｐＴＧ５０６５をトランスフエクション後、相同的組み換えにより生じ、かつＸ−Ｇａｌを用いた寒天下での染色により取り出される。このワクシニアウイルスＶＶＴＧ５０２１および同ＶＶＴＧ５０６５は二重感染テストに使用される。この二重組み換え体は２つのマーカーに従って選択される：Ｘ−Ｇａｌ存在下での青色プラークの形成およびＴＫマーカーの失欠。ＶＶＴＧ５０２１＆５０６５と呼称されるこれらは、Ｋ1 Ｌ遺伝子座で組み込まれるユニットｐ７．５Ｋ−ＩＬ−２、ｐＨ５Ｒ−Ｅ6 ^＊、およびｐＨ５Ｒ−Ｅ7 ^＊を発現し、かつＴＫ遺伝子座で組み込まれたユニットｐ７．５Ｋ−Ｌ1 およびｐ７．５Ｋ−Ｌ2 を発現する。

ＨＰＶ遺伝子の発現は、適当なモノクロナールもしくはポリクロナール抗体を用いた Western-blot 分析により、または逆ＰＣＲにより証明できる。ＩＬ−２の生産は、文献記載のようなＥＬＩＳＡテストまたはＣＴＬテストにより評価できる。参考までに、in vitro におけるこの発現レベルは６０ｎｇ／ｍｌ／１０^６細胞（１ｐｆｕ／細胞および２４時間感染）程度である。

実施例２：Ｅ6 およびＥ7 遺伝子ならびにヒトＩＬ−２遺伝子を発現するＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルスの構築
ヒトインターロイキン−２をコードするｃＤＮＡをＰｓｔＩ消化によりプラスミドｐＴＧ３６から単離し、かつプラスミドｐＴＧ１８６のＰｓｔＩ部位中に挿入して、ｐＴＧ１８８を得る。相同的組み換えにより得られるこのウイルスをＶＶＴＧ１８８と呼称する。

このＥ6 ^＊遺伝子をＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの形でＭ１３ＴＧ９１２５から単離し、かつ７．５Ｋプロモーターの下流でｐＴＧ２１４７のＰｓｔＩとＸｂａＩ部位の間に、ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩアダプターの存在下で、挿入してｐＴＧ５０５７を得る。このＥ7 ^＊遺伝子をＭ１３ＴＧ９１３８生産Ｈ５Ｒワクシニアプロモーターの制御下に置き、ＢａｍＨＩ−Ｂｇ１ＩＩサイトにより区画されたカセットをｐＴＧ５０５７のＢａｍＨＩサイト中にサブクローン化する。ｐＴＧ５０５９が得られ、そのＢａｍＨＩサイト中にＬａｃＺ選択可能マーカーを、Ｋ１Ｌワクシニア遺伝子のプロモーターの制御下、ベクトルｐＩＶ７５のＢｇ１ＩＩ−ＢａｍＨＩ消化により挿入する。生成構築体はｐＴＧ５０６１と呼称し、かつこのウイルスはワクシニアゲノムＶＶＴＧ５０６１を用いた相同的組み換えにより生ずる。

Ｋ１Ｌ遺伝子座で組み込まれるＥ6 ^＊およびＥ7 ^＊遺伝子、ならびにＴＫ遺伝子座で組み込まれるヒトＩＬ−２遺伝子を発現する組み換えワクシニアウイルスは、ウイルスＶＶＴＧ５０６１およびＶＶＴＧ１８８を用いたチキン胚細胞の共感染により得られる。参考として、後者は約４００ｎｇ／１０^６細胞（細胞当り１ｐｆｕ、２４時間感染）を上回るＩＬ−２量を生産する。この２重組み換えウイルスをＶＶＴＧ５０６１＆１８８と呼称する。

実施例３：Ｅ6 およびＥ7 遺伝子、ならびにヒト付着補因子Ｂ７．１をコードする遺伝子を発現するＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルスの構築
Ｂ７．１をコードするｃＤＮＡは、Ｄａｕｄｉ細胞ライン（ＡＴＣＣＣＣＬ−２１３）から得られたｍＲＮＡ調製物から、プライマーｏＴＧ６３５３およびｏＴＧ６３５２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３および４）を用いる逆ＰＣＲにより単離される。この遺伝子の配列は届出番号第Ｍ２７５３３としてGenebankに開示されている。この増幅フラグメントはＭ１３ＴＧ６１３１のＢｇ１ＩＩとＥｃｏＲＩサイトとの間にクローン化されてＭ１３ＴＧ９１４９に導かれ、次いでｐＴＧ１８６のＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとの間にクローン化される。この構築体をｐＴＧ５０９０と呼称し、またこのウイルスは相同的組み換えＶＶＴＧ５０９０により得られる。Ｋ１Ｌ遺伝子座で組に込まれたＨＰＶ−１６Ｅ6 ^＊およびＥ7 ^＊遺伝子、ならびにＴＫ遺伝子座に組み込まれたヒトＢ７．１遺伝子を発現するワキシニアウイルスは、ウイルスＶＶＴＧ５０６１および同ＶＶＴＧ５０９０を用いたチキン胚の共感染により得ることができる。この組み換えウイルスをＶＶＴＧ５０６１＆５０９０と呼称する。

実施例４：Ｅ6 およびＥ7 遺伝子ならびに切除ＩＩＩ帯域中に組み込まれたＢ７．１遺伝子を発現するワクシニアウイルスのＭＶＡ株の構築
このＭＶＡウイルスは、ワクシニアウイルスのＡｎｋａｒａ株から導かれる。哺乳類細胞上で感染粒子を発生させることはできないが、チキン胚繊維芽細胞上では満足に発生する。これらの細胞へそれを適応すると、この種タイプの細胞上での発生と感染サイクルにとり必須でない６領域の切除が起きる（ウイルスゲノムの約１５％が消失；Meyer ら、1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038）。外生遺伝子材料はこれら切除帯域のいずれのレベルでも組み込める。本発明の枠組以内で、ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＮおよびＡそれぞれのレベルに位置する切除ＩＩおよびＩＩＩが使用される（Altenburger ら、1989, Arch. Virol.105,15-27 ）。

最初の例では、ＭＶＡウイルスの切除帯域ＩＩＩ中への挿入を可能にするベクターｐＴＧ６０１９が構築される。この切除帯域ＩＩＩのいずれかの側上の相同的組み換えアームがウイルスゲノム（米国特許第 5,185,146 号公報参照）および左アームの場合はプライマーｏＴＧ７６３７およびｏＴＧ７６３８（ＳＥＱＩＤＮＯ：５および６）、かつ右アームの場合はｏＴＧ７６３５およびｏＴＧ７６３６（ＳＥＱＩＤＮＯ：７および８）からＰＣＲにより単離される。この増幅フラグメントをベクターｐＴＧ１ＥのＥｃｏＲＩサイト中にクローン化するとｐＴＧ６０１９を与える。トランスフアーされる遺伝子材料はこの２つの組み換えアームの間に挿入される。ベクターｐＴＧ１Ｅは多重クローニングサイトの代わりにＥｃｏＲＩアダプターが存在する以外は、ｐＴＧ１Ｈ（フランス特許第 2,583,429号公報）に類似している。

先ず、ｇｕｓＡマーカー遺伝子の発現用カセットを挿入する。この７．５Ｋプロモーターを先ずｐＴＧ６０１９のＢａｍＨＩサイト中にクローン化する。ｐＴＧ６０２１が得られ、これのＢａｍＨＩサイト中に、Ｂｇ１ＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの形で生じたｇｕｓＡ遺伝子をを挿入する。このものは文献に開示の配列から得られる。生じた構築体をｐＴＧ６０２２と呼称する。このマーカーの存在により、基質Ｘｇ１ｃＡを用いたＧＵＳ酵素活性の検出による、野生型ウイルスと組み換えウイルスとの間の識別が可能になる。赤色はβ−グルクロニダーゼ活性を示す。しかし、臨床に応用する目的では、このバクテリアマーカーを組み換えウイルスの選択後に最終産物から除去し得ることが有用かもしれない。これを行うためには、２つの相同サイト間の配列を削除するワクシニアの能力を利用するのが便利である。したがって、第２プロモーターｐ７．５Ｋを、その発現を指令するものと比較してセンス配向で、ｇｕｓＡ遺伝子の下流に挿入する。

このベクターｐＴＧ６０２２は付着末端を備えたフラグメントｐ７．５ＫのＢａｍＨＩサイトとＳａｃＩサイトとの間への挿入により修飾を受けてｐＴＧ６０２５を与える。

後者は突然変異体Ｅ6 ^＊およびＥ7 ^＊遺伝子発現カセットの挿入により完成させる。新規プロモーター配列ｐ７．５Ｋを先ず導入するが、この場合は先行のものとは相対的にアンチセンス配向で導入する。したがってｐＴＧ６０３９と呼称されるこの構築体は、反対配向におけるｐ７．５Ｋが後続する不安定ＧＵＳカセット”ｐ７．５Ｋ→ｇｕｓＡ−ｐ７．５Ｋ→”を含む。平行して、Ｅ6 ^＊およびＥ7 ^＊遺伝子はＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ消化によりベクターＭ１３ＴＧ９１０４およびＭ１３ＴＧ９１２５それぞから単離され、かつＭ１３ＴＧ６１３１のＰｓｔＩサイトで、お互いに関して反対配向で組み立てられる。全体は、同一酵素を用いて線状化したｐＴＧ６０３９中に挿入されるＰｓｔＩフラグメントの形で取り出される。ベクターｐＴＧ６０５６が得られ、このものは次の配列ｐ７．５Ｋ→ｇｕｓＡ−ｐ７．５Ｋ→Ｅ7 ^＊−Ｅ6 ^＊←ｐ７．５Ｋ”を含む。

免疫刺激遺伝子Ｂ７．１は後者構築体中に組み込まれる。これを行うには、ベクターｐＴＧ６０５６を、オリゴヌクレオチドｏＴＧ１０４５１およびｏＴＧ１０４５０（ＳＥＱＩＤＮＯ：９および１０）の存在下で連結させるに先立ってＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩを用いて開裂し、ｐＴＧ６０７０を生じさせる。後者は相同的組み換えにより発現カセット”ｐＨ５Ｒ−Ｂ７．１”のクローニングを可能にする。この趣旨で、Ｍ１３ＴＧ９１４９から単離したＢ７．１配列をワクシニアプロモーターｐＨ５Ｒの下流でクローン化し、Ｍ１３ＴＧ９１８４を形成させる。このカセットを有するＢｇ１ＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉ中の相同的組み換えによりＸｈｏＩで線状化したベクターｐＴＧ６０７０中に組み込む。ベクターｐＴＧ６０７９が得られ、このものは全体として”不安定”型のｇｕｓＡマーカー遺伝子、およびＨＰＶ−１６初期遺伝子の発現用カセット、ならびに共刺激遺伝子Ｂ７．１用のカセットを含む。ＭＶＡゲノムを用いた相同的組み換えにより生じたウイルスはＭＶＡＴＧ６０７９と呼称する。

ＨＰＶ−１６後期遺伝子の発現用ユニットは、トランスフアーベクターｐＴＧ６０１８を用いて切除帯域ＩＩ中に挿入できる。このものはＩＩ切除を区画するｐＴＧ１Ｅ左および右組み換えアームのＥｃｏＲＩサイト中に挿入することにより構築され、それらはプライマーｏＴＧ７６６５およびｏＴＧ７５８４（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１および１２）ならびにｏＴＧ７６３９よびｏＴＧ７６４０（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３および１４）を用いたＰＣＲにより生じさせる。このように、ポジテイブマーカーの発現用カセットは、組み換えウイルスの検出を容易にする目的で、上記２つのアーム間に組み込まれるが、選択工程後にこれを除去すことができる（Spehner ら、1990, J. Virol. 64, 527-533 ）。ベクターｐＴＧ６０２０は、プロモーターｐ７．５Ｋの下流に位置するＬａｃＺ遺伝子の、ＢａｍＨＩで線状化したベクターｐＴＧ６０１８中へのクローニングにより得られる。ｐＴＧ６０２０は、ＬａｃＺ遺伝子の下流に位置するＢａｍＨＩおよびＳａｃＩサイト間に配列ｐ７．５Ｋを挿入することにより修飾される。ｐＴｇ６０２４が得られる。このカセットＬ1 およびＬ2 は、次いで図３に示す戦略に従って導入することができる。

実施例５：Ｅ6 およびＥ7 遺伝子、ならびに切除帯域ＩＩＩ中に組み込まれたＩＬ−２遺伝子を発現するワクシニアウイルスのＭＶＡ株の構築
上記と同じ戦略を用いてベクターｐＴＧ６０５６中にＩＬ−２遺伝子を導入する。組み換えオリゴヌクレオチドｏＴＧ１０５０３およびｏＴＧ１０５０２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５および１６）をクローン化してｐＴＧ６０７６を生産後、ＸｈｏＩを用いて後者を開裂し、かつ相同的組み換えにより挿入したＭ１３ＴＧ９１８５（ｐＨ５Ｒ−ＩＬ−２）からＢｇ１ＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを調製する。かくして得られるベクターｐＴＧ６０９０は、”不安定”型ｇｕｓＡマーカー遺伝子、ＨＰＶ−１６初期遺伝子の発現用カセット、ならびにヒトＩＬ−２遺伝子カセットを含んでいる。ＭＶＡゲノムを用いた相同的組み換えにより得られる組み換えウイルスをＭＶＡＴＧ６０９０と呼称する。この後期遺伝子は上記のようにｐＴＧ６０１８を用いて切除帯域ＩＩ中に組み込める。

実施例６：動物モデルにおけるベクターＶＶＴＧ５０２１および５０６５の確認
Ａ．毒性研究
静脈内、筋肉内、皮下または頭蓋内ルートでＶＶＴＧ５０２１＆５０６５の
１０^７ｐｆｕまたは野生型ワクシニアウイルスの１０^７ｐｆｕをヌードマウスに投与した。注射ウイルスのタイプ、および投与ルートに応じて５マウスからなる群を形成させ、ワクシニアに関連する病変を有する動物数を注射後２６日で評価した。組み換えウイルスを投与したマウスは採用投与ルートに係わらずなんらの病変も示さなかった。一方、野生型ワクシニアを用いて処置した大部分の動物は病変を有し、その頻度および重大さは投与ルートに依存する。その上、静脈内および頭蓋内注射の場合は複数の死亡例が記録される。これらのデータでは、ＶＶＴＧ５０２１＆５０６５は野生型ウイルスに較べて減衰的であり、かつこのものは頭蓋内注射後でさえも病変を起こさせないことを示す。

Ｂ．ＶＶＴＧ５０２１＆５０６５を用いた免疫予防実験
Ｃ57ＢＬ6 マウスをＶＶＴＧ５０２１＆５０６５の１０^７ｐｆｕを用いて皮下ルートで３回ワクチン投与した。最終免疫化の３日後、これらの動物に皮下経由で１０^３Ｅ7 Ｗ1 細胞を移植して抗原投与する。参考までに、このＥ7 Ｗ1 細胞はＨＰＶ−１６発がん性Ｅ7 遺伝子を発現するベクターを用いてトランスフエクションしたネズミ（murine）リンパ腫ラインから得られる。時間の関数としての動物の生存率％を非組み換えワクシニアウイルスＶＶＴＧ１８６（上記ＴＧ１８６ベクターの誘導体）の１０^７ｐｆｕを用いて処置した対照マウスで得られた生存率％と比較する。死亡率のモニタリングによれば、２群間に差異がみられる。対照群では、Ｄ36において１００％の動物が死滅し、一方、ＶＶＴＧ５０２１＆５０６５を用いたワクチン処置では４０％の動物がＤ36において依然として生存し、Ｄ51では３０％を超えて生存していた。

このように、ＨＰＶ抗原および免疫刺激遺伝子を発現する組み換えウイルスは、ＨＰＶ−１６Ｅ7 発がん性遺伝子（oncogene）を発現する腫瘍細胞に対する抗腫瘍活性を示
す。

Ｃ．免疫治療実験
皮下経由（Ｄ0 ）で移植した１０^３Ｅ7 Ｗ1 細胞を用いてＣ57ＢＬ6 マウスに接種する。次いで１０^７ｐｆｕの組み換えウイルスを同じく皮下ルートでＤ3 、さらにＤ6 で最終的にはＤ9 において投与し、動物の生存率％を、非組み換えウイルスを投与した対照動物と比較して決定した。対照動物の１００％が死滅したが、一方、ＶＶＴＧ５０６１＆５０２１およびＶＶＴＧ１８８の混合物を用いて注射した動物の生存率は著しい増加が観測される。同様の結果が、ＶＶＴＧ５０６５＆５０２１とＶＶＴＧ１８８の投与後に得られる。

Ｅ7 Ｗ1 細胞に代えて異なった腫瘍モデル、ＢＭＫ１６ｍｙｃ細胞を用いてこれらの免疫治療実験を繰り返した。ＢＭＫ１６ｍｙｃ細胞はＨＰＶ−１６ゲノムおよびネズミｃｍｙｃ遺伝子を用いてトランスフエクションした新生マウスからの腎臓細胞である。複数動物をＨＰＶ−１６Ｅ6 ^＊およびＥ7 ^＊遺伝子ならびにヒトＩＬ−２遺伝子を発現するＭＶＡＴＧ６０９０ウイルスの１０^７を用いて処置する。対照と比較すると、処置マウスの腫瘍成長遅延はＤ15までであることを示す。

配列表

プロモーターｐ７．５Ｋの統制下に置かれたＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアのＴＫ遺伝子座、ＨＰＶ−１６後期遺伝子Ｌ1 およびＬ2 のＴＫ遺伝子座へのトランスフアーを可能にするベクターｐＴＧ５０２１を示す略図であり、この２つのカセットは互いに関し反対配向をなしている。プロモーターｐＨ５Ｒ（この２つのカセットは互いに関し反対配向をなしている）の統制下に置かれたＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアのＫ１Ｌ遺伝子座、ＨＰＶ−１６初期遺伝子Ｅ6 およびＥ7 のＫ１Ｌ遺伝子座、プロモーターｐ７．５ｋのコントロール下に置かれたヒトＩＬ−2 （ＩＬ２ｈ）遺伝子のＫ１Ｌ遺伝子座、およびプロモーターｐＫ１Ｌの統制下に置かれたマーカー遺伝子ＬａｃＺ（ｂｔａＧＡＬ）のＫ１Ｌ遺伝子座へのトランスフアーを可能にするベクターｐＴＧ５０６５を示す略図である。ＨＰＶ−１６後期遺伝子Ｌ1 およびＬ2 をＭＶＡワクシニアウイルスの排除帯域ＩＩ中に導入するのに使用できる戦略の略式説明図であり、左および右の組み換えアーム（ＢＲＧ2 とＢＲＤ2 ）がそれぞれ示されている。

Claims

パピローマウイルス感染または腫瘍の治療を意図した医薬組成物であって、治療剤として、パピローマウイルスの(i)初期Ｅ6 領域からの１種のポリペプチド、(ii)初期Ｅ7 領域からの１種のポリペプチド、および(iii)インターロイキン−２、インターロイキン−７、および共付着分子Ｂ７．１およびＢ７．２からなる群から選択される免疫刺激活性を有する少なくとも１種のポリペプチド、を含む医薬組成物。
パピローマウイルスの初期Ｅ6 および／またはＥ7 領域からのポリペプチドがパピローマウイルスのＥ6 および／またはＥ7 タンパク質の非発がん性変異体であることを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
免疫刺激活性を有するポリペプチドが、インターロイキン−２から誘導されることを特徴とする、請求項１〜２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
免疫刺激活性を有するポリペプチドが、上記分子Ｂ７．１から誘導されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
次の：
（１）パピローマウイルスのＥ6 領域からのポリペプチド、Ｅ7 領域からのポリペプチド、およびインターロイキン−２から誘導されるポリペプチド、
（２）パピローマウイルスのＥ6 領域からのポリペプチド、Ｅ7 領域からのポリペプチド、上記分子Ｂ７．１から誘導されるポリペプチド、または
（３）パピローマウイルスのＥ6 領域からのポリペプチド、Ｅ7 領域からのポリペプチド、上記分子Ｂ７．１から誘導されるポリペプチド、およびインターロイキン−２から誘導されるポリペプチド、
を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
パピローマウイルスが、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１および／またはＨＰＶ−４５の型から選択されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
パピローマウイルス感染または腫瘍の治療を意図した医薬組成物であって、治療剤として、パピローマウイルスの(i)初期Ｅ6 領域からの１種のポリペプチド、(ii)初期Ｅ7 領域からの１種のポリペプチド、および(iii)インターロイキン−２、インターロイキン−７および共付着分子Ｂ７．１およびＢ７．２からなる群から選択される免疫刺激活性を有する１種以上のポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントが挿入される１種の組み換えベクターを含み、上記ＤＮＡフラグメントが、宿主細胞または生物中でのそれらの発現に必要な諸要素の統制下に置かれる医薬組成物。
上記ポリペプチドが請求項１から６に定義した特性を有することを特徴とする、請求項７記載の医薬組成物。
組み換えベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノウイルス関連ウイルスから選択されるウイルスのゲノムから誘導されるウイルスベクターであることを特徴とする、請求項７または８記載の医薬組成物。
組み換えベクターが、ワクシニアウイルス、カナリヤポックスウイルスおよび禽痘ポックスウイルスからなる群から選択されるポックスウイルスから誘導されることを特徴とする、請求項９記載の医薬組成物。
組み換えベクターが、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｗｙｅｔｈおよび修飾Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）株から選択されるワクシニアウイルスから誘導されることを特徴とする、請求項１０記載の医薬組成物。
上記ポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントの発現に必須な諸要素が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、７．５Ｋ、Ｈ５ＲおよびＫ１Ｌ遺伝子のプロモーターから選択されたワクシニアウイルスの遺伝子のプロモーターを含むことを特徴とする、請求項１０または１１記載の医薬組成物。
組み換えベクターが、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株のワクシニアウイルスから誘導され、かつ上記ポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメンが上記ワクシニアウイルスのＴＫ遺伝子座および／またはＫ１Ｌ遺伝子座中に挿入されることを特徴とする、請求項１１または１２記載の医薬組成物。
組み換えベクターが、ＭＶＡ株のワクシニアウイルスから誘導され、かつ上記ポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントが、上記ワクシニアウイルスのＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩ切除から選択された切除帯域のいずれかのレベルで挿入されることを特徴とする、請求項１１または１２記載の医薬組成物。
次の：
（１）パピローマウイルスのＥ6 タンパク質をコードする１種のＤＮＡフラグメント、パピローマウイルスのＥ7 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、および上記分子Ｂ７．１コードするＤＮＡフラグメント、
（２）パピローマウイルスのＥ6 タンパク質をコードする１種のＤＮＡフラグメント、パピローマウイルスのＥ7 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、インターロイキン−２をコードするＤＮＡフラグメント、または
（３）パピローマウイルスのＥ6 タンパク質をコードする１種のＤＮＡフラグメント、パピローマウイルスのＥ7 タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、上記分子Ｂ７．１をコードするＤＮＡフラクメント、およびインターロイキン−２をコードするＤＮＡフラグメント、
が挿入されるＣｏｐｅｎｈａｇｅｎまたはＭＶＡ株のワクシニアウイルスから誘導される１種の組み換えベクターを含むことを特徴とする、パピローマウルス感染または腫瘍の治療を意図した、請求項７から１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
組み換えベクターが生存または死滅していることを特徴とする、請求項７から１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
ヒトまたは動物中への注射による投与を可能にする、薬剤的に許容される担体を含むことを特徴とする、請求項１から１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
子宮頚部がん、低い等級の頚部の異形成、およびパピローマウイルス感染の治療のための医薬物としての、請求項１から１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。