JP2012144566A - 表皮機能改善剤における有効成分の選択方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒト皮膚表皮角化細胞のヒアルロン酸産生とインボルクリン産生とを併せて促進し皮膚のうるおい、キメ、バリア機能等を改善することのできる表皮機能改善剤を提供する。
【解決手段】表皮角化細胞に対しヒアルロン酸産生促進効果とインボルクリン産生促進効果とを併せ持つ物質を含有する表皮機能改善剤であって、前記物質が、ヒアルロン酸産生促進効果を発揮する作用濃度がインボルクリン産生促進効果を発揮する作用濃度より低濃度となる物質であることを特徴とする表皮機能改善剤。
【選択図】なし

Description

本発明は表皮角化細胞中のヒアルロン酸産生とインボルクリン産生とを併せて促進する表皮機能改善剤に関し、更に詳しくはヒト皮膚表皮角化細胞のヒアルロン酸産生とインボルクリン産生とを併せて促進し皮膚のうるおい、キメ、バリア機能等を改善することのできる表皮機能改善剤に関するものである。

皮膚の表皮は本来の機能が正常に働くことによって、うるおいがあり、キメが整い、なめらかな表面状態を保つことができる。しかし、加齢、ストレス、睡眠不足、乾燥環境、紫外線暴露等によって表皮角化細胞の機能に低下や不調が生じた場合、健康で美しい皮膚を維持できなくなる。

ヒアルロン酸はグリコサミノグリカンの一つで水分を保持する能力に優れ皮膚のうるおいを保つために重要であり、線維芽細胞や表皮角化細胞等によって産生されることが知られている（非特許文献１、２）。一方、インボルクリンは表皮角化細胞によって産生され、健全な角層バリア機能形成に関わるコーニファイドエンベロープの前駆体タンパクの一つであり、他の角化不溶性膜のタンパク質、ロリクリンなどとトランスグルタミナーゼによって架橋され不溶化して、さらに、その一部には、セラミドなどと共有結合し、角層バリア機能には重要な役割を担っていることが知られている。

これまでにも、表皮角化細胞のヒアルロン酸産生を促進する物質は知られておりＮ−アセチルグルコサミン、しそ科植物抽出物等がある（特許文献１、２）。一方、表皮角化細胞のインボルクリン産生を促進する物質も知られておりオトギリソウ科のセイロンテツボクの種子抽出物、シラカンバ樹液等がある（特許文献３、４）。しかし、両方の効果を併せ持つ物質は知られていない。

外用による表皮機能改善剤を開発しようとする場合、物質による角層透過率の差を考慮し、該物質の表皮角化細胞環境濃度を、ヒアルロン酸産生促進物質、インボルクリン産生促進物質各々が効果を発揮する濃度になるように設定することは極めて困難である。この観点からも、両方の効果を併せ持つ物質が望まれる。

γ−アミノ酪酸（以下ＧＡＢＡと略す）は脳、繊維芽細胞などにグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）により合成されるが、表皮に検出されなかった（非特許文献３）。従って、表皮角化細胞において細胞賦活作用、インボルクリン産生促進作用をもつＧＡＢＡは、外用することによって角層バリア機能の低下に起因する肌荒れに対する緩和効果が期待できる。

Ｂｉｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、１９９１年、第８巻、ｐ．３４６ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、１９６７年、第１０巻、ｐ．３５７ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、２００７年、第１７７０巻、ｐ．２９１−２９６ 特開２００１−００２５５１号公報 特開平１０−０９５７３５号公報 特開２００５−２１３１８７号公報 特開２００７−２１７３２６号公報

表皮角化細胞に対しヒアルロン酸産生促進効果とインボルクリン産生促進効果とを併せ持つ一つの物質を含有する表皮機能改善剤を開発しようとする場合、ヒアルロン酸産生促進効果を発揮する作用濃度とインボルクリン産生促進効果を発揮する作用濃度との関係に以下の課題がある。すなわち、ヒアルロン酸産生促進効果を発揮する作用濃度がインボルクリン産生促進効果を発揮する作用濃度より高かった場合、外用により両効果を有する物質が次第に細胞環境濃度を高めつつ表皮角化細胞に作用すると、まず低濃度領域でインボルクリン産生が促進され、表皮角化細胞の状態は角化過程に移行してしまい、その後、細胞環境濃度が高まりヒアルロン酸産生促進を発揮できる高濃度領域に達したとしても角化過程の表皮角化細胞にヒアルロン酸を産生する機能は期待できない点である。

本発明者は上記事情に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、表皮角化細胞に対しヒアルロン酸産生促進効果とインボルクリン産生促進効果とを併せ持つ物質を含有する表皮機能改善剤であって、ヒアルロン酸産生促進効果を発揮する作用濃度がインボルクリン産生促進効果を発揮する作用濃度より低濃度となる物質であることを特徴とする表皮機能改善剤により、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成したものである。

すなわち本発明は、表皮角化細胞に対しヒアルロン酸産生促進効果とインボルクリン産生促進効果とを併せ持つ物質を含有する表皮機能改善剤であって、前記物質が、ヒアルロン酸産生促進効果を発揮する作用濃度がインボルクリン産生促進効果を発揮する作用濃度より低濃度となる物質であることを特徴とする表皮機能改善剤である。

また表皮角化細胞に対しヒアルロン酸産生促進効果とインボルクリン産生促進効果とを併せ持つ物質がγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）であることを特徴とする表皮機能改善剤が好ましい。

本発明の表皮機能改善剤は、ヒト皮膚表皮角化細胞のヒアルロン酸産生とインボルクリン産生とを併せて促進し皮膚のうるおい、キメ、バリア機能等を改善する効果に優れる。

以下、本発明について詳述する。

本発明のＧＡＢＡは公知化合物である。表皮機能改善剤として用いられる場合、単独で用いるほか、通常用いられる各種の美白剤、抗酸化剤、細胞賦活剤、保湿剤、紫外線防止剤など上記の薬効剤から選ばれる薬効剤の一種または二種以上と併用して、皮膚に直接に塗布、貼布または散布する経皮投与する投与方法をとることができる。

＜試験例１＞表皮角化細胞におけるヒアルロン酸産生促進作用
ヒト正常新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、ヒト正常新生児表皮角化細胞増殖用無血清培地（以下ＫＧＭと略す）を用いて培養した後、トリプシン／エチレンジアミン四酢酸（以下ＥＤＴＡと略す）溶液処理により細胞を回収し、２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、４８穴培養プレートに５×１０^４個ずつ播種し、５％ＣＯ_２環境下、３７℃で４日間培養した。４日間培養後培養液を表１に示すＧＡＢＡ含有基礎培地と交換し、培養を続けた。３日間培養後、培養上清を採取し、培養上清中のヒアルロン酸濃度を測定した。

培養上清中のヒアルロン酸濃度はヒアルロン酸結合タンパク質（ＨＡＢＰ）を利用した
サンドイッチバインディングアッセイ法により測定した。ＧＡＢＡを添加していない対照例の培養液中のヒアルロン酸濃度も同時に測定した。ＧＡＢＡ無添加培養液中のヒアルロン酸濃度を１００としたときのＧＡＢＡ添加により誘導されたヒアルロン酸濃度を表１に併せて示す。

表１に示すように、ヒアルロン酸産生量はＧＡＢＡを添加することによって有意に促進された。また、試験例においては細胞に損傷を与えるようなことはなく、安全性も極めて高いものであった。ＧＡＢＡが効果を示す細胞環境濃度は少なくとも０．３８μｇ／ｍＬであった。

＜試験例２＞表皮角化細胞におけるインボルクリン産生促進作用
ヒト正常新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、ヒト正常新生児表皮角化細胞増殖用無血清培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液処理により細胞を回収し、１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、４８穴培養プレートに２×１０^４個ずつ播種し、５％ＣＯ_２環境下、３７℃で２４時間培養した。培養終了後、ＧＡＢＡを表２に示す濃度で４８時間培養した。培養終了後、培地を抜き、細胞を培養プレートに固定させ、細胞表面に発現したインボルクリンの量をモノクローナル抗ヒトインボルクリン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法を用いてインボルクリン産生量を定量した。ＧＡＢＡ無添加（対照）を１００としたときのインボルクリン産生量を表２に併せて示す。

表２に示すように、インボルクリン産生はＧＡＢＡを添加することによって有意に促進された。また、試験例においては細胞に損傷を与えるようなことはなく、安全性も極めて高いものであった。ヒアルロン酸産生が有意に促進されるＧＡＢＡ３．４μｇ／ｍＬ添加ではインボルクリン産生の促進に有意差は認められなかったが、それよりも高濃度である１２．５μｇ／ｍＬ添加および５０μｇ／ｍＬ添加の細胞環境濃度ではＧＡＢＡが効果を示した。

試験例１、２の結果から明らかな通り、ＧＡＢＡはヒアルロン酸産生促進効果を発揮する作用濃度がインボルクリン産生促進効果を発揮する作用濃度より低濃度となる物質である。

次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。なお、配合量はすべて質量％である。

＜実施例１、比較例１＞
表３中の成分（１）〜（６）と、全量が１００％となる成分（１１）精製水を加え混合した後成分（７）を加えて中和し、ホモミキサーで均一に分散した後、成分（８）〜（１０）を混合したものを添加し、さらによく分散して増粘乳化製剤を得た。比較例１も同様に調製した。得られた増粘乳化製剤を、綿１００％の水流絡合不織布（目付６０ｇ／ｍ^２）に含浸させた。含浸量としては、フェイスマスク１枚（半顔分）約１８０ｃｍ^２に１０ｇを含浸させた。

上記の実施例１、及び比較例１について使用試験等を行って効果を比較した。使用試験は３０〜４０代の女性パネラー各１０名ずつに上記実施例１、比較例１の不織布含浸組成物を、夜、洗顔後の顔面左右に１５分間使用、以後２日空け３日に１回、全１０回連続して使用した。パネラーに使用性、及び直後、翌日の肌状態を総合評価してもらった。実施例１と比較例１の使用性の評価結果を表３に、また使用試験終了翌日の肌の状態について、常法に従い表皮水分量、ＴＥＷＬ、キメの観察を行なった結果を表３に示す。

表皮角化細胞に対しヒアルロン酸産生促進効果とインボルクリン産生促進効果とを併せ持ち、ヒアルロン酸産生促進効果を発揮する作用濃度がインボルクリン産生促進効果を発揮する作用濃度より低濃度であるＧＡＢＡを配合した不織布含浸組成物は、皮膚のうるおい、キメ、バリア機能の改善に有効であった。

本発明は表皮角化細胞中のヒアルロン酸産生とインボルクリン産生とを併せて促進する表皮機能改善剤における有効成分の選択方法に関し、更に詳しくはヒト皮膚表皮角化細胞のヒアルロン酸産生とインボルクリン産生とを併せて促進し皮膚のうるおい、キメ、バリア機能等を改善することのできる表皮機能改善剤における有効成分の選択方法に関するものである。

皮膚の表皮は本来の機能が正常に働くことによって、うるおいがあり、キメが整い、なめらかな表面状態を保つことができる。しかし、加齢、ストレス、睡眠不足、乾燥環境、紫外線暴露等によって表皮角化細胞の機能に低下や不調が生じた場合、健康で美しい皮膚を維持できなくなる。

ヒアルロン酸はグリコサミノグリカンの一つで水分を保持する能力に優れ皮膚のうるおいを保つために重要であり、線維芽細胞や表皮角化細胞等によって産生されることが知られている（非特許文献１、２）。一方、インボルクリンは表皮角化細胞によって産生され、健全な角層バリア機能形成に関わるコーニファイドエンベロープの前駆体タンパクの一つであり、他の角化不溶性膜のタンパク質、ロリクリンなどとトランスグルタミナーゼによって架橋され不溶化して、さらに、その一部には、セラミドなどと共有結合し、角層バリア機能には重要な役割を担っていることが知られている。

これまでにも、表皮角化細胞のヒアルロン酸産生を促進する物質は知られておりＮ−アセチルグルコサミン、しそ科植物抽出物等がある（特許文献１、２）。一方、表皮角化細胞のインボルクリン産生を促進する物質も知られておりオトギリソウ科のセイロンテツボクの種子抽出物、シラカンバ樹液等がある（特許文献３、４）。しかし、両方の効果を併せ持つ物質は知られていない。

外用による表皮機能改善剤を開発しようとする場合、物質による角層透過率の差を考慮し、該物質の表皮角化細胞環境濃度を、ヒアルロン酸産生促進物質、インボルクリン産生促進物質各々が効果を発揮する濃度になるように設定することは極めて困難である。この観点からも、両方の効果を併せ持つ物質が望まれる。

γ−アミノ酪酸（以下ＧＡＢＡと略す）は脳、繊維芽細胞などにグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）により合成されるが、表皮に検出されなかった（非特許文献３）。従って、表皮角化細胞において細胞賦活作用、インボルクリン産生促進作用をもつＧＡＢＡは、外用することによって角層バリア機能の低下に起因する肌荒れに対する緩和効果が期待できる。

特開２００１−００２５５１号公報 特開平１０−０９５７３５号公報 特開２００５−２１３１８７号公報 特開２００７−２１７３２６号公報

Ｂｉｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、１９９１年、第８巻、ｐ．３４６ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、１９６７年、第１０巻、ｐ．３５７ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、２００７年、第１７７０巻、ｐ．２９１−２９６

表皮角化細胞に対しヒアルロン酸産生促進効果とインボルクリン産生促進効果とを併せ持つ一つの物質を含有する表皮機能改善剤を開発しようとする場合、ヒアルロン酸産生促進効果を発揮する作用濃度とインボルクリン産生促進効果を発揮する作用濃度との関係に以下の課題がある。すなわち、ヒアルロン酸産生促進効果を発揮する作用濃度がインボルクリン産生促進効果を発揮する作用濃度より高かった場合、外用により両効果を有する物質が次第に細胞環境濃度を高めつつ表皮角化細胞に作用すると、まず低濃度領域でインボルクリン産生が促進され、表皮角化細胞の状態は角化過程に移行してしまい、その後、細胞環境濃度が高まりヒアルロン酸産生促進を発揮できる高濃度領域に達したとしても角化過程の表皮角化細胞にヒアルロン酸を産生する機能は期待できない点である。

本発明者は上記事情に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、表皮角化細胞に対しヒアルロン酸産生促進効果とインボルクリン産生促進効果とを併せ持つ物質を有効成分として含有する表皮機能改善剤であって、ヒアルロン酸産生促進効果を発揮する作用濃度がインボルクリン産生促進効果を発揮する作用濃度より低濃度となる物質を有効成分として選択することを特徴とする表皮機能改善剤により、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成したものである。

すなわち本発明は、表皮機能改善剤における有効成分の選択方法であって、表皮角化細胞に対しヒアルロン酸産生促進効果とインボルクリン産生促進効果とを併せ持つ物質から、ヒアルロン酸産生促進効果を発揮する作用濃度がインボルクリン産生促進効果を発揮する作用濃度より低濃度となる物質を有効成分として選択することを特徴とする表皮機能改善剤における有効成分の選択方法である。

本発明の表皮機能改善剤における有効成分の選択方法によれば、ヒト皮膚表皮角化細胞のヒアルロン酸産生とインボルクリン産生とを併せて促進し皮膚のうるおい、キメ、バリア機能等を改善する効果に優れる。

以下、本発明について詳述する。

本発明の表皮機能改善剤における有効成分の選択方法により選択されるＧＡＢＡは公知化合物である。表皮機能改善剤として用いられる場合、単独で用いるほか、通常用いられる各種の美白剤、抗酸化剤、細胞賦活剤、保湿剤、紫外線防止剤など上記の薬効剤から選ばれる薬効剤の一種または二種以上と併用して、皮膚に直接に塗布、貼布または散布する経皮投与する投与方法をとることができる。

＜試験例１＞表皮角化細胞におけるヒアルロン酸産生促進作用
ヒト正常新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、ヒト正常新生児表皮角化細胞増殖用無血清培地（以下ＫＧＭと略す）を用いて培養した後、トリプシン／エチレンジアミン四酢酸（以下ＥＤＴＡと略す）溶液処理により細胞を回収し、２．５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、４８穴培養プレートに５×１０⁴個ずつ播種し、５％ＣＯ₂環境下、３７℃で４日間培養した。４日間培養後培養液を表１に示すＧＡＢＡ含有基礎培地と交換し、培養を続けた。３日間培養後、培養上清を採取し、培養上清中のヒアルロン酸濃度を測定した。

培養上清中のヒアルロン酸濃度はヒアルロン酸結合タンパク質（ＨＡＢＰ）を利用したサンドイッチバインディングアッセイ法により測定した。ＧＡＢＡを添加していない対照例の培養液中のヒアルロン酸濃度も同時に測定した。ＧＡＢＡ無添加培養液中のヒアルロン酸濃度を１００としたときのＧＡＢＡ添加により誘導されたヒアルロン酸濃度を表１に併せて示す。

表１に示すように、ヒアルロン酸産生量はＧＡＢＡを添加することによって有意に促進された。また、試験例においては細胞に損傷を与えるようなことはなく、安全性も極めて高いものであった。ＧＡＢＡが効果を示す細胞環境濃度は少なくとも０．３８μｇ／ｍＬであった。

＜試験例２＞表皮角化細胞におけるインボルクリン産生促進作用ヒト正常新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、ヒト正常新生児表皮角化細胞増殖用無血清培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液処理により細胞を回収し、１×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、４８穴培養プレートに２×１０⁴個ずつ播種し、５％ＣＯ₂環境下、３７℃で２４時間培養した。培養終了後、ＧＡＢＡを表２に示す濃度で４８時間培養した。培養終了後、培地を抜き、細胞を培養プレートに固定させ、細胞表面に発現したインボルクリンの量をモノクローナル抗ヒトインボルクリン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法を用いてインボルクリン産生量を定量した。ＧＡＢＡ無添加（対照）を１００としたときのインボルクリン産生量を表２に併せて示す。

表２に示すように、インボルクリン産生はＧＡＢＡを添加することによって有意に促進された。また、試験例においては細胞に損傷を与えるようなことはなく、安全性も極めて高いものであった。ヒアルロン酸産生が有意に促進されるＧＡＢＡ３．４μｇ／ｍＬ添加ではインボルクリン産生の促進に有意差は認められなかったが、それよりも高濃度である１２．５μｇ／ｍＬ添加および５０μｇ／ｍＬ添加の細胞環境濃度ではＧＡＢＡが効果を示した。

試験例１、２の結果から明らかな通り、ＧＡＢＡはヒアルロン酸産生促進効果を発揮する作用濃度がインボルクリン産生促進効果を発揮する作用濃度より低濃度となる物質である。

次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。なお、配合量はすべて質量％である。

＜実施例１、比較例１＞
表３中の成分（１）〜（６）と、全量が１００％となる成分（１１）精製水を加え混合した後成分（７）を加えて中和し、ホモミキサーで均一に分散した後、成分（８）〜（１０）を混合したものを添加し、さらによく分散して増粘乳化製剤を得た。比較例１も同様に調製した。得られた増粘乳化製剤を、綿１００％の水流絡合不織布（目付６０ｇ／ｍ²）に含浸させた。含浸量としては、フェイスマスク１枚（半顔分）約１８０ｃｍ²に１０ｇを含浸させた。

上記の実施例１、及び比較例１について使用試験等を行って効果を比較した。使用試験は３０〜４０代の女性パネラー各１０名ずつに上記実施例１、比較例１の不織布含浸組成物を、夜、洗顔後の顔面左右に１５分間使用、以後２日空け３日に１回、全１０回連続して使用した。パネラーに使用性、及び直後、翌日の肌状態を総合評価してもらった。実施例１と比較例１の使用性の評価結果を表３に、また使用試験終了翌日の肌の状態について、常法に従い表皮水分量、ＴＥＷＬ、キメの観察を行なった結果を表３に示す。

表皮角化細胞に対しヒアルロン酸産生促進効果とインボルクリン産生促進効果とを併せ持ち、ヒアルロン酸産生促進効果を発揮する作用濃度がインボルクリン産生促進効果を発揮する作用濃度より低濃度であるＧＡＢＡを配合した不織布含浸組成物は、皮膚のうるおい、キメ、バリア機能の改善に有効であった。

Claims (2)

1. 表皮角化細胞に対しヒアルロン酸産生促進効果とインボルクリン産生促進効果とを併せ持つ物質を含有する表皮機能改善剤であって、前記物質が、ヒアルロン酸産生促進効果を発揮する作用濃度がインボルクリン産生促進効果を発揮する作用濃度より低濃度となる物質であることを特徴とする表皮機能改善剤。
2. 表皮角化細胞に対しヒアルロン酸産生促進効果とインボルクリン産生促進効果とを併せ持つ物質が、γ−アミノ酪酸であることを特徴とする請求項１記載の表皮機能改善剤。