JP2012149092A - Ｔｏｌｌ様受容体３アンタゴニスト、方法および使用 - Google Patents

Abstract

【課題】 Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）が媒介する疾患または症状を治療できる活性成分を提供する。
【解決手段】 ＴＬＲ３アンタゴニスト、ＴＬＲ３アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメント、および前記のものの作成および使用法を開示する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、ＴＯｌｌ様受容体３（ＴＲＬ３）アンタゴニスト、ＴＲＬ３アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメント、および前記の作成および使用方法に関する。

炎症状態に伴う病状は健康管理における重大な挑戦を表し、そして痛く、衰弱し、そして致死的となり得る。例えば敗血症および敗血症に伴う状態は、米国において年間２８〜５０％の致死率で７５０，０００人以上に影響を与え、２１５，０００人の年間死者を生じる（非特許文献１；非特許文献２）。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病および潰瘍性大腸炎のような他の炎症状態は、米国で１年間に１００万人以上の人々に影響を及ぼしている（非特許文献３）。

慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息および肺感染のような肺機能に影響を及ぼす炎症性の肺状態も米国においてかなりの数の人々に影響を及ぼしている。例えばＣＯＰＤは１０００万人の成人アメリカ人に影響を与え、そして罹患率は上昇している（非特許文献４）。これらの炎症状態に伴う病状、およびこれらの状態の増悪は、重大な健康および経済的打撃を与える。

喘息およびＣＯＰＤのような肺疾患における増悪は、症状の悪化および肺機能の低下を特徴とする。ウイルス感染は多くの肺疾患の増悪に関連し（非特許文献５；非特許文献６）、そして増悪の主要な原因であると考えられている。ウイルス感染後の肺における前炎症性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインの分泌は、種々の肺疾患において炎症応答を促進する重要な段階を表す（非特許文献７：非特許文献８）。

インスリン抵抗性は、グルコース不耐症（ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、インスリン抵抗性、肥満、高トリグリセリド血症、低ＨＤＬコレテロール、高血圧症、および加速性のアテローム硬化症を含むメタボリックシンドロームの不可欠な特徴として認識されてきた（非特許文献９）。肥満、２型糖尿病およびインスリン抵抗性の間の素因は十分に確立されているが、肥満に伴うインスリン抵抗性および２型糖尿病を制御する分子および細胞のメカニズムは、漠然としたままである。

肥満した個体は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１ｂおよびＩＬ−６のような前炎症性サイトカインの上昇したレベルを示すという事実は、肥満を誘導するインスリン抵抗性が炎症状態であるという仮説を思いつかせる（非特許文献１０）。このように炎症、肥満、インスリン抵抗性および異常な脂質代謝は、メタボリックシンドロームの共通する特徴を構成し得る。実際に、シクロオキシゲナーゼインヒビターのような非ステロイド系薬剤（これはＮＦ−ｋβおよびＩＫＫβのような重要な炎症性転写因子と相互作用することができる）は、２型糖尿病の動物モデルおよびヒト患者においてインスリン感受性を上げる（非特許文献１０）。さらに最近のデータは、骨髄様細胞において、ＩＫＫｂコンディショナルノックアウトマウスが完全な（ｇｌｏｂａｌ）インスリン感受性を表し、そしてインスリン抵抗性に対して保護されるようになる能力、ならびに肝臓でＩＫＫｂを過剰発現するマウスが全身性インスリン抵抗性を発症する能力により示されるように、インスリン抵抗性と炎症との間の結び付きに支持を加える（非特許文献１１；非特許文献１２）。あわせると、これらの結果は肥満、インスリン抵抗性および２型糖尿病を炎症性疾患と結び付けるための強い根本的理由を提供する。

宿主免疫系による微生物抗原の認識は、活性化が炎症応答の開始における重要な段階を表す生来の免疫受容体を介して媒介される。Ｔｏｌｌ−様受容体（ＴＬＲ）は、外来抗原に対する免疫応答の媒介において、決定的な役割を果たす生来の免疫受容体のファミリーを表す。例えばＴＬＲ３は、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡならびに合成ｄｓＲＮＡ類似体ポリ−リボイノシン酸−リボシチジル酸（ポリ（Ｉ；Ｃ））を認識する哺乳動物のパターン認識受容体である（非特許文献１３）。さらにＴＬＲ３は壊死細胞から放出されるｍＲＮＡのような内因性のリガンドを認識することが示され（非特許文献１４）、炎症部位での壊死細胞の死が、ＴＬＲ３の活性化に貢献し得ることを示唆する。

ポリ（Ｉ：Ｃ）による、または内因性ｍＲＮＡリガンドによるＴＬＲ３の活性化は、炎症性サイトカインおよびケモカインの分泌を誘導し、ＴＬＲ３アゴニストが感染に伴う炎症中に疾患の発生をモジュレートすることを示唆することが見いだされた。すなわちインビボでのＴＬＲ３のライゲーションは、ウイルス感染（非特許文献１５）、または壊死に伴う炎症の状況において起こると考えられる（非特許文献１６）。総じて、これらのデータはＴＬＲ３のライゲーションが生来の免疫に貢献すると考えられる数々の炎症性サイトカインの生産を生じるリン酸化および転写活性化反応（ｅｖｅｎｔ）をカスケードを開始することを証明している（非特許文献１７を参照にされたい）。さらにこれらのデータは、持続的なＴＬＲ３の活性化が感染に関連する炎症性疾患のモジュレーションに重要な成分となり得ることを示唆している。公開されたデータは、炎症性サイトカインの過剰生産を全身的な炎症性応答症候群、感染に伴う急性のサイトカイン急性発作（非特許文献１８により総論されている）、および慢性関節リウマチ（非特許文献１９により総説されている）、および炎症性腸疾患（非特許文献２０により総説されている）のような免疫が媒介する慢性状態と関連付ける知見により示されるような仮説を支持する。

インビトロの実験では、ポリ（Ｉ：Ｃ）での肺の上皮細胞の刺激が多くのサイトカイン、ケモカインの分泌および転写因子の分泌を誘起し、そしてＴＬＲの発現を上昇させることが示されたが（非特許文献２１：非特許文献２２）、そのような出来事の生理学的関連性は不明なままである。

このような病状に伴う炎症状態、および感染に伴うその他の状態は、重大な健康および経済的影響を有する。さらに医学の多く分野における進歩にもかかわらず、多くのこれらの状態に関して利用できる処置の選択および治療法は比較的少ない。

例えば肺疾患の増悪は、高用量のコルチコステロイドおよびオマリズマブ（ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）の商品名ＸＯＬＡＩＲ（商標）のような抗−ＩｇＥで処置される。β２アゴニストと組み合わせた吸引コルチコステロイドは、増悪の発生の低下に効果的であることが示された。しかしこれらの治療薬は増悪の発症するリスクを減らすだけであり、そして重要な副作用を伴うので、肺疾患の増悪の防止および処置には代替的治療のモダリティが必要である。

このように炎症状態におけるＴＬＲ３の役割を理解し、そしてこの役割をこれらの状態を効果的に処置するアンタゴニストのような作用物質の開発に活用することが必要である。

Ｎａｔａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２６：１９２７−１９３１，１９９８ Ａｎｇｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２９：１３０３−１３１０，２００１ Ｈａｎａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．３：８１−９２，２００３ Ｍａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｎａｇ．Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ １７：６１−６６，２００４ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１５２：Ｓ４６−５２，１９９５ Ｂａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：６９−７５，２００３ Ｇｅｒｎ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：７３１−７３７，２００３ Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｕｌｍ．Ｍｅｄ．９：１０４−１１０，２００３ Ｗｉｓｓｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１５：２７９２−８００，２００４ Ｋａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．３：１７−２６，２００４ Ａｒｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：１９１−１９８，２００５ Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：１８３−９０，２００５ Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１３：７３２−２３８，２００１ Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６：１２５４２−１２５５０，２００４ Ｔａｂｅｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：３５１６−３５２１，２００４ Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６：１２５４２−１２５５０，２００４ Ｔａｋｅｄａ ａｎｄ Ａｋｉｒａ，Ｊ．Ｄｅｒｍ．Ｓｃｉ．３４：７３−８２，２００４ Ｖａｎ Ａｍｅｒｓｆｏｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１６：３７９−４１４，２００３ Ｍｉｏｓｓｅｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１６：２１８−２２２，２００４ Ｏｇａｔａ ａｎｄ Ｈｉｂｉ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．９：１１０７−１１１３，２００３ Ｉｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ ３４：７４５−５２，２００４ Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３５８−６４，２００４

本発明の１つの態様は、ＲＡＮＴＥＳの細胞生産を阻害するＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）のアンタゴニストである。

本発明の別の態様は、配列番号９、１１および１３に示す重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、および配列番号１９、２１および２３に示す軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を含んでなるモノクローナル抗体の抗原結合能力を有するＴＬＲ３と反応性の単離された抗体である。

本発明の別の態様は、配列番号９、１１および１３に示す重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、および配列番号１９、２１および２３に示す軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を含んでなるＴＬＲ３と反応性の単離された抗体である。

本発明の別の態様は、式（Ｉ）：
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｘａａ_１ Ｈｉｓ
（Ｉ）
式中、Ｘａａ_１はＩｌｅまたはＭｅｔである
で示されるＶ_ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号６１）；
式（ＩＩ）：
Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｓｎ
Ｘａａ_２ Ｘａａ_３ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｘａａ_４ Ｌｙｓ Ｔｈｒ
（ＩＩ）
式中、Ｘａａ_２はＴｙｒまたはＧｌｙであり、Ｘａａ_３はＡｓｎまたはＡｌａであり、そしてＸａａ_４はＰｈｅまたはＧｌｙである、
で示されるＶ_Ｈ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号６２）；および
式（ＩＩＩ）：
Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｘａａ_５ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｔｙｒ。
（ＩＩＩ）
式中、Ｘａａ_５はＭｅｔまたはＩｌｅである、
で示されるＶ_Ｈ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号６３）；
および配列番号１９、２１および２３に示されるアミノ酸配列を有するＶ_Ｌ ＣＤＲ、を有する単離された抗体である。

本発明の別の観点は、配列番号９、１１および１３に示されるＣＤＲアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドである。

本発明の別の観点は、配列番号１９、２１および２３に示されるＣＤＲアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドである。

本発明の別の観点は、配列番号６、２５、２７、２９、３１、４５、４７、４９、５１または５３に示されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドである。

本発明の別の観点は、配列番号１６、３３、３５、３７または３９に示されるアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドである。

本発明の別の観点は、炎症状態を処置または防止する方法であり、この方法は治療に有効量のＴＬＲ３アンタゴニストをそれが必要な患者に炎症状態を処置または防止するために十分な時間、投与することを含んでなる。

本発明の別の観点は、細胞の増殖率を上げる方法であり、この方法はＴＬＲ３アンタゴニストを、ＴＬＲ３受容体を発現する細胞と細胞の増殖率を上げるために十分な時間接触させることを含んでなる。

発明の詳細な説明
限定するわけではないが本明細書に引用する特許および特許出願を含めすべての刊行物は、完全な説明を通して参照により本明細書に編入する。

本明細書で使用する用語「アンタゴニスト」は、任意のメカニズムにより受容体のような別の分子の効果を一部または完全に阻害する分子を意味する。本明細書で使用する「ＴＬＲ３アンタゴニスト」または「ＴＬＲ３と反応性の」化合物は、ＴＬＲ３の生物活性またはＴＬＲ３受容体の活性化を直接的または間接的に、実質的に対抗し、減少させ、または阻害することができる分子を記載する。そのようなアンタゴニストは例えば、低有機分子、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、抗体フラグメント、ミメティボディまたはポリヌクレオチドであることができる。

本明細書で使用する用語「抗体」は広い概念を意味し、そしてポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒトに適合した、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、および抗体フラグメントを含め、免疫グロブリンまたは抗体分子を含む。

一般に、抗体は特異的抗原への結合特異性を表すタンパク質またはペプチド鎖である。完全な抗体は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖からなるヘテロ四量体の糖タンパク質である。典型的には、各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に連結され、一方、多数のジスルフィド結合は種々を免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。各重鎖および軽鎖も、規則的に間隔が空いた鎖内ジスルフィド橋を有する。各重鎖は１つの末端に可変性ドメイン（Ｖ_Ｈ）、続いて多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は１つの末端に可変性ドメイン（Ｖ_Ｌ）を、そしてそのもう１つの末端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１定常ドメインと並び、そして軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並ぶ。任意の脊椎動物種の抗体軽鎖は、２つの明確に異なる型の１つ、すなわちカッパ（κ）およびラムダ（λ）に、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき割り当てることができる。

免疫グロブリンは、５つの主要クラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に基づき割り当てることができる。ＩｇＡおよびＩｇＧはさらにアイソタイプＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３およびＩｇＧ_４と細分される。

用語「抗体フラグメント」とは完全な抗体の一部、一般に完全な抗体の抗原結合または可変領域を意味する。抗原フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖフラグメント、ダイアボディ、単鎖抗体分子および少なくとも２つの完全な抗体から形成された多重特異的抗体を含む。

本明細書で使用する用語「抗原」は、直接的または間接的のいずれかで抗体を生成する能力を有する任意の分子を意味する（あるいは免疫原と呼ばれる）。「抗原」の定義に含まれるのは、タンパク質をコードする核酸である。

「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列と定義される。例えばＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，免疫学的に興味深いタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第４版、米国 保健福祉省、国立衛生研究所（１９８７）を参照にされたい。免疫グロブリンの可変部分には３つの重鎖および３つの軽鎖ＣＤＲまたはＣＤＲ領域がある。すなわち本明細書で使用する「ＣＤＲ」は、すべての３種の重鎖ＣＤＲ、またはすべての３種の軽鎖ＣＤＲ、または適切ならばすべての重鎖およびすべての軽鎖ＣＤＲを指す。

ＣＤＲは抗体を抗原またはエピトープへ結合させるための接触残基の大部分を提供する。本発明の目的のＣＤＲは、供与体抗体の可変重鎖および軽鎖配列から誘導され、そして自然に存在するＣＤＲの類似体を含み、その類似体もそれらが誘導される供与体抗体と同
じ抗原結合特異性および／または中和能力を共有または保有する。

本明細書で使用する用語「上皮細胞」は、動物の自由な（ｆｒｅｅ）表面（例えば皮膚）または管もしくは腔（例えば結腸）の内張りの一部を覆う膜様の細胞組織に由来する細胞を意味する。そのような細胞は組織、器官またはこれらのインビトロモデルで見いだされるもののような、より高度に組織化された細胞群から単離されるか、または一部を含んでなることができる。

用語「相同体」は、参照する配列と４０％から１００％の間の配列同一性を有するタンパク質配列を意味する。ｈＴＬＲ３の相同体には、既知のｈＴＬＲ３配列と４０％から１００％の間の配列同一性を有する他の種に由来するポリペプチドを含む。２つのペプチド鎖間の同一性のパーセントは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｖ．９．０．０（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｄｅｎ Ｃｏｒｐ）、カールスバット、カナダ）のＡｌｉｇｎＸモジュールのデフォルト設定を使用して、対合様式の配列により測定することができる。「ＴＬＲ３」は、ｈＴＬＲ３およびその相同体を意味する。完全長のヒトＴＬＲ３のアミノ酸配列およびコードするポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１および２に示す。

本明細書で使用する用語「組み合わせて」とは、記載する作用物質が、動物に混合物中で一緒に、単一の作用物質として同時に、あるいは単一の作用物質を任意の順序で順次に投与することができることを意味する。

本明細書で使用する用語「炎症状態」とは、一部がサイトカイン、ケモカインまたは炎症性細胞（例えば好中球、単球およびリンパ球）の活性により媒介される細胞の損傷に対する局所的応答を意味し、これはほとんどの場合、疼痛、紅赤、腫張および組織機能の損失を特徴とする。本明細書で使用する用語「炎症性の肺状態」とは、肺に影響を及ぼす、または関連する炎症状態を意味する。

本明細書で使用する用語「ミメティボディ」は、一般式（Ｉ）：
（Ｖ１−Ｐｅｐ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３）（ｔ）
（Ｉ）
を有するタンパク質を意味し、式中、Ｖ１は免疫グロブリン可変領域のＮ−末端の一部であり、Ｐｅｐは細胞表面のＴＬＲ３に結合するポリペプチドであり、Ｌｋはポリペプチドまたは化学的結合であり、Ｖ２は免疫グロブリン可変領域のＣ−末端の一部であり、Ｈｇは免疫グロブリンはヒンジ領域の一部であり、Ｃ_Ｈ２は免疫グロブリン重鎖Ｃ_Ｈ２定常領域であり、そしてＣ_Ｈ３は免疫グロブリン重鎖Ｃ_Ｈ３定常領域であり、そしてｔは独立して１から１０の整数である。ミメティボディは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥのような種々の型の免疫グロブリン分子の特性および機能を、構築物中に存在する重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に依存して模することができる。幾つかのミメティボディの態様では、Ｖ１が不存在であり得る。本発明のミメティボディアンタゴニストは、細胞表面のＴＬＲ３への結合を介してＴＬＲ３の生物学的活性に影響を及ぼす。

本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、実質的に均一な抗体の集団から得た抗体（または抗体フラグメント）を意味する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、典型的には単一の抗原決定基に対して向けられている。モデファイヤー（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な特性を示し、そして任意の特定の方法による抗体の生産を必要としない。例えばマウスｍＡｂはＫｏｈｌｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）のハイブリドーマ法により作成することができる。供与体抗体（多くはマウス）の軽鎖および重鎖可変領域を、受容体抗体（多くはヒトのような別の哺乳動物種）に由来する軽鎖および重鎖定常領域
と一緒に含有するキメラｍＡｂは、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に開示されている方法により調製することができる。非ヒト供与体の免疫グロブリン（多くはマウス）に由来するＣＤＲを有し、そして分子の残る免疫グロブリンに由来する部分は１もしくは複数のヒト免疫グロブリンに由来するヒトに適合したｍＡｂは、米国特許第５，２２５，５３９号明細書に開示されているように当業者に知られている技法により調製することができる。場合によりヒトに適合したｍＡｂは、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：１００２９−１００３２（１９８９）、およびＨｏｄｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４２１（１９９１）に開示されたような技術により、結合親和性を保存するために改変された骨格を支持する残基を包含することによりさらに修飾することができる。

ヒトに適合させるために有用なヒト骨格配列の例は、例えば
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ； ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ； ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ．ｐｈｐ； ｗｗｗ．ｋａｂａｔｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ／ｔｏｐ．ｈｔｍｌ； ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ｋａｂａｔ；
ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ； ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ； ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ； ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ〜ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ； ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ； ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ； ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ〜ｍｒｃ７／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ； ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ； ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ； ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ〜ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ； ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ； ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ； ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃ．ｊｐ〜ｙａｓｕｈｉｔｏ／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ； ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ；
ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｕｋ．ｏｒｇ； ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ； ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ； ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ〜ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓ１．ｈｔｍｌ； ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ； ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ； ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ； ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ； ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ； ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ〜ｕｂｃｇ０７ｓ； ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍｌ； ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ〜ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ； ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ； ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ； ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ； ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ； およびＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，免疫学的に興味深いタンパク質の配列、米国保健省（１９８７）に開示され、これらは全部、参照により本明細書に編入する。

いかなる非ヒト配列も含まない完全なヒトｍＡｂは、ヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスから、例えばＬｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１（１９９６）およびＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）を参照とした
技法により調製することができる。またヒトｍＡｂは、例えばＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６（２０００）およびＫｒｅｂｓ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：６７−８４（２００１）を参照にした技法によりファージディスプレイライブラリーから調製し、そして至適化することができる。

本明細書で使用する用語「増殖率」とは、単位時間あたりの細胞数の変化、または単位時間あたりに細胞サイクルを通して細胞分裂に向かう進行のマーカーを現す細胞数の変化を指す。そのようなマーカーは形態学的でよく、ＤＮＡ複製の指標または発現された遺伝子産物でよい。

本明細書で使用する用語「ＴＬＲ３の生物活性」または「ＴＬＲ３受容体の活性化」は、細胞表面のＴＬＲ３に結合するリガンドの結果として生じる任意の活性を指す。

従来の１もしくは３文字アミノ酸暗号を以下のように本明細書では使用する：
アミノ酸 ３文字暗号 １文字暗号
アラニン ａｌａ Ａ
アルギニン ａｒｇ Ｒ
アスパラギン ａｓｎ Ｎ
アスパルテート ａｓｐ Ｄ
システイン ｃｙｓ Ｃ
グルタメート ｇｌｕ Ｅ
グルタミン ｇｌｎ Ｑ
グリシン ｇｌｙ Ｇ
ヒスチジン ｈｉｓ Ｈ
イソロイシン ｉｌｅ Ｉ
ロイシン ｌｅｕ Ｌ
リシン ｌｙｓ Ｋ
メチオニン ｍｅｔ Ｍ
フェニルアラニン ｐｈｅ Ｆ
プロリン ｐｒｏ Ｐ
セリン ｓｅｒ Ｓ
トレオニン ｔｈｒ Ｔ
トリプトファン ｔｒｐ Ｗ
チロシン ｔｙｒ Ｙ
バリン ｖａｌ Ｖ

主題の組成物
本発明は、ＴＬＲ３受容体が媒介するシグナリングを阻害することができるアンタゴニスト、およびそのようなアンタゴニストの使用に関する。そのようなＴＬＲ３アンタゴニストはＴＬＲ３受容体に結合し、そしてＴＬＲ３受容体が媒介するシグナリングを阻害する特性を有することができる。そのようなアンタゴニストにより阻害され得るＴＬＲ３シグナリングによるメカニズムの例には、キナーゼ活性の阻害、転写の減少または受容体アタゴニスト作用がある。他のメカニズムによりＴＬＲ３受容体が媒介するシグナリングを阻害することができる他のアンタゴニストも本発明の種々の観点および態様の範囲内である。これらのアンタゴニストは、研究試薬、診断試薬および治療薬として有用である。

本発明の１つの観点は、ＲＡＮＴＥＳ（活性化について調節された、正常Ｔ細胞発現型および分泌型：Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｄ）サイトカインの細胞生産を
阻害するＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）のアンタゴニストである。本発明の別の観点は、ＲＡＮＴＥＳおよびインターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）およびマクロファージ炎症タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ１−アルァ）からなる群から選択されるサイトカインの細胞生産を阻害するＴＬＲ３のアンタゴニストである。

別の観点では、本発明は配列番号９（Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１）、１１（Ｖ_Ｈ ＣＤＲ２）および１３（Ｖ_Ｈ ＣＤＲ３）に示す重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、および配列番号１９（Ｖ_Ｌ ＣＤＲ１）、２１（Ｖ_Ｌ ＣＤＲ２）および２３（Ｖ_Ｌ ＣＤＲ３）に示す軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体の抗原結合能力を有するＴＬＲ３と反応性の単離された抗体を提供する。抗体の例は、配列番号９、１１および１３に示す重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列、および配列番号１９、２１および２３に示す軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を含んでなるモノクローナル抗体である。

本発明の別の観点は、配列番号６に示すアミノ酸配列を有するＶ_Ｈ、および配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するＶ_Ｌを含んでなるＴＬＲ３と反応性の単離された抗体である。

本発明の別の観点は、本発明の抗体または他のタンパク質ＴＬＲ３アンタゴニストをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはその相補鎖である。特定の例のポリヌクレオチドを本明細書で開示するが、遺伝子暗号の縮重または所定の発現系における暗号の優先性（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を仮定して、本発明の抗体または他のタンパク質ＴＬＲ３アンタゴニストをコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内にある。

本発明の別の観点は、配列番号９、１１および１３に示されるＣＤＲアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖である。

本発明の別の観点は、配列番号１９、２１および２３に示されるＣＤＲアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドである。

本発明の別の観点は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチド配列の例は配列番号５に示される。

本発明の別の観点は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチド配列の例は配列番号１５に示される。

本発明の別の観点は、配列番号２５、２７、２９または３１に示されるＶ_Ｈアミノ酸配列、および配列番号３３、３５、３７または３９に示されるＶ_Ｌアミノ酸配列を含んでなるヒトに適合したｍＡｂである。配列番号２５、２７、２９および３１に示されるＶ_Ｈアミノ酸配列、および配列番号３３、３５、３７および３９に示されるＶ_Ｌアミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチドも、本発明の観点である。これらのヒトに適合したｍＡｂは、配列番号９、１１および１３に示されるＶ_Ｈ ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号１９、２１および２３に示されるＶ_Ｌ ＣＤＲアミノ酸配列を含んでなる。配列番号２５、２７、２９および３１のＶ_Ｈアミノ酸配列をコードする核酸配列の例は、配列番号２６、２８、３０および３２にそれぞれ示される。配列番号３３、３５、３７および３９のＶ_Ｌアミノ酸配列をコードする核酸配列の例は、配列番号３４、３６、３８および４０にそれぞれ示される。本発明のヒトに適合したモノクローナル抗体の１つの特定の態様は配列番号２５に示すＶ_Ｈアミノ酸配列、および配列番号３３に示されるＶ_Ｌアミノ酸配列を含んでなる。

本発明の別の態様は、式（Ｉ）：
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｘａａ_１ Ｈｉｓ
（Ｉ）
式中、Ｘａａ_１はＩｌｅまたはＭｅｔである
で示されるＶ_Ｈ ＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号６１）；
式（ＩＩ）：
Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｓｎ
Ｘａａ_２ Ｘａａ_３ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｘａａ_４ Ｌｙｓ Ｔｈｒ
（ＩＩ）
式中、Ｘａａ_２はＴｙｒまたはＧｌｙであり、Ｘａａ_３はＡｓｎまたはＡｌａであり、そしてＸａａ_４はＰｈｅまたはＧｌｙである、
で示されるＶ_Ｈ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号６２）；および
式（ＩＩＩ）：
Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｘａａ_５ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｔｙｒ
（ＩＩＩ）
式中、Ｘａａ_５はＭｅｔまたはＩｌｅである、
で示されるＶ_Ｈ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号６３）；
および配列番号１９、２１および２３に示されるアミノ酸配列を有するＶ_Ｌ ＣＤＲ、を有する単離された抗体である。

例となる種には、配列番号３３に示されるＶ_Ｌアミノ酸配列、および式（Ｉ）のＶ_Ｌ−ＣＤＲ１を含んでなるＶ_Ｈアミノ酸配列を有する抗体を含み、式中、Ｘａａ_１がＭｅｔであり、そしてＶ_Ｌ−ＣＤＲ２およびＶ_Ｌ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１１および１３に示される（配列番号４５、例示の核酸は配列番号４６に示されている）。この種ではＸａａ_１がＭｅｔであり、；Ｘａａ_２がＴｙｒであり；Ｘａａ_３がＡｓｎであり；Ｘａａ_４がＰｈｅであり；そしてＸａａ_５がＭｅｔである。

別の例となる種には、配列番号３３に示されるＶ_Ｌアミノ酸配列、および配列番号９および１３にそれぞれ示されるＶ_Ｈ−ＣＤＲ１およびＶ_Ｈ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列、および式（ＩＩ）：
式中、Ｘａａ_２がＧｌｙであり、Ｘａａ_３がＡｓｎであり、そしてＸａａ_４がＰｈｅである（配列番号４７；例示の核酸配列は配列番号４８に示される）；
Ｘａａ_２がＴｙｒであり、Ｘａａ_３がＡｌａであり、そしてＸａａ_４がＰｈｅである（配列番号４９；例示の核酸配列は配列番号５０に示される）；および
Ｘａａ_２がＴｙｒであり、Ｘａａ_３がＡｓｎであり、そしてＸａａ_４がＧｌｙである（配列番号５１、例示の核酸配列は配列番号５２に示される）
のＶ_Ｈ−ＣＤＲ２を含んでなるＶ_Ｈアミノ酸配列、
を有する抗体を含む。

別の例となる種には、配列番号３３に示されるＶ_Ｌアミノ酸配列、および配列番号９および１１にそれぞれ示すようなＶ_Ｈ−ＣＤＲ１およびＶ_Ｈ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および式（ＩＩＩ）のＶ_Ｈ−ＣＤＲ３（式中、Ｘａａ_５がＩｌｅである）のＶ_Ｈ−ＣＤＲ３を含んでなるＶ_Ｈアミノ酸配列を有する抗体を含む（配列番号５３、例示の核酸配列は配列番号５４に示されている）。

まとめると、例となる種には以下のＶ_ＬおよびＶ_Ｈアミノ酸配列の組み合わせの１つを有する抗体を含む：
Ｖ _Ｌ 配列番号： Ｖ _Ｈ 配列番号：
３３ ４５
３３ ４７
３３ ４９
３３ ５１
３３ ５３

本発明はさらにＶ_Ｈが配列番号４５、４７、４９、５１または５３に示されるアミノ酸配列を有し、そしてＶ_Ｌが配列番号３３、３５、３７または３９に示されるアミノ酸配列を有する単離された抗体を含む。

抗体アンタゴニストの例は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＧＡまたはＩｇＭアイソタイプの抗体であることができる。さらに、そのようなアンタゴニスト抗体は、グリコシル化、イソメリゼーション、脱グリコシル化または自然には起こらないポリエチレングリコール部分の付加（ペギレーション：ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）のような共有的修飾および脂質化のようなプロセスにより翻訳後に修飾され得る。そのような修飾はインビボまたはインビトロで起こり得る。例えば本発明の抗体はポリエチレングリコールに結合させて（ＰＥＧ化：ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）、それらの薬物動態学的プロファイルを改善することができる。結合は当業者に知られている技法により行うことができる。ＰＥＧを用いた治療用抗体の結合は、薬物動態を強化するが機能は妨害しないことが示された。Ｄｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８７：３８２−３９０，２０００；Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ １５：４０９−４１８，２００４；Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６：１０６−１１９，２００１；およびＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１６；７６１−７７０、２００３を参照にされたい。

本発明の抗体の薬物動態学的特性は、当業者に知られている技術によりＦｃ修飾を介して強化することもできる。例えばＩｇＧ４アイソタイプ重鎖は、重鎖間または内のいずれかのジスルフィド結合を形成することができるそれらのヒンジ領域中のＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（ＣＰＳＣ）モチーフを含み、すなわちＣＰＳＣモチーフ中の２つのＣｙｓ残基は、他の重鎖中の対応するＣｙｓ残基とジスルフィド結合することができ（重鎖間）、または所定のＣＰＳＣモチーフ内の２つのＣｙｓ残基が互いにジスルフィド結合することができる（重鎖内）。インビボのイソメラーゼ酵素はＩｇＧ４分子の重鎖内結合を重鎖間結合に、またはその逆に転換することができると考えられる（Ａａｌｂｅｒｓｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０５：９−１９，２００２）。したがってこのようなＩｇＧ４分子内の重：軽鎖（ＨＬ）対のヒンジ領域中の重鎖内結合との対は互いに共有的に会合していないので、それらはＨＬモノマーに解離することができ、それは次いで他のＩｇＧ４分子に由来するＨＬモノマーと再会合し、二重特異的なヘテロ二量体のＩｇＧ４分子を形成する。二重特異的ＩｇＧ抗体では、抗体分子の２つのＦａｂがそれらが結合するエピトープで異なる。ＩｇＧ４のヒンジ領域のＳｅｒ２２８をＰｒｏに置き換えて「ＩｇＧ１様の挙動」を生じ、すなわち分子が重鎖間で安定なジスルフィド結合を形成し、したがって他のＩｇＧ４分子とＨＬ交換することはできない。１つの態様では、本発明の抗体はＳ２２８Ｐ突然変異を有するＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含んでなる。

さらに本発明の抗体中のＦｃＲｎ救済（ｓａｌｖａｇｅ）受容体以外のＦｃ受容体への結合に影響を及ぼす部位を除去することができる。例えばＡＤＣＣ活性に関与するＦｃ受容体は、本発明の抗体から除去することができる。例えばＩｇＧ１のヒンジ領域のＬｅｕ２３４／Ｌｅｕ２３５のＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａへの、またはＩｇＧ４のヒンジ領域のＰｈｅ２３４／Ｌｅｕ２３５のＰ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａへの突然変異は、ＦｃＲ結合を最少とし、そして免疫グロブリンが補体依存的な細胞傷害性およびＡＤＣＣを媒介する能力を
減らす。１つの態様では、本発明の抗体はＰ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変を含むＩｇＧ４
Ｆｃドメインを含んでなる。

本発明の別の態様では、抗体はＳ１０８Ｐ、Ｐ１１４ＡおよびＬ１１５Ａ突然変異を有するＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含んでなり、Ｆｃドメインは配列番号４１に示すアミノ酸配列を有する。配列番号４１をコードする核酸配列の例は、配列番号４２に示されている。完全長のＩｇＧ４重鎖では、突然変異の座標はＳ２２８Ｐ、Ｐ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。

完全にヒトの、ヒトに適合した、ヒト化および親和性が成熟した（ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｍａｔｕｒｅｄ）抗体分子または抗体フラグメントは、ミメティボディ、融合タンパク質およびキメラタンパク質として本発明の範囲内にある。

本発明のアンタゴニストは、ＴＬＲ３と約１０^−７、１０^−８、１０^−９、１０^−１０、１０^−１１または１０^−１２Ｍ以下のＫ_ｄで結合することができる。所定の分子のｈＴＬＲ３のようなＴＬＲ３受容体に対する親和性は、任意の適切な方法を使用して実験的に決定することができる。そのような方法は、当業者に知られているＢｉａｃｏｒｅまたはＫｉｎＥｘＡ装置、ＥＬＩＳＡまたは競合的結合アッセイを利用することができる。

所望する親和性で所定のＴＬＲ３相同体と結合するアンタゴニスト分子は、抗体親和性成熟を含む技術、および非抗体分子に適切な他の技術的に知られている技法によりバリアントまたはフラグメントのライブラリーから選択することができる。

本発明の別の態様は、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなるベクターである。そのようなベクターはプラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾンに基づくベクター、または本発明のポリヌクレオチドを所定の生物または遺伝的バックグラウンドに任意の手段で導入するために適する他のベクターでよい。

本発明の別の態様は、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および配列番号１９、配列番号２１および配列番号２３を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのような本発明の任意のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞である。他の宿主細胞の例は、配列番号２５、２７、２９、３１、４５、４７、４９、５１または５３の１つを含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および配列番号３３、３５、３７または３９を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる。そのような宿主細胞は真核細胞、細菌細胞、植物細胞または古細菌（ａｒｃｈｅａｌ）細胞でよい。真核細胞の例は、哺乳動物、昆虫、鳥類または他の動物起源でよい。哺乳動物の真核細胞には、ＳＰ２／０（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、マナッサス、バージニア州、ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（ヨーロピアンコレクションオブセルカルチャー（ＥＣＡＣＣ）、ソールズベリー、ウィルトショア、英国、ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６４６）およびＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株を初めとするハイブリドーマまたはミエローマ細胞株のような不死化細胞株を含む。ヒトミエローマ細胞株の例は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。他の有用な細胞株には、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−６１）のようなチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＤＧ４４に由来するものを含む。

本発明の別の態様は、本発明の宿主細胞を培養し、そして宿主細胞により生産される抗体を回収することを含んでなるＴＬＲ３と反応性の抗体の作成法である。そのような抗体は、以下の配列番号６および１６にそれぞれ示されるような重および軽アミノ酸配列を含んでなるｍＡｂ１０６８、または配列番号２５、２７、２９、３１、４５、４７、４９、
５１または５３に示される重鎖アミノ酸配列、および配列番号３３、３５、３７または３９に示される軽鎖アミノ酸配列を含んでなるｍＡｂ１０６８のヒト適合化、もしくはヒトに適合したＣＤＲバリアントに例示されるＴＬＲ３アンタゴニスト抗体であり得る。

本発明の別の態様は、本発明の抗体を生産するハイブリドーマ細胞株である。

処置法
本発明はＴＬＲ３活性の弱化（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）が望ましい状態を防止し、そして処置する方法を提供する。ＴＬＲ３アンタゴニストで処置または防止することができる状態には、サイトカインにより媒介される状態、およびＴＬＲ３の活性化またはＴＬＲ３経路を介するシグナリングから全部または一部生じる状態を含む。本発明はＲＡＮＴＥＳまたはＩＬ−６、ＩＬ−８もしくはＭＩＰ１−アルファと一緒にＲＡＮＴＥＳの細胞生産を阻害する方法を含み、この方法は本明細書に開示する単離された抗体のようなＴＬＲ３アンタゴニストを、ＴＬＲ３受容体を発現する細胞と、これらのサイトカインの生産を阻害するために十分な時間、接触させることを含んでなる。

本発明の方法は任意の分類に属する動物患者を処置するために使用することができる。そのような動物の例にはヒト、齧歯類、イヌ、ネコおよび家畜動物のような哺乳動物、ならびに鳥、爬虫類および魚のような他の動物種を含む。いかなる特定の理論とも結び付けられることを望まないが、ＴＬＲ３アンタゴニストの治療的利益は、そのようなアンタゴニストが幾つかの炎症状態に関与する炎症性ケモカインおよびサイトカインの分泌を阻害する能力によると考えられている。またＴＬＲ３アンタゴニストの治療的利益は、そのようなアンタゴニストが細胞増殖を上げ、すなわち組織修復を促進する能力によるとも考えられている。

例えば本発明の方法は、患者の炎症状態を処置または防止し、そして組織修復（外傷後の創傷または火傷の治癒のような）を促進するために有用である。さらに本発明の方法はインビトロで細胞密度も提供する。

任意のＴＬＲ３アンタゴニストを本発明の防止および処置法に使用することができる。１例として本明細書に開示する任意の単離された抗体は、炎症状態の処置または防止、あるいは組織修復の促進にＴＬＲ３アンタゴニストとして有用である。特に、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３に示すＶ_Ｈ ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号１９、配列番号２１および配列番号２３に示すＶ_Ｌ ＣＤＲアミノ酸配列を含んでなるモノクローナル抗体の抗原結合能を有するＴＬＲ３と反応性の単離された抗体は有用である。他の有用な抗体は配列番号２５、２７、２９、３１、４５、４７、４９、５１または５３に示されるアミノ酸配列を有するＶ_Ｈ、および配列番号３３、３５、３７または３９に示すアミノ酸配列を有するＶ_Ｌを含んでなる。

所定の炎症状態を処置または防止するために十分な所定のＴＬＲ３アンタゴニストの量は、容易に決定できる。本発明の方法では、ＴＬＲ３アンタゴニストは単一で、または少なくとも１つの他の分子と組み合わせて投与され得る。そのようなさらなる分子は他のＴＬＲ３アンタゴニスト分子またはＴＬＲ３受容体シグナリングにより媒介されない治療的利益を有する他の分子でよい。抗生物質、抗ウイルス薬、緩和剤、およびサイトカインレベルまたは活性を下げる他の化合物は、そのようなさらなる分子の例である。

炎症状態を処置し、または防止する方法の別の態様では、ＴＬＲ３活性がＴＬＲ３遺伝子発現を阻害することより減少される。ＴＬＲ３遺伝子発現は、ＴＬＲ３媒介シグナリングを阻害するために、ＴＬＲ３の生物活性の発現を下げる任意の手段により阻害することができる。そのような手段には、例えばゲノムＤＮＡを不活性化する組換えを介する遺伝
子の不活性化（例えば遺伝子ノックアウト、プロモーターハイジャキングまたは他の遺伝子突然変異誘発法）、および遺伝子転写の不活性化（例えばＲＮＡのサイレンシングまたはアンチセンスＲＮＡ）を含む。当業者は、活性なＴＬＲ３の発現を下げるための多くの他の手段を認識している。

このように本発明の観点は、治療に有効な量のＴＬＲ３アンタゴニストをそれが必要な患者に、炎症状態を処置または防止するために十分な時間投与することを含んでなる、炎症状態の処置法または防止法である。

そのような炎症状態の１例は敗血症に伴う状態である。敗血症は感染に対する全身的応答であり、これは重篤な場合には臓器不全および死を引き起こす。敗血症は医学的にはウイルス、細菌、真菌または寄生生物感染から生じる全身性の炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）と定義されている。ウイルス、細菌、真菌または寄生生物感染により、および壊死細胞により放出されるｄｓＲＮＡは、敗血症の発生に貢献し得る。敗血症に伴う状態にはＳＩＲＳ、敗血症ショックまたは多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）が含まれ得る。いかなる理論とも結び付けられることを望まないが、ＴＬＲ３アンタゴニストを用いた処置は、敗血症に伴う炎症状態に罹患している患者の生存時間を延ばし、または局所的な炎症反応（例えば脚）が全身状態へと広がることを防ぐことにより、生来の抗微生物活性を強化することにより、抗微生物剤と組み合わせた時に相乗的活性を示すことにより、病気に貢献する局所的炎症状態を最少にすることにより、あるいは前記の任意の組み合わせにより治療的利益を提供することができると考えられている。そのような介入は、患者の生存を確実とするために必要なさらなる処置（例えば元にある感染の処置またはサイトカインレベルの減少）を可能にするために十分となるだろう。

そのような炎症状態の別の例は、炎症性腸疾患である。炎症性腸疾患は、クローン病または潰瘍性大腸炎であり得る。当業者は腸の炎症を引き起こす病因が既知または未知である他の炎症性腸疾患を認識している。さらにＴＬＲ３アンタゴニストは、強直性脊椎炎、仙腸骨炎および乾癬性脊椎関節炎（ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）を含む鉛関節痛および関節炎のような潰瘍性大腸炎またはクローン病と関連する腸管外の後遺症（ｅｘｔｒａｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｅｑｕｅｌａｅ）の処置および防止に有用である。他の腸管外後遺症には、口内炎、結節性紅斑（痛い硬化した卵形の結節の発生）、および皮膚の深い重篤な潰瘍形成を特徴とする壊死性膿皮症のような粘膜の損傷；上強膜炎、虹彩炎およびブドウ膜炎のような目の合併症；腎石症のような腎臓疾患；原発性硬化性胆管炎、潰瘍性大腸炎、クローン病に伴う線維化炎症を特徴とする慢性肝臓疾患のような肝胆管（ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ）疾患；ならびに骨粗鬆症および長期コルチコステロイド使用の合併として起こる骨減少を含む骨の疾患がある。さらに含まれるのは間質性肺炎、気管狭窄、気管支炎、器質化肺炎を伴う閉塞性細気管支炎、肺脈管炎、サルコイドーシス、慢性気管支炎、および好酸球増加症を伴う肺の浸潤物を示す臨床的状態を含むＩＢＤ−誘導型の肺機能不全および呼吸障害である。

そのような炎症状態の別の例は、感染に伴う状態である。感染に伴う状態には重篤な肺炎、嚢胞性線維症、気管支炎、気道の増悪および急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を含めウイルスまたは細菌性肺炎を含むことができる。そのような感染に伴う状態は原発性ウイルス感染および２次的な細菌感染のような多重感染が関与し得る。

そのような炎症状態の別の例は、炎症性の肺状態である。例示される炎症性の肺状態には、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物またはプリオン感染に関連するものを含め、感染により誘導される肺の状態；アレルゲンに誘導される肺の状態；石綿症、珪肺症またはベリリウム症のような汚染物質に誘導される肺の状態；胃の吸引に誘導される肺の状態；免疫脱調節（ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）；嚢胞性線維症のような遺伝的に誘導される炎症
性の肺状態；および人工呼吸器のような物理的外傷が誘導する肺の状態を含む。これらの炎症状態には喘息、気腫、気管支炎、ＣＯＰＤ、サルコイドーシス、組織球増加症、リンパ脈管筋腫症（ｌｙｍｐａｎｇｉｏｍｙｏｍａｔｏｓｉｓ）、急性肺損傷、急性呼吸促迫症候群、慢性肺疾患、気管支肺形成異常、市中肺炎、院内肺炎、人工呼吸器に伴う肺炎、敗血症、ウイルス性肺炎、インフルエンザ感染、パラインフルエンザ感染、ヒトメタニューモウイルス感染、ＲＳウイルス感染およびアルペルギルスまたは他の真菌感染も含む。

そのような炎症状態の別の例は、２型糖尿病、肥満、脂質代謝異常およびメタボリックシンドロームである。ＴＬＲ３アンタゴニストは、肥満およびインスリン抵抗性に伴う炎症プロセスの阻害に有用である。ＴＬＲ３シグナリングの阻害は、患者の脂質プロファイルを改善し、すなわち総コレステロールレベルを下げ、そしてＨＤｌｃ／ＬＤＬｃ比を上げる。またＴＬＲ３シグナリングの阻害はインスリンの分泌の上昇を導き、すなわちインスリン抵抗性に改善を導く。２型糖尿病の現行処置は、低血糖および体重増加を含め様々な悪い副作用を伴う。２型糖尿病の処置にＴＬＲ３アンタゴニストを使用することは、より少ない副作用および持続的な薬物動態学的プロファイルを有することが期待される。さらに本発明の単離された抗体のような長期循環半減期を有する化合物での処置は、まれな投与を要するだろう。

さらに脂質プロファイルにおける改善は、アテローム硬化症のような肥満および２型糖尿病に関連する心血管疾患の発生を遅らせるか、または防止すると思われる。加えてＴＬＲ３シグナリングの阻害は、膵臓小島細胞への直接的効果を介して、または脂質プロファイルに影響を及ぼし、そして高脂質レベルにより誘導される悪化から小島を保護することによるいずれかでインスリンの循環レベルに上昇をもたらすことができる。したがってＴＬＲ３阻害は単独または他の治療と組み合わせて、２型糖尿病におけるインスリン処置の導入を遅らせ、そしてインスリン処置に伴う望ましくない副作用を回避すると思われる。

さらにＣ型肝炎およびＨＩＶ感染の患者は、肝臓における脂質の蓄積、あるいは処置薬から生じる硬化または繊維症により、インスリン刺激に対する肝臓の反応の無能により、インスリン抵抗性および２型糖尿病を発生する傾向がある。ＴＬＲ３アンタゴニストによるＴＬＲ３シグナリングの阻害は、この高度に障害のある（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）患者群において感染およびインスリン抵抗性の両方を標的とすることができる。

本発明の方法により防止または処置できる他の炎症状態およびニューロパシーには、多発性硬化症、硬化症狼瘡エリテマトーデス、およびアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、双極性障害および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む神経変性および中枢神経系（ＣＮＳ）障害、繊維症、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を含む肝臓疾患、関節炎、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎および若年性関節炎（ＪＲＡ）、骨粗鬆症、変形性関節炎、膵炎、繊維症、脳炎、乾癬、巨細胞性動脈炎、強直性脊椎炎、自己免疫肝炎、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、炎症性の皮膚状態、臓器移植、癌、アレルギー、内分泌疾患、他の自己免疫障害および気道の超反応性（ａｉｒｗａｙ ｈｙｐｅｒ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）を含む。

本発明の別の観点は、細胞の増殖率を上げる方法であり、この方法は細胞におけるＴＬＲ３活性を例えば細胞をＴＬＲ３アンタゴニストと接触させることにより下げることを含んでなる。本発明のこの観点の１つの態様では、細胞は上皮または結腸組織のような組織に由来することができる。上皮細胞は例えば胃腸管上皮、皮膚上皮、肺上皮または気管支肺上皮のような任意の上皮組織から生じ得る。炎症状態は例えば心組織および胃腸管の組織のような任意の組織に影響を及ぼすことができ、正常組織から構造的および機能的逸脱を生じる。場合により、そのような炎症状態は遺伝的因子または感染の結果であり得る。別の状況では、そのような炎症状態は例えば火傷のような外的損傷の結果であり得る。当
業者は多くの異なる炎症状態および関与する種々の組織により現される関連する病状を認識している。

本発明の別の観点は、細胞死から生じる状態を処置する方法であり、この方法は治療に有効な量のＴＬＲ３アンタゴニストを処置が必要な患者に、症状を処置するために十分な時間投与することを含んでなる。

本発明の別の観点は、細胞死から生じる状態を防止する方法であり、この方法は治療に有効な量のＴＬＲ３アンタゴニストを防止が必要な患者に、状態を防止するために十分な時間投与することを含んでなる。

投与／製薬学的組成物
本発明のアンタゴニストの治療的使用に関する投与様式は、作用物質を宿主に送達する任意の適当な経路でよい。タンパク質、抗体、抗体フラグメントおよびミメティボディおよびこれらの作用物質の製薬学的組成物は、非経口投与、すなわち皮下、筋肉内、皮内、静脈内、鼻内に、または吸引により投与するために特に有用である。

本発明のアンタゴニストは、有効成分として有効量のアンタゴニストを製薬学的に許容され得る担体中に含有する製薬学的組成物として調製され得る。注入の準備ができているアンタゴニストを含有する水性の懸濁液または溶液、好ましくは生理学的ｐＨで緩衝化されているものが好ましい。非経口投与用の組成物は通常、製薬学的に許容され得る担体、好ましくは水性担体に溶解された本発明のアンタゴニストの溶液またはそのカクテルを含んでなる。種々の水性担体、例えば０．４％塩水、０．３％グリシン等を使用することができる。これらの溶液は滅菌されており、そして一般に粒状物質を含まない。これらの溶液は通例の周知の滅菌技法（例えば濾過）により滅菌することができる。組成物はｐＨ調整および緩衝化剤等のような生理学的条件に近づけるために必要な製薬学的に許容され得る補助物質を含むことができる。そのような製剤中の本発明のアンタゴニストの濃度は大変広く変動でき、すなわち約０．５％未満から、通常少なくとも約１％から多くても１５もしくは２０重量％であり、そして主に選択した特定の投与様式に従い、主に流体容量、粘度等に基づき選択される。

このように筋肉内注射用の本発明の製薬学的組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝化水および約１ｎｇから約１００ｍｇの間、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、またはさらに好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のアンタゴニストを含むように調製することができる。同様に静脈内注入用の本発明の製薬学的組成物は、約２５０ｍｌの滅菌リンゲル溶液および約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、そして好ましくは５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のアンタゴニストを含むように作成することができる。非経口的に投与可能な組成物を調製する実際の方法は周知であり、そして例えば「レミングトンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」第１５版、マック出版社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、イーストン、ペンシルバニア州にさらに詳細に記載されている。

本発明のアンタゴニストは、製薬学的調製物中にある時、単位剤形で存在することができる。適切な治療に有効な用量は、当業者により容易に決定されることができる。決定された用量が、必要に応じて適切に選択された適切な時間間隔で医師により処置期間中、繰り返される。

本発明のアンタゴニストは保存用に凍結乾燥され、そして使用前に適切な担体中で再構成され得る。この技術は通常の免疫グロブリンおよびタンパク質調製物を用いて効果的であることがすでに示され、そして技術的に知られている凍結乾燥および再構成技術を使用
することができる。

アンタゴニストは、そのような分子を細胞に提供する任意の技術により投与され得る。細胞に関してはインビトロのアンタゴニスト投与は、例えば培養基にアンタゴニストを補充することによるものでよい。細胞に関してインビボのアンタゴニスト投与は、例えばアンタゴニストの動物または組織への静脈内注射によるものでよい。当業者はアンタゴニストを細胞にインビトロまたはインビボで投与するための他の手段を認識している。そのような手段も上で検討した宿主に作用物質を送達するための様式を含む。

抗−ヒトＴＬＲ３（ｈＴＬＲ３）モノクローナル抗体アンタゴニストに由来する重鎖可変領域配列を示す（ＣＤＲに下線を付す）。 抗−ｈＴＬＲ３モノクローナル抗体アンタゴニストに由来する軽鎖可変領域配列を示す（ＣＤＲに下線を付す）。 ヒト肺上皮由来細胞におけるポリ（Ｉ：Ｃ）誘導型のＩＬ−６サイトカイン生産のＴＬＲ３アンタゴニストによる阻害を示す。 ヒト肺上皮由来細胞におけるポリ（Ｉ：Ｃ）誘導型のＩＬ−８サイトカイン生産のＴＬＲ３アンタゴニストによる阻害を示す。 ヒト肺上皮由来細胞におけるポリ（Ｉ：Ｃ）誘導型のＲＡＮＴＥＳサイトカイン生産のＴＬＲ３アンタゴニストによる阻害を示す。 初代ヒト気管支上皮細胞におけるポリ（Ｉ：Ｃ）誘導型のＭＩＰ１−アルファサイトカイン生産のＴＬＲ３アンタゴニストによる阻害を示す。 初代ヒト気管支上皮細胞におけるポリ（Ｉ：Ｃ）誘導型のＩＬ−６サイトカイン生産のＴＬＲ３アンタゴニストによる阻害を示す。 ＩＢＤに伴う体重減少に及ぼすＴＬＲ３活性のノックアウト効果を示す。 ＴＬＲ３アンタゴニストによるＩＢＤに伴う体重減少の抑制を示す。 ＴＬＲ３アンタゴニストでの処置を介してマウス敗血症モデルにおける生存の上昇を示す。 マウス敗血症モデルにおけるＩＬ−６サイトカイン生産のＴＬＲ３アンタゴニストによる減少を示す。 マウス敗血症モデルにおけるＴＮＦ−アルファサイトカイン生産のＴＬＲ３アンタゴニストによる減少を示す。 ポリ（Ｉ：Ｃ）が誘導するマウス肺組織における炎症細胞の総数の増加を示す。 ポリ（Ｉ：Ｃ）が誘導するマウス肺組織における好中球の増加を示す。 ポリ（Ｉ：Ｃ）が誘導するマウス肺組織における単核炎症細胞の増加を示す。 ポリ（Ｉ：Ｃ）の単回投与でのＴＬＲ３の活性化は、メタコリン対抗マウスの肺機能をさらに損傷する。 ポリ（Ｉ：Ｃ）の多回投与でのＴＬＲ３の活性化は、メタコリン対抗マウスの肺機能をさらに損傷する。 ＴＬＲ３ノックアウトマウスは、メタコリン対抗中に単回のポリ（Ｉ：Ｃ）投与が誘導する肺機能の傷害から保護されることを示す。 ＴＬＲ３ノックアウトマウスは、メタコリン対抗中に多回のポリ（Ｉ：Ｃ）投与が誘導する肺機能の傷害から保護されることを示す。 ＴＬＲ３アンタゴニストの、ヒト肺気管支上皮細胞におけるサイトカインおよびケモカイン生産に及ぼす効果を示す。 ＴＬＲ３アンタゴニストの予防および処置を介して、マウスの致死的肺炎モデルにおける生存の上昇を示す。 インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８および肺炎双球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏ ｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の致死以下の用量に感染した後のマウスモデルでは致死的な肺炎の発症を示す。 インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８および肺炎双球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染マウスの肺における細菌負荷量を示す。 図Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ヒトに適合した抗−ＴＬＲ３ ｍＡｂのｈＴＬＲ３への結合を示す。 細胞に基づくサイトカイン放出アッセイにおいて、ヒトに適合した抗−ＴＬＲ３ ｍＡｂの評価を示す。 ＩＰ−１０の読み取りを用いた細胞に基づく生物活性アッセイにおいて、バリアントｍＡｂ ＨＢＶ１からＨＢＶ８（ＨＢＶ４は除く）の評価を示す。 ＲＡＮＴＥＳの読み取りを用いた細胞に基づく生物活性アッセイにおいて、バリアントｍＡｂ ＨＢＶ１からＨＢＶ８（ＨＢＶ４は除く）の評価を示す。 ＩＬ−８の読み取りを用いた細胞に基づく生物活性アッセイにおいて、バリアントｍＡｂ ＨＢＶ１からＨＢＶ８（ＨＢＶ４は除く）の評価を示す。 ＭＣＰ−１の読み取りを用いた細胞に基づく生物活性アッセイにおいて、バリアントｍＡｂ ＨＢＶ１からＨＢＶ８（ＨＢＶ４は除く）の評価を示す。 ＩＬ−６の読み取りを用いた細胞に基づく生物活性アッセイにおいて、バリアントｍＡｂ ＨＢＶ１からＨＢＶ８（ＨＢＶ４は除く）の評価を示す。 ＡおよびＢは、高脂肪食のＴＬＲ３ノックアウトマウスが、高脂肪食に伴うグルコース寛容減損の発症から保護されることを示す。 ＴＬＲ３ノックアウトマウスは高脂肪食で２６週間後に、正常な空腹時血中グルコースレベルを有する。 Ａ、ＢおよびＣは、高脂肪食で２６週間後にＴＬＲ３ノックアウトマウスでのグルコース対抗前および後に、空腹時インスリンレベルの上昇を示す。 Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、高脂肪食の野生型マウスに比べて、３０週間高脂肪食を与えたＴＬＲ３ノックアウトマウスの改善された脂質プロファイルを示す。 慢性ＤＳＳ大腸炎の誘導中に、ＴＬＲ３アンタゴニストで予防的に（Ｐｒ）および治療的に（Ｔ）処置するための実験プロトコールを示す。 ＤＳＳ摂取の各サイクルで起こる体重減少のＴＬＲ３アンタゴニストによる保護を示す。 第２のＤＳＳサイクル後の体重減少およびＴＬＲ３アンタゴニストによる回復を示す。 第３のＤＳＳサイクル後の体重減少およびＴＬＲ３アンタゴニストによる回復を示す。 慢性ＤＳＳ大腸炎に伴う正味の体重減少に及ぼすＴＬＲ３アンタゴニスト処置の効果を示す。 慢性ＤＳＳ大腸炎に伴う結腸の短縮化に及ぼすＴＬＲ３アンタゴニスト処置の効果を示す。 Ａ、ＢおよびＣは、慢性ＤＳＳ大腸炎の重症度に及ぼすＴＬＲ３アンタゴニスト処置の効果を示す。Ｄ、ＥおよびＦは慢性ＤＳＳ大腸炎におけるｈＴＬＲ３アンタゴニスト処置の組織病理学的効果を示す。 慢性ＤＳＳ大腸炎におけるＴ細胞活性化を示す。 脾臓でのＣＤ１１ｂ＋細胞のＤＳＳに伴う上昇に及ぼす予防的ＴＬＲ３アンタゴニスト処置の効果を示す。 慢性ＤＳＳ大腸炎におけるＩＬ−４およびＩＬ−１０の全身レベルに及ぼすＴＬＲ３アンタゴニスト処置の効果を示す。

本発明をこれから以下の具体的な、非限定的実施例を参照にして記載する。

実施例１
抗−ｈＴＬＲ３アンタゴニストｍＡｂの同定
ｈＴＬＲ３受容体を介してシグナリングを遮断することができる抗−ｈＴＬＲ３アンタゴニストｍＡｂは、細胞に基づくスクリーニングアッセイにより同定された。抗−ｈＴＬＲ３ ｍＡｂを生産するハイブリドーマのプールを、ＢＡＬＢ／Ｃマウスで標準的技法を使用して作成した（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７６）。マウスは、ｈＴＬＲ３のアミノ酸１−７０３をコードするプラスミドＤＮＡの皮内注射によりｈＴＬＲ３で免疫感作した（配列番号３）。アミノ酸１−７０３はｈＴＬＲ３の予想される細胞外ドメインに対応する（配列番号４）。マウスには最初に１０μｇのプラスミドＤＮＡを、続いて２回目に１０μｇのＤＮＡ注射を２週間後に注射した。１５μｇのＤＮＡの追加免疫注射を、各マウスに２回目の１０μｇプラスミドＤＮＡ注射から２週間後に投与した。Ｂ細胞融合の３日前、マウスにリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ；１０ｍＭ リン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中の１５μｇのｈＴＬＲ３タンパク質を静脈内注射した。次いで免疫感作したマウスからの脾臓を回収し、そしてＢ細胞融合を標準的方法を使用して行った（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７６）。ハイブリドーマは、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジンを含有する培地を使用して選択し、そして最初に抗−ＴＬＲ３抗体について酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりスクリーニングした。抗−ｈＴＬＲ３ ｍＡｂを生産している個々のハイブリドーマを限界希釈法によりクローン化した。

抗−ｈＴＬＲ３アンタゴニストｍＡｂを生産しているハイブリドーマは、ｈＴＬＲ３を安定に過剰発現している肺上皮細胞株に由来するヒトＡ５４９を使用して、細胞に基づくスクリーニングアッセイにより同定した。スクリーニングの生成に使用したＡ５４９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ；ＣＣＬ−１８５）およびこれらのアッセイ用の対照細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（マナッサス、バージニア州）から得た。スクリーニング細胞株は、Ａ５４９−ｈＴＬＲ３と呼ばれるＡ５４９に由来する細胞株であった。Ａ５４９−ｈＴＬＲ３細胞は、ｈＴＬＲ３およびネオマイシン耐性遺伝子をコードする哺乳動物プラスミド発現ベクターで安定にトランスフェクトされる。対照のＡ５４９由来細胞株はＡ５４９−ｎｅｏと命名した。Ａ５４９−ｎｅｏ細胞はネオマイシン耐性遺伝子のみをコードする哺乳動物プラスミド発現ベクターで安定にトランスフェクトされる。これらの安定にトランスフェクトされた細胞株は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、カールスバッド、カリフォルニア州）トランスフェクションにより製造元の使用説明および選択およびクローニングの標準的方法に従い作成した。Ａ５４９−ｈＴＬＲ３およびＡ５４９−ｎｅｏ細胞は、最少必須培地“ＭＥＭ”（１０％ＦＢＳ、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ） インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）、１ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含有する）中で標準的条件下で培養した。

Ａ５４９−ｈＴＬＲ３細胞を使用した細胞に基づくスクリーニングアッセイで、ｍＡｂ１０６８と名付けた１つのｈＴＬＲ３アンタゴニストｍＡｂを同定した。これらのスクリーニングアッセイの元にある原理は、Ａ５４９−ｈＴＬＲ３細胞に存在するｈＴＬＲ３受容体のポリ（Ｉ；Ｃ）刺激が、細胞のサイトカイン生産の上昇をもたらすということであった。スクリーニングアッセイを介して同定された候補のｈＴＬＲ３アンタゴニストｍＡｂは、Ａ５４９−ｈＴＬＲ３細胞中のｈＴＬＲ３受容体を介してポリ（Ｉ：Ｃ）媒介型のシグナリングを阻害し、そしてｍＡｂに暴露されない対照Ａ５４９−ｈＴＬＲ３細胞に比べて減少したサイトカイン生産を引き起こす。

スクリーニングアッセイはＡ５４９−ｈＴＬＲ３細胞を試験ｍＡｂと３０分間、３７℃でインキュベーションした後、５μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）（アマシャム バイオサイ
エンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ．）、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を加えることにより行い；２４時間後に細胞培養上清中のサイトカインレベルを測定した。対照Ａ５４９−ｈＴＬＲ３細胞は同一に処理したが、これらの細胞は試験ｍＡｂとインキュベーションしなかった。Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）マルチチャンネル分析（ルミネックス社（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ）、オースチン、テキサス州）およびＩＬ−６（インターロイキン−６）、ＩＬ−８（インターロイキン−８）、およびＲＡＮＴＥＳ（活性化で調節される、正常にＴ−発現し、そして恐らく分泌する）特異的ｍＡｂ結合ビーズを製造元の指示に従い使用して、スクリーニングアッセイにおける細胞のサイトカイン生産レベルを測定した。ｈＴＬＲ３に結合する、アンタゴニストｍＡｂ１０６８は、そのようなアッセイにより同定した。

ｍＡｂ１０６８の重鎖および軽鎖をコードする重鎖および軽鎖核酸配列は、標準的方法を使用してｍＡｂ１０６８を発現しているハイブリドーマからクローン化した。ｍＡｂ１０６８の重鎖および軽鎖核酸およびアミノ酸配列は、それぞれ図１および２および配列番号６および１６に示す。組換えｍＡｂ１０６８（ｒ１０６８）をコードする重鎖および軽鎖核酸配列を両方を含んでなる細胞株を標準的方法を使用して作成した。

実施例２
ヒト肺に由来する細胞中でのＩＬ−６、ＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳサイトカイン生産のｈＴＬＲ３アンタゴニスト阻害
ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳ特異的サイトカインアッセイは、Ａ５４９−ｈＴＬＲ３細胞を１０６８ｍＡｂまたはＴＬＲ３．７ｍＡｂと３７℃で３０分間インキュベーションした後、５μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）（アマシャム バイオサイエンス社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を、図３、図４および図５に示すように加えることにより行った。細胞培養上清中のサイトカインレベルは、２４時間後にＬｕｍｉｎｅｘ（商標）装置（ルミネックス社、オースチン、テキサス州）およびＩＬ−６、ＩＬ−８またはＲＡＮＴＥＳ特異的ｍＡｂ結合ビーズを適切に使用して測定した。各サイトカインに関するＬｕｍｉｎｅｘ（商標）アッセイは、製造元の指示により行った。

結果ではｈＴＬＲ３アンタゴニストｍＡｂ１０６８がヒト肺上皮由来のＡ５４９−ｈＴＬＴ３細胞でＩＬ−６（図３）、ＩＬ−８（図４）およびＲＡＮＴＥＳ（図５）サイトカインのｈＴＬＲ３媒介型生産を阻害することが示される。しかしｈＴＬＲ３特異的マウスｍＡｂＴＬＲ３．７（イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）は、ｈＴＬＲ３媒介型のポリ（Ｉ：Ｃ）が誘導するＩＬ−６（図３）およびＩＬ−８（図４）の生産を、ｍＡｂ１０６８と同程度までは阻害しなかった。ＲＡＮＲＥＳ生産に関しては（図５）、これらのヒト肺に由来する細胞では、ｍＡｂ１０６８が生産を阻害したが、ｍＡｂＴＬＲ３．７はＲＡＮＴＥＳの生産を上げた。１０６８とＴＬＲ３．７ｍＡｂとの間のこれらの差異は、以前の研究がＴＬＲ３．７ｍＡｂがｈＴＬＲ３受容体と拮抗することを示唆した（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４：１３６４−１３６９（２００２））ように重要である。この以前の研究は、ＴＬＲ３．７ｍＡｂがヒトの繊維芽細胞由来ＭＲＣ−５細胞においてポリ（Ｉ：Ｃ）誘導型ＩＦＮ−ベータの生産を阻害するようであると報告された（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４：１３６４−１３６９（２００２））。この結果は明らかに１０６８ｈＴＬＲ３アンタゴニストｍＡｂが、ＴＬＲ３．７ｍＡｂよりもサイトカインのさらに一層広いスペクトルの生産を阻害し、そしてこれら２つのｍＡｂがこれに基づき各々区別され得ることを示している。

実施例３
初代ヒト気管支−上皮細胞でのＭＩＰ１−アルファおよびＩＬ−６サイトカイン生産のｈ
ＴＬＲ３アンタゴニスト阻害
ｈＴＬＲ３アンタゴニストｍＡｂ１０６８は、初代ヒト気管支−上皮細胞においてＭＩＰ１−アルファ（図６）およびＩＬ−６（図７）サイトカインのｈＴＬＲ３媒介型生産を阻害する。ＭＩＰ１−アルファおよびＩＬ−６特異的サイトカインアッセイは、初代ヒト気管支−上皮細胞を１０６８ｍＡｂまたは非特異的ポリクローナルマウスＩｇＧ調製物と、３７℃で３０分間インキュベーションすることにより行った後、５μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）（アマシャム バイオサイエンス社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を図６または図７に示したように加えた。細胞培養上清中のサイトカインレベルは、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）装置（ルミネックス社、オースチン、テキサス州）およびＭＩＰ１−アルファまたはＩＬ−６特異的ｍＡｂ結合ビーズを適切に使用して２４時間後に測定した。各サイトカインに関するＬｕｍｉｎｅｘ（商標）アッセイは、製造元の指示により行った。初代ヒト気管支−上皮細胞はヒト組織サンプルから単離し、そして標準的方法を使用して培養した。

実施例４
ＴＬＲ３活性のノックアウトは炎症性腸疾患症状の重篤度を軽減する
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）症状の重篤度は、ＴＬＲ３受容体遺伝子活性をノックアウトすることによりＩＢＤのマウスモデルで減少した（図８）。クローン病および潰瘍性大腸炎は、硫酸デキストランナトリウム（ＤＳＳ）を摂取した動物でモデル化することができる（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．１５：７９−９４，２００２）。これらの動物モデルで観察される症状には実質的な体重の減少（図８）および上皮細胞の潰瘍化を含む。これらの症状は潰瘍性大腸炎またはクローン病のようなＩＢＤの患者で観察される症状を模する。このＩＢＤのマウスモデルでは、ＤＳＳで処置したＴＬＲ３ノックアウトマウスには実質的な体重減少がなく（図８）、そしてＤＳＳ処置した野生型マウスに比べて軽い上皮細胞傷害の発症が組織病理学的分析により評価された。これらの結果はＴＬＲ３シグナリングがＩＢＤに関与するような炎症プロセスに決定的な役割を果たすことができることを示した。

これらの実験では、メスの野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＴＬＲ３ノックアウトマウス（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１３：７３２−７３８（２００１））に、それぞれ５（重量／容量）％の硫酸デキストランナトリウム（ＤＳＳ）が飲料水中に与えられるか、またはそれを補充していない水が自由に図８に示すように５日間与えられて、急性の潰瘍性大腸炎を誘発させた。すべてのマウスが６〜８週齢であり、そして各処置群は少なくとも５匹のマウスを有した。ＤＳＳ処置後の大腸炎の発症は、体重（図８）、結腸重量の変化、便の軟度、直腸の出血および結腸の組織病理学により評価した。そのようなすべての評価は、実験動物の取り扱いおよび使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ；ＩＡＣＵＣ）のガイドラインに従って行った。図８のデータは、処置１日〜５日から体重の変化をパーセントとして示している。各記号は１匹のマウスからのデータを示す。ＷＴは野生型マウスを表し；ＫＯはＴＬＲ３ノックアウトマウスを表す。水平の棒は平均を示す。示すデータは３回の独立した実験の複合である。ＤＳＳを受容しなかった対照の野生型およびＴＬＲ３ノックアウトマウス（図８）は、体重に同様の変化を示した（Ｐ＝０．６、ｔ−検定）。ＤＳＳを受容した野生型およびＴＬＲ３ノックアウトマウス（図８）は、体重に有意な変化を示した（Ｐ＝０．００３、ｔ−検定）。

組織病理学的分析用の結腸は、実験の５日目に動物から摘出した。結腸をパラフィンに包埋し、切片とし、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで標準的方法を使用して染色した。ＤＳＳを受容した野生型マウスからの代表的結腸切片は、粘膜の潰瘍化および稠密な炎症性滲出物ならびに陰窩および杯細胞の損失を現した。未補充水を受容したＴＬＲ３ノックアウトマウスからの代表的な結腸切片は、未補充水を受容した野生型マウスの結腸で
観察された所見に類似する形態学および組織学を有した。ＤＳＳを受容したＴＬＲ３ノックアウトマウスからの代表的な結腸は、幾らか稠密な細胞の滲出を含んだが、他は完全な粘膜上皮および杯細胞の最少の損失を現した。この組織病理学的データは、ＤＳＳを受容したＴＬＲ３ノックアウトマウスがＤＳＳを受容した野生型マウスよりも少ない上皮潰瘍化を発症することを示し、そしてＴＬＲ３活性がＩＢＤに関与するような炎症プロセスに重要な役割を果たし得ることを明らかにしている。

実施例５
ｈＴＬＲ３アンタゴニストの処置は炎症性腸疾患に伴う体重の減少を止める
ｈＴＬＲ３アンタゴニスト処置は、ＩＢＤのマウスモデルにおいて炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に伴う体重減少の重篤度を下げる（図９）。データはＴＬＲ３アンタゴニストでの処置が潰瘍性大腸炎およびクローン病のようなＩＢＤに伴う症状を軽減することができることを明らかにする。さらにこの結果はＴＬＲ３シグナリングがＩＢＤのような炎症状態において重要な役割を果たすことができることをさらに示している。

これらの実験では、メスの野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、それぞれ５（重量／容量）％の硫酸デキストランナトリウム（ＤＳＳ）が飲料水中に与えられるか、または未補充水が図９に示すように自由に５日間与えられて、急性の潰瘍性大腸炎を誘発させた。０．２ｍｇのｍＡｂ１０６８（ＰＢＳ担体中）、０．２ｍｇの非特異的マウスＩｇＧポリクローナル抗体調製物（ＰＢＳ担体中）、またはＰＢＳ担体のみを図９に示すようにＤＳＳ処置の最初の４日間、毎日、腹腔内注射によりマウスに投与した。各注射は０．９ｍｌのｍＡｂまたは非特異的ＩｇＧ調製物（ＰＢＳ中）、または０．９ｍｌのＰＢＳ担体のみを含んでなった。すべてのマウスは６〜８週齢であり、そして各処置群は少なくとも５匹のマウスを含んだ。ＤＳＳ処置後の大腸炎の発症は、体重（図９）、結腸重量の変化、便の軟度、直腸の出血および結腸の免疫組織病理学を観察することにより評価した。そのようなすべての評価は、確立された動物の取り扱いおよび使用のガイドラインに従って行った。

図９のデータは、処置１日〜４日から体重の変化をパーセントとして示している。各記号は１匹のマウスからのデータを示す。水平の棒は中央値を示す。示すデータは２回の独立した実験の複合である。ＤＳＳおよびｍＡｂ１０６８を受容したマウスと、ＤＳＳを受容しなかったマウスとの間の体重の変化における有意差はなかった（Ｐ＞０．０５、Ｄｕｎｎの検定；図９）。ＤＳＳおよびｍＡｂ１０６８を受容したマウスにおける体重変化は、ＤＳＳおよび非特異的ＩｇＧ（ＰＢＳ中）またはＰＢＳのみを受容したマウスで観察される体重の変化とは有意に異なった（双方についてＰ＜０．０１、Ｄｕｎｎの検定；図９）。

実施例６
ＴＬＲ３ノックアウトマウスまたはｈＴＬＲ３アンタゴニスト処置マウスにおける慢性大腸炎の重篤度の減少
６〜８週齢のメスの野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＴＬＲ３ノックアウト（ＫＯ）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６のバックグラウンド）（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１３：７３２−７３８（２００１））をすべての実験に使用した。マウスには全部で３サイクルの２（重量／容量）％の硫酸デキストランナトリウム（ＤＳＳ）が飲料水中に与えられた（Ｏｋａｙａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９８：６９４−７０２（１９９０））。ＤＳＳ水は５日間、自由に与えられて、潰瘍性大腸炎を誘導し、そして次に普通水を与えた。２回目の２％ＤＳＳの５日間のサイクルは１４日目に始め、これに次いで９日間休んだ。今度は７日間である第３回目の２％ＤＳＳサイクルは、２８日目から始めた。マウスを２つの異なる時点で屠殺した；実験２５日目の２回目の休息期間後、または実験の３７日目の第３ＤＳＳサイクルの後のいずれか。各処置群は少なくとも８匹のマウスからなった。大腸炎の発症は、実験を通じて体
重の変化を観察し、ならびにＤＳＳ処置後の結腸長、結腸重量、便の軟度、直腸の出血および結腸の組織病理学を含め、屠殺時の他のパラメーターを評価することにより評価した。

組織病理学は、実験計画に対して知らない独立した獣医病理学者により評価された。結腸の縦方向の切片は、上皮細胞壊死、上皮潰瘍化および侵食性（ｓｌｏｕｇｈｉｎｇ）、陰窩損失、陰窩細胞増殖、粘膜固有層における顆粒化組織形成、粘膜下組織での顆粒化組織、粘膜下の炎症細胞浸潤および粘膜下水腫を含む変化のパネルについてスコアを付けた。スコアは以下のように損傷の程度を反映して与えた：０、存在せず；１、軽度、病巣；２、軽度、多病巣；３、中程度、限定された領域に頻繁に見られる；４、重症、渡された組織の多くの領域に頻繁に見られる；５、大変重症、渡された組織の大部分に広がる。統計分析をスチューデントｔ検定を使用して行った（ＪＭＰ、ＳＡＳ研究所；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。潰瘍性大腸炎およびクローン病の患者の症状には、体重減少、血便の存在、および結腸の上皮層の潰瘍化を含む。このように硫酸デキストランナトリウム処置マウスで誘導される症状は、潰瘍性大腸炎またはクローン病の患者で見られる症状を一部模する（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１５：７９−９４（２００２））。

各サイクルのＤＳＳ摂取で、このモデルでは野生型およびＴＬＲ３ ＫＯマウスの両方に体重減少を誘導する。しかしＴＬＲ３ ＫＯマウスは野生型マウスよりも有意に少ない体重減少を体験した。またＴＬＲ３ ＫＯマウスは、結腸の炎症および傷害の総合的な測定により評価されるように疾患の重篤度の減少も示された：ＴＬＲ３ ＫＯマウスにおける結腸の短縮化はＷＴマウスで見られるよりも有意に少なく、そしてＴＬＲ３ ＫＯマウスはさらに低い頻度の直腸出血を示した。結腸粘膜傷害の組織病理学的評価は、これらの総合的な測定と一致した。１つの細胞壊死、上皮潰瘍化、上皮侵食性、陰窩脱落および陰窩膿瘍に関する中央値のスコアは、ＴＬＲ３ ＫＯマウスでＷＴマウスよりも低かった。これらのデータは一緒に、ＴＬＲ３シグナリングの不存在が慢性大腸炎のマウスモデルにおいて、疾患から部分的に保護を与えることを示し、そしてＴＬＲ３シグナリングがヒトのＩＢＤにおいて疾患の重症度を増悪するらしいことを示唆している。

疾患のモジュレーションにおけるＴＬＲ３の役割をさらに証明するために、ＷＴＣ５７ＢＬ／６マウスをアンタゴニスト抗−ＴＬＲ３ｍＡｂ１０６８で処置した。ＤＳＳに暴露したマウス群は、０．２ｍｇの抗−ＴＬＲ３ｍＡｂ１０６８を予防的（最初のＤＳＳサイクルで開始した、“Ｐｒ”）または治療的（２回目のＤＳＳサイクルで開始した、“Ｔｈ”；図３５）を受けた。ＤＳＳ暴露マウスの対照群は、ＰＢＳ（賦形剤対照）または０．２ｍｇの非特異的陰性対照ｍＡｂのいずれかを受けた。さらなる対照群はＤＳＳを与えなかった。図３５のアタリスクは、抗−ＴＬＲ３アンタゴニストｍＡｂ投与の時点を表す。

ＤＳＳ暴露マウスのすべての群で、ＤＳＳ摂取の各サイクルで体重の減少が続いた（図３６）。図３６の各記号は少なくとも８匹のマウスの平均を表し、誤差棒は標準偏差を表す。ＤＳＳは０〜４、１４〜１８および２８〜３５日に与えた。しかし抗−ＴＬＲ３ｍＡｂで処置した群は、減少した体重の損失を示し、そしてＰＢＳまたは対照ｍＡｂで処置した群と比べて２回目のＤＳＳサイクル後に早い速度で体重が回復した（図３７）。３回目のＤＳＳサイクル後の体重損失も、抗−ＴＬＲ３ｍＡｂ処置群で大きく減少した（図３８）。実験の開始（０日）から実験の終わり（３７日）までの正味の体重減少の平均は、ＰＢＳまたは対照ｍＡｂのいずれかを受けたＤＳＳ暴露マウスでおよそ２０％であった。抗−ＴＬＲ３ｍＡｂでの処置は、およそ１０％まで体重損失を有意に減らした（図３９）。図３９では、データは実験の開始（０日）から実験の終わり（３７日）までの体重の変化の％として示されているので、プラスの数字は正味の増加を、そしてマイナスの数字は正味の損失を示す。抗−ＴＬＲ３ｍＡｂ処置群での体重損失の％は、賦形剤対照（ＰＢＳ）
または非特異的ＩｇＧで処置した群よりも有意に少なかった（予防的抗−ＴＬＲ３処置（抗−ＴＬＲ３ Ｐ）対ＰＢＳ、Ｐ＝０．００６；抗−ＴＬＲ３ Ｐ対非特異的ＩｇＧ、Ｐ＝０．００６；治療的抗−ＴＬＲ３（抗−ＴＬＲ３Ｔｈ）対ＰＢＳ、Ｐ＝０．００１；抗−ＴＬＲ３ Ｔｈ対非特異的ＩｇＧ、Ｐ＝０．００９）。各記号は１匹のマウスを表し、水平棒は平均を表す。

また抗−ＴＬＲ３ｍＡｂ処置は、結腸の短縮化の程度も減少させた。抗−ＴＬＲ３ｍＡｂで予防的に、または治療的のいずれかで処置したマウス群の結腸の長さは、賦形剤または対照ｍＡｂを与えた群の長さよりも有意に大きかった（図４０）。（抗−ＴＬＲ３ Ｐ
対 ＰＢＳ、Ｐ＝０．００９；抗−ＴＬＲ３ Ｐ 対 非特異的ＩｇＧ、ｐ＝０．０１；抗−ＴＬＲ３ Ｔｈ 対 ＰＢＳ、Ｐ＝０．０３；抗−ＴＬＲ３ Ｔｈ 対 非特異的ＩｇＧ、ｐ＝０．０４）。

さらに結腸の粘膜傷害は、軽い組織病理学的変化（上皮細胞壊死、陰窩脱落、上皮潰瘍化および浸潤、陰窩損失および陰窩細胞増殖を含む）、および慢性の修復的組織病理学的変化（粘膜固有層での顆粒化組織形成、粘膜下での顆粒化組織、粘膜下の炎症細胞浸潤および粘膜下水腫を含む；図４１ａ）により評価されるように、ＰＢＳまたは非特異的対照ｍＡｂを与えた対照群に比べて、抗−ＴＬＲ３ｍＡｂで治療的に処置した群では重症度が有意に低かった。グラフに示すデータは、ＤＳＳおよび異なる処置を受けた各群のマウスに関するすべての組織病理学的スコアに関する和、軽度な変化に関する和、または慢性的変化に関する和を表す（群：１、ＰＢＳ賦形剤処置；３、予防的抗−ＴＬＲ３ｍＡｂ；４、治療的抗−ＴＬＲ３ｍＡｂ；５、非特異的対照ｍＡｂ）。各グラフの右パネル上の丸は、各処置群に関するスコアの平均および標準偏差を囲う。群間の統計的な有意差は、最少に重複する丸で表す。

特に抗−ＴＬＲ３ｍＡｂ処置は、ＰＢＳまたは非特異的ｍＡｂに比べて上皮潰瘍化を減らし、そして粘膜下および粘膜固有層の顆粒化組織の形成を防いだ（図４１ｂ）。グラフで表すデータは、ＤＳＳおよび異なる処置を受けた各群のマウスに関する組織病理学的スコアを表す（群：１、ＰＢＳ賦形剤処置；３、予防的抗−ＴＬＲ３ｍＡｂ；４、治療的抗−ＴＬＲ３ｍＡｂ；５、非特異的対照ｍＡｂ）。各グラフの右パネル上の丸は、各処置群に関するスコアの平均および標準偏差を囲う。群間の統計的な有意差は、最少に重複する丸で表す。

抗−ＴＬＲ３が付与する防御の潜在的な免疫相関を測定するために、免疫細胞群および全身的サイトカインレベルを調査した。ＤＳＳへの暴露は、脾臓および腸間膜リンパ節における活性化Ｔ細胞の数の上昇を伴うことが観察され（図４２）、公開された報告と一致し、この慢性的な大腸炎モデルにＴ細胞の関与を示す。フローサイトメトリーを使用して、脾臓および腸間膜リンパ節におけるＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＴ細胞の頻度を測定し、全身的および局所的Ｔ細胞の活性化をそれぞれ表す。慢性的な大腸炎は脾臓および腸間膜リンパ節における活性化ＣＤ４＋（ヘルパー）Ｔ細胞の上昇した頻度と関連し、ヘルパーＴ細胞活性化における全体的な増加を示唆している。脾臓における活性化ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の頻度の低下は、腸間膜リンパ節における活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の上昇を伴い、エフェクターＴ細胞の消化管の場所へのトラフィッキングを示唆している。データは２回目のＤＳＳサイクル後の２５日から示す。各記号は１匹のマウスからのデータを表し；水平棒は平均を示す。

さらに、より高い頻度ＣＤ１１ｂ＋細胞がＤＳＳ暴露マウスの脾臓で見いだされ、恐らく炎症性マクロファージの大腸炎に伴う増加を反映している。驚くことに、予防的な抗−ＴＬＲ３ｍＡｂ処置が、有意に減少した脾臓のＣＤ１１ｂ＋細胞の頻度と関連し、ＤＳＳに暴露しなかった対照マウスで見られるレベルまで下がった（図４３）。ＤＳＳに暴露し
た抗−ＴＬＲ３ｍＡｂ処置マウスの脾臓のＣＤ１１ｂ＋細胞の割合は、ＤＳＳを受けなかったマウスの割合と同様であり、そしてＰＢＳ（Ｐ＝０．００１）または非特異的ＩｇＧ（Ｐ＝０．０２）のいずれかを受けたＤＳＳ暴露マウスよりも有意に低かった。データは２回目のＤＳＳサイクル後の２５日から示す。各記号は１匹のマウスからのデータを表し；水平棒は平均を示す。

ＤＳＳ暴露マウスの血清サイトカインプロファイルも、抗−ＴＬＲ３ｍＡｂ処置に関連する変化を示す：上昇したＩＬ−４およびＩＬ−Ｉ０レベルは、抗−ＴＬＲ３ｍＡｂを予防的に受けたマウスで測定された（図４４）。慢性ＤＳＳ大腸炎の誘導中の抗−ＴＬＲ３ｍＡｂ処置は、全身的なＩＬ−４およびＩＬ−１０レベルを強化した。２５日および３７日からのデータを示し、第２および第３回目のＤＳＳサイクル後の時点をそれぞれ表す。各記号は１匹のマウスからのデータを表し；水平棒は平均を示す。ＩＬ−４およびＩＬ−１０は両方が炎症の調節に重要な役割を果たすことが証明された。ＩＢＤの免疫病理の制御においてＩＬ−１０に関する具体的な役割は、ＩＬ−１０ノックアウトマウスが自然に大腸炎を発症するという観察により示唆される。これらの結果は抗−ＴＬＲ３ｍＡｂ処置がＤＳＳ摂取により誘導される炎症およびＴ細胞応答を改変することを示唆する。

合わせると、これらのデータはＴＬＲ３シグナリングを抗−ＴＬＲ３ｍＡｂで遮断することが、慢性大腸炎モデルにおいて疾患の重症度を緩和することを表し、そしてヒトＩＢＤの処置のために抗−ＴＬＲ３ｍＡｂの潜在的効力の証拠を提供する。

実施例７
ｈＴＬＲ３アンタゴニスト処置は敗血症での生存を上げる
敗血症はマウスのような動物で、Ｄ−ガラクトサミンおよびポリ（Ｉ：Ｃ）の投与によりモデル化することができる。そのようなモデルでは、Ｄ−ガラクトサミンは敗血症の「感作物質」として機能するヘパトトキシンであり、そしてポリ（Ｉ：Ｃ）はｄｓＲＮＡを模し、そしてＴＬＲ３を活性化する敗血症誘導分子である。結果はＴＬＲ３アンタゴニスト処置が敗血症のマウスモデルにおいて動物の生存率をほぼ２倍にすることができることを示した。

これらの実験では、メスの野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＰＢＳ担体中の１ｍｇのｈＴＬＲ３アンタゴニスト１０６８ｍＡｂ、ＰＢＳ担体中の１ｍｇの非特異的マウスポリクローナルＩｇＧ調製物、またはＰＢＳ担体単独のいずれかを図１０に示すように腹腔内注射で与えた。各注射は１ｍｌのｍＡｂまたはＰＢＳ中の非特異的ＩｇＧ調製物または１ｍｌのＰＢＳ担体のみからなった。翌日、マウスは１００μｌの滅菌ＰＢＳ中の１０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）および２０ｍｇのＤ−ガラクトサミン（シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．）、セントルイス、ミズーリ州）を図１０に示すように腹腔内注射により受けた。マウスの生存は１日に２回、３日間監視した。すべての評価は確立された動物の扱いおよび使用のガイドラインに従って行った。結果はｈＴＬＲ３アンタゴニスト処置が敗血症のマウスモデルにおいて動物の生存率を上げることを示す（図１０）。

実施例８
ｈＴＬＲ３アンタゴニスト処置は、敗血症のマウスモデルにおいてＩＬ−６およびＴＮＦ−アルファサイトカインの生産を下げる
ｈＴＬＲ３アンタゴニスト処置は、敗血症のマウスモデルにおいて炎症に伴うＩＬ−６（図１１）およびＴＮＦ−アルファ（図１２）サイトカインの血清レベルを下げる。この結果はＴＬＲ３活性を阻害することが、敗血症に貢献するサイトカインのＴＬＲ３媒介型生産を下げることにより、敗血症からの生存を促進できることを示す。

上記実施例６に記載したように処置したマウスの血清は、ポリ（Ｉ：Ｃ）投与から２時間後、ＣＯ_２／Ｏ_２麻酔をかけたマウスの後眼窩洞出血により調製した。血清は室温で血液をインキュベーションし、続いて２５００ｒｐｍで１５分間遠心することにより調製した。血清はサイトカインアッセイ前に−８０℃に保存した。血清サンプル中のサイトカインレベルは、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）装置（ルミネックス社、オースチン、テキサス州）および、適切なＩＬ−６（図１１）、またはＴＮＦ−アルファ（図１２）特異的ｍＡｂ結合ビーズを使用して測定した。各サイトカインに関するＬｕｍｉｎｅｘ（商標）アッセイは、製造元により指示されるように行った。すべての測定は確立された動物の扱いおよび使用のガイドラインに従い行った。

図１１および図１２中の各記号は１匹のマウスからのデータを示す。水平の棒は平均を示す。示すデータは２回の独立した実験の複合である。ｍＡｂ１０６８での処置は、ポリ（Ｉ：Ｃ）投与から２時間後の血清ＩＬ−６レベルを有意に減少させた（Ｐ＝０．０４、ｔ−検定；図１１）。ｍＡｂ１０６８での処置は、ポリ（Ｉ：Ｃ）投与から２時間後の血清ＴＮＦ−アルファレベルを有意に減少させた（Ｐ＝０．０３、ｔ−検定；図１２）。

実施例９
ポリＩ：Ｃ投与は炎症性サイトカインの分泌および肺のＴＬＲ遺伝子発現のアップレギュレーションを誘導する
イソフルランで麻酔をかけたオスまたはメスの野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＰＢＳ中のポリ（Ｉ：Ｃ）またはＰＢＳのみの鼻内投与用量を２４時間毎に３日間、３回受けた。すべてのマウスは１２週齢であった。各ポリ（Ｉ：Ｃ）用量は５０μｇまたは１００μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）のいずれかを表１に示すように含んだ。各用量の容量は５０μｌであった。各処置群は６〜８匹のマウスを含んだ。マウスはＣＯ_２処置により屠殺し、そして肺に最後の投与から２４時間後に肺にカニューレを挿入した。次いで気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を、１ｍＬのＰＢＳを肺に注射し、そして流出物を回収（ｒｅｔｒｉｅｖｉｎｇ）することにより行った。次いでＢＡＬ調製物は遠心して細胞をペレットとし、そして細胞を含まない上清を集め、そしてマルチチャンネルサイトカインアッセイで使用するまで−８０℃で保存した。すべての評価は確立された動物の扱いおよび使用のガイドラインに従って行った。

ＢＡＬ上清中のサイトカインレベルは、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）マルチチャンネル分析（ルミネックス社、オースチン、テキサス州）、および適切なＩＦＮγ、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ１０、ＪＥ、ＫＣ、ＭＧＣＳＦ、ＭＩＰ１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦαまたはＧＭＣＳＦ特異的ｍＡｂ結合ビーズ（ＬＩＮＣＯ リサーチ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、セントチャールズ、ミズーリ州）を使用して測定した。各サイトカインに関するＬｕｍｉｎｅｘ（商標）アッセイは、製造元により指示されるように行った。データは６〜８匹のマウスからの平均ｐｇ／ｍｌ±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。

結果は、５０または１００μｇのポリＩ：Ｃの多数回投与がインターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、組織壊死因子−α（ＴＮＦα）、ケモカイン（ＣＸＣモチーフ）、リガンド１０（ＣＸＣＬ１０）、ケモカイン（ＣＣモチーフ）、リガンド２（ＪＥ）、ケモカインＫＣ（ＫＣ）、マクロファージ炎症タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）、活性化で調節される、正常にＴ細胞が発現し、そして分泌する／ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、マウス顆粒球コロニー刺激因子（ｍＧ−ＣＳＦ）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むサイトカイン、ケモカインおよび増殖因子のタンパク質レベルの上昇を誘導したことを示した（表１）。この結果はＴＬＲ３の活性化がＣＯＰＤのようなサイトカイン、ケモカインおよび増殖因子が媒介する肺の病因に重要な役割を果たし得ることを示す。

さらに肺組織のＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲ分析では、多数回投与がサイトカイン遺伝子ならびに多くのＴＬＲおよびそれらに関連する細胞内シグナリング分子のｍＲＮＡのアップレギュレーションを誘発したことを示す（表２）。これらのデータは、インビボで投与された合成の二本鎖ＲＮＡ類似体であるポリＩ：Ｃが、多くの炎症性サイトカイン、ケモカインの分泌、およびＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９のようなＴＬＲ遺伝子発現のアップレギュレーションをもたらす反応のカスケードを誘導することを示す。

実施例１０
ＴＬＲ３の活性化は、肺組織中のサイトカイン、ケモカイン、増殖因子およびＴｏｌｌ遺伝子転写産物のレベルを上げる
上記実施例８に記載のように処置したオスまたはメスＣ５７ＢＬ／６マウスの肺から抽出した全ＲＮＡの転写産物のレベルは、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定した。全ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ（商標）（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）を使用して、マウスの肺組織サンプルから抽出し、そしてＲＮＥａｓｙ Ｍｉｎｉキット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）、バレンシア、カリフォルニア州）を使用して単離した。次いで６〜８匹の同一に処置したマウスからのＲＮＡをプールした。

ｃＤＮＡは各ＲＮＡプールからＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ（商標）キット（キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州）を使用して製造元の使用説明に従い調製した。１００ｎｇのｃＤＮＡをＴａｑＭａｎ（商標）低密度免疫プロファイリングアレイカード（Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ａｒｒａｙ Ｃａｒｄｄｓ）（ア
プライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスターシティ、カリフォルニア州）またはカスタム低密度アレイ（ｃｕｓｔｏｍ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙ：ＬＤＡ）カードを製造元による指示に従い使用して増幅した。Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ）を使用してプローブおよびプライマーの組み合わせを設計した。次いでＴａｑＭａｎ（商標）ＲＴ−ＰＣＲ（アプライドバイオシステムズ）を３８４ウェル形式でＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標）７０００ＨＴ装置（アプライドバイオシステムズ）で製造元により指示されるように行った。

ＰＣＲの初期対数期におけるデータの回収および転写産物の定量は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標）７０００ＨＴ装置および付随するソフトウェアを用いて行った。個々の転写産物のレベルは、１８ＳリボゾームＲＮＡに関する転写産物に対して標準化した。表２のデータは、ＰＢＳ賦形剤で処置されたマウスに対して、ポリ（Ｉ：Ｃ）の多回投与を受けたマウスにおけるｍＲＮＡの転写産物のレベルの平均増加倍数として表す。データは６〜８匹のマウスからプールしたＲＮＡを表す。

データはＴＬＲ３の活性化が、マウス肺組織中のサイトカイン、ケモカイン、増殖因子およびＴｏｌｌ遺伝子転写産物（例えばＴＬＲ３および他のＴｏｌｌ様受容体）を上昇させることを示す（表２）。この結果はさらにＴＬＲ３の活性化および他のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性化が、サイトカイン、ケモカインおよび増殖因子が媒介する肺の病因に重要な役割を果たし得ることを示している。

実施例１１
ＴＬＲ３の活性化は肺組織の炎症細胞レベルを上げる
ＴＬＲ３の活性化は、マウス肺組織の炎症細胞レベルを上げる（図１３、１４および１５）。この結果は、ＴＬＲ３の活性化が好中球（図１４）および単核細胞（図１５）（例えば単球またはリンパ球）のような炎症細胞の肺浸潤の増加に伴う肺の病理学に重要な役割を果たし得ることを示す。ポリ（Ｉ：Ｃ）を受けたＣ５７ＢＬ／６マウスの肺への炎症細胞の浸潤は、血球計の計数（図１３）または分染法（図１４および１５）のいずれかにより評価された。マウスは上記実施例９に記載されたような多回のポリ（Ｉ：Ｃ）投与または単回のポリ（Ｉ：Ｃ）投与を受けた。単回のポリ（Ｉ：Ｃ）投与はイソフルランで麻酔をかけたオスまたはメスのＣ５７ＢＬ／６マウスの鼻内に投与された。すべてのマウスは８〜１２週齢の間であった。単回投与は５０μＬのＰＢＳ中、５０μｇまたは１００μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）からなった。肺の浸潤細胞を回収するためにＢＡＬは、単回ポリ（Ｉ：Ｃ）投与を受けた動物についてはポリ（Ｉ：Ｃ）投与から２４時間後に、または多回投与を受けた動物に関しては最後のポリ（Ｉ：Ｃ）投与から２４時間後に行った。ＢＡＬは上記実施例８に記載したように行った。

処置したマウスの肺についてのＢＡＬ後に回収した細胞ペレットを、０．１％のＢＳＡを含有する２００μＬのダッベッコリン酸緩衝化塩溶液（ＤＰＢＳ）に再懸濁した。懸濁
した細胞の５０μＬのアリコートを５０μＬのＴｕｒｋの血液希釈液（レッド バード サービス（Ｒｅｄ Ｂｉｒｄ Ｓｅｒｖｉｃｅ）、オスグード、インディアナ州）に加え、徹底的に混合し、そして全細胞数を血球計の計数により数えた（図１３）。次いで１ｘ１０^５細胞／μＬ未満を含有する懸濁液の１００μＬのアリコートを、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ（商標）スライドアッセンブリーに乗せ、そして４分間、４００ｒｐｍで遠心した。スライドをＣｙｔｏｓｐｉｎ（商標）アッセンブリーから取り出し、そして少なくとも１時間乾燥させた。次いでスライドをライト−ギエムザ（Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ）染色に９０秒間沈め、そしてｄｄＨ_２Ｏで５分間脱色した。スライドを一晩乾燥させた。油含浸下、１００ｘ対物レンズを使用して、スライドは分別的にカウントされ、そして好中球（図１４）および単核細胞（図１５）の総数を数えた。各処置群からの６〜８匹のマウスから集めた肺浸潤細胞データの平均およびＳＥＭをプロットした（図１３、１４および１５）。

実施例１２
ＴＬＲ３ノックアウト動物は、肺組織においてポリ（Ｉ：Ｃ）が誘導する炎症細胞レベルの上昇から保護される
炎症細胞の、Ｃ５７ＢＬ／６またはＴＬＲ３ノックアウトマウスまたは単回もしくは多数回ポリ（Ｉ：Ｃ）投与を受けているマウスの肺への浸潤は、血球計の計数および分染法により評価して好中球および単球細胞を同定した。マウスは実施例８に記載したような多回ポリ（Ｉ：Ｃ）投与を、または実施例１０に記載したような単回のポリ（Ｉ：Ｃ）投与を受けた。肺の浸潤細胞を回収するためのＢＡＬは、単回ポリ（Ｉ：Ｃ）投与を受けた動物についてはポリ（Ｉ：Ｃ）投与から２４時間後に、または多回投与を受けた動物に関しては最後のポリ（Ｉ：Ｃ）投与から２４時間後に行った。ＢＡＬは上記実施例８に記載したように行った。炎症細胞の野生型Ｃ５７ＢＬ／６またはＴＬＲ３ノックアウトマウスの肺への浸潤細胞の評価は、実施例１０に記載したように血球計の計数または分染法のいずれかにより数えた。データはＰＢＳのみを受けた動物での平均肺浸潤細胞カウントに対して、ポリ（Ｉ：Ｃ）処置動物での平均肺浸潤細胞カウントにおける増加倍数として表した。データは６匹のマウスから得た値を表す。

表３に示す結果は、ＴＬＲ３ノックアウトマウスが野生型マウスと比べて肺組織でのポリ（Ｉ：Ｃ）誘導型の炎症細胞レベルの上昇から保護されること、およびポリ（Ｉ：Ｃ）投与の効果はほとんどがＴＬＲ３活性化によることを示す。さらに結果はＴＬＲ３活性化が好中球および単核細胞（例えば単球またはリンパ球）のような炎症細胞による上昇した肺への浸潤を伴う肺の病理学に重要な役割を果たし得ることを示す。

実施例１３
ポリ（Ｉ：Ｃ）でのＴＬＲ３の活性化は、メタコリンで対抗（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）した動物の肺機能をさらに損なう
オスまたはメスの野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＰＢＳ中の単回ポリ（Ｉ：Ｃ）投与またはＰＢＳのみ（図１６）、あるいは２４時間毎に３回のＰＢＳ中のポリ（Ｉ：Ｃ）の鼻内投与またはＰＢＳのみを３日間受けた（図１７）。ポリ（Ｉ：Ｃ）はＴＬＲ３を活性化する。すべてのマウスは１２週齢であった。各ポリ（Ｉ：Ｃ）投与は５０μｇまたは１００μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）のいずれかを含み、そして５０μＬの容量からなった。各処置群は６〜８匹のマウスを含んだ。

肺機能は最後のポリ（Ｉ：Ｃ）投与から２４時間後に気道閉塞のマーカーとしてＰｅｎＨ値および呼吸努力を使用して評価した。ＰｅｎＨ値は、図１６または図１７に示すように増加するメタコリン暴露で対抗したマウスからの全体重プレチスモグラフにより集めた。メタコリンは呼吸努力を上げ、そして肺機能を害する。メタコリンはＰＢＳに溶解し、そして噴霧化エーゾルとして投与した。すべての評価は確立された動物の扱いおよび使用のガイドラインに従って行った。図１６および１７に示すデータは、６〜８匹の各処置群からの平均値およびＳＥＭを表す。

結果はＴＬＲ３の活性化がメタコリンで対抗した野生型マウスの肺機能をさらに害することを示す（図１６および図１７）。この結果は、ＴＬＲ３の活性化がさらに、すでに感染、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または他の障害による肺傷害に罹患している個体の肺機能をさらに害する恐れがあることを示唆する。その結果、ＴＬＲ３活性と拮抗する治療的介入はすでに損傷した肺機能に罹患している個体のさらなる肺機能障害を防止することができる。

実施例１４
ＴＬＲ３ノックアウト動物は、メタコリン対抗中に肺機能のポリ（Ｉ：Ｃ）が誘導する傷
害から保護される
実施例１２に記載したように、単回（図１８）および多回用量（図１９）のポリ（Ｉ：Ｃ）投与を、オスまたはメスの野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＴＬＲ３ノックアウトマウスに行った。肺機能は実施例１２に記載したようにＷＥＰにより集めたＰｅｎＨ値を使用して評価した。メタコリン投与も実施例１２に記載した通りであった。すべての評価は確立された動物の扱いおよび使用のガイドラインにしたがって行った。図１８および１９に示すデータは、６〜８匹の各処置群からの平均値およびＳＥＭを表す。

ＴＬＲ３ノックアウトマウスは、メタコリン対抗中にポリ（Ｉ：Ｃ）誘導型の肺機能の傷害から保護される。この結果はＴＬＲ３活性と拮抗する治療的介入はすでに感染、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または喘息のような他の障害により傷害を受けた肺機能に罹患している個体のさらなる肺機能傷害を防止することができる。

加えて、この結果はポリ（Ｉ：Ｃ）投与の効果が大部分、ＴＬＲ３活性化に依ることをさらに示す。

実施例１５
ヒト肺気管支上皮細胞においてサイトカインおよびケモカイン生産に及ぼすｈＴＬＲ３アンタゴニスト効果
ヒト肺気管支上皮細胞株ＢＥＡＳ−２Ｂは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＣＲＬ−９６０９）から得た。ＢＥＡＳ−２ＢはコラーゲンＩ被覆フラスコ中で（ＢＤ
バイオサイエンス：Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＬＨＣ−９無血清培地にて成長させ、そして０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡで軽く洗浄した後に回収した。次いで細胞をＬＨＣ−９無血清培地（バイオソース：Ｂｉｏｄｏｕｒｃｅ）で洗浄し、そしてＬＨＣ−９培地に１ｘ１０^６／ｍｌで再懸濁した。細胞はコラーゲンＩ被覆９６ウェル平底プレートに２００μｌ／ウェルでプレーティングし；３連の培養ウェルを各条件について実験した。

細胞を接着させるために６時間インキュベーションした後、培地を取り出し、そして２００μｌの新しい培地と交換した。１００μｇ／ｍｌから始まるｍＡｂ１０６８の１０倍の連続希釈物を３７℃で４０分間インキュベーションした後、１２５ｎｇ／ウェルのＴＬＲ３アゴニストポリ（Ｉ：Ｃ）を加えた。培養上清をポリ（Ｉ：Ｃ）での刺激から２４時間後に集め、そしてＬｕｍｉｎｅｘ（商標）マルチチャンネル分析（ルミネックス社、オースチン、テキサス州）をサンプルについて行って、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＩＰ−１０、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１０の発現レベルをアッセイした。

結果は抗−ＴＬＲ３アゴニストｍＡｂ１０６８（図２０ではｍＡｂ ＣＮＴＯ２６０と確認される）がポリ（Ｉ：Ｃ）刺激化ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞においてＩＬ−６、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１およびＩＰ−１０生産を下げることが示された。ｍＡｂ１０６８中のＩＬ−６、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１およびＩＰ−１０の発現は、図２０に示すようにｍＡｂ１０６８用量依存的様式で減少した。ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１０発現はサンプル中に検出されなかった。

実施例１６
ｈＴＬＲ３アンタゴニストの処置は致死的肺炎からの生存を上げる
これらの実験では、８〜１０週齢のメスの野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、５０μｌのＰＢＳ中、５プラーク形成単位（ＰＦＵ）のインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８で鼻内感染させ、そして次いで７日後、５０μｌのＰＢＳ中、５０コロニー形成単位（ＣＦＵ）の肺炎双球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の菌体を鼻内感染させた。投与したウイルス
および細菌用量のみでは致死以下であるが、これらの用量は一緒にするとほとんどのマウスに致死的であった（図２２）。モック感染したマウスの対照群は、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８または肺炎双球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の代わりにＰＢＳを受けた。ｈＴＬＲ３アンタゴニスト処置マウスは、０．２ｍｌのＰＢＳ中、０．６ｍｇまたは０．０６ｍｇのいずれかを、７日目に肺炎双球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の接種２時間前に腹腔内投与され（予防的処置）、そして８日目に再度、同じく投与された（治療的投与）。モック処置したマウスの対照群は、腹腔内に投与される非特異的ＩｇＧの０．６ｍｇまたは０．０６ｍｇ（ＰＢＳ中）を受けた。各処置または対照群は、７匹のマウスを含んだ。本明細書に記載するすべての評価は、ＩＡＣＵＣガイドラインに従い行った。

インフルエンザＡ／ＰＲ／８ウイルスはニワトリ卵中で培養し、ＰＦＵ力価はＭＤＣＫ細胞を用いた標準アッセイを使用して測定し、そして接種用の凍結ウイルスストックとして維持した。肺炎双球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＡＴＣＣ（商標）番号：６３０１（商標））接種物は、５％のヒツジ血液（ＴＳＡ／血液）を含有するトリプチカーゼ大豆寒天プレート上で一晩成長させ、次いで細菌をプレートから取り出し、そしてリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）に懸濁した。ＰＢＳ懸濁液中の細菌のＣＦＵ力価は、６００ｎｍの光学密度および標準法を使用して計算した。次いで細菌接種物をＰＢＳ中に調製した。細菌調製物中のＣＦＵは標準コロニー形成アッセイにより確認して、マウスに接種する接種物中に実際に存在する細菌の数を決定した。

接種物の調製後、マウスは上記のようにインフルエンザＡ／ＰＲ／８ウイルスまたは肺炎双球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）で鼻内感染させた。モック感染対照マウスは上記のように鼻内投与したＰＢＳを受けた。ｈＴＬＲ３アンタゴニストで処置したマウスは腹腔内に投与したｍＡｂ１０６８を、上記のように予防的または治療的の両方で受けた。モック処置した対照マウスは、上記のようにＰＢＳ中の非特異的ＩｇＧを腹腔内投与で受けた。インフルエンザＡ／ＰＲ／８ウイルスおよび肺炎双球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）用量単独での感染は、ウイルスまたは細菌に感染したマウスの１００％が生存することから致死以下であった（図２２）。しかしウイルスまたは細菌の感染は一緒になるとそうではなくこれらの致死以下の用量で、マウス大部分に致死的な肺炎を生じた（図２２）。

マウスは細菌感染後４８時間で安楽死させ、肺を無菌的に摘出し、滅菌ＰＢＳ中で均一化し、ホモジネート希釈物をＰＢＳで調製し、そして希釈物をＴＳＡ／血液プレート上に置いて、肺中の細菌負荷量（ｂｕｒｄｅｎ）を決定した。次いで血小板をコロニーが見えるようになるまでインキュベーションし、そしてＣＦＵを数えた。図２３に示すように、致死未満用量のインフルエンザウイルスで感染させる前、肺炎双球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染から２日後のマウスの肺で細菌負荷量が増加した。

８および９日にマウスあたり０．６ｍｇまたは０．０６ｍｇの抗−ＴＬＲ３ｍＡｂ１０６８投与は、０．６ｍｇまたは０．０６ｍｇの非特異的ＩｇＧ対照ｍＡｂを受けた対照マウスに比べて、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８および肺炎双球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に感染したマウスでのマウス生存率を上げた（図２１）。

重要なことは、平均メスＣ５７ＢＬ／６マウスの体重が１８ｇから２０ｇの間であり；結局、投与したＴＬＲ３アンタゴニストの用量範囲は、０．６ｍｇのｍＡｂ１０６８を受けたマウスに関しては約３．０ｍｇ／ｋｇから３．３ｍｇ／ｋｇの間、または０．０６ｍｇのｍＡｂ１０６８を受けたマウスに関しては約３０ｍｇ／ｋｇから３３ｍｇ／ｋｇの間であった。図２１はこの範囲の下端を示すために標識されている。

実施例１７
結腸上皮細胞増殖率に及ぼすＴＬＲ３活性の効果
マウスモデルの結腸上皮細胞の増殖率は、ＴＬＲ３受容体遺伝子活性をノックアウトすることにより上昇した（データは表４に示す）。これらの実験で、上記のメスの野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＴＬＲ３ノックアウトマウスにそれぞれ１ｍｌのＰＢＳ中、１ｍｇのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を腹腔内投与し、そして２時間後に屠殺した。すべてのマウスは６〜８週齢であり、そして各処置群は少なくとも３匹のマウスを有した。

次いで組織病理学的分析用の結腸を回収した。結腸組織を固定し、切片に切断し、パラフィンに包埋し、そして５μｍの切片を調製した。切片を順次、マウス抗−ＢｒｄＵ ＩｇＧ ｍＡｂ（ベクトン−デッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）バイオサイエンス社、サンジョーズ、カリフォルニア州）、ヤギ抗−マウスＩｇＧｍＡｂ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体（ベクトン−デッキンソンバイオサイエンス社、サンジョーズ、カリフォルニア州）、およびジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質（ベクトン−デッキンソンバイオサイエンス社、サンジョーズ、カリフォルニア州）と、製造元の使用説明によりインキュベーションした。インキュベーションした切片は標準法によりヘマトキシリンでカウンター染色した。

次いでインキュベーションした切片を視覚的に調査し、そしてＤＮＡへのＢｒｄＵ取り込みについて陽性に染色された結腸陰窩中の細胞数を数えた。細胞は結腸の同じセグメントから切片中の２４の連続するウェルで並んだ陰窩中で数えた。ＢｒｄＵの取り込みは、細胞サイクルを進行的に通っている細胞を同定するための代理マーカー、すなわち増殖している細胞として使用した。表４では、増殖率を２時間あたりの動物毎の結腸陰窩当たりＢｒｄＵ染色された細胞数の平均として表す。これらのデータは平均増殖速度±標準偏差（ｐ＜０．０００１、Ｔ検定）として提示する。データはＴＬＲ３の不活性化が結腸上皮細胞増殖を上げることを示す。

実施例１８
炎症性腸疾患からの回復中の結腸上皮細胞増殖率に及ぼすＴＬＲ３活性の効果
炎症性丁疾患（ＩＢＤ）のマウスモデルにおいて、回復中の結腸上皮細胞の増殖率は、ＴＬＲ３受容体遺伝子活性をノックアウトすることにより上昇した（表５）。これらの実験では、上記のメスの野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＴＬＲ３ ＫＯマウスにそれぞれ飲料水中の５（重量／容量）％の硫酸デキストランナトリウムを３日間与え、急性の潰瘍性大腸炎を誘導した。次いでマウスには３０時間後の実験終了まで普通水を与えた。マウスは上記のようにＢｒｄＵを注射され、６時間後、それらは普通水を飲み始めた。次いでマウスはＤＳＳが誘導した潰瘍性大腸炎から２４時間、回復させ、そして屠殺した。すべてのマウスが６〜８週齢であり、そして各処置群は少なくとも３匹のマウスを含んだ。

結腸陰窩細胞増殖の組織病理学的分析用の結腸サンプルを調製し、そして上記実施例１５のように分析した。増殖率データは２４時間あたりの動物毎の結腸陰窩毎にＢｒｄＵ染色された細胞の平均数として表す。これらのデータは平均増殖率±標準偏差（Ｐ＜０．０
０４、Ｔ検定）として提示する。表５のデータは、ＴＬＲ３の活性化が炎症性腸疾患の回復中に結腸上皮細胞の増殖率を上げることを示す。

実施例１９
ＴＬＲ３ノックアウトマウスでのインスリン感受性
ＴＬＲ３ノックアウト（ＫＯ）（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラインドで）および野生型（ＷＴ）対照マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６）に、６０．９％ ｋｃａｌの脂肪および２０．８％ｋｃａｌの炭水化物からなる高脂肪食を与えた（ピュリナ（Ｐｕｒｉｎａ）、ＴｅｓｔＤｉｅｔ、＃５８１２６）。対照ＴＬＲ３ＫＯおよびＷＴマウスは標準食を与えた。動物は一晩絶食させ、そして耐糖試験（ＧＴＴ）を、１．０ｍｇ／ｇのグルコースを腹腔内注射することにより行い、そして血中グルコースの読み取りを０、１５、３０、６０、９０および１２０分で得た。

図３１は、１４および２６週間の高脂肪食のＴＬＲ３ ＫＯマウスが、高脂肪食の野生型マウスと比較した時、耐糖試験で改善を示したことを表す。標準食を与えたマウスは予想されたような変化を示さなかった。これらの結果はＴＬＲ３シグナリングがインスリン感受性に影響を及ぼす可能性があり、そして２型糖尿病の処置にＴＬＲ３アンタゴニストの用途の基礎を提供する。

図３２は、高脂肪および普通食のマウスにおける空腹時血中グルコースレベルを表す。ＴＬＲ３ ＫＯマウスは、高脂肪食の野生型マウスと比べた時、それらの空腹時血中グルコースレベルを標準化する。これらのデータはＴＬＲ３シグナリングが耐糖における傷害、およびインスリン抵抗性の発症に貢献する肝臓グルコース代謝を妨害する恐れを示唆している。

次にインスリンレベルを、標準食または高脂肪食を与えたＴＬＲ３ ＫＯおよび野生型マウスで評価した。血中インスリンレベルは、グルコース対抗前および後に一晩絶食させたマウスで測定した。インスリンはＣｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ（ダウナーズグローブ（Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ）、イリノイ州）超感度ＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｃａｔ＃９００６０）を使用して定量した。高脂肪食を与えたＴＬＲ３ ＫＯマウスは、ベースラインで（グルコース対抗無しで）およびグルコース対抗から２０および６０分後に上昇したインスリンレベルを示した（図３３）。全体として耐糖試験で得られたデータは、ＴＬＲ３シグナリングの不存在がインスリンレベルおよびインスリン感受性に影響を及ぼすことを示唆する。

高脂肪食の３０週目で、ＴＬＲ３ ＫＯマウスを屠殺し、そしてそれらの脂質プロファイルを血清サンプル中で測定した。総コレステロール、ＨＤｌ、ＬＤＬ、トリグリセリドおよびＦＦＡのレベルを測定した。簡単に説明すると、すべての脂質試験はＧＥＭＣＡＬ参照血清（アルファ ワズセラマン ダイアグノスティック テクノロジー（Ａｌｆａ Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＬＣＣ、
ウエストカードウェル、ニュージャージー州）を使用して、標準の吸収における変化に対して、未知のサンプルの吸収における変化を参照にすることにより算出した。２つのレベルの対照を結果を報告する前に毎日し実験した。サンプルを乗せ、そして脂質データを得、そして通例の単位ｍｇ／ｄＬで表した。ＦＦＡレベルはＮＥＦＡキット（ワコー：Ｗａｋｏ）を使用して決定した。ＴＬＲ３ ＫＯ動物は循環コレステロール、ＬＤＬおよびＨＤＬならびにＦＦＡにおいて、同じ食事の野生型マウスに比べて低いレベルを示した。これらの結果はＴＬＲ３シグナリングの不存在がコレステロールレベルを下げる有益な役割を有することを示し、ＴＬＲ３アンタゴニストＭＡｂの、２型糖尿病に伴う心血管障害の処置および心血管合併症の発症の防止に用途を示す。

まとめると提示する結果は、高脂肪食を与えたＴＬＲ３ＫＯマウスが野生型マウスに比べてインスリン抵抗性の特徴としての傷害のある耐糖の発症から保護されることを示し、ＴＬＲ３シグナリングの不存在がマウスを２型糖尿病に対する保護を示す。さらにデータは高脂肪食のＴＬＲ３ ＫＯマウスは、高脂肪食の野生型マウスに比べて低いレベルの総コレステロール、ＬＤＨおよびＨＤＬコレステロール、ならびにＨＤＬｃ／ＬＤＬｃ比を有し、これは心血管障害に伴う危険因子のダウンモジュレーティイングにＴＬＲ３アンタゴニストの有益な役割を示す。これらの知見は、２型糖尿病、脂質代謝異常およびメタボリックシンドロームを処置するための方法としてＴＬＲ３インヒビターの使用を示唆している。

実施例２０
ヒトに適合した抗−ＴＬＲ３ｍＡｂの作成および特性決定
マウス抗−ＴＬＲ３ ｍＡｂ Ｃ１０６８のアミノ酸配列を使用して公的な抗体配列データベースから編集されたヒト抗体データベースに質問した。Ｃ１０６８の重鎖の可変領域は（配列番号６）、４つの重鎖生殖細胞系配列、すなわちヒトＶＨ１重鎖ファミリーのＶＢ １−０３／ＪＨ１ ７２、ＶＢ １−０２／ＪＨ１ ７１、ＶＢ １−０８／ＪＨ１ ７１およびＶＢ １−６９／ＪＨ２ ７０と高い相同性を示した。Ｃ１０６８重鎖のＣＤＲ領域が選択されたヒト生殖細胞系重鎖配列に移された４つの核酸構築物を合成して、配列番号２５、２７、２９および３１にそれぞれ示す可変領域アミノ酸配列を有するＨＶ１、ＨＶ４、ＨＶ５およびＨＶ７と命名された４つのヒトに適合した抗−ＴＬＲ３ ｍＡｂ重鎖を作成した。

Ｃ１０６８の軽鎖の可変領域（配列番号１６）は、４つの軽鎖生殖細胞系配列、すなわちヒトＶＫ ＩファミリーのＶＢ ０１２／ＪＫ２ ７８、ＶＢ Ａ３０／ＪＫ２ ７７、ＶＢ Ａ２０／ＪＫ４ ７６およびＶＢ Ｌ１／ＪＫ２ ７６と高い相同性を示した。Ｃ１０６８軽鎖のＣＤＲ領域が選択されたヒト生殖細胞系軽鎖配列に移された４つの核酸構築物を合成して、配列番号３３、３５、３７および３９にそれぞれ示す可変領域アミノ酸配列を有するＬＶ１、ＬＶ３、ＬＶ５およびＬＶ７と命名された４つのヒトに適合した抗−ＴＬＲ３ ｍＡｂ軽鎖を作成した。

４種の重鎖および４種の軽鎖可変領域構築物のすべての可能な組み合わせを表す１６のｍＡｂが発現された。すべての重鎖可変領域骨格は、残基１０８でＳｅｒからＰｒｏへの置換、およびＰｈｅ１１４およびＬｅｕ１１５のＡｌａ置換（配列番号４１）；Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを完全長の重鎖に有するヒトＩｇＧ４重鎖構築物領域を用いて発現された。すべての軽鎖可変領域骨格は、ヒトＫ定常領域（配列番号４）を使用して発現された。

抗体は適切な重鎖および軽鎖含有プラスミドのコートランスフェクションにより哺乳動物細胞中で一時的に発現された。抗体は標準的なプロテインＡ精製を使用して精製し、そして特性決定のためにＰＢＳ中に透析した。

１６種すべてのｍＡｂは、元のマウスｍＡｂ Ｃ１０６８と比べるように、ＥＬＩＳＡ形式を使用してヒトＴＬＲ３の細胞外ドメイン（配列番号４）に結合することを評価された。簡単に説明すると、可溶性のヒトＴＬＲ３細胞外ドイメンを、９６ウェルプレートのウェルにコーティングし、そして候補ｍＡｂを種々の濃度（１０^−３〜１０^３ｎｇ／ｍｌ）でインキュベーションし、そして結合した抗体はウサギ抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰを用いて、マウスＩｇＧ１アイソタイプ（ザイメッド（Ｚｙｍｅｄ）、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）について、またはＨＲＰ−標識抗−ヒトＩｇＧ（ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）１０９−０３６−０８８）を用いて、ヒトＩｇＧ４アイソタイプについて検出した。ＥＣ_５０値を決定し、そして結果を以下の図２４および表７に示す。

Ｃ１０６８について算出したＥＣ_５０は８ｎｇ／ｍｌであり；この結果は１２のヒト適合化ｍＡｂがマウスの元のｍＡｂ１０６８に比べて算出されたＥＣ_５０において４０倍未満の低下を有することを示した。太字のＥＣ_５０値を有するｍＡｂは、Ｂｉａｃｏｒｅにより結合親和性を決定し、そして細胞に基づくサイトカイン放出アッセイで結合活性を決定することによりさらに特性決定した。

Ｂｉａｃｏｒｅによる結合親和性の測定は、ｍＡｂ捕捉およびＴＬＲ３捕捉技法により行った。ＭＡｂ捕捉分析は、２５℃で標準的なアミンカップリングによりプロテインＡ（６，０００ＲＵ）で修飾された表面を有するＣＭ５チップを備えたＢｉａｃｏｒｅ２０００バイオセンサーを使用して２５℃で行った。抗体は３０ｎＭに希釈し、そして１分間、異なるプロテインＡ表面上で捕捉された。ＴＬＲ３は０、０．１、０．３、１．０、３．０および９．０ｎＭで注射し、そして会合および解離を５分間監視した。プロテインＡ修飾表面は、１００ｍＭリン酸の２回の６秒間のパルスを使用して再生した。利用可能な結合データ組は１：１の相互作用モデル（ＣＬＡＭＰ（商標））に合わせた。速度定数およびそれらの比（Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｄ／Ｋ_ａ）および見掛けの平衡定数の予想について行った適合の誤差を算出した。

ＴＬＲ３捕捉分析は、３０℃で標準的なアミンカップリングにより抗−Ｈｉｓ抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ）（１０，０００ＲＵ）で修飾された表面を有するＣＭ５チップを備えたＢｉａｃｏｒｅ３０００バイオセンサーを使用して２５℃で行った。８０、１２０および３００ＲＵ密度でヒト ヘキサ−ヒスチジン−ＴＬＲ３を３面上で捕捉し、同時に４面は参照として使用した。抗体は０、０．４、１．１、３．３、１０および３０ｎＭで二連にて注射した。会合相を３分間監視し、そして解離を７分間監視した。抗−Ｈｉｓ抗体表面は５０ｍＭ リン酸の２回の３秒間のパルスを使用して再生した。利用可能な結合データ組は、各ｍＡｂ濃度のプロファイルの異なるドリフトについて集めた１：１の相互作用モデル（ＢＩＡｅｖａｌ（商標））に合わせた。速度定数およびそれらの比（Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｄ／Ｋ_ａ）および見掛けの平衡定数の予想について行った適合の誤差を算出した。

算出されたＫ_Ｄの結果を以下の表８に示す。２つの測定は、１）溶液中に適用されたヒトＴＬＲ３を用いてチップ表面上で捕捉された抗−ＴＬＲ３ ｍＡｂでの結合親和性、お
よび２）チップ上および溶液相中に適用した抗−ＴＬＲ３ ｍＡｂで捕捉されたＴＬＲ３を表す。結果は、溶液に基づくＴＬＲ３が固定化されたｍＡｂにより捕捉された時、すべての候補物質がｎＭの親和性を保持することを示し、組み合わせｍＡｂが１０６８の結合特性を保持したことが確認された。ＴＬＲ３が、ほとんどの候補物質が強力な結合特性を保持するチップ上に固定化された時、その結果はＥＬＩＳＡ結合曲線と一致する。

Ｂｉａｃｏｒｅによりアッセイされたヒトに適合した抗−ＴＬＲ３ ｍＡｂの結合活性も、細胞に基づくサイトカイン放出アッセイで測定した。ヒト肺上皮細胞株ＢＥＡＳ−２Ｂは、９６ウェルプレートにまき、そしてポリ（Ｉ：Ｃ）、または無血清マトリックス中で抗体候補と前インキュベーションしたポリ（Ｉ：Ｃ）のいずれかを細胞に加えた。４日後、コンディショニング培地を除去し、そして可溶性サイトカインレベルをＬｕｍｉｎｅｘ（商標）技法により測定した。結果を図２５に示し、そして元のｍＡｂ Ｃ１０６８の生物学的活性、すなわちＴＬＲ３ リガンドポリ（Ｉ：Ｃ）で対抗した細胞により生成された炎症性サイトカインの減少により測定されるＴＬＲ３活性の中和が、ヒト適合化ｍＡｂで保持されたことを証明する。

実施例２１
ヒト適合化Ｃ１０６８重鎖および軽鎖バリアントの生成および特性決定
マウス抗−ＴＬＲ３ ｍＡｂ １０６８ ＣＤＲのＩｎ ｓｉｌｉｌｃｏ免疫原性分析は、配列の免疫原性スコアを下げるように操作することができるＣＤＲ境界内の一連のアグレトープを明らかにした。いったん操作できる領域が同定されれば、配列および構造の両方の基準が、どのアミノ酸置換を使用すべきかを決定するために適用された。これらの基準を使用して、４つの１点アミノ酸置換を重鎖可変領域（Ｖ_Ｒ）内に、そして３つの突然変異（単一、２重および３重）を軽鎖可変領域（Ｖ_ｋ）内に同定した。すべての８つの突然変異をＨＶ１／ＬＶ１バックグラウンド内に独立して作成し、そして表９に列挙する。１つの他の型の置換も、Ｍ１０２残基をイソロイシンに交換する効果を測定するために適用し、これはこれらの残基の潜在的にタンパク質の溶解性に良くない修飾を翻訳後に酸化することができるように、これはＣＤＲ中のメチオンの全数を減らすように仕上げられた。これらの抗体を生成し、そしてＴＬＲ３結合（表１０および１１を参照にされたい）および生物活性（図２６〜３０を参照にされたい）について評価した。

ＨＶ１／ＬＶ１バックグラウンドに移植された１０６８ＣＤＲのＶｈ中に作成されたすべての５個の１点突然変異は、ヒトＴＬＲ３に対する結合ＥＣ５０により示されるように十分に寛容化されていた。ＨＶ１／ＬＶ１バックグラウンドのＥＣ_５０は２９．２ｎｇ／ｍｌであり：Ｉ３４ＭおよびＹ６０Ｇの両方に関する値はこれより低く、それぞれ１７および１４．６ｎｇ／ｍｌであった。これはこれらの変化がＨＶ１／ＬＶ１のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ免疫原性を下げるだけでなく、ＴＬＲ３への結合も改善することを示唆している。他の３つの突然変異は、ＨＶ１／ＬＶ１よりも少し弱く結合した。

Ｖ１のＣＤＲ１中の突然変異のいずれも寛容ではなく（ＥＣ５０＞１０００ｎｇ／ｍｌ）、この領域はどのように１０６８がヒトＴＬＲ３を認識するかに重要であることを示唆している。

ここで本発明は完全に説明され、当業者には添付する特許請求の精神または範囲から逸脱することなく、多くの変化および修飾が作成できることが明白である。以下、本発明の主たる態様または特徴について記載する。

態様１：
活性化について調節された、正常Ｔ細胞発現型および分泌型（ＲＡＮＴＥＳ）サイトカインの細胞生産を阻害するＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）のアンタゴニスト。

態様２：インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）およびマクロファージ炎症タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ１−アルファ）からなる群から選択されるサイトカインの細胞生産も阻害される態様１に記載のアンタゴニスト。

態様３：アンタゴニストが抗体である態様１または２に記載のアンタゴニスト。

態様４：配列番号９、１１および１３に示す重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、および配列番号１９、２１および２３に示す軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を含んでなるモノクローナル抗体の抗原結合能力を有するＴＬＲ３と反応性の単離された抗体。

態様５：配列番号９、１１および１３に示す重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列、および配列番号１９、２１および２３に示す軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を含んでなる態様４に記載の単離された抗体。

態様６：配列番号６に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）、および配列番号１６に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含んでなる態様４に記載の単離された抗体。

態様７：配列番号２５、２７、２９または３１に示すアミノ酸配列を有するＶ_Ｈ、および配列番号３３、３５、３７または３９に示すＶ_Ｌアミノ酸配列を含んでなる態様４に記載の単離された抗体。

態様８：Ｖ_Ｈが配列番号２５に示すアミノ酸配列を有し、そしてＶ_Ｌが配列番号３３に示すアミノ酸配列を有する態様７に記載の単離された抗体。

態様９：式（Ｉ）：
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｘａａ_１ Ｈｉｓ
（Ｉ）
式中、Ｘａａ_１はＩｌｅまたはＭｅｔである
で示されるＶ_Ｈ ＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号６１）；
式（ＩＩ）：
Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｓｎ
Ｘａａ_２ Ｘａａ_３ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｘａａ_４ Ｌｙｓ Ｔｈｒ
（ＩＩ）
式中、Ｘａａ_２はＴｙｒまたはＧｌｙであり、Ｘａａ_３はＡｓｎまたはＡｌａであり、そしてＸａａ_４はＰｈｅまたはＧｌｙである、
で示されるＶ_Ｈ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号６２）；および
式（ＩＩＩ）：
Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｘａａ_５ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｔｙｒ
（ＩＩＩ）
式中、Ｘａａ_５はＭｅｔまたはＩｌｅである、
で示されるＶ_Ｈ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号６３）；
および配列番号１９、２１および２３に示すアミノ酸配列を有するＶ_Ｌ ＣＤＲ、
を有する単離された抗体。

態様１０：Ｘａａ_１がＭｅｔであり；Ｘａａ_２がＴｙｒであり；Ｘａａ_３がＡｓｎであり；Ｘａａ_４がＰｈｅであり；そしてＸａａ_５がＭｅｔである、態様９に記載の単離された抗体。

態様１１：Ｖ_Ｈが配列番号４５に記載のアミノ酸配列を有し、そしてＶ_Ｌが配列番号３３に記載のアミノ酸配列を有する、態様１０に記載の単離された抗体。

態様１２：Ｘａａ_１がＩｌｅであり；Ｘａａ_２がＧｌｙでり；Ｘａａ_３がＡｓｎであり；Ｘａａ_４がＰｈｅであり；そしてＸａａ_５がＭｅｔである、態様９に記載の単離された抗体。

態様１３：Ｖ_Ｈが配列番号４７に示すアミノ酸配列を有し、そしてＶ_Ｌが配列番号３３に示すアミノ酸配列を有する、態様１２に記載の単離された抗体。

態様１４：Ｘａａ_１がＩｌｅであり；Ｘａａ_２がＴｙｒであり；Ｘａａ_３がＡｌａであり；Ｘａａ_４がＰｈｅであり；そしてＸａａ_５がＭｅｔである、態様９に記載の単離された抗体。

態様１５：Ｖ_Ｈが配列番号４９に示すアミノ酸配列を有し、そしてＶ_Ｌが配列番号３３に示すアミノ酸配列を有する、態様１４に記載の単離された抗体。

態様１６：Ｘａａ_１がＩｌｅであり；Ｘａａ_２がＴｙｒであり；Ｘａａ_３がＡｓｎであり；Ｘａａ_４がＧｌｙであり；そしてＸａａ_５がＭｅｔである、態様９に記載の単離された抗体。

態様１７：Ｖ_Ｈが配列番号５１に示すアミノ酸配列を有し、そしてＶ_Ｌが配列番号３３に示すアミノ酸配列を有する、態様１６に記載の単離された抗体。

態様１８：Ｘａａ_１がＩｌｅであり；Ｘａａ_２がＴｙｒであり；Ｘａａ_３がＡｓｎであり；Ｘａａ_４がＰｈｅであり；そしてＸａａ_５がＩｌｅである、態様９に記載の単離された抗体。

態様１９：Ｖ_Ｈが配列番号５３に示すアミノ酸配列を有し、そしてＶ_Ｌが配列番号３３に示すアミノ酸配列を有する態様１８に記載の単離された抗体。

態様２０：Ｖ_Ｈが配列番号４５、４７、４９、５１または５３に示すアミノ酸配列を有し、そしてＶ_Ｌが配列番号３３、３５、３７または３９に示すアミノ酸配列を有する態様９に記載の単離された抗体。

態様２１：抗体がヒト起源である態様４に記載の単離された抗体。

態様２２：抗体がマウス起源である態様４に記載の単離された抗体。

態様２３：抗体がＦａｂフラグメントを含んでなる態様４に記載の単離された抗体。

態様２４：抗体がｓｃＦｖフラグメントを含んでなる態様４に記載の単離された抗体。

態様２５：抗体またはフラグメントがヒトに適合している態様４に記載の単離された抗体。

態様２６：抗体またはフラグメントがキメラ抗体を含んでなる態様４に記載の単離された抗体。

態様２７：抗体がポリエチレングリコールに結合している態様４に記載の単離された抗体。

態様２８：抗体またはフラグメントがマウス抗原結合残基およびヒト抗体残基を含んでなる、態様４に記載の単離された抗体。

態様２９：ＩｇＧ４アイソタイプを有する態様４に記載の単離された抗体。

態様３０：ＦｃドメインがＳ２２８Ｐ、Ｐ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を含んでなる、態様２９に記載の単離された抗体。

態様３１：態様４に記載の単離された抗体および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる製薬学的組成物。

態様３２：配列番号９、１１および１３に示すＣＤＲアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド。

態様３３：配列番号１９、２１および２３に示すＣＤＲアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド。

態様３４：配列番号６、２５、２７、２９、３１、４５、４７、４９、５１または５３に示すアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド。

態様３５：配列番号５、２６、２８、３０、３２、４６、４８、５０、５２または５４に示す配列を含んでなる態様３４に記載のポリヌクレオチド。

態様３６：配列番号１６、３３、３５、３７または３９に示すアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド。

態様３７：配列番号１５、３４、３６、３８または４０に示す配列を含んでなる態様３６に記載のポリヌクレオチド。

態様３８：態様３２、３３、３４、３５、３６または３７に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなるベクター。

態様３９：態様３８に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。

態様４０：ＴＬＲ３と反応性の抗体の作成方法であって、態様３９に記載の宿主細胞を培養し、そして宿主細胞により生産された抗体を回収することを含んでなる上記作成方法。

態様４１：態様４に記載の抗体を生産するハイブリドーマ細胞株。

態様４２：態様４に記載の単離された抗体を、ＴＬＲ３受容体を発現する細胞と、ＲＡＮＴＥＳの生産を阻害するために十分な時間接触させることを含んでなる、ＲＡＮＴＥＳの細胞生産を阻害する方法。

態様４３：ＩＬ−６、ＩＬ−８またはＭＩＰ１−アルファの細胞生産も阻害される、態様４２に記載の方法。

態様４４：炎症状態を処置または防止する方法であって、治療に有効な量のＴＬＲ３アン
タゴニストをそれが必要な患者に炎症状態を処置または防止するために十分な時間、投与することを含んでなる上記方法。

態様４５：炎症状態が敗血症に伴う状態である態様４４に記載の方法。

態様４６：炎症状態が炎症性腸疾患である態様４４に記載の方法。

態様４７：炎症状態が感染に伴う状態である態様４４に記載の方法。

態様４８：炎症状態が炎症性肺状態である態様４４に記載の方法。

態様４９：炎症状態が２型糖尿病、脂質代謝異常またはメタボリックシンドロームである態様４４に記載の方法。

態様５０：炎症状態が自己免疫疾患により引き起こされる態様４４に記載の方法。

態様５１：ＴＬＲ３アンタゴニストをＴＬＲ３受容体を発現する細胞と細胞の増殖率を上げるために十分な時間、接触させることを含んでなる、細胞の増殖率を上げる方法。

態様５２：細胞が動物の組織に存在する態様５１に記載の方法。

態様５３：細胞が上皮細胞である態様５１に記載の方法。

態様５４：組織が結腸組織である態様５２に記載の方法。

態様５５：組織が炎症状態に伴う病状を現す態様５２に記載の方法。

態様５６：炎症状態が炎症性腸疾患である態様５５に記載の方法。

態様５７：細胞死から生じる状態を処置または防止する方法であって、治療に有効な量のＴＬＲ３アンタゴニストをそれが必要な患者に、状態を処置するために十分な時間、投与することを含んでなる上記方法。

態様５８：ＴＬＲ３アンタゴニストが、配列番号９、１１および１３に示す重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列、および配列番号１９、２１および２３に示す軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を含んでなるモノクローナル抗体の抗原結合能を有するＴＬＲ３と反応性の単離された抗体である、態様４４、５１または５７に記載の方法。

態様５９：ＴＬＲ３と反応性の単離された抗体が、配列番号９、１１および１３に示す重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列、および配列番号１９、２１および２３に示す軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を含んでなる、態様５８に記載の方法。

態様６０：単離された抗体が、配列番号６、２５、２７、２９または３１に示すアミノ酸配列を有するＶ_Ｈ、および配列番号１６、３３、３５、３７または３９に示すアミノ酸配列を有するＶ_Ｌを含んでなる、態様５９に記載の方法。

態様６１：ＴＬＲ３アンタゴニストが、配列番号４５、４７、４９、５１または５３に示すアミノ酸配列を有するＶ_Ｈ、および配列番号３３、３５、３７または３９に示すアミノ酸配列を有するＶ_Ｌを含んでなるモノクローナル抗体の抗原結合能を有するＴＬＲ３と反応性の単離された抗体である、態様４４、５１または５７に記載の方法。

態様６２：単離された抗体が、配列番号４５、４７、４９、５１または５３に示すアミノ酸配列を有するＶ_Ｈ、および配列番号３３、３５、３７または３９に示すアミノ酸配列を有するＶ_Ｌを含んでなる、態様６１に記載の方法。

本発明によれば、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）が媒介する疾患または症状を治療できるＴＬＲ３アンタゴニストが提供されるので、少なくとも医薬製造業で利用できる。

Claims (17)

1. 配列番号９、１１および１３に示す重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列、および配列番号１９、２１および２３に示す軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を含んでなるＴＬＲ３と反応性の単離された抗体。
2. 配列番号２７、２９または３１に示すアミノ酸配列を有するＶ_Ｈ、および配列番号３５、３７または３９に示すＶ_Ｌアミノ酸配列を含んでなるＴＬＲ３と反応性の単離された抗体。
3. 抗体がヒト起源である請求項１または２に記載の単離された抗体。
4. 抗体がマウス起源である請求項１または２に記載の単離された抗体。
5. 抗体がＦａｂフラグメントを含んでなる請求項１〜４のいずれかに記載の単離された抗体。
6. 抗体がポリエチレングリコールに結合している請求項１〜４のいずれかに記載の単離された抗体。
7. ＩｇＧ４アイソタイプを有する請求項１〜４のいずれかに記載の単離された抗体。
8. 請求項１〜４のいずれかに記載の単離された抗体および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる製薬学的組成物。
9. ＴＬＲ３アンタゴニストを有効成分として含んでなる炎症状態の処置または防止用の製薬学的製剤であって、ＴＬＲ３アンタゴニストが請求項１〜４のいずれかに記載の抗体である、製剤。
10. 炎症状態が敗血症に伴う状態、炎症性腸疾患、感染に伴う状態、炎症性肺状態、２型糖尿病、脂質代謝異常、メタボリックシンドロームまたは自己免疫疾患により引き起こされる状態である請求項９に記載の製剤。
11. ＴＬＲ３アンタゴニストを有効成分として含んでなるＴＬＲ３受容体を発現する細胞の増殖率を上げるための製薬学的製剤あって、ＴＬＲ３アンタゴニストが請求項１〜４のいずれかに記載の抗体である、製剤。
12. 細胞が動物の組織に存在する請求項１１に記載の製剤。
13. 細胞が上皮細胞である請求項１１に記載の製剤。
14. 組織が結腸組織である請求項１２に記載の製剤。
15. 組織が炎症状態に伴う病状を現す請求項１２に記載の製剤。
16. 炎症状態が炎症性腸疾患である請求項１１５に記載の方法。
17. ＴＬＲ３アンタゴニストを有効成分として含んでなる細胞死から生じる状態の処置または防止用製薬学的製剤であって、ＴＬＲ３アンタゴニストが請求項１〜４のいずれかに記載の抗体である、製剤。

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