KR101683033B1 - 톨-유사 수용체 3 길항제 - Google Patents

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Abstract

톨유사 수용체 3(TLR3) 항체 길항제, TLR3 항체 길항제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편 및 전술한 것의 제조방법 및 이용방법이 개시된다.

Description

톨-유사 수용체 3 길항제{TOLL-LIKE RECEPTOR 3 ANTAGONISTS}
본 출원은 미국 가출원 제61/109974호(출원일: 2008년 10월 31일) 및 미국 가출원 제61/161860호(출원일: 2009년 3월 20일) 및 미국 가출원 제61/165100호(출원일: 2009년 3월 31일) 및 미국 가출원 제61/173686호(출원일: 2009년 4월 29일)의 이익을 주장하며, 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 톨-유사 수용체 3(TLR3) 항체 길항제, TLR3 항체 길항제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편 및 전술한 것의 제조방법 및 이용방법에 관한 것이다.
톨-유사 수용체(TLR)는 선천성 면역 반응의 활성화를 조절하며, 박테리아, 바이러스, 기생충 및 일부 경우에는 숙주 유래의 리간드에 대한 반응으로 신호 전달 캐스케이드(cascade)를 개시함으로써, 후천적 면역성의 발생에 영향을 미친다(문헌[Lancaster et al ., J. Physiol. 563:945-955, 2005]). 원형질 막에 국소화된 TLR인, TLR1, TLR2, TLR4 및 TLR6은 박테리아 및 진균류의 단백질 또는 지질 성분을 포함하는 리간드를 인식한다. 대부분 세포 내 TLR인, TLR3, TLR7 및 TLR9는 각각 dsRNA, ssRNA 및 비메틸화(unmethylated) CpG DNA에 반응한다. TLR 신호전달의 조절이상이 다수의 문제를 야기하는 것으로 여겨지며, 이러한 중심축을 향한 치료 전략이 개발 중에 있다(문헌[Hoffman et al., Nat. Rev. Drug Discov. 4:879-880, 2005]; 문헌[Rezaei, Int. Immunopharmacol. 6:863-869, 2006]; 문헌[Wickelgren, Science 312:184-187, 2006]). 예를 들어, TLR4, 및 TLR 7 및 9의 길항제는 각각 중증 패혈증 및 루푸스(lupus)를 위하여 임상 개발 중에 있다(문헌[Kanzler et al., Nat.Med. 13:552-559, 2007]).
TLR3 신호전달은 염증 또는 바이러스 감염 동안에 괴사 세포(necrotic cell)로부터 방출되는 dsRNA, mRNA 또는 RNA에 의해 활성화된다. TLR3 활성화는 인터페론 및 전-염증성 사이토카인의 분비를 유도하고, 면역 세포 활성화 및 동원을 촉발시키며, 이는 특정 미생물 감염 동안에 방어적이게 한다. 예를 들어, 우성-음성 TLR3 대립형질은 소아기에 HSV-1로의 일차 감염에 따라 단순헤르페스뇌염(Herpes Simplex encephalitis)에 대한 감수성이 증가하는 것과 관련된다(문헌[Zheng et al., Science 317:1522-1527 2007]). 마우스에서, TLR3 결함은 콕사키(coxsackie) 바이러스 챌린지(challenge)에 따른 생존의 감소와 관련된다(문헌[Richer et al ., PLoS One 4:e4127, 2009]). 그러나, 미조절되거나 이상조절된 TLR3 신호전달은 웨스트 나일(West Nile), 플레보바이러스(phlebovirus), 백시니아(vaccinia) 및 인플루엔자 A(influenza A)를 비롯한 특정 바이러스 감염 모델에서 이환율 및 사망률에 기여하는 것으로 나타났다(문헌[Wang et al., Nat. Med. 10:1366-1373, 2004]; 문헌[Gowen et al ., J. Immunol. 177:6301-6307, 2006]; 문헌[Hutchens et al., J. Immunol. 180:483-491, 2008]; 문헌[Le Goffic et al ., PloS Pathog. 2:E53, 2006]).
또한, TLR3은 예컨대 패혈 쇼크(문헌[Cavassani et al., J. Exp. Med. 205:2609-2621, 2008]), 급성 폐 손상(문헌[Murray et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178:1227-1237, 2008]), 류마티스성 관절염(문헌[Kim et al., Immunol. Lett. 124:9-17, 2009]; 문헌[Brentano et al., Arth. Rheum. 52:2656-2665, 2005]), 천식(문헌[Sugiura et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 40:654-662, 2009]; 문헌[Morishima et al ., Int. Arch. Allergy Immunol. 145:163-174, 2008]; 문헌[Stowell et al ., Respir. Res. 10:43, 2009]), 크론병 및 궤양성 대장염과 같은 염증성 장질환(문헌[Zhou et al ., J. Immunol. 178:4548-4556, 2007]; 문헌[Zhou et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 104:7512-7515, 2007]), 자가면역 간 질환(문헌[Lang et al ., J. Clin. Invest. 116:2456-2463, 2006]) 및 I형 당뇨병(문헌[Dogusan et al. Diabetes 57:1236-1245, 2008]; 문헌[Lien and Zipris, Curr. Mol. Med. 9:52-68, 2009])을 비롯한 염증, 면역-매개 및 자가면역 질환의 범위에서 발병 메카니즘을 작동시키는 것으로 나타났다. 또한, TLR3의 기관-특이적인 발현 증가는 간 조직의 원발성 담즙성 간경화(문헌[Takii et al ., Lab Invest. 85:908-920, 2005]), 류마티스성 관절염 관절(문헌[Ospelt et al ., Arthritis Rheum. 58:3684-3692, 2008]) 및 알러지성 비염 환자의 코 점막(문헌[Fransson et al., Respir. Res. 6: 100, 2005])과 같이 이상조절된 국소 염증성 반응에 의해 작동되는 수많은 병리학적 증상과 상호관련되는 것으로 나타났다.
괴사 증상에서, 내재성 mRNA를 비롯한 세포내 함유물의 방출은 사이토카인, 케모카인 및 국소 염증을 유도하는 다른 인자의 분비를 촉발시키고, 사멸 세포 잔유물의 제거를 촉진하고, 손상을 복구한다. 괴사는 종종 염증 과정을 영구화시키며, 이는 만성 또는 과대(exaggerated) 염증의 원인이 된다(문헌[Bergsbaken et al., Nature Reviews 7:99-109, 2009]). 괴사 부위에서 TLR3의 활성화는 이들 이상 염증 과정에 기여할 수 있으며, 방출된 TLR3 리간드를 통하여 추가의 전-염증성 양성 피드백 루프(positive feedback loop)를 생성할 수 있다. 따라서, TLR3 길항작용은 만성 또는 과대 염증 및/또는 괴사를 수반하는 다양한 질병에서 유익할 것이다.
또한, TLR3 활성화의 하향-조절은 신장 세포 암종 및 두경부 편평 세포 암종을 비롯한 종양학적 증후에 대한 신규한 치료 전략을 나타낼 수 있다(문헌[Morikawa et al., Clin. Cancer Res. 13:5703-5709, 2007]; 문헌[Pries et al., Int. J. Mol. Med. 21: 209-215, 2008]). 또한, 감소된 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 TLR3L423F 대립형질은 진행형 "건성" 연령 관련 황반 변성에 대한 보호와 관련되며(문헌[Yang et al ., N. Engl. J. Med. 359:1456-1463, 2008]), 이는 TLR3 길항제가 이러한 질환에 유익할 수 있음을 나타낸다.
감염과 관련된 증상과 같은 염증성 증상 등과 관련된 병리는 상당한 건강 및 경제적 영향력을 갖는다. 많은 의약 분야에서의 발전에도 불구하고, 아직까지, 다수의 이들 증상에 대해 비교적 소수의 치료 옵션 및 치료법이 이용가능하다.
따라서, TLR3-관련 증상을 치료하기 위하여 TLR3 활성을 저해할 필요가 있다.
[도면의 간단한 설명]
<도 1>
도 1은 NF-κB 리포터 유전자 분석에서의 항-인간 TLR3(huTLR3) mAb의 효과를 나타낸 것이다.
<도 2a 및 2b>
도 2a 및 2b는 BEAS-2B 분석에서의 항-huTLR3 mAb의 효과(억제%)를 나타낸 것이다.
<도 3a 및 3b>
도 3a 및 3b는 NHBE 분석에서의 항-huTLR3 mAb의 효과를 나타낸 것이다.
<도 4>
도 4는 PBMC 분석에서의 항-huTLR3 mAb의 효과를 나타낸 것이다.
<도 5a 및 5b>
도 5a 및 5b는 HASM 분석에서의 항-huTLR3 mAb를 나타낸 것이다.
<도 6a, 6b 및 6c>
도 6a, 6b 및 6c는 TLR3 돌연변이에 대한 항-huTLR3 mAb의 결합을 나타낸 것이다.
<도 7>
도 7a는 인간 TLR3 ECD의 구조 상에 포개 놓은 mAb 15EVQ(검정색) 및 C1068 mAb(회색)(상부 이미지)에 대한 에피토프, 및 mAb 12QVQ/QSV(검정색, 하부 이미지)에 대한 에피토프를 나타낸 것이다. 도 7b는 mAb 15EVQ와 복합체화된 TLR3 ECD 단백질의 국소화된 H/D 교환 섭동(perturbation) 맵을 나타낸 것이다.
<도 8a 및 8b>
도 8a 및 8b는 a) NF-κB 및 b) ISRE 리포터 유전자 분석에서의 랫트/마우스 항-마우스 TLR3 mAb인 mAb 5429(대용물)의 효과를 나타낸 것이다.
<도 9>
도 9는 MEF CXCL10/IP-10 분석에서의 대용물 mAb(mAb 5429, mAb c1811)의 효과를 나타낸 것이다.
<도 10>
도 10은 TLR3에 대한 대용물 mAb의 결합의 특이성을 나타낸 것이다. 상부 패널: 아이소형(isotype) 대조군; 하부 패널: mAb c1811.
<도 11>
도 11은 AHR 모델에서의 penH 수준 상의 대용물 mAb의 효과를 나타낸 것이다.
<도 12>
도 12는 AHR 모델에서의 BAL 액체 내의 총 호중구 개수 상의 대용물 mAb의 효과를 나타낸 것이다.
<도 13>
도 13은 AHR 모델에서의 BAL 액체 내의 CXCL10/IP-10 수준 상의 대용물 mAb의 효과를 나타낸 것이다.
<도 14>
도 14는 DSS 모델에서의 조직병리학 점수 상의 대용물 mAb의 효과를 나타낸 것이다.
<도 15>
도 15는 T-세포 전달 모델에서의 a) 조직병리학 점수 및 b) 호중구 유입 상의 대용물 mAb의 효과를 나타낸 것이다.
<도 16>
도 16은 CIA 모델에서의 임상 점수 상의 대용물 mAb의 효과를 나타낸 것이다.
<도 17>
도 17은 CIA 모델에서의 임상 AUC 점수 상의 대용물 mAb의 효과를 나타낸 것이다.
<도 18>
도 18은 인플루엔자 A/PR/8/34의 비강내 투여 이후에 C57BL/6 마우스의 생존 상의 대용물 mAb의 효과를 나타낸 것이다.
<도 19>
도 19는 인플루엔자 A/PR/8/34의 투여 이후에 임상 점수 상의 대용물 mAb의 효과를 나타낸 것이다.
<도 20>
도 20은 인플루엔자 A/PR/8/34의 투여 이후에 14일에 걸친 체중 상의 대용물 mAb의 효과를 나타낸 것이다.
<도 21>
도 21은 당 챌린지 후에 (a) 야생형 DIO 및 (b) TLR3KO DIO 동물의 혈당 수준 상의 대용물 mAb의 효과를 나타낸 것이다.
<도 22>
도 22는 야생형 DIO 동물에서의 인슐린 수준 상의 대용물 mAb의 효과를 나타낸 것이다.
<도 23>
도 23은 NHBE 세포에서의 (a) NTHi 및 (b) 리노바이러스(rhinovirus) 유도성 CXCL10/IP-10 및 CCL5/RANTES 수준 상의 mAb 15EVQ의 효과를 나타낸 것이다.
<도 24>
도 24는 HUVEC 세포에서의 (a) sICAM-1 수준 및 (b) 생존력 상의 mAb 15EVQ의 효과를 나타낸 것이다.
본 발명의 일면은 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 여기서, 항체는 서열 번호 2의 잔기 K467, R488 또는 R489로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TLR3 아미노산 잔기와 결합한다.
본 발명의 또 다른 면은 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 여기서, 항체는 서열 번호 2의 잔기 D116 또는 K145로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TLR3 아미노산 잔기와 결합한다.
본 발명의 또 다른 면은 TLR3에 반응성인 단리된 항체이며, 여기서, 항체는 하기의 특성 중 적어도 하나를 갖는다:
a. 1 ㎍/ml 미만에서, 시험관 내 폴리(I:C) NF-kB 리포터 유전자 분석에서의 인간 TLR3 생물학적 활성의 50% 초과의 감소;
b. 10 ㎍/ml 미만에서, 100 ng/ml 미만의 폴리(I:C)로 자극된 BEAS-2B 세포로부터의 IL-6 또는 CXCL10/IP-10 생성의 60% 초과의 억제;
c. 0.4 ㎍/ml 미만에서, 100 ng/ml 미만의 폴리(I:C)로 자극된 BEAS-2B 세포로부터의 IL-6 또는 CXCL10/IP-10 생성의 50% 초과의 억제;
d. 5 ㎍/ml 미만에서, 62.5 ng/ml의 폴리(I:C)로 자극된 NHBE 세포로부터의 IL-6 생성의 50% 초과의 억제;
e. 1 ㎍/ml 미만에서, 62.5 ng/ml의 폴리(I:C)로 자극된 NHBE 세포로부터의 IL-6 생성의 50% 초과의 억제;
f. 1 ㎍/ml 미만에서, PBMC 세포에 의한 폴리(I:C)-유도성 IFN-γ, IL-6 또는 IL-12 생성의 20% 초과의 억제;
g. 10 ㎍/ml 미만의 IC50으로, 시험관 내 NF-kB 리포터 유전자 분석에서의 사이노몰거스(cynomolgus) TLR3 생물학적 활성의 억제; 또는
h. 5 ㎍/ml 미만의 IC50으로, 시험관 내 ISRE 리포터 유전자 분석에서의 사이노몰거스 TLR3 생물학적 활성의 억제.
본 발명의 또 다른 면은 TLR3 결합을 위해 모노클로날 항체와 경쟁하는, TLR3에 반응성인 단리된 항체이며, 여기서, 모노클로날 항체는 특정 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2 및 3의 아미노산 서열, 특정 경쇄 CDR 1, 2 및 3의 아미노산 서열, 특정 중쇄 가변 영역(VH)의 아미노산 서열 또는 특정 경쇄 가변 영역(VL)의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 면은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 모두를 포함하는 TLR3에 반응성인 단리된 항체이며, 여기서, 항체는 특정 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2 및 3, 및 특정 경쇄 CDR 1, 2 및 3의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 면은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 모두를 포함하는 TLR3에 반응성인 단리된 항체이며, 여기서, 항체는 특정 중쇄 가변 영역(VH)의 아미노산 서열 및 특정 경쇄 가변 영역(VL)의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 면은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 모두를 포함하는 TLR3에 반응성인 단리된 항체이며, 여기서, 항체는 특정 중쇄의 아미노산 서열 및 특정 경쇄의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 면은 서열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 또는 216에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 중쇄이다.
본 발명의 또 다른 면은 서열 번호 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209, 210 또는 211에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 경쇄이다.
본 발명의 또 다른 면은 서열 번호 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 또는 168에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 중쇄이다.
본 발명의 또 다른 면은 서열 번호 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165 또는 167에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 경쇄이다.
본 발명의 또 다른 면은 서열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 또는 216에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 또 다른 면은 서열 번호 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209, 210 또는 211에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 또 다른 면은 서열 번호 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 또는 168에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 또 다른 면은 서열 번호 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165 또는 167에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 또 다른 면은 본 발명의 단리된 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 발명의 또 다른 면은 본 발명의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다.
본 발명의 또 다른 면은 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.
본 발명의 또 다른 면은 본 발명의 숙주 세포를 배양하고 숙주 세포에 의해 생성되는 항체를 회수하는 것을 포함하는 TLR3에 반응성인 항체의 제조방법이다.
본 발명의 또 다른 면은 본 발명의 단리된 항체의 치료적 유효량을 염증성 증상을 치료하거나 예방하기에 충분한 시간 동안 염증성 증상의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 염증성 증상의 치료 또는 예방방법이다.
본 발명의 또 다른 면은 본 발명의 단리된 항체의 치료적 유효량을 전신의 염증성 증상을 치료하거나 예방하기에 충분한 시간 동안 전신의 염증성 증상의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 전신의 염증성 증상의 치료 또는 예방방법이다.
본 발명의 또 다른 면은 본 발명의 단리된 항체의 치료적 유효량을 II형 당뇨병을 치료하기에 충분한 시간 동안 II형 당뇨병의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 II형 당뇨병의 치료방법이다.
본 발명의 또 다른 면은 본 발명의 단리된 항체의 치료적 유효량을 고혈당증을 치료하기에 충분한 시간 동안 고혈당증의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 고혈당증의 치료방법이다.
본 발명의 또 다른 면은 본 발명의 단리된 항체의 치료적 유효량을 인슐린 내성을 치료하기에 충분한 시간 동안 고인슐린혈증의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 고인슐린혈증의 치료방법이다.
본 발명의 또 다른 면은 본 발명의 단리된 항체의 치료적 유효량을 바이러스 감염을 치료하거나 예방하기에 충분한 시간 동안 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 바이러스 감염의 치료 또는 예방방법이다.
본 명세서에 인용된, 특허 및 특허 출원을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모든 간행물은 마치 완전히 개시되는 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "길항제"는 임의의 메카니즘에 의하여, 수용체 또는 세포내 매개체와 같은 다른 분자의 영향을 부분적으로 또는 완전히 억제하는 분자를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 "TRL3 항체 길항제" 또는 "TLR3에 반응성인" 항체는 TLR3 생물학적 활성 또는 TLR3 수용체 활성화를 직접적으로 또는 간접적으로, 실질적으로 방해, 감소 또는 억제할 수 있는 항체를 말한다. 예를 들어, TLR3에 반응성인 항체는 TLR3에 직접 결합하고, TLR3 활성을 중화시킬 수 있으며, 즉, TLR3 신호전달을 차단하여, 사이토카인 및 케모카인 방출 또는 NF-κB 활성화를 감소시킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 넓은 의미에 있는 것을 의미하며, 폴리클로날 항체, 뮤린, 인간, 인간-적응화된, 인간화된 및 키메라 모노클로날 항체를 비롯한 모노클로날 항체 및 항체 단편을 포함하는 면역글로불린 또는 항체 분자를 포함한다.
일반적으로, 항체는 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 단백질 또는 펩티드이다. 온전한(intact) 항체는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된 헤테로테트라머 당단백질이다. 이황화 결합의 수는 상이한 면역글로불린 아이소형의 중쇄 간에 다양하나, 전형적으로 각 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의하여 중쇄에 연결된다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 이황화 가교를 갖는다. 각 중쇄는 일단에서 가변 도메인(VH)에 이어서, 많은 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 일단에 가변 도메인(VL)과, 그 타단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 함께 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 함께 정렬된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 명확하게 별개인 2개의 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 정해질 수 있다.
면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 분류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 정해질 수 있다. IgA 및 IgG는 아이소형 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 하위-분류된다.
용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 일반적으로 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 의미한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 디아바디(diabody), 단쇄 항체 분자 및 적어도 2개의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 "3개의 "항원-결합 부위에 의해 단절된 "프레임워크"로 구성된다. 항원-결합 부위는 하기와 같은 다양한 용어를 사용하여 정의한다: (i) 용어 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 가변성을 기초로 한다(문헌[Wu and Kabat, J. Exp. Med. 132:211-250, 1970]). 일반적으로, 항원-결합 부위는 VH 내에 3가지(HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 VL 내에 3가지(LCDR1, LCDR2, LCDR3)의 6가지 CDR을 갖는다(문헌[Kabat et al ., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]). (ii) 용어 "과가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는 초티아(Chothia) 및 레스크(Lesk)가 정의한 바와 같이, 구조가 과가변성인 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다(문헌[Chothia and Lesk, Mol. Biol. 196:901-917, 1987]). 일반적으로, 항원-결합 부위는 VH 내에 3가지(H1, H2, H3) 및 VL 내에 3가지(L1, L2, L3)의 6가지의 과가변 영역을 갖는다. 초티아 및 레스크는 구조적으로 보존된 HV를 "기준(canonical) 구조"로 언급하였다. (iii) 레프란크(Lefranc)가 제안한 "IMGT-CDR"(문헌[Lefranc et al ., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003])은 면역글로불린으로부터의 V 도메인과 T-세포 수용체의 비교를 기준으로 한다. 국제적인 면역유전학(ImMunoGeneTics; IMGT) 데이터베이스(http://www_imgt_org)는 표준화된 넘버링(numbering) 및 이들 영역의 정의를 제공한다. CDR, HV 및 IMGT 서술 사이의 관련성은 문헌[Lefranc et al ., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003]에 기재되어 있다. (iv) 또한, 항원-결합 부위는 알마그로(Almagro)에 따라, 특이성 결정 잔기 사용(SDRU)에 기초하여, 서술될 수 있으며(문헌[Almagro, Mol. Recognit. 17:132-143, 2004]), 여기서, 특이성 결정 잔기(SDR)는 항원 접촉에 직접적으로 연루되는 면역글로불린의 아미노산 잔기를 지칭한다. 알마그로가 정의한 SDRU는 항원-항체 복합체의 결정 구조의 분석에 의해 정의된 바와 같은 상이한 유형의 항원에 대한 SDR의 수 및 분포의 정밀한 척도이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "복합 서열"은 카바트(Kabat), 초티아(Chothia) 또는 IMGT, 또는 임의의 다른 적절한 항원-결합 영역 서술에 의해 개별적으로 서술되는 모든 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 정의되는 항원-결합 부위를 의미한다.
"프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 항원-결합 부위인 것으로 결정된 것 이외의 가변 영역의 나머지 서열이다. 항원-결합 부위가 상술된 바와 같은 다양한 용어에 의해 정의될 수 있기 때문에, 프레임워크의 정확한 아미노산 서열은 항원-결합 부위가 어떻게 정의되는지에 따라 달라진다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원"은 직접적으로 또는 간접적으로 항체를 생성할 능력을 갖는 임의의 분자를 의미한다. "항원"의 정의 내에 단백질-코딩 핵산이 포함된다.
용어 "상동체"는 참조 서열에 대하여 40% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질 서열을 의미한다. 인간 TLR3의 상동체는 공지의 인간 TLR3 서열에 대하여 40% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는 다른 종으로부터의 폴레펩티드를 포함한다. 두 펩티드 사슬 사이의 퍼센트 동일성은 벡터(Vector) NTI v.9.0.0의 얼라인엑스 모듈(AlignX module)(Invitrogen, Carslbad, CA)의 디폴트 셋팅을 사용하여 페어와이즈 정렬(pairwise alignment)로 결정될 수 있다. "TLR3"은 인간 TLR3(huTLR3) 및 이의 상동체를 의미한다. 전장 huTLR3의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 각각 서열 번호 1 및 2에 나타내었다. huTLR3 세포외 도메인(ECD)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 각각 서열 번호 3 및 4에 나타내었다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로 동일한"은 비교하는 2개의 항체 또는 항체 단편 아미노산 서열이 동일하거나 "적은(insubstantial) 차이"를 갖는 것을 의미한다. 적은 차이는 항체 또는 항체 단편 아미노산 서열 내의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 아미노산의 치환이다. 또한, 본 명세서에 기재된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열도 본 출원의 일부이다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상일 수 있다. 퍼센트 동일성은 상술된 바와 같이 결정될 수 있다. 비교되는 예시적인 펩티드 사슬은 중쇄 또는 경쇄 가변 영역이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "병용하여"는 기재된 제제가 혼합물 중에 함께, 단일 제제로서 동시에, 또는 단일 제제로서 임의의 순서로 순차적으로, 동물에게 투여될 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "염증성 증상"은 대부분의 예에서, 통증, 발적, 부기 및 조직 기능의 소실을 특징으로 하는 사이토카인, 케모카인 또는 염증성 세포(예를 들면, 중성구, 단핵구, 림프구, 대식구)의 활성에 의하여 부분적으로 매개되는 세포적 손상에 대한 국부적인 반응을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "염증성 폐 증상"은 폐와 관련되거나, 이에 영향을 미치는 염증성 증상을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"(mAb)는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득되는 항체(또는 항체 단편)를 의미한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 전형적으로 단일 항원성 결정물질에 대하여 지향된다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 필요로 하지 않는다. 예를 들어, 뮤린(murine) mAb는 문헌[Kohler et al ., Nature 256:495-497, 1975]의 하이브리도마(hybridoma) 방법에 의해 제조될 수 있다. 수여자 항체(전형적으로 인간과 같은 다른 포유동물 종)로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 회합된 공여자 항체(전형적으로 뮤린)로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 키메라 mAb는 미국 특허 제4,816,567호에 개시된 방법으로 제조될 수 있다. 비-인간 공여자 면역글로불린(전형적으로 뮤린)으로부터 유래된 CDR 및 하나 이상의 인간 면역글로불린으로부터 유래된 분자의 나머지의 면역글로불린-유래의 부분을 갖는 인간-적응화된 mAb는 미국 특허 제5,225,539호에 개시된 것과 같은 당업자에게 알려져 있는 기술에 의해 제조될 수 있다. 인간-적응화에 유용한 인간 프레임워크 서열은 당업자가 관련있는 데이터베이스로부터 선택할 수 있다. 임의로, 인간-적응화된 mAb는 문헌[Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86:10029-10032, 1989] 및 문헌[Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421, 1991]에 개시된 것과 같은 기술에 의해 결합 친화도를 유지하기 위하여, 변경된 프레임워크 지지 잔기를 혼입함으로써, 추가로 변형될 수 있다.
임의의 비-인간 서열이 결여된, 완전 인간 mAb는 예를 들어, 문헌[Lonberg et al ., Nature 368:856-859, 1994]; 문헌[Fishwild et al ., Nature Biotechnology 14:845-851, 1996]; 및 문헌[Mendez et al ., Nature Genetics 15:146-156, 1997]에서 참조한 기술에 의해 인간 면역글로불린 트랜스제닉 마우스로부터 제조될 수 있다. 또한, 인간 mAb는 예를 들어, 문헌[Knappik et al ., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000]; 및 문헌[Krebs et al ., J. Immunol. Meth. 254:67-84 2001]에서 참조한 기술에 의해 파지 디스플레이 라이브러리로부터 제조되고 최적화될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 부분을 의미한다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 다당류 측쇄와 같은 부분의 화학적으로 활성(이를 테면, 극성, 비극성 또는 소수성)인 표면 그룹화(grouping)로 이루어지며, 특이적인 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 천연에서 선형이거나, 불연속 에피토프, 예를 들어 선형의 일련의 아미노산 보다는 항원의 비-인접 아미노산 사이의 공간 관계에 의해 형성되는 입체구조적(conformational) 에피토프일 수 있다. 입체구조적 에피토프는 항원의 폴딩(folding)으로부터 야기된 에피토프를 포함하며, 여기서 항원의 선형 서열의 상이한 부분으로부터의 아미노산은 3차원 공간에서 매우 근접하게 된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "특이적인 결합"은 다른 항원 또는 단백질에 대한 친화도보다 더 큰 친화도로, 항체가 소정의 항원에 결합하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 10-7 M 이하의 해리 상수(KD)로 결합하며, 소정의 항원 이외의 비특이적인 항원(예를 들어, BSA, 카세인, 또는 임의의 다른 특정 폴리펩티드)으로의 결합에 대한 그의 KD보다 적어도 2배 더 작은 KD로 소정의 항원에 결합한다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체" 또는 "항원 특이적인 항체", 예를 들어, TLR3 특이적인 항체와 본 명세서에서 상호호환적으로 사용된다. 해리 상수는 후술되는 표준 절차를 사용하여, 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "TLR3 생물학적 활성" 또는 "TLR3 활성화"는 TLR3에 대한 리간드 결합의 결과로 발생하는 임의의 활성을 지칭한다. TLR3 리간드는 dsRNA, 폴리(I:C) 및 내재성 mRNA, 예를 들어, 괴사 세포로부터 방출되는 내재성 mRNA를 포함한다. 예시적인 TLR3 활성화는 TLR3 리간드에 대한 반응으로 NF-κB의 활성화를 야기한다. NF-κB 활성화는 폴리(I:C)를 사용한 수용체의 유도 시에 리포터-유전자 분석을 사용하여 분석할 수 있다(문헌[Alexopoulou et al ., Nature 413:732-738, 2001]; 문헌[
Figure 112011039693804-pct00001
et al ., EMBO J. 18:6973-6982, 1999]). 또 다른 예시적인 TLR3 활성화는 TLR3 리간드에 대한 반응으로, 인터페론 반응 인자(IRF-3, IRF-7)의 활성화를 야기한다. TLR3-매개의 IRF 활성화는 인터페론-자극된 반응 요소(ISRE)에 의해 작동되는 리포터 유전자를 사용하여 분석할 수 있다. 또 다른 예시적인 TLR3 활성화는 전-염증성 사이토카인 및 케모카인, 예를 들어, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12, CXCL5/IP-10 및 RANTES의 분비를 야기한다. 세포, 조직 또는 순환 중으로부터의 사이토카인 및 케모카인의 방출은 잘 알려져 있는 면역분석, 이를 테면 ELISA 면역분석을 사용하여 측정할 수 있다.
후술되는 바와 같은 통상적인 1-문자 및 3-문자 아미노산 코드를 본 명세서에 사용한다:
Figure 112011039693804-pct00002
대상 조성물
본 발명은 TLR3 생물학적 활성을 억제할 수 있는 항체 길항제 및 이들 항체의 용도를 제공한다. 이들 TLR3 길항제는 TLR3와 결합하고, TLR3 활성화를 억제하는 특성을 가질 수 있다. 이들 항체에 의해 TLR3 활성화를 억제할 수 있는 예시적인 메카니즘은 TLR3에 대한 리간드 결합의 시험관 내, 생체 내 또는 인 시츄(in situ) 억제, 수용체 이량체화의 억제, TLR3의 엔도솜 구획으로의 국소화의 억제, 다운스트림 신호전달 경로의 키나아제 활성의 억제, 또는 TLR3 mRNA 전사의 억제를 포함한다. 또한, 다른 메카니즘에 의해 TLR3 활성화를 억제할 수 있는 다른 항체 길항제가 본 발명의 다양한 면 및 실시형태의 범주 내에 있다. 이들 길항제는 연구 시약, 진단 시약 및 치료제로서 유용하다.
항체 다양성은 가변 영역을 코딩하는 다중의 생식계열 유전자 및 다양한 신체의 사건의 사용에 의해 생성된다. 이러한 신체의 사건은 가변(V) 유전자 세그먼트(segment), 및 다양성(diversity; D) 및 연결(joining; J) 유전자 세그먼트의 재조합으로 완전한 VH 영역을 만들고, 가변 및 연결 유전자 세그먼트의 재조합으로 완전한 VL 영역을 만드는 것을 포함한다. 본 명세서에 개시된 서열과 동일하거나 유사한 CDR 서열을 갖는 항체 및 조성물은 아마도 독립적으로 생성되지 않을 것이다. 어셈블리(assembly) 및 신체 돌연변이 이후의 항체 유전자의 서열은 매우 다르며, 이들 다른 유전자는 1010 개의 상이한 항체 분자를 코딩하는 것으로 추산된다(문헌[Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1995]).
본 발명은 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 유래된 신규한 항원-결합 부위를 제공한다. 항원-결합 부위를 운반하기 위한 구조는 일반적으로 항체 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 부분이며, 여기서, 항원-결합 부위는 상술된 바와 같이 결정된 자연 발생 항원-결합 부위에 위치한다.
본 발명은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 모두를 포함하는, TLR3에 반응성인 단리된 항체 또는 이의 단편을 제공하며, 여기서, 항체는 표 1a에 나타낸 바와 같은 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열 1, 2 및 3(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열 1, 2 및 3(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함한다.
[표 1a]
Figure 112011039693804-pct00003
특정 실시형태에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 모두를 포함하는, TLR3에 반응성인 단리된 항체 또는 단편을 제공하며, 여기서, 항체는 서열 번호 192에 나타낸 HCDR2 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 서열 192의 HCDR2는 화학식 (I)에 나타낸 바와 같이 정의된다:
Xaa6-I-Xaa7-Xaa8-R-S-Xaa9-W-Y-N-D-Y-A-V-S-V-K-S, (I)
상기 식에서,
Xaa6은 Arg 또는 Lys일 수 있고;
Xaa7은 Tyr, His 또는 Ser일 수 있으며;
Xaa8은 Met, Arg 또는 Tyr일 수 있고;
Xaa9는 Lys 또는 Arg일 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 모두를 포함하는, TLR3에 반응성인 단리된 항체 또는 단편을 제공하며, 여기서, 항체는 서열 번호 194에 나타낸 HCDR2 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 서열 194의 HCDR2는 화학식 (III)에 나타낸 바와 같이 정의된다:
I-I-Q -Xaa15-R-S-K-W-Y-N-Xaa16-Y-A-Xaa17-S-V-K-S, (III)
상기 식에서,
Xaa15는 Lys, Thr 또는 Ile일 수 있고;
Xaa16은 Asn 또는 Asp일 수 있으며;
Xaa17은 Val 또는 Leu일 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 모두를 포함하는, TLR3에 반응성인 단리된 항체 또는 단편을 제공하며, 여기서, 항체는 서열 번호 196에 나타낸 HCDR2 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 서열 196의 HCDR2는 화학식 (V)에 나타낸 바와 같이 정의된다:
Xaa24-I-D-P-S-D-S-Y-T-N-Y-Xaa25-P-S-F-Q-G, (V)
상기 식에서,
Xaa24는 Phe 또는 Arg일 수 있고;
Xaa25는 Ala 또는 Ser일 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 모두를 포함하는, TLR3에 반응성인 단리된 항체 또는 단편을 제공하며, 여기서, 항체는 서열 번호 191에 나타낸 LCDR3 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 서열 191의 LCDR3은 화학식 (II)에 나타낸 바와 같이 정의된다:
Xaa1-S-Y-D-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-T-V, (II)
상기 식에서,
Xaa1은 Ala, Gln, Gly 또는 Ser일 수 있고;
Xaa2는 Gly, Glu 또는 Ser일 수 있으며;
Xaa3은 Asp 또는 Asn일 수 있고;
Xaa4는 Glu 또는 Ser일 수 있으며;
Xaa5는 Phe, Ala 또는 Leu일 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 모두를 포함하는, TLR3에 반응성인 단리된 항체 또는 단편을 제공하며, 여기서, 항체는 서열 번호 193에 나타낸 LCDR3 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 서열 193의 LCDR3은 화학식 (IV)에 나타낸 바와 같이 정의된다:
Xaa10-S-Y-D-Xaa11-P-Xaa12-Xaa13-Xaa14-V, (IV)
상기 식에서,
Xaa10은 Gln 또는 Ser일 수 있고;
Xaa11은 Thr, Glu 또는 Asp일 수 있으며;
Xaa12는 Val 또는 Asn일 수 있고;
Xaa13은 Tyr 또는 Phe일 수 있으며;
Xaa14 는 Ser, Asn 또는 Gln일 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 모두를 포함하는, TLR3에 반응성인 단리된 항체 또는 단편을 제공하며, 여기서, 항체는 서열 번호 195에 나타낸 LCDR3 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 서열 번호 195의 LCDR3은 화학식 (VI)에 나타낸 바와 같이 정의된다:
Q-Q-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-T, (VI)
상기 식에서,
Xaa18은 Tyr, Gly 또는 Ala일 수 있고;
Xaa19는 Gly, Glu 또는 Asn일 수 있으며;
Xaa20은 Ser 또는 Thr일 수 있고;
Xaa21은 Val, Ile 또는 Leu일 수 있으며;
Xaa22 는 Ser 또는 Leu일 수 있고;
Xaa23은 Ile, Ser, Pro 또는 Tyr일 수 있다.
또한, 본 발명은 표 1a에 나타낸 바와 같은 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열 1, 2 및 3(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열 1, 2 및 3(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 갖는, TLR3에 반응성인 단리된 항체 또는 단편을 제공한다.
항원-결합 부위 아미노산 서열이 표 1a에 나타낸 서열(서열 번호 49-121 및 191-196)과 조금 상이한 항체가 본 발명의 범주 내에 포함된다. 전형적으로, 이는 유사한 전하, 소수성 또는 입체화학적 특징을 가지는 아미노산을 사용한 하나 이상의 아미노산 치환을 수반한다. 또한, 항원-결합 부위와 반대로, 프레임워크 영역 내의 추가의 치환은 이들이 항체의 특성에 악영향을 미치지 않는 한, 이루어질 수 있다. 치환은 항체 특성, 예를 들어, 안정성 또는 친화도가 개선되도록 이루어질 수 있다. 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 치환이 항원 결합 부위에서 이루어질 수 있다.
보존적 변형은 이러한 변형이 이루어지는 분자의 특징과 유사한 기능적 및 화학적 특징을 가지는 분자를 생성할 것이다. 분자의 기능적 및/또는 화학적 특징의 실질적인 변형은 (1) 예를 들어, 시트 또는 나선형 입체구조로서의, 치환 영역 내의 분자 골격(backbone)의 구조, (2) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (3) 분자의 크기를 유지하는 데에서의 이들의 효과가 상당히 상이한 아미노산 서열의 치환을 선택함으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, "보존적 아미노산 치환"은 그 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하 상의 영향이 거의 없거나 영향이 없게 하는, 천연 아미노산 잔기의 비천연 잔기로의 치환을 수반할 수 있다. 또한, 폴리펩티드 내의 임의의 천연의 잔기는 알라닌 스캐닝(scanning) 돌연변이생성(문헌[MacLennan et al ., Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67, 1998]; 문헌[Sasaki et al ., Adv. Biophys. 35:1-24, 1998])에 대해 이전에 기재된 바와 같이, 알라닌으로 치환될 수 있다. 요망되는 아미노산 치환(보존적이든지 비-보존적이든지 간에)은 이러한 치환을 원하는 때에, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환을 사용하여, 분자 서열의 중요한 잔기를 동정하거나, 본 명세서에 기재된 분자의 친화도를 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 예시적인 아미노산 치환을 표 1b에 나타내었다.
[표 1b]
Figure 112011039693804-pct00004
또한, 특정 실시형태에서, 보존적 아미노산 치환은 생물학적 시스템 내에서의 합성에 의한 것보다는 전형적으로 화학적 펩티드 합성에 의해 혼입되는 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 아미노산 치환은 예를 들어, PCR 돌연변이생성에 의해 행해질 수 있다(미국 특허 제 4,683,195호). 변이체의 라이브러리를 공지의 방법, 예를 들어, 무작위(NNK) 또는 비-무작위 코돈, 예를 들어, 11개 아미노산(ACDEGKNRSYW)을 코딩하는 DVK 코돈을 사용하는 잘 알려진 방법 및 실시예 1에 나타낸 바와 같이, 요망되는 특성을 갖는 변이체를 위한 라이브러리의 스크리닝을 사용하여, 생성할 수 있다. 표 1c는 항체 특성을 개선시키기 위하여, LCDR3 및 HCDR2 영역 내의 3개의 모(parent) TLR3 항체 길항제에 이루어진 치환을 나타낸 것이다.
항원-결합 부위의 서술에 따라, 본 발명의 항체의 항원-결합 부위 잔기 및 결과적으로 프레임워크 잔기는 각각의 중쇄 및 경쇄에 대하여 약간 달라질 수 있다. 표 2a 및 2b는 카바트, 초티아 및 IMGT에 따라 서술된 본 발명의 예시적인 항체의 항원-결합 부위 잔기 및 이들의 복합 서열을 나타낸 것이다.
[표 1c]
Figure 112011039693804-pct00005
[표 2a]
Figure 112011039693804-pct00006
다른 실시형태에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 모두를 포함하는, TLR3에 반응성인 단리된 항체 또는 단편을 제공하며, 여기서, 항체는 중쇄 가변(VH) 및 경쇄 가변(VL) 영역의 아미노산 서열을 포함하며, 또한 표 3a에 나타낸 바와 같은 각각의 단리된 중쇄 가변 및 경쇄 가변 영역에 대해 제공된다. F17, F18 및 F19는 각각 패밀리 17, 18 및 19에 대한 공통 아미노산 서열을 포함하는 항체 변이체를 나타낸다.
[표 2b]
Figure 112011039693804-pct00007
[표 3a]
Figure 112011039693804-pct00008
실시예에 예시된 실시형태가 중쇄로부터 하나, 그리고 경쇄로부터 하나의 가변 영역의 쌍을 포함할지라도, 숙련자는 대안적인 실시형태가 단일의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 단일의 가변 영역을 사용하여 예를 들어, TLR3에 결합할 수 있는 2-도메인 특이적 항원-결합 단편을 형성할 수 있는 가변 도메인에 대해 스크리닝할 수 있다. 스크리닝은 예를 들어, PCT 공보 제 WO92/01047호에 기재된 계층적 이중 조합 접근법을 사용하여, 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성할 수 있다. 이러한 접근법에서, H 또는 L 사슬 클론 중 하나를 함유하는 개별 콜로니를 사용하여, 다른 사슬(L 또는 H)을 코딩하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키고, 생성된 2-사슬 특이적 항원-결합 도메인을 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 따라 선택한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 표 3a에 나타낸 바와 같은 가변 영역 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 모두를 포함하는, TLR3에 반응성인 단리된 항체 또는 단편을 제공한다.
또 다른 면에서, 본 발명은 표 3b에 나타낸 바와 같은 특정 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 갖는 단리된 항체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 면은 본 발명의 항체 또는 이들의 보체 중 임의의 것을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 특정 예시적인 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에 개시되나, 주어진 발현 시스템 내에서 유전자 코드의 축퇴성 또는 코돈 선호도를 고려하여, 본 발명의 항체 길항제를 코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드도 또한 본 발명의 범주 내에 있다.
예시적인 항체 길항제는 IgG, IgD, IgG, IgA 또는 IgM 아이소형의 항체일 수 있다. 또한, 이러한 항체 길항제는 글리코실화, 이성체화, 탈글리코실화(deglycosylation) 또는 비-자연 발생 공유적 변형, 이를 테면 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부분의 첨가(페길화(pegylation)) 및 지질화에 의해 번역-후 변형될 수 있다. 이들 변형은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 폴리에틸렌 글리콜에 컨쥬게이트되어(페길화), 이들의 약동학적 프로파일을 개선시킬 수 있다. 컨쥬게이션은 당업자에게 알려져 있는 기술에 의해 수행될 수 있다. 치료적 항체와 PEG와의 컨쥬게이션은 기능을 간섭하지 않으면서, 약역학을 증진시키는 것으로 보인다. 문헌[Deckert et al ., Int. J. Cancer 87:382-390, 2000]; 문헌[Knight et al ., Platelets 15:409-418, 2004]; 문헌[Leong et al ., Cytokine 16:106-119, 2001]; 및 문헌[Yang et al ., Protein Eng. 16:761-770, 2003]을 참고한다.
[표 3b]
Figure 112011039693804-pct00009
또한, 본 발명의 항체의 약동학적 특성은 당업자에게 알려져 있는 기술에 의해, Fc 변형을 통하여 증진될 수 있다. 예를 들어, IgG4 아이소형 중쇄는 중쇄-사이 또는 중쇄-내의 이황화 결합을 형성할 수 있는 힌지 영역 내의 Cys-Pro-Ser-Cys(CPSC) 모티브를 함유하며, 즉, CPSC 모티브 내의 2개의 Cys 잔기가 다른 중쇄 내의 상응하는 Cys 잔기와 이황화 결합되거나(중쇄-사이), 주어진 CPSC 모티브 내의 2개의 Cys 잔기가 서로 이황화 결합될 수 있다(중쇄-내). 생체 내 아이소머라아제(isomerase) 효소는 IgG4 분자의 중쇄-사이 결합을 중쇄-내 결합으로 및 그 반대로 전환시킬 수 있다(문헌[Aalberse and Schuurman, Immunology 105:9-19, 2002]). 따라서, 힌지 영역 내의 중쇄-내 결합을 갖는 이러한 IgG4 분자 내에서 중쇄:경쇄(H:L) 쌍이 서로 공유적으로 회합되지 않기 때문에, 이들은 H:L 단량체로 해리된 다음, 다른 IgG4 분자로부터 유래된 H:L 단량체와 다시 회합되어, 이중특이적인 헤테로다이머 IgG4 분자를 형성할 수 있다. 이중특이적 IgG 항체 내에서, 항체 분자의 2개의 Fab는 이들이 결합하는 에피토프가 상이하다. IgG4의 힌지 영역 CPSC 모티브 내의 Ser 잔기를 Pro로 치환하는 것은 "IgG1-유사 거동 "을 야기하며, 즉, 분자는 중쇄 간의 안정한 이황화 결합을 형성하며, 이에 따라 다른 IgG4 분자와의 H:L 교환이 쉽지 않다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항체는 CPSC 모티브 내에 S의 P로의 돌연변이를 갖는 IgG4 Fc 도메인을 포함할 것이다. CPSC 모티브의 위치는 전형적으로, 성숙 중쇄의 잔기 228에서 발견되나, CDR 길이에 따라 변경될 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 내에서 FcRn 살비지(salvage) 수용체 이외의 Fc 수용체에 대한 결합에 영향을 미치는 부위를 제거할 수 있다. 예를 들어, ADCC 활성에 연루되는 Fc 수용체 결합 영역을 본 발명의 항체에서 제거할 수 있다. 예를 들어, IgG1의 힌지 영역 내의 Leu234/Leu235의 L234A/L235A로의 돌연변이, 또는 IgG4의 힌지 영역 내의 Phe235/Leu236의 P235A/L236A로의 돌연변이는 FcR 결합을 최소화시키고, 보체 의존성 세포독성 및 ADCC를 매개하는 면역글로불린의 능력을 감소시킨다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항체는 P235A/L236A 돌연변이가 있는 IgG4 Fc 도메인을 포함할 것이다. 상기에서 동정된 이들 잔기의 위치는 성숙 중쇄 내에서 전형적이나, CDR 길이에 따라 변경될 수 있다. P235A/L236A 돌연변이를 갖는 예시적인 항체는 서열 번호 218, 219 또는 220에 나타낸 서열에 의해 코딩된 중쇄를 갖는 항체이다.
완전 인간, 인간-적응화된, 인간화된 및 친화도-성숙 항체 분자 또는 항체 단편은 융합 단백질 및 키메라 단백질과 같이 본 발명의 범주 내에 있다. 항원을 지향하는 항체 친화도는 무작위 또는 지정 돌연변이생성과 같은 잘 알려져 있는 방법을 사용하거나 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하는 합리적인 설계, 또는 무작위 친화도 성숙에 의해 개선될 수 있다. 예를 들어, 프레임워크 영역 내에 주로 존재하는 버니어 존(Vernier Zone) 잔기의 변이를 사용하여 미국 특허 제6,639,055호에 기재된 바와 같이 항체의 친화도를 조절할 수 있다. 최근, 알마그로 등은 CDR 내에 존재하는 "친화도 결정 잔기(ADR)"를 정의하였으며, 이의 조작으로 친화도를 증가시킬 수 있다(문헌[Cobaugh et al ., J Mol Biol. 378: 622-633, 2008]).
안정성, 선택성, 교차-반응성, 친화도, 면역원성 또는 다른 바람직한 생물학적 또는 생물물리학적 특성을 개선시키기 위하여 변형된 완전 인간, 인간-적응화, 인간화, 친화도-성숙 항체 분자 또는 항체 단편이 본 발명의 범주 내에 있다. 항체의 안정성은 (1) 그들의 본래 안정성에 영향을 미치는 개별 도메인의 코어 패킹(core packing), (2) HC 및 LC 페어링(pairing)에 영향력을 갖는 단백질/단백질 인터페이스(interface) 상호작용, (3) 극성 또는 하전된 잔기의 매몰(burial), (4) 극성 및 하전된 잔기에 대한 H-결합 네트워크 및 (5) 다른 분자-내 및 분자-사이 힘 중의 표면 전하 및 극성 잔기 분포를 비롯한 수많은 인자에 의해 영향을 받을 수 있다(문헌[Worn et al., J. Mol. Biol., 305:989-1010, 2001]). 유력한 구조 불안정화 잔기는 항체의 결정 구조에 기초하여 또는 특정 경우에 분자 모델링에 의하여 동정할 수 있으며, 동정된 잔기 내에 돌연변이를 갖는 변이체를 생성하고 평가함으로써, 항체 안정성 상의 잔기의 영향을 시험할 수 있다. 항체 안정성을 증가시키는 방법 중 하나는 시차 주사 열량계(DSC)에 의해 측정되는 열 전이 중간치(Tm)를 상승시키는 것이다. 일반적으로, 단백질 Tm은 그 안정성과 비례하며, 용액 내에서의 언폴딩(unfolding) 및 변성, 및 단백질이 언폴딩되는 경향에 따라 달라지는 분해 과정에 대한 그의 감수성과 반비례한다(문헌[Remmele et al., Biopharm., 13:36-46, 2000]). 수많은 연구에서 DSC에 의해 열 안정성으로 측정한 제제의 물리적 안정성의 순위와 다른 방법에 의해 측정된 물리적 안정성 간의 상관관계를 찾아내었다(문헌[Gupta et al., AAPS PharmSci. 5E8, 2003]; 문헌[Zhang et al., J. Pharm. Sci. 93:3076-3089, 2004]; 문헌[Maa et al., Int. J. Pharm., 140:155-168, 1996]; 문헌[Bedu-Addo et al., Pharm. Res., 21:1353-1361, 2004]; 문헌[Remmele et al., Pharm. Res., 15:200-208, 1997]). 제제 연구는 Fab Tm이 상응하는 mAb의 장기간 물리적 안정성에 대한 영향을 갖는 것을 시사한다. 프레임워크 또는 CDR 내의 아미노산의 차이는 Fab 도메인의 열 안정성 상에 상당한 영향을 가질 수 있다(문헌[Yasui, et al., FEBS Lett. 353:143-146, 1994]).
본 발명의 항체 길항제는 약 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 또는 10-12 M 이하의 Kd로, TLR3와 결합할 수 있다. 주어진 분자, 이를 테면 항체의 TLR3에 대한 친화도는 임의의 적절한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 이들 방법은 당업자에게 알려져 있는 Biacore 또는 KinExA 기기, ELISA 또는 경쟁적 결합 분석을 사용할 수 있다.
주어진 TLR3 상동체에 원하는 친화도로 결합하는 항체 길항제는 항체 친화도 성숙을 비롯한 기술에 의해 변이체 또는 단편의 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 임의의 적절한 방법을 사용하여, 이들의 TLR3 생물학적 활성의 억제에 기초하여 항체 길항제를 동정할 수 있다. 이들 방법은 리포터-유전자 분석, 또는 잘 알려져 있는 방법을 사용하는, 그리고 본 출원서에 기재된 바와 같은, 사이토카인 생성을 측정하는 분석을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 본 발명의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 이들 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 배큘로바이러스(baculovirus) 발현용 벡터, 트랜스포존(transposon) 기반의 벡터, 또는 임의의 수단에 의한 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 주어진 유기체 또는 유전자 백그라운드(genetic background)로의 도입에 적절한 임의의 다른 벡터일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 서열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 또는 216에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 또는 서열 번호 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209 또는 210에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 서열 번호 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 또는 168에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄, 또는 서열 번호 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165 또는 167에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포이다. 이들 숙주 세포는 진핵 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 또는 고세균(archeal) 세포일 수 있다. 예시적인 진핵 세포는 포유동물, 곤충, 조류 또는 다른 동물 기원의 것일 수 있다. 포유동물 진핵 세포는 불멸화 세포주, 이를 테면 하이브리도마 또는 골수종 세포주, 이를 테면, SP2/0(American Type Culture Collection(ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NS0(European Collection of Cell Cultures(ECACC), 솔리스버리(Salisbury), 윌트셔(Wiltshire), UK, ECACC No. 85110503), FO(ATCC CRL-1646) 및 Ag653(ATCC CRL-1580) 뮤린 세포주를 포함한다. 예시적인 인간 골수종 세포주는 U266(ATTC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 이를 테면 CHO-K1SV(Lonza Biologics, Walkersville, MD), CHO-K1(ATCC CRL-61) 또는 DG44로부터 유래된 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 본 발명의 숙주 세포를 배양하고 숙주 세포에 의해 생성되는 항체를 회수하는 것을 포함하는 TLR3에 반응성인 항체의 제조방법이다. 항체의 제조방법 및 이들의 정제방법은 해당 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 본 발명의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 TLR3에 반응성인 단리된 항체 또는 이의 단편이며, 여기서, 항체는 (a) 서열 번호 2의 잔기 K467, R488, 또는 R489; (b) 서열 번호 2의 잔기 K467; (c) 서열 번호 2의 잔기 R489; (d) 서열 번호 2의 잔기 K467 및 R489; 및 (e) 서열 번호 2의 잔기 K467, R488 및 R489로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TLR3 아미노산 잔기와 결합한다. 단리된 항체는 추가로 서열 번호 2의 잔기 Y465, Y468, N517, D536, Q538, H539, N541, E570 또는 K619로부터 선택된 적어도 하나의 TLR3 아미노산 잔기와 결합할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 단리된 항체 또는 이의 단편이며, 여기서, 항체는 서열 번호 2의 잔기 D116 또는 K145로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TLR3 아미노산 잔기와 결합한다.
몇가지의 잘 알려져 있는 방법을 사용하여, 본 발명의 항체의 결합 에피토프를 결정할 수 있다. 예를 들어, 개별 성분 둘 모두의 구조가 알려져 있는 경우에, 컴퓨터 모의실험(in silico) 단백질-단백질 도킹(docking)을 수행하여, 양립할 수 있는 상호작용의 부위를 동정할 수 있다. 항원 및 항체 복합체를 사용하여 수소-중수소(H/D) 교환을 수행하여, 항체에 의해 결합될 수 있는 항원 상의 영역을 맵핑(map)할 수 있다. 항원의 세그먼트 및 점 돌연변이생성을 사용하여, 항체 결합에 중요한 아미노산의 위치를 찾을 수 있다. TLR3과 같은 큰 단백질에 대해서, 결합 부위가 먼저 도킹, 세그먼트 돌연변이생성 또는 H/D 교환에 의해서와 같이 단백질 상의 영역으로 국소화되는 경우, 점 돌연변이생성 맵핑이 간단하게 된다.
본 발명의 또 다른 면은 TLR3 결합을 위해 모노클로날 항체와 경쟁하는, TLR3에 반응성인 단리된 항체 또는 이의 단편이며, 여기서, 모노클로날 항체는 특정 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2 및 3의 아미노산 서열, 특정 경쇄 CDR 1, 2 및 3의 아미노산 서열, 특정 중쇄 가변 영역(VH)의 아미노산 서열 또는 특정 경쇄 가변 영역(VL)의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 예시적인 모노클로날 항체는 서열 번호 216에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 41에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체, 및 서열 번호 214에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 211에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체이다.
TLR3에 대한 결합 간의 경쟁은 잘 알려진 방법을 사용하여 시험관 내에서 분석할 수 있다. 예를 들어, 미표지 항체의 존재 하에서의 MSD 설포-Tag™ NHS-에스테르-표지된 항체의 TLR3으로의 결합은 ELISA에 의해 평가될 수 있다. 본 발명의 예시적인 항체는 mAb 12, mAb 15 및 mAb c1811이다(표 3a 참조). 이전에 기재된 항-TLR3 항체 c1068 및 이의 유도체(PCT 공보 제WO06/060513A2호에 기재), TLR3.7(eBiosciences, 카탈로그 번호 14-9039) 및 Imgenex IMG-315A(Imgenex IMG-315A; 인간 TLR3 아미노산에 대하여 생성, 아미노산 55-70, VLNLTHNQLRRLPAAN)는 실시예 5에 나타낸 바와 같은 mAb 12, 15 또는 c1811과 TLR3에 대한 결합에 대하여 경쟁하지 않는다.
본 발명의 또 다른 면은 TLR3에 반응성인 단리된 항체이며, 여기서, 항체는 하기의 특성 중 적어도 하나를 갖는다:
a. 1 ㎍/ml 미만에서, 시험관 내 폴리(I:C) NF-kB 리포터 유전자 분석에서의 인간 TLR3 생물학적 활성의 50% 초과의 감소;
b. 10 ㎍/ml 미만에서, 100 ng/ml 미만의 폴리(I:C)로 자극된 BEAS-2B 세포로부터의 IL-6 또는 CXCL5/IP-10 생성의 60% 초과의 억제;
c. 0.4 ㎍/ml 미만에서, 100 ng/ml 미만의 폴리(I:C)로 자극된 BEAS-2B 세포로부터의 IL-6 또는 CXCL5/IP-10 생성의 50% 초과의 억제;
d. 5 ㎍/ml 미만에서, 62.5 ng/ml의 폴리(I:C)로 자극된 NHBE 세포로부터의 IL-6 생성의 50% 초과의 억제;
e. 1 ㎍/ml 미만에서, 62.5 ng/ml의 폴리(I:C)로 자극된 NHBE 세포로부터의 IL-6 생성의 50% 초과의 억제;
f. 1 ㎍/ml 미만에서, PBMC 세포에 의한 폴리(I:C)-유도성 IFN-γ, IL-6 또는 IL-12 생성의 20% 초과의 억제;
g. 10 ㎍/ml 미만의 IC50으로, 시험관 내 NF-kB 리포터 유전자 분석에서의 사이노몰거스 TLR3 생물학적 활성의 억제; 또는
h. 5 ㎍/ml 미만의 IC50으로, 시험관 내 ISRE 리포터 유전자 분석에서의 사이노몰거스 TLR3 생물학적 활성의 억제.
치료 방법
본 발명의 TLR3 길항제, 예를 들어 TLR3 항체 길항제는 면역계를 조절하기 위하여 사용할 수 있다. 임의의 특정 이론에 의해 제한하고자 하지 않고, 본 발명의 길항제는 TLR3에 대한 리간드 결합의 방지 또는 감소, TLR3의 이량체화, TLR3 내재화 또는 TLR3 트래피킹(trafficking)에 의하여, 면역계를 조절할 수 있다. 본 발명의 방법은 임의의 분류에 속하는 동물 환자를 치료하기 위해 사용할 수 있다. 이들 동물의 예에는 포유동물, 이를 테면 인간, 설치류, 개, 고양이 및 가축이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 염증, 염증성 및 대사성 질환의 치료에서, TLR3 활성을 길항시키는 데 유용하며, 또한 이러한 치료를 위한 약제의 제조에 유용하고, 여기서, 약제는 본 명세서에서 규정된 용량으로 투여하기 위하여 제조된다.
일반적으로, 본 발명의 TLR3 항체 길항제의 투여에 의해 예방되거나 치료될 수 있는 염증성 증상, 감염-관련 증상 또는 면역-매개의 염증성 질병은 사이토카인 또는 케모카인에 의해 매개되는 것, 및 TLR3의 활성화 또는 TLR3 경로를 통한 신호전달로부터 전적으로 또는 부분적으로 야기되는 증상을 포함한다. 이들 염증성 증상의 예에는 패혈증-관련 증상, 염증성 장질환, 자가면역 장애, 염증성 질병 및 감염-관련 증상이 포함된다. 또한, 암, 심혈관 및 대사성 증상, 신경 및 섬유증 증상도 본 발명의 TLR3 항체 길항제의 투여에 의해 예방되거나 치료될 수 있다. 염증은 조직에 영향을 미치거나 전신성일 수 있다. 영향을 받는 예시적인 조직은 기도, 폐, 위장관, 소장, 대장, 결장, 직장, 심혈관계, 심장 조직, 혈관, 관절, 뼈 및 활막 조직(synovial tissue), 연골, 상피, 내피, 간 또는 지방질 조직이다. 예시적인 전신 염증성 증상은 사이토카인 발작(cytokine storm) 또는 하이퍼사이토키네미아(hypercytokinemia), 전신 염증성 반응 증후군(SIRS), 이식편대숙주병(GVHD), 급성호흡곤란증후군(ARDS), 중증 급성호흡곤란증후군(SARS), 파국성 항인지질 증후군(catastrophic anti-phospholipid syndrome), 중증 바이러스 감염, 인플루엔자, 폐렴, 쇼크 또는 패혈증이다.
염증은 침입 물질(invading agent)을 방어하기 위한 기관에 의한 보호 반응이다. 염증은 많은 세포성 및 체액성 매개체를 수반하는 캐스케이딩(cascading) 사건이다. 한편으로는, 염증성 반응의 저해는 숙주를 면역손상되게 만들 수 있으나; 제지되지 않는다면, 염증은 만성 염증성 질환(예를 들어, 천식, 건선, 관절염, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장질환 등), 패혈 쇼크 및 다발 장기 부전을 비롯한 심각한 합병증을 야기할 수 있다. 중요하게는, 이들 다양한 질환 상태는 공통의 염증 매개체, 이를 테면 사이토카인, 케모카인, 염증성 세포 및 이들 세포에 의해 분비되는 다른 매개체를 공유한다.
그의 리간드 폴리(I:C), dsRNA 또는 내재성 mRNA에 의한 TLR3 활성화는 전-염증성 사이토카인의 합성 및 분비, 염증성 세포, 이를 테면, 대식구, 과립구, 호중구 및 호산구의 활성화 및 동원, 세포 사멸, 및 조직 파괴를 초래하는 신호전달 경로의 활성화를 야기한다. TLR3은 IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α, MIP-1, CXCL5/IP-10 및 RANTES, 및 면역 세포 동원 및 활성화에 연루되는 다른 전-염증성 사이토카인 및 케모카인의 분비를 유도하여, 자가면역 및 다른 염증성 질환에서 조직 파괴의 원인이 된다. TLR3 리간드 내재성 mRNA는 염증 동안에 괴사 세포로부터 방출되며, 양성 피드백 루프를 야기하여, TLR3을 활성화시키고, 염증 및 추가의 조직 손상을 영속시킬 수 있다. TLR3 항체 길항제와 같은 TLR3 길항제는 사이토카인 분비를 정상화시키고, 염증성 세포의 동원을 감소시키고, 조직 손상 및 세포 사멸을 감소시킬 수 있다. 따라서, TLR3 길항제는 염증 및 다양한 염증성 증상을 치료할 치료적 가능성을 갖는다.
염증성 증상의 일 예는 전신염증반응증후군(SIRS), 패혈증 쇼크 또는 다중 기관 기능이상 증후군(MODS)을 포함할 수 있는 패혈증-관련 증상이다. 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 기생충 감염에 의하여, 그리고 괴사 세포에 의하여 방출되는 dsRNA는 패혈증의 발병의 원인이 될 수 있다. 특정 이론에 제한하고자 하지 않고, TLR3 길항제로의 치료는 패혈증-관련 염증성 증상으로 고통받는 환자의 생존 시간을 늘리거나, 국소적 염증 사건(예를 들어, 폐에서)이 전신 증상으로 퍼지는 것을 예방함으로써, 선천적 항미생물 활성을 강력하게 함으로써, 항미생물 제제와 병용하는 경우 상승적인 활성을 나타냄으로써, 병리에 기여하는 국소 염증성 상태를 최소화함으로써, 또는 상기한 것 중 임의의 조합으로써, 치료적 혜택을 제공할 수 있는 것으로 여겨진다. 그러한 중재는 환자의 생존을 보장하는 데 필요한 추가적인 치료(예를 들어, 선행 감염의 치료 또는 사이토카인 수준의 감소)를 허용하는 데 충분할 수 있다. 패혈증은 D-갈락토사민 및 폴리(I:C)의 투여에 의하여 동물, 이를 테면 마우스에서 모델링할 수 있다. 이들 모델에서, D-갈락토사민은 패혈증 민감제로 기능하는 간독소이며, 폴리(I:C)는 dsRNA를 모방하고, TLR3을 활성화시키는 패혈증-유도 물질이다. TLR3 길항제 처리는 뮤린 패혈증 모델에서, 동물 생존률을 증가시킬 수 있으며, 이에 따라, TLR3 길항제는 패혈증의 치료에 유용할 수 있다.
위장 염증은 위장관 점막층의 염증이며, 급성 및 만성 염증성 증상을 포함한다. 급성 염증은 일반적으로, 짧은 발병 시간 및 호중구의 침윤 또는 유입을 특징으로 한다. 만성 염증은 일반적으로, 상대적으로 더 긴 발병 기간 및 단핵구의 침윤 또는 유입을 특징으로 한다. 점막층은 장(소장 및 대장 포함), 직장, 위(stomach, gastric) 내면, 또는 구강의 점막일 수 있다. 예시적인 만성 위장 염증성 증상은 염증성 장질환(IBD), 환경 자극에 의해 유도되는 대장염(예를 들어, 치료 요법, 이를 테면 화학요법, 방사선 요법 등의 시행에 의해 유발되거나 이와 관련된(예를 들어, 부작용) 위장염증(예를 들어, 대장염)), 감염성 대장염, 허혈성 대장염, 교원성 또는 림프구성 대장염, 괴사소장대장염, 만성 육아종 질환, 또는 복강 질환과 같은 증상의 대장염, 음식물 알러지, 위염, 감염성 위염, 또는 소장대장염(예를 들어, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)-감염된 만성 활성 위염) 및 임의의 감염성 물질에 의해 유발되는 다른 형태의 위장 염증이다.
염증성 장질환(IBD)은 일반적으로 알려져 있지 않은 병인의 만성 염증성 질병의 그룹, 예를 들어, 궤양대장염(UC) 및 크론병(CD)을 포함한다. 임상적 및 실험적 증거는 IBD의 발병기전이 감수성 유전자 및 환경 인자를 포함하여 다인적임을 제시한다. 염증성 장질환에서, 조직 손상은 장의 미생물무리의 항원에 대한 부적절한, 또는 과대한 면역 반응으로부터 야기된다. 염증성 장질환에 대한 몇몇 동물 모델이 존재한다. 가장 널리 사용되는 동물의 일부는 2,4,6-트라이니트로벤설폰산/에탄올(TNBS)-유도성 대장염 모델 또는 옥사잘론 모델이며, 이들은 결장에서 만성 염증 및 궤양을 유도한다(문헌[Neurath et al ., Intern. Rev. Immunol 19:51-62, 2000]). 또 다른 모델은 덱스트란 설페이트 소듐(DSS)을 사용하며, 이는 피가 섞인 설사, 체중 감소, 결장의 단축 및 호중구 침윤이 있는 점막 궤양로 나타나는 급성 대장염을 유도한다. DSS-유도성 대장염은 림프구 증식, 국소 움구조 손상(focal crypt damage) 및 상피 궤양과 함께, 조직학적으로 염증성 세포의 고유판내로의 침윤을 특징으로 한다(문헌[Hendrickson et al ., Clinical Microbiology Reviews 15:79-94, 2002]). 또 다른 모델은 RAG 또는 SCID 마우스로의 나이브(
Figure 112011039693804-pct00010
) CD45RB고 CD4 T 세포의 입양 전달(adoptive transfer)을 포함한다. 이러한 모델에서, 공여자 나이브 T 세포는 수여자 장을 공격하여, 만성 장 염증 및 인간 염증성 장질환과 유사한 증후를 야기한다(문헌[Read and Powrie, Curr. Protoc. Immunol. Chapter 15 unit 15.13, 2001]). 이들 모델 중 임의의 것에서 본 발명의 길항제의 투여를 사용하여, 증후를 개선하고, 장의 염증, 이를 테면 염증성 장질환과 관련된 질환의 경과를 변경시키기 위한 이들 길항제의 잠재적인 효능을 평가할 수 있다. IBD에 대한 몇가지의 치료 옵션이 이용가능하며, 예를 들어 크론 병을 치료하기 위하여 10년 동안 항-TNF-α 항체 치료법이 사용되어 왔다(문헌[Van Assche et al ., Eur. J. Pharmacol. Epub Oct 2009]). 그러나, 상당한 퍼센트의 환자는 현재의 치료에 불응성이어서(문헌[Hanauer et al., Lancet 359:1541-1549, 2002]; 문헌[Hanauer et al., Gastroenterology 130:323-333, 2006]), 불응성 환자 개체군을 표적으로 하는 새로운 치료법이 필요하다.
염증성 증상의 또 다른 예는 염증성 폐 증상이다. 예시적인 염증성 폐 증상은 바이러스, 박테리아, 진균류, 기생충 또는 프리온(prion) 감염에 관련된 것을 비롯한 감염-유도성 폐 증상; 알러지-유도성 폐 증상; 석면증(asbestosis), 규폐증(silicosis), 또는 벨릴륨증(berylliosis)과 같은 오염물질-유도성 폐 증상; 위 흡인-유도성 폐 증상; 면역 조절곤란; 낭성섬유증과 같은 유전적 소인이 있는 염증성 증상; 및 호흡기 손상(ventilator injury)과 같은 물리적 외상-유도성 폐 증상을 포함한다. 이들 염증성 증상은 또한 천식, 폐기종, 기관지염, 만성폐쇄폐질환(COPD), 사코이드증, 조직구증, 림프관근종증, 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 만성 폐질환, 기관지폐형성이상, 지역사회-획득 폐렴, 병원내 폐렴, 호흡기-관련 폐렴, 패혈증, 바이러스성 폐렴, 인플루엔자 감염, 파라인플루엔자 감염, 로타바이러스 감염, 인간 메타뉴모바이러스(metapneumovirus), 호흡기 세포융합 바이러스 감염 및 아스파르길루스 또는 다른 진균류 감염을 포함한다. 예시적인 감염-관련 염증성 질환은 중증 폐렴, 낭성섬유증, 기관지염, 기도 결절(airway exacerbations), 및 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)를 비롯한 바이러스 또는 박테리아 폐렴을 포함할 수 있다. 그러한 감염-관련 증상은 일차 바이러스 감염 및 이차 박테리아 감염과 같은, 다중 감염을 포함할 수 있다.
천식은 기도 과민성("AHR"), 기관지수축, 천명, 호산구 또는 호중구 염증, 점액 과다분비, 상피하 섬유증 및 증가된 IgE 수준을 특징으로 하는 폐의 염증성 질환이다. 천식 환자는 통상 기도의 미생물 감염(예를 들어, 리노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 해모필루스 인플루엔자 등)에 기인하여, 증후가 나빠지는 "악화"를 경험한다. 천식 발작은 환경 인자(예를 들어, 회충, 곤충, 동물(예를 들어, 고양이, 개, 토끼, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니아 피그 및 새), 진균류, 공기 오염물질(예를 들어, 담배 연기), 자극성 가스, 퓸(fume), 증기, 에어로졸, 화학물질, 화분, 운동 또는 찬 공기에 의해 촉발될 수있다. 천식과 별개로, 폐에 영향을 미치는 몇몇의 만성 염증성 질환, 예를 들어, 만성폐쇄폐질환(COPD), 세균성 폐렴 및 낭성섬유증은 호중구의 기도로의 침습을 특징으로 하며(문헌[Linden et al ., Eur. Respir. J. 15:973-977, 2000]; 문헌[Rahman et al ., Clin. Immunol. 115:268-276, 2005]), COPD, 알러지성 비염 및 낭성섬유증과 같은 질환은 기도 과민성을 특징으로 한다(문헌[Fahy and O'Byrne, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163:822-823, 2001]). 천식 및 기도 염증에 대하여 통상적으로 사용되는 동물 모델은 오브알부민(ovalbumin) 챌린지 모델 및 메타콜린 민감화 모델을 포함한다(문헌[Hessel et al., Eur. J. Pharmacol. 293:401-412, 1995]). 또한, 배양된 인간 기관지 상피 세포, 기관지 섬유모세포 또는 기도 평활근 세포로부터의 사이토카인 및 케모카인 생성의 억제는 시험관 내 모델로 사용될 수 있다. 본 발명의 길항제의 이들 모둘 중 임의의 것으로의 투여를 사용하여, 천식, 기도 염증, COPD 등의 경로를 변경하고, 증후를 개선하기 위한 이들 길항제의 용도를 평가할 수 있다.
본 발명의 방법으로 예방하거나 치료할 수 있는 다른 염증성 증상 및 신경병증은 자가면역 질환에 의해 야기되는 것이다. 이들 증상 및 신경병증은 다발성 경화증, 전신홍반루푸스, 및 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 양극성 장애 및 근육위축가쪽경화증(ALS)을 포함하는 신경변성 및 중추 신경계(CNS) 장애, 원발 담즙성 간경화, 원발 경화성 담관염, 비-알코올성 지방간 질환/지방간염(steatohepatitis), 섬유증, C형 간염 바이러스(HCV)와 B형 간염 바이러스(HBV)를 포함하는 간 질환, 죽상동맥경화증, 뇌출혈, 뇌졸중 및 심근경색을 비롯한 심혈관 질환, 관절염, 류마티스성 관절염, 건선 관절염 및 소아 류마티스성 관절염(JRA), 골다공증, 골관절염, 이자염, 섬유증, 뇌염, 건선, 거세포동맥염, 강직성척추염, 자기면역 간염, 사람 면역결핍 바이러스(HIV), 염증성 피부증상, 이식, 암, 알러지, 내분비 질환, 상처 회복, 다른 자가면역 질병 및 기도 과민증 및 세포, 바이러스 또는 프리온-매개의 감염 또는 질병을 포함한다.
골관절염, 류마티스성 관절염, 손상의 결과로서 관절염이 있는 관절 등은 본 발명의 길항제와 같은 항염증성 단백질의 치료적 사용으로부터 유익할 것인 통상적인 염증성 증상이다. 예를 들어, 류마티스성 관절염(RA)은 온몸에 영향을 미치는 전신 질환이며, 관절염의 가장 통상적인 형태 중 하나이다. 류마티스성 관절염이 조직 손상을 야기하기 때문에, TLR3 리간드는 염증 부위에 존재할 수 있다. TLR3 신호전달의 활성화는 염증을 영구화시키며, 추가로 악화된 관절에서 조직 손상을 영구화시킨다. 류마티스성 관절염을 위한 몇몇의 동물 모델이 해당 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 콜라겐-유도성 관절염(CIA) 모델에서, 마우스에는 인간 류마티스성 관절염과 매우 유사한 만성 염증성 관절염이 생긴다. 본 발명의 TLR3 길항제의 CIA 모델 마우스로의 투여를 사용하여, 증후를 질환의 증후를 개선하고, 경과를 변경시키기 위한 이들 길항제의 용도를 평가할 수 있다.
당뇨병(Diabetes mellitus, diabetes)은 다중의 유발 인자로부터 유래되며 고혈당증을 특징으로 하는 질환 과정을 지칭한다(문헌[LeRoith et al ., (eds.), Diabetes Mellitus, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa. U.S.A. 1996] 및 상기 문헌에 기재된 모든 참고문헌). 비조절형 고혈당증은 신장병, 신경병증, 망막병증, 고혈압, 뇌혈관 질환 및 관상동맥 심질환을 비롯한 미세혈관 및 대혈관(macrovascular) 질환에 대한 위험 증가에 기인한, 사망률 증가 및 조기 사망(premature mortality)과 관련된다. 따라서, 당 항상성의 조절은 당뇨병의 치료를 위한 결정적으로 중요한 접근법이다.
근본적인 결함은 당뇨병의 2가지 주요 그룹으로의 분류를 야기한다: 환자에 그들의 췌장샘(pancreatic gland) 내의 인슐린-생성 베타-세포가 결여되는 경우 발생하는 1형 당뇨병(인슐린 의존형 당뇨병, IDDM) 및 손상된 베타-세포 인슐린 분비 및/또는 인슐린 활성에 대한 내성이 있는 환자에서 발생하는 2형 당뇨병(비-인슐린 의존형 당뇨병, NIDDM).
2형 당뇨병은 절대적이라기 보다는 상대적인 인슐린 결함에 의해 달성되는 인슐린 내성을 특징으로 한다. 인슐린 내성 개체 내에서, 신체는 이러한 결함을 보상하기 위하여, 비정상적으로 다량의 인슐린을 분비한다. 인슐린 내성을 보상하고, 당을 적절하게 조절하기 위한 부적절한 양의 인슐린이 존재하는 경우, 내당능 장애(impaired glucose tolerance)의 상태가 발생한다. 상당한 수의 개체 내에서, 인슐린 분비가 추가로 감소하며, 혈당 수준이 증가하여, 당뇨병의 임상 상태가 야기된다. 지방증-관련 염증은 인슐린 내성, 2형 당뇨병, 이상지질혈증 및 심혈관 질환의 발생에 강력히 연루된다. 비만의 지방질은 대식구를 동원하고 보유하며, TNF-α 및 IL-6, 유리 지방산 및 아디포카인(adipokine)을 비롯한 과도한 전-염증성 사이토카인을 생성할 수 있으며, 이는 인슐린 신호전달을 간섭하고, 인슐린 내성을 유도할 수 있다. 대식구 상의 TLR3 활성화는 지방질의 전-염증성 상태에 기여할 수 있다. 인슐린 내성의 몇몇 동물 모델이 알려져 있다. 예를 들어, 식이-유도 비만 모델(DIO) 동물에서, 체중 증가로 달성되는 고혈당증 및 인슐린 내성이 발생한다. 본 발명의 TLR3 길항제의 DIO 모델 내로의 투여를 사용하여, 2형 당뇨병과 관련된 합병증을 개선시키고, 질환의 경과를 변경시키기 위한 길항제의 사용을 평가할 수 있다.
예시적인 암은 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), B-세포 또는 T-세포 ALL, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 모발상 세포 백혈병, 골수 이형성 증후군(MDS), 림프종, 호지킨병, 악성 림프종, 비호지킨 림프종, 버킷(Burkitt) 림프종, 다발성 골수종, 카포시 육종, 결장직장암, 췌장암종, 신장 세포 암종, 유방암, 비인두 암종, 악성 조직구증, 부종양 증후군/악성종양에 의한 고칼슘혈증, 고형종양, 선암종, 편평세포암종, 육종, 악성 흑색종, 특히 전이성 흑색종, 혈관종, 전이성 질환, 암 관련 골흡수, 암 관련 뼈통증을 포함하나 이에 한정되지 않는, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자의 적어도 하나의 악성 질환을 포함할 수 있다.
예시적인 심혈관 질환은 심장 스턴(cardiac stun) 증후군, 심근경색, 울혈성 심부전, 뇌졸중, 허혈성 뇌졸중, 출혈, 동맥경화증, 죽상동맥경화증, 재협착, 당뇨병성 죽상동맥경화성 질환, 고혈압, 동맥성 고혈압, 신장혈관성 고혈압, 실신, 쇼크, 심장혈관 매독, 심부전, 폐심장증, 원발성 폐고혈압, 심부정맥, 주기외심방박동, 심방 조동, 심방 세동(지속성 또는 발작성), 관류후 증후군, 심폐 바이패스 염증성 반응, 혼돈성 또는 다소성 심방 빈맥, 규칙적인 좁은 QRS 빈맥, 특정 부정맥, 심실세동, 히스 다발(His bundle) 부정맥, 방실 차단, 다발 갈래 차단, 심근 허혈 장애, 심장동맥 질환, 협심증, 심근경색, 심근병증, 확장형 울혈성 심근병증, 제한성 심근병증, 판막성 심장병, 심내막염, 심장막병, 심장종양, 대동맥류 및 말초동맥류, 대동맥박리, 대동맥 염증, 배대동맥 및 그의 분지의 폐색, 말초혈관병, 폐쇄성 동맥 질병, 말초 죽상경화 질환, 폐쇄성 혈전혈관염, 기능성 말초 동맥 장애, 레이노 현상 및 레이노병, 말단청색증, 피부홍통증, 정맥 질환, 정맥 혈전증, 정맥류성 정맥, 동정맥루, 림프부종, 지방부종, 불안정성 협심증, 재관류 손상, 펌프 후(post pump) 증후군 및 허혈-재관류 손상을 포함하나 이에 한정되지 않는, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자의 심혈관 질환을 포함할 수 있다.
예시적인 신경 질환은신경 변성 질환, 다발성 경화증, 편두통, AIDS 치매 합병증, 탈수초 질환, 예를 들어 다발성 경화증 및 급성 횡단성 척수염; 추체외로 및 소뇌 질병, 예컨대 피질 척수계 병변; 기저핵 질병 또는 소뇌 질병; 과다운동성 운동 장애, 예컨대 헌팅턴 무도병 및 노인무도병; 약물 유도성 운동 장애, 예컨대 CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유도된 것; 과소운동성 운동 장애, 예컨대 파킨슨병; 진행성 핵상마비; 소뇌 구조 병변; 척수소뇌 변성증, 예컨대 척수성 운동실조증, 프리이드라이히 운동실조증, 소뇌 피질 변성증, 다발계통 변성증(멘셀 (Mencel), 데제린-토마스(Dejerine-Thomas), Shi-Drager(샤이-드래거), 및 마카도-조셉(Machado-Joseph)); 전신성 질병(레프섬 병, 무베타리포단백혈증, 운동실조증, 모세혈관확장증, 및 미토콘드리아 다발계통 질병); 탈수초성 코어(core) 질병, 예컨대 다발성 경화증, 급성 횡단성 척수염; 및 운동단위 질병, 예컨대 신경성 근위축증(전각 세포 변성, 예컨대 근위축성 측삭경화증, 유아 척수성 근육위축증 및 소아 척수성 근육위축증); 알츠하이머병; 중년기의 다운 증후군; 확장형 루이소체병; 루이소체형 노인성 치매; 베르니케-코르사코프 증후군; 만성 알코올 중독; 크로이츠펠트-야콥병; 아급성 경화성 범뇌염; 할러포르텐-스파츠 병; 권투선수 치매를 포함하나 이에 한정되지 않는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자 내의 신경 질환을 포함한다.
예시적인 섬유성 질환은 간 섬유증(알코올 유도성 경화증, 바이러스 유도성 경화증, 자가면역 유도성 간염을 포함하나 이에 한정되지 않음); 폐 섬유증(피부경화증, 특발성 폐 섬유증을 포함하나 이에 한정되지 않음); 신장 섬유증(피부 경화증, 당뇨병성 신장염, 사구체신염, 루푸스 신장염을 포함하나 이에 한정되지 않음); 피부 섬유증(피부 경화증, 비후성 및 켈로이드 흉터 형성, 화상을 포함하나 이에 한정되지 않음); 골수 섬유증; 신경 섬유종증; 섬유종; 장 섬유증; 및 외과적 처치로부터 야기된 섬유성 유착을 포함할 수 있다. 이러한 방법에서, 섬유증은 기관 특이적 섬유증 또는 전신 섬유증일 수 있다. 기관 특이적 섬유증은 폐 섬유증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 심장 섬유증, 혈관 섬유증, 피부 섬유증, 안구 섬유증, 골수 섬유증 또는 기타 섬유증 중 적어도 하나와 관련될 수 있다. 폐 섬유증은 특발성 폐 섬유증, 약물 유도성 폐 섬유증, 천식, 사코이드증 또는 만성폐쇄폐질환 중 적어도 하나와 관련될 수 있다. 간 섬유증은 경화증, 주혈흡충증 또는 담관염 중 적어도 하나와 관련될 수 있다. 경화증은 알코올성 경화증, C형 간염-후 경화증, 원발성 담즙성 간경변으로부터 선택될 수 있다. 담관염은 경화담관염이다. 신장 섬유증은 당뇨병성 신병증 또는 루푸스 사구체경화증과 관련될 수 있다. 심장 섬유증은 심근경색과 관련될 수 있다. 혈관 섬유증은 혈관확장술후 동맥 재협착 또는 죽상동맥경화증과 관련될 수 있다. 피부 섬유증은 화상 흉터형성, 비대 흉터형성, 켈로이드 또는 신장기원 섬유화 피부병과 관련될 수 있다. 안구 섬유증은 안와-후(Retro-orbital) 섬유증, 백내장 수술후 안구 섬유증 또는 증식유리체망막병과 관련될 수 있다. 골수 섬유증은 특발성 골수섬유증 또는 약물 유도성 골수섬유증과 관련될 수 있다. 다른 섬유증은 페로니병, 뒤퓌트랑구축 또는 피부근육염으로부터 선택될 수 있다. 전신 섬유증은 전신 경화증 또는 이식편대숙주병일 수 있다.
투여/약제학적 조성물
TLR3 활성의 저해가 바람직한 증상의 치료 또는 예방에 효과적인 제제의 "치료적 유효량"은 표준 연구 기술에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, 천식, 크론병, 궤양성 대장염 또는 류마티스성 관절염과 같은 염증성 증상의 치료 또는 예방에 효과적일 제제의 투여량은 본 명세서에 기재된 모델과 같은 관련있는 동물 모델에게 제제를 투여함으로써 결정할 수 있다.
또한, 시험관 내 분석을 임의로 사용하여, 최적의 투여량 범위를 동정하는 것을 도울 수 있다. 유효한 특정 투여량의 선택은 몇몇 인자의 고려사항에 기초하여, 당업자에 의해 결정될 수 있다.(예를 들어, 임상 시험을 통해). 이러한 인자는 치료 또는 예방되는 질환, 수반 증후, 환자의 체중, 환자의 면역 상태 및 당업자가 알고 있는 다른 인자를 포함한다. 제제에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환의 중증도에 좌우될 것이며, 전문의의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 검사 시스템으로부터 유래하는 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.
본 발명의 방법에서, TLR3 길항제는 단독으로 또는 적어도 하나의 다른 분자와 병용하여 투여될 수 있다. 이러한 추가의 분자는 다른 TLR3 길항제 분자 또는 TLR3 수용체 신호전달에 의해 매개되지 않는 치료 혜택을 갖는 분자일 수 있다. 사이토카인 수준 또는 활성을 감소시키는 항생제, 항바이러스제, 완화 및 다른 화합물이 이러한 추가의 분자의 예이다.
본 발명의 제제의 치료적 이용을 위한 투여 방식은 제제를 숙주에게 전달하는 임의의 적절한 경로일 수 있다. 이들 제제의 약제학적 조성물은 비경구 투여, 예를 들어 피부내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하 또는 비강내 투여에 특히 유용하다.
본 발명의 제제는 약제학적으로 허용되는 담체 중에 활성 성분으로서 제제의 유효량을 함유하는 약제학적 조성물로 제조할 수 있다. 용어 "담체"는 활성 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 비히클은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 이를 테면 피넛유, 대두유, 광물유, 참기름 등을 포함하는 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 염수 및 0.3% 글리신을 사용할 수 있다. 이들 용액을 멸균이고 일반적으로 입자상 물질이 없다. 이들은 통상적인 잘 알려져 있는 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다(예를 들어, 여과). 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 안정화제, 농후제, 윤활제 및 착색제와 같은 생리적 환경에 근접시키기 위하여 필요한, 약제학적으로 허용가능한 보조 물질을 함유할 수 있다. 그러한 약제학적 제제에서 본 발명의 제제의 농도는 예를 들어, 약 0.5 중량% 미만에서, 보통 약 1 중량%에서, 또는 1 중량% 이상에서, 15 또는 20 중량% 이하까지로 광범위하게 달라질 수 있고, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 일차적으로 원하는 투여량, 액체 부피, 점성 등에 기초하여 선택될 것이다.
따라서, 근육내 주사를 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 1 ml의 멸균 완충수 및 약 1 ng 내지 약 100 ㎎, 예를 들어, 약 50 ng 내지 약 30 ㎎ 또는 더욱 바람직하게는 약 5 ㎎ 내지 약 25 ㎎의 본 발명의 TLR3 항체 길항제를 함유하도록 제조할 수 있다. 유사하게, 정맥내 주입을 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 약 250 ml의 멸균 링거 용액 및 약 1 ㎎ 내지 약 30 ㎎, 바람직하게는 5 ㎎ 내지 약 25 ㎎의 본 발명의 길항제를 함유하도록 제조할 수 있다. 비경구적으로 투여할 수 있는 조성물을 제조하기 위한 실제의 방법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌["Remington's Pharmaceutical Science", 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA]에 더욱 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 항체 길항제는 보관을 위해 동결건조되고, 사용 전에 적절한 담체 내에 재구성될 수 있다. 이 기술은 통상의 면역글로불린 및 단백질 제제에 유효한 것으로 보이며, 해당 업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기술을 사용할 수 있다.
이제 본 발명을 하기의 구체적인 비제한적 실시예를 참고로 하여 설명할 것이다.
실시예 1
항- huTLR3 길항제 mAb 의 동정 및 유도
MorphoSys 인간 조합 항체 라이브러리(HuCAL®) 골드(Gold) 파지 디스플레이 라이브러리(Morphosys AG, Martinsried, Germany)를 인간 항체 단편의 공급원으로 사용하고, C-말단 폴리-히스티딘 태그가 있는 인간 TLR3 (huTLR3)(서열 번호 4)의 아미노산 1-703의 발현으로부터 생성된, 정제한 TLR3 항원에 대하여 패닝(paned)하고, 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피로 정제하였다. 아미노산 1-703은 huTLR3의 예측된 세포외 도메인(ECD)에 상응한다.다양한 세트의 항체 단편을 동정하고, 시퀀싱하고, 독특한 것으로 확인할 수 있도록, TLR3 단백질을 다양한 방법으로 제시함으로써, huTRL3 ECD에 특이적으로 결합하는 Fab 단편(Fab)을 선택하였다. 상이한 패닝 전략으로부터, 62개의 후보물질(상이한 V-영역 서열)을 독특한 hTLR3 ECD 결합제로 동정하였다.
huTLR3 ECD 결합제로 동정한 62개의 후보물질을 항-염증 활성을 동정하는데 적절한 다양한 세포-기반의 분석에서 중화 활성에 대하여 스크리닝하였다. 예비 활성 데이터를 사용하여(하기 실시예 2 참고), 패밀리 16-19를 규정하는 4개의 후보물질(Fab 16-19)을 중쇄 CDR2(HCDR2) 및 경쇄 CDR3(LCDR3)의 CDR 성숙에 대한 모(parent)로서 62개로부터 선택하였다. 모 후보물질 중 하나(후보물질 19)는 HCDR2 내에 N-결합 당화 부위를 나타내었으며; Ser의 Ala(S에서 A)로의 돌연변이를 이 후보물질에서 만들어서, 부위를 결실시켰다. 4개의 모 후보물질의 CDR 성숙 후에, 하기 실시예 2에 기재된 바와 같은 추가의 특성화를 위해 총 15개의 자손(progeny) 후보물질(후보물질 1-15)을 동정하였다. 19개의 후보물질 각각에 제시된 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 목록을 상기 표 3에 나타내었다. 후보물질은 이들이 Fab인지 전장 항체 사슬로 클로닝되는지(실시예 3)에 따라, 본 명세서에서 mAb 1-19 또는 Fab 1-19로 지칭하였다. 발현 벡터 설계 때문에, 모든 후보물질에 대한 가변 영역의 성숙 아미노 말단은 중쇄에 대해서는 QVE였고, 경쇄에 대해서는 DI였다. 이들 말단에서의 바람직한 서열은 후보물질 서열에 높은 동일성을 갖는 각각의 생식계 유전자 내의 것이다. 패밀리 17 및 18에 대하여, 생식계 서열은 VH에 대해서는 QVQ이고, VL에 대해서는 SY이다. 패밀리 19에 대하여, 서열은 VH에 대해서는 EVQ이고, VL에 대해서는 DI이다. SY 서열은 람다 서브그룹(subgroup) 3에 독특하며, 아미노 말단 잔기로서 S 또는 Y 중 하나를 갖는 이질성에 대한 보고가 있다. 따라서, 두드러진 람다 서브그룹 1로부터의 QSV 공통의(consensus) 말단은 패밀리 17 및 18의 VL에 대한 DIE의 더욱 적절한 대체물로 여겨진다. 이들 변화를 패밀리 18로부터의 후보물질 9, 10 및 12, 및 패밀리 19로부터의 후보물질 14 및 15로 도입시켰다. 이러한 과정에서, 이들 항체의 VH 및 VL 영역 둘 모두를 코돈 최적화시켰다. 후보물질 9, 10 및 11의 경쇄 가변 영역 N-말단 생식계 변이체의 아미노산 서열을 서열 번호 209-211에 나타내었으며, 후보물질 9, 10, 12, 14 및 15에 대한 중쇄 가변 영역 N-말단 생식계 변이체의 아미노산 서열을 서열번호 212-216에 각각 나타내었다. 후보물질의 N-말단 변이체를 본 명세서에서는 후보물질/mAb/Fab 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQ 또는 15EVQ로 지칭한다. N-말단 생식계 변이체를 mAb로 표현하였으며, 이들의 모 대응물과 비교하는 경우, TLR3에 대한 결합 상에서, 또는 TLR3 생물학적 활성을 억제하기 위한 이들의 능력에서 영향을 나타내지 않았다(데이터 미도시).
실시예 2
시험관 내에서의 TLR3 길항제 활성의 결정
상술된 15개의 CDR-성숙된 후보물질을 잠재적인 인간 치료제로 선택하고, 결합 및 중화 활성의 범위를 결정하였다. 모 Fab인, Fab 16-19 및 15 CDR-성숙된 Fab인, Fab 1-15 또는 이들의 비-생식계 V-영역 변이체에 대한 활성 분석 및 결과를 후술한다.
NF -κB 및 ISRE 신호전달 캐스케이드의 억제
293T 세포를 열-불활성화 FBS가 보충된 DMEM 및 글루타맥스(GlutaMax) 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA) 중에 성장시키고, 30 ng의 pNF-κB 또는 ISRE 반딧불(firefly) 루시퍼라아제 리포터 플라스미드, 13.5 ng의 pcDNA3.1 벡터, 5 ng의 phRL-TK 및 1.5 ng의 FL TLR3(서열 번호 2)을 코딩하는 pCDNA를 트랜스펙션(transfection)시켰다. phRL-TK 플라스미드는 HSV-1 티미딘 키나아제 프로모터에 의해 작동되는 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제 유전자를 포함한다(Promega, Madion, WI). TLR3 항체를 폴리(I:C) (GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 첨가하기 전에 30-60 분 동안 인큐베이션시켰다. 듀얼-글로(Dual-Glo) 루시퍼라아제 시약을 첨가하기 전에, 플레이트를 37℃에서 6시간 또는 24시간 인큐베이션시키고, 플레이트를 플루오스타(FLUOstar) 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 반딧불 RLU 값을 레닐라 RLU 값으로 나눔으로써, 정규화된 값(루시퍼라아제 비)을 얻었다. 자극 전에 세포를 항-TLR3 항체(0.4, 2.0 및 10 ㎍/ml)와 인큐베이션함으로써, TLR3 작용제 폴리 (I:C)(1 ㎍/ml)로의 자극 시에, NF-κB 또는 ISRE 신호전달 캐스케이드로 자극된 반딧불 루시퍼라아제 생성이 특이적으로 억제되었다. NF-κB 분석에 대한 결과를 도 1에 나타내었고, 양성 대조군으로서의 5465(중화성 항-인간 TLR3 Mab) 및 인간 IgG4 아이소형 대조군으로서의 항-인간 조직 인자 mAb(859)와 함께 반딧불/레닐라 비의 억제%로 표현하였다.mAb 농도 0.4-10 ㎍/ml로 50% 초과의 억제를 달성하였다. c1068 및 TLR3.7은 10 ㎍/ml에서 TLR3 생물학적 활성을 약 38% 및 8% 억제시켰다. 유사한 결과를 ISRE 리포터 유전자 분석으로 수득하였다(데이터 미도시).
BEAS -2B 세포 내에서의 사이토카인 방출
BEAS-2B 세포(SV-40 형질전환된 정상 인간 기관지 상피 세포주)를 I형 콜라겐 코팅된 접시에 씨딩하고(seeded), 폴리 (I:C)의 첨가 전에 항-인간 TLR3 항체와 함께 또는 이것 없이 인큐베이션하였다. 처리한지 24시간 후에, 상층액을 수집하고, IL-6, IL-8, CCL-2/MCP-1, CCL5/RANTES 및 CXCL10/IP-10의 검출을 위한 커스텀 멀티플렉스 비드(custom multi-plex bead) 분석을 사용하여 사이토카인 및 케모카인 수준에 대하여 분석하였다. 결과를 0.4, 2.0 및 10 ㎍/ml에서의 mAb 처리 후에 개별의 사이토카인/케모카인의 억제%로 도 2에 나타내었다. 5465는 양성 대조군이고; 859는 아이소형 대조군이다.
NHBE 세포 내에서의 사이토카인 방출
또한, 사이토카인 방출은 정상 인간 기관지 상피(NHBE) 세포 내에서 분석하였다(Lonza, Walkersville, MD). NHBE 세포를 증대시키고, 콜라겐-코딩된 접시로 옮기고, 48시간 동안 인베이션한 후에, 배지를 제거하고, 0.2 ml의 새로운 배지로 보충하였다. 그 다음, 폴리 (I:C)의 첨가 전에, 세포를 항-인간 TLR3 mAb와 함께 또는 이것 없이 60분 인큐베이션하였다. 상층액을 24시간 후에 수집하고, -20℃에서 보관하거나 또는 IL-6 수준에 대해 즉시 분석하였다. 결과를 도 3에서 0.001 내지 50 ㎍/ml의 투여량을 사용한 mAb 처리 후의 IL-6 분비의 억제%로서 그래프화시켰다. 5465는 양성 대조군이고, 859는 아이소형 대조군이다. 대부분의 mAb는 1 ㎍/ml 미만에서 IL-6 생성을 적어도 50% 억제하였으며, 5 ㎍/ml 미만에서 75% 억제를 달성하였다.
PBMC 세포 내에서의 사이토카인 방출
또한, 사이토카인 방출을 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 내에서 분석하였다. 인간 공여자로부터, 피콜-파큐 플러스(Ficoll-Paque Plus) 용액을 천천히 밑의 층을 이루게 한 헤파린 수집 튜브내로 전혈을 수집하였다. 튜브를 원심분리하고, 피콜 바로 위에 백색 층을 형성한 PBMC를 회수하고 플레이팅하였다. 그 다음, 25 ㎍/ml의 폴리(I:C)의 첨가 이전에, PBMC를 항-인간 TLR3 mAb와 함께, 또는 이것 없이, 인큐베이션하였다. 24시간 후에, 상층액을 수집하고, 루미넥스(Luminex) 기술을 사용하여 사이토카인 수준을 결정하였다. 결과를 단일 투여량의 mAb(0.4 ㎍/ml)를 사용하여, IFN-γ, IL-12 및 IL-6의 누적 백분율 억제로서 도 4에 그래프화하였고, 5465는 양성 대조군이며; hIgG4는 아이소형 대조군이다.
HASM 세포 내에서의 사이토카인 방출
간단하게, 인간 기도 평활근(HASM) 세포를 500 ng/ml의 폴리(I:C) 및 10 ng/ml의 TNF-α의 상승적 조합의 첨가 전에, 항-인간 TLR3과 함께 또는 이것 없이 인큐베이션하였다. 24시간 후에, 상층액을 수집하고, 루미넥스 기술을 사용하여 사이토카인 수준을 결정하였다. 결과를 3가지 투여량의 mAb(0.4, 2 및 10 ㎍/ml)를 사용하여 케모카인 CCL5/RANTES의 수준으로서 도 5에 그래프화하였다. 5465는 양성 대조군이고; hIgG4는 아이소형 대조군이다.
인간 세포에서 시험관 내 분석으로부터의 결과로, huTLR3에 대한 결합의 결과로서 사이토카인 및 케모카인 방출을 감소시키는 본 발명의 항체의 능력을 확인하였다.
실시예 3
전장 항체 구축물( Construct )
4가지 모 Fab(후보물질 번호 16-19) 및 15가지 자손 Fab(후보물질 번호 1-15) 중쇄를 S229P Fc 돌연변이와 함께 인간 IgG4 백그라운드(background) 상으로 클로닝하였다. 후보물질 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQ 또는 15EVQ를 F235A/L236A 및 S229P Fc 돌연변이와 함께 인간 IgG4 백그라운드 상으로 클로닝하였다.
성숙된 전장 중쇄 아미노산 서열을 다음과 같이 서열 번호 90-102 및 218-220에 나타내었다:
Figure 112011039693804-pct00011
이들 중쇄 서열은 발현을 위하여 Mawvwtllflmaaaqsiqa(서열 번호 103)와 같은 N-말단 리더(leader) 서열을 포함할 수 있다. 후보물질 14EVQ 및 15EVQ의 중쇄를 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열을 리더 서열과 함께, 그리고 성숙 형태(리더 서열 없이)로, 각각 서열 번호 104 및 105에 나타내었다. 마찬가지로, 본 발명의 항체의 경쇄 서열은 발현을 위하여 MgvptqVLgllllwltdarc(서열 번호 106)와 같은 N-말단 리더 서열을 포함할 수 있다. 코돈 최적화된 후보물질 15의 경쇄를 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열을 리더 서열과 함께, 그리고 성숙 형태(리더 서열 없이)로, 각각 서열 번호 107 및 108에 나타내었다.
실시예 4
항- TLR3 mAb 결합의 특성화
인간 TLR3 세포외 도메인(ECD)에 대한 mAb의 결합에 대한 EC50 값을 ELISA로 결정하였다. 인간 TLR3 ECD 단백질을 PBS 중에 2 ㎍/ml으로 희석하고, 100 ㎕의 분취액을 96-웰 플레이트(Corning Inc., Acton, MA)의 각 웰에 분배하였다. 4℃에서의 밤샘 배양 후에, 플레이트를 PBS 중의 0.05% Tween-20(Sigma-Aldrich)으로 이루어진 세정 완충액으로 3회 세정하였다. PBS 중의 2% 아이-블록(I-Block)(Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 0.05% Tween-20으로 이루어진 블로킹 용액 200 ㎕을 사용하여, 웰을 블로킹하였다. 실온에서 2시간 동안 블로킹한 후에, 플레이트를 3회 세정하고, 이어서 블로킹 완충액 중에 단계 희석한 항-TLR3 mAb 후보물질을 첨가하였다. 항-TLR3 mAb를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 3회 세정하였다. 이후에, 블로킹 완충액에 1:4000으로 희석한 과산화수소-컨쥬게이트된 양 항-인간 IgG(GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세정 완충액으로 3회 세정하였다. TMB-S(Fitzgerald Industries International, Inc., Concord, MA) 중에 10 내지 15분 인큐베이션함으로써, 결합을 검출하였다. 25 ㎕의 2N H2SO4를 사용하여 반응을 중단시키고, 스펙트라 맥스(SPECTRA Max) 분광광도계(Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA)를 사용하여 650 ㎚에서의 값을 감산하여, 450 ㎚에서 흡광도를 판독하였다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)를 사용하여, 비-선형 회귀에 의해 EC50 값을 결정하였다.
100 ㎕의 2.5 ㎍/ml 내지 0.6 pg/ml의 4-배 단계 희석한 mAb와 함께 인큐베이션함으로써, huTLR3(표 4)으로의 결합에 대한 EC50 값을 결정하였다. 항-인간 조직 인자 mAb 859 및 hu IgG4κ를 음성 대조군으로 포함시켰다.
[표 4]
Figure 112011039693804-pct00012
또한, huTLR3 ECD에 대한 결합 친화도를 비아코어(Biacore) 분석으로 결정하였다. 데이터(미도시)는 mAb 1-19가 huTLR3 ECD에 대하여 10-8 M 미만의 Kd를 갖는 것을 나타내었다.
실시예 5
경쟁적 에피토프 결합
에피토프 결합 시험을 수행하여, 항-TLR3 항체 경쟁 그룹 또는 "에피토프 빈(bin)"을 결정하였다.
경쟁적 ELISA를 위하여, 실온에서 2시간 동안 웰당 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성한 5 ㎕(20 ㎍/ml)의 정제된 인간 TLR3 ECD 단백질을 MSD 하이바인드(HighBind) 플레이트(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) 상에 코팅시켰다. 150 ㎕의 5% MSD 블록커(Blocker) A 완충액(Meso Scale Discovery)을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.1 M HEPES 완충액, pH 7.4로 3회 세정한 다음, 상이한 경쟁자와 표지된 항-TLR3 mAb의 혼합물을 첨가하였다. 표지된 항체(10 nM)를 증가하는 농도(1 nM로부터 2 μM)의 미표지 항-TLR3 항체와 인큐베이션하고, 25 ㎕ 혼합물의 부피로 지정된 웰에 첨가하였다. 실온에서 천천히 쉐이킹하면서 2시간 인큐베이션한 후에, 플레이트를 0.1 M HEPES 완충액(pH 7.4)으로 3회 세정하였다. MSD 리드(Read) 완충액 T를 멸균수로 희석하고(4-배), 150 ㎕/웰의 부피로 분배하고, SECTOR 이미져(Imager) 6000으로 분석하였다. 항체를 제조자의 지시에 따라, MSD 설포-태그(Sulfo-Tag™) NHS-에스테르로 표지하였다(Meso Scale Discovery).
하기의 항-TLR3 항체를 평가하였다: 모포시스(MorphoSys) 인간 조합 항체 라이브러리(표 3a에 나타냄)로부터 수득한 mAb 1-19; c1068(제WO06/060513A2호에 기재), c1811(마우스 TLR3 단백질로 면역화된 랫트로부터 생성한 하이브리도마에 의해 생성된 랫트 항-마우스 TLR3 mAb), TLR3.7(eBiosciences, San Diego, CA, 카달로그 번호 14-9039) 및 IMG-315A(임제넥스(Imgenex, San Diego, CA)로부터 인간 TLR3 아미노산 55-70(VLNLTHNQLRRLPAAN)에 대하여 생성). mAb 9, 10, 12, 14 및 15에 대하여, 변이체 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQ 또는 15EVQ를 이러한 연구에 사용하였다.
경쟁 분석에 기초하여, 항-TLR3 항체를 5가지 상이한 빈으로 할당하였다. 빈 A: mAb 1, 2, 13, 14EVQ, 15EVQ, 16, 19; 빈 B: mAb 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 11, 12QVQ/QSV, 17, 18; 빈 C: 항체 임제넥스 IMG-315A; 빈 D: 항체 TLR3.7, c1068; 및 빈 E: 항체 c1811.
실시예 6
에피토프 맵핑
실시예 5에 기재된 바와 같은 상이한 에피토프 빈으로부터의 대표적인 항체를 추가의 에피토프 맵핑에 대하여 선택하였다. TLR3 세그먼트 스와핑(swapping) 실험, 돌연변이생성, H/D 교환 및 컴퓨터 모의 실험 단백질-단백질 도킹을 비롯한 다양한 접근법을 사용하여, 에피토프 맵핑을 수행하였다(문헌[The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, Volume 6, Glen E. Morris ed., 1996]).
TLR3 세그먼트 스와핑 TLR3 인간-마우스 키메라 단백질을 사용하여, TLR3 상의 전체 항체 결합 도메인을 배치하였다. 인간 TLR3 단백질 세포외 도메인을 3개의 세그먼트로 나누었다(인간 TLR3 아미노산 서열(GenBank 수탁 번호 NP_003256)에 기초하여, 아미노산 넘버링에 따라 aa 1-209, aa 210-436, aa 437-708). 인간 TLR3 아미노산 210-436 및 437-708을 상응하는 마우스 아미노산(마우스 TLR3, GenBank 수탁 번호 NP_569054, 아미노산 211-437 및 438-709)으로 교체함으로써, MT5420 키메라 단백질을 생성하였다. 위치 437-708에서 인간 아미노산을 마우스 TLR3 아미노산(마우스 TLR3, GenBank 수탁 번호 NP_569054, 아미노산 438-709)으로 교체함으로써 MT6251 키메라를 생성하였다. 모든 구축물을 표준 클로닝 절차를 사용하여, pCEP4 벡터(Life Technologies, Carslbad, CA)에 생성시켰다. 단백질을 V5-His6 C-말단 융합 단백질로서 HEK293 세포에 일시적으로 발현시키고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 정제하였다.
mAb c1068. mAb c1068은 인간 TLR3 ECD에 높은 친화도로 결합하나, 뮤린 TLR3에는 잘 결합하지 않았다. c1068은 MT5420 및 MT6251 둘 모두에 결합하는 그의 능력을 잃었으며, 이는 결합 부위가 야생형 인간 TLR3 단백질의 아미노산 437-708 내에 위치함을 나타낸다.
mAb 12QVQ/QSV. mAb 12QVQ/QSV는 둘 모두의 키메라에 결합하였으며, 이는 mAb 12QVQ/QSV에 대한 결합 부위가 서열 번호 2에 나타낸 서열을 갖는 인간 TLR3 단백질의 아미노산 1-209 내에 위치함을 시사한다.
컴퓨터 모의 실험 단백질-단백질 도킹 mAb 15EVQ의 결정 구조(하기 참조) 및 공개된 인간 TLR3 구조(문헌[Bell et al ., J. Endotoxin Res. 12:375-378, 2006])를 도킹에 대한 출발 모델로 사용하기 위하여, CHARMm에서 에너지 최소화시켰다(문헌[Brooks et al ., J. Computat. 4:187-217, 1983]). 6도의 각도계를 갖는 ZDOCK 2.1(문헌[Chen and Weng, Proteins 51: 397-408, 2003])와 등가물인 ZDOCKpro 1.0(Accelrys, San Diego, CA)을 사용하여 단백질 도킹을 수행하였다. ZDOCK 알고리즘에서 에너지의 면에 의하여, 인간 TLR3 내의 공지의 N-결합 당화 부위 Asn 잔기(Asn 52, 70, 196, 252, 265, 275, 291, 398, 413, 507 및 636) (문헌[Sun et al ., J. Biol. 281:11144-11151, 2006])가 항체-항원 복합체 인터페이스에 참여하는 것을 차단시켰다. 2000개의 초기 포즈(pose)를 산출하고, 도킹 포즈를 RDOCK에서 개량하고, 다시 점수화하였다(문헌[Li et al ., Proteins 53:693-707, 2003]). 가장 높은 초기 ZDOCK 점수를 갖는 200개의 포즈 및 200개의 상위 RDOCK 포즈를 육안으로 검사하였다.
mAb 15EVQ의 결정화를 20℃에서 증기-확산 방법에 의해 수행하였다(문헌[Benvenuti and Mangani, Nature Protocols 2:1633-51, 2007]). 이러한 초기 스크리닝을 96-웰 플레이트에서 하이드라 로봇(Hydra robot)을 사용하여 준비하였다. 실험은 0.5 ㎕의 리저버(reservoir) 용액과 혼합한 0.5 ㎕의 단백질 용액의 액적으로 이루어졌다. 90 ㎕의 리저버(reservoir) 용액에 대하여 액적을 평형화시켰다. 50 mM NaCl을 함유하는 20 mM Tris 완충액, pH 7.4 중의 Fab 용액을 아미콘(Amicon) 울트라(Ultra)-5 kDa 세포를 사용하여, 14.3 ㎎/ml로 농축시켰다. 위자드(Wizard) I & II(Emerald BioSystems, Bainbridge Island, WA) 및 인-하우스(in-house) 결정화 스크린을 사용하여, 스크리닝을 수행하였다.
X-선 회절 데이터를 수집하고, 오스믹(Osmic™) 바리맥스(VariMax™) 컨포컬 옵틱스(confocal optics), 사턴(Saturn) 944 CCD 검출기 및 X-스트림(X-stream™) 2000 크라이오쿨링(cryocooling) 시스템(Rigaku, Woodlands, TX)이 장착된 리가쿠(Rigaku) 마이크로맥스(MicroMax™)-007HF 마이크로포커스(microfocus) X-선 생성기를 사용하여 처리하였다. 회절 강도를 1/2-도(half-degree) 이미지당 120초의 노출 시간을 사용하여, 270° 결정 회전에 대해 검출하였다. X-선 데이터를 프로그램 D*TREK(Rigaku)로 처리하였다. 구조를 프로그램 페이서(Phaser) 또는 CNX(Accelrys, San Diego, CA)를 사용하여 분자 치환 방법에 의해 결정하였다. mAb 15에 대한 15-2.2 Å 및 mAb 12에 대한 50-1.9 Å의 해상도 범위에서 모든 데이터를 사용하여 REFMAC로 원자 위치 및 온도 인자를 개선시켰다. 3σ의 컷-오프(cut-off) 수준을 사용하여, (Fo-Fc) 전자 밀도 피크에서 물 분자를 첨가하였다. 모든 결정학적 계산을 CCP4 스위트(suite)의 프로그램을 사용하여 수행하였다(문헌[Collaborative Computational Project, Number 4. 1994. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr. D50:760-763]). 프로그램 COOT를 사용하여 모델 조정을 수행하였다(문헌[Emsley et al., Acta Crystallogr. D60:2126-2132, 2004]).
mAb 15EVQ의 분해된 결정 구조는 항체 결합 부위가 중쇄 내의 음성 전하 잔기의 수를 특징으로 한다는 것을 보여주었다(D52, D55, E99, D106 및 D109). 따라서, mAb 15EVQ와 TLR3 사이의 인식은 아마도 양성 전하 잔기를 수반할 것이다. 수행되는 단백질-단백질 도킹 시뮬레이션으로, 다중의 양성 전하 잔기를 수반하는 TLR3 상의 2개의 큰 패치(patch)가 항체에 대한 훌륭한 상보성을 나타내는 것으로 제시되었다. TLR3 - 항-TLR3 항체 시뮬레이션된 복합체의 인터페이스에 있는 TLR3 상의 잔기는 R64, K182, K416, K467, Y468, R488, R489 및 K493이었다.
돌연변이생성 연구. mAb 12 및 mAb 15EVQ의 에피토프를 함유하도록 단일 점 돌연변이 및 점 돌연변이의 조합을 상기 정의된 영역 내의 TLR3 ECD의 표면 잔기내로 도입시키고, 돌연변이 단백질을 항체 결합에 대하여 시험하였다.
인간 TLR3 아미노산 1-703(ECD)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호 4; GenBank 수탁 번호 NP_003256)을 표준 프로토콜을 사용하여 클로닝하였다. 모든 돌연변이를 표 5a에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 제조자의 프로토콜에 따라, 스트라트진(Strategene) 퀵체인지(Quickchange) II XL 키트(Stratagene, San Diego, CA)를 사용하여 위치 지정 돌연변이생성에 의해 생성하였다. 돌연변이를 DNA 시퀀싱으로 입증하였다. 단백질을 HEK293 세포 내에서 C-말단 His-태그 융합으로서 CMV 프로모터 하에서 발현시키고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 정제하였다.
표 5a 위치 지정 돌연변이생성을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 센스(sense) 올리고뉴클레오티드의 서열을 나타내었다. 상보적인 서열을 갖는 안티-센스(anti-sense) 올리고뉴클레오티드를 돌연변이생성 반응에 사용하였다.
[표 5a]
Figure 112011039693804-pct00013
결합 분석. mAb 12QVQ/QSV 및 mAb 15EVQ의 인간 TLR3 및 생성된 변이체에 대한 결합 활성을 ELISA에 의해 평가하였다. 이 과정을 신속하게 처리하기 위하여, C-말단 His 태그를 함유하는 TLR3 ECD 돌연변이와 mAb 12QVQ/QSV를 공동-트랜스펙션시키고, 이어서 금속 친화도 크로마토그래피에 의해 정제함으로써, 예측된 mAb 15EVQ 결합 부위 내의 돌연변이를 공동-발현시켰다. 회수된 샘플은 TLR3 돌연변이와 mAb 12와의 복합체였다. mAb 12QVQ/QSV 및 mAb 15EVQ 결합 부위가 서로 떨어져 있고; 이에 따라 한 부위에서의 점 돌연변이가 다른 부위에서의 에피토프에 영향을 미치지 않을 것이기 때문에, 이러한 접근법은 실현가능하다. 이들 복합체를 ELISA 결합 분석에서 사용하였다. 웰당 5 ㎕의 PBS 중의 20 ㎍/ml의 야생형 TLR3 ECD 또는 돌연변이 단백질을 MSD 하이바인드(HighBind) 플레이트(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) 상에 코팅하였다. 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션하고, 4℃에서 MSD 블로커(Blocker) A 완충액(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) 중에서 밤새 블로킹하였다. 다음 날, 플레이트를 세정하고, MSD 설포-태그 표지된 mAb 15EVQ를 1.5 시간 동안 500 pM 내지 1 pM의 농도로 첨가하였다. 세정 후에, 표지된 항체를 MSD 리드 완충액 T를 사용하여 검출하고, 플레이트를 SECTOR 이미져 6000을 사용하여 판독하였다. mAb 12QVQ/QSV의 인간 TLR3 및 변이체에 대한 결합 활성을 평가하기 위하여, mAb 15EVQ를 사용하여 공동-발현을 수행하고, 검출 항체가 표지된 mAb 12QVQ/QSV였다는 점을 제외하고, mAb 15EVQ에 대해 기재된 바와 같이 결합 ELISA를 수행하였다.
mAb 12QVQ/QSV: mAb 12QVQ/QSV에 대한 결합 부위는 세그먼트 스왑 연구에서 결정된 바와 같이 인간 TLR3 단백질의 아미노산 1-209 내에 위치하였다. 하기의 TLR3 돌연변이를 평가하였다: D116R, N196A, N140A, V144A, K145E, K147E, K163E 및 Q167A. 야생형 TLR3 및 V144A 돌연변이는 mAb 12QVQ/QSV에 대한 비슷한 결합을 나타내었다(도 6a). 항체는 TLR3 D116R 돌연변이에 결합하지 않았으며, K145E 돌연변이에 대해서는 상당히 감소된 결합 친화력을 가졌다. 따라서, TLR3의 표면 상에 가까이에 나란히 놓인 잔기 D116 및 K145를 mAb 12QVQ/QSV에 대한 주요 에피토프 부위로 동정하였다(도 7a).
mAb 12QVQ/QSV 결합 에피토프의 2개의 결정적인 잔기는 TLR3 엑토도메인(ectodomain)의 N-말단 세그먼트에서 dsRNA 결합 부위의 면 근처에 위치한다(문헌[Pirher, et al., Nature Struct. & Mol. Biol., 15:761-763, 2008]). 완전한 에피토프는 이웃하는 영역 내에 다른 잔기를 함유할 것이나, 이는 수행된 돌연변이 분석에 의해 드러나지 않았다. 임의의 특정 이론에 제한하려는 의도 없이, mAb 12QVQ/QSV의 그의 TLR3 에피토프 상의 결합이 TLR3 엑토도메인 상의 dsRNA 결합을 직접적으로 또는 간접적으로 간섭하여, 수용체 이량체화 및 다운스트림 신호전달 경로의 활성화를 교란시킬 수 있는 것으로 여겨진다.
mAb 15EVQ: 하기의 TLR3 돌연변이를 평가하였다: R64E, K182E, K416E, Y465A, K467E, R488E, R489E, N517A, D536A, D536K, Q538A, H539A, H539E, N541A, E570R, K619A, K619E, 2중 돌연변이 K467E/Y468A, 3중 돌연변이 T472S/R473T/N474S 및 3중 돌연변이 R488E/R489E/K493E. 야생형 TLR3, R64E, K182E, K416E 돌연변이 및 3중 돌연변이 T472S/R473T/N474S는 mAb 15EVQ에 대한 유사한 결합을 나타내었다(도 6b 및 표 5b). 항체는 TLR3 돌연변이 K467E, R489E, K467E/Y468A 및 R488E/R489E/K493E(도 6b 및 6c)에 결합하지 않았다. 남아있는 변이체는 가장 큰 효과를 갖는, R488E와의 중간의 결합을 나타내었다. 이들 돌연변이 모두는 mAb 12QVQ/QSV에 결합하였다. 이들 결과는 잔기 K467 및 R489가 mAb 15EVQ 에피토프에 대한 결정적인 결정인자인 것을 나타냈다. 또한, 잔기 R488도 에피토프에 기여하였다. 이들 잔기는 TLR3의 같은 표면 상에 가까이에 나란히 놓여 있었다(도 7a). 또한, 결과는 모두 K467, R488 및 R489와 동일한 면상에 있는 잔기 Y465, Y468, N517, D536, Q538, H539, N541, E570 및 K619가 에피토프에 기여하는 것을 보여준다. 이러한 결론은 mAb 15EVQ와의 H/D 교환 연구에 의해 추가로 뒷받침된다. 도 7a는 인간 TLR3의 구조 상에 포개 놓은mAbs 12QVQ/QSV, 및 15EVQ(검정색) 및 C1068 mAb(회색)에 대한 결합 에피토프 부위를 나타낸 것이다. mAb 15EVQ에 대한 에피토프는 잔기 Y465, K467, Y468, R488, R489, N517, D536, Q538, H539, N541, E570 및 K619를 커버한다.
H/D 교환 연구. H/D 교환을 위하여, 항체 섭동을 분석하기 위하여 사용한 절차는 이전에 기재된 것과 유사하였으며, 몇가지 변형을 사용하였다(문헌[Hamuro et al ., J. Biomol. Techniques 14:171-182, 2003]; 문헌[Horn et al ., Biochemistry 45:8488-8498, 2006]). 재조합 TLR3 ECD(C-말단 His-태그를 갖는 Sf9 세포로부터 발현 및 정제)를 사전결정된 시간 동안 중수소화 수용액 중에서 인큐베이션하여, 교환가능한 수소 원자에서 중수소 혼입을 야기하였다. 중수소화 TLR3 ECD를 고정화된 mAb 15EVQ를 함유한 컬럼 상에 포획한 다음, 수성 완충액으로 세정하였다. 백(back)-교환된 TLR3 ECD 단백질을 컬럼으로부터 용출시키고, 프로테아제 분해 및 질량 분석에 의해 중수소 함유 단편의 위치를 결정하였다. 참조 대조군으로서, 항체 컬럼 상에 캡쳐한 후에만 중수소화 수에 노출시켰다는 점을 제외하고, TLR3 ECD 샘플을 유사하게 처리하고, 실험 샘플과 동일한 방식으로 세정하고 용출시켰다. 항체에 결합하는 영역은 상대적으로 교환으로부터 보호된 부위인 것으로 추론되며, 이에 따라 참조 TLR3 ECD 샘플보다 더 높은 중수소 부분을 함유한다. 약 80%의 단백질을 특정 펩티드로 맵핑할 수 있다. mAb 15EVQ에 의한 TLR3 ECD의 H/D 교환 섭동의 맵을 도 7b에 나타내었다. 명확성을 위해 mAb 15EVQ에 의해 영향을 받은 부분 주위의 TLR3의 세그먼트만을 나타내었다. TLR3 ECD의 아미노 및 카복실 말단으로 연장된 단백질의 나머지는 뚜렷하게 영향을 받지 않았다.
H/D 교환 연구로, TLR3 상의 교환이 mAb 15EVQ에 대한 결합을 특별히 변경시키는 영역으로서, 서열 번호 2의 펩티드 세그먼트 465YNKYLQL471, 514SNNNIANINDDML526 및 529LEKL532를 동정하였다. H/D 교환은 그 성질에 의해 선형 맵핑 방법이며, 통상 펩티드 세그먼트 내의 어떤 잔기가 항체 결합에 의해 아마도 영향을 받을 것이라는 것을 한정할 수 없다. 그러나, H/D 교환 및 돌연변이 결과 간의 광범위한 중복은 도 7a에 나타낸 표면이 mAb 15에 대한 결합 부위라는 부가된 확신을 제공한다. 결합 부위는 mAb c1068에 대해 이전에 기재된 것(PCT 공보 제WO06/060513A2호)과 동일한 선형 아미노산 서열 영역에 있으나, 이는 이들 항체 간의 교차-경쟁의 결여와 일치하게, 완전히 비-중첩된 표면(도 7a) 상에 위치하는 것으로 관찰되었다.
mAb 15EVQ 결합 에피토프는 TLR3 상의 C-말단 세그먼트에서 dsRNA 결합 부위에 공간적으로 근접해 있었다(문헌[Bell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 103: 8792-8797, 2006]; 문헌[Ranjith-Kumar et al., J Biol Chem, 282: 7668-7678, 2007]; 문헌[Liu et al., Science, 320: 379-381, 2008]). 임의의 특정 이론에 제한하려는 의도 없이, mAb 15EVQ의 그의 TLR3 에피토프 상의 결합은 리간드 dsRNA 분자 및/또는 이량체 파트너와의 입체적 충돌을 야기하여, 리간드 결합 및 리간드-유도성 수용체 이량체화를 막는 것으로 여겨진다.
[표 5b]
Figure 112011039693804-pct00014
실시예 7
증가된 열 안정성을 갖는 변이체의 생성
증가된 열 안정성을 갖는 항체 변이체를 생성하고, 동시에 생물학적 활성을 유지하고 면역원성을 최소화시키려는 노력으로, 구조-기반의 엔지니어링을 수행하였다.
mAb 15EVQ를 엔지니어링을 위해 선택하였다. 면역원성을 최소화시키기 위하여, 구조적 고려사항에 기초하여 유익할 것으로 예측되는 오직 생식계 돌연변이만을 추적하였다. mAb 15EVQ의 VL 및 VH 서열(각각, 서열 번호 41 및 서열 번호 216)을 BLAST 검색을 사용하여 인간 생식계 유전자와 정렬시켰다. 동정된 가장 가까운 생식계 서열은 VH 및 VL 각각에 대하여 GenBank 수탁 번호 AAC09093 및 X59318이었다. 하기의 차이를 생식계 VH, VL 및 mAb 15EVQ VH 및 VL 서열의 것 간에 동정하였다: (VH) V34I, G35S, F50R, A61S 및 Q67H; (VL) G30S, L31S 및 A34N. 동정된 서열 차이를 mAb 15EVQ의 결정 구조 상으로 맵핑하고, 패킹(packing) 및 인터페이스 상호작용을 변경시키는 것으로 예측되는 잔기를 엔지니어링을 위해 선택하였다. 항체의 결정 구조에 기초하여(실시예 6 참조), 유력한 구조 불안정화 잔기를 동정하였다. (1) 작은 폐쇄된 캐비티(enclosed cavity)를 V34 근처의 VH의 코어 내에서 동정하였다. 이러한 캐비티는 Ile과 같은 약간 더 큰 측쇄를 수용하기에 충분히 컸다. (2) VH CDR3의 E99는 H-결합 네트워크 없이, VH/VL 인터페이스에 매립되어 있었다. E99의 음성 전하 카복실기는 일반적으로 대부분 이웃하는 잔기에 반데르발스(vdw) 접촉을 갖는 소수성 환경에 있었다. 전하 그룹을 매립하는 것은 통상 에너지적으로(energetically) 불리하며, 이에 따라 불안정화 효과를 갖는다. (3) VH의 F50은 VH/VL 인터페이스 잔기이다. 이의 방향족 측쇄는 부피가 크며(bulky), 이에 따라 페어링 시에 부정적인 영향을 가질 수 있다. Fv에 대한 H-결합 및 vdw 패킹 네트워크를 계산하고, Pymol(www://_pymol_org)에서 육안으로 검사하였다. VH 및 VL 도메인 내에 매립된 캐비티를 카버(Caver)에 의해 컴퓨터 측정하였다(문헌[Petrek et al., BMC Bioinformatics, 7:316, 2006]). 모든 분자 그래픽 도면을 파이몰(Pymol)로 만들었다. 퀵(Quick) 체인지(Change) II XL 위치 지정 돌연변이생성 키트(Stratagene, San Diego, CA), 체인지-IT 멀티플 뮤테이션(Multiple Mutation) 위치 지정 돌연변이생성 키트(USB Corporation, Cleveland, OH) 또는 퀵 체인지 II 위치 지정 돌연변이생성 키트(Stratagene, San Diego, CA)를 사용하는 표준 클로닝 기술을 사용하여, 실시예 3에 기재된 바와 같이 생성한 Fab 단편 또는 IgG4 전체 항체를 코딩하는 발현 벡터에 돌연변이를 만들었다. 반응을 각각의 제조자의 권고에 따라 수행하였다. 수득한 클론을 입증하기 위하여 시퀀싱하고, 생성된 조작된(engineereing) 변이체를 mAb 15-1 내지 15-9로 명명하였다. mAb 15EVQ 및 이의 조작된 변이체에 대한 CDR, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 및 전장 중쇄 및 경쇄의 서열 번호의 목록을 표 6에 나타내었다. 표 7은 각각의 변이체의 생성을 위한 프라이머를 나타낸 것이다.
[표 6]
Figure 112011039693804-pct00015
TLR3에 대한 mAb 15-1 내지 15-9의 결합을 ELISA 면역분석으로 평가하였다. 인간 TLR3 ECD(100 ㎕의 2 ㎍/ml TLR3-ECD)를 4℃에서 밤새 블랙(black) 맥시소르브(Maxisorb) 플레이트(eBioscience)에 결합시켰다. 플레이트를 세정하고, 블로킹하고, 희석된 항체를 웰당 50 ㎕로, 웰상으로 2벌로 앨리쿼트(aliquote)하였다. 플레이트를 천천히 쉐이킹하면서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 발광 POD 기질(Roche Applied Science, Mannheim, Germany, 카달로그 번호 11 582 950 001) 및 염소 항-인간 Fc:HRP(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, 카달로그 번호 109-035-098)를 사용하여 결합을 검출하고, 플레이트를 스펙트라맥스 플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 판독하였다.
[표 7]
Figure 112011039693804-pct00016
참조 셀과 샘플 셀 간의 온도 차이를 지속적으로 측정하고, 파워 유닛(power unit)으로 보정하는 마이크로컬(MicroCal)사의 오토(Auto) VP-캐필러리(capillary) DSC 시스템(MicroCal, LLC, Northampton, MA) 상에서 DSC 실험을 수행하였다. 샘플을 60℃/시간의 가열 속도로 10℃ 내지 95℃로 가열하였다. 예비-스캔 시간은 15분이었고, 필터링 기간은 10초였다. DSC 실험에 사용된 농도는 약 0.5 ㎎/ml이었다. 생성된 온도 기록도(thermogram)의 분석을 마이크로컬 오리진(Origin) 7 소프트웨어(MicroCal, LLC)를 사용하여 수행하였다.
생성된 변이체의 열 안정도(Tm)를 DSC로 측정하였다(표 8). TLR3에 대한 항체 변이체의 결합은 모 항체의 결합과 유사하였다.
[표 8]
Figure 112011039693804-pct00017
실시예 8
대용물 항- TLR3 항체의 생성
실시예 1에서 생성한 인간화 항체가 마우스 TLR3에 대한 충분한 특이성 또는 길항제 활성을 갖지 않았기 때문에, 본 명세서에서 mAb 5429로 명명한, 키메라 길항적 랫트/마우스 항-마우스 TLR3 항체를 생성하여, 다양한 생체 내 모델에서 TLR3 신호전달을 억제하는 효과를 평가하였다. 대용물 키메라 mAb 5429뿐 아니라 그의 모 랫트 항-마우스 TLR3 항체 c1811은 시험관 내 및 생체 내에서 마우스 TLR3 신호전달을 억제하였으며, 마우스의 일부 질환 모델에서 병원성 메카니즘을 개선시켰다.
하기에 나타낸 데이터는 유해 염증의 유도 및 영속화에서의 TLR3에 대한 역할을 제시하며, 예를 들어, 하이퍼사이토키네미아, 천식 및 기도 염증, 염증성 장질환 및 류마티스성 관절염, 바이러스 감염 및 II형 당뇨병을 비롯한 급성 및 만성 염증성 증상에서의 TLR3 길항제 및 TLR3 항체 길항제의 치료적 용도의 근거에 기여한다.
대용물 mAb 5429의 생성
CD 랫트를 통상의 방법을 사용하여 생성한 재조합 뮤린 TLR3 엑토도메인(서열 번호 162의 아미노산 1-703, GenBank 수탁 번호 NP_569054)으로 면역화시켰다. 뮤린 TLR3에 대하여 특이적인 항체 역가를 나타내는 2마리의 랫트로부터의 림프구를 FO 골수종 세포에 융합시켰다. 뮤린 TLR3에 반응성인 모노클로날 항체의 패널을 동정하고, 뮤린 루시퍼라아제 리포터 및 뮤린 배아 섬유모세포 분석에서 시험관 내 길항제 활성에 대하여 시험하였다. 하이브리도마 세포주 C1811A를 추가의 작업을 위해 선택하였다. 하이브리도마에 의해 분비된 mAb c1811로부터 기능적 가변 영역 유전자를 시퀀싱하였다. 그 다음, 클로닝된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자를 통상적인 방법을 사용하여 mAb 5429로 표시된 키메라 랫트/Balb C muIgG1/κ mAb를 생성하기 위한 코딩 서열을 제공하는 플라스미드 발현 벡터 내로 각각 삽입하였다. 항체를 실시예 3에 기재된 바와 같이 발현시켰다. mAb 5429 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 164 및 서열 번호 163에 각각 나타내었고, 중쇄 및 경쇄 전장 서열을 서열 번호 166 및 서열 번호 165에 각각 나타내었다. mAb c1811의 중쇄 및 경쇄 전장 서열을 서열 번호 168 및 서열 번호 167에 각각 나타내었다.
mAb 5429의 특성화
mAb 5429를 TLR3 신호전달 상의 이의 중화 능력에 대하여 시험관 내 분석의 패널에서 특징지었다. 활성 분석 및 결과를 하기에 기재한다.
뮤린 루시퍼라아제 리포터 유전자 분석
뮤린 TLR3 cDNA(서열 번호 161, GenBank 수탁 번호 NM_126166)를 뮤린 비장 cDNA(BD Biosciences, Bedford, MA)로부터 PCR에 의해 증폭시키고, 표준 방법을 사용하여, pCEP4 벡터(Life Technologies, Carslbad, CA) 내로 클로닝하였다. 200 ㎕의 HEK293T 세포를 완전 DMEM 중에 4 x 104 세포/웰의 농도로 96 웰 백색 투명-바닥 플레이트에 플레이팅하고, 다음날 총 DNA 양이 50 ng/웰이 되게, 30 ng의 pNF-κB 반딧불 루시퍼라아제(Stratagene, San Diego, CA) 또는 30 ng의 pISRE 반딧불 루시퍼라아제(BD Biosciences, Bedford, MA), 5 ng의 phRL-TK 대조군 레닐라 루시퍼라아제(Promega Corp., Madison, WI) 리포터 플라스미드, 전장 뮤린 TLR3을 코딩하는 1.5 ng의 pCEP4 및 13.5 ng의 빈(empty) pcDNA3.1 벡터(Life Technologies, Carslbad, CA)를 사용하여, 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(Invitrogen Corp., Carslbad, CA)을 사용하여, 트랜스펙션하기 위해 사용하였다. 트랜스펙션 24시간 후에, 0.1 또는 1 ㎍/㎕ 폴리(I:C)를 첨가하기 전에, 세포를 37℃에서 30분 내지 1시간 동안 항-뮤린 TLR3 항체와 함께 인큐베이션하였다. 듀얼-글로(Dual-Glo) 루시퍼라아제 분석 시스템(Promega, Madison, WI)을 사용하여, 24시간 후에 플레이트를 수집하였다. 옵티마(OPTIMA) 소프트웨어(BMG Labtech GmbH, Germany)와 함께 플루오스타(FLUOstar) 옵티마 다중-검출 판독기를 사용하여, 상대 광 유닛(relative light unit)을 측정하였다. 반딧불 상대 광 유닛(RLU)을 레닐라 RLU로 나눔으로써, 정규화된 값(루시퍼라아제 비)을 수득하였다. mAb 5429뿐 아니라 그의 모 mAb c1811 및 mAb 15(표 3a)가 폴리(I:C)-유도성 NF-kB 및 ISRE 활성화를 용량-의존적 방식으로 감소시켰으며(도 8a 및 8b), 이는 TLR3의 활성을 길항시키는 이들의 능력을 보여준다. ISRE 분석으로 측정한 IC50은 mAb 5249, mAB 15 및 mAb c1811에 대하여 각각 0.5, 22 및 0.7 ㎍/ml이었다.
린 배아 섬유모세포 ( MEF ) 분석
C57BL/6 MEF 세포를 아티스 옵티머스(Artis Optimus)(Opti-MEF™ C57BL/6 - 0001)로부터 수득하였다. 세포를 200 ㎕ MEF 배지(글루타맥스(glutamax)가 있는 DMEM, 10% 열 불활성화-FBS, 1x NEAA 및 10 ㎍/ml 젠타마이신) 중에 20,000 세포/웰로 96-웰 평평한 바닥 플레이트(BD Falcon)에 플레이팅하였다. 모든 인큐베이션을 37℃/5%CO2에서 행하였다. 플레이팅 24시간 후에, mAb 5429 또는 mAb c1811 를 웰에 첨가하였다. 플레이트를 mAb와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 이후에 폴리(I:C)를 각 웰에 1 ㎍/ml로 첨가하였다. 상층액을 24-시간 인큐베이션 후에 수집하였다. 사이토카인 수준을 비드(bead) 키트(Invitrogen Corp., Carslbad, CA)를 사용하여 결정하여, 제조자의 프로토콜에 따라 CXCL10/IP-10을 검출하였다. 결과를 그래프패드(GraphPad) 프리즘(Prism) 소프트웨어를 사용하여 그래프화하였다. 두 항체 모두는 폴리(I:C)-유도성 CXCL10/IP-10 수준을 용량-의존적인 방식으로 감소시켰으며, 이는 이들 항체의 내재성 TLR3을 길항시키고, TLR3 신호전달을 억제하는 능력을 보여준다(도 9).
유세포분석 -표면 염색
그룹당 10마리의 C57BL/6 및 TLR3 낙아웃(knockout)(TLR3KO)(C57BL/6 백그라운드; 암컷, 8-12 주령(Ace Animals, Inc.))에 1 ml of 3% Thioglycollate medium (Sigma)를 복막내 투여하고, 96시간 후에, 마우스를 안락사시키고, 각 마우스로부터의 복막을 10 ml의 멸균 PBS로 세척하였다. 티오글리콜레이트-유도성 복막 대식구를 PBS 중에 재현탁화시키고, 세포 생존력을 트립판 블루(Trypan Blue) 염색을 사용하여 평가하였다. 세포를 원심분리에 의해 펠렛화시키고, 250 ㎕의 FACS 완충액(PBS -Ca2 +-Mg2 +, 1% 열-불활성화 FBS, 0.09% 아지드화나트륨) 중에 재현탁화시키고, 젖은 얼음 위에 계속 있게 하였다. 10 ㎍/106 세포에서 10분 동안 CD16/32 시약(eBioscience)을 사용하여, 대식구 상의 Fc 수용체를 차단하였다. 세포를 표면 염색을 위해 웰당 100 ㎕ 중에 106 세포로 분배하였다. 알렉사(Alexa)-플루오르(Fluor) 647(Molecular Probes)-컨쥬게이트된 mAb c1811 및 mAb 1679(TLR3 특이성을 갖지 않아, 아이소형 대조군으로 사용되는 랫트 항-마우스 TLR3 항체)를 0.25 ㎍/106 세포로 첨가하고, 어두운 곳에서 얼음 상에 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세정하고, 250 ㎕의 FACS 완충액 중에 재현탁화시켰다. FACS 칼리버(Calibur) 상에 샘플을 수집하기 전에, 생존성 염색, 7-AAD(BD Biosciences, Bedford, MA)를 5 ㎕/웰로 30분 이하로 첨가하여, 사멸 세포 집단을 검출하였다. 샘플을 셀 퀘스트 프로(Cell Quest Pro) 소프트웨어를 사용하여 FACS 칼리버에 의해 수집하였다. FCS 익스프레스(Express)를 사용하여, 히스토그램을 형성함으로써 수집된 데이터를 분석하였다.
C57BL/6 및 TLR3KO 마우스로부터의 뮤린 티오글리콜레이트-유도성 복막 대식구에 대한 mAb c1811의 결합을 유세포 분석으로 평가하여, 결합 특이성을 결정하였다. 이러한 키메카 항체의 마우스 Fc 영역이 비-특이적인 결합에 기여하는 것으로 예상되기 때문에, mAb 5429를 본 분석에 사용하지 않았다. mAb c1811는 TLR3KO 대식구에 대한 결합을 나타내지 않았으며, C57BL/6 복막 대식구의 세포 표면에 대한 결합을 증가시켰으며, 이는 TLR3에 대한 mAb의 특이성을 시사한다(도 10). mAb c1811과 동일한 결합 영역을 갖는 mAb 5429는 mAb c1811과 동일한 결합 특이성을 갖는 것으로 추정된다.
실시예 9
TLR3 항체 길항제는 TLR3 -매개의 전신 염증으로부터 보호한다
모델
폴리(I:C)-유도성 전신 사이토카인/케모카인 모델을 TLR3-매개의 전신 염증의 모델로 사용하였다. 이러한 모델에서, 복막내로 전달되는 폴리(I:C)(PIC)는 부분적으로 TLR3-매개되는 전신 사이토카인 및 케모카인 반응을 유도한다.
암컷 C57BL/6 마우스(8-10 주령) 또는 암컷 TLR3KO 마우스(C57BL/6 백그라운드; 8-10 주령(Ace Animals, Inc.))에 mAb 5429를 0.5 ml의 PBS 중에 10, 20 또는 50 ㎎/㎏으로, mAb c1811을 0.5 ml의 PBS 중에 2, 10 또는 20 ㎎/㎏으로, 또는 단독의 0.5 ml의 PBS(비히클 대조군)를 피하로 제공하였다. 항체 투여 24시간 후에, 마우스에 0.1 ml의 PBS 중의 50 ㎍의 폴리(I:C)(Amersham 카달로그 번호 26-4732 로트(Lot) 번호 IH0156)를 복막내로 제공하였다. 폴리(I:C) 챌린지 1시간 및 4시간 후에, 안와-후 혈액을 수집하였다. 혈청을 전혈로부터 준비하고, 루미넥스에 의해 사이토카인 및 케모카인 농도에 대하여 분석하였다.
결과
복막내로 전달되는 폴리(I:C)는 TLR3KO 동물에서 케모카인 및 사이토카인의 패널의 상당히 감소된 생성에 의해 증명된 바와 같이, 부분적으로 TLR3-매개되는 전신 사이토카인 및 케모카인 반응을 유도한다(표 9A). TLR3-의존형 폴리(I:C)-유도성 매개체는 폴리(I:C) 챌린지-1시간 후에, IL-6, KC, CCL2/MCP-1 및 TNF-α였으며, 폴리(I:C) 챌린지-4시간 후에, IL-1α, CCL5/RANTES 및 TNF-α였다. mAb c1811 및 mAb 5429 둘 모두는 이들 TLR3-의존형 매개체의 수준을 상당히 감소시켰으며, 이는 생체 내에서 TLR3 신호전달을 감소시키는 항체의 능력을 입증한다(표 9B).
표 9의 값은 pg/ml 단위의 그룹당 6마리 동물의 평균 사이토카인 또는 케모카인 농도 ± SEM으로 나타내었다. 이들 데이터는 TLR3 길항작용이 사이토카인 발작 또는 치명적인 쇼크와 같은 증상에서 과도한 TLR3-매개의 사이토카인 및 케모카인 수준을 감소시키는 데 유익할 수 있음을 시사한다.
[표 9A]
±
Figure 112011039693804-pct00018
[표 9B]
Figure 112011039693804-pct00019
실시예 10
TLR3 항체 길항제는 기도 과민증을 감소시킨다.
모델
기도 과민증을 폴리(I:C)에 의해 유도하였다.
암컷 C57BL/6 마우스(12 주령) 또는 암컷 TLR3KO 마우스(C57BL/6 백그라운드; 12 주령(Ace Animals, Inc.))를 아이소플루란으로 마취시키고, 50 ㎕의 멸균 PBS 중의 몇몇 투여량(10 내지 100 ㎍)의 폴리(I:C)를 비강내로 투여하였다. 마우스에 각 투여 사이에 24시간의 휴지 기간과 함께, 폴리(I:C)(또는 PBS)의 3회 투여를 제공하였다. 마지막 폴리(I:C)(또는 PBS) 투여 24시간 후에, 폐 기능 및 메타콜린에 대한 기도 과민증을 전신 혈량측정법(BUXCO system)을 사용하여 측정하였다. 마우스를 전혈 혈량측정 챔버에 두고, 적어도 5분 동안 순응되게 하였다. 기준선 판독 후에, 마우스를 증가하는 투여량의 분무화 메타콜린(Sigma, St. Louis, MO)에 노출시켰다. 분무화 메타콜린을 2분 동안 투여한 다음, 5분의 데이터 수집 기간에 이어서, 이후의 증가-투여량의 메타콜린 챌린지 전에 10분의 휴지 기간을 가졌다. 증가된 기류 저항을 인핸스드 포즈(Enhanced Pause)(Penh)로서 측정하고, 5분의 기록 기간에 걸쳐 평균 Penh 값으로 나타내었다(BUXCO system). 폐 기능 측정 후에, 마우스를 안락사시키고, 폐에 캐뉼러를 삽입하였다. 1 ml의 PBS를 폐내로 주입하고, 유출액을 회수함으로써, 기관지폐포 세척(BAL)을 수행하였다. 폐 조직을 제거하고, 동결시켰다. BAL 액을 원심분리하고(1200 rpm, 10 분), 세포가 없는 상층액을 수집하고, 분석할 때까지 -80℃에 보관하였다. 총 세포 카운트(count) 및 세포 차이 카운트를 위하여, 세포 펠렛을 200 ㎕의 PBS 중에 재현탁화시켰다. 제조자의 프로토콜 및 멀티플렉스 면역분석 키트(Millipore, Billercia, MA)에 따라 멀티플렉스(multiplex) 분석을 수행하였다.
결과
이전의 관찰은 폴리(I:C)의 비강내 투여가 기준선에서 전신 혈량측정법(Buxco)에서의 증가된 인핸스드 포즈(PenH) 측정치 및 분무화된 메타콜린(기도 과민성의 지표)(PCT 공보 제WO06/060513A2호)에 대한 증가된 반응성을 갖는 마우스에서 폐 기능의 TLR3-매개의 장애를 유도하는 것을 보여준다. 폐 기능의 이러한 장애는 호중구의 폐로의 동원 및 폐 내에 전-염증성 사이토카인/케모카인의 증가된 수준과 관련된다. 본 연구에서, 폴리(I:C) 챌린지 이전에 50 ㎎/㎏의 각각의 항체를 피하로 투여함으로써, mAb 1811 및 mAb 5429의 효과를 폐 기능의 폴리(I:C)-유도성 장애에서 평가하였다.
폴리(I:C) 챌린지 이전에 동물을 TLR3 항체 길항제로 처리함으로써 폐 기능의 TLR3-매개의 장애가 상당히 감소하였다. 기준선 PenH 및 메타콜린에 대한 기도 감수성의 TLR3-매개의 증가가 항-TLR3 항체-처리 동물에서 예방되었다(도 11). 또한, 호중구의 마우스 폐로의 TLR3-매개의 동원 및 기도 내의 케모카인의 생성이 항-TLR3 항체-처리 동물에서 감소하였다. 호중구 개수(도 12) 및 CXCL10/IP-10 수준(도 13)을 수집한 기관지폐 세척액(BALF)으로부터 측정하였다. 연구를 적어도 3회 반복하였으며, 유사한 결과가 있었다. 도 11, 12 및 13에 나타낸 데이터는 하나의 대표적인 연구로부터의 것이다. 각각의 기호는 하나의 마우스로부터의 데이터 점을 나타내며, 수평의 막대는 그룹 평균을 나타낸다. 연구는 폐에 도달한 전신-투여된 TLR3 항체 길항제가 사용된 모델에서 폐 기능의 TLR3-매개의 장애, 기도 내로의 호중구 침윤, 케모카인 생성 및 기도 염증을 감소시키는 것을 입증하였다. 따라서, TLR3 길항제는 천식, 알러지성 비염, 만성폐쇄폐질환(COPD) 및 낭성섬유증과 같은 기도 과민증을 특징으로 하는 호흡기 질환의 치료 또는 예방에 유익할 수 있다.
실시예 11
TLR3 항체 길항제는 염증성 장질환으로부터 보호한다.
모델
DSS 대장염 모델을 염증성 장질환의 모델로 사용하였다.
암컷 C57BL/6 마우스(8주령 미만) 또는 암컷 TLR3KO 마우스(C57BL/6 백그라운드; 체중이 16.5g 내지 18g이고 8주령 미만(Ace Animals, Inc.))에 감마-조사된(irradiated) 음식물을 1-일에 시작하여, 급식하였다. DSS(덱스트란 설페이트)(MP Biomedicals, Aurora, OH, 카달로그 번호 160110; 35-50kDa; 18-20% 황, 로트 번호 8247J)를 5%의 최종 농도로 오토클레이브한(autoclaved) 산성화된 식수에 희석하였다. DSS-물을 5일 동안 투여하고, 이후에 맹물로 교체하였다. 연구 내내 마우스가 물을 자유롭게 마시게 하였다. 모든 물병을 매일 칭량하여, 물 소비를 기록하였다. 0, 2 및 4일에, 마우스에 5 ㎎/㎏(0.1 ml PBS 중에 0.1 ㎎)의 mAb 5429, 마우스 항-TNF-α 항체 또는 대조군으로서 PBS를 비강내로 투여하였다. 마우스를 본 연구 내내 매일 모니터링하고, 0일 내지 4일 및 7일에 칭량하였다. 마우스를 본 연구의 2일 및 7일에 안락사시켰다. 복강을 열고, 상행 결장이 맹장과 연결되는 곳에서 상행 결장을 절개하였다. 결장을 수집하고, 10% 중성 완충된 포르말린에 고정시켰다. 결장을 파라핀-임베딩(embedded)하고, 섹션(section)하고, H&E염색하였다(Qualtek Molecular Labs, Santa Barbara, CA). 결장 조직병리학적 평가를 하기에 기재된 바와 같이 수의과 병리학자에 의해 블라인드 방식(blinded fashion)으로 행하였다(PathoMetrix, San Jose, CA).
조직병리학적 평가
대장의 2개의 세그먼트, 결장 및 직장을 평가하고, 하기의 변화에 대하여 점수화하였다: (i) 단일 세포 괴사; (ii) 상피 궤양; (iii) 상피 슬로핑(sloughing); (iv) 움농양; (v) 세포 증식; (vi) 창자샘 세포 증식; (vii) 고유판 내의 육아 조직 형성; (viii) 점막하층 내의 육아 조직; (ix) 주로 호중구인 점막하층의 염증성 세포 침윤물; 및 (x) 점막하층 부종.
단일의 전반적인 중증도의 점수를 하기의 기준에 기초하여 제공하였다:
0 - 존재하지 않음
1 - 경도, 국소적이거나 때때로 관찰됨
2 - 경도, 다발성
3 - 중등도, 종종 관찰되나, 제한된 영역에서 관찰됨
4 - 중증, 제시된 조직의 많은 영역 또는 확대에서 종종 관찰됨
5 - 매우 중증, 제시된 조직의 넓은 부분으로 확대
결과
이전의 관찰은 TLR3KO 동물이 DSS 섭취에 의해 유도된 염증성 장 질환의 모델에(PCT 공보 제WO06/60513A2호), 야생형 마우스에 비해 상당히 감소된 조직병리학을 나타냄을 보여주며, 이에 따라, TLR3 신호전달이 이러한 모델의 발병기전에서 역할을 수행하는 것이 제안된다. 괴사 세포로부터 방출되는 공생 박테리아 RNA 또는 포유동물 RNA는 내재성 리간드로 작용하여, TLR3 신호전달을 자극할 수 있는 것으로 보고되었으며(문헌[Kariko et al ., Immunity 23165-231175 2005; Kariko et al., J. Biol. Chem. 279:12542-12550 2004]), 이에 따라, 장에서 내재성 리간드에 의한 TLR3 자극은 DSS 대장염 모델에서 염증을 증진시키고 영속시킬 수 있다.
질환 중증도를 항-TLR3 항체로의 처리에 따라 화합물 조직병리학 점수에 의해 평가되는 바와 같이 DSS-노출 동물에서 개선시켰다(도 14). 도 14는 질환 중증도 점수에 대한 평균, 표준 편차 및 95% 신뢰구간을 수평의 막대로 나타낸 것이다. 미처리 야생형 동물과 비교하는 경우, 항-TLR3 항체로 처리한 야생형 DSS-노출 동물에서 점수의 상당한 감소가 관찰되었다(p < 0.05). DSS-노출 TLR3KO 동물은 DSS-유도 변화로부터 보호되었다. 항-마우스 TNF-α mAb를 받은 DSS-노출 동물은 DSS 모델에서 조직병리학의 개선을 나타내지 않았다. 따라서, DSS 모델은 항-TNF-α 치료법에 비-반응성인 인간 환자 개체군을 표적으로 할 수 있는 치료제를 평가하는 데 유용할 수 있으며, 중화성 항-TLR3 항체는 항-TNF-α 치료법에 반응하지 않는 염증성 장질환이 있는 환자에게 혜택을 제공할 가능성을 가질 수 있다.
모델
T 세포 전달 모델을 염증성 장질환의 모델로 사용하였다. 이러한 모델에서, 면역-컴피턴트(competent) 마우스로부터 조절 T 세포가 전혀 없는 나이브 T 세포의 집단을 전달하고, 이것이 장 점막에서 항원-제시 세포를 공격함으로써 SCID 마우스에서 장 염증이 유도된다.
나이브 T-세포(CD4+CD45RB고 T 세포)를 SCID 수여자 내로 복막내로 주사하여, 만성 대장염을 유도하였다. T-세포의 전달 48시간 후에, 마우스에 PBS(복막내로, 500 ㎕/마우스; 비히클 대조군), mAb 5429(복막내로, 0.1 ㎎/마우스), 또는 항-TNF-α 항체(복막내로, 0.05 ㎎/마우스; 양성 대조군) 중 하나를 제공한 다음, 8주 간의 연구 중에 주마다 2회 제공하였다. T-세포 전달 후 8주째에(또는 마우스가 그의 원래 체중의 15% 초과를 소실한 때), 동물을 안락사시키고, 결장을 제거하였다. 결장을 고정시키고, 파라핀-임베딩하고, H&E 염색하였다. 조직병리학(세포 침윤, 움농양, 상피 미란,술잔 세포 소실 및 장벽 비후)을 블라인드 방식으로 정량적으로 평가하였다.
결과
대조군 동물에 비하여, 항 TLR-3 항체로의 처리 시에, T-세포 전달을 받은 동물에서, 조직병리학적 점수의 합계의 상당한 감소에 의해 평가되는 바와 같이, 질환 중증도가 개선되었다(p<0.05)(도 15a). 점수의 합계를 위하여, 움농양, 궤양, 호중구 유입, 술잔세포 소실, 비정상 움구조, 고유판 염증 및 전층 연루(transmural involvement)을 평가하였다. 움농양, 궤양 및 호중구 유입에서 상당한 감소가 관찰되었다(모두에 대하여 p< 0.05)(도 15b). 항-TNF-α 항체를 최적의 혜택을 제공하는 것으로 알려져 있는 용량에서 양성 대조군으로 사용하였다.
두가지의 잘 알려져 있는 염증성 장질환의 모델인, DSS 및 T-세포 전달 모델을 사용한 연구는 전신 전달된 TLR3 항체 길항제가 장 점막에 도달하며, 2가지 상이한 발병 메카니즘을 통하여 유도되는 위장관 염증이 감소됨을 보여주었다. 따라서, TLR3 길항제는 항-TNF-α-불응 경우 및 위장관에서의 다른 면역-매개의 병리학을 비롯한 염증성 장질환의 치료에 유익할 수 있다.
실시예 12
TLR3 항체 길항제는 콜라겐-유도 관절염으로부터 보호한다.
모델
콜라겐-유도 관절염(CIA) 모델을 류마티스성 관절염의 모델로 사용하였다.
수컷 B10RIII 마우스(6-8 주령, Jackson Labs)를 그룹당 15마리(관절염 그룹) 또는 그룹당 4마리(대조군 마우스)의 그룹으로 나누었다. 관절염 그룹을 아이소플루란으로 마취시키고, 0일 및 15일에, II형 콜라겐(Elastin Products) 및 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)가 보충된 프레운트 완전 애쥬번트(Difco)의 주사를 제공하였다. 12일에, II형 콜라겐 관절염이 발생한 마우스를 체중에 의해 처리군으로 무작위화시키고, 12일, 17일 및 22일(d12, d17, 2d2)에 mAb 5429(25 ㎎/㎏), 음성 대조군 항체 CVAM(마우스 내의 알려져 있는 특이성이 없는 재조합 mAb)(5 ㎎/㎏) 또는 항-TNF-α 항체(5 ㎎/㎏, 양성 대조군)을 피하(SC)로 투여하였다. 또한, 마우스의 대조군을 피하(SC)로 12일 내지 25일에 매일(QD) 비히클(PBS) 또는 덱사메타손(0.5 ㎎/㎏, Dex, 참조 화합물)으로 처리하였다. 동물을 12일 내지 26일에 매일 관찰하였다. 앞발 및 뒷발을 임상 점수화 시스템에 의해 평가하였다(하기에 나타냄). 동물을 연구 26일에 안락사시키고, 조직병리학을 블라인드 방식으로 평가하였다(후술되는 점수화 시스템). 효능 평가는 동물 체중 및 임상 관절염 점수를 기준으로 하였다. 모든 동물은 실험 종료까지 생존하였다.
앞발 및 뒷발에 대한 임상 점수화 기준
0 - 정상
1 - 뒷발 또는 앞발 관절에 영향을 받거나, 또는 매우 적게 확산된 홍반 및 부기
2 - 뒷발 또는 앞발 관절에 영향을 받거나, 또는 경미하게 확산된 홍반 및 부기
3 - 뒷발 또는 앞발 관절에 영향을 받거나, 또는 중증도로 확산된 홍반 및 부기
4 - 현저하게 확산된 홍반 및 부기, 또는 =4 발가락에 영향을 받음)
5 - 발 전체에 홍반 및 중증의 부기가 심하게 확산됨, 발가락을 굽힐수 없음)
II형 콜라겐 관절염을 사용한 마우스 관절의 조직병리학 점수화 방법
II형 콜라겐 관절염의 병변을 갖는 마우스로부터의 발 또는 발목을 점수화하는 경우, 변화의 중증도뿐 아니라 영향을 받은 개별 관절의 수가 고려된다. 중수골/중족골/발가락 또는 발목뼈/경골뒷발목(tibiotarsal) 관절의 가능성으로부터 오직 1개 내지 3개 발 또는 발목 관절만이 영향을 받은 경우, 하기의 파라미터에 대하여 최대 점수 1, 2 또는 3의 임의 할당을 변화의 중증도에 따라 제공하였다. 2개 초과의 관절이 연루되는 경우, 하기의 기준을 가장 심각하게 영향을 받은/대부분의 관절에 적용하였다.
1일 내지 15일에 대한 앞다리 점수에 대한 임상 데이터를 AUC를 사용하여 분석하고, 대조군으로부터 억제%를 계산하였다.
염증
0 - 정상
1 - 영향을 받은 관절의 활막 및 관절주위 조직 내 매우 적은 염증성 세포 침윤
2 - 발이라면, 영향을 받은 관절에 제한된, 경도의 침윤
3 - 발이라면, 영향을 받은 관절에 제한된, 중등도의 부종이 존재하는 중등도의 침윤
4 - 현저한 부종이 존재하는 대부분의 영역에 영향을 미치는 현저한 침윤
5 - 심한 부종이 존재하는 심하게 확산된 침윤
판누스( Pannus )
0 - 정상
1 - 연골 및 연골하골 내 매우 적은 판누스 침윤
2 - 영향을 받은 관절에서 경조직의 변역부 파괴를 갖는 경도의 침윤
3 - 영향을 받은 관절에서 중등도의 경조직 파괴를 갖는 중등도의 침윤
4 - 대부분의 관절에서, 관절 구조의 현저한 파괴를 갖는 현저한 침윤
5 - 모든 관절에 영향을 미치는, 관절 구조의 전부 또는 거의 전부의 파괴와 관련된 심한 침윤
연골 손상
0 - 정상
1 - 영향을 받은 관절에서 명백한 연골세포 소실 또는 콜라겐 파괴가 없으면서, 톨루이딘 블루 염색의 아주 적은 내지 경미한 소실
2 - 영향을 받은 관절에서 국소의 경미한(표재성) 연골세포 소실 및/또는 콜라겐 파괴와 함께, 톨루이딘 블루 염색의 중등도의 소실
3 - 영향을 받은 관절에서 다발성 중등도(중간 구역까지의 깊이) 연골세포 소실 및/또는 콜라겐 파괴와 함께, 톨루이딘 블루 염색의 중등도의 소실
4 - 대부분의 관절에서 다발성의 현저한(심저(deep) 구역까지의 깊이) 연골세포 소실 및/또는 콜라겐 파괴와 함께, 톨루이딘 블루 염색의 현저한 소실
5 - 모든 관절에서 다발성의 중증의(최고선(tide mark)까지의 깊이) 연골세포 소실 및/또는 콜라겐 파괴와 함께, 톨루이딘 블루 염색의 심하게 확산된 소실
골 흡수
0 - 정상
1 - 아주 적음, 작은 흡수 영역이 존재하나, 저배율로는 용이하게 분명하지 않음, 영향을 받은 관절 내에 용골세포는 거의 없음
2 - 경도, 더욱 많은 흡수 영역이 존재하나, 저배율로는 용이하게 분명하지 않음, 영향을 받은 관절 내에 용골세포가 더욱 많음
3 - 중등도, 피질에서의 전층 결손이 존재하지 않으면서 수질 소주골 및 피질골의 명백한 흡수가 존재함, 일부 수질 골소주의 소실이 존재함, 저배율로 병변이 분명함, 영향을 받은 관절 내에 용골세포가 더욱 많음
4 - 현저함, 피질골에서의 전층 결손이 존재함, 종종 남아있는 피질 표면의 윤곽이 뒤틀려 있음, 수질 골 소실이 현저함, 용골세포가 다수 존재함, 대부분의 관절에 영향
5 - 심함, 피질골에서의 전층 결손이 존재함, 모든 관절에서 관절 구조의 파괴
결과
덱사메타손(Dex) 및 항-마우스 TNF-α 항체를 양성 대조군으로 사용하고, PBS를 비히클 대조군으로 사용하여, CVAM을 음성 대조군 항체로 사용하였다. 관절 질환이 발생 중에 있는 연구 12일째에 모든 처리를 개시하였다. 비히클-처리 질환 대조군 동물에 대한 질환 발병률은 연구 22일에 100%이었다. 비히클 또는 CVAM 항체로 처리한 음성 대조군은 가장 높은 임상 점수를 가졌다. 덱사메타손(18일 내지 26일에 대하여 p<0.05), 5 ㎎/㎏의 항-TNF-α 항체(18일 내지 26일에 대하여 p<0.05), 또는 25 ㎎/㎏의 mAb 5429(18일 내지 23일 및 25일 내지 26일에 대하여 p<0.05)로 처리한 그룹에서 상당히 감소된 임상 점수가 관찰되었다(도 16). 곡선 아래 영역(AUC)으로 나타낸 임상 관절염 점수가 비히클 대조군에 비해 25 ㎎/㎏의 mAb 5429(43% 감소), 5 ㎎/㎏의 항-TNF-α 항체(52%), 또는 덱사메타손(69%)으로의 처리에 의하여 상당히 감소되었다. 도 17은 각 그룹에 대한 AUC의 평균 및 표준 편차를 나타낸 것이다.
또한, 조직병리학적 치료 효과를 평가하였다. 비히클 대조군에 비해 25 ㎎/㎏의 mAb 5429(47% 감소)로의 처리에 의하여 발의 골 흡수가 상당히 감소하였다. 5 ㎎/㎏의 항-TNF-α 항체로 처리한 양성 대조군 마우스는 상당히 감소된 발 염증(33%), 연골 손상(38%) 및 합산된 발 점수(37%)를 가졌다. 덱사메타손으로의 처리는 모든 발 조직병리학적 파라미터를 감소시켰다(합산된 점수의 73% 감소).
이들 데이터는 TLR3 항체 길항제가 CIA 모델에서 임상 및 조직병리학적 질환 증후를 개선시키는 것을 보여주며, 류마티스성 관절염의 치료를 위한 TLR3 길항제의 이용을 제안한다.
실시예 14
TLR3 항체 길항제는 급성 치사의 바이러스 감염으로부터 보호한다
모델
인플루엔자 A 바이러스 챌린지 모델을 급성 치사의 바이러스 감염 모델로 사용하였다.
1일, 4일, 8일 및 12일에, 암컷 C57BL/6 마우스(12주령) 또는 암컷 TLR3KO 마우스(C57BL/6 백그라운드; 12 주령, ACE Animals, inc., 그룹 당 15마리의 마우스)에 20 ㎎/㎏의 mAb 5429 또는 단독의 PBS를 피하로 투여하였다. 0일에, 마우스를 아이소플루란으로 마취시키고, 25 ㎕의 PBS 중의 인플루엔자 A/PR/8/34 바이러스(ATCC, Rockland, MD, 로트 번호 218171)를 비강내로 투여하였다(105.55 CEID50와 등가). 동물을 14일의 기간에 걸쳐, 체중 변화 및 생존에 대하여 하루에 2회 관찰하였다. 임상 점수화 시스템을 사용하여, 질환 진행 수준 및 인플루엔자 A 바이러스 처리에 대한 반응의 감지하기 힘든 개선을 평가하였다.
임상 점수
0 - 정상, 각성 및 반응성, 보이는 병의 징후 없음
1 - 약간 감소된 보행과 함께 또는 이것 없이 거친 코트(ruffled coat)
2 - 거친 코트, 보행 시에 구부러진 자세, 보행을 주저함, 힘든 호흡
3 - 거친 코트, 힘든 호흡, 운동 실조, 떨림
4 - 거친 코트, 가벼운 재촉과 함께 보행 불능, 무의식, 만지면 차가운 느낌
5 - 죽은 것으로 관찰
결과
생존, 매일의 임상 점수 및 체중의 변화를 본 연구에서 평가하였다. mAb 5429(20 ㎎/㎏)를 투여한 인플루엔자 A 감염된 야생형 마우스 및 mAb 5429를 받지 않은 인플루엔자 A 감염된 TLR3KO 둘 모두는 인플루엔자 바이러스를 접종한 C57BL/6 마우스에 비해 통계적으로 유의미한 생존의 증가를 나타내었으며(각각 p<0.001 및 p<0.01), 이는 TLR3의 길항작용 또는 결함이 인플루엔자-유도 사망을 방지할 수 있음을 나타낸다(도 18). 20 ㎎/㎏의 mAb 5429를 받은 그룹뿐 아니라 TLR3KO 그룹에서 임상 점수가 상당히 감소하였다(도 19). 마우스의 체중을 인플루엔자 바이러스 투여 후 14일의 기간에 걸쳐 관찰하였다. 인플루엔자 A 바이러스를 투여한 C57BL/6 마우스에서 체중이 꾸준히 감소하였다. 그러나, 20 ㎎/㎏의 mAb 5429를 투여한 C57BL/6 마우스 및 TLR3KO 마우스는 인플루엔자 바이러스를 접종한 야생형 C57BL/6 마우스에 비해 상당히 더 큰 체중을 나타내었다(도 20). 이들 결과는 TLR3 항체 길항제가 급성 치사의 인플루엔자 바이러스 감염 모델에서 임상 증후 및 사망률을 감소시키는 것을 증명하며, TLR3 길항제가 급성 감염 상태에 있는 인간에 대한 보호를 제공할 수 있음을 시사한다.
실시예 15
TLR3 항체 길항제는 고혈당증을 개선시키고, 혈장 인슐린을 감소시킨다.
모델
식이-유도 비만(DIO) 모델을 고혈당증 및 인슐린 내성, 및 비만의 모델로 사용하였다.
C57BL/6 야생형 동물(약 3주령, Jackson Labs) 및 TLR3KO 동물(C57BL/6 백그라운드; 약 3 주령, Ace Animals, Inc.)에 12 내지 16주 동안 고지방 식이를 계속하였다. TLR3KO 및 야생형 C57BL/6 마우스 둘 모두에 정상 음식 또는 60.9 kcal%의 지방 및 20.8 kcal%의 탄수화물로 구성된 고지방 식이(Purina TestDiet 카달로그 번호 58126) 중 하나를 급식하였다. 마우스를 물과 음식물을 자유롭게 제공하면서, 12:12 시간의 명암주기로 유지하였다. 각 그룹 내의 마우스 각각의 중량을 주마다 측정하였다. mAb 5429는 첫주에는 한주에 2회 복막내로 제공하고, 이어서 총 7주 동안 한주에 1회 투여하였다. 공복의 안와-후 혈청 샘플을 표시된 시간에 인슐린 측정을 위하여 사용하였다. 7주째에, 밤샘 단식 이후에, 체중 1g당 1.0 ㎎의 복막내 당의 투여에 의하여 당부하 검사를 수행하였다. 또한, 공복의 인슐린 및 당 수준을 측정하였다.
HOMA-IR를 하기의 식을 사용하여, 공복의 당 및 인슐린 수준에 기초하여 식으로부터 결정하였다(12): HOMA-IR = ((공복의 당(mmol/l) x 공복의 인슐린(mU/l))/ 22.5 (문헌[Wallace et al., Diabetes Care 27:1487-1495,, 2004]). 공복의 혈당(BG)을 글루코오스 산화효소 분석을 사용하여 결정하였다. 공복의 인슐린 수준을 인슐린 랫트/마우스 ELISA 키트(Crystal Chem, 카달로그 번호 90060)를 사용하여 결정하였다.
결과
고지방 식이에서 12 내지 16주 후에, 야생형 DIO 동물은 고혈당증 및 고인슐린혈증이었다. mAb 5429로의 처리 시에, 내당능이 야생형 DIO 동물에서 개선되었으나, TLR3KO DIO 동물에서는 그렇지 않았다. 당 챌린지 후 60, 90, 120 및 180분에, 대조군(PBS만)에 비해, mAb 5429로 처리한 동물에서 상당히 감소된 혈당 수준이 관찰되었다(도 21a). mAb를 제공하지 않은 야생형 DIO 마우스에 비해, mAb 5429로 처리한 야생형 DIO 동물에서 AUC의 약 21%감소가 관찰되었다. 또한, mAb 5429로 처리한 야생형 DIO 동물에서 공복의 인슐린 수준이 감소하였다(도 22). TLR3KO DIO 동물은 mAb 5429의 처리시에, 공복의 인슐린의 개선을 나타내지 않았다. 항상성 모델 평가(Homeostatic model assessment; HOMA) 분석에서는 mAb 5429로 처리한 야생형 DIO 동물에서 개선된 인슐린 감수성이 나타났지만, TLR3KO DIO 동물에서는 그렇지 않았다. HOMA-IR 값은 야생형 DIO, 5 ㎎/㎏의 야생형 DIO mAb 5429 및 20 ㎎/㎏의 야생형 DIO mAb 5429 동물에 대해서 각각 14.0±9.8, 8.7±4.9, 9.0±3.0이었다. TLR3KO DIO 동물에서는 효과가 관찰되지 않았다.
본 연구는 TLR3 항체 길항제가 DIO 모델에서 체중 감소 없이, 인슐린 내성을 개선시키고 공복의 당을 감소시키는 것을 증명하였으며, 이는 TLR3 길항제가 고혈당증, 인슐린 내성 및 II형 당뇨병의 치료에 유익할 수 있음을 시사한다.
실시예 16
TLR3 항체 길항제는 박테리아 및 바이러스-유도 염증성 반응으로부터 보호한다.
시약
박테리아성 악화가 있는 COPD 환자로부터 단리된 비피막형 해모필루스 인플루엔자 (NTHi) 스트레인 35를 티. 에프. 머피(T. F. Murphy) 박사(Buffalo VA Medical Center, Buffalo, NY)로부터 얻었다. 인간 리노바이러스 16을 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC)으로부터 TCID(50)=2.8 x 107/ml로 얻었다.
NTHi 자극 분석
NHBE 세포(Lonza, Wakersville, MD)를 마이크로테스트(Microtest) 96-웰 조직 배양 플레이트(BD Biosciences, Bedford, MA)에 1 x 105 세포/웰로 씨딩하였다. 한천(agar) 플레이트 상에서 16시간 내지 20시간 배양한 NTHi를 약 2 x 108 cfu/ml로 성장 배지 중에 재현탁화시키고, 100 ㎍/ml의 젠타마이신으로 30분 동안 처리하고, NHBE를 함유하는 96-웰 플레이트에 약 2 x 107/웰로 첨가하였다. 3시간 후에, 상층액을 제거하고, 항체(0.08 내지 50 ㎍/ml의 최종 농도)가 있거나 또는 항체가 없는 새로운 성장 배지로 교체하였다. 추가의 24시간의 인큐베이션 후에, 루미넥스 100IS 멀티플렉스 형광 분석기 및 판독기 시스템(Luminex Corporation, Austin, TX)에서, 세포 상층액 내의 인간 사이토카인 및 케모카인(IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL12p40p70, IL-13, IL-15, IL-17, TNF-α, IFN-α, IFN-γ, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, IP-10, MIG, 에오탁신, RANTES 및 MCP-1 포함)의 존재를 사이토카인 25-플렉스(plex) AB 비드 키트(Life Technologies, Carslbad, CA)를 사용하여, 3중으로 분석하였다.
리노바이러스 자극 분석
NHBE 세포를 마이크로테스트 96-웰 조직 배양 플레이트(BD Biosciences, Bedford, MA)에 1 x 105/웰로 씨딩하였다. 다음 날, 항체(0.08 내지 50 ㎍/ml의 최종 농도)를 NHBE 또는 BEAS-2B 세포에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 10 ㎕/웰의 리노바이러스를 첨가하였다. 추가의 24시간의 인큐베이션 후에, 세포 상층액 내의 사이토카인 및 케모카인의 존재를 상술된 바와 같은 루미넥스 분석으로 분석하였다.
결과
mAb 15EVQ는 NTHi 유도성 IP-10/CXCL10 및 RANTES/CCL5 생성을 용량 의존적인 방식으로 억제하였으나, 대조군 항체인 인간 IgG4(Sigma, St. Louis, MO)는 NTHi 자극에서 억제 효과를 나타내지 않았다(도 23a). 또한, mAb 15EVQ는 리노바이러스 유도성 CXCL10/IP-10 및 CCL5/RANTES 생성을 억제하였다(도 23b).
실시예 17
TLR3 항체 길항제는 성상세포에서 염증성 반응을 저해한다.
방법
2명의 공여자로부터의 정상 인간 성상세포(Lonza, Walkersville, MD)를 24 웰 플레이트에 75,000 세포/웰로 플레이팅하고, 밤새 부착되게 하였다. 다음날, 성상세포를 24시간 동안 200 ng/ml의 폴리(I:C) 및/또는 10 ㎍/ml의 mAb 18로 처리하였다. 사이토카인을 루미넥스로 측정하였다.
결과
IL-6, IL-8, IL-12, IFN-α, IFN-γ, CXCL9/MIG, CCL3/MIP-1a, CCL4, CCL5/RANTES 및 CXCL10/IP-10의 폴리(I:C)-유도된 생성은 표 10에 나타낸 바와 같이 mAb 18에 의해 억제되었다.
[표 10]
Figure 112011039693804-pct00020
실시예 18
TLR3 항체 길항제는 내피 세포에서 염증성 반응을 저해한다.
방법
HUVEC 세포(Lonza, Walkersville, MD)를 론자(Lonza)에서 추천한 혈청-함유 성장 배지에서 배양하였다. 세포를 혈청이 없는 배지(Lonza, Walkersville, MD)에 재현탁화시키고, 96-웰 플레이트에 3x105 세포/ml로 플레이팅하고, 37℃, 5%CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 폴리(I:C)(GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 농도를 증가시키면서(1.5에서 100 ㎍/ml) 첨가하고, 37℃에서 다시 24시간 동안 인큐베이션하였다. 사이토카인 억제 분석을 위하여, mAb 15EVQ를 세포에 다양한 농도(0 내지 50 ㎍/ml)로 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션한 후, 20 ㎍/ml의 폴리(I:C)를 24시간 동안 첨가하였다. 세포 상층액을 수집하고, 인간 사이토카인 30-플렉스 키트 및 루미넥스 MAP 기술(Invitrogen Corp., Carslbad, CA)을 사용하여 사이토카인 수준을 측정하였다. sICAM-1 발현을 측정하기 위하여, HUVEC 세포를 20 ㎍/ml의 폴리(I:C) 및 다양한 농도의 mAb 15EVQ(0.8 내지 50 ㎍/ml)로 처리하였다. 세포 상층액을 ELISA(R&D systems)에 의해 sICAM-1에 대하여 분석하였다. CellTiterGlo 키트(Promega, Madison, WI)를 사용하여, 세포 생존력을 측정하였다.결과
HUVEC 세포는 폴리(I:C)에 대한 반응으로 하기의 사이토카인을 생성하였다: IL-1RA, IL-2, IL-2R, IL-6, IL-7, CXCL8/IL-8, IL-12 (p40-p70), IL-15, IL-17, TNF-α, IFN-α, IFN-γ, GM-CSF, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CXCL10/IP-10, CCL5/RANTES, CCL2/MCP-1, VEGF, G-CSF, FGF-염기성 및 HGF(표 11). mAb 15EVQ는 폴리(I:C)에 의해 유도된 모든 사이토카인의 수준을 용량 의존적인 방식으로 감소시켰다(표 12). TNF-α, CCL2/MCP-1, CCL5/RANTES 및 CXCL10/IP-10의 폴리(I:C)-유도된 생성을 감소시키는 mAb 15EVQ의 능력은 TLR3-매개의 활성의 억제가 죽상동맥경화증을 야기할 수 있는 백혈구 및 T 세포 침윤에 대하여 보호할 수 있음을 시사한다. 또한, mAb 15EVQ에 의한 VEGF의 억제는 다양한 암 및 연령 관련 황반 변성과 같은 안질환에서 혈관신생을 비롯한 VEGF에 의해 매개되는 병리에서의 TLR3 차단의 가능한 혜택을 제시한다.
TNF-α 및 IFN-γ는 백혈구 동원에서 기능하며, 활성화된 내피 상의 부착 분자의 발현을 증가시켰다(문헌[Doukas et al ., Am. J. Pathol. 145:137-47, 1994]; 문헌[Pober et al ., Am. J. Pathol. 133:426-33, 1988]). CCL2/MCP-1, CCL5/RANTES 및 CXCL10/IP-10은 단핵구 및 T 세포 동원에서 연루되며, 죽상동맥경화증의 발생에 기여한다(문헌[Lundgerg et al ., Clin. Immunol. 2009]). 내피 세포에 의한 VEGF의 생성은 혈관신생 중인 다양한 암에서 비정상 조직 성장 또는 종양과 관련이 있다(문헌[Livengood et al ., Cell. Immunol. 249:55-62, 2007]).
용해성 세포내 부착 분자 1(sICAM-1)은 단백질 가수분해적 절단에 의해 생성되며, 내피 세포 활성화에 대한 마커이다. ICAM-1은 백혈구 이동 및 활성화에서 중요한 역할을 수행하며, 염증 동안에 내피 세포 및 상피 세포 상에서 상향조절되며, 여기에서 이는 인테그린 분자 LFA-1 및 Mac-1을 통하여 림프구에 대한 부착을 매개한다. 폴리(I:C)는 내피 세포를 활성화시켜, sICAM-1 발현을 상향조절하며, 이 상향조절은 mAb 15EVQ로의 처리에 의해 감소된다(도 24a).
[표 11]
Figure 112011039693804-pct00021
[표 12]
Figure 112011039693804-pct00022
이는 TLR3 항체 길항제가 림프구 트래픽킹(trafficking)을 억제하여, 염증성 세포의 유입에 의해 야기되는 조직 손상을 억제할 수 있음을 시사한다.
생존력 분석을 위하여, 상술된 바와 같이 HUVEC을 배양하고, 플레이팅하고, 폴리(I:C)로 자극시켰다. mAb 15EVQ는 HUVEC 세포 생존력에서의 폴리(I:C)-유도된 감소를 용량 의존적으로 복구시켰다(도 24b).
내치 세포 활성화의 하향-조절은 과도한 면역 세포 침윤을 저해할 수 있고, 염증성 증상 동안에 증가되는 사이토카인에 의해 야기되는 조직 손상을 줄일 수 있다. 염증 및, 내피 세포 상의 사이토카인 및 부착 분자의 과발현은 죽상동맥경화증 및 고혈압을 발생시키는 주요한 원인 제공자이다. 이들 데이터는 혈관염 및 내피 기능장애를 특징으로 하는 것을 비롯한 혈관 질환에서 사용하기 위한 TLR3 길항제의 가능한 혜택을 탐구하는 것에 대한 근거를 제공한다. 염증 및 과발현된 사이토카인에 의해 영향을 받는 다른 질환에는 면역억제되고 HIV 감염된 개체에서 통상적이며, 카포시 육종 허피스 바이러스(KSHV)에 의해 유발되는 카포시 육종(KS)이 있다. VEGF 및 사이토카인 생성은 KS 세포의 생존에 기여한다(문헌[Livengood et al., Cell Immunol. 249:55-62, 2007]). TLR3 길항제는 KS 및 다른 종양과 관련된 혈관신생 위험을 감소시키고, 세포 생존력 소실을 예방하고, 혈관 누출, 기관 기능상실과 관련된 잠재적으로 심각한 증상 및 패혈증과 같은 생명-위협 염증성 증상을 예방하기 위하여 내피 배리어(barrier) 무결성을 보호하는 데 유익할 수 있다. 또한, TLR3 길항작용은 플라비비리대(flaviviridae)(예를 들어, 뎅기(Dengue), 황열), 필로비리대(filoviridae)(예를 들어, 에볼라(Ebola), 마르부르크(Marburg)), 부니아비리대(bunyaviridae)(예를 들어, 한타바이러스(Hantavirus), 나이로바이러스(Nairovirus), 플레보바이러스(Phlebovirus)) 및 아레나비리대(예를 들어, 루조(Lujo), 라사(Lassa), 아르젠틴(Argentine), 볼리비안(Bolivian), 베네주엘란(Venezuelan) 출혈열)과 같은 내피 세포 병리를 수반하는 바이러스 감염에 유익할 수 있다(문헌[Sihibamiya et al ., Blood 113:714-722, 2009]).
실시예 19
TLR3 항체 길항제의 사이노몰거스 및 뮤린 TLR3 와의 교차-반응성
실시예 2에 기재된 바와 같은 ISRE 리포터 유전자 분석을 사용하여, 사이노몰거스 및 뮤린 TLR3에 대한 활성을 평가하였다. 사이노몰거스(서열 번호 217) 및 뮤린 TLR3 cDNA(서열 번호 161)를 전혈로부터 증폭시키고, pCEP4 벡터(Clontech)로 클로닝하고, 상술된 바와 같이 발현시켰다. mAb 15EVQ는 인간 TLR3 NF-kB 및 ISRE 분석에서 각각 0.44 및 0.65 ㎍/ml인 IC50에 비해, 사이노몰거스 NF-κB 및 ISRE 분석에서 각각 4.18 ㎍/ml 및 1.74 ㎍/ml의 IC50을 가졌다. 아이소형 대조군 항체는 이들 분석에서 효과를 가지지 않았다.
SEQUENCE LISTING <110> CENTOCOR ORTHO BIOTECH INC. <120> TOLL-LIKE RECEPTOR 3 ANTAGONISTS <130> CEN5242PCT <140> TO BE ASSIGNED <141> 2009-10-30 <150> 61/109974 <151> 2008-10-31 <150> 61/161860 <151> 2009-03-20 <150> 61/165100 <151> 2009-03-31 <150> 61/173686 <151> 2009-04-29 <160> 220 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2712 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgagacaga ctttgccttg tatctacttt tgggggggcc ttttgccctt tgggatgctg 60 tgtgcatcct ccaccaccaa gtgcactgtt agccatgaag ttgctgactg cagccacctg 120 aagttgactc aggtacccga tgatctaccc acaaacataa cagtgttgaa ccttacccat 180 aatcaactca gaagattacc agccgccaac ttcacaaggt atagccagct aactagcttg 240 gatgtaggat ttaacaccat ctcaaaactg gagccagaat tgtgccagaa acttcccatg 300 ttaaaagttt tgaacctcca gcacaatgag ctatctcaac tttctgataa aacctttgcc 360 ttctgcacga atttgactga actccatctc atgtccaact caatccagaa aattaaaaat 420 aatccctttg tcaagcagaa gaatttaatc acattagatc tgtctcataa tggcttgtca 480 tctacaaaat taggaactca ggttcagctg gaaaatctcc aagagcttct attatcaaac 540 aataaaattc aagcgctaaa aagtgaagaa ctggatatct ttgccaattc atctttaaaa 600 aaattagagt tgtcatcgaa tcaaattaaa gagttttctc cagggtgttt tcacgcaatt 660 ggaagattat ttggcctctt tctgaacaat gtccagctgg gtcccagcct tacagagaag 720 ctatgtttgg aattagcaaa cacaagcatt cggaatctgt ctctgagtaa cagccagctg 780 tccaccacca gcaatacaac tttcttggga ctaaagtgga caaatctcac tatgctcgat 840 ctttcctaca acaacttaaa tgtggttggt aacgattcct ttgcttggct tccacaacta 900 gaatatttct tcctagagta taataatata cagcatttgt tttctcactc tttgcacggg 960 cttttcaatg tgaggtacct gaatttgaaa cggtctttta ctaaacaaag tatttccctt 1020 gcctcactcc ccaagattga tgatttttct tttcagtggc taaaatgttt ggagcacctt 1080 aacatggaag ataatgatat tccaggcata aaaagcaata tgttcacagg attgataaac 1140 ctgaaatact taagtctatc caactccttt acaagtttgc gaactttgac aaatgaaaca 1200 tttgtatcac ttgctcattc tcccttacac atactcaacc taaccaagaa taaaatctca 1260 aaaatagaga gtgatgcttt ctcttggttg ggccacctag aagtacttga cctgggcctt 1320 aatgaaattg ggcaagaact cacaggccag gaatggagag gtctagaaaa tattttcgaa 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cacctccgag 480 agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaaaacc 660 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 720 aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagg ccgccggggg accatcagtc 780 ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1320 aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 1380 ctctccctgt ctctgggtaa a 1401 <210> 105 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 Heavy chains of Candidate 15EVQ without leader sequence <400> 105 gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgagag cctgaagatc 60 agctgcaagg gcagcggcta cagcttcacc aactactggg tgggctgggt gcgccagatg 120 cccggcaagg gcctggagtg gatgggcttc atcgacccca gcgacagcta caccaactac 180 gcgcctagct tccagggcca ggtgaccatc agcgccgaca agagcatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggccagcgac accgccatgt actactgcgc ccgcgagctg 300 taccagggct acatggacac gttcgacagc tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 360 agcgcttcca ccaagggccc atccgtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc 420 gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaaa 600 acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660 tccaaatatg gtcccccatg cccaccatgc ccagcacctg aggccgccgg gggaccatca 720 gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780 acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg 840 gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg 900 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 960 aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020 aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac accctgcccc catcccagga ggagatgacc 1080 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200 tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag 1260 gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag 1320 agcctctccc tgtctctggg taaa 1344 <210> 106 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-termina leader sequence for expressing light chains <400> 106 Met Gly Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu 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gt 702 <210> 108 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of Candidate 15 without leader sequence (starts DIQ) <400> 108 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60 atcacctgcc gcgccagcca gagcatcggc ctgtacctgg cctggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcagcc tgcagagcgg cgtgcccagc 180 cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggcaacaccc tgagctacac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 109 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidates 15, 15-1, 15-2, 15-3, 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Artificial Sequence <220> <223> Candidate 15-5 VH <400> 128 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Tyr Gln Gly Tyr Met Asp Thr Phe Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 129 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate 15-6 VH <400> 129 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Phe Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala Pro Ser 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acagaattag gaactcaggt tcagc 45 <210> 172 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 172 gaaaattaaa aataatccct ttgtcaagca ggagaattta atcacattag atctgtc 57 <210> 173 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 173 gaaaattaaa aataatccct ttgtcgagca gaagaattta atcacattag 50 <210> 174 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 174 cagaaaatta aaaataatcc ctttgcaaag cagaagaatt taatcacatt ag 52 <210> 175 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 175 ccaactcaat ccagaaaatt aaagctaatc cctttgtcaa gcagaag 47 <210> 176 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 176 caatgagcta tctcaacttt ctcgtaaaac ctttgccttc tgcac 45 <210> 177 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 177 gtcttgagaa actagaaatt ctcaagttgc agcataacaa cttagcac 48 <210> 178 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 178 cttgagaaac tagaaattct cgcattgcag cataacaact tagcac 46 <210> 179 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 179 ctaaagtcat tgaaccttca ggagaatctc ataacatccg ttg 43 <210> 180 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 180 ctctaaagtc attgaacctt caggcgaatc tcataacatc cgttgag 47 <210> 181 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 181 ccacatcctt aacttgaggt ccaacggctt tgacgag 37 <210> 182 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 182 gaaattctcg atttgcagca taacgcctta gcacggctct ggaaac 46 <210> 183 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 183 gagaaactag aaattctcga tttggcgcat aacaacttag cacggc 46 <210> 184 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 184 ctagaaattc tcgatttgca ggaaaacaac ttagcacggc tctg 44 <210> 185 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 185 ctagaaattc tcgatttgca ggctaacaac ttagcacggc tctg 44 <210> 186 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 186 cattctggat ctaagcaaca acgccatagc caacataaat gatgac 46 <210> 187 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 187 gaaaatattt tcgaaatcta tctttccgcc aacaagtacc tgcagctgac 50 <210> 188 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 188 gccttcaacg actgatgctg aaagggtggc ccttaaaaat g 41 <210> 189 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 189 cttcaacgac tgatgctccg agaggtggcc cttaaaaatg tgg 43 <210> 190 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for mutagenesis for TLR3 variant <400> 190 cgaaatctat ctttcctaca acgagtacct gcagctgact ag 42 <210> 191 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for family 17 LCDR3 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> Wherein Xaa can be Ala, Gln, Gly or Ser <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> Wherein Xaa can be Gly, Glu or Ser <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> Wherein Xaa can be Asp or Asn <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> Wherein Xaa and be Glu or Ser <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> Wherein Xaa can be Phe, Ala or Leu <400> 191 Xaa Ser Tyr Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Val 1 5 10 <210> 192 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for family 17 HCDR2 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> Wherein Xaa can be Arg or Lys <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> Wherein Xaa can be Tyr, His or Ser <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> Wherein Xaa can be Met, Arg or Tyr <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> Wherein Xaa can be Lys or Arg <400> 192 Xaa Ile Xaa Xaa Arg Ser Xaa Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val 1 5 10 15 Lys Ser <210> 193 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for family 18B LCDR3 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> Wherein Xaa can be Gln or Ser <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> Wherein Xaa can be Thr, Glu or Asp <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> Wherein Xaa can be Val or Asn <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> Wherein Xaa can be Tyr or Phe <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> Wherein Xaa can be Ser, Asn or Gln <400> 193 Xaa Ser Tyr Asp Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Val 1 5 10 <210> 194 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for family 18B HCDR3 <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> Wherein Xaa can be Lys, Thr or Ile <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> Wherein Xaa can be Asn or Asp <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Wherein Xaa can be Val or Leu <400> 194 Ile Ile Gln Xaa Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Xaa Tyr Ala Xaa Ser Val 1 5 10 15 Lys Ser <210> 195 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for family 19 LCDR3 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> Wherein Xaa can be Tyr, Gly or Ala <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> Wherein Xaa can be Gly, Glu or Asn <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> Wherein Xaa can be Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> Wherein Xaa can be Val, Ile or Leu <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> Wherein Xaa can be Ser or Leu <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> Wherein Xaa can be Ile, Ser, Pro or Tyr <400> 195 Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 196 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for family 19 HCDR2 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> Wherein Xaa can be Phe or Arg <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> Wherein Xaa can be Ala or Ser <400> 196 Xaa Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Xaa Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 197 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus variable light chain family 17 <220> <221> misc_feature <222> (88) <223> Wherein Xaa can be Ala, Gln, Gly or Ser <220> <221> misc_feature <222> (92) <223> Wherein Xaa can be Gly, Glu or Ser <220> <221> misc_feature <222> (93) <223> Wherein Xaa can be Asp or Asn <220> <221> misc_feature <222> (94) <223> Wherein Xaa can be Glu or Ser <220> <221> misc_feature <222> (95) <223> Wherein Xaa can be Phe, Ala or Leu <400> 197 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ala Leu Gly Gly Tyr Phe Val 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Asp Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Xaa Ser Tyr Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 198 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus variable heavy chain family 17 <220> <221> misc_feature <222> (52) <223> Wherein Xaa can be Arg or Lys <220> <221> misc_feature <222> (54) <223> Wherein Xaa can be Tyr, His or Ser <220> <221> misc_feature <222> (55) <223> Wherein Xaa can be Met, Arg or Tyr <220> <221> misc_feature <222> (58) <223> Wherein Xaa can be Lys or Arg <400> 198 Gln Val Glu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Thr Arg 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Xaa Ile Xaa Xaa Arg Ser Xaa Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Thr Tyr Pro Tyr Leu Ser Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 199 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus variable light chain family 18B <220> <221> misc_feature <222> (88) <223> Wherein Xaa can be Gln or Ser <220> <221> misc_feature <222> (92) <223> Wherein Xaa can be Thr, Glu or Asp <220> <221> misc_feature <222> (94) <223> Wherein Xaa can be Val or Asn <220> <221> misc_feature <222> (95) <223> Wherein Xaa can be Tyr or Phe <220> <221> misc_feature <222> (96) <223> Wherein Xaa can be Ser, Asn or Gln <400> 199 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Tyr Tyr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Glu Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Xaa Ser Tyr Asp Xaa Pro Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 200 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus variable heavy chain family 18A and 18B <220> <221> misc_feature <222> (55) <223> Wherein Xaa can be Lys, Thr or Ile <220> <221> misc_feature <222> (62) <223> Wherein Xaa can be Asn or Asp <220> <221> misc_feature <222> (65) <223> Wherein Xaa can be Val or Leu <400> 200 Gln Val Glu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Ile Ile Gln Xaa Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Xaa Tyr Ala 50 55 60 Xaa Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ser Tyr Pro Phe Tyr Ser Ile Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 201 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus variable light chain family 19 <220> <221> misc_feature <222> (91) <223> Wherein Xaa can be Tyr, Gly or Ala <220> <221> misc_feature <222> (92) <223> Wherein Xaa can be Gly, Glu or Asn <220> <221> misc_feature <222> (93) <223> Wherein Xaa can be Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (94) <223> Wherein Xaa can be Val, Ile or Leu <220> <221> misc_feature <222> (95) <223> Wherein Xaa can be Ser or Leu <220> <221> misc_feature <222> (96) <223> Wherein Xaa can be Ile, Ser, Pro or Tyr <400> 201 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Leu Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 202 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus variable heavy chain family 19 <220> <221> misc_feature <222> (50) <223> Wherein Xaa can be Phe or Arg <220> <221> misc_feature <222> (61) <223> Wherein Xaa can be Ala or Ser <400> 202 Gln Val Glu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Xaa Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Xaa Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Tyr Gln Gly Tyr Met Asp Thr Phe Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 203 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Full length consensus light chain, family 17 <220> <221> misc_feature <222> (88) <223> Wherein Xaa can be Ala, Gln, Gly or Ser <220> <221> misc_feature <222> (92) <223> Wherein Xaa can be Gly, Glu or Ser <220> <221> misc_feature <222> (93) <223> Wherein Xaa can be Asp or Asn <220> <221> misc_feature <222> (94) <223> Wherein Xaa can be Glu or Ser <220> <221> misc_feature <222> (95) <223> Wherein Xaa can be Phe, Ala or Leu <400> 203 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ala Leu Gly Gly Tyr Phe Val 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Asp Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Xaa Ser Tyr Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 204 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Full length consensus heavy chain, family 17 <220> <221> misc_feature <222> (52) <223> Wherein Xaa can be Arg or Lys <220> <221> misc_feature <222> (54) <223> Wherein Xaa can be Tyr, His or Ser <220> <221> misc_feature <222> (55) <223> Wherein Xaa can be Met, Arg or Tyr <220> <221> misc_feature <222> (58) <223> Wherein Xaa can be Lys or Arg <400> 204 Gln Val Glu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Thr Arg 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Xaa Ile Xaa Xaa Arg Ser Xaa Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Thr Tyr Pro Tyr Leu Ser Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 Lys <210> 205 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Full length consensus light chain family 18B <220> <221> misc_feature <222> (88) <223> Wherein Xaa can be Gln or Ser <220> <221> misc_feature <222> (92) <223> Wherein Xaa can be Thr, Glu or Asp <220> <221> misc_feature <222> (94) <223> Wherein Xaa can be Val or Asn <220> <221> misc_feature <222> (95) <223> Wherein Xaa can be Tyr or Phe <220> <221> misc_feature <222> (96) <223> Wherein Xaa can be Ser, Asn or Gln <400> 205 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Tyr Tyr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Glu Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 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misc_feature <222> (65) <223> Wherein Xaa can be Val or Leu <400> 206 Gln Val Glu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Ile Ile Gln Xaa Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Xaa Tyr Ala 50 55 60 Xaa Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ser Tyr Pro Phe Tyr Ser Ile Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 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Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 Lys <210> 207 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Full length consensus light chain family 19 <220> <221> misc_feature <222> (91) <223> Wherein Xaa can be Tyr, Gly or Ala <220> <221> misc_feature <222> (92) <223> Wherien Xaa can be Gly, Glu or Asn <220> <221> misc_feature <222> (93) <223> Wherein Xaa can be Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (94) <223> Wherein Xaa can be Val, Ile or Leu <220> <221> misc_feature <222> (95) <223> Wherein Xaa can be Ser or Leu <220> <221> misc_feature <222> (96) <223> Wherein Xaa can be Ile, Ser, Pro or Tyr <400> 207 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Leu Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 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<222> (61) <223> <400> 208 Gln Val Glu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Xaa Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Xaa Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Tyr Gln Gly Tyr Met Asp Thr Phe Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 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aatccctttg taaagcagaa gaatttaatc acattagatc tgtctcataa tggcttgtca 480 tctacaaaat taggaactca ggttcagctg gaaaatctcc aagagcttct attatcaaac 540 aataaaatcc aagcgctaaa aagtgaagaa cttggtatcc ttgccaattc atctttaaaa 600 aagttagagt tgtcatcgaa tcaaattaaa gagttttctc cagggtgttt tcacgcaatt 660 ggaagattat tgggcctctt tctgaacaat gtccagctgg gtccccgcct cacagagaag 720 ctatgtttgg aattagcaaa cacaagcgtt cggaatctgt ctctgagtaa cagccagctg 780 tccaccacca gcaatacaac tttcttggga ctaaagtgga caaacctcac tatgctcgat 840 ctttcccaca acaacttaaa tgtgattggt aacgattcct ttgtttggct tccacatcta 900 gaatatttct tcctggagta taataatata cagcatttgc tctctcactc tttgcacggg 960 cttttcaatg tgcggtacct gaatttgaaa cggtctttta ctaaacaaag tatttccctt 1020 gcttcgctcc ccaagattga tgatttttct tttcggtggc taacatgttt ggagcacctt 1080 aacatggaag ataatgatat ttcaggcata aaaagcaata tgttcacagg attgataaac 1140 ctgaaatact taagtctatc caactccttt acaagtttgc aaactttgac aaatgaaaca 1200 tttgtatcac ttgctcattc tcccttacac atactcaacc taaccaagaa taaaatctca 1260 aaaatagaga gtggtgcctt ctcttggttg ggccacctag aagtacttga cttgggcctt 1320 aatgaaattg ggcaagaact cacaggccag gaatggagtg gtctagaaaa tattttcgaa 1380 atctatcttt cctacaacaa gtacctgcaa ctgactaaga actcctttgc cttggtccga 1440 agccttcaac gactgatgct ccgaagggtg gcccttaaaa atgtggattg ctctccttca 1500 ccattccagc ctcttggtaa cctgaccatt ctggatctaa gcaacaacaa catagccaac 1560 ataaatgatg acatgttgga aggtcttgag aaactagaaa ttctggattt gcagcataac 1620 aacttagcac ggctctggaa acacgcaaac cctggtggtc ctgtttattt cctaaagggt 1680 ctgtctcacc tccacatcct taacttggag tctaatggct ttgacgagat cccagttgag 1740 gtcttcaagg atttatctga actaaagatc attgatttag gattgaataa tttaaacaca 1800 cttccagcgt ctgtctttga taatcaggtg tctctaaagt cattgaacct tcagaagaat 1860 ctcataacat cagttgagaa gaaggttttc gggccagctt tcaggaacct gagtaactta 1920 gatatgcgct ttaatccctt tgattgcaca tgtgaaagta ttgcctggtt tgttaattgg 1980 attaacaaga cccacgccaa catccctgag ctgtcaagcc actacctttg caacactcca 2040 ccccactatc atgggttccc agtgagactt tttgatacat catcctgcaa agacagtgcc 2100 ccctttgaac 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219 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidates 10EVQ, 12EVQ heavy chain with S229P, F235A/L236A <400> 219 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Ile Ile Gln Lys Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asn Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ser Tyr Pro Phe Tyr Ser Ile Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 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115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445

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  7. 서열 번호 82, 86 및 84에 각각 나타낸 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR) 1, 2 및 3 아미노산 서열; 및 서열 번호 79, 80 및 87에 각각 나타낸 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR) 1, 2 및 3 아미노산 서열을 포함하며, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 모두를 포함하는, 톨-유사 수용체 3 (TLR3)에 반응성인 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. a. 서열 번호 216의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 41의 경쇄 가변 영역 (VL); 또는
    b. 서열 번호 220의 중쇄 및 서열 번호 156의 경쇄를 포함하며, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 모두를 포함하는, 톨-유사 수용체 3 (TLR3)에 반응성인 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
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  18. a. 서열 번호 82, 86 및 84에 나타난 아미노산 서열을 각각 가지는 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR) 1, 2 및 3, 및 서열 번호 79, 80 및 87에 나타난 아미노산 서열을 각각 가지는 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR) 1, 2 및 3; 또는
    b. 서열 번호 216의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 41의 경쇄 가변 영역 (VL)
    을 포함하는, 인간 톨-유사 수용체 3 (TLR3)에 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 치료적 유효량으로 포함하는, 이를 필요로 하는 환자를 위한 천식 또는 천식 악화 치료용 약제.
  19. 제18항에 있어서, 천식 또는 천식 악화가 폐 내의 염증성 세포 침윤, 기도 과민증, 점막 과분비, 상피하 섬유증 또는 IgE 수준 상승으로 인한 것인, 천식 또는 천식 악화 치료용 약제.
  20. 제19항에 있어서, 염증성 세포가 호산구 또는 호중구인, 천식 또는 천식 악화 치료용 약제.
  21. 제18항에 있어서, TLR3에 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 인간 또는 인간-적응화된 것인, 천식 또는 천식 악화 치료용 약제.
  22. a. 서열 번호 82, 86 및 84에 나타난 아미노산 서열을 각각 가지는 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR) 1, 2 및 3, 및 서열 번호 79, 80 및 87에 나타난 아미노산 서열을 각각 가지는 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR) 1, 2 및 3; 또는
    b. 서열 번호 216의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 41의 경쇄 가변 영역 (VL)
    을 포함하는 인간 톨-유사 수용체 3 (TLR3)에 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 치료적 유효량으로 포함하며, 천식, 천식 악화, 바이러스 감염, 인플루엔자 바이러스 감염, 만성폐쇄폐질환(COPD), 알러지, 세균성 폐렴 및 낭성 섬유증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폐 내의 염증성 세포 침윤 증가로 인한 질환을 앓는 환자를 치료하기 위한 약제.
  23. 제22항에 있어서, 염증성 세포가 호중구 또는 호산구인, 약제.
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  25. a. 서열 번호 82, 86 및 84에 나타난 아미노산 서열을 각각 가지는 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR) 1, 2 및 3, 및 서열 번호 79, 80 및 87에 나타난 아미노산 서열을 각각 가지는 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR) 1, 2 및 3; 또는
    b. 서열 번호 216의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 41의 경쇄 가변 영역 (VL)
    을 포함하는, 인간 톨-유사 수용체 3 (TLR3)에 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 치료적 유효량으로 포함하며, 기도 과민증으로 인한 질환을 앓는 환자를 위한, 기도 과민증 감소용 약제.
  26. 제25항에 있어서, 기도 과민증이 천식, 천식 악화, 바이러스 감염, 인플루엔자 바이러스 감염, 만성폐쇄폐질환(COPD), 알러지, 알러지성 비염 또는 낭성 섬유증으로 인한 것인, 기도 과민증 감소용 약제.
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