JP2012153732A - リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット２の阻害剤およびその使用 - Google Patents

リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット２の阻害剤およびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】Ｒ２阻害剤及び標的細胞においてＲ２の阻害を達成することができるその関連する方法及び組成物の提供。
【解決手段】本出願はリボヌクレオチドレダクターゼサブユニット２（Ｒ２）の阻害剤及びＲ２阻害剤に関連する方法及び組成物に関する。特定の実施形態においては、Ｒ２阻害剤は核酸、例えばｓｉＲＮＡを含む。標的細胞は、望ましくない増殖を起こしている細胞、例えば、癌又は腫瘍の細胞、特定の疾患又は症状（例えば自己免疫疾患又は移植片拒絶におけるＴ細胞）及び病原体に関連する過剰な成育及び／又は増殖を起こしている細胞を含む。
【選択図】図９

Description

（関連出願）
本出願は、米国仮特許出願第６０／６６７，３６２号（２００５年３月３１日出願）、同第６０／６９５，９３１号（２００５年６月３０日出願）および同第６０／７４２，１００号（２００５年１２月２日出願）の優先権を主張し、これらの出願は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
（背景）
リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）は２’−デオキシリボヌクレオチドをその相当するリボヌクレオシド５’−ジホスフェートから生成する反応を触媒する。この反応は２’−デオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートの生成のための経路における律速段階であり、そして、ＤＮＡ複製の為に必要である。ヒトＲＮＲは２つのサブユニット、Ｒ１及びＲ２よりなり、両方の蛋白の発現が酵素活性の為に必要である。Ｒ１及びＲ２は別個の染色体上の異なる遺伝子によりコードされており、そして、最も重要な点として、そのｍＲＮＡは細胞周期を通じて示差的に発現される。Ｒ１蛋白は全細胞周期に渡って安定であるが、Ｒ２はＤＮＡ複製が起こる後期Ｇ１／初期Ｓ期の間に発現されるのみである（非特許文献１）。
Ｅｎｇｓｔｒｏｍ，Ｙ．，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｓ．，Ｊｉｌｄｅｖｉｋ，Ｉ．，Ｓｋｏｇ，Ｓ．，Ｔｈｅｌａｎｄｅｒ，Ｌ．およびＴｒｉｂｕｋａｉｔ，Ｂ．，「Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ．」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８５年，第２６０巻，ｐ．９１１４−９１１６
Ｒ２の阻害は抗癌及び抗ウィルス剤の目的となっている。しかしながら癌又は病原体感染のような細胞増殖性の疾患の治療のためのＲ２の新しくターゲティングされた阻害剤が望ましい。
（本出願の簡単な説明）
従って、本出願はＲ２阻害剤及び標的細胞においてＲ２の阻害を達成することができるその関連する方法及び組成物を提供する。特に、標的細胞は望ましくない増殖を起こしている細胞、例えば、癌又は腫瘍の細胞、特定の疾患又は症状（例えば自己免疫疾患又は移植片拒絶におけるＴ細胞）及び病原体に関連する過剰な成育及び／又は増殖を起こしている細胞を含む。本出願のＲ２阻害剤はＲ２発現又はＲ２の生物学的機能（例えばＲ２の酵素活性）を低下させることによりＲ２を阻害してよい。
Ｒ２阻害剤は核酸、小分子、ペプチド、例えば抗体、ペプチド誘導体又はペプチドミメティックであることができる。
特定の実施形態は核酸であるＲ２阻害剤に関する。出願は特定の条件下（例えば生理学的又は細胞内）においてＲ２転写産物にハイブリダイズし、細胞内の標的遺伝子の発現を低減する少なくとも一部分を含む単離された核酸を提供する。標的遺伝子転写産物は何れかのスプライシング前転写産物（即ちイントロンを含有）、スプライシング後転写産物、並びに何れかのスプライス変異体であってよい。特定の実施形態においては、標的遺伝子転写産物は配列番号１〜３のいずれかに示す配列を有する。核酸のカテゴリーの例は例えばＲＮＡｉコンストラクト及び触媒性核酸コンストラクトを含む。核酸は１本鎖又は２本鎖であってよい。２本鎖核酸はまた鎖の一方又はもう一方が１本鎖であるオーバーハング又は非相補の領域を含んでよい。１本鎖核酸は二重螺旋構造の領域と、所謂、「ヘアピン」又は「ステム−ループ」の構造を化合物が形成することを意味する、自己相補性の領域を含んでよい。核酸は配列番号１〜３（図１〜２）に示すものの何れかのような標的遺伝子核酸配列のヌクレオチド１０００個以下、５００個以下、２５０個以下、１００個以下又は、５０個以下よりなる領域に相補であるヌクレオチド配列、又はその何れかの相同体（例えばオーソログ及びパラログ）又は変異体を含んでよい。相補性の領域は好ましくは少なくとも８ヌクレオチド、そして場合により少なくとも１０、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドである。相補性の領域は標的遺伝子転写産物のイントロン、コーディング配列又は非コーディング配列内に含まれてよい。一般的に、核酸は約８〜約５００ヌクレオチド又は塩基対長の長さを有し、そして場合により長さは約１４〜約５０ヌクレオチドとなる。核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ又はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドであってよい。何れの１つの鎖も、ＤＮＡとＲＮＡの混合物、並びに、ＤＮＡ又はＲＮＡの何れかとして容易に分類することができない改変された形態を含んでよい。同様に、２本鎖核酸はＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡであってよく、そして、何れの１つの鎖も又、ＤＮＡとＲＮＡの混合物、並びに、ＤＮＡ又はＲＮＡの何れかとして容易に分類することができない改変された形態を含んでよい。核酸は種々の改変、例えば骨格（天然の核酸の糖−ホスフェート部分。例えばヌクレオチド内連結部）又は塩基部分（天然の核酸のプリン又はピリミジン部分）への改変の何れを含んでもよい。核酸は好ましくは約１５〜約３０ヌクレオチドの長さを有し、そして頻繁には血清中、細胞中、又は、核酸が送達される可能性のある場所、例えば経口送達核酸の場合は胃、そして吸入された核酸の場合は肺における安定性のような特性を向上させるために改変１つ以上を含有する。ＲＮＡｉコンストラクトの場合は、標的転写産物に相補な鎖は一般的にＲＮＡ又はその改変物となる。他の鎖はＲＮＡ、ＤＮＡ又は何れかの他の変異物であってよい。２本鎖又は１本鎖の「ヘアピン」ＲＮＡｉコンストラクトのデュプレックス部分は好ましくは１８〜３０ヌクレオチド長、そして場合により約２１〜２７ヌクレオチド長の長さを有する。触媒性又は酵素性の核酸はリボザイム又はＤＮＡ酵素であってよく、そして、改変された形態を含有してもよい。本発明においては核酸は生理学的条件下において、そして非センス又はセンスの制御の影響が極僅か又は皆無である濃度において細胞に接触させた場合に約５０％、７５％、９０％以上標的Ｒ２遺伝子の発現を阻害してよい。核酸の作用を試験するための好ましい濃度は１、５又は１０マイクロモルである。核酸は本発明においては細胞の表現型に対する作用に関しても試験してよい。特定の癌細胞系統においては、細胞死又は増殖速度低下はターゲティングされた核酸の投与時に測定してよい。好ましくは、細胞の増殖は核酸の実験的に意味のある濃度において５０％を超えて阻害される。
特定の実施形態においては、出願は種々のＲ２阻害剤、例えばＲ２遺伝子をターゲティングする核酸（又はターゲティングされた核酸）のいずれかを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は一般的に製薬上許容しうる担体を含む。医薬組成物は生理学的条件下にて標的遺伝子転写産物にハイブリダイズし、そして細胞内の標的遺伝子の発現を低減する核酸を含んでよい。
特定の特徴において、出願は細胞におけるＲ２遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。方法は生理学的条件下において標的Ｒ２転写産物にハイブリダイズして細胞内の標的遺伝子の発現を低減する核酸の有効量に細胞を接触させることを含んでよい。開示したＲ２をターゲティングする核酸の何れかをそのような方法において使用してよい。細胞は腫瘍又は癌性の細胞、病原体細胞又は正常細胞であってよい。特定の実施形態においては、正常細胞は、患者において特定の疾患又は症状をもたらす望ましくない増殖を起こす。
特定の特徴において、出願は腫瘍の成長速度を低減するために十分な本明細書に記載のＲ２阻害剤の量を投与することを含む、対象における腫瘍の成長速度を低減するための方法を提供する。出願は本明細書に記載のＲ２を患者に投与することを含む癌に罹患した患者を治療するための方法を提供する。Ｒ２阻害剤は核酸、例えばＲＮＡｉ核酸又は触媒性核酸であってよく、そして製薬上許容しうる担体と共に製剤されてよい。場合により、腫瘍は核酸がターゲティングする遺伝子を発現する癌細胞１つ以上を含む。標的Ｒ２遺伝子は比較可能な組織に由来する非癌性の細胞と相対比較して過剰発現されてよい。そのような治療は核酸と相加的又は相乗的な態様において癌細胞を阻害する追加的抗癌化学療法剤少なくとも１つと組み合わせてよい。核酸及び追加的な抗癌剤は複合製剤として前もって製剤してよく、或いは、独立して製剤し、そして複合作用が達成されるような態様（例えば時点、用量）において投与してよい。
特定の特徴において、出願は例えば癌又は病原体による感染の治療のための医薬の製造における核酸の使用を提供する。
特定の特徴において、出願は（ａ）目的の遺伝子を発現する癌細胞の複数を有する腫瘍を患者において発見すること；及び（ｂ）目的の遺伝子をターゲティングする核酸を適宜患者に投与することを含む、癌に罹患した患者を治療するための方法を提供する。方法は診断的部分として、標的遺伝子の遺伝子増幅を有する癌細胞の複数を有する腫瘍を患者において発見することを含む。遺伝子増幅は種々の方法、例えば蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）又はリプリゼンテーショナルオリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析（ＲＯＭＡ）において検出してよい。
特定の特徴において、出願は病原体に感染した患者又は汚染された目標物から病原体を除去又は低減するための方法及び組成物を提供する。
本発明の別の特徴はパッケージされた医薬品を提供する。そのようなパッケージされた医薬品は（ｉ）Ｒ２遺伝子をターゲティングする本明細書に開示した阻害剤の治療有効量；及び（ｉｉ）Ｒ２遺伝子を発現する腫瘍を有する患者の治療のためのＲ２阻害剤の投与に関する説明書及び／又はラベルを含む。
本発明の別の特徴はパッケージされた消毒薬を提供する。パッケージされた消毒薬は病原体のような感染性の物質１つ以上に対抗して特異的であることができる。このようなパッケージされた消毒薬は（ｉ）感染性物質においてＲ２遺伝子をターゲティングするＲ２阻害剤の治療有効量；及び（ｉｉ）感染性物質を除去又は減量するためのＲ２阻害剤の投与に関する説明書及び／又はラベルを含む。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
以下：
（ｉ）配列番号４〜６よりなる群から選択される配列を含む１５〜３０ヌクレオチド長の第１の鎖；及び、
（ｉｉ）１５〜３０ヌクレオチド長の第２の鎖；
を含む核酸であって、
ここで該第１及び第２の鎖の少なくとも１２ヌクレオチドは相互に相補であり、そして生理学的条件下にて２本鎖核酸を形成し、そしてここで、該２本鎖核酸はＲＮＡ干渉機序により細胞内でリボヌクレオチドレダクターゼサブユニット２（Ｒ２）の発現を低減できる、核酸。
（項目２）
前記核酸が２本鎖ＲＮＡである項目１記載の核酸。
（項目３）
前記核酸がヘアピンＲＮＡである項目１記載の核酸。
（項目４）
前記ヘアピンＲＮＡのループ領域が４〜１０ヌクレオチド長である項目３記載の核酸。
（項目５）
前記ＲＮＡの２本鎖部分が約１５〜約３０ヌクレオチド長である項目１記載の核酸。
（項目６）
前記第１の鎖がＤＮＡポリヌクレオチドであり、そして第２の鎖がＲＮＡポリヌクレオチドである項目１記載の核酸。
（項目７）
前記第１及び／又は第２の鎖が更に３’オーバーハング領域、５’オーバーハング領域又は３’オーバーハング領域及び５’オーバーハング領域の両方を含む項目１記載の核酸。
（項目８）
前記オーバーハング領域が１〜１０ヌクレオチド長である項目７記載の核酸。
（項目９）
前記核酸が１つ以上の改変された骨格又は塩基部分を含む項目１記載の核酸。
（項目１０）
前記改変された骨格又は塩基部分が、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスフェートエステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシルメチルエステル、カーボネート及びホスフェートトリエステルの１つ以上である項目９記載の核酸。
（項目１１）
前記核酸が少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチドを含む項目９記載の核酸。
（項目１２）
前記第１の鎖が配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３及び９５よりなる群から選択される配列を含む項目１記載の核酸。
（項目１３）
前記第２の鎖が配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４及び９６よりなる群から選択される配列を含む項目１記載の核酸。
（項目１４）
１０ナノモルの濃度において生理学的条件下にて細胞と接触した場合に、前記核酸が該細胞によるＲ２発現を５０％以上阻害する項目１記載の核酸。
（項目１５）
生理学的条件下にて配列番号１のヌクレオチド４２２〜４８５、６１６〜６６７又は９０７〜９６８に相当するＲ２転写物の領域にハイブリダイズし、そして、細胞内のＲ２の発現を低減する配列を含む、単離された核酸。
（項目１６）
前記核酸が配列番号１のヌクレオチド４３２〜４７５、６２６〜６５７又は９１７〜９５８に相当するＲ２転写物の領域にハイブリダイズする配列を含む項目１５記載の単離された核酸。
（項目１７）
前記核酸が配列番号１のヌクレオチド４３７〜４７０、６３１〜６５２又は９２１〜９５３に相当するＲ２転写物の領域にハイブリダイズする配列を含む項目１５記載の単離された核酸。
（項目１８）
前記核酸がＲ２の前記領域の１つに相補的な少なくとも１０連続ヌクレオチドを含む項目１５記載の核酸。
（項目１９）
前記核酸が約１４〜約５０ヌクレオチド長である項目１５記載の核酸。
（項目２０）
前記核酸が１本鎖である項目１５記載の核酸。
（項目２１）
前記核酸が２本鎖である項目１５記載の核酸。
（項目２２）
前記核酸が改変された骨格又は塩基部分１つ以上を場合により含むＤＮＡ分子である項目１５記載の核酸。
（項目２３）
前記核酸が改変された骨格又は塩基部分１つ以上を場合により含むＲＮＡ分子である項目１５記載の核酸。
（項目２４）
前記核酸がＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖を含み、そして改変された骨格又は塩基部分１つ以上を場合により含む項目１５記載の核酸。
（項目２５）
前記核酸がＲＮＡｉコンストラクトである項目１５記載の核酸。
（項目２６）
前記ＲＮＡｉコンストラクトが改変された骨格又は塩基部分１つ以上を場合により含むｄｓＲＮＡである項目２５記載の核酸。
（項目２７）
前記ＲＮＡｉコンストラクトが改変された骨格又は塩基部分１つ以上を場合により含むヘアピンＲＮＡである項目２５記載の核酸。
（項目２８）
前記ＲＮＡｉコンストラクトのデュプレックス部分が約１５〜約３０ヌクレオチド長である項目２５記載の核酸。
（項目２９）
前記ＲＮＡｉコンストラクトが改変された骨格又は塩基部分１つ以上を場合により含む配列番号４〜６よりなる群から選択される配列を含む項目２５記載の核酸。
（項目３０）
前記ＲＮＡｉコンストラクトが改変された骨格又は塩基部分１つ以上を場合により含む配列番号７〜９６よりなる群から選択される配列を含む項目２５記載の核酸。
（項目３１）
前記ＲＮＡｉコンストラクトが改変された骨格又は塩基部分１つ以上を含む項目２５記載の核酸。
（項目３２）
前記ＲＮＡｉコンストラクトがアルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスフェートエステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシルメチルエステル、カーボネート及びホスフェートトリエステルよりなる群から選択されるヌクレオチド間連結少なくとも１つを含む項目３１記載の核酸。
（項目３３）
前記改変されたＲＮＡｉコンストラクトが２’−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチド少なくとも１つを含む項目３１記載の核酸。
（項目３４）
前記核酸が酵素的核酸である項目１５記載の核酸。
（項目３５）
前記酵素的核酸がリボザイムである項目３４記載の核酸。
（項目３６）
前記酵素的核酸がＤＮＡ酵素である項目３４記載の核酸。
（項目３７）
１０ナノモルの濃度において生理学的条件下にて細胞と接触した場合に前記核酸が該細胞によるＲ２発現を５０％以上阻害する項目１５記載の核酸。
（項目３８）
項目１または項目１５記載の核酸及び製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物。
（項目３９）
前記製薬上許容しうる担体がカチオン性重合体を含有する項目３８記載の医薬組成物。
（項目４０）
前記製薬上許容しうる担体がシクロデキストリン重合体を含有する項目３８記載の医薬組成物。
（項目４１）
前記シクロデキストリン構造が図２７に示すｉｍ−ＣＤＰである項目４０記載の医薬組成物。
（項目４２）
シクロデキストリン重合体及び項目１又は１５記載の核酸を含有し、そしてＰＥＧ化されている粒子を含む項目３８記載の医薬組成物。
（項目４３）
前記粒子が更にアダマンタンを含む項目４２記載の医薬組成物。
（項目４４）
更に特定の組織又は細胞型をターゲティングするリガンドを含む項目３８記載の医薬組成物。
（項目４５）
前記リガンドがガラクトースを含む項目４４記載の医薬組成物。
（項目４６）
ナノ粒子を含み、そして該ナノ粒子が直径１０〜１００ｎｍである項目３８記載の医薬組成物。
（項目４７）
前記ナノ粒子が直径約５０〜７０ｎｍである項目４６記載の医薬組成物。
（項目４８）
ナノ粒子が直径約５０ｎｍである項目４７記載の医薬組成物。
（項目４９）
項目３８記載の医薬組成物であって、ここで前記製薬上許容しうる担体が、以下：
イミダゾール改変シクロデキストリン含有カチオン性重合体、及び、
アダマンタン−ＰＥＧ−リガンドを含むターゲティング部分、
を含み、
ここで該重合体及びターゲティング部分が前記核酸をカプセル化するナノ粒子を形成する、医薬組成物。
（項目５０）
前記ナノ粒子が約５０〜１２０ｎｍの直径を有する項目４９記載の医薬組成物。
（項目５１）
前記ナノ粒子が約５０〜１００ｎｍの直径を有する項目５０記載の医薬組成物。
（項目５２）
ナノ粒子が約５０〜７０ｎｍの直径を有する項目５１記載の医薬組成物。
（項目５３）
前記ナノ粒子が約５０ｎｍの直径を有する項目４９記載の医薬組成物。
（項目５４）
前記ターゲティングリガンドがガラクトースを含む項目４９記載の医薬組成物。
（項目５５）
前記ターゲティングリガンドがトランスフェリンを含む項目４９記載の医薬組成物。
（項目５６）
細胞の望ましくない増殖に関連する疾患又は症状の治療のための医薬の製造における項目１又は１５記載の核酸の使用。
（項目５７）
前記細胞が癌性又は腫瘍の細胞である項目５６記載の使用。
（項目５８）
前記細胞が病原体細胞である項目５６記載の使用。
（項目５９）
前記細胞が正常細胞であり、該細胞の前記望ましくない増殖が疾患状態をもたらす、項目５６記載の使用。
（項目６０）
項目１又は１５記載の２本鎖核酸の治療有効量を患者に投与することを含む癌を有する患者を治療するための方法。
（項目６１）
前記核酸が製薬上許容しうる担体とともに製剤される項目６０記載の方法。
（項目６２）
前記核酸が癌細胞をターゲティングするリガンドとともに製剤される項目６０記載の方法。
（項目６３）
前記リガンドがトランスフェリンである項目６２記載の方法。
（項目６４）
前記癌細胞が肝細胞であり、そして前記リガンドがガラクトースを含む項目６２記載の方法。
（項目６５）
前記核酸が重合体ナノ粒子の成分として製剤される項目６０記載の方法。
（項目６６）
前記ナノ粒子が直径１０〜１２０ｎｍである項目６５記載の方法。
（項目６７）
前記ナノ粒子が直径５０〜１２０ｎｍである項目６５記載の方法。
（項目６８）
前記ナノ粒子が直径５０〜１００ｎｍである項目６７記載の方法。
（項目６９）
前記ナノ粒子が直径５０ｎｍである項目６５記載の方法。
（項目７０）
投与経路が全身性である項目６０記載の方法。
（項目７１）
投与経路が肝動脈内投与である項目６０記載の方法。
（項目７２）
前記癌が肝臓癌である項目７１記載の方法。
（項目７３）
前記癌細胞が比較可能な組織に由来する非癌性の細胞と比較してより高レベルのＲ２を発現する項目６０記載の方法。
（項目７４）
前記核酸と相加的又は相乗的な態様において癌細胞を阻害する追加的抗癌化学療法剤少なくとも１つを更に含有する項目６０記載の方法。
（項目７５）
化学療法剤がフルオロウラシル（５ＦＵ）である項目７４記載の方法。
（項目７６）
以下：
肝臓治療薬、及び、
（ｉ）イミダゾール改変シクロデキストリン含有カチオン性重合体、及び（ｉｉ）アダマンタン−ＰＥＧ−リガンドを含むターゲティング部分を含む送達ビヒクルであって、ここで該重合体及びターゲティング部分が核酸をカプセル化するナノ粒子を形成する、送達ビヒクル、
を含む肝特異的送達医薬組成物。
（項目７７）
前記ナノ粒子が直径１０〜１００ｎｍである項目７６記載の医薬組成物。
（項目７８）
前記ナノ粒子が直径約５０〜７０ｎｍである項目７７記載の医薬組成物。
（項目７９）
前記ナノ粒子が直径約５０ｎｍである項目７７記載の医薬組成物。
（項目８０）
前記肝臓治療薬が小分子、ポリペプチド又は核酸である項目７６記載の医薬組成物。
（項目８１）
前記肝臓治療薬が項目１又は１５記載の核酸である項目８０記載の医薬組成物。
（項目８２）
以下：
肝臓治療薬、及び、
（ｉ）イミダゾール改変シクロデキストリン含有カチオン性重合体、及び（ｉｉ）アダマンタン−ＰＥＧ−リガンドを含むターゲティング部分を含む送達ビヒクルであって、ここで該重合体及びターゲティング部分が核酸をカプセル化するナノ粒子を形成する、送達ビヒクル、
を含む組成物を肝臓の疾患又は障害の治療の必要な対象に投与することを含む該治療のための方法。
（項目８３）
前記肝臓の疾患又は障害が肝細胞癌である項目８２記載の方法。
（項目８４）
投与経路が肝動脈内投与である項目８２記載の方法。
図１はヒトリボヌクレオチドレダクターゼＭ２に関するｃＤＮＡ配列を示す（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３４）（配列番号１）。下線を付した太字の３つの１１塩基ストレッチは配列番号４〜６により示されるコア標的配列に相当する。 図２はマイコバクテリウム・ツベルクロシスＨ３７Ｒｖのリボヌクレオチドレダクターゼ小型サブユニット（図２Ａ）（配列番号２）及びヒトヘルペスウィルス４のリボヌクレオチドレダクターゼ小型サブユニット（図２Ｂ）（配列番号３）に関するｃＤＮＡ配列を示す。 図３は正常ヒト肝臓組織（図３Ａ）及び肝細胞癌（ＨＣＣ）組織（図３Ｂ）におけるＲ２の免疫組織化学的染色を示す。画像は４００Ｘの倍率で撮影した。Ｒ２発現はＨＣＣ肝臓組織においては検出可能にアップレギュレートされていた。新しく切除されたヒトＨＣＣ組織を４％パラホルムアルデヒド中に固定し、パラフィン包埋し、そして２〜５μｍ切片を切り出した。脱パラフィンし、等級付けされたアルコールを介して再水和した後、スライドをマイクロ波抗原回復（抗原脱マスキング溶液；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）に付し、そしてマウスＩｇＭ（１：４００希釈、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いながらマウス抗ヒト抗ＲＲＭ２抗体（１：４０希釈、Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）及び二次抗体で標識した。画像は冷却した電荷結合デバイスカメラ（Ｍａｇｎａｆｉｒｅ；Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いてキャプチャーし、そしてＴＩＦＦファイルとしてＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）にインポートし、そしてＸｅｒｏｘ Ｐｈａｓｅｒ ８６０ＤＰプリンター上に印刷した。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は標準的なプロトコルを用いて実施した。 図４はＲ２をターゲティングするｓｉＲＮＡの設計を示す。ヒトＲ２（ｈＲＲＭ２）ｍＲＮＡ内の標的部位の位置は本出願による新規な標的部位に関してはＡ、Ｂ及びＣで、そして公開されている標的部位に関してはＸ、Ｙ及びＺで標記する。 図５はＲ２標的に対するｓｉＲＮＡの結合を試験するゲルシフト試験を示す。レーン３、４及び５は図４に示す通り、それぞれ領域Ａ、Ｂ及びＣに対するｓｉＲＮＡ標的を用いたＲ２のゲルシフトを示す。使用したｓｉＲＮＡの配列は配列番号７及び８（標的部位Ａ）、配列番号９及び１０（標的部位Ｂ）及び配列番号１１及び１２（標的部位Ｃ）とした。部位ＡにターゲティングされたｓｉＲＮＡデュプレックスは強力な結合（レーン３）を示していた。 図６Ａ及び６ＢはｓｉＲＮＡの細胞内力価（図６Ａ）が標的に対するそれらの結合親和性（図６Ｂ）に相関することを示している。図６ＣはＥＧＦＰをターゲティングしている種々のｓｉＲＮＡを示す。 図７は本出願の特定のｓｉＲＮＡによる種々の細胞系統におけるＲ２のダウンレギュレーションを示す。図７Ａは記載した種々のｓｉＲＮＡを投与したＨｅＬａ細胞由来のｈＲＲＭ２蛋白のレベルのウエスタンブロットを示す。図７ＢはＡ、Ｂ及びＣ部位にターゲティングされたｓｉＲＮＡ、対照ｓｉＲＮＡ及びｈＲＲＭ２に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドでトランスフェクトされた種々の細胞型由来の溶解物を用いたウエスタンブロット実験の結果を示す。 図８はＲ２に対するｓｉＲＮＡのスクリーニングのためのＲ２ルシフェラーゼ融合コンストラクト（「ｐＲ２Ｌｕｃプラスミド」）を示す。細胞はｐＲ２ＬｕｃプラスミドとＲ２に対するｓｉＲＮＡで同時トランスフェクトしてよい。ルシフェラーゼレベルの定量はＲ２発現のダウンレギュレーションと相関していた。 図９はタイリング実験の結果を示す。図９Ａ、９Ｂ及び９Ｃはそれぞれ標的部位Ａ、Ｂ及びＣにおいて実施されたタイリング実験の結果を示す。各標的部位に関し、３つの元来発見されている標的部位の各々に隣接（＋又は−）する８つ以上の異なる２１量体の配列を合成し、そして３用量の各々（１０ｎＭ、１ｎＭ及び０．２ｎＭ）において比較した。図９Ｄはタイリング実験の実験設計を示す。 図１０はタイリング実験におけるｐＲ２Ｌｕｃの使用が高度に強力なｓｉＲＮＡの発見をもたらしたことを示している。ｓｉＲＲＭ２Ａ、ｓｉＲＲＭ２Ｂ、ｓｉＲＲＭ２Ｃはそれぞれ標的部位Ａ（配列番号７及び８を有する）、標的部位Ｂ（配列番号９及び１０を有する）及び標的部位Ｃ（配列番号１１及び１２を有する）に対して指向されたｓｉＲＮＡであり；ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋３及びｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５は元の部位ＢｓｉＲＮＡデュプレックスと比較した場合に増大した力価を有する標的部位Ｂからタイリングされたデュプレックスであり；ＧＴＩ−２０４０はＲ２に対してターゲティングされたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドであり；ｓｉ（ＧＴＩ−２０４０）はＧＴＩ−２０４０アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと同様の部位にターゲティングされたｓｉＲＮＡであり；ｓｉ（ＪＢＣ，２００４）はＲ２に対する以前に公開されたｓｉＲＮＡである。 図１１は標的部位Ｂの周囲（タイリングＢ＋３〜Ｂ＋１０）のデュプレックスを用いた追加的タイリング実験の結果を示す。Ｂ＋５デュプレックスは検討対象として最も強力なデュプレックスのままであり続け、そしてＢ＋９デュプレックスは二番目に強力なデュプレックスとして出現した。 図１２は２１量体及び２７量体のＲＮＡによるＲ２−ルシフェラーゼ融合蛋白の用量依存的ダウンレギュレーションを示す。 図１３はＲ２−ルシフェラーゼ融合のｓｉＲＮＡ誘導ダウンレギュレーションが内因性Ｒ２のダウンレギュレーションに相関することを示している。ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５デュプレックスはｐＲ２Ｌｕｃを用いた同時トランスフェクション試験において高度に強力であるものとして発見された。図に示される通り、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５デュプレックス単独のトランスフェクションはトランスフェクション後１日、２日及び３日において、内因性Ｒ２の配列特異的ノックダウンをもたらした。細胞をｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５又はｓｉＣＯＮ１（Ｄｈａｒａｍａｃｏｎの非ターゲティング対照デュプレックス＃１）２０ｎＭでトランスフェクトした。 図１４はＲ２に対するｓｉＲＮＡがリポフェクションされた細胞のアポトーシスを誘導することを示している。培養されたヒトＨＣＣ細胞（ＨｅｐＧ２）をＲ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５）又は非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ１）でトランスフェクトし、次にトランスフェクションの１、２又は３日後にアポトーシスについて分析した。 図１５はＲ２に対するｓｉＲＮＡがヒトＨＣＣ細胞の薬剤誘導アポトーシスを増強することを示している。培養されたヒトＨＣＣ細胞（ＨｅｐＧ２）をＲ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５）又は非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ１）でトランスフェクトし、その後、３日間アドリアマイシン（１００ｎＭ）を投与した。次にアポトーシスのレベルを測定した。 図１６はＲ２に対するｓｉＲＮＡがインビボのＲ２発現を低減することを示している。Ｒ２−ルシフェラーゼ融合遺伝子をコードするプラスミド（ｐＲ２Ｌｕｃ）をＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＲ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５）又は非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ１）と同時注射した。融合遺伝子発現は全動物バイオルミネセンス画像化により追跡した。図１６Ａは１７日間に渡る融合遺伝子発現の総括的プロットを示す。図１６Ｂは注射後２日において撮影された代表的画像を示す。 図１７はＲ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５）が培養ヒトＨＣＣ細胞（Ｈｅｐ３Ｂ細胞）の成長能力を低減することを示している。ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）の細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）を希釈しながらプレーティングし、そして次に非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ１）又はＲ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５）（５ｎＭ）でトランスフェクトする。トランスフェクションの５日後、細胞を固定し、染色（メチレンブルー）し、そしてコロニー（−５０以上の細胞）を計数する。記載する通り、Ｒ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５）は非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ１）と比較してＨｅｐ３Ｂ細胞のコロニー形成能力を有意に低減する。コラムはｎ＝３連のウエルの平均を示し；エラーバーは標準偏差を示す。 図１８はＲ２に対するｓｉＲＮＡの力価は培養ヒトＨＣＣ細胞（Ｈｅｐ３Ｂ細胞）の成長能力を低減する能力と相関していることを示している。ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）の細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）を希釈しながらプレーティングし、そして次にＲ２に対して種々の力価を有することが予めわかっている５種のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋３、ｓｉＲ２Ｂ＋５、ｓｉＲ２Ｂ＋６、ｓｉＲ２Ｂ＋７、ｓｉＲ２Ｂ＋９）（５ｎＭ）の１つでトランスフェクトした（例えば図１１参照）。トランスフェクションの５日後、細胞を固定し、染色（メチレンブルー）し、そしてコロニー（−５０以上の細胞）を計数する。記載する通り、コロニー形成を低減するｓｉＲＮＡの能力（本図）はＲ２のダウンレギュレーションに関するその力価に強力に相関しており（図１１参照）、例えばｓｉＲ２Ｂ＋３、ｓｉＲ２Ｂ＋５、ｓｉＲ２Ｂ＋９＞＞ｓｉＲ２Ｂ＋６、ｓｉＲ２Ｂ＋７であった。コラムはｎ＝３連のウエルの平均を示し；エラーバーは標準偏差を示す。 図１９はＲ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５）によるＨｅｐ３Ｂ細胞の成育能力の低減が５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）曝露により増強されることを示している。ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）の細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）を希釈しながらプレーティングし、そして次に（１）４時間ルシフェラーゼターゲティングｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ１０５−２１）又はＲ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５）（５ｎＭ）でトランスフェクト、及び／又は（２）トランスフェクション後４８時間から開始して３日間５ｍＭの５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に曝露する。トランスフェクションの５日後、細胞を固定し、染色（メチレンブルー）し、そしてコロニー（−５０以上の細胞）を計数する。前に観察された通り、ｓｉＲ２Ｂ＋５は非Ｒ２ターゲティング対照と比較してコロニー数を低減している（今回Ｌｕｃ１０５−２１）。５−ＦＵ単独（ｓｉＲＮＡ曝露を伴わない）は未投与細胞と比較してコロニー数を低減し、そしてｓｉＲ２Ｂ＋５投与後の５−ＦＵ曝露は更にコロニー数を低減する。コラムはｎ＝３連のウエルの平均を示し；エラーバーは標準偏差を示す。 図２０はＲ２に対するｓｉＲＮＡがマウスにおいて皮下Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍内のＲ２蛋白レベルを低下させることを示している。皮下ヒト肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）腫瘍を有するマウスに重合体系の送達系内において２．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ（非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ１）又はＲ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５）の何れか）を３回連続で毎日腫瘍内（ＩＴ）に注射する。３回目の注射の２日後、マウスを屠殺し、腫瘍を固定し、パラフィン包埋し、切片化し、そして免疫組織化学的（ＩＨＣ）に操作して腫瘍Ｒ２蛋白レベルを試験する。Ｒ２に対するｓｉＲＮＡを含有する製剤を投与されたマウス３匹中２匹において、腫瘍Ｒ２蛋白レベルは、非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡを投与したマウスの場合と比較して急激に低下する。このことは、ｓｉＲ２Ｂ＋５を含有する製剤の３回連続毎日腫瘍内注射はこれ等の腫瘍内においてＲ２蛋白のダウンレギュレーションを達成することを示唆している。採点は以下の尺度、即ち、＋＝低Ｒ２蛋白レベル、＋＋＝中等度Ｒ２蛋白レベル、及び＋＋＋＝高Ｒ２蛋白レベルを用いて実施した。 図２１はＲ２に対するｓｉＲＮＡが培養ラットヘパトーマ細胞（ＭｃＡ−ＲＨ７７７７）におけるＲ２蛋白レベルを低下させることを示している。ラットヘパトーマ細胞（ＭｃＡ−ＲＨ７７７７）をプレーティングし、次にＲ２に対するアンチセンス分子（ＧＴＩ−２０４０；１ｎＭ又は２０ｎＭ）、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ１０５−２１；２０ｍＭのみ）、Ｒ２に対する２１量体のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５；１ｎＭ又は２０ｎＭ）又はＲ２に対する２５／２７量体（ｓｉＲ２Ｂ＋５−２７；１ｎＭ又は２０ｎＭ）でトランスフェクトする。トランスフェクション後４８時間において、細胞を溶解し、Ｒ２蛋白レベルをウエスタンブロットで測定し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエアを用いて定量する。Ｒ２に指向された全ての分子（ＧＴＩ−２０４０アンチセンス、ｓｉＲ２Ｂ＋５の２１量体及び２５／２７量体）は陰性対照（Ｌｕｃ１０５−２１、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ）の場合よりも優れたＲ２蛋白レベルの用量依存的低下を示す。ｓｉＲ２Ｂ＋５の２１量体及び２５／２７量体からのＲ２の低下は相互に同等であり、そしてＧＴＩ−２０４０アンチセンス分子で観察されたものより優れている。 図２２は肝細胞への送達のためのモデル粒子を製造するための方法の模式図である。ガラクトース−ＰＥＧ化合物の存在又は非存在によりガラクトース含有又は単にＰＥＧ化されたビーズがそれぞれ形成される。 図２３はｓｉＲＮＡの送達の為に製造された粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）による粒径分布を示す。図２３（ａ）はモデルビーズＧａｌ−５０に関する粒径分布を示す。図２３（ｂ）は線状シクロデキストリン含有ポリカチオン及びガラクトース含有ＰＥＧ系モディファイアーを用いた自己組立により形成された製剤化ｓｉＲＮＡ粒子に関する粒径分布を示す。 図２４は注射後２０分にマウス尾静脈を介して注入したＧａｌ−５０、ＭｅＯ−５０、Ｇａｌ−１４０及びＭｅＯ−１４０粒子の肝取り込みを示す。 図２５は種々の粒径の粒子の尾静脈注射に付されたマウスに由来する肝切片を示す。左側パネルはＧａｌ−１４０ビーズ（直径１４０ｎｍ）は大部分が肝臓切片には非存在であることを示している（図２５Ａ）。右側パネルはＧａｌ−５０ビーズ（直径５０ｎｍ）は肝臓切片に存在していることを示している（図２５Ｂ）。 図２６はＧａｌ−１４０粒子がクプファー細胞内に位置し、肝細胞内部には到達しないことを示しているＴＥＭ画像である。 図２７はｉｍ−ＣＤＰ（イミダゾール含有ＣＤＰ）を生成するためのＣＤＰ末端基官能性付与の模式図である。 図２８は毒性に対するポリカチオンの疎水性の影響を示す。図示されるＡＰ５のシクロデキストリン成分が細胞毒性を低減している。 図２９はインビトロの細胞へのｓｉＲＮＡ送達のための送達ビヒクルとしてのｉｍ−ＣＤＰを示す。培養されたヒトユーイング肉腫（ＴＣ−７１）細胞を４時間オリゴフェクタミン（ＯＦＡ）又はシクロデキストリン含有ポリカチオン（ｉｍ−ＣＤＰ）を用いて作成したｓｉＥＦＢＰ２含有製剤（ＥＷＳ−ＦＬＩ１融合蛋白をターゲティングするための配列）に曝露した。感染の４８時間後、細胞を溶解し、全細胞蛋白を変性し、電気泳動に付し、そしてＰＶＤＦメンブレンに転移させ、これをＥＷＳ−ＦＬＩ１又はアクチンに対する抗体でプロービングし、そしてウエスタンブロット分析による定量を行った。平均バンド強度は密度測定により求め、そしてＥＷＳ−ＦＬＩ１のアクチンに対する強度の比を計算した。ｓｉＥＦＢＰ２ｍｕｔは陰性対照として使用したスクランブルドｓｉＥＦＢＰ２ｓｉＲＮＡである。 図３０はＣＤＰ／ｐＤＮＡ（パネルａ、ｃ及びｄ）又はｉｍ−ＣＤＰ／ｐＤＮＡ（パネルｂ、ｅ及びｆ）のポリプレックスに曝露したＢＨＫ細胞のＴＥＭ画像である。（ａ）及び（ｂ）において、細胞内小胞は細胞膜に接近し、低ｐＨではない。（ｃ〜ｆ）においては、小胞は核膜の近傍にあり、ｆに近似したｐＨ値にある。（ｅ）及び（ｆ）においては、複合体脱パッケージングが観察されるのに対し、（ｃ）及び（ｄ）においては観察されない。 図３１はシクロデキストリン含有ポリプレックス表面改変（例えばＰＥＧ化又はターゲティング）及びアダマンタン（ＡＤ）−ＰＥＧコンジュゲート及びβ−シクロデキストリンを用いた封入複合体形成の模式図である。図３１Ａはシクロデキストリン含有ポリプレックス表面改変の模式図を示す。図３１Ｂはアダマンタン（ＡＤ）−ＰＥＧコンジュゲート（系の第２の成分）及びβ−シクロデキストリンを用いた封入複合体形成の模式図である。リガンド（Ｌ）は細胞表面受容体との相互作用に供する。改変された粒子は明確に識別され、インビトロのトランスフェクション並びにインビボの試験の為に使用される条件に対して安定である。 図３２は図３１に示した成分の改変の例を示す。グルコースモディファイアーをガラクトースターゲティング試験のための対照として使用する。 図３３は５０ｍＭ塩溶液中のポリプレックス粒子の安定化を示す。完全な安定化はＡＤ−ＰＥＧ５Ｋ（ＰＥＧ５Ｋは分子量５０００のＰＥＧを意味する）を用いた場合に達成される。ＰＥＧ５Ｋの添加（対照）は如何なる安定化ももたらさない。粒径の増大は粒子の再構造化に起因するものではなく、むしろ６０ｎｍ原料粒子の凝集である（ＴＥＭ画像により確認）。 図３４はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の添加前にＣＤＰとＡＤ−ＰＥＧ５０００（ＡＤ−ＰＥＧ５Ｋ）を組み合わせることにより形成される粒子の粒径を示す。粒子はＰＢＳ中に希釈された１ｍｇＤＮＡ／ｍＬにおいて製剤した。１０００倍超の希釈度による１５０ｍＭ塩中の完全な安定化はＡＤ−ＰＥＧ５Ｋを用いた場合に達成される。 図３５は記載した種々のポリプレックスを用いたルシフェラーゼ遺伝子の送達を示す。（ａ）表面アシアロ糖蛋白（ＡＳＧＰ）受容体を含有するＨｅｐＧ２細胞。（ｂ）表面受容体を含有しないＨｅＬａ細胞。細胞の取り込みは表面受容体を介して媒介され得る。 図３６は改変剤においてアニオン性のセグメントを使用することによる粒子上のチューニング可能な表面電荷の例を示す。１００％ＡＤ−アニオン性ＰＥＧは系におけるアダマンタン（ＡＤ）のシクロデキストリン（ＣＤ）に対する１：１モル比を示す。 図３７はポリプレックス粒子の自己組立の模式図である。 図３８は１時間後の種々のポリプレックス粒子の培地（Ａ）又は１００％ＦＢＳ（Ｂ）中の濁度試験を示す。未ＰＥＧ化ポリプレックスが凝集するのに対し、ＰＥＧ化ポリプレックスは製剤時又は未結合成分除去後に凝集しない。 図３９は完全に製剤された粒子が補体系を活性化しないことを示す。ＣＤＰＰＥＧＴｆは３．１８又は５．３（＋／−）の何れかの電荷比を有する完全に製剤された粒子を指す。 図４０はＣＤＰが培養中の細胞にｓｉＲＮＡを送達することを示す。図４０ＡはＨｅＬａ細胞におけるネイキッド及びＣＤＰ製剤のＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡのＦＡＣＳ分析を示す（１００ｎＭのｓｉＲＮＡを２時間ＨｅＬａ細胞に曝露した）。図４０ＢはＨｅＬａ細胞におけるＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡのＣＤＰ送達の共焦点画像を示す（１００ｎＭのｓｉＲＮＡを４時間ＨｅＬａ細胞に曝露した）。 図４１は高圧尾静脈注射（ＨＰＴＶ；２ｍＬ容量を注射）又は低圧尾静脈注射（ＬＰＴＶ；０．２ｍＬ容量を注射）による異なる送達製剤中のｓｉＲＮＡ５０μｇを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスから得られた定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を比較したものである。 図４２はｓｉＲＮＡの送達のためのトランスフェリン（Ｔｆ）−ターゲティング粒子の組立を示す。図４２Ａは送達系の成分を示す。図４２Ｂは未ターゲティング及びターゲティングされた粒子の組立を示す。 図４３はトランスフェリン（Ｔｆ）−含有粒子によるルシフェラーゼに対抗したｓｉＲＮＡの送達を示す。 図４４は記載した種々の投与に付したＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおける移植された腫瘍の成長曲線を示す。各投与群［ｎ＝８〜１０］に関するメジアン積分腫瘍バイオルミネセントシグナル（光子／秒）を注射後の時間に対してプロットしている（全て５０μｇ ｓｉＲＮＡにおいて）。群：（Ａ）対照Ｄ５Ｗ、（Ｂ）ネイキッドｓｉＥＦＢＰ２、（Ｃ）対照配列を用いて完全に製剤（ＣＯＮ＃１）、（Ｄ）ｓｉＥＦＢＰ２を用いて完全に製剤、及び（Ｅ）ｓｉＥＦＢＰ２を用いてトランスフェリンリガンドは使用せずに製剤。 図４５はｓｉＲＮＡによるＴｆ含有粒子（左側パネル）における腫瘍成長の阻害及びｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの配列特異的阻害を示す。図４５ＡはＴｆ含有粒子におけるＥＷＳ−ＦＬＩ１に関する５０μｇ ｓｉＲＮＡの３回毎日注射（第３４日、３５日、３６日）を用いた樹立ＴＣ−７１腫瘍を用いた腫瘍成長の阻害を示す。図４５ＢはＥＷＳ−ＦＬＩ１−ｍＲＮＡの配列特異的阻害を示す２回毎日注射後の腫瘍から得られたＰＣＲデータを示す。
（本出願の詳細な説明）
概説
リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）のＲ２サブユニットは、Ｒ２発現が細胞周期全体に渡って調節され、Ｒ２は必須な遺伝子であると考えられ（Ｋｉｔｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１０３６−１０４０）、そして、Ｒ２蛋白の構造が報告されている（Ｃｅｒｑｕｅｒｉａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２：１２８３）ことから、望ましい治療標的である。細胞周期全体に渡って比較的一定のレベルにおいて過剰であるＲＮＲのＲ１サブユニットとは対照的に、Ｒ２の合成は早期のＳ期に開始し、そして細胞内で緩徐に蓄積し、後期の有糸分裂において急速に分解する。Ｒ２の発現は種々のヒト組織及び腫瘍細胞系統（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６３：６５８３−６５９４）において検出されている。特定の組織において、Ｒ２発現はそのような組織の正常細胞においては検出可能なレベル未満であるが、そのような組織の異常な（例えば腫瘍又は癌性の）細胞においては検出可能又は増量となる。例えば、Ｒ２発現は正常な肝細胞においてはウエスタンブロット又は免疫染色によればほぼ検出不能であるが、肝細胞癌においては検出することができる（図３）。従って、Ｒ２の阻害は細胞増殖に関連する疾患又は障害、例えば癌、病原体感染等を治療するためには有用である。
Ｒ２の阻害は細胞におけるＲ２の生物学的活性、例えばその酵素活性を阻害することにより達成してよい。或いは、Ｒ２の阻害は細胞におけるＲ２遺伝子の発現を阻害することにより達成してよい。小分子及び核酸はＲ２の活性及び／又は発現をダウンレギュレーションするために使用される。例示されるものは、ペプチド又はペプチド誘導体である２量化阻害剤（例えば米国特許第６，０３０，９４２号又は米国特許第４，８４５，１９５号に記載のペンタペプチドＶａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ）、触媒性阻害剤（例えばフリーラジカルスカベンジャー又は鉄キレート形成剤）、アンチセンス分子（例えばＧＴＩ−２０４０、Ｌｏｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、Ｌｉｎ ｅｔ
ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２７０３０及びＤｕｘｂｕｒｙ
ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２８：１５３９に記載のｓｉＲＮＡ分子を含む。しかしなお、新規で向上したＲ２阻害剤はＲ２をダウンレギュレートするための新しい手段として必要とされ続けている。
核酸Ｒ２阻害剤
特定の特徴において、本出願はＲ２遺伝子の核酸阻害剤、及び、例えばＲ２遺伝子の発現を低減又はダウンレギュレートすることによりＲ２遺伝子又は蛋白の活性を阻害又は低減するための方法を提供する。「阻害する」又は「低減する」とは、遺伝子の発現、又は、核酸又は１つ以上の蛋白又は蛋白サブユニットをコードする等価な核酸のレベルが本出願の核酸剤の非存在下で観察されるものよりも低値に低減されることを意味する。
本明細書においては、「核酸」又は「核酸剤」という用語は、ヌクレオチドを含有し、そしてＲ２遺伝子に対する所望の作用を有する何れかの核酸系の化合物を指す。核酸は１本鎖、２本鎖又は多重鎖であることができ、そして、改変された、又は未改変のヌクレオチド又は非ヌクレオチド又は種々の混合物及びそれらの組合せを含むことができる。本出願の核酸剤の例は限定しないが、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び酵素的核酸を含む。
特定の実施形態においては、本出願は真核生物又は原核生物を含む１つ以上の種に由来するＲ２遺伝子又はｍＲＮＡにターゲティングされる核酸阻害剤を提供する。特定の実施形態においては、核酸阻害剤は特定の種に由来するＲ２遺伝子又はｍＲＮＡ配列の発現を特異的に阻害するが、他の種に由来するＲ２遺伝子又はｍＲＮＡの発現は阻害しないように設計してよい。例えば、病原体感染の治療の為に有用な核酸阻害剤は病原体におけるＲ２遺伝子又はｍＲＮＡの発現を特異的に阻害するが、宿主のＲ２遺伝子又はｍＲＮＡの発現は阻害しないように設計してよい。細菌感染の治療の為に有用な核酸阻害剤は、原核生物のＲ２遺伝子又はｍＲＮＡの発現を阻害してよいが、真核生物のＲ２遺伝子又はｍＲＮＡの発現は阻害しない。幾つかの種に由来するＲ２ｃＤＮＡ配列の例を図１及び２に示す。
特定の実施形態においては、本出願はＲ２遺伝子内の特定の領域１つ以上にターゲティングされているＲ２遺伝子の核酸阻害剤を提供する。ヒトＲ２遺伝子内の例示される領域は以下の表１に示されるコア標的領域を含む（図１も参照）。コア標的配列は一般的には例えばｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び酵素的核酸のような阻害剤核酸による配列特異的結合によりＲ２発現を効果的に阻害する標的Ｒ２遺伝子又は相当するｍＲＮＡの一部分を指す。一般的に、核酸阻害剤は、コア標的配列を含むＲ２蛋白の領域、又は、例えば片方又は両方の末端のコア標的部位＋／−５、＋／−１０又は＋／−２０ヌクレオチドのような、Ｒ２遺伝子又はｍＲＮＡ配列内のコア標的領域の片方又は両方の末端にフランキングする５、１０又は２０ヌクレオチドを含むＲ２遺伝子又はｍＲＮＡの一部分に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる。表１に示すコア標的配列はヒトＲ２配列から得たが、他の種、例えば他の真核生物、例えば他の哺乳類に由来するＲ２配列内の等価な領域も本発明は意図している。
（表１．Ｒ２のコア標的配列）
Figure 2012153732
 ｄｓＲＮＡ及びＲＮＡｉコンストラクト
特定の実施形態においては、本出願は２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）及びＲＮＡｉコンストラクトに関する。「ｄｓＲＮＡ」という用語は本明細書においては、ｓｉＲＮＡを含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が可能な２本鎖ＲＮＡ分子を指す（例えばＢａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；及びＫｒｅｕｔｚｅｒ等のＰＣＴ公開ＷＯ００／４４８９５；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ等のＰＣＴ公開ＷＯ０１／３６６４６；ＦｉｒｅのＰＣＴ公開ＷＯ９９／３２６１９；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ等のＰＣＴ公開ＷＯ００／０１８４６；Ｍｅｌｌｏ及びＦｉｒｅのＰＣＴ公開ＷＯ０１／２９０５８；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−ＤｅｐａｉｌｌｅｔｔｅのＰＣＴ公開ＷＯ９９／０７４０９；及びＬｉ等のＰＣＴ公開ＷＯ００／４４９１４を参照）。更に又、ＲＮＡｉは当初は２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が特異的な転写後の態様において遺伝子発現をブロックする植物及び蠕虫において観察される現象に適用されていた用語である。ＲＮＡｉはインビトロ又はインビボの遺伝子発現を阻害又は低減する有用な方法である。
「短鎖干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」又は「短鎖干渉核酸」という用語は本明細書においては、細胞により適切にプロセシングされた場合にＲＮＡｉ又は遺伝子サイレンシングを媒介することができる何れかの核酸を指す。例えば、ｓｉＲＮＡは自己相補のセンス及びアンチセンスの領域を含む２本鎖ポリヌクレオチド分子であることができ、ここでアンチセンス領域は標的遺伝子に対する相補性を含む。ｓｉＲＮＡは自己相補センス及びアンチセンス領域を有する１本鎖ヘアピンポリヌクレオチドであることができ、ここで、アンチセンス領域は標的遺伝子に対する相補性を含む。ｓｉＲＮＡは２つ以上のループ構造及び自己相補センス及びアンチセンス領域を含むステムを有する環状１本鎖ポリヌクレオチドであることができ、ここで、アンチセンス領域は標的遺伝子に対する相補性を含み、そして環状ポリヌクレオチドはインビボ又はインビトロの何れかでプロセシングされてＲＮＡｉを媒介できる活性なｓｉＲＮＡを形成することができる。ｓｉＲＮＡは標的遺伝子への相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドを含むことができ、ここで１本鎖ポリヌクレオチドは更に末端のホスフェート基、例えば５’−ホスフェート（例えばＭａｒｔｉｎｅｚ
ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ，１１０，５６３−５７４参照）又は５’，３’−ジホスフェートを含むことができる。特定の実施形態においては、ｓｉＲＮＡは標的核酸に結合して標的核酸の活性を改変する非酵素性の核酸である。ｓｉＲＮＡの結合及び／又は活性はＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（即ちＲＩＳＣ）のような１つ以上の蛋白又は蛋白複合体との相互作用により促進してよい。特定の実施形態においては、ｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖の単一の隣接配列に沿って標的配列に相補な配列を含む。
場合により、本出願のｓｉＲＮＡは阻害すべき遺伝子（「標的」遺伝子）に関するｍＲＮＡ転写産物の少なくとも１部分のヌクレオチド配列に生理学的条件下（例えば細胞環境において）ハイブリダイズするヌクレオチド配列を含有する。２本鎖ＲＮＡはそれがＲＮＡｉを媒介する能力を有するために十分天然のＲＮＡと同様であることのみを必要とする。即ち、本出願は遺伝子突然変異、系統の多形又は進化的分岐により予測される配列の変異を耐容できるという利点を有する。標的配列とｓｉＲＮＡ配列の間の耐容されるヌクレオチドのミスマッチの数は５塩基対中１、又は１０塩基対中１、又は２０塩基対中１つ、又は５０塩基対中１つ未満である。ｓｉＲＮＡデュプレックスの中心におけるミスマッチは最も重要であり、標的ＲＮＡの切断を本質的に根絶する場合がある。これとは対照的に、標的ＲＮＡに相補なｓｉＲＮＡ鎖の３’末端のヌクレオチドは標的認識の特異性には大きく寄与しない。配列同一性は当該分野で知られた配列比較及びアライメントアルゴリズム（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９１及びその引用文献参照）及び例えばデフォルトパラメーターを用いたＢＥＳＴＦＩＴソフトウエアプログラムにおいて実施されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによるヌクレオチド配列間のパーセント相違の計算（例えばウィスコンシン大学遺伝子計算グループ）により最適化してよい。ｓｉＲＮＡと標的遺伝子の部分との間の９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％超の配列同一性、又は、更には１００％の配列同一性が好ましい。或いは、ＲＮＡのデュプレックス領域は機能的にはストリンジェントな条件下（例えば４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃ハイブリダイゼーションを１２〜１６時間；その後洗浄）に標的遺伝子転写産物の一部分とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列として定義してよい。
ｄｓＲＮＡの２本鎖構造は単一の自己相補ＲＮＡ鎖、２つの相補ＲＮＡ鎖、又は、ＤＮＡ鎖及び相補ＲＮＡ鎖により形成してよい。場合によりＲＮＡデュプレックス形成は細胞の内部又は外部のいずれかにおいて開始してよい。ＲＮＡは細胞当たり少なくとも１コピーの送達を可能にする量において導入してよい。より高用量（例えば細胞当たり少なくとも５、１０、１００、５００又は１０００コピー）の２本鎖物質はより効果的な阻害をもたらすが、特定の用途にはより低用量でも有用である場合がある。阻害はＲＮＡのデュプレックス領域に相当するヌクレオチド配列が阻害の為にターゲティングされるという点において配列特異的である。
本明細書に記載する通り、発明要件のｓｉＲＮＡは約１９〜３０ヌクレオチド長、約２１〜２７ヌクレオチド長、約２１〜２５ヌクレオチド長、又は、約２１〜２３ヌクレオチド長のデュプレックス領域を含む。ｓｉＲＮＡはヌクレアーゼ複合体をリクルートし、そして、特異的配列との対形成により標的遺伝子転写産物まで複合体を案内すると理解される。結果として、標的遺伝子転写産物は蛋白複合体内のヌクレアーゼにより分解される。特定の実施形態においては、ｓｉＲＮＡ分子は３’ヒドロキシル基を含む。特定の実施形態においては、ｓｉＲＮＡコンストラクトは例えば酵素ダイサーの存在下により長い２本鎖ＲＮＡをプロセシングすることにより形成することができる。１つの実施形態において、ショウジョウバエのインビトロの系を使用する。この実施形態においては、ｄｓＲＮＡをショウジョウバエから誘導した可溶性抽出物と組合せ、これにより複合物を形成する。複合物はｄｓＲＮＡが約２１〜約２７ヌクレオチドのＲＮＡ分子にまでプロセシングされるような条件化に維持する。ｓｉＲＮＡ分子は当該分野で知られた多くの手法を用いて精製できる。例えばゲル電気泳動を用いてｓｉＲＮＡを精製できる。或いは、非変性の方法、例えば非変性カラムクロマトグラフィーを用いてｓｉＲＮＡを精製できる。更に又、クロマトグラフィー（例えばサイズエクスクルージョンクロマトグラフィー）、グリセロール勾配遠心分離、抗体を用いたアフィニティー精製を使用することによりｓｉＲＮＡを精製できる。
要件のｄｓＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）の製造は化学合成法によるか、又は、組み換え核酸手法により実施できる。投与細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼはインビボの転写を媒介する場合があり、或いは、クローニングされたＲＮＡポリメラーゼをインビトロの転写の為に使用できる。本明細書においては、本出願のｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡのみを含有する分子に限定する必要はなく、むしろ化学改変されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドも含む。例えば、ｄｓＲＮＡは例えば細胞ヌクレアーゼに対する感受性を低減するため、生体利用性を向上させるため、製剤特性を向上させるため、及び／又は他の薬物動態特性を変化させるために、ホスフェート−糖骨格又はヌクレオシドの何れかの改変も含んでよい。例示すれば、天然のＲＮＡのホスホジエステル連結部を改変して少なくとも１つの窒素又はイオウのヘテロ原子が含まれるようにしてよい。ＲＮＡ構造の改変はｄｓＲＮＡへの全般的応答を回避しつつ、特定の遺伝子の阻害が可能となるように適宜調節してよい。同様に塩基を改変することによりアデノシンデアミナーゼの活性をブロックしてよい。ｄｓＲＮＡは酵素的に、又は、部分的／全体的有機合成により製造してよく、何れかの改変されたリボヌクレオチドをインビボの酵素的又は有機合成により導入できる。ＲＮＡ分子を化学改変する方法をｄｓＲＮＡを改変するために採用することができる（例えばＨｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：７７６−７８０；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇ．７：８９−９８；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２６６１−２６６８；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７：５５−６１を参照）。単に例示すれば、ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの骨格をホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホジチオエート、キメラメチルホスホネート−ホスホジエステル、ペプチド核酸、５−プロピニル−ピリミジン含有オリゴマー又は糖改変（例えば２’−置換リボヌクレオシド、ａ配置）を用いて改変できる。特定の場合において、本出願のｄｓＲＮＡは２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠失している。特定の実施形態においては、ｓｉＲＮＡ分子はホスホロチオエートセンス鎖を含む。特定の実施形態においては、ｓｉＲＮＡ分子はホスホジエステルアンチセンス鎖を含む。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖は約１〜約１０ヌクレオチド長、約１〜５ヌクレオチド長、約１〜３ヌクレオチド長、又は約２〜４ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有する。特定の実施形態においては、ｓｉＲＮＡは３’オーバーハングを有する１つの鎖を含んでよく、そしてもう一方の鎖は３’末端でブラント末端となっている（例えば３’オーバーハングを有さない）。別の実施形態においては、ｓｉＲＮＡは両方の鎖に３’オーバーハングを含んでよい。オーバーハングの長さは各鎖につき同じかまたは異なっていてよい。ｓｉＲＮＡの安定性を更に増強するためには、３’オーバーハングは分解に対して安定化させることができる。１つの実施形態において、ＲＮＡはプリンヌクレオチド、例えばアデノシン又はグアノシンヌクレオチドを含めることにより安定化される。或いは、ピリミジンヌクレオチドの改変類縁体による置換、例えば２’−デオキシチミジンによるウリジンヌクレオチド３’オーバーハングの置換は耐容性を示し、そしてＲＮＡｉの効率に影響しない。２’ヒドロキシルが非存在であることは、組織培養の培地におけるオーバーハングのヌクレアーゼ耐性を大きく増強し、そしてインビボで有益である場合がある。
別の特定の実施形態においては、要件のｄｓＲＮＡはまた長い２本鎖ＲＮＡの形態であることができる。例えば、ｄｓＲＮＡは少なくとも２５、５０、１００、２００、３００又は４００塩基である。一部の場合においては、ｄｓＲＮＡは４００〜８００塩基長である。場合により、ｄｓＲＮＡは例えば細胞内でｓｉＲＮＡ配列を生成するために細胞内で消化される。しかしながら、インビボの長２本鎖ＲＮＡの使用は、恐らくは配列非依存性のｄｓＲＮＡ応答により誘発される場合がある有害な作用の為に、常時現実的であるわけではない。そのような実施形態においては、インターフェロン又はＰＫＲの作用を低減する局所送達系及び／又は薬剤の使用が好ましい。
別の特定の実施形態においては、ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡはヘアピン構造（又はヘアピンＲＮＡ）の形態である。ヘアピンＲＮＡは外因性に合成することができ、或いは、インビボＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター転写により形成できる。哺乳類細胞における遺伝子サイレンシングのためのそのようなヘアピンＲＮＡの作成及び使用の例は例えばＰａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００２，１６：９４８−５８；ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８：３８−９；ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，２００２，８：８４２−５０；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２，９９：６０４７−５２に記載されている。好ましくは、このようなヘアピンＲＮＡを細胞内又は動物内で操作することにより標的遺伝子の持続的で安定な抑制を確保する。ｓｉＲＮＡは細胞内でヘアピンＲＮＡをプロセシングすることにより生成できることが当該分野で知られている。
ＰＣＴ出願ＷＯ０１／７７３５０はトランスジーンの二重指向性転写により真核生物の細胞において同じトランスジーンのセンス及びアンチセンスＲＮＡ転写産物の両方を生じさせるための例示されるベクターを記載している。従って、特定の実施形態においては、本出願は以下の独特な特徴を有する、即ち、逆方向に配置した２つのオーバーラップ転写単位を有し、そして、目的のｄｓＲＮＡに関するトランスジーンにフランキングしているウィルスレプリコンを含み、ここで２つのオーバーラップ転写単位は宿主細胞内で同じトランスジーンフラグメントからセンス及びアンチセンスのＲＮＡ転写産物の両方を生じさせる組み換えベクターを提供する。
例示される実施形態においては、本出願は上記表１に示すコア標的配列、又は、片側又は両側でコア標的配列にフランキングしている＋／−５、＋／−１０又は＋／−２０ヌクレオチドを有するコア標的配列に相当するＲ２遺伝子又はｍＲＮＡの領域に相当する領域に指向されたｓｉＲＮＡを提供する。種々の例示されるｓｉＲＮＡデュプレックスの配列を以下の表２〜８に示す。
（表２．標的部位Ａ、Ｂ及びＣに指向されたｓｉＲＮＡデュプレックス。下線残基は３’オーバーハングを示す。）
Figure 2012153732
 上記表２に示した３種の２１量体の相当する２７量体のｓｉＲＮＡもまた提供される。より詳細には、「２７Ｒ」及び「２７Ｌ」変異体はＲ２発現のダウンレギュレーションにおいてより強力である場合がある。Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｄｓＲＮＡ Ｄｉｃｅｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ ＲＮＡｉ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３：２２２−２２６（２００５）；Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌａｒｉｔｙ ｉｓ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｄｉｃｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｓｈｏｒｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ＲＮＡｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３（１３）：４１４０−５６（２００５）を参照できる。「Ｒ」２７量体は初期標的配列の右側（標的に対して３’）に伸長する追加的塩基を有し、「Ｌ」２７量体は初期標的配列の左側（標的に対して５’）に伸長する追加的塩基を有する。２７量体ｓｉＲＮＡの例は以下の表３に示す。
（表３．上記表２に示す２１量体ｓｉＲＮＡに相当する２７量体ｓｉＲＮＡ。大文字はＤＮＡ残基を示し、小文字はＲＮＡ残基を示し、［５’ｐｈｏｓ］は５’ホスフェートを示し、そして下線を付した残基は３’オーバーハングを示す。）
Figure 2012153732
 本出願はまたコア標的配列の−２０〜＋２０塩基内又は本出願のｓｉＲＮＡの−１０〜＋１０塩基内でターゲティングするｓｉＲＮＡを提供する。例えば、３種の２１量体のｓｉＲＮＡの各々の−５〜＋５塩基内に標的部位を有する２１量体デュプレックスが示されるか、又は、３種のコア標的配列の各々の−１０〜＋１０塩基が以下の表４〜８において示される。
（表４．標的部位Ａに対して指向され、ｓｉＲＲＭ２ＡｓｉＲＮＡデュプレックスの−５〜＋５塩基からタイリングされたｓｉＲＮＡデュプレックス。下線を付した残基は３’オーバーハングを示す。）
Figure 2012153732
Figure 2012153732
 （表５．標的部位Ｂに対して指向され、ｓｉＲＲＭ２ＢｓｉＲＮＡデュプレックスの−５〜＋５塩基からタイリングされたｓｉＲＮＡデュプレックス。下線を付した残基は３’オーバーハングを示す。）
Figure 2012153732
Figure 2012153732
 （表６．標的部位Ｃに対して指向され、ｓｉＲＲＭ２ＣｓｉＲＮＡデュプレックスの−５〜＋５塩基からタイリングされたｓｉＲＮＡデュプレックス。下線を付した残基は３’オーバーハングを示す。）
Figure 2012153732
Figure 2012153732
Figure 2012153732
 これ等の２１量体デュプレックスの相当する２７量体（「２７Ｒ」又は「２７Ｌ」）変異体もまた提供される。例を以下の表７に示す。
（表７．ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５ｓｉＲＮＡデュプレックスに相当する２７量体（又は２５／２７量体）ｓｉＲＮＡ。下線を付した残基は３’オーバーハングを示す。）
Figure 2012153732
 表８はコア標的配列の−２０〜＋２０塩基内又は本出願のｓｉＲＮＡの−１０〜＋１０塩基内でターゲティングするｓｉＲＮＡの例を示す。
（表８．標的部位Ｂに対して指向され、ｓｉＲＲＭ２ＢｓｉＲＮＡデュプレックスの＋６〜＋１０塩基からタイリングされたｓｉＲＮＡデュプレックス。下線を付した残基は３’オーバーハングを示す。）
Figure 2012153732
 酵素核酸
特定の実施形態においては、本出願はＲ２遺伝子又はｍＲＮＡの発現を阻害する酵素核酸に関する。例示される酵素核酸は上記表１に示したコア標的配列の１つにターゲティングされるもの、又はコア標的配列の片方又は両方にフランキングする５、１０又は２０ヌクレオチドを有するコア標的配列を含む領域を含む。「酵素核酸」とは、特定の標的遺伝子に対して基質結合領域において相補性を有し、そして更に標的核酸を特異的に切断する作用を示す酵素活性を有する核酸を意味する。酵素核酸は核酸を分子相互で切断することにより標的核酸を不活性化することができると理解される。これ等の相補領域は標的核酸への酵素核酸の十分なハイブリダイゼーションを可能にし、これにより切断が可能となる。１００パーセントの相補性（同一性）が好ましいが、５０〜７５％もの低値の相補性もまた本出願においては有用であることができる（例えばＷｅｒｎｅｒ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３，２０９２−２０９６；Ｈａｍｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，９，２５−３１参照）。酵素核酸は塩基、糖及び／又はホスフェート基において改変できる。本明細書に記載する通り、「酵素核酸」という用語はリボザイム、触媒ＲＮＡ、酵素ＲＮＡ、触媒ＤＮＡ、アプタザイム又はアプタマー結合リボザイム、調節可能なリボザイム、触媒オリゴヌクレオチド、ヌクレオザイム、ＤＮＡザイム、ＲＮＡ酵素、エンドリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ミニザイム、リードザイム、オリゴザイム又はＤＮＡ酵素のような表現と互換的に使用する。これらの用語は全て、酵素活性を有する核酸を説明するものである。本出願において記載する特定の酵素核酸は出願において限定されるものではなく、当業者の知る通り、本出願の酵素核酸において重要な点は、それが標的核酸領域の１つ以上に相補である特異的基質結合部位を有すること、及び、それがその基質結合部位の内部又は周囲に分子に核酸切断及び／又はライゲーション活性を付与するヌクレオチド配列を有することのみである（Ｃｅｃｈ等、米国特許第４，９８７，０７１号；Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８，２６０ＪＡＭＡ３０３０）。
天然に存在する酵素核酸の数種類が現在知られている。各々は生理学的条件下にてトランスに結合している核酸ホスホジエステルの加水分解を触媒することができる（そしてそのため他の核酸を切断できる）。一般的に酵素核酸は最初に標的核酸に結合することにより作用する。そのような結合は標的核酸を切断する作用を有する分子の酵素部分に近接して保持されている酵素核酸の標的結合部分を介して生じる。即ち、酵素核酸は標的核酸を先ず認識し、次に相補塩基対形成を介して結合し、そして正しい部位に結合した後は標的核酸を切断するために酵素的に作用する。このような標的核酸の戦略的切断はコードされた蛋白の合成を指向するその能力を破壊することになる。酵素核酸が結合し、その核酸標的を切断した後、それはその核酸から遊離し、別の標的を探し、そして新しい標的に反復的に結合して切断することができる。
特定の実施形態において、要件の酵素核酸はｍＲＮＡの翻訳を防止するためにＲ２ｍＲＮＡを触媒的に切断するように設計されたリボザイムである（例えば１９９０年１０月４日公開のＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４；Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１２２２−１２２５；及び米国特許第５，０９３，２４６号参照）。部位特異的認識配列においてｍＲＮＡを切断するリボザイムを特定のｍＲＮＡを破壊するために使用できるが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは標的ｍＲＮＡと相補塩基対を形成する領域にフランキングすることにより決定される位置においてｍＲＮＡを切断する。唯一の条件は以下の２塩基配列、即ち５’−ＵＧ−３’を標的ｍＲＮＡが有することである。ハンマーヘッドリボザイムの構築及び製造は当該分野で良く知られており、そして、Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８８、Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５８５−５９１においてより詳細に説明されている。本出願のリボザイムはまたＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以後「Ｃｅｃｈ型リボザイム」と称する）、例えばテトラヒメナ・サーモフィリア中に天然に存在（ＩＶＳ又はＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡとして知られる）し、広く報告されているもの（例えばＺａｕｇ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：５７４−５７８；Ｚａｕｇ ａｎｄ
Ｃｅｃｈ，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１：４７０−４７５；Ｚａｕｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２４：４２９−４３３；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｔｅｎｔｓ Ｉｎｃ．の公開国際特許出願ＷＯ８８／０４３００；Ｂｅｅｎ ａｎｄ Ｃｅｃｈ，１９８６，Ｃｅｌｌ，４７：２０７−２１６）を含む。
別の特定の実施形態において、要件の酵素核酸はＤＮＡ酵素である。ＤＮＡ酵素はアンチセンス及びリボザイムの手法の両方の機械的特徴の一部を組み込んでいる。ＤＮＡ酵素はアンチセンスオリゴヌクレオチドのような特定の標的核酸配列を認識するように設計されるが、リボザイムと同様、それらは触媒的であり、そして標的核酸を特異的に切断する。概すれば、標的核酸を特異的に認識して切断する理想的なＤＮＡ酵素を設計するためには、当業者は先ず独特の標的配列を発見しなければならない。好ましくは、独特の、又は実質的には、配列は約１８〜２２ヌクレオチドのＧ／Ｃリッチである。高いＧ／Ｃ含有量はＤＮＡ酵素と標的遺伝子配列の間のより強力な相互作用を確保する。ＤＮＡ酵素を合成する場合、酵素をメッセージにターゲティングする特定のアンチセンス認識配列は、それがＤＮＡ酵素の２アームを含み、そしてＤＮＡ酵素ループが２つの特異的なアームの間に位置するように分割する。ＤＮＡ酵素を製造し、そして投与する方法は例えば米国特許第６，１１０，４６２号に記載されている。
特定の実施形態においては、本出願の核酸剤は１２〜２００ヌクレオチド長であることができる。１つの実施形態において、本出願の例示される酵素核酸は１５〜５０ヌクレオチド長、例えば２５〜４０ヌクレオチド長である（例えばＪａｒｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２９１０７−２９１１２参照）。別の実施形態においては、本出願の例示されるアンチセンス分子は１５〜７５ヌクレオチド長、例えば２０〜３５ヌクレオチド長である（例えばＷｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＰＮＡＳ．，８９，７３０５−７３０９；Ｍｉｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，５３７−５４１参照）。別の実施形態においては本出願の例示されるｓｉＲＮＡは２０〜３０ヌクレオチド長、例えば２１〜２７ヌクレオチド長である。当業者の知る通り、要件の核酸剤は本明細書において意図するその活性の為に十分でありかつ適している長さ及びコンホーメーションのものであることが必要となるのみである。本出願の核酸剤の長さは、記載した一般的な限度内に限定されない。
核酸剤の合成
１００ヌクレオチド長を超える核酸の合成は自動化方法を用いた場合は困難であり、そしてそのような分子の治療上の費用は法外なものとなる。本出願においては、小型核酸モチーフ（小型とは約１００ヌクレオチド長未満、好ましくは約８０ヌクレオチド長未満、より好ましくは約５０ヌクレオチド長未満の核酸モチーフ（例えば酵素核酸及びＲＮＡｉコンストラクト））を外因性送達の為に好ましく使用する。これ等の分子の単純な構造はＲＮＡ構造のターゲティングされた領域に侵入する核酸の能力を増大させる。
本出願の例示される核酸阻害剤分子、例えばＲＮＡ及びＤＮＡ分子は化学合成できる。説明すれば、オリゴヌクレオチド（例えばＤＮＡ）をＣａｒｕｔｈｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１：３−１９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ ９９／５４４５９，Ｗｉｎｃｏｔｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２６７７−２６８４；Ｗｉｎｃｏｔｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７４：５９；Ｂｒｅｎｎａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．６１：３３−４５；及びＢｒｅｎｎａｎの米国特許第６，００１，３１１号に記載の通り当該分野で知られたプロトコルを用いて合成する。オリゴヌクレオチドの合成は共通の核酸保護及びカップリング基、例えば５’末端のジメトキシトリチル及び３’末端のホスホロアミダイトを使用する。非限定的な例においては、小規模の合成を３９４Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．の合成装置上で、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドに対しては２．５分のカップリング工程、そして２’−デオキシヌクレオチドに対しては４５秒のカップリング工程を用いて実施する。或いは、合成は９６穴プレート合成装置、例えばＰｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造された装置上で、サイクルに最小限の修正を加えながら実施できる。
場合により、本明細書の核酸の部分は別個に合成し、そして合成後に、例えばライゲーションにより接合することができる（Ｍｏｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：９９２３；Ｄｒａｐｅｒ等、国際ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２３５６９；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １６：９５１；Ｂｅｌｌｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．８：２０４）。
好ましくは、本明細書に記載した核酸はヌクレアーゼ耐性の基、例えば２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈで改変することにより安定性を増強するために広範に改変される（解説についてはＵｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ１７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３を参照）。リボザイムは一般的方法を用いてゲル電気泳動により精製するか、又は、高速液体クロマトグラフィーにより精製し（ＨＰＬＣ；上出Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．参照）、そして水に再懸濁する。
核酸の活性の最適化
改変（例えば塩基、糖及び／又はホスフェート）を有する核酸は血清中のリボヌクレアーゼによるその分解を防止するため、その力価を増大することができる。自身のヌクレアーゼ安定性及び薬効を顕著に増強するような、核酸に導入できる塩基、糖及び／又はホスフェートの改変を説明する当該分野の数例が存在する。例えば、オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性の基、例えば２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈによる改変、ヌクレオチド塩基改変により、安定性増強及び／又は生物学的活性増強の為に改変される（解説についてはＵｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ．１７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１４０９０を参照）。核酸の糖改変は当該分野で広範に報告されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９９０，３４４，５６５−５６８；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１，２５３，３１４−３１７；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９２，１７，３３４−３３９；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許第５，３３４，７１１号 ａｎｄ Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ公開ＷＯ９７／２６２７０；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，７１６，８２４号；Ｕｓｍａｎ ｅｔａｌ．，米国特許第５，６２７，０５３号；Ｗｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ公開ＷＯ ９８／１３５２６；１９９８年４月２０日出願のＴｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．ＳＮｏ．６０／０８２，４０４；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３９，１１３１；Ｅａｒｎｓｈａｗ ａｎｄ Ｇａｉｔ，１９９８，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），４８，３９−５５；Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，９９−１３４；及び ａｎｄ Ｂｕｒｌｉｎａ ｅｔ
ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５，１９９９−２０１０を参照）。同様の改変を用いて本出願の核酸を改変できる。
ホスホロチオエート、ホスホロチオエート及び／又は５’−メチルホスホネート連結によるオリゴヌクレオチド分子間連結の化学改変は安定性を向上させるが、これ等の改変の過剰量は毒性を誘発する場合がある。従って、核酸を設計する場合には、これ等のヌクレオチド間連結の量を評価し、適宜最小限化することが必要である。これ等の連結の濃度を低下させれば毒性は低下するはずであり、これによりこれ等の分子の薬効が増大し、特異性が上昇する。
１つの実施形態において、本出願の核酸は１つ以上のＧ−クランプヌクレオチドを含む。Ｇ−クランプヌクレオチドは改変されたシトシン類縁体であり、ここで、改変はデュプレックス内の相補グアニンのワトソンクリック及びフーグスティーン面の両方に水素結合するする能力を付与する（例えばＬｉｎ ａｎｄ Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０，８５３１−８５３２参照）。オリゴヌクレオチド内の単一のＧクランプ類縁体置換は相補オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした場合に実質的に増強された螺旋熱安定性及びミスマッチ判別性をもたらすことができる。本出願の核酸におけるこのようなヌクレオチドの存在は増強されたアフィニティー及び核酸標的への特異性の両方をもたらす。別の実施形態においては、本出願の核酸は１つ以上ＬＮＡ（ロックド核酸）ヌクレオチド、例えば２’，４’−Ｃミチレンビシクロヌクレオチドを含む（例えばＷｅｎｇｅｌ等、ＰＣＴ公開ＷＯ００／６６６０４及びＷＯ９９／１４２２６参照）。
別の実施形態においては、本出願はＲ２遺伝子をターゲティングする核酸のコンジュゲート及び／又は複合体を特徴とする。このようなコンジュゲート及び／又は複合体は細胞のような生物学的な系内への核酸の送達を促進するために使用することができる。本出願により提供されるコンジュゲート及び複合体は、細胞膜を経由して標的組織又は細胞型に治療薬を輸送又は転移させること、薬物動態を改変すること、及び／又は本出願の核酸の局在性をモジュレートすることにより治療活性を付与することができる。このようなコンジュゲート及び／又は複合体もまた以下に記載する。
本出願は細胞膜を通過する分子、例えば限定しないが、小分子、脂質、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、毒素、負荷電重合体及び他の重合体、例えば蛋白、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコール又はポリアミンの送達のための新しいコンジュゲート及び複合体の設計及び合成を含む。一般的に、記載した輸送物質は独立して、又は、他成分系の部分として、分解性リンカーを伴うか伴うことなく使用されるように設計されている。これ等の化合物は血清の存在下又は非存在下に異なる組織に起源する多くの細胞型への本出願の核酸の送達及び／又は局在化を向上させることが期待される（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ及びＣｅｃｈの米国特許第５，８５４，０３８号参照）。本明細書に記載した分子のコンジュゲートは生体分解性のリンカー、例えば生体分解性の核酸リンカー分子を介して生物学的活性分子に結合することができる。
「生体分解性核酸リンカー分子」という用語は本明細書においては、ひとつの分子を別の分子、例えば生物学的に活性な分子に連結するための生体分解性リンカーとして設計された核酸分子を指す。生体分解性核酸リンカー分子の安定性はリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド及び化学改変されたヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル及び他の２’−改変又は塩基改変されたヌクレオチドの種々の組合せを用いることによりモジュレートすることができる。生体分解性核酸リンカー分子は２量体、３量体、４量体又はより長い核酸、例えば約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであることができ、或いは、リン系の結合、例えばホスホロアミデート又はホスホジエステル結合を有する単一のヌクレオチドを含むことができる。生体分解性核酸リンカー分子はまた核酸骨格、核酸糖又は核酸塩基の改変を含むこともできる。「生体分解性」という用語は本明細書においては、生物学的系における分解、例えば酵素的分解又は化学的分解を指す。
外因性に送達される治療用の核酸剤、例えば本明細書に記載した分子は場合により、望ましくない蛋白のレベルを低下させるために十分長く標的ＲＮＡの翻訳が抑制されるまで、細胞内で安定である。この期間は疾患の状態に応じて数時間〜数日の範囲となる。これ等の核酸剤は有効な細胞内治療薬として機能するためにはヌクレアーゼに耐性で無ければならない。本明細書に記載した、及び当該分野で知られた核酸の化学合成の向上により、核酸を上記した通りそのヌクレアーゼ安定性を増大させるためのヌクレオチド改変を導入することにより改変する能力が拡張した。
別の特徴において、核酸は５’及び／又は３’キャップ構造を含む。「キャップ構造」とは、オリゴヌクレオチドの何れかの末端に取り込まれている化学改変を意味する（例えばＷｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９７／２６２７０参照）。これ等の末端改変は核酸をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、そして細胞内の送達及び／又は局在化を支援することができる。キャップは５’末端（５’キャップ）又は３’末端（３’キャップ）に存在することができるか、又は両方の末端に存在することができる。非限定的な例においては、５’キャップは、反転無塩基残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；改変塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート連結部；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド；非環状３’，４’−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環状３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−反転ヌクレオチド部分；３’−３’−反転無塩基部分；３’−２’−反転ヌクレオチド部分；３’−２’−反転無塩基部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；３’−ホスホロアミデート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３’−ホスフェート；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；又は架橋又は非架橋メチルホスホネート部分を含む（より詳細な説明は上出Ｗｉｎｃｏｔｔ等参照）。他の非限定的な例においては、３’キャップは、例えば４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド、５’−アミノ−アルキルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；改変塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−反転ヌクレオチド部分；５’−５’−反転無塩基部分；５’−ホスホロアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；架橋又は非架橋の５’−ホスホロアミデート、ホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート、架橋又は非架橋のメチルホスホネート及び５’−メルカプト部分を含む（より詳細な説明はＢｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４９，１９２５参照）。
Ｒ２阻害剤の使用
特定の実施形態においては、本出願は１つ以上の細胞、例えば腫瘍又は癌性の細胞、又は病原体細胞の望ましくない増殖を阻害する方法を提供する。特定の実施形態においては、本出願は腫瘍の成長を阻害又は低減する方法及び癌に罹患した個体を治療する方法を提供する。これ等の方法は上記したＲ２阻害剤（例えばｓｉＲＮＡ）１つ以上の有効量を個体患者に投与することを含む。特定の実施形態においては、本出願は転移性の癌の治療及び／又は転移の防止のための方法を提供する。特定の実施形態においては、本出願は例えば化学療法剤のような伝統的治療薬に抵抗性である癌を治療するための方法を提供する。特定の方法は、動物、特にヒトの施療的及び予防的な治療を特に目標としており、そしてそのような方法においては、Ｒ２阻害剤の治療有効量を動物又はヒトの患者に投与する。
「治療する」という用語は予防的及び／又は施療的な治療を意味する。「予防的又は施療的な」治療という用語は当該分野で知られる通りであり、そして要件の組成物の１つ以上の宿主への投与を含む。望ましくない状態（例えば宿主動物の疾患又は他の望ましくない状況）の臨床的顕在化の前に投与する場合には治療は予防的（即ち望ましくない状態の発症に対抗して宿主を保護する）となるのに対し、望ましくない状態の顕在化の後に投与する場合には治療は施療的（即ち既存の望ましくない状態又はその副作用を減衰、緩解又は安定化させる）となる。
本明細書に記載する通り、腫瘍又は癌は個体内部の腫瘍、腫瘍の異種移植片又はインビトロで培養されている腫瘍を含む。特に、本出願の核酸剤は癌を治療又は予防するために有用である。要件の方法により治療してよい癌の例示される形態は、限定しないが、前立腺癌、膀胱癌、肺癌（小細胞又は非小細胞癌を含む）、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜又は他の子宮癌、卵巣癌、精巣癌、陰茎癌、膣癌、尿道癌、胆嚢癌、食道癌又は膵臓癌を含む。要件の方法により治療してよい癌の別の例示される形態は、限定しないが、骨格筋又は平滑筋の癌、胃癌、小腸癌、唾液腺癌、肛門癌、直腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、下垂体癌及び鼻咽頭癌を含む。本発明のＲ２阻害剤で治療できる癌の別の例示される形態はヘッジホッグ発現細胞を含む癌を含む。本出願のＲ２阻害剤で治療できる癌の更に別の例示される形態はＲ２発現細胞を含む癌を含む。特定のそのような実施形態においては、癌細胞と同じ組織型の正常又は非癌性の細胞は当該分野の手法により検出可能なレベルでＲ２を発現しない場合があり；例えば、正常な肝組織又は肝細胞は、肝細胞癌の細胞におけるＲ２の発現とは対照的に、Ｒ２の検出可能なレベルを発現しない。本出願は本明細書に記載したＲ２阻害剤が単独で使用できること、又は、他の治療薬及び／又は他の伝統的又は非伝統的な療法を含む全体的治療用法の部分として投与することができることを意図している。
本明細書に記載したＲ２阻害剤核酸を用いて治療できる癌の別の例は、以下のもの、即ち、白血病、例えば限定しないが急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、例えば骨髄芽球性、前骨髄性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病および骨髄形成異常症候群；慢性白血病、例えば限定しないが、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病；真性赤血球増加症；リンパ腫、例えば限定しないがホジキン病、非ホジキン病；多発性骨髄腫、例えば限定しないが、伏在性多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性白血病、孤立性形質細胞腫及び骨髄外形質細胞腫；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症；良性単クローン性高ガンマグロブリン血症；重鎖疾患；骨及び結合組織の肉腫、例えば限定しないが骨の肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫瘍、骨の線維肉腫、軟骨腫、骨膜性骨肉腫、軟組織骨肉腫、血管肉腫（血管の肉腫）、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫；脳腫瘍、例えば限定しないが、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、希突起神経膠腫、非神経膠腫瘍、聴覚神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫；乳癌、例えば限定しないが腺癌、小葉（小細胞）癌、腺管内癌、髄様乳癌、粘液性乳癌、管状乳癌、乳頭状乳癌、パジェット病及び炎症性乳癌；副腎癌、例えば限定しないが、褐色細胞腫及び副腎皮質癌；甲状腺癌、例えば限定しないが乳頭状又は小胞状の甲状腺癌、髄様甲状腺癌及び未分化甲状腺癌；膵臓癌、例えば限定しないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍およびカルチノイド腫瘍又は島細胞腫瘍；下垂体癌、例えば限定しないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、尖端巨大症及び尿崩症；眼の癌、例えば限定しないが、眼の黒色腫、例えば虹彩黒色腫、脈絡膜の黒色腫及び毛様体黒色腫及び網膜芽腫；膣癌、例えば扁平上皮細胞癌、腺癌及び黒色腫；外陰部癌、例えば扁平上皮細胞癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫及びパジェット病；子宮頸癌、例えば限定しないが扁平上皮細胞癌及び腺癌；子宮癌、例えば限定しないが子宮内膜癌及び子宮肉腫；卵巣癌、例えば限定しないが、卵巣上皮癌、ボーダーライン腫瘍、生殖細胞癌及び間質癌；食道癌、例えば限定しないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘液性類表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣贅癌及び燕麦細胞（小細胞）癌；胃癌、例えば限定しないが、腺癌、肉芽腫性（ポリープ）、潰瘍性、表在拡延性、播種拡延性、悪性のリンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫及び癌肉腫；結腸癌；直腸癌；肝臓癌、例えば限定しないが、肝細胞癌及び胚芽細胞腫；胆嚢癌、例えば腺癌；胆管癌、例えば限定しないが、乳頭状、結節状及び播種性のもの；肺癌、例えば非小細胞肺癌、扁平上皮細胞癌（上皮様癌）、腺癌、大細胞癌及び小細胞肺癌；精巣癌、例えば限定しないが胚腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的（典型的）、精母細胞、非精上皮腫、胎生期癌、奇形腫癌、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）、前立腺癌、例えば限定しないが腺癌、平滑筋肉腫及び横紋筋肉腫；陰茎癌；口腔癌、例えば限定しないが、扁平上皮細胞癌；基底癌；唾液腺癌、例えば限定しないが、腺癌、粘膜上皮様癌及び腺様嚢胞癌；咽頭癌、例えば限定しないが、扁平上皮細胞癌及び疣贅癌；皮膚癌、例えば限定しないが、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌及び黒色腫、表在拡延性黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端部黒子黒色腫；腎臓癌、例えば限定しないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行上皮癌（腎盂及び／又は尿管）；ウイルムス腫瘍；膀胱癌、例えば限定しないが移行上皮癌、扁平上皮細胞癌、腺癌、癌肉腫を含む。更に又、癌は粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、骨膜腫、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原生癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌及び乳頭状腺癌を含む（これ等の疾患の解説については、Ｆｉｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２ｄＥｄ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ａｎｄ Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｉｎｆｏｒｍｅｄ Ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａｎｄ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ，Ｖｉｋｉｎｇ Ｐｅｎｇｕｉｎ，Ｐｅｎｇｕｉｎ Ｂｏｏｋｓ ＵＳＡ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ参照）。
特定の実施形態においては、本出願は例えば病原体細胞による感染に罹患した患者における、又は、病原性細胞により汚染された物体（例えば実験用又は医療用の装置、キッチンカウンター又は病原体汚染に付される何れかの物体等）の内部又は上部における病原性細胞の増殖を阻害する方法を提供する。病原体の例はウィルス、細菌、カビ等を含む。広範な種類の病原体に関する広範なゲノム情報は公的なデータベースから入手できる。このようなゲノム情報を用いて種々の病原体のＲ２遺伝子にターゲティングされる核酸阻害剤を設計することができる。
本明細書に記載した方法に従って使用してよい疾患誘発ウィルスの例は、レトロウィルス科（例えばヒト免疫不全ウィルス、例えばＨＩＶ−１（別称ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、Ｒａｔｎｅｒ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１３，Ｐｐ．２２７−２８４（１９８５）；Ｗａｉｎ Ｈｏｂｓｏｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．４０：Ｐｐ．９−１７（１９８５）参照）；ＨＩＶ−２（Ｇｕｙａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２８，Ｐｐ．６６２−６６９（１９８７）；欧州特許公開０２６９５２０；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２８，Ｐｐ．５４３−５４７（１９８７）；及び欧州特許出願０６５５５０１参照）；及び他の単離体、例えばＨＩＶ−ＬＰ（国際公開ＷＯ９４／００５６２、表題”Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ”；ピコナウイルス科（例えばポリオウィルス、Ａ型肝炎ウィルス（Ｇｕｓｔ，Ｉ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０，Ｐｐ．１−７（１９８３）；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウィルス、ライノウィルス、エコーウィルス）；カルシウィルス科（例えば胃腸炎を誘発する菌株）；トガウィルス科（例えばウマ脳炎ウィルス、風疹ウィルス）；フラウイルス科（例えばデングウィルス、脳炎ウィルス、黄熱病ウィルス）；コロナウィルス科（例えばコロナウィルス）；ラブドウィルス科（例えば水疱性口内炎ウィルス；狂犬病ウィルス）；フィロウィルス科（例えばエボラウィルス）；パラミクソウィルス科（例えばパラインフルエンザウィルス、おたふくかぜウィルス、麻疹ウィルス、呼吸器シンシチウム症ウィルス）；オルトミクソウィルス科（例えばインフルエンザウィルス）；ブンガウィルス科（例えばハンターンウィルス、ブンガウィルス、フレボウィルス及びナリオウィルス）；アレナウィルス科（出血性発熱ウィルス）；レオウィルス科（例えばレオウィルス、オルビウィルス及びロタウィルス）；ビルナウィルス科；ヘパドナウィルス科（Ｂ型肝炎ウィルス）；パルボウィルス科（パルボウィルス）；パポバウィルス科（パピローマウィルス、ポリオーマウィルス）；アデノウィルス科（大部分のアデノウィルス）；ヘルペスウィルス科（単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）１及び２、帯状疱疹ウィルス、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウィルス）；ポックスウィルス科（痘瘡ウィルス、ワクシニアウィルス、ポックスウィルス）；及びイリドウィルス科（例えばアフリカブタ熱病ウィルス）；及び未分類のウィルス（例えば海綿状脳障害の病因物質、デルタ肝炎の物質（Ｂ型肝炎ウィルスの欠損性衛星株と考えられている）、非Ａ、非Ｂ肝炎の物質（クラス１＝内部伝染；クラス２＝非経腸伝染（即ちＣ型肝炎）；ノーウォークウィルス及び関連ウィルス及び星状ウィルス）を含む。
感染性の細菌の例は、ヘリコバクター・ピロリ、ボレリア・ブルグドルフェリ、レジオネラ・ニューモフィリア、マイコバクテリウムｓｐ．（例えばＭ・ツベルクロシス、Ｍ・アビウム、Ｍ・イントラセルラエ、Ｍ・カンサイ、Ｍ・ゴルドナエ）、スタフィロコッカス・アウレウス、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギチジス、リステリア・モノサイトゲネス、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ａ群ストレプトコッカス）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｂ群ストレプトコッカス）、ストレプトコッカス（ビリダンス群）、ストレプトコッカス・フェカリス、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス（嫌気性菌ｓｐｓ．）、ストレプトコッカス・ニューモニア、病原性カンピロバクター・ｓｐ．、エンテロコッカス・ｓｐ．、ヘモフィルス・インフルエンザ、バチルス・アントラシス、コリネバクテリウム・ジフテリア、コリネバクテリウム・ｓｐ．、エリシペロスリックス・ルシオパシエ、クロストリジウム・パーフリンゲン、クロストリジウム・テタニー、エンテロバクター・アエロゲネス、クレブシエラ・ニューモニア、パスツレラ・ムルトシダ、バクテリオイデス・ｓｐ．、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ストレプトバチルス・モニリフォルミス、トレポネーマ・パリジウム、トレポネーマ・ペルテヌエ、レプトスピラ及びアクチノマイセス・イスラエリを含む。
感染性のカビの例は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラタム、コクシジオイデス・イミティス、ブラストマイセス・デルマチチディス、クラミジア・トラコマチス、カンジダ・アルビカンスを含む。他の感染性生物（すなわち原生生物）はプラズモジウム・ファルシパルム及びトキソプラズマ・ゴンジを含む。
種々の微生物に関するゲノム情報（ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、蛋白発現情報、及び／又は、蛋白構造情報を含有）はＴｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）（ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）及び／又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）により維持されているデータベース中に記載されている。ゲノム情報が入手できる細菌の例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスｓｔｒ．Ｃ５８（Ｃｅｒｅｏｎ）（ＮＣ＿００３０６２＆ＮＣ＿００３０６３）、アグロバクテリウム・ツメファシエンスｓｔｒ．Ｃ５８（Ｕ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）（ＮＣ＿００３３０４＆ＮＣ＿００３３０５）、アキフェックス・アエイオリカス（ＮＣ＿０００９１８）、バチルス・ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ（ＮＣ＿００２５７０）、バチルス・ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＮＣ＿０００９６４）、ボレリア・ブルグドルフェリ（ＮＣ＿００１３１８）、ブルセラ・メリテンシス（ＮＣ＿００３３１７＆ＮＣ＿００３３１８）、ブクネラ・ｓｐ．ＡＰＳ（ＮＣ＿００２５２８）、カンピロバクター・ジェジュニ（ＮＣ＿００２１６３）、カウロバクター・クレセンタス−−ＣＢ１５（ＮＣ＿００２６９６）、クラミジア・ムリダウム（ＮＣ＿００２６２０）、クラミジア・トラコマティス（ＮＣ＿０００１１７）、クラミドフィラ・ニューモニアＡＲ３９（ＮＣ＿００２１７９）、クラミドフィラ・ニューモニアＣＷＬ０２９（ＮＣ＿０００９２２）、クラミドフィラ・ニューモニアＪ１３８（ＮＣ＿００２４９１）、クロストリジウム・アセトブチリカム（ＮＣ＿００３０３０）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（ＮＣ＿００３３６６）、コリネバクテリウム・グルタミカム（ＮＣ＿００３４５０）、デイノコッカス・ラジオヅランス（ＮＣ＿００１２６３＆ＮＣ＿００１２６４）、Ｅ・コリＫ−１２（ＮＣ＿０００９１３）、Ｅ・コリＯ１５７：Ｈ７（ＮＣ＿００２６９５）、Ｅ・コリＯ１５７：Ｈ７ＥＤＬ９３３（ＮＣ＿００２６５５）、フソバクテリウム・ヌクレアタムｓｕｂｓｐ．ヌクレアタムＡＴＣＣ２５５８６（ＮＣ＿００３４５４）、ヘモフィルス・インフルエンザＲｄ（ＮＣ＿０００９０７）、ヘリコバクター・ピロリ２６６９５（ＮＣ＿０００９１５）、ヘリコバクター・ピロリＪ９９（ＮＣ＿０００９２１）、ラクトコッカス・ラクチスｓｕｂｓｐ．ラクチス（ＮＣ＿００２６６２）、リステリア・イノキュラ（ＮＣ＿００３２１２）、リステリア・モノサイトゲネスＥＧＤ−ｅ（ＮＣ＿００３２１０）、メソリゾビウム・ロチ（ＮＣ＿００２６７８）、マイコバクテリウム・ｌｅｐｒａｅ（ＮＣ＿００２６７７）、マイコバクテリウム・ツベルクロシスＣＤＣ１５５１（ＮＣ＿００２７５５）、マイコバクテリウム・ツベルクロシスＨ３７Ｒｖ（ＮＣ＿０００９６２）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（ＮＣ＿０００９０８）、マイコプラズマ・ニューモニア（ＮＣ＿０００９１２）、マイコプラズマ・パルモニス（ＮＣ＿００２７７１）、ナイセリア・メニンギチジスＭＣ５８（ＮＣ＿００３１１２）、ナイセリア・メニンギチジス（ＮＣ＿００３１１６）、ノストックｓｐ．（ＮＣ＿００３２７２）、パスツレラ・マルトシダ（ＮＣ＿００２６６３）、シュードモナス・アエルギノーサ（ＮＣ＿００２５１６）、ラルストニア・ソラナセラム（ＮＣ＿００３２９５＆ＮＣ＿００３２９６）、リケッチア・コノリ（ＮＣ＿００３１０３）、リケッチア・プロワゼキ（ＮＣ＿０００９６３）、サルモネラ・エンテリカｓｕｂｓｐ．エンテリカｓｅｒｏｖａｒＴｙｐｈｉ（ＮＣ＿００３１９８）、サルモネラ・チフィ（ＮＣ＿００２３０５）、サルモネラ・チフムリウムＬＴ２（ＮＣ＿００３１９７）、シノリゾビウム・メリロチ（ＮＣ＿００３０４７）、スタフィロコッカス・アウレウスｓｕｂｓｐ．アウレウスＭＷ２（ＮＣ＿００３９２３）、スタフィロコッカス・アウレウスｓｕｂｓｐ．アウレウスＭｕ５０（ＮＣ＿００２７５８）、スタフィロコッカス・アウレウスｓｕｂｓｐ．アウレウスＮ３１５（ＮＣ＿００２７４５）、ストレプトコッカス・ニューモニアＲ６（ＮＣ＿００３０９８）、ストレプトコッカス・ニューモニアＴＩＧＲ４（ＮＣ＿００３０２８）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭ１ＧＡＳ（ＮＣ＿００２７３７）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ８２３２（ＮＣ＿００３４８５）、ストレプトマイセス・コエリコラＡ３（２）（ＮＣ＿００３８８８）、シネコシスティスｓｐ．ＰＣＣ６８０３（ＮＣ＿０００９１１）、サーモアナエロバクター・テングコンジェンシス（ＮＣ＿００３８６９）、サーモトガ・マリチマ（ＮＣ＿０００８５３）、トレポネーマ・パリジウム（ＮＣ＿０００９１９）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（ＮＣ＿００２１６２）、ビブリオ・コレラ（ＮＣ＿００２５０５＆ＮＣ＿００２５０６）、キサントモナス・アキソノポジスｐｖ．シトリｓｔｒ．３０６（ＮＣ＿００３９１９）、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．カンペストリスｓｔｒ．ＡＴＣＣ３３９１３（ＮＣ＿００３９０２）、キシレラ・ファスチジオーサ９ａ５ｃ（ＮＣ＿００２４８８）及びイエルシニア・ペスチス（ＮＣ＿００３１４３）を含む。
ＴＩＧＲ及び／又はＮＣＢＩからゲノム情報が入手できる原始生物の例はアエロピルム・ペルニックス（ＮＣ＿０００８５４）、アルカエオグロブス・フルギダス（ＮＣ＿０００９１７）、ハロバクテリウムｓｐ．ＮＲＣ−１（ＮＣ＿００２６０７）、メタノコッカス・ジャナシ（ＮＣ＿０００９０９）、メタノピルス・カンドレリＡＶ１９（ＮＣ＿００３５５１）、メタノサルシナ・アセチボランスｓｔｒ．Ｃ２Ａ（ＮＣ＿００３５５２）、メタノサルシナ・メザイＧｏｅｌ（ＮＣ＿００３９０１）、メタノサーモバクテル・サーマウトトロフィカス（ＮＣ＿０００９１６）、ピロバクラム・アエロフィラム（ＮＣ＿００３３６４）、ピロコッカス・アビシ（ＮＣ＿０００８６８）、ピロコッカス・フリオサスＤＳＭ３６３８（ＮＣ＿００３４１３）、ピロコッカス・ホリコシ（ＮＣ＿０００９６１）、スルホロブス・ソルファタリカス（ＮＣ＿００２７５４）、スルホロブス・トコダイ（ＮＣ＿００３１０６）、サーモプラズマ・アシドフィラム（ＮＣ＿００２５７８）及びサーモプラズマ・ボルカニウム（ＮＣ＿００２６８９）を含む。
ＴＩＧＲ及び／又はＮＣＢＩからゲノム情報が入手できる真核生物の例は、アノフェレス・ガンピエ、アラビドプシス・サリアナ、ケノルハブジチス・エレガンス、ドロソフィリア・メラノガスター、エンセファリトゾン・クニクリ、ギラルジア・シータ・ヌクレオモルフ、サッカロマイセス・セレビシアエ及びスキゾサッカロマイセス・ポンベを含む。
９００超のウィルス種、例えばデルタウィルス、レトロイドウィルス、衛星株、ｄｓＤＮＡウィルス、ｄｓＲＮＡウィルス、ｓｓＤＮＡウィルス、ｓｓＲＮＡ陰性鎖ウィルス、ｓｓＲＮＡ陽性鎖ウィルス、未分類バクテリオファージ及び他の未分類ウィルスに関するゲノム情報がＴＩＧＲ及び／又はＮＣＢＩから入手可能である。
特定の実施形態においては、本出願は正常細胞（例えば非癌性及び／又は非病原性の細胞）の望ましくない増殖を防止する方法を提供する。例えば、正常細胞は体毛の成育の為に必要な細胞であり、そして望ましくない体毛の成育は本明細書に記載した方法により治療してよく；細胞の望ましくない増殖は正常な体毛の成長において、異所発毛、過剰発毛、多毛症又は毛嚢炎、例えば脱毛性毛嚢炎、網状瘢痕性紅斑性毛嚢炎、ケロイド性毛嚢炎および偽性毛嚢炎において起こる場合がある。別の例においては、正常細胞は自己免疫応答、移植片拒絶等の望ましくない免疫応答に関与する免疫細胞であってよい。例示される実施形態においては、正常細胞は正常Ｔ細胞であってよく、そしてＴ細胞の過剰な活性又は増殖は多くの疾患又は症状、例えば、真性糖尿病、関節炎（例えば慢性関節リューマチ、若年性慢性関節リューマチ、骨関節炎及び乾癬性関節炎）、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（例えばアトピー性皮膚炎及び湿疹性の皮膚炎）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、硬皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病の逆転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、間質性肺線維症、対宿主性移植片病、移植時症例（例えば同種又は異種組織を用いた移植）、例えば骨髄移植、肝臓移植又は何れかの臓器又は組織の移植、アレルギー、例えばアトピー性アレルギー、及び、Ｔ細胞新生物、例えば白血病及び／又はリンパ腫の原因となる。
本明細書に記載した方法の特定の実施形態においては、Ｒ２の核酸阻害剤１つ以上を共に（同時に）、又は、異なる時点で（逐次的に）投与することができる。例えば２種以上のｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又は酵素核酸又はこれ等の組合せを本明細書に記載した方法に従って使用してよい。
特定の実施形態においては、本出願の要件の阻害剤核酸は単独で使用できる。或いは、要件の阻害剤核酸は他の従来の抗癌剤、抗病原体剤又は望ましくない細胞増殖の治療又は防止を指向した他の治療方法と組み合わせて投与してよい。例えば、そのような方法は予防的な癌の防止、手術後の癌の再発及び転移の防止において、そして他の従来の癌療法の補助薬として、使用することができる。本出願は従来の癌療法（例えば化学療法、放射線療法、光学的療法、免疫療法及び手術）の有効性は要件の核酸剤の使用を介して増強できると認識する。Ｒ２阻害剤核酸及び他の治療薬を含む複合療法を使用する場合、そのような治療薬は別個に、又は連帯して投与してよい。特定の実施形態においては、複合療法ではＲ２阻害剤核酸及び共に製剤されるか別個の製剤として投与される他の治療薬を使用する。
広範な種類の従来の化合物が抗新生物活性を有することがわかっている。これ等の化合物は固形癌を収縮させ、転移及び追加的成長を防止し、或いは、白血病又は骨髄悪性疾患における悪性細胞の数を低減させるための化学療法における医薬品として使用されている。化学療法は種々の型の悪性疾患の治療において有効であるが、多くの抗新生物化合物は望ましくない副作用を誘導する。２種以上の治療法を組み合わせると治療は相乗効果的に作用し、そして治療の各々の用量の低減を可能にし、これにより、より高用量で各化合物により誘発される有害副作用を低減できる。他の場合においては、治療に対して抵抗性の悪性疾患は２種以上の治療の複合療法に対して応答する場合がある。
複合療法、特に抗腫瘍療法の為に使用してよい医薬品化合物は、一例を挙げれば、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンポテシン、カぺシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエンストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、マイトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセン、ジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンを含む。
これ等の化学療法抗腫瘍化合物はそれらの作用機序により例えば以下のグループ、即ち、代謝拮抗物質／抗癌剤、例えばピリミジン類縁体（５−フルオロウラシル、フロキシウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン及びシタラビン）及びプリン類縁体、フォレート拮抗剤及び関連の阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））；抗増殖／抗有糸分裂剤、例えば天然産物、例えばビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン）、微小管破壊物質、例えばタキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン及びナベルビン、エピヂポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メルクロレタミン、マイトマイシン、マイトキサントロン、ニトロソ尿素、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテレ、テニポシド、トリエチレンチオホスホロアミド及びエトポシド（ＶＰ１６）；抗生物質、例えばダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、マイトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミスラマイシン）及びマイトマイシン；酵素類（Ｌ−アスパラギンを全身的に代謝し、自身のアスパラギンを合成する能力を有さない細胞を枯渇させるＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤、例えば窒素マスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド及び類縁体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミン及びメチルメラミン（ヘキサメチルメラミン及びチオテパ）、アルキルスルホネートブスルファン、ニトロソ尿素（カルムスチン（ＢＣＮＵ）及び類縁体、ストレプトゾシン）、トラゼン−ダカルバジン（ＤＴＩＣ）；抗増殖／抗有糸分裂代謝拮抗剤、例えば葉酸類縁体（メトトレキセート）；白金配位複合体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン類、ホルモン類縁体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）及びアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩及び他のトロンビン阻害剤）；線維溶解剤（例えば組織プラスミノーゲン活性化物質、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤；抗分泌剤（ブレヴェルジン）；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、マイコフェノレートモフェチル）；抗血管形成化合物（ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン）及び成長因子阻害剤（血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンジオテンシン受容体ブロッカー；酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラツズマブ）；細胞周期阻害剤及び分化誘導剤（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤；トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン及びミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルペドニソロン、プレドニソン及びプレニソロン）；成長因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘導剤及びカスパーゼ活性化剤；及びクロマチン破壊剤に分類してよい。
特定の実施形態においては、本明細書に記載したＲ２阻害剤核酸は他の治療薬、例えば抗炎症剤、免疫抑制剤及び／又は抗感染症剤（例えば抗生物質、抗ウィルス及び／又は抗カビ化合物等）と組み合わせて投与してよい。例示される抗炎症剤は、例えばステロイド剤（例えばコルチゾール、アルドステロン、プレドニソン、メチルプレドニソン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、デオキシコルチコステロン及びフルオロコルチゾール）及び非ステロイド抗炎症剤（例えばイブプロフェン、ナプロキセン及びピロキシカム）を含む。例示される免疫抑制剤は、例えばプレドニソン、アザチオプリン（イムラン）、シクロスポリン（サンドイミューン、ネオラル）、ラパマイシン、抗胸腺細胞グロブリン、ダクリズマブ、ＯＫＴ３及びＡＬＧ、マイコフェノレートモフェチル（セルセプト）及びタクロリムス（プログラフ、ＦＫ５０６）を含む。例示される抗生物質は、例えばサルファ剤（例えばスルファニラミド）、葉酸類縁体（例えばトリメトプリン）、ベータラクタム（例えばペナシリン、セファロスポリン）、アミノグリコシド（例えばストレプトマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン）、テトラサイクリン（例えばクロロテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン及びドキシサイクリン）、マクロリド（例えばエリスロマイシン、アジスロマイシン及びクラリスロマイシン）、リンコサミド（例えばクリンダマイシン）、ストレプトグラミン（例えばキヌプリスチン及びダルフォプリスチン）、フルオロキノロン（例えばシプロフロキサシン、レボフロキサシン及びモキシフロキサシン）、ポリペプチド（例えばポリミキシン）、リファンピン、ムピロシン、シクロセリン、アミノシクリトール（例えばスペクチノマイシン）、糖ペプチド（例えばバンコマイシン）及びオキサゾリジノン（例えばリネゾリド）を含む。例示される抗ウィルス剤は、例えばビダラビン、アシクロビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ヌクレオシド類縁体逆転写酵素阻害剤（例えばＺＡＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、Ｄ４Ｔ、３ＴＣ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えばネビラピン、デラビルジン）、プロテアーゼ阻害剤（例えばサキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル）、リバビリン、アマンタジン、リマンタジン、レレンザ、タミフル、プレコナリル及びインターフェロンを含む。例示される抗カビ剤は、例えば、ポリエン抗カビ剤（例えばアンホテリシン及びニスタチン）、イミダゾール抗カビ剤（ケトコナゾール及びミコナゾール）、トリアゾール抗カビ剤（例えばフコナゾール及びイトラコナゾール）、フルシトシン、グリセオフルビン及びテルビナフィンを含む。
複合療法の性質に応じて、本出願の核酸治療薬の投与は、他剤の投与中にも継続するか、又はその後に行ってよい。核酸治療薬の投与は単回において、又は複数回において行ってよい。一部の例においては、核酸治療薬の投与は従来の療法よりも少なくとも数日前に開始するが、別の例においては投与を従来療法の投与の直前又は同時に開始する。
投与方法及び組成物
特定の実施形態においては、本出願は本明細書に記載したＲ２阻害剤１つ以上を含む組成物を提供する。特定の実施形態においては、組成物は患者における治療用途に適する医薬品である。特定の実施形態においては、組成物は動物又はヒトにおける化粧品用途に適する化粧品である。別の実施形態においては、組成物は非医薬品及び非化粧品である。一般的に、化粧品と医薬品の相違は後者がヒト及び動物で使用するためには規制当局の認可（例えば食品医薬品局による）を要する点である。
Ｒ２阻害剤、特に核酸を送達するための方法は当該分野で知られる方法に基づいてよい（例えばＡｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，２，１３９；及びＤｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５；Ｓｕｌｌｉｖａｎ等のＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２５９５参照）。これ等のプロトコルは実質的に如何なる核酸の送達のためにも利用、訂正又は改善することができる。核酸は当該分野で知られた種々の方法、例えば限定しないが、リポソーム内へのカプセル化、イオントフォレシスによるか、又は他のビヒクル、例えばヒドロゲル、シクロデキストリン、生体分解性ナノカプセル及び生体接着性微小球内への取り込みによるなどして、細胞に投与することができる。或いは、核酸／ビヒクルの組合せを直接注射によるか、又は注入ポンプの使用により局所送達する。送達の他の経路は限定しないが経口（錠剤又は丸薬の形態）及び／又は髄腔内送達を含む（Ｇｏｌｄ，１９９７，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，７６，１１５３−１１５８）。他の方法は、例えばコンジュゲート及び生体分解性重合体の使用を介した種々の輸送系及び担体系の使用を含む。特定の実施形態においては、要件のＲ２阻害剤及びビヒクルは、投与前に、最終投与形態で組合わせられて製剤される。別の実施形態では、要件のＲ２阻害剤及びビヒクルは、それらが投与時に組み合わせられるように別個に製剤する。例えば、要件のＲ２阻害剤とビヒクルを送達キット又はパッケージの別個のコンパートメントに保存してよく、そして所望の部位に対する、又は、所望の経路を介した投与の時点において、要件Ｒ２阻害剤およびビヒクルを混合して送達に付す。別個のコンパートメントはキット内の別個のバイアル、医薬送達ペン中の別個のカートリッジ（米国特許第５，５４２，７６０号参照）、別個のカニューレ又はシリンジ内の別個のコンパートメント等であることができる。
特定の実施形態においては、要件Ｒ２阻害剤は送達ビヒクルとして重合体の微粒子又はナノ粒子を含む分子レベル以上の複合体として提供される。「微粒子」又は「ナノ粒子」という用語は本明細書においては、微小球又はナノ小球（均一な小球）、マイクロカプセル又はナノカプセル（コア及び重合体外層を有する）及び不規則な形状の粒子を含む。
本出願は一般的には１年、より典型的には数ヶ月、更に典型的には数日〜数週間の範囲にあるＲ２阻害剤の放出が望まれる時間帯内又はその比較的直ぐ後の好ましくは生体分解性である重合体の使用を意図する。生体分解とは微粒子の破壊、即ち微粒子／ナノ粒子を形成する重合体及び／又は重合体自身の解離の何れかを意味する。これはジケトピペラジンの場合のような放出部位ｐＨへの粒子投与用担体のｐＨからの変化、ポリ（ヒドロキシ酸）の場合のような加水分解の結果として、アルギネートのような重合体のイオン結合により形成された微粒子又はナノ粒子の場合のような微粒子のからのカルシウムのようなイオンの拡散により、および、多糖類及び蛋白の多くの場合のような酵素的作用により生じる可能性がある。一部の場合においては、一次的な放出が最も有用であるが、別の場合にはパルス的な放出又は「バルク放出」がより効果的な結果をもたらす場合がある。
代表的な合成物質は、ジケトピペラジン、ポリ（ヒドロキシ酸）、例えばポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）及びこれ等の共重合体、ポリ無水物、ポリエステル、例えばポリオルトエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリビニル化合物、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアセテート及びポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリシロキサン、アクリル及びメタクリル酸の重合体、例えばポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリウレタン及びその共重合体、セルロース、例えばアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシルエチルセルロース、セルローストリアセテート及びセルローススルフェートナトリウム塩、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）及びポリ（ラクチドコカプロラクトン）である。
天然重合体は、アルギネート及び他の多糖類、例えばデキストラン及びセルロース、コラーゲン、アルブミン及び他の親水性蛋白、ゼインおよび他のプロラミンおよび疎水性蛋白、それらの共重合体及び混合物を含む。本明細書においては、その化学的誘導体とは、置換、例えばアルキル、アルキレンのような化学基の付加、ヒドロキシル化、酸化及び当該分野で通常行われる他の改変を指す。
生体接着性の重合体はＨ．Ｓ．Ｓａｗｈｎｅｙ，Ｃ．Ｐ．Ｐａｔｈａｋ ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｈｕｂｅｌｌ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９３，２６，５８１−５８７に記載の生体腐食性ヒドロゲル、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギネート、キトサン及びポリアクリレートを含む。
薬剤送達法に関する包括的な考察については、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１，３３６−３４３及びＪａｉｎ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ，Ｄｅｃｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，１９９８及びＧｒｏｏｔｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．ＮｅｕｒｏＶｉｒｏｌ．，３，３８７−４００を参照できる。核酸の送達及び投与のより詳細な説明は上出Ｓｕｌｌｉｖａｎ等、Ｄｒａｐｅｒ等のＰＣＴＷＯ９３／２３５６９、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等のＰＣＴ公開ＷＯ９９／０５０９４及びＫｌｉｍｕｋ等のＰＣＴ公開ＷＯ９９／０４８１９に記載されている。
「非経腸投与」及び「非経腸投与された」という表現は本明細書においては、経腸及び局所投与以外の、通常は注射による投与の様式を意味し、そして限定しないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢胞内、眼内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、胸骨下の注射及び注入、及び、肝動脈内投与（肝動脈内注射及び肝動脈内注入を含む）を含む。
「全身投与」、「全身投与された」、「末梢投与」及び「末梢投与された」という表現は本明細書においては、化合物、薬剤又は他の物質が中枢神経系に直接ではなく、患者の全身系に侵入し、そしてこれにより代謝及び他の類似の過程に付されるようにした、その投与、例えば皮下投与を意味する。
特定の実施形態においては、本出願の要件の核酸（例えばＲＮＡｉコンストラクト及び酵素核酸）は製薬上許容しうる担体と共に製剤する。そのような治療薬は単独又は医薬品製剤（組成物）の成分として投与できる。薬剤はヒト又は家畜の医薬中の使用のための何れかの好都合な方法における投与の為に製剤してよい。水和剤、乳化剤及び潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、フレーバー及び芳香剤、保存料及び抗酸化剤もまた組成物中に存在できる。
要件の核酸の製剤は全身、局所、経口、経鼻、患部、非経腸、直腸及び／又は膣内の投与に適するものを含む。製剤は単位剤型で好都合に提供してよく、そして製薬の当該分野で良く知られている何れかの方法により製造してよい。単回投与形態を製造するために担体物質と組み合わせてよい活性成分の量は治療するべき宿主、投与の特定の様式に応じて変動する。単回投与形態を製造するために担体物質と組み合わせてよい活性成分の量は一般的に治療効果をもたらす化合物の量となる。
特定の実施形態においては、これ等の製剤又は組成物を製造する方法は、別の型の治療薬又は抗感染剤及び担体、及び、場合により１つ以上の副次的成分を組み合わせることを含む。一般的に、製剤は液体担体又は微細分割固体担体又は両方と共に製造し、そして次に必要に応じて生成物を成型する。
経口投与用の製剤はカプセル、カシェ剤、丸薬、錠剤、ロゼンジ（フレーバー基剤、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカントを使用）、粉末、顆粒の形態、又は、水性又は非水性の液体中の溶液又は懸濁液として、又は、水中油又は油中水のエマルジョンとして、又は、エリキシル又はシロップとして、又は、香錠（不活性基剤、例えばゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシアを使用）及び／又はマウスウオッシュ等として存在してよく、各々が所定量の要件核酸治療薬を活性成分として含有する。
経口投与用の固体剤型（カプセル、錠剤、丸薬、ドラジェ剤、粉末、顆粒等）においては、１つ以上の本出願の核酸治療薬を１つ以上の製薬上許容しうる担体、例えばクエン酸ナトリウム又はリン酸２カルシウム及び／又は以下のもの、即ち（１）充填剤又は増量剤、例えば澱粉、乳糖、スクロース、グルコース、マンニトール及び／又はケイ酸；（２）バインダー、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／又はアカシア；（３）湿潤剤、例えばグリセロール；（４）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、バレイショ又はタピオカ澱粉、アルギン酸、特定のケイ酸塩及び炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン；（６）吸収加速剤、例えば第４アンモニウム化合物；（７）水和剤、例えばセチルアルコール及びグリセロールモノステアレート；（８）吸収剤、例えばカオリン及びベントナイト粘土；（９）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びこれ等の混合物；及び（１０）着色剤と混合してよい。カプセル、錠剤及び丸薬の場合は、医薬組成物は又緩衝剤も含んでよい。同様の型の固体組成物はまた、乳糖又はミルクシュガーのような賦形剤並びに高分子量ポリエチレングリコールを用いるソフト及びハードゼラチンカプセルにおける充填剤としても使用してよい。
経口投与用の液体剤型は製薬上許容しうる乳液、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルを含む。活性成分の他に、液体剤型は当該分野で一般的に使用されている不活性の希釈剤、例えば水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油脂（特に綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル及びこれ等の混合物を含有してよい。不活性希釈剤の他に、経口用組成物は又、水和剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味料、フレーバー、着色料、芳香剤及び保存料のような補助剤を含むことができる。
懸濁液は、活性化合物の他に、懸濁剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカント及びこれ等の混合物を含有してよい。
本出願の方法及び組成物は皮膚又は子宮頚部及び膣部のような粘膜の何れかに局所投与できる。これにより、副作用を誘導する可能性を最低限としながら、皮膚又は粘膜に局在する望ましくない細胞増殖への直接の送達の最大の可能性がもたらされる。局所用製剤は更に皮膚又は角質層の浸透増強剤として効果的であることが知られている広範な種類の物質１つ以上を含んでよい。これ等の例は、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチル又はイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド及びアゾンである。追加的物質を更に含有させることにより製剤を化粧品として適合させてよい。これ等の例は、脂肪、ワックス、油脂、染料、芳香剤、保存料、安定化剤及び界面活性剤である。当該分野で知られた角質溶解剤も含んでよい。例としてはサリチル酸及びイオウが挙げられる。
局所又は経皮投与用の剤型は粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤を含む。要件の核酸は滅菌下、製薬上許容しうる担体と、そして必要とされる何れかの保存料、緩衝剤又は高圧ガスと、混合してよい。軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは要件の核酸分子の他に、賦形剤、例えば動物性及び植物性の脂肪、油脂、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛又はこれ等の混合物を含有してよい。
粉末及びスプレーは要件の核酸治療薬の他に、賦形剤、例えば乳糖、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末又はこれ等の物質の混合物を含有できる。スプレーは更に慣用的な高圧ガス、例えばクロロフルオロハイドロカーボン及び揮発性の未置換の炭化水素、例えばブタン及びプロパンを含有できる。
吸入に適する製剤も提供され、そしてそのような製剤は肺への送達に使用でき、これは肺系に局在化するか、又は全身性となることができる。肺送達のための医薬品装置の例は、計量用量吸入器（ＭＤＩ）及び乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）を含む。要件のＲ２阻害剤及び／又は活性剤の送達に適合できる吸入による送達系の例は例えば米国特許第５，７５６，３５３号；第５，８５８，７８４号；及びＰＣＴ出願ＷＯ９８／３１３４６；ＷＯ９８／１０７９６；ＷＯ００／２７３５９；ＷＯ０１／５４６６４；ＷＯ０２／０６０４１２に記載されている。Ｒ２阻害剤及び／又は活性剤の送達に使用してよい他のエアロゾル製剤は米国特許第６，２９４，１５３号；第６，３４４，１９４号；第６，０７１，４９７号；米国特許出願２００４／００６３６５４及びＰＣＴ出願ＷＯ０２／０６６０７８；ＷＯ０２／０５３１９０；ＷＯ０１／６０４２０；ＷＯ００／６６２０６に記載されている。
加圧計量用量吸入器（ｐＭＤＩ）は全世界で最も一般的に使用されている吸入器である。エアロゾルは弁の開放時（通常は高圧ガスキャニスターを押し下げることによる）に形成され、これにより液体高圧ガスがキャニスターから噴出する。典型的には薬剤又は治療薬は、液体高圧ガス中に懸濁させた小粒子（通常は直径数ミクロン）内に含有させるが、一部の製剤においては、薬剤又は治療薬は高圧ガス中に溶解させてよい。高圧ガスはエアロゾルが装置を離れると急速に気化し、薬剤又は治療薬の小粒子が形成されて吸入される。このようなｐＭＤＩにおいて典型的に使用される高圧ガスは例えば限定しないがハイドロフルオロアルカン類（ＨＦＡ）である。界面活性剤もまた、例えばｐＭＤＩと共に薬剤又は治療薬を製剤するために使用してよい。他の溶媒又は賦形剤もまたｐＭＤＩと共に使用してよく、それらにはエタノール、アスコルビン酸、メタ重硫酸ナトリウム、グリセリン、クロロブタノール及び塩化セチルピリジニウムが含有される。そのようなｐＭＤＩはまた例えばスペーサー、保持チャンバー及び他の変形例のようなアドオン型の装置も含んでよい。
第３の型の吸入器は乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）である。ＤＰＩにおいては、エアロゾルは通常は吸入時まで装置内に含有される粉末である。治療薬又は薬剤は小型の粉末粒子（通常は直径数１００万分の１メートル、又はマイクロメートル）として粉末形態に製造される。多くのＤＰＩにおいて、薬剤又は治療薬は典型的には直径５０〜１００マイクロメートルのより大型の糖粒子（例えば乳糖の１水和物）と混合される。乳糖／薬剤凝集塊上の増大した空気力学的力が吸入時の薬剤粒子の運搬を向上させると同時に、少量の個別の粉末用量の充填をより容易なものとする。吸入時、乱流及び／又は機械的装置、例えば粒子凝集塊が衝突する回転表面の助けにより、粉末はその構成粒子にまで分解され、小型の個々の薬剤粉末粒子を肺内に吸入される空気中に放出する。糖粒子は通常は装置内及び／又は口腔−咽頭部に留まることを意図される。
本出願の１つの特徴はＲ２阻害剤を含むエアロゾル組成物を提供する。エアロゾル組成物はエアロゾル化したＲ２阻害剤を含む組成物又はエアロゾル化に適する製剤中にＲ２阻害剤を含む組成物であることができる。Ｒ２阻害剤は別の活性剤と組み合わせて製剤してよく、そして組み合わせた製剤がエアロゾル化に適するものとなる。或いは、Ｒ２阻害剤及び別の活性剤は、エアロゾル化が起こった後、又は、対象に投与された後にそれらが組み合わせられるように、別個に製剤してよい。
非経腸投与に適する医薬組成物は、抗酸化剤、緩衝物質、静菌剤、製剤を意図するレシピエントの血液と等張性とするための溶質又は懸濁剤又は濃厚化剤を含有してよい、１つ以上の製薬上許容しうる滅菌等張性の水性又は非水性の溶液、分散液、懸濁液又は乳液、又は、使用直前に希釈再調整して滅菌された注射可能な溶液又は分散液としてよい滅菌粉末と組み合わせて１つ以上の核酸剤を含んでよい。本出願の医薬組成物において使用してよい適当な水性又は非水性の担体の例は、水、エタノール、ポリオール類（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）及びこれ等の適当な混合物、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルを含む。適当な流動性は例えばコーティング物質、例えばレシチンの使用により、分散体の場合は必要な粒径を維持することにより、そして界面活性剤の使用により維持することができる。
これ等の組成物は又補助剤、例えば保存料、水和剤、乳化剤及び分散剤を含有してよい。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤及び抗カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等を含有させることにより確保してよい。等張性付与剤、例えば糖類、塩化ナトリウム等を組成物に含有させることが望ましい場合がある。更に又、注射可能な医薬品の形態の延長された吸収は、吸収を遅延させる物質、例えば１ステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有させることにより、達成してよい。
注射可能なデポ剤形態はポリラクチド−ポリグリコリドのような生体分解性の重合体内に核酸剤１つ以上のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより作成する。薬剤の重合体に対する比及び使用される特定の重合体の性質に応じて、薬剤放出の速度を制御することができる。他の生体分解性重合体の例はポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）を含む。デポ剤の注射可能な製剤はまた身体組織と適合性のあるリポソーム又はマイクロエマルジョン中に薬剤を捕獲することによっても製造される。
膣内又は直腸投与用の製剤は坐剤として提供してよく、これは１つ以上の本出願の化合物を、例えばカカオ脂、ポリエチレングリコール、坐剤用ワックス又はサリシレートを含む１つ以上の適当な非刺激性の賦形剤又は担体と混合することにより製造してよく、そしてこれは、室温では固体であるが、体温では液体となり、これにより直腸又は膣腔において溶融し、活性化合物を放出することになる。
特定の実施形態においては、本出願の核酸は、その所望の活性に最も適する生理学的位置への核酸の効果的な分布を可能にする製薬上許容しうる物質と共に製剤する。そのような製薬上許容しうる物質の非限定的な例は、ＰＥＧ、リン脂質、ホスホロチオエート、種々の組織への薬剤の進入を増強できるＰ−糖蛋白阻害剤（例えばプルロニックＰ８５）、生体分解性重合体、例えば移植後の除放性送達のためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）微小球（Ｅｍｅｒｉｃｈ，ＤＦ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８，４７−５８）、及び、血液脳関門を通過して薬剤を送達することができ、そしてニューロン取り込み機序を改変することができるポリブチルシアノアクリレートで作成したもののような担持型ナノ粒子（Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２３，９４１−９４９，１９９９）を含む。
他の実施形態においては、本出願の核酸の特定のものは真核生物プロモーターから細胞内で発現させることができる（例えばＩｚａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，３４５；ＭｃＧａｒｒｙ ａｎｄ Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８３，３９９；Ｓｃａｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３，２２５９；Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４，４５）。当業者の知る通り何れかの核酸は適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから真核生物の細胞中で発現させることができる。このような核酸の活性は酵素核酸による一次転写産物からのそれらの放出により増強することができる（Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴＷＯ９３／２３５６９，ａｎｄ Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴＷＯ９４／０２５９５；Ｏｈｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−１６；Ｔａｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ ｅｔ
ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５８５６；参照により全体が本明細書に組み込まれる）。ＣＮＳに特異的な遺伝子療法の試みはＢｌｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．，１３，２６９−２８０；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｎｔ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓｔ．Ｄｉｓ．，４８５−５０８；Ｐｅｅｌ ａｎｄ Ｋｌｅｉｎ，２０００，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，９８，９５−１０４；Ｈａｇｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７，７５９−７６３；ａｎｄ Ｈｅｒｒｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，３５，２８７−３１２により記載されている。神経系細胞への核酸のＡＡＶ媒介送達は更にＫａｐｌｉｔｔ等の米国特許第６，１８０，６１３号に記載されている。
本出願の別の特徴においては、本出願のＲＮＡ分子は好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡベクターに挿入された転写単位（例えばＣｏｕｔｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０参照）から発現される。組み換えベクターは好ましくはＤＮＡプラスミド又はウィルスベクターである。リボザイム発現ウィルスベクターは例えば限定しないがアデノ関連ウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス又はアルファウィルスに基づいて構築できる。好ましくは、核酸を発現することができる組み換えベクターを上記した通り送達し、標的細胞内に存続させる。或いは、核酸の一過性の発現をもたらすウィルスベクターを使用できる。そのようなベクターは必要に応じて反復して投与できる。発現された後、核酸は標的ｍＲＮＡに結合する。核酸発現ベクターの送達は全身性、例えば静脈内又は筋肉内投与によるか、患者から外植した標的細胞への投与とその後の患者への再導入によるか、又は、所望の標的細胞内への導入を可能にする何れかの別の手段により行うことができる（考察についてはＣｏｕｔｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０参照）。
１つの特徴において、本出願は、本出願の核酸の少なくとも１つをコードする核酸配列を含む発現ベクターを意図している。核酸配列は本出願の核酸の発現を可能にする態様において作動可能に連結している。例えば、本出願はａ）転写開始領域（例えば真核生物ｐｏｌＩ、ＩＩ又はＩＩＩ開始領域）；ｂ）転写終止領域（例えば真核生物ｐｏｌＩ、ＩＩ又はＩＩＩ終止領域）；ｃ）本出願の核酸触媒少なくとも１つをコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴としており；そしてここで該配列は、該核酸の発現及び／又は送達を可能にする態様において該開始領域及び該終止領域に作動可能に連結している。ベクターは場合により、本出願の核酸触媒をコードする配列の５’側又は３’側に作動可能に連結した蛋白に関するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；及び／又はイントロン（介在配列）を含むことができる。
２本鎖核酸を含む特定の実施形態においては、その２つの鎖は別個に発現させ、そして後に細胞内でハイブリダイズさせることができる。そのような別個の発現は別個の発現コンストラクトを介するか、又は、単一の発現コンストラクトを介するものであってよい。或いは、２つの鎖を共に発現させることができ、例えばヘアピンＲＮＡの２つの鎖を共に発現させてよい。
選択される投与経路とは関わりなく、適当な水和型で使用してよい本出願のＲ２阻害剤は及び／又は本出願の医薬組成物は後述する通り、又は他の従来の方法により製薬上許容しうる剤型に製剤される。
本発明の医薬組成物の活性成分の実際の用量レベルは、患者に毒性となることなく、特定の患者、組成物及び投与様式に対する所望の治療応答を達成するために有効な活性成分の量が得られるように変動してよい。
選択される用量レベルは種々の要因、例えば使用する本出願の特定のＲ２阻害剤又はそのエステル、塩又はアミドの活性、投与経路、投与時間、使用する特定の化合物の排出速度、投与の継続期間、使用する特定のＲ２阻害剤と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物及び／又は物質、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康度及び過去の病歴、及び、医療の当該分野で良く知られている同様の要因に応じたものとなる。
医師又は獣医師は必要な医薬組成物の有効量を容易に決定及び処方することができる。例えば、医師又は獣医師は所望の治療効果を達成するために必要なレベルより低いレベルで医薬組成物中に用いられる本出願のＲ２阻害剤の投薬を開始し、そして所望の効果が達成されるまで用量を漸増することができる。
一般的に本出願のＲ２阻害剤の適当な一日当たり用量は治療効果をもたらすために有効な最低の用量である化合物の量となる。そのような有効用量は一般的に上記した要因に応じたものとなる。一般的に、患者に対する静脈内、脳室内及び皮下の用量は一日当たりキログラム体重当たり約０．０００１〜約１００ｍｇの範囲となる。
所望により、活性化合物の有効な一日当たり用量を、場合により単位剤型において、一日に渡って適切な間隔を置いて個別に投与される２、３、４、５、６回分以上のサブ用量として投与してよい。
本出願の医薬品製剤は獣医科用の組成物、例えば、牧畜又は家畜動物、例えばイヌの治療のための獣医科用途に適するＲ２阻害剤の医薬調製品も含む。この治療を受ける患者は必要とする何れかの動物、例えば霊長類、特にヒト、及び他の非ヒト哺乳類、例えばウマ、ウシ、ブタ及びヒツジ；及び一般的には家禽類及び愛玩動物である。
Ｒ２阻害剤はまた非医薬品用途のため、例えば何れかの病原体汚染物体から病原体を除去するための消毒剤として使用するため、又は、望ましくない体毛の成長を除去するための化粧品として使用するために製剤してもよい。化粧品組成物は本明細書に記載した特定の医薬組成物（例えばローション、軟膏、フィルム、パッチ等）と同様に製剤できる。
本出願のＲＮＡｉコンストラクトのようなＲ２阻害剤はまた、取り込み、分布及び／又は吸収を支援するために、例えばリポソーム、重合体、受容体標的分子、経口、直腸、局所又は他の製剤として、他の分子、分子構造又は化合物の混合物との添加混合、カプセル化、コンジュゲート又は他の会合状態としてよい。要件のＲＮＡｉコンストラクトは、浸透増強剤、担体化合物及び／又はトランスフェクション剤も含む製剤中に提供することができる。
ＲＮＡｉコンストラクト、特にｓｉＲＮＡ分子の送達に適合することができる、このような取り込み、分布及び／又は吸収を支援する製剤の製造を教示した代表的米国特許は、限定しないが、第５，１０８，９２１号；第５，３５４，８４４号；第５，４１６，０１６号；第５，４５９，１２７号；第５，５２１，２９１号；第５，５４３，１５８号；第５，５４７，９３２号；第５，５８３，０２０号；第５，５９１，７２１号；第４，４２６，３３０号；第４，５３４，８９９号；第５，０１３，５５６号；第５，１０８，９２１号；第５，２１３，８０４号；第５，２２７，１７０号；第５，２６４，２２１号；第５，３５６，６３３号；第５，３９５，６１９号；第５，４１６，０１６号；第５，４１７，９７８号；第５，４６２，８５４号；第５，４６９，８５４号；第５，５１２，２９５号；第５，５２７，５２８号；第５，５３４，２５９号；第５，５４３，１５２号；第５，５５６，９４８号；第５，５８０，５７５号；及び第５，５９５，７５６号を含む。
本出願のＲＮＡｉコンストラクトはまた、ヒトを含む動物への投与時に生物学的に活性な自身の代謝産物又は残基を（直接又は間接的に）与えることができる、何れかの製薬上許容しうる塩、エステル又はそのようなエステルの塩、又は何れかの他の化合物を含む。従って、例えば、本開示は又ＲＮＡｉコンストラクト及びｓｉＲＮＡの製薬上許容しうる塩、そのようなＲＮＡｉコンストラクトの製薬上許容しうる塩及び他の生物学的等価物にも着目している。
製薬上許容しうる塩基付加塩は金属又はアミン、例えばアルカリ及びアルカリ土類金属又は有機アミンを用いて形成する。カチオンとして使用する金属の例はナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等である。適当なアミンの例はＮ，ＮＩ−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン及びプロカインである（例えばＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１−１９参照）。該酸性化合物の塩基付加塩は、従来の態様において遊離の酸の形態を十分な量の所望の塩基と接触させて塩を生成することにより製造する。遊離の酸の形態は従来の態様において塩形態を酸と接触させ遊離の酸を単離することにより再生してよい。遊離の酸の形態は、極性溶媒中の溶解度のような特定の物理的性質において幾分その対応する塩形態とは異なるが、他の点においては塩は本発明の目的のためにはその対応する遊離酸と等価である。本明細書においては、「薬学的な付加塩」とは本発明の組成物の成分の１つの酸の形態の製薬上許容しうる塩を含む。これ等にはアミンの有機又は無機酸の塩が含有される。好ましい酸塩は塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩及びリン酸塩である。他の適当な製薬上許容しうる塩は当該分野で良く知られているものであり、種々の無機酸及び有機酸の塩基塩を含む。
ｓｉＲＮＡに関しては、製薬上許容しうる塩の例は限定しないが、（ａ）カチオン、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン、例えばスペルミン及びスペルミジン等と共に形成された塩；（ｂ）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等と共に形成された酸付加塩；（ｃ）有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等と共に形成された塩；及び（ｄ）元素アニオン、例えば塩素、臭素及びヨウ素と共に形成された塩を含む。
例示される組成物は送達系、例えばリポソーム系と混合され、そして場合により許容される賦形剤を含むＲＮＡｉコンストラクトを含む。特定の実施形態においては、組成物は例えばヘルペスウィルス感染に対する局所投与の為に製剤される。
特定の実施形態においては、要件の核酸は重合体ビヒクルを用いて送達される。重合体ビヒクルは要件核酸１つ以上と微粒子を形成してよい。特定の実施形態において、特に全身投与が望ましい場合は、ナノ粒子は直径約１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１２０ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ又以上の大きさを有してよい。特定の実施形態においては、ナノ粒子は直径約１０〜１２０ｎｍ、１０〜１００ｎｍ、５０〜１２０ｎｍ、５０〜１００ｎｍ、１０〜７０ｎｍ、５０〜７０ｎｍ又は約５０ｎｍの大きさを有してよい。特定の実施形態においては、ナノ粒子はシクロデキストリンを含む。特別の実施形態においては、ナノ粒子はシクロデキストリン共重合体、例えば米国特許第６，５０９，３２３号及び米国特許出願２００２／０１５１５２３に記載の線状シクロデキストリン共重合体及び米国特許出願２００４／００７７５９５及び２００４／０１０９８８８に記載のシクロデキストリン系重合体を含む。特別の実施形態においては、シクロデキストリンは例えば図２７及び４２に示すような本明細書に記載のｉｍ−ＣＤＰのような官能性末端を有するように改変される。特定の実施形態においては、核酸は米国特許出願２００３／０００８８１８、２００３／００１７９７２及び２００４／００６３６５４に記載のもののような封入複合体を用いて送達される。特定の実施形態においては、送達系又はビヒクルは更に１つ以上のモディファイアー又は改変成分、例えば微粒子の表面化学を変化させることができるモディファイアーを含んでよい。モディファイアーはアニオン性の成分であってよい。モディファイアーは後述するとおり特定の組織又は細胞の型をターゲティングするリガンドであってよい。モディファイアーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えばＰＥＧ５０００分子であってよい。
特定の実施形態においては、Ｒ２阻害剤又はその医薬組成物は標的細胞上の特定の細胞表面蛋白又はマトリックスに結合するために有効であるリガンド１つ以上と会合していることができ、これにより標的細胞への複合体の封鎖を促進し、そして一部の例においては細胞によるＲＮＡｉコンストラクトの取り込みを増強する。例示に過ぎないが、特定の細胞型への本発明の分子レベル以上の複合体及びリポソームのターゲティングにおける使用に適するリガンドの例を以下の表に列挙する。
（表９．種々の細胞型へのターゲティング送達のための適当なリガンド）
Figure 2012153732
 特定の実施形態においては、Ｒ２阻害剤又はその医薬組成物はガラクトースを含むターゲティングリガンド１つ以上と会合していることができる。ガラクトースを含む例示されるリガンドは例えば乳糖及び同様の分子を含む。肝アシアロ糖蛋白受容体（ＡＳＧＰＲ）は肝細胞の表面上で発現されるＣ型のレクチンである。ＡＳＧＰＲは末端β−Ｄ−ガラクトース（Ｇａｌ）又はＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を有する糖蛋白に結合する。ＡＳＧＰＲに対するリガンドの親和性は多重触角型の残基の型（Ｇａｌ ｖｓ．ＧａｌＮＡｃ）、数（４触角＞３触角＞＞２触角＞＞１触角）及び配置により異なる。ＡＳＧＰＲの各ポリペプチドサブユニット（ヒト型は４量体である）は単一の末端Ｇａｌ又はＧａｌＮＡｃに結合できる。
他の実施形態
特定の実施形態においては、本出願は治療薬、例えば本明細書に記載した阻害剤核酸の肝臓特異的送達に適する送達ビヒクルを提供する。肝臓特異的送達ビヒクルは（１）図２７に示す重合体を含有するイミダゾール改変シクロデキストリンを含むホスト成分、及び（２）図３２に示すアダマンタン−ＰＥＧ−ガラクトース分子を含むゲスト成分、を含む。治療薬１つ以上と混合されると、ゲスト及びホスト成分は、封入複合体又はポリプレックスを形成し、これは重合体内に治療薬をカプセル化して粒状の組成物を形成したものである（図３１参照）。特定の実施形態においては、送達ビヒクルは約３０〜１００ｎｍ、約４０〜７０ｎｍ、約５０〜７０ｎｍ、約５０〜６０ｎｍ又は約５０ｎｍの平均直径を有する粒状組成物を提供するように製剤される。
種々の実施形態において、肝臓特異的送達ビヒクルは、例えば肝臓特異的な疾患又は障害を治療するため、又は肝臓が関与するか影響を受ける疾患又は障害を治療するために、肝臓に何れかの型の治療薬を送達するために用いてよい。
本発明の肝臓治療薬は小分子、ペプチド又はペプチド類縁体、例えばペプチドミメティック及び核酸であることができる。本発明の核酸肝臓治療薬はアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉコンストラクト（例えばｓｉＲＮＡ）又はリボザイムであることができる。核酸肝臓治療薬はまた、遺伝子療法コンストラクト、例えば肝細胞内で発現されるべき遺伝子を送達する発現コンストラクトであってもよい。
本発明の肝臓治療薬は肝臓の疾患又は症状、例えばヒトの肝臓の疾患又は症状に対して有効である。肝臓の疾患又は症状は、例えば肝細胞又は肝臓内の病原体のような細胞の望ましくない増殖により生じる場合がある。本発明の方法及び組成物は何れかの肝臓の疾患又は症状、例えば限定しないが、肝臓癌（例えば肝細胞癌、又は他の癌、例えば膵臓癌の肝臓転移）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、Ｇ型肝炎、自己免疫性肝炎、肝硬変、アラジール症候群、アルコール性肝臓病、アルファ−１−抗トリプシン欠損症、バッド・キアリ症候群、胆道閉鎖症、バイラー病、カロリ病、クリグラー−ナジャー症候群、デュービン−ジョンソン症候群、脂肪肝、ガラクトース血症、ジルベール症候群、Ｉ型糖原病、血管腫、ヘモクロマトーシス、肝疾患に伴う掻痒症、肝臓移植、晩発性皮膚ポルフィリン症、原発性胆汁性肝硬変、プロトポルフィリン症、紅色肝症、ローター症候群、硬化性胆管炎及びウィルソン病に対して有用又は有効であってよい。従って、本発明の医薬組成物は本明細書に記載したもののような肝臓の疾患又は症状の１つ以上に対して有効であることができる。
特定の実施形態においては、本発明の肝臓治療薬は肝細胞特異的遺伝子を、例えば肝細胞特異的遺伝子の発現を調節する（阻害又は促進する）ことにより、ターゲティングする。肝細胞特異的遺伝子は一般的に他の細胞（例えばクプファー細胞）又は組織よりも肝細胞において高値の発現レベルを有する何れかの遺伝子を含む。
特定の実施形態においては、肝臓治療薬は肝臓の疾患又は症状を有する患者の肝細胞において調節不全となる遺伝子をターゲティングする。遺伝子は肝細胞特異的遺伝子であってよい。或いは、遺伝子は、例えば他の細胞及び組織と比較して肝細胞における発現が同じか低値である遺伝子のような肝細胞特異的遺伝子ではなく、そして、その遺伝子の発現及び／又は活性は正常な肝臓に由来する肝細胞と比較して肝臓疾患又は症状を有する患者の肝細胞において改変される。例えば、リボヌクレオチドレダクターゼサブユニットＩＩ（Ｒ２）は肝細胞癌において調節不全となり、即ち、Ｒ２は細胞周期を進行させている肝細胞癌では発現されるが、一般的に休止状態の正常な肝細胞では発現されない。Ｒ２をターゲティングする肝臓治療薬はＲ２の発現を特異的に低減又は阻害する核酸剤であってよく、そしてそのような核酸剤はアンチセンス分子、ＲＮＡｉコンストラクト（例えばｓｉＲＮＡコンストラクト）又はリボザイムであることができる。
肝臓治療薬は又肝臓特異的な分子又はゲノム領域、例えば肝臓癌特異的な転写調節エレメント（ＴＲＥ）、好ましくは米国特許出願２００５０１２４０６８に記載のＣＲＧ−Ｌ２調節配列をターゲティングしてもよい。肝臓治療薬はまた肝臓疾患又は症状１つ以上に関連する核酸（遺伝子又はゲノム領域）、例えば米国特許出願２００４０２４１６５７に記載の核酸をターゲティングしてもよい。
肝臓治療薬は例えば肝細胞増殖を阻害又は促進することにより肝臓の成長を阻害又は促進してよい。そのような薬剤は肝臓の保護において有用であることができ、その例は米国特許出願２００４０１７０６１３に記載されている。
本発明の別の特徴は肝臓の疾患又は症状を有する患者を治療するための方法を提供する。方法は一般的に本発明の医薬組成物の治療有効量を患者に全身投与することを含む。全身投与は種々の送達経路、例えばｉｖ又はｉｐ注射、経皮送達、肺送達又は経口の取り込みを介して達成できる。
本発明の方法及び組成物は何れかの肝臓の疾患又は症状、例えば限定しないが、肝臓癌（例えば肝細胞癌、又は他の癌、例えば膵臓癌の肝臓転移）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、Ｇ型肝炎、自己免疫性肝炎、肝硬変、アラジール症候群、アルコール性肝臓病、アルファ−１−抗トリプシン欠損症、バッド・キアリ症候群、胆道閉鎖症、バイラー病、カロリ病、クリグラー−ナジャー症候群、デュービン−ジョンソン症候群、脂肪肝、ガラクトース血症、ジルベール症候群、Ｉ型糖原病、血管腫、ヘモクロマトーシス、肝疾患に伴う掻痒症、肝臓移植、晩発性皮膚ポルフィリン症、原発性胆汁性肝硬変、プロトポルフィリン症、紅色肝症、ローター症候群、硬化性胆管炎及びウィルソン病に対して有用又は有効であってよい。
本発明の方法及び組成物は、現在使用可能又は開発中（例えば臨床治験において）の医薬品を含めて、肝臓治療薬の送達において有用である。本発明は種々の肝臓治療薬、例えば限定しないが小分子薬剤、ペプチド又はペプチド類縁体（例えばペプチドミメティック）、核酸剤（例えばＲＮＡｉコンストラクト、例えばｓｉＲＮＡコンストラクト、アンチセンス分子、酵素核酸又は他の遺伝子療法コンストラクト）又はワクチンを意図している。
アラジール症候群、即ちＡＧＳは重度の病的状態及び１０〜２０％の死亡率を有する小児における慢性肝臓疾患の主要な形態の１つである。ＡＧＳはＪａｇｇｅｄ−１遺伝子（ＪＡＧ１）における突然変異により生じると報告されている。例えばＡｌａｇｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔ．８６：６３−７１，１９７５；Ａｎａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．２７：７２９−７３７，１９９０；Ｋａｍａｔｈ ｅｔ ａｌ．，ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．４０：８９１−８９５，２００３を参照できる。従って、肝臓治療薬はＡＧＳ治療薬（又はＡＧＳに対して有効な医薬）であってよく、ＡＧＳ治療薬は突然変異したＪＡＧ１遺伝子をターゲティングする遺伝子療法コンストラクトを含んでよい。
アルコール乱用は全世界を通じて病的状態及び死亡例の先導的原因である。アルコールは身体の多くの臓器系に影響するが、最も顕著に影響されるものは恐らくは中枢神経系及び肝臓である。摂取されたアルコールのほぼ全ては肝臓で代謝され、過剰なアルコールの使用は急性及び慢性の肝疾患をもたらす場合がある。アルコール乱用に起因する肝硬変は合衆国の死亡原因１０位内の１つである。アルコール乱用は一般的に３つの病理学的に異なる肝臓疾患をもたらす。臨床慣行においては、これ等の３つの症状の何れか又は全ては同じ患者において同じ時期に共に生じる場合がある。これ等の３つの症状は（１）脂肪肝（脂肪変性）：アルコール乱用は肝臓の主な細胞型である肝細胞の内部の脂肪の蓄積をもたらす場合がある。同様の症状はアルコール乱用者ではない一部の肥満者等においても観察されえる。脂肪肝は患者が飲酒を中止すれば逆行するが、脂肪肝は脂肪変性肝炎をもたらす場合がある。脂肪変性肝炎は炎症を伴った脂肪肝であり、そしてこの症状は肝臓の瘢痕形成及び肝硬変をもたらす場合がある。（２）肝炎：アルコールは急性及び慢性の肝炎をもたらす場合がある。アルコール性肝炎を呈する患者は通常は例外的に多大な消費の最近の事例を有する慢性的な飲酒者である。他の所見もあり得る。アルコール性肝炎は異常な臨床検査数値が唯一の疾患の指標である軽度の肝炎から、黄疸（ビリルビン貯留により生じる黄色の皮膚）、肝性脳症（肝不全により生じる神経学的機能不全）、腹水（腹部の体液貯留）、出血性食道静脈瘤（食道の拡張蛇行静脈）、異常な血液の凝固及び昏睡のような合併症を伴う重度の肝不全にまで至る。組織学的には、アルコール性肝炎は肝細胞のバルーン状変性、好中球及び場合によってはマロリー体を伴った炎症を有する特徴的な外観を有する（細胞の中間フィラメント蛋白の異常な凝集）。（３）肝硬変は線維症と組み合わせられた肝臓の広範な結節を解剖学的特徴とする。線維症及び結節の形成は正常な肝臓の構造を歪曲させ、これが肝臓を経由する血流を妨害する。肝硬変により肝臓はまたその生化学的機能を実行することが不可能となる。合衆国においては、アルコール乱用は肝硬変の主要原因である。解剖学的には、アルコール性肝硬変はほぼ常時、微小結節性である（即ち、再生されている肝臓結節は小型である）。
肝硬変はまた何れかの慢性の肝臓疾患、例えば慢性Ｂ、ＣおよびＤ型肝炎、慢性自己免疫性肝炎、遺伝性の代謝疾患（例えばヘモクロマトーシス、ウィルソン病）、慢性胆管疾患、慢性鬱血性心不全、寄生虫感染症（例えば住血吸虫症）、非アルコール性脂肪変性肝炎（脂肪肝により生じる場合がある肝臓の炎症）又は毒素又は薬物への長期曝露によっても誘発されえる。
肝硬変の治療は一般的に伏在する病因により変動する。アルコール摂取の停止によりアルコール性肝硬変の進行は停止し、そしてこの理由により、慢性のアルコール乱用者においては早期の診断が重要である。同様に、肝毒性の薬物の中止又は環境の毒素の除去が進行を停止させる。ヘモクロマトーシスにおける鉄の過剰負荷及びウィルソン病における銅の過剰負荷の治療のような代謝性疾患の治療もまた有効な治療法である。慢性のウィルス製のＢ型及びＣ型の肝炎はインターフェロンによる治療に応答する場合があり、そして自己免疫性の肝炎はプレドニソン及びアザチオプリン（イムラン）により改善する場合がある。ウルソジオール（アクチガル）のような薬剤は原発性胆汁性肝硬変及び恐らくは硬化性胆管炎の進行を遅延させる場合がある。肝臓移植は末期の肝硬変の治療のためには高度に有効である。
胆汁鬱滞、即ち進行性家族性肝臓内１型のもの、即ちＰＦＩＣ１、及び、良性の再発性の肝臓内胆汁鬱滞（ＢＲＩＣ）はＡＴＰ８Ｂ１遺伝子の突然変異により誘発される。進行性家族性肝臓内胆汁鬱滞の第２の型（ＰＦＩＣ２）は肝臓特異的なＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送物質（ＢＳＥＰ）の突然変異により誘発される。ＰＦＩＣ３はクラスＩＩＩの多剤耐性Ｐ糖蛋白（ＭＤＲ３）の突然変異により誘発される。ＰＦＩＣ４は３−ベータ−ヒドロキシ−デルタ−５−Ｃ２７−ステロイドオキシドレダクターゼ（ＨＳＤ３Ｂ７）の突然変異により誘発される。例えばＧｈｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔ．９３：１２７−１３２，１９７８；Ｔｒａｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：１２１７−１２２７，１９９８；Ｗｈｉｔｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｎｕｔｒ．１８：１３４−１４１，１９９４を参照できる。
肝臓癌は以下の非限定的な例、即ち肝臓の転移癌、胆管癌又は肝細胞癌の何れかであることができる。
転移癌は臓器又は起源から拡張する腫瘍である。その血流供給のため、肝臓は一部の癌が拡張するための共通の部位となる。肝臓に拡張してくる最も一般的な癌の一部は結腸、膵臓、肺及び乳房を起源とするものである。リンパ腫及び白血病もまた肝臓を侵襲する場合がある。胆管癌は肝臓内部の胆管の細胞から生じる癌である。胆管癌はまた、固有肝の外部の胆管に生じる場合もある。
肝細胞癌は肝臓の主要な細胞の型である肝細胞から生じる癌である。世界的には、肝細胞癌は癌の死亡例の最大２原因に属している。アジア及びアフリカの一部で特に蔓延している。肝細胞癌を有する者の約８０％が肝硬変を有している。Ｂ型肝炎ウィルス及びＣ型肝炎ウィルスによる慢性の感染もまた肝細胞癌を発症する危険性を増大させる。木の実類（最も一般的にはピーナツ）、穀類及び豆類の汚染物質であるカビにより生産されるアフラトキシンもまた肝細胞癌を誘発させる主要危険因子として関与を示唆されている。合衆国においては実質的には非存在であるが、アフラトキシンは世界の他の一部では一般的なものであり、そして、しばしば食品を汚染している。
デュービン−ジョンソン症候群は、多剤耐性関連蛋白２（ＭＲＰ２）とも称され、胆管の有機アニオン輸送において重要な役割を果たしている管状（肝細胞の先端部分）の多重特異性の臓器アニオン輸送物質（ＣＭＯＡＴ）における突然変異により誘発される。Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．７：２０３−２０７，１９８８。
遺伝性の高ビリルビン血症（Ｗｏｌｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（出版）（第５版），１９８３，ｐｐ．１３８５−１４２０）は（１）主に未結合型の高ビリルビン血症をもたらすもの：ジルベール−アリアス症候群、クリグラー−ナジャー症候群Ｉ型及びクリグラー−ナジャー症候群ＩＩ型；（２）主に結合型の高ビリルビン血症をもたらすもの：デュービン−ジョンソン症候群、ローター症候群及び肝臓内胆汁鬱滞の数種の型を含む。詳細な研究によれば、ジルベール症候群を有する患者はビリルビングルクロノシルトランスフェラーゼの低減した活性を有することがわかっている。Ｂｏｓｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３３：１１７１−１１７５，１９９５。しかしながらジルベール症候群はＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＵＧＴ１Ａ１）の突然変異により生じることがわかっている。同じ遺伝子における突然変異はクリグラー−ナジャー症候群Ｉ型及びクリグラー−ナジャー症候群ＩＩ型を誘発する。従って、ＵＧＴ１Ａ１をターゲティングする肝臓治療薬はこれ等の遺伝性の高ビリルビン血症に対して有効である場合がある。
脂肪肝の状態は脂肪変性とも称され、そして肝臓の炎症を伴った脂肪肝は脂肪変性肝炎と称される。脂肪変性及び脂肪変性肝炎はアルコール及び他の薬物により誘発される場合があり、そして場合によっては真性糖尿病患者においても生じる。アルコールにより誘発されていない脂肪変性肝炎は場合により非アルコール性脂肪変性肝炎、即ち「ＮＡＳＨ」とも称される。
古典的なガラクトース血症はガラクトース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ遺伝子（ＧＡＬＴ）の突然変異により誘発される。
糖原病はグルコース−６−ホスファターゼの欠損により誘発される。肝臓及び腎臓がこの障害に関与しており、そして低血糖症が主要な問題である。この障害は又、肝細胞腺腫にも関連付けられている。Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ．１９９３；１５２Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ６３−７０。
肝血管腫には２つの型、即ち海綿状のもの及び血管内皮腫が存在する。血管内皮腫は一般的に小児においてのみ観察される。海綿状血管腫は成人における最も一般的な良性の肝臓腫瘍であるが、全年齢及び全世界における個体において生じる。
古典的なヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）、即ち常染色体劣性障害は染色体６ｐ２１．３上のＨＦＥと表記される遺伝子における突然変異により最も頻繁に生じる。１ｑ２１にマッピングされているヘモジュベリン（ＨＪＶ）をコードする遺伝子における突然変異によって誘発されることもわかっている。若年性ヘモクロマトーシス即ちヘモクロマトーシス２型（ＨＦＥ２）もまた常染色体劣性である。ＨＦＥ２Ａと表記される１つの型はＨＪＶ遺伝子における突然変異により誘発される。ＨＦＥ２Ｂと表記される第２の型は１９ｑ１３にマッピングされているヘプシジン抗微生物ペプチド（ＨＡＭＰ）をコードする遺伝子における突然変異によって誘発される。常染色体劣性障害のヘモクロマトーシス３型（ＨＦＥ３）は７ｑ２２にマッピングされているトランスフェリン受容体２（ＴＦＲ２）をコードする遺伝子における突然変異によって誘発される。常染色体優性障害のヘモクロマトーシス４型（ＨＦＥ４）は、フェロポルチンをコードし、そして２ｑ３２にマッピングされているＳＬＣ４０Ａ１遺伝子における突然変異によって誘発される。ヘモクロマトーシスの臨床的特徴は肝硬変、糖尿病、皮膚黒色色素沈着亢進及び心不全を含む。肝硬変に合併する原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）は、罹患したホモ接合体における死亡例の約三分の一の原因となっている。ヘモクロマトーシスは診断されれば比較的容易に治療される障害であるため、防止可能な癌の形態である。
Ａ型肝炎（ＨＡ）又はＡ型ウイルス性肝炎という用語は、全ての以前の表記、即ち、感染性肝炎、流行性肝炎、流行性黄疸、カタル性黄疸、感染性黄疸、ボトキンス病及びＭＳ−１肝炎を置き換えている。Ａ型肝炎は疾患の急性又は早期の回復期の間に採取された血清中にＩｇＭクラスの抗ＨＡＶを検出することにより診断される。Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）は、ピコルナウイルス科ファミリーのエンテロウイルス属として分類される。ＨＡＶは小型（直径２７ｎｍ）の蛋白カプシドにより包囲されたＲＮＡの単一の分子および１．３３ｇ／ｍｌのＣｓＣｌ中の浮遊密度を有する。
Ｂ型肝炎はヘパドナウィルス科の大部分は２本鎖ＤＮＡウィルスであるＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）により一般的には誘発される。ＨＢＶはヒトにおいて肝炎を生じさせ、このファミリーの関連ウィルスはアヒル、ジリス及びウッドチャックにおいて肝炎を誘発する。ＨＢＶのゲノムは４つの遺伝子、即ち、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｐｒｅ−ｃｏｒｅ及びＸを有し、それぞれがウィルスＤＮＡポリメラーゼ、エンベロープ蛋白、プレコア蛋白（プロセシングされてウィルスカプシドになる）及びプロテインＸをコードしている。プロテインＸの機能は明らかではないが、宿主細胞遺伝子の活性化及び癌の発症に関与している可能性がある。
アルファ−インターフェロンは慢性Ｂ型肝炎の治療の為に合衆国で認可された最初の薬剤であった。インターフェロン治療は「複製疾患」を有する（ＨＢｅＡｇ陽性）個体に対して推奨される。このような個体の約４０％がインターフェロンアルファによる治療の１６週間後には血清中ＨＢｅＡｇを消失させることになる。ＨＢｅＡｇの消失は良好化した予後と相関している。数人の治療患者（１０％未満）はＨＢｅＡｇの消失により判断して治癒している場合もある。慢性Ｂ型肝炎の他の治療はヌクレオシド類縁体を含む。１９９８年１２月、合衆国食品医薬品局は（ＦＤＡ）は慢性Ｂ型肝炎（ＨＢｅＡｇ陽性患者）の治療に関して、３ＴＣとしても知られＨＩＶに対しても有効であるラミブジンを認可している。ラミブジンは慢性Ｂ型肝炎に対し１００ｍｇ／日で経口服用される。それらを比較した試験では、血清中ＨＢｅＡｇの消失の誘導においてラミブジンはインターフェロンアルファと等しく効果的であった。１年間治療を受けた患者において肝生検所見を改善することも知られている。２００２年９月、ＦＤＡはＢ型肝炎の治療に関してＨＩＶに対しても有効である別のヌクレオシド類縁体であるアデボフィルジピボキシルを認可した。用量は慢性Ｂ型肝炎に対して１０ｍｇ／日である。現時点において、他のヌクレオシド類縁体が臨床治験において試験中である。インターフェロンアルファとヌクレオシド類縁体の組合せ、二種のヌクレオシド類縁体の併用（例えばラミブジン及びアデフォビル）もまた検討中である。他のヌクレオシド類縁体、例えばファムシクロビル、ロブカビル及びアドフォビルもまた慢性Ｂ型肝炎を治療するための複合療法に関して試験されている。Ｙａｏ ａｎｄ Ｇｉｓｈｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９９９，１：２０−２６。
全世界で約１７０，０００，０００人、合衆国で４，０００，０００人がＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）に感染している。ウィルスは血液及び血液製剤により主に伝染する。ＨＣＶに急性感染している個体の約８５％が慢性感染となる。従って、ＨＣＶは慢性（６ヶ月より長く持続する）肝炎の主要原因である。慢性感染後は、ウィルスは治療非存在下ではほぼ全く浄化されない。稀少な例においてはＨＣＶ感染は臨床的に急性の疾患、更には肝不全を誘発するが、急性感染の大部分の例は臨床的には検出不可能である。ＨＣＶはフラビウィルス科のファミリーにおいて陽性の１本鎖ＲＮＡウィルスである。ゲノムは約１０，０００ヌクレオチドであり、そして約３，０００アミノ酸の単一のポリ蛋白をコードする。ポリ蛋白は宿主細胞及びウィルスプロテアーゼによりプロセシングされてウィルスの複製に必要な３種の主要な構造蛋白及び数種の非構造蛋白となる。僅かに異なるゲノム配列を有するＨＣＶの数種の異なる遺伝子型が発見されており、それらはインターフェロンアルファにより治療への応答の相違に相関している。Ｃ型肝炎に対する全ての現在の治療プロトコルは筋肉内又は皮下注射により投与されるインターフェロンアルファの種々の調製品の使用に基づいている。インターフェロンアルファ−２ａ（ロフェロン−Ａ；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、インターフェロンアルファ−２ｂ（イントロン−Ａ；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）及びインターフェロンアルファコンー１（インフェルゲン；Ｉｎｔｅｒｍｕｎｅ）は全て単剤として慢性Ｃ型肝炎を有する成人の治療に関して合衆国で認可されている。場合によりｐｅｇ化インターフェロンとも称されるｐｅｇインターフェロンアルファもまた慢性Ｃ型肝炎の治療の為に使用可能となっている。Ｃ型肝炎を有する患者において検討されているｐｅｇインターフェロンアルファには２種の製剤、即ち、ｐｅｇインターフェロンアルファ−２ｂ（Ｐｅｇ−イントロン；Ｓｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）及びｐｅｇインターフェロンアルファ−２ａ（Ｐｅｇアシス；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）が存在する。ｐｅｇインターフェロンアルファ−２ａ単独では、患者の約３０％〜４０％が２４〜４８週間治療への持続的応答を達成する。Ｚｅｕｚｅｍ
ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０００；３４３：１６６６−１１７２；Ｈｅａｔｈｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０００；３４３：６７３−１６８０。リバビリンをインターフェロンアルファに追加すると、インターフェロンアルファ単独よりも慢性Ｃ型肝炎の治療において優れたものとなる。リバビリンは広範なウィルススペクトルに対して活性を有する合成ヌクレオシドである。ＦＤＡはまた過去のインターフェロンアルファ治療の後に回帰した慢性Ｃ型肝炎を有する個体の治療に関してインターフェロンアルファ−２ｂ＋リバビリンを認可している。更に又、インターフェロンアルファ−２ｂ＋リバビリンの組合せは、インターフェロンによる治療歴のない慢性Ｃ型肝炎患者の治療においては、インターフェロンアルファ−２ｂ単独の場合よりも持続応答の達成においてより有効であり、そしてこのことは１９９８年１２月のこの適応症に対するＦＤＡ認可をもたらした。ＦＤＡはまた慢性Ｃ型肝炎の治療に関してｐｅｇインターフェロンアルファ＋リバビリンの組合せを認可している。
ｐｅｇインターフェロンアルファのＶＸ−４９７（Ｖｅｒｔｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）と称される化合物との臨床治験もまた進行中である。ＶＸ−４９７はリバビリンと同様の一部特徴を有し、そしてその作用の一部に関わるイノシンモノホスフェートデヒドロゲナーゼとして知られた細胞内酵素を阻害する。Ｃ型肝炎を治療する薬剤又は治療薬の新しい世代は、Ｃ型肝炎ウィルスの機能を阻害するように特に設計されたものを含む。このような薬剤の１つの標的はＣ型肝炎ウィルスＲＮＡゲノムである。リボザイム（ヘパタザイム、Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）はウィルスが生存するために必要とする領域においてＣ型肝炎ウィルスＲＮＡゲノムを切断するために設計されている。Ｃ型肝炎ウィルスＲＮＡを切断する場合のその効力は試験管内では確立されており、薬剤は現在、初期臨床治験に付されている。ＩＳＩＳ−１４８０３（Ｉｓｉｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）はＣ型肝炎ウィルスＲＮＡの保存された配列に相補なアンチセンス阻害剤である。分子はウィルスＲＮＡに結合し、そして複製に必要な蛋白の発現を阻害する。ＩＳＩＳ−１４８０３は現在、初期臨床治験に付されている。ＶＰ−５０４０６（ＶｉｒｏＰｈａｒｍａ）として知られている小分子もまた実験室においてＣ型肝炎ウィルスＲＮＡを阻害することが明らかにされており、初期の臨床開発に付されている。内部リボソーム進入部位、即ちＩＲＥＳとして知られている蛋白合成のために必要なＣ型肝炎ウィルスＲＮＡの独特の構造の阻害剤もまた、実験室における研究に付されている。
Ｄ型肝炎ウィルス（デルタウィルスとも称する）は小型の環状ＲＮＡウィルスである。Ｄ型肝炎ウィルスは複製欠損であり、従って別のウィルスの非存在下に増殖することはできない。ヒトにおいては、Ｄ型肝炎ウィルスの感染はＢ型肝炎感染の存在下においてのみ起こる。慢性のＢ型肝炎及びＤ型肝炎の感染を有する患者を治療するためにはインターフェロンアルファが使用される。
Ｅ型肝炎ウィルス（ＨＥＶ）は約８ｋｂの１本鎖ポリアデニル化ＲＮＡゲノムを有する。その物理化学的特性に基づいて、カリシ様ウィルスであると推測されている。ＨＥＶにより誘発される疾患はＥ型肝炎又は経腸伝染非Ａ非Ｂ型肝炎（ＥＴ−ＮＡＮＢＨ）と称される。他の名称は糞口感染非Ａ非Ｂ型及びＡ様非Ａ非Ｂ型肝炎を含む。
Ｇ型肝炎ウィルス（ＨＧＶ）はＨＣＶに関連するフラビウィルスである。
現時点で肝疾患に伴う掻痒症の治療の為に使用される数種の医薬品が存在する。これ等の医薬品はコレスチルアミン、抗生物質リファンピシン、アヘン拮抗剤ナロキソン及びナルトレキソン、及び、セロトニン３型受容体拮抗剤を含む。肝臓疾患に起因する掻痒症の治療のための薬剤ガパペンチンの使用に関する臨床治験（ＩＲＢプロトコル＃９６１８）。
晩発性皮膚ポルフィリン症は光感受性の皮膚炎を特徴とする常染色体優性障害であり、尿中のウロポルフィリンの大量排出を伴う。低減した肝臓及び赤血球のウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ活性が晩発性皮膚ポルフィリン症の家族性（Ｋｕｓｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７６Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５８：１０８９−１０９７；Ｌｅｈｒ
ａｎｄ Ｄｏｓｓ，１９８１，Ｄｔｓｃｈ．Ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．１０６：２４１−２４５）及び散発性（Ｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９９：２７４−２７８；Ｆｅｌｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９９：１０９５−１０９８）の症例において報告されている。
原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）は肝臓内部の小型胆管の炎症性の破壊を特徴とする疾患である。ＰＢＣは最終的には肝硬変に至る。ＰＢＣの原因は不明であるが、自己抗体の存在により一般的には自己免疫疾患と考えられている。他の病因、例えば感染性物質も完全には排除されていない。ＰＢＣ患者はこの疾患の共通した合併症である骨粗鬆症（骨損失）の防止の為にビタミン及びカルシウムの摂取を推奨される。コルヒチンは肝線維症の抑制において役割を果たし、そして検査値を改善するが、兆候や症状は改善しない。種々の免疫抑制剤がＰＢＣ患者で検討されている。コルチコステロイドは恐らくは有効ではなく、ＰＢＣ患者に共通して存在する骨粗鬆症を悪化させる場合がある。アザチオプリン（イヌラン）、メトトレキセート及びシクロスポリンＡが数例の研究において調べられている。胆汁酸であるウルソジオール（アクチガル又はウルソ）はＰＢＣ患者の検査値及び臨床パラメーターを改善することがわかっており、そして１つの研究の結果は疾患の進行を遅延することを示唆している。正常位肝移植はＰＢＣに起因する末期肝臓疾患の患者においては高度に良好な結果を示す。
紅色肝性プロトポルフィリン症即ちＥＰＰは不完全浸透度の常染色体優性として遺伝する。ハプロタイプ分離比分析を用いてＧｏｕｙａ等（２００２）はイントロン性の単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）、ＩＶＳ３−４８Ｔ−Ｃ（１７７０００．００１５）を発見しており、これは正常なものの６３ｂｐ上流にある構成的異常アクセプタースプライス部位の使用をモジュレートする。異常にスプライスされたｍＲＮＡは非センス媒介崩壊機序（ＮＭＤ）により分解され、ｍＲＮＡの低減した定常状態レベル及びＥＰＰ表現型発現に必要な追加的ＦＥＣＨ酵素欠損をもたらす。
原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）は肝硬変をもたらす肝内及び肝外の胆管の炎症、破壊及び線維症を特徴とする慢性の肝臓疾患である。ＰＳＣは細菌性の胆管炎（細菌による胆管の感染）の再発性のエピソードと合併する場合が多い。ＰＳＣ患者はまた胆管癌（胆管の癌）の増大した危険性を有する。正常位肝臓移植はＰＳＣにより誘発された進行肝臓疾患を有する患者の治療において高度に有効である。
ウィルソン病は劇的な肝細胞内銅蓄積とその後の肝臓及び神経の異常を特徴とする常染色体劣性障害である。ウィルソン病においては、基底核及び肝臓は、それぞれ神経学的な顕在性及び硬変の兆候においてそれら自身を発現する変化を起こす。銅代謝の撹乱が機序にある程度関与している。Ｂｅａｒｎ，Ｓｔａｎｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（出版）（第３版）１９７２、Ｐｐ．１０３３−１０５０。
肝臓移植は他の治療が不成功となった特定の肝臓の疾患又は症状に対して推奨される場合がある。そのような肝臓の疾患又は症状の例は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、尿素回路欠損、家族性高コレステロール血症、アルコール誘導肝硬変、糖原病、自己免疫性肝炎、Ｉ型原発性高シュウ酸尿症、特発性肝硬変、Ｉ型クリグラー−ナジャー症候群、先天性肝線維症、ニーマン−ピック病、原発性胆汁性肝硬変、家族性アミロイドーシス、胆道閉鎖症、肝細胞癌、原発性硬化性胆管炎、胚芽細胞腫、アラジール症候群、血管内皮腫、家族性胆汁鬱滞症、非カルチノイド神経内分泌、薬剤誘導肝不全、肝臓腫瘍、急性／劇症肝不全、バッド−キアーリ症候群、アルファ−１−抗トリプシン欠損、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、チロシン血症、プロトポルフィリン症又は嚢胞性線維症を含む。
本開示内容はここでは一般的に説明するが、本開示の特定の特徴及び実施形態の説明を目的とするためのみに包含され、そして開示内容を限定する意図の無い以下の実施例を参照すればより容易に理解される。
実施例１：ｓｉＲＮＡの設計及び試験
ＲＮＡ干渉、即ちＲＮＡｉは植物（転写後の遺伝子サイレンシング即ちＰＴＧＳとして知られる）、Ｃ・エレガンス及びショウジョウバエにおいて最初に説明された遺伝子サイレンシング機序である（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｃａｒｍｅｌｌ
ｅｔ ａｌ．，２００２において考察されている）。現在のモデルにおいては、ＲＮＡｉの経路は２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）「トリガー」により活性化され、これが次に細胞酵素ダイサーによりプロセシングされ、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と称される短い２１〜２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡとなる。ｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内に取り込まれ、そこでｓｉＲＮＡアンチセンス鎖は、ｓｉＲＮＡガイドの５’末端から約１０塩基のｓｉＲＮＡ／標的デュプレックス内にエンドヌクレアーゼ切断に関して相同ｍＲＮＡをターゲティングするためのガイドとして機能する。哺乳類細胞においては３０ヌクレオチドを超えるｄｓＲＮＡはＲＮＡｉではなく非特異的なインターフェロン経路をトリガーする。しかしながら、Ｔｕｓｃｈｌ等（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ
ａｌ．，２００１ａ：Ｈａｒｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｃａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）によれば哺乳類細胞に外因性に導入されたより短いｓｉＲＮＡはダイサー工程を迂回し、インターフェロン応答を開始させることなく相同ｍＲＮＡ分解を直接活性化する。その後、多くの研究期間がヒトウィルス及び細胞標的に対してインビボでｓｉＲＮＡ及び関連の短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現することの実現可能性を明らかにした。ＲＮＡｉの進歩は急速に進んでおり、そして治療用途に向けた多大な進展が既に存在している（Ｚａｍｏｒｅ，２００１；Ｋｉｔａｂｗａｌｌａ ａｎｄ Ｒｕｐｒｅｃｈｔ，２００２；Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｃｏｕｚｉｎ，２００３；Ｓｃｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｈａｎｎｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，２００４）。
合成ｓｉＲＮＡは外因性の短期使用のために選択される方法である。現在、未改変のｓｉＲＮＡは典型的にはトランスフェクション後２〜３日に最大となるＲＮＡｉ作用を媒介する。合成ｓｉＲＮＡに関する最も一般的な設計はトリガーｄｓＲＮＡのダイサー切断により生じる内因性ｓｉＲＮＡを模倣している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１ａ）のに対し、センス及びアンチセンスの鎖は２１〜２３ヌクレオチド長である。デュプレックスのアニーリング部分は両方の３’末端の２ヌクレオチドオーバーハングを除いて完全に相補である。合成ｓｉＲＮＡについては、３’ジヌクレオチドオーバーハングは標的配列から、その天然の対応物の場合のように誘導することができる。２１〜２３量体から構築されたｓｉＲＮＡが大部分の目的の為に十分であるが、２９ヌクレオチドまでのオリゴマーをインターフェロンの応答の開始を伴うことなく使用できる。本発明者等はダイサーの作用により細胞内でより長い２本鎖ＲＮＡから生成したｓｉＲＮＡは外因性に提供される２１量体よりも１００倍まで強力であり得ることを観察している（Ｋｉｍ ｅｔ
ａｌ．，２００５）。Ｓｉｏｌａｓ等（２００５）による共同著書は同様の結論を示しているが、これ等の研究者等はダイサー基質として合成ヘアピンを使用している。本明細書において提案される試験は、動物試験において使用するための強力なｓｉＲＮＡを形成するために、これ等の重要な発見を利用することになる。ダイサー基質デュプレックスＲＮＡから形成されるｓｉＲＮＡの厳密な予測を可能にする新しい設計の規則を以下に述べる。
ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖と標的との間のミスマッチはそれらの数及び位置に応じて、様々な程度にまで活性を低下させる傾向を有する。ｓｉＲＮＡ／標的ミスマッチとＲＮＡｉ活性の間の関連性を支配する規則は完全には樹立されていないが、ｓｉＲＮＡ及び単純なｓｈＲＮＡの両方に恐らくは適用される一部の一般化を行うことができる。エンドヌクレアーゼ切断部位の近傍の突然変異は常時ではないが頻繁にＲＮＡｉ作用を低下させる。更にまた、アンチセンス鎖の前半（５’末端）における突然変異は極めて有害である（Ｒａｎｄａｌｌ ａｎｄ Ｒｉｃｅ，２００１；Ｈｏｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。エンドヌクレアーゼ切断はアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖の５’末端から「採寸」されるため、ガイド鎖の５’末端における突然変異は活性化ＲＩＳＣ複合体におけるアンチセンス／ｍＲＮＡ標的デュプレックスを脱安定化させ、切断を阻害する。総括すれば、これ等の結果は、特定のアイソフォームをターゲティングするためにＲＮＡｉコンストラクトを設計する場合には、その相当するｓｉＲＮＡと非ターゲティングのアイソフォームとの間のミスマッチがデュプレックスの５’末端内に属するように標的アイソフォーム内の標的部位を選択することが望ましいことを示唆している。これが不可能な場合、例えば切断の為の接触が不可能な標的の場合（Ｓｃｈｅｒｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，２００３ｂ）には、交差反応性を試験することが重要である。
２１〜２３量体から構築されたｓｉＲＮＡが大部分の目的の為に十分であるが、２９ヌクレオチドまでのオリゴマーをインターフェロンの作用の開始を伴うことなく使用できる。本発明者等はダイサーの作用により細胞内でより長い２本鎖ＲＮＡから生成したｓｉＲＮＡは外因性に提供される２１量体よりも１００倍まで強力であり得ることを観察している（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００５）。Ｓｉｏｌａｓ等（２００５）による共同著書は同様の結論を示しているが、これ等の研究者等はダイサー基質として合成ヘアピンを使用している。提案される試験は、動物試験において使用するための強力なｓｉＲＮＡを形成するために、これ等の重要な発見を利用することになる。ダイサー基質デュプレックスＲＮＡから形成されるｓｉＲＮＡの厳密な予測を可能にする新しい設計の規則を述べる。
ショウジョウバエの胚の溶解物における実験によれば、合成ｓｉＲＮＡ鎖上の遊離の５’−ＯＨ又は５’−ホスフェートの何れかの必要性が示された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ
ａｌ．，２００１ｂ；Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。同様の結果がＨｅＬａ抽出物（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００２）又は未損傷細胞（Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｒａｎａ，２００２）においても観察されている。一方又は他方のｓｉＲＮＡ鎖の非対称５’−アミノ改変は、アンチセンス鎖の５’アミノ改変はＲＮＡｉを消滅させるが、センス鎖のみの同様の改変はＲＮＡｉ作用を阻害しないことを示している。更に又、細胞内にトランスフェクトされ、その後再度単離された非ホスホリル化合成ｓｉＲＮＡはホスファターゼにより予め処理しない限り、インビトロでキナーゼ作用を受けることができない（Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｒａｎａ，２００２）。総括すれば、これはアンチセンス鎖上の５’ホスフェートについてインビボの強力な必要性を示唆している。このことは、このヌクレオチドの改変はアンチセンス鎖が活性化ＲＩＳＣ複合体のエンドヌクレアーゼ切断に関するガイドとして機能する能力を妨害するという仮説に合致する。一方、３’末端をブロックする改変はデュプレックスｓｉＲＮＡに対しては、何れの鎖に対しても、大部分の場合においては殆ど影響しない（Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
ｓｉＲＮＡデュプレックスに対する骨格の改変の試験によれば、５’及び３’末端の間に分布しているｓｉＲＮＡ鎖当たり６つまでの２’−Ｏ−メチル、又は、３’末端における２つの２’−Ｏ−アリル改変はＲＮＡｉに悪影響を与えないことがわかった（Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。この点を超えた改変の数の増大又は５’末端におけるアリル改変はＲＮＡｉを低減する（Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｈｏｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。逆に、２つより多いホスホロチオレート改変は細胞毒性であるが力価の有意な増大は促進しない（Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ｓｉＲＮＡの骨格改変の利点は、骨格の改変がこれ等の分子の半減期を延長するため、ｓｉＲＮＡを直接動物に注射する場合にのみ実感される（Ｌａｙｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００４）。今回本発明者等はシクロデキストリンナノ粒子担体により可能となった血清中ヌクレアーゼからの保護を利用しており、従って、本発明者等のＲＮＡは骨格改変されないことになり、従ってインビボで効果的にダイサー作用に付されることができる。
配列の定義
ＲＮＡｉはカチオン性脂質又は他の担体を用いて細胞に送達された合成ｓｉＲＮＡにより、又は、ｓｉＲＮＡ内にプロセシングされた２１量体のセンス及びアンチセンス鎖又は短鎖ヘアピンＲＮＡの遺伝子発現を介してトリガーすることができる（Ｓｃｈｅｒｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，２００３ａにより考察されている）。ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンの成功の重要な決定要因は、標的部位の接触し易さとｓｉＲＮＡからの適切な鎖の選択の組合せである。本発明者等は標的部位とｓｉＲＮＡデュプレックスの適切な組み合わせを発見するアルゴリズムを開発している（Ｈｅａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。本発明者等のアルゴリズムは標的部位の二次構造の予測及びｓｉＲＮＡのデュプレックス末端安定性を考慮している。後者はＲＩＳＣに入れるアンチセンス鎖の選択において重要である（Ｋｈｖｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｔｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＲＮＡｓｅＩＩＩファミリーメンバーダイサーにより切断されるために十分長いｄｓＲＮＡは２１量体のｓｉＲＮＡよりも１００倍まで強力であることができることがわかっている（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｓｉｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）。即ち標的部位及びｓｉＲＮＡの発見のための本発明者等の好ましい方法は本発明者等のアルゴリズム（Ｈｅａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）を用いて配列モチーフを決定し、潜在的標的配列及び２１量体ｓｉＲＮＡを発見し、そして相対的効力に関して数種の２１量体を試験することである。
最適標的部位を決定するための新しいコンピューターアルゴリズムを用いてヒトＲ２（ｈＲＲＭ２）遺伝子内の３つの潜在的標的部位を発見した（図４参照）（Ｈｅａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅ３０（２００５））。これ等の３つの標的配列に指向されたｓｉＲＮＡを合成し、後述する細胞抽出液プレスクリーニング試験において試験した。細胞抽出液結合試験における３標的部位に対して指向されたｓｉＲＮＡに関する結果を図５に示す。
２１量体をプレスクリーニングに際しては細胞抽出液結合試験が細胞内薬効を高度に予測可能であることを本発明者等は発見していた（Ｋｉｍ，Ａｍａｒｚｇｕｏｉ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ、執筆中）。概すれば、合成の２１量体をその５’末端において３２Ｐで標識し、室温でＨＥＫ２９３原形質抽出液中インキュベートした。ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣ成分アルゴノート２（Ａｇｏ２）を含有する複合体に結合することができる。結合効率は細胞内力価と強い相関を有する（図６Ａ〜６Ｃ）。本発明者等が最も強力な２１量体を発見した後、その配列を、ダイサーの基質である２７塩基デュプレックス内に取り込む（図６Ａ〜６Ｃ）。本発明者等は選択された２１量体のみが２７量体から生産されるようにダイサー処理のフォーマットを確立している（後述参照）。即ち、選択された２７量体を用いることに対する唯一の制約は送達である。インビボのダイサー処理のための本発明者等の好ましい基質は以下の一般的特徴を有する。
Figure 2012153732
 インビボダイサー処理及びダイサー処理産物の質量スペクトル分析を用いることにより、本発明者等はダイサーが２塩基３プライムオーバーハングを認識し、センス鎖の５’末端から２１塩基、そして、２塩基オーバーハングから２１塩基を切断して１つのみの２１量体を形成することを測定した。センス鎖の３’末端に２つのデオキシリボヌクレオチドを含ませることにより（ｄＮ）、ダイサーはこのデュプレックスの右側から進入しなくなり、即ち目的の２１量体のみの形成が確保されるのである。図６Ａ〜６Ｃもまた１塩基が異なる２１量体のシリーズを抽出液と共にインキュベートした抽出液結合試験の結果を示す。ｓｉＲＮＡの結合親和性は標的のノックダウンと緊密に相関している。本発明者等は２０種の異なるｓｉＲＮＡについてこの試験を反復し、そして相関は維持されている。
ヒト及びマウスのＲ２配列を本発明者等のアルゴリズムに付した（Ｈｅａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。上位５種の予測ｓｉＲＮＡ及び標的について他のネズミ配列との潜在的相補性に関して分析し、アンチセンス鎖の５’末端における伸長されたマッチを探した。他の標的に関して伸長された５’相同性を共有しない配列を抽出液結合試験で試験することになり、最高結合物質を使用することになる。２１量体の配列は上記した２７／２９量体のフォーマット内に組み込まれ、伸長配列は標的ｍＲＮＡから誘導する。ｄｓＲＮＡを細胞培養物中５ｎＭ〜５ｐＭの範囲の濃度において滴定する。最低のＩＣ５０値を有するｄｓＲＮＡを後のインビボ実験において使用した。オフターゲティングが潜在的に問題となるため、プレスクリーニングした配列であっても、アルファ及びベータインターフェロンの活性化をＥＬＩＳＡ試験及びネズミマイクロアレイ分析により日常的に試験する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
材料及び方法
図６Ａ：ＲＮＡｉ試験。同時トランスフェクション試験については、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションの前日に６０％コンフルエントとなっている２４穴プレートに播種した。各ＲＮＡの少量をレポーターベクターを含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）５０μＬ中に希釈し、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）１．５μＬを含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ５０μＬと混合した。混合物を室温で１５分間インキュベートし、培地の終容量５００μＬとなるように細胞に添加した。トランスフェクション効率を規格化するために、各試験では標的及び／又はデュプレックスＲＮＡと赤色蛍光蛋白（ＲＦＰ）レポータープラスミドの同時トランスフェクションを行った。トランスフェクション効率の変動が１０％未満（ＲＦＰ発現により測定）であった実験のみを評価した。ＥＧＦＰ発現のレベルはトランスフェクション後２４時間に測定した。ＥＧＦＰ発現は蛍光スペクトル分析器で測定した。
図６Ｂ：ゲルシフト分析。１０ｃｍプレート中のコンフルエントのＨＥＫ２９３細胞を採取しＰＢＳで洗浄した。細胞ペレットを緩衝液Ｄ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）０．５μＬ中に再懸濁し、１５秒間超音波処理した。マイクロ遠心分離５分後に上澄みを採取した。各試験につき、抽出液１０μＬを３０分間標識ｓｉＲＮＡ１０ｆｍｏｌと共にインキュベートした。試料をネイティブのローディング染料と混合し、低温室中２００Ｖで２時間、５％ポリアクリルアミドゲル（２９：１）上で分離した。（ｃ）（ｂ）におけるレーンＡ〜Ｅにおいて使用した配列。
実施例２：ｓｉＲＮＡを用いたＲ２発現のダウンレギュレーション
本発明者等は今回Ｒ２配列に特異的な多数のｓｉＲＮＡを設計し、それらがインビトロ及びインビボの両方においてＲ２の発現をダウンレギュレートする能力に関して試験した。特定のｓｉＲＮＡに関する配列を配列番号７〜９６（上記表２〜８）として本明細書に記載する。
図７に示す通り、Ｒ２に対して指向されたｓｉＲＮＡは多重培養細胞系統においてＲ２の発現をダウンレギュレートすることができた。Ｒ２に対する３種のｓｉＲＮＡデュプレックス（配列番号７〜１２として表２に示したｓｉＲＲＭ２−Ａ、ｓｉＲＲＭ２−Ｂ及びｓｉＲＲＭ２−Ｃ）の各々は試験した３細胞系統の各々においてＲ２蛋白のレベルを低減した。これとは対照的に、ＧＴＩ−２０４０アンチセンスデオキシヌクレオチドは最小限のダウンレギュレーションしか示していない。
図７に示す実験を実施するために、ＨｅＬａ（ヒト頚部腺癌）、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌）及びＣＣＤ−１０７４Ｓｋ（ヒト線維芽細胞）細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。トランスフェクションの２４時間前に細胞を６穴の組織培養プレート中にプレーティング（ウエル当たり２５０，０００個）した。トランスフェクションに際しては、オリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び以下の核酸の各々を用いて、製造元の指示に従って、複合体を血清非含有培地（ＯｐｔｉＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に製造した。
「ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ」又は「ｓｉＣＯＮ１」：以下の表１０における配列番号９７及び９８として示す非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ＃１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）；
「ｓｉＲＲＭ２−Ａ」：上記表２の配列番号７及び８として示したｈＲＲＭ２の「Ａ」部位に対するｓｉＲＮＡ；
「ｓｉＲＲＭ２−Ｂ」：上記表２の配列番号９及び１０として示したｈＲＲＭ２の「Ｂ」部位に対するｓｉＲＮＡ；
「ｓｉＲＲＭ２−Ｃ」：上記表２の配列番号１１及び１２として示したｈＲＲＭ２の「Ｃ」部位に対するｓｉＲＮＡ；及び、
「ＧＴＩ−２０４０」：以下の表１０における配列番号９９として示すｈＲＲＭ２に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ６３：２８０２−２８１１（２００３））。
（表１０．本明細書に記載した実施例において使用した対照核酸の配列。下線の残基は３’オーバーハングを示す。）
Figure 2012153732
 核酸複合体を４時間５０ｎＭの最終核酸濃度で細胞に曝露し、その後吸引により複合体を除去し、完全培地と交換した。トランスフェクション後２日（４８時間）に細胞を溶解し、１：２５０の希釈度の一次ヤギポリクローナル抗Ｒ２抗体（ｓｃ−１０８４６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）及び１：５０００希釈度の二次ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いながらウエスタンブロットによりＲ２蛋白のレベルを測定した。ブロットはＥＣＬ検出キット（ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて発色させ、そしてＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＬソフトウエア（ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて定量した。
実施例３：各標的部位におけるＲ２ｓｉＲＮＡの発見のためのタイリング実験
図１０に示す通り、増大した力価を有するＲ２に対して指向されたｓｉＲＮＡを発見するためにタイリング実験を使用した。Ｒ２に対する３種のｓｉＲＮＡデュプレックス（配列番号７〜１２として表２に示したｓｉＲＲＭ２Ａ、ｓｉＲＲＭ２Ｂ及びｓｉＲＲＭ２Ｃ）の各々はＲ２ルシフェラーゼ融合蛋白レベルを低減した。ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋３及びｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５デュプレックスの両方は３種の元のデュプレックスの各々よりも優れたダウンレギュレーションを示し、ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５が最も強力なダウンレギュレーションを示した。これとは対照的に、ＧＴＩ−２０４０アンチセンスデオキシヌクレオチド及び同じ標的を有するｓｉＲＮＡ（「ｓｉ（ＧＴＩ−２０４０）」）は如何なるダウンレギュレーションも示すことができなかった。最後に、以前に報告されたＲＲＭ２に対するｓｉＲＮＡ（「ｓｉ（ＪＢＣ，２４００）」）により達成されたダウンレギュレーションを比較の為に示す。
図１０に示す実験を実施するために、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌）細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ から入手した。トランスフェクションの２４時間前に細胞を２４穴の組織培養プレート中にプレーティング（ウエル当たり５０，０００個）した。トランスフェクションに際しては、リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲ２Ｌｕｃプラスミド（１μｇ／ウエル）及び以下の核酸の各々を用いて、製造元の指示に従って、複合体を血清非含有培地（ＯｐｔｉＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に製造した。
「ｓｉＲＲＭ２Ａ」：上記表２の配列番号７及び８として示したｈＲＲＭ２の「Ａ」部位に対するｓｉＲＮＡ；
「ｓｉＲＲＭ２Ｂ」：上記表２の配列番号９及び１０として示したｈＲＲＭ２の「Ｂ」部位に対するｓｉＲＮＡ；
「ｓｉＲＲＭ２Ｃ」：上記表２の配列番号１１及び１２として示したｈＲＲＭ２の「Ｃ」部位に対するｓｉＲＮＡ；
「ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋３」：上記表５の配列番号５９及び６０として示したｈＲＲＭ２の元の「Ｂ」部位の３ヌクレオチド下流のｓｉＲＮＡ；
「ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５」：上記表５の配列番号６３及び６４として示したｈＲＲＭ２の元の「Ｂ」部位の５ヌクレオチド下流のｓｉＲＮＡ；
「ＧＴＩ−２０４０」：上記の表１０における配列番号９９として示すｈＲＲＭ２に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド；
「ｓｉ（ＧＴＩ−２０４０）」：ｈＲＲＭ２に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと同じ標的部位を有するｓｉＲＮＡデュプレックス（以下の表１１において配列番号１００及び１０１として示す）；及び、
「ｓｉ（ＪＢＣ，２００４）」：以前に報告されたｈＲＲＭ２に対するｓｉＲＮＡデュプレックス（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（２６）：２７０３０−２７０３８，２００４）（以下の表１１において配列番号１０２及び１０３として示す）。
（表１１．本明細書に記載した実施例において使用したｓｉ（ＧＴＩ−２０４０）及びｓｉ（ＪＢＣ，２００４）の配列。下線の残基は３’オーバーハングを示す。）
Figure 2012153732
 これ等の核酸複合体を４時間１０ｎＭの最終核酸濃度で細胞に曝露し、その後吸引により複合体を除去し、完全培地と交換した。トランスフェクション後２日（４８時間）に細胞を溶解し、Ｒ２−ルシフェラーゼ融合蛋白のレベルをルシフェラーゼ試験（ルシフェラーゼ試験システム、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造元の説明書に従って測定した。
実施例４：標的部位ＢにおけるＲ２ｓｉＲＮＡの発見のための追加的タイリング実験
図１１は増大した力価を有するＲ２に指向されたｓｉＲＮＡを発見するために実施した追加的タイリング実験の結果を示す。図１０に示す結果と同様、ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５は最も強力なダウンレギュレーションをもたらしている。ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋９及びｓｉＲＲＭ２Ｂ＋３デュプレックスもまた強力なダウンレギュレーションをもたらしているが、ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５ほど強力ではない。
図１１に示す実験を実施するために、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌）細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ から入手した。トランスフェクションの２４時間前に細胞を２４穴の組織培養プレート中にプレーティング（ウエル当たり５０，０００個）した。トランスフェクションに際しては、リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲ２Ｌｕｃプラスミド（１μｇ／ウエル）及び以下の核酸の各々を用いて、製造元の指示に従って、複合体を血清非含有培地（ＯｐｔｉＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に製造した。
「ｓｉＧＬ３」：Ｄｈａｒｍａｃｏｎにより販売されているｓｉＲＮＡターゲティングルシフェラーゼ（「ルシフェラーゼＧＬ３デュプレックス」）；
「ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋３」：上記表５の配列番号５９及び６０として示したｈＲＲＭ２の元の「Ｂ」部位の３ヌクレオチド下流のｓｉＲＮＡ；
「ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋４」：上記表５の配列番号６１及び６２として示したｈＲＲＭ２の元の「Ｂ」部位の４ヌクレオチド下流のｓｉＲＮＡ；
「ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５」：上記表５の配列番号６３及び６４として示したｈＲＲＭ２の元の「Ｂ」部位の５ヌクレオチド下流のｓｉＲＮＡ；
「ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋６」：上記表８の配列番号８７及び８８として示したｈＲＲＭ２の元の「Ｂ」部位の６ヌクレオチド下流のｓｉＲＮＡ；
「ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋７」：上記表８の配列番号８９及び９０として示したｈＲＲＭ２の元の「Ｂ」部位の７ヌクレオチド下流のｓｉＲＮＡ；
「ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋８」：上記表８の配列番号９１及び９２として示したｈＲＲＭ２の元の「Ｂ」部位の８ヌクレオチド下流のｓｉＲＮＡ；
「ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋９」：上記表８の配列番号９３及び９４として示したｈＲＲＭ２の元の「Ｂ」部位９ヌクレオチド下流のｓｉＲＮＡ；及び、
「ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋１０」：上記表８の配列番号９５及び９６として示したｈＲＲＭ２の元の「Ｂ」部位の１０ヌクレオチド下流のｓｉＲＮＡ。
これ等の複合体を４時間１０ｎＭ、１ｎＭ又は０．２ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度で細胞に曝露し、その後吸引により複合体を除去し、完全培地と交換した。トランスフェクション後２日（４８時間）に細胞を溶解し、Ｒ２−ルシフェラーゼ融合蛋白のレベルをルシフェラーゼ試験（ルシフェラーゼ試験システム、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造元の説明書に従って測定した。
実施例５：２１量体及び２７量体のｓｉＲＮＡ活性の試験
図１２に示す通り、増大した力価を有するＲ２に指向されたｓｉＲＮＡを発見するために、Ｂ＋５標的部位におけるＲＮＡデュプレックス（２１量体又は２７量体の何れか）を用いた用量依存性同時トランスフェクション試験を実施した。ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５の２１量体及び２７量体の両方とも、同時リポフェクションされたＲ２Ｌｕｃの強力なダウンレギュレーションをもたらしている。試験した最高濃度（１０ｎＭ及び１ｎＭ）において、２１量体は２７量体より僅かに高値の力価を示したが、試験した最低濃度（０．２ｎＭ）においては２７量体が僅かに高値の力価を示した。
図１２に示す実験を実施するために、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌）細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ から入手した。トランスフェクションの２４時間前に細胞を２４穴の組織培養プレート中にプレーティング（ウエル当たり５０，０００個）した。トランスフェクションに際しては、リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲ２Ｌｕｃプラスミド（１μｇ／ウエル）及び以下の核酸の各々を用いて、製造元の指示に従って、複合体を血清非含有培地（ＯｐｔｉＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に製造した。
「ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５の２１量体」：上記表５の配列番号６３及び６４として示したｈＲＲＭ２の元の「Ｂ」部位の５ヌクレオチド下流のｓｉＲＮＡ；及び、
「ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５の２７量体」：ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５の２１量体と同じ標的部位を有し、そしてｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５の２１量体と同一のダイサー切断産物を有すると予測される２７量体のＲＮＡデュプレックス（上記表７の配列番号８５及び８６として示す）。
これ等の複合体を４時間１０ｎＭ、１ｎＭ又は０．２ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度で細胞に曝露し、その後吸引により複合体を除去し、完全培地と交換した。トランスフェクション後２日（４８時間）に細胞を溶解し、Ｒ２−ルシフェラーゼ融合蛋白のレベルをルシフェラーゼ試験（ルシフェラーゼ試験システム、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造元の説明書に従って測定した。
実施例６：ｓｉＲＮＡを用いた内因性Ｒ２発現のダウンレギュレーション
図１３に示す通り、Ｒ２ルシフェラーゼ融合のｓｉＲＮＡ誘導ダウンレギュレーションは内因性Ｒ２発現のノックダウンに相関している。試験した４時点の全てにおいて、ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５は非ターゲティング対照（ｓｉＣＯＮ１）ｓｉＲＮＡでは観察されなかった内因性Ｒ２蛋白の強力なダウンレギュレーションを誘導している。このことはＲ２ルシフェラーゼ融合蛋白を用いた「タイリング実験」において最初に検討されたｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５デュプレックスが実際に肝細胞癌の細胞において内因性Ｒ２の強力なダウンレギュレーターであることを確認するものである。
図１３に示す実験を実施するために、Ｈｅｐ３Ｂ（肝細胞癌）細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ から入手した。トランスフェクションの２４時間前に細胞を６穴の組織培養プレート中にプレーティング（ウエル当たり２５０，０００個）した。トランスフェクションに際しては、オリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び以下の核酸の各々を用いて、製造元の指示に従って、複合体を血清非含有培地（ＯｐｔｉＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に製造した。
「ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ」：非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ＃１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）（上記表１０における配列番号９７及び９８として示す）；及び、
「ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５」：ｈＲＲＭ２の元の「Ｂ」部位の５ヌクレオチド下流のｓｉＲＮＡ（上記表５の配列番号６３及び６４として示す）。
これ等の複合体を４時間５０ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度で細胞に曝露し、その後吸引により複合体を除去し、完全培地と交換した。トランスフェクション後１日（２４時間）、２日（４８時間）、３日（７２時間）又は３．２５日（７８時間）に細胞を溶解し、Ｒ２蛋白のレベルをウエスタンブロットにより測定した。ウエスタンブロットでは１：２５０の希釈度の一次ヤギポリクローナル抗Ｒ２抗体（ｓｃ−１０８４６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）及び１：５０００希釈度の二次ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いた。ウエスタンブロットはＥＣＬ検出キット（ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて発色させた。その後、膜を剥離し（ＲＥｓｔｏｒｅ剥離緩衝液、Ｐｉｒｅｃｅ）、ローディング対照としてＧＡＰＤＨについてブロットした。ウエスタンブロットの定量はＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＬソフトウエア（ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。
実施例７：Ｒ２に対するｓｉＲＮＡはＨｅｐＧ２細胞においてアポトーシスを誘導する
図１４に示す通り、Ｒ２に対するｓｉＲＮＡはＨｅｐＧ２細胞においてアポトーシスを誘導する。検討した３時点の全てにおいて、ただし最も顕著にはトランスフェクション後３日において、ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５でトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞はｓｉＣＯＮ１でトランスフェクトしたものよりも高値の程度の蛍光（より高範囲のアポトーシスを示す）を呈していた。
図１４に示す実験を実施するために、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌）細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ から入手した。トランスフェクションの２４時間前に細胞を６穴の組織培養プレート中にプレーティング（ウエル当たり２５０，０００個）した。トランスフェクションに際しては、オリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び以下の核酸の各々を用いて、製造元の指示に従って、複合体を血清非含有培地（ＯｐｔｉＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に製造した。
「ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ」：非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ＃１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）（上記表１０における配列番号９７及び９８として示す）；及び、
「ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５」：ｈＲＲＭ２の元の「Ｂ」部位の５ヌクレオチド下流のｓｉＲＮＡ（上記表５の配列番号６３及び６４として示す）。
これ等の複合体を４時間５０ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度で細胞に曝露し、その後吸引により複合体を除去し、完全培地と交換した。トランスフェクション後１日（２４時間）、２日（４８時間）又は３日（７２時間）に、Ｖｙｂｒａｎｔアポトーシス試験＃２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びフローサイトメトリーを用いてアポトーシスについて細胞を分析した。データはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識アネキシンＶへの曝露後の集団平均蛍光として報告した。
実施例８：Ｒ２に対するｓｉＲＮＡはＨＣＣ細胞の薬剤誘導アポトーシスを増強する
図１５に示す通りＲ２に対するｓｉＲＮＡはＨＣＣの薬剤誘導アポトーシスを増強する。アドリアマイシン曝露の前にｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５によるリポフェクションに付してあるＨｅｐＧ２細胞は、ｓｉＲＮＡを投与されていないか、又は非ターゲティング対照（ｓｉＣＯＮ１）ｓｉＲＮＡによるリポフェクションに付されているものよりも、有意に高度な程度のアポトーシスを示した。
図１５に示す実験を実施するために、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌）細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ から入手した。トランスフェクションの２４時間前に細胞を６穴の組織培養プレート中にプレーティング（ウエル当たり２５０，０００個）した。トランスフェクションに際しては、オリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び以下の核酸の各々を用いて、製造元の指示に従って、複合体を血清非含有培地（ＯｐｔｉＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に製造した。
「ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ」：非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ＃１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）（上記表１０における配列番号９７及び９８として示す）；及び、
「ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５」：ｈＲＲＭ２の元の「Ｂ」部位の５ヌクレオチド下流のｓｉＲＮＡ（上記表５の配列番号６３及び６４として示す）。
これ等の複合体を４時間５０ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度で細胞に曝露し、その後吸引によりそれらを除去し、そして細胞（リポプレックス処理並びに未予備投与の細胞）を３日間アドリアマイシン（１００ｎＭ）と共にインキュベートした。次に細胞をＶｙｂｒａｎｔアポトーシス試験＃２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びフローサイトメトリーを用いてアポトーシスについて細胞を分析した。データはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識アネキシンＶへの曝露後の集団平均蛍光として報告した。
実施例９：Ｒ２に対するｓｉＲＮＡはインビボのＲ２ルシフェラーゼ融合蛋白の発現を低減する
図１６に示す通り、Ｒ２に対するｓｉＲＮＡはインビボのＲ２ルシフェラーゼ融合蛋白の発現を低減する。全時点において、ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５デュプレックス（上記表５の配列番号６３及び６４として示す）を投与されたマウスはｐＲ２Ｌｕｃプラスミド単独又はｓｉＣＯＮ１デュプレックスを有するプラスミドを投与されたマウスと比較して顕著に低減したルミネセンスを呈した。
図１６に示す実験を実施するために、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（〜６週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ，ｎ＝５の群）に、ｐＲ２Ｌｕｃプラスミド（０．２５ｍｇ／ｋｇ）を単独又はＲ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５）（１．２５ｍｇ／ｋｇ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ１０５−２１）又は非ターゲティング対照（ｓｉＣＯＮ１）ｓｉＲＮＡと組み合わせて単回高圧（１０％ｖ／ｗ）尾静脈注射により投与した。注射後の種々の時点（２、６、１１及び１７日）において、マウスを麻酔（イソフランガス）し、Ｄ−ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ；腹腔内ＰＢＳ中１５０ｍｇ／ｋｇ）を注射し、そして１０分後に撮影することにより、全動物バイオルミネセンスを測定した（使用機器：ＩＶＩＳ１００画像化システム、Ｘｅｎｏｇｅｎ）。棒グラフのデータは、各時点においてｐＲ２Ｌｕｃプラスミドのみを投与されたマウスの平均値のパーセントとして全動物バイオルミネセンスとして提示した。更に又、ｔ＝注射後２日に撮影したマウスの代表的画像も示す（図１６）。
実施例１０：Ｒ２に対するｓｉＲＮＡは培養ＨＣＣ細胞の成育能力を低減する
図１７に示す通りＲ２に対して最適化されたｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５）は培養ヒトＨＣＣ細胞（Ｈｅｐ３Ｂ細胞）の成育能力を低減する。Ｒ２に対して最適化されたｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５）によるＨｅｐ３Ｂ細胞のリポフェクションは非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ１）の同様の投与と比較してコロニー形成能力を顕著に低減している。このことは、これ等の細胞におけるＲ２のダウンレギュレーション（抗Ｒ２ｓｉＲＮＡによるリポフェクションのみに起因）はその成長能力を低減することを示唆している。
図１７に示す実験を実施するために、Ｈｅｐ３Ｂ（ヒト肝細胞癌）細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ から入手した。トランスフェクションの２４時間前に細胞を６穴の組織培養プレート中に希釈しながらプレーティング（ウエル当たり１，０００個）した。トランスフェクションに際しては、オリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び以下の核酸の各々を用いて、製造元の指示に従って、複合体を血清非含有培地（ＯｐｔｉＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に製造した。
「ｓｉＲ２Ｂ＋５」：ｈＲＲＭ２に対して最適化されたｓｉＲＮＡ（上記表５の配列番号６３及び６４として示す）；及び、
「ｓｉＣＯＮ１」：非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ＃１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）（上記表１０における配列番号９７及び９８として示す）。
これ等の複合体を４時間５ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度で細胞に曝露し、その後吸引により複合体を除去し、完全培地と交換した。トランスフェクション後５日（１２０時間）、細胞をエタノールで固定（１０分）し、そしてメチレンブルーで染色した（水中）。コロニー（〜５０個以上の細胞を有するもの）を手作業で計数した。３連のウエル（ｎ＝３）を各投与に使用し；柱状グラフは平均を示し、エラーバーは標準偏差を表す（図１７）。
実施例１１：ｓｉＲＮＡの力価は成長能力を低減する能力に相関する
図１８に示す通り、Ｒ２に対するｓｉＲＮＡの能力は培養ヒトＨＣＣ細胞の成長能力を低減するｓｉＲＮＡの能力と相関する。Ｒ２の強力なダウンレギュレーターであることがわかっている３種のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋３、ｓｉＲ２Ｂ＋５及びｓｉＲ２Ｂ＋９）の何れかによるＨｅｐ３Ｂ細胞のリポフェクションはＲ２の弱いダウンレギュレーターであることがわかっている２種のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋６及びｓｉＲ２Ｂ＋７）の何れかによる同様の投与と比較してコロニー形成能を顕著に低減している。この結果は、図１７の結果に関連すれば、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるＲ２のダウンレギュレーション（抗Ｒ２ｓｉＲＮＡによるリポフェクションのみに起因）がその成長能力を低減することを示唆している。
図１８に示す実験を実施するために、Ｈｅｐ３Ｂ（ヒト肝細胞癌）細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ から入手した。トランスフェクションの２４時間前に細胞を６穴の組織培養プレート中に希釈しながらプレーティング（ウエル当たり５００個）した。トランスフェクションに際しては、オリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び以下の核酸の各々を用いて、製造元の指示に従って、複合体を血清非含有培地（ＯｐｔｉＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に製造した。
「ｓｉＲ２Ｂ＋３」：ｈＲＲＭ２に対する相対的に強力なｓｉＲＮＡ（上記表５の配列番号５９及び６０として示す）；、
「ｓｉＲ２Ｂ＋５」：ｈＲＲＭ２に対する相対的に強力なｓｉＲＮＡ（上記表５の配列番号６３及び６４として示す）；、
「ｓｉＲ２Ｂ＋６」：ｈＲＲＭ２に対する低強度のｓｉＲＮＡ（上記表８の配列番号８７及び８８として示す）；
「ｓｉＲ２Ｂ＋７」：ｈＲＲＭ２に対する低強度のｓｉＲＮＡ（上記表８の配列番号８９及び９０として示す）；及び、
「ｓｉＲ２Ｂ＋９」：ｈＲＲＭ２に対する相対的に強力なｓｉＲＮＡ（上記表５の配列番号９３及び９４として示す）。
これ等の複合体を４時間５ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度で細胞に曝露し、その後吸引により複合体を除去し、完全培地と交換した。トランスフェクション後５日（１２０時間）、細胞をエタノールで固定（１０分）し、そしてメチレンブルーで染色した（水中）。コロニー（〜５０個以上の細胞を有するもの）を手作業で計数した。３連のウエル（ｎ＝３）を各投与に使用し；柱状グラフは平均を示し、エラーバーは標準偏差を表す（図１８）。比較目的の為に、同時トランスフェクション試験（Ｒ２に対するこれ等のｓｉＲＮＡデュプレックスの相対力価を評価するため）の結果を図１１に示す。
実施例１２：Ｒ２ｓｉＲＮＡによる成長能力の低減は５−ＦＵにより増強される
図１９に示す通り、Ｒ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５）によるＨｅｐ３Ｂ細胞の成長能力の低下は５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）曝露により増強される。上記した通り（図１７参照）、Ｒ２に対して最適化されたｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５）によるＨｅｐ３Ｂ細胞のリポフェクションは陰性対照ｓｉＲＮＡ（本明細書においてはそのｓｉＲＮＡはＬｕｃ１０５−２１であり、これはホタルルシフェラーゼをターゲティングする）による同様の投与と比較してコロニー形成能力を顕著に低減する。更に又、化学療法剤５−フルオロウラシル（７２時間５μＭ）への細胞の曝露は未投与細胞と相対比較してコロニー数を低減し、そして、ｓｉＲ２Ｂ＋５の抗増殖作用を増強する。
図１９に示す実験を実施するために、Ｈｅｐ３Ｂ（ヒト肝細胞癌）細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ から入手した。トランスフェクションの２４時間前に細胞を６穴の組織培養プレート中に希釈しながらプレーティング（ウエル当たり５００個）した。トランスフェクションに際しては、オリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び以下の核酸の各々を用いて、製造元の指示に従って、複合体を血清非含有培地（ＯｐｔｉＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に製造した。
「ｓｉＲ２Ｂ＋５」：ｈＲＲＭ２に対する強力なｓｉＲＮＡ（上記表５の配列番号６３及び６４として示す）；及び、
「Ｌｕｃ１０５−２１」：ホタルルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（本発明において陰性対照として使用；下記表１２の配列番号１０４及び１０５として示す）。
（表１２．本明細書に記載した実施例において使用したＬｕｃ１０５−２１の配列。大文字はＤＮＡ残基、小文字はＲＮＡ残基、下線残基は３’オーバーハングを示す。）
Figure 2012153732
 これらの複合体を４時間５ｎＭの最終核酸濃度で細胞に曝露し、その後吸引により複合体を除去し、完全培地と交換した。５−ＦＵ投与試料については、トランスフェクション４８時間後に成長培地に５μＭの５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を添加し、そして細胞を更に３日間インキュベートした。トランスフェクション後５日（１２０時間）、細胞をエタノールで固定（１０分）し、そしてメチレンブルーで染色した（水中）。コロニー（約５０個以上の細胞を有するもの）を手作業で計数した。３連のウエル（ｎ＝３）を各投与に使用し；柱状グラフは平均を示し、エラーバーは標準偏差を表す（図１９）。
実施例１３：Ｒ２に対するｓｉＲＮＡはマウスにおいて腫瘍中のＲ２蛋白レベルを低減する
図２０に示す通り、Ｒ２に対するｓｉＲＮＡはマウスにおいて皮下Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍内部のＲ２蛋白レベルを低減する。抗Ｒ２ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５）を含有する製剤を投与したマウス３匹中２匹において、腫瘍Ｒ２蛋白レベルは非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ１）を投与したマウスのものと比較して急激に低下している。このことは、ｓｉＲ２Ｂ＋５を含有する製剤の３回連続毎日腫瘍内注射はこれ等の腫瘍内においてＲ２蛋白のダウンレギュレーションを達成することを示唆している。
図２０に示す実験を実施するために、Ｈｅｐ３Ｂ（ヒト肝細胞癌）細胞をＨＲＬＮ雌性ｎｕ／ｎｕマウスに皮下注射した。腫瘍が平均質量約２００〜３００ｍｇに達した時点で、アダマンタン−ポリ（エチレングリコール）−トランスフェリン（ＡＤ−ＰＥＧ−Ｔｆ）ターゲティングリガンド（注射当たり２．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ）を保有するシクロデキストリン含有ポリカチオン（ＣＤＰ）送達系内で、Ｒ２に対して最適化されたｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５）（表５において配列番号６３及び６４として示す）又は非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ１）（表１０において配列番号９７及び９８として示す）をマウスに３回連続毎日腫瘍内（ＩＴ）注射した。３回目の注射の２日後、マウスを安楽死させ、腫瘍を採取し、ホルマリン固定し、パラフィン包埋し、切片化し、そして免疫組織化学（ＩＨＣ）を介してヒトＲ２蛋白発現に関してプローブした。切片は相対Ｒ２発現に関して採点した（＋；低、＋＋：中等度、＋＋＋：高）。
実施例１４：Ｒ２に対するｓｉＲＮＡはラットヘパトーマ細胞における蛋白レベルを低減する
図２１に示す通り、Ｒ２に対するｓｉＲＮＡは培養ラットヘパトーマ細胞（Ｍｃａ−Ｒｈ７７７７）におけるＲ２蛋白レベルを低減する。Ｒ２に対して指向された分子（ＧＴＩ−２０４０アンチセンス、ｓｉＲ２Ｂ＋５の２１量体及びｓｉＲ２Ｂ＋５−２７の２５／２７量体）は全て、陰性対照（Ｌｕｃ１０５−２１、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ）よりも優れたＲ２蛋白レベルの用量依存的低減を示している。ｓｉＲ２Ｂ＋５の２１量体及びｓｉＲ２Ｂ＋５−２７の２５／２７量体によるＲ２低下は相互に同等であり、そしてＧＴＩ−２０４０アンチセンス分子で観察されたものより良好となっている。最後に、このデータは当初はｈＲＲＭ２に対して開発されたこれら２デュプレックスもＲ２蛋白のラットオーソログ（ｒＲＲＭ２）のダウンレギュレーションを達成することができることを示唆している。
図２１に示した実験を実施するために、ＭｃＡ−ＲＨ７７７７（ラットヘパトーマ）細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ から入手した。トランスフェクションの２４時間前に細胞を６穴の組織培養プレート中にプレーティング（ウエル当たり２５０，０００個）した。トランスフェクションに際しては、オリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び以下の核酸の各々を用いて、製造元の指示に従って、複合体を血清非含有培地（ＯｐｔｉＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に製造した。
「Ｌｕｃ１０５−２１」：ホタルルシフェラーゼに対する最適化されたｓｉＲＮＡ（陰性対照）；
「ＧＴＩ−２０４０」：ｈＲＲＭ２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド；
「ｓｉＲ２Ｂ＋５」：ｈＲＲＭ２に対する最適化されたｓｉＲＮＡ（２１量体）；
「ｓｉＲ２Ｂ＋５−２７」：ｈＲＲＭ２に対する最適化されたダイサー基質ＲＮＡ（２５／２７量体）。
これらの複合体を４時間１ｎＭ又は２０ｎＭの最終核酸濃度で細胞に曝露し、その後吸引により複合体を除去し、完全培地と交換した。トランスフェクション後２日（４８時間）に細胞を溶解し、一次抗体としての１：２５０の希釈度のヤギポリクローナル抗Ｒ２抗体（ｓｃ−１０８４６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）及び二次抗体としての１：１００００希釈度のＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いながらウエスタンブロットによりＲ２蛋白のレベルを測定した。ブロットはＥＣＬ検出キット（ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて発色させた。ウエスタンブロットの定量はＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＬソフトウエア（ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。
実施例１５：ｓｉＲＮＡのための送達系
本発明者等は短鎖のシクロデキストリン含有ポリカチオン（ＣＤＰ）を基剤とする非ウィルス系の核酸送達系を開発した。このビヒクルは自己組立により完全に形成された重合体系の核酸送達系の最初の例であり、そして現在使用可能な最も調節しやすいベクターである（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）。この送達系はインビトロ及びインビボで極めて低毒性であることがわかっており（インビトロ：Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｐｕｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，２００２；Ｒｅｉｎｅｋｅ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，２００３ａ，ｂ；インビボ：Ｂｅｌｌｏｃｑ ｅｔ ａｌ．，２００３ｂ；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｐｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）、そして動物へのオリゴヌクレオチド（Ｐｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）、ｓｉＲＮＡ（Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）及びプラスミド（Ｂｅｌｌｏｃｑ ｅｔ ａｌ．，２００３ｂ）の全身投与を可能にする。マウス及びウサギを用いた初期の研究によれば送達系は免疫応答をもたらさず、そして動物内における送達された核酸の生体内分布を改変する能力を有することが判っている（Ｐｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。送達系は自己組立粒子よりなり、調節可能な約５０ｎｍの直径及び表面電荷を有する。これ等のナノ粒子は自己組立により完全に調製され、再現性のある測定可能な送達ビヒクルを与える。ナノ粒子はそれらが細胞内環境の低ｐＨを「感知する」まで組み立てられた状態を持続するように設計され、感知後はそれらは細胞内運搬を支援するように自身を改変する。ナノ粒子は細胞表面受容体への結合のためのターゲティングリガンドを収容することができ、そして、その使用は動物におけるターゲティングされた送達に寄与している（Ｂｅｌｌｏｃｑ ｅｔ ａｌ．，２００３ｂ；Ｐｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。従って、本発明者等は（ｉ）定量的方法で特徴付けられる調節可能な特性を有する明確に定義された核酸送達ビヒクルを創作し、そして、（ｉｉ）げっ歯類動物モデルにおいて有効な送達及び機能を提供することができるのである。
肝臓癌
肝臓癌は多くの形態であることができる。肝臓の細胞の癌、即ち肝細胞癌は肝臓内に存在する結腸直腸癌、乳癌、肺癌等のような他の組織型の転移腫瘍とは顕著に異なっている。原発の肝臓癌は世界中で第６番目の頻発癌である（Ｇｅｒｏｌａｍｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。本明細書において提案される研究は肝細胞癌を用いるものであり、従って、肝細胞の癌を含む。米国癌学会の２００４年の統計によれば肝臓に限定された肝臓癌に関する１９９２〜１９９９年の５年相対生存率は１６．３％であったのに対し、他の限定組織に関しては、乳癌（９７．０％）、結腸及び直腸癌（９０．１％）、前立腺癌（１００．０％）及び膵臓癌（１６．６％）であった。即ち、肝臓及び膵臓は遥かに致命的な局所限定されたヒトの癌であり、そしてこのような事実はこれ等の癌に対する遥かに良好な新規治療法の必要性を示している。今回本発明者等は、肝臓癌の治療のための新規治療薬を提案する。即ち本発明者等は非ウィルス的に送達される短鎖の干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）サブユニット２（Ｒ２）の阻害が肝臓癌のための新しい効果的な治療法を提供することになると提案する。Ｒ２阻害は、単独及び低用量化学療法剤との組合せにおいて、の治療法に対し、予測される優れた安全性の側面を有する肝臓癌の新しい治療的作用機序を現在の治療法に与えることになる。
肝臓癌に対するリボヌクレオチドレダクターゼサブユニット２の阻害
リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）は２’−デオキシリボヌクレオチドをその相当するリボヌクレオシド５’−ジホスフェートから生成する反応を触媒する。この反応は２’−デオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートの生成のための経路における律速段階であり、そしてＤＮＡ複製に必要である。ヒトＲＮＲは２つのサブユニット、即ちＲ１及びＲ２よりなり、そして両方の蛋白の発現が酵素活性には必要である。Ｒ１およびＲ２は別個の染色体上の異なる遺伝子によりコードされており、そして最も重要な点はそれらのｍＲＮＡは細胞周期に渡って示差的に発現される点である。Ｒ１蛋白は全細胞周期を通じて安定であるのに対し、Ｒ２はＤＮＡ複製が起こる後期Ｇ１／初期Ｓ期に発現されるのみである（Ｅｎｇｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。
ＲＮＲは抗癌治療薬の興味深い標的である。文献記載の証拠によれば、網膜芽細胞腫の腫瘍サプレッサは細胞周期への進行を制御するための機序の１つとしてＲ１及びＲ２を抑制する（Ａｎｇｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００２）。Ｒ２蛋白はまた多くの活性化された癌遺伝子との相互作用を介して腫瘍細胞の悪性能を決定する場合に役割を果たすことができる。例えば、Ｆａｎ等はｖ−ｆｍｓ、ｖ−ｓｒｃ、Ａ−ｒａｆ、ｃ−ｍｙｃ及び他のもので形質転換された細胞の足場依存性の成長はＲ２が過剰発現されている場合に顕著に増強されることを明らかにしている（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。Ｒ２の過剰発現はゲムシタビン耐性を誘発する因子として示されている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００４）。最近Ｌｉｕ等（２００４）はｓｉＲＮＡによるＲ２の抑制がＤＮＡ損傷剤及びＲＮＲ阻害剤に対してＨＣＴ−１１６を感受性とすることを報告している。これ等及びその他の問題点によりＲ２の阻害は抗癌剤療法の有用な目標となっている（Ｙｅｎ，２００３）。
Ｙｅｎ等（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）はＲ２に対するアンチセンス分子がインビトロ及びインビボの両方でヒト癌細胞の成育を顕著に低減できることを明らかにしている。Ｌｅｅ等はインビトロで２００ｎＭにおいてＲ２の生産を阻害することがわかっている（Ｏｒｒ ａｎｄ Ｄｏｒｒ，２００４）２０量体のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ＰＳ−ＯＤＮ）であるＧＴＩ−２０４０がヒト結腸、膵臓、肝臓、肺、乳房、腎臓、卵巣、脳、前立腺等のヌードマウスにおける皮下腫瘍を顕著に阻害することを明らかにしている。この研究者等はまた癌細胞系統においてＲ２蛋白のレベルが上昇しており、そしてこれ等の結果は腫瘍及び腫瘍細胞系統におけるＲＮＲの上昇したレベルを明らかにした早期の研究と合致している（Ｊｅｎｓｅｎ
ｅｔ ａｌ．，１９９４）。ヒトにおける抗癌の方策としてＲ２阻害剤を使用することの概念は、現在ＧＴＩ−２０４０で第ＩＩ相臨床治験を実施中であるＬｏｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにおいて研究者等（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）により試験されている（Ｏｒｒ ａｎｄ Ｄｏｒｒ，２００４）。第Ｉ相の結果（進行がんを有する患者２７人に３週間連続静注投与の後サイクル間休薬１週間）によれば、第ＩＩ相治験の推奨用量は１８５ｍｇ／ｍ２／ｄ（５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）であった（Ｏｒｒ ａｎｄ Ｄｏｒｒ，２００４）。第ＩＩ相治験は腎細胞癌の治療の為にカペシタビンと組み合わせてＧＴＩ−２０４０を使用している。治験の初期のデータによれば疾患の安定化及び一部の腫瘍の応答が評価２１患者の一部で明らかになった（Ｏｒｒ ａｎｄ Ｄｏｒｒ，２００４）。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は遺伝子発現の配列特異的阻害のためにはアンチセンス分子よりも遥かに強力であることがわかっており、そして、急速に、アンチセンス、リボザイム又はＤＮＡザイム手法を超えた遺伝子発現調節のための選択肢となりつつある。極めて最近において、Ｗｈａｎｇ等は（ｉ）ゲムシタビンに対する膵臓腺癌の化学感受性を増強するためにＲ２に対するｓｉＲＮＡ（Ｄｕｘｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００４ａ）を、及び（ｉｉ）膵臓腺癌の細胞侵襲性を減衰させ、そのゲムシタビン耐性を減少させるためにＲ２に対するレトロウィルス発現ｓｉＲＮＡを使用している（Ｄｕｘｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００４ｂ）。
これ等の研究及び本明細書に報告していない他のものは肝臓癌に関してＲ２が優れた標的であることを示している。肝癌に関して特に重要な点は、正常な肝細胞は休止状態の間も癌細胞は腫瘍の成育に従って細胞周期を進行させる。即ち、正常な肝細胞へのオフターゲティングの送達は重篤な副作用をもたらすとは考えにくい。今回本発明者等は、Ｒ２の発現を阻害するために肝細胞にＲ２に対するｓｉＲＮＡを送達する肝細胞ターゲティング粒子を創作することにより肝細胞癌に対する新規で有効な治療法を提供する。
治療薬の効果的な全身送達のための５０〜１００ｎｍ大きさの重要性
１０ナノメートルの長さのスケールが腫瘍内の顕著な蓄積及び運搬を可能にするための十分な循環時間を有さなければならない薬剤にとっては、数１０ナノメートルの長さのスケールが適切である。直径１０ｎｍ未満の薬剤は腎臓により循環系から急速（数分内）に浄化される（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ １９７９）。小分子治療薬はこの態様により主に除去される。薬剤が直径１０ｎｍを超えると、それらは物理的に腎臓を経由しては退出できない。即ち、１０ｎｍが長い（数時間）循環時間を必要とする薬剤のための最低限の大きさである。循環のための大きさの上限は毛細管の直径である。しかしながら、この大きさは腫瘍の効果的浸透のためには大きすぎる。大部分の固形腫瘍は正常組織においては観察されない特徴を有する。これ等の特徴の一部は（ｉ）旺盛な血管形成及びそれにより生じる高い血管密度（Ｍａｔｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、（ｉｉ）旺盛な血管の浸透性、（ｉｉｉ）欠損性の血管の構造、及び（ｉｖ）間質部からのリンパクリアランスの減損である（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。腫瘍の特徴（ｉ）〜（ｉｖ）の結果である所謂「増強された浸透性及び貯留性」（ＥＰＲ）の作用はよく知られており、そして生物学的及び合成による巨大分子が循環系から出て腫瘍内に蓄積することを可能とする（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２００４）。従来の低分子量の薬剤は通常は血漿中半減期は数分である。ＥＰＲ作用は顕著な蓄積が起こるためには数時間を必要とする。即ち、ＥＰＲ作用による腫瘍内への取り込みは腎臓を経由して浄化されない実体（１０ｎｍ超の大きさ）に対しては増強される。直径数１００ｎｍ内の実体は循環系から退出し、そして、腫瘍に進入する。この大きさの薬剤は循環系から接触可能なその他の部位をほとんど有さないが、１つの他の組織は肝臓である（内皮の開窓は約１００〜１５０ｎｍ）。循環系から退出し、腫瘍塊内に進入した時点で、薬剤は腫瘍内である程度の運動性を有することが必要である。本発明者等は実験（後述）を通じて直系約５０ｎｍの薬剤が大きさにおいて良好な妥協点を示すことを発見した。即ち、薬剤が１０ｎｍであれば、それらは治療薬を十分担持することができず、そして１００ｎｍを超える大きさでは組織内の運動性が制限される。肝細胞癌に関しては、この大きさは又、粒子が肝臓の開窓（約１５０ｎｍ；Ｇｕｙｔｏｎ，１９８１）を通過しなければならず、そしてＡＳＧＰＲに係留しなければならない（７０ｎｍ未満の大きさ；Ｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）という点において、極めて腫瘍細胞への送達に適切なものである。
Ｄａｖｉｓ等は、全身注射から肝細胞の細胞内位置に到達することに対する、大きさとターゲティングリガンドの影響を検討している。蛍光標識単分散重合体ビーズを使用しながら、図２２に模式的に示す方法により４種の型の粒子を合成している。ビーズの特性を表１に示し、そして、ビーズが治療薬粒子に関する良好なモデルであることを示すために、製剤したｓｉＲＮＡ粒子（詳細は後のセクション）と共に典型的な粒径分布を図２３に示す。
（表１１．取り込み実験用のビーズ）
Figure 2012153732
 尾静脈注射によりマウスに同じ数のビーズを曝露した場合の肝臓内に収集された用量のパーセントを図２４に示す。ガラクトース非存在の粒子は意味のある量までは蓄積しないことに留意しなければならない。肝臓切片（図２５）によれば、Ｇａｌ−１４０粒子は実際には肝細胞には到達せず（図２５Ａ）、個々の粒子としてクプファー細胞に取り込まれ（図２６）、そしてこの結果は粒子が血液、組織及び細胞内で凝集しないことを示している。一方Ｇａｌ−５０粒子は試料全体に渡って肝細胞中に細胞内に位置している（図２５Ｂ）。核は青色染色により可視化し、ビーズは緑色に可視化した。
これ等のデータは約５０ｎｍの大きさの粒子は組織全体に渡って顕著な運動を呈することができ、そして細胞に進入できることを示唆している。これ等の試験は肝細胞のターゲティングを用いていたが、本発明者等は腫瘍内においても同様の挙動を観察している。５０ｎｍの大きさの蛍光標識ＤＮＡザイムを担持したトランスフェリンターゲティング粒子はマウスの尾静脈注射により腫瘍細胞内部に位置しているが、トランスフェリンターゲティングリガンドを有さない５０ｎｍ粒子はＥＰＲ作用により腫瘍に局在したが腫瘍細胞には進入していなかった（Ｐｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。即ち、これ等の２つの試験は直径５０ｎｍ程度の粒径が全身投与から肝細胞及び腫瘍内の細胞内局在を効果的に達成するためには適切であることを明らかにしている。
自己組立核酸送達系の設計及び機能
本発明者等の非ウィルス系の送達系（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｐｕｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，２００２；Ｒｅｉｎｅｋｅ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，２００３ａ，ｂ）は２つの成分を用いている。第１の成分はシクロデキストリン含有ポリカチオンである（図２７参照）。電荷間隔、電荷中心型及び疎水性（重合体骨格の疎水性を変化させることによる）において変動する多くのポリカチオンを製造することにより、インビトロ毒性はポリカチオンの疎水性に相関することがわかった（図２８参照）。ＣＤ含有ポリカチオンは短鎖の１本鎖オリゴから長鎖のプラスミド（本発明者等は１０ｋｂｐまで使用した）までの大きさの核酸と相互作用をし、静電的相互作用（重合体は正荷電、核酸は負荷電）を介して核酸と自己組立を起こして混合物中に核酸の１００％を含有する５０〜１００ｎｍのポリプレックスを形成し、そして、ヌクレアーゼ分解から核酸を完全に保護する（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｐｕｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，２００２）。ＴＥＭ画像化はポリプレックスが球状の形態を有することを示唆している（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＦＥ−ＳＥＭ及びＴＥＭステロペアは粒子が球状の形態を有することを確認するものであり、そしてクリオＴＥＭ画像はこれ等の粒子が緻密であることを示している。ポリカチオンは低毒性を呈する（ポリカチオン単独：インビトロＩＣ５０は１ｍＭ超であり、１００ｍｇ／ｋｇ超の量でマウスで良好な耐容性（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１）；完全製剤粒子：ＣＤＰ量はマウスにおいて５００ｍｇ／ｋｇ超であることができ、急性毒性を伴わない（Ｐｕｎ
ｅｔ ａｌ．，２００４））。明らかに、シクロデキストリンは低毒性を呈するための重要な特徴である。
プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）のインビトロ送達を図３０に示すデータにより説明する。ｐＨ７未満で緩衝作用を示す他のポリカチオンは増強された遺伝子発現にある程度寄与する（Ｚｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｐｕｔｎａｍ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＣＤＰにこの種の緩衝能を有させ、そしてインビボ試験に適切なものとするために、イミダゾール（ｐＫａ約６．２）基を図２７に説明するようにＣＤＰの末端にコンジュゲートした。
イミダゾール含有ＣＤＰはエンドサイトーシス小胞のｐＨを実際に緩衝している（生存細胞における他のｐＨ感受性蛍光プローブを用いた最近の測定はｐＨが緩衝されていることを決定的に示している−データ示さず）。エンドソームの緩衝作用は浸透圧性の膨潤を誘発し、これは最終的には小胞の破壊をもたらし、核酸の放出を起こさせる。更に又、ＣＤＰ上のイミダゾールのプロトン化は重合体に核酸を放出させる。図３１はこの点を説明するＴＥＭを示す。
ＣＤＰ又はｉｍ−ＣＤＰによる上記ポリプレックスは、それらが生理学的条件において凝集する正荷電のコロイド状粒子であるという意味において、他のポリプレックスと同様の問題点を孕んでいる。ＰＥＧ化（ＰＥＧ：ポリエチレングリコール）によるポリプレックスの塩及び血清安定化を達成する試みの結果は様々である。ＰＥＧ化はｐＤＮＡの結合及び縮合を防止（Ｇａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０００）するか、又はポリプレックスの形態を変化させることができる（Ｎｇｕｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。しかしながら、ポリカチオンのＰＥＧ化後のｐＤＮＡ縮合の良好な例は存在する（Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。Ｄａｖｉｓ等はシクロデキストリンを含有するポリプレックスのＥＧ化の新しい方法を開発している。図３１は方法を説明する（Ｐｕｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，２００２）。
改変成分（例は図３２に示す）は表面シクロデキストリン、荷電セグメント、ＰＥＧのセグメント及びターゲティングリガンドとともに封入複合体を形成するための末端アダマンタン（ＡＤ）を有している。Ｐｕｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓによれば、モディファイアーは粒子表面をデコレートし、そしてそのようにするに際して（ｉ）生理学的塩状態で安定であり（図３３及び３４）（Ｐｕｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，（２００２））、（ｉｉ）細胞表面受容体をターゲティングすることができ（図３５）、そして（ｉｉｉ）所定の表面電荷（図３６）及びターゲティングリガンド数（Ｐｕｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，２００２）を有する粒子の創作を可能とする。
現在、安定化された粒子の製剤化はポリカチオンとモディファイアーを混合した後にそれらを核酸に添加することにより行われる。全体の系は自発的に自己組立を起こし、３成分が混合された後数秒以内に均一な大きさの粒子（核酸の１００％が粒子中にある）となり（図３７参照）、そしてこの製剤化は１０ｍｇｐＤＮＡ／ｍＬもの高いｐＤＮＡ濃度で行うことができる。
遺伝子送達粒子の物理化学的挙動はモデル生物学的流体において試験されている。上記した通り、粒子は１５０ｍＭのＮａＣｌ中で安定である。更に又、本発明者等は濁度試験を用いて血液及び血液成分の存在下の安定性について試験している。即ち、凝集が起これば、凝集した実体は定量的に測定できるより多くの光を散乱する。図３８はこの試験を示しており、そして未ＰＥＧ化ポリプレックスは培地中（ａ）又は１００％活性ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中（ｂ）で凝集するが、ＰＥＧ化粒子は凝集しないことを示している。
カチオン性脂質及び重合体は補体系を活性化することが判っている（Ｐｌａｎｋ ｅｔ
ａｌ．，１９９６）。図３９はＰｌａｎｋ等（１９９６）により報告されたデータと合致してＰＥＩ及びＣＤＰのようなポリカチオンが実際に補体活性化を呈することを示している。しかしながら、完全に製剤化された粒子（Ｔｆ−ＰＥＧ−ＡＤ、ＡＤ−ＰＥＧ、ＣＤＰ及びｐＤＮＡ）は、遊離の成分が除去されていない場合でも動物において使用される濃度では補体を活性化しない（Ｔｆ−ＰＥＧ−ＡＤ；トランスフェリン（Ｔｆ）含有ＰＥＧ−ＡＤ、ここでＴｆは腫瘍をターゲティングするために使用される（Ｐｕｎ ｅｔ ａｌ，２００４））。
マウスにおける核酸の全身送達
ｓｉＲＮＡを用いた肝臓へのガラクトースのターゲティング
ネイキッドのｓｉＲＮＡは培養細胞には取り込まれないが、ＣＤＰ製剤化物質（粒径５０ｎｍ、図２３ｂ）は本質的には全ての細胞に進入する（図４０）。本発明者等の場合は、ネイキッドのｓｉＲＮＡは血清中安定ではないが、ＣＤＰ製剤はヌクレアーゼ分解からの保護をもたらす（本発明者等は７２時間までの保護を示している）。即ち、ＣＤＰ／ｓｉＲＮＡ製剤は血清中で安定であり、細胞にｓｉＲＮＡを送達する。
マウスにおいて肝細胞をターゲティングした試験において、本発明者等はＦＡＳ遺伝子をダウンレギュレートするためにＳｏｎｇ等（２００３）のｓｉＲＮＡ配列を使用した。Ｓｏｎｇ等（２００３）は流体力学的注射（尾静脈において急速に注射された溶液約１ｍＬ）がＦＡＳｍＲＮＡレベルを低下させたことを示している。流体力学的注射法はｓｉＲＮＡを含めて肝細胞（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｚｈａｎｇ ｅｔａｌ．，１９９９；Ｙａｎｔ ｅｔａｌ．，２０００）に核酸を送達することがよく知られている（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＢＡＬＢ／ｃマウス及びｓｉＲＮＡ５０μｇ注射を用いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより図４１に示すデータが得られた。Ｓｏｎｇ等（２００３）により報告された通り、流体力学的注射法（標識ＨＰＴＶ）はＦＡＳｍＲＮＡレベルを低減したが、ネイキッドｓｉＲＮＡの標準的な低容量（２００μＬ）注射は低減しなかった。しかしながら、ガラクトース含有ｉｍ−ＣＤＰ製剤化粒子はＨＰＴＶ法で観察されたものと同様のＦＡＳｍＲＮＡ低下（標準的な低容量（２００μＬ）注射を使用）をもたらした。
ｓｉＲＮＡを用いた腫瘍へのトランスフェリンターゲティング
癌細胞への核酸の送達を促進するために、標的リガンドとして本発明者等の送達系内にトランスフェリン（Ｔｆ）が取り込まれている（Ｂｅｌｌｌｏｑ等．，２００３ａ）。トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）は正常細胞よりも遥かに高値のレベルで悪性細胞表面上に存在している。
ルシフェラーゼ遺伝子の取り込みを可能にするためにレンチウィルスで形質導入したＴＣ−７１細胞（ＴＣ７１−ＬＵＣ）の尾静脈注射によりＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス中に播種性腫瘍モデルが創作されている。ＴＣ−７１細胞はＥＷＳ−ＦＬＩ１と称される融合遺伝子を含有し、その表面上にＴｆＲを有するユーイング肉腫細胞である。この融合遺伝子由来の蛋白産物は細胞増殖に関与することが知られている。
第１に、機能性ｓｉＲＮＡは通常の尾静脈注射を用いて腫瘍に送達することができることが明確化した。図４３はＴｆ含有粒子を用いたルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡの送達により、ルシフェラーゼシグナルの極めて大きい低減が可能であったことを示している（ネイキッドのｓｉＲＮＡでは観察されていない）。次に、本発明者等はＥＷＳ−ＦＬＩ１に関するｓｉＲＮＡの送達（インビトロの結果は図２９に示す）は樹立された腫瘍（図４５）又は腫瘍樹立中（図４４）のいずれかにおいて腫瘍の成長に影響することができる（配列はＲｏｓｓｉ研究所より入手；Ｄｏｈｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，２００３）ことを明確化した（脳を除いて腫瘍成長を完全に阻害；Ｔｆ含有粒子は血液脳関門を通過しない（Ｐｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００４））。これ等のデータは、送達ビヒクルが実際に動物中でターゲティングリガンドと共に未損傷のまま存在することを明確に示している。最後に、血液化学分析及び主要臓器の病理学的検討の結果によれば、ｓｉＲＮＡは免疫応答を誘発することなく（血清中ＩＬ−１２及びインターフェロンアルファは変化しなかった）、また、主要臓器に損傷を生じさせること無く、安全に送達されることがわかった。
図４３に示される通り（上パネル）、４週間にわたり製剤化ｓｉＲＮＡを週２回投与したＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスからバイオルミネセンス画像を得た。ＴＣ７１−ＬＵＣ細胞の注射直後から、マウスには４週間にわたり週２回ＥＷＳ−ＦＬＩ１ターゲティングｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＦＢＰ２）又は非ターゲティング対照配列（ｓｉＣＯＮ１）を含有する製剤を投与した。これ等のマウスのバイオルミネセンスを週２回モニタリングした。
図４２はどのようにしてルシフェラーゼターゲティングｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＬ３）を製剤してターゲティングしたかを説明している。送達系の成分は以下のもの、即ち；ｓｉＲＮＡを濃縮し、それをヌクレアーゼ分解から保護するシクロデキストリン含有ポリカチオン（ＣＤＰ）；含有化合物形成を介して生理学的液体中で粒子を安定化させるアダマンタン−ポリ（エチレングリコール）（ＡＤ−ＰＥＧ）コンジュゲート；細胞表面トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を過剰発現する細胞による自身の取り込みを促進する粒子にターゲティングリガンドを付与するＡＤ−ＰＥＧ−トランスフェリン（ＡＤ−ＰＥＧ−Ｔｆ）コンジュゲートを含むものとした。非ターゲティング又はターゲティング粒子の組立：非ターゲティング粒子の場合は、ＣＤＰ及びＡＤ−ＰＥＧを組合せ、ｓｉＲＮＡに添加することにより安定であるが非ターゲティングのポリプレックスを形成する。ターゲティング粒子の場合は、ＣＤＰ、ＡＤ−ＰＥＧおよびＡＤ−ＰＥＧ−Ｔｆを組合せ、ｓｉＲＮＡに添加することにより安定なターゲティングされた粒子を形成する。ｓｉＲＮＡへの添加する前に、ＣＤＰをＡＤ−ＰＥＧ５０００コンジュゲートと１：１のＡＤ：β−ＣＤ（モル：モル）比で混合した。ターゲティングされたポリプレックスはまたトランスフェリン−改変ＡＤ−ＰＥＧ（ＡＤ−ＰＥＧ−Ｔｆ）を１：１０００のＡＤ−ＰＥＧ−Ｔｆ：ＡＤ−ＰＥＧ（ｗ：ｗ）比で含有していた。次にこの混合物を３／１（＋／−）の電荷比（ＣＤＰ由来の正電荷のｓｉＲＮＡ骨格由来の負電荷に対する）において等容量のｓｉＲＮＡに添加した。得られたポリプレックスに水中１０％（ｗ／ｖ）グルコース等容量を添加することにより注射に適する５％（ｗ／ｖ）グルコース中の最終ポリプレックス製剤（Ｄ５Ｗ）を得た。
製剤化されたｓｉＲＮＡは、ＴＣ７１−ＬＵＣ細胞の注射後連続２日（黒矢印）低圧尾静脈（ＬＰＴＶ）注射により投与した。積分されたバイオルミネセンスのフラックス（光子／秒）を細胞注射後の時間に対してプロットした。観察されたルシフェラーゼ発現は第４３日には投与前（第４０日）の約８％まで低減した（図４３）。ターゲティングされた製剤化ｓｉＧＬ３含有ポリプレックスを投与したマウスの腫瘍は注射後２〜３日にルシフェラーゼシグナルの強力な低下（９０％超）を示した。
（引用文献）
Figure 2012153732
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 当業者は、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態の多くの等価物を、日常的実験を超えることなく、認識又は確認することができるはずである。このような等価物は後述する請求項により包含されることを意図している。
上記引用した参考文献及び公開物の全ては、参照により全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (9)

  1. 以下：
    肝臓治療薬、及び、
    （ｉ）イミダゾール改変シクロデキストリン含有カチオン性重合体、及び（ｉｉ）アダマンタン−ＰＥＧ−リガンドを含むターゲティング部分を含む送達ビヒクルであって、ここで該重合体及びターゲティング部分が核酸をカプセル化するナノ粒子を形成する、送達ビヒクル、
    を含む肝特異的送達医薬組成物。
  2. 前記ナノ粒子が直径１０〜１００ｎｍである請求項１記載の医薬組成物。
  3. 前記ナノ粒子が直径約５０〜７０ｎｍである請求項２記載の医薬組成物。
  4. 前記ナノ粒子が直径約５０ｎｍである請求項２記載の医薬組成物。
  5. 前記肝臓治療薬が小分子、ポリペプチド又は核酸である請求項１記載の医薬組成物。
  6. 前記肝臓治療薬が、
    （ｉ）配列番号５９、６１、６３、９１、９３および９５から選択される配列を含む１５〜３０ヌクレオチド長の第１の鎖と、配列番号６０、６２、６４、９２、９４および９６から選択される配列を含む１５〜３０ヌクレオチド長の第２の鎖とを含む核酸であって、該第１及び第２の鎖の少なくとも１２ヌクレオチドは相互に相補であり、そして生理学的条件下にて２本鎖核酸を形成し、そしてここで、該２本鎖核酸はＲＮＡ干渉機序により細胞内でリボヌクレオチドレダクターゼサブユニット２（Ｒ２）の発現を低減できる、核酸；あるいは
    （ｉｉ）ａ）配列番号５９を含む第１の鎖と、配列番号６０を含む第２の鎖；
    ｂ）配列番号６１を含む第１の鎖と、配列番号６２を含む第２の鎖；
    ｃ）配列番号６３を含む第１の鎖と、配列番号６４を含む第２の鎖；
    ｄ）配列番号９１を含む第１の鎖と、配列番号９２を含む第２の鎖；
    ｅ）配列番号９３を含む第１の鎖と、配列番号９４を含む第２の鎖；または
    ｆ）配列番号９５を含む第１の鎖と、配列番号９６を含む第２の鎖
    を含む核酸であって、該核酸は、生理学的条件下にて配列番号１のヌクレオチド６１６〜６６７に相当するＲ２転写物の領域にハイブリダイズし、そして、細胞内のＲ２の発現を低減する、核酸
    である請求項５記載の医薬組成物。
  7. 以下：
    肝臓治療薬、及び、
    （ｉ）イミダゾール改変シクロデキストリン含有カチオン性重合体、及び（ｉｉ）アダマンタン−ＰＥＧ−リガンドを含むターゲティング部分を含む送達ビヒクルであって、ここで該重合体及びターゲティング部分が核酸をカプセル化するナノ粒子を形成する、送達ビヒクル、
    を含む、肝臓の疾患又は障害を治療するための組成物。
  8. 前記肝臓の疾患又は障害が肝細胞癌である請求項７記載の組成物。
  9. 肝動脈内投与により投与される請求項７記載の組成物。
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