RS67553B1 - Kombinovana hbv terapija - Google Patents

Kombinovana hbv terapija

Info

Publication number
RS67553B1
RS67553B1 RS20251294A RSP20251294A RS67553B1 RS 67553 B1 RS67553 B1 RS 67553B1 RS 20251294 A RS20251294 A RS 20251294A RS P20251294 A RSP20251294 A RS P20251294A RS 67553 B1 RS67553 B1 RS 67553B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
hbv
amino acid
seq
antibody
acid sequence
Prior art date
Application number
RS20251294A
Other languages
English (en)
Inventor
Anna Bakardjiev
Phillip Pang
Davide Corti
Original Assignee
Humabs Biomed Sa
Vir Biotechnology Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Humabs Biomed Sa, Vir Biotechnology Inc filed Critical Humabs Biomed Sa
Publication of RS67553B1 publication Critical patent/RS67553B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • A61K31/522—Purines, e.g. adenine having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. hypoxanthine, guanine, acyclovir
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—DNA viruses
    • C07K16/082—Hepadnaviridae (F), e.g. hepatitis B virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

[0001] Opis
[0003] POZADINA
[0005] Širom sveta više od 400 miliona ljudi ima hroničnu HBV infekciju (HHB), i stoga su u povećanom riziku od razvoja ozbiljnih bolesti jetre, kao što su hronični hepatitis, ciroza, otkazivanje jetre i hepatocelularni karcinom (HCC), što rezultira sa procenjenih 600000 smrtnih slučajeva svake godine.
[0006] Longitudinalna ispitivanja pacijenata sa HHB pokazuju da se petogodišnja kumulativna učestalost razvoja ciroze kreće od 8 do 20%, a petogodišnja kumulativna učestalost dekompenzacije jetre je približno 20%. Svetska učestalost HCC je porasla i trenutno predstavlja treći vodeći uzrok smrti povezanih sa rakom širom sveta. (El-Serag H.B., and Rudolph K.L., Gastroenterology 132:2557-76 (2007)).
[0008] HBV je DNK virus sa lipidnim omotačem i ikosaedarskim nukleokapsidom koji obuhvata virusni DNK genom i DNK polimerazu. Kapsid HBV se formira u citozolu inficirane ćelije tokom pakovanja kompleksa replikacije RNK pregenoma i sastoji se od osnovnog proteina, poznatog i kao HBcAg, i njegove varijante deljenja, HBeAg. Kada se virusna DNK disocira od kapsida pri ulasku u novu ćeliju, može se pretvoriti u kovalentno zatvorenu kružnu DNK (cccDNK), koja može ostati u ćelijama jetre nakon tretmana HBV-om i ima potencijal da reaktivira infekciju. Lipidni omotač uključuje površinski antigen hepatitisa B (HBsAg), koji se odnosi na tri odvojena proteina, S-HBsAg (mali antigen), M-HBsAg (srednji antigen) i L-HBsAg (veliki antigen) koji su kodirani istim otvorenim okvirom za čitanje, ali koriste različite početne kodone. HBsAg je antigen prisutan u trenutno dostupnim vakcinama protiv hepatitisa B. HBV takođe kodira protein HBx, koji inhibira tumorski supresor p53, promoviše progresiju ćelijskog ciklusa i povećava proizvodnju reaktivnih vrsta kiseonika.
[0010] Pored proizvodnje viriona, HBV takođe uzrokuje proizvodnju subvirusnih čestica (SVP), koje uključuju lipidni omotač HBV viriona, ali nisu kompetentne za replikaciju i obično im nedostaje nukleokapsid. SVP se mogu proizvesti i do 3-4 logaritamski broja više u odnosu na virione kompetentne za replikaciju. Visoki nivoi HBsAg prisutni na SVP mogu iscrpeti HBsAg-specifičan T-ćelijski odgovor, što je verovatno važan faktor koji doprinosi nemogućnosti imunog sistema da očisti HBV infekciju tokom hroničnog hepatitisa B. (Chisari, F.Y., i dr., Pathologie Biologie 58:258-66 (2010)).
[0012] Prirodna evolucija infekcije HBC obuhvata četiri uzastopne faze: (1) rana „imunotolerantna“ faza, koja je povezana sa visokim nivoima replikacije virusa i minimalnom upalom jetre; (2) imunoreaktivna faza, koja je povezana sa značajnom upalom jetre i povišenim serumskim aminotransferazama; pri čemu neki pacijenti napreduju do (3) „nereplikativne“ ili „neaktivne“ faze, koja je povezana sa: serokonverzijom u anti-HBe; nedetektabilnim ili niskim nivoom viremije (ispod 2000 IU/ml pomoću PCR analiza); i rešavanjem upale jetre; i kod nekih pojedinaca, (4) reaktivacijom virusa. Reaktivacija HBV infekcije može biti povezana sa pojavom specifičnih virusnih mutacija koje sprečavaju proizvodnju HBeAg, ali ne ometaju replikaciju virusa, što je poznato kao HBeAg-negativni hronični hepatitis B. HBeAg-negativni hronični hepatitis B (takođe poznat kao anti-HBe-pozitivni ili prekor mutantni hepatitis) karakteriše se fluktuirajućim nivoima serumske HBV DNK i serumskih aminotransferaza (ALT i AST) i progresivnom bolešću jetre.
[0014] Primarni cilj trenutno dostupnih tretmana za HBV je trajno suzbijanje replikacije HBV i poboljšanje bolesti jetre. Klinički važni kratkoročni ciljevi uključuju: postizanje HBeAg-serokonverzije, normalizaciju serumskih ALT i AST, rešavanje upale jetre i sprečavanje hepatične dekompenzacije. Krajnji dugoročni cilj lečenja HBV je postizanje trajnog imunološkog odgovora kako bi se sprečio razvoj ciroze i raka jetre, a samim tim i produžilo preživljavanje. Trenutno dostupni HBV tretmani ne uklanjaju virus u potpunosti zbog perzistencije cccHBV DNK u jezgrima inficiranih hepatocita. Međutim, lečenjem indukovano klirens serumskog HBsAg je marker završetka hronične HBV infekcije i povezano je sa najboljim dugoročnim ishodom.
[0016] [0006] Iako tri primarna HBV proteina (HBsAg, HBeAg i HBcAg) imaju imunoinhibitorna svojstva, HBsAg čini ogromnu većinu HBV proteina u cirkulaciji HBV inficiranih osoba. Pored toga, dok uklanjanje (putem serokonverzije) HBeAg ili smanjenje serumske viremije nisu u korelaciji sa razvojem održive kontrole HBV infekcije nakon lečenja, uklanjanje serumskog HBsAg iz krvi (i serokonverzija) kod HBV infekcije je dobro prepoznat prognostički indikator antivirusnog odgovora na lečenje koji će dovesti do kontrole HBV infekcije nakon lečenja (iako se to dešava samo kod malog dela pacijenata koji primaju imunoterapiju). Stoga, uklanjanje HBsAg može biti važna strategija za prevazilaženje virusne inhibicije imune funkcije kod osoba sa HBV infekcijom.
[0017] Trenutni standardni postupci lečenja HBV uključuju imunoterapije zasnovane na interferonu ili timozinu α1 i suzbijanje proizvodnje virusa inhibicijom HBV polimeraze. Inhibitori HBV polimeraze su efikasni u smanjenju proizvodnje virusa, ali imaju mali ili nikakav efekat u brzom smanjenju HBsAg ili mogu sporo smanjiti HBsAg uz dugotrajno lečenje kod ograničenog broja pacijenata (kao što je slučaj sa tenofovirdizoproksil fumaratom). Imunoterapija zasnovana na interferonu može postići smanjenje i proizvodnje virusa i rano uklanjanje HBsAg iz krvi, ali samo kod malog procenta lečenih ispitanika.
[0018] Opšteprihvaćena uloga HBsAg u krvi je da sekvestriraju anti-HBsAg antitela i omogući da infektivne virusne čestice izbegnu imunološku detekciju, što je verovatno jedan od razloga zašto HBV infekcija ostaje hronično stanje. Pored toga, HBsAg, HBeAg i HBcAg imaju imunoinhibitorna svojstva i perzistencija ovih virusnih proteina u krvi pacijenata nakon primene bilo kog od trenutno dostupnih tretmana za HBV verovatno ima značajan uticaj na sprečavanje pacijenata da postignu imunološku kontrolu svoje HBV infekcije.
[0019] Nijedan od trenutno dostupnih tretmana ne obnavlja imunološku kontrolu HBV kod velikog broja pacijenata. Shodno tome, i dalje postoji potreba za efikasnim tretmanom protiv HBV infekcije koji može inhibirati replikaciju virusa, kao i obnoviti imunološku kontrolu kod većine pacijenata.
[0020] WO2011/047312 opisuje antisens oligomere korisne za modulaciju infekcija hepatitisa B i za lečenje virusa hepatitisa B i stanja povezanih sa hepatitisom B kod životinja, uključujući ljude.
[0021] US2015/1666371 opisuje antitelo koje se vezuje za površinski antigen (HBsAg) virusa hepatitisa B (HBV) kako bi neutralisalo virus hepatitisa B.
[0022] WO2016/077321 usmeren je na upotrebu RNKi protiv HBV povećanjem nivoa anti-HBV antitela kod ispitanika.
[0023] REZIME
[0024] Pronalazak je definisan u priloženim patentnim zahtevima.
[0025] U nekim otelotvorenjima, predmetno obelodanjivanje pruža inhibitor ekspresije HBV gena za upotrebu u lečenju hronične HBV infekcije kod ispitanika, pri čemu se subjektu naknadno primenjuje anti-HBV antitelo.
[0026] Predmetno obelodanjivanje takođe pruža sredstvo koje smanjuje HBV antigensko opterećenje za upotrebu u lečenju hronične HBV infekcije kod ispitanika, pri čemu se ispitaniku naknadno primenjuje anti-HBV antitelo.
[0027] Predmetno obelodanjivanje takođe pruža sastav za upotrebu u lečenju hronične HBV infekcije kod ispitanika, pri čemu (a) sastav sadrži anti-HBV antitelo i ispitaniku je prethodno primenjivan inhibitor ekspresije gena; ili (b) sastav sadrži anti-HBV antitelo i ispitaniku je prethodno primenjivan agens koji smanjuje HBV antigensko opterećenje.
[0028] U nekim otelotvorenjima, predmetno obelodanjivanje pruža upotrebu inhibitora ekspresije HBV gena i anti-HBV antitela u proizvodnji leka za lečenje hronične HBV infekcije. Predmetno obelodanjivanje takođe pruža upotrebu sredstva koje smanjuje antigensko opterećenje HBV-om i anti-HBV antitela u proizvodnji leka za lečenje hronične HBV infekcije.
[0029] U nekim otelotvorenjima, predmetno obelodanjivanje pruža postupak lečenja hronične HBV infekcije kod ispitanika koji ima potrebu za time, koji obuhvata: davanje sredstva ispitaniku koje smanjuje HBV antigensko opterećenje; i davanje anti-HBV antitela ispitaniku. Predmetno obelodanjivanje takođe pruža postupak lečenja hronične HBV infekcije kod ispitanika koji ima potrebu za time, koji obuhvata: davanje ispitaniku inhibitora ekspresije HBV gena; i davanje anti-HBV antitela ispitaniku.
[0030] U nekim postupcima, sastavima za upotrebu ili upotrebama opisanim ovde, anti-HBV antitelo je HBC34 ili neprirodna varijanta HBC34.
[0031] U nekim postupcima, sastavima za upotrebu ili upotrebama opisanim ovde, sredstvo koje smanjuje HBV antigensko opterećenje ili inhibitor ekspresije HBV gena je RNKi sredstvo (npr., siRNK, kao što je HBV02).
[0032] Ovaj opis takođe pruža, u nekim otelotvorenjima, komplete koji sadrže RNKi sredstvo i anti-HBV antitelo kao što je ovde opisano, opciono sa uputstvima za primenu ovde opisanog postupka.
[0033] KRATAK OPIS SLIKA
[0034]
[0035] Slika 1 prikazuje raspored doziranja u ispitivanju kombinovane terapije na mišjem HBV modelu (AAV-HBV model), kao što je opisano u Primeru 1. Entekavir je primenjivan oralno jednom dnevno. HBV-specifična siRNK je primenjivana subkutano jednom na početku ispitivanja, a mišje-himerno anti-HBV antitelo je primenjivano intraperitonealno dva puta nedeljno, tokom treće i četvrte nedelje studije. Podgrupa miševa je žrtvovana u četvrtoj nedelji, a druga podgrupa je žrtvovana u šestoj nedelji studije.
[0036] Slika 2A prikazuje rezultate testiranja HBV virusnog opterećenja u uzorcima mišjeg seruma, mereno kao broj kopija HBV DNK, miševa tretiranih HBV02 siRNK (kvadrati, puna linija); mišje-himerno HBC34 antitelo (HBC34v7; u dozi od 15 mg/kg) (krugovi, puna linija); ili fiziološki rastvor (trouglovi, puna linija).
[0037] Slika 2B prikazuje rezultate testiranja virusnog opterećenja HBV u uzorcima mišjeg seruma, mereno kao broj kopija HBV DNK, kod miševa tretiranih kontrolnom siRNK i kontrolnim antitelom (kvadrati, isprekidana linija); samo entekavir („ETV“, rombovi, isprekidana linija); HBV02 siRNK i mišjehimerno HBC34v7 antitelo (u dozi od 15 mg/kg) (krugovi, isprekidana linija); ili HBV02 siRNK, HBC34v7 antitelo (u dozi od 15 mg/kg) i entekavir (trouglovi, puna linija).
[0038] Slika 3A prikazuje nivoe HBsAg izmerene iz mišjeg seruma nakon tretmana sa HBV02 siRNK (kvadrati, puna linija); mišje-himerno HBC34v7 antitelo u dozi od 15 mg/kg (krugovi, puna linija); ili fiziološki rastvor (trouglovi, puna linija).
[0039] Slika 3B prikazuje nivoe HBsAg izmerene iz mišjeg seruma nakon tretmana kontrolnom siRNK i kontrolnim antitelom (kvadrati, isprekidana linija); samo entekavir („ETV“, rombovi, isprekidana linija); HBV02 siRNK i mišje-himerno HBC34v7 antitelo (pri 15 mg/kg) (krugovi, isprekidana linija); ili HBV02 siRNK, mišje-himerno HBC34v7 antitelo (pri 15 mg/kg) i entekavir (trouglovi, isprekidana linija).
[0040] Slika 4 prikazuje nivoe slobodnih antitela merenih iz mišjeg seruma između 14. i 42. dana nakon primene siRNK. Prikazane su sledeće grupe tretmana: samo mišje-himerno HBC34v7 antitelo (krugovi); HBV02 siRNK, mišje-himerno HBC34v7 antitelo i entekavir (kvadrati); i HBV02 siRNK i mišje-himerno HBC34v7 antitelo (trouglovi).
[0041] Slika 5A prikazuje rezultate testiranja HBV virusnog opterećenja u uzorcima mišjeg seruma, mereno kao broj kopija HBV DNK, nakon tretmana siRNK, antitelom i/ili kontrolom. Miševima je ubrizgan AAV/HBV virus 28. dana. Miševima C57Bl/6 inficiranim AAV/HBV primenjen je jedan od jedanaest različitih tretmana 0. dana: (1) HBV-specifična siRNK (HBV02, sa antisens lancem SEQ ID NO:8; videti opis u Primeru 1); (2)-(3) anti-HBV antitelo (potpuno murinizovani HBC24), u jednoj od dve doze; (4)-(5) HBV02 siRNK u jednoj dozi i potpuno murinizovani HBC24 u jednoj od dve doze; (6-9) HBV02 siRNK u jednoj od dve doze i potpuno murinizovano anti-HBV antitelo HBC34 (HBC34v35), u jednoj od tri doze antitela; (10) kontrolna siRNK i kontrolno antitelo; ili (11) samo PBS, primenjen intraperitonealno. Rezultati su prikazani za tretmane 1-5, 10 i 11.
[0042] Slika 5B prikazuje rezultate testiranja HBV virusnog opterećenja u uzorcima mišjeg seruma, mereno kao broj kopija HBV DNK, nakon tretmana siRNK, antitelom i/ili kontrolom. Miševima je ubrizgan AAV/HBV virus 28. dana. Miševima C57Bl/6 inficiranim AAV/HBV primenjen je jedan od jedanaest različitih tretmana 0. dana: (1) HBV-specifična siRNK (HBV02, sa antisens lancem SEQ ID NO:8; videti opis u Primeru 1); (2)-(3) anti-HBV antitelo (potpuno murinizovani HBC24), u jednoj od dve doze; (4)-(5) HBV02 siRNK u jednoj dozi i potpuno murinizovani HBC24 u jednoj od dve doze; (6-9) HBV02 siRNK u jednoj od dve doze i potpuno murinizovano anti-HBV antitelo HBC34 (HBC34v35), u jednoj od tri doze antitela; (10) kontrolna siRNK i kontrolno antitelo; ili (11) samo PBS, primenjen intraperitonealno. Rezultati su prikazani za tretmane 1 i 6-11.
[0043] Slika 6A prikazuje nivoe HBsAg merene iz mišjeg seruma nakon tretmana siRNK, antitelom i/ili kontrolom, kao što je iznad opisano za Sliku 5A.
[0044] Slika 6B prikazuje nivoe HBsAg merene iz mišjeg seruma nakon tretmana siRNK, antitelom i/ili kontrolom, kao što je iznad opisano za Sliku 5B.
[0045] Slika 7A prikazuje nivoe HBeAg merene iz mišjeg seruma nakon tretmana siRNK, antitelom i/ili kontrolom, kao što je iznad opisano za Sliku 5A.
[0046] Slika 7B prikazuje nivoe HBeAg merene iz mišjeg seruma nakon tretmana siRNK, antitelom i/ili kontrolom, kao što je iznad opisano za Sliku 5B.
[0047] Slika 8 prikazuje eksperimentalni dizajn za ispitivanje opisano u Primeru 3, uključujući raspored doziranja za procenu serumskog klirensa HBsAG i inhibicije ulaska virusa u mišjem modelu nakon tretmana anti-HBV antitelom i HBV-specifičnom siRNK. AAV/HBV-inficirani SCID miševi sa transplantiranim primarnim ljudskim hepatocitima (n=4 miša po grupi za tretman) primali su jedan od sedam različitih tretmana: (1) samo PBS; (2-4) anti-HBV antitelo (potpuno murinizovani HBC34v35), u jednoj od tri doze, primenjeno intraperitonealno dva puta nedeljno tokom druge i treće nedelje; ili (5-7) HBV-specifična siRNK (HBV02, sa antisens lancem SEQ ID NO:8; videti opis u Primeru 1) primenjena subkutano jednom na početku studije, i potpuno murinizovani HBC34v35, u jednoj od tri doze antitela, primenjeno intraperitonealno dva puta nedeljno tokom druge i treće nedelje. Miševi su žrtvovani u 6. nedelji.
[0048] Slika 9 prikazuje koncentraciju serumske HBV DNK kod miševa sa SCID transplantiranim primarnim ljudskim hepatocitima nakon tretmana sa PBS (kontrola); HBC34v35 antitelo; ili HBV34v35 antitelo i HBV02 siRNK.
[0049] Slika 10 prikazuje koncentraciju HBsAg u serumu kod miševa SCID sa transplantiranim primarnim ljudskim hepatocitima nakon tretmana PBS-om (kontrola); HBC34v35 antitelo; ili HBV34v35 antitelo i HBV02 siRNK.
[0050] Slika 11 prikazuje koncentraciju serumske HBeAg kod miševa sa SCID transplantiranim primarnim ljudskim hepatocitima nakon tretmana sa PBS (kontrola); HBC34v35 antitelo; ili HBV34v35 antitelo i HBV02 siRNK.
[0051] Slika 12 prikazuje koncentraciju HBcrAg u serumu kod miševa SCID sa transplantiranim primarnim ljudskim hepatocitima nakon tretmana PBS-om (kontrola); HBC34v35 antitelo; ili HBV34v35 antitelo i HBV02 siRNK.
[0052] Slika 13 prikazuje raspored lečenja osmišljen za ispitivanje faze 2 za procenu efikasnosti kombinovane terapije siRNK-antitelo u lečenju HBV.
[0053] DETALJNI OPIS
[0054] Predmetno obelodanjivanje pruža postupke i sastave za upotrebu u lečenju infekcije virusom hepatitisa B (HBV) inhibitorom ekspresije HBV proteina i anti-HBV antitelom, kao i srodne komplete. Kombinovane terapije mogu se koristiti za lečenje hroničnog hepatitisa B (HHB).
[0055] U nekim otelotvorenjima, postupci uključuju lečenje hronične HBV infekcije kod subjekta kome je to potrebno, putem: (i) davanja ispitaniku inhibitora ekspresije HBV gena; i (ii) davanja ispitaniku anti-HBV antitela. U posebnim otelotvorenjima, ekspresija najmanje jednog HBV gena je smanjena nakon davanja inhibitora ekspresije HBV gena, a anti-HBV antitelo se primenjuje kod ispitanika kada je ekspresija najmanje jednog HBV gena smanjena.
[0056] U određenim otelotvorenjima, inhibitor ekspresije HBV gena je RNKi sredstvo koji inhibira ekspresiju HBV transkripta. U određenim otelotvorenjima, RNKi agens je siRNK (takođe se ovde naziva „dvolančana RNK“ ili „dsRNK“) koja cilja i inhibira ekspresiju mRNK koju kodira X gen HBV.
[0057] U određenim otelotvorenjima, anti-HBV antitelo prepoznaje HBV genotipove A, B, C, D, E, F, G, H, I i J; i/ili je ljudsko antitelo. U određenim otelotvorenjima, anti-HBV antitelo je izabrano iz: antitela divljeg tipa HBC34, neprirodne varijante HBC34 antitela i/ili HBC24 antitela.
[0058] U nekim ovde opisanim otelotvorenjima, inhibitor ekspresije HBV gena i anti-HBV antitelo deluju sinergistički kako bi smanjili virusno opterećenje i cirkulišući HBsAg. Ova kombinovana terapija može pružiti funkcionalno izlečenje hroničnog HBV i može omogućiti primenu nižih doza antitela, što dovodi do smanjenog potencijala za toksičnost izazvanu antitelima.
[0059] I. Rečnik
[0060] [0027] Sledeći odeljci pružaju detaljan opis kombinovane terapije za HBV, uključujući: inhibitore ekspresije HBV proteina; Anti-HBV antitela; postupke lečenja ispitanika korišćenjem inhibitora ekspresije HBV proteina u kombinaciji sa anti-HBV antitelom; i komplete koji se odnose na kombinovane terapije. Pre nego što se predmetno obelodanjivanje detaljnije izloži, za njegovo razumevanje može biti korisno dati definicije određenih termina koji će se ovde koristiti. Dodatne definicije su navedene u predmetnom obelodanjivanju.
[0062] U predmetnom opisu, termin „oko“ znači ± 20%) naznačenog opsega, vrednosti ili strukture, osim ako nije drugačije naznačeno.
[0064] Termin „sadrži“ znači prisustvo navedenih karakteristika, celih brojeva, koraka ili komponenti kako je navedeno u patentnim zahtevima, ali to ne isključuje prisustvo ili dodavanje jedne ili više drugih karakteristika, celih brojeva, koraka, komponenti ili njihovih grupa. Termin „koji se u suštini sastoji od“ ograničava obim patentnog zahteva na navedene materijale ili korake i one koji ne utiču značajno na osnovne i nove karakteristike zahtevanog pronalaska.
[0066] Treba razumeti da se termini „a“ i „an“, kako se ovde koriste, odnose na „jednu ili više“ nabrojanih komponenti. Upotreba alternative (npr., „ili“) treba da se shvati kao jedna, obe ili bilo koja njihova kombinacija alternativa i može se koristiti sinonimno sa „i/ili“. Kako se ovde koristi, termini „uključuje“ i „ima“ koriste se sinonimno, a ti termini i njihove varijante treba da se tumače kao neograničavajući.
[0068] Reč „značajno“ ne isključuje „potpuno“; npr., sastav koji je „značajno slobodan“ od Y može biti potpuno slobodan od Y. Gde je potrebno, reč „značajno“ može biti izostavljena iz definicija datih ovde.
[0070] Termin „bolest“, kako se ovde koristi, generalno je sinonim i koristi se naizmenično sa terminima „poremećaj“ i „stanje“ (kao u medicinskom stanju), jer svi odražavaju abnormalno stanje ljudskog ili životinjskog tela ili jednog od njegovih delova koje narušava normalno funkcionisanje, tipično se manifestuje različitim znacima i simptomima i uzrokuje da čovek ili životinja imaju smanjeno trajanje ili kvalitet života.
[0072] Kako se ovde koriste, termini „peptid“, „polipeptid“ i „protein“ i varijacije ovih termina odnose se na molekul, posebno peptid, oligopeptid, polipeptid ili protein, uključujući fuzioni protein, respektivno, koji sadrži najmanje dve aminokiseline povezane jedna sa drugom normalnom peptidnom vezom ili modifikovanom peptidnom vezom, kao na primer u slučajevima izosternih peptida. Na primer, peptid, polipeptid ili protein mogu biti sastavljeni od aminokiselina odabranih od 20 aminokiselina definisanih genetskim kodom, povezanih jedna sa drugom normalnom peptidnom vezom („klasični“ polipeptid). Peptid, polipeptid, ili protein mogu biti sastavljeni od L-aminokiselina i / ili D-aminokiselina. Naročito, pojmovi "peptid", "polipeptid", i "protein takođe uključuju" peptidomimetike" koji su definisani kao peptidni analozi koji sadrže nepeptidne strukturne elemente, a koji su peptidi sposobni da oponašaju ili antagoniziraju biološka dejstva prirodnog matičnog peptida. Peptidomimetiku nedostaju klasične karakteristike peptida, kao što su enzimski deljive peptidne veze. Konkretno, peptid, polipeptid ili protein mogu da sadrže aminokiseline osim 20 aminokiselina definisanih genetskim kodom pored ovih aminokiselina, ili mogu biti sastavljene od aminokiselina osim 20 aminokiselina definisanih genetskim kodom. Naročito, peptid, polipeptid ili protein u kontekstu predmetnog obelodanjivanja mogu podjednako biti sastavljeni od aminokiselina modifikovanih prirodnim procesima, kao što su procesi post-translacionog sazrevanja ili hemijski procesi, koji su dobro poznati stručnjaku u umetnost. Takve modifikacije su u celosti detaljno opisane u literaturi. Ove modifikacije se mogu pojaviti bilo gde u polipeptidu: u skeptiru peptida, u lancu aminokiselina ili čak na krajevima karboksi- ili amino-terminala. Naročito, peptid ili polipeptid se može razgranati posle ubikvitacije ili biti cikličan sa ili bez grananja. Ova vrsta modifikacije može biti rezultat prirodnih ili sintetičkih posttranslacionih procesa koji su dobro poznati stručnjaku. Termini "peptid", "polipeptid", ili "protein" u kontekstu predmetnog obelodanjivanja naročito takođe uključuju modifikovane peptide, polipeptide i proteine. Na primer, modifikacije peptida, polipeptida ili proteina mogu da uključuju acetilaciju, acilaciju, ADP-ribozilaciju, amidaciju, kovalentnu fiksaciju nukleotida ili nukleotidnog derivata, kovalentnu fiksaciju lipida ili lipidnog derivata, kovalentnu fiksaciju fosfatidilinozitola, kovalentno ili nekovalentno umrežavanje, ciklizacija, formiranje disulfidnih veza, demetilacija, glikozilacija uključujući pegiliranje, hidroksilacija, jodiranje, metilacija, miristilacija, oksidacija, proteolitički procesi, fosforilacija, prenilacija, racemizacija, seneloilacija, sulfatacija, dodavanje aminokiselina kao što je arginitilacija. Takve modifikacije su detaljno opisane u literaturi (Proteins Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, New York (1993); Post-translational Covalent Modifications of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter, i dr., Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol.182:626-46 (1990); i Rattan, i dr., Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci 663:48-62(1992)). Prema tome, pojmovi "peptid", "polipeptid", i "protein" uključuju na primer lipopeptide, lipoproteine, glikopeptide, glikoproteine i slično.
[0073] Kako se ovde koristi, „(poli)peptid“ obuhvata jedan lanac monomera aminokiselina povezanih peptidnim vezama kao što je iznad objašnjeno. „Protein“, kako se ovde koristi, obuhvata jedan ili više, npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 (poli)peptida, tj., jedan ili više lanaca monomera aminokiselina povezanih peptidnim vezama kao što je iznad objašnjeno. U posebnim otelotvorenjima, protein prema predmetnom obelodanjivanju obuhvata 1, 2, 3 ili 4 polipeptida.
[0075] Termin „rekombinantni“, kako se ovde koristi (npr., rekombinantno antitelo, rekombinantni protein, rekombinantna nukleinska kiselina, itd.), odnosi se na bilo koji molekul (antitelo, protein, nukleinska kiselina, siRNK, itd.) koji je pripremljen, ekspresovan, kreiran ili izolovan rekombinantnim sredstvima, a koji se ne javlja prirodno. Kako se ovde koristi, termini „nukleinska kiselina“, „molekul nukleinske kiseline“ i „polinukleotid“ se koriste naizmenično i namenjeni su da obuhvate molekule DNK i molekule RNK. Molekul nukleinske kiseline može biti jednolančani ili dvolančani. U određenim otelotvorenjima, molekul nukleinske kiseline je dvolančana RNK.
[0077] Kako se ovde koristi, termini „ćelija“, „ćelijska linija“ i „ćelijska kultura“ se koriste naizmenično i sva takva označenja uključuju potomstvo. Stoga, reči "transformatori" i "transformisane ćelije" uključuju primarnu ćeliju ispitanika i kulture izvedene iz njih bez obzira na broj prenosa. Takođe se razume da svi potomci možda nisu tačno identični u sadržaju DNK, zbog namernih ili nenamernih mutacija. Uključeno je mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je pregledano u prvobitno transformisanoj ćeliji. Gde su namenjene različite oznake, biće jasno iz konteksta.
[0079] Kako se ovde koristi, termin „varijanta sekvence“ odnosi se na bilo koju sekvencu koja ima jednu ili više promena u poređenju sa referentnom sekvencom, pri čemu je referentna sekvenca bilo koja od sekvenci navedenih u listi sekvenci, tj. SEQ ID NO:1 do SEQ ID NO:104.104. Stoga, termin "varijanta sekvence" uključuje varijante nukleotidne sekvence i varijante sekvence aminokiselina. Za varijantu sekvence u kontekstu nukleotidne sekvence, referentna sekvenca je takođe nukleotidna sekvenca, dok je za varijantu sekvence u kontekstu aminokiselinskih sekvenci, referentna sekvenca takođe aminokiselinski sekvenca. „Varijanta sekvence“ kako se ovde koristi je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična referentnoj sekvenci. Identitet sekvence se obično izračunava u odnosu na punu dužinu referentne sekvence (tj., sekvence navedene u patentnoj prijavi), osim ako nije drugačije naznačeno. Procentualni identitet, kako je ovde navedeno, može se odrediti, na primer, korišćenjem BLAST-a koristeći podrazumevane parametre koje je odredio NCBI (Nacionalni centar za biotehnološke informacije; http://www.ncbi.nim.nih.gov/) [Blosum 62 matrix; kazna za otvaranje jaza = 11 i kazna za proširenje jaza = 1]. „Varijanta sekvence“ u kontekstu sekvence nukleinske kiseline (nukleotida) ima izmenjenu sekvencu u kojoj je jedan ili više nukleotida u referentnoj sekvenci izbrisan ili supstituisan, ili je jedan ili više nukleotida umetnut u sekvencu referentne nukleotidne sekvence. Nukleotidi se ovde nazivaju standardnom oznakom od jednog slova (A, C, G ili T). Zbog degeneracije genetskog koda, „varijanta sekvence“ nukleotidne sekvence može rezultirati promenom u odgovarajućoj referentnoj sekvenci aminokiselina, tj., „varijantom“ aminokiseline ili ne. U određenim otelotvorenjima, varijante nukleotidne sekvence su varijante koje ne rezultiraju varijantama aminokiseline (tj., tihim mutacijama). Međutim, varijante nukleotidne sekvence koje dovode do „ne-tihih“ mutacija takođe su u okviru, posebno takve varijante nukleotidne sekvence koje rezultiraju sekvencom aminokiselina koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična referentnoj sekvenci aminokiselina. „Varijanta sekvence“ u kontekstu aminokiselinske sekvence ima izmenjenu sekvencu u kojoj je jedna ili više aminokiselina izbrisana, supstituisana ili umetnuta u poređenju sa referentnom aminokiselinskom sekvencom. Kao rezultat izmena, takva varijanta sekvence ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična referentnoj aminokiselinskoj sekvenci. Na primer, na 100 aminokiselina referentne sekvence, varijantna sekvenca koja nema više od 10 izmena, tj., bilo koju kombinaciju delecija, insercija ili supstitucija, je „najmanje 90% identična“ referentnoj sekvenci.
[0081] [0038] Iako je moguće imati nekonzervativne supstitucije aminokiselina, u određenim otelotvorenjima, supstitucije su konzervativne supstitucije aminokiselina, u kojima supstituisana aminokiselina ima slična strukturna ili hemijska svojstva sa odgovarajućom aminokiselinom u referentnoj sekvenci. Na primer, konzervativne supstitucije aminokiselina uključuju supstituciju jedne alifatične ili hidrofobne aminokiseline, npr., alanina, valina, leucina i izoleucina, drugom; supstituciju jedne aminokiseline koja sadrži hidroksil, npr., serina i treonina, drugom; supstituciju jednog kiselog ostatka, npr., glutaminske kiseline ili asparaginske kiseline, drugim; zamenu jednog ostatka koji sadrži amid, npr., asparagina i glutamina, drugim; zamenu jednog aromatičnog ostatka, npr., fenilalanina i tirozina, drugim; zamenu jednog baznog ostatka, npr., lizina, arginina i histidina, drugim; i zamena jedne male aminokiseline, npr., alanina, serina, treonina, metionina i glicina, drugom.
[0083] Insercije aminokiselinske sekvence uključuju fuzije amino- i / ili karboksilnih terminala u dužini od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i ubacivanja intrasekvenci pojedinačnih ili višestrukih aminokiselinskih ostataka. Primeri terminalnih insercija uključuju fuziju sa N- ili C-terminusom aminokiselinske sekvence reporter molekula ili enzima.
[0085] Osim ako nije drugačije navedeno, izmene u varijantama sekvence ne ukidaju funkcionalnost odgovarajuće referentne sekvence, na primer, u ovom slučaju, funkcionalnost sekvence anti-HBV antitela ili inhibitora ekspresije HBV gena (npr., siRNK) da bi se dovoljno neutralisala infekcija HBV ili smanjila ekspresija HBV proteina, respektivno. Uputstva za određivanje koji nukleotidi i aminokiselinski ostaci, respektivno, mogu biti supstituisani, umetnuti ili izbrisani bez ukidanja takve funkcionalnosti mogu se pronaći korišćenjem računarskih programa dobro poznatih u struci.
[0087] Kako se ovde koristi, sekvenca nukleinske kiseline ili sekvenca aminokiseline „izvedena iz“ određene nukleinske kiseline, peptida, polipeptida ili proteina odnosi se na poreklo nukleinske kiseline, peptida, polipeptida ili proteina. U nekim otelotvorenjima, sekvenca nukleinske kiseline ili sekvenca aminokiseline koja je izvedena iz određene sekvence ima sekvencu aminokiseline koja je u suštini identična toj sekvenci ili njenom delu iz koje je izvedena, pri čemu „suštinski identično“ uključuje varijante sekvence kao što je iznad definisano. U određenim otelotvorenjima, sekvenca nukleinske kiseline ili sekvenca aminokiseline koja je izvedena iz određenog peptida ili proteina izvedena je iz odgovarajućeg domena u određenom peptidu ili proteinu. Stoga se „odgovarajući“ odnosi posebno na istu funkcionalnost. Na primer, „ekstracelularni domen“ odgovara drugom „ekstracelularnom domenu“ (drugog proteina), ili „transmembranski domen“ odgovara drugom „transmembranskom domenu“ (drugog proteina). „Odgovarajući“ delovi peptida, proteina i nukleinskih kiselina su stoga prepoznatljivi stručnjaku u ovoj oblasti. Slično tome, sekvence „izvedene iz“ druge sekvence su obično prepoznatljive stručnjaku u ovoj oblasti kao one koje potiču iz te sekvence.
[0089] U nekim otelotvorenjima, sekvenca nukleinske kiseline ili sekvenca aminokiseline izvedena iz druge nukleinske kiseline, peptida, polipeptida ili proteina može biti identična početnoj nukleinskoj kiselini, peptidu, polipeptidu ili proteinu (iz kojeg je izvedena). Međutim, sekvenca nukleinske kiseline ili sekvenca aminokiseline izvedena iz druge nukleinske kiseline, peptida, polipeptida ili proteina može takođe imati jednu ili više mutacija u odnosu na početnu nukleinsku kiselinu, peptid, polipeptid ili protein (iz kojeg je izvedena), posebno sekvenca nukleinske kiseline ili sekvenca aminokiseline izvedena iz druge nukleinske kiseline, peptida, polipeptida ili proteina može biti funkcionalna varijanta sekvence, kao što je iznad opisano, početne nukleinske kiseline, peptida, polipeptida ili proteina (iz kojeg je izvedena). Na primer, u peptidu/proteinu jedan ili više ostataka aminokiselina mogu biti supstituisani drugim ostacima aminokiselina ili može doći do insercija ili delecija jednog ili više ostataka aminokiselina.
[0091] Kako se ovde koristi, termin „mutacija“ odnosi se na promenu u sekvenci nukleinske kiseline i/ili u sekvenci aminokiseline u poređenju sa referentnom sekvencom, npr., odgovarajućom genomskom sekvencom. Mutacija, npr. u poređenju sa genomskom sekvencom, može biti, na primer, (prirodno nastala) somatska mutacija, spontana mutacija, indukovana mutacija, npr., indukovana enzimima, hemikalijama ili zračenjem, ili mutacija dobijena usmerenom mutagenezom (metode molekularne biologije za stvaranje specifičnih i namernih promena u sekvenci nukleinske kiseline i/ili u sekvenci aminokiseline). Stoga, termini „mutacija“ ili „mutiranje“ treba da se razumeju i kao fizičko stvaranje mutacije, npr., u sekvenci nukleinske kiseline ili u sekvenci aminokiseline. Mutacija uključuje supstituciju, deleciju i umetanje jednog ili više nukleotida ili aminokiselina, kao i inverziju nekoliko uzastopnih nukleotida ili aminokiselina. Da bi se postigla mutacija u aminokiselinskoj sekvenci, mutacija se može uvesti u nukleotidnu sekvencu koja kodira navedenu aminokiselinsku sekvencu kako bi se ekspresovao (rekombinantni) mutirani polipeptid. Mutacija se može postići, npr., izmenom, npr., usmerenom mutagenezom, kodona molekula nukleinske kiseline koji kodira jednu aminokiselinu da bi se dobio kodon koji kodira drugu aminokiselinu, ili sintezom varijante sekvence, npr., poznavanjem nukleotidne sekvence molekula nukleinske kiseline koji kodira polipeptid i dizajniranjem sinteze molekula nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira varijantu polipeptida bez potrebe za mutacijom jednog ili više nukleotida molekula nukleinske kiseline.
[0093] Kako se ovde koristi, termin „kodirajuća sekvenca“ se odnosi na molekul polinukleotida koji kodira aminokiselinska sekvenca proteinskog proizvoda. Granice kodirajuće sekvence su generalno određene otvorenim okvirom za čitanje, koji obično počinje sa ATG startnim kodonom.
[0094] Termin „ekspresija“, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji korak uključen u proizvodnju polipeptida, uključujući transkripciju, posttranskripcionu modifikaciju, translaciju, posttranslacionu modifikaciju, sekreciju ili slično.
[0096] U nekim aspektima, predmetno obelodanjivanje se odnosi na upotrebu inhibitora ekspresije HBV gena. Kako se ovde koristi, „inhibitor ekspresije HBV gena“ je bilo koje sredstvo koje dovodi do barem delimičnog smanjenja ekspresije HBV gena, što se manifestuje smanjenjem količine HBV mRNK koja se može izolovati iz ili detektovati u prvoj ćeliji ili grupi ćelija u kojima je HBV gen transkribovan i koje su tretirane ili su tretirane inhibitorom ekspresije HBV gena, tako da je ekspresija HBV gena inhibirana, u poređenju sa drugom ćelijom ili grupom ćelija suštinski identičnim prvoj ćeliji ili grupi ćelija, ali koje su ili nisu tako tretirane (kontrolne ćelije). U nekim otelotvorenjima, inhibitor ekspresije HBV gena je RNKi sredstvo (npr., siRNK). Ekspresija HBV gena može se meriti metodama poznatim u struci. Osim ako nije drugačije naznačeno, „ekspresija HBV gena“ kako se ovde koristi određuje se korišćenjem rtPCR ili merenjem ekspresije proteina korišćenjem enzimski povezanog imunosorbentnog testa (ELISA) ili imunohistohemije.
[0098] U nekim aspektima, predmetno obelodanjivanje se odnosi na upotrebu sredstva koje smanjuje HBV antigensko opterećenje. Kako se ovde koristi, „sredstvo koje smanjuje HBV antigensko opterećenje“ odnosi se na bilo koje sredstvo koje rezultira smanjenjem količine HBV antigena koji se može izolovati iz ili detektovati u prvoj ćeliji ili grupi ćelija koja je tretirana ili je tretirana sredstvom, u poređenju sa drugom ćelijom ili grupom ćelija koje su suštinski identične prvoj ćeliji ili grupi ćelija, ali koje jesu ili nisu tako tretirane (kontrolne ćelije). U nekim otelotvorenjima, sredstvo koje smanjuje HBV antigensko opterećenje je RNKi sredstvo (npr., siRNK). Antigensko opterećenje može se meriti postupcima poznatim u struci. Osim ako nije drugačije naznačeno, „HBV antigensko opterećenje“ kako se ovde koristi određuje se merenjem količine antigena (npr., HBsAg) korišćenjem ELISA testa.
[0100] Predmetno obelodanjivanje pruža kombinovanu terapiju za lečenje HBV, koja uključuje anti-HBV antitelo. U određenim otelotvorenjima, anti-HBV antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen vezuje se za antigenski region petlje HBsAg i neutrališe infekciju virusom hepatitisa B.
[0102] Kako se ovde koristi, termin „antitelo“ obuhvata različite oblike antitela, uključujući, bez ograničenja, cela antitela; fragmente antitela, fragmente koji vezuju antigen, ljudska antitela, himerna antitela, humanizovana antitela; rekombinantna antitela i genetski modifikovana antitela (varijantna ili mutantna antitela) sve dok se zadržavaju karakteristična svojstva antitela. U nekim otelotvorenjima, antitela su ljudska antitela i/ili monoklonska antitela. U određenim otelotvorenjima, antitela su ljudska monoklonska antitela. U određenim posebnim otelotvorenjima, antitela su rekombinantna ljudska monoklonska antitela. Kako se ovde koristi, termini „fragment koji vezuje antigen“, „fragment“ i „fragment antitela“ koriste se naizmenično da bi se odnosili na bilo koji fragment antitela kombinovane terapije koji zadržava aktivnost vezivanja antigena antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, jednolančano antitelo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv ili scFv. Dalje, termin „antitelo“ kako se ovde koristi obuhvata i antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen.
[0104] Kako se ovde koristi, „neutralizujuće antitelo“ je ono koje može neutralisati, tj., sprečiti, inhibirati, smanjiti, ometati ili ometati sposobnost patogena da započne i/ili održi infekciju kod domaćina. Termini „neutralizujuće antitelo“ i „antitelo koje neutrališe“ ili „antitela koja neutrališu“ se ovde koriste naizmenično. Ova antitela se mogu koristiti sama ili u kombinaciji, kao profilaktička ili terapeutska sredstva uz odgovarajuću formulaciju, u vezi sa aktivnom vakcinacijom, kao dijagnostičko sredstvo ili kao proizvodno sredstvo kako je ovde opisano.
[0106] [0051] Humana antitela su dobro poznata u stanju tehnike (van Dijk, M. A., and van de Winkel, J. C, Curr. Opin. Chem. Biol.5:368-74 (2001)). Humana antitela se takođe mogu proizvesti u transgenim životinjama (npr., miševima) koje su sposobne, nakon imunizacije, da proizvedu pun repertoar ili selekciju ljudskih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Transfer niza gena ljudskih imunoglobulina germinativne linije u takve mutantne miševe germinativne linije rezultiraće proizvodnjom humanih antitela nakon izlaganja antigenu (videti, npr., Jakobovits, A., i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-55 (1993); Jakobovits, A., i dr., Nature 362:255-258 (1993); Bruggemann, M., i dr., Year Immunol.7:3340 (1993)). Humana antitela se takođe mogu proizvesti u bibliotekama fagnog prikaza (Hoogenboom, H. R., and Winter, G., Mol. Biol.227:381-88 (1992); Marks, J. D., i dr., Mol Biol.222:581-97 (1991)). Tehnike koje su koristili Kol i dr. i Berner i dr. su takođe dostupne za pripremu humanih monoklonskih antitela (Cole, i dr., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boerner, P., i dr., Immunol.147:86 95 (1991)). U nekim otelotvorenjima, ljudska monoklonska antitela se pripremaju korišćenjem poboljšane immortalizacije EBY-B ćelija kao što je opisano u Traggiai, E., i dr. (Nat Med.10(8):871-5 (2004)). Termin „humano antitelo“, kako se ovde koristi, takođe obuhvata takva antitela koja su modifikovana, npr., u varijabilnom regionu, da bi se generisala svojstva kao što je ovde opisano.
[0108] Antitela kombinovane terapije mogu biti bilo kog izotipa (npr., IgA, IgG, IgM, tj. teški lanac κ, γ ili µ), ali u određenim posebnim otelotvorenjima, antitela su IgG. Unutar IgG izotipa, antitela mogu biti podklase IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. U posebnim otelotvorenjima, antitela su IgG1. Antitela kombinovane terapije mogu imati κ ili λ laki lanac. HBsAg-specifična antitela IgG tipa mogu povoljno blokirati i oslobađanje HBV i HBsAg iz inficiranih ćelija, na osnovu antigen-nezavisnog preuzimanja IgG preko FcRN-IgG receptora u hepatocite. Stoga, HBsAg-specifična antitela IgG tipa mogu se vezati intracelularno i time blokirati oslobađanje HBV viriona i HBsAg.
[0110] Kako se ovde koristi, termin „varijabilni region“ (varijabilni region lakog lanca (V<L>), varijabilni region teškog lanca (V<H>)) označava deo lakog lanca (LC) ili teškog lanca (HC) antitela (tipično oko 105-120 amino-terminalnih aminokiselina teškog ili lakog lanca zrelog antitela) koji obuhvata regione koji određuju komplementarnost („CDR“) i okvirne regione („FR“), i koji je direktno uključen u vezivanje antitela za antigen. Termini „region koji određuje komplementarnost“ i „CDR“ su sinonimi za „hipervarijabilni region“ ili „HVR“ i poznati su u struci da se odnose na nesusedne sekvence aminokiselina unutar varijabilnih regiona antitela, koje daju specifičnost za antigen i/ili afinitet vezivanja. Generalno, postoje tri CDR u svakom varijabilnom regionu proteina koji vezuje imunoglobulin; npr., za antitela, VH i VL regioni generalno obuhvataju šest CDR (CDRH1, CDRH2, CDRH3; CDRL1, CDRL2, CDRL3). Imunoglobulinske sekvence mogu se poravnati sa šemom numeracije (npr., Kabat, EU, International Immunogenetics Information System (IMGT) i Aho), što može omogućiti anotaciju ekvivalentnih pozicija ostataka i poređenje različitih molekula korišćenjem softverskog alata za numerisanje i klasifikaciju receptora antigena (ANARCI). (Bioinformatics 15:298-300 (2016)). Razume se da u određenim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja može da sadrži ceo ili deo teškog lanca (HC), lakog lanca (LC) ili oba. Na primer, monomer intaktnog IgG antitela pune dužine tipično uključuje V<H>, CH1, CH2, CH3, V<L>i CL.
[0112] U određenim otelotvorenjima, anti-HBV antitela kombinovane terapije, prema predmetnom obelodanjivanju, ili njihov fragment koji vezuje antigen, je prečišćeno antitelo, jednolančano antitelo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv ili scFv.
[0114] Antitela kombinovane terapije mogu stoga biti ljudska antitela, monoklonska antitela, ljudska monoklonska antitela, rekombinantna antitela; i/ili prečišćena antitela. Predmetno obelodanjivanje takođe pruža fragmente antitela, posebno fragmente koji zadržavaju aktivnost vezivanja antigena antitela. Takvi fragmenti uključuju, ali nisu ograničeni na, jednolančana antitela, Fab, Fab', F(ab')2, Fv ili scFv. Iako se na nekim mestima predmetno obelodanjivanje može eksplicitno odnositi na fragment(e) koji vezuju antigen, fragment(e) antitela, varijantu(e) i/ili derivat(e) antitela, kako se ovde koristi, termin „antitelo“ ili „antitelo kombinovane terapije“ obuhvata sve kategorije antitela, naime, fragment(e) koji vezuju antigen, fragment(e) antitela, varijantu(e) i derivat(e) antitela.
[0116] Fragmenti antitela mogu se dobiti iz antitela postupcima koje uključuju varenje enzimima, kao što su pepsin ili papain, i/ili deljenjem disulfidnih veza hemijskom redukcijom. Alternativno, fragmenti antitela mogu se dobiti kloniranjem i ekspresijom dela sekvenci teških ili lakih lanaca. Predmetno obelodanjivanje takođe obuhvata jednolančane Fv fragmente (scFv) izvedene iz teških i lakih lanaca antitela iz predmetnog obelodanjivanja. Na primer, obelodanjivanje uključuje scFv koji sadrži CDR-ove iz antitela iz predmetnog obelodanjivanja. Takođe su uključeni monomeri i dimeri teškog ili lakog lanca, jednodomenski teški lanac antitela, jednodomenski laki lanac antitela, kao i jednolančana antitela, npr., jednolančani Fv u kome su varijabilni domeni teškog i lakog lanca spojeni peptidnim linkerom.
[0118] Fragmenti antitela iz predmetnog obelodanjivanja mogu dati monovalentne ili multivalentne interakcije i biti sadržani u različitim strukturama kao što je iznad opisano. Na primer, scFv molekuli mogu biti sintetizovani da bi se stvorilo trovalentno „triatelo“ ili tetravalentno „tetratelo“. scFv molekuli mogu da uključuju domen Fc regiona, što rezultira dvovalentnim minitelima. Pored toga, sekvence antitela/fragmenta antitela mogu biti komponenta multispecifičnog molekula u kome sekvence ciljaju epitope kao što je ovde opisano, a drugi regioni multispecifičnog molekula se vezuju za druge ciljeve. Primeri multispecifičnih molekula uključuju, ali nisu ograničeni na, bispecifični Fab2, trispecifični Fab 3, bispecifični scFv i diatela (Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 9:1126-36 (2005)).
[0121] 1
[0122] Antitela prema predmetnom obelodanjivanju mogu biti obezbeđena u prečišćenom obliku. Tipično, antitelo će biti prisutno u sastavu koji je značajno bez drugih polipeptida, npr., gde je manje od 90% (po masi), obično manje od 60% i češće manje od 50% sastava sastavljeno od drugih polipeptida.
[0124] Antitela i fragmenti koji vezuju antigen predmetnog obelodanjivanja mogu, u nekim otelotvorenjima, biti multispecifična (npr., bispecifična, trispecifična, tetraspecifična ili slično), i mogu biti obezbeđena u bilo kom multispecifičnom formatu, kao što je ovde obelodanjeno. U određenim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen ovog otkrića je multispecifično antitelo, kao što je bispecifično ili trispecifično antitelo. Formati za bispecifična antitela su opisani, na primer, u Spiess, i dr. (Mol. Immunol.67(2):95 (2015)), i Brinkmann and Kontermann (mAbs 9(2):182-212 (2017)), koji bispecifični formati i postupci za njihovu izradu uključuju, na primer, bispecifične T ćelijske angažore (BiTE), DART, Knobs-Into-Holes (KIH) sklopove, scFv-CH3-KIH sklopove, KIH antitela za zajednički laki lanac, TandAbs, trostruka tela, TriBi mini tela, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2-scFv2, tetravalentne HCab, intratela, CrossMabs, Dual Action Fabs (DAF) (dva-u-jednom ili četiri-u-jednom), DutaMabs, DT-IgG, parove naelektrisanja, Fab-arm razmenu, SEED tela, Triomabs, LUZ-Y sklopove, Fcabs, kl-tela, ortogonalne Fabs, DVD-IgGs, IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zybody, i DVI-IgG (četiri u jedan). Bispecifično ili multispecifično antitelo može da sadrži HBV- i/ili HDV-specifični vezivni domen predmetnog obelodanjivanja u kombinaciji sa drugim takvim vezivnim domenom ovog otkrića, ili u kombinaciji sa različitim vezivnim domenom koji se specifično vezuje za HBV i/ili HDV (npr., na isti ili različiti epitop), ili sa vezivnim domenom koji se specifično vezuje za različiti antigen.
[0126] Termin „vakcina“, kako se ovde koristi, obično se shvata kao profilaktički ili terapeutski materijal koji obezbeđuje najmanje jedan antigen ili imunogen. Antigen ili imunogen može biti izveden iz bilo kog materijala koji je pogodan za vakcinaciju. Na primer, antigen ili imunogen može biti izveden iz patogena, kao što su bakterije ili virusne čestice itd., ili iz tumora ili kancerogenog tkiva. Antigen ili imunogen stimuliše adaptivni imuni sistem tela da obezbedi adaptivni imuni odgovor. Konkretno, „antigen“ ili „imunogen“ se obično odnosi na supstancu koju imuni sistem (npr., adaptivni imuni sistem) može prepoznati i koja je sposobna da pokrene antigen-specifični imuni odgovor, npr., formiranjem antitela i/ili antigenspecifičnih T ćelija kao deo adaptivnog imunog odgovora. Tipično, antigen može biti ili može sadržati peptid ili protein koji MHC može prezentovati T-ćelijama.
[0128] Doze se često izražavaju u odnosu na telesnu masu. Dakle, doza koja je izražena kao [g, mg ili druga jedinica]/kg (ili g, mg, itd.) obično se odnosi na [g, mg ili druga jedinica] „po kg (ili g, mg, itd.) telesne mase“, čak i ako termin „telesna masa“ nije eksplicitno pomenut.
[0130] Kako se ovde koristi, „virus hepatitisa B“, koji se koristi naizmenično sa terminom „HBV“, odnosi se na dobro poznati necitopatski, hepatropni DNK virus koji pripada porodici Hepadnaviridae. Genom HBV je delimično dvolančana, kružna DNK sa četiri preklapajuća okvira za čitanje (koji se ovde mogu nazivati „geni“, „otvoreni okviri za čitanje“ ili „transkripti“): C, X, P i S. Osnovni protein je kodiran genom C (HBcAg). Antigen hepatitisa B e (HBeAg) se proizvodi proteolitičkom obradom pre-jezgra (pre-C) proteina. DNK polimerazu kodira gen P. Gen S je gen koji kodira površinske antigene (HBsAg). Gen HBsAg je jedan dugačak otvoreni okvir za čitanje koji sadrži tri „startna“ (ATG) kodona u okviru, što rezultira polipeptidima tri različite veličine nazvanim veliki, srednji i mali S antigeni, pre-S1 pre-S2 S, pre-S2 S ili S.
[0131] Površinski antigeni, pored toga što ukrašavaju omotač HBV-a, takođe su deo subvirusnih čestica, koje se proizvode u velikom višku u poređenju sa virionskim česticama, i igraju ulogu u imunološkoj toleranciji i u sekvestraciji anti-HBsAg antitela, čime omogućavaju infektivnim česticama da izbegnu imunološku detekciju. Funkcija ne strukturnog proteina kodiranog genom X nije u potpunosti shvaćena, ali igra ulogu u transkripcionoj transaktivaciji i replikaciji i povezana je sa razvojem raka jetre. Utvrđeno je osam genotipova HBV-a, označenih od A do H, a predložena su još dva genotipa I i J, od kojih svaki ima različitu geografsku distribuciju. Termin „HBV“ obuhvata bilo koji od genotipova HBV-a (od A do J). Kompletna kodirajuća sekvenca referentne sekvence HBV genoma može se naći, na primer, u GenBank pristupnim brojevima GI:21326584 i GI:3582357. Aminokiselinske sekvence za C, X, P i S proteine mogu se naći, na primer, pod NCBI pristupnim brojevima YP_009173857.1 (C protein); YP_009173867.1 i BAA32912.1 (X protein); YP_009173866.1 i BAA32913.1 (P protein); i YP_009173869.1, YP_009173870.1, YP_009173871.1, i BAA32914.1 (S protein). Dodatni primeri HBV mRNK sekvenci su lako dostupni korišćenjem javno dostupnih baza podataka, npr., GenBank, UniProt i OMIM. Međunarodnom repozitorijumu za podatke o sojevima virusa hepatitisa B može se pristupiti na http://www.hpa-bioinformatics.org.uk/HepSEQ/main.php. Termin „HBV“, kako se ovde koristi, takođe se odnosi na prirodno prisutne varijacije DNK sekvence HBV genoma, tj., genotipove A-J i njihove varijante.
[0133] II. Inhibitori ekspresije i sistemi za isporuku HBV proteina
[0135] Predmetno obelodanjivanje pruža inhibitore ekspresije HBV proteina za upotrebu u kombinovanoj terapiji za lečenje HBV. U određenim otelotvorenjima, inhibitor ekspresije HBV gena je RNKi agens. Kako se ovde koristi, termin „RNK interferencijski agens“ ili „RNKi agens“ odnosi se na sredstvo koje sadrži RNK kako je taj termin ovde definisan, i koji posreduje u ciljanom deljenju RNK transkripta putem puta RNK-indukovanog kompleksa za utišavanje (RISC). U nekim otelotvorenjima, RNKi agens kako je ovde opisano deluje na inhibiciju ekspresije HBV gena.
[0137] U jednom aspektu, RNK interferencijsko sredstvo uključuje jednolančanu RNK koja interaguje sa ciljnom RNK sekvencom kako bi usmerilo deljenje ciljne RNK. Bez želje da se vežemo za određenu teoriju, duga dvolančana RNK (dsRNK) uneta u biljke i ćelije beskičmenjaka se razlaže na siRNK pomoću endonukleaze tipa III poznate kao (Sharp, i dr., Genes Dev.15:485 (2001)). Dajser, enzim sličan ribonukleazi III, obrađuje dcRNK u kratke interferirajuće RNK (siRNK) dužine 19-23 baznih parova sa karakterističnim dvobaznim 3' prepustima (Bernstein, i dr., Nature 409:363 (2001)). siRNK se zatim ugrađuju u kompleks za utišavanje indukovan RNK (RISK) gde jedna ili više helikaza odmotavaju dupleks siRNK, omogućavajući komplementarnom antisens lancu da vodi prepoznavanje cilja (Nykanen, i dr., Cell 107:309 (2001)). Nakon vezivanja za odgovarajuću ciljnu mRNK, jedna ili više endonukleaza unutar RISK-a cepaju cilj da bi indukovali utišavanje. (Elbashir, i dr, Genes Dev.15:188 (2001)). Dakle, u jednom aspektu, tehnologija opisana ovde se odnosi na jednolančanu RNK koja promoviše formiranje RISC kompleksa kako bi se izazvalo utišavanje ciljnog gena.
[0139] Termini „utišavanje“, „inhibira ekspresiju“, „snižava ekspresiju“, „suzbija ekspresiju“ i slično, ukoliko se odnose na HBV gen, ovde se odnose na barem delimično smanjenje ekspresije HBV gena, što se manifestuje smanjenjem količine HBV mRNK koja se može izolovati iz ili detektovati u prvoj ćeliji ili grupi ćelija u kojima je HBV gen transkribovan i koje su tretirane ili su tretirane inhibitorom ekspresije HBV gena, tako da je ekspresija HBV gena inhibirana, u poređenju sa drugom ćelijom ili grupom ćelija suštinski identičnim prvoj ćeliji ili grupi ćelija, ali koje su ili nisu tako tretirane (kontrolne ćelije). Stepen inhibicije može se meriti, na primer, kao razlika između stepena ekspresije mRNK u kontrolnoj ćeliji minus stepen ekspresije mRNK u tretiranoj ćeliji. Alternativno, stepen inhibicije može se dati u smislu smanjenja parametra koji je funkcionalno povezan sa ekspresijom gena HBV, npr., količina proteina kodiranog genom HBV ili broj ćelija koje pokazuju određeni fenotip, npr., fenotip HBV infekcije kao što je HBV infekcija, ekspresija proteina HBV (kao što je površinski antigen hepatitisa B, HBsAg), ili promene u ćelijskoj ekspresiji gena koje odražavaju ekspresiju gena HBV (npr., ekspresija i lokalizacija Smc5/6). Stepen inhibicije može se meriti i korišćenjem ćelije konstruisane da ekspresuje reporterski gen koji odražava ekspresiju HBV RNK. U principu, utišavanje gena HBV može se odrediti u bilo kojoj ćeliji koja ekspresuje gen HBV, npr., ćelija inficirana HBV-om ili ćelija konstruisana da ekspresuje gen HBV, i bilo kojim odgovarajućim testom.
[0141] Nivo HBV RNK koju ekspresuje ćelija ili grupa ćelija, ili nivo cirkulišuće HBV RNK, može se odrediti korišćenjem bilo kojeg postupka poznatog u struci za procenu ekspresije mRNK, kao što je rtPCR postupak dat u Primeru 2 Međunarodne patentne prijave br. WO 2016/077321A1 i patentnoj prijavi SAD br. US2017/0349900A1. U nekim otelotvorenjima, nivo ekspresije HBV gena (npr., ukupne HBV RNK, HBV transkripta, npr., HBV transkripta od 3,5 kb) u uzorku se određuje detekcijom transkribovanog polinukleotida ili njegovog dela, npr., RNK HBV gena. RNK se može ekstrahovati iz ćelija korišćenjem tehnika ekstrakcije RNK, uključujući, na primer, korišćenje ekstrakcije kiselim fenolom/gvanidin izotiocijanatom (RNAzol B;
[0143] Biogenisis), RMeasy komplete za pripremu RNK (Qiagen®) ili PAXgene (PreAnalytix, Švajcarska). Tipični formati analiza koji koriste hibridizaciju ribonukleinske kiseline uključuju testove nuklearnog naleta, RT-PCR, testove zaštite RNase (Melton i dr., Nuc. Acids Res.12:7035), nortern blot, in situ hibridizaciju i analizu mikročipova. Cirkulišuća HBV mRNK može se detektovati korišćenjem postupaka opisanih u međunarodnoj patentnoj objavi br. WO 2012/177906A1 i patentnoj prijavi SAD br. US2014/0275211A1.
[0145] [0066] Kako se ovde koristi, „ciljna sekvenca“ odnosi se na susedni deo nukleotidne sekvence molekula mRNK formiranog tokom transkripcije HBV gena, uključujući mRNK koja je proizvod RNK obrade primarnog transkripcionog proizvoda. Ciljni deo sekvence biće bar dovoljno dugačak da služi kao supstrat za cepanje usmereno RNKi na ili blizu tog dela. Na primer, ciljna sekvenca će generalno biti dužine od 9-36 nukleotida, npr., 15-30 nukleotida, uključujući sve podopsege između njih. Kao neograničavajući primeri, ciljna sekvenca može biti od 15-30 nukleotida, 15-26 nukleotida, 15-23 nukleotida, 15-22 nukleotida, 15-21 nukleotida, 15-20 nukleotida, 15-19 nukleotida, 15-18 nukleotida, 15-17 nukleotida, 18-30 nukleotida, 18-26 nukleotida, 18-23 nukleotida, 18-22 nukleotida, 18-21 nukleotida, 19-26 nukleotida, 19-23 nukleotida, 19-22 nukleotida, 19-21 nukleotida, 19-20 nukleotida, 20-30 nukleotida, 20-26 nukleotida, 20-25 nukleotida, 20-24 nukleotida, 20-23 nukleotida, 20-22 nukleotida, 20-21 nukleotid, 21-30 nukleotida, 21-26 nukleotida, 21-25 nukleotida, 21-24 nukleotida, 21-23 nukleotida ili 21-22 nukleotida.
[0147] Kako se ovde koristi, termin „lanac koji sadrži sekvencu“ odnosi se na oligonukleotid koji sadrži lanac nukleotida koji je opisan sekvencom na koju se poziva korišćenjem standardne nomenklature nukleotida.
[0149] Kako se ovde koristi, i osim ako nije drugačije naznačeno, termin „komplementaran“, kada se koristi za opisivanje prve nukleotidne sekvence u odnosu na drugu nukleotidnu sekvencu, odnosi se na sposobnost oligonukleotida ili polinukleotida koji sadrži prvu nukleotidnu sekvencu da se hibridizuje i formira dupleks strukturu pod određenim uslovima sa oligonukleotidom ili polinukleotidom koji sadrži drugu nukleotidnu sekvencu, što će stručnjak razumeti. Takvi uslovi mogu, na primer, biti strogi uslovi, gde strogi uslovi mogu uključivati: 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA, 50°C ili 70°C tokom 12-16 sati, nakon čega sledi pranje. Mogu se primeniti i drugi uslovi, kao što su fiziološki relevantni uslovi koji se mogu sresti unutar organizma. Stručnjak će biti u stanju da odredi skup uslova koji je najprikladniji za test komplementarnosti dve sekvence u skladu sa konačnom primenom hibridizovanih nukleotida.
[0151] Komplementarne sekvence unutar RNKi sredstva, npr., unutar siRNK kako je ovde opisano, uključuju uparivanje baza oligonukleotida ili polinukleotida koji sadrži prvu nukleotidnu sekvencu sa oligonukleotidom ili polinukleotidom koji sadrži drugu nukleotidnu sekvencu duž cele dužine jedne ili obe nukleotidne sekvence. Takve sekvence se ovde mogu nazvati „potpuno komplementarnim“ jedna u odnosu na drugu. Međutim, tamo gde se prva sekvenca ovde naziva „suštinski komplementarnom“ u odnosu na drugu sekvencu, dve sekvence mogu biti potpuno komplementarne ili mogu formirati jedan ili više, ali generalno ne više od 5, 4, 3 ili 2 neusklađena bazna para nakon hibridizacije za dupleks do 30 baznih parova, uz zadržavanje sposobnosti hibridizacije pod uslovima koji su najrelevantniji za njihovu krajnju primenu, npr., inhibicija ekspresije gena putem RISC puta. Međutim, tamo gde su dva oligonukleotida dizajnirana da formiraju, nakon hibridizacije, jedan ili više jednolančanih prepusta, takvi prepusta se neće smatrati neusklađenostima u pogledu određivanja komplementarnosti. Na primer, siRNK koja sadrži jedan oligonukleotid dužine 21 nukleotida i drugi oligonukleotid dužine 23 nukleotida, gde duži oligonukleotid sadrži sekvencu od 21 nukleotida koja je potpuno komplementarna kraćem oligonukleotidu, ipak se može nazivati „potpuno komplementarnom“ za svrhe opisane ovde.
[0153] „Komplementarne“ sekvence, kako se ovde koriste, takođe mogu da uključuju ili da budu u potpunosti formirane od ne-Vatson-Krikovih baznih parova i/ili baznih parova formiranih od neprirodnih i modifikovanih nukleotida, ukoliko su ispunjeni iznad navedeni zahtevi u pogledu njihove sposobnosti hibridizacije. Takvi ne-Vatson-Krikovi bazni parovi uključuju, ali nisu ograničeni na, G:U Wobble ili Hoogstein uparivanje baza.
[0155] Termini „komplementaran“, „potpuno komplementaran“ i „suštinski komplementaran“ ovde se mogu koristiti u odnosu na podudaranje baza između smislenog lanca i antismislenog lanca siRNK, ili između antisens lanca RNKi sredstva i ciljne sekvence, što će se razumeti iz konteksta njihove upotrebe.
[0157] Kako se ovde koristi, polinukleotid koji je „suštinski komplementaran“ bar delu informacione RNK (mRNK) odnosi se na polinukleotid koji je suštinski komplementaran susednom delu mRNK od interesa (npr., mRNK koja kodira HBV protein). Na primer, polinukleotid je komplementaran bar delu HBV mRNK ako je sekvenca suštinski komplementarna neprekinutom delu HBV mRNK.
[0159] a. siRNK-e
[0161] U nekim otelotvorenjima, RNKi sredstvo sadrži siRNK. Termin „siRNK“, kako se ovde koristi, odnosi se na RNKi koja uključuje RNK molekul ili kompleks molekula koji imaju hibridizovani dupleks region koji sadrži dva antiparalelna i suštinski komplementarna lanca nukleinskih kiselina, koji će se nazivati onima koji imaju „sens“ i „antisens“ orijentacije u odnosu na ciljnu RNK. Dupleks region može biti bilo koje dužine koja omogućava specifičnu degradaciju željene ciljne RNK kroz RISC put, ali će tipično biti u rasponu od 9 do 36 baznih parova dužine, npr., 15-30 baznih parova dužine. Uzimajući u obzir dupleks između 9 i 36 baznih parova, dupleks može biti bilo koje dužine u ovom opsegu, na primer, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ili 36 i bilo koji podopseg
[0164] 1
[0165] između njih, uključujući, ali ne ograničavajući se na 15-30 baznih parova, 15-26 baznih parova, 15-23 baznih parova, 15-22 bazna para, 15-21 bazni par, 15-20 baznih parova, 15-19 baznih parova, 15-18 baznih parova, 15-17 baznih parova, 18-30 baznih parova, 18-26 baznih parova, 18-23 baznih parova, 18-22 baznih para, 18-21 bazni par, 18-20 baznih parova, 19-30 baznih parova, 19-26 baznih parova, 19-23 baznih parova, 19-22 baznih para, 19-21 bazni par, 19-20 baznih parova, 20-30 baznih parova, 20-26 baznih parova, 20-25 baznih parova, 20-24 baznih parova, 20-23 baznih para, 20-22 baznih para, 20-21 bazni par, 21-30 baznih parova, 21-26 baznih parova, 21-25 baznih parova, 21-24 baznih parova, 21-23 baznih para i 21-22 baznih para. siRNK generisane u ćeliji obradom pomoću Dajsera i sličnih enzima su generalno dužine u rasponu od 19-22 bazna para. Termin „dvolančana RNK“ ili „dsRNK“ se ovde takođe koristi sinonimno za siRNK kao što je iznad opisano.
[0167] Jedan lanac dupleks regiona siRNK sadrži sekvencu koja je u suštini komplementarna regionu ciljne RNK. Dva lanca koja formiraju dupleks strukturu mogu biti iz jednog molekula RNK koji ima najmanje jedan samokomplementarni region ili mogu biti formirana od dva ili više odvojenih molekula RNK. Kada je dupleks region formiran od dva lanca jednog molekula, molekul može imati dupleks region odvojen jednolančanim lancem nukleotida (ovde se naziva „petlja u obliku ukosnica“) između 3'-kraja jednog lanca i 5'-kraja odgovarajućeg drugog lanca koji formira dupleks strukturu. Petlja u obliku ukosnica može da sadrži najmanje jedan neupareni nukleotid; u nekim otelotvorenjima, petlja u obliku ukosnica može da sadrži najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 20, najmanje 23 ili više neuparenih nukleotida. Tamo gde su dva suštinski komplementarna lanca siRNK sastavljena od odvojenih molekula RNK, ti molekuli ne moraju, ali mogu biti kovalentno povezani. Tamo gde su dva lanca kovalentno povezana na način koji nije u obliku ukosnice, struktura za povezivanje se naziva „veznik“.
[0169] Termin „antisens lanac“ ili „vodeći lanac“ odnosi se na lanac RNKi sredstvo, npr., siRNK, koji uključuje region koji je suštinski komplementaran ciljnoj sekvenci. Kako se ovde koristi, termin „region komplementarnosti“ odnosi se na region na antisens lancu koji je suštinski komplementaran sekvenci, na primer ciljnoj sekvenci, kako je ovde definisano. Tamo gde region komplementarnosti nije potpuno komplementaran ciljnoj sekvenci, neusklađenosti mogu biti u unutrašnjim ili terminalnim regionima molekula.
[0171] Generalno, najtolerantnija neusklađenja su u terminalnim regionima, npr., unutar 5, 4, 3 ili 2 nukleotida od 5' i/ili 3' terminala.
[0173] Termin „sens lanac“ ili „zaostajući lanac“, kako se ovde koristi, odnosi se na lanac RNK interferencije koji uključuje region koji je suštinski komplementaran regionu antisens lanca, kako je taj termin ovde definisan.
[0175] U drugom aspektu, sredstvo je jednolančani antisens RNK molekul. Antisens RNK molekul može imati 15-30 nukleotida komplementarnih cilju. Na primer, antisens RNK molekul može imati sekvencu od najmanje 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ili više susednih nukleotida iz jedne od antisens sekvenci opisanih ovde.
[0177] [0079] Stručnjak će prepoznati da termin „molekul RNK“ ili „molekul ribonukleinske kiseline“ obuhvata ne samo molekule RNK kako su izražene ili pronađene u prirodi, već i analoge i derivate RNK koji sadrže jedan ili više analoga ili derivata ribonukleotida/ribonukleozida kako je ovde opisano ili kako je poznato u struci. Strogo govoreći, „ribonukleozid“ uključuje nukleozidnu bazu i šećer riboze, a „ribonukleotid“ je ribonukleozid sa jednim, dva ili tri fosfatna dela. Međutim, termini „ribonukleozid“ i „ribonukleotid“ mogu se smatrati ekvivalentnim kako se ovde koriste. RNK može biti modifikovana u strukturi nukleobaze ili u strukturi ribozo-fosfatnog skeleta, npr., kao što je detaljnije opisano u nastavku. Međutim, molekuli siRNK koji sadrže analoge ili derivate ribonukleozida zadržavaju sposobnost formiranja dupleksa. Kao neograničavajući primeri, molekul RNK može takođe da sadrži najmanje jedan modifikovani ribonukleozid, uključujući, ali ne ograničavajući se na, 2'-O-metil modifikovani nukleozid, nukleozid koji sadrži 5' fosforotioatnu grupu, terminalni nukleozid povezan sa derivatom holesterila ili bisdecilamidnom grupom dodekanske kiseline, zaključani nukleozid, abazični nukleozid, 2'-deoksi-2'-fluoro modifikovani nukleozid, 2'-amino-modifikovani nukleozid, 2'-alkil-modifikovani nukleozid, morfolino nukleozid, fosforamidat ili neprirodnu bazu koja sadrži nukleozid, ili bilo koju njihovu kombinaciju. Alternativno, molekul RNK može da sadrži najmanje dva modifikovana ribonukleozida, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 15, najmanje 20 ili više, sve do cele dužine molekula siRNK. Modifikacije ne moraju biti iste za svaki od takvih višestrukih modifikovanih ribonukleozida u molekulu RNK. U nekim otelotvorenjima, modifikovane RNK koje se predviđaju za upotrebu u postupcima i sastavima opisanim ovde su peptidne nukleinske kiseline (PNK) koje imaju sposobnost da formiraju potrebnu dupleks strukturu i koje dozvoljavaju ili posreduju u specifičnoj razgradnji ciljne RNK putem RISC puta.
[0179] U nekim otelotvorenjima, modifikovani ribonukleozid uključuje dezoksiribonukleozid. Na primer, RNKi sredstvo može da sadrži jedan ili više dezoksinukleozida, uključujući, na primer, dezoksinukleozidni prepust(e), ili jedan ili više dezoksinukleozida unutar dvolančanog dela siRNK. Međutim, termin „RNKi sredstvo“, kako se ovde koristi, ne uključuje potpuni molekul DNK.
[0181] Kako se ovde koristi, termin „nukleotidni prepust“ odnosi se na najmanje jedan neupareni nukleotid koji viri iz dupleks strukture RNKi sredstva, npr., siRNK. Na primer, kada se 3'-kraj jednog lanca siRNK proteže preko 5'-kraja drugog lanca, ili obrnuto, postoji nukleotidni prepust. siRNK može da sadrži prepust od najmanje jednog nukleotida; Alternativno, prepust može da sadrži najmanje dva nukleotida, najmanje tri nukleotida, najmanje četiri nukleotida, najmanje pet nukleotida ili više. Nukleotidni prepust može da sadrži ili da se sastoji od analoga nukleotida/nukleozida, uključujući dezoksinukleotid/nukleozid. Prepust(i) mogu biti na smislenom lancu, antisens lancu ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji. Štaviše, nukleotid(i) prepusta mogu biti prisutni na 5' kraju, 3' kraju ili oba kraja antisens ili sens lanca siRNK.
[0183] U nekim otelotvorenjima, antisens lanac siRNK ima prepust od 1-10 nukleotida na 3' kraju i/ili 5' kraju. U nekim otelotvorenjima, sens lanac siRNK ima prepust od 1-10 nukleotida na 3' kraju i/ili 5' kraju. U nekim drugim otelotvorenjima, jedan ili više nukleotida u prepustu je zamenjen nukleozidnim tiofosfatom.
[0185] U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan kraj siRNK ima jednolančani nukleotidni prepust od 1 do 4, generalno 1 ili 2 nukleotida. siRNK koje imaju najmanje jedan nukleotidni prepust mogu imati neočekivano superiorna inhibitorna svojstva u odnosu na svoje pandane sa tupim krajevima.
[0187] Termini „tup“ ili „tupog kraja“, kako se ovde koriste u vezi sa siRNK, znače da nema neuparenih nukleotida ili nukleotidnih analoga na datom terminalnom kraju siRNK, tj., nema nukleotidnog prepusta. Jedan ili oba kraja siRNK mogu biti tupi. Kada su oba kraja siRNK tupa, za siRNK se kaže da ima „tup kraj“. siRNK sa „tupim krajem“ je siRNK koja je tupa na oba kraja, tj., nema nukleotidnog prepusta ni na jednom kraju molekula. Najčešće će takav molekul biti dvolančan celom dužinom.
[0189] U određenim otelotvorenjima, kombinovana terapija opisana ovde uključuje jedan ili više RNKi sredstava koji inhibiraju ekspresiju HBV gena. U nekim otelotvorenjima, RNKi sredstvo uključuje kratke interferirajuće molekule ribonukleinske kiseline (siRNK) za inhibiranje ekspresije HBV gena kod sisara, npr., kod HBV-inficiranog čoveka, gde siRNK uključuje antisens lanac koji ima region komplementarnosti koji je komplementaran bar delu mRNK formirane u ekspresiji HBV gena, i gde je region komplementarnosti dužine 30 nukleotida ili manje, generalno 19-24 nukleotida dužine, i gde siRNK, nakon kontakta sa ćelijom koja ekspresuje HBV gen, inhibira ekspresiju HBV gena za najmanje 10%, kako je testirano, na primer, metodom zasnovanom na PCR ili razgranatoj DNK (bDNK), ili metodom zasnovanom na proteinima, kao što je Vestern blot. HBV gena u ćelijskoj kulturi ili ekspresija ćelijskog gena kao surogata za ekspresiju HBV gena (npr., Smc5/6), kao što je u COS ćelijama, HeLa ćelijama, primarnim hepatocitima, HepG2 ćelijama, primarno kultivisanim ćelijama ili u biološkom uzorku od ispitanika, može se testirati merenjem nivoa HBV mRNK, kao što je bDNK ili TaqMan test, ili merenjem nivoa proteina, kao što je imunofluorescentna analiza, korišćenjem, na primer, Vestern blota ili tehnika protočne citometrije.
[0191] siRNK sadrži dva lanca RNK koji su komplementarni i hibridizuju se da bi formirali dupleks strukturu pod uslovima u kojima će se siRNK koristiti. Jedan lanac siRNK (antisens lanac) sadrži region komplementarnosti koji je u suštini komplementaran, i generalno potpuno komplementaran, sa ciljnom sekvencom. Ciljna sekvenca može biti izvedena iz sekvence mRNK formirane tokom ekspresije HBV gena. Drugi lanac (sens lanac) sadrži region koji je komplementaran antisens lancu, tako da dva lanca hibridizuju i formiraju dupleks strukturu kada se kombinuju pod odgovarajućim uslovima. Generalno, dupleks struktura je između 15 i 30, generalno između 18 i 25, još generalno između 19 i 24, i najčešće između 19 i 21 baznog para. Slično tome, region komplementarnosti ciljne sekvence je između 15 i 30 nukleotida, generalno između 18 i 25, još generalno između 19 i 24, i najčešće između 19 i 21 nukleotida, uključujući te brojeve. U nekim otelotvorenjima, siRNK je dužine između 15 i 20 nukleotida, uključujući te brojeve, a u drugim otelotvorenjima, siRNK je dužine između 25 i 30 nukleotida, uključujući te brojeve. Kao što će prosečno stručnjak prepoznati, ciljani region RNK ciljane za deljenje najčešće će biti deo većeg molekula RNK, često molekula iRNK. Gde je relevantno, „deo“ cilja iRNK je susedni niz cilja iRNK dovoljne dužine da bude supstrat za deljenje usmereno RNKi (tj., cepanje kroz RISC put). siRNK koje imaju duplekse kratke i do 9 baznih parova mogu, pod određenim okolnostima, posredovati u cepanje RNK usmereno RNKi. Najčešće će
[0194] 1
[0195] meta biti dugačka najmanje 15 nukleotida. U određenim otelotvorenjima, meta je dugačka 15-30 nukleotida.
[0197] Stručnjak u ovoj oblasti će takođe prepoznati da je dupleks region primarni funkcionalni deo siRNK, npr., dupleks region od 9 do 36, npr., 15-30 baznih parova. Dakle, u nekim otelotvorenjima, u meri u kojoj se obrađuje u funkcionalni dupleks od npr., 15-30 baznih parova koji cilja željenu RNK za razlaganje, molekul RNK ili kompleks molekula RNK koji ima dupleks region veći od 30 baznih parova je siRNK. Dakle, prosečno vešt stručnjak će prepoznati da je u nekim otelotvorenjima, dakle, miRNK siRNK. U nekim drugim otelotvorenjima, siRNK nije prirodna miRNK. U nekim otelotvorenjima, RNKi sredstvo koristan za ciljanje ekspresije HBV gena se ne generiše u ciljnoj ćeliji razlaganjem veće dvolančane RNK.
[0199] siRNK kako je ovde opisano može se sintetizovati standardnim metodama poznatim u struci, npr., upotrebom automatizovanog DNK sintetizatora, kao što su komercijalno dostupni od, na primer, Biosearch, Applied Biosystems, Inc.
[0201] U nekim otelotvorenjima, RNKi sredstvo sadrži siRNK koja cilja i inhibira ekspresiju HBV mRNK. U nekim otelotvorenjima, RNKi sredstvo sadrži siRNK koja cilja i inhibira ekspresiju mRNK kodirane HBV genomom prema NCBI referentnoj sekvenci NC_003977.2 (GenBank pristupni broj GI:21326584) (SEQ ID NO:1). Transkripcija HBV genoma rezultira policistronskom, preklapajućom RNK, i stoga, u nekim otelotvorenjima, siRNK kombinovane terapije koja cilja jedan HBV gen može dovesti do značajne inhibicije ekspresije većine ili svih HBV transkripata. U nekim otelotvorenjima, ciljna mRNK od siRNK može biti mRNK kodirana od strane: P gen, nukleotidi 2309-3182 i 1-1625 iz NC_003977.1; S gena (koji kodira L, M i S proteine), nukleotidi 2850-3182 i 1-837 iz NC_003977; X proteina, nukleotida 1376-1840 iz NC_003977; i/ili C gena, nukleotida 1816-2454 iz NC_003977.
[0203] U nekim otelotvorenjima, siRNK cilja i inhibira ekspresiju mRNK koju kodira X gen HBV. U nekim otelotvorenjima, RNKi sredstvo ili siRNK cilja mRNK koju kodira deo HBV genoma koji obuhvata sekvencu GTGTGCACTTCGCTTCAC (SEQ ID NO:2), što odgovara nukleotidima 1579-1597 iz NC_003977.2 (GenBank pristupni broj GI:21326584) (SEQ ID NO:1).
[0205] U još daljim otelotvorenjima, siRNK ima sens lanac koji obuhvata 5'-GUGUGCACUUCGCUUCACA-3' (SEQ ID NO:3) i antisens lanac koji obuhvata 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3' (SEQ ID NO:4).
[0207] U određenim otelotvorenjima, inhibitor ekspresije HBV gena obuhvata siRNK koja sadrži sens lanac i antisens lanac, gde smisleni lanac obuhvata SEQ ID NO:3, ili sekvencu koja se razlikuje za ne više od 4, ne više od 3, ne više od 2 ili ne više od 1 nukleotida od SEQ ID NO:3; i gde antisens lanac obuhvata SEQ ID NO:4, ili sekvencu koja se razlikuje za ne više od 4, ne više od 3, ne više od 2 ili ne više od 1 nukleotida od SEQ ID NO:4,
[0209] U jednom aspektu, siRNK će obuhvatati najmanje dve nukleotidne sekvence, sens i antisens sekvencu, gde: sens sekvenca obuhvata SEQ ID NO:3, a odgovarajuća antisens sekvenca obuhvata SEQ ID NO:4. U ovom aspektu, jedna od dve sekvence je komplementarna drugoj od dve sekvence, pri čemu je jedna od sekvenci suštinski komplementarna sekvenci iRNK generisane u ekspresiji HBV gena. Kao takva, u ovom aspektu, siRNK će uključivati dva oligonukleotida, gde je jedan oligonukleotid opisan kao sens lanac, a drugi oligonukleotid je opisan kao odgovarajući antisens lanac sens lanca. Kao što je opisano na drugim mestima ovde i kao što je poznato u struci, komplementarne sekvence siRNK takođe mogu biti sadržane kao samokomplementarni regioni jednog molekula nukleinske kiseline, za razliku od toga da budu na odvojenim oligonukleotidima.
[0211] U još daljim oličenjima, siRNK ima smisleni lanac koji sadrži 5'-GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA -3' (SEQ ID NO:106) i antismisleni lanac koji sadrži 5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC -3' (SEQ ID NO:107).
[0213] U određenim otelotvorenjima, inhibitor ekspresije HBV gena obuhvata siRNK koja sadrži sens lanac i antisens lanac, gde smisleni lanac obuhvata SEQ ID NO:106, ili sekvencu koja se razlikuje za ne više od 4, ne više od 3, ne više od 2 ili ne više od 1 nukleotida od SEQ ID NO:106; i gde antisens lanac sadrži SEQ ID NO: 107, ili sekvencu koja se razlikuje za najviše 4, najviše 3, najviše 2 ili najviše 1 nukleotida od SEQ ID NO: 107.
[0215] U jednom aspektu, siRNK će obuhvatati najmanje dve nukleotidne sekvence, sens i antisens sekvencu, gde: sens sekvenca obuhvata SEQ ID NO:106, a odgovarajuća antisens sekvenca obuhvata SEQ ID NO: 107. U ovom aspektu, jedna od dve sekvence je komplementarna drugoj od dve sekvence, pri čemu
[0218] 1
[0219] je jedna od sekvenci suštinski komplementarna sekvenci iRNK generisane u ekspresiji HBV gena. Kao takva, u ovom aspektu, siRNK će uključivati dva oligonukleotida, gde je jedan oligonukleotid opisan kao sens lanac, a drugi oligonukleotid je opisan kao odgovarajući antisens lanac sens lanca. Kao što je opisano na drugim mestima ovde i kao što je poznato u struci, komplementarne sekvence siRNK takođe mogu biti sadržane kao samokomplementarni regioni jednog molekula nukleinske kiseline, za razliku od toga da budu na odvojenim oligonukleotidima.
[0221] Stručnjaku je dobro poznato da su siRNK koje imaju dupleks strukturu između 20 i 23, a posebno 21, baznih parova, smatrane posebno efikasnim u indukovanju RNK interferencije (Elbashir, i dr., EMBO 20:6877-88 (2001)). Međutim, drugi su otkrili da kraće ili duže strukture RNK dupleksa takođe mogu biti efikasne. U iznad opisanim otelotvorenjima, ovde opisane siRNK mogu da sadrže najmanje jedan lanac dužine od minimalno 21 nukleotida. U nekim otelotvorenjima, kraći dupleksi koji imaju jednu od sekvenci SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:106 ili SEQ ID NO:107 minus samo nekoliko nukleotida na jednom ili oba kraja su slično efikasni u poređenju sa iznad opisanim siRNK. Stoga, siRNK koje imaju delimičnu sekvencu od najmanje 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više susednih nukleotida iz jednog ili oba SEQ ID NO:3 i SEQ ID NO:4, i koje se razlikuju po svojoj sposobnosti da inhibiraju ekspresiju HBV gena ne više od 5, 10, 15, 20, 25 ili 30% inhibicije od siRNK koja sadrži punu sekvencu, razmatraju se u skladu sa ovde opisanom tehnologijom. Takođe, u okviru predmetnog obelodanjivanja, razmatraju se siRNK koje imaju delimičnu sekvencu od najmanje 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više susednih nukleotida iz jednog ili oba SEQ ID NO:106 i SEQ ID NO:107, i koje se razlikuju po svojoj sposobnosti da inhibiraju ekspresiju HBV gena za ne više od 5, 10, 15, 20, 25 ili 30% inhibicije od siRNK koja sadrži punu sekvencu, u skladu sa ovde opisanom tehnologijom.
[0223] Pored toga, siRNK koje su ovde date identifikuju mesto u transkriptu gena HBV koje je podložno cepanju posredovanom RISC-om. Kao takva, tehnologija opisana ovde dalje karakteriše RNKi sredstva koja ciljaju unutar jedne od takvih sekvenci. Kako se ovde koristi, kaže se da RNKi sredstvo cilja unutar određenog mesta RNK transkripta ako RNKi promoviše deljenje transkripta bilo gde unutar tog određenog mesta. U nekim otelotvorenjima, RNKi sredstvo uključuje najmanje 15 susednih nukleotida iz jedne ili obe sekvence SEQ ID NO:3 i SEQ ID NO:4, povezanih sa dodatnim nukleotidnim sekvencama uzetim iz regiona koji je susedan odabranoj sekvenci u HBV genu. U nekim otelotvorenjima, RNKi sredstvo uključuje najmanje 15 susednih nukleotida iz jedne ili obe sekvence SEQ ID NO: 106 i SEQ ID NO:107, povezanih sa dodatnim nukleotidnim sekvencama uzetim iz regiona koji je susedan odabranoj sekvenci u HBV genu.
[0225] Iako je ciljna sekvenca generalno dužine 15-30 nukleotida, postoje velike varijacije u pogodnosti određenih sekvenci u ovom opsegu za usmeravanje deljenja bilo koje date ciljne RNK. Različiti softverski paketi i smernice navedene ovde pružaju smernice za identifikaciju optimalnih ciljnih sekvenci za bilo koji dati ciljni gen, ali se može primeniti i empirijski pristup u kojem se „prozor“ ili „maska“ date veličine (kao neograničavajući primer, 21 nukleotid) bukvalno ili figurativno (uključujući, npr., in silico) postavlja na ciljnu RNK sekvencu da bi se identifikovale sekvence u opsegu veličina koje mogu poslužiti kao ciljne sekvence. Postepenim pomeranjem „prozora“ sekvence jedan nukleotid uzvodno ili nizvodno od početne lokacije ciljne sekvence, može se identifikovati sledeća potencijalna ciljna sekvenca, sve dok se ne identifikuje kompletan skup mogućih sekvenci za bilo koju izabranu veličinu cilja. Ovaj proces, zajedno sa sistematskom sintezom i testiranjem identifikovanih sekvenci (korišćenjem testova kao što je ovde opisano ili kao što je poznato u struci) radi identifikacije onih sekvenci koje optimalno funkcionišu, može identifikovati one RNK sekvence koje, kada se ciljaju RNKi sredstvom, posreduju u najboljoj inhibiciji ekspresije ciljnog gena. Pretpostavlja se da se dalja optimizacija efikasnosti inhibicije može postići postepenim „hodanjem kroz prozor“ jedan nukleotid uzvodno ili nizvodno od datih sekvenci kako bi se identifikovale sekvence sa jednakim ili boljim karakteristikama inhibicije.
[0227] Dalje, smatra se da bi se za bilo koju identifikovanu sekvencu, npr., SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 106, ili SEQ ID NO: 107, dalja optimizacija mogla postići sistematskim dodavanjem ili uklanjanjem nukleotida da bi se generisale duže ili kraće sekvence i testiranjem tih sekvenci generisanih prolaskom kroz prozor duže ili kraće veličine uz ili niz ciljnu RNK od te tačke. Ponovo, spajanje ovog pristupa sa generisanjem novih kandidatskih ciljeva sa testiranjem efikasnosti RNKi sredstava na osnovu tih ciljnih sekvenci u testu inhibicije, kao što je poznato u struci ili kao što je ovde opisano, može dovesti do daljih poboljšanja efikasnosti inhibicije. Dalje, takve optimizovane sekvence mogu se podesiti, npr., uvođenjem modifikovanih nukleotida kao što je ovde opisano ili kao što je poznato u struci, dodavanjem ili promenama u pregibu, ili drugim modifikacijama kao što je poznato u struci i/ili ovde diskutovano, kako bi se dalje optimizovao molekul (npr., povećanje stabilnosti u serumu ili polu-raspada cirkulacije, povećanje
[0230] 1
[0231] termičke stabilnosti, poboljšanje transmembranske isporuke, ciljanje na određenu lokaciju ili tip ćelije, povećanje interakcije sa enzimima puta utišavanja, povećanje oslobađanja iz endozoma, itd.) kao inhibitor ekspresije.
[0233] RNKi sredstvo kao što je ovde opisan može sadržati jedno ili više neusklađenosti sa ciljnom sekvencom. U nekim otelotvorenjima, RNKi sredstvo kao što je ovde opisano sadrži ne više od 3 neusklađenosti. U nekim otelotvorenjima, ako antisens lanac RNKi sredstva sadrži neusklađenosti sa ciljnom sekvencom, područje neusklađenosti se ne nalazi u centru regiona komplementarnosti. U određenim otelotvorenjima, ako antisens lanac RNKi sredstva sadrži neusklađenosti sa ciljnom sekvencom, neusklađenost je ograničena na poslednjih 5 nukleotida sa 5' ili 3' kraja regiona komplementarnosti. Na primer, za lanac RNK interferencije sredstva od 23 nukleotida koji je komplementaran regionu HBV gena, lanac RNK možda ne sadrži nikakvo neusklađivanje unutar centralnih 13 nukleotida. Postupci opisani ovde ili metode poznate u struci mogu se koristiti za određivanje da li je RNK interferencija agensa koji sadrži neusklađenost sa ciljnom sekvencom efikasan u inhibiranju ekspresije HBV gena. Razmatranje efikasnosti RNK interferencije agensa sa neusklađenostima u inhibiranju ekspresije HBV gena je važno, posebno ako je poznato da određeni region komplementarnosti u HBV genu ima polimorfnu varijaciju sekvence.
[0235] b. Hemijska modifikovana RNK interferencijska sredstva
[0237] U nekim otelotvorenjima, RNK od RNKi interferencijskog sredstva, npr., siRNK, je hemijski modifikovana da bi se poboljšala stabilnost ili druge korisne karakteristike. Nukleinske kiseline predstavljene u tehnologiji opisanoj ovde mogu se sintetizovati i/ili modifikovati postupcima dobro utvrđenim u struci, kao što su one opisane u "Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L., i dr (Edrs), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA.
[0239] Modifikacije uključuju, na primer, (a) modifikacije krajeva, npr., modifikacije 5' kraja (fosforilacija, konjugacija, invertovane veze, itd.), modifikacije 3' kraja (konjugacija, DNK, nukleotidi, invertovane veze, itd.), (b) modifikacije baza, npr., zamena stabilizujućim bazama, destabilizujućim bazama ili bazama koje se uparuju sa proširenim repertoarom partnera, uklanjanje baza (abaznih nukleotida) ili konjugovanih baza, (c) modifikacije šećera (npr., na 2' poziciji ili 4' poziciji) ili zamenu šećera, kao i (d) modifikacije osnovne cevi, uključujući modifikaciju ili zamenu fosfodiestarskih veza. Specifični primeri RNK jedinjenja korisnih u ovde opisanim otelotvorenjima uključuju, ali nisu ograničeni na RNK koje sadrže modifikovane osnovne cevi ili nemaju prirodne internukleozidne veze. RNK sa modifikovanim osnovnim cevima uključuju, između ostalog, one koje nemaju atom fosfora u osnovnoj cevi. Za potrebe ove specifikacije, i kao što se ponekad navodi u struci, modifikovane RNK koje nemaju atom fosfora u svom internukleozidnom skeletu takođe se mogu smatrati oligonukleozidima. U određenim otelotvorenjima, modifikovana RNK će imati atom fosfora u svom internukleozidnom skeletu.
[0241] Nije neophodno da sve pozicije u datom jedinjenju budu jednoobrazno modifikovane, i zapravo više od jedne od iznad pomenutih modifikacija može biti ugrađeno u jedno jedinjenje ili čak na jednom nukleozidu unutar RNKi sredstva. Tehnologija opisana ovde takođe uključuje jedinjenja RNKi sredstva koja su himerna jedinjenja. „Himerna“ jedinjenja RNKi sredstva ili „himere“, u kontekstu predmetnog obelodanjivanja, su jedinjenja RNKi sredstva, kao što su siRNK, koja sadrže dva ili više hemijski različitih regiona, svaki sastavljen od najmanje jedne monomerne jedinice, tj., nukleotida u slučaju siRNK jedinjenja. Ova RNKi sredstva tipično sadrže najmanje jedan region u kome je RNK modifikovana tako da RNKi sredstvu daje povećanu otpornost na degradaciju nukleazama, povećano ćelijsko usvajanje i/ili povećan afinitet vezivanja za ciljnu nukleinsku kiselinu. Dodatni region RNKi sredstva može služiti kao supstrat za enzime sposobne da cepaju RNK:DNK ili RNK:RNK hibride. Na primer, RNaza H je ćelijska endonukleaza koja deli RNK lanac RNK:DNK dupleksa. Aktivacija RNaza H, dakle, dovodi do deljenja ciljne RNK, čime se značajno povećava efikasnost inhibicije ekspresije gena od strane RNKi sredstva. Shodno tome, uporedivi rezultati se često mogu dobiti sa kraćim RNK interferencijskim sredstvima kada se koriste himerne siRNK, u poređenju sa fosforotioat dezoksi siRNK koje hibridizuju sa istim ciljnim regionom. Razdvajanje ciljne RNK može se rutinski detektovati gel elektroforezom i, ako je potrebno, povezanim tehnikama hibridizacije nukleinskih kiselina poznatim u struci.
[0243] Modifikovani RNK lanci uključuju, na primer, fosforotioate, hiralne fosforotioate, fosforditioate, fosfotriestre, aminoalkilfosfotriestre, metil i druge alkil fosfonate, uključujući 3'-alkilen fosfonate i hiralne fosfonate, fosfinate, fosforamidate, uključujući 3'-amino fosforamidat i aminoalkilfosforamidate, tionofosforamidate, tionoalkilfosfonate, tionoalkilfosfotriestre i boranofosfate sa normalnim 3'-5' vezama, 2'-5' povezanim analozima ovih, i one) sa invertovanim polaritetom gde su susedni parovi nukleozidnih jedinica
[0246] 1
[0247] povezani 3'-5' prema 5'-3' ili 2'-5' prema 5'-2'. Različite soli, mešovite soli i oblici slobodnih kiselina su takođe uključeni.
[0249] Reprezentativni američki patenti koji podučavaju pripremu iznad navedenih veza koje sadrže fosfor uključuju, ali nisu ograničeni na, U.S. Pat. br.3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,195;
[0250] 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496;
[0251] 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799;
[0252] 5,587,361; 5,625,050; 6,028,188; 6,124,445; 6,160,109; 6,169,170; 6,172,209; 6, 239,265; 6,277,603;
[0253] 6,326,199; 6,346,614; 6,444,423; 6,531,590; 6,534,639; 6,608,035; 6,683,167; 6,858,715; 6,867,294;
[0254] 6,878,805; 7,015,315; 7,041,816; 7,273,933; 7,321,029; i US Pat RE39464.
[0256] Modifikovani RNK lanci koji ne uključuju atom fosfora imaju lance koji su formirani od kratkolančanih alkil ili cikloalkil internukleozidnih veza, mešovitih heteroatoma i alkil ili cikloalkil internukleozidnih veza, ili jedne ili više kratkolančanih heteroatomskih ili heterocikličnih internukleozidnih veza. Ovi uključuju one koji imaju morfolino veze (delimično formirane od šećernog dela nukleozida); siloksanske glavne lance; sulfidne, sulfoksidne i sulfonske glavne lance; formacetilne i tioformacetilne glavne lance; metilen formacetilne i tioformacetilne glavne lance; alken koji sadrži glavni lanac; sulfamatne glavne lance; metilenimino i metilenhidrazino glavne lance; sulfonatne i sulfonamidne glavne lance; amidne glavne lance; i druge koji imaju mešovite N, O, S i CH<2>komponente.
[0258] Reprezentativni američki patenti koji podučavaju pripremu iznad navedenih oligonukleozida uključuju, ali nisu ograničeni na patente SAD br.5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307;
[0259] 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240, 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360;
[0260] 5,677,437; i 5,677,439.
[0262] U drugim otelotvorenjima, razmatraju se odgovarajući RNK mimetici za upotrebu u RNKi sredstvima, u kojima su i šećer i internukleozidna veza, tj., kičma, nukleotidnih jedinica zamenjeni novim grupama. Bazne jedinice se održavaju za hibridizaciju sa odgovarajućim ciljnim jedinjenjem nukleinske kiseline. Jedno takvo oligomerno jedinjenje, RNK mimetik za koji je pokazano da ima odlična hibridizaciona svojstva, naziva se peptidna nukleinska kiselina (PNK). U PNK jedinjenjima, RNK glavni lanac šećera je zamenjena kičmom koja sadrži amid, posebno aminoetilglicinskim glavnim lancem. Nukleobaze se zadržavaju i direktno ili indirektno su vezane za aza atome azota amidnog dela glavnog lanca.
[0263] Reprezentativni američki patenti koji uče o pripremi PNK jedinjenja uključuju, ali nisu ograničeni na, U.S. Pat. br.5,539,082; 5,714,331; i 5,719,262. Dalja učenja o PNA jedinjenjima mogu se naći, na primer, u Nielsen, i dr. (Science, 254:1497- 1500 (1991)).
[0265] Neka otelotvorenja predstavljena u tehnologiji opisanoj ovde uključuju TNA sa fosforotioatnim skeletom i oligonukleozide sa heteroatomskim skeletom, a posebno -CH<2>-NH-CH<2->, -CH<2>-N(CH<3>)-O-CH<2>-[poznat kao metilen (metilamino) ili MMI skelet], -CH<2>-O-N(CH<3>)-CH<2>-, -CH<2>-N(CH<3>)-N(CH<3>)-CH<2>-, i -N(CH<3>)-CH<2>-CH<2>- [gde je nativni fosfodiesterski skelet predstavljen kao - O-P-O-CH<2->] od U.S. Pat. No. 5,489,677, i amidnog glavnog lanca U.S. Pat. br.5,602,240. U nekim otelotvorenjima, RNK prikazane ovde imaju morfolino strukturu glavnog lanca U.S. Pat. br.5,034,506.
[0267] Modifikovane RNK mogu takođe da sadrže jednu ili više supstituisanih šećernih jedinica. RNK interferencijski agensi, npr., siRNK, predstavljeni ovde mogu da uključuju jedno od sledećeg na 2' poziciji: OH; F;O-, S-, ili N-alkil; O-, S-, ili N-alkenil; O-, S- ili N-alkinil; ili O-alkil-O-alkil; gde alkil alkenil i alkinil mogu biti supstituisani ili nesupstituisani C<1>do C<10>alkil ili C<2>do C<10>alkenil i alkinil. Primeri odgovarajućih modifikacija uključuju O[(CH<2>)<n>O]<m>CH<3>, O(CH<2>).<n>OCH<3>, O(CH<2>)<n>NH<2>, O(CH<2>)<n>CH<3>, O(CH<2>)<n>ONH<2>, i O(CH<2>)<n>ON[(CH<2>)<n>CH<3>)]<2>, gde su n i m od 1 do oko 10. U drugim otelotvorenjima, siRNK uključuju jedno od sledećeg na 2' poziciji: C<1>do C<10>niži alkil, supstituisani niži alkil, alkaril, aralkil, O-alkaril ili O-aralkil, SH, SCH<3>, OCN, CI, Br, CN, CF<3>, OCF<3>, SOCH<3>, SO<2>CH<3>, ONO<2>, NO<2>, N<3>, NH<2>, heterocikloalkil, heterocikloalkaril, aminoalkilamino, polialkilamino, supstituisani silil, grupa za cepanje RNK, reporterska grupa, interkalator, grupa za poboljšanje farmakokinetičkih svojstava RNKi sredstva ili grupa za poboljšanje farmakodinamičkih svojstava RNKi sredstva i druge zamene sa sličnim svojstvima. U nekim otelotvorenjima, modifikacija uključuje 2'-metoksietoksi (2'-O-CH<2>CH<2>OCH<3>, takođe poznat kao 2'-O-(2-metoksietil) ili 2'-MOE) (Martin, i dr., Helv. Chim. Acta 78:486-504 (1995)), tj., alkoksi-alkoksi grupu. Još jedna primerna modifikacija je 2'-dimetilaminooksietoksi, tj., O(CH<2>)<2>ON(CH<3>)<2>grupa, takođe poznata kao 2'-DMAOE, i 2'-dimetilaminoetoksietoksi (takođe poznata u struci kao 2*-O-dimetilaminoetoksietil ili 2*-DMAEOE), tj., 2*-O-CH<2>-O-CH<2>-N(CH<2>)<2>.
[0270] 1
[0271] Druge primerne modifikacije uključuju 2'-metoksi (2'-OCH<3>), 2'-aminopropoksi (2-OCH<2>CH<2>CH<2>NH<2>) i 2'Fluoro (2'-F). Slične modifikacije mogu se napraviti i na drugim pozicijama na RNK interferentnog agenta RNK, posebno na 3' poziciji šećera na 3' terminalnom nukleotidu ili u 2'-5' povezanim siRNK i na 5' poziciji 5' terminalnog nukleotida. RNKi sredstva takođe mogu imati šećerne mimetike kao što su ciklobutil ostaci umesto pentofuranozil šećera.
[0273] Reprezentativni američki patenti koji podučavaju pripremu takvih modifikovanih šećernih struktura uključuju, ali nisu ograničeni na U.S. Pat. No.4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878;
[0274] 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300;
[0275] 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; i 5,700,920.
[0277] RNKi sredstvo može takođe da uključuje modifikacije ili supstitucije nukleobaza (često se u struci nazivaju jednostavno „baza“). Kako se ovde koristi, „nemodifikovane“ ili „prirodne“ nukleobaze uključuju purinske baze adenin (A) i guanin (G), i pirimidinske baze timin (T), citozin (C) i uracil (U). Modifikovane nukleobaze uključuju druge sintetičke i prirodne nukleobaze kao što su 5-metilcitozin (5-me-C), 5-hidroksimetilcitozin, ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i drugi alkil derivati adenina i gvanina, 2-propil i drugi alkil derivati adenina i gvanina, 2-tiouracil, 2-tiotimin i 2-tiocitozin, 5-halouracil i citizon, 5-propinil uracil i citozin, 6-azouracil, citozin i timin, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalkil, 8-hidroksil i drugi 8-supstituisani adenini i gvanini, 5-halo, posebno 5-bromo, 5-trifluorometil i drugi 5-supstituisani uracili i citozini, 7-metilguanin i 7-metiladenin, 8-azaguanin i 9-azaadenin, 7-deazaguanin i 7-daazaadenin i 3-deazaguanin i 3-deazaadenin. Dalje nukleobaze uključuju one obelodanjene u U.S. Pat. No.3,687,808, one obelodanjene u Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine (Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, (2008)); one obelodanjene u The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering (pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons (1990)), one obelodanjene od strane Englisch i dr. (Angewandte Chemie, International Edition, 30, 613 (1991)), one obelodanjene od strane Sanghvi, Y S. (Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press (1993)). Određene od ovih nukleobaza su posebno korisne za povećanje afiniteta vezivanja oligomernih jedinjenja predstavljenih u tehnologiji opisanoj ovde. To uključuje 5-supstituisane pirimidine, 6-azapirimidine i N-2, N-6 i O-6 supstituisane purine, uključujući 2-aminopropiladenin, 5-propinilluracil i 5-propinilcitozin. Pokazano je da 5-metilcitozinske supstitucije povećavaju stabilnost dupleksa nukleinskih kiselina za 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, pp.276-278 (1993)) i predstavljaju primere supstitucija baza, još posebno kada se kombinuju sa modifikacijama 2'-O-metoksietil šećera.
[0279] Reprezentativni američki patenti koji podučavaju pripremu određenih od iznad navedenih modifikovanih nukleobaza, kao i drugih modifikovanih nukleobaza, uključuju, ali nisu ograničeni na, U.S. Pat. No.3,687,808; pat. SAD. br.4,845,205; 5.130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272;
[0280] 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596,091;
[0281] 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368;
[0282] 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; i 7,495,088.
[0284] RNK od RNKi sredstva takođe može biti modifikovana tako da uključuje jednu ili više zaključanih nukleinskih kiselina (LNK). Zaključana nukleinska kiselina je nukleotid koji ima modifikovani ribozni deo u kome ribozni deo sadrži dodatni most koji povezuje 2' i 4' ugljenike. Ova struktura efikasno „zaključava“ ribozu u 3'-endo strukturnoj konformaciji. Pokazano je da dodavanje zaključanih nukleinskih kiselina siRNK povećava stabilnost siRNK u serumu i smanjuje efekte van cilja (Elman, J., i dr., Nucleic Acids Research 33(l):439-47 (2005); Mook, O.R., i dr., Mol Cane Ther 6(3):833-43 (2007); Grunweller, A., i dr, Nucleic Acids Research 31 (12):3185-93 (2003)).
[0286] Reprezentativni američki patenti koji podučavaju pripremu zaključanih nukleotida nukleinskih kiselina uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: pat. SAD. br.6,268,490; 6,670,461; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,084,125; i 7,399,845.
[0288] U određenim otelotvorenjima, kombinovana terapija uključuje siRNK koja je modifikovana da uključuje jednu ili više adenozin-glikol nukleinskih kiselina („GNA“). Opis adenozin-GNA može se naći, na primer, u Zhang, i dr. (JACS 127(12):4174-75 (2005)).
[0290] U nekim otelotvorenjima, predmetno obelodanjivanje pruža postupke i srodne sastave, gde je RNKi siRNK koja sadrži oligonukleotidnu sekvencu sa jednim ili više modifikovanih nukleotida. Skraćenice za nukleotidne monomere u modifikovanim sekvencama nukleinskih kiselina, kako se ovde koriste, date su u Tabeli 1.
[0293] 2
[0294] Tabela 1. Skraćenice nukleotidnih monomera korišćenih u predstavljanju modifikovane sekvence nukleinskih kiselina. Razume se da su, osim ako nije drugačije naznačeno, ovi monomeri, kada su prisutni u oligonukleotidu, međusobno povezani 5'-3'-fosfodiestarskim vezama.
[0296]
[0299] U nekim otelotvorenjima, inhibitor ekspresije HBV gena obuhvata siRNK, pri čemu siRNK ima smisleni lanac koji sadrži 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (SEQ ID NO:5) i antismisleni lanac koji sadrži 5'-usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (SEQ ID NO:6).
[0301] [0121] U još daljim otelotvorenjima, siRNK ima smisleni lanac koji sadrži 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (SEQ ID NO:7) i antisens lanac koji sadrži 5'-usGfsuga(Agn) CfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (SEQ ID NO:8).
[0303] U određenim otelotvorenjima, inhibitor ekspresije HBV gena obuhvata siRNK koja sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu sens lanac obuhvata SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:7, ili sekvencu koja se razlikuje za ne više od 4, ne više od 3, ne više od 2 ili ne više od 1 nukleotida od SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:7, respektivno.5 ili SEQ ID NO:7, respektivno.
[0305] U određenim otelotvorenjima, inhibitor ekspresije HBV gena obuhvata siRNK koja sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu antisens lanac obuhvata SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:8, ili sekvencu koja se razlikuje za ne više od 4, ne više od 3, ne više od 2 ili ne više od 1 nukleotida od SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:8, respektivno.
[0307] U nekim otelotvorenjima, inhibitor ekspresije HBV gena obuhvata siRNK, pri čemu siRNK ima lanac koji sadrži 5'-gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuuaL96-3' (SEQ ID NO:108) i antisens lanac koji sadrži 5'-usAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc-3' (SEQ ID NO:109).
[0309] U određenim otelotvorenjima, inhibitor ekspresije HBV gena obuhvata siRNK koja sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu smisleni lanac obuhvata SEQ ID NO: 108, ili sekvencu koja se razlikuje za ne više od 4, ne više od 3, ne više od 2 ili ne više od 1 nukleotida od SEQ ID NO:108.
[0311] c. RNKi sredstva konjugovana sa ligandom
[0313] U nekim otelotvorenjima, RNKi sredstvo uključuje modifikacije koje uključuju hemijsko povezivanje sa RNK jednog ili više liganda, delova ili konjugata koji poboljšavaju aktivnost, ćelijsku distribuciju ili ćelijski apsorpcioni unos RNKi sredstva. Takvi delovi uključuju, ali nisu ograničeni na, lipidne delove kao što je holesterolski deo (Letsinger, i dr., Proc. Natl. Acid. Sci. USA 86:6553-56 (1989)), holna kiselina (Manoharan, i dr., Biorg. Med. Chem. Let.4:1053-60 (1994)), tioetar, npr., berilS-tritiltiol (Manoharan, i dr., Ann. N.Y. Acad. Sci.660:306-9 (1992); Manoharan, i dr., Biorg. Med. Chem. Let.3:2765-70 (1993)), tioholesterol (Oberhauser, i dr., Nucl. Acids Res.20:533-38 (1992)), alifatski lanac, npr., dodekandiol ili undecil ostaci (Saison-Behmoaras, i dr., EMBO J 10:1111-18 (1991); Kabanov, i dr., FEBS Lett.259:327-30 (1990); Svinarchuk, i dr., Biochimie 75:49-54 (1993)), fosfolipid, npr., di-heksadecil-rac-glicerol ili trietilamonijum 1,2-di-O-heksadecil-rac-glicero-3-fosfonat (Manoharan, i dr., Tetrahedron Lett.36:3651-54 (1995); Shea, i dr., Nucl. Acids Res.18:3777-83 (1990)), poliamin ili lanac polietilen glikola (Manoharan, i dr., Nucleosides & Nucleotides 14:969- 73 (1995)),ili adamantan sirćetna kiselina (Manoharan, i dr., Tetrahedron Lett.36:3651-54 (1995)), palmitil deo (Mishra, i dr., Biochim. Biophys. Acta 1264:229-37 (1995)), ili oktadecilamin ili heksilamino-karboniloksiholesterolni deo (Crooke, i dr., J. Pharmacol. Exp. Ther.277:923-37 (1996)).
[0315] U nekim otelotvorenjima, ligand menja distribuciju, ciljanje ili životni vek RNKi sredstva u koje je inkorporiran. U nekim otelotvorenjima, ligand pruža poboljšani afinitet za odabranu metu, npr., molekul, ćeliju ili tip ćelije, odeljak, npr., ćelijski ili organski odeljak, tkivo, organ ili region tela, u poređenju sa vrstom koja nema takav ligand. U takvim otelotvorenjima, ligandi neće učestvovati u dupleksnom uparivanju u dupleksiranoj nukleinskoj kiselini.
[0317] Ligandi mogu uključivati prirodnu supstancu, kao što je protein (npr., humani serumski albumin (HSA), lipoprotein niske gustine (LDL) ili globulin); ugljeni hidrat (npr., dekstran, pululan, hitin, hitozan, inulin, ciklodekstrin ili hijaluronska kiselina); ili lipid. Ligand takođe može biti rekombinantni ili sintetički molekul, kao što je sintetički polimer, npr., sintetička poliaminokiselina. Primeri poliaminokiselina uključuju poliaminokiselinu kao polilizin (PLL), poli L-asparaginsku kiselinu, poli L-glutaminsku kiselinu, kopolimer stiren-maleinske kiseline i anhidrida, poli(L-laktid-ko-glikoliran) kopolimer, kopolimer divinil etarmaleinskog anhidrida, N-(2-hidroksipropil)metakrilamidni kopolimer (MIPA), polietilen glikol (PEG), polivinil alkohol (PVA), poliuretan, poli(2-etilakrilna kiselina), N-izopropilakrilamidne polimere ili polifosfazin. Primeri poliamina uključuju: polietilenimin, polilizin (PLL), spermin, spermidin, poliamin, pseudopeptid-poliamin, peptidomimetički poliamin, dendrimer poliamin, arginin, amidin, protamin, katjonski lipid, katjonski porfirin, kvaternarna so poliamina ili alfa helikoidni peptid.
[0319] [0129] Ligandi takođe mogu da uključuju grupe za ciljanje, npr., sredstvo za ciljanje ćelija ili tkiva, npr., lektin, glikoprotein, lipid ili protein, npr., antitelo, koje se vezuje za određeni tip ćelija kao što je ćelija jetre. Ciljana grupa može biti tirotropin, melanotropin, lektin, glikoprotein, surfaktant protein A, mucin ugljeni hidrat, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetil-galaktozamin, N-acetil-gulukozamin multivalentna manoza, multivalentna fukoza, glikozilirane poliaminokiseline, multivalentna galaktoza, transferin, bisfosfonat, poliglutamat, poliaspartat, lipid, holesterol, steroid, žučna kiselina, folat, vitamin B12, vitamin A, biotin ili RGD peptid ili mimetik RGD peptida. Drugi primeri liganda uključuju boje, interkalirajuća sredstva (npr., akridine), umrežavajuće agense (npr., psoralen, mitomicin C), porfirine (TPPC4, teksafirin, safirin), policiklične aromatične ugljovodonike (npr., fenazin, dihidrofenazin), veštačke endonukleaze (npr., EDTA), lipofilne molekule (npr., holesterol, holna kiselina, adamantanska sirćetna kiselina, 1-piren buterna kiselina, dihidrotestosteron, 1,3-Bis-0(heksadecil)glicerol, geraniloksilieksil grupa, heksadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propandiol, heptadecil grupa, palmitinska kiselina, miristinska kiselina, 03-(oleoil)litoholna kiselina, 03-(oleoil)holna kiselina, dimetoksitritil ili fenoksazin), peptidni konjugati (npr., Antennapedia peptid, Tat peptid), alkilujući agensi, fosfat, amino, merkapto, PEG (npr., PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alkil, supstituisani alkil, radioobeleženi markeri, enzimi, hapteni (npr., biotin), pospešivači transporta/apsorpcije (npr., aspirin, vitamin E, folna kiselina), sintetičke ribonukleaze (npr., imidazol, bisimidazol, histamin, imidazolni klasteri, akridin-imidazolni konjugati, Eu3+ kompleksi tetraazamakrociklusa), dinitrofenila, HRP i AP.
[0321] Ligandi mogu biti proteini, npr., glikoproteini, ili peptidi, npr., molekuli koji imaju specifičan afinitet za ko-ligand, ili antitela, npr., antitelo, koje se vezuje za određeni tip ćelije, kao što je ćelija jetre. Ligandi takođe mogu uključivati hormone i hormonske receptore. Takođe mogu uključivati nepeptidne vrste, kao što su lipidi, lektini, ugljeni hidrati, vitamini, kofaktori, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetilgalaktozamin, N-acetil-gulukozamin, multivalentna manoza i multivalentna fukoza. Ligand može biti, na primer, lipopolisaharid, aktivator p38 MAP kinaze ili aktivator NF-kB.
[0323] Ligand može biti supstanca, npr., lek, koji može povećati unos RNKi sredstva u ćeliju, na primer, narušavanjem citoskeleta ćelije, npr., narušavanjem mikrotubula, mikrofilamenata i/ili intermedijarnih filamenata ćelije. Lek može biti, na primer, takson, vinkristin, vinblastin, citohalazin, nokodazol, japlakinolid, latrunkulin A, faloidin, svinholid A, indanocin ili mioservin.
[0325] U drugom aspektu, ligand je deo, npr., vitamin, koji apsorbuje ciljna ćelija, npr. ćelija jetre. Primeri vitamina uključuju vitamin A, E i K. Drugi primeri vitamina uključuju vitamine B, npr., folnu kiselinu, B12, riboflavin, biotin, piridoksal ili druge vitamine ili hranljive materije koje apsorbuju ciljne ćelije, kao što su ćelije jetre. Takođe su uključeni HSA i lipoproteini niske gustine (LDL).
[0327] U nekim otelotvorenjima, ligand vezan za RNKi sredstvo, kao što je ovde opisano, deluje kao farmakokinetički (PK) modulator. Kako se ovde koristi, „PK modulator“ se odnosi na farmakokinetički modulator. PK modulatori uključuju lipofile, žučne kiseline, steroide, analoge fosfolipida, peptide, sredstva za vezivanje proteina, PEG, vitamine itd. Primeri PK modulatora uključuju, ali nisu ograničeni na, holesterol, masne kiseline, holnu kiselinu, litoholnu kiselinu, dialkilgliceride, diacilglicerid, fosfolipide, sfingolipide, naproksen, ibuprofen, vitamin E, biotin itd. Oligonukleotidi koji sadrže niz fosforotioatnih veza takođe su poznati po vezivanju za serumske proteine, stoga su kratki oligonukleotidi, npr., oligonukleotidi od oko 5 baza, 10 baza, 15 baza ili 20 baza, koji sadrže više fosforotioatnih veza u kičmi, takođe pogodni za tehnologiju opisanu ovde kao ligandi (npr., kao PK modulirajući ligandi). Pored toga, aptameri koji vezuju serumske komponente (npr., serumske proteine) takođe su pogodni za upotrebu kao PK modulirajući ligandi u ovde opisanim otelotvorenjima.
[0329] (i) Lipidni konjugati. U nekim otelotvorenjima, ligand ili konjugat je lipid ili molekul na bazi lipida. Lipid ili ligand na bazi lipida može (a) povećati otpornost na razgradnju konjugata, (b) povećati ciljanje ili transport u ciljnu ćeliju ili ćelijsku membranu i/ili (c) može se koristiti za podešavanje vezivanja za serumski protein, npr., HSA. Takav lipid ili molekul na bazi lipida može se vezati za serumski protein, npr., ljudski serumski albumin (HSA). Ligand koji vezuje HSA omogućava distribuciju konjugata u ciljno tkivo, npr., u ciljno tkivo tela koje nije bubreg. Na primer, ciljno tkivo može biti jetra, uključujući parenhimske ćelije jetre. Drugi molekuli koji mogu da se vežu za HSA takođe se mogu koristiti kao ligandi. Na primer, mogu se koristiti neproksin ili aspirin.
[0331] Ligand na bazi lipida može se koristiti za inhibiciju, npr. kontrolu vezivanja konjugata za ciljno tkivo. Na primer, lipid ili ligand na bazi lipida koji se jače vezuje za HSA će biti manje verovatno usmeren na bubreg i stoga manje verovatno da će biti izbačen iz tela. Lipid ili ligand na bazi lipida koji se slabije vezuje za HSA može se koristiti za usmeravanje konjugata na bubreg.
[0333] U nekim otelotvorenjima, ligand na bazi lipida vezuje HSA. Ligand na bazi lipida može se vezati za HSA sa dovoljnim afinitetom tako da će se konjugat distribuirati u tkivo koje nije bubreg. U određenim posebnim otelotvorenjima, vezivanje HSA-liganda je reverzibilno.
[0335] U nekim drugim otelotvorenjima, ligand na bazi lipida se slabo ili uopšte ne vezuje za HSA, tako da
[0338] 2
[0339] će se konjugat distribuirati u bubreg. Drugi delovi koji ciljaju ćelije bubrega takođe se mogu koristiti umesto ili pored liganda na bazi lipida,
[0341] (ii) Peptid i sredstva za ćelijsku permeaciju. U drugom aspektu, ligand je sredstvo za ćelijsku permeaciju, kao što je helikoidno sredstvo za ćelijsku permeaciju. U nekim otelotvorenjima, sredstvo je amfipatsko. Primer sredstva je peptid kao što su tat ili antennopedia. Ako je sredstvo peptid, može biti modifikovan, uključujući peptidilmimetik, invertomere, nepeptidne ili pseudopeptidne veze i upotrebu D-aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, helikoidno sredstvo je alfa-heliksni sredstvo. U određenim posebnim otelotvorenjima, helikoidno sredstvo ima lipofilnu i lipofobnu fazu.
[0343] „Peptid za ćelijsku permeaciju“ je sposoban da permeira ćeliju, npr., mikrobnu ćeliju, kao što je bakterijska ili gljivična ćelija, ili ćeliju sisara, kao što je ljudska ćelija. Peptid koji prodire u mikrobne ćelije može biti, na primer, alfa-heliksni linearni peptid (npr., LL-37 ili Ceropin PI), peptid koji sadrži disulfidnu vezu (npr., α-defenzin, β-defenzin ili baktenecin) ili peptid koji sadrži samo jednu ili dve dominantne aminokiseline (npr., PR-39 ili indolicidin).
[0345] Ligand može biti peptid ili peptidomimetik. Peptidomimetik (ovde se takođe naziva oligopeptidomimetik) je molekul sposoban da se savije u definisanu trodimenzionalnu strukturu sličnu prirodnom peptidu. Vezivanje peptida i peptidomimetika za RNKi sredstva može uticati na farmakokinetičku distribuciju RNKi, kao što je poboljšanje ćelijskog prepoznavanja i apsorpcije. Peptidni ili peptidomimetički deo može biti dugačak oko 5-50 aminokiselina, npr., dugačak oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 aminokiselina.
[0347] Peptid ili peptidomimetik može biti, na primer, peptid za ćelijsku permeaciju, katjonski peptid, amfifilni peptid ili hidrofobni peptid (npr., koji se sastoji prvenstveno od Tyr, Trp ili Phe). Peptidni deo može biti dendrimerni peptid, ograničeni peptid ili umreženi peptid. U drugoj alternativi, peptidni deo može da sadrži hidrofobnu membransku translokacionu sekvencu (MTS). Primer hidrofobnog peptida koji sadrži MTS je RFGF sa aminokiselinskom sekvencom AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO:9). Analog RFGF-a (npr., aminokiselinska sekvenca AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 10) koji sadrži hidrofobni MTS takođe može biti ciljni deo. Peptidni deo može biti peptid „za isporučivanje“, koji može da nosi velike polarne molekule, uključujući peptide, oligonukleotide i proteine preko ćelijskih membrana. Na primer, utvrđeno je da su sekvence iz HIV Tat proteina (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO:11) i proteina Drosophila Antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWK (SEQ ID NO:12) sposobne da funkcionišu kao peptidi za isporučivanje. Peptid ili peptidomimetik može biti kodiran slučajnom sekvencom DNK, kao što je peptid identifikovan iz biblioteke fagnog displeja ili kombinatorne biblioteke jedna kuglica-jedno jedinjenje (Lam, i dr., Nature 354:82-84 (1991)).
[0349] Peptid ćelijske permeacije takođe može da uključuje signal nuklearne lokalizacije (NLS). Na primer, Peptid ćelijske permeacije može biti dvodelni amfifilni peptid, kao što je MPG, koji je izveden iz fuzionog peptidnog domena HIV-1 gp41 i NLS velikog T antigena SV40 (Simeoni, i dr., Nucl. Acids Res.31:2717-24 (2003)).
[0351] (iii) Konjugati ugljenih hidrata. U nekim otelotvorenjima, oligonukleotidi RNKi sredstva opisani ovde dalje sadrže konjugate ugljenih hidrata. Konjugati ugljenih hidrata mogu biti korisni za in vivo isporuku nukleinskih kiselina, kao i sastave pogodne za in vivo terapijsku upotrebu. Kako se ovde koristi, „ugljeni hidrat“ se odnosi na jedinjenje koje je ili ugljeni hidrat per se sastavljen od jedne ili više monosaharidnih jedinica sa najmanje 6 atoma ugljenika (koji mogu biti linearni, razgranati ili ciklični) sa atomom kiseonika, azota ili sumpora vezanim za svaki atom ugljenika; ili jedinjenje koje kao deo ima ugljeni hidratni deo sastavljen od jedne ili više monosaharidnih jedinica, od kojih svaka ima najmanje šest atoma ugljenika (koji mogu biti linearni, razgranati ili ciklični), sa atomom kiseonika, azota ili sumpora vezanim za svaki atom ugljenika. Reprezentativni ugljeni hidrati uključuju šećere (mono-, di-, tri- i oligosaharide koji sadrže od oko 4-9 monosaharidnih jedinica) i polisaharide kao što su skrobovi, glikogen, celuloza i polisaharidne gume. Specifični monosaharidi uključuju C5 i više (u nekim otelotvorenjima, C5-C8) šećere; a di- i trisaharidi uključuju šećere koji imaju dve ili tri monosaharidne jedinice (u nekim otelotvorenjima, C5-C8).
[0353] U nekim otelotvorenjima, ugljeni hidratni konjugat je izabran iz grupe koja se sastoji od:
[0354]
[0357] 
[0358]
[0361] 
[0362]
[0365] 
[0366]
[0369] Još jedan reprezentativni ugljeni hidratni konjugat za upotrebu u ovde opisanim otelotvorenjima uključuje, ali nije ograničen na,
[0372]
[0375] (Formula XXII), gde kada je jedan od X ili Y oligonukleotid, drugi je vodonik.
[0377] U nekim otelotvorenjima, ugljeni hidratni konjugat dodatno sadrži drugi ligand kao što je, ali nije ograničeno na, PK modulator, endosomolitički ligand ili peptid ćelijske permeacije.
[0379] (iv) Veznici. U nekim otelotvorenjima, konjugati opisani ovde mogu biti vezani za oligonukleotid RNKi sredstva pomoću različitih veznika koji mogu biti deljivi ili nedeljivi.
[0381] Termin „veznik“ ili „vezujuća grupa“ označava organski deo koji povezuje dva dela jedinjenja. Veznici obično sadrže direktnu vezu ili atom kao što su kiseonik ili sumpor, jedinicu kao što je NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH ili lanac atoma, kao što su, ali ne ograničavajući se na, supstituisani ili nesupstituisani alkil, supstituisani ili nesupstituisani alkenil, supstituisani ili nesupstituisani alkinil, arilalkil, arilalkenil, arilalkinil, heteroarilalkil, heteroarilalkenil, heteroarilalkinil, heterociklilalkil, heterociklilalkenil, heterociklilalkinil, aril, heteroaril, heterociklil, cikloalkil, cikloalkenil, alkilarilalkil, alkilarilalkenil, alkilarilalkinil, alkenilarilalkinil, alkenilarilalkenil, alkenilarilalkinil, alkinilarilalkinil, alkinilarilalkenil, alkinilarilalkinil, alkinilarilalkinil, alkinilarilalkinil, alkilheteroarilalkinil, alkilheteroarilalkinil, alkilheteroarilalkinil, alkenilheteroarilalkinil, alkinilheteroarilalkil, alkinilheteroarilalkenil, alkinilheteroarilalkinil, alkilheterociklilalkil, alkilheterociklilalkenil, alkilhererociklilalkinil, alkenilheterociklilalkenil, alkenilheterociklilalkinil, alkinilheterociklilalkilalkil, alkinilheterociklilalkenil,
[0384] 2
[0385] alkinilheterociklilalkinil, alkilaril, alkenilaril, alkinilaril, alkilheteroaril, alkenilheteroaril i alkinilhereroaril, gde jedan ili više metilena mogu biti prekinuti ili završeni sa O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), supstituisanim ili nesupstituisanim arilom, supstituisanim ili nesupstituisanim heteroarilom ili supstituisanim ili nesupstituisanim heterociklom; gde je R8 vodonik, acil, alifatična grupa ili supstituisana alifatična grupa. U određenim otelotvorenjima, veznik je između 1-24 atoma, između 4-24 atoma, između 6-18 atoma, između 8-18 atoma ili između 8-16 atoma.
[0387] Raskidiva povezujuća grupa je ona koja je dovoljno stabilna van ćelije, ali koja se po ulasku u ciljnu ćeliju razdvaja da bi se oslobodila dva dela koja veznik drži zajedno. U određenim otelotvorenjima, raskidiva veznička grupa se razdvaja najmanje 10 puta, ili najmanje 100 puta brže u ciljnoj ćeliji ili pod prvim referentnim uslovom (koji može, npr., biti izabran da imitira ili predstavlja intracelularne uslove) nego u krvi ispitanika, ili pod drugim referentnim uslovom (koji može, npr., biti izabran da imitira ili predstavlja uslove koji se nalaze u krvi ili serumu).
[0389] Grupe za razlaganje koje se mogu deliti podložne su sredstvima za deljenje, npr., pH vrednosti, redoks-potencijalu ili prisustvu molekula za razgradnju. Generalno, sredstva za deljenje su češći ili se nalaze na višim nivoima ili aktivnostima unutar ćelija nego u serumu ili krvi. Primeri takvih sredstava za deljenje uključuju: redoks sredstva koja su odabrana za određene supstrate ili koji nemaju specifičnost za supstrat, uključujući, npr., oksidativne ili reduktivne enzime ili reduktivna sredstva kao što su merkaptani, prisutne u ćelijama, koji mogu razgraditi redoks grupu za deljenje koja se može deliti redukcijom; esteraze; endozome ili sredstva koja mogu stvoriti kiselo okruženje, npr., ona koja rezultiraju pH vrednošću od pet ili nižom; enzime koji mogu hidrolizovati ili razgraditi grupu za deljenje koja se može deliti kiselinom delujući kao opšta kiselina, peptidaze (koje mogu biti specifične za supstrat) i fosfataze. Deljiva grupa za vezivanje, kao što je disulfidna veza, može biti osetljiva na pH vrednost. pH vrednost ljudskog seruma je 7,4, dok je prosečna intracelularna pH vrednost nešto niža, u rasponu od oko 7,1-7,3. Endozomi imaju kiseliju pH vrednost, u rasponu od 5,5-6,0, a lizozomi imaju još kiseliju pH vrednost, oko 5,0. Neki veznici će imati deljivu grupu za vezivanje pri određenoj pH vrednosti, čime se oslobađa katjonski lipid iz liganda unutar ćelije ili u željeni odeljak ćelije.
[0391] Veznik može da sadrži deljivu grupu za vezivanje pomoću određenog enzima. Vrsta deljive grupe za vezivanje ugrađene u veznik može zavisiti od ćelije koja se cilja. Na primer, ligandi koji ciljaju jetru mogu biti povezani sa katjonskim lipidima preko veznika koji sadrži estarsku grupu. Ćelije jetre su bogate esterazama i stoga će se veznik efikasnije deliti u ćelijama jetre nego u tipovima ćelija koje nisu bogate esterazama. Drugi tipovi ćelija bogati esterazama uključuju ćelije pluća, bubrežnog korteksa i testisa.
[0393] Veznici koji sadrže peptidne veze mogu se koristiti kada se ciljaju tipovi ćelija bogati peptidazama, kao što su ćelije jetre i sinovijalne ćelije.
[0395] Generalno, pogodnost kandidata za deljivu vezujuću grupu može se proceniti testiranjem sposobnosti degradativnog sredstva (ili stanja) da deli kandidata za vezujuću grupu. Može biti poželjno testirati i kandidata za deljivu vezujuću grupu na sposobnost da se odupre deljenju u krvi ili kada je u kontaktu sa drugim tkivom koje nije cilj. Stoga se može odrediti relativna podložnost deljenju između prvog i drugog stanja, gde je prvo odabrano da bude pokazatelj deljenja u ciljnoj ćeliji, a drugo je odabrano da bude pokazatelj deljenja u drugim tkivima ili biološkim tečnostima, npr., krvi ili serumu. Evaluacije se mogu sprovoditi u sistemima bez ćelija, u ćelijama, u ćelijskoj kulturi, u kulturi organa ili tkiva ili na celim životinjama. Može biti korisno izvršiti početne evaluacije u uslovima bez ćelija ili kulture i potvrditi daljim evaluacijama na celim životinjama. U određenim otelotvorenjima, korisna kandidatska jedinjenja se razlažu najmanje 2, najmanje 4, najmanje 10 ili najmanje 100 puta brže u ćeliji (ili pod in vitro uslovima odabranim da imitiraju intracelularne uslove) u poređenju sa krvlju ili serumom (ili pod in vitro uslovima odabranim da imitiraju ekstracelularne uslove).
[0397] Jedna klasa deljivih veznih grupa su redoks deljive vezne grupe koje se dele nakon redukcije ili oksidacije. Primer reduktivno deljive vezne grupe je disulfidna vezna grupa (-S-S-). Da bi se utvrdilo da li je kandidat za deljivu veznu grupu odgovarajuća „reduktivno deljiva vezna grupa“ ili je, na primer, pogodna za upotrebu sa određenim RNKi delom i određenim ciljnim sredstvom, mogu se pogledati postupci opisani ovde. Na primer, kandidat se može proceniti inkubacijom sa ditiotreitolom (DTT) ili drugim redukcionim sredstvom korišćenjem reagensa poznatih u struci, koji imitiraju brzinu deljenja koja bi se primetila u ćeliji, npr., ciljnoj ćeliji. Kandidati se takođe mogu proceniti pod uslovima koji su odabrani da imitiraju uslove krvi ili seruma. U nekim otelotvorenjima, kandidat jedinjenja se dele najviše 10% u krvi. U određenim otelotvorenjima, korisna jedinjenja kandidati se razgrađuju najmanje 2, najmanje 4, najmanje 10 ili najmanje
[0400] 2
[0401] 100 puta brže u ćeliji (ili pod in vitro uslovima odabranim da imitiraju intracelularne uslove) u poređenju sa krvlju (ili pod in vitro uslovima odabranim da imitiraju ekstracelularne uslove). Brzina razlaganja kandidat jedinjenja može se odrediti korišćenjem standardnih enzimskih kinetičkih testova pod uslovima odabranim da imitiraju intracelularne medijume i upoređenim sa uslovima odabranim da imitiraju ekstracelularne medijume.
[0403] Deljive vezničke grupe na bazi fosfata dele se sredstvima koja razgrađuju ili hidrolizuju fosfatnu grupu. Primer sredstva koje deli fosfatne grupe u ćelijama su enzimi kao što su fosfataze u ćelijama. Primeri vezničkih grupa na bazi fosfata su -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O- P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-. U određenim otelotvorenjima, vezničke grupe na bazi fosfata su izabrane iz: -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, - O- P(0)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, - O- P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, i -O-P(S)(H)-S-. U određenim otelotvorenjima, fosfatna grupa za vezivanje je -O-P(O)(OH)-O-. Ovi kandidati mogu se proceniti korišćenjem postupaka analognih onima opisanim iznad.
[0405] Vezničke grupe koje se mogu deliti kiselinom su vezničke grupe koje se dele pod kiselim uslovima. U nekim otelotvorenjima, vezničke grupe koje se mogu deliti kiselinom se dele u kiseloj sredini sa pH od oko 6,5 ili nižom (npr., oko 6,0, 5,5, 5,0 ili nižom), ili sredstvima kao što su enzimi koji mogu delovati kao opšta kiselina. U ćeliji, specifične organele sa niskim pH, kao što su endozomi i lizozomi, mogu obezbediti okruženje za deljenje za vezničke grupe koje se mogu deliti kiselinom. Primeri vezničkih grupa koje se mogu deliti kiselinom uključuju, ali nisu ograničeni na, hidrazone, estre i estre aminokiselina. Grupe koje se mogu deliti kiselinom mogu imati opštu formulu -C=N-, C(O)O ili -OC(O). U nekim otelotvorenjima, ugljenik vezan za kiseonik estra (alkoksi grupa) je aril grupa, supstituisana alkil grupa ili tercijarna alkil grupa kao što su dimetil pentil ili t-butil. Ovi kandidati mogu se proceniti korišćenjem postupaka analognih onima opisanim iznad.
[0407] Estarske grupe za deljenje se dele enzimima kao što su esteraze i amidaze u ćelijama. Primeri estarskih grupa za deljenje uključuju, ali nisu ograničeni na estre alkilenskih, alkenilenskih i alkinilenskih grupa. Estarske grupe za deljenje imaju opštu formulu -C(O)O- ili -OC(O)-. Ovi kandidati mogu se proceniti korišćenjem postupaka analognih onima opisanim iznad.
[0409] Peptidne grupe za deljenje se dele enzimima kao što su peptidaze i proteaze u ćelijama. Peptidne grupe za deljenje su peptidne veze formirane između aminokiselina da bi se dobili oligopeptidi (npr., dipeptidi, tripeptidi itd.) i polipeptidi. Peptidne grupe za deljenje ne uključuju amidnu grupu (-C(O)NH-). Amidna grupa može se formirati između bilo kog alkilena, alkenilena ili alkinilena. Peptidna veza je poseban tip amidne veze koja se formira između aminokiselina da bi se dobili peptidi i proteini. Grupa za deljenje na bazi peptida je generalno ograničena na peptidnu vezu (tj., amidnu vezu) formiranu između aminokiselina koje daju peptide i proteine i ne uključuje celu amidnu funkcionalnu grupu. Deljive vezne grupe na bazi peptida imaju opštu formulu - NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, gde su RA i RB R grupe dve susedne aminokiseline. Ovi kandidati mogu se proceniti korišćenjem postupaka analognih onima opisanim iznad.
[0411] Reprezentativni ugljeni hidratni konjugati sa veznicima uključuju, ali nisu ograničeni na,
[0414]
[0415]
[0418] 
[0419]
[0421] gde kada je jedan od X ili Y oligonukleotid, drugi je vodonik.
[0422] U određenim otelotvorenjima sastava i postupaka, ligand je jedan ili više derivata „GalNAc“ (N-acetilgalaktozamin) vezanih preko dvovalentnog ili trovalentnog razgranatog veznika. Na primer, u nekim otelotvorenjima, siRNK je konjugovana sa GalNAc ligandom kao što je prikazano u sledećoj strukturi:
[0424]
[0426] gde je X O ili S.
[0427] U nekim otelotvorenjima, sens lanac siRNK je konjugovan sa ligandom vezanim na 3' kraju sens lanca preko veznika kao što je prikazano u sledećoj strukturi:
[0429]
[0432] 2
[0433] gde je X O ili S.
[0434] U nekim otelotvorenjima, kombinovana terapija uključuje siRNK koja je konjugovana sa dvovalentnim ili trovalentnim razgranatim veznikom izabranim iz grupe struktura prikazanih u bilo kojoj od formula
[0437]
[0439] gde:
[0440] q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B i q5C predstavljaju nezavisno za svako pojavljivanje 0-20 i gde ponavljajuća jedinica može biti ista ili različita;
[0441] P<2A>, P<2B>, P<3A>, P<3B>, P<4A>, P<4B>, P<5A>, P<5B>P<5C>, T<2A>, T<2B>, T<3A>, T<3B>, T<4A>, T<4B>, T<4A>, T<5B>, i T<5C>su svaki nezavisno za svako odsutno pojavljivanje, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH<2>, CH<2>NH, ili CH<2>O;
[0442] Q<2A>, Q<2B>, Q<3A>, Q<3B>, Q<4A>, Q<4B>, Q<5A>, Q<5B>, i Q<5C>su nezavisno za svako pojavljivanje odsutni, alkilen ili supstituisani alkilen gde jedan ili više metilena mogu biti prekinuti ili završeni sa jednim ili više od O,
[0445]
[0449]
[0451] ili heterociklil;
[0452] L<2A>L<2B>, L<3A>, L<3B>, L<4A>, L<4B>, L<5A>, L<5B>, i L<5C>predstavljaju ligand; tj., svaki nezavisno za svako pojavljivanje monosaharid (kao što je GalNAc), disaharid, trisaharid, tetrasaharid, oligosaharid ili polisaharid; i R<a>je H ili bočni lanac aminokiseline. Trovalentni konjugujući GalNAc derivati su posebno korisni za upotrebu sa RNKi sredstvima za inhibiranje ekspresije ciljnog gena, kao što su oni formule (XXXIV):
[0455]
[0456] Gde L<5A>, L<5B>i L<5C>predstavljaju monosaharid, kao što je derivat GalNAc.
[0458] Primeri pogodnih dvovalentnih i trovalentnih razgranatih linker grupa koje konjuguju GalNAc derivate uključuju, ali nisu ograničeni na, strukture navedene iznad kao formule I, VI, X, IX i XII.
[0460] Reprezentativni američki patenti koji uče o pripremi RNK konjugata uključuju U.S. Pat. br.
[0461] 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731;
[0462] 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046;
[0463] 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582;
[0464] 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469;
[0465] 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241; 5,391,723; 5,416,203; 5,451,463;
[0466] 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726;
[0467] 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 i 5,688,941; 6,294,664; 6,320,017;,6,576,752; 6,783,931; 6,900,297; i 7,037,646.
[0469] U određenim slučajevima, RNK RNKi sredstva može biti modifikovana neligandnom grupom. Brojni neligandni molekuli su konjugovani sa RNKi sredstvima kako bi se poboljšala aktivnost, ćelijska distribucija ili ćelijski apsorpcija RNKi sredstava, a postupci za izvođenje takvih konjugacija su dostupni u naučnoj literaturi. Takvi neligandni delovi uključuju lipidne delove, kao što je holesterol (Kubo, T., i dr., Biochem. Biophys. Res. Comm.365(1):54-61 (2007); Letsinger, i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553 (1989)), holna kiselina (Manoharan i dr., Bioorg. Med. Chem. Lett.4:1053 (1994)), tioetar, npr., heksil-S-tritiltiol (Manoharan, i dr., Ann. N.Y. Acad. Sci.660:306 (1992); Manoharan, i dr., Bioorg. Med. Chem. Let.3:2765 (1993)), tioholesterol (Oberhauser, i dr., Nucl. Acids Res.20:533 (1992)), alifatski lanac, npr., dodekandiol ili undecil ostaci (Saison-Behmoaras, i dr., EMBO J.10:111 (1991); Kabanov, i dr., FEBS Lett.259:327 (1990); Svinarchuk, i dr., Biochimie 75:49 (1993)), fosfolipid, npr., di-heksadecil-rac-glicerol ili trietilamonijum 1,2-di-O-heksadecil-rac-glicero-3-H-fosfonat (Manoharan, i dr., Tetrahedron Lett.36:3651 (1995); Shea, i dr., Nucl. Acids Res.18:3777 (1990)), poliamin ili lanac polietilen glikola (Manoharan, i dr., Nucleosides & Nucleotides 14:969 (1995)), ili adamantanska sirćetna kiselina (Manoharan, i dr., Tetrahedron Lett.36:3651 (1195)), palmitil deo (Mishra, et a., Biochim. Biophys. Acta 1264:229 (1995)), ili oktadecilamin ili heksilamino-karbonil-oksiholesterolni deo (Crooke, i dr., J. Pharmacol. Exp. Ther.277:923 (1996)).
[0471] Tipični protokoli konjugacije uključuju sintezu RNK koje nose aminoveznik na jednoj ili više pozicija sekvence. Amino grupa zatim reaguje sa molekulom koji se konjuguje korišćenjem odgovarajućih reagensa za kuplovanje ili aktiviranje. Reakcija konjugacije može se izvesti ili dok je RNK još uvek vezana za čvrsti nosač ili nakon deljenja RNK, u fazi rastvora. Prečišćavanje RNK konjugata pomoću HPLC-a tipično daje čisti konjugat.
[0473] d. Isporuka RNKi sredstva
[0475] „Unošenje u ćeliju“, kada se odnosi na RNKi sredstvo, znači olakšavanje ili sprovođenje apsorpcije ili usvajanja u ćeliju, kako je to shvaćeno stručnjacima u ovoj oblasti.
[0477] Apsorpcija ili usvajanje RNKi sredstva može se desiti putem neaktivnih difuzionih ili aktivnih ćelijskih procesa, ili pomoću pomoćnih sredstava ili uređaja. Značenje ovog termina nije ograničeno na ćelije in vitro; RNKi sredstvo se takođe može „uneti u ćeliju“, pri čemu je ćelija deo živog organizma. U takvom slučaju, unošenje u ćeliju će uključivati isporuku organizmu. Na primer, za in vivo isporuku, RNKi sredstvo se može ubrizgati u mesto tkiva ili sistemski primeniti. In vivo isporuka može se izvršiti i putem sistema za isporuku beta-glukana, kao što su oni opisani u pat. SAD br.5,032,401 i 5,607,677, i patentnoj objavi SAD br.2005/0281781. In vitro unošenje u ćeliju uključuje metode poznate u struci kao što su elektroporacija i lipofekcija. Dalji pristupi su opisani u nastavku ili su poznati u struci.
[0479] Isporuka RNKi sredstva ispitaniku kome je to potrebno može se postići na više različitih načina. In vivo isporuka može se izvršiti direktno davanjem sastava koji sadrži RNKi sredstvo, npr., siRNK, ispitaniku. Alternativno, isporuka se može izvršiti indirektno davanjem jednog ili više vektora koji kodiraju i usmeravaju ekspresiju RNKi sredstva. Ove alternative su detaljnije razmotrene u nastavku.
[0481] Generalno, bilo koji postupak isporuke molekula nukleinske kiseline može se prilagoditi za upotrebu sa RNKi sredstvom (videti, npr., Akhtar S. and Julian RL., Trends Cell. Biol.2(5):139-44 (1992) i WO94/02595). Tri faktora koja su posebno važna za uspešnu isporuku RNKi sredstva in vivo: (a) biološka stabilnost isporučenog molekula, (2) sprečavanje nespecifičnih efekata i (3) akumulacija isporučenog molekula u ciljnom tkivu. Nespecifični efekti RNKi sredstva mogu se minimizirati lokalnom primenom, na
[0484] 4
[0485] primer, direktnom injekcijom ili implantacijom u tkivo (kao neograničavajući primer, tumor) ili lokalnom primenom preparata. Lokalna primena na mesto tretmana maksimizira lokalnu koncentraciju sredstva, ograničava izloženost agensa sistemskim tkivima koja inače mogu biti oštećena agensom ili koja mogu razgraditi sredstvo, i omogućava primenu niže ukupne doze RNKi sredstva. Nekoliko ispitivanja je pokazalo uspešno suzbijanje genskih proizvoda kada se RNKi sredstvo primenjuje lokalno. Na primer, intraokularna isporuka VEGF siRNK intravitrealnom injekcijom kod cinomolgus majmuna (Tolentino, M.J., i dr., Retina 24:132-38 (2004)) i subretinalne injekcije kod miševa (Reich, S.J., i dr., Mol. Vis.9:210-16 (2003)) pokazalo se da oba sprečavaju neovaskularizaciju u eksperimentalnom modelu makularne degeneracije povezane sa starenjem. Pored toga, direktna intratumoralna injekcija siRNK kod miševa smanjuje zapreminu tumora (Pille, J.,i dr., Mol. Ther.11:267-74 (2005)) i može produžiti preživljavanje miševa sa tumorom (Kim, W.J., i dr., Mol. Ther.14:343-50 (2006): Li, S., i dr., Mol. Ther.15:515-23 (2007)). RNK interferencija je takođe pokazala uspeh sa lokalnom isporukom u CNS direktnom injekcijom (Dorn, G., i dr., Nucleic Acids 32:e49 (2004); Tan, P.H., i dr., Gene Ther.12:59-66 (2005); Makimura, H., i dr., BMC Neurosci.3: 18 (2002); Shishkina, G.T., i dr., Neuroscience 129:521-28 (2004); Thakker, E.R., i dr. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-75 (2004); Akaneya, Y., i dr., J. Neurophysiol.93:594-602 (2005)) i u pluća intranazalnom primenom (Howard, K.A., i dr., Mol. Ther.14:476-84 (2006); Zhang, X., i dr., J. Biol, Chem.279:10677-84 (2004); Bitko. V., i dr., Nat. Med.11:50-55 (2005)). Za sistemsku primenu RNKi sredstva za lečenje bolesti, RNK se može modifikovati ili alternativno isporučiti korišćenjem sistema za isporuku lekova; oba postupka deluju tako što sprečavaju brzu razgradnju siRNK endo- i egzonukleazama in vivo. Modifikacija RNK ili farmaceutskog nosača takođe može omogućiti ciljanje sastava RNKi sredstva na ciljno tkivo i izbeći neželjene efekte van cilja. RNKi sredstva se mogu modifikovati hemijskom konjugacijom sa lipofilnim grupama kao što je holesterol kako bi se poboljšao ćelijski apsorpcioni unos i sprečila razgradnja. Na primer, RNKi sredstvo usmeren protiv ApoB konjugovanog sa lipofilnim holesterolskim delom je sistemski ubrizgan u miševe i rezultirao je smanjenjem apoB mRNK i u jetri i u jejunumu (Soutschek, J., i dr., Nature 4432:173-78 (2004)). U nekim drugim otelotvorenjima, RNKi sredstvo se može isporučiti korišćenjem sistema za isporuku lekova kao što su nanočestice, dendrimeri, polimeri, lipozomi ili katjonski sistem za isporuku. Pozitivno naelektrisani katjonski sistemi za isporuku obično olakšavaju vezivanje RNKi sredstva (negativno naelektrisanog) i poboljšavaju interakcije na negativno naelektrisanoj ćelijskoj membrani kako bi se omogućilo efikasno usvajanje RNKi sredstva od strane ćelije. Katjonski lipidi, dendrimeri ili polimeri mogu biti vezani za RNKi sredstvo ili indukovani da formiraju vezikulu ili micelu (videti, npr., Kim, S,H., i dr., Journal of Controlled Release 129(2):107-16 (2008)) koja obuhvata RNKi sredstvo. Formiranje vezikula ili micela dodatno sprečava degradaciju RNKi sredstva kada se sistemski primenjuje. Postupci za pravljenje i primenu kompleksa katjonskog i RNKi sredstva su u potpunosti u okviru sposobnosti stručnjaka u ovoj oblasti (videti, npr., Sorensen, D.R., i dr., J. Mol. Biol.327:761-66 (2003): Verma, U.N., i dr., Clin. Cancer Res. 9:1291-1300 (2003): Arnold, A.S. i dr., J. Hypertens.25:197-205 (2007). Neki neograničavajući primeri sistema za isporuku lekova korisnih za sistemsku isporuku RNKi sredstava uključuju DOTAP (Sorensen, D.R., i dr. (2003), supra; Verma, U.N., i dr., (2003), supra), oligofektamin, „čvrste čestice lipida nukleinskih kiselina“ (Zimmermann, T.S., i dr., Nature 441:111-14 (2006)), kardiolipin (Chien, P.Y, i dr., Cancer Gene Ther.12:3211-28 (2005); Pal. A., i dr., Int J. Oncol.26: 1087-91 (2005)), polietilenimin (Bonnet, M.E., i dr., Pharm. Res.25(12):2972-82; Aigner, A., J. Biomed. Biotechnol.2006(4):71659 (2006)), Arg-Gly-Asp (RGC) peptidi (Liu, S., Mol. Pharm.3:472-487 (2006)), i poliamidoamini (Tomalia, D.A., i dr., Biochem. Soc. Trans.35:61-7 (2007); Yoo, H., i dr., Pharm. Res.16:1799-1804 (1999)).
[0487] Kako se ovde koristi, termin „SNALP“ odnosi se na stabilnu česticu nukleinske kiseline i lipida. SNALP predstavlja vezikulu lipida koja prekriva redukovanu vodenu unutrašnjost koja sadrži nukleinsku kiselinu kao što je RNKi sredstvo ili plazmid iz kojeg se RNKi sredstvo transkribuje. SNALPs su opisano, npr. u prijavi patentne objave SAD br. US2006/0240093 and US2007/0135372, i u međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 2009/082817.
[0489] U nekim otelotvorenjima, RNKi formira kompleks sa ciklodekstrinom za sistemsku primenu.
[0490] Postupci za primenu i farmaceutski sastavi RNKi i ciklodekstrina mogu se naći u U.S. Pat. No.7, 427, 605. U nekim otelotvorenjima, gen koji kodira RNKi je kodiran i ekspresovan iz ekspresionog vektora. Primeri vektora i njihova upotreba u isporuci RNKi opisani su u američkoj patentnoj prijavi br. US2017/0349900A1.
[0491] e. Farmaceutski sastavi i formulacija RNKi sredstava
[0493] [0172] U nekim otelotvorenjima, ovde su dati farmaceutski sastavi koji sadrže RNKi sredstvo, kao što je ovde opisano, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens. Farmaceutski sastav koji sadrži RNKi sredstvo je koristan u kombinovanoj terapiji za lečenje HBV infekcije ili smanjenje HBV virusnog opterećenja kod ispitanika. Takvi farmaceutski sastavi su formulisani na osnovu načina isporuke. Na primer, sastavi mogu biti formulisani za sistemsku primenu putem parenteralne isporuke, npr., intravenskom (IV) isporukom, ili za direktnu isporuku u moždani parenhim, npr., infuzijom u mozak, kao što je kontinuirana infuzija pumpom.
[0495] „Farmaceutski prihvatljiv nosač“ ili „ekscipijens“ je farmaceutski prihvatljiv rastvarač, suspendujuće sredstvo ili bilo koji drugi farmakološki inertni nosač za isporuku jedne ili više nukleinskih kiselina životinji. Ekscipijens može biti tečan ili čvrst i bira se, imajući u vidu planirani način primene, tako da se obezbedi željena zapremina, konzistencija itd., kada se kombinuje sa nukleinskom kiselinom i drugim komponentama datog farmaceutskog sastava. Tipični farmaceutski prihvatljivi nosači ili ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, vezivna sredstva (npr., preželatinizovani kukuruzni skrob, polivinilpirolidon, hidroksipropil metilceluloza); punila (npr., laktoza i drugi šećeri, mikrokristalna celuloza, pektin, želatin, kalcijum sulfat, etil celuloza, poliakrilati, kalcijum hidrogenfosfat); maziva (npr., magnezijum stearat, talk, silicijum dioksid, koloidni silicijum dioksid, stearinska kiselina, metalni stearati, hidrogenizovana biljna ulja, kukuruzni skrob, polietilen glikoli, natrijum benzoat, natrijum acetat); dezintegranti (npr., skrob, natrijum skrob glikolat); i sredstva za kvašenje (npr., natrijum lauril sulfat).
[0497] Farmaceutski prihvatljivi organski ili neorganski ekscipijensi pogodni za neparenteralnu primenu koji ne reaguju štetno sa nukleinskim kiselinama takođe se mogu koristiti za formulisanje sastava predmetnog obelodanjivanja. Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, rastvore soli, alkohole, polietilen glikole, želatin, laktozu, amilozu, magnezijum stearat, talk, silicijumsku kiselinu, viskozni parafin, hidroksimetilcelulozu, polivinilpirolidon i slično.
[0499] Formulacije za lokalnu primenu nukleinskih kiselina mogu uključivati sterilne i nesterilne vodene rastvore, nevodene rastvore u uobičajenim rastvaračima kao što su alkoholi ili rastvore nukleinskih kiselina u tečnim ili čvrstim uljnim bazama. Rastvori takođe mogu sadržati pufere, razblaživače i druge pogodne aditive. Farmaceutski prihvatljivi organski ili neorganski ekscipijensi pogodni za neparenteralnu primenu koji ne reaguju štetno sa nukleinskim kiselinama mogu se koristiti.
[0501] Pogodni farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, rastvore soli, alkohol, polietilen glikole, želatin, laktozu, amilozu, magnezijum stearat, talk, silicijumsku kiselinu, viskozni parafin, hidroksimetilcelulozu, polivinilpirolidon i slično.
[0503] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastavi koji sadrže RNKi sredstvo opisan ovde se primenjuju u dozama dovoljnim da inhibiraju ekspresiju HBV gena. Generalno, odgovarajuća doza RNKi sredstva biće u opsegu od 0,001 do 200,0 miligrama po kilogramu telesne mase primaoca dnevno, a tipičnije u opsegu od 1 do 50 mg po kilogramu telesne mase dnevno. Na primer, siRNK se može primenjivati u dozama od 0,01 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg ili 50 mg/kg po jednokratnoj dozi. Farmaceutski sastav se može primenjivati jednom dnevno, ili se RNKi sredstvo može primenjivati kao dve, tri ili više poddoza u odgovarajućim intervalima tokom dana ili čak korišćenjem kontinuirane infuzije ili isporuke putem formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem. U tom slučaju, RNKi sredstvo sadržano u svakoj poddozi mora biti odgovarajuće manji da bi se postigla ukupna dnevna doza. Jedinica doze se takođe može sastaviti za isporuku tokom nekoliko dana, npr., korišćenjem konvencionalne formulacije sa produženim oslobađanjem koja obezbeđuje produženo oslobađanje RNKi tokom perioda od nekoliko dana. Formulacije sa produženim oslobađanjem su dobro poznate u struci i posebno su korisne za isporuku sredstava na određenom mestu, kao što bi se moglo koristiti sa sredstvima tehnologije opisane ovde. U ovom otelotvorenju, jedinica doze sadrži odgovarajuće višekratne dnevne doze.
[0505] Efekat jedne doze na nivo ekspresije HBV gena može biti dugotrajan, tako da se naredne doze primenjuju u intervalima ne dužim od 3, 4 ili 5 dana, ili u intervalima ne dužim od 1, 2, 3 ili 4 nedelje.
[0507] Stručnjak će razumeti da određeni faktori mogu uticati na dozu i vreme potrebno za efikasno lečenje subjekta, uključujući, ali ne ograničavajući se na težinu bolesti ili poremećaja, prethodne tretmane, opšte zdravstveno stanje i/ili starost ispitanika i druge prisutne bolesti. Štaviše, lečenje ispitanika terapeutski efikasnom količinom sastava može uključivati jedan tretman ili seriju tretmana. Procene efikasnih doza i in vivo polu-raspada za pojedinačna RNKi sredstva obuhvaćene ovde opisanom tehnologijom mogu se napraviti korišćenjem konvencionalnih metodologija ili na osnovu in vivo testiranja korišćenjem odgovarajućeg životinjskog modela, kao što je opisano na drugom mestu ovde.
[0509] Modeli miševa su dostupni za proučavanje HBV infekcije, i takvi modeli se mogu koristiti za in vivo testiranje RNKi, kao i za određivanje doze koja je efikasna u smanjenju ekspresije HBV gena.
[0511] [0181] U nekim otelotvorenjima, primena farmaceutskih sastava i formulacija opisanih ovde može biti lokalna (npr., transdermalnim flasterom), plućna (npr., inhalacijom ili insuflacijom prahova ili aerosola, uključujući i nebulizator), intratrahealna; intranazalna; epidermalna i transdermalna; oralna; ili parenteralna. Parenteralna primena obuhvata intravenoznu, intraarterijsku, subkutanu, intraperitonealnu i intramuskularnu injekciju ili infuziju; subdermalnu primenu (npr., putem implantiranog uređaja); ili intrakranijalnu primenu (npr., intraparenhimalnom, intratekalnom ili intraventrikularnom primenom).
[0513] U određenim otelotvorenjima, RNKi sredstvo koji se koristi u kombinovanoj terapiji za lečenje HBV, kao što je ovde opisano, primenjuje se subkutano.
[0515] U nekim otelotvorenjima, RNKi sredstva se mogu primenjivati na način da ciljaju određeno tkivo, kao što je jetra (npr., hepatociti jetre).
[0517] Farmaceutski sastavi i formulacije za lokalnu primenu mogu uključivati transdermalne flastere, masti, losione, kreme, gelove, kapi, supozitorije, sprejeve, tečnosti i praškove. Konvencionalni farmaceutski nosači, vodene, praškaste ili uljane baze, zgušnjivači i slično mogu biti neophodni ili poželjni. Obloženi kondomi, rukavice i slično takođe mogu biti korisni. Pogodne formulacije za lokalnu primenu uključuju one u kojima su RNKi, predstavljene u tehnologiji opisanoj ovde, pomešane sa sredstvom za lokalnu primenu kao što su lipidi, lipozomi, masne kiseline, estri masnih kiselina, steroidi, helatni agensi i surfaktanti. Pogodni lipidi i lipozomi uključuju neutralne (npr., dioleoilfosfatidil DOPE etanolamin, dimiristoilfosfatidil holin DMPC, distearolifosfatidil holin), negativne (npr., dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) i katjonske (npr., dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP i dioleoilfosfatidil etanolamin DOTMA). RNKi sredstva mogu biti inkapsulirani unutar lipozoma ili mogu formirati komplekse sa njima, posebno sa katjonskim lipozomima. Alternativno, RNKi sredstva mogu biti kompleksirani sa lipidima, posebno sa katjonskim lipidima. Pogodne masne kiseline i estri uključuju, ali nisu ograničeni na, arahidonsku kiselinu, oleinsku kiselinu, eikozanojsku kiselinu, laurinsku kiselinu, kaprilnu kiselinu, kaprinsku kiselinu, miristinsku kiselinu, palmitinska kiselina, stearinska kiselina, linolna kiselina, linolenska kiselina, dikaprat, trikaprat, monoolein, dilaurin, gliceril 1-monokaprat, 1-dodecilazacikloheptan-2-on, acilkarnitin, acilholin ili C<1-20>alkil estar (npr., izopropilmiristat IPM), monoglicerid, diglicerid ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so. Primeri topikalnih formulacija detaljno su opisani u patentu SAD br.6,747,014.
[0519] Vezikule, kao što su lipozomi, mogu se koristiti u formulacijama za isporuku RNKi sredstava opisanih ovde.; takva formulacija može imati poželjna svojstva kao što su specifičnost i trajanje delovanja. Kako se ovde koristi, termin „lipozom“ označava vezikulu sastavljenu od amfifilnih lipida raspoređenih u sfernom dvosloju ili dvoslojevima.
[0521] Lipozomi su unilamelarne ili multilamelarne vezikule koje imaju membranu formiranu od lipofilnog materijala i vodenu unutrašnjost. Vodeni deo sadrži sastav koji se isporučuje. Katjonski lipozomi mogu imati prednost što se mogu spojiti sa ćelijskim zidom. Nekatjonski lipozomi, iako nisu u stanju da se efikasno spoje sa ćelijskim zidom, mogu biti apsorbovani od strane makrofaga in vivo. Važna razmatranja u pripremi formulacija lipozoma su površinsko naelektrisanje lipida, veličina vezikula i vodena zapremina lipozoma.
[0523] U nekim otelotvorenjima, isporuka lipozoma može imati sledeća povoljna svojstva; biti veoma deformabilna i sposobna da prođe kroz fine pore u koži; biokompatibilnost i biorazgradivost; sposobnost ugradnje širokog spektra lekova rastvorljivih u vodi i lipidima; sposobnost zaštite inkapsuliranih lekova u njihovim unutrašnjim odeljcima od metabolizma i razgradnje (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.245 (1998)); za lokalnu primenu, smanjeni neželjeni efekti povezani sa visokom sistemskom apsorpcijom primenjenog leka, povećana akumulacija primenjenog leka na željenom cilju i mogućnost primene širokog spektra lekova, i hidrofilnih i hidrofobnih, u kožu; i sposobnost isporuke sredstava, uključujući nukleinske kiseline visoke molekulske mase, analgetike, antitela i hormone, u kožu.
[0525] Lipozomi se dele u dve široke klase. Katjonski lipozomi su pozitivno naelektrisani lipozomi koji interaguju sa negativno naelektrisanim molekulima nukleinskih kiselina i formiraju stabilan kompleks.
[0526] Pozitivno naelektrisani kompleks DNK/lipozom vezuje se za negativno naelektrisanu površinu ćelije i internalizuje se u endozomu. Zbog kiselog pH unutar endozoma, lipozomi se pucaju, oslobađajući svoj sadržaj u ćelijsku citoplazmu (Wang, i dr., Biochem. Biophys. Res. Commun.147, 980-985 (1987)).
[0528] [0189] Lipozomi koji su pH-osetljivi ili negativno naelektrisani, zarobljavaju nukleinske kiseline umesto da se kompleksuju sa njima. Pošto su i DNK i lipid slično naelektrisani, dolazi do odbijanja umesto formiranja kompleksa. Ipak, deo DNK je zarobljen unutar vodene unutrašnjosti ovih lipozoma. Lipozomi osetljivi na pH su korišćeni za isporuku nukleinskih kiselina ćelijskim monoslojevima u kulturi (npr., Zhou, i dr., Journal of Controlled Release 19, 269-74 (1992)).
[0530] U nekim otelotvorenjima, lipozomski sastav se formira od fosfatidilholina (PC), kao što je, na primer, PC iz soje i PC iz jajeta. U nekim otelotvorenjima, lipozomski sastavi uključuju fosfolipide koji nisu prirodno dobijeni fosfatidilholin. Neutralni lipozomski sastavi, na primer, mogu se formirati od dimiristoil fosfatidilholina (DMPC) ili dipalmitoil fosfatidilholina (DPPC). Anjonski lipozomski sastavi mogu se formirati od dimiristoil fosfatidilglicerola, dok se anjonski fuzogeni lipozomi mogu formirati od dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). U još nekim otelotvorenjima, lipozomalni sastav se formira od smeša fosfolipida i/ili fosfatidilholina i/ili holesterola.
[0532] U nekim otelotvorenjima, lipozomalne formulacije lekova se primenjuju lokalno na kožu.
[0534] U nekim otelotvorenjima, RNKi sredstvo koje se koristi u kombinovanoj terapiji opisanoj ovde je potpuno inkapsuliran u lipidnoj formulaciji, npr., da bi se formirala SPLP, pSPLP, SNALP ili druga nukleinska kiselina-lipidna čestica. Kako se ovde koristi, termin „SNALP“ se odnosi na stabilnu nukleinsku kiselinu-lipidnu česticu, uključujući SPLP. Kako se ovde koristi, termin „SPLP“ se odnosi na nukleinsku kiselinu-lipidnu česticu koja sadrži plazmidnu DNK inkapsuliranu unutar lipidne vezikule. SNALP-ovi i SPLP-ovi obično sadrže katjonski lipid, nekatjonski lipid i lipid koji sprečava agregaciju čestice (npr., PEG-lipidni konjugat). SNALP-ovi i SPLP-ovi mogu se koristiti za sistemske primene, jer pokazuju produženi vek trajanja cirkulacije nakon intravenske (i.v.) injekcije i akumuliraju se na distalnim mestima (npr., mestima fizički odvojenim od mesta primene). SPLP-ovi uključuju „pSPLP“, koji uključuju enkapsulirani kompleks kondenzujućeg sredstva i nukleinske kiseline, kao što je navedeno u međunarodnoj prijavi br. WO 00/03683. Čestice tehnologije opisane ovde obično imaju srednji prečnik od oko 50 nm do oko 150 nm, tipičnije od oko 60 nm do oko 130 nm, tipičnije od oko 70 nm do oko 110 nm, i najčešće od oko 70 nm do oko 90 nm, i suštinski su netoksične. Pored toga, u nekim otelotvorenjima, nukleinske kiseline, kada su prisutne u česticama nukleinske kiseline i lipida, otporne su u vodenom rastvoru na razgradnju nukleazom. Čestice nukleinske kiseline i lipida i srodni postupci pripreme su obelodanjeni u, npr., U.S. Pat. br.
[0535] 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; i međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 96/40964.
[0537] U nekim otelotvorenjima, RNKi sredstvo se isporučuje putem lipozoma ili druge lipidne formulacije, gde je odnos lipida i leka (odnos mase/mase) (npr., odnos lipida i siRNK) u opsegu od oko 1:1 do oko 50:1, od oko 1:1 do oko 25: 1, od oko 3:1 do oko 15:1, od oko 4: 1 do oko 10:1, od oko 5:1 do oko 9:1 ili oko 6:1 do oko 9:1.
[0539] 111. Anti-HBV antitela
[0541] Predmetno obelodanjivanje pruža anti-HBV antitela za upotrebu u kombinovanoj terapiji za lečenje HBV.
[0543] a. Antitela koja se vezuju za HBV proteine
[0545] U nekim otelotvorenjima, anti-HBV antitelo kombinovane terapije, ili njegov antigen vezujući fragment, vezuje se za antigenski region petlje HBsAg. Omotač virusa hepatitisa B sadrži tri „proteina omotača HBV“ (poznata i kao „HBsAg“, „površinski antigen hepatitisa B“): S protein (za „mali“, takođe se naziva S-HBsAg), M protein (za „srednji“, takođe se naziva M-HBsAg) i L protein (za „veliki“, takođe se naziva L-HBsAg). S-HBsAg, M-HBsAg i L-HBsAg dele isti C-terminalni kraj (takođe se naziva „S domen“, 226 aminokiselina), koji odgovara S proteinu (S-HBsAg) i koji je uključen u sklapanje i infektivnost virusa. S-HBsAg, M-HBsAg i L-HBsAg se sintetišu u endoplazmatskom retikulumu (ER), sklapaju i luče kao čestice kroz Goldžijev aparat. S domen obuhvata četiri predviđena transmembranska (TM) domena, gde su i N-terminus i C-terminus S domena izloženi lumenu. Transmembranski domeni TM1 i TM2 su oba neophodna za kotranslacionu integraciju proteina u ER membranu, a transmembranski domeni TM3 i TM4 se nalaze u C-terminalnoj trećini S domena. „Region antigene petlje“ HBsAg se nalazi između predviđenih transmembranskih domena TM3 i TM4 S domena HBsAg, gde region antigene petlje obuhvata aminokiseline 101-172 S domena (Salisse J., and Sureau C. Journal of Virology 83:9321 -8 (2009)). Važna determinanta infektivnosti nalazi se u regionu antigene petlje proteina omotača HBV. Posebno, ostaci između 119 i 125 HBsAg sadrže CXXC motiv, za koji je pokazano da je najvažnija sekvenca potrebna za infektivnost HBV-a. (Jaoude, G.A., and Sureau, C., Journal of Virology 79:10460-6 (2005)).
[0547] Kako se ovde koristi, S domen HBsAg odnosi se na aminokiselinska sekvenca kao što je navedeno u SEQ ID NO:13 (prikazano ispod) ili na prirodne ili veštačke varijante sekvence.
[0548]
[0551] Na primer, termin „aminokiseline 101-172 S domena“ odnosi se na aminokiselinske ostatke od pozicija 101-172 polipeptida prema SEQ ID NO:13. Međutim, stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da se mutacije ili varijacije (uključujući, ali ne ograničavajući se na, supstituciju, deleciju i/ili adiciju, na primer, HBsAg različitog genotipa ili različitog HBsAg mutanta kao što je ovde opisano) mogu prirodno javiti u aminokiselinskom sekvenci S domena HBsAg ili biti veštački uvedene u aminokiselinska sekvenca S domena HBsAg bez uticaja na njegova biološka svojstva. Stoga, termin „S domen HBsAg“ obuhvata sve takve polipeptide, na primer, uključujući polipeptid prema SEQ ID NO:13 i njegove prirodne ili veštačke mutante. Pored toga, kada su ovde opisani fragmenti sekvence S domena HBsAg (npr., aminokiseline 101-172 ili aminokiseline 120-130 S domena HBsAg), oni uključuju ne samo odgovarajuće fragmente sekvence SEQ ID NO: 13, već i odgovarajuće fragmente sekvence njegovih prirodnih ili veštačkih mutanata. Na primer, termin „aminokiselinski ostaci sa pozicija 101-172 S domena HBsAg“ uključuje aminokiselinske ostatke sa pozicija 101-172 SEQ ID NO:13 i odgovarajuće fragmente njegovih mutanata (prirodnih ili veštačkih mutanata).
[0553] Kako se ovde koristi, termin „odgovarajući fragmenti sekvence“ ili „odgovarajući fragmenti“ odnosi se na fragmente koji se nalaze na jednakim pozicijama sekvenci kada su sekvence podvrgnute optimizovanom poravnanju, naime, sekvence su poravnate da bi se dobio najveći procenat identiteta. M protein (M-HBsAg) odgovara S proteinu produženom za N-terminalni domen od 55 aminokiselina nazvan „pre-S2“. L protein (L-HBsAg) odgovara M proteinu produženom za N-terminalni domen od 108 aminokiselina nazvan „pre-S1“ (genotip D). Pre-S1 i pre-S2 domeni L proteina mogu biti prisutni ili na unutrašnjoj strani virusnih čestica (na citoplazmatskoj strani ER), igrajući ključnu ulogu u sklapanju virusa, ili na spoljašnjoj strani (na luminalnoj strani ER), dostupni za interakciju sa ciljnim ćelijama i neophodni za virusnu infektivnost. Štaviše, površinski proteini HBV (HBsAg) se ne samo ugrađuju u virionske omotače, već se i spontano odvajaju od membrana ER-Goldžijevog aparata, formirajući prazne „subvirusne čestice“ (SVP) koje se oslobađaju iz ćelije sekrecijom.
[0555] Pošto sva tri proteina omotača HBV-a, S-HBsAg, M-HBsAg i L-HBsAg, čine S domen, sva tri proteina omotača HBV-a, S-HBsAg, M-HBsAg i L-HBsAg, takođe čine „region antigene petlje“. Shodno tome, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigeni region petlje HBsAg vezuje se za sva tri proteina omotača HBV-a: S-HBsAg, M-HBsAg, i L-HBsAg.
[0557] Štaviše, u nekim otelotvorenjima, anti-HBV antitelo kombinovane terapije, ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, neutrališe infekciju virusom hepatitisa B. Drugim rečima, antitelo, ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, može smanjiti virusnu infektivnost virusa hepatitisa B.
[0559] Da bi proučio i kvantifikovao infektivnost virusa (ili „neutralizaciju“) u laboratoriji, stručnjak u ovoj oblasti poznaje različite standardne „testove neutralizacije“. Za test neutralizacije, životinjski virusi se tipično razmnožavaju u ćelijama i/ili ćelijskim linijama. U kontekstu predmetnog obelodanjivanja, za test neutralizacije, kultivisane ćelije mogu se inkubirati sa fiksnom količinom HBV u prisustvu (ili odsustvu) antitela koje se testira. Kao rezultat, mogu se koristiti nivoi površinskog antigena hepatitisa B (HBsAg) ili antigena hepatitisa B e (HBeAg) izlučenih u supernatant ćelijske kulture i/ili se može proceniti bojenje HBcAg. U jednom otelotvorenju testa neutralizacije HBV, kultivisane ćelije, na primer HepaRG ćelije, posebno diferencirane HepaRG ćelije, inkubiraju se sa fiksnom količinom HBV u prisustvu ili odsustvu antitela koje se testira, na primer tokom 16 sati na 37°C. Inkubacija se može izvršiti u medijumu (npr., dopunjenom sa 4% PEG 8000). Nakon inkubacije, ćelije se mogu isprati i dalje kultivisati. Da bi se izmerila infektivnost virusa, nivoi površinskog antigena hepatitisa B (HBsAg) i antigena hepatitisa B e (HBeAg) izlučenih u supernatant kulture, npr., od 7. do 11. dana nakon infekcije, mogu se odrediti imunosorbentnim testom povezanim sa enzimima (ELISA). Pored toga, bojenje HBcAg može se proceniti imunofluorescentnim testom.
[0561] U nekim otelotvorenjima, antitelo i fragment koji vezuje antigen imaju visoku neutralizujuću moć.
[0562] Koncentracija antitela predmetnog obelodanjivanja potrebna za 50% neutralizaciju virusa hepatitisa B (HBV) je, na primer, oko 10 pg/ml ili manje. U određenim otelotvorenjima, koncentracija antitela predmetnog obelodanjivanja potrebna za 50% neutralizaciju HBV je oko 5 pg/ml, oko 1 pg/ml ili oko 750 ng/ml. U određenim otelotvorenjima, koncentracija antitela predmetnog obelodanjivanja potrebna za 50% neutralizaciju HBV je 500 ng/ml ili manje, npr.450, 400, 350, 300, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60 ili oko 50 ng/ml ili manje. To znači da su potrebne samo niske koncentracije antitela za 50% neutralizaciju HBV. Specifičnost i potencija mogu se meriti korišćenjem standardnih testova poznatih stručnjaku u ovoj oblasti.
[0564] U nekim otelotvorenjima, anti-HBV antitelo, kao komponenta kombinovane terapije, korisno je u prevenciji i/ili lečenju hepatitisa B.
[0566] U nekim otelotvorenjima, antitelo prema predmetnom obelodanjivanju, ili njegov fragment koji vezuje antigen, promoviše klirens HBsAg i HBV. Konkretno, antitelo prema predmetnom obelodanjivanju, ili njegov fragment koji vezuje antigen, može promovisati klirens i HBV i subvirusnih čestica virusa hepatitisa B (SVP). Klirens HBsAg ili subvirusnih čestica može se proceniti merenjem nivoa HBsAg, na primer, u uzorku krvi, npr., od pacijenta sa hepatitisom B. Slično tome, klirens HBV može se proceniti merenjem nivoa HBV, na primer u uzorku krvi, npr., od pacijenta sa hepatitisom B.
[0568] U serumu pacijenata inficiranih HBV-om, pored infektivnih čestica (HBV), obično postoji višak (obično 1000 do 100000 puta) praznih subvirusnih čestica (SVP) sastavljenih isključivo od proteina omotača HBV-a (HBsAg) u obliku relativno manjih sfera i filamenata promenljive dužine. Pokazano je da subvirusne čestice snažno poboljšavaju intracelularnu replikaciju virusa i ekspresiju gena HBV (Bruns, M., i dr., J Virol 72(2):1462-8 (1998)). Ovo je takođe važno u kontekstu infektivnosti seruma koji sadrže HBV, jer infektivnost ne zavisi samo od broja virusa već i od broja SVP (Bruns, M., i dr., J Virol 72(2):1462-8 (1998)). Štaviše, višak subvirusnih čestica može poslužiti kao mamac apsorbujući neutrališuća antitela i time odložiti čišćenje infekcije. Tipično, postizanje gubitka površinskog antigena hepatitisa B (HBsAg) se stoga smatra idealnim krajnjim ciljem lečenja i najbližim ishodom izlečenja hroničnog hepatitisa B (CHB). Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, antitelo prema predmetnom obelodanjivanju, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje promoviše klirens HBsAg, a posebno klirens subvirusnih čestica virusa hepatitisa B i HBV, omogućava poboljšani tretman hepatitisa B, posebno u kontekstu hroničnog hepatitisa B. Na taj način, antitelo prema predmetnom obelodanjivanju, ili njegov fragment koji vezuje antigen, može snažno neutralisati HBV, jer SVP-ovi apsorbuju manje antitela, delujući kao mamac. Pored toga, u određenim otelotvorenjima, antitelo prema predmetnom obelodanjivanju, ili njegov fragment koji vezuje antigen, promoviše klirens subvirusnih čestica virusa hepatitisa B i smanjuje infektivnost HBV u serumu.
[0570] HBV se diferencira u mnoge genotipove, prema sekvenci genoma. Do danas je definisano osam dobro poznatih genotipova (A-H) HBV genoma. Štaviše, identifikovana su i dva nova genotipa, I i J (Sunbul, M., World J Gastroenterol 20(18):5427-34 (2014)). Poznato je da genotip utiče na progresiju bolesti, a utvrđene su i razlike između genotipova u odgovoru na antivirusnu terapiju. Na primer, genotip A ima tendenciju ka hroničnosti, dok se virusne mutacije često sreću kod genotipa C. I hroničnost i učestalost mutacija su uobičajene kod genotipa D. Štaviše, genotipovi HBV su diferencijalno raspoređeni širom sveta (Sunbul, M., 2014, supra). U određenim otelotvorenjima, antitelo prema predmetnom obelodanjivanju, ili njegov fragment koji vezuje antigen, vezuje se za najmanje 6, za najmanje 8 ili za svih 10 HBsAg genotipova A, B, C, D, E, F, G, H, I i J. U određenim otelotvorenjima, antitelo prema predmetnom obelodanjivanju, ili njegov fragment koji vezuje antigen, vezuje se za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 HBsAg genotipova A, B, C, D, E, F, G, H, I i J. Primeri za različite genotipove HBsAg uključuju sledeće: GenBank pristupni broj J02203 (HBV-D, ayw3), GenBank pristupni broj FJ899792.1 (HBV-D, adw2), GenBank pristupni broj AM282986 (HBV-A), GenBank pristupni broj D23678 (HBV-B1 Japan), pristupni broj GenBank AB117758 (FMV-C1 Kambodža), pristupni broj GenBank AB205192 (HBV-E Gana), pristupni broj GenBank X69798 (HBV-F4 Brazil), pristupni broj GenBank AF160501 (HBV-G SAD), pristupni broj GenBank AY090454 (HBV-H Nikaragva), pristupni broj GenBank AF241409 (HBV-I Vijetnam) i pristupni broj GenBank AB486012 (HBV-J Borneo). Aminokiselinske sekvence antigene petlje regiona S domena HBsAg različitih genotipova prikazane su u Tabeli 2 (SEQ ID NOs: 14-42).
[0573] 4
[0574] Tabela 2. Antigenske sekvence petlji iz različitih HBV genotipova
[0575]
[0576]
[0579] U određenim otelotvorenjima, antitelo prema predmetnom obelodanjivanju, ili njegov fragment koji vezuje antigen, vezuje se za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ili 18 HBsAg mutanata koji imaju mutacije u regionu antigene petlje: HBsAg Y100C/PI20T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121 S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141 E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R, i HBsAg N146A. Ovi mutanti su prirodno prisutni mutanti zasnovani na S domenu HBsAg genotipa D (SEQ ID NO:43), Genbank pristupni broj FJ899792 (pri čemu su mutirani aminokiselinski ostaci naznačeni u nazivu).
[0581] MENVTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGT TVCLGQNSQSPTSNHSPTS CPPTCPGYRWNICLRRFIIFLFILLLCLI FLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSC CCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQ WFVGLSPTVWLSVTWMMWYWGPSLYSTLSPFLPLLPIFFCLWVY I (SEQ ID NO:43) (region antigenske petlje, tj., aminokiseline 101-172, prikazan je podvučen).
[0583] U posebnim otelotvorenjima, antitelo prema predmetnom obelodanjivanju, ili njegov fragment koji vezuje antigen, vezuje se za najmanje 12, za najmanje 15 ili za svih 18 infektivnih HBsAg mutanata koji imaju mutacije u regionu antigene petlje: HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121 S, HBsAg R122D, HBsAg R1221, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M1 33H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141 E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R, i HBsAg N146A.
[0585] [0209] U određenim otelotvorenjima, antitelo prema predmetnom obelodanjivanju, ili njegov fragment koji vezuje antigen, vezuje se za epitop koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, najmanje tri aminokiseline ili najmanje četiri aminokiseline regiona antigene petlje HBsAg, gde su najmanje dve, najmanje tri ili najmanje četiri aminokiseline izabrane od aminokiselina 115-133 S domena HBsAg, aminokiselina 120-133 S domena HBsAg ili aminokiselina 120-130 S domena HBsAg. Treba napomenuti da se položaj aminokiselina (npr., 115-133, 120-133, 120-130) odnosi na S domen HBsAg kao što je iznad opisano, koji je prisutan u sva tri HBV proteina omotača S-HBsAg, M-HBsAg i L-HBsAg.
[0587] U posebnim otelotvorenjima, antitelo prema predmetnom obelodanjivanju, ili njegov fragment koji vezuje antigen, vezuje se za epitop u regionu antigene petlje HBsAg, pri čemu je epitop formiran od jedne ili više aminokiselina koje se nalaze na pozicijama odabranim od pozicija aminokiselina 115-133, pozicija aminokiselina 120-133 ili pozicija aminokiselina 120-130 S domena HBsAg.
[0589] Termin „formiran od“, kako se ovde koristi u kontekstu epitopa, znači da epitop za koji se antitelo prema predmetnom obelodanjivanju, ili njegov fragment koji vezuje antigen, vezuje može biti linearan (kontinuiran) ili konformacioni (diskontinuiran). Linearni ili sekvencijalni epitop je epitop koji antitela prepoznaju po svom linearnom nizu aminokiselina ili primarnoj strukturi. Nasuprot tome, konformacioni epitop ima specifičan trodimenzionalni oblik i proteinsku strukturu. Shodno tome, ako je epitop linearni epitop i sadrži više od jedne aminokiseline koja se nalazi na pozicijama odabranim od pozicija aminokiselina 115-133 ili pozicija aminokiselina 120-133 S domena HBsAg, aminokiseline koje čini epitop mogu se nalaziti na susednim pozicijama primarne strukture (tj., uzastopne aminokiseline u sekvenci aminokiselina). U slučaju konformacionog epitopa (3D struktura), nasuprot tome, sekvenca aminokiselina tipično formira 3D strukturu kao epitop i, stoga, aminokiseline koje formiraju epitop (ili aminokiseline „koje čini“ epitop) mogu biti, ali i ne moraju biti locirane na susednim pozicijama primarne strukture (tj., mogu, ali i ne moraju biti uzastopne aminokiseline u sekvenci aminokiselina). U određenim otelotvorenjima, epitop za koji se vezuje antitelo predmetnog obelodanjivanja, ili njegov fragment koji vezuje antigen, formiran je samo od aminokiseline (aminokiselina) izabrane iz pozicija aminokiselina 115-133, pozicija aminokiselina 120-133 ili pozicija aminokiselina 120-130 S domena HBsAg. U određenim otelotvorenjima, nisu potrebne (dodatne) aminokiseline - koje se nalaze izvan pozicija 115-133, pozicija 120-133 ili pozicija 120-130 - da bi se formirao epitop za koji se vezuje antitelo predmetnog obelodanjivanja, ili njegov fragment koji vezuje antigen.
[0591] U određenim otelotvorenjima, epitop u regionu antigene petlje HBsAg za koji se vezuje antitelo predmetnog obelodanjivanja, ili njegov fragment koji vezuje antigen, formiran je od dve ili više aminokiselina koje se nalaze na pozicijama izabranim od pozicija aminokiselina 115-133, pozicija aminokiselina 120-133 ili pozicija aminokiselina 120-130 S domena HBsAg. U određenim otelotvorenjima, epitop u regionu antigene petlje HBsAg za koji se vezuje antitelo ovog otkrića, ili njegov fragment koji vezuje antigen, formiran je od tri ili više aminokiselina koje se nalaze na pozicijama izabranim od pozicija aminokiselina 115-133, pozicija aminokiselina 120-133 i pozicija aminokiselina 120-130 S domena HBsAg. U nekim otelotvorenjima, epitop u regionu antigene petlje HBsAg za koji se vezuje antitelo predmetnog obelodanjivanja, ili njegov fragment koji vezuje antigen, formiran je od četiri ili više aminokiselina koje se nalaze na pozicijama odabranim od aminokiselinskih pozicija 115-133, aminokiselinskih pozicija 120-133 ili aminokiselinskih pozicija 120-130 S domena HBsAg. Kao takvo, antitelo prema predmetnom obelodanjivanju, ili njegov fragment koji vezuje antigen, može se vezati za najmanje jednu, najmanje dve, najmanje tri ili najmanje četiri aminokiseline regiona antigene petlje HBsAg odabrane od aminokiselina 115-133 S domena HBsAg, aminokiselina 120-133 S domena HBsAg ili aminokiselina 120-130 S domena HBsAg. U određenim otelotvorenjima, antitelo prema predmetnom obelodanjivanju, ili njegov fragment koji vezuje antigen, vezuje se za epitop koji sadrži najmanje dve, najmanje tri ili najmanje četiri aminokiseline regiona antigene petlje HBsAg, gde su najmanje dve, najmanje tri ili najmanje četiri aminokiseline izabrane iz aminokiselina 120-133 ili aminokiselina 120-130 S domena HBsAg i gde su najmanje dve, najmanje tri ili najmanje četiri aminokiseline smeštene u susednim pozicijama (tj., su uzastopne aminokiseline u sekvenci aminokiselina/primarnoj strukturi).
[0593] U određenim otelotvorenjima, epitop za koji se vezuje antitelo prema predmetnom obelodanjivanju, ili njegov fragment koji vezuje antigen, je konformacioni epitop. Shodno tome, antitelo prema predmetnom obelodanjivanju, ili njegov fragment koji vezuje antigen, može se vezati za epitop koji sadrži najmanje dve, najmanje tri ili najmanje četiri aminokiseline regiona antigene petlje HBsAg, gde su najmanje dve, najmanje tri ili najmanje četiri aminokiseline izabrane iz aminokiselina 120-133, ili aminokiselina 120-130, S domena HBsAg i gde se najmanje dve, ili najmanje tri, ili najmanje četiri aminokiseline ne nalaze u susednim pozicijama (primarne strukture).
[0595] U određenim specifičnim otelotvorenjima, antitelo predmetnog obelodanjivanja je bispecifično antitelo, sa prvom specifičnošću za HBsAg i drugom specifičnošću koja stimuliše imunološku efektorsku ćeliju (npr., ciljanjem proteina površine T ćelija, kao što je, na primer, ekstracelularni deo CD3 proteina). Druga specifičnost može izazvati, na primer, citotoksični efekat ili vakcinalni efekat.
[0598] 4
[0599] b. Fc delovi
[0601] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein (npr., antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen) sadrži Fc deo. U određenim otelotvorenjima, Fc deo može biti izveden iz ljudskog porekla, npr., iz ljudskog IgG1, IgG2, IgG3 i/ili IgG4. U specifičnim otelotvorenjima, antitelo ili fragmenti koji vezuju antigen mogu sadržati Fc deo izveden iz ljudskog IgG1.
[0603] Kako se ovde koristi, termin „Fc deo“ odnosi se na sekvencu koja obuhvata ili je izvedena iz dela teškog lanca imunoglobulina koji počinje u zglobnom regionu neposredno uzvodno od mesta deljenja papaina (npr., ostatak 216 u nativnom IgG, gde se prvi ostatak konstantnog regiona teškog lanca smatra 114) i završava se na C-terminusu teškog lanca imunoglobulina. Shodno tome, Fc deo može biti kompletan Fc deo ili njegov deo (npr., domen). U određenim otelotvorenjima, kompletan Fc deo obuhvata zglobni domen, CH2 domen i CH3 domen (npr., EU aminokiselinske pozicije 216-446). Dodatni lizinski ostatak (K) je ponekad prisutan na krajnjem C-terminusu Fc dela, ali se često cepa sa zrelog antitela. Pozicije aminokiselina unutar Fc grupe su numerisane prema Kabat sistemu numeracije EU (videti, npr., Kabat, i dr., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Dept. Health and Human Services, 1983 and 1987). Pozicije aminokiselina Fc grupe takođe mogu biti numerisane prema IMGT sistemu numeracije (uključujući jedinstveno numerisanje za C-domen i numerisanje eksona) i Kabat sistemu numeracije.
[0605] U nekim otelotvorenjima, Fc deo sadrži najmanje jedan od: šarke (npr., gornji, srednji i/ili donji zglobni region) domena, CH2 domena, CH3 domena ili njegove varijante, dela ili fragmenta. U nekim otelotvorenjima, Fc deo sadrži najmanje zglobni domen, CH2 domen ili CH3 domen. U daljim otelotvorenjima, Fc deo je kompletan Fc deo. Aminokiselinska sekvenca primernog Fc dela ljudskog IgG1 izotipa data je u SEQ ID NO:96. Fc deo takođe može da sadrži jednu ili više insercija, delecija ili supstitucija aminokiselina u odnosu na prirodni Fc deo. Na primer, najmanje jedan od zglobnog domena, CH2 domena ili CH3 domena, ili njihovog dela, može biti izbrisan. Na primer, Fc deo može da obuhvati ili se sastoji od: (i) domena šarke (ili njegovog dela) spojenog sa CH2 domenom (ili njegovim delom), (ii) domena šarke (ili njegovog dela) spojenog sa CH3 domenom (ili njegovim delom), (iii) CH2 domena (ili njegovog dela) spojenog sa CH3 domenom (ili njegovim delom), (iv) domena šarke (ili njegovog dela), (v) CH2 domena (ili njegovog dela), ili (vi) CH3 domena ili njegovog dela.
[0607] Fc deo predmetnog obelodanjivanja može biti modifikovan tako da se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od kompletnog Fc dela prirodno prisutnog molekula imunoglobulina, dok zadržava (ili poboljšava) najmanje jednu poželjnu funkciju koju daje prirodni Fc deo. Takve funkcije uključuju, na primer, vezivanje za Fc receptor (FcR), modulaciju polu-raspad antitela (npr., vezivanjem za FcRn), ADCC funkciju, vezivanje za protein A, vezivanje za protein G i vezivanje za komplement. Delovi prirodnih Fc jedinica koje su uključene u takve funkcije opisani su u struci.
[0609] Na primer, da bi se aktivirala kaskada komplementa, proteinski kompleks C1q može se vezati za najmanje dva molekula IgG1 ili jedan molekul IgM kada je molekul(i) imunoglobulina vezan(i) za antigenski cilj (Ward, E. S., and Ghetie, V., Ther. Immunol.277-94 (1995)). Region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinske ostatke od 318 do 337 uključen je u fiksaciju komplementa (Burton, D. R., Mol. Immunol.22:161-206 (1985)). Duncan, A. R., and Winter, G. (Nature 332:738-40 (1988)), koristeći mutagenezu usmerenu na mesto, objavili su da Glu318, Lys320 i Lys322 formiraju mesto vezivanja za C1q. Uloga ostataka Glu318, Lys320 i Lys 322 u vezivanju C1q potvrđena je sposobnošću kratkog sintetičkog peptida koji sadrži ove ostatke da inhibira lizu posredovanu komplementom.
[0611] Na primer, vezivanje FcR može biti posredovano interakcijom Fc dela (antitela) sa Fc receptorima (FcR), koji su specijalizovani receptori na površini ćelija na ćelijama, uključujući ćelije hematopoeze. Fc receptori pripadaju superfamiliji imunoglobulina i pokazano je da posreduju i u uklanjanju patogena obloženih antitelima fagocitozom imunih kompleksa i u lizi eritrocita i raznih drugih ćelijskih meta (npr., tumorskih ćelija) obloženih odgovarajućim antitelom, putem ćelijski zavisne citotoksičnosti posredovane citotoksičnošću (ADCC; Van de Winkel, J. G., and Anderson, C. L., J. Leukoc. Biol.49:511-24 (1991)). FcR su definisani svojom specifičnošću za klase imunoglobulina; Fc receptori za IgG antitela se nazivaju FcγR, za IgE kao FcεR, za IgA kao FcαR, i tako dalje, a neonatalni Fc receptori se nazivaju FcRn. Vezivanje Fc receptora je opisano, na primer, u Ravetch, J. V., and Kinet, J. P., Annu. Rev. Immunol.9:457-92 (1991); Capel, P. J., i dr., Immunomethods 4:25-34 (1994); de Haas, M., i dr., J Lab. Clin. Med.126:330-41 (1995); i Gessner, J. E., i dr., Ann. Hematol.76:231-48 (1998).
[0613] [0221] Unakrsno povezivanje receptora pomoću Fc domena prirodnih IgG antitela (FcγR) pokreće širok spektar efektorskih funkcija, uključujući fagocitozu, ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela i oslobađanje inflamatornih medijatora, kao i klirens imunih kompleksa i regulaciju proizvodnje antitela. Ovde se razmatraju Fc delovi koji obezbeđuju unakrsno povezivanje receptora (npr., FcγR). Kod ljudi su okarakterisane tri klase FcγR: (i) FcγRI (CD64), koji se vezuje za monomerni IgG sa visokim afinitetom i ekspresuje se na makrofagima, monocitima, neutrofilima i eozinofilima; (ii) FcγRII (CD32), koji se vezuje za kompleksni IgG sa srednjim do niskim afinitetom, široko se ekspresuje, posebno na leukocitima, smatra se centralnim igračem u imunitetu posredovanom antitelima, i može se podeliti na FcgRIIA, FcγRIIB i FcgRIIC, koji obavljaju različite funkcije u imunom sistemu, ali se vezuju sa sličnim niskim afinitetom kao IgG-Fc, a ektodomeni ovih receptora su visoko homologni; i (iii) FcγRIII (CD16), koji se vezuje za IgG sa srednjim do niskim afinitetom i pronađen je u dva oblika: FcγRIIIA, koji je pronađen na NK ćelijama, makrofagima, eozinofilima i nekim monocitima i T ćelijama, i smatra se da posreduje u ADCC; i FcγRIIIB, koji se visoko ekspresuje na neutrofilima.
[0614] FcγRIIA se nalazi na mnogim ćelijama uključenim u ubijanje (npr., makrofagi, monociti, neutrofili) i čini se da je sposoban da aktivira proces ubijanja. Izgleda da FcγRIIB igra ulogu u inhibitornim procesima i nalazi se na B-ćelijama, makrofagima, mastocitima i eozinofilima. Pokazano je da se 75% svih FcgRIIB nalazi u jetri (Ganesan, L. P., i dr., Journal of Immunology 189:4981-8 (2012)). FcγRIIB se obilno ekspresuje na sinusoidnom endotelu jetre, nazvanom LSEC, i u Kupferovim ćelijama u jetri, a LSEC su glavno mesto klirensa malih imunih kompleksa (Ganesan, L. P. i dr., 2012, supra).
[0615] U nekim otelotvorenjima, antitela opisana ovde i njihovi fragmenti koji vezuju antigen sadrže Fc deo za vezivanje za FcRIIb, posebno Fc region, kao što su, na primer, antitela tipa IgG. Štaviše, moguće je inženjerisati Fc deo da bi se poboljšalo vezivanje FcRIIB uvođenjem mutacija S267E i L328F kao što je opisano od strane Chu, S. Y. i dr. (Molecular Immunology 45:3926-33 (2008)). Na taj način, klirens imunih kompleksa može biti poboljšan (Chu, S., i dr., Am J Respir Crit, American Thoracic Society International Conference Abstracts (2014)). U nekim otelotvorenjima, antitela predmetnog obelodanjivanja, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže inženjerisani Fc deo sa mutacijama S267E i L328F, posebno kao što je opisano od strane Chu, S. Y. i dr. (2008, supra).
[0616] Na B ćelijama, FcγRIIB izgleda funkcioniše tako što suzbija dalju proizvodnju imunoglobulina i prelazak na izotip, na primer, IgE klasu. Na makrofagima, smatra se da FcgRIIB inhibira fagocitozu posredovanu FcgRIIA. Na eozinofilima i mastocitima, b oblik može pomoći u suzbijanju aktivacije ovih ćelija putem vezivanja IgE za njegov odvojeni receptor.
[0617] Što se tiče vezivanja FcgRI, modifikacija u nativnom IgG najmanje jednog od E233-G236, P238, D265, N297, A327 i P329 smanjuje vezivanje za FcgRI. Ostaci IgG2 na pozicijama 233-236, supstituisani u odgovarajuće pozicije IgG1 i IgG4, smanjuju vezivanje IgG1 i IgG4 za FcyRI za 10<3>puta i eliminišu odgovor ljudskih monocita na crvena krvna zrnca senzibilizovana antitelima (Armour, K. L., i dr., Eur. J. Immunol.29:2613-2624 (1999)).
[0618] Što se tiče vezivanja za FcyRII, smanjeno vezivanje za FcyRIIA je pronađeno, npr., za IgG mutaciju najmanje jednog od E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 i K414.
[0619] Što se tiče vezivanja FcyRIII, smanjeno vezivanje za FcyRIIIA je utvrđeno, npr., za mutaciju najmanje jednog od E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 i D376.
[0620] Mapiranje mesta vezivanja na ljudskom IgG1 za Fc receptore, iznad pomenuta mesta mutacije i metode za merenje vezivanja za FcyRI i FcyRIIA, opisane su u Shields, R. L., i dr. (J. Biol. Chem.276:6591-6604 (2001)).
[0621] Što se tiče vezivanja za FcyRII, izgleda da su dva regiona prirodnog IgG Fc uključena u interakcije između FcyRII i IgG, naime (i) donje mesto šarnira IgG Fc, posebno aminokiselinske ostatke L, L, G i G (234-237, EU numeracija), i (ii) susedni region CH2 domena IgG Fc, posebno petlja i lanci u gornjem CH2 domenu pored donjeg regiona šarnira, npr., u regionu P331 (Wines, B.D., i dr., J. Immunol.164:5313 - 8 (2000)). Štaviše, izgleda da se FcyRI vezuje za isto mesto na IgG Fc, dok se FcRn i protein A vezuju za drugo mesto na IgG Fc, koje izgleda da je na CH2-CH3 interfejsu (Wines, B.D., i dr., 2000, supra).
[0622] Takođe se razmatraju mutacije koje povećavaju afinitet vezivanja Fc dela predmetnog obelodanjivanja za (tj., jedan ili više) Fcy receptora (npr., u poređenju sa referentnim Fc delom ili antitelom koje ne sadrži mutaciju(e)). Videti npr., Delillo and Ravetch, Cell 161(5):1035-45 (2015) i Ahmed i dr., J. Struc. Biol.194(1):78 (2016). U bilo kom od ovde obelodanjenih otelotvorenja, vezujući protein može da sadrži Fc deo koji sadrži mutaciju izabranu iz G236A; S239D; A330L; i 1332E; ili kombinaciju koja sadrži
[0625] 4
[0626] isto; npr., S239D/I332E; S239D/A330L/1332E, G236A/S239D/I332E; G236A/A330L/I332E,; i G236A/S239D/A330L/1332E.
[0628] U određenim otelotvorenjima, Fc deo može da obuhvati ili se sastoji od najmanje dela Fc dela koji je uključen u vezivanje za FcRn. U određenim otelotvorenjima, Fc deo obuhvata jednu ili više modifikacija aminokiselina koje poboljšavaju afinitet vezivanja za FcRn i, u nekim otelotvorenjima, time produžavaju polu-raspad in vivo molekula koji sadrži Fc deo (npr., u poređenju sa referentnim Fc delom ili antitelom koje ne sadrži modifikaciju(e)). U određenim otelotvorenjima, Fc deo obuhvata ili je izveden iz IgG Fc, a mutacija koja produžava polu-raspad obuhvata jednu ili više od sledećeg: M428L; N434S; N434H; N434A; N434S; M252Y; S254T; T256E; T250Q; P257I; Q313I; D376V; T307A; i E380A (EU numerisanje). U određenim otelotvorenjima, mutacija koja produžava polu-raspad obuhvata M428L/N434S. U određenim otelotvorenjima, mutacija koja produžava polu-raspad obuhvata M252Y/S254T/T256E. U određenim otelotvorenjima, mutacija koja produžava polu-raspad obuhvata T250Q/M428L. U određenim otelotvorenjima, mutacija koja produžava polu-raspad obuhvata P257I/Q311I. U određenim otelotvorenjima, mutacija koja produžava polu-raspad obuhvata P257I/N434H. U određenim otelotvorenjima, mutacija koja produžava polu-raspad obuhvata D376V/N434H. U određenim otelotvorenjima, mutacija koja produžava polu-raspad obuhvata T307 A/E380A/N434A.
[0630] U određenim otelotvorenjima, vezujući protein uključuje Fc deo koji sadrži supstitucione mutacije: M428L/N434S i G236A/A330L/I332E. U određenim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen uključuje Fc deo koji sadrži supstitucione mutacije: M428L/N434S i G236A/S239D/A330L/1332E.
[0632] U određenim otelotvorenjima, vezujući protein uključuje Fc deo koji sadrži supstitucione mutacije: G236A/A330L/I332E. U određenim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen uključuje Fc deo koji sadrži supstitucione mutacije: G236A/S239D/A330L/I332E.
[0634] Alternativno ili dodatno, Fc deo vezujućeg proteina iz predmetnog obelodanjivanja može da sadrži bar deo za koji je u struci poznato da je potreban za vezivanje za protein A; i/ili Fc deo antitela iz predmetnog obelodanjivanja sadrži bar deo Fc molekula za koji je u struci poznato da je potreban za vezivanje za protein G. U nekim otelotvorenjima, zadržana funkcija obuhvata eliminaciju HBsAg i HBVg. Shodno tome, u određenim otelotvorenjima, Fc deo sadrži bar deo za koji je u struci poznato da je potreban za vezivanje za FcγR. Kao što je iznad navedeno, Fc deo može stoga bar da obuhvati (i) donje mesto šarnira nativnog IgG Fc, posebno aminokiselinske ostatke L, L, G i G (234-237, EU numeracija), i (ii) susedni region CH2 domena nativnog IgG Fc, posebno petlju i lance u gornjem CH2 domenu pored donjeg regiona šarnira, npr., u regionu P331, na primer region od najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 uzastopnih aminokiselina u gornjem CH2 domenu nativnog IgG Fc oko P331, npr., između aminokiselina 320 i 340 (EU numeracija) nativnog IgG Fc.
[0636] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein prema predmetnom obelodanjivanju sadrži Fc region. Kako se ovde koristi, termin „Fc region“ odnosi se na deo imunoglobulina formiran od strane dva ili više Fc delova teških lanaca antitela. Na primer, Fc region može biti monomerni ili „jednolančani“ Fc region (tj., scFc region). Jednolančani Fc regioni se sastoje od Fc delova povezanih unutar jednog polipeptidnog lanca (npr., kodiranih u jednoj susednoj sekvenci nukleinske kiseline). Primeri scFc regiona su obelodanjeni u WO 2008/143954 A2, i uključeni su ovde referencom. Fc region može biti ili obuhvatati dimerni Fc region. „Dimerni Fc region“ ili „dcFc“ odnosi se na dimer formiran od strane Fc delova dva odvojena teška lanca imunoglobulina. Dimerni Fc region može biti homodimer od dva identična Fc dela (npr., Fc region prirodnog imunoglobulina) ili heterodimer od dva neidentična Fc dela (npr., jedan Fc monomer dimernog Fc regiona sadrži najmanje jednu modifikaciju aminokiseline (npr., supstituciju, deleciju, inserciju ili hemijsku modifikaciju) koja nije prisutna u drugom Fc monomeru, ili jedan Fc monomer može biti skraćen u poređenju sa drugim).
[0638] Trenutno obelodanjeni Fc delovi mogu da sadrže Fc sekvence ili regione iste ili različite klase i/ili podklase. Na primer, Fc delovi mogu biti izvedeni iz imunoglobulina (npr., ljudskog imunoglobulina) podklase IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4, ili iz bilo koje njihove kombinacije. U određenim otelotvorenjima, Fc delovi Fc regiona su iste klase i podklase. Međutim, Fc region (ili jedan ili više Fc delova Fc regiona) može takođe biti himeran, pri čemu himerni Fc region može da sadrži Fc delove izvedene iz različitih klasa i/ili podklasa imunoglobulina. Na primer, najmanje dva Fc dela dimernog ili jednolančanog Fc regiona mogu biti iz različitih klasa i/ili podklasa imunoglobulina. U određenim otelotvorenjima, dimerni Fc region može da sadrži sekvence iz dva ili više različitih izotipova ili podklasa; npr., SEEDbody („domeni projektovani razmenom lanaca“) (videti Davis, i dr., Protein Eng. Des. Sel.23(4):195 (2010)).
[0641] 4
[0642] Dodatno ili alternativno, himerni Fc regioni mogu da sadrže jedan ili više himernih Fc delova. Na primer, himerni Fc region ili deo može da sadrži jedan ili više delova izvedenih iz imunoglobulina prve podklase (npr., podklase IgG1, IgG2 ili IgG3), dok je ostatak Fc regiona ili dela druge podklase. Na primer, Fc region ili deo Fc polipeptida može da sadrži CH2 i/ili CH3 domen izveden iz imunoglobulina prve podklase (npr., podklase IgG1, IgG2 ili IgG4) i zglobni region iz imunoglobulina druge podklase (npr., podklase IgG3). Na primer, Fc region ili deo može da sadrži zglobni i/ili CH2 domen izveden iz imunoglobulina prve podklase (npr., podklase IgG4) i CH3 domen iz imunoglobulina druge podklase (npr., podklase IgG1, IgG2 ili IgG3). Na primer, himerni Fc region može da sadrži Fc deo (npr., kompletan Fc deo) iz imunoglobulina za prvu podklasu (npr., IgG4 podklasu) i Fc deo iz imunoglobulina druge podklase (npr., IgG1, IgG2 ili IgG3 podklasu). Na primer, Fc region ili deo mogu da sadrže CH2 domen iz IgG4 imunoglobulina i CH3 domen iz IgG1 imunoglobulina. Na primer, Fc region ili deo mogu da sadrže CH1 domen i CH2 domen iz IgG4 molekula i CH3 domen iz IgG1 molekula. Na primer, Fc region ili deo mogu da sadrže deo CH2 domena iz određene podklase antitela, npr., EU pozicije 292-340 CH2 domena. Na primer, Fc region ili deo mogu da sadrže aminokiseline na pozicijama 292-340 CH2 izvedenog iz IgG4 dela i ostatka CH2 izvedenog iz IgG1 dela (alternativno, 292-340 CH2 mogu biti izvedeni iz IgG1 dela, a ostatak CH2 izveden iz IgG4 dela).
[0644] Štaviše, Fc region ili deo mogu (dodatno ili alternativno) na primer da sadrže himerni region šarke. Na primer, himerna šarka može biti izveden, npr., delimično, iz molekula IgG1, IgG2 ili IgG4 (npr., gornja i donja srednja sekvenca šarke) i, delimično, iz molekula IgG3 (npr., srednja sekvenca šarke). U drugom primeru, Fc region ili deo mogu da sadrže himernu šarku izveden, delimično, iz molekula IgG1 i, delimično, iz molekula IgG4. U drugom primeru, himernu šarku može da sadrži gornje i donje zglobne domene iz molekula IgG4 i srednji zglobni domen iz molekula IgG1. Takva himerna šarka može biti napravljen, na primer, uvođenjem prolinske supstitucije (Ser228Pro) na EU poziciji 228 u srednjem zglobnom domenu IgG4 zglobnog regiona. U nekim drugim otelotvorenjima, himerna šarka može da sadrži aminokiseline na EU pozicijama 233-236 koje su iz IgG2 antitela i/ili Ser228Pro mutacije, gde su preostale aminokiseline šarnira iz IgG4 antitela (npr., himerni šarnir sekvence ESKYGPCPCPPAPPVAGP (SEQ ID NO:105)). Dalja himerna šarka, koji se mogu koristiti u Fc delu antitela prema predmetnom obelodanjivanju, opisani su u US 2005/0163783 A1.
[0646] U nekim otelotvorenjima, Fc deo ili Fc region sadrži ili se sastoji od aminokiseline izvedene iz sekvence ljudskog imunoglobulina (npr., iz Fc regiona ili Fc dela iz molekula ljudskog IgG). Međutim, polipeptidi mogu da sadrže jednu ili više aminokiselina iz druge vrste sisara. Na primer, Fc deo primata ili mesto vezivanja primata mogu biti uključeni u predmetne polipeptide. Alternativno, jedna ili više mišjih aminokiselina mogu biti prisutne u Fc delu ili u Fc regionu.
[0648] c. Antitela protiv HBC34 i HBC24
[0650] U određenim otelotvorenjima, anti-HBV antitelo je HBC34 ili njegova inženjerisana varijanta, ili je HBC24 ili njegova inženjerisana varijanta. HBC34 i HBC24 su ljudska antitela protiv HBsAg sa visokom neutrališućom aktivnošću. HBC34 se vezuje za antigensku petlju HBsAg sa visokim afinitetom (u pM opsegu), prepoznaje svih 10 HBV genotipova i 18 mutanata i vezuje se za sferne SVP-ove sa niskom stehiometrijom. Aktivnost HBC34, merena dijagnostički imunološkim testom, je 5000 IU/mg. Poređenja radi, aktivnost HBIG je ~ 1 IU/mg.
[0652] Kako je ovde navedeno, termini „antitelo na HBC34“ i „antitela na HBC“ mogu da uključuju antitelo divljeg tipa HBC34 ili njegovu inženjerski stvorenu varijantu (npr., HBC34 i varijante HBC34 opisane u Tabeli 3), osim ako nije drugačije naznačeno.
[0654] Tabela 3 prikazuje aminokiselinske sekvence CDR-ova, varijabilnih regiona teškog lanca (V<H>) i varijabilnih regiona lakog lanca (V<L>) HBC34 i njegovih inženjerskih varijanti
[0655] („HBC34v7,“ HBC34v23,“ „HBC34v31,“ „HBC34v32,“ „HBC34v33,“ „HBC34v34“ i „HBC34v35“), kao i „HBC24“. Takođe su prikazane aminokiselinske sekvence teškog lanca (HC) i lakog lanca (LC) pune dužine primernih antitela predmetnog obelodanjivanja.
[0657] Tabela 3. Sekvence za HBC34 i HBC24 antitela.
[0659]
[0663] 4
[0664]
[0666] 4
[0669] 4
[0670]
[0673] 1
[0676] 2
[0677]
[0680] 4
[0681]
[0682]
[0683]
[0684] _ _
[0685] _ _
[0688] U određenim otelotvorenjima, antitelo predmetnog obelodanjivanja je HBC34 ili neprirodna varijanta HBC34 antitela. Primeri neprirodnih varijanti HBC34 uključuju, na primer, „HBC34v7“, HBC34v23“, „HBC34v31“, „HBC34v32“, „HBC34v33“, „HBC34v34“ i „HBC34v35“.
[0690] U određenim otelotvorenjima, anti-HBV antitelo sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci kao što je navedeno u Tabeli 3. U određenim otelotvorenjima, antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, prema ovom otkriću, sadrži aminokiselinski sekvencu koja ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 92%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sa CDR sekvencom, V<H>sekvencom, V<L>sekvencom, HC sekvencom, i/ili LC sekvencu kao što je prikazano u Tabeli 3. U bilo kom od sada obelodanjenih otelotvorenja, antitelo ili fragment koji vezuje antigen može da sadrži CDR, V<H>, V<L>, HC i/ili LC sekvencu kao što je navedeno u Tabeli 3.
[0692] U nekim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži: (i) CDRH1, CDRH2 i CDRH3 aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NOs:44, 45 ili 46 i 47, respektivno; i (ii) CDRL1, CDRL2 i CDRL3 aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NOs:48, 49 ili 50 i 51 ili 52, respektivno.
[0694] Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, CDRH1, CDRH2 i CDRH3 su prema SEQ ID NOs:44, 45 i 47, respektivno. U nekim otelotvorenjima, CDRH1, CDRH2 i CDRH3 su prema SEQ ID NOs:44, 46 i 47, respektivno. U nekim otelotvorenjima, CDRL1, CDRL2 i CDRL3 su prema SEQ ID NOs:48, 49 i 51, respektivno. U nekim otelotvorenjima, CDRL1, CDRL2 i CDRL3 su prema SEQ ID NOs:48, 49 i 52, respektivno. U nekim otelotvorenjima, CDRL1, CDRL2 i CDRL3 su prema SEQ ID NOs:48, 50 i 51, respektivno. U nekim otelotvorenjima, CDRL1, CDRL2 i CDRL3 su prema SEQ ID NOs:48, 50 i 52, respektivno.
[0696] [0247] Razume se da antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja može da sadrži bilo koju kombinaciju aminokiselinskih sekvenci CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3 prema SEQ ID NOs:44-52.
[0697] U određenim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži: aminokiselinske sekvence CDRH1, CDRH2 i CDRH3 prema SEQ ID NOs:44, 45 i 47, respektivno; i aminokiselinske sekvence CDRL1, CDRL2 i CDRL3 prema SEQ ID NOs:48, 49 i 51, respektivno. U drugim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži: aminokiselinske sekvence CDRH1, CDRH2 i CDRH3 prema SEQ ID NOs:44, 45 i 47, respektivno; i aminokiselinske sekvence CDRL1, CDRL2 i CDRL3 prema SEQ ID NOs:48, 49 i 52, respektivno.
[0698] U određenim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži: (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO:55-69; i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:53 ili 54.
[0699] U određenim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži:
[0700] (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO:55-63; i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:53.
[0701] U određenim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži:
[0702] (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO: 55-57 ili 64-69; i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:54.
[0703] U određenim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži:
[0704] (i) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:55, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:53;
[0705] (ii) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:55, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:54;
[0706] (iii) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:56, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:53;
[0707] (iv) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:56, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:54;
[0708] (v) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID
[0711] 1
[0712] NO:57, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:53;
[0714] (vi) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:57, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:54;
[0716] (vii) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:58, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:53;
[0718] (viii) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:59, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:53;
[0720] (ix) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:60, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:53;
[0722] (x) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:61, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:53;
[0724] (xi) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:62, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:53;
[0726] (xii) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:63, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:53;
[0728] (xiii) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:64, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:54;
[0730] (xiv) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:65, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:54;
[0732] (xv) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:66, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci
[0735] 2
[0736] navedenoj u SEQ ID NO:54;
[0737] (xvi) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:67, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:54;
[0738] (xvii) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:68, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:54; ili
[0739] (xviii) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:69, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:54.
[0740] U određenim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži:
[0741] (a) laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci kao što je navedeno u SEQ ID NO:73, i (b) teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO:70-72 i 97; ili (a) laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:74, i (b) teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO:70-72 i 97; ili
[0742] (a) laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO:83-95, i (b) teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO:70-72, 97 i 98.
[0743] U posebnim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži (a) laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:73, i (b) teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:70.
[0744] U posebnim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži (a) laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:73, i (b) teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:71.
[0745] U drugim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži (a) laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:73, i (b) teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:72.
[0746] U drugim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži (a) laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:73, i (b) teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:97.
[0747] U još nekim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži (a) laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:74, i (b) teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:70.
[0748] U još nekim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži (a) laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:74, i (b) teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:71.
[0749] [0260] U još nekim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži (a) laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:74, i (b) teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:72.
[0750] U još nekim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži (a) laki lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:74, i (b) teški lanac koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:97.
[0751] U određenim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3 koji imaju aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO:77-82, respektivno. U određenim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži (a) aminokiselinska sekvenca varijabilnog domena lakog lanca (VL) prema SEQ ID NO:76; i (b) aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (V<H>) prema SEQ ID NO:75.
[0752] U određenim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog obelodanjivanja sadrži (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:76, i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:75. d. Farmaceutski sastavi
[0753] U nekim otelotvorenjima, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen kombinovane terapije je obezbeđen kao farmaceutski sastav, koji uključuje anti-HBV antitelo i opciono, farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim otelotvorenjima, sastav može da sadrži anti-HBV antitelo, pri čemu antitelo može da čini najmanje 50% po masi (npr., 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) ukupnog proteina u sastavu. U takvom sastavu, antitelo može biti u prečišćenom obliku.
[0754] Farmaceutski sastavi anti-HBV antitela mogu da sadrže antimikrobno sredstvo, posebno ako su pakovani u formatu višestrukih doza. Mogu da sadrže deterdžent, npr. Tween (polisorbat), kao što je Tween 80. Kada su prisutni, deterdženti su obično prisutni u niskim količinama, npr., manje od 0,01%. Sastavi takođe mogu da sadrže natrijumove soli (npr., natrijum hlorid) za toničnost. Na primer, u nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži NaCl u koncentraciji od 10±2 mg/ml.
[0755] Dalje, farmaceutski sastavi mogu da sadrže šećerni alkohol (npr., manitol) ili disaharid (npr., saharozu ili trehalozu), npr., oko 15-30 mg/ml (npr., 25 mg/ml), posebno ako treba da se liofilizuju ili ako sadrže materijal koji je rekonstituisan iz liofilizovanog materijala. pH vrednost sastava za liofilizaciju može se podesiti na između 5 i 8, ili između 5,5 i 7, ili oko 6,1 pre liofilizacije.
[0756] Sastav antitela predmetnog obelodanjivanja može takođe da sadrži jedno ili više imunoregulatornih sredstava. U nekim otelotvorenjima, jedno ili više imunoregulatornih sredstava uključuje(ju) adjuvans.
[0757] Postupci pripreme farmaceutskog sastava anti-HBV antitela mogu da uključuju korake: (i) pripremu antitela; i (ii) mešanje prečišćenog antitela sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.
[0758] IV. Postupci lečenja korišćenjem kombinovane terapije
[0759] U nekim otelotvorenjima, predmetno obelodanjivanje pruža postupke za lečenje HBV infekcije ili bolesti povezane sa virusom hepatitisa B.
[0760] Kako se ovde koristi, „ispitanik“ je životinja, kao što je sisar, uključujući bilo kog sisara koji može biti inficiran sa HBV, npr., primat (kao što je čovek, neljudski primat, npr., majmun ili šimpanza), ili životinja koja se smatra prihvatljivim kliničkim modelom HBV infekcije, HBV-AAV mišji model (videti, npr., Yang, i dr., Cell and Mol Immunol 11:71 (2014)) ili HBV 1,3xfs transgeni mišji model (Guidotti, i dr., J. Virol.69:6158 (1995)). U nekim otelotvorenjima, ispitanik ima infekciju virusom hepatitisa B (HBV). U nekim drugim otelotvorenjima, ispitanik ima i infekciju virusom hepatitisa B (HBV) i infekciju virusom hepatitisa D (HDV). U nekim drugim otelotvorenjima, ispitanik je čovek, kao što je čovek koji ima HBV infekciju, posebno hroničnu infekciju virusom hepatitisa B (CHBV).
[0761] Kako se ovde koriste, termini „lečenje“ ili „tretman“ odnose se na koristan ili željeni rezultat, uključujući, ali ne ograničavajući se na, ublažavanje ili poboljšanje jednog ili više znakova ili simptoma povezanih sa neželjenom ekspresijom HBV gena ili HBV replikacijom, npr., prisustvo serumske ili jetrene HBV cccDNK, prisustvo serumske HBV DNK, prisustvo serumskog ili jetrenog HBV antigena, npr., HBsAg ili HBeAg, povišen ALT, povišen AST (normalni opseg se obično smatra oko 10 do 34 U/L), odsustvo ili nizak nivo anti-HBV antitela; oštećenje jetre; cirozu; delta hepatitis; akutni hepatitis B; akutni fulminantni hepatitis B; hroničan hepatitis B; fibrozu jetre; završnu fazu bolesti jetre; hepatocelularni karcinom;
[0764] 4
[0765] sindrom sličan serumskoj bolesti; anoreksiju; mučninu; povraćanje, nisku temperaturu; mijalgiju; umor; poremećena oštrina ukusa i osećaj mirisa (odbojnost prema hrani i cigaretama); ili bol u gornjem desnom kvadrantu i epigastrijumu (povremeni, blagi do umereni); hepatičnu encefalopatiju; somnolenciju; poremećaji spavanja; mentalna konfuzija; koma; asciti; gastrointestinalno krvarenje; koagulopatija; žutica; hepatomegalija (blago uvećana, mekana jetra); splenomegalija; palmarni eritem; paukoliki angiomi; propadanje mišića; paukoliki nevusi; vaskulitis: varicealno krvarenje; periferni edem; ginekomastija; atrofija testisa; abdominalne kolateralne vene (glava meduze); nivoi ALT viši od nivoa AST; povišeni nivoi gama-glutamil transpeptidaze (GGT) (normalni raspon se obično smatra oko 8 do 65 U/L) i alkalne fosfataze (ALP) (normalni raspon se obično smatra oko 44 do 147 IU/L (internacionalnih jedinica po litru), ne više od 3 puta od gornje granice normalne vrednosti); blago niski nivoi albumina; povišeni nivoi gvožđa u serumu; leukopenija (tj., granulocitopenija); limfocitoza; povećana brzina sedimentacije eritrocita (SE); skraćeno preživljavanje crvenih krvnih zrnaca; hemoliza; trombocitopenija; produženje međunarodnog normalizovanog odnosa (INR); prisustvo serumskog ili jetrenog HBsAg, HBeAg, antitela na hepatitis B (anti-HBc), imunoglobulina M (IgM); površinskog antitela na hepatitis B (anti-HBs), antitela na hepatitis B e (anti-HBe) ili HBV DNK; povišeni nivoi bilirubina; hiperglobulinemija; prisustvo tkivno nespecifičnih antitela, kao što su antitela protiv glatkih mišića (ASMA) ili antinuklearna antitela (ANA) (10-20%); prisustvo tkivno specifičnih antitela, kao što su antitela protiv štitne žlezde (10-20%); povišeni nivoi reumatoidnog faktora (RF); nizak broj trombocita i belih krvnih zrnaca; lobularni, sa degenerativnim i regenerativnim hepatocelularnim promenama i pratećom upalom; i pretežno centrilobularna nekroza, bez obzira da li je detektovana ili ne. Verovatnoća razvoja, npr., fibroze jetre, smanjena je, na primer, kada osoba koja ima jedan ili više faktora rizika za fibrozu jetre, npr., hroničnu infekciju hepatitisom B, ili ne razvije fibrozu jetre ili razvije fibrozu jetre sa manjom težinom u odnosu na populaciju koja ima iste faktore rizika i ne prima lečenje kao što je ovde opisano. „Lečenje“ takođe može značiti produženje preživljavanja u poređenju sa očekivanim preživljavanjem u odsustvu lečenja.
[0767] Kako se ovde koriste, termini „sprečavanje“ ili „prevencija“ odnose se na neuspeh u razvoju bolesti, poremećaja ili stanja, ili smanjenje razvoja znaka ili simptoma povezanog sa takvom bolešću, poremećajem ili stanjem (npr., za klinički relevantnu količinu), ili ispoljavanje odloženih znakova ili simptoma (npr., za dane, nedelje, mesece ili godine). Prevencija može zahtevati primenu više od jedne doze.
[0769] U nekim otelotvorenjima, lečenje HBV infekcije rezultira „funkcionalnim izlečenjem“ hepatitisa B. Kako se ovde koristi, funkcionalno izlečenje se shvata kao klirens cirkulišućeg HBsAg i može biti praćeno konverzijom u stanje u kojem HBsAg antitela postaju detektovana korišćenjem klinički relevantnog testa. Na primer, detektovana antitela mogu uključivati signal veći od 10 mIU/ml mereno hemiluminescentnim imunotestom mikročestica (CMIA) ili bilo kojim drugim imunotestom. Funkcionalno izlečenje ne zahteva klirens svih replikativnih oblika HBV (npr., cccDNK iz jetre). Serokonverzija anti-HBs se javlja spontano kod oko 0,2-1% hronično inficiranih pacijenata godišnje. Međutim, čak i nakon serokonverzije anti-HBs, često se primećuje perzistencija HBV niskog nivoa decenijama, što ukazuje na to da dolazi do funkcionalnog, a ne potpunog izlečenja. Bez vezivanja za određeni mehanizam, imuni sistem može biti u stanju da drži HBV pod kontrolom u uslovima u kojima je postignuto funkcionalno izlečenje. Funkcionalno izlečenje dozvoljava prekid bilo kog lečenja HBV infekcije. Međutim, podrazumeva se da „funkcionalno izlečenje“ HBV infekcije možda neće biti dovoljno za sprečavanje ili lečenje bolesti ili stanja koja su rezultat HBV infekcije, npr., fibroze jetre, HCC ili ciroze. U nekim specifičnim ostvarenjima, „funkcionalno izlečenje“ može se odnositi na trajno smanjenje serumskog HBsAg, kao što je <1 IU/mL, tokom najmanje 3 meseca, najmanje 6 meseci ili najmanje godinu dana nakon početka režima lečenja ili završetka režima lečenja.
[0771] Kako se ovde koristi, termin „bolest povezana sa virusom hepatitisa B“ ili „bolest povezana sa HBV“ je bolest ili poremećaj koji je uzrokovan ili povezan sa HBV infekcijom ili replikacijom. Termin „bolest povezana sa HBV“ uključuje bolest, poremećaj ili stanje koje bi imalo koristi od smanjenja ekspresije ili replikacije HBV gena. Neograničavajući primeri bolesti povezanih sa HBV uključuju, na primer, infekciju virusom hepatitisa D, delta hepatitis, akutni hepatitis B; akutni fulminantni hepatitis B; hroničan hepatitis B; fibrozu jetre; završnu fazu bolesti jetre; i hepatocelularni karcinom.
[0773] U nekim otelotvorenjima, bolest povezana sa HBV je infekcija virusom hepatitisa D. Virus hepatitisa D ili virus hepatitisa delta (HDV) je ljudski patogen. Međutim, virus je defektan i zavisi od obaveznih pomoćnih funkcija koje obezbeđuje virus hepatitisa B (HBV) za prenos; zaista, HDV zahteva povezanu ili postojeću HBV infekciju da bi postao zarazan i napredovao, posebno virusnu ovojnicu koja sadrži površinski antigen hepatitisa B. HDV može dovesti do teških akutnih i hroničnih oblika bolesti jetre u vezi sa HBV.
[0774] Infekcija hepatitisom D ili delta hepatitis je visoko endemska u nekoliko afričkih zemalja, regionu Amazona i na Bliskom istoku, dok je njena učestalost niska u industrijalizovanim zemljama, osim u Mediteranu.
[0776] Prenos HDV može se dogoditi ili putem simultane infekcije sa HBV (koinfekcija) ili superponiranjem na hronični hepatitis B ili stanje nosioca hepatitisa B (superinfekcija). I superinfekcija i koinfekcija sa HDV obično rezultiraju težim komplikacijama u poređenju sa infekcijom samo sa HBV. Ove komplikacije uključuju veću verovatnoću otkazivanja jetre kod akutnih infekcija i brzu progresiju do ciroze jetre, sa povećanom šansom za razvoj raka jetre kod hroničnih infekcija. U kombinaciji sa virusom hepatitisa B, hepatitis D ima najveću stopu smrtnosti od svih hepatitis infekcija, sa 20%.
[0778] U nekim slučajevima, bolest povezana sa HBV je akutni hepatitis B. Akutni hepatitis B uključuje upalu jetre koja traje manje od šest meseci. Tipični simptomi akutnog hepatitisa B su umor, anoreksija, mučnina i povraćanje. Često se primećuju veoma visoke vrednosti aminotransferaza (>1000 U/L) i hiperbilirubinemija. Teški slučajevi akutnog hepatitisa B mogu brzo napredovati do akutnog otkazivanja jetre, obeleženog lošom sintetičkom funkcijom jetre. Ovo se često definiše kao protrombinsko vreme (PT) od 16 sekundi ili međunarodni normalizovani odnos (INR) od 1,5 u odsustvu prethodne bolesti jetre. Akutni hepatitis B može evoluirati u hronični hepatitis B.
[0780] U nekim otelotvorenjima, bolest povezana sa HBV je hronični hepatitis. Hronični hepatitis B (HHB) uključuje upalu jetre koja traje duže od šest meseci. Subjekti sa HHB su HBsAg pozitivni i imaju ili visoku viremiju (≥10⁴ kopija HBV-DNK / ml krvi) ili nisku viremiju (<10⁴ kopija HBV-DNK / ml krvi). U određenim otelotvorenjima, ispitanici su inficirani HBV najmanje pet godina. U određenim otelotvorenjima, ispitanici su inficirani HBV najmanje deset godina. U određenim otelotvorenjima, ispitanici su se inficirali HBV pri rođenju. Ispitanici sa hroničnom bolešću hepatitisa B mogu biti imunotolerantni ili imati neaktivnu hroničnu infekciju bez ikakvih dokaza o aktivnoj bolesti, a takođe su i asimptomatski. Pacijenti sa hroničnim aktivnim hepatitisom, posebno tokom replikativnog stanja, mogu imati simptome slične onima kod akutnog hepatitisa. Ispitanici sa hroničnim hepatitisom B mogu imati aktivnu hroničnu infekciju praćenu nekroinflamatornom bolešću jetre, povećan promet hepatocita u odsustvu vidljive nekroinflamacije ili neaktivnu hroničnu infekciju bez ikakvih dokaza o aktivnoj bolesti, a takođe su i asimptomatski.
[0781] Perzistencija HBV infekcije kod ispitanika sa CHB je rezultat cccHBV DNK. U nekim otelotvorenjima, ispitanik sa CHB je HBeAg pozitivan. U nekim drugim otelotvorenjima, ispitanik sa CHB je HBeAg negativan. Ispitanici sa CHB imaju nivo serumske HBV DNK manji od 105 i trajno povišene transaminaze, na primer ALT, AST i gama-glutamil transferaze. Ispitanik sa CHB može imati rezultat biopsije jetre manji od 4 (npr., nekroinflamatorni rezultat).
[0783] U nekim otelotvorenjima, bolest povezana sa HBV je akutni fulminantni hepatitis B. Osoba koja ima akutni fulminantni hepatitis B ima simptome akutnog hepatitisa i dodatne simptome konfuzije ili kome (zbog nesposobnosti jetre da detoksikuje hemikalije) i modrice ili krvarenje (zbog nedostatka faktora zgrušavanja krvi).
[0785] Ispitanici koji imaju HBV infekciju, npr., HB, mogu razviti fibrozu jetre. Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, bolest povezana sa HBV je fibroza jetre. Fibroza jetre, ili ciroza, histološki se definiše kao difuzni hepatički proces koji karakteriše fibroza (višak vlaknastog vezivnog tkiva) i konverzija normalne arhitekture jetre u strukturno abnormalne čvoriće.
[0787] Ispitanici koji imaju HBV infekciju, npr., HB, mogu razviti terminalnu bolest jetre. Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, bolest povezana sa HBV je terminalna bolest jetre. Na primer, fibroza jetre može napredovati do tačke u kojoj telo više neće moći da kompenzuje, npr. smanjenu funkciju jetre, kao rezultat fibroze jetre (tj., dekompenzovane jetre), i rezultirati, npr., mentalnim i neurološkim simptomima i otkazivanjem jetre.
[0789] Ispitanici koji imaju HBV infekciju, npr., CHB, mogu razviti hepatocelularni karcinom (HCC), takođe poznat kao maligni hepatom. Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, bolest povezana sa HBV je HCC. HCC se obično razvija kod ispitanika sa CHB i može biti fibrolamelarni, pseudoglandularni (adenoidni), pleomorfni (džinovski ćelijski) ili bistri ćelijski.
[0791] „Poremećaj povezan sa HDV-om“ ili poremećaj povezan sa virusom hepatitisa D“ je bolest ili poremećaj povezan sa ekspresijom HDV-a. Primeri poremećaja povezanih sa HDV-om uključuju infekciju virusom hepatitisa B, akutni hepatitis B, akutni hepatitis D; akutni fulminantni hepatitis D; hronični hepatitis D; fibrozu jetre; završnu fazu bolesti jetre; i hepatocelularni karcinom.
[0793] „Terapeutski efikasna količina“, kako se ovde koristi, podrazumeva količinu RNKi sredstva ili antiHBV antitela koja je, kada se primeni pacijentu za lečenje ispitanika koji ima HBV infekciju ili bolest povezanu sa HBV, dovoljna da sprovede lečenje bolesti (npr., smanjenjem ili održavanjem postojeće bolesti ili jednog ili više simptoma bolesti). „Terapeutski efikasna količina“ može da varira u zavisnosti od RNKi sredstva i/ili anti-HBV antitela, načina primene, bolesti i njene težine, kao i istorije, starosti, težine, porodične istorije, genetskog sastava, stadijuma patoloških procesa posredovanih ekspresijom HBV gena, vrsta prethodnih ili istovremenih tretmana, ako ih ima, i drugih individualnih karakteristika pacijenta koji se leči. Terapeutski efikasna količina može zahtevati primenu više od jedne doze.
[0795] „Terapeutski efikasna količina“ takođe uključuje količinu RNKi sredstva ili anti-HBV antitela koja proizvodi željeni efekat uz razuman odnos koristi i rizika koji se primenjuje na bilo koji tretman. Terapeutski agensi (npr., RNKi sredstva, anti-HBV antitela) koji se koriste u postupcima predmetnog obelodanjivanja mogu se primenjivati u dovoljnoj količini da bi se postigao razuman odnos koristi i rizika koji se primenjuje na takav tretman.
[0797] Termin „uzorak“, kako se ovde koristi, obuhvata kolekciju sličnih tečnosti, ćelija ili tkiva izolovanih od ispitanika, kao i tečnosti, ćelije ili tkiva prisutnih unutar subjekta. Primeri bioloških tečnosti uključuju krv, serum i serozne tečnosti, plazmu, limfu, urin, pljuvačku i slično. Uzorci tkiva mogu uključivati uzorke iz tkiva, organa ili lokalizovanih regiona. Na primer, uzorci mogu biti izvedeni iz određenih organa, delova organa ili tečnosti ili ćelija unutar tih organa. U određenim otelotvorenjima, uzorci mogu biti izvedeni iz jetre (npr., cela jetra ili određeni segmenti jetre ili određene vrste ćelija u jetri, kao što su, npr., hepatociti). U određenim otelotvorenjima, „uzorak izveden od ispitanika“ odnosi se na krv, ili plazmu ili serum dobijen iz krvi uzete od ispitanika. U daljim otelotvorenjima, „uzorak izveden od ispitanika“ odnosi se na tkivo jetre (ili njegove podkomponente) ili tkivo krvi (ili njegove podkomponente, npr., serum) izvedeno od ispitanika.
[0799] Neka otelotvorenja predmetnog obelodanjivanja pružaju postupke lečenja hronične HBV infekcije ili bolesti povezane sa HBV kod ispitanika kome je to potrebno, a koje obuhvataju: (i) davanje ispitaniku sredstva koje smanjuje HBV antigensko opterećenje; i (ii) davanja ispitaniku anti-HBV antitela. U određenim otelotvorenjima, sredstvo koje smanjuje HBV antigensko opterećenje se primenjuje pre anti-HBV antitela. U određenim otelotvorenjima, primena sredstva koje smanjuje HBV antigensko opterećenje pre anti-HBV antitela dovodi do smanjenja virusnog opterećenja kada se anti-HBV antitelo primenjuje. U određenim otelotvorenjima, terapeutski efikasna količina anti-HBV antitela kombinovane terapije je manja od terapeutski efikasne količine anti-HBV antitela koje se primenjuje kada sredstvo koje smanjuje HBV antigensko opterećenje nije primenjeno ispitaniku (npr., kada se anti-HBV antitelo primenjuje samo kao monoterapija). U nekim otelotvorenjima, sredstvo koje smanjuje antigensko opterećenje HBV-om je RNKi sredstvo (npr., siRNK) koje inhibira ekspresiju HBV transkripta.
[0801] U određenim otelotvorenjima, predmetno obelodanjivanje pruža postupak lečenja hronične HBV infekcije ili bolesti povezane sa HBV-om kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata: davanje sredstva ispitaniku koje smanjuje HBV antigensko opterećenje; i davanje anti-HBV antitela ispitaniku. i dalje obuhvata merenje količine HBsAg prisutne u uzorku krvi ispitanika pre i posle davanja sredstva koje smanjuje HBV antigensko opterećenje, pri čemu smanjenje HBsAg ukazuje na smanjenu ekspresiju najmanje jednog HBV gena.
[0803] U određenim otelotvorenjima, predmetno obelodanjivanje pruža sredstvo koje smanjuje HBV antigensko opterećenje za upotrebu u lečenju hronične HBV infekcije ili bolesti povezane sa HBV kod ispitanika, pri čemu se ispitaniku naknadno daje anti-HBV antitelo. U određenim drugim otelotvorenjima, predmetno obelodanjivanje pruža anti-HBV antitelo za upotrebu u lečenju hronične HBV infekcije ili bolesti povezane sa HBV kod ispitanika, a ispitaniku je prethodno dato sredstvo koje smanjuje HBV antigensko opterećenje. U daljim otelotvorenjima, ekspresija najmanje jednog HBV gena je smanjena nakon primene sredstva koje smanjuje HBV antigensko opterećenje, a anti-HBV antitelo se primenjuje kod ispitanika kada je ekspresija najmanje jednog HBV gena smanjena.
[0805] U određenim otelotvorenjima, predmetno obelodanjivanje pruža upotrebu sredstva koje smanjuje HBV antigensko opterećenje i/ili anti-HBV antitela u proizvodnji leka za lečenje hronične HBV infekcije ili bolesti povezane sa HBV.
[0807] [0291] Neka otelotvorenja predmetnog obelodanjivanja pružaju postupke lečenja hronične HBV infekcije ili bolesti povezane sa HBV kod ispitanika kome je to potrebno, a koje obuhvataju: (i) davanja ispitaniku inhibitora ekspresije HBV gena; i (ii) davanja ispitaniku anti-HBV antitela. U određenim otelotvorenjima, inhibitor ekspresije HBV gena se primenjuje pre anti-HBV antitela. U određenim otelotvorenjima, primena inhibitora ekspresije HBV gena pre anti-HBV antitela dovodi do smanjenja virusnog opterećenja kada se primenjuje anti-HBV antitelo. U određenim otelotvorenjima, terapeutski efikasna količina anti-HBV antitela kombinovane terapije je manja od terapeutski efikasne količine anti-HBV antitela koje se primenjuje kada inhibitor ekspresije HBV gena nije primenjen na ispitaniku (npr., kada se anti-HBV antitelo primenjuje samo kao monoterapija).
[0808] U određenim otelotvorenjima, ekspresija najmanje jednog HBV gena je smanjena nakon primene inhibitora ekspresije HBV gena, a anti-HBV antitelo se primenjuje na ispitaniku kada je ekspresija najmanje jednog HBV gena smanjena. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedan HBV gen je HBV X gen i/ili HBsAg.
[0809] U određenim otelotvorenjima, predmetno obelodanjivanje pruža postupak lečenja hronične HBV infekcije ili bolesti povezane sa HBV-om kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata: davanje ispitaniku inhibitora ekspresije HBV gena; i davanje anti-HBV antitela ispitaniku. i dalje obuhvata merenje količine HBsAg prisutne u uzorku krvi subjekta pre i posle primene inhibitora ekspresije HBV, gde smanjenje HBsAg ukazuje na smanjenu ekspresiju najmanje jednog HBV gena.
[0810] U određenim otelotvorenjima, predmetno obelodanjivanje pruža inhibitor ekspresije HBV gena za upotrebu u lečenju hronične HBV infekcije ili bolesti povezane sa HBV kod ispitanika, gde se ispitaniku naknadno primenjuje anti-HBV antitelo. U određenim drugim otelotvorenjima, predmetno obelodanjivanje pruža anti-HBV antitelo za upotrebu u lečenju hronične HBV infekcije ili bolesti povezane sa HBV kod ispitanika, a ispitaniku je prethodno primenjivan inhibitor ekspresije gena. U daljim otelotvorenjima, ekspresija najmanje jednog HBV gena je smanjena nakon primene inhibitora ekspresije HBV gena, a anti-HBV antitelo se primenjuje ispitaniku kada je ekspresija najmanje jednog HBV gena smanjena.
[0811] U određenim otelotvorenjima, predmetno obelodanjivanje pruža upotrebu inhibitora ekspresije gena HBV i/ili anti-HBV antitela u proizvodnji leka za lečenje hronične HBV infekcije ili bolesti povezane sa HBV.
[0812] U bilo kojem od iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, postupci i sastavi mogu se koristiti za lečenje hronične HBV infekcije.
[0813] U određenim otelotvorenjima, inhibitor ekspresije gena HBV se primenjuje u jednoj dozi, dve doze, tri doze, četiri doze ili pet doza.
[0815] U određenim posebnim otelotvorenjima, barem prva doza inhibitora ekspresije gena HBV se primenjuje pre primene anti-HBV antitela.
[0816] U određenim otelotvorenjima, inhibitor ekspresije gena HBV se primenjuje u jednoj dozi, dve doze, tri doze, četiri doze ili pet doza, šest doza, sedam doza ili osam doza. Doza ili doze mogu se primenjivati, na primer, dva puta dnevno, jednom dnevno, svaka dva dana, svaka tri dana, dva puta nedeljno, jednom nedeljno, svake druge nedelje, svake četiri nedelje ili jednom mesečno.
[0817] U određenim otelotvorenjima, primena anti-HBV antitela obuhvata primenu anti-HBV antitela dva puta nedeljno, jednom nedeljno, svake druge nedelje, svake dve nedelje ili jednom mesečno.
[0818] U određenim otelotvorenjima, primena anti-HBV antitela obuhvata primenu najmanje dve doze terapeutski efikasne količine anti-HBV antitela. U određenim daljim otelotvorenjima, najmanje dve doze se primenjuju dva puta nedeljno, jednom nedeljno, svake druge nedelje, svake dve nedelje ili jednom mesečno.
[0819] U određenim otelotvorenjima, primena anti-HBV antitela počinje najmanje 1 nedelju nakon primene inhibitora ekspresije HBV gena. U određenim otelotvorenjima, primena anti-HBV antitela počinje 2 nedelje nakon primene inhibitora ekspresije HBV gena. U određenim otelotvorenjima, primena anti-HBV antitela počinje 8 nedelje nakon primene inhibitora ekspresije HBV gena.
[0820] U određenim otelotvorenjima, anti-HBV antitelo i inhibitor ekspresije HBV gena se primenjuju subkutano.
[0821] U posebnim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, anti-HBV antitelo može prepoznati HBV genotipove A, B, C, D, E, F, G, H, I i J.
[0822] [0304] U posebnim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, anti-HBV antitelo može biti ljudsko antitelo; monoklonsko antitelo; ili bispecifično antitelo, sa prvom specifičnošću za HBsAg i drugom specifičnošću koja stimuliše imuni efektor (npr., drugom specifičnošću koja stimuliše citotoksičnost ili vakcinalni efekat). U određenim drugim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji opisanih ovde, anti-HBV antitelo je monoklonsko antitelo.
[0824] U određenim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, anti-HBV antitelo može biti HBC34 ili neprirodna varijanta HBC34 kao što je ovde opisano. Na primer, u određenim otelotvorenjima, anti-HBV antitelo sadrži CDR-ove koji imaju aminokiselinske sekvence (i) prema SEQ ID NOs:44, 45, 47-49 i 51; ili (ii) prema SEQ ID NOs:44, 45, 47-49 i 52. U određenim otelotvorenjima, anti-HBV antitelo sadrži CDR-ove koji imaju aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NOs:44, 45, 47, 48, 49 i 51. U određenim otelotvorenjima, anti-HBV antitelo sadrži CDR-ove koji imaju aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NOs:44, 45, 47, 48, 49 i 52. U određenim otelotvorenjima, anti-HBV antitelo sadrži: (1) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskom nizu kao što je navedeno u bilo kom od SEQ ID NOs:55-63; i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci kao što je navedeno u SEQ ID NO:53: ili (2) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO:55-57 i 64-69; i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci kao što je navedeno u SEQ ID NO:54.
[0826] U određenim otelotvorenjima, anti-HBV antitelo sadrži: (1) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskom nizu kao što je navedeno u bilo kom od SEQ ID NOs:55-69; i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci kao što je navedeno u SEQ ID NO:53: ili (2) (a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskom nizu kao što je navedeno u bilo kom od SEQ ID NOs:55-69; i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci kao što je navedeno u SEQ ID NO:54.
[0828] U određenim otelotvorenjima, anti-HBV antitelo sadrži: (a) sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (V<L>) prema SEQ ID NO:59; i (b) sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (V<H>) prema SEQ ID NO:53.
[0830] U određenim otelotvorenjima, anti-HBV antitelo sadrži: (a) sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (V<L>) prema SEQ ID NO:58; i (b) sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (V<H>) prema SEQ ID NO:53.
[0832] U posebnim otelotvorenjima postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, anti-HBV antitelo sadrži: (a) laki lanac koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci kao što je navedeno u SEQ ID NO:73, i (b) teški lanac koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO:70-72 i 97.
[0834] U posebnim otelotvorenjima postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, anti-HBV antitelo sadrži: (a) laki lanac koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci kao što je navedeno u SEQ ID NO:74, i (b) teški lanac koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO:70-72 i 97.
[0836] U posebnim otelotvorenjima postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, anti-HBV antitelo sadrži: (a) laki lanac koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO:83-95, i (b) teški lanac koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO:70-72, 97 i 98.
[0838] U posebnim otelotvorenjima postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, anti-HBV antitelo sadrži: (a) aminokiselinsku sekvencu lakog lanca prema SEQ ID NO:73, i (b) aminokiselinsku sekvencu teškog lanca prema SEQ ID NO:70.
[0840] U posebnim otelotvorenjima postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, anti-HBV antitelo sadrži: (a) aminokiselinsku sekvencu lakog lanca prema SEQ ID NO:73, i (b) aminokiselinsku sekvencu teškog lanca prema SEQ ID NO:71.
[0842] U posebnim otelotvorenjima postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, anti-HBV antitelo sadrži: (a) aminokiselinsku sekvencu lakog lanca prema SEQ ID NO:74, i (b) aminokiselinsku sekvencu teškog lanca prema SEQ ID NO:70.
[0844] [0315] U određenim drugim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, anti-HBV antitelo sadrži CDR-ove koji imaju aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO:77-82. U određenim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, anti-HBV antitelo sadrži (a) aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (VL) prema SEQ ID NO:76; i (b) aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) prema SEQ ID NO:75.
[0846] U određenim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, anti-HBV antitelo sadrži (a) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci kao što je navedeno u SEQ ID NO:76, i (b) varijabilni domen teškog lanca (VL) koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci kao što je navedeno u SEQ ID NO:75.
[0848] U određenim otelotvorenjima, terapeutski efikasna količina anti-HBV antitela je manja od terapeutski efikasne količine anti-HBV antitela primenjenog kada inhibitor ekspresije HBV gena nije primenjen subjektu. Na primer, kombinovana terapija može smanjiti efikasnu dozu anti-HBV antitela, u poređenju sa primenom samog anti-HBV antitela.
[0850] U određenim otelotvorenjima, anti-HBV antitelo se primenjuje u najmanje dve odvojene doze. U posebnim otelotvorenjima, najmanje dve doze se primenjuju dva puta nedeljno, jednom nedeljno, svake druge nedelje, svake dve nedelje ili jednom mesečno.
[0852] U određenim otelotvorenjima, ispitanik je čovek i primenjuje se terapeutski efikasna količina anti-HBV antitela; pri čemu je terapeutski efikasna količina od oko 3 mg/kg do oko 30 mg/kg.
[0854] U posebnim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, inhibitor je RNKi sredstvo koje inhibira ekspresiju HBV transkripta. U nekim otelotvorenjima, inhibicija ekspresije HBV transkripta se meri pomoću rtPCR. U nekim otelotvorenjima, inhibicija ekspresije HBV transkripta se meri smanjenjem nivoa proteina mereno pomoću ELISA.
[0856] U određenim otelotvorenjima, RNKi sredstvo sadrži sens lanac i antisens lanac koji formiraju dvolančani region, pri čemu sens lanac sadrži najmanje 15 susednih nukleotida koji se razlikuju za najviše 3 nukleotida od nukleotida 1579-1597 SEQ ID NO: I. U određenim otelotvorenjima, RNKi sredstvo sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu smisleni lanac sadrži nukleotide 1579-1597 SEQ ID NO:1.
[0858] U određenim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, najmanje jedan lanac RNKi sredstva može da sadrži 3' prepust od najmanje 1 nukleotida ili najmanje 2 nukleotida.
[0860] U određenim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, dvolančani region RNKi sredstva može biti dužine 15-30 parova nukleotida; dužine 17-23 parova nukleotida; dužine 17-25 parova nukleotida; dužine 23-27 parova nukleotida; dužine 19-21 parova nukleotida; ili dužine 21-23 parova nukleotida.
[0862] U posebnim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, svaki lanac RNKi sredstva može biti 15-30 nukleotida ili 19-30 nukleotida.
[0864] U određenim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, RNK interferencijski agens je siRNK. U određenim otelotvorenjima, siRNK inhibira ekspresiju HBV transkripta koji kodira HBsAg protein, HBcAg protein i HBx protein, ili HBV DNK polimerazu protein. U određenim otelotvorenjima, siRNK se vezuje za najmanje 15 susednih nukleotida cilja kodiranog od strane: P gen, nukleotidi 2309-3182 i 1-1625 iz NC_003977.2; S gen (koji kodira L, M i S proteine), nukleotidi 2850-3182 i 1-837 iz NC_003977.2; HBx, nukleotidi 1376-1840 iz NC_003977.2; ili C gen, nukleotidi 1816-2454 od NC_003977.2.
[0866] U određenim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, RNKi agens je siRNK, a antisens lanac siRNK sadrži najmanje 15 susednih nukleotida ili 19 susednih nukleotida nukleotidne sekvence 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3' (SEQ ID NO:4). U nekim otelotvorenjima, antisens lanac siRNK sadrži nukleotidnu sekvencu 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3' (SEQ ID NO:4). U nekim otelotvorenjima, antisens lanac se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3' (SEQ ID NO:4). U nekim otelotvorenjima, sens lanac siRNK sadrži nukleotidnu sekvencu 5'-GUGUGCACUUCGCUUCACA -3' (SEQ ID NO:3). U nekim otelotvorenjima, sens lanac siRNK sastoji se od nukleotidne sekvence 5'-GUGUGCACUUCGCUUCACA -3' (SEQ ID NO:3).
[0867] U određenim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, RNKi agens je siRNK, a antisens lanac siRNK sadrži najmanje 15 susednih nukleotida ili 19 susednih nukleotida nukleotidne sekvence 5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3' (SEQ ID NO:107). U nekim otelotvorenjima, antisens lanac siRNK sadrži nukleotidnu sekvencu 5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3' (SEQ ID NO: 107). U nekim otelotvorenjima, antisens lanac se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3' (SEQ ID NO: 107). U nekim otelotvorenjima, sens lanac siRNK sadrži nukleotidnu sekvencu 5'-GGUGGACUUCUCUCAAUUUUUA-3' (SEQ ID NO:106). U nekim otelotvorenjima, sens lanac siRNK se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-GGUGGACUUCUCUCAAUUUUUA-3' (SEQ ID NO: 106).
[0869] U posebnim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, RNKi agens je siRNK, gde su uglavnom svi nukleotidi navedenog sens lanca i uglavnom svi nukleotidi navedenog antisens lanca modifikovani nukleotidi, i gde je navedeni sens lanac konjugovan sa ligandom vezanim na 3'-terminusu. U posebnim otelotvorenjima, ligand je jedan ili više GalNAc derivata vezanih preko monovalentnog veznika, dvovalentnog razgranatog veznika ili trovalentnog razgranatog veznika. U određenim otelotvorenjima, GalNAc derivat vezan preko veznika jeste ili sadrži:
[0872]
[0875] U posebnim otelotvorenjima, siRNK je konjugovana sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi (tj., GalNAc derivat vezan preko veznika je):
[0878]
[0881] gde je X O ili S.
[0883] U posebnim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, RNKi agens je siRNK, gde je najmanje jedan nukleotid siRNK modifikovani nukleotid koji sadrži dezoksi-nukleotid, 3'-terminalni dezoksi-timin (dT) nukleotid, 2'-O-metil modifikovani nukleotid, 2'-fluoro modifikovani nukleotid, 2'-dezoksi-modifikovani nukleotid, zaključani nukleotid, otključani nukleotid, konformaciono ograničeni nukleotid, ograničeni etil nukleotid, abazični nukleotid, 2'-aminomodifikovani nukleotid, 2'-O-alil-modifikovani nukleotid, 2'-C-alkil-modifikovani nukleotid, 2'-hidroksilmodifikovani nukleotid, 2'-metoksietil modifikovani nukleotid, 2'-O-alkil-modifikovani nukleotid, morfolino nukleotid, fosforamidat, neprirodnu bazu koja sadrži nukleotid, tetrahidropiran modifikovani nukleotid, 1,5-anhidroheksitol modifikovani nukleotid, cikloheksenil modifikovani nukleotid, nukleotid koji sadrži fosforotioatnu grupu, nukleotid koji sadrži metilfosfonatnu grupu, nukleotid koji sadrži 5'-fosfat, adenozinglikolnu nukleinsku kiselinu ili nukleotid koji sadrži 5'-fosfatnu imitaciju. U određenim otelotvorenjima, siRNK sadrži modifikaciju fosfatnog skeleta, 2' riboznu modifikaciju, 5' trifosfatnu modifikaciju ili GalNAc konjugacionu modifikaciju. U određenim otelotvorenjima, modifikacija fosfatnog skeleta sadrži
[0886] 1
[0887] fosforotioatnu vezu. U određenim otelotvorenjima, 2' ribozna modifikacija sadrži fluoro ili -O-metil supstituciju.
[0888] U posebnim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, RNKi sredstvo je siRNK koja ima smisleni lanac koji sadrži 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (SEQ ID NO:5) i antisens lanac koji sadrži 5'-usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (SEQ ID NO:6),
[0889] gde su a, c, g i u 2'-O-metiladenozin-3'-fosfat, 2'-O-metilcitidin-3'-fosfat, 2'-O-metilguanozin-3'-fosfat i 2'-O-metiluridin-3'-fosfat, respektivno;
[0890] Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluoroadenozin-3'-fosfat, 2'-fluorocitidin-3'-fosfat, 2'-fluoroguanozin-3'-fosfat i 2'-fluoruridin-3'-fosfat, respektivno;
[0891] s je fosforotioatna veza; i
[0892] L96 je N-[tris(GalNAc-alkil)-amidodekanoil)]-4-hidroksiprolinol.
[0893] U posebnim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, RNKi sredstvo je siRNK koja ima smisleni lanac koji sadrži 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (SEQ ID NO:7) i antisens lanac koji sadrži 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu -3' (SEQ ID NO:8)
[0894] gde su a, c, g i u 2'-O-metiladenozin-3'-fosfat, 2'-O-metilcitidin-3'-fosfat, 2'-O-metilguanozin-3'-fosfat i 2'-O-metiluridin-3'-fosfat, respektivno;
[0895] Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluoroadenozin-3'-fosfat, 2'-fluorocitidin-3'-fosfat, 2'-fluoroguanozin-3'-fosfat i 2'-fluoruridin-3'-fosfat, respektivno;
[0896] (Agn) je adenozin-glikol nukleinska kiselina (GNA);
[0897] s je fosforotioatna veza; i
[0898] L96 je N-[tris(GalNAc-alkil)-amidodekanoil)]-4-hidroksiprolinol.
[0899] U posebnim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, RNKi sredstvo je siRNK koja ima smisleni lanac koji sadrži 5'-gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuuaL96-3' (SEQ ID NO:108) i antisens lanac koji sadrži 5'-usAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc -3' (SEQ ID NO:109),
[0900] gde su a, c, g i u 2'-O-metiladenozin-3'-fosfat, 2'-O-metilcitidin-3'-fosfat, 2'-O-metilguanozin-3'-fosfat i 2'-O-metiluridin-3'-fosfat, respektivno;
[0901] Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluoroadenozin-3'-fosfat, 2'-fluorocitidin-3'-fosfat, 2'-fluoroguanozin-3'-fosfat i 2'-fluoruridin-3'-fosfat, respektivno;
[0902] s je fosforotioatna veza; i
[0903] L96 je N-[tris(GaINAc-alkil)-amidodekanoil)]-4-hidroksiprolinol.
[0904] U posebnim otelotvorenjima iznad navedenih postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba u proizvodnji, ispitanik je čovek i ispitaniku se primenjuje terapeutski efikasna količina RNKi ili siRNK; i gde je efikasna količina RNKi ili siRNK od oko 1 mg/kg do oko 8 mg/kg.
[0905] U nekim otelotvorenjima postupaka, sastav za upotrebu ili upotreba ovde obelodanjenih, siRNK se primenjuje kod ispitanika dva puta dnevno, jednom dnevno, svaka dva dana, svaka tri dana, dva puta nedeljno, jednom nedeljno, svake druge nedelje, svake četiri nedelje ili jednom mesečno. U nekim otelotvorenjima, gde se siRNK primenjuje kod ispitanika svake četiri nedelje.
[0906] U određenim otelotvorenjima, postupci uključuju primenu dva inhibitora ekspresije HBV gena sa anti-HBV antitelom. Dva inhibitora ekspresije HBV gena mogu biti dve siRNK, kao što su dve siRNK koje ciljaju različite HBV gene. Dva različita HBV gena mogu, na primer, biti HBsAg i HBV X. Dva inhibitora ekspresije HBV gena mogu se primenjivati istovremeno. U određenim otelotvorenjima, primenjuju se dve siRNK, svaka usmerena na HBV gen, a prva siRNK ima antisens lanac koji sadrži SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:8; a druga siRNK sadrži siRNK koja ima sens lanac koji sadrži najmanje 15 susednih nukleotida 2850-3182 SEQ ID NO:1. U određenim otelotvorenjima, primenjuju se dve siRNK, svaka usmerena ka HBV genu, a prva siRNK ima antisens lanac koji sadrži SEQ ID NO:107 ili SEQ ID NO:109; a
[0909] 2
[0910] druga siRNK sadrži siRNK koja ima sens lanac koji sadrži najmanje 15 susednih nukleotida 2850-3182 SEQ ID NO:1. U određenim otelotvorenjima, primenjuju se dve siRNK, svaka usmerena na HBV gen, a prva siRNK ima antisens lanac koji sadrži SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:8; i druga siRNK ima antisens lanac koji sadrži SEQ ID NO: 107 ili SEQ ID NO:109. U određenim otelotvorenjima, prva siRNK ima sens lanac koji sadrži SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:7; i druga siRNK ima sens lanac koji sadrži SEQ ID NO:106 ili SEQ ID NO:108.
[0912] U određenim otelotvorenjima, anti-HBV antitelo i inhibitor ekspresije HBV gena pokazuju sinergistički terapeutski efekat. Termin „sinergija“ se koristi za opisivanje kombinovanog efekta dva ili više aktivnih agenasa koji je veći od zbira pojedinačnih efekata svakog odgovarajućeg aktivnog sredstva. Dakle, tamo gde kombinovani efekat dva ili više agenasa rezultira „sinergističkom inhibicijom“ aktivnosti ili procesa, podrazumeva se da je inhibicija aktivnosti ili procesa veća od zbira inhibitornih efekata svakog odgovarajućeg aktivnog sredstva. Termin „sinergistički terapeutski efekat“ odnosi se na terapeutski efekat primećen kombinacijom dve ili više terapija, pri čemu je terapeutski efekat (meren bilo kojim od brojnih parametara) veći od zbira pojedinačnih terapeutskih efekata primećenih kod odgovarajućih pojedinačnih terapija.
[0914] U nekim otelotvorenjima, RNKi sredstvo koje cilja HBV mRNK se primenjuje na ispitanika koji ima HBV infekciju i/ili bolest povezanu sa HBV, tako da se ekspresija jednog ili više HBV gena, nivoi HBV ccc DNK, nivoi HBV antigena, nivoi HBV virusnog opterećenja, ALT i/ili AST, npr., u ćeliji, tkivu, krvi ili tečnosti ispitanika, smanjuju za najmanje oko 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 62%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% ili više.
[0916] U nekim otelotvorenjima, RNKi sredstvo koje cilja HBV mRNK se primenjuje na ispitanika koji ima HBV infekciju i/ili bolest povezanu sa HBV-om, i inhibira ekspresiju HBV gena za najmanje oko 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99%, ili oko 100%, tj., do ispod nivoa detekcije testa.
[0918] U nekim otelotvorenjima, kombinovana terapija prema predmetnom obelodanjivanju obuhvata primenu nukleotidnog(ih) analoga kao treće komponente. Kako se ovde koristi, termin „nukleotidni(ih) analog“ (ili „inhibitor polimeraze“ ili „inhibitor reverzne transkriptaze“) je inhibitor replikacije DNK koji je strukturno sličan nukleotidu ili nukleozidu i specifično inhibira replikaciju HBV cccDNK i ne inhibira značajno replikaciju DNK domaćina (npr., ljudske). Takvi inhibitori uključuju tenofovir dizoproksil fumarat (TDF), tenofovir alafenamid (TAF), lamivudin, adefovir dipivoksil, entekavir (ETV), telbivudin, AGX-1009, emtricitabin (FTC), klevudin, ritonavir, dipivoksil, lobukavir, famvir, N-acetil-cistein (NAC), PC1323, teradigm-HBV, timozin-alfa, ganciklovir, besifovir (ANA-380/LB-80380) i tenofovir-eksaliadeks (TLX/CMX157). U određenim otelotvorenjima, nukleotidni analog je entekavir (ETV). Nukleotidni(i) analozi su komercijalno dostupni iz brojnih izvora i koriste se u metodama koje su ovde date u skladu sa njihovim naznačenim uputstvima (npr., obično se oralno primenjuju u određenoj dozi) ili kako odredi stručnjak za lečenje HBV-a.
[0920] Anti-HBV antitelo ili inhibitor ekspresije HBV gena mogu biti prisutni ili u istom farmaceutskom sastavu kao i treća aktivna komponenta ili su anti-HBV antitelo, inhibitor ekspresije HBV gena i treća aktivna komponenta prisutni u tri različita farmaceutska sastava. Takvi različiti farmaceutski sastavi mogu se primenjivati ili kombinovano/simultano ili u odvojeno vreme ili na odvojenim lokacijama (npr., odvojeni delovi tela).
[0922] V. Kompleti za kombinovanu HBV terapiju
[0924] [0342] Ovde su dati kompleti koji uključuju komponente HBV terapije. U nekim otelotvorenjima, komplet sadrži jedno ili više anti-HBV antitela, jedan ili više inhibitora ekspresije HBV gena i opciono treću komponentu HBV kombinovane terapije (npr., analog nukleotida). Kompleti mogu dodatno da sadrže uputstva za pripremu i/ili primenu komponenti HBV kombinovane terapije.
[0925] PRIMERI PRIMER 1
[0926] KOMBINOVANA TERAPIJA SA ANTITELOM I H BV-USMERNOM SIRNA SMANJUJE MARKERE HBV INFEKCIJE KOD AAV-HBV-MIŠEVA
[0927] Da bi se utvrdilo da li kombinovana terapija siRNK-antitelo može biti efikasna u lečenju HBV infekcija, AAV/HBV-inficiranim C57BL/6 miševima je primenjen jedan od četrnaest različitih tretmana: (1) HBV-specifična siRNK (HBV02, sa antisens lancem SEQ ID NO:8); (2)-(5) anti-HBV antitelo (mišja himerna verzija HBC34 antitela HBC34v7, HBC34-v7-mu-IgG2a) u jednoj od četiri doze; (6-7) HBV02 siRNK i HBC34-v7-mu-IgG2a antitelo, u jednoj od dve doze antitela; (8-11) HBV02 siRNK, HBC34-v7-mu-IgG2a antitelo i entekavir (ETV), u jednoj od četiri doze antitela; (12) kontrolna siRNK i kontrolno antitelo; (13) samo entekavir; ili (14) samo fiziološki rastvor (videti Tabelu 4).
[0928] Tabela 4. Nivoi lečenja i doze.
[0930]
[0933] HBV02 je hemijski sintetizovani dvolančani oligonukleotid kovalentno povezan sa ligandom koji sadrži tri GalNAc ostatka. Svi nukleozidi su modifikovani 2'-OMe ili 2'-F, a jedan nukleozid antisens lanca je zamenjen sa (S)-1-(2,3-dihidroksipropil)adenozinom (Agn). Nukleozidi sens i antisens lanca su povezani preko 3'-5' fosfodiestarskih veza ili 3'-5' fosforotioatnih veza, koje formiraju šećerno-fosfatni lanac oligonukleotida.
[0934] HBC34 je visoko neutrališuće monoklonsko antitelo protiv površinskog antigena HBV (PreS1, PreS2 i S). HBC34 antitelo korišćeno u ovom eksperimentu bilo je potpuno murinizovani HBC34v7, sa izuzetkom dela Fab fragmenta koji se vezuje za površinski antigen HBV. Ljudski HBC34v7 ima VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:53 i V<L>sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:56. Mišja himerna verzija HBC34v7 sekvenci korišćena u HBC34-v7-mu-IgG2a antitelu za ovaj eksperiment imala je aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:99 i 100, respektivno.
[0935] siRNK koja cilja gen ljudskog transtiretina korišćena je kao kontrolna siRNK, jer se ne očekuje da izazove smanjenje HBV markera infekcije u serumu.
[0936] Kontrolno monoklonsko antitelo (mAb) korišćeno u ovom primeru bilo je antitelo specifično za respiratorni sincicijalni virus i ne očekuje se da izazove smanjenje HBV markera infekcije u serumu.
[0937] Miševi (soj C57BL/6) su inokulirani sledećom količinom rAAV8-1.3HBV soja ayw, D tipa: 1,0X10<11>virusnih genoma po mišu u zapremini od 200 µl putem injekcije u repnu venu. Četiri nedelje nakon virusne inokulacije, započet je tretman test jedinjenjima.
[0938] Raspored doziranja je prikazan na Slici 1. Entekavir je primenjivan oralno jednom dnevno. HBV-specifična siRNK je primenjivana subkutano jednom na početku ispitivanja, a anti-HBV antitelo je primenjivano intraperitonealno dva puta nedeljno, tokom treće i četvrte nedelje ispitivanja. Podgrupa miševa
[0941] 4
[0942] je žrtvovana u četvrtoj nedelji, a druga podgrupa je žrtvovana u šestoj nedelji ispitivanja.
[0944] Dva puta nedeljno, virusno opterećenje, HBsAg i slobodno HBC34 antitelo su mereni iz uzoraka seruma. Takođe su merenja obavljena za serumski HBeAg, serumsku alanin transferazu (ALT), jetreni HBcAg, jetreni HBsAg, ukupnu HBV DNK u jetri (pomoću qPCR) i serumska anti-HBV antitela. Limfociti jetre, splenociti i limfni čvorovi (portalni/celijačni naspram ingvinalnih) su testirani da bi se odredio udeo HBV-specifičnih IFNg-CD4<+>ćelija i IFNg<+>CD8- ćelija.
[0946] Prosečne vrednosti HBsAg za grupe lečenja su prikazane u Tabeli 5.
[0948] Tabela 5. Nivoi HBsAg iz mišjeg seruma nakon tretmana sa HBV-specifičnom siRNK, anti-HBV antitelom i/ili entekavirom (ETV), ili sa kontrolama.
[0950]
[0953] [0352] Slike 2A i 2B prikazuju virusno opterećenje mereno brojem kopija HBV DNK, a Slike 3A i 3B prikazuju nivoe HBsAg u serumu. Slike 2A i 3A, respektivno, prikazuju virusno opterećenje i nivoe HBsAg kada su HBV02 siRNK ili HBC34 antitelo (u dozi od 15 mg/kg) primenjeni pojedinačno. HBV02 siRNK je smanjila serumsku HBV DNK i HBsAg za ~0,5-log10 i 1-log10, respektivno, u odnosu na kontrolu sa fiziološkim rastvorom. HBC34 antitelo samo po sebi nije imalo efekta na HBV DNK i smanjilo je serumski HBsAg za <1-log<10>u odnosu na kontrolu sa fiziološkim rastvorom. Slike 2B i 3B pokazuju da je tretman i sa HBV02 siRNK i sa HBC34 antitelom (u dozi od 15 mg/kg) smanjio virusno opterećenje i nivoe HBsAg za -3-log<10>, u odnosu na kontrolu sa fiziološkim rastvorom. Smanjenje serumske HBV DNK i HBsAg bilo je značajno jače kada su HBV02 siRNK i HBC34 antitelo korišćeni u kombinaciji u odnosu na tretman bilo kojim molekulom pojedinačno, a kombinatorni efekat je premašio zbir efekata monoterapija. Kombinovana terapija je takođe smanjila virusno opterećenje i nivoe HbsAg više nego tretman samo entekavirom. Efekti kombinacije HBV02 siRNK i HBC34 antitela su primećeni bez obzira na to da li je entekavir takođe primenjen. Ovi rezultati pokazuju da HBV02 siRNK i HBC34 antitelo imaju potencijal da deluju sinergistički u smanjenju virusnog opterećenja i HBsAg, i da je ovaj efekat nezavisan od tretmana entekavirom.
[0955] Slika 4 prikazuje nivoe slobodnih HBC34 antitela merene između 14 i 42 dana nakon početka ispitivanja, 1. dana (1. dan = primena siRNK za odabrane grupe lečenja). U odnosu na lečenje samo HBC34, lečenje kombinacijom HBV02 siRNK i HBC34 antitela rezultiralo je mnogo višim početnim nivoima slobodnih antitela, koji su održavani duže od 28 dana, bez obzira na to da li je lečenje uključivalo entekavir. Rezultati prikazani na Slici 4, zajedno sa virusnim opterećenjem i nivoima serumskog HBsAg, ukazuju na to da efekti lečenja zavise od količine slobodnih cirkulišućih HBC34 antitela i da niže doze antitela mogu postati efikasne kako se smanjuje opterećenje HBsAg. Na primer, kombinovana terapija može omogućiti efikasne tretmane sa: manjim dozama antitela, nižim dozama antitela i/ili manje invazivnim putevima primene (npr., potkožno umesto intravenozno), barem delimično zasnovanim na smanjenju opterećenja HBsAg pre lečenja antitelima.
[0957] Ukratko, ovo ispitivanje pokazuje da primena siRNK usmerena na HBV, a zatim primena antitela usmerenog na HBV, efikasno smanjuje serumsku HBV DNK i HBsAg. Štaviše, čini se da pojedinačne komponente sinergistički deluju, tako da je efekat ove kombinovane terapije veći nego za svaku komponentu pojedinačno i veći od onog koji bi se očekivao da su efekti samo aditivni. Konačno, rezultati sugerišu da primena siRNK smanjuje serumski HBsAg, omogućavajući antitelu da bude efikasnije.
[0959] PRIMER 2
[0961] KOMBINOVANA TERAPIJA SA JEDNIM OD DVA ANTI-H BV ANTITELA I siRNK USMERENA NA HBV
[0963] Da bi se utvrdilo da li je kombinovana terapija siRNK-antitelo korišćenjem siRNK i anti-HBV antitela HBC24 efikasna u lečenju HBV infekcija, miševima C57BL/6 inficiranim AAV/HBV primenjen je jedan od jedanaest različitih tretmana: (1) HBV-specifična siRNK (HBV02, sa antisens lancem SEQ ID NO:8; videti opis u Primeru 1); (2)-(3) anti-HBV antitelo (potpuno murinizovani HBC24), u jednoj od dve doze; (4)-(5) HBV02 siRNK u jednoj dozi i potpuno murinizovani HBC24 u jednoj od dve doze; (6-9) HBV02 siRNK u jednoj od dve doze, i potpuno murinizovano anti-HBV antitelo HBC34 (HBC34-v35-mu-IgG2a), u jednoj od tri doze antitela; (10) kontrolna siRNK i kontrolno antitelo; ili (11) samo PBS, primenjen intraperitonealno (videti Tabelu 6).
[0965] Tabela 6. Nivoi lečenja i doze za Primer 2.
[0967]
[0970] [0356] Antitela HBC24 i HBC34 korišćena u ovom eksperimentu su potpuno murinizovana, sa izuzetkom dela Fab fragmenta koji se vezuje za površinski antigen HBV. Ljudski HBC24 ima V<H>aminokiselinska sekvenca kao što je navedeno u SEQ ID NO:75 i VL aminokiselinska sekvenca kao što je navedeno u SEQ ID NO:76. Murinizovana verzija HBC24 sekvenci korišćenih u antitelu za ovaj eksperiment imala je teške i lake lance koji sadrže aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 103 i 104, respektivno. HBC34 antitelo je bila murinizovana varijanta HBC34v35, HBC34-v35-mu-IgG2a. Ljudski HBC34v35 ima aminokiselinska sekvenca teškog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:70 i aminokiselinska sekvenca lakog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:73. Murinizovana verzija HBC34v35 sekvenci korišćenih u HBC34-v35-mu-IgG2a antitelu za ovaj eksperiment imala je teške i lake lance koji sadrže aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NOs:101 i 102, respektivno.
[0972] Kontrolna siRNK cilja gen ljudskog transtiretina i ne očekuje se da će izazvati smanjenje HBV markera infekcije u serumu.
[0974] Kontrolno monoklonsko antitelo (mAb) bilo je antitelo specifično za respiratorni sincicijalni virus, za koje se ne očekuje da će izazvati smanjenje HBV markera infekcije u serumu.
[0976] Tretmani su primenjeni na WuXi imunokompromitovanom HBV miševu. Ovaj mišji model je generisan transdukcijom hepatocita kod imunokompetentnih miševa sa adeno-asociranim virusom koji sadrži HBV genom. Korišćenjem ovog modela, proizvodnja HBV proteina je pod kontrolom endogenih HBV promotera, a miševi razvijaju HBV-specifične ćelijske i humoralne T ćelijske odgovore. Međutim, ne dolazi do HBV infekcije, ne proizvodi se cccDNK, replikacija je prolazna, a imuni odgovor je otežan interferencijom vođenom vektorom.
[0978] Miševi (soj C57BL/6) su inokulirani sa rAAV8-1.3HBV soja ayw, D tipa, ubrizgavanjem u repnu venu zapremine od 200 µl koja sadrži 1,0X10<11>virusnih genoma po mišu.
[0980] Svaka grupa za tretman je obuhvatala pet miševa. HBV-specifična siRNK je primenjena subkutano jednom na početku ispitivanja, a anti-HBV antitela su primenjena intraperitonealno dva puta nedeljno, tokom druge i treće nedelje ispitivanja. Miševi su žrtvovani u šestoj nedelji ispitivanja.
[0982] Uzorci seruma su periodično sakupljani tokom ispitivanja, a mereno je virusno opterećenje, HBsAg i slobodno HBC34 antitelo. Takođe su merenja obavljena za serumski HBeAg, serumsku alanin transferazu (ALT), jetreni HBcAg, jetreni HBsAg, ukupnu HBV DNK u jetri (pomoću qPCR) i serumska anti-HBV antitela. Limfociti jetre, splenociti i limfni čvorovi (portalni/celijačni naspram ingvinalnih) su testirani da bi se odredio udeo IFNg<+>CD4<->specifičnih ćelija IFNg-CD8<+>ćelija.
[0984] Rezultati eksperimenta su prikazani na Slikama 5A i 5B (koncentracija HBV DNK u serumu), Slikama 6A i 6B (koncentracija HBsAg u serumu) i Slikama 7A i 7B (koncentracija HBeAg u serumu). Koncentracija HBV DNK u serumu, koncentracija HBsAg i koncentracija HBeAg bile su niže kod miševa tretiranih sa HBV02 i jednim od anti-HBV antitela u odnosu na miševe tretirane samo siRNK ili sa kontrolama. Ovaj efekat je primećen i za HBC34 i za HBC24 antitela. Pored toga, efekat je bio veći pri višim dozama HBV02, a kada su korišćene veće doze HBV02, smanjenje HBsAg je postignuto pri nižim dozama antitela. Ovi rezultati pružaju dodatne dokaze da kombinovani tretman korišćenjem HBV02 i monoklonskog antitela usmerenog na HBV smanjuje HBsAg i HBeAg više nego monoterapija HBV02. Ovi rezultati takođe ukazuju da veće doze siRNK pre primene antitela mogu da obezbede slično smanjenje HBsAg pri nižim dozama antitela.
[0986] PRIMER 3
[0988] SERUMSKI KLIRENS HBsAG I INHIBICIJA ULAZA VIRUSA U MIŠJEM MODELU
[0990] Imunodeficijentni miš sa transplantiranim ljudskim hepatocitima korišćen je za testiranje efikasnosti kombinovane terapije sa HBV-specifičnom siRNK i anti-HBV antitelom u uklanjanju HBsAg. PXB-Mouse® model (PhoenixBio, Japan) koristi uPA/SCID miš za generisanje miševa sa ≥70% repopulacije mišje jetre ljudskim hepatocitima (Ohshita H and Tateno C, Methods Mol Biol.1506:91-100, (2017)). Za razliku od AAV-HBV modela, cccDNK je uspostavljena i može doći do intrahepatičnog širenja HBV.
[0992] Primarni ljudski hepatociti su transplantirani u SCID miševe kod kojih su mišji hepatociti prethodno enzimatično uništeni. Miševi su imali deficit T- i B-ćelija. Ovaj model je koristan za proučavanje HBV infekcije, uključujući ulazak, širenje, regulaciju cccDNK, intrinzične imune odgovore hepatocita i integraciju virusa u genom domaćina. Ovaj model se takođe može koristiti za proučavanje efekta ljudskog IFNa na infekciju. Međutim, ovaj model ne uključuje indukciju adaptivnog imunog odgovora. Miševi su inokulirani putem injekcije u repnu venu sa HBV genotipom C u količini od 1,0X10<7>virusnih genoma po mišu.
[0993] Tretmani su počeli osam nedelja nakon infekcije.
[0995] HBV-inficiranim miševima (n=4 po grupi za tretman) primenjen je jedan od sedam različitih tretmana: (1) samo PBS; (2-4) anti-HBV antitelo (potpuno murinizovano HBC34v35 antitelo, HBC34-v35-mu-IgG2a), u jednoj od tri doze, primenjeno intraperitonealno dva puta nedeljno tokom druge i treće nedelje; ili (5-7) HBV-specifična siRNK (HBV02, sa antisens lancem SEQ ID NO:8; videti opis u Primeru 1) primenjena subkutano jednom na početku ispitivanja, i potpuno murinizovani HBC34v35, u jednoj od tri doze antitela, primenjeno intraperitonealno dva puta nedeljno tokom druge i treće nedelje (videti Tabelu 7).
[0996] Miševi su žrtvovani u 6. nedelji. Dizajn ispitivanja je takođe prikazan na Slici 8.
[0997] Tabela 7. Nivoi lečenja i doze.
[1000]
[1003] HBC34 antitelo korišćeno u ovom eksperimentu, HBC34v35, je potpuno murinizovano sa izuzetkom dela Fab fragmenta koji se vezuje za površinski antigen HBV. Ljudski HBC34v35 ima aminokiselinska sekvenca teškog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:70 i aminokiselinska sekvenca lakog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:73. Murinizovana verzija HBC34v35 sekvenci korišćenih u HBC34-v35-mu-IgG2a antitelu za ovaj eksperiment imala je teške i lake lance koji sadrže aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NOs:101 i 102, respektivno.
[1004] Uzorci seruma su periodično sakupljani tokom ispitivanja, a mereno je virusno opterećenje, HBsAg i slobodno HBC34 antitelo. Takođe su merenja takođe obavljena za serumski HBeAg, serumsku alanin transferazu (ALT), jetreni HBcAg, jetreni HBsAg, ukupnu HBV DNK u jetri (pomoću qPCR) i serumska anti-HBV antitela. Limfociti jetre, splenociti i limfni čvorovi (portalni/celijačni naspram ingvinalnih) su testirani da bi se odredio udeo IFNg<+>CD4<->specifičnih ćelija IFNg-CD8<+>ćelija.
[1005] Primena kombinacije siRNK i anti-HBV antitela smanjila je koncentraciju HBV DNK u serumu (Slika 9) i koncentraciju HBsAg u serumu (Slika 10) u odnosu na primenu antitela u istoj dozi. Slični trendovi su primećeni za koncentraciju HBeAg u serumu (Slika 11) i koncentraciju HBcrAg u serumu (Slika 12). Pored toga, u ovom modelnom sistemu, antitelo takođe funkcioniše kao inhibitor ulaska virusa u hepatocite; koncentracija HBV DNK u serumu (Slika 9) i koncentracija HBsAg u serumu (Slika 10) takođe su bile niže kada je HBC34 antitelo primenjeno kao monoterapija (tj., ne u kombinaciji sa siRNK) u dozi od 15 mg/kg.
[1006] Ovo ispitivanje pruža eksperimentalnu podršku u autentičnom modelu infekcije da HBV02 siRNK i HBC34 antitelo, kada se primenjuju u kombinaciji, smanjuju nivoe HBV DNK i HBsAg u većoj meri nego monoterapija HBC34.
[1007] PRIMER 4
[1008] KLINIČKA EVALUACIJA KOMBINOVANE TERAPIJE siRNK-ANTITELO ZA LEČENJE HRONIČNE HBV INFEKCIJE
[1009] Sprovedeno je kliničko ispitivanje faze 2 kombinovane terapije siRNK-antitelo kako bi se procenila efikasnost kombinovane terapije kod ljudi sa hroničnom HBV infekcijom. Tabela 8 prikazuje režime lečenja za ispitivanje. Studija može da uključi dodatne kohorte za testiranje efekata dodatnih terapija na kombinovanu terapiju (npr., devet kohorti, ako se testiraju dve dodatne terapije). Svaka grupa/kohorta uključuje petnaest pacijenata.
[1010] Tabela 8. Nivoi lečenja i doze za kliničko ispitivanje.
[1012]
[1013] Slika 13 prikazuje raspored lečenja osmišljen za Fazu 2 ispitivanja. Ispitivanje obuhvata dvadeset četiri nedelje lečenja i dvadeset četiri nedelje praćenja. Svi pacijenti su necirotični i imaju supresiju NUC (lečeni su nukleotidnim(im) analogom) pri ulasku u ispitivanje. Sve kohorte pacijenata mogu primati NUC terapiju tokom celog ispitivanja (npr., tenofivir ili entekavir koji se primenjuju oralno, dnevno). Ispitivanje počinje tako što sve kohorte primaju osmonedeljni uvodni tretman sa HBV02 siRNK. Doze HBV02 mogu biti, na primer, dve doze od 400 mg koje se primenjuju subkutano, svake četiri nedelje. Međutim, odgovarajuća doza se može odrediti monoterapijskim ispitivanjem pre Faze 2 ispitivanja. Nakon osam nedelja ispitivanja, sve kohorte nastavljaju lečenje sa HBV02; kohorte 2, 4 i 6 počinju lečenje niskom dozom HBC34 antitela (HBC34v35); kohorte 3, 5 i 7 počinju lečenje većom dozom HBC34 antitela; a kohorta 1 ne prima terapiju HBC34 antitelima. Niska doza HBC34v35 može biti, na primer, 0,5 grama koja se primenjuje intravenozno, svake dve nedelje; a viša doza može biti, na primer, 2 grama koja se primenjuje intravenozno, svake dve nedelje. Odgovarajuće doze mogu se proveriti monoterapijskim ispitivanjem pre ispitivanja faze 2. Tokom dvanaeste nedelje ispitivanja, kohorte 1-3 mogu primati dodatnu terapiju, jednom nedeljno. Pored toga, neke kohorte (npr., kohorte 6 i 7) mogu primati još jednu terapiju. Nakon 24 nedelje lečenja, pacijenti se prate i procenjuju kako bi se utvrdilo da li je postignuto funkcionalno izlečenje, što je naznačeno gubitkom detektabilnog serumskog HBsAg i/ili anti-HBs serokonverzije.

Claims (18)

1. Patentni zahtevi
1. Sastav koji sadrži anti-HBV antitelo za upotrebu u lečenju infekcije virusom hepatitisa D (HDV) kod ispitanika, pri čemu je ispitaniku prethodno dat inhibitor ekspresije HBV gena ili sredstvo koje smanjuje HBV antigensko opterećenje, i pri čemu;
(a) anti-HBV antitelo sadrži (i) CDRH1, CDRH2 i CDRH3 aminokiselinske sekvence prema SEQ ID Nos.: 44, 45 ili 46, i 47, respektivno; i (ii) CDRL1, CDRL2 i CDRL3 aminokiselinske sekvence prema SEQ ID Nos: 48, 49 ili 50, i 52 ili 51, respektivno; i
(b) inhibitor ekspresije HBV gena ili sredstvo koje smanjuje HBV antigensko opterećenje je siRNK koja inhibira ekspresiju HBV transkripta, pri čemu siRNK ima lanac koji sadrži 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96 -3' (SEQ ID NO:7) i antisens lanac koji sadrži 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu -3' (SEQ ID NO:8), gde:
(i) su a, c, g i u 2'-O-metiladenozin-3'-fosfat, 2'-O-metilcitidin-3'-fosfat, 2'-O-metilguanozin-3'-fosfat i 2'-O-metiluridin-3'-fosfat, respektivno;
(ii) su Af, Cf, Gf i Uf 2'-fluoroadenozin-3'-fosfat, 2'-fluorocitidin-3'-fosfat, 2'-fluoroguanozin-3'-fosfat i 2'-fluoruridin-3'-fosfat, respektivno;
(iii) je (Agn) adenozin-glikolna nukleinska kiselina (GNK);
(iv) je s fosforotioatna veza; i
(v) L96 je N-[trs(GaINAc-alkil)-amidodekanoil)]-4-hidroksiprolinol.
2. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, u kojoj je ekspresija najmanje jednog HBV gena smanjena nakon primene inhibitora ekspresije HBV gena ili sredstva koje smanjuje HBV antigensko opterećenje, a anti-HBV antitelo se primenjuje kod ispitanika kada je ekspresija najmanje jednog HBV gena smanjena.
3. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, u kojoj (a) je terapeutski efikasna količina anti-HBV antitela manja od terapeutski efikasne količine anti-HBV antitela primenjenog kada inhibitor ekspresije HBV gena ili sredstvo koje smanjuje HBV antigensko opterećenje nije primenjeno kod ispitanika; ili (b) primena anti-HBV antitela počinje najmanje 1 nedelju nakon primene inhibitora ekspresije HBV gena ili sredstva koje smanjuje HBV antigensko opterećenje.
4. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde primena anti-HBV antitela obuhvata primenu najmanje dve doze terapeutski efikasne količine anti-HBV antitela.
5. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, gde se najmanje dve doze primenjuju dva puta nedeljno, jednom nedeljno, svake druge nedelje, svake dve nedelje ili jednom mesečno.
6. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se anti-HBV antitelo primenjuje subkutano.
7. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde anti-HBV antitelo obuhvata:
(i) CDRH1, CDRH2 i CDRH3 aminokiselinske sekvence prema SEQ ID Nos: 44, 45 i 47m, respektivno; i
(ii) CDRL1, CDRL2 i CDRL3 aminokiselinske sekvence prema SEQ ID Nos: 48, 49 i 52, respektivno.
8. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde anti-HBV antitelo sadrži:
(i) CDRH1, CDRH2 i CDRH3 aminokiselinske sekvence prema SEQ ID Nos: 44, 45 i 47, respektivno; i
(ii) CDRL1, CDRL2 i CDRL3 aminokiselinske sekvence prema SEQ ID Nos: 48, 49 i 51, respektivno.
9. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde anti-HBV antitelo sadrži:
(a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID Nos: 55-69; i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj
sekvenci navedenoj u SEQ ID Nos: 53: ili
(a) varijabilni domen lakog lanca (V<L>) koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID Nos: 55-69; i (b) varijabilni domen teškog lanca (V<H>) koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID br.: 54.
10. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde
antitelo protiv HBV sadrži:
(a) aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (V<L>) prema SEQ ID NO: 59; i (b) aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (V<H>) prema SEQ ID NO:53.
11. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde anti-HBV antitelo sadrži:
(a) laki lanac koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 73, i (b) teški lanac koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO: 70-72 i 97; ili (a) laki lanac koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:74, i (b) teški lanac koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO:70-72 i 97; ili (a) laki lanac koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NOs:83-93, i (b) teški lanac koji je najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NOs:70-72, 97 i 98
12. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde anti-HBV antitelo sadrži:
(a) aminokiselinsku sekvencu lakog lanca prema SEQ ID NO:73, i (b) aminokiselinsku sekvencu teškog lanca prema SEQ ID NOs:70; ili
(a) aminokiselinsku sekvencu lakog lanca prema SEQ ID NO:73, i (b) aminokiselinsku sekvencu teškog lanca prema SEQ ID NOs:71.
13. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, gde anti-HBV antitelo sadrži (a) aminokiselinsku sekvencu lakog lanca prema SEQ ID NO:73, i (b) aminokiselinsku sekvencu teškog lanca prema SEQ ID NOs:71.
14. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je ispitanik čovek i daje se terapeutski efikasna količina anti-HBV antitela; pri čemu je terapeutski efikasna količina od oko 3 mg/kg do oko 30 mg/kg.
15. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je siRNK konjugovana sa L96 kao što je prikazano u sledećoj strukturi:
gde je X O.
1
16. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je (a) ispitanik čovek i daje se terapeutski efikasna količina siRNK; i gde je efikasna količina siRNK od oko 1 mg/kg do oko 8 mg/kg; ili (b) siRNK se primenjuje kod ispitanika dva puta dnevno, jednom dnevno, svaka dva dana, svaka tri dana, dva puta nedeljno, jednom nedeljno, svake druge nedelje, svake četiri nedelje ili jednom mesečno.
17. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se ispitaniku takođe primenjuje nukleotidni analog.
18. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde ispitanik ima i infekciju virusom hepatitisa B (HBV) i infekciju virusom hepatitisa D (HDV).
2
RS20251294A 2018-12-20 2019-12-19 Kombinovana hbv terapija RS67553B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862782896P 2018-12-20 2018-12-20
EP23190149.7A EP4285929B1 (en) 2018-12-20 2019-12-19 Combination hbv therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67553B1 true RS67553B1 (sr) 2026-01-30

Family

ID=69191249

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20251294A RS67553B1 (sr) 2018-12-20 2019-12-19 Kombinovana hbv terapija

Country Status (26)

Country Link
US (2) US12404318B2 (sr)
EP (3) EP4285929B1 (sr)
JP (1) JP7513616B2 (sr)
KR (1) KR20210126559A (sr)
CN (2) CN120860227A (sr)
AU (1) AU2019405961B2 (sr)
BR (1) BR112021012056A2 (sr)
CA (1) CA3122402A1 (sr)
DK (2) DK4285929T3 (sr)
EA (1) EA202191736A1 (sr)
ES (2) ES2961039T3 (sr)
FI (2) FI3897672T3 (sr)
HR (2) HRP20231338T1 (sr)
HU (1) HUE064532T2 (sr)
IL (1) IL284047A (sr)
LT (2) LT4285929T (sr)
MX (1) MX2021006954A (sr)
MY (1) MY206794A (sr)
PH (1) PH12021551451A1 (sr)
PL (2) PL3897672T3 (sr)
PT (1) PT4285929T (sr)
RS (1) RS67553B1 (sr)
SG (1) SG11202106489RA (sr)
SI (2) SI3897672T1 (sr)
TW (1) TWI912239B (sr)
WO (1) WO2020132346A1 (sr)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2021006756A (es) * 2018-12-19 2021-09-28 Humabs Biomed Sa Anticuerpos que neutralizan el virus de la hepatitis b y usos de los mismos.
MY206794A (en) 2018-12-20 2025-01-08 Humabs Biomed Sa Combination hbv therapy
KR20220063188A (ko) * 2019-08-29 2022-05-17 비르 바이오테크놀로지, 인코포레이티드 B형 간염 바이러스 감염을 치료하기 위한 항체 조성물 및 방법
MX2022015206A (es) * 2020-06-08 2023-01-05 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hbv y metodos de uso.
CA3182458A1 (en) * 2020-06-24 2021-12-30 Laura ROSEN Engineered hepatitis b virus neutralizing antibodies and uses thereof
WO2023004197A1 (en) 2021-07-23 2023-01-26 Teneoten, Inc. Heavy chain antibodies binding to hepatitis b surface antigen
CN119546629A (zh) * 2022-05-19 2025-02-28 维尔生物科技公司 用于治疗丁型肝炎病毒（hdv）感染和相关疾病的组合物与方法
EP4526338A2 (en) * 2022-05-19 2025-03-26 VIR Biotechnology, Inc. Compositions and methods for treating hepatitis b virus (hbv) infection and hbv-associated diseases
CN120202010A (zh) * 2022-10-21 2025-06-24 上海京新生物医药有限公司 配体-寡核苷酸共轭物及用于该共轭物的接头
EP4706646A1 (en) * 2023-06-01 2026-03-11 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Novel double-stranded sirna, conjugate thereof, and use thereof
WO2025242164A1 (zh) * 2024-05-23 2025-11-27 正大天晴药业集团股份有限公司 siRNA剂与逆转录酶抑制剂的联合及其治疗乙肝的用途

Family Cites Families (221)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US596091A (en) 1897-12-28 Weather-strip
US513030A (en) 1894-01-16 Machine for waxing or coating paper
US564562A (en) 1896-07-21 Joseph p
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5130300A (en) 1986-03-07 1992-07-14 Monsanto Company Method for enhancing growth of mammary parenchyma
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
AU598946B2 (en) 1987-06-24 1990-07-05 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5032401A (en) 1989-06-15 1991-07-16 Alpha Beta Technology Glucan drug delivery system and adjuvant
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
ATE269870T1 (de) 1989-10-24 2004-07-15 Isis Pharmaceuticals Inc 2'-modifizierte oligonukleotide
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
CA2029273A1 (en) 1989-12-04 1991-06-05 Christine L. Brakel Modified nucleotide compounds
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
ES2116977T3 (es) 1990-05-11 1998-08-01 Microprobe Corp Soportes solidos para ensayos de hibridacion de acidos nucleicos y metodos para inmovilizar oligonucleotidos de modo covalente.
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
BR9106702A (pt) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Inc Analogo de oligonucleotideos e processos para modular a producao de uma proteina por um organismo e para tratar um organismo
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
ES2083593T3 (es) 1990-08-03 1996-04-16 Sterling Winthrop Inc Compuestos y metodos para inhibir la expresion de genes.
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
CA2092002A1 (en) 1990-09-20 1992-03-21 Mark Matteucci Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
WO1992008728A1 (en) 1990-11-08 1992-05-29 Hybridon, Inc. Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
GB9100304D0 (en) 1991-01-08 1991-02-20 Ici Plc Compound
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US6235887B1 (en) 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
KR940703846A (ko) 1991-12-24 1994-12-12 비. 린네 파샬 갭(gap)이 형성된 2′ 변성된 올리고뉴클레오티드(gapped 2′ modifed oligonucleotides)
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE4203923A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
WO1994002595A1 (en) 1992-07-17 1994-02-03 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of animal diseases
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
AU6449394A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
CA2159629A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sanofi Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US5955591A (en) 1993-05-12 1999-09-21 Imbach; Jean-Louis Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation
US6015886A (en) 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US6294664B1 (en) 1993-07-29 2001-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
AU678085B2 (en) 1993-11-16 1997-05-15 Genta Incorporated Synthetic oligomers having chirally pure phosphonate internucleosidyl linkages mixed with non-phosphonate internucleosidyl linkages
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US6608035B1 (en) 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US6166197A (en) 1995-03-06 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions
AU5359496A (en) 1995-03-06 1996-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Improved process for the synthesis of 2'-o-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom
US5645620A (en) 1995-05-25 1997-07-08 Foster Wheeler Development Corp. System for separating particulates and condensable species from a gas stream
ATE285477T1 (de) 1995-06-07 2005-01-15 Inex Pharmaceutical Corp Herstellung von lipid-nukleinsäure partikeln duch ein hydrophobische lipid-nukleinsäuree komplexe zwischenprodukt und zur verwendung in der gentransfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
CA2251904A1 (en) 1996-04-18 1997-10-23 Abbott Laboratories An antigenic epitope of the a determinant of hepatitis b surface antigen and uses thereof
GB9608626D0 (en) 1996-04-25 1996-07-03 Univ College Of London Hepatitis b monoclonal antibodies
US6444423B1 (en) 1996-06-07 2002-09-03 Molecular Dynamics, Inc. Nucleosides comprising polydentate ligands
JP2001508054A (ja) 1996-12-30 2001-06-19 イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ ＨＢｓＡｇ由来アネキシンＶ結合ポリペプチドおよびその使用
US6639062B2 (en) 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
DE69834038D1 (de) 1997-07-01 2006-05-18 Isis Pharmaceutical Inc Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von oligonukleotiden über die speiseröhre
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6617438B1 (en) 1997-11-05 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Oligoribonucleotides with enzymatic activity
US6528640B1 (en) 1997-11-05 2003-03-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
US7273933B1 (en) 1998-02-26 2007-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for synthesis of oligonucleotides
US7045610B2 (en) 1998-04-03 2006-05-16 Epoch Biosciences, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US6531590B1 (en) 1998-04-24 2003-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Processes for the synthesis of oligonucleotide compounds
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
WO2000003683A2 (en) 1998-07-20 2000-01-27 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
AU5285899A (en) 1998-07-21 2000-02-14 Connex Gesellschaft Zur Optimierung Von Forschung Und Entwicklung Mbh Anti hepatitis c virus antibody and uses thereof
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
EP1178999B1 (en) 1999-05-04 2007-03-14 Santaris Pharma A/S L-ribo-lna analogues
US6593466B1 (en) 1999-07-07 2003-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
US7321029B2 (en) 2000-01-21 2008-01-22 Geron Corporation 2′-arabino-fluorooligonucleotide N3′→P5′ phosphoramidates: their synthesis and use
JP4413493B2 (ja) 2000-10-04 2010-02-10 サンタリス ファーマ アー／エス プリンｌｎａ類似体の改善された合成方法
US6878805B2 (en) 2002-08-16 2005-04-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide-conjugated oligomeric compounds
CA2529945A1 (en) 2003-06-27 2005-01-06 Biogen Idec Ma Inc. Use of hydrophobic-interaction-chromatography or hinge-region modifications for the production of homogeneous antibody-solutions
ES2559828T3 (es) 2003-07-16 2016-02-16 Protiva Biotherapeutics Inc. ARN de interferencia encapsulado en lípidos
EP1661905B9 (en) 2003-08-28 2012-12-19 IMANISHI, Takeshi Novel artificial nucleic acids of n-o bond crosslinkage type
US7740861B2 (en) 2004-06-16 2010-06-22 University Of Massachusetts Drug delivery product and methods
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
WO2006076640A1 (en) 2005-01-14 2006-07-20 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind or neutralize hepatitis b virus
EP1866414B9 (en) 2005-03-31 2012-10-03 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
US8101741B2 (en) 2005-11-02 2012-01-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
JP5342881B2 (ja) 2006-01-27 2013-11-13 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド ６−修飾された二環式核酸類似体
MX2009012343A (es) 2007-05-14 2010-02-10 Biogen Idec Inc Regiones fc (sc fc) de cadena sencilla, polipeptidos de enlace que comprenden las mismas, y metodos relacionados con ello.
KR20090056537A (ko) 2007-11-30 2009-06-03 주식회사 녹십자 Ｂ형 간염 바이러스 중화능을 갖는 항체를 유효성분으로포함하는 ｂ형 간염 바이러스 감염의 예방 또는 치료용조성물
WO2009082817A1 (en) 2007-12-27 2009-07-09 Protiva Biotherapeutics, Inc. Silencing of polo-like kinase expression using interfering rna
EP2998405B1 (en) 2009-05-13 2019-12-11 Genzyme Corporation Anti-human cd52 immunoglobulins
KR20120095397A (ko) * 2009-10-16 2012-08-28 글락소 그룹 리미티드 Ｈｂｖ 안티센스 억제제
US20140275211A1 (en) 2011-06-21 2014-09-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject
HRP20190393T1 (hr) * 2012-07-10 2019-04-19 Green Cross Corporation Pripravak protutijela namijenjen sprječavanju ili liječenju infekcije mutantnim virusom hepatitisa b
AU2013308045B2 (en) 2012-08-30 2018-10-04 Replicor Inc. Methods for the treatment of hepatitis B and hepatitis D infections
GB201216649D0 (en) 2012-09-18 2012-10-31 Univ Birmingham Agents and methods
WO2014072526A1 (en) 2012-11-12 2014-05-15 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Development of hbv- and/or hdv-susceptible cells, cell lines and non-human animals
US20140294812A1 (en) 2013-03-15 2014-10-02 Xencor, Inc. Fc variants that improve fcrn binding and/or increase antibody half-life
SG10201806025TA (en) 2014-01-16 2018-08-30 Mario Umberto Francesco Mondelli Neutralizing human monoclonal antibodies against hepatitis b virus surface antigen
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
IL316808A (en) 2014-08-20 2025-01-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Modified double-stranded RNA materials and their uses
TWI710633B (zh) * 2014-11-10 2020-11-21 美商阿尼拉製藥公司 Ｂ型肝炎病毒（ＨＢＶ）ｉＲＮＡ組成物及其用途方法
HK1244843A1 (zh) 2014-11-17 2018-08-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 载脂蛋白c3(apoc3)irna组合物及其使用方法
WO2016138160A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Middle east respiratory syndrome coronavirus immunogens, antibodies, and their use
WO2016209862A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glucokinase (gck) irna compositions and methods of use thereof
KR20180038465A (ko) 2015-08-07 2018-04-16 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 Ｂ형 간염 바이러스 감염에 대한 ｒｎａｉ 치료법
WO2017059878A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 Humabs Biomed Sa Antibodies that potently neutralize hepatitis b virus and uses thereof
WO2017100542A1 (en) 2015-12-10 2017-06-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Sterol regulatory element binding protein (srebp) chaperone (scap) irna compositions and methods of use thereof
UA125819C2 (uk) 2015-12-15 2022-06-15 Гіліад Сайєнсіз, Інк. ВИДІЛЕНЕ МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З gp120 ВІРУСУ ІМУНОДЕФІЦИТУ ЛЮДИНИ
JOP20190015A1 (ar) * 2016-08-04 2019-02-04 Arrowhead Pharmaceuticals Inc عوامل (ار ان ايه آي) لعدوى فيروس الالتهاب الكبدي الوبائي ب
KR102645243B1 (ko) 2016-11-23 2024-03-11 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 표적외 효과가 감소된 변형 rna 작용제
IL269927B2 (en) * 2017-04-18 2025-04-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Methods of treating patients with hepatitis B virus infection
KR20200003915A (ko) 2017-05-10 2020-01-10 알바후나 테라퓨틱스, 에스.엘. 높은 이중 ＨＩＶ 항바이러스 활성과 면역조절 활성을 갖는 Ｆｃ-융합 단백질 유도체
JP7774283B2 (ja) 2017-12-19 2025-11-21 ザ ロックフェラー ユニバーシティー エフェクター機能を改良したヒトＩｇＧのＦｃ領域改変体
CA3106701A1 (en) * 2018-08-13 2020-02-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Hepatitis b virus (hbv) dsrna agent compositions and methods of use thereof
MX2021006756A (es) 2018-12-19 2021-09-28 Humabs Biomed Sa Anticuerpos que neutralizan el virus de la hepatitis b y usos de los mismos.
MY206794A (en) 2018-12-20 2025-01-08 Humabs Biomed Sa Combination hbv therapy
KR20220063188A (ko) 2019-08-29 2022-05-17 비르 바이오테크놀로지, 인코포레이티드 B형 간염 바이러스 감염을 치료하기 위한 항체 조성물 및 방법

Also Published As

Publication number Publication date
AU2019405961B2 (en) 2024-10-10
PL4285929T3 (pl) 2026-03-23
CA3122402A1 (en) 2020-06-25
SI3897672T1 (sl) 2024-02-29
FI3897672T3 (fi) 2023-11-03
EA202191736A1 (ru) 2021-10-01
DK4285929T3 (da) 2025-12-22
PH12021551451A1 (en) 2022-04-18
EP4656656A3 (en) 2026-03-04
TWI912239B (zh) 2026-01-21
MX2021006954A (es) 2021-10-22
EP4285929B1 (en) 2025-10-08
NZ777877A (en) 2025-06-27
DK3897672T5 (da) 2024-08-05
SI4285929T1 (sl) 2026-02-27
JP7513616B2 (ja) 2024-07-09
AU2019405961A1 (en) 2021-07-22
DK3897672T3 (da) 2023-10-30
EP4285929A2 (en) 2023-12-06
TW202039000A (zh) 2020-11-01
EP3897672B1 (en) 2023-08-09
LT4285929T (lt) 2026-01-12
CN113543791B (zh) 2025-08-05
WO2020132346A1 (en) 2020-06-25
US20220056110A1 (en) 2022-02-24
EP4656656A2 (en) 2025-12-03
SG11202106489RA (en) 2021-07-29
FI4285929T3 (fi) 2025-12-30
CN120860227A (zh) 2025-10-31
BR112021012056A2 (pt) 2021-11-23
EP3897672A1 (en) 2021-10-27
US12404318B2 (en) 2025-09-02
EP4285929A3 (en) 2024-03-06
ES2961039T3 (es) 2024-03-07
HUE064532T2 (hu) 2024-03-28
ES3057518T3 (en) 2026-03-03
PT4285929T (pt) 2026-01-02
HRP20231338T1 (hr) 2024-02-16
MY206794A (en) 2025-01-08
HRP20251671T1 (hr) 2026-02-13
IL284047A (en) 2021-08-31
US20260022161A1 (en) 2026-01-22
CN113543791A (zh) 2021-10-22
LT3897672T (lt) 2023-11-10
PL3897672T3 (pl) 2024-10-07
KR20210126559A (ko) 2021-10-20
JP2022515778A (ja) 2022-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20260022161A1 (en) Combination hbv therapy
US20250320497A1 (en) Compositions and methods for treating hepatitis b virus (hbv) infection and hbv-associated diseases
US20230242621A1 (en) Engineered hepatitis b virus neutralizing antibodies and uses thereof
US20250302951A1 (en) Compositions and methods for treating hepatitis d virus (hdv) infection and associated diseases
HK40103966B (en) Combination hbv therapy
HK40103966A (en) Combination hbv therapy
EA050744B1 (ru) Комбинированная терапия hbv
HK40060755A (en) Combination hbv therapy
HK40060755B (zh) 组合hbv疗法
HK40091567A (zh) 工程化乙型肝炎病毒中和抗体和其用途
EA046489B1 (ru) Композиции и способы лечения инфекции вируса гепатита b (вгв)