JP2012502012A - 軟組織工学のための方法及び手段 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞不含脂肪組織抽出物、同抽出物を含むインプラント、及びこれを調製する方法に関する。当該抽出物及びインプラントは、脂肪形成性及び血管形成性を誘発する能力を有し、従って、軟組織の修復、工学的操作、及び血管形成の誘発、例えば創傷治癒、火傷及び虚血状態の治療を含む用途で有用である。

Description

本発明は軟組織工学に関する。より正確には、本発明は、無細胞脂肪組織抽出物、前記抽出物を含むインプラント、その調製方法及びその使用を対象とする。

軟組織は、筋肉、結合組織、脂肪組織、及び血管等の体内の結合構造及び支持構造から構成される。軟組織工学は、例えば外傷（火傷及び瘢痕）、外科的切除、又は先天的奇形に起因する軟組織欠損の交換パーツの製作を追及する。更に、美容用途、例えば顔の皺の充填術などは再構成軟組織の重要な応用例である。

シリコン及びウシコラーゲン等の異物的形成材料が、組織工学に用いられてきた。但し、かかる材料は重度の拒絶反応の他、アレルギー反応を引き起こすおそれがある。従って、天然の移植材料の利用が今日では好まれる。

自己移植は、軟組織工学の用途に望ましい。自己脂肪組織移植は、旧来方式の治療手順であり、この手順では、成熟した脂肪細胞又は脂肪組織そのものを欠損部位に移植する。脂肪組織は豊富で、収集しやすく、臨床用途としてすぐに入手可能である。しかし、自己脂肪組織移植を利用した場合、やはりいくつかの問題、例えば再吸収、結合組織の過剰形成（瘢痕）、炎症反応の他、移植物の硬化及び凝固を引き起こすおそれがある。更に、脂肪組織移植により得られる長期結果は予測不能で、用いる方法及び前記方法を実施する作業者の技量に依存して変化しやすい。

脂肪幹細胞が軟組織工学で用いられてきた。かかる細胞は増殖し、成熟脂肪組織に分化する能力を有する。しかし、細胞の増殖と分化には、細胞外マトリクスが必須の役割を担っているので、大型の、又は深部の軟組織の欠損を細胞単独で修復できる可能性は低い。機能性の組織に再生するためには、移植細胞は、人工の細胞外マトリクス、すなわち細胞の付着、増殖、及び分化を支援するための生体物質からなる足場を必要とする。

新たな血管の形成、すなわち新血管形成（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）は、再生中の軟組織における栄養分の供給及び廃棄物の処理を行う上で重要である。今日まで、単一の増殖因子（例えば、ＦＧＦ−２又はＶＥＧF）が、かかる目的のために生物活性物質として用いられてきたが、結果は満足のいくものではなかった。因子を単独で用いるのに替えて、様々な増殖因子／分化因子のプールが必要に思われる。しかし、分化因子の正しい組合せは不明である。単一のインプラントにおいて、生物工学による増殖因子のプールを用いれば、コストは非常に高くつくことになろう。

今日まで、軟組織の欠損の再構築に向けた適当なアプローチで、利用できるものは１つもない。従って、欠損部位が充填されるように迅速な体積増加を誘発し、時間と共に体積が減少することなく移植組織を維持し、迅速な新血管形成を誘発するインプラントを開発する必要性が当技術分野で広く認められている。

新規脂肪形成（Ｄｅ ｎｏｖｏ ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、軟組織工学にとって有望なアプローチである。本発明は、細胞の増殖及び分化に好適であり、従って外部から細胞移植することなく脂肪組織の形成を引き起こす微環境を提供しようとする研究に基づく。最適な微環境は、脂肪幹細胞が周囲組織から移動するのを促進し、これらの細胞が成熟脂肪細胞に分化するのを誘発する。発生中の組織における新血管形成は、壊死、瘢痕形成、及び移植組織の再吸収を防ぐために、並びに、いくつかの分化因子を分泌するためにも必要である。

本発明は、細胞不含脂肪組織抽出物を提供し、同抽出物は事前に決定された量のＶＥＧF、ＦＧＦ−２、及びＩＧＦ−１を含む。いくつかの実施形態では、抽出物は、総タンパク質１ｍｇ当たり、少なくとも１ｐｇのＶＥＧＦ、少なくとも７０ｐｇのＦＧＦ−２、及び少なくとも５０ｐｇのＩＧＦ−１を含む。他の実施形態では、総タンパク質１ｍｇ当たりのＶＥＧＦ含量は、少なくとも７ｐｇである。当該抽出物は、軟組織の修復又は工学的操作で、及び組織工学、例えば創傷治癒、火傷の治療、及び虚血状態の治療における血管形成の誘発で用いることができる。

本発明は、本発明の任意の実施形態による細胞不含脂肪組織抽出物、及び生体適合性マトリクスを含むインプラントを更に提供する。当該抽出物は、好ましくは同種異系であり、当該マトリクスは、好ましくはヒドロゲルであり、ヒアルロン酸、キトサン、フィブリン、コラーゲン、アルギネート、ポリ乳酸をベースとするポリエステル、ポリ乳酸グリコール酸、ポリカプロラクトン、及びこれらの混合物からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態では、インプラントは注射可能である。当該インプラントは、軟組織の修復又は工学的操作で、及び組織工学、例えば創傷治癒、火傷の治療、及び虚血状態の治療における血管形成の誘発で用いることができる。

本発明は、本発明の任意の実施形態による細胞不含脂肪組織抽出物を調製する方法も更に提供する。当該方法は、ａ）生存細胞を含むホモジナイズされていない脂肪組織サンプルを提供するステップ、ｂ）前記サンプルを事前に決定された時間インキュベーションするステップ、及びｃ）抽出物を収集するステップを含む。更に提供されるものとして、前記方法によって取得可能な細胞不含脂肪組織抽出物が挙げられる。

更に、本発明は、本発明の任意の実施形態によるインプラントを調製する方法を提供する。当該方法は、脂肪組織抽出物を生体適合性材料と混合する、又はこれを生体適合性材料に吸収させるステップを含む。

また更に、本発明は、脂肪形成を誘発する方法、及び血管形成を誘発する方法も提供する。当該方法は、本発明の任意の該当する実施形態によるインプラントを、これを必要とする対象に移植するステップを含む。

下記では、本発明は、好ましい実施形態により、添付の図面を参照しながら更に詳記される。

本発明による脂肪組織抽出物に含まれる総タンパク質及び増殖因子含量を示す図である。図１Ａは、ランダムに選択されたヒト脂肪組織抽出物２０検体中の、異なる時点における総タンパク質濃度を示す図である。図１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄは、異なる時点におけるヒト脂肪組織抽出物（ＡＴＥ）中のＩＧＦ−１、ＦＧＦ−２、及びＶＥＧＦの各濃度を示す図である。各図中、平均値を横線で示す。 ヒト脂肪幹細胞（ｈＡＳＣ）の脂肪形成細胞分化を示す図である。図２Ａは、対照増殖培地中で増殖したｈＡＳＣを示す図である。図２Ｂは、タンパク質を約３５０μｇ／ｍｌ含むＡＴＥ培地中で増殖したｈＡＳＣを示す図であり、図２Ｃではタンパク質を約７００μｇ／ｍｌ、及び図２Ｄではタンパク質を約１２００μｇ／ｍｌ含む。ＡＴＥ処理は、用量依存性の脂肪形成誘導能力を有する。 血管形成アッセイにおけるチューブ形成を示す図である。図３Ａはチューブ形成を示さない陰性対照を表す図である。図３Ｂ及び図３Ｃは、９００μｇ／ｍｌ（タンパク質含量）又は１３００μｇ／ｍｌのＡＴＥでそれぞれ処理した細胞を表す図である。図３Ｄは、公知の血管形成増殖因子、すなわちＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ、及びＦＧＦ−２、１ｎｇ／ｍｌで処理した陽性対照細胞を示す図である。チューブ形成は、図３Ｂ、図３Ｃ、及び図３Ｄで明確に認めることができる。ＡＴＥで処理した上記２例は、陽性対照３Ｄの血管形成能力と比較して等しくはあるが、用量依存性の血管形成誘導能力を有する。 本実施形態によるインプラントの移植後２週目における、ラット皮下組織中でのｉｎ ｖｉｖｏ血管形成及び脂肪組織形成を示す図である。図４Ａ及び図４Ｂは、インプラント領域における広範な毛細血管形成を示す図である。図４Ｃ及び図４Ｄは、大規模な細動脈様構造の他、若干の脂肪組織の発現を示す図である。血管の例を矢印で示す。 本実施形態によるインプラントの移植後１２週目（図５Ａ及び図５Ｂ）並びに２０週目（図５Ｃ及び図５Ｄ）における大規模な脂肪組織形成を示す図である。インプラントを、図５Ｂ及び図５Ｄ中に矢印で示す。 本実施形態によるインプラントを脚部の古い瘢痕組織下に移植した後の、ヒト皮下組織、及び同組織の脂肪組織形成と血管形成を示す臨床前試験を表す図である。図６Ａは、移植前の組織を示す。図６Ｂは移植後３カ月目における皮下組織を示す。図６Ｃは、６カ月目における上部皮下組織血管形成を示す。図６Ｄは、６カ月目における真皮直下の皮下組織に生じた脂肪組織及び血管形成を示す。組織重量は、６カ月の時点において少なくとも２倍であり、脂肪組織及び大血管が発現した。

脂肪組織は、様々な分化段階にある脂肪細胞、内皮細胞、線維芽細胞、周皮細胞、並びにいくつかの細胞系統に分化する能力を有する脂肪幹細胞及び間充織幹細胞を含む。新規脂肪形成、すなわち新たな脂肪組織の形成は、軟組織工学にとって有望なアプローチである。本発明は、細胞の増殖及び分化に好適である微環境を提供しようとする研究に基づき、従って外部から細胞移植することなく血管及び脂肪組織の形成を引き起こす。最適な微環境は、脂肪幹細胞が周囲組織から移動するのを促進し、内皮細胞前駆細胞及び脂肪細胞前駆細胞が成熟脂肪細胞、疎性結合組織、及び筋肉細胞、及び血管細胞へと分化するのを誘発する。成長組織における新規血管形成は、壊死、瘢痕形成を防ぐために、すなわち機能的に成熟した脂肪組織が発現するのを可能にするために、常に必要である。

本発明は、細胞を投与しなくても、移植部位において脂肪組織及び血管系の迅速な形成を誘発する能力を有する、細胞不含脂肪組織抽出物（ＡＴＥ）に関する。ＡＴＥは、新規脂肪形成及び血管形成のための最適な微環境を生み出す能力を有し、従って軟組織の修復及び／又は工学的操作で用いることができる。

用語「脂肪組織抽出物」（ＡＴＥ）とは、本明細書において生物活性物質、好ましくは脂肪組織細胞、すなわち様々な分化段階にある脂肪細胞、内皮細胞、線維芽細胞、周皮細胞、並びに脂肪幹細胞より分泌される脂肪形成因子及び血管形成因子の混合物を指す。当該抽出物は細胞不含、又は無細胞である。当該脂肪組織抽出物は、従来方式で管理された媒体とは異なり、例えば当該抽出物が小組織片又は生存細胞から収集されるという点で異なる。調製プロセスには、細胞を培養するステップが含まれず、得られる抽出物は管理媒体よりもかなり高濃度であり、インキュベーション時間は短く、数分〜数日の範囲で変化する。

脂肪組織抽出物は、例えば脂肪吸引術又は外科手術により得られる脂肪又は脂肪組織サンプルから調製可能である。必要ならば、組織サンプルは、細胞が実質的に生存状態を保つように小片に切断される。脂肪吸引術の試料は直接利用可能である。換言すれば、組織サンプルの処理にはホモジナイズするステップは含まれない。生物活性因子は、培地、滅菌塩溶液、リン酸緩衝化された生理食塩水、又は細胞若しくは組織片が、インキュベーション中に生物活性因子を液相に放出するその他の適する等張水性緩衝溶液内で、細胞をインキュベーションすることにより抽出される。次に、ＡＴＥ、すなわち細胞不含液相が収集される。ＡＴＥは、使用前に抽出物を滅菌し、無細胞液を作製するために、ろ過することもできる。得られたＡＴＥは、サイトカイン及びその他の生物活性物質からなる、細胞不含タンパク質混合物である。

自己脂肪組織のみならず、同種異系の脂肪組織もＡＴＥの供給源として用いることができ、上記のように当該目的のために処理され得る。かかる同種異系の抽出物は、例えば凍結乾燥された「既製の」軟組織足場内に吸収可能、及び同足場内で利用可能である。かかる種類の製品の１つの例として、架橋されたヒアルロン酸（例えば、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ）及び同種異系のＡＴＥから製造されたものが挙げられる。当該抽出物は無細胞なので、同一抽出物及びインプラントが複数の患者に適する同種異系で用いても、免疫反応及びアレルギー反応は起きにくいと考えられる。このことは、例５で更に詳記される動物試験により裏付けられ、この例では、ラットに移植されたヒトＡＴＥ（異種移植）は、いかなる炎症反応もその他の合併症も引き起こさなかった。

ＡＴＥは、脂肪組織の細胞により発現される脂肪形成因子及び血管形成因子からなる最適なサイトカイン混合物である。ＡＴＥの生物活性物質は、当技術分野で公知のルーチン法（例えば、ＥＬＩＳＡ）で測定可能である。本明細書では、様々なＡＴＥ中の１２０種類のサイトカインの発現を測定した（例１を参照）。長時間、例えば２４時間以上インキュベーションすると、より多くの血管形成性抽出物が得られたが、一方、短時間及び長時間のインキュベーションでは、いずれにおいても脂肪形成性混合物が生成された。

ＡＴＥは、望ましい、又は事前に決定された量の脂肪形成因子及び血管形成因子を含むように特別に調製可能であるが、前記因子には、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、及びインスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）が含まれる。望ましい組成は使用目的に依存し得る。最新の知見に基づき、及び本発明の裏付けによれば、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ−２は、血管形成を刺激するための重要な因子とみなされ、一方、ＦＧＦ−２及びＩＧＦは、脂肪形成を刺激する上で重要である。従って、１つの実施形態では、ＡＴＥは、総タンパク質１ｍｇ当たり、少なくとも１ｐｇのＶＥＧＦ、少なくとも７０ｐｇのＦＧＦ−２、及び少なくとも５０ｐｇのＩＧＦ−１を含む。かかるＡＴＥは、例えば軟組織の修復及び工学的操作で脂肪形成を刺激するのに特に適する。別の実施形態では、ＡＴＥは、総タンパク質１ｍｇ当たり、少なくとも７ｐｇのＶＥＧＦ、少なくとも７０ｐｇのＦＧＦ−２、及び少なくとも５０ｐｇのＩＧＦ−１を含む。かかる種類のＡＴＥは、例えば創傷治癒の誘発で、並びに虚血状態及び火傷の治療で血管形成を刺激するのに特に有用である。異なる特別調製されたＡＴＥは、具体的な用途で必ずしも重要とはなり得ないものの、異なる量の数種のその他のサイトカインを更に含むことができる（表１を参照）。一般的に、ＡＴＥは、約２：１〜約１：２のＩＧＦ−１及びＦＧＦ−２、並びに約１：１００〜約１：１０のＶＥＧF及びＦＧＦ−２を含む必要がある。

脂肪組織抽出物の含量は、ＡＴＥの調製において異なるインキュベーション時間及び温度を用いることにより、特別調製可能である。一般的に、インキュベーション時間は、数分〜数時間、例えばオーバーナイトの範囲である。例えば、約１時間のインキュベーション時間では、一般的に含有量約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２．５ｍｇ／ｍｌの総タンパク質、含有量約２００ｐｇ／ｍｌ〜約１３００ｐｇ／ｍｌのＩＧＦ−１、含有量約２００ｐｇ／ｍｌ〜約１４００ｐｇ／ｍｌのＦＧＦ−２、及び含有量約２ｐｇ／ｍｌ〜約２５ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦが得られる。換言すれば、１時間インキュベーションすると、一般的に総タンパク質１ｍｇ当たり含有量約１５０ｐｇ〜約５５０ｐｇのＩＧＦ−１、総タンパク質１ｍｇ当たり含有量約１００ｐｇ〜約５００ｐｇのＦＧＦ−２、及び総タンパク質１ｍｇ当たり含有量約３ｐｇ〜約２０ｐｇのＶＥＧＦが得られる。かかる種類の抽出物は、脂肪形成性及び血管形成性の両方を有する。しかし、特に高濃度のＶＥＧＦ（約２００ｐｇ／ｍｌ〜約１４００ｐｇ／ｍｌ、すなわちタンパク質１ｍｇ当たり約２５ｐｇ〜約５００ｐｇのＶＥＧＦ）が、例えば特に、所望の標的組織内で血管形成を誘発するために抽出物に含まれるのが望ましい場合には、インキュベーション時間は、例えば約２４時間まで延長する必要がある。２４時間インキュベーションすると、一般的に総タンパク質１ｍｇ当たり含有量約６０ｐｇ〜約２００ｐｇのＩＧＦ−１、総タンパク質１ｍｇ当たり含有量約１３０ｐｇ〜約５００ｐｇのＦＧＦ−２、及び総タンパク質１ｍｇ当たり含有量約２５ｐｇ〜約５００ｐｇのＶＥＧＦが得られる。更に、様々なインキュベーション温度、一般的に室温〜約３７℃の範囲が、脂肪組織抽出物を改変するために使用可能である。しかし、いくつかの実施形態では、４℃等の低温も利用可能である。なおも他の実施形態では、タンパク質が変性しない限り、より高い温度も利用可能である。

より一般的に、抽出物中のＶＥＧＦの濃度は、約１ｐｇ／ｍｌ〜約１４００ｐｇ／ｍｌの間で、及び好ましくは約１０ｐｇ／ｍｌ〜約１０００ｐｇ／ｍｌの間で、より好ましくは約７ｐｇ／ｍｌ〜約７００ｐｇ／ｍｌの間で、及び最も好ましくは約１０ｐｇ／ｍｌ〜約１００ｐｇ／ｍｌの間で変化し得る。抽出物中のＦＧＦ−２の濃度は、約２０ｐｇ／ｍｌ〜約１５００ｐｇ／ｍｌの間で、好ましくは約１００ｐｇ／ｍｌ〜約１３００ｐｇ／ｍｌの間で、より好ましくは約１５０ｐｇ／ｍｌ〜約１０００ｐｇ／ｍｌの間で、及び最も好ましくは約２００ｐｇ／ｍｌ〜約８００ｐｇ／ｍｌの間で変化し得る。ＩＧＦ−１の濃度は、約１００ｐｇ／ｍｌ〜約１５００ｐｇ／ｍｌの間で、及び好ましくは約１５０ｐｇ／ｍｌ〜約８００ｐｇ／ｍｌの間で、及び最も好ましくは約２００ｐｇ／ｍｌ〜約５００ｐｇ／ｍｌの間で変化し得る。一方、抽出物の総タンパク質濃度は、約０．７５ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌの間で変化し得る。好ましくは、総タンパク質濃度は、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２．７ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約２．７ｍｇ／ｍｌ、なおもより好ましくは約２ｍｇ／ｍｌ〜約２．７ｍｇ／ｍｌ、及び最も好ましくは約２．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．５ｍｇ／ｍｌである。

抽出物中の生物活性物質の濃度も、総タンパク質濃度に関連して規定し得る。従って、総タンパク質を１ｍｇ含む抽出物中のＶＥＧＦの量（タンパク質１ｍｇ当たりの増殖因子含量）は、約１ｐｇ〜約８００ｐｇの間で、及び好ましくは約３．５ｐｇ〜約５００ｐｇの間で、より好ましくは約７ｐｇ〜約３００ｐｇの間で、及び最も好ましくは約２０ｐｇ〜約１００ｐｇの間で変化し得る。総タンパク質を約１ｍｇ含む抽出物中のＦＧＦ−２の量（タンパク質１ｍｇ当たりの増殖因子含量）は、約１ｐｇ〜約１２００ｐｇの間で、好ましくは約１ｐｇ〜約６００ｐｇの間で、より好ましくは約７０ｐｇ〜約５００ｐｇの間で、及びなおもより好ましくは約１１０ｐｇ〜約４５０ｐｇの間で、及び最も好ましくは約２５０ｐｇ〜約３５０ｐｇの間で変化し得る。ＩＧＦ−１の量（タンパク質１ｍｇ当たりの増殖因子含量）は、約５０ｐｇ〜約７００ｐｇの間で、及び好ましくは約１００ｐｇ〜約５００ｐｇの間で、及びなおもより好ましくは約１００ｐｇ〜約３００ｐｇの間で、及び最も好ましくは約１１０ｐｇ〜約２３０ｐｇの間で変化し得る。

ＡＴＥは、数種類のその他の脂肪形成因子及び血管形成因子（表Ｉに示す）、例えば増殖因子、インターロイキン、補体系生成物、グルココルチコイド、プロスタグランジン、リポタンパク質、及び遊離脂肪酸、並びに細胞外マトリクス成分、例えばコラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、及びコラーゲンＶＩ、プロテオグリカン、エラスチン、及びヒアルロナンを、天然由来で、又はＡＴＥを更に特別調製するためにこれに添加されたものとして更に含むことができる。更に、ＡＴＥは使用する前に、例えば任意の望ましい薬物又は薬剤の補給を受けることができる。

一方、ＡＴＥは、使用する前に単一の増殖因子又はサイトカイン等の物質を除去することにより、更に特別調製可能である。ＡＴＥが、例えば虚血状態の治療において、主として血管形成性を誘発するために用いられる場合には、例えば、ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２等の血管形成阻害剤、並びにＩＧＦ−１、アディポネクチン、及び／又はレプチン等の主として脂肪形成因子を除去することができる。望ましい物質を除去又は単離する方法は、当技術分野では容易に利用可能であり、この方法には免疫吸着法による増殖因子の単離が含まれる。

ＡＴＥの特別調製として、特定の用途のために適したＡＴＥとするための濃縮（例えば、遠心分離による）、又は希釈（例えば、培地、滅菌生理的食塩水、又は任意のその他の緩衝化された等張溶液による）を更に挙げることができる。

脂肪組織抽出物の脂肪形成能力を、ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＳＣ）が、本実施形態による抽出物の存在下、非存在下で培養された細胞培養試験でテストした。図２に示し、例２で更に詳記するように、抽出物は、オイルレッドＯの色素蓄積（トリグリセリド形成）の増加により判断されるように、大半の幹細胞について脂肪細胞への分化を誘発したのは明らかである。

更に、本実施形態による抽出物の血管形成能力を、細管形成アッセイ法によりｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。ヒト内皮細胞は、脂肪組織抽出物、又はＶＥＧＦ及びＦＧＦ−２の存在下、非存在下で、線維芽細胞培養の最上部で培養された。すべてのケースにおいて、図３に示し、例３で更に詳記するように、血管形成、すなわち管形成が明確に認められた。しかし、ＡＴＥの血管形成能力は、明らかに用量依存性であった。

いくつかの実施形態では、本発明によるＡＴＥは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで脂肪形成性又は血管形成性を試験するための細胞培養培地、又は細胞培養培地補助剤として利用可能である。ＡＴＥは、細胞培養中に分化した脂肪細胞の分布さえも引き起こし、従ってヒトでのｉｎ ｖｉｖｏ条件を反映する優れた脂肪形成細胞モデルを提供する。今日まで、脂肪細胞分化に関する適当な細胞モデルは存在しない。

細胞培養において、特に臨床用途において、異種血清に置き換えたいという一般的な目標がある。ヒト血清は極めて高価であり、従って最適な解決策とはならない。本発明のいくつかの実施形態では、ＡＴＥは、細胞培養培地における細胞培養成分として、又は血清代替物として利用可能である。ＡＴＥはコスト効率が高いだけでなく、組織工学によるヒト構築物を生み出すのに、特に動物由来成分が適切でない場合に有用である。

本発明は、自己又は同族異種の細胞不含脂肪組織抽出物、及び生体適合性マトリクスを含むインプラントに更に関する。脂肪組織抽出物単独で、大型の、又は深部の軟組織の欠損を修復するのは困難であるが、提供される当該インプラントは、軟組織の欠損を充填するのに適し、機械的負荷に耐え、また新規組織の再生を可能にする。更に、当該インプラントは安定した長期結果、すなわち自然組織に似た感触や外観をもたらし、使用が容易で、無毒、不活性であるが、一方、栄養分及び代謝物が適切に拡散できるようにする。生体適合性マトリクスはヒトに対して無毒であり、組織内でほぼ不活性であり、小分子（例えば、増殖因子）に結合しまたこれを放出し、及び組織内で分解可能でなければならない。

本発明によるインプラントで用いられる生体適合性マトリクスは、好ましくはヒドロゲルである。本明細書で用いる場合、用語「ヒドロゲル」とは、親水性ポリマー鎖からなる高度に水和した物質で、その構造内に水を吸収することができ、その当初の容積の何百パーセント、何千パーセントにも膨張し、なおかつその構造を保つ物質を意味する。天然ポリマーのヒドロゲルはいくつかの有望な特性を有する。かかるヒドロゲルは分解可能で、温和な条件で処理可能であり、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の成分であるか、又はそのようなマトリクスと構造的類似性を有する。天然ポリマーは、ｉｎ ｖｉｖｏで多くの場合無毒であり、周囲の組織とよく相互作用する。ヒドロゲルの硬度又は剛性、分解速度、及び生物活性物質との結合速度又は同物質の放出速度は、具体的なインプラントの要望に応じて改変可能である。かかる改変方法は、当技術分野ですぐに利用可能である。

１つの適するヒドロゲル物質として、ヒアルロン酸又はヒアルロナンが挙げられ、これは結合組織の細胞外マトリクスを形成し、幅広く分布する天然の多糖類である。これはＮ−アセチルグルコサミン鎖に結合したＤ−グルクロン酸の基からなる。ヒアルロン酸は一般的に用いられる天然の生体物質であるが、それは免疫原性が全くなく、当技術分野で数十年にわたり安全に用いられてきたためである。架橋されたヒアルロン酸は、例えば商品名Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）（Ｑ−Ｍｅｄ、スウェーデン）、Ｅｌｅｖｅｓｓ（登録商標）（Ａｎｉｋａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、米国）、Ｊｕｖｅｄｅｒｍ（登録商標）（Ｌ．Ｅ．Ａ．Ｄｅｒｍ、フランス）、Ｒｅｙｏｕｎｇｅｌ（登録商標）（Ｂｉｏｈａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、中国）、Ｐｕｒａｇｅｎ（登録商標）（Ｇｅｎｚｙｍｅ、米国）、Ｐｒｅｖｅｌｌｅ Ｓｉｌｋ（登録商標）（Ｇｅｎｚｙｍｅ、米国）、Ｔｅｏｓｙａｌ（登録商標）（Ｔｅｏｘａｎｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、スイス）、Ｂｏｌｏｔｅｒｏ（登録商標）（Ｍｅｒｚ Ａｅｓｔｈｅｔｉｋ、ドイツ）、Ｒｅｖａｎｅｓｓｅ（登録商標）（Ａｕｒａｇｅｎｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ、オランダ）、及びＲｏｆｉｌａｎ Ｈｙｌａｎ Ｇｅｌ（登録商標）（Ｃａｉｒｏ Ｔｅｃｈ、エジプト）として市販されている。かかる架橋されたヒアルロン酸のうちのいくつか（例えば、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ）は、臨床用途で軟組織充填物質としてＦＤＡより承認を受けている。

本発明で用いるのに適する別のヒドロゲルとしてキトサンが挙げられ、これは、グルコサミン及びＮ−アセチルグルコサミンからなるポリマーを含む天然の多糖類である。徐々に分解可能な生体物質であり、ヒトに対して無毒であることから、キトサンは医薬品として工業界や研究室で幅広く利用されてきた。これまで、改変されたキトサンが、ホルモン、薬物、又はタンパク質用の制御放出式送達システムとして用いられてきたが、同システムでは、拡散及び生体物質の分解の両方により放出が生ずる。

本発明で用いられるその他の好適な天然ヒドロゲル構成材料は、当業者には容易に入手可能であり、それらには例えば、コラーゲン、アルギネート、ゼラチン、フィブリン、及びアガロースが含まれる。

ポリ乳酸（ＰＬＡ）ベースのポリエステル、ポリ乳酸グリコール酸ＰＬＧＡ、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）等の合成ヒドロゲルも、本発明の実施形態によるインプラントで、ヒドロゲルとして利用可能である。

材料に応じて、より高い脂肪形成性又は血管形成性を実現させることが可能である。異なる足場材料を選択することにより、又は材料を改変すること（例えば、ヒアルロナンの架橋）により、インプラントの脂肪形成効果又は血管形成効果を改善し、より高い血管形成能力又はより高い脂肪形成能力を有するように、当該効果を重点強化することが可能である。

本実施形態によるインプラントは、キトサンとヒアルロン酸との混合物等のヒドロゲルの混合物も含み得る。ヒドロゲルは、混合、共重合、又は官能基の付加により組合せ可能である。

いくつかの実施形態では、生体適合性マトリクスはナノ粒子又は微粒子を含み得る。例えば、微粒子は、例えばイオンゲル化法によりキトサンから作製可能であり、又は合成ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、若しくはＰＣＬ微粒子は、水中油中水（ｗａｔｅｒ−ｏｉｌ−ｗａｔｅｒ）法により生成可能であり、及び当該微粒子は、第２のヒドロゲル物質、例えばヒアルロン酸内に混合可能である。従って、脂肪組織抽出物は、インプラント内にあるナノ粒子又は微粒子内、及び前記粒子を取り巻くヒドロゲル内の両方に含めることができる。一般的に、ＡＴＥは、任意の分解可能な薬物放出デバイスと組み合わせることができる。

インプラント中の脂肪組織抽出物の量に対する生体適合性マトリクスの量は、一般的には生体適合性マトリクスが約３７％〜約５０％であり、抽出物は約５０％〜約６３％である。生体適合性マトリクスがヒアルロン酸等のヒドロゲルの場合、インプラント中のヒドロゲル含量が低下すると、ゲル構造の弱体化を引き起こし、その結果体内分解速度は速まる。１つの特定の実施形態では、インプラントはヒアルロン酸を約４５．５％、及び脂肪組織抽出物を約５４．５％含む。かかるインプラントは、受容者組織内への直接注入を可能にするのに十分軟弱なゲル強度を有する。

ヒドロゲル又はそれらを組み合わせたものも、架橋、凍結乾燥、混合、及び／又は共重合により改変可能であり、異なる濃度のヒドロゲルを組み合わせて使用することが可能である。インプラントのサイズも、非常に小さいもの（数マイクロリットル）から数十ミリリットルまで変化し得る。一般的には、例えば顔面再構築の目的で、１〜５ミリリットルのインプラントが用いられる。

インプラント中の脂肪組織抽出物含量は変化し得る。一般的に、インプラントは約３００μｇ／ｍｌ〜約１．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含み、好ましくは約６００μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、及びなおもより好ましくは８００〜９００μｇ／ｍｌに近い。

本発明によるインプラントは、任意の適する手段により移植可能である。注射は移植にとって実現可能な方法である。移植の別の形態は当技術分野で周知であり、例えば足場、フィルム、又は膜等が挙げられる。

本発明によるインプラントの脂肪形成能力及び血管形成能力は、動物実験により確認された。当該インプラントをラット皮下にｉｎ ｖｉｖｏで移植し、そして脂肪組織及び血管の形成を移植部位において監視した（例４、図４及び図５）。２週間後すでに、脂肪組織の蓄積の他、血管形成が認められた。４〜６週目では、広範な血管形成及び動脈様構造の他、若干の脂肪組織形成が、インプラントと緊密に接触した状態で認められた。１２〜２０週目では、高度に血管形成した、成熟脂肪組織の肥厚緻密層が、インプラントと緊密に接触した状態で検出された。４０週目では、インプラントは分解していたが、但し、成長した成熟脂肪組織はなおも存在し、本実施形態のインプラントを用いて得ることができる長期結果を実証した。従って、かかる結果は、本実施形態によるインプラントは軟組織工学、及びｉｎ ｖｉｖｏでの修復で真に用いられ得ることを実証している。

従って、本発明は、新規脂肪組織の形成及び血管形成を誘発するインプラントを提供し、並びにヒドロゲル構造内に捕捉、固定化された脂肪形成因子及び／又は血管形成因子を長期にわたり送達するシステムを提供する。本発明の生物活性インプラントは、宿主細胞の浸潤の誘発を支援し、より効率的な組織再生を可能にする。当該インプラントの効果は局所的、部位特異的であり、所定の効果を得るために必要とされる脂肪形成因子及び血管形成因子の全体用量を低減する。これはコスト効率が高いだけでなく、有害な全身効果を回避する方法でもある。

本発明は、本発明によるインプラントを作製する方法を更に提供する。当該方法は、脂肪組織抽出物を生体適合性マトリクスと混合するステップ、又は同マトリクスに当該抽出物を吸収させるステップを含む。当該混合ステップは、一般的に、ＡＴＥとヒドロゲル物質とが完全に混合するまで、気泡形成を避けつつ、滅菌シリンジ内において室温で慎重に実施される。当該抽出物は速やかにヒドロゲル物質中に捕捉、吸収され、いつでも移植に用いられる。

更に、本発明は、本発明による脂肪組織抽出物及びインプラントを軟組織の修復及び工学的操作で利用できるようにする。従って、当該抽出物及びインプラントは、成熟脂肪組織の発現及び適切な血管形成を実現するように、軟組織を修復する方法及び工学的に操作する方法で用いることができる。１つの特定の実施形態では、当該インプラントは注射により投与される。

更に、本発明は、本発明による脂肪組織抽出物及びインプラントを、血管形成誘発及び／又は虚血組織の修復で利用できるようにする。従って、当該抽出物及びインプラントは、適切な血管形成の発現を実現するように、毛細血管を修復する方法及び工学的に操作する方法で用いることができる。１つの特定の実施形態では、当該インプラントは注射で投与される。本発明に関連して、脂肪形成の場合、通常、組織中に既存の脂肪細胞又は脂肪組織幹細胞が存在すると有利であることが明らかにされている。当該インプラントが、例えば、脂肪細胞が全く存在しない状態で組織に投与された場合、インプラントの効果は脂肪形成性であるよりもむしろ血管形成性であるか、ほとんど血管形成性であり得る。

本発明の１つの利点として、インキュベーション時間が短く、混合も短時間で済むため、ＡＴＥの調製が容易で、その特別調製も迅速に行われることが挙げられる。従って、脂肪組織を誘導する、これをＡＴＥにし、更にインプラントに処理する全プロセス、並びに移植は１つの作業で完結し得る。

技術が進歩しているので、本発明の概念が様々な方法で実施可能であることは当業者にとって明白であろう。本発明及びその実施形態は、下記実施例に限定されることはなく、特許請求の範囲内で変化し得る。

（例１）
細胞培養及び動物試験のための脂肪組織抽出物の調製
脂肪吸引術より得られた、及び外科手術から皮下組織として得られたヒト脂肪組織試料、並びに犠牲ラットから得られたラット脂肪組織試料を、必要に応じて小片に細分化した。組織片又は脂肪吸引術試料を５０ｍｌの試験管（Ｎｕｎｃ）に移した。補給剤を一切含まない滅菌塩溶液（動物試験用）、又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（細胞培養試験用）を試験管に添加し、少なくとも４５分間インキュベーションした。インキュベーション中に、試験管を数回、穏やかに振とうした。脂肪組織抽出物（ＡＴＥ）のサンプルを様々な時刻に収集し（各収集時には、培地又は塩溶液を完全に除去し、新鮮な液に交換した）、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、及び細胞培養又は動物実験で使用する前に滅菌ろ過した。ＡＴＥを作製してから２４時間後に細胞を単離し、更に細胞を培養することにより、細胞の生存率を分析した。間質血管細胞群の細胞は形態学的に正常であり、生物学的活性を保持し、また正常に増殖した。

異なる患者に由来する、及び／又は異なる時点（１時間、２時間、又は２４時間）で収集されたヒトＡＴＥサンプル８０検体を、総タンパク質濃度について、ＢＣＡタンパク質アッセイ法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州、米国）により分析した。総タンパク質濃度は、常に１時間の時点（１．一定分量）、及び２時間の時点（２．一定分量）で最高値にあり、タンパク質濃度は時間と共に減少した（図１Ａ）。一般的に、総タンパク質濃度は、第１の一定分量（１ｈｒ）では約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約２．５ｍｇ／ｍｌであり、第２の一定分量（２ｈｒ）では約１．５ｍｇ／ｍｌであり、また第３の一定分量（２４ｈｒ）では約１ｍｇ／ｍｌであった。滅菌塩溶液中又は細胞培養培地中でインキュベーションした抽出物は、類似の総タンパク質濃度を有した。インキュベーション溶液（培地又は滅菌塩溶液）及び細分化した脂肪組織について等しい容積を抽出に用いると、最適なタンパク質生成が実現した。かかる条件では、タンパク質濃度はほぼ２ｍｇ／ｍｌとなり、これは細胞培養試験用として適する範囲内にある。しかし、濃度が高まった場合には、適当な範囲まで希釈することができ、また多くの場合希釈しなければならない。過剰にインキュベーションした溶液では、いずれもタンパク質濃度が低くなりすぎて、スピンカラムでの濃縮による更なる改変が必要であった。

更に、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、又はインスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）の濃度を、それぞれヒト脂肪組織抽出サンプル３１〜４０検体について、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ、それぞれ、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ免疫測定法、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ ＦＧＦ塩基性免疫測定法、又はＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ ＩＧＦ−１免疫測定法、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、英国）により測定した。ＥＬＩＳＡは、メーカーの説明書に基づき実施した。すべての標準品及びサンプルについて二重測定した。

結果によれば、ＩＧＦ−１濃度は１時間インキュベーションした後で最高レベルに達し（図１Ｂ）、一方ＦＧＦ−２濃度は、インキュベーションしている間、非常に高いレベルにあった（図１Ｃ）。ＶＥＧＦは、２４時間培養した後に、劇的に増加するようにみえた（図１Ｄ）。テスト結果に基づけば、脂肪形成誘発又は血管形成誘発に関して、１時間及び２時間のＶＥＧＦ濃度が適当であるが、但し、ＶＥＧＦは２４時間インキュベーション後に限り非常に高いレベルに達した。

更に、２つの異なる抽出サンプルから得られた全部で１２０種類の増殖因子とサイトカインを、２つの異なる時点（１時間及び２４時間）で、ＲａｙＢｉｏ（登録商標）ヒトサイトカイン抗体アレイＣシリーズ１０００（ＲａｙＢｉｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ジョージア州、米国）を用いてテストした。当該アレイは、メーカーの説明書に基づき実施した。全サンプルについて二重測定を行い、得られた結果は半定量的であった。表１中の（−）として表された因子は無発現であった、又はその発現は低く、従って当該アレイでは検知不能であった。

サイトカイン測定によれば、アレイの検出限界内にあるＡＴＥのサイトカインパターンは下記の通り：表１に示すように、１時間インキュベーションＡＴＥサンプルは、多量のアンジオジェニン、アディポネクチン、ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２、ＭＩＦ、ＩＧＦＢＰ−６、ＮＡＰ−２、レプチン、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＧＲＯ、並びに少量の数種のその他の因子を発現した。表１に示すように、２４時間インキュベーションＡＴＥサンプルは、多量のアンジオジェニン、ＩＬ−６、ＮＡＰ−２、ＭＣＰ−１、アディポネクチン、ＧＲＯ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、及び少量の数種のその他の因子を発現した。２４時間では、全体的に１時間よりも多くの種類のサイトカインを発現した（表１を参照）。レプチン、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＭＩＦ、及びＩＧＦＢＰ−６の発現は１時間で高く、２４時間では低かった。２４時間で、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＣＣＬ５、及びＶＥＧＦの発現は高かったが、１時間では少量しか検出されなかった。

従って、インキュベーション時間を変え、及び成長因子濃度を調節することにより、異なる用途のためにＡＴＥを作製、及び特別調製することが可能である。

略号：ＡｇＲＰ、アグーチ関連タンパク質；Ａｘｌ、ＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ；ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５；ＣＴＡＣＫ、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン；Ｄｔｋ、増殖因子受容体チロシンキナーゼ；ＥＧＦ−Ｒ、上皮増殖因子受容体；ＥＮＡ−７８、上皮好中球活性化ペプチド−７８；ＥＧＦ−Ｒ、上皮増殖因子Ｒ；ＦＧＦ−２、線維芽細胞増殖因子２；ＦＧＦ−４、線維芽細胞増殖因子４；ＦＧＦ−６、線維芽細胞増殖因子６；ＦＧＦ−９、線維芽細胞増殖因子９；ＧＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子；ＧＩＴＲ、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体；ＧＩＴＲ−リガンド、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体リガンド；ＧＲＯ、サイトカイン誘導好中球化学遊走物質１増殖関連腫瘍遺伝子；ＩＣＡＭ−１、細胞接着分子１；ＩＣＡＭ−３、細胞接着分子３；ＩＧＦ−１、インスリン様増殖因子１；ＩＧＦ−１ ＳＲ、インスリン様増殖因子１可溶性受容体；ＩＧＦＢＰ−３、インスリン様増殖因子結合タンパク質３；ＩＧＦＢＰ−６、インスリン様増殖因子結合タンパク質６；ＩＬ−１ Ｒ４／ＳＴ２、インターロイキン１受容体４；ＩＬ−１ Ｒ１、インターロイキン１受容体１；ＩＬ−５、インターロイキン５；ＩＬ−６、インターロイキン６；ＩＬ−８、インターロイキン８；ＩＬ−１１、インターロイキン１１；ＩＬ−１２ ｐ７０、インターロイキン１２ ｐ７０；ＩＬ−１２ ｐ４０、インターロイキン１２ ｐ４０；ＩＬ−１７、インターロイキン１７；Ｉ−ＴＡＣ、インターフェロン誘導性Ｔ細胞α化学遊走物質；ＬＩＧＨＴ、リンホトキシンに類似し、誘導性発現を示し、及びヘルペスウイルス侵入メディエーターに関するＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合する、Ｔリンパ球が発現する受容体；ＭＣＰ−１、単球化学遊走性タンパク質−１；ＭＣＰ−２、単球化学遊走性タンパク質−２；ＭＣＰ−３、単球化学遊走性タンパク質−３；ＭＩＦ、マクロファージ移動阻害因子；ＭＩＰ−１α、マクロファージ炎症タンパク質−１α；ＭＩＰ−１β、マクロファージ炎症タンパク質−１β；ＭＩＰ−３β、マクロファージ炎症タンパク質−３β；ＭＳＰ−α、マクロファージ刺激タンパク質α；ＮＡＰ−２、ヒト好中球活性化タンパク質−２；ＮＴ−４、ニューロトロフィン４；ＰＩＧＦ、胎盤増殖因子；ＴＩＭＰ−１、マトリックスメタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤；ＴＩＭＰ−２、マトリックスメタロプロテイナーゼ２の組織阻害剤；ＴＲＡＩＬ Ｒ３、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体３；ＴＲＡＩＬ Ｒ４、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体４；ｕＰＡＲ、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子；ＶＥＧＦ、血管内皮増殖因子；ＶＥＧＦ−Ｄ、血管内皮増殖因子Ｄ。

（例２）
脂肪組織抽出物の脂肪形成能力
ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＳＣ）は、Ｚｕｋ ＰＡら（Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．２００２年１２月；第１３巻（１２）：４２７９〜９５頁）から修正したプロトコールに基づき単離した。簡潔には、外科手術又は脂肪吸引術から得られたヒト脂肪組織試料を、必要に応じて小断片に切断し、０．０５％コラゲナーゼＩを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地内で、３７℃、６０〜９０分間、シェーカー内において酵素的に消化した。消化を容易にするために、インキュベーション中に組織を時々吸引した。間質血管細胞群及び幹細胞集団を分離するために、消化組織を６００×ｇで、１０分間、室温にて遠心分離した。消化済みの組織を、最初孔径１００μｍを有するフィルターでろ過し、次いで孔径４０μｍを有するフィルターでろ過した。得られたヒト幹細胞集団を、１５％ヒト血清（ＨＳ、Ｃａｍｂｒｅｘ）、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び１％抗生物質−抗真菌薬混合物（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２内で培養した。一定湿度に保たれた５％ＣＯ_２を含む空気雰囲気の下で、細胞を３７℃に維持した。細胞を付着させたまま１晩放置した。翌日、細胞を数回洗浄し、培地を交換してデブリを除去した。

ｈＡＳＣを上記のように培養し、また培地を２〜３日毎に交換した。２〜３名の異なる患者に由来する密集性の幹細胞培養物の初期通過物（ｐ１〜ｐ５）をトリプシン消化し、共にプールし、そして細胞１００００個／ｃｍ^２の密度で培地内に播種した。翌日、６つの異なる培養条件を適用した。

１）ヒト血清を補充した通常培地；ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１５％ヒト血清、１％抗生物質−抗真菌薬混合物、１ｍＭ Ｌ−グルタミン；

２）ＡＴＥを補充した培地；ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１５％ヒト血清、１％抗生物質−抗真菌薬混合物、１ｍＭ Ｌ−グルタミン；及び３００μｇ／ｍｌ（タンパク質濃度）のＡＴＥ（培地容積の約２５％）

３）ＡＴＥを補充した培地；ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１５％ヒト血清、１％抗生物質−抗真菌薬混合物、１ｍＭ Ｌ−グルタミン；及び６００μｇ／ｍｌ（タンパク質濃度）のＡＴＥ（培地容積の約５０％）

４）ＡＴＥを補充した培地；ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１５％ヒト血清、１％抗生物質−抗真菌薬混合物、１ｍＭ Ｌ−グルタミン；及び９５０μｇ／ｍｌ（タンパク質濃度）のＡＴＥ（培地容積の約７５％）

５）１５％ヒト血清、１％抗生物質−抗真菌薬混合物、１ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充したＡＴＥ（１２００μｇ／ｍｌのタンパク質濃度；最終培地容積の８３％）；

６）脂肪形成培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％抗生物質−抗真菌薬混合物、１％ Ｌ−グルタミン、３３Ｍビオチン、１７Ｍパントテン酸塩、１００ｎＭインスリン、１Ｍデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、及び０．２５ｍＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ、Ｓｉｇｍａ）。ＩＢＭＸは、最初の２４時間のみ脂肪形成培地内に留めた。

２〜３日毎に培地を交換した。規定時刻において（２〜３週間、及び５週間）、オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ）で細胞培養物を染色することにより脂肪細胞分化を評価した。細胞培養試薬は、別途記載しない限り、Ｇｉｂｃｏより入手した。

異なる培養条件における脂肪細胞分化を、オイルレッドＯ染色により検出される細胞内のトリグリセリドの蓄積に基づき評価した。簡潔には、オイルレッドＯを１００％イソプロパノールに溶解することにより、０．５％オイルレッドＯ溶液を作製した。当該溶液を蒸留水と２：３の比で混合し、１０分間室温に放置した。得られた溶液を、標準的ろ紙を用いてろ過した。染色する前に、細胞培養培地をウェルから吸引し、当該ウェルをＰＢＳで２〜３回穏やかにリンスした。４％パラホルムアルデヒド溶液を用いて、当該細胞を２０分間固定した。次に、当該ウェルを蒸留水で洗浄した。６０％イソプロパノール溶液中で、当該細胞を２〜５分間インキュベートし、その後、あらかじめ作製しておいたオイルレッドＯ溶液を添加し、５分間インキュベートした。水が透明になるまで、当該ウェルを蒸留水でリンスした。染色した細胞の位相差顕微鏡写真を、ＣＣＤカメラユニットに接続されたＮｉｋｏｎ ＴＳ−１００（Ｎｉｋｏｎ、東京、日本）を用いて撮影した。脂肪細胞に分化した量を、細胞中の赤色に染色された領域の範囲を評価することにより測定した。

各幹細胞集団では、脂肪組織抽出物は、１〜３週間培養した後に、ほとんどの培地内細胞に対して用量依存性の同系遺伝子脂肪形成変換を誘導することが認められた（図２）。少なくとも２００μｇ／ｍｌのＡＴＥを用いた時に脂肪形成効果が認められ、また最高２ｍｇ／ｍｌまでより高濃度のＡＴＥをテストした時には、脂肪形成効果はより広範に及んだ。本実験に用いられたＡＴＥは例１に記載するように調製され、タンパク質を１．８ｍｇ／ｍｌ、ＩＧＦ−１を１４３ｐｇ／ｍｌ、ＦＧＦ−２を１２３ｐｇ／ｍｌ、及びＶＥＧＦを３．６ｐｇ／ｍｌ含んだ。

（例３）
脂肪組織抽出物の血管形成能力
ＢＪ線維芽細胞（ＣＲＬ−２５２２；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州、米国）を、１０％ウシ胎仔血清、１％Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、及び１％抗生物質−抗真菌薬混合物（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。一定湿度に保たれた５％ＣＯ_２を含む空気雰囲気の下で、細胞を３７℃に維持した。培地を２〜３日毎に交換し、密集状態の細胞を１：４に分割した。

臍帯試料からヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を単離し、内皮細胞増殖培地（ＥＧＭ−２、Ｌｏｎｚａ）内で、パッセージ７まで培養した。一定湿度に保たれた５％ＣＯ_２を含む空気雰囲気の下で、細胞を３７℃に維持した。培地を２〜３日毎に交換し、密集状態の細胞を１：４に分割した。

本発明に基づく脂肪組織抽出物の血管形成能力を試験するために、ＢＪ線維芽細胞を、細胞２００００個／ｃｍ^２の密度で４８−ウェルプレートに播種し、密集状態になるまで培養した（３〜４日）。次に、ＨＵＶＥＣを密集した線維芽細胞培養物上に、細胞４０００個／ｃｍ^２の密度で播種した。ＨＵＶＥＣを播種する際には、培地をＥＧＭ−２培地（ＥＧＭ−２ブレットキット、Ｌｏｎｚａより）に交換した。翌日、並行共培養物を異なる方法で処理した；

１）陰性対照：内皮細胞基礎培地（ＥＢＭ−２培地、ＥＧＭ−２ブレットキットより）；

２）陽性対照Ａ：１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２（Ｓｉｇｍａ）を補充したＥＢＭ−２；

３）陽性対照Ｂ：５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２（Ｓｉｇｍａ）を補充したＥＢＭ−２；

４）４４０μｇ／ｍｌ（タンパク質濃度；細胞培養培地の総容積の約２５％）のＡＴＥを補充したＥＢＭ−２；

５）８８０μｇ／ｍｌ（タンパク質濃度；細胞培養培地の総容積の約５０％）のＡＴＥを補充したＥＢＭ−２；

６）１３２０μｇ／ｍｌ（タンパク質濃度；細胞培養培地の総容積の約７５％）のＡＴＥを補充したＥＢＭ−２。

すべての培地には、２％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミン、０．１％ＧＡ−１０００（硫酸ゲンタマイシン及びＥＧＭ−２ブレットキットからのアンフォテリシンＢからなる溶液）を補充した。本実験で用いたＡＴＥは例１に記載したように調製し、これには１．７６ｍｇ／ｍｌのタンパク質、１４３．４ｐｇ／ｍｌのＩＧＦ−１、１２３．１ｐｇ／ｍｌのＦＧＦ−２、及び３．５６ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦが含まれた。

内皮細胞特異抗体（抗フォンヴィレブランド因子）を用いた免疫細胞化学的染色を行う前に、細胞を７日間培養した。培養中、培地を１回交換した。

下記のように免疫細胞化学的染色を実施した：ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、氷冷した７０％エタノールで２０分間固定し、０．５％トリトンＸ−１００（ＪＴ Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ニュージャージー州、米国）で１５分間透過処理し、そして１０％ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、３０分間非特異的染色をブロックした。ブロックした後、フォンヴィレブランド因子一次抗体（ウサギ内で生成した抗ｖＷＦ、Ｓｉｇｍａ、１：５００）を用いて、細胞を４℃で一晩インキュベーションした。翌日、ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、二次抗体（ウサギＩｇＧ ＦＩＴＣに対するポリクロナール抗体，Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｈｉｄｄｅｎｈａｕｓｅｎ、ドイツ、１：５００）で３０分間インキュベーションし、そしてＰＢＳで３回洗浄した。染色後、５００μｌのＰＢＳを細胞培養ウェルに残し、当該ウェルをパラフィルムで密閉した。Ｎｉｋｏｎ ＤＳ カメラコントロールユニットＤＳ Ｌ−１を装備したＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＳ１００顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、東京、日本）で、蛍光を可視化し、そして画像をＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州、米国）で処理した。

脂肪組織抽出物は、第４日又は第５日から共培養物中に管状構造形成を誘発した。７日後、明白な管形成が陽性対照Ａ及びＢ（それぞれ、図３Ｅ及び図３Ｆ）、並びに８８０μｇ／ｍｌのＡＴＥ（図３Ｃ）又は１３２０μｇ／ｍｌのＡＴＥ（図３Ｄ）で処理された細胞で認められた。陽性対照Ａで増殖因子処理を行うと、かかる処理は明らかに、長く、薄い、分岐した典型的な毛細血管様構造形成を刺激した。しかし、陽性対照Ｂでは、増殖因子が過剰になると、その結果若干無秩序な、又はクラスター状の管構造が生じた。陽性対照Ａで増殖因子処理を行うと、組織内でｉｎ ｖｉｖｏの状況を示した。１３２０μｇ／ｍｌのＡＴＥを用いて得られた結果、また８８０μｇ／ｍｌのＡＴＥを用いて得られた結果でも、公知の血管新生増殖因子で得られた結果（陽性対照Ａ）と非常に類似していた。脂肪組織抽出物は、ＨＵＶＥＣ細胞に対して用量依存性の効果を生み出し、また毛細血管のネットワークを生成した。

（例４）
注射可能なインプラントの作製
本発明に基づく、２つの異なる注射可能なインプラントを、動物試験用に処方した：１）ラットＡＴＥを５４．５％（総タンパク質濃度が１．３ｍｇ／ｍｌ）、及びヒアルロン酸を４５．５％含むインプラント；及び２）ヒトＡＴＥを５４．５％（総タンパク質濃度が２．５ｍｇ／ｍｌ）、及びヒアルロン酸を４５．５％含むインプラント。かかる処方では、使用したヒアルロン酸は、２０ｍｇ／ｍｌの非動物由来の安定化ヒアルロン酸（ＮＡＳＨＡ）、すなわちＲｅｓｔｙｌａｎｅ（Ｑ−Ｍｅｄ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）であった。欠損の種類に応じて異なる形態の架橋化ヒアルロン製品（例えば、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ Ｐｅｒｌａｎｅ、又はＲｅｓｔｙｌａｎｅ Ｔｏｕｃｈ、又はＭａｃｒｏｌａｎｅ）も利用可能である。

１ｍｌのＲｅｓｔｙｌａｎｅを１．２ｍｌのＡＴＥと慎重に混合することにより、インプラントを作製した（例１に記載した通りに作製）。ラット皮下に配置した最終インプラント容積は、常に１００μｌであり、ヒアルロン酸４５．５μｌと、含有液５４．５μｌとから構成された。かかるインプラントは、組織への速やかな再吸収、又は注入部位からの漏出を防ぐのに十分粘稠であるが、多量の抽出物を含む。

５４．５％のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、及び４５．５％のヒアルロン酸を含む対照インプラントを、上記の通り作製した。

インプラントからのタンパク質の放出を調べるために、１２０μｌの各インプラントを、０．２μｍの孔径を有する９６−ウェルプレート用ストリップインサート（Ｎｕｎｃ）に注入した。当該インサートを９６−ウェル細胞培養プレートに配置し、１５０μｌのＰＢＳ中において３７℃で数週間インキュベーションした。３日毎にＰＢＳを交換した。総タンパク質分析及びＥＬＩＳＡ分析を行うために、一定量を収集し、−２０℃で保管した。対照インプラントはタンパク質を全く放出しなかったが、一方ＡＴＥ含有インプラントは、２週間の期間において３日間当たり最大３５０μｇ／ｍｌのタンパク質、及び３日間当たり最低１００μｇ／ｍｌのタンパク質を放出した。この放出実験により、インプラントからタンパク質が放出され、従ってインプラントは有効であることが明らかにされた。

（例５）
ｉｎ ｖｉｖｏでのインプラントの脂肪形成活性及び血管形成活性（動物試験）
すべての動物実験はフィンランド動物保護法に基づき、また西部フィンランド、州地方事務所、社会福祉及び保健サービス部門から承認を得た。

雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット２７匹（平均体重３００ｇ）を、ドミトール（Ｄｏｍｉｔｏｒ）（１ｍｇ／ｍｌ；０．５ｍｇ／ｋｇ）及びＫｅｔａｌａｒ（１０ｍｇ／ｍｌ；７５ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔した。例４に記載の通りに調製されたインプラント及び対照を、ラットの背部皮下に、１ｍｌシリンジ及び２７ゲージ針を用いて、最終容量１００μｌで注射した。インプラントを皮下に１、２、３、４、６、８、１２、又は２０週、及び９カ月間留置し、その後、当該動物を二酸化炭素で絶命させた。組織サンプルを移植部位から取り出し、組織学的分析を行うために処理した。本実験で用いたヒトＡＴＥは、例１に記載する通りに調製されたが、これには２．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質、２００ｐｇ／ｍｌのＩＧＦ−１、８６３ｐｇ／ｍｌのＦＧＦ−２、及び６１ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦが含まれた。本実験に用いたラットＡＴＥは、例１に記載する通りに調製されたが、これには１．３ｍｇ／ｍｌのタンパク質が含まれた。

組織サンプルを４％パラホルムアルデヒド中で１晩固定し、段階的に調製されたエタノールシリーズを用いて脱水し、パラフィン内に包埋した。組織学的分析を行うために、試料をミクロトーム（Ｍｉｃｒｏｍ ＨＭ ４３０、Ｍｉｃｒｏｍ ＧｍｂＨ、Ｗａｌｄｏｒｆ、ドイツ）を用いて５μＭの厚さの薄片に切削し、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。Ｎｉｋｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ ＦＸＡ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、東京、日本）を用いて画像を撮影し、Ｃｏｒｅｌ Ｄｒａｗ １０、及びＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ７．０を用いて処理した。

組織学試料をヘマトキシリン−エオシン染色すると、移植領域において新規血管形成及び脂肪組織形成が明らかとなった（図４及び図５）。非常に多くの小血管、及び赤血球を伴ういくつかの成熟した大血管が存在することが、移植してから２週間後に採取されたサンプルで検出された。脂肪組織形成は、ごくわずかしか、又は全く検出されなかった。移植後４週目に採取されたサンプルでは、いくつかの白色円形状の脂肪組織蓄積物が、残りのインプラント及び形成された血管構造と緊密に接触した状態で検出された。小型の脂肪組織蓄積物が検出されたが、これは新規に形成されたことを示唆した。移植後４週目又は６週目に採取されたサンプルでは、血管形成が進行し、極めて多数の小血管及び細動脈及び細静脈に類似した構造の他、いくつかの脂肪組織形成が認められた。形成された血管は、対照と比較して数が多いばかりでなく直径も大きかった。１２〜２０週目では、成熟した脂肪組織の高度に血管が発達した肥厚緻密層が、インプラントと緊密に接触した状態で検出された。

本実験では、炎症反応、インプラント分解速度、脂肪形成性及び血管形成性を、最長９カ月間追跡した。インプラント注入手順、又は麻酔からの術後回復に起因した合併症はなかった。炎症又は皮膜形成は検出されなかった。おそらくは、外来ヒアルロン酸物質により引き起こされた軽度の反応に起因して、インプラント及び対照のすべてが、いくつかの小血管形成を誘発した。しかし、ラットＡＴＥ及びヒトＡＴＥを含むインプラントを注入したラットに限り、血管形成は広範囲であった。ラットでは、ヒトＡＴＥは、ラットＡＴＥよりも多くの血管形成を引き起こしたが、但し、両ＡＴＥは、十分に脂肪形成を誘発したようであった。

（例６）
臨床前試験
滅菌シリンジ内への直接吸引による脂肪吸引サンプルから、ヒト脂肪組織抽出物を調製した。タンパク抽出を最大化するために、脂肪吸引により得られた脂肪２．５ｍｌを滅菌等張塩溶液１．５ｍｌと、滅菌シリンジ内で混合し、室温で４５分間インキュベーションした。インキュベーション中、シリンジを数回振とうした。得られた抽出物の総タンパク質濃度は２．５ｍｇ／ｍｌであり、また増殖因子濃度は、ＶＥＧＦが１７ｐｇ／ｍｌ、またＦＧＦ−２が１７７ｐｇ／ｍｌであった。

インキュベーション後、アダプターを介して第１のシリンジと連結している第２の滅菌シリンジ内に、０．２μｍフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ、Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ａｎ Ａｒｂｏｒ、米国）を経由して、抽出物を滅菌ろ過した。現在抽出物を収納する第２のシリンジを、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅを適当量含む第３の滅菌シリンジに、アダプターを介して連結した。Ｒｅｓｔｙｌａｎｅが０．９ｍｌ（４５．５％）、及び脂肪組織抽出物が１．２ｍｌ（５４．５％）の比率で、得られた滅菌脂肪組織抽出物をＲｅｓｔｙｌａｎｅと混合した。液相とゲル相とを、当該物質を第２と第３のシリンジ間で往復させながら注入することにより混合した。インプラント物質は十分均一と考えられ、その時淡いピンク色をした脂肪組織抽出物は当該物質内で均一に浮遊していた。最終的なインプラントは１．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含んだ。

３０Ｇ針を用いて健常志願者の脚部の異なる２つの部位に、得られたインプラントを速やかに皮下注射した。第１の部位は古い既存瘢痕組織を含み、インプラント４５０μｌを当該部位に注入した。脚部の第２の部位では、組織内に形成される円形の欠損部位が直径約１ｃｍとなるように、皮下脂肪組織を除去して２つの欠損を設けた。一方の欠損は対照としてそのままとし、他方には９００μｌのインプラントを注入した。

移植後、又はフォローアップ期間中に、アレルギー反応又はその他の合併症は認められなかった。前試験開始後３カ月目（１２週目）及び６カ月目（２８週目）に、インプラント部位から、並びに対照組織から生検を採取した。炎症反応は認められず、３カ月後でも多量のインプラント物質がなおも存在していた。血管形成の増加が、移植後の瘢痕組織に認められた。しかし、過剰な脂肪組織形成は、なおも存在しなかった。６カ月目（図６Ｃ）では、真皮内の組織容積は、対照と比較してかなり拡大しており、また正常で、高度に血管が発達した疎性結合組織を認めることができた。対照（図６Ａ）では、ごくわずかな血管しか認められない。６カ月目では、真皮下部において過剰の血管（細動脈様血管）形成が認められ（ｂ＝血管（ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ）、また新規に形成された脂肪組織（ａ＝脂肪組織（ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）も存在した（図６Ｃ）。臨床パイロット試験によれば、当該物質は極めて良好な耐容性を有し、また脂肪組織形成及び血管形成を誘発し、そして新規に形成された組織も、インプラントそのものが分解した後でも存在する。

このように、本発明は新規脂肪組織形成、及び血管形成を誘発するインプラントを提供し、またヒドロゲル構造中に捕捉、及び固定化された脂肪形成因子、及び血管形成因子を長期間送達するシステムを提供する。本発明の生物活性インプラントは、宿主細胞の浸潤を誘発するのに役立ち、またより効率的な組織再生を可能にする。当該インプラントの効果は局所的、部位特異的であり、所定の効果を得るために必要とされる脂肪形成因子及び血管形成因子の全体用量を低減する。これはコスト効率が高いだけでなく、有害な全身効果を回避する方法でもある。

Claims (17)

1. 事前決定された量のＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、及びＩＧＦ−１を含む、細胞不含脂肪組織抽出物。
2. 総タンパク質１ｍｇ当たりの前記増殖因子含量が、少なくとも１ｐｇのＶＥＧＦ、少なくとも７０ｐｇのＦＧＦ−２、及び少なくとも５０ｐｇのＩＧＦ−１である、請求項１に記載の抽出物。
3. 総タンパク質１ｍｇ当たりの前記ＶＥＧＦ含量が、少なくとも７ｐｇである請求項２に記載の抽出物。
4. アンジオジェニン、アディポネクチン、ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２、ＭＩＦ、ＩＧＦＢＰ−６、ＮＡＰ−２、レプチン、ＰＤＧＦ−ＢＢ、並びにＧＲＯを更に含む、請求項２に記載の抽出物。
5. アンジオジェニン、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＣＬ５、ＮＡＰ−２、ＭＣＰ−１、アディポネクチン、ＧＲＯ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２を更に含む、請求項２又は３に記載の抽出物。
6. 軟組織の修復又は工学的操作で、創傷治癒で、火傷治療で又は虚血状態の治療で用いられる、請求項１から５までのいずれか一項に記載の抽出物。
7. 請求項１から５までのいずれか一項に記載の細胞不含脂肪組織抽出物、及び生体適合性マトリクスを含むインプラント。
8. 前記生体適合性マトリクスがヒドロゲルである、請求項７に記載のインプラント。
9. 前記ヒドロゲルがヒアルロン酸、キトサン、フィブリン、コラーゲン、アルギン酸塩、ポリ乳酸ベースのポリエステル、ポリ乳酸グリコール酸、ポリカプロラクトン、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項８に記載のインプラント。
10. 注射可能である、請求項７から９までのいずれか一項に記載のインプラント。
11. 前記抽出物が同系異種である、請求項７から１０までのいずれか一項に記載のインプラント。
12. 軟組織の修復又は工学的操作で、創傷治癒で、火傷治療で又は虚血状態の治療で用いられる、請求項７から１１までのいずれか一項に記載のインプラント。
13. 事前に決定された量のＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、及びＩＧＦ−１を含む、細胞不含脂肪組織抽出物を調製する方法であって、
    ａ）生存細胞を含むホモジナイズされていない脂肪組織サンプルを提供するステップ、
    ｂ）前記サンプルを事前に決定された時間インキュベートするステップ、及び
    ｃ）前記抽出物を収集するステップ
    を含む前記方法。
14. 請求項１３に記載の方法によって取得可能な細胞不脂肪組織抽出物。
15. 前記脂肪組織抽出物を前記生体適合材料と混合する、又は前記脂肪組織抽出物を前記生体適合材料に吸収させるステップを含む、請求項７から１１までのいずれか一項に記載のインプラントを調製する方法。
16. 脂肪形成を誘発する方法であって、請求項７から１１までのいずれか一項に記載のインプラントを、これを必要とする対象に移植するステップを含む、前記方法。
17. 血管形成を誘発する方法であって、請求項７から１１までのいずれか一項に記載のインプラントを、これを必要とする対象に移植するステップを含む、前記方法。