JP2012503473A - 耐熱性耐圧性生物の材料への取り込み - Google Patents

Abstract

生存能力のある微生物を取り込んだ材料を製造する方法に関する。その材料は、高温及び／または高圧条件下で製造され、微生物は、これらの条件下になる前またはその最中に材料に取り込まれる。また、これらの条件下でも生存可能であり続け、また材料の性質に応じて様々な用途を有する微生物が提供される。
【選択図】なし

Description

本願は、生存能力のある微生物を取り込んだ材料を製造するための方法に関する。より具体的には、その材料（例えば、ポリマー、プラスチック、食品、医薬品）は、高温及び／または高圧条件下で製造（例えば、押出成形、ペレット化）され、微生物は、これらの条件下になる前またはその最中に材料に取り込まれる。また、これらの条件下でも生存可能であり続け、典型的には材料の性質に応じて様々な用途（例えば、プロバイオティクスとしてまたは酸素バリアを形成するため）を有する微生物が提供される。

多くの微生物の多種多様で有益な特性が長きにわたって認められている。典型的な例には、酸素の消費もしくは吸収、放射エネルギーの吸収（例えば、ＵＶ吸収）またはそのプロバイオティクスとしての使用が挙げられる。
しかしながら、これらの有益な特性が材料に取り入れられるように微生物を材料中に取り込むことは容易ではない。実際、ポリマー、樹脂等だけではなく、食品、動物用飼料、医薬品、薬物にまで至る多くの材料が、高温、高圧の条件下で調製される。例えば、永久非生分解性ポリマーの加工温度は、常圧条件であったとしても１００℃よりずっと高く、生体材料を取り込ませるには温度が高すぎる。生きている活性微生物をこのレベルの温度でその生物に致命的な影響を与えることなく着床させるのは不可能である。
そのため、導入する生物が通常は正常な周囲温度で有用な活動を行うとしても、材料製造中に生きているかまたは生存能力のある生物を取り込むことができないならば、利点は得られない。これはポリマーやプラスチックだけではなく、人間や動物が消費する材料（例えば、食物、薬物）にも言える。
材料を加工する温度が（可能性は否めないものの）必ずしもこれほど高いわけではないが、材料は、高温プロセス、例えば、食品の押出成形、調理時の押出成形、その他の押出成形プロセス（例えば、特許文献１）、ペレット化、圧力調理、成型、熱成形等を経ることが多い。これらの高圧プロセスもまた、高温（また恐らくは乾燥）と組み合わされることが多く、典型的な微生物の生存能に悪影響を及ぼす。例えば、Ｂｉｏｕｒｇｅらは、バチルス株（ＣＩＰ５８３２）をドッグフードに含めようとしたが、押出成形／発泡／乾燥プロセスによって芽胞の９９％より多くが失われてしまうことから、バチルス株ＣＩＰ５８３２を押出成形／発泡／乾燥プロセスの前にドッグフードに含めるべきではないと結論付けている（非特許文献１）。

この問題を回避するために、幾つかの解決策が当該分野において提案されている。ある方策は、微生物を使用せずに同じ機能を果たす化合物を使用することである。例えば、特許文献２は、活性化金属をプラスチック容器にその酸素バリア特性を目的として使用することについて開示している。これによって同様の効果は得られるものの、金属の使用は本質的に微生物より深刻な生分解性問題及び環境問題をひきおこす。また、これによってプロセスのコストがより高くなる。別の方策では、典型的には、細菌を含有しているコーティング層を押出成形またはペレット化された製品上に適用することによって高圧（及び／または高温）工程と材料中への微生物の混合とを分離する。特許文献３においては、動物用飼料の調製方法が提供され、この方法では死んだプロバイオティクス細菌を、押出成形またはペレット化されたペレットにコーティングして、そのコーティングされたペレットを、周囲空気または約１００℃を超えない温度にまで加熱された空気で乾燥させる。特許文献４には、２種類の物理的にはっきりと異なる成分、すなわちタンパク質源、脂肪源及び炭水化物源を含む少なくとも部分的に押出成形され得る第１成分と、生存能力のあるプロバイオティクス微生物を含む第２の物理的にはっきりと異なる成分とを含むペットフードが開示されている。
マトリックス成分と微生物とを分けて維持することから、これらの応用例では必然的にプロセス工程の数が多くなり、より複雑でコストの高い方法となる。更に、これらのプロセスは、微生物を材料から分離し得る場合にしか適用できず（例えば、微生物が材料の外側にくる）、活性が材料の外側ではなく内側で起きるべき場合は使用することができない。単細胞または多細胞生物の疎水性ポリマーへの取り込みが特許文献５で提案されていて、これは１００℃より高い温度ではあるが依然として標準的な圧力条件下の場合のものである。しかしながら、これは（単細胞または多細胞）生物を使用した実施例が含まれていないことから、そのような生物が記載の疎水性ポリマーの調製に使用されても依然として生存可能か否かは不明であり、生物の生存は考えにくい。これらの条件下では細胞中の水が沸騰し始めるからである。

要約すると、材料加工（例えば、ポリマー加工、食品加工）は、細胞または生物が生存できない高温で行われることが多いことが当該分野で知られている。更に、材料加工においては、特に材料を成型、ペレット化または押出成形する必要がある場合、高圧下で作業をすることが多い（例えば、ポリマー加工、食品加工の場合も）。印加される圧力も、（微）生物の生存能を確保するには高すぎる。更に、生物が生存可能であるためには、最低量の水が加工済み材料中に存在すべきである。実際、生存能が報告されたとしても、通常、この生存能は著しく低下している。

米国特許出願第２００５／０２３８７２１号 米国特許第５０３４２５２号 国際公開第２００７／６０５３９号 国際公開第２００６／１１０４０７号 国際公開第２００６／０２４１１５号

Ｂｉｏｕｒｇｅ Ｖ，Ｖａｌｌｅｔ Ｃ，Ｌｅｖｅｓｑｕｅ Ａ，Ｓｅｒｇｈｅｒａｅｒｔ Ｒ，Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ Ｓ，Ｒｏｂｅｒｔｏｎ Ｊ−Ｌ．Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉｅｔ ｏｆ Ｄｏｇｓ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．１９９８；１２８：２７３０Ｓ−２７３２Ｓ． Ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｈａｎｄｂｏｏｋ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ） Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９） Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４７），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９） Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９３） ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ Ｃｈｕｎ Ｊ．及びＢａｅ Ｋ．Ｓ．，Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｔａｘａ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐａｒｔｉａｌ ｇｙｒＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ ７８：１２３−１２７（２０００）

本発明は、生存能力のある微生物を様々な材料に取り込むことができ、材料の製造プロセス中の高圧及び／または高温条件下でも微生物が生存可能なままである方法を得ることを課題とする。この方法によって、製造された材料は、微生物の有益な特性を取り込むことができるものである。

従来は、材料加工温度は過酷すぎることから、生きているまたは生存能力のある（微）生物を材料（天然または合成ポリマー、樹脂、食品、動物用飼料、薬物等）に取り込むことはできなかった。同じことが、材料加工（例えば、押出成形、ペレット化、圧力調理、熱成型、圧縮成形、射出成形、熱成形、含浸、真空成形、発泡、ホットメルト等のプロセス）の間に印加される圧力にも言える。
しかし驚くべきことに、材料加工温度でも生き延びる特殊な細菌（特にはその芽胞）を、生存能を大きく失うことなく使用可能なことが発見された。更に、この細菌は材料加工温度でも様々な材料に取り込むことが可能であり、細菌は材料に取り込まれてもその特性を維持可能である。最も注目すべきことは、この特殊な細菌が、微生物を使用した作業で通常想定される温度よりはるかに高い温度にも耐えることである。しかしながら、そのような高温は、材料加工の分野（例えば、ポリマー加工、食品加工）では一般的であり、典型的には１００〜３５０℃の範囲、より具体的には１２０〜３００℃の範囲、より一層具体的には１３０〜３００℃の範囲、最も具体的には１５０〜３００℃の範囲である。特定の実施形態において、温度範囲の上限は（例えば生存能を上昇させるために）２２０℃、２１０℃、２００℃、より一層具体的には１５０〜２００℃に限定される。更に、材料加工中に印加される圧力下でも生存能を大きく失うことなく生き延びる特殊な細菌（特にはその芽胞）を使用可能である。ここでもまた、その細菌を、材料加工圧力下で様々な材料に取り込むことが可能であり、細菌は材料に取り込まれてもその特性を維持可能である。

これにより、第１の態様において、本発明は、生存可能であり続けながら高温に耐えることができる微生物、特には芽胞形成生物の同定及び単離に関する。第２の態様において、本発明は、生存可能であり続けながら高圧に耐えることができる微生物、特には芽胞形成生物の同定及び単離に関する。特定の実施形態において、生物（またはその芽胞）は、生存可能であり続けながら高温及び高圧の両方に（連続または同時に）耐えることができる。

特定の実施形態において、本発明は、ベルギー微生物保存機関（Ｂｅｌｇｉａｎ Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ＢＣＣＭ）にＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株、または、ｇｙｒＡ配列が、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株の部分ｇｙｒＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％同一であるバチルス株に関する。

別の形態において、生存能力のある生物が含まれた材料を製造するための方法が提供され、この方法は、天然または合成ポリマー、樹脂、食品、動物用飼料及び薬物から選択されるマトリックスと、温度１００〜３５０℃及び／または圧力１．５〜４００バールで生存可能な、微生物の生きているまたは生存能力のある芽胞とを、温度１００〜３５０℃及び／または圧力１．５〜４００バールで混合することを含む。

特定の実施形態において、微生物またはその芽胞は、温度１００〜３５０℃及び圧力１．５〜４００バールで生存可能である。特定の実施形態において、芽胞の混合は乾燥条件下で行われる。極めて特定の実施形態において、乾燥条件とは、存在する水の量が５０００ｐｐｍ未満であることを意味し、例えば、吸湿性ポリマーを、使用前に５０００ｐｐｍ未満の含水量にまで乾燥させることが可能である。これは特に非食品または非飼料マトリックスに当てはまることであるが、これは食品または飼料は水を含有していることが多いからである。別の特定の実施形態において、芽胞の混合が湿潤条件下で行われる場合があるが、細胞の内側または外側で水が沸点に到達しないような圧力及び温度となるように注意する必要がある。水の沸点と気圧との関係については当該分野において標準グラフが入手可能である。

更に特定の実施形態において、本方法で使用される微生物またはその芽胞は、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株、または、ｇｙｒＡ配列が、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株の部分ｇｙｒＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％同一であるバチルス株である。

一部の実施形態においては、天然または合成ポリマーが、おけるマトリックス材料として使用される。特定の実施形態において、ポリマーは、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アルコール、アミン、無水物、エポキシド、スチレン、官能化ビニル、官能化アリル、プロペン、ブタジエン、エチレン、イソシアネート、ラクタム、ラクトン、糖類、グルコース及びエステルから成る群から選択される少なくとも１種のモノマーを含む。

更に特定の実施形態において、ポリマーは極性ポリマーである。極性値は、当該分野、例えば非特許文献２で入手可能であり、典型的にはヒルデブラントパラメータで表される。極性値は、典型的には１２（無極性）〜４４（極度に極性）（ＭＰａ）^１／２である。本発明の目的のために、少なくとも１７、より具体的には少なくとも１８、より一層具体的には少なくとも１９、更により一層具体的には少なくとも２０、最も具体的には少なくとも２１（ＭＰａ）^１／２の極性値を有する場合、ポリマーは極性であると言うことができる。

別の特定の実施形態において、ポリマーは最低限の吸水値を有する。吸水値は以下のようにして測定される。すなわち、粒状ポリマーをまずプレスしてプレートにし、７０℃で乾燥させる。この事前に乾燥させたポリマープレートの重量を測定し、これを質量Ｍ１とする。その後、このプレートを既定の時間にわたって蒸留水中に沈め、表面水を除去した後に再度重量を測定する。これが質量Ｍ２となる。時間の関数として、吸水値は以下の式によって求められる。
重量％＝（Ｍ２−Ｍ１）×１００／Ｍ１
全ての測定は好ましくは２度行われて、平均をとるべきである。特定の実施形態において、吸収値は少なくとも０．０１、具体的には少なくとも０．０２、より具体的には少なくとも０．１、最も具体的には少なくとも０．２であるべきである。
更に特定の実施形態において、極性及び吸水値は組み合わされ、例えば、ポリマーは、望ましい特性に応じて少なくとも１７（ＭＰａ）^１／２の極性値及び少なくとも０．０１の吸水値を有する。高い吸水値は、ポリマーが時間の経過に伴ってより多くの水を吸収することを意味し、高い極性値は、ポリマー鎖と極性溶媒（すなわち、水）との間の相互作用がより大きいことを示す。ポリマーの極性は、所定の溶媒における溶解度に依存し、この溶解度は、化学構造、鎖分岐の量及び結晶化度に左右される。極めて特定の実施形態において、ポリマーは酸素透過性である。

特定の実施形態において、（マトリックス）材料ひいては得られる製品は、人間または動物が消費するためのものであり、微生物及びその芽胞はプロバイオティクスである。

特定の実施形態においては、追加の工程が行われ、この工程は、押出成形工程、ペレット化工程、圧力調理工程、熱成型工程、圧縮成形工程、射出成形工程、熱成形工程、含浸工程、真空成形工程、発泡工程またはホットメルト工程から選択可能である。この工程は、混合中または混合後に実行可能である。

更に特定の実施形態において、押出成形工程、ペレット化工程、圧力調理工程、熱成型工程、圧縮成形工程、射出成形工程、熱成形工程、含浸工程、真空成形工程、発泡工程またはホットメルト工程は、温度１００〜３５０℃及び／または圧力１．５〜４００バールで行われる。本方法で採用する温度及び圧力を可能な限り調節することによって、依然としてマトリックス材料を要望通りに扱い可能なまま微生物の生存能を最大限確保する。

更なる態様において、本発明は、生存能力のある微生物またはその芽胞が含まれ、天然または合成ポリマー、樹脂、食品、動物用飼料及び薬物から選択されるマトリックスを含む材料と、その材料の使用に関する。より具体的な実施形態において、この生存能力のある微生物は、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株、または、ｇｙｒＡ配列が、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株の部分ｇｙｒＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％同一であるバチルス株である。別の具体的な実施形態において、マトリックスは極性ポリマーである。

別の態様において、本発明は、生存能力のある微生物が含まれた材料を製造するために、温度１００〜３５０℃及び／または圧力１．５〜４００バールで生存可能であり、微生物の生きているまたは生存能力のある芽胞の使用に関する。より具体的な実施形態において、この生きているまたは生存能力のある芽胞は、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株、または、ｇｙｒＡ配列が、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株の部分ｇｙｒＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％同一であるバチルス株に由来する。

異なる微生物の乾熱耐性を示すグラフ。１：株ＩＤ９６９８（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓと同定）、２：ＬＭＧ８１９７、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｓｐｉｚｉｚｅｎｉｉ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に対して７０％より大きい配列同一性を示すｇｙｒＡ配列を有する細菌、３：Ｅｎｔｅｒｏｌ（登録商標）、生酵母（プロバイオティクス）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）を含む市販薬、４：Ｐｒｏｂａｃｔｉｏｌ（登録商標）、乳酸菌生菌（プロバイオティクス）（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭとＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ ＢＩ−０７との１／１混合物）を含む市販薬。左から右に、棒グラフは異なる熱処理を表す。 異なるポリマーの吸水性を、時間の関数として示すグラフ。Ｐｒｏｐ（ポリプロピレンまたはＰＰ）、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＥＴｇ（ポリエチレンテレフタレート−１，４−シクロヘキサンジメタノール）、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＵ（ポリウレタン）。 同じく異なるポリマーの吸水性を、時間の関数として示すグラフ。図２と同じ省略記号を使用する。ＢｉｏＰＥＴｇは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ芽胞の混合物が本発明方法に従って取り込まれたＰＥＴｇである。 湿度１００％に３日間にわたってさらされた後の液体含有量（％）を示すグラフ。 １００％のクロロホルム中の芽胞の生存率を、時間の関数として示すグラフ。

本発明を、特定の実施形態に関連して特定の図を参照しながら説明するが、本発明はこれらに限定されず、請求項によって限定される。請求項中のいずれの参照記号も、範囲を限定するものではない。図は概略的なものに過ぎず、非限定的である。図においては、説明を目的として一部の要素のサイズを強調し、正しい縮尺で描いていない場合がある。用語「含む・有する・備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を本明細書及び請求項で使用するにあたって、この用語はその他の要素または工程を除外しない。単数名詞について言及するのに不定冠詞または定冠詞が使用される場合、特に記載がない限り、これには複数の場合も含まれる。

更に、用語「第１、第２、第３」等は、同様の要素を区別するために使用され、必ずしも連続したまたは時系列の順番を表してはいない。このようして使用される用語が適当な状況下で同じ意味で使用され、また異なる順序で実行可能である。

以下の用語または定義は、本発明の理解を補助するためのものである。本願において特に定義されない限り、本願で使用の全ての用語は、当業者にとってのものと同じ意味を有する。当該分野の定義及び用語について、特に非特許文献３及び４を参照される。本願に記載の定義は、当業者によって理解されるものより狭い範囲を有すると解釈されるものではない。

本願で使用の用語「芽胞（ｓｐｏｒｅ）」または「内生胞子（ｅｎｄｏｓｐｏｒｅ）」は、多数の細菌によって産生される休眠状態にあり、丈夫で、非生殖性の構造体である。芽胞の主な役割は、環境ストレス下にある間、細菌を生き延びさせることである。したがって、ＵＶ及びガンマ線、乾燥、リゾチーム、温度、飢餓及び化学殺菌剤に耐性である。芽胞は一般に土壌及び水中に見られ、長期間にわたって生き延びる。芽胞ではなく外生胞子またはシストを産生する細菌もあるが、シストは、形成のされ方及び好ましくない条件への耐性度が内生胞子／芽胞とは異なる。芽胞はシストより耐性がずっと高い。

本願で使用の用語「極性ポリマー」は、溶解度パラメータを使用して極性であると分類されるポリマーのことである。溶解度パラメータは当該分野で周知であり、例えばハンセンパラメータ、ヒルデブラントパラメータが含まれる。ヒルデブラントパラメータは単位（ＭＪ／ｍ^３）^１／２またはＭＰａ^１／２で表される。ヒルデブラント溶解度パラメータ（δ）によって、材料間の相互作用の度合いを数値的に判断することができ、溶解度、特には多くのポリマー等の非極性材料にとっての溶解度の良い指標となる。同様のδ値を有する材料は混和性であることが多い。ヒルデブラントパラメータの値が高ければ高いほど、ポリマーはより極性である。本発明の目的のために、極性ポリマーは、１７以上、１８以上、１９以上、より具体的には２０、最も具体的には少なくとも２１（ＭＰａ）^１／２以上のヒルデブラントパラメータを有する。

本願で使用の用語「プロバイオティクス」は、十分な量を投与すると宿主に健康上の利益をもたらし、生きている微生物のことである。

第１の態様において、本発明は、生存可能であり続けながら高温に耐えられる微生物、特には芽胞形成生物の同定及び単離に関する。高温は、典型的には、１００〜３５０℃の範囲、より具体的には１２０〜３５０℃、１３０〜３５０℃、１４０〜３５０℃、１５０〜３５０℃、１２０〜３００℃、１３０〜３００℃、１４０〜３００℃、１５０〜３００℃の範囲である。或いは、高温を、１００℃、１１０℃、１２０℃または１３０℃より高いが２２０℃、２１０℃、２００℃、１９０℃、１８０℃、１７０℃、１６０℃または１５０℃を超えない温度と定義することができる。特定の実施形態において、微生物（またはその芽胞）は、これらの温度に長時間にわたってさらされても生存可能であり続ける。これらの微生物（芽胞）が上記の範囲の温度で生き残ることができる典型的な時間には、最高３０秒、最高４５秒、最高１分、最高９０秒、最高２分、最高１５０秒、最高３分、最高２１０秒、最高４分、最高２７０秒、最高５分、最高６分、最高７分、最高８分、最高９分、最高１０分、最高１５分、最高２０分、最高２５分、最高３０分、最高４５分、最高１時間、最高２時間、最高３時間、最高４時間、最高５時間、最高６時間、最高１２時間、最高２４時間、最高４８時間、最高７２時間またはさらに長い時間が含まれる。

第２の態様において、本発明は、生存可能であり続けながら高圧に耐えられる微生物、特には芽胞形成生物の同定及び単離に関する。高圧は、典型的には、１．５〜４００バール、２〜４００バール、３〜４００バール、４〜４００バール、５〜４００バール、１０〜４００バール、２０〜４００バール、２５〜４００バール、３０〜４００バール、４０〜４００バール、５０〜４００バール、７５〜４００バール、１００〜４００バール、１５０〜４００バール、２００〜４００バール、２５０〜４００バール、３００〜４００バール、１．５〜３５０バール、２〜３５０バール、３〜３５０バール、４〜３５０バール、５〜３５０バール、１０〜３５０バール、２０〜３５０バール、２５〜３５０バール、３０〜３５０バール、４０〜３５０バール、５０〜３５０バール、７５〜３５０バール、１００〜３５０バール、１５０〜３５０バール、２００〜３５０バール、２５０〜３５０バール、３００〜３５０バールの範囲である。上限が低くなる場合もあり、例えば、最高２５０バール、最高２００バール、最高１５０バール、最高１００バール、最高５０バール、最高４０バール、最高３０バール、最高２５バール、最高２０バール、最高１０バール、最高５バールの圧力である。１バールは、１００ｋＰａ及び０．９８６９２気圧に等しい。

特定の実施形態において、上記の微生物は、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株、または、ｇｙｒＡ配列が、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株の部分ｇｙｒＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％同一であるバチルス株である。更に特定の実施形態において、ｇｙｒＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一でさえある。配列同一性の割合は、当該分野で既知の方法に従って計算される（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム）。以下の用語：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウィンドウ」、（ｃ）「配列同一性の割合」は、典型的には、２つ以上の核酸またはポリヌクレオチド間の配列関係を表すために使用される。

（ａ）本願において、「参照配列」とは、配列を比較するための基準として使用される確定配列である。参照配列は、ある指定の配列のサブセットまたは全体になり得て、例えば完全長ｇｙｒＡ配列のセグメント（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１等）または完全ｇｙｒＡ配列である。

（ｂ）本願において、「比較ウィンドウ」とは、参照配列と比較するポリヌクレオチド配列のある連続した指定のセグメントのことを意味し、比較ウィンドウ内にあるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列を最適にアラインするために、参照配列（付加、欠失を含まない）に対して付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。一般に、比較ウィンドウは、少なくとも２０連続ヌクレオチド長であり、任意で３０、４０、５０、１００またはより長い連続ヌクレオチド長になり得る。当業者ならば、ポリヌクレオチド配列にギャップが含まれることによって参照配列との類似度が高くなるのを回避するために、典型的にはギャップペナルティを導入し、マッチ数から差し引くことがわかる。長さの異なる配列をアラインする際、比較ウィンドウは通常、２つの配列のうちの短いほうを使用して決定される。

（ｃ）本願において、「配列同一性の割合」とは、２つの最適にアラインされた配列を比較ウィンドウにおいて比較することによって求められる値を意味し、その際、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列を最適にアラインするために、参照配列（付加、欠失を含まない）に対して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。割合は、同じ核酸塩基が両方の配列に出現する位置の数を求めてマッチ位置の数を得て、このマッチ位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で割り、この結果を１００倍して配列同一性の割合を得ることによって計算される。

比較のために配列をアラインする方法は当該分野で周知である。遺伝子は、ＢＬＡＳＴ「ＧＥＮＥＭＢＬ」データベースに登録されている配列との同一性を調べるためにデフォルトパラメータ下でＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ、非特許文献５〜６）検索を行うことによって比較可能である。配列は、デフォルトパラメータ下でＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを利用して、ＧＥＮＥＭＢＬデータベースに登録されている全ての公開ＤＮＡ配列との同一性について解析可能である。

ＩＤ９６９８株は、高温に、たとえそれが上記の範囲にあっても特に耐性が高いことを特徴とする。特定の実施形態においては、乾熱処理中にこの高温となる。これらの範囲は、材料加工中、特には天然ポリマー加工、合成ポリマー加工、樹脂加工、食品もしくは飼料加工または医薬組成物（薬物）の加工中に適用される典型的な温度範囲内でもある。微生物の芽胞は、材料加工中に典型的に適用される様々な時間（約１５秒〜上記の時間範囲になり得る）にわたってこれらの温度にさらされたとしても、その生存能を保持し続ける。

また、ＩＤ９６９８株は、高圧に、たとえそれが上記の範囲にあっても特に耐性が高いことを特徴とする。これらの範囲は、材料加工中、特には天然ポリマー加工、合成ポリマー加工、樹脂加工、食品もしくは飼料加工または医薬組成物（薬物）の加工中（例えば、押出成形、ペレット化、圧力調理、熱成型、圧縮成形、射出成形、熱成形、含浸、真空成形、発泡、ホットメルト等の工程中）に適用される典型的な圧力範囲内でもある。微生物の芽胞は、材料加工中に典型的に適用される様々な時間（約１５秒〜上記の時間範囲になり得る）にわたってこれらの圧力にさらされたとしても、その生存能を保持し続ける。

材料加工には、高温工程、高圧工程またはその両方が含まれ得る。材料加工法に高温工程と高圧工程の両方がある場合、これらの工程は付随的に（材料が、高圧及び高温に同時にさらされる）または連続的に（高温工程に続いて（必ずしも直後ではないが）高圧工程が続く、またはその反対）起こり得る。高圧工程と高温工程の両方を伴う材料加工の例には、ペレット化（例えば、１．５バール下で７０〜９０℃）及び押出成形（例えば、３０〜４０バール下で１２５〜１５０℃。食品または飼料の場合、ドウ（生地）は典型的には２００〜３００ｇ水分／ｋｇを含有する）が含まれる。更なる態様において、材料の製造において上述したような耐熱性及び／または耐圧性微生物を使用するための方法が提供される。得られる材料は少なくとも１つの新しい特性を取り込むが、これは微生物を取り込むことによる直接的な結果である。
これにより、生存能力のある生物が含まれた材料を製造するための方法が提供され、この方法は、天然または合成ポリマー、樹脂、食品、動物用飼料及び薬物から選択されるマトリックスと、温度１００〜３５０℃及び／または圧力１．５〜４００バールで生存可能な、微生物の生きているまたは生存能力のある芽胞とを、温度１００〜３５０℃及び／または圧力１．５〜４００バールで混合することを含む。特定の実施形態において、微生物は、マトリックス／加工材料全体に均等に（均質に）分散させられる。

特定の実施形態において、微生物またはその芽胞は、温度１００〜３５０℃、また圧力１．５〜３５０バールで生存可能である。更に特定の実施形態において、マトリックスと材料との混合は、高温でのみ起こる（すなわち、１００〜３５０℃、より具体的には１００〜２２０℃、より具体的には１１０〜２００℃）。更により一層具体的な実施形態において、この高温は、乾熱処理中に達せられる。別の特定の実施形態において、マトリックスと材料との混合は高圧下でのみ起こる（すなわち、１．５〜４００バール）。更に別の特定の実施形態において、マトリックスと材料との混合は、高温及び高圧の両方で起こる。

高温及び／または高圧を維持する時間は特定のプロセスに左右され、典型的にはマトリックスの材料に応じて大きく異なり得る（マトリックスは例えば特定の融点、可塑性を有する）。しかしながら、扱う材料に応じて既知のプロセスを応用することができ、またそのようなプロセスに記載の温度及び圧力、またこのような温度または圧力をかけるべき時間を応用することができる。典型的には、温度または圧力は、少なくとも２秒、少なくとも５秒、少なくとも１０秒、少なくとも２０秒、少なくとも３０秒、少なくとも４０秒、少なくとも５０秒、少なくとも１分、少なくとも７０秒、少なくとも８０秒、少なくとも９０秒、少なくとも１００秒、少なくとも１１０秒、少なくとも２分、少なくとも５分、少なくとも１０分にわたって上昇させられる（１００〜３５０℃または１．５〜４００バール）。最長時間もプロセスに左右されるが、典型的には、最高３０秒、最高４５秒、最高１分、最高９０秒、最高２分、最高１５０秒、最高３分、最高２１０秒、最高４分、最高２７０秒、最高５分、最高６分、最高７分、最高８分、最高９分、最高１０分、最高１５分、最高２０分、最高２５分、最高３０分、最高４５分、最高１時間、最高２時間、最高３時間、最高４時間、最高５時間、最高６時間、最高１２時間、最高２４時間、最高４８時間または最高７２時間である。一部の生物は、マトリックスへの生存能力を残したままの取り込みに特に適している。したがって、特定の実施形態において、微生物またはその芽胞が、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株、または、ｇｙｒＡ配列が、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株の部分ｇｙｒＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％同一であるバチルス株である。

工業製品（包装材料、織物繊維、顆粒等）の製造プロセス中、微生物（特にはその芽胞）及び材料（例えば、ポリマー、食品、動物用飼料、医薬組成物）は、マトリックス材料を液体のままで、すなわちマトリックス材料の融点より高い温度または加工温度で通常は短時間混合される。特定の実施形態において、液状材料は沸騰しておらず、温度及び圧力条件は、水の沸点に達しないように選択される。取り込まれた微生物は、典型的には、条件（例えば、温度、圧力、渇水）が好ましくないものである限り不活性のままである。しかしながら、生息環境が好ましいものになるや否や、芽胞は有益な特性を有する活性な代謝細胞に変化する。好ましい周囲条件は通常、温度、圧力及び相対湿度の観点から生命に適した環境で製品が使用され始めるのに先行するまたはそれと一致する。条件が好ましい限り、その生物学的な活性形態はその目的とされる機能を果たす。条件がストレス条件に戻ると、微生物の活性形態は芽胞の形態に戻る。加工中、細菌の不活性形態は、マトリックスとして定義される連続相において封入される。好ましくは、この封入によって、生物は均質に分散させられる。これらの生物は複数の機能を有することができ、多数の考えられ得る用途を以下に示す。

特定の実施形態において、使用されるマトリックス材料は天然または合成ポリマーである。天然ポリマーには、例えば、セルロース及びその他の多糖類が含まれる。多種多様な合成ポリマーが存在し、その多くは極めて重要な工業化合物である（例えば、ＰＥＴ、ＰＶＣ、ＰＥ、ＰＵ、ＰＬＡ、ＰＰ等）。特定の実施形態において、天然または合成ポリマーは、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アルコール、アミン、無水物、エポキシド、スチレン、官能化ビニル、官能化アリル、プロペン、ブタジエン、エチレン、イソシアネート、ラクタム、ラクトン、糖類、グルコース及びエステルから成る群から選択される少なくとも１種のモノマーを含む。

取り込む特性または生物は、典型的には、その後に想定される用途のタイプに応じて異なる。特に重要な応用分野は食品包装部門であり、この部門では酸素バリアとして知られるものを、例えばＰＥＴボトル等の食品用の多層包装材料において使用する。このようなボトルは、ビール、フルーツジュース等の飲料に使用可能である。この場合のマトリックス材料はポリマーＰＥＴであり、製造プロセスの高温に耐えられる微生物が使用される。例えばパッケージに飲料を充填する場合、ＰＥＴの内部環境は水で飽和するため、微生物（の芽胞）が活性化して、ボトル内に存在する全酸素を消費する呼吸細胞が形成される。これはパッケージの内容物（例えば、食品、飲料）の酸化の防止に有益である。また、微生物の呼吸によってパッケージの壁面を通過しようとする全ての外部酸素が捕捉されるため、効率的な酸素バリアが形成される。
別の実施形態においては、微生物が二酸化炭素を消費するまたは内容物中で脱着を行って浸透バリアとして機能する二酸化炭素を産生する場合、二酸化炭素バリアが得られる。これらの用途では、脱水状態／乾燥状態の生物に再度水分補給が可能である必要がある。このため、このような用途で使用されるポリマーは、水飽和が可能であるべきであり、すなわちポリマーは、中の芽胞がその含水量を増大させて代謝的に活性な生物に戻れるように十分な含水が可能でなくてはならない。これは極性ポリマーの使用によって達成し得る。特定の実施形態において、マトリックス成分として使用されるポリマーは極性ポリマーである。或いはまたはそれに加えて、十分に高い吸水値を有するポリマーが使用される。特定の実施形態において、ポリマーのＨ_２Ｏ吸収値は少なくとも０．０１、少なくとも０．０２、少なくとも０．１または少なくとも０．２である。極めて特定の実施形態において、ポリマーは、十分に高い吸水値を有する極性ポリマーである。

用途の更なる例にＵＶブロッカーとしての働きがあり、ＵＶブロッカーは上の例と同様の形で作用する。このような場合、その芽胞が極めて強力にＵＶ光をブロックする微生物が使用されるべきである（典型的には、そのような芽胞は高濃度のアスタキサンチンを含有する）。この特徴は、耐水性の紫外線防止フィルム及びポリマーコーティングに利用可能である。
本方法の利用の別の例が、人間または動物が消費する材料（例えば、食品、動物用飼料（ペットフード）、薬物、医薬品等）の調製における利用である。典型的には、このような材料に取り込まれる微生物は、摂取されることによって生物の健康に与えるその有益な特性を目的として使用され、すなわちプロバイオティクスである。プロバイオティクス細菌または酵母培養物は、身体の天然の腸管内菌叢（微生物の生態系）の再構築の支援を目的としたものである。これらは抗生物質の投与後または消化管関連カンジダ症の治療の一環として推奨されることがある。プロバイオティクスによってアレルギー、過度のアルコール摂取、ストレス、有毒物質への暴露及びその他の疾患に対抗するための免疫系が強化されると言われている。これらの場合、人間の身体での効果が高い細菌は、有害な細菌が人間の健康に害を与えるほど増殖する事象の発生回数を低下させ得る。プロバイオティクスは、例えば乳糖不耐症への対処、大腸がんの予防、コレステロールの低下、血圧の低下、免疫機能の改善、感染症の防止、ヘリコバクター・ピロリ感染症の治療、抗生物質関連下痢の軽減、炎症の軽減、ミネラル吸収の改善、ストレス下での有害な細菌の増殖の防止並びに過敏性腸症候群及び潰瘍性大腸炎の症状の改善において有益であることが判明している。特定の実施形態において、（マトリックス）材料は人間または動物による消費用であり、微生物またはその芽胞はプロバイオティクスである。

微生物またはその芽胞は、例えば、当業者に知られているように粉末としてまたは凍結乾燥粉末として取り込むことが可能である。その他の形態であってもよく、マトリックス材料または実行するプロセスのタイプに依存する。

材料加工中、材料が特定の形状である必要があることが多い。例えば、食品、飼料及び薬物は押出成形されることが多く、動物用飼料はペレット化されることが多く、ポリマーは特定の形状に成型され得る。当業者はこれらのプロセスを知っている。現在では成形を典型的には微生物の添加前に行っているが（非特許文献１）、本願で提示の方法では、微生物の添加を、微生物の生存能力を維持したままそのような加工工程の前に行うことができる。この方法はより単純で費用対効果が高いだけでなく、微生物を材料全体に均等に取り込み可能であるという更なる利点を有する。
このため、押出成形工程、ペレット化工程、圧力調理工程、熱成型工程、圧縮成形工程、射出成形工程、熱成形工程、含浸工程、真空成形工程、発泡工程またはホットメルト工程を、マトリックス材料と微生物またはその芽胞との混合中またはその後に行う方法が提供される。更に特定の実施形態において、押出成形工程、ペレット化工程、圧力調理工程、熱成型工程、圧縮成形工程、射出成形工程、熱成形工程、含浸工程、真空成形工程、発泡工程またはホットメルト工程は、温度１００〜３５０℃で行われる。別の特定の実施形態において、押出成形工程、ペレット化工程、圧力調理工程、熱成型工程、圧縮成形工程、射出成形工程、熱成形工程、含浸工程、真空成形工程、発泡工程またはホットメルト工程は、圧力１．５〜４００バールで行われる。更に別の実施形態において、押出成形工程、ペレット化工程、圧力調理工程、熱成型工程、圧縮成形工程、射出成形工程、熱成形工程、含浸工程、真空成形工程、発泡工程またはホットメルト工程は、温度１００〜３５０℃及び圧力１．５〜４００バールで行われる（材料を高圧にさらした後に高温にさらす、またはその反対が可能であり、またこの加工工程中に両方が起こることは、温度と圧力とが同時に上昇することを必然的に示唆するものではないが、それも１つの可能性である）。

更なる態様において、本発明は、生存能力のある微生物またはその芽胞が含まれた材料に関し、この材料は、天然または合成ポリマー、樹脂、食品、動物用飼料及び薬物から選択されるマトリックスを含む。より具体的には、この材料は、上述のような本発明の方法によって得られる。特定の実施形態において、材料中の生存能力のある微生物は上述したように耐熱性及び／または耐圧性の生物である。より具体的には、この生存能力のある微生物は、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株、または、ｇｙｒＡ配列が、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株の部分ｇｙｒＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％同一であるバチルス株である。追加の実施形態において、上記の材料のマトリックスは極性ポリマーである。特定の実施形態において、材料は、限定するものではないがＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株、または、ｇｙｒＡ配列が、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株の部分ｇｙｒＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％同一であるバチルス株等の生存能力のある耐熱性及び／または耐圧性微生物を含有する上述のような極性ポリマーである。別の実施形態において、本発明は、酸素バリアとして生存能力のある好気性の耐熱性及び／または耐圧性微生物を含有する極性ポリマーの使用に関する。

別の態様において、本発明は、生存能力のある生物が含まれた材料を製造するための、微生物の生きているまたは生存能力のある芽胞の使用に関し、この芽胞は、温度１００〜３５０℃及び／または圧力１．５〜４００バール、より特定すると温度１００〜２２０℃及び／または圧力１．５〜５０バールで生存可能である。より具体的な実施形態において、この生きているまたは生存能力のある芽胞は、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株、または、ｇｙｒＡ配列が、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株の部分ｇｙｒＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％同一であるバチルス株に由来する。

本発明の細胞及び方法に関して特定の実施形態、特定の構成、材料及び／または分子を説明したが、形態及び詳細における様々な変更または改変を、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく加え得る。以下の実施例は、特定の実施形態をより詳しく説明するためのものであり、本願を限定するものはなく、請求項によって限定される。

実施例１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの特徴づけ
・微生物の培養
４種類のコロニー（ＩＤ９６９８ ｔ１、ＩＤ９６９８ ｔ２、ＩＤ９６９８ ｔ３、ＩＤ９６９８ ｔ４）を原料から単離することができ、個々のコロニーを純化し、分析した。原料は、アンティアトラス山脈の乾燥地帯であるモロッコのビウグラ（Ｂｉｏｕｇｒａ）から入手した。ここでは太陽光にさらされた乾燥した有機培養基上で夏の極めて高い温度にも耐える芽胞を発見する可能性があった。脂肪酸分析を行い、４種類の培養物全てが「バチルス及び関連種」の群に割り振られた。続いて、部分１６Ｓ ｒＤＮＡ配列解析を行ったところ、４種類の培養物全てが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ複合体に属すると同定された。

・部分ｇｙｒＡ配列解析を利用したＩＤ９６９８ ｔ１の更なる同定
部分ｇｙｒＡ配列解析及び系統学的研究：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ複合体内での種の識別のためのｇｙｒＡ配列の利用可能性はＣｈｕｎ及びＢａｅによって報告されていて（非特許文献７）、また既に実証に成功している。ｇｙｒＡ遺伝子は、ＲＡＰＤ分析の一環で抽出されたＤＮＡからＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲで増幅されたｇｙｒＡは、ＮｕｃｌｅｏＦａｓｔ（登録商標）９６ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、デューレン、ドイツ）を使用して精製された。シーケンシング反応は、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を使用して行われ、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＴ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を使用して精製された。シーケンシングは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１３０ＸＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を使用して行われた。プライマーは、配列を部分的に重複させて選択され、信頼性の高いデータが集められた。配列アセンブリングは、プログラムであるＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を使用して行われた。類似性マトリックスは、ソフトウェアパッケージであるＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｓ、ベルギー）を使用して、ギャップペナルティ０％で不明な塩基の排除後に相同性を計算することによって作成され、類似性マトリックスは、オープンギャップペナルティ１００％、ユニットギャップペナルティ０％のペアワイズアラインメントに基づく。

国際塩基配列ライブラリＥＭＢＬから収集されたリボソーム小サブユニット配列のアラインメントにおけるコンセンサス配列を含めた後、系統学的解析をソフトウェアパッケージであるＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｓ、ベルギー）を使用して行った。得られる系統樹は、近隣結合法を使用して構築された。

・結論
１．ＩＤ９６９８ ｔ１の系統学的位置は、明らかにＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ複合体にある。
２．幾つかのＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株に見られた高いｇｙｒＡ配列類似性（９５．９〜９９．７％）は、ＩＤ９６９８ ｔ１がこの種に属することを実証している。

実施例２：微生物の乾熱耐性
・材料及び方法
以下の微生物を試験した。
１．株ＩＤ９６９８（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓと同定）
２．ＬＭＧ８１９７：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｓｐｉｚｉｚｅｎｉｉ；ｇｙｒＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して７０％より大きい配列同一性を示す細菌
３．Ｅｎｔｅｒｏｌ（登録商標）：生酵母（プロバイオティクス）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）の入った市販の薬物
４．Ｐｒｏｂａｃｔｉｏｌ（登録商標）：乳酸菌生菌（プロバイオティクス）（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭとＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ Ｂｌ−０７との１／１混合物）の入った市販の薬物
なお、結果でも同じ番号を使用した。

・乾熱処理
既知の量の異なる微生物の粉末を直径８ｍｍのガラス試験管（ＶＷＲ、製品番号２１２−００１１）に移し、適切なプラスチックキャップで閉じた。最大で試験管の１／４まで粉末を入れた。試験管の３／４を、１００℃±０．１及び１１０℃±０．１のフライ油並びに２４０℃±５及び２８０℃±５の金属浴（バチルスの場合のみ）に沈めた。浴の温度を、データロガー付き熱電対で観察した。全ての処理において、温度を、砂を１／４充填した試験管でも観察した。これらの測定から、サンプルを所望の温度にまで温めるには１分かかると思われた。この温度を更に１分間にわたって維持した（２分間の処理）。酵母のサンプルだけは２４０℃で１分しか浸漬しなかったが、これは物理的に２分は実行不可能だからであった（サンプルの過剰な発泡）。また、バチルス株のサンプルは２８０℃で１分間だけ処理された。

処理後、１ｍｌのＰＰＳを試験管に加え、希釈系列をプレート上に並べた。４８時間にわたる３０℃でのインキュベーション後、全てのプレートでコロニーの数を数えた。３０℃でのインキュベーションを１日延ばしても、コロニーの数は増えなかった。インキュベーションは、全てのバチルス株について強化栄養寒天培地（ＮＡ＋）で、乳酸菌についてはＭＲＳ寒天培地（Ｍａｎ，Ｒｏｇｏｓａ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ ａｇａｒ）で、酵母についてはＹＧＣ寒天培地（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ Ａｇａｒ）で行われた。全ての測定は二連で行われ、結果はｌｏｇ ｃｆｕ／グラム粉末で表された。

・結果
図１の結果から、１００℃及び１１０℃での乳酸菌は既に±３．５０ｌｏｇの低下を見せたように思われた。これらの温度でのバチルス株の場合の低下は±１〜１．５ｌｏｇ単位であり、酵母株の場合、（コロニー形成能は初期に既に低かったものの）低下は観察されなかった。２４０℃で、酵母と乳酸菌の両方が依然として若干の増殖を見せる。しかしながら、これはわずかなものであった。両方のサンプルにおいて、ｃｆｕの数は絶対数で＞１０^８ｃｆｕから１０ｃｆｕに低下した。このわずかな割合の生き残りは、試験管のキャップについた微生物で間違いない。サンプルのこの部分は浴に沈めていないことから、同程度には加熱されなかった。若干異なる装置を使用した第２の実験において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株ＩＤ９６９８の乾熱耐性を、酵母及び乳酸菌の乾熱耐性と比較した。

・材料及び方法
以下の微生物を試験した。
１．株ＩＤ９６９８（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓと同定）
２．酵母：パン酵母Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ Ｉｎｓｔａｎｔ（Ａｌｇｉｓｔ Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ、ヘント）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
３．Ｐｒｏｂａｃｔｉｏｌ（登録商標）：乳酸菌生菌（プロバイオティクス）（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭとＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ Ｂｌ−０７との１／１混合物）の入った市販の薬物

・乾熱処理
乾熱処理を、熱重量分析機（ＴＧＡ）で行った。処理温度は１００〜２４０℃の範囲で１０℃間隔で変化させた。１０．８９ｌｏｇ芽胞／ｇのＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、１０．１７ｌｏｇ ｃｆｕ／ｇの酵母または９．０９ｌｏｇ ｃｆｕ／ｇの乳酸菌をそれぞれ含有する既知の量（約１５ｍｇ）を乾燥粉末を処理温度にまで予備加熱されたＴＧＡに入れ、２分間にわたって熱処理した。この粉末を滅菌マイクロピペットに移し、１ｍｌの滅菌生理食塩水（ＰＰＳ）に再懸濁させた。その後、適切な希釈物をＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓについては強化栄養寒天培地、乳酸菌についてはＭＲＳ寒天培地、酵母についてはＹＧＣ寒天培地上で培養した。全てのプレートを３日間にわたって３０℃でインキュベートしてからコロニー数を数えた。

・結果
試験した微生物の熱安定性における大きな違いを示した。処理温度１３０℃では、乳酸菌の場合、５ｌｏｇより大きい減少が起きた（表１）。同じ温度で、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ及び酵母では減少はほとんど観察されなかった。酵母の場合、処理温度１５０℃で大幅な減少が起き（３．６１ｌｏｇ）、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓでは１８０℃まで減少がほとんど見られなかった（＜１ｌｏｇ）。
なお、表１は、乾燥粉末の１５ｍｇサンプルにおける減少（ｌｏｇ ｃｆｕ）を示し、「＞」は、検出限界を表す。

より少ない量を使用しての酵母の乾熱耐性を評価するための一連のその他の比較実験においては、コロニー増殖の大幅な低下が既に１３０℃から観察された（データ示さず）。

実施例３：ポリマーの吸水分析
全ての試験ポリマーについて、時間の経過に伴う吸水量の増加が観察された（図２、図３）。図３において、ＰＵは極めて高い吸水量を示し、これは残り３つのポリマーと対照的である。これらの測定において、ＰＵは３日後に停滞状態に達する。ＰＥＴｇ及びＢｉｏＰＥＴｇ（すなわち、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ芽胞とＰＥＴｇとの混合物）の場合、高い吸収値も観察される。図３において、これら２種類のポリマー間でのわずかな差をはっきりと観察することができる。ＢｉｏＰＥＴｇの停滞状態は、１〜３日目に得られた。４日目からは、上昇を観察することができる。時間の経過に伴うＰＥＴの吸水量の少なさは予測可能であった。図４は、湿度１００％に３日間にわたってさらされた後の液体含有量（％）を示す。表２は、幾つかのポリマーについての極性値及び吸水値を示す。

実施例４：ポリエステル中への高温高圧取り込み後に生き残っている芽胞の測定
・導入
乾燥した芽胞材料を、高温及び高圧下でポリエステル中に取り込んだ。取り込みプロセス後の芽胞の生存率を、このポリエステルから芽胞を抽出することによって測定した。生きている芽胞の数を平板培養技法によって数えた。

・材料及び方法
乾燥芽胞粉末は、適切な発酵プロセス及び下流処理によって製造された。乾燥芽胞をポリエステルに取り込んだ。ポリエステルの典型的な例として、ＰＥＴＧを使用した。取り込みは、４％ｗ／ｗ濃度のポリマープレスで行われた。芽胞を含有していないポリマーのプレート（素材片）は、２１０℃、圧力１０ｋＮで５分間にわたってプレスされた。乾燥芽胞粉末を、素材片である２枚のポリマープレート間に正しい濃度でプレスすることによって、芽胞を取り込んだ１枚の新しいサンプルを得た。加工は２１０℃、２９バールで５分間にわたって行わされた。

芽胞が取り込まれた０．０２ｇのポリマープレートを、クロロホルム（ＣＨＣｌ_３）脱塩水混合物（１／１）に溶解させた。これは超音波浴中で１０分間にわたって行われた。溶解プロセス中、芽胞はポリマーからクロロホルム中に放出される。しっかりと攪拌することによって、放出された芽胞は速やかに水側に移動する。溶解後、ポリマーを含有するクロロホルムと、芽胞を含有する水との間で相分離が起きた。水中の生きている芽胞の量を、ＰＰＳで適切な１０倍希釈物を用意し、栄養寒天培地（ＮＡ）上に塗って培養することによって測定した。ＮＡプレートを４８時間にわたって３０℃でインキュベートしてから芽胞の数を数えた。

・結果及び結論
実験によって、１００％のクロロホルムでの１０分間の処理によって芽胞の数が最大で１．７ｌｏｇ減少することが判明した（図５）。抽出された芽胞は速やかに水相に移動し、クロロホルムとの接触時間は最小限に抑えられる。このため、抽出プロセスは芽胞の生き残りに最小限の影響しか与えないと予想することができる。表３の結果から、選択された芽胞がポリマーマトリックス中への高温及び高圧取り込み後も生き残り、取り込み後にこれらの生物を更に利用できることが見て取れる。なお、表３は、ポリエステル中への取り込み後の芽胞の減少を示す。

実施例５：材料特性が取り込まれた生物の酸素除去活性に与える影響
・導入
乾燥した芽胞材料を異なるポリマー材料に取り込んだ。ポリマーは、幅広い極性で選択された（表２）。ポリウレタン（ＰＵ）の極性＞ポリ乳酸（ＰＬＡ）。ポリマーの極性は、ポリマー吸湿性に大きな影響を与える。ポリマーの極性が高ければ高いほど、吸水量は多くなる。これは、幾つかのポリマーについての吸水データによって実証される（表２）。

・材料及び方法
乾燥した芽胞粉末は、適切な発酵プロセス及び下流処理によって製造された。乾燥芽胞を、２種類のポリマー（ＰＵ、ＰＬＡ）に４％ｗ／ｗ濃度で取り込んだ。ポリマーマトリックスへの取り込みは、ポリマープレスによって行われた。芽胞を含有していないポリマーのプレート（素材片）は、ＰＵについては１３０℃、ＰＬＡについては１７０℃の圧力１０ｋＮで５分間にわたってプレスされた。乾燥した芽胞粉末を、素材片である２枚のポリマープレート間で正しい濃度でプレスすることによって、芽胞をポリマーマトリックス内で溶融混合し、１枚の新しい混合サンプルを得た。加工は５分間にわたってＰＵについては１３０℃、ＰＬＡについては１７０℃の１０ｋＮで行われた。ヘッドスペース内の酸素の濃度を、窒素でのフラッシングによって±５％に設定した。９ｍｌの滅菌脱塩水の添加によって、芽胞の発芽に必要な高い湿度を達成した。酸素消費微生物の水中での増殖を防止するために、１０ｍｇ／ｌのアンピリシン、様々な抗生物質を添加した。酸素吸収測定は、１．２ｇのプレス加工されたサンプルを２１ｍｌのヘッドスペースを有する閉鎖容器に入れることによって行われた。

ヘッドスペース内の酸素濃度は、非侵襲的酸素測定装置であるＯｘｙｓｅｎｓｅ ２１０Ｔで測定された。

・結果
平均酸素吸収率（ｏｘｙｇｅｎ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒａｔｅ：ＯＡＲ）（ｍｌＯ_２／日）を２回繰り返した測定について計算した。ＰＵ及びＰＬＡに取り込まれた芽胞の酸素吸収率のデータを表４に示す。

ＰＬＡ及びＰＵ（極性値は２０より高い）のポリマーに関して、良好な活性酸素除去活性が認められた。ＰＵとＰＬＡの酸素吸収率に有意な差は観察されなかった。

この実験から、活性酸素除去剤として生物学的因子（芽胞）をポリマー中で使用する場合、極性及び吸水能に関して発明者が定義した基準に準拠しているポリマーを使用することができると結論づけることができる。

Claims (17)

1. ベルギー微生物保存機関（ＢＣＣＭ）にＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株であるか、
   または、ｇｙｒＡ配列が、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株の部分ｇｙｒＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％同一である
   ことを特徴とするバチルス株。
2. 生存能力のある生物が含まれた材料を製造する方法であって、
   天然または合成ポリマーから選択されるマトリックスと、
   温度１００〜２２０℃及び／または圧力１．５〜５０バールで生存可能であり、微生物の生きているまたは生存能力のある芽胞とを、
   温度１００〜２２０℃及び／または圧力１．５〜５０バールで混合するステップを有する
   ことを特徴とする製造方法。
3. 微生物またはその芽胞が、温度１００〜２２０℃及び圧力１．５〜５０バールで生存可能である
   請求項２に記載の方法。
4. 微生物またはその芽胞が、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株、または、ｇｙｒＡ配列が、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株の部分ｇｙｒＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％同一であるバチルス株である
   請求項２または３に記載の方法。
5. ポリマーが、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アルコール、アミン、無水物、エポキシド、スチレン、官能化ビニル、官能化アリル、プロペン、ブタジエン、エチレン、イソシアネート、ラクタム、ラクトン、糖類、グルコース、エステルから成る群から選択される少なくとも１種のモノマーを含む
   請求項２ないし４のいずれかに記載の方法。
6. ポリマーが、極性ポリマーである
   請求項２ないし５のいずれかに記載の方法。
7. ポリマーが、少なくとも２０（ＭＰａ）１／２の極性を有する
   請求項６に記載の方法。
8. ポリマーが、少なくとも０．２の吸水値を有する
   請求項２ないし７のいずれかに記載の方法。
9. 押出成形工程、ペレット化工程、圧力調理工程、熱成型工程、圧縮成形工程、射出成形工程、熱成形工程、含浸工程、真空成形工程、発泡工程またはホットメルト工程を、混合するステップの最中か、混合するステップの後に行う
   請求項２ないし８のいずれかに記載の方法。
10. 押出成形工程、ペレット化工程、圧力調理工程、熱成型工程、圧縮成形工程、射出成形工程、熱成形工程、含浸工程、真空成形工程、発泡工程またはホットメルト工程を、温度１００〜２２０℃及び／または圧力１．５〜５０バールで行う
    請求項９に記載の方法。
11. 乾燥条件下で高温となる
    請求項２ないし１０のいずれかに記載の方法。
12. 生存能力のある生物が含まれた材料であって、
    請求項２ないし１１に記載の方法によって得られる
    ことを特徴とする材料。
13. 生物が、好気性微生物である
    請求項１２に記載の材料。
14. 生物が、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株、または、ｇｙｒＡ配列が、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株の部分ｇｙｒＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％同一であるバチルス株である
    請求項１２または１３に記載の材料。
15. 生存能力のある生物が含まれた材料の使用であって、
    請求項１３ないし１４に記載の材料を酸素バリアとして使う
    ことを特徴とする使用。
16. 微生物の生きているまたは生存能力のある芽胞の使用であって、
    生存能力のある微生物が含まれた材料を製造するために、温度１００〜２２０℃及び／または圧力１．５〜５０バールで生存可能である微生物の生きているまたは生存能力のある芽胞を使う
    ことを特徴とする使用。
17. 芽胞が、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株、または、ｇｙｒＡ配列が、ＢＣＣＭにＩＤ９６９８で寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株の部分ｇｙｒＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％同一であるバチルス株に由来するものである
    請求項１６に記載の使用。

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