JP2014149189A

JP2014149189A - 生体粘膜由来検体測定イムノアッセイにおいて偽陰性を抑制する方法

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Publication number: JP2014149189A
Application number: JP2013017134A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Miyazawa; 恭宮澤; Yuki Shinohara; 友樹篠原
Original assignee: Denka Seiken Co Ltd
Current assignee: Denka Seiken Co Ltd
Priority date: 2013-01-31
Filing date: 2013-01-31
Publication date: 2014-08-21
Anticipated expiration: 2033-01-31
Also published as: EP2952896A4; KR102173675B1; KR20150113162A; EP2952896A1; WO2014119725A1; EP2952896B1; JP6116268B2; ES2711398T3; US20150369799A1

Abstract

【課題】生体粘膜由来検体に含まれるイムノアッセイ阻害物質の働きを抑制し、被検出物質を正確に、特異的に検出することを課題とする。
【解決手段】生体粘膜由来検体中の被検出物質を測定するイムノアッセイにおいて、硫酸基を２個以上有する化合物を含む検体処理液で検体を処理することにより、偽陰性を抑制することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、生体粘膜由来検体を使ったイムノアッセイにおいて、検体中の被検出物質を正確に、特異的に検出するための検体処理液の組成および前処理方法に関するものである。

生体由来検体から被検出物質を検出する方法として、Enzyme Linked Immuno Assay、イムノクロマト法、自動分析装置によるラテックス比濁法などが挙げられる。これらの方法に用いる検体種としては、血液、血清、喀痰、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、角結膜拭い液検体などがある。

血液、血清を除く、これらの検体種の多くは、生体粘膜由来の検体であり、粘膜免疫系に由来する生体防御成分を多く含む。この成分はイムノアッセイによる被検出物質の検出において、偽陽性や偽陰性の原因となることが知られている（特許文献１等を参照）。

また、イムノクロマトを原理とする迅速診断薬の多くは、ウイルス又は細菌の感染症を迅速・簡便に検出し、治療方針を決定する一つの手段として広く使われている。

上述の偽陽性や偽陰性は、イムノクロマトを原理とする迅速診断薬において、間違った治療を促し、治療を遅らせ、時には死に至るケースもある。特に、偽陰性は正確な診断・治療の妨げとなるため、非常に大きな問題である。

特開2009-52945号公報

生体粘膜由来検体に含まれるイムノアッセイ阻害物質の働きを抑制し、被検出物質を正確に、特異的に検出することを課題とする。

本発明者らは、生体粘膜由来検体を処理する処理液に2つ以上の硫酸基を有する分子を加えることで、被検出物質を正確かつ特異的に検出できることを見出し、本発明に至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] 生体粘膜由来検体中の被検出物質を測定するイムノアッセイにおいて、硫酸基を２個以上有する化合物を含む検体処理液で検体を処理することを含む、偽陰性を抑制する方法。
[２] 生体粘膜由来検体が、喀痰、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、角結膜拭い液及び糞便から選択される検体である、[１]の方法。
[３] 硫酸基を２個以上有する化合物が、PIPES(Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid))又はデキストラン硫酸塩である[１]又は[２]の方法。
[４] デキストラン硫酸塩が平均分子量5,000〜500,000のデキストラン硫酸ナトリウムである、[３]の方法。
[５] 検体処理液中に硫酸基を２個以上有する化合物が0.1〜２(w/v)％の濃度で含まれる、[１]〜[４]のいずれかの方法。
[６] イムノアッセイがイムノクロマトグラム法によるイムノアッセイである、[１]〜[５]のいずれかの方法。

生体粘膜由来検体を硫酸基を２個以上有する化合物を含む検体処理液で処理することにより、生体粘膜由来検体を用いたイムノアッセイの偽陰性を抑制することができ、被検出物質の正確な検出が可能になる。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、イムノアッセイにおいて、偽陽性及び偽陰性、特に偽陰性を防止し、被検出物質を正確に測定する方法である。ここで、偽陽性とは、検体中に被検出物質が含まれていないのにもかかわらず、アッセイにおいて陽性を示すシグナルが発生することをいい、偽陰性とは、検体中に被検出物質が含まれているのにもかかわらず、アッセイにおいて陽性を示すシグナルが発生しないことをいう。例えば、イムノクロマト法（イムノクロマトグラフィー法）においては、検体中に被検出物質が存在する場合、固定化した物質-被検出物質-標識試薬の複合体が固相支持体上に形成され、該複合体から発する標識試薬のシグナルが発生するが、偽陰性においては、上記の複合体が形成されない等の理由によりシグナルの発生が阻害されてしまう。

本発明の方法において、測定対象となる生体粘膜由来検体は、生体の粘膜由来の物質が混入している検体をいい、鼻咽頭粘膜由来検体や口腔粘膜由来検体があり、具体的には、喀痰、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、角結膜拭い液、糞便検体等が含まれる。生体粘膜由来検体中には粘膜免疫系に関与するIgA等の生体防御成分が含まれ、これらの成分がイムノアッセイの反応を阻害し偽陽性や偽陰性の原因となり得る。

本発明の方法において、測定対象となる被検出物質はイムノアッセイ、すなわち抗原抗体反応を利用したアッセイで測定し得る抗原又は抗体である。抗原としては抗体を作製し得るものなら如何なる抗原でもよく、例えば、タンパク質、多糖類、脂質等が挙げられる。これらの物質を含む原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、ウイルス等も検出し得る。

本発明の方法で偽陽性及び偽陰性、特に偽陰性を防止し、被検出物質を正確に測定するための測定系は、測定対象である被検出物質に対する抗体を用いるか、あるいは測定対象である抗体に結合する抗原を用いる抗原抗体反応を利用した測定系であるイムノアッセイである。このような測定系として、ELISA、イムノクロマト法、凝集法、自動分析装置によるラテックス比濁法、ウエスタンブロット、イムノブロット等が挙げられる。この中でも、粘膜由来物質の影響を受けやすいイムノクロマト法が好ましい。

本発明の方法においては、生体粘膜由来検体を、１分子中に硫酸基を２個以上有する化合物により前処理する。ここで１分子中に硫酸基を２個以上有する化合物による前処理は、採取された生体粘膜由来検体を１分子中に硫酸基を２個以上有する化合物を含む検体処理液に添加して混合することにより行うことができる。本発明においては、生体粘膜由来検体に前処理液としての検体処理液を添加して混合し、生体粘膜由来検体中の測定対象である物質を検体処理液により処理することを生体粘膜由来検体の前処理という。

１分子中に硫酸基を２個以上有する化合物としては、PIPES(Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid))、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）等のデキストラン硫酸塩が挙げられる。PIPESはC₈H₁₈N₂O₆S₂で表わされる化合物であり分子中に２個の硫酸基を有する。デキストラン硫酸ナトリウムは(C₁₁H₁₂O₂₈S₆. 6Na)nで表わされる化合物であり重合度により分子量が異なり分子量は1,000〜500,000程度（平均分子量1,600〜500,000）である。デキストラン硫酸ナトリウムは、種々の平均分子量のものが市販されており、例えば、平均分子量約1,600のもの、平均分子量約5,000のもの（分子量1,000〜9,000）、6,500〜10,000のもの、9,000〜20,000のもの、約500,000のもの等がある。硫酸基の数は分子量に依存しており、デキストラン硫酸ナトリウムはほぼ100％硫化されているので、平均分子量から硫酸基の数を算出することができる。例えば、平均分子量約5,000のもの（分子量1,000〜9,000）の硫酸基の数は約30、平均分子量6,500〜10,000のものの硫酸基の数は約55、平均分子量9,000〜20,000のもの硫酸基の数は約94、平均分子量500,000のもの硫酸基の数は約3253である。本発明の１分子中に硫酸基を２個以上有する化合物としては、平均分子量1,600〜500,000のもの、あるいは平均分子量5,000〜500,000のものを用いることができる。デキストラン硫酸ナトリウムの分子量は高いほど、低濃度でも偽陰性化を抑制できるので、デキストラン硫酸塩の中でも分子量500,000のデキストラン硫酸ナトリウムが好ましい。

本発明の方法における前処理は、生体粘膜由来検体に、１分子中に硫酸基を２個以上有する化合物を含む検体処理液を添加剤として添加し、検体を検体処理液中に浮遊させる。検体処理液には、緩衝液に１分子中に硫酸基を２個以上有する化合物の他、界面活性剤、BSA（ウシ血清アルブミン）、塩等を含ませればよい。緩衝液は限定されないが、pH６〜9程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液を用い得る。界面活性剤も限定されず、イムノアッセイで通常用いられる、Triton X-100、Tween 20、Tween 80、Pluronic、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）等を用いることができる。なお、１分子中に硫酸基を２個以上有する化合物として、緩衝作用を有する化合物を用いることもできる。例えば、上記のPIPESはグッド緩衝液の１つである。この場合でも、トリス緩衝液等の緩衝液を緩衝作用を有する物質として添加すればよい。

検体処理液中の１分子中に硫酸基を２個以上有する化合物の濃度は0.1〜２(w/v)％、好ましくは0.1〜１(w/v)％、さらに好ましくは0.25〜0.75(w/v)％、特に好ましくは0.4〜0.6(w/v)％である。

例えば、検体処理液数百μl、好ましくは200〜800μlに、上記の検体を添加し、よく攪拌し検体を浮遊させればよい。例えば、検体が唾液の場合、検体採取用の綿棒に唾液を含ませ唾液が含んだ綿棒を検体処理液に浸し、検体を浮遊させればよい。また、検体が咽頭拭い液の場合、綿棒を用いて咽頭の粘膜を採取した後、綿棒を検体処理液に浸し、検体を浮遊させればよい。

生体粘膜由来検体を検体処理液に浮遊させ、検体を浮遊させた検体処理液を検体として抗原抗体反応を利用した測定系で被検出物質を測定すればよい。検体を検体処理液に混合しよく攪拌して浮遊させればすぐにアッセイに用いることができる。例えば、イムノクロマト法においては、ニトロセルロース膜等の適当な固相支持体上に抗体等の被検出物質と結合し得る物質を固定化し、該固相支持体に毛管現象を利用して、着色ポリスチレン粒子や金コロイド等の適当な標識物質で標識した被検出物質（標識試薬）と結合し得る物質と被検出物質の複合体を展開移動させる。この結果、固定化した物質-被検出物質-標識試薬の複合体が固相支持体上に形成され、該複合体から発する標識試薬のシグナル（金コロイドの場合は、被検出物質と結合し得る物質を固定化した固相支持体部分が赤くなる）を検出することにより、被検出物質を検出することができる。

イムノアッセイは、５〜３５℃、好ましくは室温で行うことができ、生体粘膜由来検体の検体処理液による処理もこの温度範囲内で行えばよい。

さらに、本発明は１分子中に硫酸基を２個以上有する化合物を含む検体処理液であって、生体粘膜由来検体を測定するイムノアッセイにおいて偽陰性を抑制するための検体処理液を包含し、さらに、該検体処理液を含む、生体粘膜由来検体を測定するイムノアッセイにおいて偽陰性を抑制するためのイムノアッセイキットをも包含する。該イムノアッセイキットは、例えば、イムノクロマト法を行うための試薬を含んだイムノクロマト法用デバイス等を含む。

本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

調製例
１．抗B型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体の作製
B型インフルエンザウイルス抗原をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、３７℃インキュベーター中で維持し、B型インフルエンザウイルスＮＰ抗原を固相したプレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。

得られた腹水からプロティンＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により、それぞれＩｇＧを精製し、２種類の精製抗B型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を得た。

２．抗B型インフルエンザウイルス抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
精製した抗B型インフルエンザウイルスNP抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液をPETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンの所定の位置に線状に塗布し、45℃、30分間乾燥させ、抗B型インフルエンザウイルスNP抗体固定化メンブレンを得た（以下抗体固定化メンブレンとする）。

３．抗B型インフルエンザウイルス抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
ニトロセルロースメンブレンへの固定化に使用しなかったもう一つの精製した抗B型インフルエンザウイルスNP抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子（Thermo scientific社製）を0.1(w/v)％になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1(w/v)％になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris（pH9.0）、3(w/v)％BSAに再浮遊し、抗B型インフルエンザウイルスNP抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。

４．抗B型インフルエンザウイルスNP抗体結合着色ポリスチレン粒子の塗布・乾燥
３．で得た抗B型インフルエンザウイルスNP抗体結合着色ポリスチレン粒子をグラスファイバー不織布に所定量1.0μgを塗布し、45℃、30分間乾燥させた。

５．固定化メンブレン、乾燥パッド、他部材との貼り合わせ
２．及び４．で調製した抗体固定化メンブレンと乾燥パッドを他部材（バッキングシート、吸収帯（サンプルパッド）と貼り合せて5mm幅に切断し、インフルエンザウイルスB型試験片とした。

６．抗A型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体の作製
A型インフルエンザウイルス抗原をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、３７℃インキュベーター中で維持し、A型インフルエンザウイルスＮＰ抗原を固相したプレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。

得られた腹水からプロティンＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により、それぞれＩｇＧを精製し、２種類の精製抗A型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を得た。

７．抗A型インフルエンザウイルス抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
精製した抗A型インフルエンザウイルスNP抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液をPETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンの所定の位置に線状に塗布し、45℃、30分間乾燥させ、抗A型インフルエンザウイルスNP抗体固定化メンブレンを得た（以下抗体固定化メンブレンとする）。

８．抗A型インフルエンザウイルス抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
ニトロセルロースメンブレンへの固定化に使用しなかったもう一つの精製した抗B型インフルエンザウイルスNP抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子を0.1(w/v)％になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1(w/v)％になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris（pH9.0）、3(w/v)％BSAに再浮遊し、抗A型インフルエンザウイルスNP抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。

９．抗A型インフルエンザウイルスNP抗体結合着色ポリスチレン粒子の塗布・乾燥
８．で得た抗A型インフルエンザウイルスNP抗体結合着色ポリスチレン粒子をグラスファイバー不織布に所定量1.0μgを塗布し、45℃、30分間乾燥させた。

１０．固定化メンブレン、乾燥パッド、他部材との貼り合わせ
７．および９．で調製した抗体固定化メンブレンと乾燥パッドを他部材、バッキングシート、吸収帯、サンプルパッドと貼り合せて5mm幅に切断し、インフルエンザウイルスA型試験片とした。

実施例１ B型インフルエンザウイルス抗原検出イムノクロマト法における唾液検体による偽陰性化抑制効果の検証
10mM Tris（pH7.0）、3(w/v)％BSA、0.2(w/v)％Triton X-100を対照として、硫酸基を有する添加剤として、1分子当たりに硫酸基を1つ持つ緩衝液であるMES、硫酸基を2つもつ緩衝液であるPIPES、陰イオン性界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（以下SDS、硫酸基1つ/分子）、デオキシコール酸ナトリウム（以下DOC、硫酸基0/分子）、陰イオン性ポリマーであるポリアクリル酸ナトリウム（以下SPA、硫酸基0/分子）、デキストラン硫酸ナトリウム（以下DSS、硫酸基はデキストラン分子量に依存する）、対照としてデキストラン（以下DEX、硫酸基0/分子）について検証を行うべく、各組成の検体処理液を調製した（詳細は表１参照）。硫酸基を有する添加剤は緩衝液に0.5(w/v)％添加した。表１の６〜９のデキストラン硫酸ナトリウムはSIGMA社より入手した（カタログ番号は、それぞれ、D8906、D6921、D4911及びD7037である）。

綿棒（Exスワブ-001；デンカ生研社製）を口に含み、よく唾液を吸わせて、これを各組成の検体処理液400μLにそれぞれ浮遊する。これに不活化B型インフルエンザウイルスを30μL加え、混合する。混合液50μLをインフルエンザウイルスB型試験片のサンプルパッド部分に滴加し、10分後に目視判定を行った。B型テストライン上にシグナルを確認できたものを＋とし、シグナルが明らかに薄いものを＋weak、シグナルがあるかどうか判断が難しい場合を±、シグナルが確認できなかったものを−とした。また、同時に唾液なしについても試験を実施し、処理液の組成による反応系への影響を確認する。

結果、対照が唾液により偽陰性化してしまうのに対して、硫酸基を持つ緩衝液であるMES、PIPESは偽陰性化を抑制でき、特に2つの硫酸基を持つPIPESで効果が高かった。陰イオン性の界面活性剤では、唾液を加えてない系において、反応を阻害する傾向が見られ、SDSについては、唾液による偽陰性化を若干抑制できたが、著しい感度低下が認められた。これらの界面活性剤はニトロセルロースに固定化した抗体の脱離を招いているか、もしくはその変性効果により、B型インフルエンザウイルスNP抗原もしくは抗B型インフルエンザウイルスNP抗体を変性させてしまっている可能性がある。陰イオン性ポリマーでは、カルボキシル基を有するポリアクリル酸ナトリウムで効果がないのに対し、硫酸基を有するデキストラン硫酸ナトリウムでは偽陰性化をほぼ完全に抑制できた。デキストラン硫酸ナトリウムの対照であるデキストランでは効果はなかった。

以上の結果より、硫酸基を2つ以上持つ分子を処理液に加えることで唾液検体による偽陰性化を抑制できることが証明された。ここにデータは示していないが、デキストラン硫酸ナトリウムの分子量は高いほど、低濃度でも偽陰性化を抑制でき、低分子量では高濃度で使用する必要があった。よって、実施例２以降では平均分子量500,000のデキストラン硫酸ナトリウムを用いて検証することにした。
得られた結果を表２に示す。

実施例２ A型インフルエンザウイルス抗原検出イムノクロマト法における唾液検体による偽陰性化抑制効果の検証
実施例１で最も効果の高かった検体処理液No.6を用いて、A型インフルエンザウイルス抗原検出イムノクロマト法における唾液による偽陰性化抑制効果の検証を行った。

綿棒（Exスワブ-001；デンカ生研社製）を口に含み、よく唾液を吸わせて、これを各組成の検体処理液400μLにそれぞれ浮遊する。これに不活化A型インフルエンザウイルスを30μL加え、混合する。混合液50μLをインフルエンザウイルスA型試験片のサンプルパッド部分に滴加し、10分後に目視判定を行った。

結果、実施例1と同様に検体処理液No.6を使用することで、唾液による偽陰性化を抑制することが出来た（表３にまとめる）。

実施例３ A型およびB型インフルエンザウイルス抗原検出イムノクロマト法における鼻咽頭拭い検体による偽陰性化抑制効果の検証
実施例１で最も効果の高かった検体処理液No.6を用いて、A型およびB型インフルエンザウイルス抗原検出イムノクロマト法における鼻咽頭拭い液検体による偽陰性化抑制効果の検証を行った。

綿棒（Exスワブ-002；デンカ生研社製）を使って、鼻咽頭拭い液検体を採取し、これを各組成の検体処理液400μLにそれぞれ浮遊する。これに不活化A型インフルエンザウイルスもしくは不活化B型インフルエンザウイルスを30μL加え、混合する。混合液50μLを各試験片のサンプルパッド部分に滴加し、10分後に目視判定を行った。

結果、実施例1、2と同様に検体処理液No.6を使用することで、鼻咽頭拭い液検体による偽陰性化を抑制することができた（表４にまとめる）。

以上の結果より、本発明の硫酸基を持つ分子（特に2つ以上の硫酸基を持つポリマー）を含む検体処理液を用いることで、鼻咽頭粘膜由来検体、唾液検体（口腔粘膜由来検体）によるイムノアッセイにおける偽陰性化を抑制できることを見出した。

本発明により、偽陰性を抑制し、正確な測定が可能なイムノアッセイ系の構築が可能である。

Claims

生体粘膜由来検体中の被検出物質を測定するイムノアッセイにおいて、硫酸基を２個以上有する化合物を含む検体処理液で検体を処理することを含む、偽陰性を抑制する方法。
生体粘膜由来検体が、喀痰、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、角結膜拭い液及び糞便から選択される検体である、請求項１記載の方法。
硫酸基を２個以上有する化合物が、PIPES(Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid))又はデキストラン硫酸塩である請求項１又は２に記載の方法。
デキストラン硫酸塩が平均分子量5,000〜500,000のデキストラン硫酸ナトリウムである、請求項３記載の方法。
検体処理液中に、硫酸基を２個以上有する化合物が0.1〜２(w/v)％の濃度で含まれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
イムノアッセイがイムノクロマトグラム法によるイムノアッセイである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。