JP2014228432A - マイクロ流路の洗浄方法 - Google Patents

Abstract

【課題】マイクロ流路の破損などが抑制された状態で、より容易に流路内を洗浄できるようにする。【解決手段】ステップＳ１０２の洗浄工程では、測定直後であり、分析対象の生体試料が含まれる測定溶液がマイクロ流路に充填されている。この状態のマイクロ流路の一端より洗浄液を導入し、マイクロ流路の他端より測定溶液を吸引して流路内の測定溶液を流路内より排出するとともに流路内を洗浄液で置換し、洗浄液で流路内を洗浄する。【選択図】 図１

Description

本発明は、生体試料の測定を行うマイクロ流路の洗浄方法に関する。

臨床医学的な知見を得るにおいて、患者の生体内のホルモンバランスや疾患マーカーの定量を行う生化学分析（測定）は、非常に有益な情報源となる。例えば、健康診断や入院前の診断、入院後のアフターケアなど、様々な状況において逐次に生化学分析が行われ、分析により得られた最新の情報を元に、詳細な病名判断や治療方針、投薬量の調製などが行われる。

近年、集積回路の作製で培われたマイクロ加工技術を利用し、微小な構造のマイクロ流路の作製が可能となった。マイクロ流路は、マイクロリットル，ナノリットル単位の微量な生体試料の定量分注，混合，分離，および化学反応の効率化に優れた機能を発揮する。このため、マイクロ流路は、様々な検出装置と組み合わせることにより、生体試料の採集量が多く検査ごとの侵襲性が問題視されていた生化学分析の利便化が期待されている。

生化学分析では、蛍光観察や吸光度、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance；ＳＰＲ）やＱＣＭ（Quarts Crystal Microbalance）など、光学を利用した分析装置が多く用いられる。これらの分析装置でマイクロ流路を用いた測定を行う場合、検体ごとの測定誤差を無くし正確な測定値を得るためには、マイクロ流路の特に光学測定を行う部分は、常に均一に清潔な状態を維持することが重要となる。

生化学分析で生じる汚れは、主に非特異的なタンパク質または脂質の吸着に起因している。水溶性の低分子量のタンパク質汚れでは、水洗のみであっても半分程度除去される。しかしながら、特に未修飾の金属表面を有するマイクロ流路の場合、タンパク質の多くの残基の同時相互作用を一度に可能とするような分子量の大きなタンパク質や、不溶性に変化したタンパク質などは、水洗ではほぼ除去できない（非特許文献１参照）。

従来のマイクロ流路、もしくは生化学分析に使用するセルの主な洗浄方法としては、マイクロ流路チップごとアルカリ洗浄液などのタンパク質除去溶媒に浸す方法がある。また、通常の生化学分析で用いるセルの洗浄では、浸し洗浄では除去しきれない頑固な脂質汚れを除去するために、有機高分子を分解する強力な有機溶媒を使用することもある。

また物理的な洗浄方法として、粘着テープによる除去（特許文献１参照）がある。また、洗浄液の噴射、超音波洗浄などを組み合わせる洗浄方法（特許文献２参照）が挙げられる。ただし、超音波洗浄は細かい振動を流路に対して連続的に与えるため、ひびや傷が発生している場合や劣化している場合、流路を破損させる要因にもなる。このため、近年ではマイクロバブル発生装置を用いた洗浄方法も使用されている。

また、マイクロ・トータル・アナリシス・システム（μＴＡＳ），ラボオンチップ（Lab on a Chip）の分野でよく用いられるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）による流路や、金属面や帯電した表面が露出している部分を有する流路では、タンパク質が非特異吸着しやすい。このため、流路内部を生体適合性材料で修飾し、また、自己組織化膜（Self assembled monolayer：ＳＡＭ）などで被覆することで吸着を低減させることも効果的とされている。

特開２０１０−２１６９７３号公報 特開２０１０−１３３７２７号公報

N.C. Nwokem et al., "Inhibition of Cell Adhesion and Protein Adsorption onto Biomaterial Titanium by Polyethylene glycol", New York Science Journal, vol.4 no.7, 2011.

しかしながら、上述したマイクロ流路の洗浄方法では，廃液の処理や洗浄機材の関係上、完全に比特異的な吸着を除去するためには、マイクロ流路を一度検出装置から取り外すことになる。さらに流路の形状によっては、生化学反応後に生じた汚れにより表面状態が変化し、導入口から排出口までの洗浄液の均一な展開が難しい可能性もある。また、強力な有機溶媒での洗浄の場合、溶解力が強すぎるために、主にＰＤＭＳなどの樹脂やプラスチックまたガラスなどで作製されるマイクロ流路自体に損傷を与える危険性が高くなり、同一流路を用いた繰り返しの測定は難しくなる。また，強力な有機溶媒を用いる場合、人体への安全性を考慮する必要があり取り扱いが容易ではない。一方、１測定ごとの使い捨て仕様とすると，現行の生化学分析を行うための様々なコストの上昇につながる。

本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、マイクロ流路の破損などが抑制された状態で、より容易に流路内を洗浄できるようにすることを目的とする。

本発明に係るマイクロ流路の洗浄方法は、分析対象の生体試料が含まれる測定溶液が充填されているマイクロ流路の一端より洗浄液を導入し、マイクロ流路の他端より測定溶液を吸引して流路内の測定溶液を流路内より排出するとともに流路内を洗浄液で置換し、洗浄液で流路内を洗浄する洗浄工程と、マイクロ流路の一端より水を導入し、マイクロ流路の他端より洗浄液を吸引して流路内の洗浄液を流路内より排出するとともに流路内を水で置換し、洗浄液を流路内より除去するリンス工程とを備える。

上記マイクロ流路の洗浄方法において、洗浄工程に続いて、マイクロ流路の他端より洗浄工程とは異なる吸引力で洗浄液を吸引して流路内を洗浄する追加洗浄工程を備えるようにしてもよい。

以上説明したことにより、本発明によれば、マイクロ流路の破損などが抑制された状態で、より容易に流路内を洗浄できるようになるという優れた効果が得られる。

図１は、本発明の実施の形態におけるマイクロ流路の洗浄方法を説明するフローチャートである。 図２は、本発明の実施の形態におけるマイクロ流路の洗浄方法を適用するマイクロ流路を備える測定チップの構成を示す構成図である。 図３は、図２を用いて説明した測定チップ２００におけるマイクロ流路２０２の洗浄方法を説明するための説明図である。 図４は、洗浄方法の実験のために実際に作製した測定チップの構成を示す構成図である。 図５は、表面プラズモン共鳴測定における流速の算出について説明する説明図である。 図６は、第１洗浄条件を用いた場合の測定結果を示す特性図である。 図７は、第２洗浄条件を用いた場合の測定結果を示す特性図である。

以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態におけるマイクロ流路の洗浄方法を説明するフローチャートである。まず、測定を行い（ステップＳ１０１）、この直後に洗浄を行う（ステップＳ１０２）。ステップＳ１０２の洗浄工程では、測定直後であり、分析対象の生体試料が含まれる測定溶液がマイクロ流路に充填されている。この状態のマイクロ流路の一端より洗浄液を導入し、マイクロ流路の他端より測定溶液を吸引して流路内の測定溶液を流路内より排出するとともに流路内を洗浄液で置換し、洗浄液で流路内を洗浄する。

次に、ステップＳ１０３で、マイクロ流路の一端より水を導入し、マイクロ流路の他端より洗浄液を吸引して流路内の洗浄液を流路内より排出するとともに流路内を水で置換し、洗浄液を流路内より除去する（リンス工程）。

上述した実施の形態によれば、測定に引き続いて測定溶液の代わりに洗浄液をマイクロ流路に導入してマイクロ流路内を洗浄するようにしたので、まず、マイクロ流路が形成されている測定チップを、測定装置（検出装置）から取り外す必要がない。測定チップを取り外して洗浄を行う場合、測定チップの取り外しおよび洗浄後の測定チップの取り付けなどの作業が発生し、多くの時間を要することになる。これに対し、実施の形態によれば、取り外しや再度の取り付け作業が発生しないので、迅速な作業が行える。

また、取り外してから洗浄を行う場合、洗浄までの期間内に流路内が乾燥し、汚れがより強固に流路内壁面に付着し、汚れが除去しにくくなる場合が発生する。これに対し、実施の形態では、流路内を乾燥させることなく洗浄が行えるので、汚れの強固な付着などが抑制でき、より容易に洗浄が行えるようになる。

また、実施の形態では、マイクロ流路の洗浄において、マイクロ流路が形成されている測定チップ全体を洗浄液に浸漬する必要もない。測定チップ自体を洗浄液などに浸漬して洗浄する場合、マイクロ流路内の全域に洗浄液を展開させることは容易ではない。これに対し、実施の形態によれば、測定と同様に洗浄液をマイクロ流路内に導入するので、マイクロ流路内の全域に洗浄液を展開させることが容易に実現できる。

次に、実施の形態における洗浄方法を適用するマイクロ流路を備える測定チップについて、図２を用いて説明する。測定チップ２００は、透明な基板２０１ａと、基板２０１ａの上に配置された流路基板２０１ｂとを備え、基板２０１ａと流路基板２０１ｂとの間にマイクロ流路２０２が形成されている。測定チップ２００は、測定装置２１１に取り付けられている。

また、マイクロ流路２０２の一端には導入口２０３が接続している。導入口２０３は、流路基板２０１ｂを貫通して形成されている。また、マイクロ流路２０２の他端には、排出口２０４が接続している。排出口２０４も、流路基板２０１ｂを貫通して形成されている。導入口２０３と排出口２０４とが、マイクロ流路２０２により連通している。

排出口２０４には、まず、配管２０５により廃液タンク２０６が接続している。また、廃液タンク２０６には、配管２０７により負圧ポンプ２０８が接続されている。廃液タンク２０６は、密閉可能とされており、負圧ポンプ２０８を動作させて吸引させることで、例えば、マイクロ流路２０２内の液体が、排出口２０４および配管２０５を経由して、廃液タンク２０６に収容されるようになる。

次に、上述した構成の測定チップ２００におけるマイクロ流路２０２の洗浄について、図３を用いて説明する。図３は、実施の形態におけるマイクロ流路２０２の洗浄方法を説明するための説明図である。

まず、測定直後では、図３の（ａ）に示すように、マイクロ流路２０２の内部は、測定溶液３０１で満たされている。また、マイクロ流路２０２の内部には、タンパク質や脂質などによる汚れ３０２が残存している。

上述した測定直後の状態より、直ちにマイクロ流路２０２の一端より洗浄液３０３を導入し、マイクロ流路２０２の他端より測定溶液３０１を吸引してマイクロ流路２０２内の測定溶液３０１をマイクロ流路２０２内より排出するとともにマイクロ流路２０２内を洗浄液３０３で置換し、図３の（ｂ）に示すように、マイクロ流路２０２内を洗浄液で充填する。

マイクロ流路２０２には、図２を用いて説明したように、一端に導入口２０３が接続し、他端に排出口２０４が接続している。また、排出口２０４には、配管２０５により廃液タンク２０６が接続し、廃液タンク２０６には、配管２０７により負圧ポンプ２０８が接続している。負圧ポンプ２０８を動作させて配管２０７を介して廃液タンク２０６内を吸引して負圧状態とすれば、マイクロ流路２０２内の測定溶液３０１は、排出口２０４，配管２０５を介して廃液タンク２０６内に吸引されていく。

吸引を継続すれば、充填されていた洗浄液３０３も、図３の（ｃ）に示すように排出されていく。これらのことにより、洗浄液３０３でマイクロ流路２０２内を洗浄すれば、ほとんどの汚れ３０２が、洗浄液３０３とともにマイクロ流路２０２内より排出されて除去される。

また、続いて、マイクロ流路２０２の一端より洗浄液３０３を供給し、マイクロ流路２０２の他端より、上述した洗浄工程とは異なる吸引力で洗浄液３０３を吸引してマイクロ流路２０２内を洗浄する。例えば、より大きな吸引力（圧力）で洗浄液３０３を吸引する。この追加の洗浄工程により、１回目の洗浄工程でマイクロ流路２０２内に残存する汚れ３０２を除去する。吸引力を各々変化させて複数回の追加洗浄工程を行い、マイクロ流路２０２における洗浄液３０３の流れに強弱を付けてマイクロ流路２０２内の洗浄を行うようにしてもよい。

最後に、図３の（ｅ）に示すように、マイクロ流路２０２の一端より水３０４を導入し、マイクロ流路２０２の他端より洗浄液３０３を吸引してマイクロ流路２０２内の洗浄液３０３をマイクロ流路２０２内より排出するとともにマイクロ流路２０２内を水３０４で置換し、洗浄液３０３をマイクロ流路２０２内より除去する。また、マイクロ流路２０２の他端より水３０４を吸引し、マイクロ流路２０２内を空の状態とする。これにより、マイクロ流路２０２内が清浄な状態で、マイクロ流路２０２を用いた次の測定（検査）が行えるようになる。

次に、実際に作製した測定チップを用い、上述した洗浄方法を実施（実験）した結果について説明する。

はじめに、作製した測定チップについて図４を用いて説明する。測定チップ４００は、ＢＫ７ガラスを加工して形成した基板４０１ａと、基板４０１ａの上に配置された流路基板４０１ｂとを備える。流路基板４０１ｂは、ポリジメチルシロキサンより構成した板部材を加工することで形成し、深さ５０μｍの流路溝を形成している。この流路溝により、基板４０１ａと流路基板４０１ｂとの間にマイクロ流路４０２が形成されている。

また、基板４０１ａの表面のマイクロ流路４０２が配置される領域には、層厚５０ｎｍ程度のＡｕ層４１１を形成した。Ａｕ層４１１は、例えば、基板４０１ａの表面にスパッタリング法などにより堆積した金膜を、よく知られたリフトオフ法などのパターニング技術によりパターニングすることで形成する。Ａｕ層４１１を形成してあるので、マイクロ流路４０２の下面（基板４０１ａ側）は、Ａｕ層４１１から構成されることになる。

また、流路基板４０１ｂを貫通する円筒形状の導入口４０３を形成し、マイクロ流路４０２の一端に接続させ、流路基板４０１ｂを貫通する円筒形状の排水溝４０４を形成し、マイクロ流路４０２の他端に接続させている。導入口４０３は直径３ｍｍとし、排出口４０４は直径１．５ｍｍと下。これにより、導入口４０３と排出口４０４とが、マイクロ流路４０２により連通した状態となる。

なお、Ａｕ層４１１を形成した基板４０１ａおよび流路溝を形成した流路基板４０１ｂの各々の貼り合わせ面を、酸素ガスのプラズマ（反応イオン）の照射により活性化させた後、各々の貼り合わせ面を当接させて貼り合わせることで、両者を一体とした。プラズマの照射は、プラズマ処理装置の処理室内で実施する。プラズマは、出力７０Ｗのマイクロ波により生成し、また、処理室内には酸素を１００ｓｃｃｍで供給し、処理室内における酸素分圧は１０Ｐａとした。なお、ｓｃｃｍは流量の単位であり、０℃・１０１３ｈＰａの流体が１分間に１ｃｍ³流れることを示す。また、プラズマの照射は、５秒程度実施した。

次に、上述したように作製した測定チップを用いた測定について説明する。この測定は、表面プラズモン共鳴測定により行う。測定においては、測定チップを表面プラズモン共鳴測定装置（Ｓｍａｒｔ ＳＰＲ ＳＳ−１００；エヌ・ティ・ティ・アドバンステクノロジ株式会社製）に設置する。より詳しくは、測定プリズムに形成されている測定面上に、屈折率がＢＫ７ガラスと等しいマッチングオイルを塗布し、この上に測定チップの基板裏面を配置する。また、測定装置の光軸上に、測定チップの測定領域が重なる状態に、測定チップを配置する。測定領域は、測定チップのマイクロ流路の部分である。

また、上述したように測定チップを配置した後、排出口にステンレスパイプからなる配管で廃液タンクを接続し、また、廃液タンクにステンレスパイプからなる配管で負圧ポンプ（ＭＦＣＳ−ＶＡＣ，Ｆｌｕｉｇｅｎｔ社製）を接続した。これらの接続構成は、図２を用いて説明した構成と同様である。

上述した測定チップを用いた検査では、プロトロンビン時間の測定用の凝固試薬（１０マイクロリットル）およびコントロール血漿（１０マイクロリットル）を、連続的にマイクロ流路内に流し、凝固試薬とコントロール血漿との界面が、マイクロ流路内を移動する速度（流速）を測定する。また、１回の検査ごとに洗浄を行い、これを１０回繰り返した。

実施した洗浄について説明する。マイクロ流路の一端より洗浄液を供給する状態で、マイクロ流路の他端より上述した血漿および凝固試薬を含む測定溶液を吸引し、マイクロ流路内の測定溶液をマイクロ流路内より排出するとともにマイクロ流路内を洗浄液で置換し、引き続き洗浄液を排出することで流路内を洗浄する。

ここで、洗浄液は、アルカリ洗剤を水に溶解したものを用いる。また、測定溶液の排出では、吸引圧力（負圧）を３００００Ｐａとし、洗浄液の排出では、吸引圧力を２０００Ｐａとした。この洗浄を第１洗浄条件とする。なお、洗浄の後、マイクロ流路の一端より水を導入し、マイクロ流路の他端より洗浄液を吸引して流路内の洗浄液を流路内より排出するとともに、流路内を水で置換して洗浄液を流路内より除去し、この後流路内より水を除去した。

また、第２洗浄条件として、マイクロ流路の一端より洗浄液（１０マイクロリットル）を供給する状態で、マイクロ流路の他端より上述した血漿および凝固試薬を含む測定溶液を吸引し、マイクロ流路内の測定溶液をマイクロ流路内より排出するとともにマイクロ流路内を洗浄液で置換し、引き続き洗浄液を排出することで流路内を洗浄する。次いで、新たにマイクロ流路の一端より洗浄液を供給し、また、マイクロ流路内の洗浄液をマイクロ流路内より排出することで追加洗浄を行う。

この第２洗浄条件においても、洗浄液は、アルカリ洗剤を水に溶解したものを用いる。また、測定溶液の排出では、吸引圧力を１００００Ｐａとし、洗浄液の排出も、吸引圧力を１００００Ｐａとした。また、追加洗浄では、洗浄液の排出における吸引圧力を２０００Ｐａとした。なお、追加洗浄の後、マイクロ流路の一端より水を導入し、マイクロ流路の他端より洗浄液を吸引して流路内の洗浄液を流路内より排出するとともに、流路内を水で置換して洗浄液を流路内より除去し、この後流路内より水を除去した。

次に、流速の測定について説明する。流速の測定は、よく知られた表面プラズモン共鳴測定により行う。表面プラズモン共鳴測定においては、例えば、ＣＣＤイメージセンサのＸ方向の１ラインごとに屈折率を反映したデータが観測されている。このため、検出領域のマイクロ流路を、血漿と凝固試薬との接触領域が進行していくことにより発生する屈折率変化が、ＣＣＤイメージセンサのラインごとにどのタイミングで発生したかが記録される。このように、マイクロ流路内を流れる接触領域の時系列的な屈折率変化の測定の中で、屈折率変化の起こった時点（時刻）を読み取るようにすれば流速が得られる。

例えば、図５の（ａ）に示すように、ＣＣＤイメージセンサのＹラインごとに記録されている屈折率変化の時間変化から、屈折率のステップ変化が起こった時刻を読み取る。図５の（ｂ）に示すように、表面プラズモン共鳴角度に相当する最も光が吸収されたピクセル強度をカラープロファイルで表示することで、上述した読み取りの状態をより視覚的に表す。また、図５の（ｃ）に示すように、上述した読み取りにおけるＸラインごとの時間変化をカラープロファイルの変化で表すようにしてもよい。図５の（ｃ）に示す矢印で示される傾きが、流速となる。Ｙラインのピクセルに対応するマイクロ流路上の実距離（約１０μｍ）を代入して計算し、傾きである流速はμｍ／ｓｅｃの単位で記述される。なお、図５では、カラープロファイルをグレースケールで簡略化して示している。

次に、測定の結果について図６，図７を用いて説明する。図６は、測定の間の洗浄を第１洗浄条件で実施した場合の結果を示している。また、図７は、測定の間の洗浄を第２洗浄条件で実施した場合の結果を示している。

第１洗浄条件で洗浄を行うと、図６に示すように、測定を重ねると流速が減少し、また、測定回数の増加とともに、測定される流速の誤差が大きくなっている。これに対し、第２洗浄条件で洗浄を行うと、図７に示すように、測定を重ねても流速の減少はあまりみられず、また、測定される流速の誤差も大きくならない。図７に示す結果では、測定データの相対標準偏差は３．８％である。この結果より、第１洗浄条件に比較して第２洗浄条件の方がより高い洗浄効果が得られていることが分かる。

ここで、試料（血漿）とマイクロ流路壁面が触れ合う時間の経過に従ってタンパク質の非特異吸着は増加する。第１洗浄条件では、測定溶液の排出において、吸引圧力を３００００Ｐａと比較的高い圧力としている。このため、弱い結合でマイクロ流路内壁面に吸着していた汚れが、高い圧力により発生した摩擦により壁面に押し付けられる状態となり、より強く吸着する状態になったため、上述した結果になったものと考えられる。上記測定により発生する汚れの１つに、血漿と凝固試薬との混合により生化学的に発生した凝固現象で発生した凝固物質がある。この凝固物質の固着力が、第１洗浄条件では上述したことにより強まることが考えられ、結果として高い洗浄効果が得られなかったものと考えられる。

ただし、測定の間に洗浄を行わずに、複数回の測定を連続して行うと、２回目以降の測定では、測定される流速が非常に小さくなり、２回目以降は測定が不可能な状態となった。従って、第１洗浄条件であっても、測定の間に上述した洗浄を行うことで、マイクロ流路内の汚れが低減できていることが分かる。

以上に説明したように、本発明では、測定の直後に分析対象の生体試料が含まれる測定溶液が充填されている状態のマイクロ流路の一端より洗浄液を導入し、マイクロ流路の他端より測定溶液を吸引して流路内の測定溶液を流路内より排出するとともに流路内を洗浄液で置換し、洗浄液で流路内を洗浄するようにした。この結果、本発明によれば、マイクロ流路の破損などが抑制された状態で、より容易に流路内を洗浄できるようになる。

このようにした本発明は、臨床検査（生化学分析）において、多量サンプルの連続測定（繰り返しの測定）を、マイクロ流路内で行う際の洗浄手段として有効である。

なお、本発明は以上に説明した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で、当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形および組み合わせが実施可能であることは明白である。例えば、洗浄液は、セスキ炭酸ソーダ（Ｎａ₂ＣＯ₃・ＮａＨＣＯ₃・２Ｈ₂Ｏ）や、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムの水溶液などのアルカリ洗浄液であればよい。また、タンパク質分解酵素溶液でもよい。なお、洗浄液は、発泡が抑制されたものであるとよい。微細なマイクロ流路内では、一度気泡が混入すると、気泡を抜くために高圧力で加圧もしくは高い負圧でけん引する必要が生じ、除去に非常に手間のかかる問題となる。従って、洗浄液には、発泡が発現しやすい界面活性剤などが含まれない方がよい。

２０１ａ…基板、２０１ｂ…流路基板、２０２…マイクロ流路、２０３…導入口、２０４…排出口、２０５…配管、２０６…廃液タンク、２０７…配管、２０８…負圧ポンプ、２１１…測定装置。

Claims (2)

1. 分析対象の生体試料が含まれる測定溶液が充填されているマイクロ流路の一端より洗浄液を導入し、前記マイクロ流路の他端より前記測定溶液を吸引して前記流路内の前記測定溶液を前記流路内より排出するとともに前記流路内を前記洗浄液で置換し、前記洗浄液で前記流路内を洗浄する洗浄工程と、
   マイクロ流路の一端より水を導入し、前記マイクロ流路の他端より前記洗浄液を吸引して前記流路内の前記洗浄液を前記流路内より排出するとともに前記流路内を前記水で置換し、前記洗浄液を前記流路内より除去するリンス工程と
   を備えるマイクロ流路の洗浄方法。
2. 請求項１記載のマイクロ流路の洗浄方法において、
   前記洗浄工程に続いて、前記マイクロ流路の他端より前記洗浄工程とは異なる吸引力で前記洗浄液を吸引して前記流路内を洗浄する追加洗浄工程を備えることを特徴とするマイクロ流路の洗浄方法。