JP2016121994A - 凝集を判断するための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】マイクロ流体デバイスのマイクロ流体反応チャネルを流れる生体液体の流体力学的抵抗における変化を測定することで、生体液体の凝集を判断する方法の提供。【解決手段】ａ）凝集の有無に関わる既知の生体液体の流体力学的抵抗の較正値により較正する段階と、ｂ）マイクロ流体反応チャネル５に疎水性連続液相（連続相）を充填する段階と、ｃ）該チャネルに、第１の参照液滴を導入し、ｄ)該チャネル内に流す段階と、ｅ）測定セクション５ａを介して、第１の参照液滴の流下時間を測定する段階と、ｆ）該チャネルに第２の参照液滴導入後、一連の試験液滴を導入し、ｇ）該チャネルに流す段階と、ｈ）一連の試験液滴の存在下、測定セクション５ａを介して第２の参照液滴の流下時間を測定する段階と、ｉ）一連の試験液滴の流体力学的抵抗を計算する段階と、ｊ）流体力学的抵抗を複数の較正値と比較することによって、生体液体の凝集を判断する。【選択図】図１

Description

本発明は、血液またはその成分、または唾液若しくは尿等の生体液の凝集試験を実行するための方法に関し、より具体的にはマイクロ流体デバイス内での凝集を伴う抗原抗体反応を判断するための方法に関する。

通常、マイクロ流体デバイスとして動作するラブオンチップは、例えば血液、血漿または尿といった生体液体試料の様々な化学分析を容易化する構造物である。今日、マイクロ流体システムはその小型化により、調査される試料の使用量の低減が必要とされるので、ますます重要性が高まっている。

マイクロ流体システムに適用される化学分析のうちの１つに、血液の凝集試験が含まれる。通常、当該測定にはチャネル（マイクロ流体チャネル等）内での血球または全血と、試薬として作用する物質、すなわち凝集剤（抗体）との反応を伴い、そこにおいて試薬は調査される血液の特定の物理的特性における変化を生じさせ、結果的に凝集はその変化を測定することによって判断され得る。通常、血液型判定は遠心分離後の血液画分を使用して実行される。全血から分離された血球はその後、抗体を包含するモノクローナル試薬と接触させて試験され、分離された血漿は表面に既知の抗原を有する標準化された赤血球を用いて試験される。血清試験の別のカテゴリは、例えばＰＣＲおよびＥＬＩＳＡといった免疫測定法である。

凝集を判断するための最も広く知られている既知の方法は、試料内の血球の集塊の目視評価を伴い、それは例えば、ガラスプレート上および試験管内といった大規模スケール、あるいはマイクロ流体システムを用いる小規模スケールで実行され得る。

例えば、米国特許第８３１８４３９号には、凝集処理をもたらす凝集物の外観を目視判断することによる血液型判定のためのマイクロ流体装置が記載されている。当該デバイスは、血液供給、凝集試薬供給、溝および光学窓が提供された凝集反応チャネルを備え、そこにおいて陽性反応は、ウィンドウ内で見ることができる「集塊」の外観によって光学的に評価され得る。更に、溝の選択された寸法はレイノルズ数に影響し、従って凝集反応を増強する。とはいうものの、当該目視方法は、人間の目の不完全さによる誤差の生成を引き起こし得る。

また、様々な他の文書が、血液粘度における変化を比較することにより、生体液体試料の凝集を判断するためのデバイスおよび方法について記載している。

例えば、ＰＣＴ特許出願の国際公開２０１２／１６４２６３号は、試料粘度における変化を測定することを伴うマイクロ流体システムおよび化学分析方法について記載している。当該マイクロ流体デバイスは、入口および出口において交差する２つの並行チャネルで構成される。当該方法は、マイクロ流体チャネル内に血液試料を追加した後、当該チャネル内にチェイス緩衝液を提供する段階を伴う。当該液体は、第１および第２のチャネルに沿って流れ、凝集剤は第２のチャネルではなく、第１のチャネルに提供される。凝集が血液試料の流量を示すので、非凝集された流体のみがチャネル構成から流出し得、したがって、第１のチャネル内の凝集試料を遮断し得る。凝集液体による第１のチャネル内の移動距離は、凝集度の指標である。

米国特許出願第２００９０３１７７９３号に、同様の方法およびデバイスが記載されている。当該デバイスは、参照チャネルおよび凝集剤が提供される試験チャネルを備える。当該複数のチャネルはそれぞれの両端で交差し、上方参照チャネルセクションから混合領域へと流れる参照液体が、上方試験チャネル内の試験液体の流れを遮断するように配置された混合領域が提供される。凝集は、試験チャネル内の試料液体のフローフロントの位置を観察することによって目視判断される。

ＰＣＴ特許出願の国際公開２０１１／０３５３８５号に、別の診断化学分析方法が記載されている。当該方法は試料の凝集を伴い、次に多孔性分析基材上へのその堆積が行われ、多孔性分析基材上で試料が運ばれる。特定の抗体との接触時に凝集された試料は、当該基材との接触時に分離／溶出する一方、不特定の抗体との接触時に当該血液試料は、分離／溶出しない。当該基材上での溶出速度および試料分離の範囲が、凝固の度合いを示す。

米国特許出願第２００３０２２４４５７号は、マイクロ流体チャネルが提供された光バイオディスク上でリバースタイピングによって、血液試料内の抗体の存在を判断するための方法について記載しており、当該方法は血液試料をマイクロ流体チャネル内に適用した後、マイクロ流体チャネルを通る血清の動きに影響を与えるディスクを回転させ、次に当該血清に既知のＡＢＯ血液型を追加し、当該光バイオディスクを回転させ、次に当該マイクロ流体チャネル内の当該混合物を培養することを伴う。凝集は、電磁放射の入射ビームを用いて当該混合物を走査することによって測定される。照射によって取得されたデータが、凝集細胞の存在を判断する。

したがって、マイクロ流体デバイスを用いて凝集を判断する多数の方法がある。しかしながら、特定の状況下においては、凝集反応は流動停止を引き起こす場合があり、したがって試料は遮断され、それによって更に凝集化学分析流入物の誤った推定をもたらし得る。また、凝集反応はマイクロ流体チャネルの洗浄に困難を生じさせ得る。更に、より小さな試料、すなわち液滴サイズまたは液滴を有する試料を使用する場合、あるいは凝集反応度が実質的に不十分な場合は通常、凝集現象は正しく評価され得ない。

ポーランド国特許出願第３９６４９４号は、液滴サイズの血液試料を使用するマイクロ流体システムを用いる凝集試験を実行するためのデバイスおよび方法について記載している。当該マイクロ流体システムには、抗体キャリア液滴（モノクローナル試薬等）供給、抗原キャリア液滴（例えば、赤血球）供給およびマイクロ流体チャネルが提供され、マイクロ流体チャネル内で当該物質が混合される。化学分析はマイクロ流体チャネル沿いの予め定められた距離において、液滴の流下時間を測定することを伴う。凝集反応が発生した場合の液滴の流下時間は、反応が発生しなかった場合の液滴の同等の時間よりも著しく長い。流下時間の比較によって、凝集が発生したか否かの区別が可能になる。

したがって、マイクロ流体チャネル内を流れる際の液体の物理的特性の変化の測定について、更なる開発のニーズが存在する。このニーズに対処する様々な方法が記載されている。例えば、以下の複数の方法が、マイクロ流体チャネル内の液滴の付加抵抗を測定するために提案されている。

Ｖ．Ｌａｂｒｏｔ他は、Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｖｏｌ．３，ｐ．０１２８０４、２００９において、単一の液滴の流れ中のチャネルの短い部分上にある圧力液滴の直接的な測定のための方法について記載している。とはいうものの、それは非常に正確な微圧計の使用を必要とし、当該圧力を測定するための側方チャネルの存在により追加の誤差を生じさせる。

Ｓ．Ａ．Ｖａｎａｐａｌｌｉ他による、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ、ｖｏｌ．９、ｐ．９８２、２００９において記載された別の方法は、測定された流れ（液滴とともに）と、制御された流量の着色された参照流れとの対照に基づくフローコンパレータを特徴とする。とはいうものの、この方法の品質は着色された油および透明な油との間の界面の変位に関する実験的指標によって制限される。

Ｍ．Ｊ．Ｆｕｅｒｓｔｍａｎ他によるＬａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ、ｖｏｌ．７、ｐ．１４７９、２００７およびＶ．Ｌａｂｒｏｔ他によるＢｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、ｖｏｌ．３、ｐ．０１２８０４、２００９において記載された更なる別の既知の方法は、泡または液滴の流速を測定することによる、チャネルの単純ループを通る流体の別々の部分の流れのモデルを利用する。この方法の精度は、発散点における液滴の動作および測定の空間分解能等、多数の前提および技術的な詳細に非常に依存する。

上記引用された複数の方法は、個々の液滴の特性についての観察および測定に基づく。

上記刊行物から、マイクロ流体チャネルを用いる液体試料の特定の物理的特性における変化を測定する技術は、迅速な開発を受けていることがわかる。

液滴等の小型化された試料サイズを提供しつつ、より効率的であり、かつ、より信頼性のある結果をもたらす、液体試料の物理的特性における変化の測定に基づく、凝集試験方法の更なる開発に対するニーズが存在する。

マイクロ流体デバイスのマイクロ流体反応チャネルを流れる生体液体の流体力学的抵抗における変化を測定することによって、上記生体液体の凝集を判断するための方法であって、ａ）凝集が発生した既知の生体液体の一連の液滴の流体力学的抵抗の較正値および凝集が発生しなかった既知の生体液体の一連の液滴の較正値を計算することによってマイクロ流体デバイスを較正する段階と、試験される生体液体に対して次に実行される、ｂ）上記マイクロ流体反応チャネルの測定セクションを画定する距離をもって離間させた複数の検出器（６、７）を有する、上記マイクロ流体反応チャネルに疎水性連続液相（連続相）を充填する段階と、ｃ）上記マイクロ流体反応チャネルに、生理食塩水またはＰＢＳまたは水と混合された、上記連続相と非混和性の上記生体液体の液滴である第１の参照液滴を導入する段階と、ｄ）上記第１の参照液滴が測定セクションを有する上記マイクロ流体反応チャネルを流れるようにする段階と、ｅ）上記マイクロ流体反応チャネルの上記測定セクションを介して、上記第１の参照液滴の流下時間を測定する段階と、ｆ）上記マイクロ流体反応チャネルに、上記第１の参照液滴と同一である第２の参照液滴、その後に１から１０００の一連の試験液滴を導入する段階であって、上記試験液滴は複数の参照液滴に含まれるものと同一の上記生体液体、および凝集試薬で構成される、上記連続相と非混和性である液滴である段階と、ｇ）上記第２の参照液滴および上記一連の試験液滴が上記マイクロ流体反応チャネルを流れるようにする段階と、ｈ）上記マイクロ流体反応チャネル内の上記一連の試験液滴の存在において、上記測定セクションを介して上記第２の参照液滴の流下時間を測定する段階と、ｉ）上記一連の試験液滴の流体力学的抵抗を計算する段階と、ｊ）上記流体力学的抵抗を複数の上記較正値と比較することによって、上記生体液体の凝集を判断する段階と、を備える方法。 上記連続相は、上記液滴を上記マイクロ流体反応チャネルの壁の表面から分離してよい。 上記生体液体は全血、血漿、血清または複数の分離された血球の試料であり得る。 上記生体液体は唾液の試料であり得る。 上記生体液体は、尿の試料であり得る。 血液型判定のために、上記凝集試薬は、血液型システムの複数の抗体（抗Ａ、抗Ｂおよび抗Ｄ）からなる群から選択される複数のモノクローナル抗体を含んでよい。 上記連続相は、ヘキサデカン、フロリナートおよび鉱油からなる群から選択され得る。 上記方法は、上記マイクロ流体反応チャネルに、同一の容積を有する２つの参照液滴を導入する段階を備えてよい。 上記第２の参照液滴が前記マイクロ流体反応チャネルの幅の１０倍から２０倍の距離を移動した後、上記一連の試験液滴が上記マイクロ流体反応チャネルに導入され得る。 上記複数の試験液滴は、上記マイクロ流体反応チャネルの幅の３倍から４倍のサイズを有してよい。 上記マイクロ流体反応チャネルに導入される複数の上記試験液滴間の距離は、上記マイクロ流体反応チャネルの幅の２倍から５倍であり得る。

本方法は、図面上の複数の例示的実施形態を通して示される。

マイクロ流体デバイスの略図である。 試験される液体試料の流体力学的抵抗における変化の計算に有用な略図である。 試験される液体試料の流体力学的抵抗における変化の計算に有用な略図である。 複数の試料および試薬を含有する特定の複数の液滴の流体力学的抵抗の複数の測定結果を示す。

本明細書に示される方法は、例えば血液等の人間および動物の体液といった、抗原を含有する生体液体試料の流体力学的抵抗における変化を測定することによる凝集の検出を伴う。特に、当該方法は、生体液体試料が体から除去された後のその分析を伴い、それらが体に再び導入されることは想定されていない。本方法は特に、通常の凝集化学分析の実行並びに少量の試料のみが利用可能である場合か、または他の複数の化学分析方法の使用が誤解を生じさせる結果をもたらし得る場合における凝集分析の実行に対し好適である。その感度のおかげで、当該方法は異なる複数の方法によって取得された結果を確認するためにも使用され得る。

当該方法は凝集、すなわち特定の複数の抗原および抗体を含有する混合物内で発生する反応、の検出に好適である。当該方法は、血液型判定、交差適合試験、直接クームス試験（ＤＣＴ）／直接抗グロブリン試験（ＤＡＴ）および間接クームス試験／間接抗グロブリン試験（ＩＡＴ）に特に有用であり、あるいは他の複数の抗体の存在の検出のための個別試験として機能し得、あるいは細菌性およびウイルス性両方の感染、あるいは自己免疫病（例えば橋本甲状腺炎）でさえ示し得る。本明細書に示される方法は、好ましくは室温で実行される。しかしながら、それはさらに低いまたは高い温度でも実行され得る。

当該方法は、特定容積の試料物質を特定容積の試薬物質と混合するのに好適な構成を有する異なる複数のマイクロ流体システムを利用してよい。例えば、化学分析は図１に示されるマイクロ流体デバイスを用いて実行されてよい。例えば、ポーランド国特許出願第３９６４９４号に記載の複数の他のデバイスも同様に使用され得る。しかしながら、流体力学的抵抗における変化の判断のために利用されるマイクロ流体デバイスは、マイクロ流体チャネルの一定の流体力学的抵抗を維持する複数の毛細血管が使用し尽くされる必要がある。それにより、マイクロ流体デバイスは、本発明による流体力学的抵抗における変化の測定を実行すべく利用され得る。

図１に示されるデバイスは、試料物質８および試薬物質９の液滴を導入するための入口チャネル１、２および反応チャネル５を有し、当該物質８、９はこれらと混合しない連続液体１０で懸濁される。例えば、液体１０は水溶液と混合しない任意の液体であってよく、例えば、単純炭化水素または官能化炭化水素、鉱油、流動性のある油またはその他からなる群からの油等である。入口チャネル１、２は単一の反応チャネル５を形成すべく合流することが好ましく、混合領域３が先行して存在していることが好ましく、この場合、液滴８、９は試料物質および試薬物質の混合物である液滴１１を形成すべく合流され得る。任意には、混合領域３において、電界を振動させるパルス（電子的合体）により、複数の液滴の混合を高めるべく、デバイスの内部または外部に２つの電極（ａ、ｂ）が配置され得る。反応チャネル５は蛇行セクション４を備えてよく、または反応チャネル５全体が、反応チャネル５を流れる間の液滴の成分の混合を容易化する蛇行形状のチャネル５であることが好ましい。混合液滴は、出口チャネル５のセクション５ａを介して液滴の流下時間を測定するための、互いにかなりの距離をもって配置された２つの検出器６、７を備えるセクション５ａまで流れる。検出器６、７は例えば光学的または電気的な検出器であってよい。したがって、セクション５ａは反応チャネル５の測定セクション５ａである。

試験を実行すべく、入口チャネル１、２は疎水性の連続相１０で充填される。第１の入口チャネル１の連続相１０は、第２の入口チャネル２と同一の物質であることが好ましい。連続相および調査される液体試料は、非混和性である必要がある。連続相１０は、分析される材料が親水性（実質的に体液は水溶液である）であるため、疎水性である。調査される試料は、抗原を含有する様々な液体物質であり得る。マイクロ流体チャネルは例えば、長方形、正方形、円形または楕円の断面を有してよく、正方形断面が好ましい。好ましくは、チャネルの壁も連続相が液滴を壁から分離させる薄膜を形成することを保証すべく、疎水性である必要がある。それにより、生物学的材料によって生じるマイクロ流体デバイスの汚染のリスクが除去され、したがって当該デバイスは無菌としてみなされ得る。

流体力学的抵抗における変化を測定することによって、凝集を判断するための方法は、次の段階を伴う。
‐マイクロ流体デバイスを連続相で充填する。
‐反応チャネル５ａ内に、第１の参照液滴、すなわち予め定められた容積の液体試料および予め定められた容積の生理食塩水を含有する液滴、を投入する。第１の参照液滴は、凝集を引き起こし得る試薬は含んでおらず、これにより凝集が第１の参照液滴内で発生しないことを保証する。
‐反応チャネル５の測定セクション５ａを介して、第１の参照液滴の流下時間を測定する。
‐第１の参照液滴が反応チャネル５を出た後、反応チャネル内に第２の参照液滴を投入する。第２の参照液滴は、第１の参照液滴と実質的に同一であり、好ましくは同一の組成を有し、全く同一である（すなわち、第２の参照液滴は同一の容積の同一の液体試料、および第１の参照液滴と同一の容積の同一の生理食塩水を有する）。第２の参照液滴は、凝集を引き起こし得る試薬は含んでおらず、これにより凝集が第２の参照液滴内で発生しないことを保証する。
‐反応チャネル５内への第２の参照液滴の導入後、反応チャネル５内に一連の試験液滴を投入する。当該一連の試験液滴は実質的に１から１０００の試験液滴を含む。当該特定の抗原が液体試料内に存在する場合、試験液滴は、液体試料が試薬、すなわちモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含有するのであれば、試験液滴に凝集を発生し得る液滴である。当該一連の試験液滴内の全試験液滴は実質的に同一であり、および好ましくは全く同一、すなわち全試験液滴は同一の組成、同一の液体試料、既知の同一試薬を有し、同一の容積である。更に、各試験液滴の液体試料は、第１および第２の参照液滴に含有される液体試料と同一である。したがって、１測定中、反応チャネル内に投入される参照液滴または試験液滴のいずれかの各液滴は、同一の液体試料を含有する。
‐反応チャネル５の測定セクション５ａを介して、第２の参照液滴の流下時間を測定する。
‐反応チャネル５の測定セクション５ａを介して測定された第１の参照液滴の流下時間に基づいて、第１の参照液滴が流れる間の反応チャネル５の流体力学的抵抗を計算する。
‐反応チャネル５の測定セクション５ａを介して測定された第２の参照液滴の流下時間に基づいて、一連の試験液滴（１から１０００の試験液滴を有する）と共に第２の参照液滴が流れる間の反応チャネル５の流体力学的抵抗を計算する。
‐取得された複数の結果を比較することによって、凝集が発生したかどうかを判断する。一連の試験液滴内で凝集が発生した場合、試験液滴の流れ（第２の参照液滴と共に）は、非凝集された液滴（すなわち、一連の非凝集された一連の試験液滴）が流れる間に計算されたこのチャネルの抵抗と比較して、マイクロ流体チャネル（反応チャネル５）の流体力学的抵抗の増加を発生させる。比較されている内容は、流体力学的抵抗値であり、ａ）第１の参照液滴およびｂ）第２の参照液滴と第２の参照液滴後に流れる一連（「連続」）の試験液滴に対して後述のように計算される。

以下に、本発明による凝集の判断のための方法が詳細に記載される。

マイクロ流体チャネル１、２、５に連続相を充填後、例えば６０ｎｌ〜１．５μｌの範囲内の量の既知の容積の液体試料が、例えば試料ポートを介して第１の入口チャネル１に導入される。液体試料と連続相との間の表面張力は、投入された試料がチャネル内の連続相１０と混合しないよう、試料を液滴８の形状に保持する。

血液の化学分析の場合、調査される血液試料は、好適な当該技術分野における既知の方法を使用して取り出された全血（遠心分離されていない）であり得る。例えば、血液試料は抗凝血剤堆積上に取り出され得る。取り出し方法およびコンテナのタイプ（例えば、管）により、以下の複数の物質が抗凝血剤として使用されるのに好適である。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはそのナトリウム塩‐ＥＤＴＡ二ナトリウム（ＥＤＴＡ‐Ｎａ_２）、クエン酸三ナトリウムまたはクエン酸、シュウ酸ナトリウムまたはシュウ酸カリウム、ヘパリン（ナトリウム、リチウムまたはカルシウム塩として）。とうはいうものの、血液が収集された堆積に関わらず、本明細書に示される方法は適用可能である。

予め定められた容積の液体試料８の液滴が入口チャネル２に導入され、このチャネル２の下流側へ流れる。予め定められた容積の生理食塩水９の液滴が入口チャネル１に導入され、チャネル９内の下流側へ流れる。液体試料の液滴および生理食塩水の液滴は混合領域３において混合され、これにより予め定められた容積の第１の参照液滴を形成する。形成された第１の参照液滴は、反応チャネル５内に導入され、反応チャネル５を通って下流側へと流れ、反応チャネル５は液滴の成分のより良い混合をもたらすべく、蛇行形状であることが好ましい。検出器６、７は、反応チャネル５の測定セクション５ａを介して第１の参照液滴の流下時間を測定する。測定セクション５ａの長さは好ましくは１０ｃｍである。第１の参照液滴は、第１の参照液滴の流下時間を測定中、反応チャネル５内に存在する唯一の液滴であるということが重要である。この測定は、詳細に後述される複数の計算において考慮される較正測定として機能する。

第１の参照液滴が反応チャネルを出た後、第２の参照液滴が反応チャネル５内に導入される。前述のように、第２の参照液滴は、第１の参照液滴と同一の組成および同一の容積であるべきである。従って、第２の参照液滴は第１の参照液滴と全く同一である。第２の参照液滴は、例えば第１の参照液滴と同一方法で生成されてよい。

反応チャネル５への第２の参照液滴の導入後、好ましくは１〜１０００の試験液滴を含有する一連の試験液滴が反応チャネル５内に導入され、従って、当該一連の試験液滴は、反応チャネル５を下流側へ流れる第２の参照液滴の後に続く。したがって、当該一連の試験液滴と共に第２の参照液滴は、反応チャネル５を同一方向に流れる一連の液滴を形成する。反応チャネル５を一連の液滴が流れる間、反応チャネル５の全長にわたり、複数の液滴が互いに分離されていることを保証すべく、当該一連の液滴内のそれぞれの液滴間の距離が選択されるべきである。

反応チャネル５を一連の液滴が流れる間、測定セクション５ａを介して、第２の参照液滴の流下時間が測定される。これは、第２の参照液滴の流下時間の測定中、測定セクション５ａを介して、一連の液滴（第２の参照液滴および一連の試験液滴、すなわち予め定められた数の試験液滴）が反応チャネル５に存在することを意味する。

第２の参照液滴後に反応チャネル５に導入される試験液滴は、次のように生成されてよい。

第１および第２の参照液滴の液体試料と同一の、既知容積の液体試料８が入口チャネル２に導入される。モノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む既知容積の試薬９が、第２の入口チャネル１を介してデバイスに投入される。試薬９は第２の入口チャネル２に沿って流れ、混合領域３において試料８と混合され、それにより、混合ポイント３において試験液滴１１を形成する。しかしながら、試薬９は混合領域に異なる方法で導入されてよく、例えば、試薬９が混合領域３内に堆積されてよい。

試薬９および試料８の水に対する親和性は同様であるべきであり、あるいは同一であることが好ましい。試薬は、例えば抗Ａ、抗Ｂまたは抗Ｄあるいはその他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含んでよく、また試料内に抗原が存在する場合、抗原との凝集反応を生じさせることが可能であるべきである（特異性）。

任意には、予め定められた容積の試料の入口チャネル１への導入後、試料８は一連の液滴を生成することによって同一の容積の各々に分割されてよく、好ましくは６０〜３００（ｎｌ）の範囲内、より好ましくは各々が６４ｎｌの容積を有するよう分割されてよい。試料の各液滴は、同一の既知のモノクローナルまたはポリクローナル抗体のいずれかを含有する試薬の液滴と混合される。

形成された一連の試料液滴が下流側方向に流れ、その結果、それらはマイクロ流体システムの混合領域３において、予め定められた容積（液滴）の同一の試薬９と１つずつ混合され、一連の試験液滴を形成する。各試験液滴が、マイクロ流体デバイスの反応チャネル５を下流側方向に流れる。

反応チャネル５には、反応チャネル５上で特定の距離をもって離間させた検出器６、７が提供されており、反応チャネル５の測定セクション５ａを画定する。反応チャネル５の測定セクション５ａと共に反応チャネル５は、蛇行形状のチャネルであるように、反応チャネル５は実質的に長く複数の蛇行部で形成されていることが好ましい。検出器６、７は測定セクション５ａの距離を流れる各参照液滴の流下時間を測定する。取得されたデータは更に、システム全体の流体力学的抵抗、すなわち反応チャネルの流体力学的抵抗と、流れる液滴の流体力学的抵抗とを合わせたものの計算に利用される。好ましくは、参照液滴および試験液滴の容積は、各液滴がチャネル幅の３倍から４倍長くなるよう選択される。以下は、測定を実行する段階を示す。

１．試料液滴と、マーカとして機能する生理食塩水またはＰＢＳとを混合することによって、第１の参照液滴を生成する。
２．反応チャネル５の測定セクション５ａを介して、第１の参照液滴の流下時間を測定し、第１の参照液滴の流体力学的抵抗（ｒ_ｄ）をチャネルの抵抗（Ｒ）と共に計算する：ｒ_ｄ＋Ｒ。
３．第１の参照液滴と全く同一の第２の参照液滴を生成する。その後、第２の参照液滴がチャネル幅の約１０〜２０倍の特定の距離（参照液滴と複数の試験液滴との間の相互作用がないことを実現するのに特に有用である）を移動した後、液体試料および特定の試薬を含有する一連のｎ個の試験液滴を生成する（ｎ∈（１、１０００））。当該複数の液滴はチャネル幅の３〜４倍の長さ（液滴のそのような長さは粘度の変化に対する最高の感度を特徴付ける）であるべきで、チャネル幅の２〜５倍で互いに分離されるべきである（衝突を防ぐ複数の液滴間の安全な距離を実現すべく（１面から）、および同時に複数の液滴間の相互作用の増大を引き起こすべく（別の面から））。
４．反応チャネル５の測定セクション５ａを介して、第２の参照液滴の流下時間を測定し、チャネルの抵抗と共に合わせたそれらの流体力学的抵抗（Ｒ＋ｒ_ｄ＋ｎｒ_ｎ）を計算する。
５．第２の参照液滴の流下時間と第１の参照液滴の流下時間の比較が、比ｎｒ_ｎ／（Ｒ＋ｒ_ｄ）の計算を可能にする。

検出される個数の数と同じだけ、段階３、４および５が反復されるべきである。各一連の試験液滴は同一の試薬を含むので、段階３、４および５は異なる複数の既知の試薬に対して反復されるべきである。この手順において、各一連の液滴は同様、すなわち当該一連の液滴内の同一数の液滴、同一の容積の液体試料、試験液滴内の同一の容積の試薬であるべきであるが、しかしながら、各一連の試験液滴は異なる既知の試薬を有する（例えば、異なるモノクローナルまたはポリクローナル抗体）。

図２Ａおよび図２Ｂは、単一の液滴（図２Ａ）および一連の液滴（図２Ｂ）の流体力学的抵抗における変化の計算に有用な略図である。

複数のチェックポイントに固定された複数の検出器によって測定された、反応チャネル５内の存在箇所における単一の液滴（すなわち、第２の参照液滴）１２の流下時間および距離Ｄにおける一連の試験液滴１３の流下時間は、流体力学的抵抗の計算に使用されるデータを与える。

第２の参照液滴によって第１の参照液滴の流れに影響しないよう、第１の参照液滴がチャネルを出た後、第２の参照液滴がチャネルに導入される。

反応チャネル５の測定セクション５ａを介した、第１の参照液滴の流下時間はその内因性粘度に依存する一方で、液滴の流下時間は内因性粘度および凝集試薬との反応によってもたらされるその粘度の変化に依存する。

システム（すなわち、反応チャネル＋それぞれの液滴）の流体力学的抵抗を比較することによって、試験される試料内の抗原の存在についての情報が取得される。流体力学的抵抗は、以下の式を使用することによって計算される。

式中、
β‐参照液滴の機動性
ｖ_ｌ‐液滴の線形的速度

連続相の平均的速度
ｎｒ_ｎ‐一連の分析される液滴の流体力学的抵抗
ｔ_１'‐第１の検出器下における第１の参照液滴の検出時間
ｔ_２'‐第２の検出器下における第１の参照液滴の検出時間
ｔ_１'‐第１の検出器下における第２の参照液滴の検出時間
ｔ_２'‐第２の検出器下における第２の参照液滴の検出時間
Ｄ‐検出器間の距離
Ｒ‐チャネルの流体力学的抵抗
Ｓ‐チャネルの断面の面積
ｒ_ｄ‐単一の液滴の流体力学的抵抗
Ｑ‐チャネル内の容積流量
ｐ‐流れを誘発する圧力

第１の参照液滴の流下時間を提供した後、Ｄ（検出器間の距離）、Ｓ（チャネルの断面の面積）は既知の値なので、式１は参照液滴の機動性（β）の計算に使用され得る。更に、Ｑ（チャネル内の容積流量）は固定時間内にチップからはかりへと流出する液体の重量を量ること、および流出した液体の容積（重量に基づいて計算される）および時間の比としてのＱを計算することによって計算される。

次に、第１の参照液滴に対し測定されたｔ_１およびｔ_２の値、および第２の参照液滴に対し測定されたｔ_１'値、ｔ_２'値は、この液滴が流れる間のシステムの流体力学的抵抗の計算のために式２を使用することによって、および第２の参照液滴および一連の試験液滴からなる一連の液滴が流れる間のシステムの流体力学的抵抗の計算のために式３を使用することによって、システムの流体力学的抵抗の計算のために利用され得る。

流れを誘発する圧力（ｐ）は、連続相（油）を備える容器に対する圧力と、気圧との差を構成する。連続相の容器は、連続相をマイクロ流体デバイスに導入するディスペンサである。

次の段階では、較正が実行される。較正は、様々な一連の試験液滴、すなわち既知の粘度の一連の凝集された試験液滴および非凝集された試験液滴に対して実行される。較正は次のように実行される。ｎ個の様々な数の液滴を含む一連の液滴が生成される。例えばｎは１から１００の範囲である。凝集ありの複数の液滴を持つあるタイプの一連の液滴が生成され、凝集なしの複数の液滴を持つ別のタイプの一連の液滴が生成される。較正の結果、流体力学的抵抗の複数の値が取得され得、特定の一連の液滴に関連付けられ得る。これらの値はいくつかの標準誤差（偏差）を受け得る。較正は、凝集が発生した一連の液滴の流体力学的抵抗値と、凝集が発生しなかった一連の液滴の流体力学的抵抗値とを区別することを可能とするための液滴の最小数ｎを判断することを可能とする。較正は、例えば複数の入力チャネルおよびバルブの構造および構成に依存する、デバイス特有の複数の結果を提供する。

較正は、凝集が発生した一連の液滴と凝集が発生しなかったこれらとを区別し得るべく、第２の参照液滴後に反応チャネル５に導入される一連の試験液滴として生成されるべき試験液滴の最小数ｎの情報を提供する。

実行された複数の試験の結果は、反応チャネル５内を第２の参照液滴の後に流れる３つの試験液滴（ｎ＝３）を有する一連の試験液滴に対し、１００パーセント（１００％）信頼性のある区別が取得され得ることを示す。「１００パーセント信頼性のある区別」という用語は、１００の凝集された試験液滴と、１００の非凝集された試験液滴のそれぞれに対して測定された３つの平均標準偏差の和として理解される。

とはいうものの、いくつかの測定について、一連の試験液滴は、凝集された一連の液滴に対して計算された流体力学的抵抗と、非凝集された一連の液滴に対して計算された流体力学的抵抗との間の信頼性のある区別を供給する、１つの試験液滴（ｎ＝１）からなってよい。

第１の参照液滴に対する測定は、この液滴の流体力学的抵抗を判断すべく実行される。しかしながら、流体力学的抵抗の厳密な値を判断する必要はなく、システムの抵抗が連続相の流れに対しどのくらい変化したかを判断することで十分である。システムの流体力学的抵抗（すなわち、液滴を備える連続相の流れ）の増加は通常、容積流量の低減を引き起こすことに留意すべきである。更に、第１の参照液滴の測定は、較正測定として処理され得る。次に、第２の参照液滴が導入され、その後に流体力学的抵抗が計算される一連の試験液滴が続く。一連の試験液滴と第２の参照液滴との間の複数の相互作用（そのような相互作用は誤った結果を引き起こし得る）を低減すべく、第２の参照液滴および試験液滴間の特定の距離が固定される。本明細書において言及されるように、各液滴はシステムの流体力学的抵抗を変化させ、これにより連続相の容積流量に影響を与える。他方、容積流量の変化はシステム全体で可視化される。従って、第２の参照液滴は、その速度を変化させることによって、追加の複数の液滴の存在を検出する。第２の参照液滴の速度の変化および第２の参照液滴の速度と第１の参照液滴の速度との比較（システムに個別に導入された）は、複数の試験液滴によってシステムに導入された流体力学的抵抗の変化の計算を可能にする。

複数の試験液滴が一連の試験液滴内を移動する際、それらは一種の「連続」（一連）を形成し、互いに影響し合う。複数の測定は、この影響は測定された液体の流体力学的抵抗を増大（または場合によっては低減）させることを示し、それは測定に対し有益である。

以下は、当該流体力学的抵抗測定を使用する血液型判定の複数の例示的段階を記載する。
１．複数のチャネルを連続相で充填する。
２．試料（１〜１．５μｌ）を入口チャネルに導入する。
３．各々２５０ｎｌの３つの一連の液滴を生成することによって試料を分割する。
４．生理食塩水／ＰＢＳ（３１２ｎｌ）および試料（２５０ｎｌ）を含む、第１の参照液滴を生成する。
５．第１の参照液滴の流体力学的抵抗を複数測定する。
６．生理食塩水／ＰＢＳ（３１２ｎｌ）および試料（２５０ｎｌ）を含む第２の参照液滴、およびその後、第１の血液液滴と混合された複数のモノクローナル抗体（抗Ａ）を備えた試薬（６４ｎｌ）を含む試験液滴を生成する。
７．試験液滴とともにチャネルを流れる第２の参照液滴の流下時間を複数回測定し、その後分析された複数の液滴の移動中のマイクロ流体チャネル内の流体力学的抵抗を計算する。
８．生理食塩水／ＰＢＳ（３１２ｎｌ）および試料（２５０ｎｌ）を含む第２の参照液滴、およびその後、第２の血液液滴と混合された前の段階とは異なる複数のモノクローナル抗体（抗Ｂ）を備えた試薬（６４ｎｌ）を含む試験液滴を生成する。
９．分析された複数の液滴の移動中に、第２の参照液滴の流下時間を複数測定し、マイクロ流体チャネルの流体力学的抵抗を計算する。
１０．生理食塩水／ＰＢＳ（３１２ｎｌ）および試料（２５０ｎｌ）を含む第２の参照液滴、およびその後、第２の血液液滴と混合された前の段階とは異なる複数のモノクローナル抗体（抗Ｄ）を備えた試薬（６４ｎｌ）を含む試験液滴を生成する。
１１．分析された複数の液滴の移動中に、第２の参照液滴の流下時間を複数測定し、マイクロ流体チャネルの流体力学的抵抗を計算する。
１２．マイクロ流体チャネルをそれらの試験液滴が流れる間の流体力学的抵抗と、参照液滴が流れる間のマイクロ流体チャネル内の抵抗とを比較することによって、個々の複数の試験液滴内で凝集が発生したか否かを判断する。

流下時間に直接影響する外部要因は、特にチャネルの形状である。
ｉ）マイクロチャネルの断面は好ましくは、面のアスペクト比１：３または１：４の長方形である。
ｉｉ）複数の測定が実行されている、マイクロ流体チャネルの部分の長さ。および
ｉｉｉ）連続相の粘度。
ｉｖ）両相内に界面活性剤が存在するまたは存在しない、または界面活性剤若しくは両相があるかないか
ｖ）連続相の流量。

これらのパラメータのすべては任意に固定される必要がある。とはいうものの、試料の導入から出力結果までの手順全体が短時間、約数分かかるように、複数の初期条件が設定されることが想定される。

輸血前の試験目的のために、複数の血液試料を備えた複数の液滴が生成され、複数の試薬と混合される段階の数は、検出される追加の抗原の数だけ増加される必要がある。これは凝集の検出のための流体力学方法に当てはまる。

全血の代わりに、表面に複数の特定の（既知の）複数の抗原を備えた、複数の標準化された赤血球を使用できる。複数のモノクローナル試薬は従って、患者の血清または血漿と置き換えられ得、その結果、試験は患者らの血液内の複数の抗体の存在を示す。この変形例は、血液型判定またはクロス試験手順の一部であってよく、あるいは他の複数の抗体の検出のための個別試験として機能してよく、他の複数の抗体の存在はウイルス性および細菌性両方の感染、あるいは自己免疫病（例えば、橋本甲状腺炎）すら示し得る。

以下は、流体力学的抵抗測定を使用する、直接クームス試験（ＤＣＴ）／直接抗グロブリン試験（ＤＡＴ）の複数の例示的段階を記載する。
１．複数のチャネルを連続相で充填する。
２．試料（０．５〜１μｌ）を入口チャネルに導入する。
３．各々２５０ｎｌの２つの一連の液滴を生成することによって試料を分割する。
４．生理食塩水／ＰＢＳ（６４ｎｌ）の液滴を生成し、チャンバ内で第１の血液液滴、第１の参照液滴と混合する。
５．複数流下時間を測定し、その移動中のマイクロ流体チャネル内のこの第１の参照液滴の流体力学的抵抗を計算する。
６．第２の参照液滴を第１の参照液滴と全く同一に生成し、および抗グロブリン血清（クームス試薬）（６４ｎｌ）の液滴を生成し、チャンバ内の第２の血液液滴、すなわち試験液滴と混合する。
７．チャネルを通る第２の参照液滴および試験液滴の移動中、第２の参照液滴の流下時間を複数測定し、これら液滴の移動中のマイクロ流体チャネル内の流体力学的抵抗を計算する。
８．試験液滴内で凝集が発生したか否かをその流体力学的抵抗と参照液滴の流体力学的抵抗との比較によって判断する。

好ましくは、ヘキサデカンは連続相として使用される。生化学的応用のためのマイクロ流体技術で一般的に使用されるフロリナート（例えば、ＦＣ４０、ＨＦＥ‐７５００）並びに他の複数の鉱油も使用され得る。油の選択は、複数のチャネルが作成される材料の濡れ性および考慮される油と分析される材料との間の表面張力に基づくべきである。

連続相とマイクロ流体チャネルが作成される材料との間の複数の任意の物理化学的相互作用は、そのような組み合わせを不適格にする。例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のようないくつかの弾性ポリマーは任意の油と接触すると膨張する。これは、それらの動作寿命の短縮をもたらし、そのような材料が使用され得る応用範囲を著しく制限する。

連続相の生体適合性およびマイクロ流体チャネルの材料は重要な課題である。その比較的低い価格および処理の容易性を主な理由として、マイクロ流体チャネルのための好ましい材料は、ポリカーボネートである。更に、その表面の疎水化のために開発された特定の手順が存在する。選択された材料の半透明性も重要である。マイクロ流体チャネルは完全に透明である必要はないが、しかしながらそれは、チャネルの少なくとも重要な複数の部分、すなわち複数の検出器が配置される複数のチェックポイント（少なくとも２つ）、の内部の光学的分析を可能にする必要がある。また、ポリラクチド（ＰＬＡ）はその透明性、疎水性、生体適合性および生分解性により、マイクロ流体チャネルのための材料として使用されてよい。

好ましくは、チャネルは長方形または正方形断面を有する。それは、流れる複数の液滴の内部に現れる複数の渦対の配置によって、円形の断面よりも好適である。正方形または長方形のチャネルを流れる液滴内に、当該渦対はその内容物の混合が強化されるように配置される。これらの渦巻きは、液滴の後部または前部における、複数の凝集（複数の抗原抗体複合体）といった複数の凝集物の収集を共同して担当する。これは、液滴を通過する光度の複数の測定または特定の試料に係る複数の分析された液滴間のコントラストの比較による、凝集の検出のための別の（確証的）方法を可能にする。

そのような区別の例が図３に提示される。光‐電圧コンバータにより、光度は電圧の振幅に変換される。凝集ありの試料の液滴と対照的に、凝集なしの液滴は均質である。凝集の処理および液滴の後部における複数の凝集物の更なる累積は、液滴の内容物の非均質的な分配をもたらす。分析された液滴と均質な液滴に割り当てられた基準線との間の不一致は、内部で発生している反応を示す。

複数のチャネルの長さは重要性が低い。液滴内容物の適切かつ十分な混合を可能とすべきである。これは、その長さまたは屈曲の形状のいずれかによって影響され得る。好ましくは、最良の効果を取得すべく、これらの特徴の両方は組み合わされてよい。

液滴の容積は、マイクロ流体チャネルの幅により調整されてよい。レオロジー的な方法は、流体力学的抵抗における変化に依存するので、その変化が最も観察可能である容積に固定されることが望ましい。幅３６０μｍの正方形断面の複数のチャネルに対し、この効果は３２０ｎｌの容積を有する複数の液滴において強化される（Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．，２０１２，１０８，１３４５０１Ｓ．Ｊａｋｉｅｌａ，Ｐ．Ｍ．Ｋｏｒｃｚｙｋ，Ｓ．Ｍａｋｕｌｓｋａ，Ｏ．Ｃｙｂｕｌｓｋｉ ａｎｄ Ｐ．Ｇａｒｓｔｅｃｋｉ内に記載）。更に、複数のモノクローナル試薬／血漿／血清と接触する複数の血液／赤血球細胞（ＲＢＣ）試料の分析のために、好ましい割合はそれぞれ２５６ｎｌおよび６４ｎｌである。これらの条件は、凝集されたおよび非凝集された複数の液滴の機動性における最大の差異を提供する。
［実施例］

試験は、試料としての人間の全血、および複数の抗体を含有する試薬としての市販の複数のモノクローナル試薬（分析実験室で使用される）を使用して実行された。検出領域は、複数の光学的検出器および同時にチェックポイントとして機能する２つのフォトダイオードを備える１０ｃｍ長さのチャネルで構成された。流体力学的抵抗の複数の測定結果は、図３に示される。典型的な流体力学的抵抗は、凝集された液滴および非凝集された液滴に対して著しく異なる。当該差異は、人間の全血試料に対して１０％にすら到達する。

複数のエラーバーは、各試料の平均標準偏差、すなわち正規分布の１σ、および３σをマークする。凝集された試料および非凝集された試料からの３σの重複はない。したがって、血液型判定ミスの可能性は実質的にゼロである。最悪の精度を持つ試料は、４を僅かに上回る数倍のσ値を有する。それは、これらの測定の最小信頼性は９９，９９９１％より高い（１００万回の試験につき１つの誤り）ことを暗示する。

複数の特別のカードを用いて実行される、複数の臨床のＡＢＯ凝集試験の信頼性は異なってよく、９３％から９９％の範囲内である（別の試験と組み合わされた場合）。複数のカードを用いて実行される弱Ａ抗原（Ａ_２）検出の場合、信頼性は４０％未満に低下する。図３から理解され得るように、Ａ_１検出と比較して、レオロジー的な方法を使用するこの抗原の検出の信頼性において著しい差異はない。その上、Ｋｅｌｌシステムからの複数の抗原の検出は、同一の高レベルの信頼性のままである。

ＡＢＯ不適合性輸血の発生は、１００，０００輸血ユニットにつき１から２５０にわたる範囲であると報告される。複数の標準的な方法を使用する、正しくない型判定（技術的エラーおよび誤記の両方）は、輸血エラーの約１３％を構成する。当該エラーは、化学分析技術に起因するだけでなく、しばしば手順のミスおよび試料の不適切な処理からももたらされる。

重要なことは、本方法は、遠心分離のような血液の前処理を必要としないことである。別の利点は、試験を実行するのに必要とされるのは少量の血液であることである。標準的な複数の方法は、型判定に５〜１５ｍｌの血液を必要とし、クロス試験にもまた同量を必要とする。流体力学方法では、約１μｌの血液のみが必要とされる。

ＰＣＲ、ＬＡＭＰまたはＥＬＩＳＡのような試験において、液滴内のますます増加するポリマー鎖、ＤＮＡまたは他の複数の分子の数は、その流体力学的抵抗における測定可能な変化をもたらすべきである。しかしながら、文献内にこの仮定を確認または否定する決定的なデータはない。

Claims (11)

1. マイクロ流体デバイスのマイクロ流体反応チャネルを流れる生体液体の流体力学的抵抗における変化を測定することによって、前記生体液体の凝集を判断するための方法であって、
   ａ）凝集が発生した既知の生体液体の一連の液滴の流体力学的抵抗の較正値および凝集が発生しなかった既知の生体液体の一連の液滴の較正値を計算することによってマイクロ流体デバイスを較正する段階と、
   試験される生体液体に対して次に実行される、
   ｂ）前記マイクロ流体反応チャネルの測定セクションを画定する距離をもって離間させた複数の検出器を有する、前記マイクロ流体反応チャネルに疎水性連続液相（連続相）を充填する段階と、
   ｃ）前記マイクロ流体反応チャネルに、生理食塩水またはＰＢＳまたは水と混合された、前記連続相と非混和性の前記生体液体の液滴である第１の参照液滴を導入する段階と、
   ｄ）前記第１の参照液滴が測定セクションを有する前記マイクロ流体反応チャネルを流れるようにする段階と、
   ｅ）前記マイクロ流体反応チャネルの前記測定セクションを介して、前記第１の参照液滴の流下時間を測定する段階と、
   ｆ）前記マイクロ流体反応チャネルに、前記第１の参照液滴と同一である第２の参照液滴、その後に１から１０００の一連の試験液滴を導入する段階であって、１または複数の前記試験液滴は複数の参照液滴に含まれるものと同一の前記生体液体、および凝集試薬で構成される、前記連続相と非混和性である１または複数の液滴である段階と、
   ｇ）前記第２の参照液滴および前記一連の試験液滴が前記マイクロ流体反応チャネルを流れるようにする段階と、
   ｈ）前記マイクロ流体反応チャネル内の前記一連の試験液滴の存在箇所において、前記測定セクションを介して前記第２の参照液滴の流下時間を測定する段階と、
   ｉ）前記一連の試験液滴の流体力学的抵抗を計算する段階と、
   ｊ）前記流体力学的抵抗を複数の前記較正値と比較することによって、前記生体液体の凝集を判断する段階と、を備える方法。
2. 前記連続相は、前記液滴を前記マイクロ流体反応チャネルの壁の表面から分離する、請求項１に記載の方法。
3. 前記生体液体は全血、血漿、血清または分離された複数の血球の試料である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記生体液体は、唾液の試料である、請求項１または２に記載の方法。
5. 前記生体液体は、尿の試料である、請求項１または２に記載の方法。
6. 血液型判定のために、前記凝集試薬は、血液型システムの複数の抗体（抗Ａ、抗Ｂおよび抗Ｄ）からなる群から選択される複数のモノクローナル抗体を含む、請求項３に記載の方法。
7. 前記連続相は、ヘキサデカン、フロリナートおよび鉱油からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記マイクロ流体反応チャネルに、同一の容積を有する２つの参照液滴を導入する段階を備える、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記第２の参照液滴が前記マイクロ流体反応チャネルの幅の１０倍から２０倍の距離を移動した後、前記一連の試験液滴が前記マイクロ流体反応チャネルに導入される、請求項１に記載の方法。
10. 複数の前記試験液滴は、前記マイクロ流体反応チャネルの幅の３倍から４倍のサイズを有する、請求項１に記載の方法。
11. 前記マイクロ流体反応チャネルに導入される複数の前記試験液滴間の距離は、前記マイクロ流体反応チャネルの幅の２倍から５倍である、請求項１０に記載の方法。