JP2016216471A - 三糖誘導体及びアジュバントとしてのその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】三糖誘導体アジュバント組成物、並びにかかるアジュバント組成物を含むワクチン又はキット。【解決手段】脂肪酸エステル基及び任意選択で１つ又は２つの硫酸エステル基又はリン酸エステル基から選ばれる１つ以上のアニオン基で完全に置換されている三糖コアを含む三糖誘導体のアジュバントとしての使用、三糖誘導体それ自体、かかる三糖の調製方法、かかる方法で得られる三糖。三糖コアは、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリウロース又はケストースに由来する。【選択図】図１

Description

発明の分野

本発明は、脂肪酸エステル基及び任意選択で１つ以上のアニオン基で完全に置換されている、置換された三糖コアを含む新規な三糖誘導体、及びアジュバントとしての該三糖誘導体の使用に関する。本発明は、さらに、この三糖誘導体の調製方法、この方法によって得られる三糖、及びワクチン中でのアジュバントの使用に関する。

発明の背景

抗体とは、血液及び他の体液中、並びに組織中に含有される物質であり、抗原に結合してその抗原を無害化する。抗体は体の天然の防御機序の１つを構成する。抗体は高度に特異的であり、抗体の形成を誘発した抗原を殺すか、その抗原に結合するか、又はその抗原を無害化する。

このように、抗原が免疫系に接触すると、複雑な一連の細胞の相互作用が活性化されて、その抗原の排除、及び／又はそれ以前の平衡の再確立がなされる。

抗原の特性のうちの２つは、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を誘発する（特異的な抗体の形成を含む）能力である免疫原性、及びその抗原が元となって生じた抗体によって選択的に認識される能力である抗原性である。

ワクチンを用いて特異的な抗原を投与することによって、免疫応答を意図的に刺激する方法が知られている。この処置を用いると、生物における免疫応答の状態を維持し、引き続き抗原と接触している間、生物の反応をより迅速により効果的にすることが可能になる。

しかし、免疫原性が弱く、生物を効果的に保護するには不十分な免疫応答しか誘発しない抗原がある。このような免疫原性は、抗原がアジュバントと同時投与されれば、顕著に改善される場合がある。

アジュバントとは、抗原に対する免疫応答を高める物質であるが、必ずしもそれ自体に免疫原性があるわけではない。アジュバントは、抗原を投与部位付近に局所的に維持して、免疫系の細胞に抗原をゆっくりと徐放することを容易にするデポ（貯蔵）効果を生むことによって作用することができる。アジュバントは、免疫系の細胞を抗原貯蔵部に誘引し、かかる細胞を刺激して免疫応答を引き出すこともできる。

アジュバントは、例えば、ワクチンに対する宿主免疫応答を向上させるために長年使用されてきた。内在性アジュバントとは、普通、ワクチンとして使用される死滅細菌又は弱毒化細菌の成分である。外在性アジュバントとは、一般的に抗原に非共有結合した免疫調節剤であり、宿主免疫応答を高めるために製剤化される。

水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム（まとめてアラムと呼ばれる）が、普通、ヒト及び動物用ワクチン中でアジュバントとして使用される。ジフテリア及び破傷風トキソイドに対する抗体応答の増加におけるアラムの有効性は十分立証されており、もっと最近では、ＨＢｓＡｇワクチンにアラムがアジュバントとして使用されている。

抗原に対する免疫応答を惹起することができる外在性アジュバントは広範にある。このような外在性アジュバントには、膜タンパク質抗原と複合体を形成するサポニン（免疫刺激複合体）、鉱油を伴うプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリマー、鉱油に入れた死滅マイコバクテリア、完全フロイントアジュバント、細菌生成物、例えばムラミルジペプチド（ＭＤＰ）など、が含まれる。

プロテオリポソームでのタンパク質の封入（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１７３９〜１７４４（１９９２）を参照）を有すると化学的に定義されたアジュバント、例えば、モノホスホリルリピドＡ、リン脂質コンジュゲートなど（Ｇｏｏｄｍａｎ−Ｓｎｉｔｋｏｆｆら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４１０〜４１５（１９９１）を参照）が研究されている。

合成ポリマーもアジュバントとして評価されている。合成ポリマーには乳酸及びグリコール酸のホモポリマー及びコポリマーが含まれ、これらは抗原を封入するマイクロスフェアを生成するために使用されてきた（Ｅｌｄｒｉｄｇｅら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２８７〜２９４（１９９３）を参照）。

非イオン性ブロックコポリマーは、評価を受けている別の合成アジュバントである。油性乳剤中の低分子量コポリマーについて（Ｈｕｎｔｅｒら、Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐａｒｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ（Ｅｄ．Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｔｕｌｌ、Ｄ．Ｅ．Ｓ．）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、５１〜９４ページ（１９９５）を参照）、及び水性製剤中の高分子量コポリマーについて（Ｔｏｄｄら、Ｖａｃｃｉｎ １５：５６４〜５７０（１９９７））、アジュバント効果も研究されている。

理想的なアジュバントに望ましい特徴は、毒性がなく、長時間持続する免疫応答を刺激できることである。ヒトにおいて最も広く使用されるアジュバントの１つにアラムがある。他のアジュバント、例えばサポニン、Ｑｕｉｌ Ａ及び油中水型アジュバント、死滅結核菌を加えたフロイント（完全フロイント）又は菌を加えないフロイント（不完全フロイント）などは、毒性作用があるため、ヒトにおける使用に制限があり、動物における弊害について懸念が高まっている。

要するに、多くのアジュバント製剤が記述されているが、そのほとんどが定期接種ワクチン用として受容されるものではなく、ヒトにおける使用に認可されたものはほとんどない。その原因は主にアジュバント製剤の毒性にある。例えば、ある動物ワクチン中でアジュバントとして使用される鉱油は、容易に分解せず、注射部位に滞留し、これによって容認し難い肉芽腫を引き起こす。概して、鉱物化合物油乳剤、リポソーム及び生分解性ポリマーマイクロスフェアなどのアジュバント製剤は、注射部位に貯蔵部を形成することが原因で局所反応を引き起こす。

ヒト用ワクチンにおいて現在認可されているアジュバントの例には、アラム、ＭＦ５９（水中油型乳剤）、ＭＰＬ（糖脂質）、ＶＬＲ、免疫増強性再構成インフルエンザヴィロソーム（Ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｏｓｏｍｅ）（ＩＲＩＶ）及びコレラ毒素が含まれる（Ｒｅｅｄら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：２３〜３２（２００８）を参照）。

当技術分野において公知のアジュバントの１つの群は、いわゆるスルホリポ多糖、即ち脂肪酸エステル及び硫酸エステルの両方を含有する多糖類である（Ｈｉｌｇｅｒｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６０．、１４１〜１４６ページ、１９８６）。これらの化合物の調製方法は、国際特許出願、国際公開第９６／２０２２２号及び国際公開第９６／２０００８号に記載されている。スルホリポ多糖を調製するこれらの方法では、結果として、多糖分子毎に存在する脂肪酸エステルの数、多糖分子毎に存在する硫酸エステルの数、多糖分子毎のヒドロキシル基の数、並びに多糖分子全体に亘る脂肪酸エステル、硫酸エステル及びヒドロキシル基の分布が異なる種々のスルホリポ多糖誘導体が形成される。このことが意味するのは、これらのスルホリポ多糖の調製中に様々なスルホリポ多糖の混合物が得られるということである。その結果、所望のスルホリポ多糖の収率が比較的低いものとなるか、又は規制問題を発生させる、特性決定の困難な混合物として、このアジュバントを使用しなければならない。

欧州特許ＥＰ１２３３９６９において、スルホリポ二糖を含むアジュバント組成物が特許請求されている。このスルホリポ二糖の調製方法も記載されている。実施形態の１つにおいて、調製されたスルホリポ二糖は脂肪酸エステル基又は硫酸エステル基で完全に置換されている。しかし、以下にさらに記載するように、このスルホリポ二糖がアジュバントとして動物に使用されると、平均体温上昇（発熱を含む）及び局所刺激（組織腫脹）の発生などの不所望な副作用が発生する。

発明の詳細な説明

上記の事項に鑑みて、本発明の目的は、調製が比較的容易且つ安価であり、良好なアジュバント特性があり、臨床で使用されるとき不所望な副作用の誘発が最小限である化合物を提供することである。本発明のさらなる目的は、例えばワクチンと組み合わせてアジュバント組成物中で使用することができ、優れた安全性及び副作用プロファイルを有する化合物を提供することである。

本発明の第１及び第２の態様は、三糖誘導体及びアジュバントとしての該三糖誘導体の使用に関する。本発明による三糖誘導体は、脂肪酸エステル基及び任意選択で１つ以上のアニオン基で完全に置換されている、置換された三糖コアを含む。

本発明による三糖誘導体は、ワクチン用アジュバントとして使用するのにきわめて好適である。この三糖誘導体の副作用プロファイルは、例えば二糖系のアジュバントなど、多糖誘導体系の他のアジュバントの副作用プロファイルよりも驚くほど顕著に優れている。

抗原組成物と、本発明による三糖誘導体を含むアジュバント組成物とをワクチン接種した動物は、例えばＥＰ１２３３９６９の二糖誘導体と比較して平均体温の上昇が少ない。本発明による三糖誘導体を含むアジュバントを使用すると、注射部分周辺の局所反応（組織腫脹）の発生度合いも低い。

本明細書で使用する抗原という用語は、人体又は動物体において免疫学的反応を誘発する任意の成分又は物質を指す。例えば、ウイルス、細菌、マイコプラズマ、寄生生物又は腫瘍細胞、微生物のサブユニット、例えばタンパク質、多糖、ペプチド、糖タンパク質、多糖−タンパク質コンジュゲート、ペプチド−タンパク質コンジュゲートなどである。

抗原は、例えば、１つ以上の生きている生物、不活化生物、又はいわゆるサブユニット（後者は例えば、合成で、若しくは組換えＤＮＡ法によって調製されるか、又は生物から単離される）からなることもあり、又はこれらを含有することもある。抗原という用語は、人体又は動物体において免疫反応を誘発しうる任意の成分をさらに指す。

本発明の誘導体の三糖コアは好ましくは、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリウロース又はケストースに由来する。特に好ましくは、三糖コアがラフィノース、メレジトース又はマルトトリオースに、最も好ましくはラフィノース又はマルトトリオースに由来する。これらの三糖は、標準形態、即ち非置換形態で、例えば脂肪酸によるエステル化などの反応に有効な、１１のＯＨ−基を有する。しかし、ＯＨ−基のうち１つ以上、好ましくは１つがアニオン基と反応し、それによって、例えば硫酸エステル基又はリン酸エステル基が得られること、好ましくは硫酸エステル基が得られることも可能である。

本発明の好ましい実施形態では、本発明による三糖誘導体は、アニオン基を含まず、脂肪酸基のみを、好ましくは同一の脂肪酸基を含む。

別の好ましい実施形態によれば、本発明による三糖誘導体は、置換された各三糖コアにつき、１つ又は２つのアニオン基と、この各々に対して１０又は９つの脂肪酸基とを含む。好ましくは、脂肪酸基は同一のものである。

本明細書で使用するアニオン基という用語は、負に帯電している部分（即ち中性ｐＨ又は誘導体が適用される環境のｐＨで負に帯電している）を指す。かかるアニオン基は、例えば、硫酸基、スルホン酸基又はリン酸基でもよい。好ましいアニオン基には、硫酸エステル基又はリン酸エステル基が含まれる。かかる基の例には、−Ｏ−ＳＯ_２−ＯＮａ又は−Ｏ−ＳＯ_２−ＯＮＨ_４、−Ｏ−ＳＯ_２−ＯＴＥＡ（即ち硫酸トリエチルアンモニウム）がある。

本発明の好ましい実施形態において、置換された三糖コアに共有結合している脂肪酸エステル基は、鎖長が炭素原子数４〜２０、好ましくは６〜１８、より好ましくは炭素原子数８〜１６、最も好ましくは１０〜１４、きわめて好ましくは炭素原子数１２の、直鎖、分枝、飽和又は不飽和の脂肪酸のエステルである。

置換された三糖コアが、複数種の脂肪酸エステルで置換されていることは本発明の範囲内であるが、１種のみが使用されること、即ち全ての脂肪酸エステルが同一のものであることが好ましい。

脂肪酸を使用することがきわめて好ましいが、しかし、他のカルボン酸、好ましくは脂肪酸に密接に近似したものが有利な結果をもたらす場合があることも、本発明によって想定される。

好ましくは、脂肪酸エステルは、飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸又は多価不飽和脂肪酸のエステル、例えば、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、リシノール酸、バクセン酸、アラキジン酸、ガドレイン酸、アラキドン酸、オレイン酸又はリノール酸などである。ラウリン酸が最も好ましい。

好ましい実施形態では、置換された三糖コアは、ラフィノース、メレジトース又はマルトトリオースに由来し、置換された各三糖につき、同一の脂肪酸エステル基で完全に置換されている三糖誘導体である。即ち、この三糖コアは１１の同一の脂肪酸エステル基で置換されている。

別の好ましい実施形態では、置換された三糖コアは、ラフィノース、メレジトース又はマルトトリオースに由来し、置換された各三糖につき、硫酸エステル基又はリン酸エステル基などの１つ又は２つのアニオン基、及びこの各々に対して１０又は９つの同一の脂肪酸エステル基を含む。最も好ましくは、脂肪酸エステルはラウリン酸のエステルである。

本発明の第３の態様は、
ｉ）三糖を用意し、これを溶媒中に溶解させるステップと、
ｉｉ）三糖の全てのＯＨ−基を脂肪酸又は脂肪酸の供給源によってエステル化し、任意選択で、三糖のＯＨ−基のうち少なくとも１つをアニオン作用剤と反応させるステップと
を含む、三糖誘導体の調製方法に関する。

全てのＯＨ−基がアニオン基及び／又は脂肪酸と反応するという事実があるため、不純物はほとんど形成されていない。このことが意味するのは、大規模な精製ステップを経ずとも、薬学的に許容される純粋な形態の想定される三糖誘導体を得ることが可能であるということである。ラウリン酸など、脂肪酸を１種のみで使用すれば、所望の三糖誘導体を薬学的に許容される純粋な形態で得るために必要な精製はさらに少なくて済む。本発明の方法の別の利点は、所望の三糖誘導体が容易に比較的大量に得られることであり、これによって本方法は経済的に魅力のあるものとなる。

本発明の好ましい実施形態では、調製された三糖誘導体は、アニオン基を含まず、脂肪酸基のみを、好ましくは同一の脂肪酸基を含む。即ち、全てのＯＨ−基が脂肪酸又は脂肪酸の供給源と反応したということである。

別の好ましい実施形態によれば、調製された三糖誘導体は、置換された各三糖コアにつき、１つ又は２つのアニオン基と、この各々に対して１０又は９つの脂肪酸基とを含む。好ましくは、脂肪酸基は同一のものである。

上記の方法において使用する三糖は、好ましくは、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリウロース又はケストースである。より好ましくは、ラフィノース、メレジトース又はマルトトリオースが、最も好ましくはマルトトリオース又はラフィノースが使用される。

上記の方法において使用する脂肪酸の意味は、脂肪酸塩、脂肪酸ハロゲン化物、脂肪酸エステル及び誘導体を含む、任意の脂肪酸の供給源を指す。好ましくは、特許請求した方法において使用する脂肪酸は、鎖長が炭素原子数４〜２０の間、好ましくは６〜１８の間、より好ましくは炭素原子数８〜１６、最も好ましくは炭素原子数１０〜１４、きわめて好ましくは炭素原子数１２の、直鎖、分枝、飽和又は不飽和の脂肪酸である。

好ましくは、使用する脂肪酸は、飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸又は多価不飽和脂肪酸、例えば酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、リシノール酸、バクセン酸、アラキジン酸、ガドレイン酸、アラキドン酸、オレイン酸又はリノール酸などである。ラウリン酸が最も好ましい。

上記の通り、本発明の好ましい実施形態では、ＯＨ基のうち少なくとも１つがアニオン性試薬と反応する。好ましくは、使用されるアニオン作用剤は、硫酸化剤又はリン酸化剤、例えば気体のＳＯ_３、ＨＣＬＳＯ_３、ＳＯ_３．ピリジン、ＳＯ_３−２−メチルピリジン、ＳＯ_３−２，６−ジメチルピリジン、ＳＯ_３−ジメチルホルムアミド、ＳＯ_３−トリメチルアミド、ＳＯ_３−トリエチルアミン、ＳＯ_３−ジメチルアナリン、ＳＯ_３−Ｎ−エチルモルホリン、ＳＯ_３−ジエチルアラニン、ＳＯ_３−ジオキサン及びこれらの組合せである。最も好ましくは、スルホン化剤はＳＯ_３．ピリジン又はＳＯ_３．トリエチルアミンである。

最も好ましい硫酸化剤はＳＯ_３．ピリジンである。三糖のＯＨ−基のうち少なくとも１つと硫酸化剤との反応は、三糖の脂肪酸でのエステル化の前に実施することがさらに好ましい。硫酸化剤との反応を最初に実施することの利点は、硫酸化剤がいわゆる第１ＯＨ−基と最初に反応してから他のＯＨ基と反応し、これによって、形成される異性体の数が低減されることである。

好ましい実施形態では、三糖：アニオン作用剤：脂肪酸の当量比は、１：０〜３：８〜１１、好ましくは１：０〜１：１０〜１１である。特許請求したこれらの範囲内では、三糖のＯＨ−基が、脂肪酸エステル及び任意選択で硫酸エステルなどのアニオン基で完全に置換されたものが効率的に得られる。

好ましくは、反応を実施するために使用する溶媒は、ピリジンとジメチルホルムアミドとの混合物である。

本発明の方法の追加のステップでは、三糖誘導体に、薬学的に許容される添加剤又は賦形剤と混合する追加のステップを施し、それによってアジュバント組成物が得られる。

本発明の第４の態様は、本発明による三糖誘導体又は該三糖誘導体の混合物を含むアジュバント組成物に関する。かかる三糖誘導体を製剤してアジュバント組成物にする際、薬学的に許容される添加剤又は賦形剤と混合することが好ましい。好ましくは、アジュバント組成物は水中油型乳剤として製剤化される。使用するのに好適な油は、中でも、動物油、植物油及び鉱油、例えば魚油、ビタミンＥ、スクアラン（ｓｑａｌａｎｅ）、スクアレンなどである。好ましくはスクアランが、好ましくはポリソルベートと組み合わせて使用される。

１種の三糖誘導体のみを使用することが可能ではあるが、本発明による種々の三糖誘導体の混合物をアジュバント組成物中に使用することも本発明の範囲内である。好ましい実施形態では、硫酸エステル基などのアニオン基を伴う、本発明による三糖誘導体の混合物、及びアニオン基を伴わない同一の三糖誘導体、例えば、スルホ−リポ−ラフィノース及びリポ−ラフィノースが使用される。最も好ましくは、かかる混合物中で使用される三糖誘導体の脂肪酸エステルは、例えばラウリン酸のエステルなどの同一のものである。

本発明の第５の態様は、上記の通りのアジュバント組成物又は三糖誘導体を含むワクチンに関する。

アジュバント組成物と抗原組成物又はワクチンとの両方が、非経口的に投与されることが好ましい。非経口投与の好適な手段には、筋肉内、皮下、真皮下及び皮内投与が含まれる。非経口投与に好適な器具には、針（マイクロニードルを含む）付き注射器及び経皮デリバリーシステムが含まれる。

非経口製剤は、標準的な方法に従って、当業者が容易に調製することができる。非経口製剤は、水中油型乳剤として調製されることが好ましい。

例えば濾過による滅菌条件下での非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技術を使用して容易に実現することができる。

本発明によるワクチン又はアジュバント組成物は、ヒト及び様々な標的動物、例えばブタ、ウシ、家禽、イヌ、ネコ、ウマなどに投与することができる。

本発明の第６の態様は、上記のアジュバント組成物及び抗原組成物を含むキットに関する。

アジュバント組成物と抗原組成物即ちワクチンとの組合せを、別々に投与することが望ましい場合がある。かかる場合には、アジュバント組成物と抗原組成物とをキットの形態中に都合よく組み合わせることができる。かかるキットは、例えば２本バイアルシステム又はデュアルチャンバーシリンジとしてもよいであろう。

次に、本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明することにする。

本発明による三糖誘導体の調製
実施例１ 本発明によるスルホ−リポ−三糖の一般的な合成
三糖を真空オーブン中で乾燥し、結晶水を除去する。続いて三糖（５ｇ）を、還流冷却器を備えた１００ｍＬ三口丸底フラスコ中で、３０ｍＬのＤＭＦ及び１４ｍＬのピリジン中に窒素流下で溶解させる。１．０５当量のピリジン．ＳＯ_３を、強力に攪拌しながら添加する。１時間後、フラスコを氷水中で冷却し、反応混合物が温まるのを防止するために強力に攪拌しながら塩化ラウロイルを滴加する。１５分後、氷浴をゆっくりと４０℃まで加熱する。反応の進行はＨＰＬＣでモニターする。反応完了後、混合物を、ロータリーエバポレーター（６０℃まで加熱）に入れて真空内で濃縮する。粗生成物を３００ｍＬヘプタン及び１５０ｍＬ塩水中に取り込む。有機層を５００ｍＬ分液漏斗中で分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過する。ヘプタン溶液を真空内で濃縮する。得られた油を２００ｍＬヘプタン中に溶解させ、トリエチルアミン（２．３７ｍＬ）を滴加する。得られた溶液を濾過し、真空内で濃縮する。油を１００ｍＬヘプタン中に再び溶解させ、濾過し、溶液を真空内で濃縮する。

実施例２ ピリジン．ＳＯ _３ ルートによるスルホ−リポ−マルトトリオース（Ｓ１Ｌ１０−Ｍａ）の合成
表題生成物を、実施例１に記載した一般的な方法に従って、以下の詳細にて合成した。即ち、マルトトリオース（５．１ｇ、１０ｍｍｏｌ）を真空炉（ｖａｃｕｕｍ ｓｔｏｖｅ）中で、＜１０ｍｂａｒにて、４０℃で１９時間及び７０℃で４８時間乾燥し、収量は４．９ｇであった。乾燥したマルトトリオースを３０ｍＬのＤＭＦ及び１４ｍＬのピリジン中に溶解させ、１．６ｇ（１．０５当量）のピリジン．ＳＯ_３で硫酸化し、２ｍＬのＤＭＦ中に懸濁した。１時間後、スルホ−三糖を、氷浴中で１１当量（２５．５ｍＬ）の塩化ラウロイルでエステル化した。混合物をゆっくりと４０℃まで加熱し、３時間反応させた。反応ステップに続いて、ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析を行った。抽出及びトリエチルアミン交換をしてから生成物を単離した。濃厚な黄褐色のシロップの収量は１５．５ｇ＋５．５ｇ（５０℃まで加熱した後の蒸発フラスコからの二次収穫物）。ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムについては図１Ａを参照。

実施例３ ピリジン．ＳＯ _３ ルートによるスルホ−リポ−マルトトリオース（Ｓ１Ｌ１０−Ｍａ）の代替合成
表題生成物を、実施例１に記載した一般的な方法に従って、以下の詳細にて合成した。即ち、マルトトリオース（５．０ｇ、１０ｍｍｏｌ）を真空炉中で、＜１０ｍｂａｒにて、４０℃で２０時間及び７０℃で９０時間乾燥し、収量は４．９ｇであった。乾燥したマルトトリオースを３０ｍＬのＤＭＦ中に溶解させ、１．６ｇ（１．０５当量）のピリジン．ＳＯ_３を１４ｍＬのピリジン中の懸濁液として添加した。１時間後、スルホ−三糖を、氷浴中で１１当量（２５．２ｍＬ）の塩化ラウロイルでエステル化し、ゆっくりと４０℃まで加熱した。ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析用試料を、処理中の一定時間毎に取り出した。塩化ラウロイルとの反応を周囲温度で終夜放置した。後処理を、実施例１に記載の通りに行った。濃厚な黄褐色のシロップの収量は２４．７ｇ。ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムについては図１Ｂを参照。

実施例４ ピリジン．ＳＯ _３ ルートによるスルホ−リポ−ラフィノース（Ｓ１Ｌ１０−Ｒａ）の合成
表題生成物を、実施例１に記載の通りに、以下の詳細にて合成した。即ち、ラフィノース五水和物（５．０ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、真空炉中で、＜１０ｍｂａｒにて、３０℃で２４時間及び６０℃で９０時間乾燥し、収量は４．３ｇであった。乾燥したラフィノースを３０ｍＬのＤＭＦ及び１４ｍＬのピリジン中に溶解させた。ピリジン．ＳＯ_３（１．６ｇ、１．０５当量）を一度に添加した。１時間後、スルホ−三糖を氷浴中で１２当量（２３．５ｍＬ）の塩化ラウロイルでエステル化し、４０℃までゆっくりと加熱した。４時間後、実施例１に記載の通りに、混合物を真空内で濃縮し、抽出し、ＴＥＡで処理した。濃厚な黄褐色のシロップの収量は１８．０ｇ。ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムについては図２を参照。

実施例５ リポ−マルトトリオース（Ｌ１１−Ｍａ）の合成
表題生成物を、実施例１に記載した一般的な方法に従って、以下の詳細にて合成した。即ち、マルトトリオース水和物（０．５０ｇ）を真空オーブン中で乾燥した。乾燥した三糖（０．４９ｇ、０．９７ｍｍｏｌ）をピリジン（１．４ｍＬ）及びＤＭＦ（３ｍＬ）中に溶解させ、氷浴中で冷却し、塩化ラウロイル（３．３６ｍＬ、１５当量）と、０℃で１時間、続いて室温で１６時間反応させた。反応混合物はゲルになり、３ｍＬのヘプタンを添加し、音波処理をすると、生成物は溶解した。ヘプタンの添加を２回繰り返した。有機相（７５ｍＬ）を水で洗浄し、３層系を形成した。有機層のみを単離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮して、濃厚な黄褐色のシロップ１．３９ｇを得た。ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムについては図３Ａを参照。

実施例６ リポ−ラフィノース（Ｌ１１−Ｒａ）の合成
ラフィノース五水和物（０．５０ｇ）を真空オーブン中で乾燥した。乾燥したラフィノース（０．４１ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）をピリジン（１．４ｍＬ）及びＤＭＦ（３ｍＬ）中に入れ、氷浴中で冷却し、塩化ラウロイル（２．９７ｍｌ、１５当量）と、０℃で１時間、続いて室温で１８時間反応させた。反応混合物をヘプタン（５０ｍｌ）で希釈し、水（２５ｍｌ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮して、濃厚な黄褐色のシロップ２．３３ｇを得た。ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムについては図３Ｂを参照。

本発明による三糖誘導体を含むアジュバントの、抗ＧｎＲＨ価、血清テストステロン値及び有害作用の発生に対する影響。
動物実験を実施して、本発明による三糖のアジュバントとしての使用に関連する有効性及び考えられる有害作用を評価した。ラットにおける当試験では、３種の（スルホ−）リポ−三糖系のアジュバントを試験した。即ち、実施例３に従って調製したスルホ−リポ−マルトトリオース（１つの硫酸−エステル基及び１０のラウロイルエステル基、Ｓ１Ｌ１０−Ｍａ）、実施例４に従って調製したスルホ−リポ−ラフィノース（１つの硫酸−エステル基及び１０のラウロイルエステル基、Ｓ１Ｌ１０−Ｒａ）、及び実施例６に従って調製したリポ−ラフィノース（ラウロイルエステル基で完全に置換されたラフィノース、Ｌ１１−Ｒａ）である。スルホ−リポ−マルトトリオースを含むアジュバントには、リポ−マルトトリオース（ラウロイルエステル基で完全に置換されたもので、Ｌ１１−Ｍａ）も含めた。スルホ−リポ−ラフィノースを含むアジュバントには、リポ−ラフィノース（ラウロイルエステル基で完全に置換されたもので、Ｌ１１−Ｒａ）も含めた。

スルホ−リポ系のアジュバントを、１用量につき０．００８〜８ｍｇの種々な用量にて試験した。アジュバントを、１用量につき、０．７μｇのコンジュゲートしたＧｎＲＨを伴うＧｎＲＨ−ＫＬＨコンジュゲートと組み合わせて試験した。アジュバントのアジュバント活性を、陽性対照アジュバントのスルホ−リポ−スクロース（１つの硫酸エステル基及び７つのラウロイル酸エステル基を伴う二糖、Ｓ１Ｌ７−Ｓｕ）、及び糖類化合物を含まず水中スクアラン乳剤からなる陰性対照アジュバント、並びにＰＢＳのみを受ける１グループと比較した。

有効性を、抗体価と、テストステロン値に対する誘発された抗体の生物学的影響とによって判定した。アジュバントを伴う免疫処置の有害作用を判定するために、毎日の臨床観察を行い、体温及び注射部位反応を判定した。

アジュバント乳剤の調製
糖類：スルホ−リポ−マルトトリオース（Ｓ１Ｌ１０−Ｍａ）
スルホ−リポ−ラフィノース（Ｓ１Ｌ１０−Ｒａ）
リポ−ラフィノース（Ｌ１１−Ｒａ）
スクアラン（Ａ＆Ｅ Ｃｏｎｎｏｃｋ）
ポリソルベート−８０（Ｆａｇｒｏｎ）
滅菌ＰＢＳ−ｗｉｔ ｐＨ７．４（Ｍｅｄｉａｂｅｒｅｉｄｉｎｇ ＡＳＧ、Ｌｅｌｙｓｔａｄ）
ＭｉｌｌｉＱ水
Ｍｉｌｌｅｘシリンジ式フィルターユニット０．２２μｍＰＥＳ、３３ｍｍ、４．５ｃｍ^２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
相互作用チャンバー、型Ｆ２０Ｙを備えたマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）Ｍ−１１０Ｓ
マイクロトラックナノトラックアナライザーシステム（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ Ｎａｎｏｔｒａｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ）ＮＰＡ−２５３

実験用アジュバントを以下の通り調製した。

注：グループ５及び１０については、糖類をスクアラン中に溶解させた。これらの溶液のうち、４．００５６ｇ（５）及び４．０００６ｇ（１０）を、さらなる乳剤の調製に使用した。最終的な乳剤中のＳＬＳ含有量は１ｍｇ／２５ｍｌであった。

油相成分（糖、スクアラン、ポリソルベート−８０及びＭｉｌｌｉＱ水、量は表１に示した通り）を、５０ｍｌファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブ中で重量測定した。ボルテックスを使用して成分を混合し、５０℃の湯浴中で糖類が溶解するまで加熱した。温まった油相を水相（ＰＢＳ）に添加し、２つの相を、ボルテックス及びウルトラタラックス（ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘ）によって、２４０００ｍｉｎ^−１で約３０秒間、間隔を置いて混合した。続いて、乳剤を、マイクロフルイダイザー処理によって形成した。操作圧力を５００ｋＰａ（５ｂａｒ）に設定し、各混合物を、氷浴に浸した相互作用チャンバーの冷却下に３回通過させた。各乳剤に手作業で滅菌濾過を施した。乳剤の粒径を、ナノトラック粒子測定器を使用して測定した。

ワクチン１〜１３を、同等体積のアジュバント（表２に示した糖類化合物を含む）を水相（０．７μｇのコンジュゲートしたＧｎＲＨを含有する）に添加することによって製剤した。ワクチン１４はＰＢＳのみからなる。以下のワクチンを調製した。

動物及び免疫処置
雄の１０週齢のウィスターラットを、１ケージにつき３匹ずつ収容した。ラットに餌及び水を自由に摂取させた。実験デザイン（表２）に従って、０日目、１４日目及び２８日目に、ラットに２００μｌ水相及び２００μｌアジュバントを含む４００μｌワクチンで免疫処置した。２本の筋肉内注射（各１００μｌ）を左右大腿部内側に注射し、２×１００μｌを頸部に皮下注射した。各グループは５匹のラットからなるものとする。

免疫処置前並びに４１日目及び５６日目に、血清用の血液試料を全ての動物から採取した。

ワクチンの有効性
アッセイ
ＧｎＲＨに特異的な抗体をＥＬＩＳＡで測定した。リン酸緩衝液（ｐＨ５）に溶解した０．２％グルタルジアルデヒドでプレート（９６ウェル）をプレコートし、室温で３時間置き、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）で洗浄し、各ウェルにリン酸緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌにつき１０μｇのＧｎＲＨ（Ｐｅｐｓｃａｎ Ｐｒｅｓｔｏ、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、オランダ）を含有する溶液１００μｌをコートし、３７℃で３時間インキュベートした。コートしたプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０で洗浄した。血清試料をＰＥＭ（４％ウマ血清を伴う１％Ｔｗｅｅｎ−８０）中に希釈した（１／１０）。この希釈液を９６ウェルプレート（各ウェルに１００μｌ、８ステップ）中でさらに希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０で洗浄してから、ＰＥＭに入れた、ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗ラット抗血清１００μｌをウェルに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０で１２回洗浄した。続いて、２，２−アジノ−ビス−（３−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）にＨ_２Ｏ_２を加えたものを含有する１５０μｌの基質溶液を、プレートの各ウェルに加えた。プレートを周囲の室温で４５分間インキュベートし、吸光度を４０５ｎｍで測定した。抗体価を希釈因子の１０ｌｏｇとして表した。これはバックグラウンドの４倍の光学密度（約１００）を示している。

血清テストステロン値を、市販のテストステロンＥＩＡ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｗｏｅｒｄｅｎ、オランダ）を使用して、製造元の使用説明書に従って測定した。

ＧｎＲＨ抗体価
スルホ−リポ−マルトトリオース（Ｓ１Ｌ１０−Ｍａ）及びスルホ−リポ−ラフィノース（Ｓ１Ｌ１０−Ｒａ）で処置したグループのＧｎＲＨ抗体価を、図４Ａ及び４Ｂに示す。両スルホ−リポ−三糖とも、ＧｎＲＨに対して用量依存的な抗体価を誘発した。抗体価は、０．０８〜８ｍｇのスルホ−リポ−三糖で処置したラットの方が、糖類を含まないアジュバントで処置したラット（ＮＳ、グループ１１）よりも大幅に高かった。これは、免疫応答に対してスルホ−リポ−三糖が大いに貢献していることを示している。

図４Ｃは、本発明による８ｍｇの糖類化合物、即ちＳ１Ｌ１０−Ｍａ−８、Ｓ１Ｌ１０−Ｒａ−８及びＬ１１−Ｒａ−８を受けたラットのＧｎＲＨ抗体価が、スクアラン乳剤のみで処置したラット（ＮＳ）よりも大幅に高かったことを明白に示す。これによって、Ｓ１Ｌ１０−三糖とＬ１１−三糖の両方の強力なアジュバント活性が際立つ。

血清テストステロン
本発明によるスルホ−リポ−三糖、即ちＳ１Ｌ１０−Ｍａ及びＳ１Ｌ１０−Ｒａを含むアジュバントとともに乳化したＧｎＲＨ−ＫＬＨコンジュゲートで免疫処置をした結果、スルホ−リポ−三糖０．０８ｍｇからそれ以上で、血清テストステロン値の劇的な減少をもたらした（図５Ａ〜Ｂ）が、一方、最も低用量のスルホ−リポ−三糖（０．００８ｍｇ）の、血清テストステロンに対する影響は糖類化合物を含まない水中油型乳剤と類似していた。脂質化三糖（Ｌ１１−Ｒａ−８）での免疫処置もテストステロン値の減少を誘発した（図５Ｃ）。

有害作用
平均体温の上昇
全ての動物において少なくとも１日１回の臨床観察を行った。全ての動物に対し、各免疫処置の前後に、直腸温にて平均体温（ＭＢＴ）を測定した。各グループの平均体温（ＭＢＴ）を、免疫処置前の値について図６に示す。

各ワクチン接種の３時間後、０．８、０．０８及び０．００８ｍｇ用量のスルホ−リポ−三糖で処置したラットには、ＭＢＴに対する影響は認められなかった一方で、８及び２ｍｇ用量でのみ、ＭＢＴにおけるわずかな上昇が観察された。しかしその翌日、ワクチン接種の２１時間後、ＭＢＴは降下して再びほぼ正常値になった（図６Ａ及び６Ｂ）。これとは対照的に、二糖化合物（Ｓ１Ｌ７−Ｓｕ−８）での免疫処置では、ワクチン接種の３時間後に、三糖化合物よりもＭＢＴの上昇がわずかに高く、免疫処置の１日後にＭＢＴの降下は示されず、ＭＢＴはワクチン接種の２１時間後も依然として上昇していた（図６Ｃ）。脂質化三糖（Ｌ１１−Ｒａ−８）はＭＢＴの上昇を何ら誘発しなかった。したがって、図６から明らかであるのは、従来技術において既知の二糖誘導体と比較したとき、本発明による化合物（Ｓ１Ｌ１０−三糖）をアジュバントとして含むワクチンが誘発する体温への影響は驚くほど顕著に短く、一方、脂質化三糖（Ｌ１１−三糖）は、糖類化合物を含まない水中油型乳剤（ＮＳ）と類似して、体温への影響を全く誘発しなかったということである。

注射部位反応
ワクチン接種前に、異常の存在又は存在する局所反応について注射部位を評価した。かかる異常も局所反応もなければ、動物のその部位に注射した。各免疫処置の後、注射部位の組織腫脹について検査した。皮下注射部位のサイズを測定した（直径ｍｍにて）。後肢の筋肉内注射部位反応は判定が困難であるため、筋肉内注射部位（組織腫脹）の存在のみを判定し、任意の値（有り＝１０ｍｍ、無し＝０ｍｍ）で表した。各検査でラット１匹につき４つの注射部位について、注射部位反応のスコアを合計し、グループ毎の平均値を計算した。その結果を図７に示す。

免疫処置後、軽度の用量依存的注射部位反応が、スルホ−リポ−三糖で処置したラット、主に８及び／又は２ｍｇで処置したラットにおいて観察された（図７Ａ及び７Ｂ）。注射部位反応のサイズは、免疫処置後３日目に漸減し、次の免疫処置の５日後にはほとんど検知不能であった。スルホ−リポ−二糖（Ｓ１Ｌ７−Ｓｕ−８）での免疫処置によって生じた注射部位反応は完全に異なるパターンを示した。即ち、注射部位反応がサイズにおいて４日目まで増加し、スルホ−リポ−三糖の４倍よりも大きく（図７Ｃを参照）、さらに、免疫処置の５日後の最終検査の際、依然として顕著な注射部位反応があった。

脂質化三糖（Ｌ１１−Ｒａ−８）は、注射部位で有害作用を何ら誘発しなかった。明らかに、ワクチン製剤を含むスルホ−リポ−二糖が誘発する注射部位反応は、本発明によるスルホ−リポ−三糖を含むワクチンより大きいものであった。

ピリジン．ＳＯ_３ルートによって合成したスルホ−リポ−マルトトリオースのＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムである。 ピリジン．ＳＯ_３ルートによって合成したスルホ−リポ−ラフィノースのＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムである。 リポ−マルトトリオース及びリポ−ラフィノースのＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムである。 種々のワクチン製剤で免疫処置したラットのＧｎＲＨ抗体価（平均）を示すグラフである。 種々のワクチン製剤で免疫処置したラットの血清テストステロン値を示すグラフである。 種々のワクチン製剤で免疫処置したラットの平均体温を示すグラフである。 種々のワクチン製剤で免疫処置したラットの注射部位反応を示すグラフである。

Claims (38)

1. 脂肪酸エステル基及び任意選択で１つ以上のアニオン基で完全に置換されている、置換された三糖コアを含む三糖誘導体の、アジュバントとしての使用。
2. 前記置換された三糖コアが、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリウロース又はケストース、好ましくはラフィノース、メレジトース又はマルトトリオース、最も好ましくはラフィノース又はマルトトリオースに由来する、請求項１に記載の使用。
3. 前記置換された三糖コアが、アニオン基として、１つ又は２つの硫酸エステル基又はリン酸エステル基を含む、請求項１又は２に記載の使用。
4. 前記アニオン基が硫酸エステルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
5. 前記脂肪酸エステル基が、鎖長が炭素原子数４〜２０、好ましくは６〜１８、より好ましくは炭素原子数８〜１６、最も好ましくは炭素原子数１０〜１４、きわめて好ましくは炭素原子数１２の、直鎖、分枝、飽和又は不飽和の脂肪酸のエステルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
6. 前記脂肪酸エステルが、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸又はアラキジン酸、好ましくはラウリン酸のエステルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
7. 前記置換された三糖コアの脂肪酸エステル基が全て同一である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
8. 前記置換された三糖コアが、ラフィノース、メレジトース又はマルトトリオースに由来し、前記三糖誘導体が、置換された各三糖につき、同一の脂肪酸エステル基で完全に置換されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
9. 前記置換された三糖コアが、ラフィノース、メレジトース又はマルトトリオースに由来し、前記三糖コアが、置換された各三糖につき、１個の硫酸エステル基若しくはリン酸エステル基及び１０個の同一の脂肪酸エステル基を、又は、置換された各三糖につき、２個の硫酸エステル基若しくはリン酸エステル基及び９個の同一の脂肪酸エステル基を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
10. 前記脂肪酸エステル基がラウリン酸のエステルである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
11. 脂肪酸エステル基及び任意選択で１つ以上のアニオン基で完全に置換されている、置換された三糖コアを含む、アジュバントとしての三糖誘導体。
12. 前記置換された三糖コアが、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリウロース又はケストース、好ましくはラフィノース、メレジトース又はマルトトリオース、最も好ましくはラフィノース又はマルトトリオースに由来する、請求項１１に記載の三糖誘導体。
13. 前記置換された三糖コアが、アニオン基として、１つ又は２つの硫酸エステル基又はリン酸エステル基を含む、請求項１１又は１２に記載の三糖誘導体。
14. 前記アニオン基が硫酸エステルである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の三糖誘導体。
15. 前記脂肪酸エステル基が、鎖長が炭素原子数４〜２０、好ましくは６〜１８、より好ましくは炭素原子数８〜１６、最も好ましくは炭素原子数１０〜１４、きわめて好ましくは炭素原子数１２の、直鎖、分枝、飽和又は不飽和の脂肪酸のエステルである、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の三糖誘導体。
16. 前記脂肪酸エステルが、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸又はアラキジン酸、好ましくはラウリン酸のエステルである、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の三糖誘導体。
17. 前記置換された三糖コアの脂肪酸エステル基が全て同一である、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の三糖誘導体。
18. 前記置換された三糖コアが、ラフィノース、メレジトース又はマルトトリオースに由来し、前記三糖誘導体が、置換された各三糖につき、同一の脂肪酸エステル基で完全に置換されている、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の三糖誘導体。
19. 前記置換された三糖コアが、ラフィノース、メレジトース又はマルトトリオースに由来し、前記三糖コアが、各置換された三糖につき、１個の硫酸エステル基若しくはリン酸エステル基及び１０個の同一の脂肪酸エステル基を、又は、各置換された三糖につき、２個の硫酸エステル基若しくはリン酸エステル基及び９個の同一の脂肪酸エステル基を含む、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の三糖誘導体。
20. 前記脂肪酸エステル基がラウリン酸のエステルである、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の三糖誘導体。
21. ｉ）三糖を用意し、これを溶媒中に溶解させるステップと、
    ｉｉ）前記三糖の全てのＯＨ−基を脂肪酸又は該脂肪酸の供給源によってエステル化するステップと
    を含む、三糖誘導体の調製方法。
22. 前記三糖のＯＨ−基のうち少なくとも１つをアニオン作用剤と反応させる、請求項２１に記載の方法。
23. 前記アニオン作用剤が、ピリジン．ＳＯ_３若しくはＴＥＡ．ＳＯ_３などの硫酸化剤、又は、リン酸化剤である、請求項２２に記載の方法。
24. 使用する前記溶媒が、ジメチルホルムアミド、ピリジン又はこれらの混合物である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 三糖：アニオン作用剤：脂肪酸の当量比が、それぞれ、１：０〜３：８〜ｌ１、好ましくは１：０〜１：１０〜１１である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記三糖が、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリウロース又はケストースである、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記三糖が、ラフィノース、メレジトース又はマルトトリオースである、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記脂肪酸が、鎖長が炭素原子数４〜２０の間、好ましくは６〜１８の間、より好ましくは炭素原子数８〜１６の間、最も好ましくは炭素原子数１０〜１４、きわめて好ましくは炭素原子数１２の、直鎖、分枝、飽和又は不飽和の脂肪酸である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記脂肪酸が、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸又はアラキジン酸である、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記三糖が、ラフィノース、メレジトース又はマルトトリオースであり、前記三糖が、同一の脂肪酸で、又は、各三糖につき、平均で１個の硫酸エステル基若しくはリン酸エステル基及び１０個の同一の脂肪酸エステル基で、又は、各三糖につき、２個の硫酸エステル基若しくはリン酸エステル基及び９個の同一の脂肪酸エステル基で完全にエステル化されており、好ましくは前記脂肪酸エステルがラウリン酸のエステルである、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法によって得られる三糖誘導体。
32. 請求項３１に記載の三糖誘導体の、アジュバントとしての使用。
33. アジュバントとして使用するための、請求項１１〜２０又は３１のいずれか一項に記載の三糖。
34. 請求項１１〜２０又は３１のいずれか一項に記載の三糖誘導体又はその混合物並びに薬学的に許容されるレシピエント（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）及び／又は賦形剤を含むアジュバント組成物。
35. 水中油型乳剤として製剤化された、請求項３４に記載のアジュバント組成物。
36. 前記乳剤の油相がスクアラン及び／又はポリソルベートを含む、請求項３５に記載のアジュバント組成物。
37. 請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のアジュバント組成物を含むワクチン製剤。
38. 抗原組成物及び請求項３４〜３７のいずれか一項に記載のアジュバント組成物を含むキット。
    

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