JP2017000160A - 抗アルファシヌクレイン結合分子 - Google Patents

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Abstract

【課題】抗アルファシヌクレイン結合分子を提供すること。【解決手段】抗−ヒトα−シヌクレインに特異的な結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体が、これらに関連する方法とともに提供される。さらに、ヒトα−シヌクレインに対して特異的なＮ−末端エピトープ及びＣ末端エピトープに結合する抗−ヒトα−シヌクレイン結合分子が提供される。本明細書に記載の結合分子を、α−シヌクレインを標的とする免疫療法及び診断のための医薬用組成物及び診断用組成物にそれぞれ使用することができる。【選択図】なし

Description

（電子提出された配列表に対する言及）
本出願とともに出願された、ＡＳＣＩＩテキストファイルによって電子提出された配列表の内容（名称：ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ＿ａｓｃｉｉ．ｔｘｔ；大きさ；２３ＫＢ；作成日：２０１１年６月２３日）は、全体として参照により組み込まれる。
本発明は、一般的に、それぞれ、α−シヌクレインに特異的な新規結合分子、特に、ヒト抗体、およびα−シヌクレイン及びα−シヌクレインの凝集形態を認識するそのフラグメント、誘導体及び改変体に関する。それに加え、本発明は、このような結合分子、その抗体及び模倣物を含む、血漿中及びＣＳＦ中でα−シヌクレインの毒性種を特定するための診断用ツールとして、また、α−シヌクレインの凝集物に関連する障害、例えば、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）及びアルツハイマー病（ＡＤ）のレビー小体改変体、及び他のシヌクレイン病を治療する受動免疫戦略にも価値が高い医薬用組成物及び診断用組成物に関する。
タンパク質の異常な折り畳み及び凝集は、多くの神経変性疾患の病的な態様である。α−シヌクレインの凝集物は、パーキンソン病（ＰＤ）に関連するレビー小体及びレビー神経突起の主な構成要素である。天然では折り畳まれていないタンパク質であるα−シヌクレインは、オリゴマー、前原線維及び原線維を含む異なる凝集形態をとることができる。小さなオリゴマー凝集物は、特に毒性があることが示されている。
α−シヌクレインに対し、天然に発生する自己抗体は、健康なヒトで検出されており、患者においてそのレベルが変わることは、特定の神経変性障害と関係があった。総説としては、非特許文献１を参照のこと。したがって、パーキンソン病を患う患者において、特に、健康な患者において、自然に又は免疫によって天然に発生する抗体は、α−シヌクレインの凝集に関し、予防的な役割を果たすことがある。例えば、非特許文献２及び非特許文献３を参照のこと。これまでに、自己抗体が治療に対していかなる意義を有するかを評価するのは困難であった。これは、ほとんどが、自己抗体の単離、その後にｉｎ ｖｉｔｒｏでの特性決定するための直接的な実験手法が存在しないことによるものである。
近年、血漿及びＣＳＦにおいて、α−シヌクレインのオリゴマー種が細胞外で報告されており（Ｅｌ−Ａｇｎａｆ ｅｔ ａｌ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０（２００６）、４１９〜４２５）、ＰＤマウスモデルにおける免疫研究は、α−シヌクレインに対する細胞外マウスモノクローナル抗体によって、細胞内でのα−シヌクレイン凝集物の蓄積を減らすことができることを示し（Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ、４６（２００５）、８５７〜８６８）、このことは、α−シヌクレインモノマーの有益な機能を妨害することなく、神経毒性のある凝集物を解毒する抗体が有用な治療薬となり得るという考えを裏付けている。しかし、ヒトにおけるマウス由来の抗体の治療有用性は、非ヒト由来であるという観点でヒト抗−マウス抗体（ＨＡＭＡ）の応答によって妨害される。
Ｅｍａｄｉ ｅｔ ａｌ．は、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６８（２００７）、１１３２〜１１４４において、α−シヌクレインに対するヒト配列に基づくファージディスプレイによる抗体ライブラリーからの一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）の単離について記載しており、このフラグメントはα−シヌクレインのオリゴマー形態にのみ結合し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでα−シヌクレインの凝集及び毒性を阻害する。しかし、ファージディスプレイからのｓｃＦｖの作成はかなり簡単であるものの、このようにして製造される抗体は、自己抗原に対する望ましくない交差反応性の危険性を内在し、ヒト免疫系によって作られた進化的に最適化された天然ヒト抗体の特徴を有していないため、この技術には重大な欠点がある。さらに、このような抗体は、他のタンパク質と、及び／又は正常な生理学的な環境及び機能という観点で標的となるタンパク質との交差反応性のため、十分に特異性ではなくなることがある。パーキンソン病の場合、例えば、α−シヌクレインの生理学的誘導体とも交差反応する抗体は、生理学的な標的構造の正常な機能に関連する副作用を引き起こす可能性を内在する。この観点で、望ましくない自己免疫疾患がひどく誘発されてしまうことがあり、改変体形態のタンパク質構造を使用する有効な免疫実験の概念的な設計において、計算することが非常に困難な危険性も生理学的に生じる。
さらに近年、Ｓｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（８１．Ｋｏｎｇｒｅｓｓ ｄｅｒ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｆｕｅｒ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｅ ｍｉｔ Ｆｏｒｔｂｉｌｄｕｎｇｓａｋａｄｅｍｉｅ Ｈａｍｂｕｒｇ １０．−１３．０９．２００８）は、異なる免疫グロブリン溶液および親和性クロマトグラフィーによる１種類の血液ドナーのサンプルから得た抗−α−シヌクレインポリクローナル自己抗体の単離について報告した。しかし、この手法は、望ましい抗体をかなり限定的な量しか与えないという事実以外に、ポリクローナル抗体は、例えば、その多様性や、望ましくない副作用を有する他のα−シヌクレイン関連分子が混入する危険性のため、治療用途での使用に制限がある。同様に、ポリクローナル抗体の診断上の価値は、抗体の組成変動が全体的な特異性および反応性に影響を与え得るため、低い。これらのことはすべて、異常な折り畳みに起因して凝集および堆積を起こすタンパク質に対する抗体については、もっとあてはまる。
Ｎｅｆｆ ｅｔ ａｌ．、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．７（２００８）、５０１〜５０７ Ｗｏｕｌｆｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５８（２００２）、１４３５〜１４３６ Ｐａｐａｃｈｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１０１（２００７）、７４９〜７５６
したがって、上述の制限を克服すること、また、α−シヌクレインに対し、治療用および診断用のイト抗体を提供することが必要とされている。
一実施形態では、本発明は、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１）のアミノ酸４〜１５内のエピトープに特異的に結合する、単離された結合分子を提供する。特定の態様では、この結合分子は、α−シヌクレインに対するリファレンスモノクローナル抗体ＮＩ−２０２．１２Ｆ４の結合を競合的に阻害する。本発明の結合分子は、抗体又はその抗原結合フラグメントであってもよい。特定の実施形態では、結合分子は、ヒトモノクローナル抗体ＮＩ−２０２．１２Ｆ４、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体ではない。
別の実施形態は、α−シヌクレイン（配列番号１）のアミノ酸１１３〜１２３内、又はアミノ酸１１７〜１２３内のエピトープに特異的に結合する、単離された結合分子を提供する。特定の態様では、この結合分子は、リファレンスモノクローナル抗体ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１と同じヒトα−シヌクレインエピトープに特異的に結合するか、又はヒトα−シヌクレインに対するリファレンスモノクローナル抗体ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１の結合を競合的に阻害する。本発明の結合分子は、抗体又はその抗原結合フラグメントであってもよい。本発明の特定の結合分子は、ヒトモノクローナル抗体ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体である。
本発明は、さらに、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨが、配列番号１５又は配列番号２０と少なくとも９０％同一、又は１００％同一のポリペプチド配列を含み、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。さらに、ＶＨとＶＬとを含み、ＶＬが、配列番号２２又は配列番号２６と少なくとも９０％同一、又は１００％同一のポリペプチド配列を含み、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合フラグメントも提供される。同様に、本発明は、ＶＨとＶＬとを含み、ＶＨ及びＶＬが、それぞれ、配列番号１５及び配列番号２２、配列番号１５及び配列番号２６、配列番号２０及び配列番号２２、又は配列番号２０及び配列番号２６のリファレンスポリペプチドと少なくとも９０％同一又は１００％同一のポリペプチド配列を含み、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
さらに、ＶＨを含み、ＶＨのＣＤＲ１領域が、リファレンス重鎖のＣＤＲ１配列である配列番号１６と同一であるか、又は３個未満の保存的なアミノ酸置換以外は同一である、単離されたポリペプチド、ＶＨを含み、ＶＨのＣＤＲ２領域が、リファレンス重鎖のＣＤＲ２配列である配列番号１７と同一であるか、又は５個未満の保存的なアミノ酸置換以外は同一である、単離されたポリペプチド、ＶＨを含み、ＶＨのＣＤＲ３領域が、リファレンス重鎖のＣＤＲ３配列である配列番号１８と同一であるか、又は５個未満の保存的なアミノ酸置換以外は同一である、単離されたポリペプチド、ＶＬを含み、ＶＬのＣＤＲ１領域が、リファレンス軽鎖のＣＤＲ１配列である配列番号２３と同一であるか、又は５個未満の保存的なアミノ酸置換以外は同一である、単離されたポリペプチド、ＶＬを含み、ＶＬのＣＤＲ２領域が、リファレンス重鎖のＣＤＲ２配列である配列番号２４と同一であるか、又は３個未満の保存的なアミノ酸置換以外は同一である、単離されたポリペプチド、及びＶＬを含み、ＶＬのＣＤＲ３領域が、リファレンス重鎖のＣＤＲ３配列である配列番号２５と同一であるか、又は３個未満の保存的なアミノ酸置換以外は同一である、単離されたポリペプチドを含む、単離されたポリペプチドが提供される。上述のそれぞれのポリペプチドにおいて、このポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合する。
本発明の特定の実施形態では、単離された抗体又はそのフラグメントは、ヒトα−シヌクレインの非線形立体構造エピトープに優先的に結合する。他の実施形態では、単離された抗体又はそのフラグメントは、オリゴマー形態又は凝集した形態のヒトα−シヌクレインに優先的に結合する。さらなる実施形態では、単離された抗体又はそのフラグメントは、ヒトβ−シヌクレイン又はヒトγ−シヌクレインには特異的に結合しないか、及び／又はマウスα−シヌクレインには特異的に結合しない。
また、上述の抗体又はそのフラグメントと、担体とを含む組成物も提供される。この組成物は、治療用組成物又は診断用組成物であってもよい。
さらに、本明細書に記載するポリペプチド又は結合分子をコードする１つ以上の単離されたポリヌクレオチド、及びこのような結合分子を発現するためのベクター及び宿主細胞が提供される。
本発明の特定の目的は、例えば、限定されないが、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）のようなシヌクレイン病を治療又は予防するための方法を提供することである。この方法は、有効な濃度の抗−ヒトα−シヌクレイン結合分子、例えば、抗体又は抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を被検体に投与することを含み、この抗体は、α−シヌクレインを標的とする。
また、本発明の目的は、本発明の抗体又はそのフラグメントを用い、診断対象の被検体におけるα−シヌクレインのレベル、局在化、立体配置又はこれらの組み合わせを評価することと、被検体におけるα−シヌクレインのレベル、局在化、立体配置又はこれらの組み合わせを、１つ以上のコントロールサンプルから誘導される１つ以上のリファレンス標準と比較することとを含み、被検体およびリファレンス標準におけるα−シヌクレインのレベル、局在化、立体配置又はこれらの組み合わせの差又は類似性が、その被検体がシヌクレイン病であるか否かを示す、被検体においてシヌクレイン病を診断する方法を提供することである。
本発明の診断方法は、患者サンプルのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、又はｉｎ ｖｉｖｏイメージング技術によって行うことができる。
本発明のさらなる実施形態は、以下の記述及び実施例から明らかになるだろう。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
ヒトα−シヌクレイン（配列番号１）のアミノ酸４〜１５内のエピトープに特異的に結合する、単離された結合分子。
（項目２）
α−シヌクレインに対するリファレンスモノクローナル抗体ＮＩ−２０２．１２Ｆ４の結合を競合的に阻害する、項目１に記載の結合分子。
（項目３）
ヒトモノクローナル抗体ＮＩ−２０２．１２Ｆ４、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体ではない、項目１又は項目２に記載の結合分子。
（項目４）
抗体又はその抗原結合フラグメントである、項目１〜３のいずれか１項に記載の結合分子。
（項目５）
α−シヌクレイン（配列番号１）のアミノ酸１１３〜１２３内のエピトープに特異的に結合する、単離された結合分子。
（項目６）
配列番号１のアミノ酸１１７〜１２３内のエピトープに特異的に結合する、項目５に記載の結合分子。
（項目７）
リファレンスモノクローナル抗体ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１と同じヒトα−シヌクレインエピトープに特異的に結合する、単離された結合分子。
（項目８）
α−シヌクレインに特異的に結合し、ヒトα−シヌクレインに対するリファレンスモノクローナル抗体ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１の結合を競合的に阻害する、単離された結合分子。
（項目９）
抗体又はその抗原結合フラグメントである、項目５〜８のいずれか１項に記載の結合分子。
（項目１０）
ヒトモノクローナル抗体ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体である、項目９に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目１１）
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨが、配列番号１５又は配列番号２０と少なくとも９０％同一のポリペプチド配列を含み、このＶＨ領域を含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１）に特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１２）
ＶＨが配列番号１５又は配列番号２０を含む、項目１１に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目１３）
ＶＨとＶＬとを含み、ＶＬが、配列番号２２又は配列番号２６と少なくとも９０％同一のポリペプチド配列を含み、このＶＨ領域を含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１）に特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１４）
ＶＬが配列番号２２又は配列番号２６を含む、項目１３に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目１５）
ＶＨとＶＬとを含み、ＶＨ及びＶＬが、それぞれ、配列番号１５及び配列番号２２、配列番号１５及び配列番号２６、配列番号２０及び配列番号２２、又は配列番号２０及び配列番号２６のリファレンスポリペプチドと少なくとも９０％同一なポリペプチド配列を含み、このＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１）に特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１６）
ＶＨ及びＶＬが、それぞれ、配列番号１５及び配列番号２２、配列番号１５及び配列番号２６、配列番号２０及び配列番号２２、又は配列番号２０及び配列番号２６を含む、項目１５に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１７）
ＶＨを含み、ＶＨのＣＤＲ１領域が、リファレンス重鎖のＣＤＲ１配列である配列番号１６と同一であるか、又は３個未満の保存的なアミノ酸置換以外は同一であり、このＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１）に特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
（項目１８）
ＶＨを含み、ＶＨのＣＤＲ２領域が、リファレンス重鎖のＣＤＲ２配列である配列番号１７と同一であるか、又は５個未満の保存的なアミノ酸置換以外は同一であり、このＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１）に特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
（項目１９）
ＶＨを含み、ＶＨのＣＤＲ３領域が、リファレンス重鎖のＣＤＲ３配列である配列番号１８と同一であるか、又は５個未満の保存的なアミノ酸置換以外は同一であり、このＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１）に特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
（項目２０）
ＶＬを含み、ＶＬのＣＤＲ１領域が、リファレンス軽鎖のＣＤＲ１配列である配列番号２３と同一であるか、又は５個未満の保存的なアミノ酸置換以外は同一であり、このＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１）に特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
（項目２１）
ＶＬを含み、ＶＬのＣＤＲ２領域が、リファレンス重鎖のＣＤＲ２配列である配列番号２４と同一であるか、又は３個未満の保存的なアミノ酸置換以外は同一であり、このＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１）に特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
（項目２２）
ＶＬを含み、ＶＬのＣＤＲ３領域が、リファレンス重鎖のＣＤＲ３配列である配列番号２５と同一であるか、又は３個未満の保存的なアミノ酸置換以外は同一であり、このＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１）に特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
（項目２３）
ＶＨを含み、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域が、リファレンス重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列である配列番号１５、配列番号１７、及び配列番号１８とそれぞれ同一であるか、又は合計で２０個未満の保存的なアミノ酸置換以外は同一であり、このＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１）に特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
（項目２４）
項目１７〜２３のいずれか１項に記載のポリペプチドに対して融合する異種ポリペプチドをさらに含む、項目１７〜２３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２５）
上記ポリペプチドが、治療薬剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調整剤、医薬品、又はＰＥＧからなる群から選択される薬剤に接合する、項目１７〜２３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２６）
項目１７〜２５又は項目７９のいずれか１項に記載のポリペプチドを含み、その抗体又はそのフラグメントは、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１）に特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目２７）
ヒトα−シヌクレイン（配列番号１）に特異的に結合し、解離定数（ＫＤ）が、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍより大きくないことを特徴とする親和性を有する、項目４、９〜１６、又は２６のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目２８）
直線状エピトープに優先的に結合する、項目４、９〜１６、２６、又は２７のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目２９）
非線形立体構造エピトープに優先的に結合する、項目４、９〜１６、２６、又は２７のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３０）
オリゴマー形態又は凝集した形態のヒトα−シヌクレインに優先的に結合する、項目４、９〜１６、２６、又は２７のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３１）
ヒトβ−シヌクレイン（配列番号３）又はヒトγ−シヌクレイン（配列番号４）には特異的に結合しない、項目４、９〜１６、又は２６〜３０のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３２）
マウスα−シヌクレイン（配列番号２）には特異的に結合しない、項目４、９〜１６、又は２６〜３１のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３３）
ヒトα−シヌクレイン（配列番号１）のアミノ酸１１３〜１２３内のエピトープに特異的に結合する、項目９〜１６、又は２６〜３２のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３４）
配列番号１のアミノ酸１１７〜１２３内のエピトープに特異的に結合する、項目３３に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３５）
上記ＶＨに融合するシグナルペプチドをさらに含む、項目４、９〜１６、又は２６〜３４のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３６）
上記ＶＬに融合するシグナルペプチドをさらに含む、項目４、９〜１６、又は２６〜３５のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３７）
上記ＶＨに融合するＣＨ１ドメインをさらに含む、項目４、９〜１６、又は２６〜３６のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３８）
上記ＶＨに融合するＣＨ２ドメインをさらに含む、項目４、９〜１６、又は２６〜３７のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３９）
上記ＶＨに融合するＣＨ３ドメインをさらに含む、項目４、９〜１６、又は２６〜３８のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目４０）
上記ＶＨに融合するヒンジ領域をさらに含む、項目４、９〜１６、又は２６〜３９のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目４１）
上記ＶＬに融合するＣＫドメインをさらに含む、項目４、９〜１６、又は２６〜４０のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目４２）
上記ＶＬに融合するＣＬドメインをさらに含む、項目４、９〜１６、又は２６〜４０のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目４３）
ヒト化されている、項目４、９〜１６、又は２６〜４２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目４４）
キメラである、項目４、９〜１６、又は２６〜４２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目４５）
完全にヒトである、項目４、９〜１６、又は２６〜４２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目４６）
Ｆａｂフラグメントである、項目４、９〜１６、又は２６〜４５のいずれか１項に記載の抗原結合フラグメント。
（項目４７）
Ｆａｂ’フラグメントである、項目４、９〜１６、又は２６〜４５のいずれか１項に記載の抗原結合フラグメント。
（項目４８）
Ｆ（ａｂ）２フラグメントである、項目４、９〜１６、又は２６〜４５のいずれか１項に記載の抗原結合フラグメント。
（項目４９）
一本鎖Ｆｖフラグメントである、項目４、９〜１６、又は２６〜４５のいずれか１項に記載の抗原結合フラグメント。
（項目５０）
一本鎖抗体である、項目４、９〜１６、又は２６〜４５のいずれか１項に記載の抗原結合フラグメント。
（項目５１）
項目４、９〜１６、又は２６〜５０のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメントに融合する異種ポリペプチドをさらに含む、項目４、９〜１６、又は２６〜５０のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目５２）
上記抗体が、治療薬剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調整剤、医薬品、及びＰＥＧからなる群から選択される薬剤に接合する、項目４、９〜１６、又は２６〜５１のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目５３）
項目４、９〜１６、又は２６〜５２のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメントと、担体とを含む組成物。
（項目５４）
診断用組成物である、項目５３に記載の組成物。
（項目５５）
項目１７〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチド又は項目４、９〜１６、又は２６〜５２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目５６）
異種ポリヌクレオチドをさらに含む、項目５５に記載のポリヌクレオチド。
（項目５７）
上記異種ポリヌクレオチドが、異種ポリペプチドをコードする、項目５６に記載のポリヌクレオチド。
（項目５８）
項目５５〜５７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。
（項目５９）
ＶＨをコードするポリヌクレオチドと、ＶＬをコードするポリヌクレオチドとを含み、このＶＨをコードするポリヌクレオチドとＶＬをコードするポリヌクレオチドが、それぞれ、リファレンスポリペプチドである配列番号１５及び配列番号２２、配列番号１５及び配列番号２６、配列番号２０及び配列番号２２、又は配列番号２０及び配列番号２６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含み、このＶＨをコードするポリヌクレオチドとＶＬをコードするポリヌクレオチドが合わさって、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする、組成物。
（項目６０）
上記ＶＨをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１９又は配列番号２１をコードする核酸を含み、ＶＬをコードするポリヌクレオチドが、配列番号２７又は配列番号２８をコードする核酸を含む、項目５９に記載の組成物。
（項目６１）
項目５５〜５７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目６２）
上記ポリヌクレオチドが、プロモーターと作動可能に結合する、項目６１に記載のベクター。
（項目６３）
ＶＨをコードするポリヌクレオチドと、ＶＬをコードするポリヌクレオチドが、これらと作動可能に結合する１個のプロモーターから一緒に転写されるが、別個に翻訳される、項目６２に記載のベクター。
（項目６４）
ＶＨをコードするポリヌクレオチドとＶＬをコードするポリヌクレオチドとの間に配置されたＩＲＥＳ配列をさらに含む、項目６３に記載のベクター。
（項目６５）
ＶＨをコードするポリヌクレオチドと、ＶＬをコードするポリヌクレオチドが別個に転写され、それぞれ、別個のプロモーターに作動可能に結合する、項目６２に記載のベクター。
（項目６６）
上記別個のプロモーターが、同じプロモーターの複写物である、項目６５に記載のベクター。
（項目６７）
上記別個のプロモーターが同一ではない、項目６５に記載のベクター。
（項目６８）
項目６１〜６７のいずれか１項に記載のベクターを含む組成物。
（項目６９）
項目５５〜５７のいずれか１項に記載のＶＨをコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、項目５５〜５７のいずれか１項に記載のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターとを含む、組成物。
（項目７０）
項目５５〜５７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、又は項目６１〜６７のいずれか１項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目７１）
第１のベクター及び第２のベクターを少なくとも含み、第１のベクター及び第２のベクターが同一ではなく、第１のベクターが、ＶＨをコードする項目５５〜５７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含み、第２のベクターが、ＶＬをコードする項目５５〜５７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
（項目７２）
項目７０又は項目７１に記載の宿主細胞を培養することと、その抗体又はそのフラグメントを回収することとを含む、抗−ヒトα−シヌクレイン抗体又はその抗原結合フラグメントを製造する方法。
（項目７３）
項目７２に記載の方法によって製造される、抗−ヒトα−シヌクレイン抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目７４）
項目４、９〜１６、２６〜５２、又は７３のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント、項目５３、５４、５８〜６０、又は６９のいずれか１項に記載の組成物、項目５５〜５７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、項目６１〜６７のいずれか１項に記載のベクター、又は項目７０又は項目７１に記載の宿主細胞を、これらを必要とする被検体に投与することを含む、被検体においてシヌクレイン病を治療又は予防する方法。
（項目７５）
被検体においてシヌクレイン病を診断する方法であって、
（ａ）項目４、９〜１６、２６〜５２、又は７３のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメントを用い、診断対象の被検体におけるα−シヌクレインのレベル、局在化、立体配置又はこれらの組み合わせを評価することと、
（ｂ）被検体におけるα−シヌクレインのレベル、局在化、立体配置又はこれらの組み合わせを、１つ以上のコントロールサンプルから誘導される１つ以上のリファレンス標準と比較することとを含み、
被検体およびリファレンス標準におけるα−シヌクレインのレベル、局在化、立体配置又はこれらの組み合わせの差又は類似性が、その被検体がシヌクレイン病であるか否かを示す、方法。
（項目７６）
シヌクレイン病が、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、又はこれらの組み合わせである、項目７４又は項目７５に記載の方法。
（項目７７）
上記被検体が哺乳動物である、項目７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
（項目７８）
上記哺乳動物がヒトである、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
ＶＬを含み、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域が、リファレンス軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列である配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５とそれぞれ同一であるか、又は合計で２０個未満の保存的なアミノ酸置換以外は同一であり、このＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１）に特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
（項目８０）
被検体におけるα−シヌクレインのレベル、局在化、立体配置又はこれらの組み合わせをｉｎ ｖｉｖｏイメージングによって測定する、項目７５に記載の方法。
（項目８１）
上記ｉｎ ｖｉｖｏイメージングが、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光イメージング又は核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む、項目８０に記載の方法。
図１。ヒト抗体ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１の可変領域、すなわち、重鎖及びカッパ軽鎖のアミノ酸及びヌクレオチド配列。フレームワーク（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）が示されており、ＣＤＲには下線が引かれている。クローニング戦略に起因して、この重鎖及び軽鎖のＮ末端でのアミノ酸配列は、抗体の生体活性に実質的な影響を与えないようなＦＲ１にプライマーによって誘発された変化部分を含む可能性があってもよい。コンセンサスヒト抗体を与えるために、元々のクローンのヌクレオチド及びアミノ酸配列を、データベース中の適切なヒト生殖細胞系可変領域配列を用いて整列させ、このヒト生殖細胞系可変領域配列に従って調整した。例えば、ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ケンブリッジ、ＵＫ）運営のＶｂａｓｅ（ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）を参照のこと。これらのアミノ酸は、コンセンサス生殖細胞系配列と逸脱している可能性があると考えられ、これはＰＣＲプライマーによるものであってもよく、太字で示されている。 図２。組み換えヒトＮＩ−２０２．２１Ｄ１１は、ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡにおいて、ヒトβ−シヌクレイン、ヒトγ−シヌクレイン及びマウスα−シヌクレインよりもヒトα−シヌクレインに選択的に結合する。組み換えヒトα−，β−，γ−シヌクレイン及び組み換えヒト及びマウスＨｉｓタグ化α−シヌクレインを、同じ濃度（２μｇ／ｍｌ）でＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。次いで、プレートを、組み換えヒトＮＩ−２０２．２１Ｄ１１、ヒトＮＩ−２０２．１２Ｆ４及びｐａｎ−シヌクレイン抗体をプローブとして用いて分析した。（Ａ）組み換えＮＩ−２０２．２１Ｄ１１は、α−シヌクレインに選択的に結合し、一方、ｐａｎ−シヌクレイン抗体は、３種類すべてのシヌクレインタンパク質に結合し、等しく組み換えタンパク質のコーティングを確認している。（Ｂ）組み換えＮＩ−２０２．２１Ｄ１１は、マウスα−シヌクレインに対し、ヒトα−シヌクレインに選択的である。一方、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡにおいて、ヒトα−シヌクレイン及びマウスα−シヌクレインの両方に結合する。 図３。組み換えＮＩ−２０２．２１Ｄ１１は、高密度にコーティングされたα−シヌクレインに優先的に結合する。組み換えヒトα−シヌクレインを指定濃度でＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡによって、種々の濃度のＮＩ−２０２．２１Ｄ１１をプローブとして用いて分析した（□ ２０μｇ／ｍｌ；▲ ５μｇ／ｍｌ；◆ １μｇ／ｍｌ；■ ０．２５μｇ／ｍｌ；▼ ０．１μｇ／ｍｌ）。抗体の能力を示す半数効果濃度（ＥＣ５０）は、それぞれのコーティング濃度について決定された。 図４。ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１の免疫組織化学的結合分析は、（Ａ）ヒトα−シヌクレインＡ５３Ｔを過剰発現するトランスジェニックマウス由来、及び（Ｃ）レビー小体型認知症患者のヒト脳組織由来のパラフィン切片中にレビー小体及びレビー神経突起のような内包物を含むα−シヌクレイン病態の顕著な染色を示した。（Ｂ）野生型マウス組織及び（底部右側の）二次抗体のみのコントロールにおいて、染色は観察されなかった。ＨＣ＝海馬、ＣＴＸ＝大脳皮質、ＢＳ＝脳幹。 図５。エピトープマッピングは、ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１のためのヒトα−シヌクレイン（アミノ酸１１７〜１２３）内のＣ末端に結合するエピトープを明らかにした。（Ａ）ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡにおいて、組み換えＮＩ−２０２．２１Ｄ１１は、ヒトα−シヌクレインのＣ末端ドメインに結合した。α−シヌクレイントランケーションを、同じ濃度（２ｕｇ／ｍｌ）でＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１は、トランケーションされたα−シヌクレインのアミノ酸６１〜１４０及び９５〜１４０にのみ結合し、トランケーションのアミノ酸１〜６０、１〜９５には結合しなかった。（Ｂ）Ｐｅｐｓｃａｎ分析は、ヒトα−シヌクレインの重複するペプチドＢ０８（アミノ酸１０９〜１２３）、Ｂ０９（アミノ酸１１３〜１２７）及びＢ１０（アミノ酸１１７〜１３１）に対するＮＩ−２０２．２１Ｄ１１の結合を示しており、このことは、ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１の結合に必要な最低限の配列が、ヒトα−シヌクレイン内のＰＶＤＰＤＮＥ（アミノ酸１１７〜１２３）であることを示唆している。（Ｃ）組み換えＮＩ−２０２．２１Ｄ１１は、ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡにおいて、ヒトα−シヌクレインＤ１２１Ｇ／Ｎ１２２Ｓに対する結合の低下を示した。組み換え野生型及び変異型のα−シヌクレインタンパク質を、同じ濃度（２ｕｇ／ｍｌ）でＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、組み換えＮＩ−２０２．２１Ｄ１１の結合について試験した。 図６。ＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、α−シヌクレインのまさにＮ末端に選択的に結合する。（Ａ）Ｐｅｐｓｃａｎ分析は、ペプチドＡ０１に対するＮＩ−２０２．１２Ｆ４の結合を示し、このことは、最低限の認識配列がα−シヌクレインの残基１〜１５内にあることを示している。（Ｂ）溶液中ＥＬＩＳＡにおいて、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４の結合について、残基１〜３０、４〜３０及び５〜３０から得た合成α−シヌクレインペプチドを試験した。ＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、アミノ酸１〜３０及び４〜３０に結合したが、５〜３０には結合しなかった。このことは、ＮＩ２０２．１２Ｆ４エピトープ配列が、α−シヌクレインの残基４から始まることを示していた。（Ｃ）ＮＩ−２０２．１２Ｆ４エピトープ内の残基Ｋ１０は、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４がβ−シヌクレインよりもα−シヌクレインに対して選択性であることの鍵となるアミノ酸である。組み換え野生型および変異型のα−及びβ−シヌクレインタンパク質を、ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡによって、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４の結合について試験した。ＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、野生型のα−シヌクレイン及び変異型のβ−シヌクレインＭ１０Ｋに結合したが、野生型のβ−シヌクレイン及び変異型のα−シヌクレインＫ１０Ｍには結合しなかった。このことは、残基Ｋ１０が、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４α−シヌクレインの選択性に関与していることを示す。
（Ｉ．定義）
シヌクレイン病又はシヌクレイノパチーは、ニューロン及びグリアの選択的に攻撃を受けやすい集合における不溶性α−シヌクレインタンパク質の凝集物で構成される共通の病変を有する多様な神経変性障害群である。これらの障害としては、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン認知症（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、若年発症性広汎性神経軸索ジストロフィー（ハラーフォルデンシュパッツ病）、純粋自律神経失調症（ＰＡＦ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）及び脳の鉄沈着を伴う神経変性１型（ＮＢＩＡ−Ｉ）が挙げられる。臨床的に、これらの障害は、病変の分布に依存して、運動機能、認識機能、行動機能及び自律機能の慢性的かつ進行性の低下を特徴とする。
パーキンソン病は、まだ病因がわかっていない加齢に依存する神経変性疾患である。散発性パーキンソン病は、遺伝的脆弱性と環境障害の組み合わせから生じると考えられている。さらに、パーキンソン病（ＰＤ）は、まったく異なる機構が引き金となるものの、共通の病態生理学的経路に従うと考えられる。共通する中心点のひとつは、α−シヌクレインを含むことである。このタンパク質とパーキンソン病の発病機序との関係は、家族性の場合には遺伝子の点変異および三重化の両方の特定によって確立されており、パーキンソン病の特質となる病的な特徴の１つであるα−シヌクレインがレビー小体に局在化すること、及びパーキンソン病の神経毒性モデルにおけるα−シヌクレイン発現と疾患の病態の相関関係によって確立されている。さらなる証拠は、特定の形態のα−シヌクレイン（例えば、異常に折り畳まれ、α−シヌクレインに結合したドーパミン）が散発性疾患に関与していることを示している。
シヌクレインは、主に、神経組織および特定の腫瘍で発現する小さな可溶性タンパク質である。シヌクレインファミリーには、α−シヌクレイン、β−シヌクレイン及びγ−シヌクレインといった３種類の既知のタンパク質が含まれる。すべてのシヌクレインは、置き換え可能なアポリポタンパク質のＡ２群の脂質結合ドメインとの類似性を有する高度に保存されたα−らせん状脂質結合モチーフを共通に有している。シヌクレインファミリーの構成要素は、脊椎動物以外では発見されていないが、植物の「後期胚発生時に豊富に含まれる」タンパク質とある程度の保存された構造類似性を有する。α−シヌクレインタンパク質及びβ−シヌクレインタンパク質は、主に脳組織で発見され、この場合、これらのタンパク質は、主に、シナプス前終末にみられる。γ−シヌクレインタンパク質は、主に、末梢神経系及び網膜で発見されるが、乳房腫瘍での発現は、腫瘍の進行のマーカーである。正常な細胞機能は、シヌクレインタンパク質について何ら決定されてはいないが、あるデータは、膜安定性及び／又はターンオーバーの制御に対する役割を示唆している。α−シヌクレインでの変異は、まれな家族型の早発性パーキンソン病に関係があり、このタンパク質は、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び重篤な他の神経変性疾病で異常に蓄積している。総説としては、例えば、２００１年１２月２０日にオンラインで公開されたＧｅｏｒｇｅ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．３（２００２）、ｒｅｖｉｅｗｓ３００２．１〜ｒｅｖｉｅｗｓ３００２．６を参照のこと。ここで、表１は、ＧｅｎＢａｎｋに現時点でリスト化されているシヌクレインファミリーの固有の構成要素の目録であり、この開示内容は、参照により組み込まれる。
α−シヌクレインは、元来、アルツハイマー病（ＡＤ）の斑の非βアミロイド成分（ＮＡＣ）の前駆体タンパク質としてヒトの脳で特定された。例えば、Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０（１９９３）、１２８２〜１２８６を参照のこと。α−シヌクレインは、ＡＤアミロイドの非Ａβ成分の前駆体（ＮＡＣＰ）とも呼ばれ、１４０アミノ酸のタンパク質である。α−シヌクレインは、その天然型ではランダムコイルとして存在するが、ｐＨの変化、分子の密集、重金属含有量、及びドーパミンレベルが、すべてタンパク質の立体配置に影響を及ぼす。オリゴマー部分、前原線維部分、原線維部分、及び凝集物部分への立体配置の変化は、タンパク質の毒性を制御すると思われる。増えつつある証拠は、ドーパミンが付加したα−シヌクレインは、付加していないタンパク質と比較して、原線維が生成するまでの一連の時間が速いことを示している。さらに、α−シヌクレイン過剰発現という背景がある状態で、ドーパミンは毒性である。
本明細書において、「α−シヌクレイン」、「アルファ−シヌクレイン」、「ａ−シヌクレイン」及び「ａＳｙｎ」という用語は、α−シヌクレインの天然モノマー型を特定的に指すために相互に置き換え可能に用いられる。「α−シヌクレイン」という用語は、一般的に、α−シヌクレインの他の配座異性体、例えば、ドーパミン−キノン（ＤＡＱ）に結合したα−シヌクレイン、及びα−シヌクレインのオリゴマー又は凝集物を特定するためにも用いられる。「α−シヌクレイン」という用語は、α−シヌクレインのあらゆる型および形態を総称するためにも用いられる。ヒトα−シヌクレインのタンパク質配列は、ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ（配列番号１）である。α−シヌクレインのアミノ酸配列は、文献及び適切なデータベースから検索することができ、例えば、Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．（前出）；ＧｅｎＢａｎｋ ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：ｌｏｃｕｓ ＳＹＵＡ＿ＨＵＭＡＮ、寄託番号Ｐ３７８４０を参照のこと。ＡＤアミロイドの非Ａβ成分（ＮＡＣ）は、α−シヌクレインから誘導される。ＮＡＣは、α−シヌクレイン内の非常に疎水性のドメインであり、少なくとも２８アミノ酸残基（残基６０〜８７）と、場合により、３５アミノ酸残基（残基６１〜９５）からなるペプチドである。ＮＡＣは、βシート構造を形成する傾向を示す（Ｉｗａｉ，ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４（１９９５）１０１３９〜１０１４５）。ＮＡＣのアミノ酸配列は、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１０（１９９５）、９１〜９４；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｓ５６７４６及びＵｅｄａ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０（１９９３）、１２８２〜１１２８６に記載されている。
脱凝集させたα−シヌクレイン、又はＮＡＣを含むそのフラグメントは、モノマーペプチド単位を意味する。脱凝集させたα−シヌクレイン又はそのフラグメントは、一般的に可溶性であり、自己凝集して可溶性オリゴマーを形成することができる。α−シヌクレイン及びそのフラグメントのオリゴマーは、通常は可溶性であり、主に、αらせんとして存在する。モノマー状α−シヌクレインは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、凍結乾燥されたペプチドを超音波処理しつつＤＭＳＯ原液に溶解することによって調製することができる。得られた溶液を遠心分離処理し、不溶性粒状物を除去する。凝集したα−シヌクレイン、又はＮＡＣを含むそのフラグメントは、会合して不溶性βシート集合体になるα−シヌクレイン及びそのフラグメントのオリゴマーを意味する。凝集したα−シヌクレイン、又はＮＡＣを含むそのフラグメントは、原線維状ポリマーも意味する。原線維は、通常は不溶性である。ある種の抗体は、可溶性のα−シヌクレイン又はそのフラグメント、又は凝集したα−シヌクレイン又はそのフラグメントのいずれかに結合する。ある種の抗体は、α−シヌクレインのモノマー形態又は原線維形態よりもα−シヌクレインのオリゴマーに強力に結合する。ある種の抗体は、可溶性のα−シヌクレイン又はそのフラグメント及び凝集したα−シヌクレイン又はそのフラグメントの両方に結合し、場合により、オリゴマー形態にも同様に結合する。
本明細書に開示するヒト抗−α−シヌクレイン抗体は、α−シヌクレイン及びそのエピトープに特異的に結合し、また、α−シヌクレイン及びそのエピトープの種々の立体配置に特異的に結合する。例えば、α−シヌクレインに特異的に結合する抗体、天然モノマー形態のα−シヌクレイン、全長α−シヌクレイン及びトランケーションされたα−シヌクレイン及びα−シヌクレイン凝集物が本明細書に開示されている。本明細書で使用する場合、α−シヌクレインに「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、又は「優先的に結合する」抗体との言及は、他の関連のないタンパク質に結合しない抗体を指す。一例では、本明細書に開示するα−シヌクレイン抗体は、α−シヌクレイン又はそのエピトープに結合することができ、他のタンパク質にはバックグラウンドの約１．５倍を超える結合を示さない。α−シヌクレイン配座異性体に「特異的に結合する」又は「選択的に結合する」抗体は、α−シヌクレインのすべての立体配置には結合しない抗体を指し、すなわち、少なくとも１つの他のα−シヌクレイン配座異性体に結合しない抗体を指す。例えば、α−シヌクレイン、ヒトα−シヌクレイン及びマウスα−シヌクレインのモノマー形態及び凝集物形態の中で、全長α−シヌクレイン及びトランケーションされた形態及びヒトα−シヌクレインをβ−シヌクレイン及びγ−シヌクレインと区別することができる抗体が本明細書に開示される。本発明のヒト抗−α−シヌクレイン抗体が、パーキンソニズムの徴候を示さず、α−シヌクレインに特異的な免疫応答を示す高齢者被検体の中から単離されたため、本発明の抗−α−シヌクレイン抗体は、これらの抗体が被検体によって発現が誘発され、例えば、これまでにヒト様抗体を提供しようとする共通の一方法をあらわすヒト免疫グロブリン発現ファージライブラリーから単離されていないことを強調するために、「ヒト自己抗体」とも呼ばれる。
なお、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」の物という用語は、１個以上のその物を指し、例えば、「抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、１個以上の抗体をあらわすと理解される。この場合、「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上」及び「少なくとも１つの」は、本明細書では相互に置き換え可能に用いることができる。
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、１個の「ポリペプチド」及び複数の「ポリペプチド」を包含することを意図しており、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）で直線状に結合したモノマー（アミノ酸）で構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２個以上のアミノ酸の任意の１つ以上の鎖を指し、特定の長さの産物を指すわけではない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」又は２個以上のアミノ酸の任意の１つ以上の鎖を指すために用いられる任意の他の用語が、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらのいずれかの用語の代わりに、またはこれらの用語と相互に置き換え可能に用いることができる。
「ポリペプチド」という用語は、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク分解による開裂、又は天然には発生しないアミノ酸による修飾を含むポリペプチドの発現後修飾の産物も指すことも意図している。ポリペプチドは、天然の生物源から誘導されてもよく、又は組み換え技術によって製造されてもよいが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるわけではない。ポリペプチドは、化学合成を含め、任意の様式で作られてもよい。
本発明のポリペプチドは、大きさが、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、又は２，０００以上のアミノ酸であってもよい。ポリペプチドは、規定されている三次元構造を有していてもよいが、必ずしもこのような構造を有しているわけではない。規定されている三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれていると称され、規定されている三次元構造を有さないポリペプチドは、多様な異なる立体配置に変化していてもよく、折り畳まれていないと称される。本明細書で使用する場合、糖タンパク質という用語は、例えば、セリン残基又はアスパラギン残基のようなアミノ酸残基の酸素を含有する側鎖又は窒素を含有する側鎖によってタンパク質に接続した少なくとも１個の炭水化物部分に結合したタンパク質を指す。
「単離された」ポリペプチド又はそのフラグメント、改変体、又は誘導体は、その天然の環境にはないポリペプチドを意図している。特定のレベルの精製は必要ない。例えば、単離されたポリペプチドは、その自然又は天然の環境から取り出すことができる。組み換えによって製造されたポリペプチド及び宿主細胞中で発現したタンパク質は、任意の適切な技術によって分離され、分画され、又は部分的若しくは実質的に精製された天然型又は組み換えポリペプチドであるため、本発明の目的では単離されたものと考える。
本発明のポリペプチドには、上述のポリペプチドのフラグメント、誘導体、アナログ、又は改変体、及びこれらの任意の組み合わせも含まれる。「フラグメント」、「改変体」、「誘導体」及び「アナログ」という用語は、本発明の抗体又は抗体ポリペプチドを指す場合、対応する天然の結合分子、抗体、又はポリペプチドの抗原結合性の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドのフラグメントには、本明細書の他の箇所に記載する特定の抗体フラグメントに加え、タンパク分解フラグメント、及び欠失フラグメントが含まれる。本発明の抗体及び抗体ペプチドの改変体としては、上述のフラグメントが挙げられ、さらに、アミノ酸の置換、欠失又は挿入に起因して変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。改変体は、天然で発生してもよく、又は、天然では発生しなくてもよい。天然では発生しない改変体は、当該技術分野で既知の変異誘発技術を用いて製造することができる。改変体ポリペプチドは、保存的又は非保存的なアミノ酸置換、欠失又は付加を含んでいてもよい。α−シヌクレイン特異的な結合分子の誘導体、例えば、本発明の抗体及び抗体ポリペプチドは、天然型ポリペプチドでは発見されないさらなる特徴を示すように変更されたポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。改変体ポリペプチドは、本明細書では、「ポリペプチドアナログ」とも呼ばれる。本明細書で使用する場合、結合分子又はそのフラグメント、抗体、又は抗体ポリペプチドの「誘導体」は、１つ以上の残基が機能性側鎖基の反応によって化学的に誘導体化された目的のポリペプチドを指す。さらに、２０種類の標準アミノ酸の天然に発生するアミノ酸誘導体を１個以上含むペプチドも「誘導体」に含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンの代わりに用いてもよく、５−ヒドロキシリジンをリジンの代わりに用いてもよく、３−メチルヒスチジンをヒスチジンの代わりに用いてもよく、ホモセリンをセリンの代わりに用いてもよく、オルニチンをリジンの代わりに用いてもよい。
「ポリヌクレオチド」という用語は、１個の核酸及び複数の核酸を包含することを意図しており、単離された核酸分子又は構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来型のホスホジエステル結合又は非従来型の結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）でみられるようなアミド結合）を含んでいてもよい。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１個以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡフラグメント又はＲＮＡフラグメントを指す。「単離された」核酸又はポリヌクレオチドは、天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図している。例えば、ベクターに含まれる抗体をコードする組み換えポリヌクレオチドは、本発明の目的では単離されたものと考える。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞中に維持される組み換えポリヌクレオチド、又は（部分的又は実質的に）精製された溶液中のポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明のポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ転写物が挙げられる。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸としては、さらに、合成によって製造されたこのような分子が含まれる。それに加え、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターのような制御エレメントであってもよく、又はこのような制御エレメントを含んでいてもよい。
本明細書で使用する場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると考えてもよく、しかし、フランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。本発明の２個以上のコード領域が、１個のポリヌクレオチド構築物中、例えば、１個のベクター上、又は別個のポリヌクレオチド構築物中、例えば、別個の（異なる）ベクター上に存在していてもよい。さらに、任意のベクターが１個のコード領域を含んでいてもよく、又は２個以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば、１個のベクターが、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を別個にコードしてもよい。それに加え、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、結合分子、抗体、又はそのフラグメント、改変体、又は誘導体をコードする核酸に融合しているか、又は融合していない異種コード領域をコードしてもよい。異種コード領域としては、限定されないが、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインのような特殊なエレメント又はモチーフが挙げられる。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、１個以上のコード領域に作動可能に結合するプロモーター及び／又は他の転写又は翻訳を制御するエレメントを含んでいてもよい。作動可能に結合とは、制御配列の影響下又は制御下で遺伝子産物の発現が起きるような様式で、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が１個以上の制御配列に結合している場合である。２個のＤＮＡフラグメント（例えば、ポリペプチドのコード領域と、これらと結合するプロモーター）は、プロモーター機能の誘発によって、所望な遺伝子産物をコードするｍＲＮＡを転写する場合、また、２個のＤＮＡフラグメント間の連結の性質が、発現制御配列が遺伝子産物の発現を起こす能力を妨害せず、又はＤＮＡテンプレートを転写する能力を妨害しない場合、「作動可能に結合」又は「作動可能に連結」している。従って、プロモーター領域は、このプロモーターが核酸の転写に影響を与えることができる場合、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合するだろう。プロモーターは、所定の細胞でのみＤＮＡの実質的な転写が起こる細胞特異的なプロモーターであってもよい。プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写停止シグナルは、ポリヌクレオチドに作動可能に結合し、細胞特異的な転写を起こしてもよい。適切なプロモーター及び他の転写制御領域が本明細書に開示されている。
種々の転写制御領域は、当業者に知られている。これらの転写制御領域としては、限定されないが、脊椎動物の細胞で機能を発揮する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（イントロン−Ａと合わせて前初期プロモーター）、サルウイルス４０（初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）が挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物の遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ−グロビン、及び真核細胞中の遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられる。さらなる適切な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、及びリンホカインによって誘発可能なプロモーター（例えば、インターフェロン又はインターロイキンによって誘発可能なプロモーター）が挙げられる。
同様に、種々の翻訳制御エレメントは、当業者に知られている。これらの翻訳制御エレメントとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン及び停止コドン、及びピコルナウイルスから誘導されるエレメント（特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちＩＲＥＳは、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）。
他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードし、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を行うさらなるコード領域と結合していてもよい。シグナルの仮説によれば、粗面小胞体全体で成長するタンパク質鎖の外への輸送が開始したら、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、成熟タンパク質から開裂したシグナルペプチド又は分泌配列を有する。当業者は、一般的に、脊椎動物細胞によって分泌するポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端に融合するシグナルペプチドを有し、このペプチドは、完全又は「全長」ポリペプチドから開裂し、ポリペプチドの分泌形態又は「成熟」形態を産生することに気づく。特定の実施形態では、天然のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖のシグナルペプチドを使用するか、又はこれに作動可能に結合するポリペプチドの分泌を行う能力を保持する、この配列の機能性誘導体を使用する。または、異種哺乳動物のシグナルペプチド、又はその機能性誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列と置き換えることができる。
特に明記しない限り、「障害」及び「疾患」という用語は、本明細書で置き換え可能に用いられる。
「結合分子」は、本発明の内容で使用する場合、主に、抗体、及びそのフラグメントに関するが、限定されないが、ホルモン、受容体、リガンド、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のようなシャペロン、及び細胞−細胞接着分子、例えば、カドヘリン、インテグリン、Ｃ型レクチン、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーといった構成要素、及び合成結合分子を含む、α−シヌクレインに結合する他の非抗体分子も指すことができる。従って、単に明瞭にするためであり、本発明の範囲を制限しないが、以下の実施形態のほとんどを、治療薬剤及び診断薬剤を開発するための例示的な結合分子をあらわす抗体及び抗体様分子に関して記載する。
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。抗体又は免疫グロブリンは、重鎖の可変ドメインを少なくとも含み、通常は、重鎖及び軽鎖の可変ドメインを少なくとも含むα−シヌクレイン結合分子である。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ
ｅｔ ａｌ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）を参照のこと。
以下にさらに詳細に記載するように、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に区別可能な種々の多様な種類のポリペプチドを含む。当業者は、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はエプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、その中にいくつかの副分類（例えば、γ１〜γ４）を含むことを理解するだろう。この鎖の性質は、抗体の「分類」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、又はＩｇＥとして決定づける。免疫グロブリンの副分類（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などは、十分に特性決定されており、機能を特化することが知られている。これらの分類及びアイソタイプそれぞれの改変態様は、本開示の観点から当業者なら簡単に認識可能であり、従って、本発明の範囲内である。すべての分類の免疫グロブリンは、明らかに本発明の範囲内であり、以下の記載は、一般的に、免疫グロブリン分子のＩｇＧ群に関するものである。ＩｇＧに関し、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量が約２３，０００ダルトンの２個の同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量が５３，０００〜７０，０００の２個の同一の重鎖ポリペプチドとを含む。この４つの鎖は、典型的には、「Ｙ」構造になるようにジスルフィド結合によって接続しており、軽鎖は、重鎖を囲んでおり、重鎖は、「Ｙ」の口の部分から始まり、可変領域を通って続いている。
軽鎖は、カッパ又はラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。それぞれの分類の重鎖が、カッパまたはラムダの軽鎖に結合することができる。一般的に、軽鎖及び重鎖は互いに共有結合し、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって作られる場合、２つの重鎖の「尾」部分が、共有結合性ジスルフィド接続又は非共有結合性接続によって互いに結合する。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ構造の分岐末端にあるＮ末端から始まり、それぞれの鎖の底部にあるＣ末端まで続く。
軽鎖及び重鎖を構造ホモロジー及び機能ホモロジーを有する領域に分ける。「不変」及び「可変」という用語は、機能的に用いられる。この観点で、軽鎖部分の可変ドメイン（ＶＬ）及び重鎖部分の可変ドメイン（ＶＨ）は、両方とも抗原の認識及び特異性を決定づけることが理解されるだろう。これとは逆に、軽鎖の不変ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の不変ドメインＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）は、分泌、経胎盤移行、Ｆｃ受容体結合、相補性結合などの重要な生物学的特性を与える。慣例により、定常領域ドメインは、抗体の中で抗原結合部位又はアミノ末端から離れるほど数字が大きくなる。Ｎ−末端部分は、可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域であり、ＣＨ３及びＣＬドメインは、実際に、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。
上に示したように、可変領域は、抗体を選択的に認識し、抗原上のエピトープに特異的に結合することができる。つまり、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）の一部が合わさって、三次元の抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、Ｙのそれぞれの腕部分の末端に存在する抗原結合部位を形成する。さらに具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ及びＶＬ鎖それぞれにある３個のＣＤＲによって規定される。α−シヌクレインに特異的に結合するのに十分な構造を含む任意の抗体又は免疫グロブリンフラグメントは、本明細書で「結合フラグメント」又は「免疫特異的なフラグメント」と相互に置き換え可能に示される。
自然に発生する抗体では、抗体は、６個の超可変領域を含み、この領域は、時に、それぞれの抗原結合ドメインに存在する「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれ、この抗体は水性環境でその三次元構造が推測されるため、抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置されている短く非連続的なアミノ酸配列である。「ＣＤＲ」には、４個の比較的保存された「フレームワーク」領域又は「ＦＲ」が隣接しており、分子間の変動性は少ないことが示されている。フレームワーク領域は、大部分はβシート立体配置をとり、ＣＤＲは、接続してループを形成し、ある場合には、βシート構造の一部を形成する。従って、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用によってＣＤＲを正しい向きに配置するために与えられる足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって作られる抗原結合ドメインは、免疫応答性抗原の上にあるエピトープに対する表面相補性を規定する。この相補性表面は、同種エピトープに対する抗体の非共有結合性の結合を促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域を含むアミノ酸は、それぞれ、当業者によって、任意の所与の重鎖又は軽鎖可変領域について、これらが正確に特定されるため、簡単に特定することができる。「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９８３）；及びＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６（１９８７）、９０１〜９１７を参照のこと。これらは、全体的に参照により組み込まれる。
当該技術分野で用いられ、及び／又は受け入れられている用語の定義が２つ以上存在する場合には、本明細書で使用するその用語の定義は、矛盾する意味が明示されていない限り、このようなすべての意味を含むことが意図される。具体的な例は、重鎖及び軽鎖のポリペプチドの両可変領域内にみられる非連続的な抗原が合わさった部位を記述するための「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語の使用である。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６（１９８７）、９０１〜９１７に記載されており、参照により組み込まれ、その定義は、互いに比較したときに、重複するアミノ酸残基又はアミノ酸残基の部分集合を含む。それにもかかわらず、抗体又はその改変体のＣＤＲを指すようないずれかの定義の適用は、定義される通りの用語の範囲及び本明細書で使用する用語の範囲の中に含まれることが意図される。上に引用したそれぞれの参考文献によって定義されるようなＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表１に示す。特定のＣＤＲを包含する実際の残基の数は、ＣＤＲの配列及び大きさによって変動するだろう。当業者は、どの残基が抗体の可変領域のアミノ酸配列によって与えられる抗体のヒトＩｇＧサブタイプの特定の超可変領域又はＣＤＲを含むかを日常業務によって決定することができる。
Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．は、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列の番号付けシステムも定義した。当業者は、配列自体を超えるいかなる実験データにも頼ることなく、この「Ｋａｂａｔ番号付け」システムを任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用する場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって記載された番号付けシステムを指す。特別の定めがない限り、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体の中の特定のアミノ酸残基の位置の番号付けに関する言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う。
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、免疫特異的なフラグメント、改変体、又は誘導体としては、限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、マウス化抗体又はキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープに結合フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィドで接続したＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬドメイン又はＶＨドメインのいずれかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作られるフラグメント、及び抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示する抗体に対する抗−Ｉｄ抗体を含む）が挙げられる。ＳｃＦｖ分子は、当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリン又は抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、任意の分類（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又は任意の副分類であってもよい。
一実施形態では、本発明の抗体は、五価構造を有するＩｇＭ又はその誘導体ではない。特に、本発明の特定の用途、特に治療用途では、ＩｇＭは、その五価構造及び親和性成熟が起きないため、非特異的な交差反応性を示し、親和性が非常に低いので、ＩｇＭは、ＩｇＧ及び他の二価抗体又は対応する結合分子よりも有用性が低い。
一実施形態では、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体ではない。すなわち、本発明の抗体は、血漿免疫グロブリンサンプルから得られる混合物ではなく、１つの特定の抗体種から実質的になる。
一本鎖抗体を含む抗体フラグメントは、可変領域のみを含んでいてもよく、又はヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインの全部又は一部と組み合わせて含んでいてもよい。また、本発明には、可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインの任意の組み合わせも含む、α−シヌクレインの結合フラグメントも含まれる。本発明の抗体又はその免疫特異的なフラグメントは、鳥類及び哺乳動物類を含む任意の動物由来であってもよい。特定の実施形態では、抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、ロバ抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、モルモット抗体、ラクダ抗体、ラマ抗体、ウマ抗体、又はニワトリ抗体である。別の実施形態では、可変領域は、軟骨魚類由来であってもよい（例えば、サメ由来）。
一態様では、本発明の抗体は、ヒトから単離されたヒトモノクローナル抗体である。場合により、ヒト抗体のフレームワーク領域を、データベース中の適切なヒト生殖細胞系可変領域配列を用いて整列させ、このヒト生殖細胞系可変領域配列に従って調整する。例えば、ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ケンブリッジ、ＵＫ）主催のＶｂａｓｅ（ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）を参照のこと。例えば、真の生殖細胞系配列から逸脱している可能性があると考えられるアミノ酸は、クローニングプロセス中に組み込まれたＰＣＲプライマー配列に起因するものであろう。人工的に作られたヒト様抗体、例えば、ファージディスプレイによる抗体ライブラリー又は異種マウスから得た一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）と比較すると、本発明のヒトモノクローナル抗体は、以下の特徴がある。（ｉ）代理動物ではなく、ヒト免疫応答を用いて得られる。すなわち、この抗体は、ヒトの体内での関連する立体配置での天然α−シヌクレインに応答して作られる。（ｉｉ）個体を保護するか、又は、α−シヌクレインの存在が少なくとも有意である。（ｉｉｉ）この抗体は、ヒト由来であるため、自己抗原に対する交差反応性の危険性が最低限である。従って、本発明に従って、「ヒトモノクローナル抗体」、「ヒトモノクローナル自己抗体」、「ヒト抗体」などの用語は、ヒト由来のα−シヌクレイン結合分子を示すために用いられる。すなわち、Ｂ細胞又はそのハイブリドーマのようなヒト細胞から単離されたか、又はそのｃＤＮＡがヒト細胞、例えば、ヒト記憶Ｂ細胞のｍＲＮＡから直接クローニングされる分子を示すために用いられる。ヒト抗体は、例えば、結合特徴を向上させるために抗体中でアミノ酸の置換が行われた場合であっても、まだ「ヒト」である。
ヒト免疫グロブリンライブラリーから誘導される抗体、又は内因性免疫グロブリンを発現しない１つ以上のヒト免疫グロブリンのために動物トランスジェニックから誘導される抗体は、以下に記載されるように、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第５，９３９，５９８号に記載されるように、本発明の真のヒト抗体とこれらを区別するために、ヒト様抗体と示される。
本明細書で使用する場合、「マウス化抗体」又は「マウス化免疫グロブリン」という用語は、本発明のヒト抗体からの１つ以上のＣＤＲと、マウス抗体配列に基づくアミノ酸置換及び／又は欠失及び／又は挿入を含むヒトフレームワーク領域とを含む抗体を指す。ＣＤＲを与えるヒト免疫グロブリンは、「親」又は「アクセプター」と呼ばれ、フレームワークを変化させるマウス抗体は、「ドナー」と呼ばれる。定常領域は存在する必要はないが、定常領域が存在する場合、定常領域は、通常は、マウス抗体の定常領域と実質的に同一であり、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、又は約９５％以上同一である。従って、ある実施形態では、全長マウス化ヒト重鎖又は軽鎖免疫グロブリンは、マウス定常領域と、ヒトＣＤＲと、多くの「マウス化する」アミノ酸置換を有する実質的なヒトフレームワークとを含む。典型的には、「マウス化抗体」は、マウス化可変軽鎖及び／又はマウス化可変重鎖を含む抗体である。例えば、マウス化抗体は、例えば、キメラ抗体の可変領域全体が非マウスであるため、典型的なキメラ抗体を包含しないだろう。「マウス化」のプロセスによって「マウス化」された改変抗体は、親抗体と比較した場合に、ＣＤＲを与え、通常は、マウスでは免疫原性がない親抗体と同じ抗原に結合する。
本明細書で使用する場合、「重鎖部分」という用語は、免疫グロブリン重鎖から誘導されるアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中部及び／又は下部のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又は改変体又はそのフラグメントのうち、少なくとも１つを含む。例えば、本発明で使用するための結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、少なくとも一部のヒンジドメイン、及びＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、少なくとも一部のヒンジドメイン、及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、又はＣＨ１ドメイン、少なくとも一部のヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含んでいてもよい。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明で使用するための結合ポリペプチドは、少なくとも一部のＣＨ２ドメイン（例えば、ＣＨ２ドメインのすべて又は一部）が欠失していてもよい。上述のように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）を、天然に発生する免疫グロブリン分子から得たアミノ酸配列を変えるように改変してもよいことを当業者は理解するだろう。
本明細書に開示する特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体において、マルチマーの１つのポリペプチド鎖の重鎖部分は、そのマルチマーの第２のポリペプチド鎖の重鎖部分と同一である。または、本発明のモノマーを含有する重鎖部分は、同一ではない。例えば、各モノマーは、例えば、二重特異性抗体又はダイアボディを形成する異なる標的に結合する部位を含んでいてもよい。
別の実施形態では、本明細書に開示する抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、ｓｃＦｖのような１種類のポリペプチド鎖で構成され、ｉｎ ｖｉｖｏでの治療用途及び診断用途の可能性のために細胞内で発現すべきである（細胞内抗体）。
本明細書に開示する診断方法及び治療方法で使用するための結合ポリペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子から誘導されてもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子から誘導されるＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ３分子から誘導されるヒンジ領域とを含んでいてもよい。別の例では、重鎖部分は、一部分がＩｇＧ１分子から誘導され、一部分がＩｇＧ３分子から誘導されるヒンジ領域を含んでいてもよい。別の例では、重鎖部分は、一部分がＩｇＧ１分子から誘導され、一部分がＩｇＧ４分子から誘導されるキメラヒンジを含んでいてもよい。
本明細書で使用する場合、「軽鎖部分」という用語は、免疫グロブリン軽鎖から誘導されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、軽鎖部分は、ＶＬ又はＣＬドメインのうち、少なくとも１つを含む。
抗体のためのペプチド又はポリペプチドエピトープの最低限の大きさは、約４〜５のアミノ酸であると思われる。ペプチド又はポリペプチドエピトープは、例えば、少なくとも７、少なくとも９、又は少なくとも約１５〜約３０のアミノ酸を含んでいてもよい。ＣＤＲが、その三次元形態で抗原のペプチド又はポリペプチドを認識することができるため、エピトープを含むアミノ酸は、連続的である必要はなく、ある場合には、同じペプチド鎖の上でさえなくてもよい。本発明では、本発明の抗体によって認識されるペプチド又はポリペプチドエピトープは、α−シヌクレインのうち少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、又は約１５〜約３０の連続的又は非連続的なアミノ酸の配列を含む。本明細書で使用する場合、抗体が、所与の範囲のアミノ酸「内に」結合すると言われる場合、例えば、「α−シヌクレインのアミノ酸４〜１５内の」エピトープに結合すると言われる場合、そのエピトープは、述べられているアミノ酸の全長範囲又はそれより短い範囲を包含することを意味している。言い換えると、「α−シヌクレインのアミノ酸４〜１５内の」エピトープの場合、このエピトープは、４〜１５の１２アミノ酸ペプチド鎖全体を含んでいてもよいが、例えば、アミノ酸４〜１２、アミノ酸４〜１０、又はアミノ酸４〜８のようにもっと小さくてもよい。また、述べられている範囲からはずれたアミノ酸が、もっと良好な結合親和性に寄与してもよく、又は、エピトープの立体配置の認識を高めてもよいが、結合する必要はないことを当業者は認識するだろう。
「特異的に結合する」又は「特異的に認識する」は、本明細書で相互置き換え可能に用いられ、一般的に、結合分子、例えば、抗体が抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、また、その結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間のある種の相補性を伴うことを意味する。この定義によれば、抗体が、関係のないランダムなエピトープに結合するよりももっと簡単に、抗原結合ドメインを介してエピトープに結合する場合、その抗体はエピトープに「特異的に結合する」と言われる。「特異性」という用語は、特定の抗体が特定のエピトープに結合することによって相対的な親和性を定性するために本明細書で用いられる。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも所与のエピトープに対して高い特異性を有すると考えることができ、又は、抗体「Ａ」は、関連するエピトープ「Ｄ」よりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言うことができる。
存在する場合、「免疫学的な結合特徴」又はあらゆる文法的な形態での抗原に対する抗体の他の結合特徴とは、抗体の特異性、親和性、交差反応性、及び他の結合特徴を指す。
「優先的に結合する」とは、結合分子、例えば、抗体が、関連の、同様の、同族の、又は類似するエピトープに結合するよりももっと簡単に、あるエピトープに特異的に結合することを意味する。従って、所与のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、この抗体が関連するエピトープと交差反応することができるものであったとしても、関連するエピトープよりも、そのエピトープに結合しやすいだろう。
非限定的な例として、結合分子、例えば、抗体は、解離定数（ＫＤ）が第２のエピトープの抗体のＫＤより小さい状態で第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合する。別の非限定的な例では、抗体は、第２のエピトープの抗体のＫＤより少なくとも１桁小さな親和性を有する第１のエピトープに結合する場合、第１の抗原に優先的に結合する。別の非限定的な例では、抗体は、第２のエピトープの抗体のＫＤより少なくとも２桁小さな親和性を有する第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合する。
別の非限定的な例では、結合分子、例えば、抗体は、第２のエピトープの抗体のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））より小さな抗体のｋ（ｏｆｆ）を有する第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合する。別の非限定的な例では、抗体は、第２のエピトープの抗体のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））より少なくとも１桁小さな親和性を有する第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合する。別の非限定的な例では、抗体は、第２のエピトープの抗体のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））より少なくとも２桁小さな親和性を有する第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合する。
ある実施形態では、本明細書に開示する結合分子、例えば、抗体又は抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、α−シヌクレイン又はそのフラグメント又は改変体に、オフ速度（ｋ（ｏｆｆ））が５×１０−２ｓｅｃ−１以下、１０−２ｓｅｃ−１以下、５×ｌ０−３ｓｅｃ−１以下又はｌ０−３ｓｅｃ−１以下で結合することができる。ある実施形態では、本発明の抗体は、α−シヌクレイン又はそのフラグメント又は改変体に、オフ速度（ｋ（ｏｆｆ））が５×１０−４ｓｅｃ−１以下、１０−４ｓｅｃ−１以下、５×１０−５ｓｅｃ−１以下又は１０−５ｓｅｃ−１以下、５×１０−６ｓｅｃ−１以下又は１０−６ｓｅｃ−１以下、５×１０−７ｓｅｃ−１以下又は１０−７ｓｅｃ−１以下で結合することができる。
特定の実施形態では、本明細書に開示する結合分子、例えば、抗体又は抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、α−シヌクレイン又はそのフラグメント又は改変体に、オン速度（ｋ（ｏｎ））が１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、又は５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上で結合することができる。ある実施形態では、本明細書に開示する結合分子は、α−シヌクレイン又はそのフラグメント又は改変体に、オン速度（ｋ（ｏｎ））が１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、又は５×１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、又は１０７Ｍ−１ｓｅｃ−１以上で結合することができる。
結合分子、例えば、抗体は、所与のエピトープに対するリファレンス抗体の結合をある程度まで遮断する程度までエピトープに優先的に結合する場合、その所与のエピトープに対し、リファレンス抗体の結合を競合的に阻害すると言われる。競合的な阻害は、当該技術分野で既知の任意の方法によって、例えば、競争ＥＬＩＳＡアッセイによって決定することができる。一例として、抗体は、所与のエピトープに対するリファレンス抗体の結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、又は少なくとも５０％競合的に阻害することができる。
本明細書で使用する場合、「親和性」という用語は、個々のエピトープと、結合分子、例えば、免疫グロブリン分子のＣＤＲとの結合強度の測定値を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９８８）の２７〜２８ページを参照のこと。本明細書で使用する場合、「結合力」という用語は、免疫グロブリンと抗原の集合との複合体の全体的な安定性を指し、つまり、免疫グロブリン混合物と抗原を機能的に合わせた強度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの２９〜３４ページを参照のこと。結合力は、特定のエピトープとの集合の中で個々の免疫グロブリン分子の親和性と、さらに、免疫グロブリンと抗原の価数の両方に関係がある。例えば、二価モノクローナル抗体と、高度に繰り返すエピトープ構造を有する抗原、例えばポリマーとの相互作用は、高い結合力を有するひとつだろう。抗原に対する抗体の親和性又は結合力は、任意の適切な方法を用いて実験的に決定することができる。例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．、「Ａｎｔｉｇｅｎ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ、Ｗ．Ｅ．編集、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ Ｙ （１９８４）、Ｋｕｂｙ、Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ及びＣｏｍｐａｎｙ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ Ｙ（１９９２）、及びここに記載されている方法を参照のこと。抗原に対する抗体の親和性を測定する一般的な技術としては、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び表面プラズモン共鳴が挙げられる。特定の抗体−抗原相互作用の親和性の測定値は、異なる条件、例えば、塩濃度、ｐＨで測定すると変わる場合がある。従って、親和性及び他の抗原結合パラメーター、例えば、ＫＤ、ＩＣ５０の測定は、抗体及び抗原の標準溶液、及び標準化したバッファーを用いて行うことができる。
本発明の結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体は、交差反応性という観点で記載又は明記することもできる。本明細書で使用する場合、「交差反応性」との用語は、ある抗原に特異的な抗体が第２の抗原と反応する能力を指し、２種類の異なる抗原基質間の関連の測定値である。従って、ある抗体は、その抗体が、その生成を誘発するエピトープ以外のエピトープに結合する場合、交差反応性である。交差反応性のエピトープは、一般的に、誘発するエピトープと同じ相補性構造の特徴の多くを含んでおり、ある場合には、実際に元々のものよりも良好に適合する場合がある。
例えば、特定の抗体は、関連するが同一ではないエピトープに、例えば、リファレンスエピトープに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、及び少なくとも５０％の同一性を有するエピトープ（当該技術分野で既知の方法及び本明細書に記載の方法を用いて計算した場合）に結合する場合、この抗体は、ある程度の交差反応性を有する。ある実施形態では、ある抗体は、リファレンスエピトープに対する同一性が９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、及び５０％未満であるエピトープ（当該技術分野で既知の方法及び本明細書に記載の方法を用いて計算した場合）に結合しない場合、この抗体は、交差反応性がほとんどない、又はまったくないと言うことができる。ある抗体は、あるエピトープの任意の他のアナログ、オルソログ又はホモログに結合しない場合、特定のエピトープに対して「非常に特異的」であると考えることができる。
本発明の結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体は、α−シヌクレインに対する結合親和性という観点で記載又は明記することもできる。結合親和性としては、解離定数又はＫｄが５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満、又は１０−１５Ｍ未満である結合親和性が含まれる。
すでに示したように、種々の免疫グロブリン種の定常領域のサブユニット構造及び三次元構造は、よく知られている。本明細書で使用する場合、「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の第１の（アミノ最末端）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端である。
本明細書で使用する場合、「ＣＨ２ドメイン」という用語は、例えば、従来の番号付けスキームを用い、抗体のほぼ残基２４４〜残基３６０に広がる重鎖分子の一部を含む（残基２４４〜３６０、Ｋａｂａｔ番号付けシステム；及び残基２３１〜３４０、ＥＵ番号付けシステム；Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．（既出）を参照のこと）。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密に対にはなっておらず、固有である。むしろ、２個のＮ接続した分岐した炭水化物鎖が、インタクトな天然のＩｇＧ分子の２個のＣＨ２ドメインの間に挟まれている。さらに、ＣＨ３ドメインが、ＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端に広がり、約１０８残基を含むことも十分に記載されている。
本明細書で使用する場合、「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインがＣＨ２ドメインに接続する重鎖分子の一部を含む。このヒンジ領域は、ほぼ２５残基を含み、可撓性であるため、２個のＮ末端抗原結合領域は独立して移動することができる。ヒンジ領域は、上部、中部又は下部のヒンジドメインという３つの別個のドメインに分けることができる。Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（１９９８）、４０８３を参照のこと。
本明細書で使用する場合、「ジスルフィド結合」という用語は、２個の硫黄原子間に作られる共有結合を含む。システインアミノ酸は、第２のチオール基とジスルフィド結合又は架橋を形成することができるチオール基を含む。ほとんどの天然に発生するＩｇＧ分子では、Ｋａｂａｔ番号付けシステムを用いて２３９及び２４２（位置２２６又は２２９、ＥＵ番号付けシステム）に対応する位置で、ＣＨ１領域及びＣＬ領域は、ジスルフィド結合によって接続し、２個の重鎖は、２個のジスルフィド結合によって接続する。
本明細書で使用する場合、「接続した」、「融合した」又は「融合」という用語は、相互に置き換え可能に用いられる。これらの用語は、どんな手段を用いても、化学接合又は組み換え手段を含む２つ以上のエレメント又は成分を一緒に接続することを指す。「フレーム内融合」は、元々のＯＲＦの正しい翻訳リーディングフレームを維持する様式で２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が接続し、連続した長いＯＲＦを形成することを指す。従って、組み換え融合タンパク質は、元々のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含む一種類のタンパク質である（セグメントは、通常では、そのように接続する性質はない）。従って、リーディングフレームは、融合したセグメント全体にわたって連続的に作られるが、このセグメントは、物理的又は空間的に、例えば、フレーム内のリンカー配列によって分離することができる。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、フレーム内で融合させることができるが、「融合した」ＣＤＲが連続ポリペプチドの一部として一緒に翻訳されるものである限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域又はさらなるＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって分離することができる。
「発現」という用語は、本明細書で使用する場合、遺伝子が生化学物質、例えば、ＲＮＡ又はポリペプチドを産生するプロセスを指す。このプロセスは、限定されないが、遺伝子ノックダウン及び一時的な発現及び安定な発現を含む、細胞内の遺伝子の機能の存在が現れることを含む。発現としては、限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は任意の他のＲＮＡ産物への遺伝子の転写、及びこのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が挙げられる。最終的な望ましい産物が生化学物質である場合、発現としては、この生化学物質及び任意の前駆体の生成を含む。遺伝子の発現によって「遺伝子産物」が生成する。本明細書で使用する場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって作られるメッセンジャーＲＮＡ、又は転写から翻訳されるポリペプチドのいずれかであってもよい。本明細書に記載の遺伝子産物は、さらに、例えば、ポリアデニル化のような転写後修飾を受けた核酸、又は例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク分解による開裂などの翻訳後修飾を受けたポリペプチドを含む。
本明細書で使用する場合、「サンプル」という用語は、被検体又は患者から得られる任意の生体材料を指す。一態様では、サンプルは、血液、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）、又は尿を含んでいてもよい。他の態様では、サンプルは、全血、血漿、血液サンプルから得たＢ細胞を豊富に含むもの、及び培養した細胞（例えば、被検体から得たＢ細胞）を含んでいてもよい。サンプルは、さらに、神経組織を含む生検サンプル又は組織サンプルを含んでいてもよい。さらなる他の態様では、サンプルは、全細胞及び／又は細胞の溶解物を含んでいてもよい。血液サンプルは、当該技術分野で既知の方法によって集めることができる。一態様では、２００μｌのバッファー（２０ｍＭ トリス、ｐＨ７．５、０．５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ＩＸ Ｓｉｇｍａ Ｐｒｏｔｅａｓｅ阻害剤、及びＩＸ Ｓｉｇｍａ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ阻害剤１及び２）中、４℃でボルテックス回転させることによってペレットを再懸濁させることができる。この懸濁物を断続的にボルテックス回転させつつ、氷上で２０分間保持してもよい。約４℃、１５，０００×ｇで５分間回転させた後、上澄みを等分し、−約７０℃で保存してもよい。
本明細書で使用する場合、「治療する」又は「治療」という用語は、治療的な処置及び予防的な処置又は予防的な測定の両方を指し、この目的は、望ましくない生理学的な変化又は障害、例えば、パーキンソニズムの進行を予防するか、又は遅らせる（低下させる）ことである。有益又は望ましい臨床結果としては、検出可能であるか検出不可能であるかにかかわらず、限定されないが、症状の軽減、疾患の程度を低くすること、疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行を遅らせるか、又はゆっくりにすること、疾患の状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的に又は完全に）が挙げられる。「治療」は、治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を伸ばすことも意味する。治療が必要なものには、すでにその状態又は障害を有しているもの、及びその状態又は障害を有する傾向があるもの、又はその状態又は障害の発生を予防すべきであるものが挙げられる。
「被検体」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」とは、診断、予後診断、予防又は治療が望ましい任意の被検体、特に、哺乳動物被検体、例えば、ヒト患者を意味する。
（ＩＩ．抗体）
本発明は、一般的に、実施例に示す抗体について概説した免疫学的な結合特徴及び／又は生物額的特性を示すことができるヒト抗−α−シヌクレイン抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。本発明によれば、α−シヌクレインに特異的なヒトモノクローナル抗体は、高齢被検体の集合からクローニングした。
本発明に従って行った一連の実験において、α−シヌクレインに特異的な抗体をクローニングしようとする初期の試みはうまくいかなかったが、ほとんどいつも擬陽性クローンが得られた。これらのクローンをさらに観察すると、これらのクローンが、Ｅ．Ｃｏｌｉの抗体認識タンパク質を産生していることがわかった。この問題を回避するために、ヒト記憶Ｂ細胞培養物の馴化培地中の抗体について、コーティングされた全長アルファシヌクレインモノマーに対する結合と、Ｅ．Ｃｏｌｉタンパク質及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対する結合がないことを並行してスクリーニングした。特に、Ｂ細胞の馴化培地は、この培地についてα−シヌクレインに結合するヒト抗体をスクリーニングするためのＥＬＩＳＡアッセイを行う前に、あらかじめＥ．Ｃｏｌｉタンパク質を用いて吸収させておいた。
特異的な抗体を単離しようとする初期の試みは、循環するα−シヌクレイン抗体の血漿レベルが高いことが示唆される、α−シヌクレインに対する高い血漿結合活性を有するヒト被検体の集合に注目していた。これらの試みでは、α−シヌクレインに特異的なヒト記憶Ｂ細胞を産生することができず、α−シヌクレインへの血漿反応性が低い被検体の集合から、本発明に記載する抗体が単離された。
この測定に起因して、数種類の抗体が単離された。さらに、選択した抗体について、分類及び軽鎖の副分類を分析した。次いで、記憶Ｂ細胞培養物から選択した関連する抗体のメッセージをＲＴ−ＰＣＲによって転写し、クローニングし、組み換え生成のために発現ベクター内で合わせた。ＰＣＴ出願公開第ＷＯ ２０１０／０６９６０３ Ａ１号を参照のこと。例示的な抗−ヒトα−シヌクレイン抗体ＮＩ−２０２．１２Ｆ４、ＮＩ−２０２．３Ｇ１２、及びＮＩ−２０２．３Ｄ８は、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ ２０１０／０６９６０３ Ａ１号に開示されている。
本明細書には、ヒトモノクローナル抗体ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１が開示されている。ＨＥＫ２９３細胞内又はＣＨＯ細胞内でのＮＩ−２０２．２２Ｄ１１の組み換え発現、その後、ヒトα−シヌクレインへの結合特異性の特徴（図２Ａ〜Ｂ）を決定した。従って、本発明の一態様は、単離されたヒトモノクローナル抗−α−シヌクレイン抗体ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１及び抗原結合フラグメント、その誘導体及び改変体に関する。さらに、本発明は、結合分子、例えば、抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体に向けられており、ここで、抗体は、配列番号１４又は配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号２２又は配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ、又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体を含む。一実施形態では、ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１、及びその改変体、フラグメント、又は誘導体は、ヒトβ−シヌクレイン及びヒトγ−シヌクレインと比較して、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合し、マウスα−シヌクレインと比較してヒトα−シヌクレインに特異的に結合するという特徴を有する。ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１は、オリゴマー形態又は凝集した形態のα−シヌクレインに優先的に結合する。
一実施形態では、本発明は、抗−α−シヌクレイン抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体に向けられており、ここで、抗体は、リファレンス抗体ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１と同じヒトα−シヌクレインエピトープに特異的に結合する。実施例に示されているように、抗体ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１は、ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、Ｃ末端酸性領域（アミノ酸９６〜１４０）を含むα−シヌクレイントランケーション、例えば、配列番号１のアミノ酸１１３〜１２３に結合し、アミノ酸ＰＶＤＰＤＮＥ（配列番号１のアミノ酸１１７〜１２３）内のエピトープに特異的に結合する。
抗体ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１は、実施例２に示すように、α−シヌクレインのモノマー形態よりも、α−シヌクレインの凝集物又は原線維に優先的に結合する。さらに、抗体ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１は、脳内のα−シヌクレインの病的な形態、例えば、実施例３に記載する免疫組織化学的染色によって例示されるようなα−シヌクレインの病的な凝集物に結合する。従って、本発明は、診断目的及び治療目的で有用な新規ヒト抗−α−シヌクレイン抗体を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ ２０１０／０６９６０３ Ａ１号に記載されるような例示的なＮＩ−２０２．１２Ｆ４抗体の正確な結合特性を示す結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を提供する。本発明は、α−シヌクレインのＮ末端にあるエピトープに結合する結合分子、例えば、配列番号１のアミノ酸４〜１５内に結合する結合分子を提供する。特定の実施形態は、配列番号１のアミノ酸４〜１５内に結合するが、但し、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４のＶＨ（配列番号５又は配列番号９）、ＶＬ（配列番号１０又は配列番号１４）、ＶＨＣＤＲ１（配列番号６）、ＶＨＣＤＲ２（配列番号７）、ＶＨＣＤＲ３（配列番号８）、ＶＬＣＤＲ１（配列番号１１）、ＶＬＣＤＲ２（配列番号１２）及び／又はＶＬＣＤＲ３（配列番号１３）を含む抗体、又はそのフラグメント、改変体、又は誘導体を除く、結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体を提供する。
本発明は、さらに、図１に示すいずれかのアミノ酸配列を含む、ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１のＶＨ可変領域及び／又はＶＬ可変領域の少なくとも１個、２個、３個、４個、５個又は６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、結合分子、例えば、抗体及びその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を提供する。上に特定した可変領域をコードする対応するヌクレオチド配列は、添付する配列表に記載している。図１に示すＶＨ領域及び／又はＶＬ領域の上のアミノ酸配列の例示的なＣＤＲ群も、添付した配列表に示されている。しかし、以下に記載するように、当業者は、これらに加えて、又はこれらに代えて、図１に記載するアミノ酸配列と、１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上のアミノ酸が異なるＣＤＲを使用してもよいという事実に十分に気づいている。ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１のＶＨは、配列番号１５のアミノ酸配列及び配列番号１９のＤＮＡ配列によってあらわされており、そのＧＬ修正した形態は、配列番号２０のアミノ酸配列及び配列番号２１のＤＮＡ配列としてあらわされる。ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１のＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列及び配列番号２８のＤＮＡ配列によってあらわされており、そのＧＬ修正した形態は、配列番号２６のアミノ酸配列及び配列番号２７のＤＮＡ配列としてあらわされる。ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８によってあらわされる。ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５によってあらわされる。
一実施形態では、本発明の結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、図１に示すようなＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列を含むいずれかの抗体である。または、本発明の抗体は、図１に示すＶＨ領域及び／又はＶＬ領域を有する抗体を用い、α−シヌクレインへの結合に競争する結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体である。これらの抗体は、特に、治療用途で、同様にヒトであってもよい。または、この抗体は、動物での診断方法及び診断試験に特に有用なマウス抗体、マウス化抗体及びキメラマウス−ヒト抗体である。
上述のように、ヒト免疫応答時の生成に起因して、本発明のヒトモノクローナル抗体は、例えば、それぞれ、マウスモノクローナル抗体の生成、及びファージディスプレイライブラリーのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングにおける免疫化プロセスの場合に、利用可能ではないか、又は免疫原性が低い特定の生理学的関連性を有するエピトープを認識する。従って、本発明のヒト抗−α−シヌクレイン抗体のエピトープは、固有であってもよい。従って、本発明は、さらに、一般的に、α−シヌクレインに対する特異的な結合について、本発明のヒトモノクローナル抗体と競争する抗−α−シヌクレイン抗体及びα−シヌクレイン結合分子まで拡張される。本発明は、さらに具体的には、結合分子、例えば、抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体に向けられ、ここで、抗体は、リファレンス抗体ＮＩ−２０２．２２Ｇ１１と同じα−シヌクレインのエピトープに特異的に結合する。
抗体同士の競争は、例えば、免疫グロブリンが、試験中、共通の抗原、例えばα−シヌクレインに対するリファレンス抗体の特異的な結合を阻害するアッセイによって決定することができる。多種類の競争結合アッセイが知られており、例えば、固相の直接的又は間接的なラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相の直接的又は間接的な酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競争アッセイ；Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９（１９８３）、２４２〜２５３を参照のこと；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ；Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７（１９８６）、３６１４〜３６１９及びＣｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６（１９９０）、５４６〜５５２を参照のこと；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照のこと；Ｉ１２５標識を用いる固相直接標識ＲＩＡ；Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１９８８）、７〜１５及びＭｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（１９９０）、７７〜８２を参照のこと、が挙げられる。典型的には、このようなアッセイは、これらのいずれかを含む固体表面又は細胞に結合した精製α−シヌクレイン又は凝集物、標識されていな試験免疫グロブリン及び標識されたリファレンス免疫グロブリン、すなわち、本発明のヒトモノクローナル抗体の使用を含む。競合的な阻害は、試験免疫グロブリン存在下、固体表面又は細胞に結合した標識の量を決定することによって測定される。通常は、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。競争結合アッセイは、添付した実施例でＥＬＩＳＡアッセイについて記載した条件で行うことができる。競争アッセイによって特定される抗体（競争抗体）としては、リファレンス抗体と同じエピトープに結合する抗体、立体障害を起こすためにリファレンス抗体が結合したエピトープと十分に近い隣接エピトープに結合する抗体が挙げられる。通常は、競争抗体が過剰に存在する場合、競争抗体は、共通の抗原に対するリファレンス抗体の特異的な結合を少なくとも５０％又は７５％阻害するだろう。従って、本発明は、さらに、結合分子、例えば、抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体に向けられており、ここで、抗体は、α−シヌクレインに対する結合からリファレンス抗体 ＮＩ−２０２．２２Ｇ１１を競合的に阻害する。
さらに、アミノ酸配列が、配列番号１５又は配列番号２０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一な免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合する、単離された結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントも開示される。
さらに、配列番号１５又は配列番号２０と同一であるか、又は配列番号１５又は配列番号２０に対して１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸置換以外は同一であるＶＨアミノ酸配列を含む、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合する、単離された結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントが開示される。
さらに、アミノ酸配列が、配列番号２２又は配列番号２６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一な免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合する、単離された結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントも開示される。
ある実施形態は、配列番号２２又は配列番号２６と同一であるか、又は配列番号２２又は配列番号２６に対して１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸置換以外は同一であるＶＬアミノ酸配列を含む、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合する、単離された結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントを開示する。
他の実施形態では、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列が、（ａ）それぞれ、配列番号１５及び配列番号２２、（ｂ）それぞれ、配列番号１５及び配列番号２６、（ｃ）それぞれ、配列番号２０及び配列番号２２、（ｄ）それぞれ、配列番号２０及び配列番号２６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一なＶＨ及びＶＬを含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなる。
さらに、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなり、重鎖可変領域の少なくとも１つ、２つ又は３つすべてのＶＨ−ＣＤＲが、図１のリファレンス重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２又はＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一であり、それぞれ、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８によってあらわされる。従って、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８によってあらわされるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に関連するＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３のポリペプチド配列を有する、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合する、単離された結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントが開示される。図１は、Ｋａｂａｔ ｓｙｓｔｅｍによって定義されるＶＨ−ＣＤＲを示すが、他のＣＤＲの定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステムによって定義されるＶＨ−ＣＤＲも本発明に含まれ、存在する配列データを用い、当業者によって簡単に特定することができる。
さらに、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなり、ここで、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３領域は、それぞれ配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８によってあらわされるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３と同一のポリペプチド配列を含む、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合する、単離された結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントが開示される。
さらに、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなり、ここで、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３領域は、それぞれ配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８によってあらわされるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対し、任意の１つのＶＨ−ＣＤＲにおいて、同一であるか、または１個、２個、３個、４個、５個、６個のアミノ酸置換以外は同一であるポリペプチド配列を含む、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合する、単離された結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントが開示される。さらに、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３領域が、それぞれ配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８によってあらわされるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と同一であるか、又はそれぞれ配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８によってあらわされるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対し、合計で５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個又は２０個のＣＤＲ置換以外は同一であるポリペプチド配列を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）も提供される。
さらに、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなり、ここで軽鎖可変領域の少なくとも１つ、２つ、または３つすべてのＶＬ−ＣＤＲが、それぞれ、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５によってあらわされるリファレンス軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２又はＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合する、単離された結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントが開示される。従って、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、図１に示され、それぞれ配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５によってあらわされるポリペプチドに関連するＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３のポリペプチド配列を有する。図１は、Ｋａｂａｔ ｓｙｓｔｅｍによって定義されるＶＬ−ＣＤＲを示すが、他のＣＤＲの定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステムによって定義されるＶＬ−ＣＤＲも本発明に含まれる。特定の実施形態では、アミノ酸置換は、保存的である。
さらに、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなり、ここで、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３領域は、図１に示され、それぞれ配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５によってあらわされるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３群と同一のポリペプチド配列を有する、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合する、単離された結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントが開示される。さらに、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなり、ここで、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３領域は、それぞれ配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５によってあらわされるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と同一であるか、又は、任意のＶＬ−ＣＤＲにおいて、それぞれ配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５によってあらわされるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対し、１個、２個、３個、４個、５個又は６個のアミノ酸置換以外は同一であるポリペプチド配列を含む、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合する、単離された結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントが開示される。さらに、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３領域は、それぞれ配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５によってあらわされるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対し、合計で５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個又は１５個のＣＤＲ置換以外は同一であるポリペプチド配列を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）も提供される。特定の実施形態では、アミノ酸置換は、保存的である。
免疫グロブリン又はそのコードするｃＤＮＡをさらに改変してもよい。従って、さらなる実施形態では、本発明の方法は、キメラ抗体、マウス化抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ−フラグメント、二重特異的な抗体、融合抗体、標識化抗体又はこれらのいずれか１つのアナログを製造するいずれかの工程を含む。対応する方法は、当業者には知られており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、「抗体，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８８）に記載されている。この抗体の誘導体は、ファージディスプレイ技術によって得られ、ＢＩＡｃｏｒｅシステムで利用されるような表面プラズモン共鳴を使用し、本明細書に記載するいずれかの抗体と同じエピトープに結合するファージ抗体の効率を高めることができる（Ｓｃｈｉｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７（１９９６）、９７〜１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３（１９９５）、７〜１３）。キメラ抗体の製造は、例えば、国際出願第ＷＯ８９／０９６２２号に記載される。ヒト化抗体を製造するための方法は、例えば、欧州出願第ＥＰ−Ａ１ ０ ２３９ ４００号及び国際出願第ＷＯ９０／０７８６１号に記載されている。本発明に従って利用される抗体のさらなる供給源は、いわゆる異種抗体である。異種抗体、例えば、マウス中のヒト様抗体の製造の一般原理は、例えば、国際出願第ＷＯ９１／１０７４１号、ＷＯ９４／０２６０２号、ＷＯ９６／３４０９６号及びＷＯ ９６／３３７３５号に記載される。上述のように、本発明の抗体は、完全な抗体以外にも種々の形態で存在していてもよく、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２、及び一本鎖、例えばｓｃＦｖが挙げられ、例えば、国際出願第ＷＯ８８／０９３４４号を参照のこと。
本発明の抗体又はその対応する免疫グロブリン鎖を、当該技術分野で既知の従来技術を用いて、例えば、アミノ酸の欠失、挿入、置換、付加及び／又は組み換え及び／又は当該技術分野で既知の任意の他の改変を単独又は組み合わせて用いることによって、さらに改変してもよい。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の下にあるＤＮＡ配列にこのような改変を導入する方法は、当業者ならよく知っている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９） Ｎ．Ｙ． ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照のこと。本発明の抗体の改変としては、１個以上の構成アミノ酸の化学的及び／又は酵素的誘導体化、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、及び炭水化物又は脂質部分の付着、補因子などを含む、側鎖の修飾、骨格の修飾及びＮ末端及びＣ末端の修飾が挙げられる。同様に、本発明は、カルボキシル末端にある免疫刺激リガンドのような異種分子に融合したアミノ末端で、上述の抗体またはそのある種のフラグメントを含むキメラタンパク質の製造を包含する。例えば、対応する技術の詳細については、国際出願第ＷＯ００／３０６８０を参照のこと。
さらに、本発明は、上述の結合分子を含有するもの、例えば、重鎖のＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）は、可変度が大きい領域であり、主に抗原−抗体相互作用に参加することが頻繁に観察されるため、上述の抗体のいずれか１つの可変領域のＣＤＲ３領域、特に、重鎖のＣＤＲ３を含むものを含め、ペプチドを包含する。このようなペプチドは、簡単に合成することができ、又は、本発明に有用な結合薬剤を製造する組み換え手段によって作られる。このような方法は、当業者にはよく知られている。ペプチドは、例えば、市販されている自動化されたペプチド合成機を用いて合成することができる。ペプチドは、ペプチドを発現するＤＮＡを発現ベクターに組み込み、この発現ベクターを用いて細胞を形質転換し、ペプチドを製造することによる組み換え技術によって製造することもできる。従って、本発明は、任意の結合分子、例えば、本発明のヒト抗−α−シヌクレイン抗体に指向し、上述の特性を示す、すなわち、具体的には、α−シヌクレインを認識する抗体またはその結合フラグメントに関する。本明細書に記載するＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット及び免疫組織化学によって、結合特異性及び親和性について、このような抗体及び結合分子を試験することができる。例えば、実施例を参照のこと。さらに、本発明に従って行われたその後の実験に対する予備的な結果から、本発明のヒト抗−α−シヌクレイン抗体、特に、抗体ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１は、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）又はパーキンソン病（ＰＤ）を患う患者のヒト脳切片に存在するα−シヌクレインを含む小体を認識する。従って、本発明の一実施形態では、ヒト抗体またはその結合フラグメント、誘導体又は改変体は、ヒトのＤＬＢ又はＰＤ脳切片にあるα−シヌクレインを認識する（例えば、図４ｃを参照のこと）。
不死化したＢ細胞又はＢ記憶細胞を、その後の発現及び／又は遺伝子操作のための再配置された重鎖及び軽鎖の遺伝子座の供給源として使用することができる。再配置された抗体遺伝子を適切なｍＲＮＡから逆転写し、ｃＤＮＡを製造することができる。所望な場合、重鎖の定常領域を異なるアイソタイプの定常領域と交換することができ、又は完全に取り除くことができる。ヌクレオチド配列を遺伝子操作し、望ましくないモチーフ（例えば、スプライス部位又は制限部位）を除去することができ、抗体又はそのフラグメントが発現する細胞のために、コドンの使用を最適化することができる。それに加え、可変領域のアミノ酸を変えるような１つ以上の変異を作ることができ、例えば、親和性が上げることができるか、又は安定性を高めることができる。可変領域を接続し、一本鎖Ｆｖ領域をコードすることができる。複数のＦｖ領域を接続し、１個より多い標的に対する結合能力を与えることができ、又はキメラの重鎖及び軽鎖の組み合わせを使用することができる。遺伝子材料が利用可能である場合、所望な標的に結合する能力を保持する上述のアナログの設計は簡単である。抗体の可変領域をクローニングし、組み換え抗体を作成する方法は、当業者に知られており、例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４７（１９９６）、１〜２０；Ｄｏｅｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １１（１９９７）、１７８７〜１７９２に記載されている。
適切な遺伝子材料が得られたら、所望な場合、最低でも、重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする配列を含むアナログ、コード配列をコードするように改変された遺伝子材料を、ベクターに含まれる発現系に挿入することができ、効率的な処理のために標準的な組み換え宿主細胞に導入することができる。この目的のために有用な典型的な哺乳動物細胞系としては、限定されないが、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞又はＮＳＯ細胞が挙げられる。
次いで、改変された組み換え宿主を、宿主細胞を成長させ、コード配列を発現するのに適した培養条件下で培養することによって、抗体又はアナログの製造を行う。次いで、培養物から抗体を単離することによって、抗体を回収する。得られた抗体が培地に分泌するように、シグナルペプチドを含む発現系を設計することができる。しかし、細胞内での産生も可能である。
上述の内容によれば、本発明は、さらに、本発明の抗体又は等価な結合分子、１つ以上のＣＤＲ、１つ以上の重鎖又は軽鎖の可変領域又はその改変体、上述の抗−α−シヌクレイン抗体の免疫グロブリン鎖をコードするポリヌクレオチドに関する。
当業者は、抗体の可変ドメイン、又はその任意の一部を、所望な特異性及び生体機能を有する他のポリペプチド又は抗体の構築に使用することができることを簡単に理解するだろう。従って、本発明は、さらに、添付の実施例に記載されるように、ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１と実質的に同じ又は類似の結合特性を有することができる、抗体ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１の少なくとも１つの重鎖又は軽鎖のＣＤＲ、又は１個、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸置換を有するこのようなＣＤＲを含むポリペプチド及び抗体を提供する。当業者は、ＣＤＲ内又は超可変ループ内にアミノ酸置換を作ることによって、結合親和性を高めることができることを知っており（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）、９０１〜９１７）、Ｋａｂａｔによって定義される場合、ＣＤＲが部分的に重複している。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）、３２３〜３２７を参照のこと。従って、本発明は、さらに、上述の１つ以上のＣＤＲが、１つ以上のアミノ酸置換を含む抗体に関する。特定の実施形態では、本発明の抗体は、免疫グロブリン鎖の片方又は両方に、図１に記載するような可変領域の２つ又は３つすべてのＣＤＲ（元々のもの、又は修正されたもの）を含む。
結合分子、例えば、本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、当業者が知っているように、１つ以上の効果又は機能に介在する定常領域を含んでいてもよい。例えば、抗体に定常領域に相補的なＣ１構成要素の結合は、相補系を活性化することができる。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化及び溶解にとって重要である。補体の活性化は、炎症反応も刺激し、自己免疫の過敏性にも関与することがある。さらに、抗体は、Ｆｃ領域を介して種々の細胞の受容体に結合し、抗体のＦｃ領域にあるＦｃ受容体に結合する部位は、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（エプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）及びＩｇＭ（ミュー受容体）を含め、異なる種類の抗体に特異的な多くのＦｃ受容体が存在する。細胞表面にあるＦｃ受容体に抗体が結合すると、抗体がコーティングされた粒子の呑食及び破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による、抗体がコーティングされた標的細胞の溶解（抗体依存性細胞障害作用、又はＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症メディエーターの放出、胎盤通過及び免疫グロブリン産生の制御を含め、多くの重要かつ多様な生体反応の引き金となる。
従って、本発明の特定の実施形態は、効果又は機能の低下、非共有結合によって二量化する能力、α−シヌクレインが凝集し、蓄積する部位に局在化する能力の上昇、血清半減期の減少、又はほぼ同じ免疫原性を有する改変されていない全抗体と比較したときに、血清半減期の増加といった所望な性化学物質の特徴を与えるように、１つ以上の定常領域ドメインの少なくとも一部が欠失しているか、又はその他の方法で変更されている抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を含む。例えば、本明細書に記載する診断方法及び治療方法で使用するための特定の抗体は、免疫グロブリン重鎖と類似しているが、１つ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部が欠失したポリペプチド鎖を含む欠失抗体を含むドメインである。例えば、特定の抗体では、改変された抗体の定常領域のドメインの１つが完全に欠失しており、例えば、ＣＨ２ドメインのすべて又は一部が欠失しているだろう。他の実施形態では、本明細書に記載する診断方法及び治療方法で使用するための特定の抗体は、グリコシル化を起こさないように変えられた定常領域、例えば、ＩｇＧ重鎖定常領域を有し、本明細書のどこかの箇所で、脱グリコシル化抗体又は「ａｇｌｙ」抗体と呼ぶ。このような「ａｇｌｙ」抗体は、酵素によって調製することができ、また、定常領域のコンセンサスグリコシル化部位を遺伝子操作することによって調製することができる。理論によって束縛されないが、「ａｇｌｙ」抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで改良された安全性及び安定性のプロフィールを有していてもよいと考えられる。望ましい効果又は機能を有する脱グリコシル化抗体を製造する方法は、例えば、国際出願第ＷＯ２００５／０１８５７２にみられ、全体として参照により組み込まれる。
本明細書に記載する特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体では、当該技術分野で既知の技術を用い、効果又は機能が低下するようにＦｃ部分を変異させることができる。例えば、定常領域ドメインの（点変異又は他の手段による）欠失又は不活性化によって、改変された循環する抗体のＦｃ受容体への結合を低下させ、それによってα−シヌクレインの局在化を増加させることができる。その他の場合に、本発明に一致する定常領域の改変は、相補的な結合を抑え、それによって、血清半減期及び接合した細胞毒との非特異的な会合を減少させる。定常領域のさらに他の改変を用い、抗原特異性又は抗体の柔軟性が高まることに起因して、局在化を高めることができるようにジスルフィド接続又はオリゴ糖部分を改変することができる。得られた生理学的プロフィール、バイオアベイラビリティ及び他の生化学物質の改変効果、例えば、α−シヌクレインの局在化、生体内分布及び血清半減期は、過度な実験をすることなく、よく知られた免疫学的技術を用いて簡単に測定し、定量することができる。
本明細書に記載する特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体では、Ｆｃ部分を、一例として、Ｆｃγ受容体、ＬＲＰ、又はＴｈｙ１受容体又は「Ｓｕｐｅｒ抗体 Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」によって、受容体が介在する抗体のエンドサイトーシスを高めることによって、抗体の細胞内取り込みを増やすような代替的なタンパク質配列のために変異させ、又は交換することができ、生きた細胞を傷つけることなく、生きた細胞へと抗体が行き来することができるといわれる（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５）、２３７〜２４１）。例えば、α−シヌクレイン及び細胞表面受容体に結合する特異的な配列を有する、細胞表面受容体又は二重特異性抗体又は多重特異性抗体の抗体に結合する領域及び同族のタンパク質リガンドの融合タンパク質の生成は、当該技術分野で既知の技術を用いて操作することができる。
本明細書に記載する特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体では、Ｆｃ部分を、代替的なタンパク質配列のために変異させ、又は交換することができ、又は抗体を化学修飾し、血液脳関門での透過性を高めることができる。
本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体の改変形態は、当該技術分野で既知の技術を用い、前駆体又は親抗体全体から作ることができる。例示的な技術を本明細書でさらに詳細に記載する。本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、当該技術分野で既知の技術を用いて製造することができる。特定の実施形態では、抗体分子又はそのフラグメントは、「組み換えによって製造」され、すなわち、組み換えＤＮＡ技術を用いて製造される。抗体分子又はそのフラグメントを製造する例示的な技術を、本明細書の他の箇所でさらに詳細に記載する。
本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、例えば、共有結合によって、抗体が同種エピトープに特異的に結合しないように防ぐように、抗体に対する任意の種類の分子の共有結合によって改変する誘導体を含む。例えば、限定されないが、抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク分解による開裂、細胞内リガンド又は他のタンパク質などに対する接続によって改変された抗体を含む。既知の技術によって、限定されないが、特殊な化学開裂、アセチル化、ホルミル化、代謝によるツニカマイシンの合成などを含む任意の多くの化学修飾を行ってもよい。さらに、誘導体は、１つ以上の従来のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。
特定の実施形態では、本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、治療対象の動物、例えばヒトの有害な免疫応答を誘発しないだろう。特定の実施形態では、本発明の結合分子、例えば、抗体、又はその抗原結合フラグメントは、患者、例えば、ヒト患者から誘導され、その後、誘導されたのと同じ種、例えばヒトで用いられ、有害な免疫応答の発生を軽減するか、又は最低限にする。
抗体の免疫原性を下げるために、脱免疫化を用いることもできる。本明細書で使用する場合、「脱免疫化」という用語は、Ｔ細胞エピトープを改変する抗体の変化部分を含む。例えば、国際出願第ＷＯ９８／５２９７６号及びＷＯ００／３４３１７号を参照のこと。例えば、出発抗体から得たＶＨ配列及びＶＬ配列を分析し、それぞれのＶ領域からのヒトＴ細胞エピトープ「マップ」は、配列内の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び他の鍵となる残基に関連してエピトープの位置を示す。最終的な抗体の活性を変えてしまう危険性が低い代替的なアミノ酸置換を特定するために、Ｔ細胞エピトープマップから、個体Ｔ細胞のエピトープを分析する。アミノ酸置換の組み合わせを含む代替的なＶＨ配列及びＶＬ配列の範囲が設計され、その後、本明細書に開示する診断方法及び治療方法で使用するために、これらの配列を、ある範囲の結合ポリペプチド、例えば、α−シヌクレインに特異的な抗体又はその免疫特異的なフラグメントに組み込み、次いで、機能について試験する。典型的には、１２〜２４の改変体抗体が生成し、これを試験する。次いで、改変されたＶ領域及びヒトＣ領域を含む重鎖及び軽鎖の競争遺伝子を発現ベクター内でクローニングし、その後、全抗体を産生するためにプラスミドを細胞系に導入した。次いで、この抗体を適切な生化学物質及び生化学アッセイで比較し、最適な改変体を特定する。
ハイブリドーマ、組み換え、及びファージディスプレイ技術、又はこれらの組み合わせの使用を含む当該技術分野で既知の広範囲の技術を用い、モノクローナル抗体を調製することができる。例えば、当該技術分野で既知の技術を含むハイブリドーマ技術を用い、モノクローナル抗体を製造することができ、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２編（１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、５６３〜６８１（１９８１）に教示があり、この参考文献は、全体として参照により組み込まれる。「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、限定されないが、ハイブリドーマ技術によって作られる抗体を指す。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物、原核生物を含む１種類のクローン、又はファージクローンから誘導される抗体を指し、製造される方法を指さない。従って、「モノクローナル抗体」という用語は、限定されないが、ハイブリドーマ技術によって作られる抗体である。特定の実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に記載したように、エプスタインバーウイルスの形質変換によって不死化したヒトＢ細胞から誘導される。
よく知られているハイブリドーマプロセス（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ２５６（１９７５）、４９５）において、哺乳動物から得た比較的短寿命又は死ぬ間際のリンパ球、例えば、本明細書に記載するヒト被検体から誘導されるＢ細胞を、不死の腫瘍細胞系と融合させ（例えば、骨髄腫細胞系）、従って、不死でもあり、Ｂ細胞の遺伝的にコードされた抗体を産生することもできるハイブリッド細胞又は「ハイブリドーマ」を製造する。得られたハイブリッドは、選択し、希釈し、１種類の抗体を作成するための特定の遺伝子を含むそれぞれの個体株を用いて再び成長させることによって、分離されて、１種類の遺伝子株となる。これらのハイブリッドは、所望な抗原に対して純粋な遺伝家系について同種な抗体を産生し、「モノクローナル」と呼ばれる。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない元々の骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する１つ以上の基質を含有してもよい適切な培地に播種し、成長させる。当業者は、ハイブリドーマを作成し、選択し、成長させるための試薬、細胞系及び培地は、多くの供給源から市販されており、標準的なプロトコルが十分に確立されていることを理解するだろう。一般的に、ハイブリドーマ細胞が成長する培地を、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞によって作られるモノクローナル抗体の結合特異性をｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば、本明細書に記載するような免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって決定する。所望の特異性、親和性及び／又は活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定した後、標準的な方法によってクローンを限界希釈手順によってサブクローニングし、成長させてもよい。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ５９〜１０３（１９８６）を参照のこと。さらに、サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体を、例えば、タンパク質−Ａ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティクロマトグラフィーのような従来の精製手順によって培地、腹水又は血清から分離することができることも理解されるだろう。
別の実施形態では、顕微操作によってリンパ球を選択することができ、可変遺伝子を単離した。例えば、末梢血の単核細胞を免疫化哺乳動物又は天然の免疫哺乳動物、例えば、ヒトから単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで約７日間培養することができる。この培養物を、スクリーニング基準を満たす特異的なＩｇＧについてスクリーニングすることができる。陽性のウェルから得た細胞を単離することができる。個体のＩｇを産生するＢ細胞を、ＦＡＣＳによって、又は補体による溶血プラークアッセイでこれらを特定することによって単離することができ、Ｉｇを産生するＢ細胞を管内で顕微操作し、ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅させることができる。ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を抗体発現ベクター内でクローニングし、発現のために細胞（例えば、真核細胞又は原核細胞）に導入することができる。
または、当業者にはよく知られている技術を用い、抗体を産生する細胞系を選択し、培養することができる。このような技術は、種々の実験マニュアル及び先行文献に記載されている。この観点で、以下に記載する本発明で使用するのに適した技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．編集、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されており、補遺を含め、全体として参照により組み込まれる。
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントを既知の技術によって作成することができる。例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントを組み換えによって、又はパパイン（Ｆａｂフラグメントを製造するため）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを製造するため）といった酵素を用い、免疫グロブリン分子のタンパク分解による開裂によって製造することができる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のＣＨ１ドメインを含む。このようなフラグメントは、例えば、免疫グロブリンの免疫特異的な部分とカップリングし、放射性同位体のようは試薬を検出することを含む免疫診断手順で用いるのに十分である。
例えば、本明細書に記載するような完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的な処置に特に望ましい。例えば、高齢のために例えばパーキンソン病のような障害が進行する危険性がある疑いがある高齢者被検体、又は障害を有しているが、通常とは異なる安定な疾患経過をたどっている患者から、本発明のヒト抗体を単離する。しかし、それぞれ、高齢で健康であり、症状がない被検体を予測するのは軽々しくは行えないが、本発明のヒト抗体を得るための供給源として同様に使用することができるもっと若い被検体よりも、予防的な抗−α−シヌクレイン抗体をもっと規則的に発生するだろう。このことは、シヌクレイン病の家族性形態が進行することがあらかじめ診断されているが、まだ症状がない若年性患者の場合には、若年性患者の免疫系及び応答機能は、高齢の成人よりも効果的であるため、特にあてはまる。
一実施形態では、本発明の抗体は、抗体分子の少なくとも１つの重鎖又は軽鎖のＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の抗体は、１種類以上の抗体分子から得た少なくとも２個のＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の抗体は、１種類以上の抗体分子から得た少なくとも３個のＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の抗体は、１種類以上の抗体分子から得た少なくとも４個のＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の抗体は、１種類以上の抗体分子から得た少なくとも５個のＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の抗体は、１種類以上の抗体分子から得た少なくとも６個のＣＤＲを含む。被検体の抗体に含まれ得る少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的な抗体分子を本明細書に記載する。
抗体を合成するための当該技術分野で既知の任意の方法によって、特に、化学合成によって、又は本明細書に記載する組み換え発現技術によって、本発明の抗体を製造することができる。
一実施形態では、本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、１つ以上のドメインが、部分的又は完全に欠失した合成定常領域を含む（「ドメイン欠失抗体」）。特定の実施形態では、適合する改変抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除去されたドメイン欠失構築物又は改変体を含むだろう（ΔＣＨ２構築物）。他の実施形態では、短い接続ペプチドを欠失ドメインと置き換え、可変領域に柔軟性及び移動の自由度を与えてもよい。ドメイン欠失構築物は、ＩｇＧ１ヒト不変ドメインをコードするベクターを用いて誘導することができ、例えば、国際出願第ＷＯ０２／０６０９５５号及びＷＯ０２／０９６９４８Ａ２号を参照のこと。このベクターを操作してＣＨ２ドメインを欠失させ、ドメイン欠失ＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを得る。
特定の実施形態では、本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、ミニボディである。ミニボディは、当該技術分野で記載されている方法を用いて作ることができ、例えば、米国特許第５，８３７，８２１号又は国際出願第ＷＯ ９４／０９８１７号に記載されている。
一実施形態では、本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、モノマーサブユニット間の会合が可能な場合に限り、いくつかのアミノ酸、又は１個のアミノ酸の欠失又は置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択した領域での１個のアミノ酸の変位は、Ｆｃの結合を実質的に低下させ、それによって、α−シヌクレインの局在化を増やすのに十分な場合がある。同様に、効果又は機能を制御する（例えば、補体に結合する）１個以上の定常領域ドメインを欠失させることができる。定常領域のこのような部分的な欠失は、被検体の定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を損なわずに、抗体の選択した特徴（血清半減期）を高めることができる。さらに、上に暗示したように、開示した抗体の定常領域は、得られる構築物のプロフィールを高める１個以上のアミノ酸の変異又は置換による合成によってもよい。この観点で、改変された抗体の構造及び免疫原性プロフィールを実質的に維持しつつ、保存された結合部位（例えば、Ｆｃに結合）によって得られる活性を破壊することができる。さらに他の実施形態は、効果又は機能のような望ましい特徴を高め、又は、もっと多くの細胞毒素又は炭水化物の付着を与えるために、１個以上のアミノ酸を定常領域に付加することを含む。このような実施形態では、選択した定常領域ドメインから誘導される特定の配列を挿入又は複製することが望ましい場合がある。
本発明は、さらに、本明細書に記載する抗体分子の改変体（誘導体を含む）（例えば、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域）を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなり、抗体又はそのフラグメントが、α−シヌクレインに免疫特異的に結合する抗体を提供する。当業者が知っている標準的な技術を使用し、抗体をコードするヌクレオチド配列に、限定されないが、アミノ酸置換を生じる部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲによる突然変異誘発によって変異を導入することができる。改変体（誘導体を含む）は、リファレンスのＶＨ領域、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、又はＶＬ−ＣＤＲ３に対し、５０未満のアミノ酸置換、４０未満のアミノ酸置換、３０未満のアミノ酸置換、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、又は２未満のアミノ酸置換をコードすることができる。「保存的なアミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基を、同様の電荷を有する側鎖を含むアミノ酸残基と置き換えることである。同様の電荷を有する側鎖を含むアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を含むアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を含むアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷のない極性側鎖を含むアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を含むアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐した側鎖を含むアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を含むアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。または、例えば飽和突然変異誘発によってコード配列の全て又は一部にわたってランダムに変異を導入することもでき、得られた変異体を生体活性についてスクリーニングし、活性（例えば、α−シヌクレインに結合する能力）を保持している変異体を特定することができる。
例えば、抗体分子のフレームワーク領域にのみ、又はＣＤＲ領域にのみ変異を導入することも可能である。導入した変異は、サイレント変異又は中立的ミスセンス変異であってもよく、例えば、抗体が抗原に結合する能力に対する影響をまったくもたないか、又はほとんどもたなくてもよく、実際に、このような変異は、アミノ酸配列をなんら変えない。これらの種類の変異は、コドンの使用を最適化するために、又はハイブリドーマの抗体産生を向上させるために有用な場合がある。本発明の抗体をコードするコドンを最適化したコード領域は、本明細書の他の箇所で開示している。または、非中立的ミスセンス変異は、抗体が抗原に結合する能力を変えることができる。ほとんどのサイレント変異及び中立的ミスセンス変異の位置は、フレームワーク領域内にあると思われるが、ほとんどの非中立的ミスセンス変異の位置は、ＣＤＲ内にあると思われるが、このことは、絶対に必要というわけではない。当業者は、抗原結合活性の変化部分がなく、又は結合活性の変化部分がない（例えば、抗原結合活性の向上、又は抗体特異性の変化）望ましい特性を有する変異分子を設計し、試験することができるだろう。突然変異誘発の後、コードされるタンパク質を通常の方法で発現させることができ、コードされるタンパク質の機能及び／又は生体活性（例えば、α−シヌクレインの少なくとも１つのエピトープの免疫特異的に結合する能力）を本明細書に記載の技術を用い、又は当該技術分野で既知の通常の改変技術によって決定することができる。
（ＩＩＩ．抗体をコードするポリヌクレオチド）
抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドで構成されていてもよく、改変していないＲＮＡ又はＤＮＡ又は改変したＲＮＡ又はＤＮＡであってもよい。例えば、抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖のＲＮＡ、及び一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖であってもよく、又はさらに典型的には、二本鎖、又は一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子であってもよい。それに加え、抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡを両方含む三本鎖領域で構成されていてもよい。抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは、さらに、１つ以上の改変された塩基、又は安定性又は他の理由で改変されたＤＮＡ又はＲＮＡ骨格を含んでいてもよい。「改変された」塩基としては、例えば、トリチル化塩基及び通常にはない塩基、例えばイノシンが挙げられる。種々の改変がＤＮＡ及びＲＮＡに対して行われてもよく、そのため、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的又は代謝的に改変された形態を包含する。
１つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失が、コードされるタンパク質に導入されるように、免疫グロブリンのヌクレオチド配列に１つ以上のヌクレオチド置換、付加又は欠失を導入することによって、免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリンの重鎖部分又は軽鎖部分）から誘導されるポリペプチドの非天然改変体をコードする単離されたポリヌクレオチドを作成することができる。変異を標準的な手順によって、例えば、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲによる突然変異誘発によって導入することができる。保存的なアミノ酸置換は、１つ以上の非必須アミノ酸残基で行われてもよい。
よく知られているように、元々のＢ細胞、ハイブリドーマ細胞から、又は他の形質転換された細胞から標準的な技術によって、例えば、グアニジニウムイソチオシアネート抽出及び沈殿の後、遠心分離又はクロマトグラフィーによってＲＮＡを単離することができる。所望な場合、全ＲＮＡから標準的な技術によって、例えば、オリゴｄＴセルロースによるクロマトグラフィーによってｍＲＮＡを単離することができる。適切な技術は、当該技術分野でありふれた技術である。一実施形態では、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡを、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを用い、よく知られた方法に従って同時又は別個に作ることができる。コンセンサス定常領域プライマーによって、又は公開されている重鎖及び軽鎖のＤＮＡ及びアミノ酸配列に基づいてもっと特異的なプライマーによって、ＰＣＲを開始することができる。上に記載したように、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために、ＰＣＲを使用することもできる。この場合、コンセンサスプライマー又は大きな同種プローブ、例えば、ヒト定常領域プローブによって、ライブラリーをスクリーニングすることができる。
細胞から、当該技術分野で既知の技術を用い、ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡを単離し、詳細に記載する標準的なよく知られた技術に従って、例えば、組み換えＤＮＡ技術に関する上に記載の参考文献にある技術に従って制限マッピングし、並べることができる。もちろん、単離プロセス又はその後の分析中の任意の時点で本発明に従ってＤＮＡを合成することができる。
一実施形態は、アミノ酸配列が、配列番号１５又は配列番号２０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一な免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態は、配列番号１５又は配列番号２０と同一であるか、又は配列番号１５又は配列番号２０に対して１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸置換以外は同一であるＶＨアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態は、重鎖可変領域の少なくとも１つ、２つ又は３つすべてのＣＤＲが、それぞれ配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８によってあらわされるリファレンス重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２又はＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。従って、この実施形態は、それぞれ配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８によってあらわされるアミノ酸配列に関連するＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列が図１に示される、本発明の重鎖可変領域をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態では、本発明は、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３領域が、図１に示されるように、それぞれ配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８によってあらわされるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
さらなる実施形態は、ヒトα−シヌクレインに特異的又は優先的に結合するポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含む、単離された結合分子、例えば、抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。
別の実施形態は、アミノ酸配列が配列番号２２又は配列番号２６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態は、配列番号２２又は配列番号２６と同一であるか、又は配列番号２２又は配列番号２６に対し、１個、２個、３個、４個、５個、又はそれ以上のアミノ酸置換以外は同一であるＶＬアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態は、軽鎖可変領域の少なくとも１つ、２つ又は３つすべてのＶＬ−ＣＤＲが、それぞれ配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５によってあらわされるリファレンス軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２又はＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。従って、この実施形態は、図１に示されるように、それぞれ配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５によってあらわれるアミノ酸配列に関連するＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む本発明の軽鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態では、本発明は、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３領域が、図１に示されるように、それぞれ配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８によってあらわされるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
さらなる実施形態は、ヒトα−シヌクレインに特異的又は優先的に結合するポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含む、単離された結合分子、例えば、抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。
当該技術分野で知られているように、２種類のポリペプチド間又は２種類のポリヌクレオチド間の「配列同一性」は、片方のポリペプチド又はポリヌクレオチドと、第２のポリペプチド又はポリヌクレオチドのアミノ酸配列又は核酸配列を比較することによって決定される。本明細書で記載する場合、任意の特定のポリペプチドが、別のポリペプチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一であることは、当該技術分野で既知の方法及びコンピュータープログラム／ソフトウェア、例えば、限定されないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｕｎｉｘ（登録商標）用Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ ５３７１１）を用いて決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２（１９８１）、４８２〜４８９の局所的なホモロジーアルゴリズムを用い、２つの配列間の最適なホモロジーセグメントを見つけ出す。ＢＥＳＴＦＩＴ又は任意の他の配列整列プログラムを用い、特定の配列が、例えば、本発明のリファレンス配列と９５％同一であるかどうかを決定する場合、もちろん、リファレンスポリペプチド配列の全長にわたって同一性の割合を決定し、リファレンス配列の合計アミノ酸数の５％までのホモロジーギャップを許容するようにパラメーターを設定する。
本発明の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１９又は配列番号２１に記載のＶＨのポリヌクレオチド配列、又は配列番号２７又は配列番号２８に記載のＶＬのポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなる。この観点で、当業者は、軽鎖及び／又は重鎖の可変ドメインを少なくともコードするポリヌクレオチドが、両方の免疫グロブリン鎖又は片方のみの可変ドメインをコードすることができることを簡単に理解するだろう。
本発明は、さらに、本明細書の他の箇所で記載しているように、本発明のポリヌクレオチドのフラグメントを含む。さらに、融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂフラグメント、及び他の誘導体をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載するように、これも本発明であると想定される。
ポリヌクレオチドを当該技術分野で既知の任意の方法によって製造又は製作することができる。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知の場合、抗体をコードするポリヌクレオチドを、化学合成したオリゴヌクレオチドから、例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７（１９９４）２４２に記載されるように組み立てることができ、簡単に言うと、抗体をコードする配列の一部を含む重複するオリゴヌクレオチドを合成し、このオリゴヌクレオチドをアニーリングし、つなぎ、次いで、つないだオリゴヌクレオチドをＰＣＲによって増幅させる。
または、抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体をコードするポリヌクレオチドを、適切な供給源に由来する核酸から作成することができる。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンが入手できないものの、その抗体分子の配列が知られている場合、その抗体をコードする核酸を化学的に合成するか、又は適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、又はこれから作られるｃＤＮＡライブラリー、又は核酸、例えば、ｐｏｌｙＡ＋ ＲＮＡ、これから単離されたもの、α−シヌクレインに特異的な抗体を発現する任意の組織又は細胞、例えば、抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞）から、その配列の３’末端及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、又は、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを特定する特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローニングすることによって得ることができる。次いで、ＰＣＲによって作られる増幅された核酸を、当該技術分野で既知のよく知られた任意の方法によって、複製可能なクローニングベクター内にクローニングすることができる。
その抗体のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体が決定されると、そのヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列を操作するための当該技術分野でよく知られた方法を用いて、例えば、組み換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、全体として参照により組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９８）に記載されている技術）を用いて操作し、例えば、アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を作成し、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作成することができる。
（ＩＶ．抗体ポリペプチドの発現）
本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を得るために、単離された遺伝子材料を操作した後、抗体をコードするポリヌクレオチドは、典型的には、所望な量の抗体を産生するために用いることができる宿主細胞に導入するために、発現ベクターに挿入される。抗体、又はそのフラグメント、誘導体又はアナログ、例えば、標的分子に結合する抗体の重鎖又は軽鎖の組み換え発現について、本明細書に記載する。本発明の抗体分子又は抗体の重鎖又は軽鎖、又はその一部（例えば、重鎖又は軽鎖の可変ドメインを含む）をコードするポリヌクレオチドが得られたら、抗体分子を産生するためのベクターを、当該技術分野でよく知られている技術を用い、組み換えＤＮＡ技術によって製造することができる。従って、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含むポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を調製する方法を本明細書に記載する。当業者によく知られている方法を用い、抗体コード配列及び適切な転写及び翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結する本発明の抗体分子、又はその重鎖又は軽鎖、又は重鎖又は軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよく（例えば、国際出願第ＷＯ ８６／０５８０７号及びＷＯ
８９／０１０３６号；及び米国特許第５，１２２，４６４号）、抗体の可変ドメインを、重鎖又は軽鎖全体を発現するようなベクター内にクローニングすることができる。
「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、望ましい遺伝子を宿主細胞に導入し、発現させるための賦形剤として本発明で使用されるベクターを意味するために本明細書で用いられる。当業者に知られているように、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス及びレトロウイルスからなる群から選択することができる。一般的に、本発明と適合するベクターは、選択マーカー、望ましい遺伝子のクローニングを促進し、真核細胞又は原核細胞に入り込み、及び／又は複製する能力を促進するのに適切な制限部位を含むだろう。本発明の目的のために、多くの発現ベクター系を使用することができる。例えば、ある種類のベクターは、動物ウイルス、例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ又はＭＯＭＬＶ）又はＳＶ４０ウイルスから誘導されるＤＮＡエレメントを利用する。その他のベクターは、内部リボソーム結合部位を含むポリシストロニックの使用を含む。さらに、形質転換された宿主細胞を選択することができる１つ以上のマーカーを導入することによって、ＤＮＡを染色体に組み込んだ細胞を選択することができる。このマーカーは、栄養要求性であり、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）又は銅のような重金属への耐性がある宿主の原型を与えることができる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ配列に直接接続していてもよく、又は、同じ細胞に一緒に形質転換することによって導入してもよい。ｍＲＮＡの最適な合成のために、さらなるエレメントを加えることもできる。これらのエレメントは、シグナル配列、スプライスシグナル、及び転写プロモーター、エンハンサー、及び停止シグナルを含んでいてもよい。
特定の実施形態では、クローン化された可変領域遺伝子を、上述のように重鎖及び軽鎖の定常領域の遺伝子（例えば、ヒト）とともに発現ベクターに挿入する。一実施形態では、この挿入は、米国特許第６，１５９，７３０号に開示され、ＮＥＯＳＰＬＡと呼ばれるＢｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．の独占所有権のある発現ベクターを用いて行う。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、そのマウスβグロビンメジャープロモーター、ＳＶ４０由来の複製、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのエキソン１及びエキソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子及びリーダー配列を含む。このベクターは、可変領域及び定常領域の遺伝子を組み込み、ＣＨＯ細胞内で形質転換した後、Ｇ４１８含有培地内で選択し、メトトレキサート増幅を行うと、非常に高いレベルで抗体を発現することがわかっている。もちろん、真核細胞内で発現を誘発することができる任意の発現ベクターを本発明で使用することができる。適切なベクターの例としては、限定されないが、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、及びｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡから入手可能）、及びプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩから入手可能）を挙げることができる。一般的に、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が、例えば、ロボットシステムによる実行可能な通常の実験である場合、適切に高いレベルで発現するために、大量の形質転換された細胞をスクリーニングすること。ベクターシステムは、米国特許第５，７３６，１３７号及び第５，６５８，５７０号に教示されており、それぞれ、全体として参照により組み込まれる。このシステムは、例えば、３０ｐｇ／細胞／日を超える高い発現レベルを与える。他の例示的なベクターシステムは、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
他の実施形態では、本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、全体として参照により組み込まれる米国特許出願第２００３−０１５７６４１ Ａ１号に開示されているようなポリシストロニック構築物を用いて発現させることができる。これらの発現系では、目的の複数の遺伝子産物、例えば、抗体の重鎖及び軽鎖を１種類のポリシストロニック構築物から製造することができる。これらの系は、有利なことに、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を使用し、抗体を比較的高レベルで与えることができる。適合するＩＲＥＳ配列は、米国特許第６，１９３，９８０号に開示されており、参照により組み込まれる。当業者は、本出願に開示する抗体の全範囲を効果的に産生するこのような発現系を使用することができることを理解するだろう。
さらに一般的に、抗体のモノマーサブユニットをコードするベクター又はＤＮＡ配列を調製したら、発現ベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者がよく知っている種々の技術によって達成することができる。これらの技術としては、限定されないが、例えば、Ｆｕｇｅｎｅ又はリポフェクタミンを用いたリポトランスフェクションを含む形質転換、プロトプラスト融合、リン酸カルシウムによる沈降、エンベロープＤＮＡを用いた細胞融合、マイクロインジェクション、及びインタクトなウイルスを用いた感染が挙げられる。典型的には、宿主へのプラスミドの導入は、標準的なリン酸カルシウムによる共沈降法による。発現構築物を含む宿主細胞を、軽鎖及び重鎖を産生するのに適した条件下で成長させ、重鎖及び／又は軽鎖のタンパク質合成についてアッセイする。例示的なアッセイ技術としては、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、又は蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが挙げられる。
従来の技術によって発現ベクターを宿主細胞に移し、次いで、形質転換した細胞を従来の技術によって培養し、本明細書に記載する方法で使用するための抗体を製造する。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結した、本発明の抗体、又はその重鎖又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二本鎖抗体を発現させるために、重鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターを、以下に詳細に記載するように、免疫グロブリン分子全体を発現させるために宿主細胞に挿入することができる。
宿主細胞を本発明の２種類の発現ベクターを用いて一緒に形質転換することができ、第１のベクターは、重鎖から誘導されるポリペプチドをコードし、第２のベクターは、軽鎖から誘導されるポリペプチドをコードする。この２種類のベクターは、重鎖及び軽鎖のポリペプチドを同等に発現することができる同一の選択可能なマーカーを含んでいてもよい。又は、重鎖及び軽鎖のポリペプチドを両方ともコードする１種類のベクターを使用することができる。このような状況で、軽鎖は、有利には、毒性のない過剰な重鎖を避けるために、重鎖の前に配置される。Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２（１９８６）、５２；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）、２１９７を参照こと。重鎖及び軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含んでいてもよい。
本明細書で使用する場合、「宿主細胞」は、組み換えＤＮＡ技術を用い、少なくとも１つの異種遺伝子をコードして構築したベクターを内包する細胞を指す。組み換え宿主から抗体を単離するプロセスに関する記載において、「細胞」及び「細胞培養物」という用語は、他の意味であると明記されていない限り、抗体の供給源を示すために相互に置き換え可能に用いられる。言い換えると、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠沈した全細胞から、又は培地と懸濁した細胞を両方とも含む細胞培養物からの回収を意味していてもよい。
種々の宿主−発現ベクターを利用し、本明細書に記載する方法で使用するための抗体分子を発現させることができる。このような宿主−発現系は、目的のコード配列を産生することができ、その後に、精製することができる賦形剤をあらわすだけではなく、適切なヌクレオチドコード配列を用いて形質転換又は導入する場合、本発明の抗体分子を系内で発現させることができるような細胞をあらわす。これらの系としては、限定されないが、抗体コード配列を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された菌類（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体コード配列を含む組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コード配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染した昆虫細胞系；組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染した植物細胞系、抗体コード配列を含む組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；又は哺乳動物細胞（例えば、メタロチオネインプロモーター）のゲノムから誘導したか、又は哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター）から誘導したプロモーターを含む組み換え発現構築物を収容する、哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられる。細菌性細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、又は真核細胞、特に、全組み換え抗体分子を発現するための細胞を、組み換え抗体分子の発現のために使用する。例えば、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ヒトサイトメガロウイルスから得た主要前初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わせることが、抗体の有効な発現系であり、例えば、Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ ４５（１９８６）、１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８（１９９０）、２を参照のこと。
タンパク質発現のために使用する宿主細胞系は、哺乳動物由来であることが多い。当業者は、本明細書で発現すべき望ましい遺伝子産物に最も適している特定の宿主細胞系を決定する能力があると考えている。例示的な宿主細胞系としては、限定されないが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０ Ｔ抗原を用いたＣＶＩの誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）及び２９３（ヒト腎臓）が挙げられる。宿主細胞系は、典型的には、商業的な供給源、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ又は公開された文献から入手可能である。
それに加え、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調整し、又は望ましい特定の様式になるように遺伝子産物を改変し、処理するように選択することができる。タンパク産物のこのような改変（例えば、グリコシル化）及び処理（例えば、開裂）は、タンパク質の機能にとって重要な場合がある。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後の処理および改変のための特徴的で特定の機構を有している。発現する外来タンパク質を正しく改変し、処理するように、適切な細胞系又は宿主系を選択することができる。この目的で、一次転写物の適切な処理、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。
長期間にわたって、組み替えタンパク質を高収率で産生し、安定に発現するものを用いる。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞系を遺伝子操作することができる。ウイルス由来の複製を含む発現ベクターを用いるのではなく、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）及び選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡを用いて形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後、遺伝子操作された細胞を、例えば、栄養が豊富な培地中、例えば、１〜２日間成長させ、次いで、選択的な培地に変える。組み換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞は、プラスミドを染色体に安定に組み込み、成長させ、次いで、クローニングし、細胞系へと増やすことができる。有利には、抗体分子を安定に発現する細胞系を遺伝子操作するために、この方法を用いることができる。
多くの選択系を使用することができる。限定されないが、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ １１（１９７７）、２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８（１９９２）、２０２）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ２２（１９８０）、８１７）遺伝子を、それぞれ、ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞又はａｐｒｔ細胞で使用することができる。さらに、以下の遺伝子について、代謝拮抗物質に対する耐性を選択の基礎として用いることができる。メトトレキサートへの耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７７（１９８０）、３５７；Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８（１９８１）、１５２７）；ミコフェノール酸への耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８（１９８１）、２０７２）；アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を与えるｎｅｏ、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２（１９９３）、４８８〜５０５；Ｗｕ及びＷｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３（１９９１）、８７〜９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２（１９９３）、５７３〜５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０（１９９３）、９２６〜９３２；及びＭｏｒｇａｎ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２（１９９３）、１９１〜２１７；ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（１９９３）、１５５〜２１５；及びハイグロマイシンへの耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ ３０（１９８４）、１４７。使用可能な組み換えＤＮＡ技術の分野で一般的に知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編集）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）；及びＣｈａｐｔｅｒｓ １２及び１３、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（編集）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されており、これらは、全体として参照により組み込まれる。
抗体分子の発現レベルは、ベクターの増幅によって高めることができ、総説として、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ及びＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｖｏｌ．３．（１９８７）を参照のこと。抗体を発現するベクター系の中でマーカーを増幅させることが可能な場合、阻害レベルの増大、又は宿主細胞培養物中の存在は、マーカー遺伝子の複製数を増やすだろう。増幅した領域が抗体遺伝子と関係があるため、抗体の産生も増えるだろう。Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３（１９８３）、２５７を参照のこと。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの産生は、大量の望ましいポリペプチドを得るためにスケールアップすることができる。組織培養条件での哺乳動物細胞培養の技術は、当該技術分野で知られており、例えば、エアリフトリアクター内又は連続攪拌リアクター内での均質な懸濁培養物、又は例えば、中空繊維内、マイクロカプセル内、アガロースマイクロビーズ上、又はセラミックカートリジ上に固定されるか、又は捕捉された細胞培養物を含む。必要な場合、及び／又は所望な場合、例えば、本明細書に記載する合成ヒンジ領域ポリペプチドを優先的に生合成した後、又はその後のＨＩＣクロマトグラフィーの前に、通常のクロマトグラフィー方法によって、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロース上のクロマトグラフィー又は免疫アフィニティクロマトグラフィー、ポリペプチドの溶液を精製することができる。
本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体をコードする遺伝子を、非哺乳動物細胞内で、例えば、細菌又は昆虫細胞又は酵母又は植物細胞内で発現させることもできる。核酸を容易に取り込む細菌としては、腸内細菌、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株；Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ； Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの群が挙げられる。さらに、細菌中で発現する場合、異種ポリペプチドは、典型的には、封入体の一部となることが理解されるだろう。異種ポリペプチドは、単離し、精製し、次いで、機能性分子になるように並べなければならない。四価形態の抗体が望ましい場合、サブユニットが四価抗体へと自己整列するだろう。例えば、国際出願第ＷＯ０２／０９６９４８号を参照のこと。
細菌系では、有利には、発現する抗体分子のために意図した使用に依存して、多くの発現ベクターを選択することができる。例えば、多量のこのようなタンパク質を産生すべき場合、抗体分子の医薬組成物を作製するために、簡単に精製される高レベルの融合タンパク産物の発現に向かうベクターを使用してもよい。このようなベクターとしては、限定されないが、融合タンパク質が精製するように、抗体コード配列を、個々に、ｌａｃＺコード領域を含むベクターにフレーム内で結合することができる、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．２（１９８３）、１７９１）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（１９８５）、３１０１〜３１０９；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４（１９８９）、５５０３〜５５０９）などが挙げられる。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を用い、融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するｐＧＥＸベクターを使用することもできる。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、蓄積によって、溶解した細胞から簡単に精製し、グルタチオン−アガロースビーズのマトリックスに結合させた後、遊離グルタチオン存在下、溶出させることができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から放出することができるように、トロンビン又は因子Ｘａのプロテアーゼ開裂部位を含むように設計される。
原核生物に加え、真核微生物を使用してもよい。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、又は一般的なパン用イーストは、真核微生物の中で最も一般的に用いられるが、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような多くの他の株が一般的に利用可能である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓでの発現のために、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ２８２（１９７９）、３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ ７（１９７９）、１４１；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ １０（１９８０）、１５７）が一般的に用いられる。このプラスミドは、トリプトファン中で成長する能力がない変異酵母株のための選択マーカーを与えるＴＲＰ１遺伝子をすでに含んでおり、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６又はＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５（１９７７）、１２）である。次いで、この酵母の宿主細胞ゲノムに特徴的なｔｒｐｌ病変の存在は、トリプトファンが存在しない状態での成長による形質転換を検出するのに有効な環境を与える。
昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、典型的には、外来遺伝子を発現させるベクターとして用いられる。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で成長する。この抗体コード配列を、このウイルスの非必須領域（例えば、ポリへドリン遺伝子）内に個々にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
本発明の抗体分子が組み換えによって発現すると、本発明の全抗体、そのダイマー、個体の軽鎖及び重鎖、又は他の免疫グロブリンを当該技術分野の標準的な手順に従って、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、特に、タンパク質Ａの後の特異的な抗原のためのアフィニティによる、及びサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、異なる可溶性、例えば、硫酸アンモニウムによる沈降、又はタンパク質を精製するための任意の他の標準的な技術によって精製することができる。例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照のこと。または、本発明の抗体の親和性を高める方法は、米国特許公開第２００２−０１２３０５７ Ａ１号に開示されている。
（Ｖ．融合タンパク質及び接合体）
特定の実施形態では、抗体ポリペプチドは、通常は抗体と会合しないアミノ酸配列又は１つ以上の部分を含む。例示的な改変について、以下にさらに詳細に記載する。例えば、ある実施形態では、本発明の一本鎖ｆｖ抗体フラグメントは、可撓性のリンカー配列を含んでいてもよく、又は機能性部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素、又は標識、例えば、蛍光、放射活性物質、酵素、核磁気、重金属など）を付加するように改変することができる。
特定の実施形態では、本発明の抗体ポリペプチドは、融合タンパク質を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなる。融合タンパク質は、例えば、免疫グロブリンα−シヌクレインに結合するドメインと、少なくとも１つの標的に結合する部位、及び少なくとも１つの異種部分、すなわち、天然では通常は接続しない部分とを含むキメラ分子である。アミノ酸配列は、通常は、一緒になって融合ポリペプチドを生じる別個のタンパク質中に存在していてもよく、又は、アミノ酸配列は、通常は、融合ポリペプチド中の新しい配置の中に配置される同じタンパク質中に存在していてもよい。例えば、化学合成によって、又はペプチド領域が望ましい関係でコードされるポリヌクレオチドを作成し、翻訳することによって、融合タンパク質を作成することができる。
「異種」という用語は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに適用される場合、そのポリヌクレオチド又はポリペプチドが、比較対象の全体の残りの物とは別個の物から誘導されることを意味する。例えば、本明細書で使用する場合、抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又はアナログに融合すべき「異種ポリペプチド」は、同じ種の非免疫グロブリンポリペプチド、又は異なる種の免疫グロブリン又は非免疫グロブリンポリペプチドから誘導される。
本明細書の他の箇所でさらに詳細に記載するように、本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を、さらに、Ｎ末端又はＣ末端で異種ポリペプチドと組み換えによって融合することができ、又はポリペプチド又は他の組成物に化学的に接合させることができる（共有結合性及び非共有結合性の接合を含む）。例えば、抗体を、検出アッセイでの標識として有用な分子、及びエフェクター分子、例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、又は毒素に対し、組み換えによって融合又は接合することができる。例えば、国際出願第ＷＯ９２／０８４９５号；ＷＯ９１／１４４３８号；ＷＯ８９／１２６２４号；米国特許第５，３１４，９９５号；及び欧州特許出願第ＥＰ ０ ３９６
３８７号を参照のこと。
本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、ペプチド結合又は改変されたペプチド結合、すなわち、ペプチド同配体によって互いに接続したアミノ酸で構成されていてもよく、２０の遺伝子でコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。抗体を天然プロセスによって、例えば、翻訳後の処理によって、又は当該技術分野でよく知られている化学修飾技術によって改変してもよい。このような改変は、基本的な文書及びさらに詳細な専門論文、及び膨大な研究文献に十分に記載されている。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ末端又はカルボキシル末端、又は炭水化物のような部分を含め、抗体のどこでも起こり得る。同じ種類の改変が、所与の抗体のいくつかの部位に同程度又は異なる程度で存在していてもよいことが理解されるだろう。また、所与の抗体は、多くの種類の改変を含んでいてもよい。抗体は、例えば、ユビキチン化の結果として分岐していてもよく、抗体は、環状であってもよく、分岐があってもよく、分岐がなくてもよい。環状抗体、分岐抗体、及び分岐した環状抗体は、天然の翻訳後プロセスから得ることができ、又は合成方法によって作ることができる。改変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合による接続、ヘム部分の共有結合による接続、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合による接続、脂質又は脂質誘導体の共有結合による接続、ホスホチジルイノシトールの共有結合による接続、交差接続、環化、ジスルフィド結合生成、脱メチル化、共有結合性の架橋生成、システインの生成、ピログルタメートの生成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー生成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、トランスファー−ＲＮＡが介在する、タンパク質に対するアミノ酸の付加、例えば、アルギニル化、及びユビキチン化が挙げられる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２ｎｄ Ｅｄ．、（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１〜１２ページ（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２（１９９０）、６２６〜６４６；Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３（１９９２）、４８〜６２）を参照のこと。
本発明は、さらに、抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体と、異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体のＶＨ配列のいずれか１つのアミノ酸配列又は本発明の抗体のＶＬ領域のいずれか１つのアミノ酸配列、又はそのフラグメント又は改変体を含むポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなる。別の実施形態では、本明細書に開示する診断方法及び治療方法で使用する融合タンパク質は、ある抗体のＶＨ−ＣＤＲのいずれか１つ、２つ、３つのアミノ酸配列、又はそのフラグメント、改変体、又は誘導体、又はある抗体のＶＬ−ＣＤＲのいずれか１つ、２つ、３つのアミノ酸配列、又はそのフラグメント、改変体、又は誘導体を含むポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなる。一実施形態では、融合タンパク質は、本発明の抗体のＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列、又はそのフラグメント、誘導体、又は改変体を含むポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含み、融合タンパク質は、α−シヌクレインに特異的に結合する。別の実施形態では、融合タンパク質は、本発明の抗体の少なくとも１つのＶＨ領域のアミノ酸配列及び本発明の抗体の少なくとも１つのＶＬ領域のアミノ酸配列、又はそのフラグメント、誘導体又は改変体を含むポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含む。ある実施形態では、融合タンパク質のＶＨ領域及びＶＬ領域は、α−シヌクレインに特異的に結合する１種類の供給源となる抗体（又はｓｃＦｖフラグメント又はＦａｂフラグメント）に対応する。さらに別の実施形態では、本明細書に開示する診断方法及び治療方法で使用する融合タンパク質は、ある抗体のＶＨ ＣＤＲのいずれか１つ、２つ、３つ又はそれ以上のアミノ酸配列、及びある抗体のＶＬ ＣＤＲのいずれか１つ、２つ、３つ又はそれ以上のアミノ酸配列、又はそのフラグメント、改変体を含むポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含む。特定の実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ又はＶＬ−ＣＤＲのうち、２個、３個、４個、５個、６個又はそれ以上は、本発明の１種類の供給源となる抗体（又はｓｃＦｖフラグメント又はＦａｂフラグメント）に対応する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子も、本発明に包含される。
文献に報告された例示的な融合タンパク質としては、Ｔ細胞受容体の融合物（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４（１９８７）、２９３６〜２９４０；ＣＤ４の融合物（Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３３７（１９８９）、５２５〜５３１；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３３９（１９８９）、６８〜７０；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ ｅｔ ａｌ．、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ ９（１９９０）、３４７〜３５３；及びＢｙｒｎ
ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３４４（１９９０）、６６７〜６７０）；Ｌ−セレクチンの融合物（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０（１９９０）、２２２１〜２２２９；及びＷａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３４９（１９９１）、１６４〜１６７）；ＣＤ４４の融合物（Ａｒｕｆｆｏ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ６１（１９９０）、１３０３〜１３１３）；ＣＤ２８及びＢ７の融合物（Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３（１９９１）、７２１〜７３０）；ＣＴＬＡ−４の融合物（Ｌｉｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４（１９９１）、５６１〜５６９）；ＣＤ２２の融合物（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ６６（１９９１）、１１３３〜１１４４）；ＴＮＦ受容体の融合物（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８（１９９１）、１０５３５〜１０５３９；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ ｅｔ
ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１９９１）、２８８３〜２８８６；及びＰｅｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４（１９９１）、１４８３〜１４８９（１９９１）；及びＩｇＥ受容体の融合物（Ｒｉｄｇｗａｙ及びＧｏｒｍａｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５（１９９１）、Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．１４４８）が挙げられる。
本明細書の他の箇所に記載するように、ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期を長くするため、又はイムノアッセイで用いるために、本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を、異種ポリペプチドに融合し、当該技術分野で既知の方法を用いることができる。例えば、一実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を長くするために、ＰＥＧを、本発明の抗体に接合することができる。例えば、Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６（２００１）、１０６〜１１９；Ａｄｖ．ｉｎ Ｄｒｕｇ
Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４（２００２）、５３１；又はＷｅｉｒ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ３０（２００２）、５１２を参照のこと。
さらに、精製又は検出を促進するために、本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を、マーカー配列、例えばペプチドに融合することができる。特定の実施形態では、マーカーのアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（ＨＩＳ）であり、例えば、特に、ｐＱＥベクターで与えられるタグ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ．、９１３１１）であり、その多くは市販されている。Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）、８２１〜８２４に記載されているように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を与える。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定されないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質から誘導されるエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ３７（１９８４）、７６７）及び「ｆｌａｇ」タグが挙げられる。
融合タンパク質を当該技術分野でよく知られている方法を用いて調製することができる。例えば、米国特許第５，１１６，９６４号及び第５，２２５，５３８号を参照のこと。融合が行われる正確な部位は、融合タンパク質の分泌又は結合の特徴を最適化するように実験的に選択することができる。次いで、融合タンパク質をコードするＤＮＡを、発現のために宿主細胞に形質転換する。
本発明の抗体を接合していない形態で使用してもよく、又は、例えば、少なくとも１つの種々の分子の治療特性を高めるため、標的の検出を容易にするため、又は患者のイメージング又は治療のために、少なくとも１つの種々の分子と接続してもよい。本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を、精製の前又は後に、精製を行うときに、標識化してもよく、又は接合してもよい。特に、本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を、治療薬剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調整剤、医薬品、又はＰＥＧに接続してもよい。
従来の抗体を含む免疫毒性である接合体は、当該技術分野で広く記載されてきた。従来のカップリング技術によって毒素を抗体にカップリングすることができ、又はタンパク質毒素部分を含む免疫毒素を融合タンパク質として製造することができる。本発明の抗体を、このような免疫毒素を得るための対応する様式で使用することができる。このような免疫毒素の具体例は、Ｂｙｅｒｓ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（１９９１）、５９〜７０及びＦａｎｇｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １２（１９９１）、５１〜５４に記載されるものが挙げられる。
接合されるように選択した薬剤に依存して、種々の技術を用い、接合体を並べることもできることを当業者は理解するだろう。例えば、α−シヌクレインに結合するポリペプチドを、ビオチンの活性化エステル、例えば、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることによって、例えば、ビオチンを含む接合体を調製する。同様に、例えば、本明細書に列挙するようなカップリング剤存在下、又はイソチオシアネート、例えば、フルオレセイン−イソチオシアネートとの反応によって、蛍光マーカーを含む接合体を調製することができる。本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体の接合体を類似の様式で調製する。
本発明は、さらに、診断薬剤又は治療薬剤と接合した本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を包含する。例えば、臨床試験手順の一部として、例えば、神経疾患の存在を示すため、神経疾患を生じる危険性を示すため、神経疾患、すなわち、シヌクレイン病の発生又は進行を監視し、例えば、所与の治療及び／又は予防計画の有効性を決定するために、抗体を診断に用いることができる。抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を、検出可能な基質にカップリングすることによって、検出を容易にすることができる。検出可能な基質の例としては、種々の酵素、人工装具群、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、種々の陽電子発光トモグラフィーを用いる陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられ、例えば、本発明の診断薬として試用するための抗体に接合可能な金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適切な人工装具群の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、適切な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオロセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリトリンが挙げられ、発光材料の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ、適切な放射性材料の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ又は９９Ｔｃが挙げられる。
抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を、化学発光化合物にカップリングすることによって、検出可能なように標識化することもできる。次いで、一連の化学反応中に生じる発光の存在を検出することによって、化学発光タグ化抗体の存在を決定する。特に有用な化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、着色アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが挙げられる。
抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を検出可能なように標識化する様式の１つは、酵素に接続し、接続した生成物を酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）に用いることによるものである（Ｖｏｌｌｅｒ、Ａ．、「Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ ２（１９７８）、１〜７）；Ｖｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１（１９７８）、５０７〜５２０；Ｂｕｔｌｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（１９８１）、４８２〜５２３；Ｍａｇｇｉｏ、Ｅ．（編集）、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９８０）；Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｅ．ｅｔ ａｌ．（編集）、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｋｇａｋｕ Ｓｈｏｉｎ、Ｔｏｋｙｏ（１９８１）。抗体に結合する酵素を、例えば、分光測定手段、蛍光分析手段又は視覚的な手段によって、検出可能な化学部分を製造するような様式で、適切な基材、例えば、発色基材と反応させる。抗体を検出可能なように標識化するために用いることが可能な酵素としては、限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。さらに、酵素のための発色基質を使用する比色分析方法によって検出を行うことができる。同様に調製した標準と比較して、基質の酵素反応の程度を視覚的に比較することによって、検出を行うこともできる。
任意の種々の他のイムノアッセイを用いて検出を行うこともできる。例えば、抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を放射性標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用によって抗体を検出することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｂ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ、（３月、１９８６年）を参照）、全体として参照により組み込まれる）。限定されないが、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、又はオートラジオグラフィーを含む手段によって放射性同位体を検出することができる。
抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を、１５２Ｅｕのような蛍光発光金属又はその他のランタニドシリーズを用いることによって、検出可能なように標識化することもできる。ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート化群を用いることによって、これらの金属を抗体に接続することができる。
抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体に対し、種々の部分を接合するための技術は、よく知られている。例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（編集）、ｐｐ．２４３〜５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（編集）、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ｐｐ．６２３〜５３（１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（編集）、ｐｐ．４７５〜５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｒｅｓｕｌｔｓ、Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（編集）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．３０３〜１６（１９８５）、及びＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２（１９８２）、１１９〜１５８を参照のこと。
上述のように、特定の実施形態では、結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、抗体又はその免疫特異的なフラグメントの安定性又は有効性を高める部分を接合してもよい。例えば、一実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を長くするために、ＰＥＧを、本発明の結合分子に接合することができる。Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６（２００１）、１０６；Ａｄｖ．ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４（２００２）、５３１；又はＷｅｉｒ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ３０（２００２）、５１２を参照のこと。
（ＶＩ．組成物及び使用方法）
本発明は、本発明の上述のα−シヌクレイン結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント又はその誘導体又は改変体、又は本発明のポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を含む組成物に関する。本発明の組成物は、さらに、医薬的に許容される担体を含んでいてもよい。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図する用途に依存して、インターロイキン又はインターフェロンのようなさらなる薬剤を含んでいてもよい。例えば、パーキンソン病の治療において使用するために、さらなる薬剤は、有機低分子、抗−α−シヌクレイン抗体、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。従って、一実施形態では、本発明は、本発明のα−シヌクレイン結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント、又はこれらいずれか１つと実質的に同じ結合特異性を有する結合分子、シヌクレイン病の予防的処置及び治療的処置のため、被検体において、シヌクレイン病の進行又はシヌクレイン病の治療に対する反応を監視するため、又は被検体がシヌクレイン病を発症する危険性を決定するための、医薬用組成物又は診断用組成物を調製するための本発明のポリヌクレオチド、ベクター又は細胞の使用に関する。
従って、一実施形態では、本発明は、それぞれ脳及び中枢神経系におけるα−シヌクレインの異常な蓄積及び／又は堆積を特徴とする神経障害を治療する方法に関し、この方法は、治療に有効な量の本発明の抗−α−シヌクレイン結合分子、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を、これらを必要とする被検体に投与することを含む。特定の実施形態では、ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１又はそのフラグメント、改変体又は誘導体を送達する。「神経障害」との用語は、限定されないが、シヌクレイン病、例えば、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）を含む。特に明記しない限り、神経変性、神経学的、又は神経精神病学との用語は、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。
本発明の治療手法の具体的な利点は、本発明の抗体が、パーキンソニズムの徴候がない高齢者被検体から得たＢ細胞又はＢ記憶細胞から誘導され、従って、特定の可能性がある状態で、臨床的に明らかなシヌクレイン病を効果的に防ぐことができ、又は臨床的に明らかな疾患が発生する危険性を減らし、又は、臨床的に明らかな疾患の発症又は進行を遅らせることができるという事実にある。典型的には、本発明の抗体は、体細胞での成熟、すなわち、抗体の可変領域が体細胞での変動において、標的であるα−シヌクレイン分子に対する高い親和性の結合における選択性及び有効性の観点での最適化によってすでに上手くいっている。
このような細胞が、自己免疫反応又はアレルギー反応という観点で、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、ヒトにおいて、関連する生理学的タンパク質又は他の生理学的タンパク質又は細胞構造によっては活性化しないという知識も、臨床試験段階にわたって首尾良く生存する機会がかなり増加することを示すため、医学的な重要性が非常に高い。いわば、少なくとも１人のヒト被検体において、予防的又は治療的な抗体の前臨床及び臨床での開発の前に、有効性、受容性及び忍容性がすでに示されている。従って、本発明のヒト抗−α−シヌクレイン抗体は、治療薬剤として標的構造に特異的な有効性と、副作用の可能性の低下により、臨床的に成功する可能性が顕著に高いと予測することができる。
本発明は、さらに、それぞれ、例えば、本発明の抗−α−シヌクレイン抗体、その結合フラグメント、誘導体又は改変体、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞といった上述の１つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含む医薬用及び診断用のパック又はキットも提供する。このような容器に、製造を規制する政府機関によって処方される形態、医薬品又は生化学製品の使用又は販売に関する注意書きが添付されていてもよく、この注意書きは、ヒトに投与するための製造、使用又は販売に関する機関による承認を反映している。これに加えて、又はこれに代えて、キットは、適切な診断アッセイで使用するための試薬及び／又は指示書を含む。本発明の組成物、例えばキットは、もちろん、特に、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）を治療するのに適用可能な、α−シヌクレインの存在を伴う障害の危険性評価、診断、予防及び治療に特に適している。
本発明の医薬組成物を当該技術分野でよく知られている方法に従って配合することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （２０００） ｂｙ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＩＳＢＮ ０−６８３−３０６４７２を参照のこと。適切な医薬担体の例は、当該技術分野でよく知られており、リン酸緩衝化生理食塩水溶液、水、エマルション、例えば、油／水エマルション、種々の種類の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。このような担体を含む組成物を、よく知られた従来の方法によって配合することができる。これらの医薬組成物を適切な投薬量で被検体に投与することができる。適切な組成物の投与は、異なる様式で、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経鼻、局所又は皮内投与又は脊髄又は脳への送達によって行うことができる。エアロゾル製剤、例えば、経鼻スプレー製剤は、活性薬剤と防腐剤及び等張性薬剤の精製した水溶液又は他の溶液を含む。このような製剤を、鼻粘膜と適合するｐＨ及び等張状態に調節することができる。直腸投与又は膣投与のための製剤は、適切な担体を含む坐剤として存在していてもよい。
さらに、本発明が、（幸運なことに頻繁ではないが）頭蓋骨に小さな穴をドリルによって開け、本発明の薬物を投与する新しい標準的な手順を含む一方、一態様では、本発明の結合分子、特に、抗体又は抗体に基づく薬物が、血液−脳関門を通過することができ、静脈投与又は経口投与が可能である。
投薬計画は、主治医及び臨床因子によって決定されるだろう。医学分野でよく知られているように、任意の１人の患者に対する投薬量は、患者の大きさ、体の表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与時間及び投与経路、全体的な健康状態、及び同時に投与される他の薬物を含む多くの因子によって変わる。非蛍光投与のための調製物としては、滅菌の水系又は非水系の溶液、懸濁物、エマルションが挙げられる。非水系溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水系担体としては、食塩水及び緩衝化媒体を含め、水、アルコール系／水系の溶液、エマルション又は懸濁物が挙げられる。非経口賦形剤としては、塩化ナトリウム溶液、Ｒｉｎｇｅｒデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化Ｒｉｎｇｅｒ、又は固定化油が挙げられる。静脈内賦形剤としては、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤（例えば、Ｒｉｎｇｅｒデキストロースに基づくもの）などが挙げられる。また、防腐剤、及び例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、及び不活性気体などの他の添加剤が存在してもよい。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図する用途に依存して、ドーパミン又は精神薬理学的な薬物を含むさらなる薬剤を含んでいてもよい。
さらに、例えば、受動免疫化のために、本発明の医薬組成物が、抗−α−シヌクレイン抗体、又はその結合フラグメント、誘導体又は改変体を含む場合に、医薬組成物をワクチンとして配合してもよい。背景の章で述べたように、α−シヌクレインのオリゴマー種は、血漿及びＣＳＦにおいて細胞外で報告されており（Ｅｌ−Ａｇｎａｆ ｅｔ ａｌ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０（２００６）、４１９〜４２５）、マウスパーキンソン病モデルにおける受動免疫化試験は、α−シヌクレインに対する細胞外マウスモノクローナル抗体が、細胞内α−シヌクレイン凝集物の蓄積を減らすことができることを示している（Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ、４６（２００５）、８５７〜８６８）。従って、本発明のヒト抗−α−シヌクレイン抗体及び等価なα−シヌクレイン結合分子が、ＰＤ、ＤＬＢ及びＭＳＡのようなシヌクレイン病を予防又は改善するためのワクチンとして特に有用かどうかを予測するのは軽々しくは行えない。
一実施形態では、細胞膜を簡単に透過し得る本発明の抗体の組み換えＦａｂ（ｒＦａｂ）及び一本鎖フラグメント（ｓｃＦｖｓ）を使用することが有益である。例えば、前もってオンラインで公開されたＲｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２００８）Ｏｃｔ １６；Ｓ１７４１〜０１３４は、ＡβのＮ末端領域においてエピトープを認識するモノクローナル抗体ＷＯ−２のキメラ組み換えＦａｂ（ｒＦａｂ）及び一本鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）の使用を記載している。遺伝子操作されたフラグメントは、（ｉ）アミロイドの原線維化を予防することができ、（ｉｉ）すでに生成したＡβ１〜４２原線維を分解することができ、（ｉｉｉ）全ＩｇＧ分子と同様に効果的にＡβ１〜４２オリゴマーが介在するｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経毒性を阻害することができる。影響又は機能を失った小さなＦａｂ及びｓｃＦｖの遺伝子操作された抗体の形態を用いるときの認識される利点としては、血液−脳関門をもっと効果的に通ること、引き金となる炎症性副反応の危険性を最低限にすることが挙げられる。さらに、ｓｃＦｖ及び１種類のドメイン抗体が、全長抗体の結合特異性を保持すること以外に、これらの抗体は、１種類の遺伝子として、細胞内抗体として哺乳動物細胞内で細胞内発現させることができ、これらの標的の折り畳み、相互作用、改変又は細胞内での局在化の変化部分の可能性を有する。総説として、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ及びＭｅｓｓｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １２（２００５）、３９４〜４０１を参照のこと。
異なる手法では、Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５）、２３７〜２４１は、生きた細胞を傷つけることなく、生きた細胞へと抗体が行き来することができるといわれる、いわゆる「超抗体技術」である基本技術を記載している。このような細胞を透過する抗体は、新しい診断及び治療の手法を広げる。「ＴｒａｎｓＭａｂｓ」という用語が、これらの抗体について作られた。
さらなる実施形態は、シヌクレイン病を治療するのに有用な他の神経保護薬剤の同時投与又は逐次的な投与を含む。一実施形態では、さらなる薬剤が、本発明の医薬組成物に含まれる。被検体を治療するために用いることができる神経保護薬剤の例としては、限定されないが、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、グルタミン酸作動性受容体アンタゴニスト、キナーゼ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、抗炎症性薬剤、ジバルプロエクスナトリウム、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。本発明の医薬組成物と同時に使用可能な他の神経保護薬剤の例は、当該技術分野で記載されており、例えば、国際出願第ＷＯ２００７／０１１９０７号に記載されている。一実施形態では、さらなる薬剤は、ドーパミン又はドーパミン受容体アゴニストである。
本発明のさらなる実施形態では、α−シヌクレイン結合分子、特に、本発明の抗体を、一緒に投与してもよく、又は神経移植片を用いた移植治療若しくはシヌクレイン病の処置に有用な幹細胞治療の前又は後に投与してもよい。疾患では失われているニューロンを置き換え、線条体にドーパミン作動性神経伝達を再び回復させるという目的で、真核中脳ニューロンの移植片を用いたこのような適切な手法が、パーキンソン病患者に行われた。移植してから１１〜１６年後、移植したニューロンは、レビー小体及びレビー神経突起を含むことがわかった。このような宿主から移植した組織へのα−シヌクレイン病態の広がりは、α−シヌクレイン結合分子、特に、本発明の特定の抗体を一緒に投与することによって防ぐことができる。
治療に有効な投薬量又は量は、症状又は状態を改善するのに十分な活性成分の量を指す。このような化合物の治療有効性及び毒性は、細胞培養物又は実験動物中、標準的な医薬手順によって、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％に対し、治療が有効な投薬量）及びＬＤ５０（集団の５０％が死ぬ投薬量）によって決定することができる。治療効果及び毒性効果の投薬量の比率は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比としてあらわすことができる。特定の実施形態では、治療薬剤は、組成物中に、ＰＤ、ＤＬＢ又は他のシヌクレイン病の場合に、正常な行動及び／又は認識特性を回復又は保護するのに十分な量で存在する。
上述の内容から、本発明が、特に、上述のようにシヌクレイン病を診断及び／又は治療するための、ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１の少なくとも１つのＣＤＲ、又はそのフラグメント、改変体、又は誘導体を含むα−シヌクレイン結合分子の任意の使用を包含することが明らかである。結合分子は、本発明の抗体又はその免疫グロブリン鎖であってもよい。それに加え、本発明は、本明細書に記載する上述のいずれか１つの抗体の抗−イディオタイプ抗体に関する。これらは、抗原結合部位に近い抗体の可変領域に配置された固有の抗原ペプチド配列に結合する抗体又は他の結合分子であり、例えば、被検体のサンプルにおいて、抗−α−シヌクレイン抗体を検出するのに有用である。
別の実施形態では、本発明は、本発明の上述のα−シヌクレイン結合分子、抗体、抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞のうちいずれか１つと、場合により、免疫又は核酸に基づく診断方法で従来から用いられている試薬のような適切な検出手段とを含む、診断用組成物に関する。本発明の抗体は、例えば、イムノアッセイでの使用に適しており、この抗体は、液相で利用することができるか、又は固相担体に結合することができる。本発明の抗体を利用することが可能なイムノアッセイの例は、直接的又は間接的な態様での競争イムノアッセイ及び非競争イムノアッセイである。このようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ（免疫測定アッセイ）、フローサイトメトリー及びウエスタンブロットアッセイである。本発明の抗原及び抗体を多くの異なる担体に結合することができ、これらに特異的に結合する細胞を単離するために用いることができる。よく知られている担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然セルロース及び改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、及びマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のために可溶性であってもよく、又は不溶性であってもよい。当業者が知っている多くの異なる標識及び標識方法が存在する。本発明で使用可能な種類の標識の例としては、酵素、放射性同位体、コロイド状金属、蛍光化合物、化学発光化合物、及び生物発光化合物が挙げられ、本明細書で上に記載する実施形態も参照のこと。
さらなる実施形態によって、α−シヌクレイン結合分子、特に、本発明の抗体を、血液サンプル、リンパサンプル又は任意の他の体液サンプルであってもよい、試験した固体から得た体液サンプルを得て、抗体−抗原複合体を生成することができる条件で、この体液サンプルを本発明の抗体と接触させることによって、個体の障害を診断する方法で使用する。次いで、このような複合体のレベルを当該技術分野で既知の方法によって決定し、レベルがコントロールサンプルで作られるレベルよりも顕著に高いことは、試験された個体における疾患を示す。同じ様式で、本発明の抗体によって結合する特異的な抗原を使用してもよい。従って、本発明は、本発明の結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントを含むｉｎ ｖｉｔｒｏでのイムノアッセイに関する。
この内容で、本発明は、さらに、この目的のために特定的に設計された手段に関する。例えば、α−シヌクレインを特異的に認識する本発明の抗体又は等価な抗原結合分子を入れた、抗体に基づくアレイを使用してもよい。マイクロアレイイムノアッセイの設計は、Ｋｕｓｎｅｚｏｗ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ５（２００６）、１６８１〜１６９６にまとめられている。従って、本発明は、さらに、本発明に従って特定されるα−シヌクレイン結合分子を入れたマイクロアレイに関する。
一実施形態では、本発明は、被検体におけるシヌクレイン病を診断する方法に関し、この方法は、
（ａ）本発明のいずれか１つの抗体又はそのフラグメントを用い、診断対象の被検体におけるα−シヌクレインのレベル、局在化、立体配置又はこれらの組み合わせを評価することと、
（ｂ）被検体におけるα−シヌクレインのレベル、局在化、立体配置又はこれらの組み合わせを、１つ以上のコントロールサンプルから誘導される１つ以上のリファレンス標準と比較することとを含み、
被検体およびリファレンス標準におけるα−シヌクレインのレベル、局在化、立体配置又はこれらの組み合わせの差又は類似性が、その被検体がシヌクレイン病であるか否かを示す。
診断対象の被検体は、その疾患について無症状であってもよく、前臨床状態であってもよい。リファレンス標準は、シヌクレイン病、例えば、ＰＤ、ＤＬＢ又はＭＳＡの患者から得たものであってもよく、被検体およびリファレンス標準におけるα−シヌクレインのレベル、局在化、立体配置又はこれらの組み合わせの類似性が、その被検体がシヌクレイン病であるか否かを示す。これに代えて、又はこれに加えて、リファレンス標準は、シヌクレイン病をもたない被検体から誘導される。特定の実施形態では、診断対象の被検体とリファレンス標準は、年齢を合わせる。分析は、ｉｎ ｖｉｖｏで行われてもよく、又は、診断対象の被検体から単離されたサンプルであってもよく、例えば、α−シヌクレインを含む疑いがある任意の体液、例えば、血液、ＣＳＦ又は尿サンプルであってもよい。
α−シヌクレインのレベル、局在化、及び／又は立体配置を、例えば、ウェスタンブロット、免疫沈降、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、二次元ゲル電気泳動、質量分析（ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法−飛行時間型ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、表面増強レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、多次元液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の後、タンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、及びレーザー密度計から選択される１つ以上の技術によってα−シヌクレインを分析することを含む、当該技術分野で既知の任意の適切な方法によって評価することができる。α−シヌクレインのＩｎ
ｖｉｖｏイメージングは、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光イメージング又は核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む。
シヌクレイン病、例えば、ＰＤ、ＤＬＢ又はＭＳＡを診断する方法、シヌクレイン病の進行を監視する方法、本発明に従って適用可能な抗体及び関連する手段を用いてシヌクレイン病を監視する方法は、国際出願第ＷＯ２００７／０１１９０７号にも記載されている。同様に、α−シヌクレインの抗体に基づく検出方法は、国際出願ＷＯ９９／５０３００号、ＷＯ２００５／０４７８６０号、ＷＯ２００７／０２１２５５号及びＷＯ２００８／１０３４７２号に記載されており、その開示内容は、すべて参照により組み込まれる。これらの方法を、記載のとおりに、しかし、本発明のα−シヌクレインに特異的な抗体、結合フラグメント、誘導体又は改変体を用いて適応することができる。
これらの実施形態及び他の実施形態は、本発明の記載及び例によって開示され、包含される。本発明に従って使用される材料、方法、使用及び化合物のいずれかに関するさらなる文献は、例えば電子機器を用いて、公共の図書館及びデータベースから検索することができる。例えば、公共のデータベースである「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を使用することができ、このデータベースは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ及び／又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈが作成している。さらなるデータベース及びウェブアドレス、例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （ＥＭＢＬの一部であるＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）は、当業者には知られており、インターネットサーチエンジンを用いて得ることもできる。過去の検索及びカレントアウェアネスに有用なバイオテクノロジー分野の特許情報の概説及び特許情報の関連する供給源の観察は、Ｂｅｒｋｓ、ＴＩＢＴＥＣＨ １２（１９９４）、３５２〜３６４で与えられる。
上の開示内容は、一般的に、本発明を記載する。他の意味であると示されていない限り、本明細書で使用する用語は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９７、２０００年に改訂、２００３年に増刷、ＩＳＢＮ ０ １９ ８５０６７３ ２に与えられているような定義が与えられる。いくつかの文献は、本明細書の本文全体で引用される。あらゆる引用文献の内容（本明細書の全体で引用されている参考文献、登録された特許、公開された特許明細書、製造業者の仕様、指示書などを含む）は、本明細書に明示的に全体として参照により組み込まれる。しかし、引用された任意の文書が実際に本発明の従来技術であることを認めたものではない。
単に説明のために本明細書に与え、本発明の範囲を限定することを意図したものではない以下の具体的な実施例を参照し、さらに完全な理解が得られるだろう。
実施例は、本発明をさらに説明するが、本発明の範囲をいかなる様式にも限定するものと解釈すべきではない。実施例１及び２の以下の実験は、クローニングされた状態の抗体ＮＩ−２０２．３Ｇ１２、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４、及びＮＩ−２０２．３Ｄ８について示され、記載される。すなわち、ヒト可変重鎖及び軽鎖のフレームワーク１ Ｉｇ−可変領域のまさにＮ末端にプライマーを誘発する変異を含み、生殖細胞系（ＧＬ）配列に対して修正されていない。図１を参照のこと。しかし、ＮＩ−２０２シリーズの他の抗体、特に、修正したＧＬ配列を有する抗体は、構造的に類似しており、従って、匹敵する結果を与えると予想することができる。これらの抗体は、ヒトＩｇＧ１分子であると予想された。実施例３及び４の実験は、ヒト可変重鎖及び軽鎖のＩｇ−可変領域のＮ末端にあるプライマーを誘発する変異が、生殖細胞系（ＧＬ）配列に対して修正された抗体ＮＩ−２０２．１２Ｆ４について示され、記載される。図１を参照のこと。この抗体は、修正したヒト可変ドメインを、マウスＩｇＧ２ａ定常領域に融合し、マウス抗ヒト免疫応答を誘導することなくトランスジェニックマウスモデルにおける慢性投薬試験を可能にするキメラ分子として発現された。
（材料及び方法）
例えば、本明細書で使用する従来の方法の詳細な記載は、引用した文献中に見出すことができる。以下に他の意味であると示されていない限り、α−シヌクレインに特異的なＢ細胞の特定及び目的の特異性を示すα−シヌクレイン抗体の分子クローニング、及びこれらの組み換え発現及び機能特性決定は、ＷＯ２００８／０８１００８号として公開された国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００００５３号、及びＷＯ２０１０／０６９６０３号として公開された国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００９１８６号の実施例及び補遺の方法の章に記載されるとおりに行われ、又は行うことができ、これらの開示内容は、全体として参照により組み込まれる。
（抗原の精製）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中での組み換え発現、その後、熱によって誘発される沈殿を用いた精製、Ｎｉｃｋｅｌアフィニティクロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィーによって、組み換えＨｉｓ−α−シヌクレインを得た。
例えば、Ｔ７プロモーターの制御下、α−シヌクレインをコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を用い、適切なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株、例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、１ｍＭのイソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えることによって、２００ｍｌの細胞培養物の発現を誘発させた。３７℃で誘発して４時間後に細胞を収穫し、次いで、２０ｍｌの５０ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８に再び懸濁させ、その後、音波処理した。１５分間煮沸した後、耐熱性の１７０００ｇの上澄みを集めた。同様に、耐熱性の１７０００ｇの上澄みをｍｏｃｋ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉから集めた。Ｈｉｓタグ化α−シヌクレインを発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉから得た耐熱性の１７０００ｇの上澄み（２０ｍｌ）を、５０ｍＭ トリス、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８になるように調節し、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ １ｍｌ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）カラムに入れ、３０〜５００ｍＭのイミダゾール勾配を用い、ＨＩＳ−α−シヌクレインを溶出させた。ＨＩＳ−α−シヌクレインを含むフラクションを集め、次いで、これを５０ｍＭ
トリス ｐＨ８で１：１０に希釈した。希釈して集めたフラクションをＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ １ｍｌ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）カラムに適用し、結合したタンパク質を３０〜１０００ｍＭ ＮａＣｌ勾配で溶出させた。最後に、ＨＩＳ−α−シヌクレインを含む溶出物を、高速ゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ）を用いてさらに精製した。この精製手順から、ＨＩＳ−α−シヌクレインを得て、純度のグレードは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色によって概算するとほぼ９９％であった。精製したタンパク質の濃度を、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定した。
（α−シヌクレイン抗体のスクリーニング）
９６穴ハーフエリアマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、精製したＨＩＳ−α−シヌクレイン又はα−シヌクレイン（ｒＰｅｐｔｉｄｅ）を用い、コーティングバッファー（ＰＢＳ ｐＨ９．６）中、標準濃度２μｇ／ｍｌで、４℃で一晩かけてコーティングした。プレートをＰＢＳ−Ｔ ｐＨ７．６で洗浄し、２％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ−Ｔ（Ｓｉｇｍａ、ブックス、スイス国）を用い、非特異的に結合する部位をＲＴで１時間かけて遮断した。Ｂ細胞馴化培地を、１％ＢＳＡ中の１０％の耐熱性Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質を用い、ＲＴで１時間かけてあらかじめ吸収させておいた。この前吸収工程は、ヒトα−シヌクレインに特異的な抗体を特定するための以前のＥＬＩＳＡスクリーニングのいくつかの試みがうまくいかなかった後に開発された。従って、幸運なことに、ＥＬＩＳＡプレートを耐熱性Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質を用いて前吸収すると、粘着性抗体や、精製した組み換えα−シヌクレインサンプル中におそらく存在するＥ．ｃｏｌｉタンパク質汚染物質に対して指向する抗体のような偽陽性のスクリーニングを除外することがわかった。次いで、前吸収した培地を記憶Ｂ細胞培養プレートからＥＬＩＳＡプレートに移し、ＲＴで２時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と接合したロバ抗−ヒトＩｇＧ（Ｆｃγフラグメントに特異的な）ポリクローナル抗体とともにインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、標準的な比色分析アッセイにおいてＨＲＰ活性を測定することによって、ヒト抗体の結合を決定した。
（α−シヌクレイン抗体の分子クローニング）
６０歳を超える志願者から、記憶Ｂ細胞を含むサンプルを得た。すべての志願者は、共通して、パーキンソニズムの徴候はなかった。選択した記憶Ｂ細胞培養物の生きたＢ細胞を収穫し、ｍＲＮＡを調製する。次いで、すべてのヒト可変重鎖及び軽鎖のファミリーのＩｇ−フレームワーク１に特異的なプライマーを５’プライマーとして、すべてのヒトＪセグメント（重鎖及びカッパ軽鎖）及びＣセグメント（ラムダ軽鎖）に特異的なプライマーを３’プライマーとして組み合わせて用い、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の配列を得る（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１）、５８１〜５９７；ｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６（１９９９）、１８２１８〜１８２３０）。
完全抗体の組み換え発現に対し、ＥＬＩＳＡで再びスクリーニングすることによって、所望の特異性を用いた抗体クローンの特定を行う。５’末端及び３’末端にリーダーペプチドをコードする配列を有し、適切な定常ドメインをコードする配列を有する可変領域配列に相補的な「正しいリーディングフレーム」の可変重鎖及び軽鎖の配列を発現ベクターに挿入し、完全ヒトＩｇＧ１抗体又はキメラＩｇＧ２ａ抗体の組み換え発現を達成する。この目的で、プライマーは、可変重鎖及び軽鎖の配列を抗体発現ベクターにクローニングしやすくするように設計された制限部位を含んでいた。免疫グロブリン重鎖ＲＴ−ＰＣＲ産物を、ヒト免疫グロブリンガンマ１又はマウス免疫グロブリンガンマ２ａのシグナルペプチド及び定常ドメインを含む重鎖発現ベクターにフレーム内で挿入することによって、重鎖免疫グロブリンが発現する。ＮＩ−２０２．３Ｄ８のカッパ軽鎖ＲＴ−ＰＣＲ産物を、ヒトカッパ軽鎖免疫グロブリンのシグナルペプチド及び定常ドメインを与える軽鎖発現ベクターにフレーム内で挿入することによって、カッパ軽鎖免疫グロブリンが発現する。ラムダ軽鎖ＲＴ−ＰＣＲ産物を、ヒト又はマウスのラムダ軽鎖免疫グロブリンのシグナルペプチド及び定常ドメインを与えるラムダ軽鎖発現ベクターにフレーム内で挿入することによって、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４及びＮＩ−２０２．３Ｇ１２ラムダ軽鎖免疫グロブリンが発現する。
Ｉｇ−重鎖発現ベクター及びカッパ又はラムダのＩｇ−軽鎖発現ベクターのＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞（又は任意の他の適切なヒト又はマウス由来の受容細胞系）に一緒に形質転換し、機能的な組み換えモノクローナル抗体を得た。その後に、標準的なタンパク質Ａカラム精製を用い、馴化培地から組み換えヒトモノクローナル抗体を精製した。
（抗体）
ｐａｎシヌクレイン抗体Ｓｙｎ２１１（Ｓｉｇｍａ）を製造業者のプロトコルに従って使用した。組み換えヒトα−シヌクレイン抗体ＮＩ２０２．２２Ｇ１１及びＮＩ２０２．１２Ｆ４は、本発明の抗体である。これらの抗体は、ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞で発現し、次いで、他の意味であると示されていない限り、後の適用に馴化培地を直接使用した。
（ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ）
ＰＢＳ ｐＨ９．６中、所定の濃度で抗原を用い、９６穴ハーフエリアプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を４℃で一晩かけてコーティングした。プレートをＰＢＳ−Ｔ ｐＨ７．６で洗浄し、２％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ−Ｔ（Ｓｉｇｍａ）を用い、非特異的に結合する部位をＲＴで１時間かけて遮断した。次いで、プローブ（一次抗体）を９６穴に移し、ＲＴで２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ ｐＨ７．６で洗浄した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と接合したポリクローナル抗−ヒト（組み換えヒト抗体の場合）、抗−ウサギ（ｐａｎシヌクレイン抗体の場合）又は抗−マウス（ＬＢ５０９又はＳｙｎ２１１の場合）の二次抗体を用い、ＲＴで１時間、９６穴をインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで厳密に洗浄した後、３，３’，５，５’−テトラメチルビフェニル−４，４’−ジアミン（Ｓｉｇｍａ）を発色基剤として用い、標準的な比色分析アッセイにおいてＨＲＰ活性を測定することによって、プローブの結合を決定した。
（エピトープマッピングのためのペプチドスキャン）
ヒトα−シヌクレインの全配列を、長さ１５アミノ酸（ａａ）及び１１ａａの重複を有し、セルロース膜（ＪＰＴ、ベルリン、独国）に対し、可撓性のリンカーを介してカップリングした重複するペプチドとして合成した。合計で３３ペプチドを含む膜をメタノールで洗浄し、次いで、Ｒｏｔｉｂｌｏｃｋ（Ｒｏｔｈ、カルルスルーエ、独国）を用いて遮断した。この膜を、遮断溶液で希釈した指定の抗体とともにインキュベートし、次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した二次抗体を用いて１時間インキュベートした。インキュベートの間に、膜をＰＢＳ−Ｔを用いて５分間かけて３回洗浄した。次いで、この膜をＥＣＬとＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて現像した。
（溶液中ＥＬＩＳＡ）
炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）で希釈したＮＩ−２０２．１２Ｆ４（２μｇ／ｍｌ）をＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩かけてコーティングした。次いで、このプレートを２％ ＢＳＡ ＰＢＳ−Ｔを用いて遮断し、その後に、ＰＢＳ−Ｔを用いて洗浄した。指定のビオチニル化α−シヌクレインペプチドを加え、２時間インキュベートした後に、プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。ＨＲＰで標識したストレプトアビジンとともに１時間インキュベートした後、標準的な比色分析アッセイにおいてＨＲＰ活性を測定することによって、結合を検出した。
（実施例１：ヒトから誘導されるα−シヌクレイン抗体ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１は、ヒトα−シヌクレインに選択的である）
α−，β−及びγ−シヌクレインは、主に、神経系、骨格筋及び心臓で発現する非常に相同性の高いタンパク質である。α−シヌクレインは、広いスペクトルのＣＮＳ疾患に強く関係があり、一方、β−シヌクレインは、神経保護タンパク質であり得る。従って、本発明は、β−及びγ−シヌクレインと交差反応しない、病的なα−シヌクレイン改変体に対する治療用抗体を提供する。ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１の治療用途での可能性を裏付けるために、ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡにおいて、α−、β−及びγ−シヌクレインに対する結合について、この抗体を試験した。組み換えα−，β及びγ−シヌクレインを同じ濃度でＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、次いで、組み換えＮＩ−２０２．２１Ｄ１１又はコントロールであるｐａｎシヌクレイン抗体のいずれかとともにインキュベートした。ｐａｎ−シヌクレイン抗体は、３種類すべてのシヌクレインタンパク質を検出するが、ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１は、α−シヌクレインに対する選択的な結合を示す（図２ａ）。
ヒト及びマウスのα−シヌクレインは、非常に保存されたタンパク質である。組み換えＮＩ−２０２．２１Ｄ１１が、マウスα−シヌクレインよりもヒトα−シヌクレインに優先的に結合するかどうかを調べるために、組み換えＨｉｓタグ化したヒト又はマウスのα−シヌクレインを同じ濃度でＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、次いで、ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１及びＮＩ−２０２．１２Ｆ４の結合について調べた（図２ｂ）。このｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡにおいて、ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１は、ヒトα−シヌクレインのみを検出し、一方、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、ヒト及びマウスのα−シヌクレインを両方とも検出する（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ２０１０／０６９６０３ Ａ１号を参照のこと）。これらの知見を合わせ、ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１がヒトα−シヌクレインに非常に選択的であることを示す。
（実施例２：ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１は、立体構造エピトープに対し、高いコーティング濃度でヒトａ−シヌクレインに優先的な結合を示す）
ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１の能力を示す半数効果濃度（ＥＣ５０）を、α−シヌクレインのｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡを用い、組み換えα−シヌクレインのコーティング濃度が低い場合と高い場合について決定した。高いコーティング濃度のα−シヌクレインタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）のとき、ＥＣ５０が約２００ｐＭである組み換えＮＩ−２０２．２１Ｄ１１の高親和性結合が観察された。これより低い濃度のα−シヌクレインでは、親和性の急激な低下が観察された（図３）。これらの特徴は、α−シヌクレインのＣ末端ドメインでもエピトープを検出する市販の抗体ｓｙｎ２１１とは強く対照をなしている。この知見は、ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１が、高分子量種のα−シヌクレインでみられるような高密度条件で作られるか、又はさらされるエピトープを好むことを示唆している。
（実施例３：組み換えＮＩ−２０２．２２Ｄ１１は、脳内の病的なα−シヌクレイン種に結合する）
ヒトα−シヌクレインに対するＮＩ−２０２．２１Ｄ１１の結合を、α−シヌクレイントランスジェニックマウス及び神経学的にシヌクレイノパチーが確認された患者（レビー小体型認知症）に由来する脳切片の免疫組織化学的染色によってさらに特性決定した。ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１は、ヒトα−シヌクレインＡ５３Ｔを過剰に発現するトランスジェニックマウスの脳組織に由来するプロテアーゼＫで処理されたパラフィン切片で、レビー小体及びレビー神経突起のような内包物の顕著な染色を示す（図４ａ）。野生型マウスに由来する脳切片では、ＮＩ２０２−２１Ｄ１１の染色は検出されず、このことは、ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１がヒトα−シヌクレインに特異的であることを裏付けている（図４ｂ）。ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１も、レビー小体型認知症患者のヒト脳組織において、病的なα−シヌクレインを検出した（図４ｃ）。これらの結果は、ヒトから誘導された抗体ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１が、脳内の病的なα−シヌクレインを検出することを示す。
（実施例４：ヒトから誘導されるα−シヌクレインに特異的な抗体ＮＩ−２０２．２２Ｄ１１のエピトープを、ヒトα−シヌクレインのＣ末端ドメイン内のエピトープに対してマッピング）
α−シヌクレインは、１４０アミノ酸（ａａ）長の天然では折り畳まれていないタンパク質であり、３種類のドメインで構成されている。Ｎ−末端の両親媒性繰り返し領域（ａａ １〜６０）、中央領域（ａａ ６１〜９５）及び酸性Ｃ末端領域（ａａ ９６〜１４０）が存在する。（Ａ）ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１に結合するドメインに対する初期の理解を得るために、ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡにおいて、ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１の結合について、組み換えα−シヌクレイントランケーションを試験した。残基１〜６０、１〜９５、６１〜１４０及び９６〜１４０からの組み換えα−シヌクレイントランケーションをＥＬＩＳＡプレートでコーティングし、次いで、組み換えＮＩ−２０２．２１Ｄ１１とともにインキュベートした。α−シヌクレイントランケーション６１〜１４０及び９６〜１４０に対するＮＩ−２０２．２１Ｄ１１の結合のみが観察され、このことは、ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１が、α−シヌクレインのＣ末端酸性ドメインに結合することを示している（図５ａ）。
ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１の認識配列をもっと詳細に理解するために、ヒトα−シヌクレインの全アミノ酸配列を含む重複する直線状１５マーペプチドに対する結合について、ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１を調べた。隣接ペプチドは、１１残基及びペプチドの重複が共通しており、セルロース担持膜にＣ末端で付けた。ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１は、ヒトα−シヌクレインの３つの重複するペプチド、つまり、残基１０９〜１２３（Ｂ０８）、１１３〜１２７（Ｂ０９）及び１１７〜１３１（Ｂ１０）に結合した（図５ｂ）。この結果は、ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１の結合に必要なα−シヌクレインのＣ末端内の最低限の認識配列がＰＶＤＰＤＮＥ（１１７〜１２３）であることを示唆している。なお、ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１は、ペプチドＢ０８及びＢ０９への結合よりも、ペプチドＢ１０への結合がわずかに低かった。従って、ａ−シヌクレインの残基１１３〜１１７は、ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１の結合に対して影響を与えるだろう。
マウスα−シヌクレインに対するＮＩ−２０２．２１Ｄ１１の結合は、ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡではほとんど観察されなかった（図２Ｂ）。ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１の決定したエピトープ配列（ＰＶＤＰＤＮＥ）を、対応するマウス配列のエピトープ配列（ＰＶＤＰＧＳＥ）に対して配列アラインメントを行うと、Ｄ１２１及びＮ１２２が、マウスα−シヌクレインと比較して、ヒトα−シヌクレインに対するＮＩ−２０２．２１Ｄ１１の選択性の鍵となるアミノ酸であることを示唆している。Ｄ１２１／Ｎ１２２の鍵となる役割を確認するために、組み換え変異したヒトα−シヌクレインＤ１２１Ｇ／Ｎ１２２Ｓを製造し、ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡにおいて、ＮＩ２０２．２１Ｄ１１の結合について調べた。図５ｃに示されるように、ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１は、野生型ヒトα−シヌクレインと比較して、ヒトα−シヌクレイン Ｄ１２１Ｇ／Ｎ１２２Ｓに対してほとんど結合しないことが示された。コントロールであるｐａｎ−シヌクレイン抗体を、同等のシヌクレインタンパク質コーティングのための正規化コントロールとして使用した。
これらの結果は、ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１が、ヒトから誘導されるα−シヌクレイン抗体が、ヒトα−シヌクレイン内のＣ末端エピトープ（残基１１７〜１２３）を検出し、アミノ酸Ｄ１２１／Ｎ１２２が、マウスα−シヌクレインと比較したヒトα−シヌクレインの選択性に寄与することを示している。
（実施例５：ＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４のα−シヌクレイン選択性の鍵となるアミノ酸であるα−シヌクレインのα−シヌクレイン４〜１５及びＫ１０内にあるエピトープを検出する）
ＮＩ−２０２．１２Ｆ４の認識配列（エピトープ）をもっと詳細に理解するために、ヒトα−シヌクレインの全アミノ酸配列を含む重複する直線状１５マーペプチドに対する結合について、イムノブロッティングによってＮＩ−２０２．１２Ｆ４の結合を試験した。隣接ペプチドは、１１残基及びペプチドの重複が共通しており、セルロース担持膜にＣ末端で付けた。ＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、まさにＮ末端ペプチド（Ａ０１）にのみ結合し、エピトープが残基１〜１５内にあることを示している（図６ａ）。ＮＩ−２０２．１２Ｆ４がペプチド（Ａ０２）残基５〜２０に結合しないため、エピトープは、残基１〜５から開始する。このエピトープの実際の開始残基を決定するために、溶液中での結合ＥＬＩＳＡにおいて、合成α−シヌクレインペプチドをＮＩ−２０２．１２Ｆ４の結合について試験した。最初に、溶液中での結合ＥＬＩＳＡの妥当性を立証するために、合成ペプチドα−シヌクレイン１〜３０及び５〜３０を、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４の結合について試験した。ＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、α−シヌクレイン１〜３０に結合するが、５〜３０には結合せず、このエピトープが残基１〜５から始まることを確認することによって、このアッセイの妥当性を立証している（図６ｂ）。次に、α−シヌクレイン４〜３０を、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４の結合について試験した。図６ｂに示されるように、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、α−シヌクレイン４〜３０に結合した。これらの結果は、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４エピトープが残基４から始まることを示している。
ＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、α−シヌクレインに選択的に結合するが、β−及びγ−シヌクレインには結合しなかった。対応するβ−シヌクレイン配列を有する配列（α−シヌクレイン４〜１５）を含むＮＩ−２０２．１２Ｆ４エピトープの配列アラインメントは、これらの配列が、１個のアミノ酸のみ異なることを示していた。α−シヌクレインの位置１０にあるリジンが、β−シヌクレインではメチオニンに置き換わっている。従って、ＮＩ２０２．１２Ｆ４は、β−シヌクレイン Ｍ１０Ｋに結合し、α−シヌクレイン Ｋ１０Ｍに結合しないはずである。実験的に確認するために、組み換え野生型及びＫ１０Ｍのα−シヌクレイン、及び野生型及びＭ１０Ｋのβ−シヌクレインを、ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡにおいて、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４の結合について試験した。予想どおり、ＮＩ２０２．１２Ｆ４は、野生型のα−シヌクレイン及びβ−シヌクレイン Ｍ１０Ｋにのみ結合し、野生型β−シヌクレイン及びα−シヌクレイン Ｋ１０Ｍに結合しなかった（図６ｃ）。ｐａｎ−シヌクレイン抗体は、４種類すべての組み換えタンパク質に等しく良好に結合し、ＥＬＩＳＡプレートに同等にコーティングされていることを示している。
これらの実験をすべて合わせると、ＮＩ２０２．１２Ｆ４のエピトープが、α−シヌクレインの残基４〜１５内に局在化していることを示す。このエピトープは、残基４から始まり、残基１１〜１５で終了する。α−シヌクレインの位置１０にあるリジンは、β−シヌクレインと比較して、α−シヌクレインへのＮＩ−２０２．１２Ｆ４の特異性の理由である。

Claims (32)

  1. 配列番号１のアミノ酸１１３〜１２３内でヒトα−シヌクレインに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 配列番号１のアミノ酸１１７〜１２３に結合する、請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  3. オリゴマー形態又は凝集した形態のヒトα−シヌクレインに優先的に結合する、請求項１または請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  4. ヒトα−シヌクレインに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、
    それぞれ配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８によって示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域１、２および３を含むＶＨ；および
    それぞれ配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５によって示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域１、２および３を含むＶＬ
    を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
  5. 前記ＶＨが、配列番号１５または配列番号２０によって示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列からなり、そして、前記ＶＬが、配列番号２２または配列番号２６によって示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  6. 前記ＶＨが、配列番号１５または配列番号２０によって示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなり、そして、前記ＶＬが、配列番号２２または配列番号２６によって示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  7. 前記ＶＨが、配列番号１５または配列番号２０によって示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなり、そして、前記ＶＬが、配列番号２２または配列番号２６によって示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  8. 前記ＶＨが、配列番号１５によって示されるアミノ酸配列からなり、そして、前記ＶＬが、配列番号２２によって示されるアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  9. 前記ＶＨが、配列番号２０によって示されるアミノ酸配列からなり、そして、前記ＶＬが、配列番号２６によって示されるアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  10. 前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体およびジスルフィドで接続したＦｖ（ｓｄＦｖ）からなる群より選択される、請求項４〜９のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  11. 前記抗体がダイアボディである、請求項４〜９のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  12. 前記抗体がヒトＩｇＧアイソタイプのものである、請求項４〜９のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  13. 前記ＩｇＧアイソタイプが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群より選択される、請求項１２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  14. 前記抗体がヒトラムダアイソタイプのものである、請求項１３に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  15. 前記抗体がヒトカッパアイソタイプのものである、請求項１３に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  16. 前記抗体または抗原結合フラグメントが、ヒトであるか、またはヒト化されている、請求項４〜９のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  17. 請求項４〜１６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントであって、該抗体または抗原結合フラグメントに融合した異種ポリペプチドをさらに含む、抗体または抗原結合フラグメント。
  18. 請求項４〜１６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントであって、該抗体が、ペプチド、タンパク質、ウイルス、脂質、治療薬剤、酵素、プロドラッグ、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群より選択される薬剤と接合されている、抗体または抗原結合フラグメント。
  19. 請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントと、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  20. 請求項４〜１８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントをコードする１つまたは複数の核酸を含む、単離された１つまたは複数のポリヌクレオチド。
  21. 配列番号１９、２１、２７または２８によって示される１つまたは複数の核酸配列を含む、単離された１つまたは複数のポリヌクレオチド。
  22. 請求項２０に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、１つまたは複数の発現ベクター。
  23. 請求項２２に記載の１つまたは複数の発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。
  24. 抗ヒトα−シヌクレイン抗体またはその抗原結合フラグメントを製造する方法であって、請求項２３に記載の宿主細胞を培養することと、該抗体またはそのフラグメントを回収することとを含む、方法。
  25. ヒト被検体におけるシヌクレイン病を治療又は予防するための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含む組成物、あるいは請求項１９に記載の医薬組成物。
  26. 前記シヌクレイン病が、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）または多系統萎縮症（ＭＳＡ）である、請求項２５に記載の組成物。
  27. 被検体におけるα−シヌクレインのレベル、局在化または立体配置を評価するための診断薬の調製における、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントの使用。
  28. 前記被検体におけるα−シヌクレインのレベル、局在化、立体配置またはこれらの組み合わせがｉｎ ｖｉｖｏイメージングによって測定される、請求項２７に記載の使用。
  29. 前記ｉｎ ｖｉｖｏイメージングが、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光イメージングまたは核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む、請求項２８に記載の使用。
  30. 被験体におけるα−シヌクレインのレベル、局在化または立体配置を評価するための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含む診断用組成物。
  31. 前記被検体におけるα−シヌクレインのレベル、局在化、立体配置またはこれらの組み合わせがｉｎ ｖｉｖｏイメージングによって測定される、請求項３０に記載の診断用組成物。
  32. 前記ｉｎ ｖｉｖｏイメージングが、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光イメージングまたは核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む、請求項３１に記載の診断用組成物。
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