JP2017006029A

JP2017006029A - 細胞工学用支持体の製造方法

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Publication number: JP2017006029A
Application number: JP2015123277A
Authority: JP
Inventors: 克之山中; Katsuyuki Yamanaka; 裕大坂井; Yuudai Sakai; 勇介重光; Yusuke Shigemitsu
Original assignee: GC Corp; GC Dental Industiral Corp
Current assignee: GC Corp
Priority date: 2015-06-18
Filing date: 2015-06-18
Publication date: 2017-01-12
Anticipated expiration: 2035-06-18
Also published as: US9795710B2; US20160367721A1; US20180000988A1; EP3106184A1; JP6533104B2; EP3106184B1

Abstract

【課題】細胞培養時の長期間の構造安定性と、分化能とを両立できる細胞工学用支持体の製造方法の提供。【解決手段】ポリ−Ｄ−乳酸、又はポリ−Ｌ−乳酸を含む骨格構造体１１と、前記骨格構造体の表面に形成された乳酸−グリコール酸共重合体を含むコート層１２と、を有する細胞工学用支持体であって、ポリ−Ｄ−乳酸、又はポリ−Ｌ−乳酸を含む第１の顆粒状多孔質物質１１と、乳酸−グリコール酸共重合体を含む第２の顆粒状多孔質物質１２とを混合して混合体を調製する混合工程と、前記混合体を型に入れ前記乳酸−グリコール酸共重合体の融点以上、前記ポリ−Ｄ−乳酸、又はポリ−Ｌ−乳酸の融点未満迄加圧・加熱する加圧・加熱工程と、を有する細胞工学用支持体の製造方法。骨格構造体１１の外側表面も内部の連続孔１３の表面もコート層１２１，１２２によって、一部の露出を除いて被覆されている細胞工学用支持体。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞工学用支持体の製造方法に関する。

従来から、手術、外傷等によって喪失した生体組織を体細胞、幹細胞等によって再構築し、それを患者に移植することにより喪失した生体組織を再生する治療方法が行われている。その治療において生体組織を再生するためには、播種する細胞が生体組織を再建するまでの足場となる支持体（マトリックス）が重要となる。

例えば特許文献１には、生体吸収性高分子材料から成り、孔径が５〜５０μｍの小孔構造を有する立体的な網目構造中に断面積中の２０〜８０％を占める不定形な連続孔を有し、その弾性係数が０.１〜２.５ＭＰａで、水中に２４時間浸漬した際の体積変化率が９５〜１０５％であることを特徴とするブロック状細胞工学用支持体が開示されている。また、ブロック状細胞工学用支持体に用いる生体吸収性高分子材料として、ポリグリコール酸や、ポリ乳酸等が例示されている。

特許文献１に開示されたブロック状細胞工学用支持体は、従来のスポンジ状の細胞工学用支持体と比較して弾性係数が高いので形状安定性に優れ且つ水分を吸収してもその体積変化の少ない優れた特性を有している。

特開２００６−１３６６７３号公報

ところで、近年は細胞を長期間に渡って、培養、分化させた場合においても構造を維持でき、細胞の分化能にも優れた細胞工学用支持体が求められている。

そして本発明の発明者らの検討によれば、特許文献１に開示されたブロック状細胞工学用支持体を作製する際、生体吸収性高分子材料としてポリ乳酸を用いることで、長期間に渡って細胞を培養した場合でも細胞工学用支持体は構造を維持できる。

しかしながら、生体吸収性高分子材料としてポリ乳酸を用いた場合、細胞の分化能が十分ではない場合があった。

本発明は上記従来技術が有する問題に鑑みてなされたものであって、本発明の一側面では、細胞培養時の長期間の構造安定性と、分化能とを両立できる細胞工学用支持体の製造方法を提供することを目的とする。

本発明の一態様によれば、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含む骨格構造体と、
前記骨格構造体の表面に形成された乳酸−グリコール酸共重合体を含むコート層と、を有する細胞工学用支持体の製造方法であって、
ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含む顆粒状の多孔質体である第１の顆粒状多孔質物質と、乳酸−グリコール酸共重合体を含む顆粒状の多孔質体である第２の顆粒状多孔質物質とを混合して混合体を調製する混合工程と、
前記混合体を型に入れ加圧・加熱する加圧・加熱工程と、を有し、
前記加圧・加熱工程では、前記乳酸−グリコール酸共重合体の融点以上、前記第１の顆粒状多孔質物質に含まれるポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸の融点未満まで加熱する細胞工学用支持体の製造方法を提供する。

本発明の一態様によれば、細胞培養時の長期間の構造安定性と、分化能とを両立できる細胞工学用支持体の製造方法を提供することができる。

本発明の実施形態に係る細胞工学用支持体の断面模式図。

以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明は、下記の実施形態に制限されることはなく、本発明の範囲を逸脱することなく、下記の実施形態に種々の変形および置換を加えることができる。
［第１の実施形態］
本実施形態では細胞工学用支持体の製造方法の一構成例について説明する。

本実施形態の細胞工学用支持体の製造方法は、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含む骨格構造体と、骨格構造体の表面に形成された乳酸−グリコール酸共重合体を含むコート層と、を有する細胞工学用支持体の製造方法に関し、以下の工程を有することができる。

ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含む顆粒状の多孔質体である第１の顆粒状多孔質物質と、乳酸−グリコール酸共重合体を含む顆粒状の多孔質体である第２の顆粒状多孔質物質とを混合して混合体を調製する混合工程。

混合体を型に入れ加圧・加熱する加圧・加熱工程。

そして、加圧・加熱工程では、乳酸−グリコール酸共重合体の融点以上、第１の顆粒状多孔質物質に含まれるポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸の融点未満まで加熱することができる。

ここでまず、本実施形態の細胞工学用支持体の製造方法により製造することができる細胞工学用支持体について説明する。

本実施形態の細胞工学用支持体の製造方法により製造できる細胞工学用支持体は、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含む骨格構造体と、骨格構造体の表面に形成された乳酸−グリコール酸共重合体を含むコート層と、を有することができる。

本実施形態の細胞工学用支持体は上述のように、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含む骨格構造体を有することができる。

骨格構造体は、小孔構造を有する立体的な網目構造を有しており、さらに不定形な連続孔を含むことができる。そして、本発明の発明者らの検討によれば、該骨格構造体がポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含むことで、該骨格構造体の強度を高め、細胞培養時の長期間の構造安定性を発揮することができる。

なお、ポリ乳酸としては、Ｄ体と、Ｌ体との両方を分子鎖中に同時に含むポリ−ＤＬ−乳酸も知られている。しかしながら、骨格構造体がポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含む場合と比較して、係るポリ−ＤＬ−乳酸を用いた場合、細胞培養時の長期間の構造安定性が十分ではない。このため、上述のように骨格構造体はポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含むことが好ましい。

特に、骨格構造体は、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸からなることが好ましい。ただし、この場合でも製造工程等で混入する不可避成分は含有されていてもよい。

次に、コート層について説明する。

コート層は乳酸−グリコール酸共重合体を含むことができる。本発明の発明者らの検討によれば乳酸−グリコール酸共重合体は、骨格構造体に用いた場合、細胞培養時の長期間の構造安定性はポリ−Ｄ−乳酸、ポリ−Ｌ−乳酸には劣っている。しかしながら、培養する細胞の保持性には優れており、骨格構造体の表面を覆うコート層が乳酸−グリコール酸共重合体を含むことで、分化能を高めることができる。

特にコート層は、乳酸−グリコール酸共重合体からなることが好ましい。ただし、この場合でも製造工程等で混入する不可避成分は含有されていてもよい。

次に、本実施形態の細胞工学用支持体の構造について模式的に示す。図１は、本実施形態の細胞工学用支持体の任意の面における断面構造を模式的に示したものである。

なお、既述のように、本実施形態の細胞工学用支持体は、小孔構造を有する立体的な網目構造を有しており、さらに不定形な連続孔を含んでいる。図１においては、係る連続孔が分かりやすいように断面のサイズに対して非常に大きく記載している。実際には非常に小さい孔サイズの連続孔となっている。

図１に示したように、本実施形態の細胞工学用支持体１０は、骨格構造体１１と、骨格構造体１１の表面に形成されたコート層１２とを有している。そして、骨格構造体１１はその内部に連続孔１３を有している。

図１に示したようにコート層１２は、骨格構造体１１の外形を形成する表面部分に形成された表面コート層１２１のみではなく、骨格構造体１１内部の連続孔１３の表面に形成された内部コート層１２２も含むことができる。

なお、図１においてコート層１２は、骨格構造体１１の外形を形成する表面部分全体に表面コート層１２１が形成され、且つ骨格構造体１１内部に形成された連続孔１３の表面全体にも内部コート層１２２が形成された例を示しているが、係る形態に限定されるものではない。

例えば、表面コート層１２１、および／または内部コート層１２２について、骨格構造体１１の表面を完全に覆わずに骨格構造体１１の表面を一部露出している部分があっても良い。

上述のように骨格構造体１１がポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含むことで、該骨格構造体の強度を高め、細胞培養時の長期間の構造安定性を発揮することができるが、細胞の分化能は十分ではなかった。そこで、乳酸−グリコール酸共重合体を含むコート層を設けることで、細胞の分化能を高めることができる。そして、骨格構造体１１の表面を完全に覆っていなかったとしても、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含む骨格構造体のみからなる場合と比較して、細胞培養時の長期間の構造安定性を発揮しつつも、細胞の分化能を高めることができるためである。

細胞工学用支持体１０に占めるコート層１２の割合は特に限定されるものではなく、培養する細胞の種類や、用途等に応じて任意に選択することができる。ただし、細胞を培養する際に分化能を特に高める観点から、細胞工学用支持体は、コート層を１質量％以上含有することが好ましく、３質量％以上含有することがより好ましい。

なお、細胞工学用支持体が含有するコート層の割合の上限値は特に限定されるものではないが、５０質量％以下であることが好ましく、３０質量％以下であることがより好ましい。

次に、本実施形態の細胞工学用支持体の製造方法の手順について説明する。

本実施形態の細胞工学用支持体の製造方法は、以下の工程を有することができる。

ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含み、顆粒状の多孔質体である第１の顆粒状多孔質物質と、乳酸−グリコール酸共重合体を含み、顆粒状の多孔質体である第２の顆粒状多孔質物質とを混合して混合体を調製する混合工程。

混合体を型に入れ加圧・加熱する加圧・加熱工程。

各工程について説明する。
（混合工程）
混合工程においては、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含み、顆粒状の多孔質体である第１の顆粒状多孔質物質と、乳酸−グリコール酸共重合体を含み、顆粒状の多孔質体である第２の顆粒状多孔質物質とを混合して混合体を調製できる。

ここで、第１の顆粒状多孔質物質としては、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含み、小孔構造を有し、顆粒状であればよく、その調製方法は特に限定されるものではないが、例えば以下の工程により製造することができる。

まず、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を有機溶媒中に溶解する（溶解工程）。この際用いる有機溶媒としては特に限定されるものではなく、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を溶解できる有機溶媒を用いることができる。例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、四塩化炭素、アセトン、ジオキサン、テトラハイドロフランから選ばれる少なくとも一種を好ましく使用できる。

ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を有機溶媒中に溶解する際、熱処理や超音波処理を併用してもよい。また、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を溶解した溶液中の、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸の濃度は特に限定されるものではなく、例えば有機溶媒中に均一に分散できるように選択することが好ましい。具体的には例えば、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸は、有機溶媒中に１質量％以上２０質量％以下となるように溶解することが好ましい。

次に、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を溶解した溶液に、該溶液の有機溶媒に不溶で、且つポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を溶解しない液で溶解する粒子状物質を添加、混合することができる（粒子状物質添加工程）。

係る粒子状物質としては特に限定されないが、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化アンモニウム、クエン酸三ナトリウム等の水溶性の有機及び／又は無機塩を好ましく用いることができる。

また、粒子状物質は、粒子径が１００μｍ以上２０００μｍ以下の粒子を用いることが好ましく、２００μｍ以上１０００μｍ以下であることがより好ましい。

そして、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を溶解した溶液に対する粒子状物質の添加量は特に限定されず、作製する細胞工学用支持体に要求される密度等に応じて選択することができる。例えば、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を溶解した溶液に添加した場合に、粒子状物質の濃度が１．０ｇ／ｃｍ^３以上１．５ｇ／ｃｍ^３以下となるように添加することが好ましく、１．０ｇ／ｃｍ^３以上１．２５ｇ／ｃｍ^３以下となるように添加することがより好ましい。

これは、１．０ｇ／ｃｍ^３以上とすることで、後述する粉砕工程において粒子状物質を含有するポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸が特に硬質となり、粉砕がし易くなるためである。また、１．５ｇ／ｃｍ^３以下とすることで凍結乾燥工程後に得られる粒子状物質を含有するポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸中の、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸の割合を十分に高くすることができるため、収率を高めることができるからである。

粒子状物質をポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を溶解した溶液に略均一に混合する方法としては例えば、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を溶解した溶液に粒子状物質を投入して必要により攪拌、混合した後に型内に注入する方法が挙げられる。また、粒子状物質が入った型内にポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を溶解した溶液を注入する方法や、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を溶解した溶液が入った型内に粒子状物質を混入する方法などが挙げられる。

次に、粒子状物質が添加され、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を溶解した溶液を凍結した後に乾燥して有機溶媒を取り除くことができる（凍結乾燥工程）。

凍結乾燥工程を実施することで、粒子状物質を含有する小孔構造を有するポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸とすることができる。なお、この際、粒子状物質は固体の状態でポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸中に含有されていることとなる。

次に、粒子状物質を含有するポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を粉砕して一旦顆粒状とすることができる（粉砕工程）。粒子状物質がポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸中に固体（粒子状）で存在するためにポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸が硬質になるので粉砕が容易となり任意の粒子径の顆粒とすることが可能となる。

次に、粒子状物質を含有するポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を粉砕した顆粒から、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を溶解しない溶液により粒子状物質を除去することができる（粒子状物質除去工程）。

粒子状物質の除去方法は粒子状物質により異なるが、粒子状物質が塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化アンモニウム、クエン酸三ナトリウム等の水溶性の有機及び／又は無機塩を使用していれば水により粒子状物質のみを溶解して、除去できる。

以上の工程により、第１の顆粒状多孔質物質を調製することができる。なお、第１の顆粒状多孔質物質はポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含むことができるが、特にポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸からなることが好ましい。ただし、その製造工程で残留した粒子状物質等の不可避成分を含んでいてもよい。

粒子状物質を除去後、必要に応じて篩にかけて所望の粒径をもつ第１の顆粒状多孔質物質とすることもできる。

例えば後述の加圧、加熱工程供給する第１の顆粒状多孔質物質の粒径は、１００μｍ以上３０００μｍ以下であることが好ましい。

本実施形態の細胞工学用支持体中はその内部に連続孔を有することで、該連続孔内に細胞を留まらせることができ、細胞培養の効率を高めることができる。そして、本発明の発明者らの検討によれば、加圧、加熱工程に供給する第１の顆粒状多孔質物質の粒径を、１００μｍ以上３０００μｍ以下とすることで細胞工学用支持体内に十分な量の連続孔を形成できる。このため、より細胞培養の効率を高めることができるため好ましい。

また、第２の顆粒状多孔質物質としては、乳酸−グリコール酸共重合体を含み、小孔構造を有し、顆粒状であればよく、その調製方法は特に限定されるものではない。例えば上述の第１の顆粒状多孔質物質の調製方法の一構成例として挙げた方法の溶解工程において、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸に代えて、乳酸−グリコール酸共重合体を用いることで、同様にして調製することができる。

第２の顆粒状多孔質物質については乳酸−グリコール酸共重合体を含むことができるが、特に乳酸−グリコール酸共重合体からなることが好ましい。ただし、その製造工程で残留した粒子状物質等の不可避成分を含んでいてもよい。

そして、例えば上述の工程により得られた第１の顆粒状多孔質物質と、第２の顆粒状多孔質物質とを混合することで、混合体を調製することができる。

第１の顆粒状多孔質物質と、第２の顆粒状多孔質物質との混合比は特に限定されるものではなく、任意に選択することができる。例えば混合体中の第２の顆粒状多孔質物質の割合が１質量％以上５０質量％以下となるように混合することが好ましく、３質量％以上３０質量％以下となるように混合することがより好ましい。

１質量％以上とすることで、より均一なコート層を形成することができ、分化能を高めることができるためである。また、５０質量％以下とすることでより高い強度の骨格構造体とすることができ、特に長期間の構造安定性に優れるためである。

第１の顆粒状多孔質物質と、第２の顆粒状多孔質物質とを混合する方法は特に限定されるものではなく、固体同士を混合する任意の方法により混合することができる。
（加圧・加熱工程）
次に、混合体を型に入れ加圧・加熱する加圧・加熱工程について説明する。

加圧・加熱工程における加圧の条件は製造する骨格構造体の形状や大きさ等により異なるが、例えば５００ｇ／ｃｍ^２以上３０００ｇ／ｃｍ^２以下であることが好ましく、１０００ｇ／ｃｍ^２以上２０００ｇ／ｃｍ^２以下であることがより好ましい。

これは、５００ｇ／ｃｍ^２以上とすることで骨格構造体の形状安定性を特に高めることができるためであり、３０００ｇ／ｃｍ^２以下とすることで、細胞が増殖可能な孔を十分に確保することができるためである。

加熱の条件としては、乳酸−グリコール酸共重合体の融点以上、第１の顆粒状多孔質物質に含まれるポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸の融点未満であることが好ましい。特に具体的には、４０℃以上１０５℃以下で加熱を行うことが好ましく、５５℃以上９５℃以下で加熱を行うことがより好ましい。

乳酸−グリコール酸共重合体の融点以上、第１の顆粒状多孔質物質に含まれるポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸の融点未満で加熱することで、骨格構造体は維持したまま、混合体中に含まれる乳酸−グリコール酸共重合体のみを溶融させることができる。このため、骨格構造体の表面に乳酸−グリコール酸共重合体が濡れ広がることとなる。そして、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含む骨格構造体と、骨格構造体の表面に形成された乳酸−グリコール酸共重合体を含むコート層と、を有する細胞工学用支持体とすることができる。

以上に説明した本実施形態の細胞工学用支持体の製造方法により得られた細胞工学用支持体によれば、細胞培養時においても長期間の構造安定性を有する骨格構造体と、骨格構造体の表面に形成され細胞の分化能を促進することができるコート層とを含んでいる。このため、細胞培養時の長期間の構造安定性と、分化能とを両立できる細胞工学用支持体とすることができる。
［第２の実施形態］
次に、本実施形態の細胞工学用支持体の製造方法の他の構成例について説明する。

ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含む骨格構造体を準備する骨格構造体準備工程。

骨格構造体の表面に乳酸−グリコ−ル酸共重合体の粉末を分散した後、熱処理を行う熱処理工程。

そして、熱処理工程では、乳酸−グリコール酸共重合体の融点以上、骨格構造体に含まれるポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸の融点未満まで加熱することができる。

以下、各工程について説明する。
（骨格構造体準備工程）
まず、骨格構造体準備工程について説明する。骨格構造体準備工程では、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含む骨格構造体を準備することができる。

ここで準備する骨格構造体については特に限定されるものではないが、既述のように小孔構造を有する立体的な網目構造を有しており、さらに不定形な連続孔を含むことが好ましい。

係る骨格構造体は例えば以下の手順により製造することもできる。

骨格構造体は、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含む顆粒状の多孔質体を所望の型内に入れ、加圧・加熱することによって製造することができる（加圧、加熱工程）。

なお、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含む顆粒状の多孔質体の調製方法の一構成例については、第１の実施形態で既に説明したためここでは説明を省略する。

加圧・加熱工程の加圧の条件は製造する骨格構造体の形状や大きさ等により異なるが、例えば５００ｇ／ｃｍ^２以上３０００ｇ／ｃｍ^２以下であることが好ましく、１０００ｇ／ｃｍ^２以上２０００ｇ／ｃｍ^２以下であることがより好ましい。

加熱の条件も骨格構造体の形状や大きさによって異なるが、上述の加圧条件で体積を保って加熱するのであれば６０℃以上２００℃以下であることが好ましい。
６０℃以上とすることで、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸同士の結合を十分に高めることができ、形状安定性を特に高めることができる。また、２００℃以下とすることで、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸が変性することを確実に防ぐことができる。
（熱処理工程）
次に熱処理工程について説明する。熱処理工程では、骨格構造体の表面に乳酸−グリコ−ル酸共重合体の粉末を分散した後、熱処理を行うことができる。

骨格構造体の表面に分散する乳酸−グリコール酸共重合体粉末については特に限定されるものではないが、その粒径が小さい方が、例えば骨格構造体内の連続孔等に入り易く、骨格構造体の表面により均一にコート層を形成することができるため、好ましい。

具体的には例えば、平均粒径が１００μｍ以上７１０μｍ以下であることが好ましく、１５０μｍ以上５００μｍ以下であることがより好ましい。

ここでいう平均粒径とは、レーザー回折・散乱法によって求めた粒度分布における積算値５０％での粒径を意味する。

この際分散する乳酸−グリコール酸共重合体粉末の量は特に限定されるものではなく、任意に選択することができる。例えば、骨格構造体と、分散する乳酸−グリコール酸共重合体粉末との質量の合計のうち、分散する乳酸−グリコール酸共重合体粉末の割合が１質量％以上５０質量％以下であることが好ましく、３質量％以上３０質量％以下であることがより好ましい。

これは、１質量％以上とすることで、より均一なコート層を形成することができ、分化能を高めることができるためである。また、３０質量％以下とすることでより高い強度の骨格構造体とすることができ、特に長期間の構造安定性に優れるためである。

そして、骨格構造体の表面に乳酸−グリコール酸共重合体の粉末を分散した後、熱処理を実施できる。この際の加熱の条件としては、乳酸−グリコール酸共重合体の融点以上、骨格構造体に含まれるポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸の融点未満であることが好ましい。特に具体的には、４０℃以上１０５℃以下で加熱を行うことが好ましく、５５℃以上９５℃以下で加熱を行うことがより好ましい。

乳酸−グリコール酸共重合体の融点以上、骨格構造体に含まれるポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸の融点未満で加熱することで、骨格構造体は維持したまま、骨格構造体の表面に分散した乳酸−グリコール酸共重合体のみを溶融させることができる。このため、骨格構造体の表面に乳酸−グリコール酸共重合体が濡れ拡がることとなる。そして、ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含む骨格構造体と、骨格構造体の表面に形成された乳酸−グリコール酸共重合体を含むコート層と、を有する細胞工学用支持体とすることができる。

以上に説明した本実施形態の細胞工学用支持体の製造方法により得られる細胞工学用支持体は、第１の実施形態で説明した細胞工学用支持体と同様の構造を有することができる。従って、本実施形態の細胞工学用支持体の製造方法により得られる細胞工学用支持体によれば、細胞培養時においても長期間の構造安定性を有する骨格構造体と、骨格構造体の表面に形成され細胞の分化能を促進することができるコート層とを含んでいる。このため、細胞培養時の長期間の構造安定性と、分化能とを両立できる細胞工学用支持体とすることができる。

以下に、本発明の実施例及び比較例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例によって、なんら限定されるものではない。
［実施例１］
以下の手順により細胞工学用支持体を作製した。

細胞工学用支持体の作製手順について説明する。
（混合工程）
まず、以下の手順により、ポリ−Ｌ−乳酸からなり、顆粒状の多孔質体である第１の顆粒状多孔質物質を準備した。

１，４−ジオキサン中にポリ−Ｌ−乳酸（重量平均分子量約２５０，０００）を６質量％の濃度となるように入れ、攪拌機で攪拌し溶解した（溶解工程）。

次いで、ポリ−Ｌ−乳酸が溶解された１，４−ジオキサン溶液にクエン酸三ナトリウム粉末（粒子径２００μｍ〜５００μｍ）を濃度が約１．０２ｇ／ｃｍ^３となるように略均一に混合し（粒子状物質添加工程）、型内に入れた。

その後、フリーザー（三洋電機社製商品名：ＭＤＦ−０２８１ＡＴ）にて−３０℃の条件で凍結させた。次いで真空乾燥機（ヤマト科学社製商品名：ＤＰ４３）にて減圧下で４８時間乾燥させることによって１，４−ジオキサンを取り除いてクエン酸三ナトリウム粉末を略均一に含有したポリ−Ｌ−乳酸である高分子体を得た（凍結乾燥工程）。

この高分子体を小片に切断し、遊星回転用のポットミルで２０分間粉砕した（粉砕工程）。

粉砕した高分子体をフラスコに入れ蒸留水を加え攪拌させてクエン酸三ナトリウムを取り除いた（粒子状物質除去工程）。次いで、シャーレに移して真空乾燥機で４８時間乾燥させ、篩にかけて粒子径７００〜１４００μｍ，平均孔径約５μｍのポリ−Ｌ−乳酸からなる第１の顆粒状多孔質物質を得た。

第２の顆粒状多孔質物質は、溶解工程において、１，４−ジオキサン中に乳酸−グリコール酸共重合体を６質量％の濃度となるように入れた点以外は、上述の第１の顆粒状多孔質物質を調製した場合と同様にして調製した。

得られた第１の顆粒状多孔質物質と、第２の顆粒状多孔質物質とを、混合体中の第２の顆粒状多孔質物質が１０質量％となるように秤量、混合して、混合体とした。
（加圧・加熱工程）
得られた混合体を内径９ｍｍ×高さ１０ｍｍのガラス容器内に高さが約７ｍｍとなるように入れた。そして、直径９ｍｍのチタン棒で１５００ｇ／ｃｍ^２で加圧した状態の体積を保って５０℃で２０分間加熱して、直径９ｍｍ×高さ約７ｍｍの円柱形状をした細胞工学用支持体が得られた。
［実施例２］
第１の顆粒状多孔質物質として、ポリ−Ｄ−乳酸からなる顆粒状の多孔質体を用いた点以外は、実施例１と同様にして細胞工学用支持体を作製し、評価を行った。

ポリ−Ｄ−乳酸からなる第１の顆粒状多孔質物質は、第１の顆粒状多孔質物質を調製する際の溶解工程において、１，４−ジオキサン中にポリ−Ｄ−乳酸（重量平均分子量約２５０，０００）を６質量％の濃度となるように入れ、攪拌機で攪拌し溶解した点以外は、実施例１の場合と同様にして作製した。
［実施例３］
以下の手順により細胞工学用支持体を作製した。

細胞工学用支持体の作製手順について説明する。
（骨格構造体準備工程）
まず、以下の手順により、ポリ−Ｌ−乳酸を含有する骨格構造体を準備する骨格構造体準備工程を実施した。

粉砕した高分子体をフラスコに入れ蒸留水を加え攪拌させてクエン酸三ナトリウムを取り除いた（粒子状物質除去工程）。次いで、シャーレに移して真空乾燥機で４８時間乾燥させ、篩にかけて粒子径７００〜１４００μｍ，平均孔径約５μｍのポリ−Ｌ−乳酸の顆粒状多孔質物質を得た。

得られたポリ−Ｌ−乳酸の顆粒状多孔質物質を内径９ｍｍ×高さ１０ｍｍのガラス容器内に高さが約７ｍｍとなるように入れた。そして、直径９ｍｍのガラス棒で１５００ｇ／ｃｍ^２で加圧した状態の体積を保って１８０℃で３０分間加熱して、直径９ｍｍ×高さ約４ｍｍの円柱形状をした骨格構造体を得た（加圧、加熱工程）。

なお、得られた骨格構造体を電子顕微鏡で観察したところ、隔壁に小孔構造を有する立体的な網目構造中に不定形な連続孔を有する構造であることが確認できた。
（熱処理工程）
次に得られた骨格構造体を熱処理するための加熱炉内に配置し、該骨格構造体の表面に、平均粒径が２００μｍの乳酸−グリコ−ル酸共重合体粉末を分散した。なおこの際、骨格構造体と、分散する乳酸−グリコール酸共重合体粉末との質量の合計のうち、分散する乳酸−グリコール酸共重合体粉末の割合が２０質量％となるように、乳酸−グリコール酸共重合体粉末を分散した。

そして、９５℃で２０分間加熱することにより細胞工学用支持体を得た。
［実施例４］
ポリ−Ｄ−乳酸を含有する骨格構造体を用いた点以外は実施例３と同様にして、細胞工学用支持体を作製し、評価を行った。

ポリ−Ｄ−乳酸を含有する骨格構造体は、骨格構造体準備工程の溶解工程において、１，４−ジオキサン中にポリ−Ｄ−乳酸（重量平均分子量約２５０，０００）を６質量％の濃度となるように入れ、攪拌機で攪拌し溶解した点以外は、実施例３の場合と同様にして作製した。

１０細胞工学用支持体
１１骨格構造体
１２コート層

Claims

ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含む骨格構造体と、
前記骨格構造体の表面に形成された乳酸−グリコール酸共重合体を含むコート層と、を有する細胞工学用支持体の製造方法であって、
ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含む、顆粒状の多孔質体である第１の顆粒状多孔質物質と、乳酸−グリコール酸共重合体を含む、顆粒状の多孔質体である第２の顆粒状多孔質物質とを混合して混合体を調製する混合工程と、
前記混合体を型に入れ加圧・加熱する加圧・加熱工程と、を有し、
前記加圧・加熱工程では、前記乳酸−グリコール酸共重合体の融点以上、前記第１の顆粒状多孔質物質に含まれるポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸の融点未満まで加熱する細胞工学用支持体の製造方法。
ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含む骨格構造体と、
前記骨格構造体の表面に形成された乳酸−グリコール酸共重合体を含むコート層と、を有する細胞工学用支持体の製造方法であって、
ポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸を含む前記骨格構造体を準備する骨格構造体準備工程と、
前記骨格構造体の表面に乳酸−グリコ−ル酸共重合体の粉末を分散した後、熱処理を行う熱処理工程と、を有し、
前記熱処理工程では、前記乳酸−グリコール酸共重合体の融点以上、前記骨格構造体に含まれるポリ−Ｄ−乳酸、またはポリ−Ｌ−乳酸の融点未満まで加熱する細胞工学用支持体の製造方法。