JP2017012201A - 種間特異的結合ドメイン - Google Patents

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Abstract

【課題】ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３（イプシロン）鎖のエピトープと結合する能力を有するヒト結合ドメインを含むポリペプチド、並びに前述のポリプチドを作製するためのプロセスを提供する。【解決手段】このポリペプチドをコードする核酸、それを含むベクター、及びそのベクターを含む宿主細胞。このポリペプチドを含む医薬組成物、及びこのポリペプチドの医学的な使用。ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε（ＣＤ３イプシロン）のエピトープと結合する能力を有する異種間に特異的な結合ドメインを含むポリペプチドを同定するための方法。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３（イプシロン）のエピトープと結合する能力を有する第一のヒト結合ドメインを含むポリペプチド、並びに前述のポリプチドを作製するためのプロセスに関する。本発明はさらに、このポリペプチドをコードする核酸、それを含むベクター、及びそのベクターを含む宿主細胞に関する。別の局面では、本発明は、前述のポリペプチドを含む医薬組成物、及びこのポリペプチドの医学的な使用を提供する。
Ｔ細胞認識は、ペプチドＭＨＣ（ｐＭＨＣ）のペプチド負荷分子と相互作用する、クロノタイプ的に分布するアルファベータ及びガンマデルタＴ細胞レセプター（ＴｃＲ）により媒介される（Ｄａｖｉｓ＆ Ｂｊｏｒｋｍａｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３３４ （１９８８）， ３９５−４０２）。ＴｃＲの抗原特異的鎖は、シグナリングドメインを持たず、その代わりに保存されたマルチサブユニットシグナル伝達装置ＣＤ３に結合する（Ｃａｌｌ，Ｃｅｌｌ １１１ （２００２）， ９６７− ９７９， Ａｌａｒｃｏｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． １９１ （２００３）， ３８−４６， Ｍａｌｉｓｓｅｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ． １９１ （２００３）， ７−２７）。ＴｃＲライゲーションがシグナル伝達装置に直接通じる機構は、Ｔ細胞生物学の根本的な疑問のままである（Ａｌａｒｃｏｎ，上記引用文献；Ｄａｖｉｓ， Ｃｅｌｌ １１０ （２００２）， ２８５−２８７））。持続したＴ細胞応答が、コレセプターの関与、ＴｃＲオリゴマー化及び免疫シナプス中のＴｃＲ−ｐＭＨＣ複合体の高次配列を含むことは明らかなようである（Ｄａｖｉｓ＆ ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｒｗｅ， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． １１ （２００１）， Ｒ２８９−Ｒ２９１， Ｄａｖｉｓ， Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４ （２００３），２１７− ２２４）。しかし、非常に早いＴｃＲシグナル伝達は、これらの事象の非存在下で起こり、ＣＤ３イプシロン中のリガンドが誘起するコンフォメーション変化を含むかもしれない（Ａｌａｒｃｏｎ，上記引用文献，Ｄａｖｉｓ （２００２），上記引用文献， Ｇｉｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６ （２００１）， １１１７４−１１１７９， Ｇｉｌ， Ｃｅｌｌ １０９（２００２）， ９０１ −９１２）。シグナル伝達複合体のイプシロン、ガンマ、デルタ及びゼータサブユニットは互いに会合して、ＣＤ３イプシロン−ガンマヘテロダイマー、ＣＤ３イプシロン−デルタヘテロダイマー及びＣＤ３ゼータ−ゼータホモダイマーを形成する（Ｃａｌｌ，上記引用文献）。様々な研究は、ＣＤ３分子がアルファベータＴｃＲの正常な細胞表面発現及び通常のＴ細胞発達にとって重要であることを明らかにした（Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３ （１９８８）， ８５２８−８５３６， Ｗａｎｇ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８ （１９９８）， １３７５−１３８０，Ｋａｐｐｅｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７ （１９９５）， ４４１−４４７）。マウスＣＤ３イプシロンガンマヘテロダイマーのエクトドメイン断片の溶液構造は、イプシロンガンマサブユニットが、両方とも、互いに相互作用して異常な側々ダイマーコンフィグレーションを形成するＣ２セットＩｇドメインであることを示した（Ｓｕｎ，Ｃｅｌｌ １０５ （２００１）， ９１３− ９２３）。システインに富んだ軸は、ＣＤ３の二量体化を進めるのに重要な役割を果たすようであるが（Ｓｕ，上記引用文献，Ｂｏｒｒｏｔｏ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３ （１９９８）， １２８０７−１２８１６）、ＣＤ３イプシロン及びＣＤ３ガンマの細胞外ドメインによる相互作用は、これらのタンパク質とＴｃＲベータとの集合に十分である（Ｍａｎｏｌｉｏｓ，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４ （１９９４）， ８４−９２， Ｍａｎｏｌｉｏｓ ＆ Ｌｉ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７３ （１９９５），５３２−５３６）。未だ議論の的となっているが、ＴｃＲの優勢な化学量論は、１つのアルファベータＴｃＲ、１つのＣＤ３イプシロンガンマヘテロダイマー、１つのＣＤ３イプシロンデルタヘテロダイマー及び１つのＣＤ３ゼータゼータホモダイマーを含むことが最も可能性がある（Ｃａｌｌ，上記引用文献）。免疫応答におけるヒトＣＤ３イプシロンガンマヘテロダイマーの中心的な役割を仮定して、治療抗体ＯＫＴ３に結合したこの複合体の結晶構造が最近解明された（Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎ，ＰＮＡＳ １０１， （２００４）， ７６７５−７６８０）。
多くの治療戦略は、ＴｃＲシグナル伝達を標的にしてＴ細胞免疫性を調整し、特に免疫抑制領域で臨床的に広く利用されている抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）がある。ＣＤ３特異性マウスｍＡｂＯＫＴ３は、ヒトへの使用に認可された最初のｍＡｂであり（Ｓｇｒｏ， Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ １０５ （１９９５）， ２３−２９）、移植（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ， Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ７ （１９９３）， ４２２−４３０， Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３ （２００３）， １２３−１３２， Ｋｕｍａｒ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． Ｐｒｏｃ． ３０ （１９９８）， １３５１−１３５２）、１型糖尿病（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ （２００３），上記引用文献）及び乾癬（Ｕｔｓｅｔ，Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ２９ （２００２）， １９０７−１９１３）における免疫抑制剤として臨床的に広く使用されている。さらに、抗ＣＤ３ｍＡｂは、部分的なＴ細胞シグナル伝達及びクローンアネルギーを誘起することがある（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５ （１９９７）， １４１３−１４２２）。ＯＫＴ３は、潜在的なＴ細胞マイトジェン（Ｖａｎ Ｗａｕｖｅ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２４（１９８０）， ２７０８−１８）並びに潜在的なＴ細胞キラー（Ｗｏｎｇ， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５０ （１９９０）， ６８３−９）として、文献に記載されてきた。ＯＫＴ３は、時間依存的にこれらの活性の両方を示す。サイトカイン放出につながるＴ細胞の早期活性化に続き、さらにＯＫＴ３を投与すると、公知のＴ細胞機能の全てを後に阻害する。同種移植組織拒絶の低減又はさらには全廃のために治療レジメンにおいて免疫抑制剤としてそのような広い用途をＯＫＴ３が見いだしたのは、この後期のＴ細胞機能の阻害による。
ＯＫＴ３は、急性拒絶反応に主要な役割を果たす全てのＴ細胞の機能を阻害することにより、同種移植組織拒絶を一変させていることが最も確からしい。ＯＫＴ３は、Ｔ細胞（ＴＣＲ）の抗原認識構造に関連しシグナル伝達に必須のヒトＴ細胞の細胞膜中でＣＤ３複合体と反応しその機能を阻害する。ＴＣＲ／ＣＤ３のどのサブユニットがＯＫＴ３と結合するかは、多くの研究のテーマであった。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のイプシロンサブユニットに対するＯＫＴ３の特異性を指摘したエビデンスもいくつかあった（Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅ，Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １ （１９８９）， ５４６−５０； Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎ， ＰＮＡＳ １０１， （２００４）， ７６７５−７６８０）。さらなるエビデンスは、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とのＯＫＴ３の結合には、この複合体の他のサブユニットの存在が必要であることを示している（Ｓａｌｍｅｒｏｎ，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７ （１９９１）， ３０４７−５２）。
ＣＤ３分子に特異的である他の周知の抗体は、Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅ， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １ （１９８９）， ５４６−５０に列記されている。上述のとおり、そのようなＣＤ３特異性抗体は、リンホカイン産生（ＶｏｎＷｕｓｓｏｗ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２７ （１９８１）， １１９７； Ｐａｌａｃｉｏｕｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２８ （１９８２）， ３３７）、増殖（ＶａｎＷａｕｖｅ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２４ （１９８０）， ２７０８−１８）及びサプレッサーＴ細胞誘起（Ｋｕｎｉｃｋａ， ｉｎ "Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＩＩ" １ （１９８６），２２３）などの種々のＴ細胞応答を誘起することができる。すなわち、実験条件によって、ＣＤ３特異性モノクローナル抗体は、細胞障害性を阻害することも、誘起することもできる（Ｌｅｅｗｅｎｂｅｒｇ，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３４ （１９８５）， ３７７０； Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３６ （１９８６） １５７９； Ｐｌａｔｓｏｕｃａｓ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８ （１９８１）， ４５００； Ｉｔｏｈ， Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０８ （１９８７）， ２８３−９６；Ｍｅｎｔｚｅｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３５ （１９８５）， ３４； Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １５５ （１９８２）， １５７９； Ｃｈｏｉ（２００１）， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１， ９４−１０６； Ｘｕ （２０００）， Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００， １６−２６； Ｋｉｍｂａｌｌ（１９９５）， Ｔｒａｎｓｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３， ２１２−２２１）。
当分野に記載されている多くのＣＤ３抗体がＣＤ３複合体のＣＤ３イプシロンサブユニットを認識すると報告されているが、それらのほとんどは、実際は、立体配座エピトープに結合しており、そのためＴＣＲのネイティブコンテクストにおけるＣＤ３イプシロンを認識しているのみである。立体配座エピトープは、一次配列中では分かれているがネイティブタンパク質／抗原中にポリペプチドが折り畳まれる時分子の表面で一緒になる、２つ以上の別々のアミノ酸残基の存在により特徴づけられる（Ｓｅｌａ，（１９６９） Ｓｃｉｅｎｃｅ １６６， １３６５及びＬａｖｅｒ， （１９９０） Ｃｅｌｌ ６１ ， ５５３−６）。当分野に記載されているＣＤ３イプシロン抗体に結合される立体配座エピトープは、２つの群に分けることができる。主要な群では、前記エピトープは、２つのＣＤ３サブユニット、例えばＣＤ３イプシロン鎖及びＣＤ３ガンマ鎖又はＣＤ３デルタ鎖により形成されている。例えば、最も広く使用されているＣＤ３イプシロンモノクローナル抗体ＯＫＴ３、ＷＴ３１、ＵＣＨＴ１、７Ｄ６及びＬｅｕ−４は、ＣＤ３イプシロン鎖により単独にトランスフェクトされた細胞には結合しなかったことが複数の研究で見出された。しかし、これらの抗体は、ＣＤ３イプシロンとＣＤ３ガンマ又はＣＤ３デルタの組み合わせにより二重にトランスフェクトされた細胞を染色した（Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅ，上記引用文献；Ｌａｗ， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４ （２００２）， ３８９−４００； Ｓａｌｍｅｒｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７ （１９９１）， ３０４７−５２；Ｃｏｕｌｉｅ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１ （１９９１）， １７０３−９）。第２のより小さな群では、立体配座エピトープは、ＣＤ３イプシロンサブユニット自体の中に形成される。この群のメンバーは、例えば変性ＣＤ３イプシロンに対して産出されたｍＡｂＡＰＡ１／１である（Ｒｉｓｕｅｎｏ， Ｂｌｏｏｄ １０６ （２００５）， ６０１−８）。ひとまとめにすると、当分野に記載されているＣＤ３イプシロン抗体のほとんどは、ＣＤ３の２つ以上のサブユニット上に位置する立体配座エピトープを認識する。これらのエピトープの三次元構造を形成する別々のアミノ酸残基は、この結果、ＣＤ３イプシロンサブユニット自体の上に位置するか、ＣＤ３イプシロンサブユニットとＣＤ３ガンマ又はＣＤ３デルタなどの他のＣＤ３サブユニットの上に位置することがある。
ＣＤ３抗体に関する他の問題は、多くのＣＤ３抗体が種特異的であると見いだされたことである。他のモノクローナル抗体では一般的に正しいとされているとおり、抗ＣＤ３モノクローナル抗体は、それらの標的分子の高度に特異的な認識により機能する。それらは、標的ＣＤ３分子上の単一の部位又はエピトープのみを認識する。例えば、最も広く使用されキャラクタリゼーションが詳細に行われているＣＤ３複合体に特異的なモノクローナル抗体の１つはＯＫＴ３である。この抗体は、チンパンジーのＣＤ３と反応するが、マカクザルなど他の霊長類のＣＤ３ホモログ又はイヌＣＤ３とは反応しない（Ｓａｎｄｕｓｋｙｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｐｒｉｍａｔｏｌ． １５ （１９８６）， ４４１−４５１）。抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＵＣＨＴ１もチンパンジーのＣＤ３とは反応性であるが、マカクザルのＣＤ３とは反応しない（発明者らのデータ）。その一方で、マカクザル抗原を認識するが、そのヒト対応物を認識しないモノクローナル抗体の例もある。この群の１例は、マカクザル由来のＣＤ３を対象とするモノクローナル抗体ＦＮ−１８である（Ｕｄａｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｐｒｉｍａｔｏｌ． ３０ （２００１）， １４１−１４７）。興味深いことに、カニクイザルの約１２％の末梢リンパ球が、マカクザル中のＣＤ３抗原の多形性により、抗アカゲザルＣＤ３モノクローナル抗体（ＦＮ−１８）との反応性を欠くことが見いだされている。Ｕｄａらは、ＦＮ−１８と反応性である動物から誘導されたＣＤ３と比較し、ＦＮ−１８と反応性でないカニクイザルのＣＤ３配列中にある２つのアミノ酸の置換を記載した（Ｕｄａｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ Ｐｒｉｍａｔｏｌ． ３２ （２００３）， １０５−１０； Ｕｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ Ｐｒｉｍａｔｏｌ． ３３ （２００４），３４−７）。
ＣＤ３モノクローナル抗体及びその断片に固有のこの識別能力、すなわち種特異性は、ヒトの疾患を治療するための治療薬としての開発には著しい妨げである。市場の認可を得るためには、どの新規薬剤候補も、厳しい試験を通過しなくてはならない。この試験は、前臨床相と臨床相に分けることができる。後者は、一般的に公知の臨床相Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩとしてさらに分かれているが、ヒトの患者に実施され、前者は動物に実施される。前臨床試験の目的は、薬剤候補が望まれる活性を持ち、最も重要なことであるが安全であることを証明することである。動物での安全性及び薬剤候補の見込みのある効力が前臨床試験で確立された場合にのみ、その薬剤候補は、それぞれの規制当局によりヒトへの臨床試験を認可されるであろう。以下の３種の方法で、（ｉ）関連種、すなわち薬剤候補がオルソログ抗原を認識できる種において、（ｉｉ）ヒトの抗原を含むトランスジェニック動物において、及び（ｉｉｉ）動物に存在するオルソログ抗原に結合できる薬剤候補のサロゲートの使用により、薬剤候補の動物での安全性を試験することができる。トランスジェニック動物の限界は、この技術が典型的には齧歯動物に限られることである。齧歯動物と人間の間には生理機能に著しい違いがあり、安全性の結果は容易にヒトに外挿できない。薬剤候補のサロゲートの限界は、実際の薬剤候補に比べて異なる組成物であり、多くの場合使用される動物は先に議論した限界を持つ齧歯動物である。したがって、齧歯動物で作られた前臨床データは、薬剤候補に関して限られた予測力しかない。安全性試験の選択の手法は、関連種、好ましくは下等霊長類の利用である。当分野に記載される人間の治療介入に好適なＣＤ３結合分子の目下の限界は、関連種が高等霊長類、特にチンパンジーであることである。チンパンジーは絶滅危惧種と考えられており、ヒトに似た性質のためそのような動物を薬剤安全性試験に使用することは欧州では禁じられており、他の地域でも非常に制限されている。
本発明は、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε（イプシロン）鎖のエピトープと結合する能力を有する、好ましくはヒトの結合ドメインを含むポリペプチドに関し、ここで、このエピトープは配列番号２、４、６、又は８から成る群に含まれるアミノ酸配列の一部分である。配列番号２、４、６、及び８に示す配列、並びにその機能性断片は、コンテクスト非依存性な（ｃｏｎｔｅｘｔｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）ＣＤ３エピトープである。
本発明の利点は、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε（イプシロン）鎖に異種間特異性を示す、結合ドメインを含むポリペプチドの提供であり、これは、霊長類におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性及び／又は薬物動態学的なプロファイルの前臨床評価のために、且つ理想的な形態ではヒトの薬剤として使用できる。同じ分子が、前臨床動物試験並びにヒトでの臨床試験にも使用できる。これにより、種に特異的なサロゲート分子に比べて、動物試験が高度に同等な結果を生みだし、予測力がはるかに増す。本発明において、当分野に記載されるＣＤ３イプシロンの他の公知のエピトープ全てとは対照的に、ＣＤ３複合体のネイティブ環境から取り出された（そして、ＥｐＣＡＭ又は免疫グロブリンＦｃ部などの異種アミノ酸配列に融合した）時にその三次元構造完全性を維持する、ＣＤ３イプシロンの細胞外ドメインのＮ末端１−２７アミノ酸残基ポリペプチド断片が、驚くべきことに確認された。
本発明に提供されるＣＤ３エピトープのコンテクスト非依存性は、ＣＤ３イプシロンの最初の２７のＮ末端アミノ酸又はこの２７アミノ酸ストレッチの機能性断片に相当する。ＣＤ３エピトープに関連して本願で使用される「コンテクスト非依存性」という句は、本願記載の本発明の結合分子／抗体分子の結合が、抗原決定基又はエピトープを取り巻く立体配座、配列又は構造の変化又は修飾につながらないことを意味する。対照的に、従来のＣＤ３結合分子（例えば、国際公開第９９／５４４４０号又は国際公開第０４／１０６３８０号に開示される）により認識されるＣＤ３エピトープは、コンテクスト非依存性エピトープのＣＤ３イプシロン鎖Ｃ末端からＮ末端１−２７アミノ酸に局在化するが、その場合、イプシロン鎖の残りの部分に埋め込まれ、イプシロン鎖とＣＤ３ガンマ又はデルタ鎖とのヘテロダイマー化により正しい位置に保持されないと正しいコンフォメーションがとれない。
本願に提供されコンテクスト非依存性ＣＤ３エピトープに対して発生した（対象とした）二重特異性結合分子の一部として、抗ＣＤ３結合分子は、Ｔ細胞再分布に関して驚くべき臨床上の改善及びさらに好ましい安全性プロファイルを与える。理論に拘束されないが、ＣＤ３エピトープはコンテクスト非依存性であり、ＣＤ３複合体の残りの部分にあまり影響を与えずに自律的で完全なサブドメインを形成するので、本願に提供されるＣＤ３結合分子は、コンテクスト依存性ＣＤ３エピトープを認識する従来のＣＤ３結合分子（国際公開第９９／５４４４０号に提供されている様な分子）よりも、ＣＤ３コンフォメーションに誘起するアロステリック変化が少ない。
二重特異性結合分子の一部として本発明のＣＤ３結合分子のＣＤ３エピトープのコンテクスト非依存性は、本発明のＣＤ３結合分子による治療の開始段階におけるより低いＴ細胞再分布に関連し、コンテクスト依存性ＣＤ３エピトープを認識する、当分野に公知の従来のＣＤ３結合分子と比べて、本発明のＣＤ３結合分子の安全性プロファイルをより良好にする。特に、ＣＤ３結合分子による治療の開始段階におけるＴ細胞再分布は、ＣＮＳ有害事象の主な危険因子であるため、コンテクスト依存性ではなくコンテクスト非依存性のＣＤ３エピトープを認識することにより、本発明のＣＤ３結合分子は、当分野に公知のＣＤ３結合分子に勝り、著しい安全性の利点を有する。従来のＣＤ３結合分子による治療の開始段階におけるＴ細胞再分布に関連したそのようなＣＮＳ有害事象を経験する患者は、通常混乱と失見当職になり、場合によっては尿失禁も患う。混乱は、患者が自身の通常の明晰さのレベルで考えられない、精神状態の変化である。患者は、通常集中が困難となり、思考が不鮮明で不明確であるだけでなく、しばしば著しく遅くなる。従来のＣＤ３結合分子による治療の開始段階におけるＴ細胞再分布に関連したＣＮＳ有害事象を経験する患者は、記憶喪失も患うことがある。多くの場合、混乱により、人及び／又は場所を認識する能力又は時間及び日付が分かる能力が失われる。方角が分からない感覚は混乱には通常のものであり、意志決定能力が損なわれる。従来のＣＤ３結合分子による治療の開始段階におけるＴ細胞再分布に関連したＣＮＳ有害事象は、不明瞭な発語及び／又は言葉を探すことの困難を含むこともある。この障害は、言語の表現及び理解並びに読みとり及び書きとりの両方を損なうことがある。尿失禁の他に、患者によっては、空間識失調及び目眩も、従来のＣＤ３結合分子による治療の開始段階におけるＴ細胞の再分布に関連したＣＮＳ有害事象に加わることがある。
ＣＤ３イプシロンの言及された２７アミノ酸Ｎ末端ポリペプチド断片内の三次元構造の維持は、インビトロでＮ末端ＣＤ３イプシロンポリペプチド断片に、インビボでＴ細胞上のネイティブ（ＣＤ３イプシロンサブユニット）ＣＤ３複合体に同じ結合親和性で結合することが可能な、好ましくはヒトの、結合ドメインの生成に使用できる。これらのデータは、本願に記載のＮ末端断片が、インビボで通常存在する構造に類似した三次コンフォメーションを形成していることを強く示している。ＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１−２７の構造完全性の重要性に関して非常に微妙な試験が実施された。ＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１−２７の個々のアミノ酸をアラニンに変えて（アラニンスキャニング）、微小な混乱に対するＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１−２７の感受性を試験した。本発明の二重特異性結合分子の一部としてのＣＤ３特異性抗体分子を使用して、ＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１−２７のアラニン変異体への結合を試験した（添付される実施例５参照）。断片の正にＮ末端での最初の５つのアミノ酸残基及びＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１−２７の位置２３及び２５の２つのアミノ酸の個々の変化が、抗体分子の結合に重要であった。残基Ｑ（位置１でのグルタミン）、Ｄ（位置２でのアスパラギン酸）、Ｇ（位置３でのグリシン）、Ｎ（位置４でのアスパラギン）及びＥ（位置５でのグルタミン酸）を含む、位置１〜５の領域のアミノ酸残基をアラニンに置換すると、前記断片に対する、本発明の、好ましくはヒトの、結合分子の結合が無くなった。その一方で、本発明の、好ましくはヒトの、結合分子の少なくともいくつかでは、言及された断片Ｔ（位置２３でのスレオニン）及びＩ（位置２５でのイソロイシン）のＣ末端での２つのアミノ酸残基、は、本発明の、好ましくはヒトの、結合分子への結合エネルギーを低下させた。
予期せぬことに、このように単離された、好ましくはヒトの、結合分子が、ＣＤ３イプシロンのヒトのＮ末端断片だけでなく、新世界猿（マーモセット、カリスリクス・ジャカス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘｊａｃｃｈｕｓ）；サグイヌス・オイディプス（Ｓａｇｕｉｎｕｓ ｏｅｄｉｐｕｓ）；サイミリ・シウレウス（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ））及び旧世界猿（カニクイザルとしても知られるマカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）；又はアカゲザルとしても知られるマカカ・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ））を含む種々の霊長類のＣＤ３イプシロンの対応する相同断片も認識することが見いだされた。したがって、本発明のＣＤ３結合分子の多霊長類特異性が検出された。以下の配列分析は、ＣＤ３イプシロンの細胞外ドメインのＮ末端で高度に相同性のある配列ストレッチを、ヒト及び霊長類が共有することを確認した。
ＣＤ３イプシロンに特異的な、好ましくはヒトの結合分子であって、同一分子を前臨床動物試験に、臨床試験にも、さらにヒトの治療にも使用できる結合分子を発生させることが可能であることが本発明において見いだされた。これは、ヒトＣＤ３イプシロンへの結合に加え（おそらくはチンパンジー対応物との遺伝的類似性により）新世界猿及び旧世界猿を含む、非チンパンジー霊長類の前記抗原のホモログにも結合する、好ましくはヒトの結合分子の予期せぬ確認による。以下の実施例に示されるとおり、前記ＣＤ３イプシロン特異的な、好ましくはヒトの、結合分子は、ガン又は免疫疾患を含むが、これらに限定されない種々の疾患に対する治療薬を生成するため、二重特異性単鎖抗体に一体化できる。したがって、サロゲートＣＤ３イプシロン結合ドメイン又は系統発生的に（ヒトから）遠い種での試験のためにそれを含む二重特異性単鎖抗体を構築する必要は消える。結果として、臨床試験でヒトに投与されるよう意図されるのと正に同じ分子を動物の前臨床試験に使用でき、それに続く市場の認可及び治療薬投与にも使用できる。後のヒトへの投与と同じ分子を前臨床動物試験に使用する能力があるので、前臨床動物試験で得られるデータのヒトの場合への適応性が限定される危険が、事実上消え、又は少なくとも大幅に低減する。手短に言うと、ヒトに実際に投与されるであろう分子と同じ分子を動物に使用して前臨床安全性データを得ることは、ヒトの関連するシナリオへのデータの適応性を確実にするために多くをなす。対照的に、サロゲート分子を使用する従来の手法では、前記サロゲート分子は前臨床安全性評価に使用される動物試験システムに分子的に適応させる必要がある。したがって、実際にヒトの治療に使用されるべき分子は、薬物動態パラメータ及び／又は生物的活性の前臨床試験に使用されるサロゲート分子とはその配列が異なり、おそらくは構造も異なり、前臨床動物試験で得られるデータのヒトの場合への適応性／転移性が限定される結果となる。サロゲート分子の使用は、完全に新しいコンストラクトの構築、製造、精製及びキャラクタリゼーションを必要とする。それにより、その分子を得るために追加の開発コスト及び時間がかかる。要するに、ヒトの治療に使用されるべき実際の薬剤に加えサロゲートは別に開発される必要があり、そのため２つの分子の２つの開発ラインが実施されなくてはならない。したがって、本願に記載される異種間特異性を示すヒト結合分子又は抗体系コンストラクトの主な利点は、同一の分子が、ヒトの治療薬のために、及び前臨床動物試験に使用できることである。
ヒト及び非チンパンジー霊長類のＣＤ３イプシロン鎖のエピトープに結合可能な本発明の結合分子は、ヒト起源であることが好ましい。
さらに、本発明のヒト結合分子のヒト起源のため、前記結合分子に対する免疫反応の発生は、ヒトの患者への結合分子の投与時に、最大限可能な程度除外される。
本発明の二重特異性結合分子の一部として、好ましくはヒトの、ＣＤ３イプシロン特異性結合分子の他の主な利点は、種々の霊長類での前臨床試験のためのその適応性である。動物中の薬剤候補の挙動は、理想的には、ヒトへの投与時に予期されるこの薬剤候補の挙動を示さなければならない。その結果、したがって、そのような前臨床試験から得たデータは、一般的にヒトの場合への高度な予測力を当然持つ。しかし、最近のＴＧＮ１４１２（ＣＤ２８モノクローナル抗体）の第Ｉ相臨床試験の悲劇的な結果から分かるように、霊長類の種の中では、ヒトの中と薬剤候補の挙動が異なる。前記抗体の前臨床試験において、カニクイザルで実施された動物試験では有害事象が無いか、限定された有害事象のみが観察されたが、前記抗体の投与時に６人のヒトの患者が多臓器不全を起こした（Ｌａｎｃｅｔ３６８ （２００６）， ２２０６−７）。これらの望ましくない有害な事象の結果は、前臨床試験を１つの（霊長類）種のみに限定することが十分でないことを示す。本発明のＣＤ３イプシロン特異性ヒト結合分子が、一連の新世界猿及び旧世界猿と結合するという事実は、上記の事例で直面する問題を克服する助けになることもある。したがって、本発明は、ヒトの治療用の薬剤が開発及び試験されている時に、事象における種の差異を最低限にする手段及び方法を提供する。
本発明の二重特異性結合分子の一部としての、好ましくはヒトの、異種間特異性ＣＤ３イプシロン結合ドメインにより、トランスジェニック動物の作製など、ヒトへの投与用の薬剤候補に試験動物を適応させることももはや必要でない。本発明の使用及び方法により異種間特異性を示す、ＣＤ３イプシロン特異的な、好ましくはヒトの、結合分子（又はそれを含む二重特異性単鎖抗体）は、動物の遺伝子操作を全くせずに、非チンパンジー霊長類での前臨床試験に直接使用できる。当業者に周知のように、試験動物が薬剤候補に適応させられる手法では、動物が修飾されているので、前臨床安全性試験で得られる結果の典型性が低く、ヒトのための予測性が低いという危険性を常に帯びている。例えば、トランスジェニック動物では、導入遺伝子によりコードされるタンパク質が高度に過剰発現されることが多い。したがって、このタンパク質抗原に対する抗体の生物的活性に関して得られたデータは、タンパク質の発現がはるかに低くより生理学的なレベルであるヒトに対する予測値において限定されることがある。
異種間特異性を示すＣＤ３イプシロン特異的な、好ましくはヒトの、結合分子（又はそれを含む二重特異性単鎖抗体）を使用するさらなる利点は、絶滅危惧種としてのチンパンジーが動物試験で回避される事実である。チンパンジーは、ヒトに最も近い近縁動物であり、ゲノムシーケンシングデータに基づき最近ヒト科に分類された（Ｗｉｌｄｍａｎｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １００ （２００３）， ７１８１）。したがって、チンパンジーで得られたデータは、一般的にヒトにとって高度に予測的であると考えられる。しかし、絶滅危惧種としての状況により、医学実験に使用できるチンパンジーの数は高度に制限されている。上述のとおり、したがって、動物試験のためのチンパンジーの維持は、コストがかかり、且つ倫理的にも問題である。本発明のＣＤ３イプシロン特異的な、好ましくはヒトの、結合分子（又はそれを含む二重特異性単鎖抗体）を使用すると、得られる動物試験データの質、すなわち適応性を損なわずに、前臨床試験の間の倫理的な支障及び資金面での負担を避けられる。これに照らして、ＣＤ３イプシロン特異的な、好ましくはヒトの、結合分子（又はそれを含む二重特異性単鎖抗体）の使用は、チンパンジーでの研究の妥当な代替物を与える。
本発明のＣＤ３イプシロン特異的な、好ましくはヒトの、結合分子（又はそれを含む二重特異性単鎖抗体）のさらなる利点は、動物前臨床試験の一部として使用している場合、例えば、薬物動態学動物試験の途中で、複数の血液サンプルを抽出する能力である。複数採血は、ネズミなどの下等動物よりも、非チンパンジー霊長類ではるかに容易に得られる。複数の血液サンプルを抽出すると、本発明の、好ましくはヒトの、結合分子（又は二重特異性単鎖抗体）により誘起される生物的効果を測定するための血液パラメータを連続試験できる。さらに、複数の血液サンプルの抽出により、本願に定義される、好ましくはヒトの、結合分子（又はそれを含む二重特異性単鎖抗体）の薬物動態学的プロファイルを研究者が評価できるようになる。さらに、血液パラメータに反映されている、前記の、好ましくはヒトの、結合分子（又はそれを含む二重特異性単鎖抗体）により誘起されるかもしれない潜在的な副作用が、前記抗体の投与の間に抽出された異なる血液サンプルで測定できる。これにより、本願に定義される、好ましくはヒトの、結合分子（又はそれを含む二重特異性単鎖抗体）の潜在的な毒性プロファイルを測定できる。
本願に定義される、異種間特異性を示す、好ましくはヒトの、結合分子（又は二重特異性単鎖抗体）の利点は、以下のとおり簡単に要約できる。
第１に、前臨床試験に使用される、本願に定義される、好ましくはヒトの、結合分子（又は二重特異性単鎖抗体）は、ヒトの治療に使用される物と同じである。したがって、薬物動態学的な性質及び生物的活性が異なることがある、２つの独立した分子を開発する必要はもはやない。これは、例えば薬物動態学的結果が、例えば議論の的となるサロゲート手法よりも、より直接的にヒトの状況に転移可能で適用可能である点で、非常に有利である。
第２に、ヒトの治療薬を製造するために、本願に定義される、好ましくはヒトの、結合分子（又は二重特異性単鎖抗体）を使用すると、サロゲート手法よりもコスト集約性及び労働集約性が低い。
第３に、本願に定義される、好ましくはヒトの、結合分子（又は二重特異性単鎖抗体）は、１つの霊長類種だけでなく、一連の異なる霊長類種での前臨床試験に使用でき、そのため、霊長類とヒトの間の潜在的な種の差異の危険性を限定できる。
第４に、動物試験のための、絶滅危惧種としてのチンパンジーが避けられる。
第５に、複数の血液サンプルを、広範な薬物動態研究のために抽出できる。
第６に、本発明の好ましい実施形態による、好ましくはヒトの、結合分子のヒト起源のため、ヒトの患者に投与した場合、前記結合分子に対する免疫反応の発生が最低限になる。マウス起源の治療分子に対するヒト−抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）の発生につながる、ヒトでない種、例えばマウスから誘導された薬剤候補に特異的な抗体との免疫応答の誘起が排除される。
「タンパク質」という用語は当分野に周知であり、生物学的化合物を記述する。タンパク質は、１つ以上のアミノ酸鎖（ポリペプチド）を含み、それによりアミノ酸がペプチド結合により互いに結合する。本願での「ポリペプチド」という用語は、３０を超えるアミノ酸からなる、１群の分子を説明する。本発明によると、ポリペプチドの１群は、タンパク質が単一のポリペプチドからなる限り、「タンパク質」を構成する。定義と調和して、「ポリペプチド」という用語は、断片が３０を超えるアミノ酸からなる限り、タンパク質の断片を記述する。ポリペプチドは、ダイマー、トリマーなどのマルチマー及び高次のオリゴマー、すなわち２以上のポリペプチド分子からなるものをさらに形成することもある。そのようなダイマー、トリマーなどを形成するポリペプチド分子は、同一でも、異なっていてもよい。したがって、そのようなマルチマーの対応する高次の構造は、ホモ又はヘテロダイマー、ホモ又はヘテロトリマーなどと称される。ヘテロマルチマーの一例は抗体分子であり、その天然の形態で、２つの同一のポリペプチド軽鎖及び２つの同一のポリペプチド重鎖からなる。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの翻訳後修飾により修飾が実施される、天然修飾ポリペプチド／タンパク質も意味する。そのような修飾は当分野に周知である。
本願では、「ヒト」及び「人間」はホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を意味する。本願に記載されるコンストラクトの医学的使用に関する限り、ヒトの患者が同じ分子で治療される。
本発明の分子の文脈で使用される「ヒト起源」という用語は、ヒトライブラリーから誘導可能か、又はヒト等価物に相当する構造／配列を有する分子を記述する。したがって、アナログヒト配列に対応するアミノ酸配列を有するタンパク質、例えばヒト生殖細胞配列に対応するフレームワーク中にアミノ酸配列を有する抗体断片は、ヒト起源の分子と理解される。
本願では、「非チンパンジー霊長類」又は「非チンプ霊長類」又はその文法的変形は、チンパンジー以外の任意の霊長類、すなわちチンパンジー属（Ｐａｎ）に属し、アンスロポピテクス・トログロディテス（Ａｎｔｈｒｏｐｏｐｉｔｈｅｃｕｓｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）又はシミア・サティルス（Ｓｉｍｉａ ｓａｔｙｒｕｓ）としてもまた知られる、ボノボ（Ｐａｎ ｐａｎｉｓｃｕｓ）種及びナミチンパンジー（Ｐａｎｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）種を含む動物以外である。「霊長類（ｐｒｉｍａｔｅ）」、「霊長類種」、「霊長類（ｐｒｉｍａｔｅｓ）」又はその文法的変形は、原猿（ｐｒｏｓｉｍｉａｎｓ）及び類人猿（ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄｓ）の２つの亜目に分けられ、人間、類人猿（ａｐｅｓ）、猿（ｍｏｎｋｅｙｓ）及びキツネザル（ｌｅｍｕｒｓ）を含む真獣類の目を意味する。具体的には、本願の「霊長類」は、曲鼻猿亜目（Ｓｔｒｅｐｓｉｒｒｈｉｎｉ）（非メガネザル（ｎｏｎ−ｔａｒｓｉｅｒ）原猿）を含み、前記亜目は、キツネザル下目（Ｌｅｍｕｒｉｆｏｒｍｅｓ）（それ自体、コビトキツネザル上科（Ｃｈｅｉｒｏｇａｌｅｏｉｄｅａ）及びキツネザル上科（Ｌｅｍｕｒｏｉｄｅａ）を含む）、アイアイ下目（Ｃｈｉｒｏｍｙｉｆｏｒｍｅｓ）（それ自体、アイアイ科（Ｄａｕｂｅｎｔｏｎｉｉｄａｅ）を含む）及びロリス下目（Ｌｏｒｉｓｉｆｏｒｍｅｓ）（それ自体、ロリス科（Ｌｏｒｉｓｉｄａｅ）及びガラゴ科（Ｇａｌａｇｉｄａｅ）を含む）を含む。本願の「霊長類」は、直鼻猿亜目（Ｈａｐｌｏｒｒｈｉｎｉ）もまた含み、前記亜目は、メガネザル下目（Ｔａｒｓｉｉｆｏｒｍｅｓ）（それ自体、メガネザル科（Ｔａｒｓｉｉｄａｅ）を含む）、真猿下目（Ｓｉｍｉｉｆｏｒｍｅｓ）（それ自体、広鼻小目（Ｐｌａｔｙｒｒｈｉｎｉ）又は新世界猿、及びオナガザル科（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｄｅａ）を含む狭鼻小目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）又は旧世界猿を含む）を含む。
非チンパンジー霊長類種は、本発明の意味の中で、キツネザル、メガネザル、テナガザル、マーモセット（マーモセット科（Ｃｅｂｉｄａｅ）の新世界猿に属する）又は旧世界猿（オナガザル上科（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｏｉｄｅａ）に属する）であると理解されうる。
本願では「旧世界猿」は、オナガザル上科（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｏｉｄｅａ）に分類されるあらゆる猿を含み、それ自体、主にアフリカ系であるがアジア及び北アフリカである種々のマカク属を含むオナガザル亜科（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎａｅ）；及びアジア属のほとんど及びアフリカコロブスザルも含むコロブス亜科（Ｃｏｌｏｂｉｎａｅ）に再分される。
具体的には、オナガザル亜科の中で、有利な非チンパンジー霊長類は、オナガザル族（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｉ）由来でよく、アレンモンキー属（Ａｌｌｅｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（アレン沼地ザル、アレノピテクス・ニグロビリディス（Ａｌｌｅｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓｎｉｇｒｏｖｉｒｉｄｉｓ））；コビトグエノン属（Ｍｉｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（コビトグエノン、ミオピテクス・タラポイン（Ｍｉｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｔａｌａｐｏｉｎ）；ガボン・タラポアン、ミオピテクス・オゴウエンシス（Ｍｉｏｐｉｔｈｅｃｕｓｏｇｏｕｅｎｓｉｓ））；パタスモンキー属（Ｅｒｙｔｈｒｏｃｅｂｕｓ）内（パタスモンキー、エリスロセブス・パタス（Ｅｒｙｔｈｒｏｃｅｂｕｓ ｐａｔａｓ））；クロロセブス属（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ）内（ミドリザル、クロロセブス・サバセウス（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓｓａｂａｃｅｕｓ））；グリベットモンキー、クロロセブス・アエチオプス（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）；ベールマウンテン・ベルベットモンキー、クロロセブス・ドジャムドジャメンシス（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓｄｊａｍｄｊａｍｅｎｓｉｓ）；タンタルスモンキー、クロロセブス・タンタルス（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ｔａｎｔａｌｕｓ）；ベルベットモンキー、クロロセブス・ピゲリスラス（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓｐｙｇｅｒｙｔｈｒｕｓ）；マルブルック、クロロセブス・シノスロス（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ｃｙｎｏｓｕｒｏｓ））；又はオナガザル属（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（ドリアスグエノン又はサロンゴモンキー、セルコピテクス・ドリアス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓｄｒｙａｓ）；ダイアナモンキー、セルコピテクス・ダイアナ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｄｉａｎａ）；ロロウェイモンキー、セルコピテクス・ロロウェイ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓｒｏｌｏｗａｙ）；オオハナジログエノン、セルコピテクス・ニクチタンス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｎｉｃｔｉｔａｎｓ）；ブルーモンキー、セルコピテクス・ミティス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓｍｉｔｉｓ）；シルバーモンキー、セルコピテクス・ドゲッティ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｄｏｇｇｅｔｔｉ）；ゴールデンモンキー、セルコピテクス・カンジチ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓｋａｎｄｔｉ）；サイクスモンキー、セルコピテクス・アルボグラリス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｌｂｏｇｕｌａｒｉｓ）；モナモンキー、セルコピテクス・モナ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓｍｏｎａ）；キャンベル・モナモンキー、セルコピテクス・キャンベリ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｃａｍｐｂｅｌｌｉ）；ロウ・モナモンキー、セルコピテクス・ロウイ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓｌｏｗｅｉ）；クラウングエノン、セルコピテクス・ポゴニアス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｐｏｇｏｎｉａｓ）；ウォルフグエノン、セルコピテクス・ウォルフィ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓｗｏｌｆｉ）；デント・モナモンキー、セルコピテクス・デンティ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｄｅｎｔｉ）；ショウハナジログエノン、セルコピテクス・ペタウリスタ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓｐｅｔａｕｒｉｓｔａ）；アカハラグエノン、セルコペテクス・エリスロガスター（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｇａｓｔｅｒ）；スクラターグエノン、セルコピテクス・スクラテリ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓｓｃｌａｔｅｒｉ）；アカミミグエノン、セルコピテクス・エリスロティス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｔｉｓ）；クチヒゲグエノン、セルコピテクス・セファス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓｃｅｐｈｕｓ）；アカオザル、セルコピテクス・アスカニウス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｓｃａｎｉｕｓ）；ロエストグエノン、セルコピテクス・ロエスティ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓｌｈｏｅｓｔｉ）；プロイッスモンキー、セルコピテクス・プロイッシ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｐｒｅｕｓｓｉ）；サンテイルド・モンキー、セルコピテクス・ソラタス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓｓｏｌａｔｕｓ）；ハムリンズモンキー（Ｈａｍｌｙｎ'ｓ ｍｏｎｋｅｙ）又はフクロウグエノン、セルコピテクス・ハムリニ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓｈａｍｌｙｎｉ）；ブラッザモンキー、セルコピテクス・ネグレクタス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｎｅｇｌｅｃｔｕｓ））である。
或いは、やはりオナガザル亜科内であるが、ヒヒ族（Ｐａｐｉｏｎｉｎｉ）内の有利な非チンパンジー霊長類は、マカク属（Ｍａｃａｃａ）内（バーバリマカク、マカカ・シルバヌス（Ｍａｃａｃａｓｙｌｖａｎｕｓ）；シシオザル、マカカ・シレヌス（Ｍａｃａｃａ ｓｉｌｅｎｕｓ）；ブタオザル又はベルク（Ｂｅｒｕｋ）、マカカ・ネメストリナ（Ｍａｃａｃａ ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）；キタブタオザル、マカカ・レオニア（Ｍａｃａｃａｌｅｏｎｉｎａ）；パガイモンキー又はボッコイ（Ｂｏｋｋｏｉ）、マカカ・パゲンシス（Ｍａｃａｃａ ｐａｇｅｎｓｉｓ）；シブルー島マカク（Ｓｉｂｅｒｕｔ Ｍａｃａｑｕｅ）、マカカ・シベル（Ｍａｃａｃａｓｉｂｅｒｕ）；ムーアモンキー、マカカ・マウラ（Ｍａｃａｃａ ｍａｕｒａ）；ウスイロマカク、マカカ・オケレアタ（Ｍａｃａｃａ ｏｃｈｒｅａｔａ）；トンケアンマカク、マカカ・トンケアナ（Ｍａｃａｃａｔｏｎｋｅａｎａ）；ヘックモンキー、マカカ・ヘッキ（Ｍａｃａｃａ ｈｅｃｋｉ）；ゴロンタロモンキー、マカカ・ニグリシェンス（Ｍａｃａｃａ ｎｉｇｒｉｓｃｅｎｓ）；スラウェシトサカマカク又はクロザル、マカカ・ニグラ（Ｍａｃａｃａｎｉｇｒａ）；シノモルガスサル又はカニクイザル又はオナガザル又はクラ、マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）；ベニガオザル又はクマザル、マカカ・アークトイデス（Ｍａｃａｃａａｒｃｔｏｉｄｅｓ）；アカゲザル、マカク・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）；タイワンザル、マカカ・キュクロピス（Ｍａｃａｃａ ｃｙｃｌｏｐｉｓ）；ニホンザル、マカカ・フスカタ（Ｍａｃａｃａｆｕｓｃａｔａ）；トクモンキー、マカカ・シニカ（Ｍａｃａｃａ ｓｉｎｉｃａ）；ボンネットモンキー、マカカ・ラディアタ（Ｍａｃａｃａ ｒａｄｉａｔａ）；バーバリーマカク、マカカ・シルバヌス（Ｍａｃａｃａｓｙｌｖａｎｍｕｓ）；アッサムモンキー、マカカ・アサメンシス（Ｍａｃａｃａ ａｓｓａｍｅｎｓｉｓ）；チベットマカク又はミルンエドワーズマカク（Ｍｉｌｎｅ−Ｅｄｗａｒｄｓ' Ｍａｃａｑｕｅ）、マカカ・チベタナ（Ｍａｃａｃａ ｔｈｉｂｅｔａｎａ）；アルナチャルモンキー又はムンザラ、マカカ・ムンザラ（Ｍａｃａｃａｍｕｎｚａｌａ））；ロフォセブス属（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ）内（ホホジロマンガベイ、ロフォセブス・アルビゲナ（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ ａｌｂｉｇｅｎａ）；ロフォセブス・アルビゲナ・アルビゲナ（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓａｌｂｉｇｅｎａ ａｌｂｉｇｅｎａ）；ロフォセブス・アルビゲナ・オスマニ（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ ａｌｂｉｇｅｎａ ｏｓｍａｎｉ）；ロフォセブス・アルビゲナ・ジョンストニ（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓａｌｂｉｇｅｎａ ｊｏｈｎｓｔｏｎｉ）；ブラックマンガベイ、ロフォセブス・アテリムス（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ ａｔｅｒｒｉｍｕｓ）；オプデンボッシュ・マンガベイ（Ｏｐｄｅｎｂｏｓｃｈ'ｓ Ｍａｎｇａｂｅｙ）、ロファセブス・オプデンボッシィ（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ ｏｐｄｅｎｂｏｓｃｈｉ）；ハイランド・マンガベイ、ロファセブス・キプンジ（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓｋｉｐｕｎｊｉ））；ヒヒ属（Ｐａｐｉｏ）内（マントヒヒ、パピオ・ハマドリアス（Ｐａｐｉｏ ｈａｍａｄｒｙａｓ））；ギニアヒヒ、パピオ・パピオ（Ｐａｐｉｏ ｐａｐｉｏ）；アヌビスヒヒ、パピオ・アヌビス（Ｐａｐｉｏａｎｕｂｉｓ）；キイロヒヒ、パピオ・シノセファルス（Ｐａｐｉｏ ｃｙｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ）；チャクマヒヒ、パピオ・ウルシヌス（Ｐａｐｉｏ ｕｒｓｉｎｕｓ））；ゲラダヒヒ属（Ｔｈｅｒｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（ゲラダヒヒ、テロピテクス・ゲラダ（Ｔｈｅｒｏｐｉｔｈｅｃｕｓｇｅｌａｄａ））；マンガベイ属（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ）内（スーティ・マンガベイ、セルコセブス・アティス（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ ａｔｙｓ）；セルコセブス・アティス・アティス（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓａｔｙｓ ａｔｙｓ）；セルコセブス・アティス・ルヌラトゥス（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ ａｔｙｓ ｌｕｎｕｌａｔｕｓ）；シロエリマンガベイ、セルコセブス・トルクアトゥス（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓｔｏｒｑｕａｔｕｓ）；アジルマンガベイ、セルコセブス・アギリス（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ ａｇｉｌｉｓ）；ゴールデンマンガベイ、セルコセブス・クリソガスター（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓｃｈｒｙｓｏｇａｓｔｅｒ）；ボウシマンガベイ、セルコセブス・ガレリトゥス（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ ｇａｌｅｒｉｔｕｓ）；サンジェマンガベイ、セルコセブス・サンジェイ（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓｓａｎｊｅｉ））；又はマンドリル属（Ｍａｎｄｒｉｌｌｕｓ）内（マンドリル、マンドリルス・スフィンクス（Ｍａｎｄｒｉｌｌｕｓ ｓｐｈｉｎｘ）；ドリル、マンドリルス・ロイコファエウス（Ｍａｎｄｒｉｌｌｕｓｌｅｕｃｏｐｈａｅｕｓ））由来でよい。
最も好ましいのは、マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザルとしても知られ、したがって実施例では「カニクイザル」と称される）及びマカカ・ムラッタ（Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ）（アカゲザル、「アカゲザル」と称される）である。
コロブス亜科内で、有利な非チンパンジー霊長類は、アフリカ系の群に由来してもよく、コロブス属（Ｃｏｌｏｂｕｓ）内（クロコロブス、コロブス・サタナス（Ｃｏｌｏｂｕｓｓａｔａｎａｓ）；アンゴラコロブス、コロブス・アンゴレンシス（Ｃｏｌｏｂｕｓ ａｎｇｏｌｅｎｓｉｓ）；キングコロブス、コロブス・ポリコモス（Ｃｏｌｏｂｕｓ ｐｏｌｙｋｏｍｏｓ）；クマコロブス、コロブス・ベレロサス（Ｃｏｌｏｂｕｓｖｅｌｌｅｒｏｓｕｓ）；アビシニアコロブス、コロブス・ゲレザ（Ｃｏｌｏｂｕｓ ｇｕｅｒｅｚａ））；ピリオコロブス属（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ）内（ウェスタン・アカコロブス、ピリオコロブス・バディウス（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓｂａｄｉｕｓ）；ピリオコロブス・バディウス・バディウス（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｂａｄｉｕｓ ｂａｄｉｕｓ）；ピリオコロブス・バディウス・テミンキー（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓｂａｄｉｕｓ ｔｅｍｍｉｎｃｋｉｉ）；ピリオコロブス・バディウス・ワルドロネ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｂａｄｉｕｓ ｗａｌｄｒｏｎａｅ）；ペナントアカコロブス、ピリオコロブス・ペナンティ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓｐｅｎｎａｎｔｉｉ）；ピリオコロブス・ペナンティ・ペナンティ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｐｅｎｎａｎｔｉｉ ｐｅｎｎａｎｔｉｉ）；ピリオコロブス・ペナンティ・エピエニ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓｐｅｎｎａｎｔｉｉ ｅｐｉｅｎｉ）；ピリオコロブス・ペナンティ・ボウビエリ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｐｅｎｎａｎｔｉｉ ｂｏｕｖｉｅｒｉ）；プレウス・アカコロブス（Ｐｒｅｕｓｓ'ｓ Ｒｅｄ Ｃｏｌｏｂｕｓ）、ピリオコロブス・プレウシ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｐｒｅｕｓｓｉ）；トロン・アカコロブス、ピリオコロブス・トロニ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓｔｈｏｌｌｏｎｉ）；中央アフリカ・アカコロブス、ピリオコロブス・フォアイ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｆｏａｉ）；ピリオコロブス・フォアイ・フォアイ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓｆｏａｉ ｆｏａｉ）；ピリオコロブス・フォアイ・エリオッティ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｆｏａｉ ｅｌｌｉｏｔｉ）；ピリオコロブス・フォアイ・オウスタレティ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓｆｏａｉ ｏｕｓｔａｌｅｔｉ）；ピリオコロブス・フォアイ・セムリキエンシス（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｆｏａｉ ｓｅｍｌｉｋｉｅｎｓｉｓ）；ピリオコロブス・フォアイ・パルメンティエロルム（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓｆｏａｉ ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒｏｒｕｍ）；ウガンダ・アカコロブス、ピリオコロブス・テフロスケルス（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｔｅｐｈｒｏｓｃｅｌｅｓ）；ウジングワ・アカコロブス、ピリオコロブス・ゴロドノルム（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓｇｏｒｄｏｎｏｒｕｍ）；ザンジバル・アカコロブス、ピリオコロブス・キルキ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｋｉｒｋｉｉ）；タナリバーアカコロブス、ピリオコロブス・ルフォミトラトゥス（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓｒｕｆｏｍｉｔｒａｔｕｓ））；又はプロコロブス属（Ｐｒｏｃｏｌｏｂｕｓ）内（オリーブコロブス、ポロコロブス・ベラス（Ｐｒｏｃｏｌｏｂｕｓ ｖｅｒｕｓ））でよい。
コロブス亜科内で、有利な非チンパンジー霊長類は、或いは、ラングール（Ｌａｎｇｕｒ（ｌｅａｆ ｍｏｎｋｅｙ））群由来でもよく、ラングール属（Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（ネパール・グレイラングール、センノピテクス・スキスタケウス（Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓｓｃｈｉｓｔａｃｅｕｓ）；カシミール・グレイラングール、センノピテクス・アジャクス（Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｊａｘ）；タライ・グレイラングール、センノピテクス・ヘクター（Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓｈｅｃｔｏｒ）；ハヌマンラングール、センノピテクス・エンテラス（Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｅｎｔｅｌｌｕｓ）；クロアシラングール（Ｂｌａｃｋ−Ｆｏｏｔｅｄ ＧｒａｙＬａｎｇｕｒ）、センノピテクス・ヒュポレウコス（Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｈｙｐｏｌｅｕｃｏｓ）；南部平野グレイラングール（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐｌａｉｎｓ ＧｒａｙＬａｎｇｕｒ）、センノピテクス・デゥスミエリ（Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｄｕｓｓｕｍｉｅｒｉ）；タフテッド・グレイラングール（Ｔｕｆｔｅｄ Ｇｒａｙ Ｌａｎｇｕｒ）、センノピテクス・プリアム（Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓｐｒｉａｍ））；Ｔ．ベツルス（Ｔ． ｖｅｔｕｌｕｓ）群又はトラキピテクス属（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（カオムラサキラングール、トラキピテクス・ベツルス（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓｖｅｔｕｌｕｓ）；ニルギリラングール、トラキピテクス・ジョーニ（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｊｏｈｎｉｉ））；トラキピテクス属のＴ．クリスタトゥス（Ｔ．ｃｒｉｓｔａｔｕｓ）群内（ジャワ・ルトン、トラキピテクス・アウラトゥス（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓａｕｒａｔｕｓ）；シルバーリーフモンキー又はシルバー・ルトン、トラキピテクス・クリスタトゥス（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｃｒｉｓｔａｔｕｓ）；インドシナ・ルトン、トラキピテクス・ジャーマイニ（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓｇｅｒｍａｉｎｉ）；テナセリム・ルトン、トラキピテクス・バーベイ（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｂａｒｂｅｉ））；トラキピテクス属のＴ．オブスキュルス（Ｔ．ｏｂｓｃｕｒｕｓ）群内（ダスキー・リーフモンキー又はスペクタクルリーフモンキー、トラキピテクス・オブスキュラス（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓｏｂｓｃｕｒｕｓ）；ファイレ・リーフモンキー、トラキピテクス・ファイレイ（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｐｈａｙｒｅｉ））；トラキピテクス属のＴ．ピレアトゥス（Ｔ．ｐｉｌｅａｔｕｓ）群内（ボウシラングール、トラキピテクス・ピレアトゥス（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓｐｉｌｅａｔｕｓ）；ショートリッジ・ラングール、トラキピテクス・ショートリジェイ（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｓｈｏｒｔｒｉｄｇｅｉ）；ゴールデンラングール、トラキピテクス・ギー（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓｇｅｅｉ））；トラキピテクス属のＴ．フランコイシ（Ｔ．ｆｒａｎｃｏｉｓｉ）群内（フランソワ・ルトン、トラキピテクス・フランコイシ（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓｆｒａｎｃｏｉｓｉ）；ハティン・ラングール、トラキピテクス・ハティンヘンシス（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｈａｔｉｎｈｅｎｓｉｓ）；ハクトウラングール、トラキピテクス・ポリオセファラス（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓｐｏｌｉｏｃｅｐｈａｌｕｓ）；ラオス・ラングール、トラキピテクス・ラオタム（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｌａｏｔｕｍ）；コシジロラングール、トラキピテクス・デラコーリ（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓｄｅｌａｃｏｕｒｉ）；インドシナ・クロラングール、トラキピテクス・エベヌゥス（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｅｂｅｎｕｓ））；又はリーフモンキー属（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ）内（クロカンムリリーフモンキー、プレスビティス・メラロフォス（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓｍｅｌａｌｏｐｈｏｓ）；シマコノハザル、プレスビティス・フェモラリス（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ ｆｅｍｏｒａｌｉｓ）；サラワク・スリリ（Ｓａｒａｗａｋ Ｓｕｒｉｌｉ）、プレスビティス・クリソメラス（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓｃｈｒｙｓｏｍｅｌａｓ）；シロモモ・スリリ（Ｗｈｉｔｅ−ｔｈｉｇｈｅｄ Ｓｕｒｉｌｉ）、プレスビティス・シアメンシス（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）；シロビタイ・スリリ（Ｗｈｉｔｅ−ｆｒｏｎｔｅｄＳｕｒｉｌｉ）、プレスビティス・フロンタタ（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ ｆｒｏｎｔａｔａ）；ジャワ・スリリ（Ｊａｖａｎ Ｓｕｒｉｌｉ）、プレスビティス・コマタ（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓｃｏｍａｔａ）；トーマスラングール、プレスビティス・トマシ（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ ｔｈｏｍａｓｉ）；ホースラングール、プレスビティス・ホセイ（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓｈｏｓｅｉ）；クリイロ・リーフモンキー、プレスビティス・ルビクンダ（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ ｒｕｂｉｃｕｎｄａ）；オナガラングール又はジョジャ（Ｊｏｊａ）、プレスビティス・ポテンチアニ（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓｐｏｔｅｎｚｉａｎｉ）；ナツナ島スリリ（Ｎａｔｕｎａ Ｉｓｌａｎｄ Ｓｕｒｉｌｉ）、プレスビティス・ナツナエ（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ ｎａｔｕｎａｅ））でよい。
コロブス亜科内で、有利な非チンパンジー霊長類は、或いは、シシバナ（Ｏｄｄ−Ｎｏｓｅｄ）群由来でもよく、ドゥクモンキー属（Ｐｙｇａｔｈｒｉｘ）内（アカアシドゥクモンキー、ピガスリクス・ネマエウス（Ｐｙｇａｔｈｒｉｘｎｅｍａｅｕｓ）；クロアシドゥクモンキー、ピガスリクス・ニグリペス（Ｐｙｇａｔｈｒｉｘ ｎｉｇｒｉｐｅｓ）；ハイイロアシドゥクモンキー、ピガスリクス・シネレア（Ｐｙｇａｔｈｒｉｘｃｉｎｅｒｅａ））；シシバナザル属（Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（キンシコウ、リノピテクス・ロクセラーナ（Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｒｏｘｅｌｌａｎａ）；クロキンシコウ、リノピテクス・ビエティ（Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓｂｉｅｔｉ）；ハイイロシシバナザル、リノピテクス・ブレリチ（Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｂｒｅｌｉｃｈｉ）；トンキンシシバナザル、リノピテクス・アバンキュラス（Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓａｖｕｎｃｕｌｕｓ））；テングザル属（Ｎａｓａｌｉｓ）内（テングザル、ナサリス・ラバトゥス（Ｎａｓａｌｉｓ ｌａｒｖａｔｕｓ））；又はコバナテングザル属（Ｓｉｍｉａｓ）内（メンタウェーコバナテングザル、シミアス・コンコラー（Ｓｉｍｉａｓｃｏｎｃｏｌｏｒ））でよい。
本願での用語「マーモセット」はマーモセット属（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）内の任意の新世界ザルを意味し、例えば、マーモセット亜属（原文のまま）の大西洋マーモセットに属するもの（コモンマーモセット、カリスリクス（カリスリクス）ジャカス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ｊａｃｃｈｕｓ）；クロミミマーモセット、カリスリクス（カリスリクス）ペニシラータ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ｐｅｎｉｃｉｌｌａｔａ）；クールマーモセット、カリスリクス（カリスリクス）クーリ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ｋｕｈｌｉｉ）；ジョフロワマーモセット、カリスリクス（カリスリクス）ジョフロイ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ｇｅｏｆｆｒｏｙｉ）；キクガシラコモンマーモセット、カリスリクス（カリスリクス）フラビセプス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ｆｌａｖｉｃｅｐｓ）；ミミナガコモンマーモセット、カリスリクス（カリスリクス）アウリタ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ａｕｒｉｔａ））；ミコ亜属（Ｍｉｃｏ）のアマゾンマーモセットに属するもの（リオアカリマーモセット、カリスリクス（ミコ）アカリエンシス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ａｃａｒｉｅｎｓｉｓ）；マニコアマーモセット（ＭａｎｉｃｏｒｅＭａｒｍｏｓｅｔ）、カリスリクス（ミコ）マニコレンシス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｍａｎｉｃｏｒｅｎｓｉｓ）；シルバーマーモセット、カリスリクス（ミコ）アルゲンタタ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ａｒｇｅｎｔａｔａ）；ホワイトマーモセット、カリスリクス（ミコ）ロイシペ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｌｅｕｃｉｐｐｅ）；エミリアマーモセット（Ｅｍｉｌｉａ'ｓ Ｍａｒｍｏｓｅｔ）、カリスリクス（ミコ）エミリアエ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｅｍｉｌｉａｅ）；クロテマーモセット、カリスリクス（ミコ）ニグリセプス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｎｉｇｒｉｃｅｐｓ）；マルカマーモセット（Ｍａｒｃａ'ｓ Ｍａｒｍｏｓｅｔ）、カリスリクス（ミコ）マルカイ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｍａｒｃａｉ）；オグロマーモセット、カリスリクス（ミコ）メラヌラ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｍｅｌａｎｕｒａ）；サンタレムマーモセット、カリスリクス（ミコ）フメラリフェラ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｈｕｍｅｒａｌｉｆｅｒａ）；マウエスマーモセット（ＭａｕｅｓＭａｒｍｏｓｅｔ）、カリスリクス（ミコ）マウエシ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｍａｕｅｓｉ）；キンシロフサミミマーモセット、カリスリクス（ミコ）クリソロイカ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｃｈｒｙｓｏｌｅｕｃａ）；フサミミマーモセット、カリスリクス（ミコ）インテルメディア（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）；サテアマーモセット（ＳａｔｅｒｅＭａｒｍｏｓｅｔ）、カリスリクス（ミコ）サテレイ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｓａｔｅｒｅｉ）；カリベラ亜属（Ｃａｌｌｉｂｅｌｌａ）に属するルースマレン・ドワーフマーモセット（Ｒｏｏｓｍａｌｅｎｓ' Ｄｗａｒｆ Ｍａｒｍｏｓｅｔ）、カリスリクス（カリベラ）ヒュミリス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｂｅｌｌａ）ｈｕｍｉｌｉｓ）；又はセブエラ亜属（Ｃｅｂｕｅｌｌａ）に属するピグミーマーモセット、カリスリクス（セブエラ）ピグマエア（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃｅｂｕｅｌｌａ）ｐｙｇｍａｅａ）を意味する。
新世界ザルの他の属は、タマリン属（Ｓａｇｕｉｎｕｓ）のタマリン（サグイヌス・オイディプス（Ｓ．ｏｅｄｉｐｕｓ）群、サグイヌス・ミダス（Ｓ．ｍｉｄａｓ）群、サグイヌス・ニグロコリス（Ｓ．ｎｉｇｒｉｃｏｌｌｉｓ）群、サグイヌス・ミスタックス（Ｓ．ｍｙｓｔａｘ）群、サグイヌス・ビコラー（Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒ）群及びサグイヌス・イヌスタス（Ｓ．ｉｎｕｓｔｕｓ）群を含む）及びリスザル属（Ｓａｉｍｉｒｉ）のリスザル（例えば、サイミリ・シウレウス（Ｓａｉｍｉｒｉｓｃｉｕｒｅｕｓ）、サイミリ・オエルステディ（Ｓａｉｍｉｒｉ ｏｅｒｓｔｅｄｉｉ）、サイミリ・ウストゥス（Ｓａｉｍｉｒｉ ｕｓｔｕｓ）、サイミリ・ボルビエンシス（Ｓａｉｍｉｒｉｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ）、サイミリ・バンゾリニ（Ｓａｉｍｉｒｉ ｖａｎｚｏｌｉｎｉ）を含む。
「結合ドメイン」という用語は、本発明に関連して、ある標的構造／抗原／エピトープに特異的に結合／相互作用する、ポリペプチドのドメインを特徴づける。したがって、結合ドメインは、「抗原−相互作用部位」である。「抗原−相互作用部位」という用語は、本発明によると、特定の抗原又は抗原の特定の基、例えば異なる種における同一の抗原と特異的に相互作用できる、ポリペプチドのモチーフを定義する。前記結合／相互作用は、「特異的認識」を定義するとも理解される。「特異的に認識する」という用語は、本発明によると、抗体分子が、抗原、例えば本願に定義されるヒトＣＤ３抗原の、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも３つの、より好ましくは少なくとも４つのアミノ酸と特異的に相互作用し、且つ／又はそれらと結合可能であることを意味する。そのような結合は、「鍵と鍵穴の原理」の特異性により例示することができる。したがって、結合ドメインのアミノ酸配列及び抗原における特異的なモチーフが、その一次、二次及び三次構造の結果として、並びに前記構造の二次修飾の結果として、互いを結合させる。抗原相互作用部位とその特異的な抗原との特異的な相互作用は、抗原に対する前記部位の単純な結合も起こすことがある。さらに、抗原相互作用部位とその特異的な抗原との特異的な相互作用は、或いは、抗原のコンフォメーションの変化の誘起、抗原のオリゴマー化などにより、シグナルの開始となることもある。本発明と調和する結合ドメインの好ましい例は抗体である。結合ドメインは、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、或いはモノクローナル又はポリクローナル抗体から誘導されていることがある。
「抗体」という用語は、その誘導体又は機能性断片であって、結合特異性を未だ保持するものを含む。抗体の製造の技術は、当分野に周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗａｎｄ Ｌａｎｅ "Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄＬａｎｅ "Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ" Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９９に記載されている。「抗体」という用語は、異なるクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥ）及びサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）の免疫グロブリン（Ｉｇ）も含む。これらの抗体は、例えば、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質の免疫沈降法、アフィニティ精製及び免疫局在化並びに、例えば、組換え原核生物或いは真核細胞又は真核生物の培養においてそのようなポリペプチドの存在及び量をモニタリングするために使用できる。
「抗体」という用語の定義は、キメラ、単鎖及びヒト化抗体並びに抗体断片、とりわけＦａｂ断片などの実施形態も含む。抗体断片又は誘導体は、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ断片又は単一ドメイン抗体、単一可変ドメイン抗体又は他のＶ領域又はドメインとは独立に抗原又はエピトープと特異的に結合するＶＨ又はＶＬのことがある、１つの可変ドメインのみを含む免疫グロブリン単一可変ドメインをさらに含む。例えば、Ｈａｒｌｏｗａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８８） ａｎｄ （１９９９）の上記引用文献を参照されたい。そのような免疫グロブリン単一可変ドメインは、単離された抗体単一可変ドメインポリペプチドのみでなく、抗体単一可変ドメインポリペプチド配列の１つ以上のモノマーを含むより大きなポリペプチドも包含する。
そのような抗体及び／又は断片の製造には、種々の手順が当分野に公知であり使用することができる。例えば、（抗体）誘導体は、ペプチドミメティックスにより製造できる。さらに、単鎖抗体の製造のために記載された技術（中でも米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい）を適応して、選択されたポリペプチド（複数可）に特異的な単鎖抗体を製造できる。また、トランスジェニック動物を使用して、本発明のポリペプチド及び融合タンパク質に特異的なヒト化抗体を発現できる。モノクローナル抗体の調製には、連続継代性細胞株により産生される抗体を提供するどのような技術も利用できる。そのような技術の例には、ハイブリドーマ技術（Ｋoｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ２５６ （１９７５）， ４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４ （１９８３）， ７２）及びヒトモノクローナル抗体を製造する（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． （１９８５）， ７７−９６）ＥＢＶハイブリドーマ技術がある。ＢＩＡＣｏｒｅシステムに使用されている表面プラズモン共鳴を利用して、ＣＤ３イプシロンなどの、標的ポリペプチドのエピトープに結合するファージ抗体の効率を高めることができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７ （１９９６）， ９７−１０５； Ｍａｌｍｂｏｒｇ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３（１９９５）， ７−１３）。本発明の文脈において、「抗体」という用語が、本願中で以下に記載する通りホスト中に発現される抗体コンストラクト、例えば、とりわけウイルス又はプラスミドベクターを介してトランスフェクト及び／又は形質導入される抗体コンストラクトを含むことも想定される。
本発明により使用される「特異的な相互作用」という用語は、結合分子により結合されるものと類似の構造を持ち、対象とするポリペプチドと同じ細胞により発現されるポリペプチドと、結合（ドメイン）分子が、公差反応しないか、又は著しく公差反応しないことを意味する。調査している結合分子パネルの公差反応性を、例えば、従来の条件下で結合分子の前記パネルの結合を評価することにより試験できる（例えば、Ｈａｒｌｏｗａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８及びＵｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９を参照されたい）。結合ドメインと特異的な抗原との特異的な相互作用の例は、リガンドとそのレセプターとの特異性を含む。そのような定義は、特にその特異的なレセプターとの結合時にシグナルを誘起するリガンドの相互作用を含む。前記定義により特に構成される、前記相互作用の例は、抗体の結合ドメイン（抗原結合部位）との抗原決定基（エピトープ）との相互作用である。
本願での「異種間特異性」又は「種間特異性」という用語は、本願に記載される結合ドメインの、ヒト及び非チンパンジー霊長類における同じ標的分子への結合を意味する。例えば、「異種間特異性」又は「種間特異性」は、異なる種に発現される同じ分子Ｘ以外の分子に対してではなく、同じ分子Ｘに対する種間反応性であると理解されたい。非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン、例えばマカクザルＣＤ３イプシロンに対する、例えばヒトＣＤ３イプシロンを認識するモノクローナル抗体の異種間特異性は、例えば、ＦＡＣＳ分析により測定できる。ＦＡＣＳ分析は、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン抗原をそれぞれ発現するヒト及び非チンパンジー霊長類細胞、例えばマカクザル細胞に対する結合に関して、それぞれのモノクローナル抗体を試験する方法で実施される。適当なアッセイは、以下の実施例に示される。
本願では、ＣＤ３イプシロンは、Ｔ細胞レセプターの一部として発現された分子を意味し、従来技術で典型的にそれに属する意味を有する。ヒトでは、公知の全てのＣＤ３サブユニット、例えば、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３アルファ及びＣＤ３ベータの個別又は独立に組み合わされた形態を包含する。本願で言及される非チンパンジー霊長類ＣＤ３抗原は、例えば、マカカ・ファシキュラリスＣＤ３及びマカカ・ムラッタＣＤ３である。マカカ・ファシキュラリスでは、それはＣＤ３イプシロンＦＮ−１８陰性及びＣＤ３イプシロンＦＮ−１８陽性、ＣＤ３ガンマ及びＣＤ３デルタを包含する。マカカ・ムラッタでは、それはＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ及びＣＤ３デルタを包含する。好ましくは、本願で使用される前記ＣＤ３は、ＣＤ３イプシロンである。ヒトＣＤ３イプシロンは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００７３３に示されており、配列番号１を含む。ヒトＣＤ３ガンマは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００７３に示されている。ヒトＣＤ３デルタは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００７３２に示されている。
マカカ・ファシキュラリスのＣＤ３イプシロン「ＦＮ−１８陰性」（すなわち、上述の多形性のためモノクローナル抗体ＦＮ−１８に認識されないＣＤ３イプシロン）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０７３９９４に示されている。
マカカ・ファシキュラリスのＣＤ３イプシロン「ＦＮ−１８陽性」（すなわち、モノクローナル抗体ＦＮ−１８に認識されるＣＤ３イプシロン）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０７３９９３に示されている。マカカ・ファシキュラリスのＣＤ３ガンマは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０７３９９２に示されている。マカカ・ファシキュラリスのＣＤ３デルタは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０７３９９１に示されている。
マカカ・ムラッタのそれぞれのＣＤ３イプシロン、ガンマ及びデルタホモログの核酸配列及びアミノ酸配列は、当分野に記載されている組換え技術により同定及び単離できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ２００１）。これは、本願に定義される他の非チンパンジー霊長類のＣＤ３イプシロン、ガンマ及びデルタホモログにも、必要な変更を加えて当てはまる。カリスリクス・ジャカス、サイミリ・シウレウス及びサグイヌス・オイディプスのアミノ酸配列の同定は、添付する実施例に記載されている。カリスリクス・ジャカスのＣＤ３イプシロンの細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列番号３に示されており、サグイヌス・オイディプスの配列は配列番号５に、サイミリ・シウレウスの配列は配列番号７に示されている。
上記のことと調和して、「エピトープ」という用語は、上記で定義された結合分子により特異的に結合／同定される抗原決定基を意味する。結合ドメイン又は分子は、標的構造に特有な、立体配座エピトープ又は連続エピトープ、例えばヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン鎖と特異的に結合／相互作用することができる。立体配座エピトープ又は不連続エピトープは、一次配列中では分かれているがポリペプチドがネイティブタンパク質／抗原中に折り畳まれる時分子の表面上で一緒になる２つ以上の別々なアミノ酸残基の存在により、ポリペプチド抗原のために特徴づけられる（Ｓｅｌａ，（１９６９）Ｓｃｉｅｎｃｅ １６６， １３６５及びＬａｖｅｒ， （１９９０） Ｃｅｌｌ ６１ ， ５５３−６）。エピトープに寄与する２つ以上の別々なアミノ酸残基は、１つ以上のポリペプチド鎖（複数可）の別々なセクションに存在する。これらの残基は、ポリペプチド鎖（複数可）が三次元構造中に折り畳まれる時分子の表面上で一緒になり、エピトープを構成する。対照的に、連続エピトープ又は直線エピトープは、ポリペプチド鎖の単一の直線セグメントに存在する２つ以上の別々のアミノ酸残基からなる。本発明の中では、「コンテクスト依存性」ＣＤ３エピトープは、前記エピトープのコンフォメーションを意味する。ＣＤ３のイプシロン鎖に局在化する、そのようなコンテクスト依存性エピトープは、イプシロン鎖の残りの部分に埋め込まれイプシロン鎖とＣＤ３ガンマ又はデルタ鎖とのヘテロダイマー化により正しい位置に保持されないと、その正しいコンフォメーションがとれない。対照的に、本願に提供されるコンテクスト非依存性ＣＤ３エピトープは、ＣＤ３イプシロンのＮ末端１−２７アミノ酸残基ポリペプチド又はその機能性断片を意味する。このＮ末端１−２７アミノ酸残基ポリペプチド又はその機能性断片は、ＣＤ３複合体中でそのネイティブ環境から出される時、その三次元構造完全性及び正しいコンフォメーションを維持する。ＣＤ３イプシロンの細胞外ドメインの一部である、Ｎ末端１−２７アミノ酸残基ポリペプチド又はその機能性断片のコンテクスト非依存性は、国際公開第２００４／１０６３８０号におけるヒト結合分子の調製方法に関して記載されているＣＤ３イプシロンのエピトープとは完全に異なるエピトープである。前記方法は、単独で発現したリコンビナントＣＤ３イプシロンを使用した。この単独で発現したリコンビナントＣＤ３イプシロンのコンフォメーションは、その天然形態で採り入れられたものとは異なり、すなわちＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＣＤ３イプシロンサブユニットが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＣＤ３デルタ又はＣＤ３ガンマサブユニットとの非共有結合複合体の一部として存在する形態である。そのような単独で発現したリコンビナントＣＤ３イプシロンタンパク質が、抗体ライブラリーから抗体を選択するための抗原として使用される場合、この抗原に特異的な抗体はライブラリーから同定されるが、そのようなライブラリーは自己抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎｓ）／自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ）に対する特異性を持つ抗体を含まない。これは、単独に発現したリコンビナントＣＤ３イプシロンタンパク質がインビボで存在しない事実による。それは自己抗原ではない。その結果、このタンパク質に特異的な抗体を発現するＢ細胞の亜集団は、インビボで枯渇していない。そのようなＢ細胞から構成される抗体ライブラリーならば、単独で発現したリコンビナントＣＤ３イプシロンタンパク質に特異的な抗体の遺伝物質を含むであろう。
しかし、コンテクスト非依存性Ｎ末端１−２７アミノ酸残基ポリペプチド又はその機能性断片は、そのネイティブ形態で折り畳まれたエピトープであるので、本発明に調和する結合ドメインは、国際公開第０４／１０６３８０号に記載されている手法に基づく方法では同定できない。したがって、国際公開第２００４／１０６３８０号に開示されている結合分子が、ＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端１−２７アミノ酸残基に結合できないことが試験で実証されうる。そのため、従来の抗ＣＤ３結合分子又は抗ＣＤ３抗体分子（例えば、国際公開第９９／５４４４０号に開示されたもの）は、本願に提供されるコンテクスト非依存性Ｎ末端１−２７アミノ酸残基ポリペプチド又はその機能性断片よりも、よりＣ末端に位置する位置でＣＤ３イプシロン鎖と結合する。従来技術抗体分子ＯＫＴ３及びＵＣＨＴ−１は、アミノ酸残基３５から８５の間のＴＣＲ／ＣＤ３複合体のイプシロンサブユニットに特異性を有し、したがって、これらの抗体のエピトープもよりＣ末端側に位置する。更に、ＵＣＨＴ−１は、アミノ酸残基４３から７７の領域でＣＤ３イプシロン鎖と結合する（Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅ，Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １ （１９８９）， ５４６−５０； Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎ， ＰＮＡＳ １０１， （２００４）， ７６７５− ７６８０； Ｓａｌｍｅｒｏｎ，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７ （１９９１）， ３０４７−５２）。したがって、従来技術の抗ＣＤ３分子は、本願に定義されるコンテクスト非依存性Ｎ末端１−２７アミノ酸残基エピトープ（又はその機能性断片）と結合せず、それに対して作られていない。
本発明のポリペプチド中に、例えば本願に定義された二重特異性単鎖抗体中に含まれる、好ましくはヒトの、結合ドメインを生成するために、例えば、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン（例えば、マカクザルＣＤ３イプシロン）の両方に結合するモノクローナル抗体が使用できる。
本発明のポリペプチドの好ましい実施形態において、非チンパンジー霊長類は旧世界猿である。ポリペプチドのより好ましい実施形態において、旧世界猿は、ヒヒ属、マカク属のサルである。最も好ましくは、マカク属のサルは、アッサムモンキー（マカカ・アサメンシス、Ｍａｃａｃａａｓｓａｍｅｎｓｉｓ）、バーバリーマカク（マカカ・シルバヌス、Ｍａｃａｃａ ｓｙｌｖａｎｕｓ）、ボンネットモンキー（マカカ・ラディアタ、Ｍａｃａｃａ ｒａｄｉａｔａ）、ウスイロマカク又はスラウェシマカク（マカカ・オケレアタ、Ｍａｃａｃａｏｃｈｒｅａｔａ）、クロザル（マカカ・ニグラ、Ｍａｃａｃａ ｎｉｇｒａ）、タイワンザル（マカカ・キュクロピス、Ｍａｃａｃａ ｃｙｃｌｏｐｓｉｓ）
、スノーモンキー又はニホンザル（マカカ・フスカタ、Ｍａｃａｃａ ｆｕｓｃａｔａ）、シノモルガスサル又はカニクイザル又はオナガザル又はクラ（マカカ・ファシキュラリス、Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、シシオザル（マカカ・シレヌス、Ｍａｃａｃａ ｓｉｌｅｎｕｓ）、ブタオザル（マカカ・ネメストリナ、Ｍａｃａｃａ ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）、アカゲザル（マカク・ムラッタ、Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ）、チベットマカク（マカカ・チベタナ、Ｍａｃａｃａ ｔｈｉｂｅｔａｎａ）、トンケアンモンキー（マカカ・トンケアナ、Ｍａｃａｃａ ｔｏｎｋｅａｎａ）、トクモンキー（マカカ・シニカ、Ｍａｃａｃａｓｉｎｉｃａ）、ベニガオザル（Ｓｔｕｍｐ−ｔａｉｌｅｄ ｍａｃａｑｕｅ）、ベニガオザル（Ｒｅｄ−ｆａｃｅｄ ｍａｃａｑｕｅ）又はクマザル（マカカ・アークトイデス、Ｍａｃａｃａａｒｃｔｏｉｄｅｓ）又はムーアモンキー（マカカ・マウラ、Ｍａｃａｃａ ｍａｕｒｕｓ）である。最も好ましくは、ヒヒ属のサルは、マントヒヒ（パピオ・ハマドリアス、Ｐａｐｉｏｈａｍａｄｒｙａｓ）；ギニアヒヒ（パピオ・パピオ、Ｐａｐｉｏ ｐａｐｉｏ）；アヌビスヒヒ（パピオ・アヌビス、Ｐａｐｉｏ ａｎｕｂｉｓ）；キイロヒヒ（パピオ・シノセファルス、Ｐａｐｉｏｃｙｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ）；チャクマヒヒ（パピオ・ウルシヌス、Ｐａｐｉｏ ｕｒｓｉｎｕｓ）である。
本発明のポリペプチドの別の好ましい実施形態において、非チンパンジー霊長類は新世界猿である。ポリペプチドのより好ましい実施形態において、新世界猿は、マーモセット属（マーモセット）、タマリン属又はリスザル属のサルである。最も好ましくは、マーモセット属のサルはカリスリクス・ジャカスであり、タマリン属のサルはサグイヌス・オイディプスであり、リスザル属のサルはサイミリ・シウレウスである。
本願で上述したように、本発明のポリペプチドは、ヒト及び非チンパンジー類人猿ＣＤ３ε（イプシロン）鎖のエピトープに、第１結合ドメインで結合するが、前記エピトープは、配列番号２、４、６又は８に記載される２７アミノ酸残基又はその機能性断片からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部である。
本発明と調和して、本発明のポリペプチドにとって、前記エピトープが、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６又は５アミノ酸を含むアミノ酸配列の一部であることが好ましい。
より好ましくは、前記エピトープは、少なくともアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ（Ｑ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｅ−Ｄ）を含む。
本発明の中で、「Ｎ末端１−２７アミノ酸残基の機能性断片」は、ＣＤ３複合体のネイティブ環境から取り出された（そして、例えば実施例３．１に示すとおり、ＥｐＣＡＭ又は免疫グロブリンＦｃ部などの異種アミノ酸配列に融合された）時に、前記機能性断片が、まだ、その三次元構造完全性を維持するコンテクスト非依存性エピトープであることを意味する。ＣＤ３イプシロンの２７アミノ酸Ｎ末端ポリペプチド又はその機能性断片内の三次元構造の維持は、インビトロでのＮ末端ＣＤ３イプシロンポリペプチド断片に、及びインビボでのＴ細胞上のネイティブ（ＣＤ３イプシロンサブユニット）ＣＤ３複合体に、同じ結合親和力で結合する結合ドメインの生成に利用できる。本発明の中で、Ｎ末端１−２７アミノ酸残基の機能性断片は、本願に提供されるＣＤ３結合分子が、コンテクスト独立的にそのような機能性断片に結合できることを意味する。当業者は、そのような抗ＣＤ３結合分子がエピトープのどのアミノ酸残基を認識するのかを測定するエピトープマッピングの方法（例えば、アラニンスキャニング）分析を承知している。
本発明の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、ヒト及び非チンパンジー類人猿ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な（第１）結合ドメイン及び細胞表面抗原に結合可能な第２結合ドメインを含む。
本願での「細胞表面抗原」という用語は、細胞の表面上に提示されている分子を意味する。ほとんどの場合で、この分子は、この分子の少なくとも一部分が、三次形態で細胞の外部から接近可能なままであるように、細胞の細胞膜の中又はその上に位置するであろう。細胞膜中に位置する細胞表面分子の非限定的な例は、その三次コンフォメーションで、親水性及び疎水性の領域を含む膜貫通型タンパク質である。ここで、少なくとも１つの疎水性領域は、細胞表面分子が細胞の疎水性細胞膜に埋め込まれるか、挿入されるようにし、その一方で親水性領域は、細胞膜の両面に延びてそれぞれ細胞質及び細胞外空間に延びる。細胞膜上に位置する細胞表面分子の非限定的な例は、パルミトイル基を持つようにシステイン残基で修飾されたタンパク質、ファルネシル基を持つようにＣ末端システイン残基で修飾されたタンパク質又はグリコシルホスファチジルイノシトール（「ＧＰＩ」）アンカーを持つようにＣ末端で修飾されたタンパク質である。これらの基により、細胞膜の外部表面にタンパク質が共有結合でき、それらは抗体などの細胞外分子による認識のために接近可能なままである。細胞表面抗原の例には、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＣＳＰ、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ３０、ＣＤ３３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＩｇＥ、ＣＤ４４ｖ６及びＭｕｃ−１がある。さらに、対応する細胞表面抗体の例は、特定の疾病又は病気、すなわち、ガン、自己免疫疾患又はウイルス感染を含む感染症に特徴的な抗原を含む。したがって、「細胞表面抗原」という用語は、感染細胞の表面に露出するネイティブの、未処理のウイルスタンパク質（とりわけ、Ｂ型、Ｃ型肝炎ウイルス及びＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質に関して記載される）などのウイルスタンパク質を明確に含む。
細胞障害性Ｔ細胞の防御機能の１つはウイルス感染細胞の破壊であり、したがって、本発明の二重特異性結合分子が、その自己由来の特異性にかかわらず、細胞障害性Ｔ細胞を活性化させ向け直す独特な性質は、広い分野の慢性ウイルス感染に大きな影響を持つ。これらの感染症の大部分にとって、持続感染している細胞の除去は、治癒のための唯一の機会である。最近、慢性ＣＭＶ及びＥＢＶ感染症に対して、養子Ｔ細胞療法が開発されつつある（Ｒｏｏｎｅｙ，ＣＭ．， ｅｔ ａｌ．， Ｕｓｅ ｏｆ ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ−ｖｉｒｕｓ−ｒｅｌａｔｅｄｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． Ｌａｎｃｅｔ， １９９５． ３４５ （８９４１）： ｐ． ９−１３； Ｗａｌｔｅｒ， ＥＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ｏｆ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗｂｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， １９９５． ３３３ （１６）： ｐ． １０３８−４４）。
慢性Ｂ型肝炎感染は、明らかに、最も興味深くやりがいのある適応症の１つである。世界中で３億５千万人から４億人がＨＢＶに感染している。慢性ＨＢＶ肝炎の最近の治療は、インターフェロンガンマ及びヌクレオシド又はヌクレオチドアナログにあり、肝炎拡大、発熱、筋痛症、血小板減少及び鬱の誘起などの著しい副作用を伴う長期の治療である。現在４を超える認可された治療レジメンがあるが、ウイルスの除去が達成されることは希である。慢性Ｂ型肝炎の持続炎症は、２５％を超える患者に肝硬変及び肝細胞ガンを起こす。さらに、慢性Ｂ型肝炎の患者の４０％までが、重篤な合併症で死亡し、これは世界中で年間に６０万人から１００万人の死亡原因となっている。
ヘパドナウイルスの原型であるＨＢＶは、その緩和環状（ｒｃ）ゲノムがＲＮＡプレゲノムに逆転写される、エンベロープウイルスである。感染後、ｒｃＤＮＡは肝細胞の細胞核に取り込まれ、そこで４つの重複するリーディングフレームを含む共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）になる。それは、プレゲノムＲＮＡ及び３つのサブゲノムＲＮＡのための転写鋳型として働く。ＲＮＡプレゲノムは、ウイルスコア及びポリメラーゼタンパク質の翻訳のためのｍＲＮＡとして機能する。感染細胞は、ＨＢＶ複製が停止した時でも、ｃｃｃＤＮＡからＨＢＶ表面タンパク質（ＨＢｓＡｇ）を連続的に産生する。ＨＢｓＡｇは、極低い割合の中程度及び大きい（Ｌ）表面タンパク質と共に小さい表面（Ｓ）タンパク質からなる。ＨＢＶＳ及びＬのどちらも、小胞体（ＥＲ）膜を標的とし、そこでそれらは膜小胞中でトランスゴルジ小器官を介して細胞膜に輸送される（Ｇｏｒｅｌｉｃｋ， Ｆ． Ｓ． ａｎｄＣ． Ｓｈｕｇｒｕｅ， Ｅｘｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ， ２００１． １７７ （１−２）：ｐ． １３−８）。最近示されたとおり、Ｓ及びＬタンパク質は、ＨＢＶを複製する肝細胞の表面上で永久に発現される（Ｃｈｕ， ＣＭ． ａｎｄ Ｙ．Ｆ． Ｌｉａｗ， Ｍｅｍｂｒａｎｅｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ： ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｍａｒｋｅｒ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ， １９９５． ４８（５）： ｐ．４７０−３）。
細胞表面でエンベロープタンパク質を露出するプロトタイプウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及びＨＩＶ−１であり、そのどちらも世界的に莫大な疾病の苦しみを象徴する。ＨＩＶ−１ウイルス適応症では、ｇｐ１２０エンベロープタンパク質に対するＦｖ抗体コンストラクトを持つキメラＴＣＲにより修飾されたＴ細胞がＨＩＶ−１に感染した標的細胞を殺すことができることが最近示された（Ｍａｓｉｅｒｏ，Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔｙｐｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ２００５． １２ （４）： ｐ． ２９９−３１０）。ヘパドナウイルスのうち、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ＨＢＶ複製が低下した場合ですら、エピソーマルｃｃｃＤＮＡから連続的に産生されるエンベロープタンパク質複合体ＨＢｓＡｇを発現する。
細胞表面上での無傷のＳ及びＬ ＨＢＶタンパク質としての発現は、患者が感染の急性期から回復し、循環するＨＢｓＡｇから抗ＨＢｓに変わる時に、血清変換の特徴である抗体にとって接近可能になる。血清変換が起こらない場合、最大３０％の肝細胞が、長期間の非常に活性な抗ウイルス治療の後でも、ＨＢＶＳタンパク質を発現し続ける。したがって、細胞内で処理されたＨＢＶペプチドを特異的に認識し細胞表面でＭＨＣ分子により提示されるＴリンパ球を超えて、外部細胞膜中で接近可能なＳ及びＬ抗原などの無傷の表面タンパク質に向けられた、他の形態のＴ細胞関与がありうる。Ｂ型肝炎ウイルス小（Ｓ）及び大（Ｌ）エンベロープタンパク質を認識する単鎖抗体断片を使用して、グラフトＴ細胞を感染した肝細胞に向け、これらのＴ細胞の抗原接触活性化時にサイトカインを分泌し、感染した肝細胞を殺すことを可能にする、人工Ｔ細胞レセプターが生成された。
この手法の限界は、（ｉ）Ｔ細胞をインビトロで操作する必要がある、（ｉｉ）Ｔ細胞レセプターの輸送に使用するレトロウイルスは、Ｔ細胞中に挿入突然変異を起こすことがある、（ｉｉｉ）Ｔ細胞が一旦輸送されると細胞障害性応答は制限できない。
これらの限界を克服するため、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン抗原（本発明の文脈中で本願に提供される）に対する結合特異性を持つ第１ドメイン並びに感染肝細胞のＨＢＶ又はＨＢＣエンベロープタンパク質に対する結合特異性を持つ第２ドメインを含む、二重特異性単鎖抗体分子を生成することができ、これは本発明の範囲内である。
本発明の中で、第２結合ドメインが、ヒトの及び／又は非チンパンジー霊長類の細胞表面抗原と結合することがさらに好ましい。
本発明のポリペプチド、例えば本願に定義される二重特異性単鎖抗体の第２結合ドメインを生成するために、それぞれのヒト及び／又は非チンパンジー霊長類の細胞表面抗原の両方に結合するモノクローナル抗体が利用できる。本願に定義される二重特異性ポリペプチドのための適切な結合ドメインは、当分野に記載されている組換え法による異種間特異性モノクローナル抗体から誘導できる。ヒトの細胞表面抗原及び非チンパンジー霊長類の前記表面抗原のホモログに結合するモノクローナル抗体は、上述のとおりＦＡＣＳアッセイにより試験できる。異種間特異性抗体も文献に記載されているハイブリドーマ技術から生成できることは当業者には明らかである（Ｍｉｌｓｔｅｉｎａｎｄ Ｋoｈｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６ （１９７５）， ４９５−７）。例えば、マウスを、ヒト及び非チンパンジー霊長類のＣＤ３３に対して交互に免疫することができる。これらのマウスから、異種間特異性抗体を産生するハイブリドーマ細胞がハイブリドーマ技術により単離され、上述のとおりＦＡＣＳにより分析される。本願に記載された異種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体などの二重特異性ポリペプチドの生成及び分析は、以下の実施例に示される。異種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体の利点は、以下に列挙された点を含む。
本発明のポリペプチドにとって、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープと結合可能な第１結合ドメインが、以下から選択されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含むことが特に好ましい：
（ａ）配列番号２７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２８に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２９に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
（ｂ）配列番号１１７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１８に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１１９に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
（ｃ）配列番号１５３に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５４に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１５５に示されるＣＤＲ−Ｌ３。
可変領域、すなわち可変軽鎖（「Ｌ」又は「ＶＬ」）及び可変重鎖（「Ｈ」又は「ＶＨ」）は、抗体の結合ドメインを与えると当分野で理解される。この可変領域は、相補性決定領域を含む。「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、抗体の抗原特異性を示すことが当分野に周知である。「ＣＤＲ−Ｌ」又は「ＬＣＤＲ」という用語は、ＶＬ中のＣＤＲを意味し、「ＣＤＲ−Ｈ」又は「Ｈ ＣＤＲ」という用語は、ＶＨ中のＣＤＲを意味する。
本発明のポリペプチドの別の好ましい実施形態において、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な第１結合ドメインは、以下から選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を含む：
（ａ）配列番号１２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１４に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｂ）配列番号３０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３２に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｃ）配列番号４８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４９に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号５０に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号６６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６７に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号６８に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｅ）配列番号８４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８５に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号８６に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｆ）配列番号１０２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１０３に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１０４に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｇ）配列番号１２０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２１に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１２２に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｈ）配列番号１３８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３９に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１４０に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉ）配列番号１５６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５７に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１５８に示されるＣＤＲ−Ｈ３；及び
（ｊ）配列番号１７４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７５に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１７６に示されるＣＤＲ−Ｈ３。
ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な結合ドメインが、配列番号３５、３９、１２５、１２９、１６１又は１６５に示されるＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域を含むことがさらに好ましい。
或いは、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な第１結合ドメインが、配列番号１５、１９、３３、３７、５１、５５、６９、７３、８７、９１、１０５、１０９、１２３、１２７、１４１、１４５、１５９、１６３、１７７又は１８１に示されるＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域を含むことが好ましい。
より好ましくは、本発明のポリペプチドは、以下からなる群から選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含む、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な第１結合ドメインにより特徴づけられる。
（ａ）配列番号１７又は２１に示されるＶＬ領域及び配列番号１５又は１９に示されるＶＨ領域；
（ｂ）配列番号３５又は３９に示されるＶＬ領域及び配列番号３３又は３７に示されるＶＨ領域；
（ｃ）配列番号５３又は５７に示されるＶＬ領域及び配列番号５１又は５５に示されるＶＨ領域；
（ｄ）配列番号７１又は７５に示されるＶＬ領域及び配列番号６９又は７３に示されるＶＨ領域；
（ｅ）配列番号８９又は９３に示されるＶＬ領域及び配列番号８７又は９１に示されるＶＨ領域；
（ｆ）配列番号１０７又は１１１に示されるＶＬ領域及び配列番号１０５又は１０９に示されるＶＨ領域；
（ｇ）配列番号１２５又は１２９に示されるＶＬ領域及び配列番号１２３又は１２７に示されるＶＨ領域；
（ｈ）配列番号１４３又は１４７に示されるＶＬ領域及び配列番号１４１又は１４５に示されるＶＨ領域；
（ｉ）配列番号１６１又は１６５に示されるＶＬ領域及び配列番号１５９又は１６３に示されるＶＨ領域；及び
（ｊ）配列番号１７９又は１８３に示されるＶＬ領域及び配列番号１７７又は１８１に示されるＶＨ領域。
本発明のポリペプチドの好ましい実施形態によると、ＶＨ領域とＶＬ領域の組は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）のフォーマットにある。ＶＨ及びＶＬ領域は、ＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＨの順番に配置されている。ＶＨ領域が、リンカー配列のＮ末端に位置することが好ましい。ＶＬ領域は、リンカー配列のＣ末端に位置する。
本発明の上述のポリペプチドの好ましい実施形態は、配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５又は１８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な第１結合ドメインにより特徴づけられる。
本発明は、第２結合ドメインが、好ましくは腫瘍抗原である細胞表面抗原に結合する、上述のポリペプチドにさらに関する。
本願での「腫瘍抗原」という用語は、腫瘍細胞上に提示される抗原であると理解されうる。これらの抗原は、分子の膜貫通及び細胞質部分と結合していることが多い細胞外部分とともに細胞表面に提示されることがある。これらの抗原は、腫瘍細胞によりのみ提示され、通常細胞によっては決して提示され得ない。腫瘍抗原は、腫瘍細胞上にのみ発現されるか、通常細胞と比較して腫瘍特異的な突然変異を表すことがある。この場合、それらは腫瘍特異的抗原と称される。腫瘍細胞及び通常細胞により提示される抗原がより一般的であり、それらは腫瘍関連抗原と称される。これらの腫瘍関連抗原は、正常細胞と比較して過剰発現される場合があり、又は正常組織と比較して腫瘍組織の構造が小さくないことから腫瘍細胞中で抗体結合を起こしやすい。本明細書で用いられる腫瘍抗原の限定されない例としては、ＥＧＦＲ（Ｌｉｕ，Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ８２／１２ （２０００）， １９９１‐１９９９； Ｂｏｎｎｅｒ， Ｓｅｍｉｎ． Ｒａｄｉａｔ． Ｏｎｃｏｌ． １２ （２００２），１１‐２０； Ｋｉｙｏｔａ， Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ６３／１ （２００２）， ９２‐９８； Ｋｕａｎ， Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｐａｔｈｏｌ． １７／２ （２０００），７１‐７８）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ （Ｋｕａｎ， Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｐａｔｈｏｌ． １７／２ （２０００）， ７１‐７８）、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＣａｒｂｏａｎｈｙｄｒａｓｅＩＸ）（ＭＮ／ＣＡ ＩＸ）（Ｕｅｍｕｒａ， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ８１／４ （１９９９）， ７４１‐７４６； Ｌｏｎｇｃａｓｔｅｒ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１／１７ （２００１）， ６３９４‐６３９９； Ｃｈｉａ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １９／１６ （２００１）， ３６６０‐３６６８； Ｂｅａｓｌｅｙ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１／１３ （２００１）， ５２６２‐５２６７）、ＣＤ３３（Ａｂｕｔａｌｉｂ， Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７ （２００６），３４３‐６９）、ＭＣＳＰ（Ｃａｍｐｏｌｉ， Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４ （２００４）， ２６７‐９６）、又はＩｇＥ（Ｉｎｆｕｈｒ， Ａｌｌｅｒｇｙ６０ （２００５）， ９７７‐８５）である。
腫瘍抗原は、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＣＳＰ、ＥｐＣＡＭ、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ３０、ＣＤ３３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＤ４４ｖ６、及びＭｕｃ‐１から選択されることが好ましい。
ＥＧＦＲ（ｃ−ｅｒｂ１又はＨＥＲ１としても知られる）は、ｅｒｂＢレセプターチロシンキナーゼファミリーに属する。成長因子のＥＧＦファミリーのリガンドの結合により活性化すると、ＥＧＦＲは、第２のＥＧＦＲ又はｅｒｂＢレセプターファミリーの他のメンバーとそれぞれホモダイマー化又はヘテロダイマー化し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ及び他の転写因子によりシグナル伝達カスケードを開始し、増殖、分化及び修復が起こる（Ｏｌａｙｉｏｙｅ，ＥＭＢＯ Ｊ． １９ （２０００）， ３１５９−６７）。ＥＧＦＲは、結直腸ガン、乳ガン、肺ガン及び頭頸部ガンを含む多くの上皮ガンで過剰発現される（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２１ （２００３）， ２７８７−９９； Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２０ （１８， Ｓｕｐｐｌ．）（２００２）， １Ｓ−１３Ｓ； Ｐｒｅｗｅｔｔ， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ８ （２００２）， ９９４−１００３）。悪性細胞中でのＥＧＦＲの過剰発現及び／又は突然変異は、キナーゼ活性の恒常的活性化につながり、増殖、血管形成、浸潤、転移及びアポトーシスの阻害を起こす（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ（２００３，上記引用文献； Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７ （２００１）， ２９５８−７０； Ｐｅｒｅｚ−Ｓｏｌｅｒ， Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ９ （２００４）， ５８−６７）。細胞外リガンド結合ドメイン又はＥＧＦＲの細胞内チロシンキナーゼシグナル伝達カスケードを標的にするモノクローナル抗体は、抗腫瘍標的としての効力が示されている（Ｌａｓｋｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ． Ｒｅｖｉｅｗ ３０ （２００４）， １−１７）。例えば、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、ＥＧＦＲに対するヒト化モノクローナル抗体は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインを競合阻害し、レセプターのリガンド活性化を阻害するが、トポイソメラーゼ阻害剤イリノテカンと組み合わせた転移性大腸ガンの治療用に食品医薬品局（ＦＤＡ）により２００４年に認可された。
メラノーマ関連細胞表面コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（Ｍｅｌａｎｏｍａ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｅ）（ＭＣＳＰ）は、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ‐ＭＡＡ）又はメラノーマ関連プロテオグリカンとしても知られる、２５０ｋＤａの糖タンパク質コア及びそれに結合したグリコサミノグリカン鎖を含む４５０ｋＤａを超える大型の細胞表面プロテオグリカンである（Ｐｌｕｓｃｈｋｅ，ＰＮＡＳ ９３ （１９９６）， ９７１０； Ｎｉｓｈｉｙａｍａ， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１４ （１９９１），３５９）。ＭＣＳＰの正確な作用は、未だ分かっていない。ＭＣＳＰは、細胞外器質（ＥＣＭ）との細胞間相互作用を媒介する共に、恐らく、血管形成、組織浸潤、及び細胞伸展に関与する受容体としての機能を果たす可能性があり、恐らく、血管形成、組織浸潤、及び細胞伸展に関与する（Ｂｕｒｇ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９ （１９９９）， ２８６９； ｌｉｄａ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６ （２００１）， １８７８６； Ｅｉｓｅｎｍａｎｎ，Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １ （１９９９）， ５０７； ｌｉｄａ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５ （１９９５）， ２１７７； Ｃａｍｐｏｌｉ （２００４），ｌｏｃ． ｃｉｔ）。ＭＣＳＰはａ４ｂ１によるリガンド結合を増強することができ、ＭＣＳＰの活性化により、ｃｄｃ４２依存性及びｐ１３０ｃａｓ依存性機構によるインテグリンが媒介する細胞浸潤が増強され得る。ＭＣＳＰは、コンドロイチン硫酸を介してＭＴ３−ＭＭＰと関連し、種々のＥＣＭタンパク質を分解し得る。これは、ＭＴ３−ＭＭＰを特異的に細胞のＥＣＭ接着部位に局在させることができる。従って、Ｉ型コラーゲンの浸潤及びＩ型ゼラチンの分解には、両分子が必要であると考えられる（ｌｉｄａ（２００１）， ｌｏｃ． ｃｉｔ．）。ＭＳＣＰは、腫瘍細胞の表面で顕著に発現される、メラノーマの主要なマーカーである。ＭＳＣＰは、少なくとも９０％のメラノーマ病変で発現する（Ｎａｔａｌｉ，Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ７２ （１９８４）， １３）。全てのメラノーマ関連抗原の中で、ＭＣＳＰは最も低度の不均質性を示す（Ｎａｔａｌｉ， ＣａｎｃｅｒＲｅｓ． ４５ （１９８５）， ２８８３）。通常ＭＣＳＰ陽性である、表在拡大型メラノーマ（発生率：６０％）、結節型メラノーマ（発生率：２０％）及び悪性黒子性メラノーマ（発生率：１０％）の原発腫瘍（ＲｅｚａＺｉａｉ １９８７ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４７： ２４７４）とは対照的に、末端性黒子性メラノーマ（発生率：５％）の原発腫瘍は、しばしばＭＣＳＰ陰性である（Ｋａｇｅｓｈｉｔａ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５１ （１９９１）， １７２６）。現在、米国では、毎年５３，６００件の新たなメラノーマの症例が診断されている（２００２年）。全体的なメラノーマ発生率は増加している。
本発明の好ましい実施形態において、ポリペプチドは二重特異性単鎖抗体分子である。
前臨床試験のためのサロゲート分子の開発に関する本願で先に記載した問題は、薬剤候補が二重特異性抗体、例えば二重特異性単鎖抗体である場合、さらにひどくなる。そのような二重特異性抗体では、認識される抗原の両方が、ある動物種に異種間特異性であり、そのような動物での安全性試験を可能にすることが要される。
やはり本願で先に記したとおり、本発明は、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な第１結合ドメイン及び細胞表面抗原に結合可能な第２結合ドメインを含むポリペプチドを提供するが、前記第２結合ドメインは、ヒト及び／又は非チンパンジー霊長類の細胞表面抗原にも結合することが好ましい。本発明の好ましいポリペプチドの要件を満たす薬剤候補としての二重特異性単鎖抗体分子の利点は、その様な分子の前臨床動物試験での使用並びに臨床試験で、さらにはヒトの治療での使用である。本発明の種間特異的二重特異性単鎖抗体の好ましい実施形態において、細胞表面抗原に結合する第２の結合ドメインはヒト起源である。本発明の種間特異的二重特異性分子において、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン鎖のエピトープに結合する結合ドメインは、二重特異性分子のＮ末端又はＣ末端でＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＨの順で位置する。第１及び第２結合ドメインにおいてＶＨ及びＶＬ鎖の異なる配列にある本発明の種間特異的二重特異性分子の例は、添付する実施例に記載される。
本願では、「二重特異性単鎖抗体」は、２つの結合ドメインを含むポリペプチド単鎖を意味する。各結合ドメインは、抗体重鎖からの１つの可変領域（「ＶＨ領域」）を含むが、第１結合ドメインのＶＨ領域は、ＣＤ３ε分子に特異的に結合し、第２結合ドメインのＶＨ領域は、以下により詳細に定義される細胞表面抗原に特異的に結合する。２つの結合ドメインは、短いポリペプチドスペーサーにより任意に互いに結合する。ポリペプチドスペーサーの非限定的な例は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ）及びそのリピートである。各結合ドメインは、抗体軽鎖からの１つの可変領域（「ＶＬ領域」）をさらに含み、第１及び第２結合ドメインのそれぞれにおいて、ＶＨ領域及びＶＬ領域は、例えばＥＰ６２３６７９Ｂ１に開示され特許請求されているタイプのポリペプチドリンカーにより互いに結合しているが、しかしいずれにせよ第１結合ドメインのＶＨ領域及びＶＬ領域と第２結合領域のＶＨ領域及びＶＬ領域が、それぞれの第１及び第２分子と特異的に結合できるように、互いに組むことが可能なほど長い。
本発明の好ましい態様によると、上記で特徴付けた二重特異性単鎖抗体分子は、第二の結合ドメイン中にＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、及びＣＤＲ Ｌ３として以下の配列の一群：配列番号：１８９‐１９４、配列番号：２０１‐２０６、配列番号：２１９‐２２４、配列番号：２３７‐２４２、配列番号：２５５‐２６０、配列番号：２７３‐２７９、配列番号：３８２‐３８４及び３８７‐３８９、配列番号：４００‐４０２及び４０５‐４０７、配列番号：４１８‐４２０及び４２３‐４２５、配列番号：４３６‐４３８及び４４１‐４４３、配列番号：４５４‐４５６及び４５９‐４６１、配列番号：４７２‐４７４及び４７７‐４７９、配列番号：４９０‐４９２及び４９５‐４９７、配列番号：及び５０８‐５１０及び５１３‐５１５、配列番号：５３０‐５３２及び１５６８乃至１５７０、配列番号：５４５‐５４７及び５５０‐５５２、配列番号：５５９‐５６１及び５６４‐５６６、配列番号：５７７‐５７９及び５８２‐５８４、配列番号：６１５‐６１７及び６２０‐６２２、配列番号：６３３‐６３５、６３８、６３９、及び１５７１、配列番号：６５０‐６５２及び６５５‐６５７、配列番号：６６８‐６７０及び６７３‐６７５、配列番号：６８２‐６８４及び６８７‐６８９、配列番号：６９６‐６９８及び７０１‐７０３、配列番号：７１０‐７１２及び７１５‐７１７、配列番号：７２４‐７２６及び７２９‐７３１、配列番号：７３８‐７４０及び７４３‐７４５、配列番号：７５２‐７５４及び７５７‐７５９、配列番号：７６６‐７６８及び７７１‐７７３、配列番号：７８０‐７８２及び７８５‐７８７、配列番号：７９４‐７９６及び７９９‐８０１、配列番号：８０８‐８１０及び８１３‐８１５、配列番号：８２２‐８２４及び８２７‐８２９、配列番号：８３６‐８３８及び８４１‐８４３、配列番号：８５０‐８５２及び８５５‐８５７、配列番号：８６６‐８６８及び８７１‐８７３、配列番号：８８４‐８８６及び８８９‐８９１、配列番号：９０２‐９０４及び９０７‐９０９、配列番号：９２０‐９２２及び９２５‐９２７、配列番号：９３８‐９４０及び９４３‐９４５、配列番号：９５６‐９５８及び９６１‐９６３、配列番号：９７４‐９７６及び９７９‐９８１、配列番号：９９２‐９９４及び９９７‐９９９、配列番号：１００６‐１００８及び１０１１‐１０１３、配列番号：１０２０‐１０２２及び１０２５‐１０２７、配列番号：１０３４‐１０３６及び１０３９‐１０４１、配列番号：１０４８‐１０５０及び１０５３‐１０５５、配列番号：１０６２‐１０６４及び１０６７‐１０６９、配列番号：１０７６‐１０７８及び１０８１‐１０８３、配列番号：１０９０‐１０９２及び１０９５‐１０９７、配列番号：１１１４‐１１１６及び１１１９‐１１２１、配列番号：１１２８‐１１３０及び１１３３‐１１３５、配列番号：１１４１‐１１４３及び１１４６‐１１４８、配列番号：１１５５‐１１５７及び１１６０‐１１６２、配列番号：１１６９‐１１７１及び１１７４‐１１７６、配列番号：１１８３‐１１８５及び１１８８‐１１９０、配列番号：１１９７‐１１９９及び１２０２‐１２０４、配列番号：１２１１‐１２１３及び１２１６‐１２１８、配列番号：１２２５‐１２２７及び１２３０‐１２３２、配列番号：１２３９‐１２４１及び１２４４‐１２４６、配列番号：１２５３‐１２５５及び１２５８‐１２６０、配列番号：１２６７‐１２６９及び１２７２‐１２７４、配列番号：１２８１‐１２８３及び１２８６‐１２８８、配列番号：１２９５‐１２９７及び１３００‐１３０２、配列番号：１３０９‐１３１１及び１３１４‐１３１６、配列番号：１３２３‐１３２５及び１３２８‐１３３０、配列番号：１３４３‐１３４５及び１３４８‐１３５０、配列番号：１３６１‐１３６３及び１３６６‐１３６８、配列番号：１３７５‐１３７７及び１３８０‐１３８２、配列番号：１３８９‐１３９１及び１３９４‐１３９６、配列番号：１４０３‐１４０５及び１４０８‐１４１０、配列番号：１４１７‐１４１９及び１４２２‐１４２４、配列番号：１４３１‐１４３３及び１４３６‐１４３８、配列番号：１４４５‐１４４７及び１４５０‐１４５２、配列番号：１４５９‐１４６１及び１４６４‐１４６６、配列番号：１４７３‐１４７５及び１４７８‐１４８０、配列番号：１４８６‐１４９１、配列番号：１４９２‐１４９７、配列番号：１５０５‐１５０７及び１５１０‐１５１２、配列番号：１５３１‐１５３３及び１５３６‐１５３８、配列番号：１５７３‐１５７５及び１５７８‐１５８０、配列番号：１５９１‐１５９３及び１５９６‐１５９８、配列番号：１６０５‐１６０７及び１６１０‐１６１２、及び配列番号：１６１９‐１６２１、１６２４‐１６２６、配列番号：１６３４‐１６３６及び１６３９‐１６４１、及び配列番号：１６５２‐１６５４、配列番号：１６５７‐１６５９、並びに配列番号：１６６９‐１６７４、から成る群より選択される一群を含む。
本発明の特に好ましい態様は、上記で述べたポリペプチドに関し、ここで、二重特異性単鎖抗体分子は：
（ａ）配列番号２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５若しくは３４７、３９３、３９５、３９７、４１１、４１３、４１５、４２９、４３１、４３３、４４７、４４９、４５１、４６５、４６７、４６９、４８３、４８５、４８７、５０１、５０３、５０５、５１９、５２１、５２３、１３３６、１３３８、１３４０、５３８、５４０、５４２、５５６、５７０、５７２、５７４、５８８、５９０、５９２、６２６、６２８、６３０、６４３、６４５、６４７、６６１、６６３、６６５、６７９、６９３、７０７、７２１、７３５、７４９、７６３、７７７、７９１、８０５、８１９、８３３、８４７、８６１、８６３、８７７、８７９、８８１、８９５、８９７、８９９、９１３、９１５、９１７、９３１、９３３、９３５、９４９、９５１、９５３、９６７、９６９、９７１、９８５、９８７、９８９、１００３、１０１７、１０３１、１０４５、１０５９、１０７３、１０８７、１１０１、１１２５、１１３８、１１５２、１１６６、１１８０、１１９４、１２０８、１２２２、１２３６、１２５０、１２６４、１２７８、１２９２、１３０６、１３２０、１３３４、１３５４、１３５６、１３５８、１３７２、１３８６、１４００、１４１４、１４２８、１４４２、１４５６、１４７０、１４８４、１５００、１５０２、１５１８、１５２０、１５２２、１５２４、１５２６、１５２８、１５４４、１５４６、１５４８、１５５０、１５５２、１５５４、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１５６４、１５６６、１５８６、１５８８、１６０２、１６１６、１６３０、１６４７、１６４９、又は１６６３のいずれかで示されるアミノ酸配列；及び、
（ｂ）配列番号２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６若しくは３４８、３９４、３９６、３９８、４１２、４１４、４１６、４３０、４３２、４３４、４４８、４５０、４５２、４６６、４６８、４７０、４８４、４８６、４８８、５０２、５０４、５０６、５２０、５２２、５２４、１３３７、１３３９、１３４１、５３９、５４１、５４３、５５７、５７１、５７３、５７５、５８９、５９１、５９３、６２７、６２９、６３１、６４４、６４６、６４８、６６２、６６４、６６６、６８０、６９４、７０８、７２２、７３６、７５０、７６４、７７８、７９２、８０６、８２０、８３４、８４８、８６２、８６４、８７８、８８０、８８２、８９６、８９８、９００、９１４、９１６、９１８、９３２、９３４、９３６、９５０、９５２、９５４、９６８、９７０、９７２、９８６、９８８、９９０、１００４、１０１８、１０３２、１０４６、１０６０、１０７４、１０８８、１１０２、１１２６、１１３９、１１５３、１１６７、１１８１、１１９５、１２０９、１２２３、１２３７、１２５１、１２６５、１２７９、１２９３、１３０７、１３２１、１３３５、１３５５、１３５７、１３５９、１３７３、１３８７、１４０１、１４１５、１４２９、１４４３、１４５７、１４７１、１４８５、１５０１、１５０３、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５、１５２７、１５２９、１５４５、１５４７、１５４９、１５５１、１５５３、１５５５、１５５７、１５５９、１５６１、１５６３、１５６５、１５６７、１５８７、１５８９、１６０３、１６１７、１６３１、１６４８、１６５０、又は１６６４のいずれかで示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
から選択される配列を含む。
本発明の好ましい態様では、二重特異性単鎖抗体は、ＣＤ３イプシロンに対して、及びその第二の結合ドメインによって認識される細胞表面抗原に対して種間特異的である。より好ましい態様では、このような二重特異性単鎖抗体は、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロンに対して、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類ＭＣＳＰ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＩｇＥ、ＣＤ４４ｖ６、Ｍｕｃ‐１、ＨＢＶ、及びＨＣＶに対して種間特異的である。別の選択肢としての態様では、本発明は、上述の本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。
本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。
多くの好適なベクターが分子生物学の当業者に公知であり、その選択は望まれる機能に依存するであろうが、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ及び遺伝子工学で従来使用される他のベクターがある。当業者に周知の方法を利用して種々のプラスミド及びベクターを構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．（上記引用文献）及びＡｕｓｕｂｅｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）， （１９９４）に記載されている技術を参照されたい。或いは、本発明のポリヌクレオチド及びベクターを、標的細胞への送達のため、リポソーム中に再構築することもできる。以下に詳細に議論されるように、クローニングベクターを使用してＤＮＡの個別の配列を単離することもできる。関連する配列を、特定のポリペプチドの発現が求められる発現ベクター中に移すこともできる。典型的なクローニングベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐＧＢＴ９がある。典型的な発現ベクターにはｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＯＰ１３ＣＡＴがある。
好ましくは、前記ベクターは、本願に定義される前記核酸配列に機能的に結合している調節配列である核酸配列を含む。
「調節配列」という用語は、それがライゲーションされるコード配列の発現をもたらすのに必要なＤＮＡ配列を意味する。そのような制御配列の性質は、ホスト生物により異なる。原核生物では、一般的に、制御配列はプロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターを含む。真核生物では、一般的に、制御配列は、プロモーター、ターミネーター及び、場合によって、エンハンサー、トランスアクティベーター又は転写因子を含む。「制御配列」という用語は、最低でも、その存在が発現に必要な全成分を含むものとし、追加の有利な成分も含むことがある。
「機能的に結合する」という用語は、そのように記載される成分が、その意図される方法で機能することを可能にする関係にある並列である。コード配列に「機能的に結合する」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と同等の条件下で達成するようにライゲーションされる。制御配列がプロモーターである場合、二本鎖核酸が使用されることが好ましいことは当業者には明らかである。
従って、列挙されるベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」は、選択されたホストを形質転換するために使用でき、選択されたホスト中にコード配列の発現を可能にするコンストラクトである。発現ベクターは、例えば、クローニングベクター、バイナリーベクター又は組み込み型ベクターでよい。発現は、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの核酸分子の転写を含む。
原核生物及び／又は真核生物において発現を確実にする調節因子は、当業者に周知である。真核細胞の場合には、それらは、転写の開始を確実にするプロモーター並びに、任意に、転写の停止及び転写の安定化を確実にするポリＡシグナルを通常含む。原核生物ホスト細胞での発現を可能にする可能性のある調節因子は、例えば、大腸菌でのＰL、ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターがあり、真核生物ホスト細胞での発現を可能にする調節因子の例は、酵母菌中のＡＯＸ１又はＧＡＬ１プロモーター、又は哺乳類又は他の動物細胞中のＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ−４０エンハンサー又はグロビンイントロンがある。
転写の開始の原因となる因子の他に、そのような調節因子は、ポリヌクレオチドの下流に、ＳＶ−４０−ポリＡ部位又はｔｋ−ポリ−Ａ部位など転写停止シグナルを含むこともある。
さらに、使用される発現系によって、ポリペプチドを細胞区画に向けることが可能な、又はそれを媒体中に分泌することが可能なリーダー配列も、列記された核酸配列のコード配列に加えることができ、当分野に周知である。添付される実施例も参照されたい。リーダー配列（複数可）は、翻訳、開始及び停止配列並びに好ましくは、翻訳されたタンパク質又はその一部を細胞膜周辺腔又は細胞外媒体へ分泌するよう指示することのできるリーダー配列と適当な相で組み立てられる。任意に、異種配列は、所望の特性、例えば発現された組換え産物の安定化又は簡易化精製を付与するＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。上記を参照されたい。この文脈において、Ｏｋａｙａｍａ−ＢｅｒｇｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎ−ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ、ｐＥＦ−ＡＤＡ又はｐＥＦ−ｎｅｏ（Ｍａｃｋｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（１９９５）９２，７０２１−７０２５及びＲａｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ （２００１） ５０（３），１４１−１５０）又はｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）などの好適な発現ベクターが当分野に公知である。
好ましくは、発現制御配列は真核生物ホスト細胞を形質転換若しくはトランスフェクトすることが可能なベクター中の真核生物プロモーター系であろうが、原核生物ホスト用の制御配列も使用できる。ベクターが適当なホスト中に一旦取り入れられると、ホストは、ヌクレオチド配列の高レベルな発現に好適な条件下に維持され、望まれる場合、本発明のポリペプチドの回収及び精製を続けてよい。例えば、添付される実施例を参照されたい。
細胞周期相互作用タンパク質の発現に使用できる、別な発現系はインサート系である。そのような系において、オートグラファー・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用し、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞又はイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）幼虫に外来遺伝子を発現する。言及された核酸分子のコード配列は、ポリヘドリン遺伝子など、ウイルスの非必須領域中にクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下におくことができる。前記コード配列の挿入がうまくいくと、ポリヘドリン遺伝子が不活性化し、コートタンパク質コートを欠く組換えウイルスが産生されるであろう。次いで、組換えウイルスを使用して、エス・フルギペルダ細胞又はイラクサギンウワバ幼虫を感染させ、そこで本発明のタンパク質が発現される（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４６ （１９８３）， ５８４； Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１ （１９９４）， ３２２４−３２２７）。
追加の調節因子には、転写エンハンサー並びに翻訳エンハンサーが含まれる。上述の本発明のベクターが、選択マーカー及び／又はスコア可能なマーカーを含むことが有利である。
形質転換された細胞及び、例えば、植物組織及び植物の選択に有用な選択マーカー遺伝子は当業者に周知であり、例えば、メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｒｅｉｓｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． （Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． Ａｄｖ．） １３ （１９９４）， １４３−１４９）；アミノグリコシドネオマイシン、カナマイシン及びパロマイシンに対する耐性を与えるｎｐｔ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ，ＥＭＢＯ Ｊ． ２ （１９８３）， ９８７−９９５）；及びハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｍａｒｓｈ， Ｇｅｎｅ ３２ （１９８４）， ４８１−４８５）に対する選択の基礎として代謝拮抗剤耐性を含む。追加の選択的遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するのを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するのを可能にするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５ （１９８８）， ８０４７）；細胞がマンノースを利用するのを可能にするマンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ（国際公開第９４／２０６２７号）及びオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬオルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を与えるＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，１９８７， Ｉｎ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｅｄ．）又はブラストシジンＳに対する耐性を与えるアスペルギルス・テルレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のデアミナーゼ（Ｔａｍｕｒａ， Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５９ （１９９５）， ２３３６−２３３８）が記載されている。
有用なスコア可能なマーカーも当業者に公知であり、市販されている。前記マーカーが、ルシフェラーゼ（Ｇｉａｃｏｍｉｎ， Ｐｌ．Ｓｃｉ． １１６ （１９９６）， ５９−７２； Ｓｃｉｋａｎｔｈａ， Ｊ． Ｂａｃｔ． １７８ （１９９６）， １２１）、緑色蛍光タンパク質（Ｇｅｒｄｅｓ， ＦＥＢＳＬｅｔｔ． ３８９ （１９９６）， ４４−４７）又はβ−グルクロニダーゼ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ， ＥＭＢＯ Ｊ． ６ （１９８７）， ３９０１−３９０７）をコードする遺伝子であることが有利である。この実施形態は、記載されたベクターを含む細胞、組織及び生物の簡単で迅速なスクリーニングに特に有用である。
上述のとおり、記載された核酸分子は、例えば、精製のため、それのみならず遺伝子治療目的に、単独又は細胞に本発明のポリペプチドを発現するベクターの一部として使用できる。本発明の上述のポリペプチドのいずれかをコードするＤＮＡ配列（複数可）を含む核酸分子又はベクターは、細胞に導入され、次に目的とするポリペプチドを産生する。遺伝子治療は、エキソビボ又はインビボ技術による細胞への治療遺伝子の導入に基づくが、遺伝子導入の最も重要な用途の１つである。インビトロ又はインビボ遺伝子治療のための好適なベクター、方法又は遺伝子送達システムは文献に記載されており、当業者に公知である。例えば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２ （１９９６）， ５３４−５３９； Ｓｃｈａｐｅｒ， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ７９ （１９９６）， ９１１−９１９； Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６ （１９９２）， ８０８−８１３； Ｖｅｒｍａ， Ｎａｔｕｒｅ ３８９ （１９９４）， ２３９； Ｉｓｎｅｒ， Ｌａｎｃｅｔ ３４８ （１９９６），３７０−３７４； Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ７７ （１９９５）， １０７７−１０８６； Ｏｎｏｄｅｒａ， Ｂｌｏｏｄ ９１ （１９９８），３０−３６； Ｖｅｒｍａ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５ （１９９８）， ６９２−６９９； Ｎａｂｅｌ， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１１ （１９９７），２８９−２９２； Ｖｅｒｚｅｌｅｔｔｉ， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９ （１９９８）， ２２４３−５１ ； Ｗａｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（１９９６）， ７１４−７１６；国際公開第９４／２９４６９号；国際公開第９７／００９５７号、米国特許第５，５８０，８５９号；米国特許第５，５８９，４６６号；又はＳｃｈａｐｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７ （１９９６）， ６３５−６４０を参照されたい。記載された核酸分子及びベクターは、細胞への直接導入用にも、或いはリポソーム又はウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）による導入用にも設計できる。好ましくは、前記細胞は、生殖細胞株細胞、胚細胞又は卵細胞であり、或いはそれらから誘導されており、最も好ましくは前記細胞は幹細胞である。胚性幹細胞の例は、とりわけ、Ｎａｇｙ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０ （１９９３）， ８４２４−８４２８に記載されている幹細胞でよい。
本発明は、本発明のベクターにより形質転換又はトランスフェクトされたホストも提供する。前記ホストは、本発明の上述のベクター又は本発明の上述の核酸分子をホストへ導入して製造できる。ホスト中の少なくとも１つのベクター又は少なくとも１つの核酸分子の存在が、上述の単鎖抗体コンストラクトをコードする遺伝子の発現を媒介することができる。
記載された本発明の核酸分子又はベクターは、ホストに導入され、ホストのゲノムに統合されることがあるが、染色体外に維持されることもある。
ホストは、どのような原核生物細胞でも真核生物細胞でもよい。
「原核生物」という用語は、細菌全てを含むように意味し、本発明のタンパク質の発現のためＤＮＡ又はＲＮＡ分子により形質転換又はトランスフェクトすることができる。原核細胞ホストは、大腸菌、ネズミチフス菌、霊菌及び枯草菌などのグラム陰性菌並びにグラム陽性菌を含む。「真核」という用語は、酵母、高等植物、昆虫、好ましくは哺乳類の細胞を含むように意味する。組換え産生手順に使用されるホストにより、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質はグリコシル化されることがあるが、非グリコシル化されることもある。本発明のポリペプチドのコード配列を含みＮ末端ＦＬＡＧタグ及び／又はＣ末端Ｈｉｓタグが遺伝子的に融合されるプラスミド又はウイルスの使用が特に好ましい。好ましくは、前記ＦＬＡＧタグの長さは、約４〜８アミノ酸であり、最も好ましくは８アミノ酸である。上述のポリヌクレオチドを使用して、当業者に通常公知である技術のいずれかを利用して、ホストを形質転換又はトランスフェクトすることができる。さらに、融合し、機能的に結合した遺伝子の調製及び、例えば哺乳類細胞及び細菌中でのそれらの発現の方法は、当業者に周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記引用文献中）。
好ましくは、前記ホストは、細菌或いは昆虫、真菌、植物又は動物の細胞である。
記載されたホストが哺乳類細胞であることが特に想定される。特に好ましいホスト細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２／０又はＮＳ／０などのミエローマ細胞株を含む。添付される実施例に示すとおり、ＣＨＯ細胞がホストとして特に好ましい。
より好ましくは、前記ホスト細胞は、ヒトの細胞又はヒトの細胞株、例えばｐｅｒ．ｃ６である（Ｋｒｏｏｓ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．， ２００３， １９：１６３−１６８）。
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドの産生方法にも関するが、前記方法は、本発明のポリペプチドの発現を可能にする条件下で本発明のホストを培養する工程及び産生されたポリペプチドを培養物から回収する工程を含む。
形質転換されたホストは、当業者に公知の技術により発酵槽中で生育され、培養されて、最適な細胞成長を得る。次いで、本発明のポリペプチドは、増殖培養液、細胞溶解物又は細胞膜分画から単離できる。例えば、細菌により発現した本発明のポリペプチドの単離及び精製は、例えば、分取クロマトグラフ分離並びに、例えば本発明のポリペプチドのタグに対するモノクローナル又はポリクローナル抗体の使用を含むもの或いは添付される実施例に記載のものなどの免疫学的分離など、どのような従来の手段によってもよい。
発現を可能にするホストの培養条件は当業者に公知であり、ホスト系及びそのような方法に利用される発現系／ベクターに依存する。組換えポリペプチドの発現を可能にする条件を得るために修正すべきパラメータは当分野に公知である。例えば、好適な条件は、さらなる発明のインプットなしに当業者により決定できる。
一旦発現すると、本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当分野の標準的な手順により精製することができる。Ｓｃｏｐｅｓ， "Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ"， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ． （１９８２）を参照されたい。少なくとも約９０から９５％の均質性の実質的に純粋なポリペプチドが好ましく、９８から９９％以上の均質性が医薬用途に最も好ましい。部分的に又は望まれるとおり均質に一旦精製されると、本発明のポリペプチドを（体外を含む）治療用に又はアッセイ手順の開発及び実施に使用できる。さらに、培養物からの本発明のポリペプチドの回収方法の例は、添付される実施例に詳細に記載される。
さらに、本発明は本発明のポリペプチド又は先に開示された方法により産生されたポリペプチドを含む組成物を与える。好ましくは、前記組成物は医薬組成物である。
本発明によると、「医薬組成物」という用語は、患者、好ましくはヒトの患者に投与するための組成物に関する。本発明の特に好ましい医薬組成物は、コンテクスト非依存性ＣＤ３エピトープを対象としそれに対して生成された結合分子を含む。好ましくは、医薬組成物は、キャリア、安定剤及び／又は賦形剤の好適な製剤を含む。好ましい実施形態において、医薬組成物は、非経口、経皮、腔内、動脈内、髄腔内及び／又は鼻腔内投与のための、又は組織への直接注入による組成物を含む。前記組成物が、注入又は注射により患者に投与されることが特に想定される。好適な組成物の投与は、種々の方法により、例えば、静脈中への、腹膜内への、皮下への、筋肉内への、局所又は皮内への投与により実施することができる。特に、本発明は、好適な組成物の中断されない投与を与える。非限定的な例として、中断されない、すなわち連続的な投与が、患者の体内への治療薬の流入を測定する、患者が装着する小さなポンプシステムにより実現できる。本発明のコンテクスト非依存性ＣＤ３エピトープを対象としそれに対して生成された結合分子を含む医薬組成物は、前記ポンプシステムの利用により投与できる。そのようなポンプシステムは一般的に当分野に公知であり、注入すべき治療薬を含むカートリッジの周期的な交換に通常頼る。そのようなポンプシステムでカートリッジを交換する際、患者の体内への治療薬のそうでなければ中断されない流入の一時的な中断が起こることがある。そのような場合、カートリッジ交換の前の投与の時期及びカートリッジ交換の後の投与の時期は、それでも医薬手段の意味の中にあると考えられ、本発明の方法は共に、そのような治療薬の１つの「中断されない投与」を作り上げる。
本発明のコンテクスト非依存性ＣＤ３エピトープを対象とし又はそれらに対して生成されたこれら結合分子の連続又は中断されない投与は、流体を貯蔵器から出すための流体駆動機構及び前記駆動機構を作動させるための作動機構を含む流体送達装置又は小さなポンプシステムにより、静脈又は皮下へ実施できる。皮下投与のためのポンプシステムは、患者の皮膚を貫通し、好適な組成物を患者の体内へ送達するための針又はカニューレを含む。前記ポンプシステムは、静脈、動脈又は血管に関係なく、患者の皮膚に直接固定又は付着してよく、それによりポンプシステムと患者の皮膚の直接接触を可能にする。ポンプシステムは、数日程度、２４時間、患者の皮膚に付着してよい。ポンプシステムは、小さい容積の貯蔵器を持つ小さなサイズでもよい。非限定的な例として、投与すべき好適な医薬組成物の貯蔵器の容積は、０．１から５０ｍｌでありうる。
連続投与は、皮膚に貼り付け時々交換するパッチによる経皮でもよい。当業者は、この目的に好適な薬物送達のためのパッチシステムを承知している。好都合には、第１の使用済みパッチの交換が、例えば、第１の使用済みパッチのすぐ隣の皮膚表面で第１の使用済みパッチの除去の直前に、新しい第２のパッチの配置と同時に実施できるので、経皮投与が中断されない投与を特に受け入れやすいことに留意されたい。流入の中断又は電池の消耗の問題が起こらない。
特に、コンテクスト非依存性ＣＤ３エピトープを対象としそれに対して生成される結合分子を含む本発明の組成物は、薬剤的に許容できるキャリアをさらに含んでよい。好適な医薬キャリアの例は当分野に周知であり、溶液、例えばリン酸緩衝食塩水、水、水中油滴型エマルションなどのエマルション、種々の湿潤剤、無菌液、リポソームなどが挙げられる。そのようなキャリアを含む組成物は、周知の従来法により処方できる。製剤は、炭水化物、緩衝溶液、アミノ酸及び／又は界面活性剤を含むことがある。炭水化物は、非還元糖、好ましくはトレハロース、スクロース、八硫酸エステル、ソルビトール又はキシリトールでよい。そのような製剤は、ポンプシステムがある、及び／又はポンプシステムがない経皮でも皮下でもよい連続投与に使用できる。アミノ酸は、荷電アミノ酸、好ましくはリジン、リジン酢酸塩、アルギニン、グルタミン酸塩及び／又はヒスチジンでよい。界面活性剤は、好ましくは分子量が１．２ｋＤを超える洗剤及び／又は好ましくは分子量が３ｋＤを超えるポリエーテルでよい。好ましい洗剤の非限定的な例は、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０又はＴｗｅｅｎ８５である。好ましいポリエーテルの非限定的な例は、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００又はＰＥＧ５０００である。本発明に使用される緩衝系は、ｐＨ５〜９を有することが好ましく、クエン酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、ヒスチジン及び酢酸塩を含むことがある。本発明の組成物は、例えば、非チンパンジー霊長類、例えばマカクザルへの、本願に記載される異種間特異性を示す本発明のポリペプチドの投与量を増加させることによる用量増加試験により決定できる好適な用量で、被験者に投与することができる。上述のとおり、本願に記載される異種間特異性を示す本発明のポリペプチドは、好都合には、非チンパンジー霊長類における前臨床試験とヒトの薬剤として同一の形態で使用できる。これらの組成物は、他のタンパク質又は非タンパク質薬剤と組み合わせて投与することもできる。これらの薬剤は、本願に定義される本発明のポリペプチドを含む組成物と同時に投与してもよいが、前記ポリペプチドの投与の前又は後に、折良く決められた間隔及び用量で別々に投与することもできる。投与計画は、主治医及び臨床因子により決定されるであろう。医学分野に周知の通り、ある１人の患者への投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、全般的な健康状態及び同時に投与される他の薬剤など多くの因子による。非経口投与の調剤薬は、無菌の水溶液又は非水溶液、懸濁液及びエマルションを含む。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性キャリアには、塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルション又は懸濁液がある。非経口賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル又は不揮発性油がある。静注用賦形剤には、流体及び栄養補液、電解質補液（リンゲルデキストロースに基づくものなど）等がある。抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、不活性ガスなどの防腐剤及び他の添加物も存在してよい。さらに、本発明の組成物は、好ましくはヒト起源の、血清アルブミン又は免疫グロブリンなどのタンパク質キャリアを含んでよい。本発明の組成物が、本願に定義された本発明のポリペプチドに加え、組成物の意図される用途によって、生物活性薬剤をさらに含むことが想定される。そのような薬剤は、胃腸系に作用する薬剤、細胞増殖抑止剤として作用する薬剤、高尿酸血症を防ぐ薬剤、免疫反応を阻害する薬剤（例えば、コルチコステロイド）、炎症反応を和らげる薬剤、循環系に作用する薬剤及び／又は当分野に工程のサイトカインなどの薬剤であることがある。
本願に定義される医薬組成物の生物活性は、例えば、以下の実施例、国際公開第９９／５４４４０号又はＳｃｈｌｅｒｅｔｈら（ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２０ （２００５）， １ − １２）に記載される通り、細胞障害性アッセイにより測定することができる。本願での「効能」又は「インビボ効能」は、例えば標準化されたＮＣＩ応答基準を利用する、本発明の医薬組成物による治療への応答を意味する。本発明の医薬組成物を使用する治療の成功又はインビボ効能は、その意図された目的のための組成物の効力、すなわち組成物がその望まれる効果を起こす能力、すなわち、例えば腫瘍細胞など病的細胞の消耗を意味する。インビボ効能は、白血球数、ディファレンシャル、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺法などがあるがこれらに限定されない、それぞれの疾病のための確立された標準方法により監視できる。それに加え、種々の疾病特異的な臨床化学パラメータ及び他の確立された標準法を使用してよい。さらに、コンピュータによる断層撮影、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影（例えば、米国国立ガン研究所の基準に基づく反応評価［ＣｈｅｓｏｎＢＤ， Ｈｏｒｎｉｎｇ ＳＪ， Ｃｏｉｆｆｉｅｒ Ｂ， Ｓｈｉｐｐ ＭＡ， Ｆｉｓｈｅｒ Ｒｌ， Ｃｏｎｎｏｒｓ ＪＭ， Ｌｉｓｔｅｒ ＴＡ， Ｖｏｓｅ Ｊ，Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ Ａ， Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ Ａ， Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ Ｆ， Ｋｌｉｐｐｅｎｓｔｅｎ Ｄ， Ｈｉｄｄｅｍａｎｎ Ｗ， ＣａｓｔｅｌｌｉｎｏＲ， Ｈａｒｒｉｓ ＮＬ， Ａｒｍｉｔａｇｅ ＪＯ， Ｃａｒｔｅｒ Ｗ， Ｈｏｐｐｅ Ｒ， Ｃａｎｅｌｌｏｓ ＧＰ． Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｗｏｒｋｓｈｏｐ ｔｏ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ'ｓｌｙｍｐｈｏｍａｓ． ＮＣＩ Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． １９９９ Ａｐｒ； １７（４）：１２４４］）、陽電子放出断層撮影スキャニング、白血球数、ディファレンシャル、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺、リンパ節生検／組織構造及び種々のリンパ腫特異的な臨床化学的パラメータ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ）及び他の確立された標準的な方法を利用できる。
本発明の医薬組成物などの薬剤の開発における他の主な課題は、薬物動態学的性質の予測可能な調整である。このために、薬剤候補の薬物動態学的プロファイル、すなわちある病気を治療するための特定の薬剤の能力を発揮する薬物動態学パラメータが確立される。ある疾病を治療するための薬剤の能力に影響を与える薬剤の薬物動態学的パラメータには、半減期、分布容積、肝初回通過代謝及び血清タンパク結合率があるが、これらに限定されない。ある薬剤の効能は、上述のパラメータのそれぞれにより影響を受けうる。
「半減期」は、投与された薬剤の５０％が、例えば代謝、排泄などの生物学的過程により除去される時間である。
「肝初回通過代謝」は、肝臓との初回接触時、すなわち肝臓を最初に通過する間に薬剤が代謝される傾向を意味する。「分布容積」は、体の種々の区画、例えば細胞内及び細胞外空間、組織及び器官等における薬剤の保持の程度及びこれらの区画中の薬剤の分布を意味する。「血清結合率」は、薬剤が、アルブミンなどの血清タンパク質と相互作用及び結合し、薬剤の生物活性の低下又は損失をもたらす傾向を意味する。
薬物動態学的パラメータには、投与されるある量の薬剤に対して、バイオアベイラビリティ、ラグタイム（Ｔｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度、より多くの発症及び／又はＣｍａｘがある。
「バイオアベイラビリティ」は、血液区画中の薬剤の量を意味する。
「ラグタイム」は、薬剤の投与と血液又は血漿中のその検出及び可測性の間の遅延時間を意味する。
「Ｔｍａｘ」は、薬剤の最高血液濃度に達する時間であり、「Ｃｍａｘ」はある薬剤で最大に得られる血液濃度である。その生物学的効果のために要する薬剤の血液又は組織濃度に達する時間は、全てのパラメータに影響される。異種間特異性を示す本発明のポリペプチドの好ましい実施形態である、二重特異性単鎖抗体の薬物動態学的パラメータは、上記のとおり非チンパンジー霊長類における前臨床動物試験で測定可能だが、例えばＳｃｈｌｅｒｅｔｈら（ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２０ （２００５）， １−１２）による刊行物にも述べられている。
本願での「毒性」という用語は、有害事象又は重篤な有害事象に明らかになる薬剤の毒作用を意味する。これらの副作用は、全般的な薬剤の耐容性の欠如及び／又は投与後の局所耐容性の欠如を意味することがある。毒性は、薬剤により起こる催寄性又は発ガン作用も含むことがある。
本願での「安全性」、「インビボ安全性」又は「耐容性」は、投与の直後（局所耐容性）及びより長い期間の薬剤の使用の間の重篤な有害事象を引き起こさない薬剤の投与を定義する。「安全性」、「インビボ安全性」又は「耐容性」は、例えば治療及び継続管理期間の間に定期的に評価できる。測定には、臨床評価、例えば器官の症状及び臨床検査値異常のスクリーニングが挙げられる。臨床評価は、ＮＣＩ−ＣＴＣ及び／又はＭｅｄＤＲＡ基準により記録／コード化された通常の所見により実施され基準から外れることもある。器官の症状には、ＣｏｍｍｏｎＴｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ ｖ３．０ （ＣＴＣＡＥ）に述べられている通り、アレルギー／免疫、血液／骨髄、不整脈、凝固などの基準が含まれる。試験できる臨床検査パラメータには、例えば、血液、臨床化学検査、凝固プロファイル及び尿の分析があり、血清、血漿、リンパ球又は髄液、リカーなどの他の体液の検査がある。例えば、安全性は、身体検査、イメージング技術（すなわち、超音波、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ））、技術装置による他の手段（すなわち、心電図）、バイタルサインにより、臨床検査パラメータ測定及び有害事象の記録により評価できる。例えば、本発明の使用及び方法における非チンパンジー霊長類での有害事象は、組織病理学的及び／又は組織化学的方法により調査できる。
本願での「有効且つ非毒性の投与量」は、目立った毒作用を伴わず、又は基本的に伴わずに、病的細胞の枯渇、腫瘍の消去、腫瘍の縮小又は疾病の安定化をもたらすに十分なほど高い、本願に定義される二重特異性単鎖抗体の耐容量を意味する。そのような有効且つ非毒性の投与量は、例えば、当分野に記載される用量増加試験により決定することができ、重篤な有害事象を引き起こす用量未満でなくてはならない（用量規制毒性、ＤＬＴ）。
上記の用語は、例えば、バイオテクノロジー由来医薬品の前臨床における安全性評価Ｓ６；ＩＣＨ Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ ＴｒｉｐａｒｔｉｔｅＧｕｉｄｅｌｉｎｅ； ＩＣＨ Ｓｔｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｊｕｌｙ １６， １９９７にも言及されている。
さらに、本発明は、増殖性疾患、腫瘍性疾患又は免疫疾患から選択された疾患の予防、治療又は回復のための本発明のポリペプチド（すなわち、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン鎖のエピトープに結合可能な少なくとも１つの結合ドメインを含むポリペプチドであって、前記エピトープが、本発明の、又は本発明の方法により産生された配列番号２、４、６又は８からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部である）を含む医薬組成物に関する。好ましくは、前記医薬組成物は、キャリア、安定剤及び／又は賦形剤の好適な製剤をさらに含む。
本発明のさらなる態様は、先に本願に定義されたポリペプチド又は先に本願に定義された方法により産生されるポリペプチドの、疾患の予防、治療又は回復のための医薬組成物を調製するための使用に関する。好ましくは、前記疾患は、増殖性疾患、腫瘍性疾患又は免疫疾患である。前記腫瘍性疾患が悪性疾患、好ましくはガンであることがさらに好ましい。
本発明のポリペプチドの使用の他の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、追加の薬剤と組み合わせて、すなわち併用療法の一部として投与されることが好適である。前記併用療法において、活性薬剤が、本発明のポリペプチドとして同じ医薬組成物中に任意に含まれてもよく、或いは別な医薬組成物に含まれることもある。この後者の場合、前記の別な医薬組成物の投与は、本発明のポリペプチドを含む前記医薬組成物の投与の前でも、同時でも、その後でも好適である。追加の薬剤又は医薬組成物は、非タンパク質化合物でも、タンパク質化合物でもよい。追加の薬剤がタンパク質化合物である場合、タンパク質化合物が、免疫エフェクター細胞のための活性化シグナルを提供できるタンパク質化合物であることが有利である。
好ましくは、前記タンパク質化合物又は非タンパク質化合物は、本発明のポリペプチド、上記に定義された核酸分子、上記に定義されたベクター又は上記に定義されたホストと同時にでも、又は非同時にでも投与できる。
本発明の他の態様は、その必要のある被験者での疾患の予防、治療又は回復の方法に関するが、前記方法は本発明の有効量の医薬組成物を投与する工程を含む。好ましくは、前記疾患は、増殖性疾患、腫瘍性疾患又は免疫疾患である。さらにより好ましくは、前記腫瘍性疾患は、悪性疾患、好ましくはガンである。
本発明の方法の他の好ましい実施形態では、前記医薬組成物は、追加の薬剤と組み合わせて、すなわち併用療法の一部として投与されるのが好ましい。前記併用量において、活性薬剤が、本発明のポリペプチドとして同じ医薬組成物中に任意に含まれてもよく、或いは別な医薬組成物に含まれることもある。この後者の場合、前記の別な医薬組成物の投与は、本発明のポリペプチドを含む前記医薬組成物の投与の前でも、同時でも、その後でも好適である。追加の薬剤又は医薬組成物は、非タンパク質化合物でも、タンパク質化合物でもよい。追加の薬剤がタンパク質化合物である場合、タンパク質化合物が、免疫エフェクター細胞のための活性化シグナルを提供できるタンパク質化合物であることが有利である。
好ましくは、前記タンパク質化合物又は非タンパク質化合物は、本発明のポリペプチド、上記に定義された核酸分子、上記に定義されたベクター又は上記に定義されたホストと同時にでも、又は非同時にでも投与できる。
本発明の上記の方法では、前記被験者がヒトであることが好ましい。
さらなる態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、本発明の核酸分子、本発明のベクター又は本発明のホストを含むキットに関する。
本発明は、以下のアイテムのリストによりさらに特徴づけられる。
アイテム１
ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）のエピトープに結合可能な異種間特異性結合ドメインを含むポリペプチド（複数可）の同定方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）該ポリペプチド（複数可）を、アミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ（配列番号３８１）又はＧｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−ＧＩｙ（配列番号３８２）を含み、そのＣ末端で固定相に固定されている最大２７アミノ酸のＣＤ３εの細胞外ドメインのＮ末端断片に接触させる工程；
（ｂ）結合したポリペプチド（複数可）を前記断片から溶離する工程；及び
（ｃ）該ポリペプチド（複数可）を（ｂ）溶離液から単離する工程。
本発明の上記方法で同定されたポリペプチド（複数可）がヒト起源であることが好ましい。
本「ポリペプチド（複数可）の同定方法」は、複数のポリペプチド候補から、アミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ（配列番号３８１）又はＧｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−ＧＩｙ（配列番号３８２）をそのＮ末端で含むＣＤ３εの細胞外ドメインの断片に対して同じ特異性を持つ１つ以上の異なるポリペプチドを単離する方法並びに溶液からのポリペプチドの精製方法であると理解される。ＣＤ３εの細胞外ドメインの断片に対して同じ特異性を持つ１つ以上の異なるポリペプチドを単離する方法の非限定的な実施形態には、抗原特異性結合体の選択方法、例えばハイブリドーマスクリーニングに通常利用されるパニング法、真核ホスト細胞の一過性導入／安定導入されたクローンのスクリーニング、ファージディスプレイ法がある。後者の溶液からのポリペプチドの精製方法の非限定的な例は、例えば、培養上清からのリコンビナント発現ポリペプチドの精製又はそのような培養液の調製である。
上述のとおり、本発明の方法に使用される断片は、霊長類ＣＤ３ε分子の細胞外ドメインのＮ末端断片である。異なる霊長類のＣＤ３ε分子の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１、３、５及び７に示されている。Ｎ末端オクタマーの２つの形態は、配列番号３８１及び３８２に示されている。本発明の方法により同定されるポリペプチドの結合用に、Ｎ末端が自由に利用可能であることが好ましい。本発明の文脈において、「自由に利用可能」という用語は、Ｈｉｓ−ｔａｇなどの追加モチーフがないと理解される。そのようなＨｉｓ−ｔａｇと本発明の方法により同定される結合分子との干渉は、添付する実施例６及び３４に記載されている。
本発明の方法によると、前記断片はＣ末端で固定相に固定されている。当業者は、本発明の方法の利用される実施形態に頼って、好適な固定相支持体を容易に発明の労作無く選択するであろう。固体支持体の例は、ビーズなどのマトリックス（例えば、アガロースビーズ、セファロースビーズ、ポリスチロールビーズ、デキストランビーズ）、プレート（培養プレート又は多穴プレート）並びに例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）から知られるチップがあるが、これらに限定されない。断片の前記固体支持体への固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）／固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）の手段及び方法の選択は、固体支持体の選択による。固定／固定化に通常利用される方法は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルによるカップリングである。このカップリングの基となる化学作用並びに固定／固定化の他の方法は、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ "Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． （１９９６）から当業者に公知である。クロマトグラフィ支持体に固定／固定化するには、以下の手段が通常利用される：ＮＨＳ活性化セファロース（例えば、ＧＥＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ−ＡｍｅｒｓｈａｍのＨｉＴｒａｐ−ＮＨＳ）、ＣｎＢｒ−活性化セファロース（例えば、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ＮＨＳ活性化デキストランビーズ（Ｓｉｇｍａ）又は活性化ポリメタクリレート。これらの試薬は、バッチ式手法にも使用できる。さらに、酸化鉄を含むデキストランビーズ（例えばＭｉｌｔｅｎｙｉから市販）もバッチ式手法に使用できる。これらのビーズは、溶液からビーズを分離するための磁石と組み合わせて使用できる。ポリペプチドは、ＮＨＳ活性化カルボキシメチルデキストランの使用によりＢｉａｃｏｒｅチップ（例えばＣＭ５チップ）に固定化できる。適当な固体支持体のさらなる例は、アミン反応性ＭｕｌｔｉＷｅｌｌプレート（例えば、ＮｕｎｃＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ（商標）プレート）である。
本発明の方法によると、ＣＤ３イプシロンの細胞外ドメインの前記断片は、直接に、或いは、リンカー又は他のタンパク質／ポリペプチド部分であることもあるアミノ酸のストレッチを介して固体支持体にカップリングできる。別法としては、ＣＤ３イプシロンの細胞外ドメインは、１つ以上のアダプター分子（複数可）により間接的にカップリングできる。
固定化されたエピトープに結合したペプチドを溶離する手段及び方法は当分野に周知である。同定されたポリペプチド（複数可）を溶離液から単離する方法にも同じことがいえる。
本発明と調和して、複数のポリペプチド候補から、そのＮ末端でアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−ＧＩｕ−Ｘ−ＧＩｙを含むＣＤ３εの細胞外ドメインの断片に同じ特異性を持つ１つ以上の異なるポリペプチドを単離する方法は、抗原特異体の選択に以下の方法の１つ以上の工程を含むことがある。
ＣＤ３ε特異的結合分子は、抗体から誘導されたレパートリーから選択できる。例えば、"ＰｈａｇｅＤｉｓｐｌａｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"； Ｅｄ． Ｂａｒｂａｓ， Ｂｕｒｔｏｎ，Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００１に開示されている標準的な手順に基づき、ファージディスプレイライブラリーを構築できる。抗体ライブラリー中の抗体断片のフォーマットはｓｃＦｖでよいが、一般的にはＦａｂ断片でも、さらには単一ドメイン抗体断片でもよい。抗体断片の単離には、ナイーブ抗体断片ライブラリーを利用できる。後に治療で利用するための潜在的に低い抗原性結合体の選択には、ヒト抗体断片ライブラリーが、ヒト抗体断片の直接選択に有利であることがある。場合によっては、それらは合成抗体ライブラリーの基礎を形成することがある（Ｋｎａｐｐｉｋｅｔ ａｌ． Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０００， ２９６：５７ ｆｆ）。対応するフォーマットは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ（以下に記載されるとおり）又はドメイン抗体（ｄＡｂｓ、Ｈｏｌｔｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００３， ２１ ：４８４ ｆｆに総評されるとおり）でもよい。
多くの場合において、標的抗原に対し利用可能な免疫ヒト抗体源がないことも当分野で公知である。したがって、動物を標的抗原により免疫し、それぞれの抗体ライブラリーが動物組織、例えば脾臓又はＰＢＭＣから単離される。Ｎ末端断片をビオチン化し、或いはＫＬＨ又はウシ血清アルブミン（ＳＢＡ）などのタンパク質に共有結合することができる。通常の手法によると、齧歯動物が免疫に使用される。非ヒト起源の免疫抗体レパートリーが、他の理由で、例えばラクダ種から誘導された単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）の存在により（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：２７７； Ｄｅ Ｇｅｎｓｔ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖ Ｃｏｍｏ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００６， ３０：１８７ ｆｆに記載のとおり）特に有利である。したがって、抗体ライブラリーの対応するフォーマットは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ（以下に記載の通り）又は単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）でよい。
可能性のある一手法において、ｂａｌｂ／ｃ ｘ Ｃ５７黒交配の１０週齢のＦ１マウスを、成熟ＣＤ３ε鎖のＮ末端アミノ酸１から２７を翻訳融合としてＮ末端で示す膜貫通型ＥｐＣＡＭを発現する全細胞で免疫することができる。別法としては、マウスを、１−２７ＣＤ３イプシロンＦｃ融合タンパク質で免疫することもできる（対応する手法は添付する実施例２に記載される）。追加免疫（複数可）の後、血液サンプルをとり、ＣＤ３陽性Ｔ細胞に対する抗体血清力価を、例えばＦＡＣＳ分析で試験できる。通常、血清力価は、非免疫動物より免疫動物でははるかに高い。
免疫動物は、免疫抗体ライブラリーの構築の基礎を形成できる。そのようなライブラリーの例は、ファージディスプレイライブラリーがある。そのようなライブラリーは、一般的に、例えば"Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"；Ｅｄ． Ｂａｒｂａｓ， Ｂｕｒｔｏｎ， Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００１に開示されている標準的な手順に基づき構築することができる。
非ヒト抗体は、より可変的な抗体ライブラリーの生成のためファージディスプレイによりヒト化でき、次いで選択の間バインダーのために高めることができる。
ファージディスプレイ手法では、抗体ライブラリーをディスプレイするファージのプールのいずれも、標的分子としてそれぞれの抗原を使用して結合体を選択する基礎を形成する。抗原特異的な抗原に結合したファージが単離される中心工程はパニングと称される。ファージの表面の抗体断片のディスプレイのため、この一般的な方法はファージディスプレイと称される。選択の好ましい一方法は、ファージによりディスプレイされたｓｃＦｖのＮ末端に翻訳融合した繊維状ファージＮ２ドメインなどの小さいタンパク質の使用である。結合体を単離するのに使用できる、当分野に公知の他のディスプレイ法は、リボソームディスプレイ法である（Ｇｒｏｖｅｓ＆ Ｏｓｂｏｕｒｎ， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００５， ５：１２５ ｆｆ； Ｌｉｐｏｖｓｅｋ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｊ ＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ ２００４， ２９０：５２ ｆｆに総評されている）。
１−２７ＣＤ３ε−ＦＣ融合タンパク質へのｓｃＦｖファージ粒子の結合を示すために、クローニングされたｓｃＦｖレパートリーを持つファージライブラリーを、それぞれの培養上清からＰＥＧ（ポリエチレングリコール）により採取することができる。ｓｃＦｖファージ粒子は、固定化されたＣＤ３ε融合タンパク質とともにインキュベートすることができる。固定化されたＣＤ３εＦｃ融合タンパク質は固体相に被覆することができる。結合体は溶離することができ、溶離液を、新鮮な未感染細菌ホストの感染のために使用できる。ヒトｓｃＦｖ断片をコードする、ファージミドコピーにうまく形質導入された細菌ホストは、再びカルベニシリン耐性に関して選択され、次いで、例えばＶＣＭＳ１３ヘルパーファージに感染させられ、第２ラウンドの抗体ディスプレイ及びインビトロ選択を開始する。通常、合計で４から５ラウンドの選択が実施される。
単離された結合体の結合は、フローサイトメトリーアッセイを利用して、ＣＤ３イプシロン陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨＰＢａｌｌ細胞、ＰＢＭＣ又は表面提示されたＥｐＣＡＭに融合したＮ末端ＣＤ３ε配列を有するトランスフェクトされた真核細胞で試験することができる（添付した実施例４参照）。
アイテム２
ポリペプチド（複数可）が、第１結合ドメインとして同定された結合ドメイン及び細胞表面抗原に結合可能な第２結合ドメインを含む、アイテム１の方法。
本発明の方法により同定されるポリペプチドの第２結合ドメインの生成のため、例えば、本願に定義される二重特異性単鎖抗体、それぞれのヒト及び非チンパンジー霊長類細胞表面抗原の両方に結合するモノクローナル抗体を使用できる。本願に記載される二重特異性ポリペプチドのための適当な結合ドメインを、当分野に記載の組換え法により異種間特異性モノクローナル抗体から誘導できる。ヒト細胞表面抗原及び非チンパンジー霊長類での前記細胞表面抗原のホモログに結合するモノクローナル抗体は、上述のとおりＦＡＣＳアッセイにより試験できる。文献に記載されるハイブリドーマ技術（Ｍｉｌｓｔｅｉｎａｎｄ Ｋoｈｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６ （１９７５）， ４９５−７）も異種間特異性抗体の生成に利用できる。例えば、マウスを、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３３３で交互に免疫できる。これらのマウスから、異種間特異性抗体産生ハイブリドーマ細胞をハイブリドーマ技術により単離し、上述のＦＡＣＳにより分析できる。本願に記載される異種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体などの二重特異性ポリペプチドの生成及び分析は以下の実施例に示される。異種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体の利点には以下に列記される点がある。
アイテム３
第２結合ドメインがヒト及び非チンパンジー霊長類の細胞表面抗原と結合する、アイテム２の方法。
アイテム４
第１結合ドメインが抗体である、アイテム１から３のいずれかの方法。
アイテム５
抗体が単鎖抗体である、アイテム４の方法。
アイテム６第２結合ドメインが抗体である、アイテム２から５のいずれかの方法。
アイテム７
ＣＤ３εの細胞外ドメインの断片が、配列番号２、４、６又は８に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドの１つ以上の断片からなる、アイテム１から６のいずれかの方法。
アイテム８
前記断片の長さが、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７アミノ酸残基である、アイテム７の方法。
アイテム９
同定の方法が、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３εとのエピトープに結合する異種間特異性結合ドメインを含む複数のポリペプチドをスクリーニングする方法である、アイテム１から８のいずれかの方法。
アイテム１０
同定の方法が、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３εのエピトープに結合する異種間特異性結合ドメインを含むポリペプチドを精製／単離する方法である、アイテム１から８のいずれかの方法。
アイテム１１
異種間特異性結合ドメインの生成のための、アミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ（配列番号３８１）又はＧｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号３８２）を含む最大２７アミノ酸のＣＤ３εの細胞外ドメインのＮ末端断片の使用。本発明の前記使用と調和して、生成した異種間特異性結合ドメインがヒト起源であることが好ましい。
アイテム１２
異種間特異性結合ドメインが抗体である、アイテム１１による使用。
アイテム１３
抗体が単鎖抗体である、アイテム１２による使用。
アイテム１４
抗体が二重特異性抗体である、アイテム１２から１３による使用。
これらの実施形態及び他の実施形態は、本発明の説明及び実施例により開示されており、それらに包含される。免疫学における組換え技術及び方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ２００１ ； Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ； Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ； Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ； Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９７； Ｇｏｌｅｍｉｓ； Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ： Ａ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００２に記載されている。本発明により利用されるべき抗体、方法、使用及び化合物のいずれかに関するさらなる文献は、例えば電子デバイスを利用して公共の図書館及びデータベースから検索できる。例えば、インターネットで利用可能な公共データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌで利用できる。さらなるデータベース及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／などのアドレス又はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｄｅ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌでＥＭＢＬサービスホームページに列挙されたアドレスは当業者に公知であり、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍを利用しても得られる。
［図１］異種可溶性タンパク質への霊長類ＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１−２７の融合。
［図２］一過性導入された２９３細胞の上清中で、ヒトＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃガンマ領域並びにＣ末端６ヒスチジンタグに融合した成熟ヒトＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１−２７を含むコンストラクトの存在を検出するＥＬＩＳＡアッセイで測定された４連のサンプルの平均吸収値である。「２７アミノ酸ヒトＣＤ３Ｅ」と名称を付けられた第１カラムは、コンストラクトの平均吸収値を示し、「無関係な上清」と名称を付けられた第２のカラムは、ネガティブコントロールとして無関係なコンストラクトによりトランスフェクトされた２９３細胞の上清の平均値である。コンストラクトで得られた値をネガティブコントロールで得られた値と比較すると、組換えコンストラクトの存在を明らかに示している。
［図３］ヒトＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃガンマ領域並びにＣ末端Ｈｉｓ６タグに融合した成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７を含むコンストラクトへの、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗ＣＤ３結合分子の結合を検出するＥＬＩＳＡアッセイで測定された４連のサンプルの平均吸収値を示す。カラムは、左から右へ、Ａ２ＪＨＬＰ、Ｉ２Ｃ ＨＬＰ、Ｅ２Ｍ ＨＬＰ、Ｆ７Ｏ ＨＬＰ、Ｇ４Ｈ ＨＬＰ、Ｈ２Ｃ ＨＬＰ、Ｅ１Ｌ ＨＬＰ、Ｆ１２Ｑ ＨＬＰ、Ｆ６Ａ ＨＬＰ及びＨ１Ｅ ＨＬＰと称される特異性の平均吸収値を示す。「ネガティブコントロール」と称される一番右のカラムは、ネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトＣＤ３抗体の単鎖調製物の平均吸収値を示す。抗ＣＤ３特異性で得られた値とネガティブコントロールで得られた値を比べると、成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端１−２７アミノ酸への抗ＣＤ３特異性の強い結合を明らかに示している。
［図４］異種膜結合タンパク質への霊長類ＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１−２７の融合。
［図５］カニクイザルＥｐＣＡＭ並びにそれぞれ、ヒト、マーモセット、タマリン、リスザル及び家畜ブタのＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端１−２７アミノ酸からなる組換え膜貫通型融合タンパク質の存在を検出するＦＡＣＳアッセイで試験された異なるトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、それぞれヒト２７量体、マーモセット２７量体、タマリン２７量体、リスザル２７量体及びブタ２７量体を含むコンストラクトを発現するトランスフェクタントの結果を示す。個別のオーバーレイで、細線はネガティブコントロールとして抗ＦｌａｇＭ２の代わりに２％ＦＣＳを含むＰＢＳでインキュベートされたサンプルを表し、太線は抗ＦｌａｇＭ２抗体とともにインキュベートされたサンプルを表す。各コンストラクトで、ヒストグラムのオーバーレイは、トランスフェクタントへの抗ＦｌａｇＭ２抗体の結合を示し、トランスフェクタントでの組換えコンストラクトの発現を明らかに示している。
［図６Ａ］カニクイザルＥｐＣＡＭにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗ＣＤ３結合分子の結合を検出するＦＡＣＳアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、Ｈ２Ｃ ＨＬＰ、Ｆ１２Ｑ ＨＬＰ、Ｅ２Ｍ ＨＬＰ及びＧ４Ｈ ＨＬＰとそれぞれ称されるＣＤ３特異的結合分子とともに
試験されたヒト２７量体を含む１−２７ＣＤ３−ＥｐＣＡＭを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトＣＤ３抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗ＣＤ３結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ２７量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図５に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗ＣＤ３特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗ＣＤ３結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
［図６Ｂ］カニクイザルＥｐＣＡＭにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗ＣＤ３結合分子の結合を検出するＦＡＣＳアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、Ｈ２Ｃ ＨＬＰ、Ｆ１２Ｑ ＨＬＰ、Ｅ２Ｍ ＨＬＰ及びＧ４Ｈ ＨＬＰとそれぞれ称されるＣＤ３特異的結合分子とともに試験されたマーモセット２７量体を含む１−２７ＣＤ３−ＥｐＣＡＭを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトＣＤ３抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗ＣＤ３結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ２７量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図５に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗ＣＤ３特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗ＣＤ３結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
［図６Ｃ］カニクイザルＥｐＣＡＭにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗ＣＤ３結合分子の結合を検出するＦＡＣＳアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、Ｈ２Ｃ ＨＬＰ、Ｆ１２Ｑ ＨＬＰ、Ｅ２Ｍ ＨＬＰ及びＧ４Ｈ ＨＬＰとそれぞれ称されるＣＤ３特異的結合分子とともに試験されたタマリン２７量体を含む１−２７ＣＤ３−ＥｐＣＡＭを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトＣＤ３抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗ＣＤ３結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ２７量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図５に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗ＣＤ３特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗ＣＤ３結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
［図６Ｄ］カニクイザルＥｐＣＡＭにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗ＣＤ３結合分子の結合を検出するＦＡＣ
Ｓアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、Ｈ２Ｃ ＨＬＰ、Ｆ１２Ｑ ＨＬＰ、Ｅ２Ｍ ＨＬＰ及びＧ４Ｈ ＨＬＰとそれぞれ称されるＣＤ３特異的結合分子とともに試験されたリスザル２７量体を含む１−２７ＣＤ３−ＥｐＣＡＭを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトＣＤ３抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗ＣＤ３結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ２７量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図５に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗ＣＤ３特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗ＣＤ３結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
［図６Ｅ］カニクイザルＥｐＣＡＭにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗ＣＤ３結合分子の結合を検出するＦＡＣＳアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、Ｈ２Ｃ ＨＬＰ、Ｆ１２Ｑ ＨＬＰ、Ｅ２Ｍ ＨＬＰ及びＧ４Ｈ ＨＬＰとそれぞれ称されるＣＤ３特異的結合分子とともに試験されたブタ２７量体を含む１−２７ＣＤ３−ＥｐＣＡＭを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトＣＤ３抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗ＣＤ３結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ２７量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図５に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗ＣＤ３特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗ＣＤ３結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
［図７］トランスフェクトされたネズミＥＬ４ Ｔ細胞上でのヒトＣＤ３イプシロンの検出のためのＦＡＣＳアッセイ。グラフ解析は、ヒストグラムのオーバーレイを示す。太線は、抗ヒトＣＤ３抗体ＵＣＨＴ−１とともにインキュベートされたトランスフェクトされた細胞を示す。細線は、マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールとともにインキュベートされた細胞を表す。抗ＣＤ３抗体ＵＣＨＴ−１の結合は、トランスフェクトされたネズミＥＬ４Ｔ細胞の細胞表面でのヒトＣＤ３イプシロン鎖の発現を明らかに示す。
［図８Ａ］アラニンスキャニング実験でのアラニン変異体への異種間特異性抗ＣＤ３抗体の結合。個別の図で、カラムは、左から右へ、野生型トランスフェクタント（ＷＴ）及び位置１から２７からの全てのアラニン変異体の対数スケールでの任意単位の計算結合値を示す。結合値は以下の式を利用して計算される：
（式）
この式において、「サンプル値」は、図に示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗ＣＤ３抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定の
アラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、ＵＣＨＴ−１は、特定のアラニン変異体にアッセイされたＵＣＨＴ−１抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、ｘはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、ｙはそれぞれの抗ＣＤ３抗体を明示し、ｗｔはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。個々のアラニン変異体の位置は、野生型アミノ酸の１文字のコード及び位置の数により標識づけられている。
キメラＩｇＧ分子として発現した異種間特異性抗ＣＤ３抗体Ａ２Ｊ ＨＬＰの結果を示す。位置４（アスパラギン）、位置２３（スレオニン）及び位置２５（イソロイシン）でのアラニンへの変異体では結合活性の低下が見られる。位置１（グルタミン）、位置２（アスパラギン酸）及び位置３（グリシン）及び位置５（グルタミン酸）でのアラニンへの変異体では結合が完全に失われている。
［図８Ｂ］アラニンスキャニング実験でのアラニン変異体への異種間特異性抗ＣＤ３抗体の結合。個別の図で、カラムは、左から右へ、野生型トランスフェクタント（ＷＴ）及び位置１から２７からの全てのアラニン変異体の対数スケールでの任意単位の計算結合値を示す。結合値は以下の式を利用して計算される：
（式）
この式において、「サンプル値」は、図に示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗ＣＤ３抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、ＵＣＨＴ−１は、特定のアラニン変異体にアッセイされたＵＣＨＴ−１抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、ｘはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、ｙはそれぞれの抗ＣＤ３抗体を明示し、ｗｔはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。個々のアラニン変異体の位置は、野生型アミノ酸の１文字のコード及び位置の数により標識づけられている。
キメラＩｇＧ分子として発現した異種間特異性抗ＣＤ３抗体Ｅ２Ｍ ＨＬＰの結果を示す。位置４（アスパラギン）、位置２３（スレオニン）及び位置２５（イソロイシン）でのアラニンへの変異体では結合活性の低下が見られる。位置１（グルタミン）、位置２（アスパラギン酸）及び位置３（グリシン）及び位置５（グルタミン酸）でのアラニンへの変異体では結合が完全に失われている。
［図８Ｃ］アラニンスキャニング実験でのアラニン変異体への異種間特異性抗ＣＤ３抗体の結合。個別の図で、カラムは、左から右へ、野生型トランスフェクタント（ＷＴ）及び位置１から２７からの全てのアラニン変異体の対数スケールでの任意単位の計算結合値を示す。結合値は以下の式を利用して計算される：
（式）
この式において、「サンプル値」は、図に示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗ＣＤ３抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、ＵＣＨＴ−１は、特定のアラニン変異体にアッセイされたＵＣＨＴ−１抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、ｘはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、ｙはそれぞれの抗ＣＤ３抗体を明示し、ｗｔはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。個々のアラニン変異体の位置は、野生型アミノ酸の１文字のコード及び位置の数により標識づけられている。
キメラＩｇＧ分子として発現した異種間特異性抗ＣＤ３抗体Ｈ２Ｃ ＨＬＰの結果を示す。位置４（アスパラギン）でのアラニンへの変異体では結合活性の低下が見られる。位置１（グルタミン）、位置２（アスパラギン酸）及び位置３（グリシン）及び位置５（グルタミン酸）でのアラニングルタミンへの変異体では結合が完全に失われている。
［図８Ｄ］アラニンスキャニング実験でのアラニン変異体への異種間特異性抗ＣＤ３抗体の結合。個別の図で、カラムは、左から右へ、野生型トランスフェクタント（ＷＴ）及び位置１から２７からの全てのアラニン変異体の対数スケールでの任意単位の計算結合値を示す。結合値は以下の式を利用して計算される：
（式）
この式において、「サンプル値」は、図に示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗ＣＤ３抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、ＵＣＨＴ−１は、特定のアラニン変異体にアッセイされたＵＣＨＴ−１抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、ｘはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、ｙはそれぞれの抗ＣＤ３抗体を明示し、ｗｔはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。個々のアラニン変異体の位置は、野生型アミノ酸の１文字のコード及び位置の数により標識づけられている。
ペリプラズム発現した単鎖抗体として試験される、異種間特異性抗ＣＤ３抗体Ｆ１２Ｑ ＨＬＰの結果を示す。位置１（グルタミン）、位置２（アスパラギン酸）及び位置３（グリシン）及び位置５（グルタミン酸）でのアラニンへの変異体では結合が完全に失われている。
［図９］Ｎ末端Ｈｉｓ６タグがある場合と無い場合のヒトＣＤ３への、異種間特異性抗ＣＤ３結合分子Ｈ２Ｃ ＨＬＰの結合を検出するＦＡＣＳアッセイ。
ヒストグラムオーバーレイは、異種間特異性結合分子Ｈ２Ｃ ＨＬＰの結合を検出するＦＡＣＳアッセイで試験された、野生型ヒトＣＤ３イプシロン鎖（左のヒストグラム）又はＮ末端Ｈｉｓ６タグがあるヒトＣＤ３イプシロン鎖（右のヒストグラム）によりトランスフェクトされたＥＬ４細胞株で実施される。サンプルは、ネガティブコントロールとして適当なアイソタイプコントロールと（細線）、ポジティブコントロールとして抗ヒトＣＤ３抗体ＵＣＨＴ−１と（点線）及びキメラＩｇＧ分子の形態の異種間特異性抗ＣＤ３抗体Ｈ２ＣＨＬＰと（太線）ともにインキュベートされる。
ヒストグラムオーバーレイは、組換え構築体の両方の発現を示すアイソタイプコントロー
ルに比べ、両トランスフェクタントへのＵＣＨＴ−１抗体の同等な結合を示す。ヒストグラムオーバーレイは、Ｈｉｓ６ヒトＣＤ３イプシロン鎖でなく、野生型ヒトＣＤ３イプシロン鎖のみへの抗ＣＤ３結合分子Ｈ２ＣＨＬＰの結合も示す。これらの結果は、異種間特異性抗ＣＤ３結合分子Ｈ２Ｃ ＨＬＰの結合にはフリーのＮ末端が必須であることを表す。
［図１０］ＦＡＣＳ分析による、細胞上でのＣＤ３結合のＫＤ値を測定する、ヒトＣＤ３陽性ＰＢＭＣへのＥＧＦＲ−２１−６３ ＬＨ ｘＨ２Ｃの飽和結合。このアッセイは、実施例７に記載されるとおり実施される。
［図１１ａ］ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は実施例１２に記載のとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す：細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１１ｂ］ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は実施例１２に記載のとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す：細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１１ｃ］ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は実施例１２に記載のとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す：細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１１ｄ］ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は実施例１２に記載のとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す：細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１１ｅ］ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は実施例１２に記載のとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す：細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１１ｆ］ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及
びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は実施例１２に記載のとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す：細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１１ｇ］ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は実施例１２に記載のとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す：細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１１ｈ］ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は実施例１２に記載のとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す：細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１１ｉ］ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は実施例１２に記載のとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す：細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１２］示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として、ヒトＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘがエフェクター細胞として、カニクイザルＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例１３で述べるようにして実施される。
［図１３ａ］示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として、ヒトＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘがエフェクター細胞として、カニクイザルＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例１３で述べるようにして実施される。
［図１３ｂ］示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として、ヒトＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘがエフェクター細胞として、カニクイザルＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例１３で述べるようにして実施される。
［図１３ｃ］示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒト
ＰＢＭＣがエフェクター細胞として、ヒトＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘがエフェクター細胞として、カニクイザルＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例１３で述べるようにして実施される。
［図１３ｄ］示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として、ヒトＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘがエフェクター細胞として、カニクイザルＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例１３で述べるようにして実施される。
［図１３ｅ］示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として、ヒトＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘがエフェクター細胞として、カニクイザルＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例１３で述べるようにして実施される。
［図１３ｆ］示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として、ヒトＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘがエフェクター細胞として、カニクイザルＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例１３で述べるようにして実施される。
［図１３ｇ］示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として、ヒトＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘがエフェクター細胞として、カニクイザルＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例１３で述べるようにして実施される。
［図１３ｈ］示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として、ヒトＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘがエフェクター細胞として、カニクイザルＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例１３で述べるようにして実施される。
［図１３ｉ］示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として、ヒトＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘがエフェクター細胞として、カニクイザルＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例１３で述べるようにして実施される。
［図１３ｊ］示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として、ヒトＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘがエフェクター細胞として、カニクイザルＥＧＦＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例１３で述べるようにして実施される。
［図１４］ヒトＭＣＳＰ Ｄ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＭＣＳＰＤ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ ＬｎＰｘへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は、実施例１７に記載された
とおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す：細いヒストグラム線はネガティブコントロールを表す。細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１５］ヒトＭＣＳＰ Ｄ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＭＣＳＰＤ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ ＬｎＰＸへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は、実施例１７に記載されたとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラム線はネガティブコントロールを表す。細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１６］ヒトＭＣＳＰ Ｄ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＭＣＳＰＤ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ ＬｎＰＸへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は、実施例１７に記載されたとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌのモノマータンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラム線はネガティブコントロールを表す。細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１７］示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性ＭＣＳＰ特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用され、ヒトＭＣＳＰＤ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。Ｂ）マカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘがエフェクター細胞として使用され、カニクイザルＭＣＳＰＤ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例１８に記載のとおり実施される。
［図１８］示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性ＭＣＳＰ特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。Ａ）及びＢ）マカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘがエフェクター細胞として使用され、カニクイザルＭＣＳＰ Ｄ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例１８に記載のとおり実施される。
［図１９］示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性ＭＣＳＰ特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。Ａ）及びＢ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用され、ヒトＭＣＳＰＤ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例１８に記載のとおり実施される。
［図２０］示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性ＭＣＳＰ特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用され、ヒトＭＣＳＰＤ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。Ｂ）マカクザルＴ細胞株４１１９ ＬｎＰｘがエフェクター細胞として使用され、カニクイザルＭＣＳＰＤ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例１８に記載のとおり実施される。
［図２１］示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性ＭＣＳＰ特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用され、ヒトＭＣＳＰＤ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。Ｂ）マカクザルＴ細胞株４１１９ ＬｎＰｘがエフェクター細胞として使用され、カニクイザルＭＣＳＰＤ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例１８に記
載のとおり実施される。
［図２２−１］５０％ヒト血漿とともにそれぞれ３７℃及び４℃で２４時間インキュベートされた、或いは細胞障害性試験の直前に５０％ヒト血漿が添加された、又は血漿が添加されない、明示された単鎖コンストラクトのサンプルにより誘起された、細胞障害活性の測定により試験されるＭＣＳＰ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の血漿安定性。ヒトＭＣＳＰによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞株として使用され、刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用される。アッセイは実施例１９に記載されるとおり実施される。
［図２２−２］５０％ヒト血漿とともにそれぞれ３７℃及び４℃で２４時間インキュベートされた、或いは細胞障害性試験の直前に５０％ヒト血漿が添加された、又は血漿が添加されない、明示された単鎖コンストラクトのサンプルにより誘起された、細胞障害活性の測定により試験されるＭＣＳＰ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の血漿安定性。ヒトＭＣＳＰによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞株として使用され、刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用される。アッセイは実施例１９に記載されるとおり実施される。
［図２２−３］５０％ヒト血漿とともにそれぞれ３７℃及び４℃で２４時間インキュベートされた、或いは細胞障害性試験の直前に５０％ヒト血漿が添加された、又は血漿が添加されない、明示された単鎖コンストラクトのサンプルにより誘起された、細胞障害活性の測定により試験されるＭＣＳＰ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の血漿安定性。ヒトＭＣＳＰによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞株として使用され、刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用される。アッセイは実施例１９に記載されるとおり実施される。
［図２３ａ］従来のコンテクスト依存性ＣＤ３エピトープを認識するＣＤ３結合分子ＣＤ１９×ＣＤ３の静脈内注入の開始フェーズの間における、循環するＣＤ１９‐陽性標的Ｂ細胞（黒三角）を実質的に持たないＢ‐ＮＨＬ患者（表４の特許番号１、７、２３、３０、３１、及び３３）の末梢血液中の絶対Ｔ細胞数（白四角）の最初の低下及び回復（すなわち、再分布）を示す図である。絶対細胞数は、血液１マイクロリットル中１０００個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。ＣＤ１９×ＣＤ３の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
［図２３ｂ］従来のコンテクスト依存性ＣＤ３エピトープを認識するＣＤ３結合分子ＣＤ１９×ＣＤ３の静脈内注入の開始フェーズの間における、循環するＣＤ１９‐陽性標的Ｂ細胞（黒三角）を実質的に持たないＢ‐ＮＨＬ患者（表４の特許番号１、７、２３、３０、３１、及び３３）の末梢血液中の絶対Ｔ細胞数（白四角）の最初の低下及び回復（すなわち、再分布）を示す図である。絶対細胞数は、血液１マイクロリットル中１０００個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。ＣＤ１９×ＣＤ３の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
［図２３ｃ］従来のコンテクスト依存性ＣＤ３エピトープを認識するＣＤ３結合分子ＣＤ１９×ＣＤ３の静脈内注入の開始フェーズの間における、循環するＣＤ１９‐陽性標的Ｂ細胞（黒三角）を実質的に持たないＢ‐ＮＨＬ患者（表４の特許番号１、７、２３、３０、３１、及び３３）の末梢血液中の絶対Ｔ細胞数（白四角）の最初の低下及び回復（すなわち、再分布）を示す図である。絶対細胞数は、血液１マイクロリットル中１０００個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。ＣＤ１９×ＣＤ３の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
［図２３ｄ］従来のコンテクスト依存性ＣＤ３エピトープを認識するＣＤ３結合分子ＣＤ１９×ＣＤ３の静脈内注入の開始フェーズの間における、循環するＣＤ１９‐陽性標的Ｂ細胞（黒三角）を実質的に持たないＢ‐ＮＨＬ患者（表４の特許番号１、７、２３、３０、３１、及び３３）の末梢血液中の絶対Ｔ細胞数（白四角）の最初の低下及び回復（すなわち、再分布）を示す図である。絶対細胞数は、血液１マイクロリットル中１０００個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。ＣＤ１９×ＣＤ３の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
［図２３ｅ］従来のコンテクスト依存性ＣＤ３エピトープを認識するＣＤ３結合分子ＣＤ１９×ＣＤ３の静脈内注入の開始フェーズの間における、循環するＣＤ１９‐陽性標的Ｂ細胞（黒三角）を実質的に持たないＢ‐ＮＨＬ患者（表４の特許番号１、７、２３、３０、３１、及び３３）の末梢血液中の絶対Ｔ細胞数（白四角）の最初の低下及び回復（すなわち、再分布）を示す図である。絶対細胞数は、血液１マイクロリットル中１０００個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。ＣＤ１９×ＣＤ３の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
［図２３ｆ］従来のコンテクスト依存性ＣＤ３エピトープを認識するＣＤ３結合分子ＣＤ１９×ＣＤ３の静脈内注入の開始フェーズの間における、循環するＣＤ１９‐陽性標的Ｂ細胞（黒三角）を実質的に持たないＢ‐ＮＨＬ患者（表４の特許番号１、７、２３、３０、３１、及び３３）の末梢血液中の絶対Ｔ細胞数（白四角）の最初の低下及び回復（すなわち、再分布）を示す図である。絶対細胞数は、血液１マイクロリットル中１０００個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。ＣＤ１９×ＣＤ３の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
［図２４］（Ａ）最初の投与量として１日目は５μｇ／ｍ2／２４時間とし、すぐに投与量を１５μｇ／ｍ2／２４時間に増加して連続して行ったＣＤ１９×ＣＤ３の静脈注入の下、循環するＣＤ１９‐陽性標的Ｂ細胞（黒三角）を持たないＢ‐ＮＨＬ患者番号１９（表４）で繰り返し発生するＴ細胞再分布（白四角）、及びＣＮＳ症状の発症を示す図である。絶対細胞数は、血液１マイクロリットル中１０００個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。５μｇ／ｍ2／２４時間で開始した治療によって引き起こされた再分布の第一のエピソードからの循環するＴ細胞の回復後、５から１５μｇ／ｍ2／２４時間への段階的な投与量の増加によってＴ細胞再分布の第二のエピソードが引き起こされ、これは、主として錯乱及び見当識障害であるＣＮＳ症状の発症を伴った。
（Ｂ）ＣＤ１９×ＣＤ３を１．５μｇ／ｍ2で繰り返し静脈内ボーラス注入した場合のＢ‐ＮＨＬ患者で繰り返し発生するＴ細胞再分布を示す図であり、この患者はＣＮＳ症状を発症した。絶対細胞数は、血液１マイクロリットル中１０００個の細胞の単位として表される。各ボーラス投与の注入時間は２乃至４時間とした。垂直の矢印はボーラス注入の開始を示す。各ボーラス投与の最初のデータポイントは、ボーラス注入開始直前のＴ細胞数を示す。各ボーラス注入は、Ｔ細胞再分布のエピソードを引き起こし、続いて次のボーラス注入の前にＴ細胞数は回復した。最後に、この患者では、Ｔ細胞再分布の第三のエピソードがＣＮＳ症状の発症を伴った。
［図２５］ＣＤ１９×ＣＤ３注入のランプイニシエーション（ｒａｍｐ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）、すなわち、治療の最初の２４時間はほぼ０から１５μｇ／ｍ2／２４時間まで流量を均等に徐々に増加させるという場合における、循環するＣＤ１９‐陽性標的Ｂ細胞（黒三角）を持たないＢ‐ＮＨＬ患者番号２０（表４）の複雑なＴ細胞再分布パターン（白四角）を示す図である。絶対細胞数は、血液１マイクロリットル中１０００個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。ＣＤ１９×ＣＤ３の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。ＣＤ１９×ＣＤ３への第一の曝露によって引き起こされた最初の再分布後に循環血液中に再出現するＴ細胞の一部は、ランプフェーズの間のさらに増加を続けるＣＤ１９×ＣＤ３のレベルに誘発されて循環血液中から再消滅する。
［図２６］著しい数の循環するＣＤ１９‐陽性標的Ｂ（リンパ腫）細胞（黒三角）を持つＢ‐ＮＨＬ患者番号１３（表４）をＣＤ１９×ＣＤ３で治療した際のＴ及びＢ細胞数を示す図である。絶対細胞数は、血液１マイクロリットル中１０００個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。ＣＤ１９×ＣＤ３の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。Ｔ細胞（白四角）はＣＤ１９×ＣＤ３の注入開始と共に循環から完全に消滅し、循環するＣＤ１９‐陽性標的Ｂ（リンパ腫）細胞（黒三角）が末梢血液から除去されるまで再出現しない。
［図２７］循環するＣＤ１９‐陽性標的Ｂ細胞（黒三角）を実質的に持たず、ＣＤ１９×
ＣＤ３注入をこの薬剤の安定化に必要であるＨＳＡを追加することなく開始すると共にＣＮＳ症状を発症したＢ‐ＮＨＬ患者番号２４（表４）で繰り返し発生するＴ細胞再分布（白四角）を示す図である（上側の図）。最初の再分布からの循環するＴ細胞の第一の回復後、安定化させるＨＳＡが存在しないために不均一となった薬剤流量によってＴ細胞再分布の第二のエピソードが引き起こされ、これは、主として錯乱及び見当識障害であるＣＮＳ症状の発症を伴った。同一の患者にて、薬剤安定化のためのＨＳＡを追加して含有するＣＤ１９×ＣＤ３溶液で正しく治療を再度開始すると、Ｔ細胞再分布の繰り返しは観察されず（下側の図）、この患者はいずれのＣＮＳ症状をも再度発症することはなかった。絶対細胞数は、血液１マイクロリットル中１０００個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。ＣＤ１９×ＣＤ３の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
［図２８］コンテクスト依存性ＣＤ３エピトープへの一価の結合によって誘発される内皮細胞へのＴ細胞の接着のモデルを示す図である。従来のＣＤ３結合分子は、ＣＤ３イプシロン上のそのコンテクスト依存性エピトープに対する一価の相互作用によってＣＤ３のコンフォメーションのアロステリックな変化を、続いてＣＤ３イプシロンの細胞質ドメインへのＮｃｋ２の動員を引き起こすことができる（Ｇｉｌｅｔ ａｌ． （２００２） Ｃｅｌｌ １０９： ９０１）。Ｎｃｋ２はＰＩＮＣＨ及びＩＬＫを介してインテグリンと直接結合していることから（Ｌｅｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００６） Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７： ２０）、従来のＣＤ３結合分子（実施例２０のＣＤ１９×ＣＤ３のような）がＣＤ３イプシロン上のそのコンテクスト依存性エピトープに結合することによるＣＤ３のコンフォメーションのアロステリックな変化に続いてＮｃｋ２がＣＤ３イプシロンの細胞質ドメインへ動員されると、内側からのシグナル伝達（ｉｎｓｉｄｅ‐ｏｕｔ‐ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）を通してＴ細胞表面上のインテグリンがより接着性の高いアイソフォームへと一時的に変換され、Ｔ細胞の内皮細胞への接着性を高めることができる。
［図２９］実施例２１で述べるようにカニクイザルのインビボでの研究に使用されたＣＤ３３‐ＡＦ５ ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬ試験物質の細胞障害活性を示す図である。ＣＤ３３陽性標的細胞の特異的な溶解を、ＣＤ３３‐ＡＦ５ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの濃度を上昇させる標準的な51クロム放出アッセイによって測定した。アッセイは１８時間行った。マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞源として用いた。カニクイザルＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞とした。標的細胞に対するエフェクター細胞の比（Ｅ：Ｔ比）は１０：１とした。標的細胞溶解の最大半減（ｈａｌｆ‐ｍａｘｉｍａｌｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ）に要するＣＤ３３‐ＡＦ５ ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの濃度（ＥＣ５０）は、用量反応曲線より２．７ｎｇ／ｍｌの値であると算出された。
［図３０Ａ］実施例２１で述べるＣＤ３３‐ＡＦ５ ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの連続する静脈注入による、カニクイザル末梢血液からの投与量依存及び時間依存のＣＤ３３陽性単球の除去を示す図である。カラム上に示した処理時間後の循環するＣＤ３３陽性単球の絶対数のベースライン（すなわち１００％）に対するパーセントを、投与量レベルごと、２匹のカニクイザルの各々に対して示す。投与量レベル（すなわち、注入流量）をカラムの下に示す。３０μｇ／ｍ2／２４時間の投与量で７日間処理した動物１及び２では、循環するＣＤ３３陽性単球の除去は観察されなかった。６０μｇ／ｍ2／２４時間の投与量で７日間処理した動物３及び４では、循環するＣＤ３３陽性単球数がそれぞれベースラインの６８％及び４０％へ減少した。２４０μｇ／ｍ2／２４時間では、循環するＣＤ３３陽性単球は３日間の処理の後に末梢血液からほぼ完全に除去された（動物５及び６）。１０００μｇ／ｍ2／２４時間では、循環するＣＤ３３陽性単球は１日の処理の後にすでに末梢血液から完全に除去されていた（動物７及び８）。
［図３０Ｂ−１］１２０μｇ／ｍ2／２４時間でＣＤ３３‐ＡＦ５ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬを１４日間連続注入した場合の、２匹のカニクイザルの末梢血液中のＴ細胞数及びＣＤ３３単球数の推移を示す図である。絶対細胞数は、血液１マイクロリットル中１
０００個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。注入を開始して最初の１２時間のＣＤ３３単球の最初の動員後、その後の注入の過程において末梢血液中のＣＤ３３単球（黒三角）は、それぞれのベースライン数に対して３分の２（動物１０）及び５０％（動物９）が除去されている。循環するＴ細胞数（白四角）は、最初に限定的な低下を示し、続いて循環するＣＤ３３陽性単球標的細胞が依然として存在している間に回復している。
［図３０Ｂ−２］１２０μｇ／ｍ2／２４時間でＣＤ３３‐ＡＦ５ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬを１４日間連続注入した場合の、２匹のカニクイザルの末梢血液中のＴ細胞数及びＣＤ３３単球数の推移を示す図である。絶対細胞数は、血液１マイクロリットル中１０００個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。注入を開始して最初の１２時間のＣＤ３３単球の最初の動員後、その後の注入の過程において末梢血液中のＣＤ３３単球（黒三角）は、それぞれのベースライン数に対して３分の２（動物１０）及び５０％（動物９）が除去されている。循環するＴ細胞数（白四角）は、最初に限定的な低下を示し、続いて循環するＣＤ３３陽性単球標的細胞が依然として存在している間に回復している。
［図３１］実施例２２で述べるようにカニクイザルのインビボでの研究に使用されたＭＣＳＰ‐Ｇ４ ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬ試験物質の細胞障害活性を示す図である。ＭＣＳＰ陽性標的細胞の特異的な溶解を、ＭＣＳＰ‐Ｇ４ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの濃度を上昇させる標準的な51クロム放出アッセイによって測定した。アッセイは１８時間行った。マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞源として用いた。カニクイザルＭＣＳＰでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞とした。標的細胞に対するエフェクター細胞の比（Ｅ：Ｔ比）は１０：１とした。標的細胞溶解の最大半減に要するＭＣＳＰ‐Ｇ４ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの濃度（ＥＣ５０）は、用量反応曲線より１．９ｎｇ／ｍｌの値であると算出された。
［図３２−１］実質的にコンテクスト非依存性ＣＤ３エピトープを認識するＣＤ３結合分子ＭＣＳＰ‐Ｇ４ ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの静脈内注入の開始フェーズの間における、カニクイザル末梢血液中の絶対Ｔ細胞数の低下及びそれに続く回復（すなわち、再分布）という最初のエピソードが発生していないことを示す図である。絶対細胞数は、血液１マイクロリットル中１０００個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。ＭＣＳＰ‐Ｇ４ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの投与量は動物番号の横のカッコ内に示す。カニクイザルの循環血液中にＭＣＳＰ陽性標的細胞が存在しないことが既知である場合、標的細胞の媒介によるＣＤ３の架橋を通してのＴ細胞の再分布（すなわち、絶対Ｔ細胞数の低下及びそれに続く回復という最初のエピソード）は誘発されない。さらに、Ｔ細胞がＣＤ３結合部位との相互作用を通すことでしか受けることができないシグナルによるＴ細胞の再分布（すなわち、絶対Ｔ細胞数の低下及びそれに続く回復という最初のエピソード）の誘発は、実質的にコンテクスト非依存性ＣＤ３エピトープを認識するＭＣＳＰ‐Ｇ４ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬのようなＣＤ３結合分子を用いることで避けることができる。
［図３２−２］実質的にコンテクスト非依存性ＣＤ３エピトープを認識するＣＤ３結合分子ＭＣＳＰ‐Ｇ４ ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの静脈内注入の開始フェーズの間における、カニクイザル末梢血液中の絶対Ｔ細胞数の低下及びそれに続く回復（すなわち、再分布）という最初のエピソードが発生していないことを示す図である。絶対細胞数は、血液１マイクロリットル中１０００個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。ＭＣＳＰ‐Ｇ４ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの投与量は動物番号の横のカッコ内に示す。カニクイザルの循環血液中にＭＣＳＰ陽性標的細胞が存在しないことが既知である場合、標的細胞の媒介によるＣＤ３の架橋を通してのＴ細胞の再分布（すなわち、絶対Ｔ細胞数の低下及びそれに続く回復という最初のエピソード）は誘発されない。さらに、Ｔ細胞がＣＤ３結合部位との相互作用を通すことでしか受けることができないシグナルによるＴ細胞の再分布（すなわち、絶対Ｔ細胞数の低下及びそれに続く回復という最初のエピソード）の誘発は、実質的にコンテクスト非依存
性ＣＤ３エピトープを認識するＭＣＳＰ‐Ｇ４ ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬのようなＣＤ３結合分子を用いることで避けることができる。
［図３３−１］指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＰＢＭＣのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２３．４で述べるようにして実施する。太線は、５μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＤ３３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図３３−２］指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＰＢＭＣのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２３．４で述べるようにして実施する。太線は、５μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＤ３３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図３３−３］指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＰＢＭＣのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２３．４で述べるようにして実施する。太線は、５μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＤ３３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図３３−４］指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＰＢＭＣのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２３．４で述べるようにして実施する。太線は、５μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＤ３３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図３３−５］指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＰＢＭＣのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２３．４で述べるようにして実施する。太線
は、５μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＤ３３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図３３−６］指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＰＢＭＣのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２３．４で述べるようにして実施する。太線は、５μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＤ３３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図３３−７］指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＰＢＭＣのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２３．４で述べるようにして実施する。太線は、５μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＤ３３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図３３−８］指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＰＢＭＣのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２３．４で述べるようにして実施する。太線は、５μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＤ３３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図３３−９］指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＰＢＭＣのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２３．４で述べるようにして実施する。太線は、５μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＤ３３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結
合を示している。
［図３３−１０］指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＰＢＭＣのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２３．４で述べるようにして実施する。太線は、５μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＤ３３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図３３−１１］指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＰＢＭＣのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２３．４で述べるようにして実施する。太線は、５μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＤ３３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図３３−１２］指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＰＢＭＣのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２３．４で述べるようにして実施する。太線は、５μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＤ３３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図３４−１］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＣＤ３３特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例２３．５で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
［図３４−２］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＣＤ３３特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例２３．５で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
［図３４−３］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＣＤ３３特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例２３．５で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクＣＤ３３
でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
［図３４−４］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＣＤ３３特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例２３．５で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
［図３４−５］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＣＤ３３特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例２３．５で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
［図３４−６］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＣＤ３３特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例２３．５で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
［図３４−７］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＣＤ３３特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例２３．５で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
［図３４−８］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＣＤ３３特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例２３．５で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
［図３５ａ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２４．５で述べるようにして実施した。太線は、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＡＩＸ並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図３５ｂ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２４．５で述べるようにして実施した。太線は、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す
。Ｔ細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＡＩＸ並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図３５ｃ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２４．５で述べるようにして実施した。太線は、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＡＩＸ並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図３５ｄ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２４．５で述べるようにして実施した。太線は、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＡＩＸ並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図３５ｅ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２４．５で述べるようにして実施した。太線は、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＡＩＸ並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図３５ｆ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２４．５で述べるようにして実施した。太線は、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合に
対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＡＩＸ並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図３５ｇ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２４．５で述べるようにして実施した。太線は、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＡＩＸ並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図３６ａ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＣＡＩＸ特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例２４．６で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
［図３６ｂ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＣＡＩＸ特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例２４．６で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
［図３６ｃ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＣＡＩＸ特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例２４．６で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
［図３７］ヒトＴ細胞をエフェクター細胞として用いた、指定のＥｐＣＡＭ特異的単鎖コンストラクトによって誘発されるヒトＥｐＣＡＭでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対する細胞障害活性を示す図である。このアッセイは実施例のセクションで述べるようにして実施した。この図より、各コンストラクトによる細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
エフェクター細胞：刺激されたＣＤ４／ＣＤ５６除去ヒトＰＢＭＣ
標的細胞：ヒトＥｐＣＡＭでトランスフェクトされたＣＨＯ
［図３８ａ］指定の二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＥｐＣＡＭでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（２ａ）、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３陰性細胞株としてのトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞（２ｂ）、ヒトＰＢＭＣ（２ｃ）、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（２ｄ）のそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。細胞は、それぞれの二重特異性単鎖コンストラクトを含有する上清と共にインキュベートした。ＦＡＣＳ染色は実施例のセクションで述べるようにして実施する。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒトＥｐＣＡＭ、並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
ａ：ＣＨＯ‐ＥｐＣＡＭ（ヒト）
ｂ：ＣＨＯ（トランスフェクトされていない）
ｃ：ヒトＰＢＭＣ
ｄ：マカク４１１９ＬｎＰｘ（ＣＤ３＋）
［図３８ｂ］指定の二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＥｐＣＡＭでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（２ａ）、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３陰性細胞株としてのトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞（２ｂ）、ヒトＰＢＭＣ（２ｃ）、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（２ｄ）のそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。細胞は、それぞれの二重特異性単鎖コンストラクトを含有する上清と共にインキュベートした。ＦＡＣＳ染色は実施例のセクションで述べるようにして実施する。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒトＥｐＣＡＭ、並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
ａ：ＣＨＯ‐ＥｐＣＡＭ（ヒト）
ｂ：ＣＨＯ（トランスフェクトされていない）
ｃ：ヒトＰＢＭＣ
ｄ：マカク４１１９ＬｎＰｘ（ＣＤ３＋）
［図３８ｃ］指定の二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＥｐＣＡＭでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（２ａ）、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３陰性細胞株としてのトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞（２ｂ）、ヒトＰＢＭＣ（２ｃ）、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（２ｄ）のそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。細胞は、それぞれの二重特異性単鎖コンストラクトを含有する上清と共にインキュベートした。ＦＡＣＳ染色は実施例のセクションで述べるようにして実施する。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒトＥｐＣＡＭ、並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
ａ：ＣＨＯ‐ＥｐＣＡＭ（ヒト）
ｂ：ＣＨＯ（トランスフェクトされていない）
ｃ：ヒトＰＢＭＣ
ｄ：マカク４１１９ＬｎＰｘ（ＣＤ３＋）
［図３８ｄ］指定の二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＥｐＣＡＭでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（２ａ）、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３陰性細胞株としてのトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞（２ｂ）、ヒトＰＢＭＣ（２ｃ）、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（２ｄ）のそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。細胞は、それぞれの二重特異性単鎖コンストラクトを含有する上清と共にインキュベートした。ＦＡＣＳ染色は実施例のセクションで述べるようにして実施する。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒトＥｐＣＡＭ、並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
ａ：ＣＨＯ‐ＥｐＣＡＭ（ヒト）
ｂ：ＣＨＯ（トランスフェクトされていない）
ｃ：ヒトＰＢＭＣ
ｄ：マカク４１１９ＬｎＰｘ（ＣＤ３＋）
［図３９ａ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２６．３で述べるようにして実施する。太線は、２μｇ／ｍｌの精製した単量体タンパク質と共にインキュベートされ、続いて抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール：抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
［図３９ｂ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１
９ＬｎＰｘに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２６．３で述べるようにして実施する。太線は、２μｇ／ｍｌの精製した単量体タンパク質と共にインキュベートされ、続いて抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール：抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
［図３９ｃ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２６．３で述べるようにして実施する。太線は、２μｇ／ｍｌの精製した単量体タンパク質と共にインキュベートされ、続いて抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール：抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
［図３９ｄ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２６．３で述べるようにして実施する。太線は、２μｇ／ｍｌの精製した単量体タンパク質と共にインキュベートされ、続いて抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール：抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
［図３９ｅ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２６．３で述べるようにして実施する。太線は、２μｇ／ｍｌの精製した単量体タンパク質と共にインキュベートされ、続いて抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール：抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
［図３９ｆ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２６．３で述べるようにして実施する。太線は、２μｇ／ｍｌの精製した単量体タンパク質と共にインキュベートされ、続いて抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール：抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
［図４０ａ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として、カニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例２６．３で述べるようにして実施する。
［図４０ｂ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として、カニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例２６．３で述べるようにして実施する。
［図４０ｃ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによ
って誘発された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として、カニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例２６．３で述べるようにして実施する。
［図４０ｄ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として、カニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例２６．３で述べるようにして実施する。
［図４０ｅ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として、カニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例２６．３で述べるようにして実施する。
［図４０ｆ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として、カニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例２６．３で述べるようにして実施する。
［図４０ｇ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として、カニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例２６．３で述べるようにして実施する。
［図４１ａ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２７．２で述べるようにして実施する。太線は、指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされ、続いて抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール：抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
［図４１ｂ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２７．２で述べるようにして実施する。太線は、指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされ、続いて抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール：抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
［図４１ｃ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘに対する
ＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２７．２で述べるようにして実施する。太線は、指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされ、続いて抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール：抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
［図４２ａ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒトＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として、マカクＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例２７．２で述べるようにして実施する。
［図４２ｂ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒトＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として、マカクＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例２７．２で述べるようにして実施する。
［図４２ｃ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒトＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として、マカクＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例２７．２で述べるようにして実施する。
［図４２ｄ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒトＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として、マカクＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例２７．２で述べるようにして実施する。
［図４２ｅ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒトＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として、マカクＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例２７．２で述べるようにして実施する。
［図４２ｆ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒトＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として、マカクＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例２７．２で述べるようにして実施する。
［図４２ｇ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒトＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として、マカクＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例２７．２で述べるようにして実施する。
［図４３］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ４４でト
ランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＰＢＭＣのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２８．６で述べるようにして実施した。太線は、５μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、２％ＦＣＳを含むＰＢＳを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクＣＤ４４並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図４４］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ｖ６エクソンが欠損したヒトＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２８．６で述べるようにして実施する。ＣＤ４４の発現のコントロールとして、ｖ６エクソンが欠損したヒトＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及び完全長ヒトＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を抗ＣＤ４４抗体と共にインキュベートした。太線は、５μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は示した抗ＣＤ４４抗体（５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、２％ＦＣＳを含むＰＢＳを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ｖ６エクソンが欠損したヒトＣＤ４４へのコンストラクトの結合の欠如を示している。ｖ６エクソンが欠損したヒトＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞上にＣＤ４４が存在することは、これらの細胞及び完全長ヒトＣＤ４４でトランスフェクトされた細胞に対する抗ＣＤ４４抗体の結合が同等であることによって示された。ＦＡＣＳ結合分析により、ＣＤ４４のｖ６エクソンに対する種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの特異性が示された。
［図４５］実施例２８．１で述べるように、ヒトＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞へ再指向された指定の種間特異的ＣＤ４４特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。エフェクター細胞として、刺激されＣＤ４及びＣＤ５６が除去されたヒトＰＢＭＣを１０：１のＥ：Ｔ比で用いた。このアッセイは実施例２８．７で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒトＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対するヒトエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が示された。
［図４６−１］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＣＤ３０でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３０＋Ｂ細胞株ＭＥＣ‐１、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ３０でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＰＢＭＣのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２９．５で述べるようにして実施した。太線は、５μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、２％ＦＣＳを含むＰＢＳを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＣＤ３０並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図４６−２］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＣＤ３０でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３０＋Ｂ細胞株ＭＥＣ‐１、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ３０でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＰＢＭＣのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例２９．５で述べるようにして実施した。太線は、５μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、２％ＦＣＳを含むＰＢＳを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＣＤ３０並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図４７］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＣＤ３０特異性単鎖コンス
トラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例２９．６で述べるようにして実施した。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクＣＤ３０に対して陽性である細胞それぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
［図４８］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＨＥＲ２でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＨＥＲ２でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例３０．５で述べるようにして実施した。太線は、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。細線はネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、２％ＦＣＳを含むＰＢＳを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＨＥＲ２並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図４９］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＨＥＲ２特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例３０．６で述べるようにして実施した。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクＨＥＲ２でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞それぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
［図５０］Ｅ２９２Ｆ３ ＨＬ×Ｉ２Ｃ ＨＬと称する種間特異的二重特異性単鎖分子の精製をモニタリングするＳＤＳ ＰＡＧＥゲル及びウエスタンブロットを示す図である。図に示すように、溶離液からのサンプル、細胞培養物の上清（ＳＮ）、及びカラムのフロースルー（ＦＴ）を分析した。サイズのレファレンスとしてタンパク質マーカー（Ｍ）を適用した。ＳＤＳＰＡＧＥゲルにおける５０及び６０ｋＤａの間の分子量の強いタンパク質バンドは、実施例３１．２で述べる１段階の精製法によって非常に高い純度まで種間特異的二重特異性単鎖分子が効率的に精製されていることを示す。ヒスチジン6タグを検出するウエスタンブロットにより、溶離液中のタンパク質バンドがこの種間特異的二重特異性単鎖分子であることが確認される。さらに、この高感度な検出法においてフロースルーサンプルのシグナルが非常に弱いものであることは、この精製法によって二重特異性単鎖分子がほぼ完全に捕獲されることを示している。
［図５１］Ｖ２０７Ｃ１２ ＨＬ×Ｈ２Ｃ ＨＬと称する種間特異的二重特異性単鎖分子の精製をモニタリングするＳＤＳ ＰＡＧＥゲル及びウエスタンブロットを示す図である。図に示すように、溶離液からのサンプル、細胞培養物の上清（ＳＮ）、及びカラムのフロースルー（ＦＴ）を分析した。サイズのレファレンスとしてタンパク質マーカー（Ｍ）を適用した。ＳＤＳＰＡＧＥゲルにおける５０及び６０ｋＤａの間の分子量の強いタンパク質バンドは、実施例３１．２で述べる１段階の精製法によって非常に高い純度まで種間特異的二重特異性単鎖分子が効率的に精製されていることを示す。ヒスチジン6タグを検出するウエスタンブロットにより、溶離液中のタンパク質バンドがこの種間特異的二重特異性単鎖分子であることが確認される。さらに、この高感度な検出法においてフロースルーサンプルのシグナルが非常に弱いものであることは、この精製法によって二重特異性単鎖分子がほぼ完全に捕獲されることを示している。
［図５２］ＡＦ５ＨＬ×Ｆ１２ＱＨＬと称する種間特異的二重特異性単鎖分子の精製をモニタリングするＳＤＳ ＰＡＧＥゲル及びウエスタンブロットを示す図である。図に示すように、溶離液からのサンプル、細胞培養物の上清（ＳＮ）、及びカラムのフロースルー（ＦＴ）を分析した。サイズのレファレンスとしてタンパク質マーカー（Ｍ）を適用した。ＳＤＳＰＡＧＥゲルにおける５０及び６０ｋＤａの間の分子量の強いタンパク質バンドは、実施例３１．２で述べる１段階の精製法によって非常に高い純度まで種間特異的二重特異性単鎖分子が効率的に精製されていることを示す。ヒスチジン6タグを検出するウエスタンブロットにより、溶離液中のタンパク質バンドがこの種間特異的二重特異性単鎖分子であることが確認される。この高感度な検出法におけるフロースルーサンプル中のシグナルは、上清中の二重特異性単鎖分子の濃度が高いためにアフィニティカラムが飽和したことで説明される。
［図５３］５０％マカクザル血清中のＡＦ５ＨＬ×Ｉ２ＣＨＬの標準曲線である。上側の図は実施例３２．２で述べるアッセイに対して作成された標準曲線を示す。
下側の図は、５０％マカクザル血清中のＡＦ５ＨＬ×Ｉ２ＣＨＬの品質管理サンプルに対する結果を示す。高ＱＣ及び中ＱＣサンプルに対する回収率は９０％超であり、低ＱＣサンプルに対しては８０％超である。
従って、このアッセイにより、血清サンプル中のＡＦ５ＨＬ×Ｉ２ＣＨＬに対して１０ｎｇ／ｍｌ乃至２００ｎｇ／ｍｌの範囲（希釈前）の検出が可能である。
［図５４］５０％マカクザル血清中のＭＣＳＰ‐Ｇ４ ＨＬ×Ｉ２Ｃ ＨＬの標準曲線である。上側の図は実施例３２．２で述べるアッセイに対して作成された標準曲線を示す。
下側のグラフは、５０％マカクザル血清中のＭＣＳＰ‐Ｇ４ ＨＬ×Ｉ２Ｃ ＨＬの品質管理サンプルに対する結果を示す。高ＱＣ及び中ＱＣサンプルに対する回収率は９８％超であり、低ＱＣサンプルに対しては８５％超である。
従って、このアッセイにより、血清サンプル中のＭＣＳＰ‐Ｇ４ ＨＬ×Ｉ２Ｃ ＨＬに対して１０ｎｇ／ｍｌ乃至２００ｎｇ／ｍｌの範囲（希釈前）の検出が可能である。
［図５５］カニクイザルＥｐＣＡＭに融合した指定の種のＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１‐２７でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対する抗Ｆｌａｇ抗体のＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例３３．１で述べるようにして実施した。太線は、抗Ｆｌａｇ抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、２％ＦＣＳを含むＰＢＳを用いた。ヒストグラムより、すべてのトランスフェクタントに対して抗Ｆｌａｇ抗体の結合が強く同等であることが示され、このことは、トランスフェクトされたコンストラクトの発現が強く同等であることを示している。
［図５６］カニクイザルＥｐＣＡＭに融合した指定の種のＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１‐２７を発現するＣＨＯ細胞に対するＩ２ＣＩｇＧ１コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例３３．３で述べるようにして実施する。太線は、Ｉ２Ｃ ＩｇＧ１コンストラクトを発現する細胞の細胞培養物の上清５０μｌと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合したブタのＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１‐２７を発現する細胞を用いた。ネガティブコントロールと比較して、ヒストグラムは、ヒト、マーモセット、タマリン、及びリスザルのＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１‐２７に対してＩ２ＣＩｇＧ１コンストラクトが結合することを明らかに示している。
［図５７］実施例６．１及び５．１でそれぞれ述べるＮ末端Ｈｉｓ６タグ付き及びタグ無しのヒトＣＤ３に対する実施例３３．２で述べるＩ２ＣＩｇＧ１コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析を示す図である。太線は、図に示すように、抗ヒトＣＤ３抗体ＵＣＨＴ‐１、ペンタ‐Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）、及びＩ２Ｃ ＩｇＧ１コンストラクトを発現する細胞の細胞培養物の上清のそれぞれと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムは、ネガティブコントロールとして関連性のないマウスＩｇＧ１抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。
上段の２つのヒストグラムのオーバーレイは、アイソタイプコントロールと比較して、両方のトランスフェクタントに対するＵＣＨＴ‐１抗体の結合が同等であることを表しており、両組み換えコンストラクトの発現を示している。中段の２つのヒストグラムのオーバーレイは、ペンタｈｉｓ抗体が、Ｈｉｓ６‐ヒトＣＤ３イプシロン鎖（Ｈｉｓ６‐ＣＤ３）を発現する細胞とは結合するが、野生型ＣＤ３イプシロン鎖（ＷＴ‐ＣＤ３）を発現する細胞とは結合しないことを示す。下段のヒストグラムのオーバーレイは、Ｉ２ＣＩｇＧ１コンストラクトが、野生型ヒトＣＤ３イプシロン鎖とは結合するが、Ｈｉｓ６‐ヒトＣＤ３イプシロン鎖とは結合しないことを示す。これらの結果から、種間特異的抗ＣＤ３結合分子Ｉ２ＣのＣＤ３イプシロン鎖への結合には遊離のＮ末端が不可欠であることが示される。
［図５８ａ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＭＣＳＰ Ｄ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例１７で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＭＣＳＰＤ３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図５８ｂ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＭＣＳＰ Ｄ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例１７で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＭＣＳＰＤ３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図５８ｃ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＭＣＳＰ Ｄ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例１７で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＭＣＳＰＤ３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図５８ｄ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＭＣＳＰ Ｄ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例１７で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合について
のネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＭＣＳＰＤ３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図５８ｅ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＭＣＳＰ Ｄ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例１７で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＭＣＳＰＤ３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図５８ｆ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＭＣＳＰ Ｄ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例１７で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＭＣＳＰＤ３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図５８ｇ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＭＣＳＰ Ｄ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例１７で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＭＣＳＰＤ３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図５８ｈ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＭＣＳＰ Ｄ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例１７で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への
結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＭＣＳＰ Ｄ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＭＣＳＰＤ３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図５８ｉ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＭＣＳＰ Ｄ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例１７で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＭＣＳＰＤ３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図５８ｊ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＭＣＳＰ Ｄ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例１７で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＭＣＳＰＤ３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図５８ｋ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＭＣＳＰ Ｄ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例１７で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＭＣＳＰＤ３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図５８ｌ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＭＣＳＰ Ｄ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例１７で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、２μｇ／ｍｌの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＭＣＳＰＤ３並びにヒト及びマカクＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
［図５９ａ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＭＣＳＰ Ｄ３特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性示す図である。エフェクター細胞、及び標的に対するエフェクターの比も示したものを用いた。このアッセイは実施例１８で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトによる細胞障害活性の強力な種間特異的な増加が明らかに示される。
［図５９ｂ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＭＣＳＰ Ｄ３特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性示す図である。エフェクター細胞、及び標的に対するエフェクターの比も示したものを用いた。このアッセイは実施例１８で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトによる細胞障害活性の強力な種間特異的な増加が明らかに示される。
［図５９ｃ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＭＣＳＰ Ｄ３特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性示す図である。エフェクター細胞、及び標的に対するエフェクターの比も示したものを用いた。このアッセイは実施例１８で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトによる細胞障害活性の強力な種間特異的な増加が明らかに示される。
［図５９ｄ］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＭＣＳＰ Ｄ３特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性示す図である。エフェクター細胞、及び標的に対するエフェクターの比も示したものを用いた。このアッセイは実施例１８で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトによる細胞障害活性の強力な種間特異的な増加が明らかに示される。
［図６０ａ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＰＢＭＣのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例３６．２で述べるようにして実施した。太線は、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＣＤ３３並びにヒト及びマカクＣＤ３へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。
［図６０ｂ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＰＢＭＣのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は実施例３６．２で述べるようにして実施した。太線は、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＣＤ３３並びにヒト及びマカクＣＤ３へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。
［図６１］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＣＤ３３特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。エフェクター細胞も示したものを用いた。このアッセイは実施例３６．３で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
［図６２］ＰＢＳ／５％ ＨＳＡ、及びＰＢＳ／５％ ＨＳＡプラス単鎖ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトを、１．６、２．０、３．０、及び４．５μｇ／ｋｇの投与量で週１回の静脈内ボーラス注入を行った場合のチンパンジーのＴ細胞再分布を示す図である。各ボーラス投与の注入時間は２時間とした。垂直の矢印はボーラス注入の開始を示す。各ボーラス投与の最初のデータポイントは、ボーラス注入開始直前のＴ細胞数を示す。従来のコンテクスト依存性ＣＤ３エピトープを認識する単鎖ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの各ボーラス注入によってＴ細胞再分布のエピソードが引き起こされ、続いて次のボーラス注入の前にＴ細胞はベースライン値へ回復した。
［図６３］選択されたクローンからのＦｌａｇタグｓｃＦｖタンパク質断片を含む周辺質製剤のＣＤ３特異的ＥＬＩＳＡ分析を示す図である。可溶性ｓｃＦｖタンパク質断片の周辺質製剤を、可溶性ヒトＣＤ３イプシロン（ａａ１‐２７）‐Ｆｃ融合タンパク質でコーティングしてＰＢＳ３％ＢＳＡでさらにブロックしておいたＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。検出は、モノクローナル抗Ｆｌａｇ‐ビオチン標識抗体、続いてペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンで行った。ＥＬＩＳＡの発色はＡＢＴＳ基質溶液で行った。ＯＤ値（ｙ軸）は、ＥＬＩＳＡリーダーにより４０５ｎｍで測定した。ｘ軸にクローン名を示す。
［図６４］選択されたクローンからのＦｌａｇタグｓｃＦｖタンパク質断片を含む周辺質製剤のＣＤ３特異的ＥＬＩＳＡ分析を示す図である。図６３と同じ可溶性ｓｃＦｖタンパク質断片の周辺質製剤を、可溶性ヒトＣＤ３イプシロン（ａａ１‐２７）‐Ｆｃ融合タンパク質ではなくｈｕＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）でコーティングしてＰＢＳ中の３％ＢＳＡでブロックしておいたＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。
検出は、モノクローナル抗Ｆｌａｇ‐ビオチン標識抗体、続いてペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンで行った。ＥＬＩＳＡの発色はＡＢＴＳ基質溶液で行った。ＯＤ値（ｙ軸）は、ＥＬＩＳＡリーダーにより４０５ｎｍで測定した。ｘ軸にクローン名を示す。
［図６５ａ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＣＤ４４に対する特異性を強調するために、コントロールとしてヒトＣＤ４４ｄｅｌｖ６でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用いた。ＦＡＣＳ染色は実施例３９．３で述べるようにして実施する。太線は、二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＣＤ４４及びＣＤ４４ｄｅｌｖ６でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＣＤ４４並びにヒト及びマカクＣＤ３へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。各コンストラクトについてのヒストグラムのオーバーレイは、ヒトＣＤ４４ｄｅｌｖ６でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対して特異的に結合していないことを示している。
［図６５ｂ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＣＤ４４に対する特異性を強調するために、コントロールとしてヒトＣＤ４４ｄｅｌｖ６でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用いた。ＦＡＣＳ染色は実施例３９．３で述べるようにして実施する。太線は、二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＣＤ４４及びＣＤ４４ｄｅｌｖ６でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＣＤ４４並びにヒト及びマカクＣＤ３へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。各コンストラクトについてのヒストグラムのオーバーレイは、ヒトＣＤ４４ｄｅｌｖ６でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対して特異的に結合していないことを示している。
［図６５ｃ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＣＤ４４に対する特異性を強調するために、コントロールとしてヒトＣＤ４４ｄｅｌｖ６でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用いた。ＦＡＣＳ染色は実施例３９．３で述べるようにして実施する。太線は、二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＣＤ４４及びＣＤ４４ｄｅｌｖ６でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＣＤ４４並びにヒト及びマカクＣＤ３へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。各コンストラクトについてのヒストグラムのオーバーレイは、ヒトＣＤ４４ｄｅｌｖ６でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対して特異的に結合していないことを示している。
［図６５ｄ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＣＤ４４に対する特異性を強調するために、コントロールとしてヒトＣＤ４４ｄｅｌｖ６でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用いた。ＦＡＣＳ染色は実施例３９．３で述べるようにして実施する。太線は、二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＣＤ４４及びＣＤ４４ｄｅｌｖ６でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＣＤ４４並びにヒト及びマカクＣＤ３へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。各コンストラクトについてのヒストグラムのオーバーレイは、ヒトＣＤ４４ｄｅｌｖ６でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対して特異的に結合していないことを示している。
［図６５ｅ］指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ、マカクＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対するＦＡＣＳ結合分析を示す図である。指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＣＤ４４に対する特異性を強調するために、コントロールとしてヒトＣＤ４４ｄｅｌｖ６でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用いた。ＦＡＣＳ染色は実施例３９．３で述べるようにして実施する。太線は、二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。Ｔ細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＣＤ４４及びＣＤ４４ｄｅｌｖ６でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクＣＤ４４並びにヒト及びマカクＣＤ３へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。各コンストラクトについてのヒストグラムのオーバーレイは、ヒトＣＤ４４ｄｅｌｖ６でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対して特異的に結合していないことを示している。
［図６６］示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的ＣＤ４４特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。エフェクター細胞、及び標的に対するエフェクターの比も示したものを用いた。このアッセイは実施例３９．４で述べるようにして実施する。この図より、各々の二重特異性コンストラクトによる細胞障害活性を媒介する効力が明らかに示される。
［図６７］実施例４１で述べる指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析を示す図である。
［図６８］実施例４１で述べる指定の種間特異的結合分子によって誘発された細胞障害活性を示す図である。
本発明及びその多くの利点をさらによく理解するために、以下の限定されない例示的な実施例によって本発明をさらに説明する。
１．非ヒト霊長類の血液サンプルからのＣＤ３イプシロン配列の同定
以下の非ヒト霊長類、カリスリクス・ジャカス、サグイヌス・オイディプス及びサイミリ・シウレウスの血液サンプルを、ＣＤ３イプシロン同定に使用した。新鮮なヘパリン処理全血サンプルを、製造業者のプロトコルに従い（ＱＩＡａｍｐＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）トータル細胞ＲＮＡの単離のために調製した。抽出したｍＲＮＡは、発表されているプロトコルに従いｃＤＮＡに転写した。簡単に言うと、１０μｌの沈殿したＲＮＡを、１．２μｌの１０×ヘキサヌクレオチドミックス（Ｒｏｃｈｅ）と７０℃で１０分間インキュベートし、氷上で保存した。４μｌの５×ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩバッファ、０．２μｌの０．１Ｍジチオスレイトール、０．８μｌのｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１．２μｌのデソキシリボヌクレオシド三リン酸（２５μＭ）、０．８μｌのＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）及び１．８μｌのＤＮａｓｅ・ＲＮａｓｅフリーウォーター（Ｒｏｃｈｅ）からなる反応ミックスを加えた。反応ミックスを、室温で１０分間インキュベートし、次いで４２℃で５０分間、９０℃で５分間インキュベートした。反応を氷上で冷却してから、０．８μｌのＲＮａｓｅＨ（１Ｕ／μｌ、Ｒｏｃｈｅ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
各種からの第１鎖ｃＤＮＡに、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）及びデータベース研究で設計された以下のプライマー組み合わせを利用して、別々な３５サイクルポリメラーゼ連鎖反応を施した：フォワードプライマー５'−ＡＧＡＧＴＴＣＴＧＧＧＣＣＴＣＴＧＣ−３'（配列番号３７７）；リバースプライマー５'−ＣＧＧＡＴＧＧＧＣＴＣＡＴＡＧＴＣＴＧ−３'（配列番号３７８）。増幅された５５０ｂｐバンドをゲル精製し（ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、配列決定した（Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ、Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ／ドイツ、配列表参照）。
ＣＤ３イプシロン、カリスリクス・ジャカス
ヌクレオチド
ＣＡＧＧＡＣＧＧＴＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＡＴＡＣＴＡＣＡＣＡＧＡＡＣＣＣＡＴＡＴＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＣＣＣＴＣＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＧＣＴＣＧＴＡＡＡＴＡＧＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＧＴＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＣＴＴＴＴＣＧＧＡＡＡＴＧＧＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧＴＴＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＣＴＣＣＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＣＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＡＣＴＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴ
アミノ酸
ＱＤＧＮＥＥＭＧＤＴＴＱＮＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＴＬＴＣＰＲＹＤＧＨＥＩＫＷＬＶＮＳＱＮＫＥＧＨＥＤＨＬＬＬＥＤＦＳＥＭＥＱＳＧＹＹＡＣＬＳＫＥＴＰＡＥＥＡＳＨＹＬＹＬＫＡＲＶＣＥＮＣＶＥＶＤ
ＣＤ３イプシロン、サグイヌス・オイディプス
ヌクレオチド
ＣＡＧＧＡＣＧＧＴＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＡＴＡＣＴＡＣＡＣＡＧＡＡＣＣＣＡＴＡＴＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＣＣＣＴＣＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＧＣＴＴＧＴＡＡＡＴＡＧＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＧＴＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＴＴＴＴＣＧＧＡＡＡＴＧＧＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧＴＴＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＣＴＣＣＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＣＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＡＣＴＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴ
アミノ酸
ＱＤＧＮＥＥＭＧＤＴＴＱＮＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＴＬＴＣＰＲＹＤＧＨＥＩＫＷＬＶＮＳＱＮＫＥＧＨＥＤＨＬＬＬＥＤＦＳＥＭＥＱＳＧＹＹＡＣＬＳＫＥＴＰＡＥＥＡＳＨＹＬＹＬＫＡＲＶＣＥＮＣＶＥＶＤ
ＣＤ３イプシロン、サイミリ・シウレウス
ヌクレオチド
ＣＡＧＧＡＣＧＧＴＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＣＡＴＡＴＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＣＣＣＴＣＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＧＣＴＣＧＴＡＡＡＴＧＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＧＴＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＴＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＣＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＡＣＴＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴ
アミノ酸
ＱＤＧＮＥＥＩＧＤＴＴＱＮＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＴＬＴＣＰＲＹＤＧＱＥＩＫＷＬＶＮＤＱＮＫＥＧＨＥＤＨＬＬＬＥＤＦＳＥＭＥＱＳＧＹＹＡＣＬＳＫＥＴＰＴＥＥＡＳＨＹＬＹＬＫＡＲＶＣＥＮＣＶＥＶＤ
２．ヒト及び異なる非チンパンジー霊長類のＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１−２７に結合する異種間特異性単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）の生成
２．１ 異種可溶性タンパク質への融合による、そのナイーブＣＤ３コンテクストから 分離されるＣＤ３イプシロンのＮ末端を利用するマウスの免疫
ｂａｌｂ／ｃ ｘ ｃ５７黒交配の１０週齢のＦ１マウスを、ヒト及び／又はサイミリ・シウレウスの成熟ＣＤ３イプシロン鎖の最もＮ末端アミノ酸１−２７を持つＣＤ３イプシロンＦｃ融合タンパク質（１−２７ＣＤ３−Ｆｃ）で免疫した。このために、マウスあたり３００μｌのＰＢＳ中の４０μｇの１−２７ＣＤ３Ｆｃ融合タンパク質を、１０ｎｍｏｌのチオアート修飾ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（５'−ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｔｇｃｔ−３'）とともに腹腔内に注射した。マウスには、２１日後、４２日後、任意に６３日後に追加免疫を同様に与えた。最初の追加免疫の１０日後に、血液サンプルをとり、１−２７ＣＤ３Ｆｃ融合タンパク質に対する抗体血清力価をＥＬＩＳＡにより試験した。追加的に、ＣＤ３陽性ヒトＴ細胞株ＨＰＢａｌｌに対する力価も、標準プロトコルによりフローサイトメトリーで試験した。血清力価は、非免疫動物よりも免疫動物で著しく高かった。
２．２ 免疫マウス抗体ｓｃＦｖライブラリーの生成：コンビナトリアル抗体ライブラリー及びファージディスプレイの構築
最後の注射の３日後、マウスの脾臓細胞を、標準プロトコルによりトータルＲＮＡの調製のために摘出した。
マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）軽鎖（カッパ）可変領域（ＶＫ）及びＩｇ重鎖可変領域（ＶＨ）ＤＮＡ断片のライブラリーを、ＶＫ及びＶＨ特異的なプライマーを利用してマウス脾臓ＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲにより構築した。ｃＤＮＡは、標準プロトコルにより合成した。
増幅した重鎖Ｖ断片のための５'−Ｘｈｏｌ及び３'−ＢｓｔＥｌｌ認識部位及び増幅したＶＫ ＤＮＡ断片のための５'−Ｓａｃｌ及び３'−Ｓｐｅｌ認識部位を生じるように、プライマーを設計した。
ＶＨ ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のために、８つの異なる５'−ＶＨファミリー特異性プライマー（ＭＶＨＩ（ＧＣ）ＡＧＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＣＡ ＧＧＡ ＣＣＴ；ＭＶＨ２ ＧＡＧ ＧＴＣ ＣＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＧＡ ＣＣＴ；ＭＶＨ３ ＣＡＧＧＴＣ ＣＡＡ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＧＧ ＧＣＴ；ＭＶＨ４ ＧＡＧ ＧＴＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＧＣＡ；ＭＶＨ５ ＧＡ（ＡＧ）ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＧＡ；ＭＶＨ６ ＧＡＧ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＧＴ；ＭＶＨ７ ＧＡＡＧＴＧ ＡＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＧＧＡ；ＭＶＨ８ ＧＡＧ ＧＴＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＣＴ）をそれぞれ、１つの３'−ＶＨプライマー（３'ＭｕＶＨＢｓｔＥｌｌ ｔｇａ ｇｇａ ｇａｃ ｇｇｔｇａｃ ｃｇｔ ｇｇｔ ｃｃｃ ｔｔｇ ｇｃｃ ｃｃａ ｇ）と組み合わせた：ＶＫ鎖断片のＰＣＲ増幅のために、７つの異なる５'−ＶＫファミリー特異性プライマー（ＭＵＶＫ１ＣＣＡ ＧＴＴ ＣＣＧ ＡＧＣ ＴＣＧ ＴＴＧ ＴＧＡ ＣＴＣ ＡＧＧ ＡＡＴ ＣＴ；ＭＵＶＫ２ ＣＣＡ ＧＴＴ ＣＣＧ ＡＧＣ ＴＣＧ ＴＧＴ ＴＧＡ ＣＧＣＡＧＣ ＣＧＣ ＣＣ；ＭＵＶＫ３ ＣＣＡ ＧＴＴ ＣＣＧ ＡＧＣ ＴＣＧ ＴＧＣ ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＧＴ ＣＴＣ ＣＡ；ＭＵＶＫ４ ＣＣＡ ＧＴＴ ＣＣＧ ＡＧＣＴＣＣ ＡＧＡ ＴＧＡ ＣＣＣ ＡＧＴ ＣＴＣ ＣＡ；ＭＵＶＫ５ ＣＣＡ ＧＡＴ ＧＴＧ ＡＧＣ ＴＣＧ ＴＧＡ ＴＧＡ ＣＣＣ ＡＧＡ ＣＴＣ ＣＡ；ＭＵＶＫ６ＣＣＡ ＧＡＴ ＧＴＧ ＡＧＣ ＴＣＧ ＴＣＡ ＴＧＡ ＣＣＣ ＡＧＴ ＣＴＣ ＣＡ；ＭＵＶＫ７ ＣＣＡ ＧＴＴ ＣＣＧ ＡＧＣ ＴＣＧ ＴＧＡ ＴＧＡ ＣＡＣＡＧＴ ＣＴＣ ＣＡ）を、それぞれ、１つの３'−ＶＫプライマー（３'ＭｕＶｋＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｉＷ１ｔｇｇ ｔｇｃ ａｃｔ ａｇｔ ｃｇｔ ａｃｇ ｔｔｔ ｇａｔ ｃｔｃ ａａｇ ｃｔｔ ｇｇｔ ｃｃｃ）と組み合わせた。
以下のＰＣＲプログラムを増幅に利用した：９４℃で２０秒間変性；５２℃で５０秒間プライマーアニーリング及び７２℃で６０秒間プライマー伸長及び４０サイクル、次いで７２℃で１０分間の最終伸長。
４５０ｎｇのカッパ軽鎖断片（Ｓａｃｌ−Ｓｐｅｌ消化）を、１４００ｎｇのファージミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ（Ｓａｃｌ−Ｓｐｅｌ消化；大きい断片）とライゲーションした。次いで、得られたコンビナトリアル抗体ライブラリーを、エレクトロポレーション（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５ｕＦＤ、２００オーム、Ｂｉｏｒａｄジーンパルサー）により３００μｌのエレクトロコンピテント大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ１ Ｂｌｕｅ細胞中に形質転換し、１０7を超える独立クローンのライブラリーサイズを得た。表現型発現の１時間後、陽性形質転換体を、１００ｍｌの液体スーパーブロス（ＳＢ）培地中で一晩、ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓベクターによりコードされるカルベニシリン耐性に関して選択した。次いで、細胞を遠心分離により採取し、市販のプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を利用してプラスミド調製を実施した。
ＶＫライブラリーを含む２８００ｎｇのこのプラスミドＤＮＡ（Ｘｈｏｌ−ＢｓｔＥＩＩ消化；大きい断片）を、９００ｎｇの重鎖Ｖ断片（Ｘｈｏｌ−ＢｓｔＥＩＩ消化）にライゲーションし、エレクトロポリマーレーション（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５ｕＦＤ、２００オーム）により再びエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞の２つの３００μｌアリコート中に形質転換し、１０7を超える独立クローンの総ＶＨ−ＶＫｓｃＦｖ（単鎖可変断片）ライブラリーサイズを得た。
表現型発現及びカルベニシリンへのゆっくりとした適応の後、抗体ライブラリーを含む大腸菌細胞を、ＳＢ−カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）の選択培地に移した。次いで、抗体ライブラリーを含む大腸菌細胞を、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３の１０12粒子の感染量に感染させ、繊維状Ｍ１３ファージの産生及び分泌を得たが、ファージ粒子は、マウスｓｃＦｖ断片をコードする単鎖ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ−ＤＮＡを含み、ファージコートタンパク質ＩＩＩへの翻訳融合として対応するｓｃＦｖタンパク質を提示した。抗体ライブラリーを提示するファージのプールは、後に抗体結合体の選択に使用した。
２．３ファージディスプレイに基づくＣＤ３特異性バインダーの選択
クローニングされたｓｃＦｖレパートリーを持つファージライブラリーを、ＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈殿及び遠心分離によりそれぞれの培養上清から採取した。およそ１０11から１０12のｓｃＦｖファージ粒子を、０．４ｍｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡに再懸濁し、１０5から１０7のＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ３陽性ヒトＴ細胞株）と共に氷上で１時間ゆっくりと攪拌しながらインキュベートした。これらのＪｕｒｋａｔ細胞は、事前に、ウシ胎児血清（１０％）、グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを富化したＲＰＭＩ培地中で生育し、遠心分離により採取し、ＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ（アジ化ナトリウム含有）に再懸濁した。Ｊｕｒｋａｔ細胞に特異的に結合しないｓｃＦｖファージは、最大５回のＰＢＳ／１％ＦＣＳ（アジ化ナトリウム含有）による洗浄工程により除去した。洗浄の後、細胞をＨＣｌ−グリシンｐＨ２．２（１０分間インキュベート、その後ボルテックス処理）に再懸濁して結合体を細胞から溶出し、２ＭのＴｒｉｓ ｐＨ１２で中和の後、溶出液を、新鮮な未感染大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ培養液（ＯＤ６００＞０．５）の感染に使用した。ヒトｓｃＦｖ断片をコードする、ファージミドコピーによりうまくトランスフェクトされた大腸菌細胞を含む大腸菌培養液を、再びカルベニシリン耐性で選択し、次いでＶＣＭＳ１３ヘルパーファージに感染させて、抗体ディスプレイ及びインビトロ選択の第２ラウンドを開始した。通常、４から５ラウンドの選択を実施した。
２．４ ＣＤ３特異性バインダーのスクリーニング
４から５ラウンドのパニングに相当するプラスミドＤＮＡを、選択の後大腸菌培養液から単離した。可溶性ｓｃＦｖタンパク質の産生のため、ＶＨ−ＶＬ−ＤＮＡ断片をプラスミドから切除した（Ｘｈｏｌ−Ｓｐｅｌ）。これらの断片を、元々のｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓとは、発現コンストラクト（例えばｓｃＦｖ）がｓｃＦｖとＨｉｓ６−タグの間にＦｌａｇタグ（ＴＧＤＹＫＤＤＤＤＫ）を含む点で異なるプラスミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓ中で、同じ制限部位によりクローニングし、追加のファージタンパク質を排除した。ライゲーションの後、プラスミドＤＮＡの各プール（異なるパニングのラウンド）を、１００μｌヒートショックコンピテント大腸菌ＴＧ１又はＸＬ１−Ｂｌｕｅ中に形質転換し、カルベニシリンＬＢアガーに播種した。単一のコロニーを１００μｌのＬＢｃａｒｂ（５０ｕｇ／ｍｌ）に選び入れた。
ＶＬ及びＶＨセグメントを含むｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓにより形質転換された大腸菌は、遺伝子ＩＩＩ断片の切除及び１ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導の後、可溶性ｓｃＦｖを十分な量産生する。好適なシグナル配列により、ｓｃＦｖ鎖はペリプラズムにエクスポートされ、機能的コンフォメーションに折り畳まれる。
形質転換プレートから単一の大腸菌ＴＧ１細菌コロニーを、小スケールペリプラズム調製物のために選び取り、採取の後、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2及びカルベニシリン５０μｇ／ｍｌを補い（及びＰＢＳ（例えば１ｍｌ）に再溶解された）ＳＢ培地（例えば１０ｍｌ）中で増殖させた。−７０℃での冷凍及び３７℃での解凍の４ラウンドにより、細菌の外膜を温度ショックにより破壊し、ｓｃＦｖを含む可溶性ペリプラズムタンパク質を上清中に放出させた。無傷の細胞及び細胞片を遠心分離で除去した後、ヒト抗ヒトＣＤ３−ｓｃＦｖを含む上清を回収し、さらなる実験に使用した。
２．５ ＣＤ３特異性バインダーの同定
単離したｓｃＦｖの結合を、真核細胞上でフローサイトメトリーにより試験したが、真核細胞は、その表面で、そのＮ末端でＣＤ３イプシロンの最初の２７Ｎ末端アミノ酸を提示する異種タンパク質を発現する。
実施例４に記載されるとおり、ヒトＴ細胞レセプター複合体の成熟ＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端配列の最初のアミノ酸１−２７（アミノ酸配列：ＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴ）を、Ｎ末端が外部細胞表面に位置するように、膜貫通型タンパク質ＥｐＣＡＭのＮ末端に融合した。さらに、ＦＬＡＧエピトープを、Ｎ末端１−２７ＣＤ３イプシロン配列とＥｐＣＡＭ配列の間に挿入した。この融合産物は、ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ）及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）中に発現した。
他の霊長類種の成熟ＣＤ３イプシロンの２７の最もＮ末端アミノ酸を提示する真核細胞は、サイミリ・シウレウス（リスザル）（ＣＤ３イプシロンＮ末端アミノ酸配列：ＱＤＧＮＥＥＩＧＤＴＴＱＮＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＴＬＴ）、カリスリクス・ジャカス（ＣＤ３イプシロンＮ末端アミノ酸配列：ＱＤＧＮＥＥＭＧＤＴＴＱＮＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＴＬＴ）及びサグイヌス・オイディプス（ＣＤ３イプシロンＮ末端アミノ酸配列：ＱＤＧＮＥＥＭＧＤＴＴＱＮＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＴＬＴ）に対して同様に調製した。
フローサイトメトリーには、２．５×１０5細胞を、５０μｌの上清又は２％ＦＣＳを含む５０μｌのＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌの精製コンストラクトと共にインキュベートする。コンストラクトの結合は、２％ＦＣＳを含む５０μｌのＰＢＳ中で２μｇ／ｍｌで抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ−ＨｉｓＡｎｔｉｂｏｄｙ、ＢＳＡ不含、Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）により検出された。第２工程試薬として、２％ＦＣＳを含む５０μｌ ＰＢＳ中に１：１００で希釈されたＲ−フィコエリスリン結合アフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ−ガンマ断片特異性）（Ｄｉａｎｏｖａ、ハンブルグ、ドイツ）を使用した。サンプルを、ＦＡＣＳｓｃａｎ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルブルグ、ドイツ）で測定した。
結合は、ヒト及び異なる霊長類（サイミリ・シウレウス、カリスリクス・ジャカス、サグイヌス・オイディプス）の一次Ｔ細胞上で前記段落に記載されたとおりフローサイトメトリーにより常に確認した。
２．６ 非ヒトＣＤ３イプシロン特異性ｓｃＦｖのヒト／ヒト化等価物の生成
マウス抗ＣＤ３ｓｃＦｖのＶＨ領域を、ヒト抗体生殖細胞株アミノ酸配列に対して整列させた。非ヒトＶＨに最も近い相同性を有する、ヒト抗体生殖細胞株ＶＨ配列を選び、２つのアミノ酸配列の直接整列を実施した。ヒトＶＨフレームワーク領域とは異なる、非ヒトＶＨのフレームワーク残基が多くあった（「異なるフレームワーク位置」）。これらの残基のいくつかは、標的への抗体の結合及び活性に寄与しているかも知れない。
マウスＣＤＲを含むライブラリーを構築するために、選択されたヒトＶＨ配列とは異なる全てのフレームワーク位置で、両方の可能性（ヒト及び母系マウスアミノ酸残基）、変性したオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは、異なる部位で、７５％の確率でヒトの残基を、２５％の確率でマウスの残基を取り込む。１つのヒトＶＨでは、例えば、およそ２０ヌクレオチドの末端ストレッチに重複する、これらのオリゴヌクレオチドの６つが合成されなくてはならなかった。このために、１つおきのプライマーはアンチセンスプライマーであった。オリゴヌクレオチド内の後のクローニングに必要な制限部位を削除した。
これらのプライマーは、Ｖ配列全体に拡がるのに必要とされるプライマーの数により、６０から９０ヌクレオチドの長さを有することがある。
これらの、例えば６つのプライマーを同量（例えば、１μｌの各プライマー（プライマーストック、２０から１００μＭ）を２０μｌのＰＣＲ反応に）で混合し、ＰＣＲバッファ、ヌクレオチド及びＴａｑポリメラーゼからなるＰＣＲミックスに加えた。このミックスを９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１０分間、ＰＣＲサイクラー中でインキュベートした。その後、産物を、アガロースゲル電気泳動にかけ、２００から４００のサイズの産物を標準法によりゲルから単離した。
次いで、このＰＣＲ産物を鋳型として、Ｎ末端及びＣ末端好適クローニング制限部位を取り込むプライマーを利用して、標準ＰＣＲ反応に使用した。適当なサイズのＤＮＡ断片（ＶＨではおよそ３５０ヌクレオチド）を、標準法によりアガロースゲル電気泳動により単離した。このようにして、十分なＶＨＤＮＡ断片を増幅した。このＶＨ断片は、それぞれの異なるフレームワーク位置で、それぞれに異なる量のヒト及びマウス残基を有するＶＨ断片のプールであった（ヒト化ＶＨのプール）。同じ手順を、マウス抗ＣＤ３ｓｃＦｖのＶＬ領域にも実施した（ヒト化ＶＬのプール）。
次いで、ヒト化ＶＨのプールを、ファージディスプレイベクターｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ中でヒト化ＶＬのプールと組み合わせ、機能性ｓｃＦｖのライブラリーを形成し、繊維状ファージ上での提示の後、ここから母系非ヒト（マウス）抗ＣＤ３ｓｃＦｖに関して上述のとおり抗ＣＤ３バインダーを選択し、スクリーニングし、同定し、確認した。次いで、単一のクローンを、望ましい性質及びアミノ酸配列に関して分析した。ヒト生殖細胞株Ｖセグメントに、アミノ酸配列相同性で最も近いこれらのｓｃＦｖは好ましく、ＶＨのＣＤＲＩ及びＩＩ並びにＶＬカッパのＣＤＲＩ及びＩＩ並びにＶＬラムダのＣＤＲＩ及びＩＩの中の少なくとも１つのＣＤＲが、全てのヒト生殖細胞株Ｖセグメントの最も近いそれぞれのＣＤＲに、８０％を超えるアミノ酸配列同一性を示す物が特に好ましい。抗ＣＤ３ｓｃＦｖを、以下の実施例１０及び１６に記載されるとおり組換え二重特異性単鎖抗体に変換し、さらにキャラクタリゼーションした。
３． ＩｇＧ１のＦｃ部に融合したヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７の組換え融合タンパク質の生成（１−２７ＣＤ３−Ｆｃ）
３．１ １−２７ＣＤ−３Ｆｃのクローニング及び発現
ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃガンマ領域並びに６ヒスチジンタグに融合したヒトＣＤ３イプシロン鎖の１−２７Ｎ末端アミノ酸のコード配列は、標準プロトコルによる遺伝子合成により得た（組換え融合タンパク質のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、配列番号３５０及び３４９に記されている）。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位をまず含み、次いで１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチド、次いでフレームを合わせて成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖の細胞外部分の最初の２７アミノ酸のコード配列、次いでフレームを合わせてヒトＩｇＧ１のヒンジ領域及びＦｃガンマ部分のコード配列、次いでフレームを合わせて６ヒスチジンタグのコード配列及び終止コドンを含むように設計した（図１）。遺伝子合成断片は、融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの最初及び最後に制限部位を導入するようにも設計した。導入された制限部位、５'末端でのＥｃｏＲＩ及び３'末端でのＳａｌｌは、以下のクローニング手順で利用する。遺伝子合成断片を、標準プロトコルに従い、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌｌによりｐＥＦ−ＤＨＦＲと称されるプラスミド中にクローニングした（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｍａｃｋｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ （１９９５） ７０２１−７０２５に記載されている）。配列実証済みプラスミドを、製造業者のプロトコルに従い、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ、カールスルーエ、ドイツ）でのトランスフェクションに使用した。３日後、トランスフェクタントの細胞培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡアッセイで組換えコンストラクトの存在を試験した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃガンマ断片特異性抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．ニューマーケット、サフォーク、英国から入手）をＰＢＳ中に希釈し５μｇ／ｍｌとし、ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＮｕｎｃＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ、ヴィースバーデン、ドイツ）にウェルあたり１００μｌで、４℃で一晩コーティングした。ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、室温（ＲＴ）で６０分間ＰＢＳ中３％ＢＳＡ（ウシアルブミン、Ｖ分画、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）でブロックした。その後、ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで再び洗浄し、次いで６０分間ＲＴで細胞培養上清とともにインキュベートした。洗浄の後、ウェルを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳに１：５００で希釈したペルオキシダーゼ結合抗Ｈｉｓ６抗体（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、マンハイム、ドイツ）とともに６０分間ＲＴでインキュベートした。その後、ウェルを２００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、１００μｌのＳＩＧＭＡＦＡＳＴＯＰＤ（ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド）基質溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）を、製造業者のプロトコルに従い加えた。１００μｌの１ＭＨ2ＳＯ4を加えて反応を停止した。呈色反応を、ＰｏｗｅｒＷａｖｅＸマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ、ウィヌースキ、バーモント州、米国）で、４９０ｎｍで測定し、６２０ｎｍでのバックグラウンド吸収を差し引いた。図２に示されるとおり、ネガティブコントロールとして使用した模擬トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞の無関係な上清に比べ、コンストラクトの存在がはっきりと検出できた。
３．２ １−２７ＣＤ３−Ｆｃへの異種間特異性単鎖抗体の結合アッセイ
１−２７ＣＤ３−Ｆｃへの、ＣＤ３イプシロンに特異的なペリプラズム発現した異種間特異性単鎖抗体の粗調製物の結合を、ＥＬＩＳＡアッセイで試験した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ−ガンマ断片特異性抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．ニューマーケット、サフォーク、英国）をＰＢＳ中に希釈し５μｇ／ｍｌとし、ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＮｕｎｃＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ、ヴィースバーデン、ドイツ）にウェルあたり１００μｌで、４℃で一晩コーティングした。ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、ＲＴで６０分間ＰＢＳ中３％ＢＳＡ（ウシアルブミン、Ｖ分画、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）でブロックした。その後、ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで６０分間ＲＴで１−２７ＣＤ３−Ｆｃコンストラクトを発現する細胞の上清とともにインキュベートした。ウェルを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ペリプラズム発現した異種間特異性単鎖抗体の粗調製物とともに室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、ウェルを１％ＢＳＡを含むＰＢＳに１：１００００で希釈したペルオキシダーゼ結合抗ＦｌａｇＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）とともに６０分間ＲＴでインキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、１００μｌのＳＩＧＭＡＦＡＳＴＯＰＤ（ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド））基質溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）とともに、製造業者のプロトコルに従いインキュベートした。１００μｌの１ＭＨ2ＳＯ4を加えて呈色反応を停止し、ＰｏｗｅｒＷａｖｅＸマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ、ウィヌースキ、バーモント州、米国）で、４９０ｎｍで測定し、６２０ｎｍでのバックグラウンド吸収を差し引いた。マウス抗ＣＤ３単鎖抗体に比べ、１−２７ＣＤ３−Ｆｃコンストラクトへの、ＣＤ３イプシロンに特異的な異種間特異性ヒト単鎖抗体の強い結合を観察した（図３）。
４． カニクイザル由来のＥｐＣＡＭに融合した異なる非チンパンジー霊長類由来のＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１−２７の組換え膜貫通型融合タンパク質の生成（１−２７ＣＤ３−ＥｐＣＡＭ）
４．１ １−２７ＣＤ３−ＥｐＣＡＭのクローニング及び発現
異なる非チンパンジー霊長類（マーモセット、タマリン、リスザル）及びブタから、ＣＤ３イプシロンを単離した。Ｆｌａｇタグ付きカニクイザルＥｐＣＡＭのＮ末端に融合した、成熟ヒト、コモンマーモセット（カリスリックス・ジャカス）、ワタボウシタマリン（サグイヌス・オイディプス）、コモンリスザル（サイミリ・シウレウス）及び家畜ブタ（サス・スクローファ、ＳｕｓＳｃｒｏｆａ；ネガティブコントロールとして使用）のＣＤ３イプシロン鎖の１−２７Ｎ末端アミノ酸のコード配列を、標準プロトコルに従い、遺伝子合成により得た。組換え融合タンパク質のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、配列番号３５１から３６０に示されている。遺伝子合成断片は、第１に、標的発現ベクターにすでに存在する１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列と正しいリーディングフレームでの融合を可能にするＢｓｒＧＩ部位を含むように、次いで、フレームを合わせて成熟ＣＤ３イプシロン鎖の細胞外部分のＮ末端１−２７アミノ酸のコード配列を、次いで、フレームを合わせてＦｌａｇタグのコード配列を、次いで、フレームを合わせて、成熟カニクイザルＥｐＣＡＭ膜貫通型融合タンパク質のコード配列を含むように設計した（図４）。遺伝子合成断片を、融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの末端に制限部位を導入するように設計した。導入された制限部位、５'末端でのＢｓｒＧＩ及び３'末端でのＳａｌｌを、以下のクローニング手順に利用した。遺伝子合成断片を、ＢｓｒＧＩ及びＳａｌｌにより、標準プロトコルに従い、１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列をすでに含む、ｐＥＦ−ＤＨＦＲと称されるプラスミドの誘導体中にクローニングした（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｍａｃｋｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ （１９９５） ７０２１−７０２５に記載されている）。
配列実証済みプラスミドを使用して、製造業者のプロトコルに従い、１７５ｍｌの細胞培養フラスコ中の接着性２９３−ＨＥＫ細胞のために、ＭＡＴｒａ−Ａ試薬（ＩＢＡＧｍｂＨ、ゲッティンゲン、ドイツ）及び１２μｇのプラスミドＤＮＡを使用し、２９３−ＨＥＫ細胞を一過性導入した。細胞培養の３日後、トランスフェクタントを、標準プロトコルに従い、ＦＡＣＳアッセイにより、組換え膜貫通型タンパク質の細胞表面発現に関して試験した。その目的のため、２．５×１０5の細胞を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌで抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＣｈｅｍｉｅＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）と共にインキュベートした。結合した抗体を、Ｒ−フィコエリスリン結合アフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で１：１００のヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−ガンマ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＥｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．ニューマーケット、サフォーク、英国）により検出した。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ、ドイツ）で測定した。カニクイザルＥｐＣＡＭ及び、それぞれ、ヒト、マーモセット、タマリン、リスザル及びブタのＣＤ３イプシロン鎖の１−２７Ｎ末端アミノ酸からなるＦｌａｇタグ付き組換え膜貫通型融合タンパク質の、トランスフェクトされた細胞上での発現は、はっきりと検出可能であった（図５）。
４．２ １−２７ＣＤ３−ＥｐＣＡＭへの異種間特異性抗ＣＤ３単鎖抗体の結合
カニクイザルＥｐＣＡＭに融合した、それぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖の１−２７Ｎ末端アミノ酸への、ペリプラズム発現した異種間特異性抗ＣＤ３単鎖抗体の粗調製物の結合を、標準プロトコルに従いＦＡＣＳアッセイで試験した。その目的のため、２．５×１０5の細胞を、ペリプラズム発現した異種間特異性抗ＣＤ３単鎖抗体（上述のとおり、標準プロトコルに従い調製した）の粗調製物及びネガティブコントロールとしての単鎖マウス抗ヒトＣＤ３抗体とともにインキュベートした。二次抗体として、Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体（ＱｉａｇｅｎＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）を、２％ＦＣＳを含む５０μｌＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌで使用した。抗体の結合は、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中に１：１００で希釈されたＲ−フィコエリスリン結合アフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−ガンマ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、ニューマーケット、サフォーク、英国）により検出した。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ、ドイツ）で測定した。図６（ＡからＥ）に示されるとおり、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合した、それぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルのＣＤ３イプシロンの１−２７Ｎ末端アミノ酸からなる組換え膜貫通型タンパク質を発現するトランスフェクタントへの、単鎖抗体の結合が観察された。異種間特異性単鎖抗体の、ネガティブコントロールとして使用したカニクイザルＥｐＣＡＭに融合したブタの１−２７Ｎ末端ＣＤ３イプシロンからなる融合タンパク質への結合は全く見られなかった。抗ＣＤ３単鎖抗体の多霊長類異種間特異性が示された。抗ＦｌａｇＭ２抗体と異種間特異性単鎖抗体で得られたシグナルは同等であり、異種間特異性単鎖抗体のＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１−２７への強い結合活性を示している。
５． ヒトＣＤ３イプシロン鎖及びそのアラニン変異体でトランスフェクトされたマウス細胞のアラニンスキャニングによる異種間特異性抗ＣＤ３単鎖抗体の結合分析
５．１ ヒト野生型ＣＤ３イプシロンのクローニング及び発現
ヒトＣＤ３イプシロン鎖のコード配列は、標準プロトコルに従い遺伝子合成により得た（ヒトＣＤ３イプシロン鎖のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、配列番号３６２及び３６１に記す）。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位及びヒトＣＤ３イプシロンをコードするｃＤＮＡの最初と最後に制限部位を含むように設計した。導入された制限部位、５'末端でのＥｃｏＲＩ及び３'末端でのＳａｌｌを以下のクローニング手順で利用した。次いで、以下の標準プロトコルに従い、ｐＥＦＮＥＯと称されるプラスミド中で、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌｌにより、遺伝子合成断片をクローニングした。ｐＥＦ ＮＥＯは、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ （１９９５） ７０２１−７０２５）から、従来の分子クローニングにより、ＤＨＦＲのｃＤＮＡをネオマイシン耐性のｃＤＮＡに置換することにより誘導した。配列実証済みプラスミドを使用して、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％ＨＥＰＥＳ、１％ピルビン酸、１％非必須アミノ酸（全て、ＢｉｏｃｈｒｏｍＡＧ、ベルリン、ドイツ）を補った安定化Ｌグルタミンを含むＲＰＭＩ中で、３７℃、湿度９５％、ＣＯ2７％で培養したマウスＴ細胞株ＥＬ４（ＡＴＣＣＮｏ．ＴＩＢ−３９）にトランスフェクトした。トランスフェクションは、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）及び２μｇのプラスミドＤＮＡにより、製造業者のプロトコルに従って実施した。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、再び上述の細胞培養培地で、選択のために６００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＰＡＡＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ、パッシング、オーストリア）とともに培養した。トランスフェクションの１６から２０日後に、耐性細胞の増殖が観察された。さらに７から１４日後、標準プロトコルに従い、ヒトＣＤ３イプシロンの発現に関して、ＦＡＣＳ分析により細胞を試験した。２．５×１０5の細胞を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌで、抗ヒトＣＤ３抗体ＵＣＨＴ−１（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ、ドイツ）と共にインキュベートした。抗体の結合は、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中に１：１００で希釈されたＲ−フィコエリスリン結合アフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−ガンマ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、ニューマーケット、サフォーク、英国）により検出した。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ、ドイツ）で測定した。トランスフェクトされたＥＬ４細胞上での、ヒト野生型ＣＤ３イプシロンの発現が図７に示されている。
５．２ ＩｇＧ１抗体としての異種間特異性抗ＣＤ３単鎖抗体のクローニング及び発現
異種間特異性抗ＣＤ３単鎖抗体の結合を検出する改善された手段を提供するために、Ｈ２Ｃ ＨＬＰ、Ａ２Ｊ ＨＬＰ及びＥ２Ｍ ＨＬＰを、マウスＩｇＧ１及びヒトラムダ定常部とともにＩｇＧ１抗体中に変換した。それぞれのＩｇＧ抗体の重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、標準プロトコルに従い、遺伝子合成により得た。各特異性の遺伝子合成断片は、まず、コンストラクトの真核細胞発現を可能にするコザック部位を含むように、次いで、１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチド（配列番号３６４及び３６３）を、次いで、フレームを合わせて、それぞれの重鎖可変領域又はそれぞれの軽鎖可変領域のコード配列を、次いで、フレームを合わせて、それぞれ、マウスＩｇＧ１の重鎖定常領域のコード配列（配列番号３６６及び３６５）又はヒトラムダ軽鎖定常領域のコード配列（配列番号３６８及び３６７）を含むように設計した。制限部位は、融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの最初と最後に導入した。制限部位、５'末端でのＥｃｏＲＩ及び３'末端でのＳａｌｌを以下のクローニング手順に利用した。遺伝子合成断片は、標準プロトコルに従い、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌｌにより、重鎖コンストラクト用にｐＥＦＤＨＦＲ（Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ （１９９５） ７０２１−７０２５）と称されるプラスミド中に、軽鎖コンストラクト用にはｐＥＦＡＤＡ（ｐＥＦ ＡＤＡは、Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ５０（３）， （２００１）， １４１−１５０に記載されている）と称されるプラスミド中にクローニングした。配列実証済みプラスミドを、製造業者のプロトコルに従い、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ、カールスルーエ、ドイツ）中で、それぞれの軽鎖及び重鎖コンストラクトの同時導入に使用した。３日後、トランスフェクタントの細胞培養上清を採取し、アラニンスキャニング実験に使用した。
５．３ アラニンスキャニングのためのヒトＣＤ３イプシロンのアラニン変異体のクローニング及び発現
ヒトＣＤ３イプシロン鎖をコードする２７ｃＤＮＡ断片であって、ヒトＣＤ３イプシロンの野生型配列の１つのコドンを、成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖の細胞外領域のアミノ酸１−２７の各アミノ酸のアラニン（ＧＣＣ）をコードするコドンに置換した断片を、遺伝子合成により得た。置換したコドンの他は、ｃＤＮＡ断片は、上述のヒト野生型ＣＤ３ｃＤＮＡ断片と同一であった。各コンストラクト中で、上述のヒト野生型ＣＤ３ｃＤＮＡ断片に比べ、１つのコドンのみを置換した。制限部位、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌｌを、野生型コンストラクトに比べて同一の部位でｃＤＮＡ断片中に導入した。全てのアラニンスキャニングコンストラクトを、ｐＥＦＮＥＯ中にクローニングし、配列実証済みプラスミドを、ＥＬ４細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクション及びトランスフェクタントの選択は、上述のとおり実施した。その結果、発現したコンストラクトのパネルが得られ、ヒトＣＤ３イプシロン鎖の第１アミノ酸、位置１でのグルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）をアラニンに置換した。アラニンに置換された最後のアミノ酸は、成熟ヒト野生型ＣＤ３イプシロンの位置２７でのスレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）である。グルタミン１からスレオニン２７の間の各アミノ酸で、野生型アミノ酸をアラニンに置換した、それぞれのトランスフェクタントを生成した。
５．４ アラニンスキャニング実験
２）に記載されたキメラＩｇＧ抗体及びＣＤ３イプシロンに特異的な異種間特異性単鎖抗体を、アラニンスキャニング実験で試験した。３）に記載されたヒトＣＤ３イプシロンのアラニン変異体コンストラクトでトランスフェクトされたＥＬ４細胞株への抗体の結合は、標準プロトコルに従い、ＦＡＣＳアッセイにより試験した。２．５×１０5のそれぞれのトランスフェクタントの細胞を、キメラＩｇＧ抗体を含む細胞培養上清５０μｌ又はペリプラズム発現した単鎖抗体の粗調製物５０μｌとともにインキュベートした。ペリプラズム発現した単鎖抗体の粗調製物と共にインキュベートしたサンプルでは、抗ＦｌａｇＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）を、二次抗体として、２％ＦＣＳを含む５０μｌＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌで使用した。キメラＩｇＧ抗体と共にインキュベートしたサンプルでは、二次抗体は必要なかった。全てのサンプルで、抗体分子の結合は、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中に１：１００で希釈されたＲ−フィコエリスリン結合アフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−ガンマ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、ニューマーケット、サフォーク、英国）により検出した。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ、ドイツ）で測定した。ヒトＣＤ３イプシロンのアラニン変異体によりトランスフェクトされたＥＬ４細胞株への、キメラＩｇＧ分子又は異種間特異性単鎖抗体の異なる結合が検出された。ネガティブコントロールとして、アイソタイプコントロール又は関係ない特異性のペリプラズム発現した単鎖抗体の粗調製物をそれぞれ使用した。ＵＣＨＴ−１抗体を、ヒトＣＤ３イプシロンのアラニン変異体の発現レベルのポジティブコントロールとして使用した。成熟ＣＤ３イプシロン鎖のアミノ酸、位置１５でのチロシン、位置１７でのバリン、位置１９でのイソロイシン、位置２４でのバリン又は位置２６でのロイシンのアラニン変異体によりトランスフェクトされたＥＬ４細胞株は、非常に低い発現レベルのため（データ示さず）評価しなかった。異種間特異性単鎖抗体及びキメラＩｇＧフォーマットの単鎖抗体の、ヒトＣＤ３イプシロンのアラニン変異体によりトランスフェクトされたＥＬ４細胞株への結合を、任意単位での相対結合と、全てのそれぞれの幾何平均蛍光サンプル値からそれぞれのネガティブコントロールの幾何平均蛍光値を引いた値とともに、図８Ａ−８Ｄに示す。発現レベルの違いを補償するため、あるトランスフェクタントの全サンプル値を、それぞれのトランスフェクタントのＵＣＨＴ−１抗体の幾何平均蛍光値で割った。ある特異性の野生型サンプル値の比較のため、それぞれの特異性の全サンプル値を、野生型サンプル値で最終的に割り、野生型サンプル値を結合の任意単位１に設定した。利用した計算は、以下の式に詳細に示される。
［数１］
この式において、「サンプル値」は、図８Ａから８Ｄに示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗ＣＤ３抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、ＵＣＨＴ−１は、特定のアラニン変異体にアッセイされたＵＣＨＴ−１抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、ｘはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、ｙはそれぞれの抗ＣＤ３抗体を明示し、ｗｔはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。
図８Ａから８Ｄで分かるとおり、ＩｇＧ抗体Ａ２Ｊ ＨＬＰは、成熟ＣＤ３イプシロン鎖のアミノ酸、位置４でのアスパラギン、位置２３でのスレオニン、位置２５でのイソロイシンに対して、著しい結合の低下を示した。ＩｇＧ抗体Ａ２ＪＨＬＰの結合の完全な喪失が、成熟ＣＤ３イプシロン鎖のアミノ酸、位置１でのグルタミン、位置２でのアスパラギン酸、位置３でのグリシン及び位置５でのグルタミン酸に対して見られた。ＩｇＧ抗体Ｅ２ＭＨＬＰは、成熟ＣＤ３イプシロン鎖のアミノ酸、位置４でのアスパラギン、位置２３でのスレオニン及び位置２５でのイソロイシンに対して、著しい結合の低下を示した。ＩｇＧ抗体Ｅ２ＭＨＬＰは、成熟ＣＤ３イプシロン鎖のアミノ酸、位置１でのグルタミン、位置２でのアスパラギン酸、位置３でのグリシン及び位置５でのグルタミン酸に対して、結合の完全な喪失を示した。ＩｇＧ抗体Ｈ２ＣＨＬＰは、成熟ＣＤ３イプシロン鎖のアミノ酸、位置４でのアスパラギンに対して中程度の結合の低下を示し、成熟ＣＤ３イプシロン鎖のアミノ酸、位置１でのグルタミン、位置２でのアスパラギン酸、位置３でのグリシン及び位置５でのグルタミン酸に対して、結合の完全な喪失を示した。単鎖抗体Ｆ１２ＱＨＬＰは、成熟ＣＤ３イプシロン鎖のアミノ酸、位置１でのグルタミン、位置２でのアスパラギン酸、位置３でのグリシン及び成熟ＣＤ３イプシロン鎖の位置５でのグルタミン酸に対して、基本的に完全な結合の喪失を示した。
６．マウスＴ細胞株ＥＬ４にトランスフェクトされた、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグの付いた、又は付いていないヒトＣＤ３イプシロン鎖への、異種間特異性抗ＣＤ３結合分子Ｈ２ＣＨＬＰの結合分析
６．１ Ｎ末端６ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６タグ）の付いたヒトＣＤ３イプシロン鎖のクローニング及び発現
Ｎ末端Ｈｉｓ６タグの付いたヒトＣＤ３イプシロン鎖をコードするｃＤＮＡ断片を遺伝子合成により得た。遺伝子合成断片は、まず、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位、次いで、フレームを合わせて、１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列、次いで、フレームを合わせて、Ｈｉｓ６タグのコード配列、次いで、フレームを合わせて、成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖のコード配列を含むように設計した（コンストラクトのｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、配列番号３８０及び３７９に記す）。遺伝子合成断片は、ｃＤＮＡの最初及び最後に制限部位を含むようにも設計した。導入された制限部位、５'末端でのＥｃｏＲＩ及び３'末端でのＳａｌｌを、以下のクローニング手順で利用した。次いで、遺伝子合成断片を、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌｌにより、標準プロトコルに従い、ｐＥＦ−ＮＥＯ（上述）と称されるプラスミド内にクローニングした。配列実証済みプラスミドを使用して、ネズミＴ細胞株ＥＬ４にトランスフェクトした。トランスフェクション及びトランスフェクタントの選択は、上述のとおり実施した。細胞培養の３４日後、トランスフェクタントを、以下に記載されるアッセイに使用した。
６．２ Ｎ末端Ｈｉｓ６タグの付いた、又は付いていないヒトＣＤ３イプシロン鎖への、異種間特異性抗ＣＤ３結合分子Ｈ２Ｃ ＨＬＰの結合
ＣＤ３イプシロンに特異的な結合特異性Ｈ２Ｃ ＨＬＰを持つ、キメラＩｇＧ抗体を、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグの付いた、又は付いていないヒトＣＤ３イプシロンへの結合に関して試験した。それぞれ、Ｈｉｓ６ヒトＣＤ３イプシロン及び野生型ヒトＣＤ３イプシロンによりトランスフェクトされたＥＬ４細胞株への抗体の結合を、標準プロトコルに従いＦＡＣＳアッセイにより試験した。２．５×１０5のトランスフェクタントの細胞を、キメラＩｇＧ抗体を含む細胞培養上清５０μｌ又は２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌのそれぞれの対照抗体５０μｌとともにインキュベートした。ネガティブコントロールとして適当なアイソタイプコントロールを、又はコンストラクトの発現のポジティブコントロールとしてＣＤ３特異性抗体ＵＣＨＴ−１をそれぞれ使用した。抗体の結合は、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中に１：１００で希釈されたＲ−フィコエリスリン結合アフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−ガンマ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、ニューマーケット、サフォーク、英国）により検出した。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ、ドイツ）で測定した。野生型ヒトＣＤ３イプシロンにトランスフェクトされたＥＬ４細胞株に比べ、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグの付いたヒトＣＤ３イプシロンへの、結合特異性Ｈ２ＣＨＬＰを持つキメラＩｇＧの結合の明らかな低下が検出された。これらの結果は、ＣＤ３イプシロンのフリーのＮ末端が、ヒトＣＤ３イプシロン鎖への、異種間特異性抗ＣＤ３結合特異性Ｈ２ＣＨＬＰの結合に必須であることを示した（図９）。
７．蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）により測定するＣＤ３発現ＰＢＭＣへの結合に比較した、表面プラズモン共鳴測定による融合タンパク質１−２７ＣＤ３−Ｆｃへの、霊長類ＥＧＦＲ及び霊長類ＣＤ３に異種間特異的な二重特異性単鎖抗体（ＥＧＦＲＬＨ ｘ Ｈ２Ｃ ＨＬＰ）の結合定数ＫＤの決定
７．１ 表面プラズモン共鳴測定
ヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端のアミノ酸１−２７への、完全に異種間特異的な二重特異性単鎖抗体ＥＧＦＲ−２１−６３ ＬＨ ｘＨ２Ｃ ＨＬＰの結合親和性を測定するため、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部に融合した成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７からなる組換え融合タンパク質（１−２７ＣＤ３−Ｆｃ）で、表面プラズモン共鳴測定を実施した。このために、ＢｉａｃｏｒｅＣａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−Ｄｅｘｔｒａｎ ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）を、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００（登録商標）システム（Ｂｉａｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）に取り付けた。１フローセルを、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミド塩酸塩／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド溶液で、標準プロトコルに従い活性化した。融合タンパク質１−２７ＣＤ３−Ｆｃの溶液をその後加えると、Ｂｉａｃｏｒｅチップのデキストラン層へのタンパク質の安定な共有結合が生じた。結合していないタンパク質を徹底的な洗浄により除去し、次いで、エタノールアミン溶液の添加により、未反応の残存ＮＨＳ活性化カルボキシ基をブロックした。カップリングの前のシグナルに比べ、応答単位として測定されるより高いシグナルにより、タンパク質カップリングの成功を確認した。対照セルを、タンパク質溶液を加えずに上述のとおり調製した。
精製した二重特異的抗体ＥＧＦＲ−２１−６３ ＬＨ ｘ Ｈ２Ｃ ＨＬＰを、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｍｉｎｉ ＤｉａｌｙｓｉｓＵｎｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州、米国）中で、ＨＢＳ−ＥＰバッファ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）に対して徹底的に透析した。透析後のタンパク質濃度は、ＵＶ２８０ｎｍ吸収により測定し、４３μｇ／ｍｌの濃度となった。
タンパク質溶液を、９６ウェルプレートに移し、さらに１０のウェルに１：１の比でＨＢＳ−ＥＰバッファで連続的に希釈した。
表面プラズモン共鳴測定は、全１１ウェルを別々にサンプリングして行った。測定の間で、フローセルをアセテートバッファにより再生し、結合したタンパク質を放出した。
二重特異性抗体分子の結合シグナルは、１−２７ＣＤ３−Ｆｃタンパク質と結合した測定セルのシグナルから対照セルのシグナルを引いて得た。会合及び解離曲線を応答単位として測定し記録した。結合定数は、ラングミュアモデルに基づくＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）カーブフィッティングソフトウェアを利用して計算した。
計算した結合定数ＫＤは、最初の５種の濃度で、１．５２×１０-7Ｍであった。
７．２ ＦＡＣＳ測定によるＣＤ３結合定数の決定
ナイーブヒトＣＤ３への結合強度に関して種間特異的二重特異性抗体分子の親和性を試験するため、追加の飽和ＦＡＣＳ結合分析を実施した。選択した二重特異性抗体分子ＥＧＦＲ−２１−６３ＬＨ ｘ Ｈ２Ｃ ＨＬＰを使用し、１：１．５の係数及び出発濃度６３．３μｇ／ｍｌで希釈列を設定した。二重特異性抗体分子を、これらの異なる濃度で、それぞれ１．２５×１０5のヒトＰＢＭＣとともに４℃で１時間インキュベートし、次いで、４℃でＰＢＳ中で２回洗浄した。結合した二重特異性抗体分子の検出は、Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体（ＱｉａｇｅｎＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）を、２％ＦＣＳを含む５０μｌＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌで使用して実施した。４℃で４５分間インキュベーション及び２回の洗浄工程の後、Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体の結合を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中に１：１００で希釈されたＲ−フィコエリスリン結合アフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−ガンマ断片特異性（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、ニューマーケット、サフォーク、英国）により検出した。フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳ−ＣａｎｔｏＩＩ装置で実施し、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを利用して、データを取得し分析した（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ）。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００２）に記載のとおり実施した。取得した蛍光強度平均値を、使用した二重特異性抗体分子濃度の関数としてプロットし、生物数学ソフトウェアＰｒｉｓｍにより、片側結合分析（双曲線）で分析した。ソフトウェアは、質量作用の法則に従う、リガンド（二重特異性抗体分子）のレセプター（ＣＤ３陽性ＰＢＭＣサブフラクション）への結合を記載する、対応するＫＤ値を計算した。基礎となる式は以下のとおりである：Ｙ＝Ｂｍａｘｘ Ｘ／（Ｋｄ＋Ｘ）、ここでＢｍａｘは最大結合である。ＫＤは、半最大結合に達するのに要するリガンドの濃度である。ＦＡＣＳ染色は２連で実施し、Ｒ2値は０．９５より高かった。
二重特異性抗体分子ＥＧＦＲ−２１−６３ ＬＨ ｘ Ｈ２Ｃ ＨＬＰの決定した半最大結合は、８４７２ｎｇ／ｍｌの濃度に達し、５５０００ダルトンの分子量で１５４ｎＭ（１．５４×１０-7Ｍ）に相当する（図１０）。したがって、ネイティブＣＤ３コンテクストから分離されたヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７への、ＥＧＦＲ−２１−６３ＬＨ ｘ Ｈ２Ｃ ＨＬＰの親和性は、無傷のＴ細胞上のネイティブＣＤ３へのＥＧＦＲ−２１−６３ ＬＨ ｘ Ｈ２Ｃ ＨＬＰの親和性と同等であることが証明された。
８．ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の生成ヒトＥＧＦＲに陽性の細胞株、Ａ４３１（表皮ガン細胞株、ＣＲＬ−１５５５、アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、メリーランド州）を使用し、キットマニュアル（ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、ヒルデン、ドイツ）の説明書に従い単離されたトータルＲＮＡを得た。得られたＲＮＡを、ランダムプライムド逆転写によりｃＤＮＡ合成に使用した。ヒトＥＧＦＲ抗原の全長配列のクローニングには、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
５'ＥＧＦＲ ＡＧ Ｘｂａｌ ５'−ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＣＧＡＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＧＧＧ−３'
３'ＥＧＦＲ ＡＧ Ｓａｌｌ ５'−ＴＴＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＡＡＴＡＡＡＴＴＣＡＣＴＧＣＴ−３'
コード配列をＰＣＲ（最初のサイクルに、９４℃で５分間変性、５８℃で１分間アニーリング、７２℃で２分間伸長；３０サイクルに、９４℃で１分間変性、５８℃で１分間アニーリング、７２℃で２分間伸長；７２℃で５分間末端伸長）により増幅した。次いで、ＰＣＲ産物をＸｂａｌ及びＳａｌｌで消化し、適切に消化された発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲ（Ｒａｕｍｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２００１；５０： １４１−１５０）中にライゲーションし、大腸菌中に形質転換した。上述の手順を標準的なプロトコルに従い実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列実証済みヌクレオチド配列を持つクローン（配列番号３７０、アミノ酸配列番号３６９）を、コンストラクトの真核細胞発現のためにＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞中の真核細胞タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７−５６６により記載されるとおり実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度に上昇させることにより誘導した。
９． カニクイザルＥＧＦＲの細胞外ドメインを発現するＣＨＯ細胞の生成
カニクイザルＥＧＦＲの細胞外ドメインのｃＤＮＡ配列を、以下の反応条件を利用し、カニクイザル結腸ｃＤＮＡ（カタログ番号Ｃ１５３４０９０−Ｃｙ−ＢＣ；ＢｉｏＣａｔＧｍｂＨ、ハイデルベルグ、ドイツから入手）への１組の２つのＰＣＲにより得た：９４℃で３分間で１サイクル、次いで９４℃で１分間で３５サイクル、５３℃で１分間及び７２℃で２分間、次いで７２℃で３分間で停止サイクル。以下のプライマーを使用した：
１．フォワードプライマー；５'−ＣＧＣＴＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＴＣＧＧＧＣ−３'
リバースプライマー；５'−ＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＴＡＧＣ−３'
２．フォワードプライマー；５'−ＡＣＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＴＣＡＣＧＧＣＴＣＧＴＧＣ−３'
リバースプライマー；５'−ＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＧＡＡＣＧＡＴＧＴＧＧＣＧＣＣＴＴＣＧＣ−３'
これらのＰＣＲは、２つの重複する断片を生成し（Ａ：１−８６９、Ｂ：８４８−１９２３）、ＰＣＲプライマーを使用して標準プロトコルにより単離及び配列決定し、成熟タンパク質のコドン＋１の第３ヌクレオチドから膜貫通ドメインの２１番コドンまでのカニクイザルＥＧＦＲのｃＤＮＡ配列の１９２３ｂｐ部分を与えた。カニクイザルＥＧＦＲの発現のためのコンストラクトを生成するため、ｃＤＮＡ断片を標準プロトコルに従い遺伝子合成により得た（コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列は、配列番号３７２及び３７１に記す）。このコンストラクトにおいて、成熟ＥＧＦＲタンパク質のアミノ酸＋２から＋６４１のカニクイザルＥＧＦＲのコード配列を、ヒトＥＧＦＲのコード配列中に融合し、アミノ酸＋２から＋６４１のコード配列を置換した。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位を含むように、ヒトＥＧＦＲの膜貫通ドメイン及び細胞間ドメインに融合したカニクイザルＥＧＦＲの細胞外ドメインを基本的にコードするｃＤＮＡの最初と最後に制限部位を含むように設計した。さらに、保存的突然変異をアミノ酸６２７（膜貫通ドメインの第４のアミノ酸）に導入し、バリンをロイシンに変異し、クローニング目的の制限部位（Ｓｐｈｌ）を生成した。導入された制限部位、５'末端でのＸｂａｌ及び３'末端でのＳａｌｌを以下のクローニング手順に利用した。次いで、遺伝子合成断片を、Ｘｂａｌ及びＳａｌｌにより、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲはＭａｃｋｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ （１９９５） ７０２１−７０２５に記載されている）と称されるプラスミド中にクローニングした。このプラスミドの配列実証済みクローンを使用して、上述のとおりＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクトした。
１０． ＥＧＦＲ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の生成
１０．１ 異種間特異性結合分子のクローニング
一般的に、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロンに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメイン並びにヒト及び非チンパンジー霊長類ＥＧＦＲに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメインをそれぞれ含む、二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表１に記載のとおり設計した。
ヒト及びカニクイザルＥＧＦＲに対して異種間特異的な可変軽鎖（Ｌ）及び可変重鎖（Ｈ）ドメインを含む上述のコンストラクトは、遺伝子合成により得た。遺伝子合成断片は、まず、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位を含むように、次いで１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、フレームを合わせて、それぞれの二重特異性単鎖抗体分子のコード配列を、次いで、フレームを合わせて、６ヒスチジンタグのコード配列及び終止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、断片の最初及び最後に好適な制限部位を導入するようにも設計した。導入された制限部位は、以下のクローニング手順で使用した。遺伝子合成断片は、好適なＮ及びＣ末端制限部位を導入するようにも設計した。遺伝子合成断片を、これらの制限部位により、標準プロトコルに従い（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲはＲａｕｍ ｅｔ ａｌ．、 ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ５０（２００１） １４１−１５０に記載されている）と称されるプラスミドにクローニングした。配列実証済みヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核細胞発現のために、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中にトランスフェクトした。
コンストラクトを、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ９０９６）にエレクトロポレーションにより安定導入又は一過性導入し、或いは、標準プロトコルに従い一過性にＨＥＫ２９３（ヒト胎児由来腎臓細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）にトランスフェクトした。
１０．２ 二重特異性単鎖抗体分子の発現及び精製
二重特異性単鎖抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）中で発現した。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７−５６６に記載されているとおり実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、ＭＴＸの最終濃度を２０ｎＭまで上昇させて誘導した。静置培養の２回の継代後、細胞を、ヌクレオシドを含まないＨｙＱＰＨ ＣＨＯ液体大豆培地により（４．０ｍＭのＬ−グルタミン及び０．１％のプルロニックＦ−６８、ＨｙＣｌｏｎｅを含む）回転瓶中で７日間生育してから、採取した。細胞を遠心分離により除去し、発現したタンパク質を含む上清を−２０℃で保存した。或いは、コンストラクトを、ＨＥＫ２９３細胞中で一過性発現させた。トランスフェクションは製造業者のプロトコルに従い、２９３ｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２３４７−０１９番）により実施した。
Ａｋｔａ（登録商標） Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅをクロマトグラフィに使用した。製造業者が提供するプロトコルに従い、ＺｎＣｌ2を充填したＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ Ｃｈｅｌａｔｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を使用して、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（「ＩＭＡＣ」）を実施した。バッファＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ）によりカラムを平衡化し、細胞培養上清（５００ｍｌ）を、３ｍｌ／分の流速で、カラム（１０ｍｌ）に注いだ。カラムをバッファＡで洗浄して結合してないサンプルを除いた。結合したタンパク質を、バッファＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ イミダゾール）の２段階勾配を利用して、以下のとおり溶離した：
工程１：６カラム容積の２０％バッファＢ
工程２：６カラム容積の１００％バッファＢ
工程２から溶離したタンパク質分画を、さらなる精製のために貯蔵した。全ての試薬は、研究用グレードであり、Ｓｉｇｍａ（ダイゼンホーフェン）又はＭｅｒｃｋ（ダルムシュタット）から購入した。
Ｅｑｕｉ−ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ シトレート、２００ｍＭ リジン、５％グリセロール、ｐＨ ７．２）により平衡化したＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００分取用カラム（ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ）で、ゲル濾過クロマトグラフィを実施した。溶離したタンパク質サンプル（流速１ｍｌ／分）を、検出のため、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにかけた。精製の前に、分子量測定のために（分子量マーカーキット、Ｓｉｇｍａ、ＭＷＧＦ−２００）カラムを平衡化した。タンパク質濃度は、ＯＤ２８０ｎｍを利用して測定した。
精製した二重特異性単鎖抗体タンパク質を、プレキャスト４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により実施した還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。サンプル調製及び適用は、製造業者が提供するプロトコルに従って実施した。分子量は、ＭｕｌｔｉＭａｒｋタンパク質標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により測定した。ゲルを、コロイド状クーマシー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコル）により染色した。単離したタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して９５％を超えていた。
天然条件下でＰＢＳ中のゲル濾過により測定して、二重特異性単鎖抗体の分子量は約５２ｋＤａである。コンストラクトは全てこの方法により精製した。
ウェスタンブロットは、Ｏｐｔｉｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ−Ｓ８３メンブレン及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅを利用して、製造業者が提供するプロトコルにより実施した。使用した抗体に、ＨｉｓＴａｇ（Ｐｅｎｔ Ｈｉｓ、Ｑｉａｇｅｎ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇ（Ｓｉｇｍａ）及び基質としてのＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）を作用させた。精製した二重特異性単鎖抗体に相当する５２ｋＤでシングルバンドを検出した。
１１． 表面プラズモン共鳴測定による、融合タンパク質１−２７ＣＤ３−Ｆｃへの、完全に種間特異的二重特異性単鎖抗体の結合定数ＫＤの決定
成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端のアミノ酸１−２７への、霊長類ＥＧＦＲ及び霊長類ＣＤ３に異種間特異的な二重特異性単鎖抗体分子の結合親和性を測定するため、表面プラズモン共鳴測定を、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部に融合したヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７からなる組換え融合タンパク質で実施した（１−２７ＣＤ３−Ｆｃ）。このために、ＢｉａｃｏｒｅＣａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−Ｄｅｘｔｒａｎ ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）を、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００（登録商標）システム（Ｂｉａｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）に取り付けた。フローセルを、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミド塩酸塩／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド溶液で、標準プロトコルに従い活性化した。融合タンパク質１−２７ＣＤ３−Ｆｃの溶液をその後加えると、Ｂｏａｃｏｒｅチップのデキストラン層へのタンパク質の安定な共有結合が生じた。結合していないタンパク質を徹底的な洗浄により除去し、次いで、エタノールアミン溶液の添加により、未反応の残存ＮＨＳ活性化カルボキシ基をブロックした。カップリングの前のシグナルに比べ、応答単位として測定されるより高いシグナルの検出により、タンパク質カップリングの成功を確認した。対照セルを、タンパク質溶液を加えずに上述のとおり調製した。
以下に列記する精製した二重特異性単鎖抗体は、ＨＢＳ−ＥＰバッファ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）で５μｇ／ｍｌに調整し、それぞれ１５０μｌの体積で９６ウェルプレートに移した。
全サンプルに表面プラズモン共鳴測定を実施し、測定の間にフローセルをアセテートバッファで再生し、結合したタンパク質を放出した（全て標準プロトコルによる）。
二重特異性単鎖抗体の結合シグナルは、１−２７ＣＤ３−Ｆｃタンパク質に結合した測定セルのシグナルから、対照セルのシグナルを引いて得た。
会合及び解離曲線を応答単位として測定し記録した。結合定数は、ラングミュアモデルに基づくＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）カーブフィッティングソフトウェアを利用して計算した。ヒトＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１−２７への、試験した完全に種間特異的二重特異性の単鎖分子の親和性計算値は、以下のＫＤ値として与えられ、２．５４×１０-6Ｍから２．４９×１０-7Ｍの範囲である。「ＬＨ」は、ＶＬ−ＶＨの順の可変ドメインの配置を意味する。「ＨＬ」は、ＶＨ−ＶＬの順の可変ドメインの配置を意味する。Ｇ４Ｈ、Ｆ７０、Ａ２Ｊ、Ｅ１Ｌ、Ｅ２Ｍ、Ｈ１Ｅ及びＦ６Ａは、異なる異種間特異性ＣＤ３結合分子を意味する。
１２． ＥＧＦＲ及びＣＤ３種間特異的二重特異性抗体のフローサイトメトリー結合分析
それぞれ、ヒト及びカニクイザルのＥＧＦＲ及びＣＤ３へ結合能に関して、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能性を試験するために、ＦＡＣＳ分析を実施した。この目的のため、実施例８に記載したヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ（ＤＳＭＺ、ブラウンシュヴァイク、ＡＣＣ４８３）を使用し、ヒト抗原への結合を試験した。カニクイザル抗原の結合反応性は、実施例９に記載された生成したカニクイザルＥＧＦＲトランスフェクタント及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ教授による提供に感謝、ＨｙｇｉｅｎｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｅｒｌａｎｇｅｎ−Ｎｕｅｒｎｂｅｒｇ；Ｋｎａｐｐｅ Ａ， ｅｔ ａｌ．， ａｎｄ Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ Ｈ．，Ｂｌｏｏｄ２０００，９５，３２５６−６１に発表）を使用して試験した。それぞれの細胞集団の２０万の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト（２μｇ／ｍｌ）の精製タンパク質５０μｌとともに氷上で３０分間インキュベートした。或いは、一過的に産生したタンパク質の細胞培養上清を使用した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、コンストラクトの結合を、マウスＰｅｎｔａＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ；２％ＦＣＳを含む５０μｌＰＢＳで１：２０に希釈）により検出した。洗浄の後、結合した抗Ｈｉｓ抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳに１：１００で希釈された、フィコエリスリンに結合したＦｃガンマ特異性抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）により検出した。新鮮な培地をネガティブコントロールとして使用した。
フローサイトメトリーをＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置で実施し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ）を利用してデータを取得し分析した。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のとおり実施した。
ＥＧＦＲに特異的でヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３に異種間特異的であるいくつかの二重特異性単鎖分子の結合能は、図１１に示されるとおり、明らかに検出可能であった。ＦＡＣＳ分析において、全コンストラクトが、ネガティブコントロールとしての培地及び１次・２次抗体に比べ、ＣＤ３及びＥＧＦＲへの結合を示した。ヒト及びカニクイザルＣＤ３及びＥＧＦＲ抗原に対する二重特異性抗体の異種間特異性が示された。
１３．ＥＧＦＲ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の生理活性
生成した二重特異性単鎖抗体の生理活性を、実施例８及び９に記載されたＥＧＦＲ陽性細胞株を利用して、インビトロ細胞障害アッセイにおいてクロム５１（51Ｃｒ）の放出により分析した。エフェクター細胞として、刺激を受けたヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞又はマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをそれぞれ使用した。
刺激を受けたＣＤ８＋Ｔ細胞の生成は以下のとおり実施した：
ペトリ皿（直径１４５ｍｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、市販の抗ＣＤ３特異性抗体により、最終濃度１μｇ／ｍｌで１時間３７℃でプレコートした。未結合のタンパク質を、ＰＢＳでの１洗浄工程で除去した。新鮮なＰＢＭＣを、標準プロトコルに従い、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により末梢血（３０〜５０ｍｌ、ヒトの血液）から単離した。３〜５×１０7ＰＢＭＣを、プレコートされたペトリ皿に、１２０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０／１０％ ＦＣＳ／ＩＬ−２ ２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｃｈｉｒｏｎ）に加え、２日間刺激した。３日目に、細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。ＩＬ−２を２０ Ｕ／ｍｌの最終濃度で加え、１日間再び培養した。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞の除去により、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を単離した。
標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％ＦＣＳを含む１００μｌのＲＰＭＩの最終体積で、３７℃で４５分間、１１．１ＭＢｑ51Ｃｒで標識した。次いで、標識した標的細胞を、５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次いで、細胞障害性アッセイに使用した。アッセイは、１０：１のＥ：Ｔ比で、ＲＰＭＩ（上述）を補った総体積２５０μｌで９６ウェルプレート中で実施した。１μｇ／ｍｌの種間特異的二重特異性単鎖抗体分子及びその２０回の３倍希釈体を利用した。或いは、一過性産生されたタンパク質の細胞培養上清を、１：２ステップで連続的に希釈した。アッセイ時間は１８時間であり、細胞障害性は、最大溶解（ＴｒｉｔｏｎＸの添加）と自然溶解（エフェクター細胞なし）の差に関連する上清中の放出クロムの相対値として測定した。測定は全て４連で実施した。上清中のクロム活性の測定を、Ｗｉｚａｒｄ３"ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ、ケルン、ドイツ）で実施した。実験データの分析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ４（バージョン４．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）で実施した。Ｓ字状の用量応答曲線のＲ2値は、該ソフトウェアにより測定して、通常０．９０を超えた。分析プログラムにより計算されたＥＣ50値を、生理活性の比較に使用した。
図１２及び１３に示されるように、生成した全ての種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクトは、ヒトＣＤ８＋細胞により誘発されたヒトＥＧＦＲ陽性標的細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘにより誘発されたカニクイザルＥＧＦＲ陽性標的細胞に対して、細胞障害活性を現した。異なる標的特異性を持つ二重特異性単鎖抗体をネガティブコントロールとして使用した。
１４． ヒトＭＣＳＰのＣ末端の膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインのクローニング及び発現
ヒトＭＣＳＰのＣ末端の膜貫通及び先端切断型細胞外ドメイン（アミノ酸１５３８〜２３２２）のコード配列を、標準プロトコルに従い遺伝子合成により得た（ヒトＭＣＳＰ（ヒトＤ３と称される）のＣ末端の、膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインの発現のための組換えコンストラクトのｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は配列番号３７４及び３７３に記す）。遺伝子合成断片は、まず、コンストラクトの真核細胞発現を可能にするコザック部位、次いで、１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列、次いで、フレームを合わせて、ＦＬＡＧタグ、次いで、フレームを合わせて、クローニング目的のいくつかの制限部位を含み９アミノ酸人工リンカー（ＳＲＴＲＳＧＳＱＬ）をコードする配列、次いで、フレームを合わせて、ヒトＭＣＳＰのＣ末端膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインのコード配列及び終止コドンを含むように設計した。ＤＮＡ断片の最初と最後に制限部位を導入した。制限部位、５'末端でのＥｃｏＲＩ及び３'末端でのＳａｌｌを以下のクローニング手順で使用した。断片をＥｃｏＲＩ及びＳａｌｌにより消化し、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲはＭａｃｋｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ （１９９５） ７０２１−７０２５に記載されている）に以下の標準プロトコルでクローニングした。配列実証済みプラスミドを使用し、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ９０９６）にトランスフェクトした。細胞を、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（全て、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、ベルリン、ドイツから入手）及び細胞培養グレード試薬（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）のストック溶液から１０μｇ／ｍｌのアデノシン、１０μｇ／ｍｌのデオキシアデノシン及び１０μｇ／ｍｌのチミジンの最終濃度にヌクレオシドを補い安定化グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０中で、３７℃、湿度９５％、ＣＯ2７％でインキュベーター中で培養した。トランスフェクションは、ＰｏｌｙＦｅｃｔＴｒａｎｓｆｅｃｔｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）及び５μｇのプラスミドＤＮＡを製造業者のプロトコルに従い使用して実施した。２４時間培養の後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、安定化グルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０中で再び培養した。このように、細胞培地はヌクレオシドを含んでおらず、選択はトランスフェクトされた細胞に行われた。トランスフェクションのおよそ１４日後、耐性細胞の増殖が観察された。さらに７から１４日後、トランスフェクタントを、ＦＡＣＳによりコンストラクトの発現に関して試験した。２．５×１０5の細胞を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌに希釈された抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）５０μｌとともにインキュベートした。抗体の結合を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中に１：１００で希釈されたＲ−フィコエリスリン結合アフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−ガンマ断片特異的（ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、ニューマーケット、サフォーク、英国）により検出した。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ、ドイツ）で測定した。
１５． マカクＭＳＣＰのＣ末端の膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインのクローニング及び発現
マカクザルＭＣＳＰ（マカクＤ３と称される）Ｃ末端の膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインのｃＤＮＡ配列を、以下の反応条件により、マカクザル皮膚ｃＤＮＡ（カタログ番号Ｃ１５３４２１８−Ｃｙ−ＢＣ；ＢｉｏＣａｔＧｍｂＨ、ハイデルベルグ、ドイツ）への１組の３つのＰＣＲにより得た：９４℃で３分間で１サイクル、４０サイクルを９４℃で０．５分間、５２℃で０．５分間、そして７２℃で１．７５分間、７２℃で３分間の停止サイクル。以下のプライマーを使用した：
フォワードプライマー：５'−ＧＡＴＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡＧＣ−３'
リバースプライマー：５'−ＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＡＧＧ−３'
フォワードプライマー：５'−ＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＴＧＴＣＴＧＡＴＧＧ−３'
リバースプライマー：５'−ＣＧＡＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＡＧＧ−３'
フォワードプライマー：５'−ＧＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣ−３'
リバースプライマー：５'−ＧＣＣＴＴＣＡＣＡＣＣＣＡＧＴＡＣＴＧＧＣＣ−３'
これらのＰＣＲは、３つの重複断片を生成したが（Ａ：１−１３２９、Ｂ：１２２９−２４２８、Ｃ：１７８２−２５４７）、ＰＣＲプライマーを使用して標準プロトコルにより単離及び配列決定し、Ｃ末端ドメインのコード配列の７４ｂｐ上流から終止コドンの１２１ ｂｐ下流まで、マカクザルＭＣＳＰのｃＤＮＡ配列の２５４７ ｂｐ部分を与えた（マカクザルＭＣＳＰのこの部分のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、配列番号３７６及び３７５に記す）。以下の反応条件を利用するもう１つのＰＣＲを使用して、上述の反応Ａ及びＢのＰＣＲ産物を融合した：９４℃で３分間で１サイクル、１０サイクルを９４℃で１分間で１０サイクル、５２℃で１分間及び７２℃で２．５分間、７２℃で３分間の停止サイクル。以下のプライマーを使用する：
フォワードプライマー：５'−ｔｃｃｃｇｔａｃｇａｇａｔｃｔｇｇａｔｃｃｃａａｔｔｇｇａｔｇｇｃｇｇａｃｔｃｇｔｇｃｔｇｔｔｃｔｃａｃａｃａｇａｇｇ−３'リバースプライマー：５'−ａｇｔｇｇｇｔｃｇａｃｔｃａｃａｃｃｃａｇｔａｃｔｇｇｃｃａｔｔｃｔｔａａｇｇｇｃａｇｇｇ−３'
このＰＣＲのプライマーは、マカクザルＭＣＳＰのＣ末端膜貫通及び先端切断型細胞ドメインをコードするｃＤＮＡ配列の最初と最後に制限部位を導入するように設計した。導入された制限部位、５'末端でのＭｆｅｌ及び３'末端でのＳａｌｌを以下のクローニング手順で使用した。次いで、ＰＣＲ断片を、Ｍｆｅｌ及びＳａｌｌにより、ヒトＭＣＳＰのＣ末端膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインを置換することにより、上述のプラスミドｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ５０（２００１） １４１−１５０に記載されている）のＥｃｏＲＩ／Ｍｆｅｌ断片を含むＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔプラスミド中にクローニングした。遺伝子合成断片は、免疫グロブリンリーダーペプチド及びＦｌａｇタグのコード配列並びにマカクザルＭＣＳＰのＣ末端膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ断片の５'末端にフレームを合わせて人工リンカー（ＳＲＴＲＳＧＳＱＬ）を含んでいた。このベクターを使用して、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ ９０９６）にトランスフェクトした。細胞を、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（全て、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、ベルリン、ドイツから入手）及び細胞培養グレード試薬（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）のストック溶液から１０μｇ／ｍｌのアデノシン、１０μｇ／ｍｌのデオキシアデノシン及び１０μｇ／ｍｌのチミジンの最終濃度にヌクレオシドを補い安定化グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０中で、３７℃、湿度９５％ＣＯ2７％でインキュベーター中で培養した。トランスフェクションは、ＰｏｌｙＦｅｃｔＴｒａｎｓｆｅｃｔｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）及び５μｇのプラスミドＤＮＡを製造業者のプロトコルに従い使用して実施した。２４時間培養の後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、安定化グルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０中で再び培養した。このように、細胞培地はヌクレオシドを含んでおらず、選択はトランスフェクトされた細胞に行われた。トランスフェクションのおよそ１４日後、耐性細胞の増殖が観察された。さらに７から１４日後、トランスフェクタントを、ＦＡＣＳにより組換えコンストラクトの発現に関して試験した。２．５×１０5の細胞を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌに希釈された抗Ｆｌａｇ−Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）５０μｌとともにインキュベートした。結合した抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中に１：１００で希釈されたＲ−フィコエリスリン結合アフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−ガンマ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、ニューマーケット、サフォーク、英国）により検出した。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ、ドイツ）で測定した。
１６．ＭＣＳＰ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の生成及びキャラクタリゼーション
ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロンに異種間特異的な結合ドメイン並びにヒト及び非チンパンジー霊長類ＭＣＳＰに異種間特異的な結合ドメインをそれぞれ含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表２に記載のとおり設計する。
ヒト及びマカクザルＭＣＳＰ Ｄ３に異種間特異的な可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及びヒト及びマカクザルＣＤ３に異種間特異的なＶＨ及びＶＬドメインを含む上述のコンストラクトを、遺伝子合成により得た。遺伝子合成断片を、まずコンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位を含むように、次いで、１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、次いで、フレームを合わせて、それぞれの二重特異性単鎖抗体分子のコード配列を、次いで、フレームを合わせて、ヒスチジン6タグのコード配列及び終止コドンを含むように、設計した。遺伝子合成断片を、好適なＮ末端及びＣ末端制限部位を導入するようにも設計した。遺伝子合成断片を、これらの制限部位により、ｐＥＦ−ＤＨＦＲと称されるプラスミド（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ５０（２００１） １４１−１５０に記載されている）中に、標準プロトコルに従い（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））クローニングした。コンストラクトを、エレクトロポレーションによりＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ ９０９６）に安定導入又は一過性導入し、或いはＨＥＫ２９３（ヒト胎児由来腎臓細胞、ＡＴＣＣ番号 ＣＲＬ−１５７３）に標準プロトコルに従い一過性導入させた。
ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞での真核細胞タンパク質発現は、Ｋａｕｆｍａｎｎ Ｒ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５， ５３７−５６６により記載されるとおりに実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を、２０ｎｍのＭＴＸ最終濃度まで上昇することにより誘導した。静置培養の２回の継代後、細胞を、ヌクレオシドを含まないＨｙＱＰＨ ＣＨＯ液体大豆培地により（４．０ｍＭのＬ−グルタミン及び０．１％のプルロニックＦ−６８、ＨｙＣｌｏｎｅを含む）回転瓶中で７日間生育してから、採取した。細胞を遠心分離により除去し、発現したタンパク質を含む上清を−２０℃で保存した。
Ａｋｔａ（登録商標） Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅをクロマトグラフィに使用した。製造業者が提供するプロトコルに従い、ＺｎＣｌ2を充填したＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ Ｃｈｅｌａｔｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を使用して、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（「ＩＭＡＣ」）を実施した。バッファＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ）によりカラムを平衡化し、細胞培養上清（５００ｍｌ）を、３ｍｌ／分の流速で、カラム（１０ｍｌ）に注いだ。カラムをバッファＡで洗浄して結合してないサンプルを除いた。結合したタンパク質を、バッファＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ イミダゾール）の２段階勾配を利用して、以下のとおり溶離した：
工程１：６カラム容積の２０％バッファＢ
工程２：６カラム容積の１００％バッファＢ
工程２から溶離したタンパク質分画を、さらなる精製のために貯蔵した。全ての試薬は、研究用グレードであり、Ｓｉｇｍａ（ダイゼンホーフェン）又はＭｅｒｃｋ（ダルムシュタット）から購入した。
Ｅｑｕｉ−ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ シトレート、２００ｍＭ リジン、５％グリセロール、ｐＨ ７．２）により平衡化したＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００分取用カラム（ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ）で、ゲル濾過クロマトグラフィを実施した。溶離したタンパク質サンプル（流速１ｍｌ／分）を、検出のため、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにかけた。精製の前に、分子量測定のために（分子量マーカーキット、Ｓｉｇｍａ、ＭＷＧＦ−２００）カラムを平衡化した。タンパク質濃度は、ＯＤ２８０ｎｍを利用して測定した。
精製した二重特異性単鎖抗体タンパク質を、プレキャスト４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により実施した還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。サンプル調製及び適用は、製造業者が提供するプロトコルに従って実施した。分子量は、ＭｕｌｔｉＭａｒｋタンパク質標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により測定した。ゲルを、コロイド状クーマシー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコル）により染色した。単離したタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して９５％を超える。
天然条件下でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のゲル濾過により測定して、二重特異性単鎖抗体の分子量は約５２ｋＤａである。コンストラクトは全てこの方法により精製した。
ウェスタンブロットは、Ｏｐｔｉｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ−Ｓ８３メンブレン及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅを利用して、製造業者が提供するプロトコルにより実施した。二重特異性単鎖抗体タンパク質抗体の検出には、抗ＨｉｓＴａｇ抗体（Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ，Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）を二次抗体として使用し、基質としてＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）を使用した。精製した二重特異性単鎖抗体に相当する５２ｋＤでシングルバンドを検出した。
或いは、コンストラクトは、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞中に一過性発現した。簡単に言うと、コンストラクト当たり４×１０5の細胞を、１０％胎児ウシ血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び細胞培養グレード試薬（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）のストック溶液から１０μｇ／ｍｌのアデノシン、１０μｇ／ｍｌのデオキシアデノシン及び１０μｇ／ｍｌのチミジンの最終濃度にヌクレオシドを補い安定化グルタミンを含む３ｍｌのＲＰＭＩ１６４０ ａｌｌ ｍｅｄｉｕｍ中で、３７℃、湿度９５％、ＣＯ2７％でインキュベーター中で、トランスフェクションの１日前に培養した。トランスフェクションは、製造業者のプロトコルに従い、Ｆｕｇｅｎｅ６ Ｔｒａｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ、番号１１８１５０９１００１）により実施した。９４μｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び６μｌのＦｕｇｅｎｅ６を混合し、室温で５分間インキュベートする。その後、コンストラクト当たり１．５μｇのＤＮＡを加え、混合し、室温で１５分間インキュベートした。その間、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞を、１×ＰＢＳで洗浄し、１．５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０ ａｌｌ ｍｅｄｉｕｍに再懸濁した。トランスフェクションミックスを、６００μｌのＲＰＭＩ １６４０ ａｌｌ ｍｅｄｉｕｍで希釈し、細胞に加え、３７℃で、湿度９５％、ＣＯ2７％で一晩インキュベートした。トランスフェクションの翌日、各アプローチのインキュベーション容積を５ｍｌのＲＰＭＩａｌｌ ｍｅｄｉｕｍに増量した。インキュベーションの３日後に上清を採取した。
１７． ＭＣＳＰ及びＣＤ３種間特異的二重特異性抗体のフローサイトメトリー結合分析
それぞれヒト及びマカクザルＭＣＳＰ Ｄ３及びＣＤ３に結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能性を試験するため、ＦＡＣＳ分析を実施した。この目的のため、ヒトＭＣＳＰＤ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（実施例１４に記載のとおり）及びヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ（ＤＳＭＺ、ブラウンシュヴァイク、ＡＣＣ４８３）を使用して、ヒト抗原への結合を試験した。マカクザル抗原への結合反応性は、生成したマカクザルＭＣＳＰＤ３トランスフェクタント（実施例１５に記載のとおり）及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ教授による提供に感謝、Ｈｙｇｉｅｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｅｒｌａｎｇｅｎ−Ｎｕｅｒｎｂｅｒｇ；Ｋｎａｐｐｅ Ａ， ｅｔ ａｌ．， ａｎｄ Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ Ｈ．，Ｂｌｏｏｄ ２０００，９５，３２５６−６１に発表）を使用して試験した。それぞれの細胞株の２０万の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト（２μｇ／ｍｌ）の精製タンパク質５０μｌ又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養上清とともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、コンストラクトの結合を、マウス抗Ｈｉｓ抗体（ＰｅｎｔａＨｉｓ抗体；Ｑｉａｇｅｎ，２％ＦＣＳを含む５０μｌＰＢＳで１：２０に希釈）により検出した。洗浄の後、結合した抗Ｈｉｓ抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳに１：１００で希釈された、フィコエリスリンに結合したＦｃガンマ特異性抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）により検出した。トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を、Ｔ細胞株への結合のネガティブコントロールとして使用した。無関係な標的特異性を持つ単鎖コンストラクトを、ＭＣＳＰ−Ｄ３にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合のネガティブコントロールとして使用した。
フローサイトメトリーをＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置で実施し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ）を利用してデータを取得し分析した。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のとおり実施した。
ＭＣＳＰ Ｄ３に異種間特異的でヒト及びマカクザルＣＤ３に異種間特異的である、先に列記した単鎖分子の二重特異性結合は、図１４、１５、１６及び５８に示されるとおり、明らかに検出可能であった。ＦＡＣＳ分析において、全コンストラクトが、それぞれのネガティブコントロールに比べ、ＣＤ３及びＭＣＳＰ−Ｄ３への結合を示した。ヒト及びマカクザルＣＤ３及びＭＣＳＰＤ３抗原に対する二重特異性抗体の異種間特異性が示された。
１８．ＭＣＳＰ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の生物活性
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例１４及び１５で述べるＭＣＳＰ Ｄ３陽性細胞株を用いるクロム５１（51Ｃｒ）放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。それぞれの図に示すように、エフェクター細胞としては、刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣ、刺激されたヒトＰＢＭＣ、又はマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘを用いる。
刺激されたＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣの作製は以下のようにして実施した：
ペトリ皿（直径１４５ｍｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ‐ｏｎｅ ＧｍｂＨ，クレムスミュンスター）のコーティングを、最終濃度１μｇ／ｍｌの市販の抗ＣＤ３特異的抗体（例：ＯＫＴ３，Ｏｔｈｏｃｌｏｎｅ）により３７℃にて１時間行った。非結合タンパク質をＰＢＳによる１段階の洗浄によって除去した。新鮮なＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液（３０乃至５０ｍｌのヒト血液）から単離した。安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／ＩＬ‐２２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ）を含む１２０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中、３‐５×１０7個のＰＢＭＣをあらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、２日間刺激した。３日目に細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。ＩＬ‐２を添加して最終濃度を２０Ｕ／ｍｌとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度１日培養した。標準的なプロトコルに従ってＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞を除去することにより、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）を濃縮した。
標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％ＦＣＳを含む最終容量１００μｌのＲＰＭＩ中、１１．１ＭＢｑの51Ｃｒにて３７℃で４５分間標識した。続いて、標識された標的細胞を５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次に細胞障害性アッセイに用いた。アッセイは、９６ウェルプレート上、全容量２５０μｌの補足ＲＰＭＩ（上記のように）中にて、Ｅ：Ｔ比１０：１で実施した。種間特異的二重特異性単鎖抗体分子１μｇ／ｍｌ及びその３倍希釈物２０個を適用した。種間特異的二重特異性単鎖抗体分子を含む上清を用いる場合、マカク、及びヒト細胞障害性アッセイに対してそれぞれ、２倍希釈物２１個、及び３倍希釈物２０個を適用した。アッセイの時間は１８時間とし、細胞障害性は、最大溶解（トリトンＸの添加）と自然溶解（エフェクター細胞なし）との差に関連する上清中の放出されたクロムの相対値として測定した。測定はすべて４個の反復サンプルで行った。上清中のクロムの放射能の測定は、Ｗｉｚａｒｄ３"ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ，ケルン，ドイツ）を用いて実施した。実験データの解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ４（バージョン４．０２、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）を用いて実施した。このソフトウェアによって決定されるＳ字型用量反応曲線のＲ2値は、通常＞０．９０である。この解析プログラムによって算出されるＥＣ50値を用いて生物活性を比較した。
図１７乃至２１、及び５９に示すように、作製された種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクトはすべて、刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣ又は刺激されたＰＢＭＣによって誘発されたヒトＭＣＳＰＤ３陽性標的細胞に対する細胞障害活性、並びにマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘによって誘発されたマカクＭＣＳＰ Ｄ３陽性標的細胞に対する細胞障害活性を示している。
１９．ＭＣＳＰ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の血漿中安定性
作製された二重特異性単鎖抗体のヒト血漿中での安定性を、５０％ヒト血漿中、３７℃及び４℃にて２４時間の二重特異性単鎖抗体のインキュベーション、及びこれに続く生物活性の試験を行うことによって分析した。生物活性は、ＭＣＳＰ陽性ＣＨＯ細胞株（実施例１４又は１５に従い、クローンとしてＭＣＳＰを発現）を標的として、刺激されたヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いるクロム５１（51Ｃｒ）放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。
上述の解析プログラムによって算出されたＥＣ50値を用いて、５０％ヒト血漿と共に２４時間、３７℃及び４℃にてインキュベートされた二重特異性単鎖抗体のそれぞれの生物活性を、血漿を添加しない二重特異性単鎖抗体又はアッセイの直前に同量の血漿を混合した二重特異性単鎖抗体と比較した。
図２２及び表３に示すように、二重特異性抗体Ｇ４ Ｈ‐Ｌ×Ｉ２Ｃ Ｈ‐Ｌ、Ｇ４ Ｈ‐Ｌ×Ｈ２Ｃ Ｈ‐Ｌ、及びＧ４ Ｈ‐Ｌ×Ｆ１２ＱＨ‐Ｌの生物活性は、血漿を添加しない又は生物活性の試験の直前に血漿を添加したコントロールと比較して著しく低下するということはなかった。
２０．循環する標的細胞の非存在下における、従来の、すなわち、コンテクスト依存性ＣＤ３エピトープに指向されたＣＤ３結合分子への最初の曝露による循環するＴ細胞の再分布は、治療の開始と関連する有害なイベントに対する主たるリスク因子である。
従来のＣＤ３結合分子による治療開始に続くＢ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ‐ＮＨＬ）の患者のＴ細胞再分布
従来のＣＤ１９×ＣＤ３結合分子は、二重特異性タンデムｓｃＦｖ型（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｎｄｅｍ ｓｃＦｖ ｆｏｒｍａｔ）のＣＤ３結合分子である（Ｌｏｆｆｌｅｒ（２０００， Ｂｌｏｏｄ， Ｖｏｌｕｍｅ ９５， Ｎｕｍｂｅｒ ６）、又は国際公開第９９／５４４４０号）。これは、（ｉ）正常及び悪性ヒトＢ細胞の表面上のＣＤ１９、並びに（ｉｉ）ヒトＴ細胞上のＣＤ３に指向される２つの異なる結合部分から成る。Ｔ細胞上のＣＤ３をＢ細胞上のＣＤ１９と架橋させることにより、このコンストラクトは、Ｔ細胞の細胞障害活性によって正常及び悪性Ｂ細胞の再指向された溶解を誘発する。そのような従来のＣＤ３結合分子によって認識されるＣＤ３エピトープは、ＣＤ３イプシロン鎖上に局在化しており、そこでは、イプシロン鎖の残りの部分内に埋め込まれてＣＤ３ガンマ鎖又はデルタ鎖のいずれかとのイプシロン鎖のヘテロ二量体化によって正しい位置に保持される場合は、正しいコンフォメーションしか取れない。この非常にコンテクスト依存性であるエピトープと従来のＣＤ３結合分子（例えば、Ｌｏｆｆｌｅｒ（２０００， Ｂｌｏｏｄ， Ｖｏｌｕｍｅ ９５， Ｎｕｍｂｅｒ ６）、又は国際公開第９９／５４４４０号を参照）との相互作用は、完全に一価の形態で架橋をまったく伴わずに発生する場合であっても、ＣＤ３のコンフォメーションにアロステリックな変化を誘発し、ＣＤ３イプシロンの細胞質ドメイン内に通常は隠れているプロリンリッチ領域の露出を引き起こし得る。一旦露出されると、このプロリンリッチ領域はシグナル伝達分子Ｎｃｋ２を動員することができ、この分子はさらなる細胞内シグナルを誘発する能力を有する。これは、Ｔ細胞表面上のいくつかのＣＤ３分子の架橋、例えば、Ｂ細胞の表面上のいくつかのＣＤ１９分子によるＴ細胞上のいくつかのＣＤ３分子と結合したいくつかの抗ＣＤ３分子の架橋、を必ず必要とする完全なＴ細胞活性化には不十分ではあるが、それでも、従来のＣＤ３結合分子とそのＣＤ３イプシロン上のコンテクスト依存性エピトープとの完全に一価である相互作用は、シグナル伝達という点でＴ細胞に対して不活性ではない。理論に束縛されるものではないが、一価の従来のＣＤ３結合分子（本技術分野で公知である）は、ＣＤ３架橋のための循環する標的細胞が存在しない場合であっても、ヒトに注入されるとある程度のＴ細胞の反応を誘発する場合がある。一価の従来のＣＤ１９×ＣＤ３結合分子を、実質的に循環するＣＤ１９陽性Ｂ細胞を持たないＢ‐ＮＨＬ患者へ静脈内注入した場合のこれに対する重要なＴ細胞の反応は、治療開始後のＴ細胞の再分布である。フェーズＩ臨床試験では、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子の静脈内注入の開始フェーズの間に、循環するＣＤ１９陽性標的Ｂ細胞を持たないすべての個人にこのＴ細胞の反応が発生し、これは実質的にＣＤ１９×ＣＤ３結合分子の投与量に依存しないことが分かった（図２３）。しかし、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子への曝露の急な増加が、治療開始時におけるＣＤ１９×ＣＤ３結合分子へのＴ細胞の最初の曝露とほぼ同一のＴ細胞の再分布反応をこれらの患者に引き起こすことが分かり（図２４Ａ）、そしてＣＤ１９×ＣＤ３結合分子への曝露のゆるやかな増加でさえも循環するＴ細胞への再分布効果を持ち得る（図２５）。さらに、循環する標的細胞の非存在下におけるこの実質的に投与量に依存しないＴ細胞の再分布反応は、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子（例：国際公開第９９／５４４４０号に開示のもの）のような従来のＣＤ３結合分子により、治療を受けた全個人のうちの１００％で引き起こされるため、治療の開始と関連する有害なイベントに対する主たるリスク因子であることが分かった。
この研究プロトコルに従い、マントル細胞リンパ腫を含む、再発し組織学的に確認された低悪性度Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ‐ＮＨＬ）を持つ患者を、非盲検、多施設フェーズＩ個人内投与量漸増試験（ｍｕｌｔｉ‐ｃｅｎｔｅｒｐｈａｓｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｐａｔｉｅｎｔ ｄｏｓｅ‐ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｔｒｉａｌ）に採用した。研究プロトコルは、参加するすべての施設の独立倫理委員会によって承認され、管轄の監督当局へ届けられた。ＣＴスキャンによって実証される測定可能な疾患（≧１．５ｃｍの病変部を少なくとも１つ）を持つことを研究に含める条件とした。患者は、携帯用ミニポンプシステムにより、従来のＣＤ１９×ＣＤ３結合分子を一定の流量（すなわち投与量レベル）にて４週間超にわたって連続静脈内注入された。患者は治療の最初の２週間は入院し、その後退院して自宅で治療を続けた。４週間後に疾患の進行の証拠が見られない患者は、さらに４週間の治療の継続が提供された。これまでのところ、最大耐投与量（ＭＴＤ）には達しない６つの異なる投与量レベル、０．５、１．５、５、１５、３０、及び６０μｇ／ｍ2／２４時間についての試験を行った。この研究プロトコルによってＤＬＴ（投与量規制毒性）として定義される有害なイベントが観察されなかった場合、コホートは各々３人の患者から構成した。最初の３人の患者のうち１人でＤＬＴが見られた場合、コホートは患者６人に拡大し、２人目のＤＬＴがない場合、ここで投与量をさらに増加させた。従って、患者３人のコホートでＤＬＴが見られないか、又は患者６人のコホートでＤＬＴが１人である投与量レベルを安全と見なした。研究治療はＤＬＴを発症したすべての患者で停止した。１５及び３０μｇ／ｍ2／２４時間では、いくつかの追加のコホートにて最初の２４時間の治療開始モードを変えた試験：（ｉ）最初の２４時間の５μｇ／ｍ2／２４時間の後、１５μｇ／ｍ2／２４時間の維持投与量まで段階的に増加（患者コホート１５‐ステップ）、（ｉｉ）ほぼ０から１５又は３０μｇ／ｍ2／２４時間まで流量を均等に連続的に増加（患者コホート１５‐ランプ及び３０‐ランプ）、並びに（ｉｉｉ）一番最初から維持投与量で開始（患者コホート１５‐フラット、３０‐フラット、及び６０‐フラット）、を行った。投与量レベルが０．５、１．５、及び５μｇ／ｍ2／２４時間の患者コホートは、すべて一番最初から維持投与量で開始した（すなわち、フラットな開始）。
経時での末梢血液中の絶対Ｂ細胞数及びＴ細胞数は、以下に示すように４色ＦＡＣＳ（ｆｏｕｒ ｃｏｌｏｒ ＦＡＣＳ）分析によって測定した。
血液サンプルの採取及びルーチン分析
患者コホート１５‐ランプ、１５‐フラット、３０‐ランプ、３０‐フラット、及び６０‐フラットでは、血液サンプル（６ｍｌ）は、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子（国際公開第９９／５４４４０号に開示）の注入前、及び注入開始後０．７５、２、６、１２、２４、３０、４８時間、さらには治療の第８、１５、１７、２２、２４、２９、３６、４３、５０、５７日、並びに従来のＣＤ１９×ＣＤ３結合分子注入終了の４週間後に、ＥＤＴＡ含有Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）チューブ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて採取し、４℃で分析へ送った。患者コホート１５‐ステップでは、血液サンプル（６ｍｌ）は、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子の注入前、及び注入開始後６、２４、３０、４８時間、さらには治療の第８、１５、２２、２９、３６、４３、５０、５７日、並びにＣＤ１９×ＣＤ３結合分子注入終了の４週間後に採取した。投与量レベル０．５、１．５、及び５μｇ／ｍ2／２４時間では、血液サンプル（６ｍｌ）は、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子の注入前、及び注入開始後６、２４、４８時間、さらには治療の第８、１５、２２、２９、３６、４３、５０、５７日、並びにＣＤ１９×ＣＤ３結合分子注入終了の４週間後に採取した。作業上の理由からこれらの時間点が僅かに変更される場合もあった。リンパ球亜集団のＦＡＣＳ分析は、血液サンプル採取後２４乃至４８時間以内に実施した。血液サンプル中の白血球亜集団の絶対数は、ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｕｎｔｅｒ（商標）（Ｃｏｕｌｔｅｒ）上での分画血液分析（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｂｌｏｏｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって測定した。
血液サンプルからのＰＢＭＣの単離
ＰＢＭＣ（末梢血液単核細胞）の単離は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）勾配分離プロトコルを適合させることで実施した。あらかじめＢｉｏｃｏｌｌ（商標）溶液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）３ｍｌを充填した１０ｍｌのＬｅｕｃｏｓｅｐ（商標）チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）へ血液を室温で移した。遠心分離は、スイングアウトローター（ｓｗｉｎｇ‐ｏｕｔｒｏｔｏｒ）により、１７００×ｇ及び２２℃で１５分間、減速なしで行った。Ｂｉｏｃｏｌｌ（商標）層の上にあるＰＢＭＣを単離し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ／２％ ＦＢＳ［ウシ胎仔血清；Ｂｉｏｃｈｒｏｍ］）で１回洗浄し、遠心分離し、ＦＡＣＳバッファー中へ再懸濁した。すべての洗浄工程における遠心分離は、スイングアウトローターにより、８００×ｇ及び４℃で４分間行った。必要に応じて、単離したＰＢＭＣを３ｍｌの赤血球溶解バッファー（８．２９ｇＮＨ4Ｃｌ、１．００ｇ ＫＨＣＯ3、０．０３７ｇＥＤＴＡ、ａｄ １．０ｌ Ｈ2Ｏbidest、ｐＨ７．５）中にて５分間室温でインキュベートし、続いてＦＡＣＳバッファーで洗浄することにより赤血球の溶解を行った。
細胞表面分子に対する蛍光標識抗体によるＰＢＭＣの染色
モノクローナル抗体をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（1カタログ番号ＭＨＣＤ１３０１、2カタログ番号ＭＨＣＤ１４０１）、Ｄａｋｏ（5カタログ番号Ｃ７２２４）、又はＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ（3カタログ番号５５５５１６、4カタログ番号３４５７６６）より入手し、製造元の推奨事項に従って使用した。５×１０5‐１×１０6個の細胞を以下の抗体の組み合わせによって染色した：抗ＣＤ１３1／抗ＣＤ１４2（ＦＩＴＣ）×抗ＣＤ５６3（ＰＥ）×抗ＣＤ３4（ＰｅｒＣＰ）×抗ＣＤ１９5（ＡＰＣ）。細胞をＶ字型９６ウェルマルチタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中でペレット化し、上清を除去した。細胞のペレットを、ＦＡＣＳバッファーで希釈した特異的な抗体を含む全量１００μｌ中に再懸濁した。インキュベーションを暗所にて４℃で３０分間行った。続いて、ＦＡＣＳバッファーでサンプルを２回洗浄し、フローサイトメトリー分析のために細胞ペレットをＦＡＣＳバッファー中へ再懸濁した。
染色されたリンパ球のＦＡＣＳによるフローサイトメトリー検出
４色ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてデータの収集を行った。各測定について、同定されたリンパ球亜集団の１×１０4個の細胞を得た。プログラムＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて統計的解析を実施することにより、リンパ球亜集団のパーセントを得ると共に、細胞表面分子の発現強度を分類した。続いて、ＦＡＣＳによって測定された全リンパ球（すなわち、ＣＤ１３／１４染色によるいずれの骨髄系細胞も除いたＢプラスＴプラスＮＫ細胞）に対する単一のリンパ球のサブセットのパーセントを分画血液分析からのリンパ球数と相関させることにより、Ｔ細胞（ＣＤ３+、ＣＤ５６-、ＣＤ１３／１４-）及びＢ細胞（ＣＤ１９+、ＣＤ１３／１４-）の絶対細胞数を算出した。
治療開始時に循環するＣＤ１９陽性Ｂ細胞を実質的に持たなかったすべての患者における、従来のＣＤ１９×ＣＤ３結合分子（例：国際公開第９９／５４４４０号に開示）による治療の開始フェーズの間のＴ細胞再分布を（図２３）に示す。比較のために、相当数の循環するＣＤ１９陽性Ｂ細胞を持つ患者における、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子による治療の開始フェーズの間のＴ細胞再分布の代表例を図２６に示す。
いずれの場合でも（すなわち、循環するＢ細胞が実質的に存在しなくても、又は多く存在しても）、循環するＴ細胞数は治療の開始と共に急速に減少する。しかし、循環するＢ細胞が存在しない場合、Ｔ細胞は非常に早い段階で循環血液中に戻る傾向にあり、一方、治療開始時に相当数の循環するＢ細胞を持つ患者の循環血液中へのＴ細胞の戻りは、通常これらの循環するＢ細胞が除去されるまで遅延される。従って、Ｔ細胞再分布のパターンは主として、循環血液中のＴ細胞再出現の動態という点で異なる。
ＣＴスキャンに基づいた効力の評価を、４週間の治療後、及び追加の４週間の治療を受けた患者はさらに８週間の治療後、プラスいずれの場合に対しても治療終了から４週間後に、中央標準放射線医学（ｃｅｎｔｒａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｒａｄｉｏｌｏｇｙ）により実施した。すべての既知の病変（脾腫を含む）の消滅及び／又はサイズの正常化、プラス骨髄浸潤の場合は骨髄中のリンパ腫細胞のクリアランスを完全寛解（ＣＲ）とみなした。ベースラインである既定の各標的病変の２つの最大直径の積の総和（ＳＰＤ）からの少なくとも５０％の減少を部分寛解（ＰＲ）と定義し；少なくとも２５％の減少を最小応答（ＭＲ）と見なした。進行性疾患（ＰＤ）は、ベースラインからのＳＰＤの増加が≧５０％と定義した。ベースラインからのＳＰＤの偏差が＋５０％と−２５％との間である状態を安定疾患（ＳＤ）と見なした。
３４人の患者の患者個体群統計、投与量、及び臨床結果を表４にまとめる。ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子の臨床的抗腫瘍活性は明らかに投与量依存であった。５μｇ／ｍ2／２４時間からそれ以上では、末梢血液からの循環するＣＤ１９陽性Ｂ（リンパ腫）細胞の除去が一貫して観察された。１５μｇ／ｍ2／２４時間及び３０μｇ／ｍ2／２４時間で、最初の他覚的な臨床応答（ＰＲ及びＣＲ）が記録され、さらにはＢリンパ腫細胞が浸潤骨髄から部分的及び完全に除去されるケースもあった。最後に、６０μｇ／ｍ2／２４時間では、応答率は１００％まで上昇し（ＰＲ及びＣＲ）、評価可能なすべてのケースにおいて、骨髄中のＢリンパ腫細胞のクリアランスは完全であった。
ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子は、大部分の患者が十分な耐容性を示した。３４人の患者に最も多く発生したグレード１乃至４の有害イベントを、原因に関わらず表５にまとめる。ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子に関連する有害イベントは、通常は一過性であり完全に回復可能である。特に、実質的に循環するＣＤ１９陽性Ｂ細胞を持たない２人の患者（表４中の患者番号１９及び２４）では、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子注入の開始フェーズの間の繰り返されるＴ細胞再分布と関連するＣＮＳ有害イベント（代表的な症状：錯乱及び見当識障害）のために治療が早期に中止された。
このうちの１人（番号１９）は、コホート１５‐ステップであった。この患者は、最初の２４時間は５μｇ／ｍ2／２４時間のＣＤ１９×ＣＤ３結合分子の投与を受け、続いて１５μｇ／ｍ2／２４時間の維持投与量へ急に増加させた。対応するＴ細胞再分布パターンにより、５μｇ／ｍ2／２４時間での注入の開始と共に循環するＴ細胞数は急速に減少し、続いて、実質的に循環するＣＤ１９陽性Ｂ細胞が存在しない循環血液中にＴ細胞が早期に再出現したことが分かる。結果として、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子の投与量が２４時間後に５から１５μｇ／ｍ2／２４時間へ増加された際には、末梢Ｔ細胞数は完全に回復していた。従って、図２４Ａに示すように、投与工程がＴ細胞再分布の第二のエピソードを引き起こすことが可能であった。この患者では、この繰り返されるＴ細胞再分布はＣＮＳ副作用（代表的な症状：錯乱及び見当識障害）と関連しており、このために注入が中止された。繰り返されるＴ細胞再分布とこのようなＣＮＳ有害イベントとの関係は、各々２乃至４時間のボーラス注入を、通常はこれに続いて２日間の治療を行わない間隔を置いて繰り返すことにより、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子（例：国際公開第９９／５４４４０号に開示）の投与を受けたＢ‐ＮＨＬの患者での過去のフェーズＩ臨床試験でも観察された（図２４Ｂ）。各回のボーラス注入すべてが、循環するＴ細胞数の急速な減少及び次のボーラス注入の前のＴ細胞の回復から成るＴ細胞再分布の１つのエピソードを引き起こした。まとめると、繰り返されるＴ細胞再分布と関連するＣＮＳ有害イベントは、２１人の患者のうち５人で観察された。図２４Ｂは、ボーラス注入試験において、第三のＴ細胞再分布エピソードの後にＣＮＳ症状を発症した１人の患者の代表的な例を示す。通常、ボーラス注入試験においてＣＮＳ有害イベントを起こした患者は、循環するＢ細胞数も低かった。
ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子注入の開始フェーズの間の繰り返されるＴ細胞再分布と関連するＣＮＳ有害イベント（代表的な症状：錯乱及び見当識障害）のために治療が早期に中止された連続注入試験のもう１人の患者（番号２４）は、コホート１５‐フラットであった。手違いにより、この患者は、薬剤の安定化に必要であるＨＳＡが追加されないＣＤ１９×ＣＤ３結合分子の注入を受けた。その結果としての不均一な薬剤の流れによって１回のみではなく繰り返されるＴ細胞再分布のエピソードが引き起こされ（図２７Ａ）、ＣＮＳ症状の発症により注入を中止しなければならない結果となった。しかし、同じ患者で、薬剤の安定化のためのＨＳＡを追加して含有するＣＤ１９×ＣＤ３結合分子溶液（例：国際公開第９９／５４４４０号に開示）により正しく再開したところ、繰り返されるＴ細胞再分布は観察されず、この患者が再度ＣＮＳ症状を発症することはなかった（図２７Ｂ）。この患者も実質的に循環するＢ細胞を有していなかったため、観察されたように、薬剤への曝露の僅かな変化に対してさえも、循環するＴ細胞は急速な再分布動態で反応することが可能であった。実質的に循環する標的細胞を持たない患者におけるＴ細胞再分布と関連するＣＮＳ有害イベントは、内皮細胞へのＴ細胞の接着性の一時的な上昇、それに続く血管壁への循環するＴ細胞の同時発生的な大量の接着、そしてその結果としての観察されたような循環血液中のＴ細胞数の低下によって説明することができる。血管壁へのＴ細胞の同時発生的な大量の接着は、内皮透過性の上昇及び内皮細胞の活性化を引き起こすことができる。内皮透過性の上昇の結果、血管内コンパートメントからＣＮＳ間質を含む間質コンパートメントへ体液が移動する。Ｔ細胞の接着による内皮細胞の活性化は凝血促進効果をもたらすことができ（Ｍｏｎａｃｏｅｔ ａｌ． Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ７１ （２００２） ６５９‐６６８）、血流（脳血流を含む）の乱れを伴うことが、特に毛細血管の微小循環に関して考えられる。従って、実質的に循環する標的細胞を持たない患者におけるＴ細胞再分布と関連するＣＮＳ有害イベントは、Ｔ細胞の内皮細胞への接着による毛細血管漏出及び／又は毛細血管の微小循環の乱れによる結果であり得る。Ｔ細胞再分布の１回のエピソードに起因する内皮ストレス（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｓｔｒｅｓｓ）に対しては、大部分の患者が耐容性を示すが、一方、繰り返されるＴ細胞再分布に起因する高められた内皮ストレスは、ＣＮＳ有害イベントを引き起こすことが多い。Ｔ細胞再分布の２回以上のエピソードは、循環するＴ細胞のベースライン数が低い患者の場合にのみ、そのリスクが低い場合がある。しかし、Ｔ細胞再分布の１回のエピソードに起因する限定的な内皮ストレスも、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子のボーラス注入試験における２１人の患者のうちの１人で観察されたように、このようなイベントに対する感受性の高い稀なケースでは、ＣＮＳ有害イベントを引き起こす場合がある。
理論に束縛されるものではないが、実質的に循環する標的細胞を持たない患者におけるＴ細胞の内皮細胞への接着性の一時的な上昇は、上述のように、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子（例：国際公開第９９／５４４４０号）のような従来のＣＤ３結合分子とそのＣＤ３イプシロン上のコンテクスト依存性エピトープとが一価の相互作用を起こし、その結果ＣＤ３のコンフォメーションがアロステリックに変化し、続いてＣＤ３イプシロンの細胞質ドメインへＮｃｋ２が動員されることに対してＴ細胞が反応することで説明することができる。Ｎｃｋ２はＰＩＮＣＨ及びＩＬＫ（図２８）を介してインテグリンと直接結合していることから、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子のような従来のＣＤ３結合分子とそのＣＤ３イプシロン上のコンテクスト依存性エピトープとの結合を通してのＣＤ３のコンフォメーションのアロステリックな変化に続いてＣＤ３イプシロンの細胞質ドメインへＮｃｋ２が動員されると、内側からのシグナル伝達を通してＴ細胞表面上のインテグリンがより接着性の高いアイソフォームへと一時的に変換され、Ｔ細胞の内皮細胞への接着性を高めることができる。
*太字は、中央で確認されたチェソン基準（Ｃｈｅｓｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ）による完全寛解（ＣＲ）及び部分寛解（ＰＲ）；ＭＲ、最小応答（≧２５乃至＜５０％）；ＳＤ、安定疾患；ＰＤ、進行性疾患；カッコ内は最初の応答の記録からの期間；＋は進行中の応答を表す。
aコホート４は、３種類の異なる治療開始スケジュールの研究のために拡大した。
b８週間の治療後はＰＲであるが、治療を行わない７週間の間隔を空けた後、同一の投与量での４週間の追加の治療サイクル後にＣＲとなった。
ｎ．ｅ．：治療期間が７日未満のため評価不可。
ｎ．ｄ．：測定せず（浸潤していたが、治療の最後に第二の生検を実施せず）。
ｎ．ｉ．：治療開始時に浸潤していなかった。
用いた略号は：ＡＥ、有害イベント；ＡＰ、アルカリホスファターゼ；ＬＤＨ、乳酸デヒドロゲナーゼ；ＣＲＰ、Ｃ反応性タンパク質；ＡＬＴ、アラニントランスアミナーゼ；ＡＳＴ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ；ＧＧＴ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼであり；患者３４の追加の治療サイクルからのＡＥデータはまだ含まれていない。
上記で説明したように、コンテクスト依存性エピトープと結合する能力を有する従来のＣＤ３結合分子（例：国際公開第９９／５４４４０号に開示）は、機能的ではあるが、患者にＴ細胞再分布という望ましくない作用を引き起こし、ＣＮＳ有害イベントの原因となる。対照的に、本発明の結合分子は、ＣＤ３イプシロン鎖のコンテクスト非依存性Ｎ末端アミノ酸１‐２７と結合することにより、そのようなＴ細胞再分布作用を引き起こさない。結果として、本発明のＣＤ３結合分子は、従来のＣＤ３結合分子と比較して、より安全性の高いプロファイルを伴う。
２１．表面標的抗原を認識することによってＴ細胞媒介標的細胞溶解を誘発する本発明の二重特異性ＣＤ３結合分子は、インビボにて標的抗原陽性細胞を除去する。
標的抗原としてＣＤ３３を認識する本発明の二重特異性ＣＤ３結合分子は、カニクイザルの末梢血液から循環するＣＤ３３陽性単球を除去する。
ＣＤ３３‐ＡＦ５ ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬ（アミノ酸配列：配列番号４１５）を、配列番号４１６のコードヌクレオチド配列を用いたＣＨＯ細胞内での発現によって産生させた。（ｉ）コザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列内に埋め込まれた開始コドンを含むＮ末端免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、及び（ｉｉ）停止コドンが続くＣ末端Ｈｉｓ6タグのコード配列の両方を、配列番号４１６のヌクレオチド配列へフレームを揃えて結合し、その後、遺伝子合成によって得られたこのＤＮＡ断片を発現ベクターｐＥＦ‐ＤＨＦＲのマルチクローニング部位へ挿入した（Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０）。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞の安定なトランスフェクション、ＣＤ３結合分子ＣＤ３３‐ＡＦ５ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬを培養物の上清中へ分泌するＤＨＦＲ陽性トランスフェクタントの選択、及び発現レベルを高めるためのメトトレキサートによる遺伝子増幅は記述（Ｍａｃｋｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ （１９９５） ７０２１‐７０２５）に従って実施した。カニクイザルの処理のための試験物質は、２０リットルの発酵槽中で作製した。３回の作製工程の回収物からのタンパク質精製は、ＣＤ３３‐ＡＦ５ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬのＣ末端Ｈｉｓ６タグを標的とするＩＭＡＣアフィニティクロマトグラフィ、及びこれに続く分取用分子ふるいクロマトグラフィ（ＳＥＣ）に基づいて行った。最終的な内毒素を含まない試験物質の総収量は６０ｍｇであった。カニクイザルに使用するためのＣＤ３３‐ＡＦ５ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの分析用ＳＥＣプロファイルより、この試験物質がほとんど単量体のみから構成されていることが分かった。この試験物質の効力は、カニクイザルＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として、マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞源として用いた実施例２３．５で述べる細胞障害性アッセイにより測定した（図２９）。エフェクターＴ細胞による標的細胞溶解の最大半減に要するＣＤ３３‐ＡＦ５ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの濃度（ＥＣ５０）は、２．７ｎｇ／ｍｌであると測定された。
若年（およそ３歳）の成体カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を、種々の流量（すなわち投与量レベル）によるＣＤ３結合分子ＣＤ３３‐ＡＦ５ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの連続静脈内注入によって処理し、循環するＣＤ３３陽性単球の末梢血液からの除去を調べた。この状況は、循環するＣＤ１９陽性標的Ｂ細胞を持つＢ‐ＮＨＬ患者を従来のＣＤ３結合分子ＣＤ１９×ＣＤ３（Ｂ細胞上のＣＤ１９及びＴ細胞上のＣＤ３に特異的）で治療するものと同等である（例えば、国際公開第９９／５４４４０号を参照）。末梢血液からの循環するＣＤ１９陽性標的Ｂ細胞の除去は、Ｂ‐ＮＨＬのようなＣＤ１９陽性Ｂ細胞マリグノーマ（ｍａｌｉｇｎｏｍａｓ）を持つ患者における従来のＣＤ３結合分子（国際公開第９９／５４４４０号に記載のＣＤ１９×ＣＤ３）の一般的な臨床効果に対する有効なサロゲートであることが分かっている。同様に、循環するＣＤ３３陽性単球の末梢血液からの除去は、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）のようなＣＤ３３陽性骨髄性マリグノーマを持つ患者におけるＣＤ３３‐ＡＦ５ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬのような本発明のＣＤ３３指向性二重特異性ＣＤ３結合分子の一般的な臨床効果に対する有効なサロゲートであると見なされる。
連続注入は、Ｓｗｉｖｅｌ法に従い以下のようにして実施した：サルを、静脈カテーテルを用いて大腿静脈を通して尾側大静脈へカテーテル処理する。カテーテルを、背側の肩領域まで皮下を通し、尾側の肩甲骨で外へ出す。次に、チューブをジャケット及び保護スプリングに通す。ジャケットを動物の周りに固定し、カテーテルをチューブを経由して注入ポンプへ接続する。
試験物質を含まない投与溶液（１．２５Ｍ リジン、０．１％ ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７）を処理開始前の７日間、４８ｍｌ／２４時間で連続的に注入し、動物を注入条件に順応させた。処理は、試験物質ＣＤ３３‐ＡＦ５ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬを、試験すべき個々の各投与量レベルに要する量（すなわち、ＣＤ３３‐ＡＦ５ ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの流量）で投与溶液へ添加することで開始した。注入リザーバーは、順応及び処理の全フェーズを通して毎日取り替えた。予定された処理期間は７日間であったが、ただし、１２０μｇ／ｍ2／２４時間の投与量レベルについては動物に１４日間の処理を受けさせた。
循環するＴ細胞及びＣＤ３３陽性単球の絶対数の経時変化は、それぞれ４色又は３色ＦＡＣＳ分析によって測定した。
血液サンプルの採取及びルーチン分析
血液サンプル（１ｍｌ）は、ＭＣＳＰ‐Ｇ４ ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの連続注入前、及び注入開始後０．７５、２、６、１２、２４、３０、４８、７２時間、並びに７及び１４日間の処理の後（及び、１２０μｇ／ｍ2／２４時間の投与量レベルでは９日間の処理の後）に、ＥＤＴＡ含有Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて採取し、４℃で分析へ送った。作業上の理由からこれらの時間点が僅かに変更される場合もあった。リンパ球亜集団のＦＡＣＳ分析は、血液サンプル採取後２４乃至４８時間以内に実施した。血液サンプル中の白血球亜集団の絶対数は、通常の獣医学研究室にて分画血液分析によって測定した。
血液サンプルからのＰＢＭＣの単離
ＰＢＭＣ（末梢血液単核細胞）の単離は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）勾配分離プロトコルを適合させることで実施した。あらかじめＢｉｏｃｏｌｌ（商標）溶液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）１ｍｌを充填した５ｍｌのＦａｌｃｏｎ（商標）チューブへ血液を室温で移した。遠心分離は、スイングアウトローターにより、１７００×ｇ及び２２℃で１５分間、減速なしで行った。Ｂｉｏｃｏｌｌ（商標）層の上にあるＰＢＭＣを単離し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ／２％ＦＢＳ［ウシ胎仔血清；Ｂｉｏｃｈｒｏｍ］）で１回洗浄し、遠心分離し、ＦＡＣＳバッファー中へ再懸濁した。すべての洗浄工程における遠心分離は、スイングアウトローターにより、８００×ｇ及び４℃で４分間行った。必要に応じて、単離したＰＢＭＣを３ｍｌの赤血球溶解バッファー（８．２９ｇＮＨ4Ｃｌ、１．００ｇ ＫＨＣＯ3、０．０３７ｇＥＤＴＡ、ａｄ １．０ｌ Ｈ2Ｏbidest、ｐＨ７．５）中にて５分間室温でインキュベートし、続いてＦＡＣＳバッファーで洗浄することにより赤血球の溶解を行った。
細胞表面分子に対する蛍光標識抗体によるＰＢＭＣの染色
カニクイザル抗原と反応性を持つモノクローナル抗体をＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（1カタログ番号３４５７８４、2カタログ番号５５６６４７、3カタログ番号５５２８５１、6カタログ番号５５７７１０）、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ（4カタログ番号ＩＭ２４７０）、及びＭｉｌｔｅｎｙｉ（5カタログ番号１３０‐０９１‐７３２）より入手し、製造元の推奨事項に従って使用した。５×１０5‐１×１０6個の細胞を以下の抗体の組み合わせによって染色した：抗ＣＤ１４1（ＦＩＴＣ）×抗ＣＤ５６2（ＰＥ）×抗ＣＤ３3（ＰｅｒＣＰ）×抗ＣＤ１９4（ＡＰＣ）、及び抗ＣＤ１４1（ＦＩＴＣ）×抗ＣＤ３３5（ＰＥ）×抗ＣＤ１６6（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（商標））。細胞をＶ字型９６ウェルマルチタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中でペレット化し、上清を除去した。細胞のペレットを、ＦＡＣＳバッファーで希釈した特異的な抗体を含む全量１００μｌ中に再懸濁した。インキュベーションを暗所にて４℃で３０分間行った。続いて、ＦＡＣＳバッファーでサンプルを２回洗浄し、フローサイトメトリー分析のために細胞ペレットをＦＡＣＳバッファー中へ再懸濁した。
染色されたリンパ球のＦＡＣＳによるフローサイトメトリー検出
４色ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてデータの収集を行った。各測定について、同定されたリンパ球亜集団の１×１０4個の細胞を得た。プログラムＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて統計的解析を実施することにより、リンパ球亜集団のパーセントを得ると共に、細胞表面分子の発現強度を分類した。続いて、ＦＡＣＳによって測定された全リンパ球（すなわち、ＣＤ１４染色による骨髄系細胞を除いたＢプラスＴプラスＮＫ細胞）に対する単一のリンパ球のサブセットのパーセントを分画血液分析からのリンパ球数と相関させることにより、Ｔ細胞（ＣＤ３+、ＣＤ５６-、ＣＤ１４-）の絶対細胞数を算出した。ＣＤ３３陽性単球の絶対数は、分画血液分析からの単球数を、ＦＡＣＳによって測定された全単球（ＣＤ１４+）に対するＣＤ３３陽性単球（ＣＤ３３+、ＣＤ１４+）の対応する比と掛け合わせることによって算出した。
２匹のカニクイザルの４つのコホートにてコホート間の投与量の増加を３０から６０及び２４０を通して１０００μｇ／ｍ2／２４時間までとしたＣＤ３３‐ＡＦ５ ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬによる処理終了時のベースライン（すなわち１００％）と比較した循環するＣＤ３３陽性単球の絶対数のパーセントを図３０Ａに示す。
図３０Ａに示すように、ＣＤ３３‐ＡＦ５ ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの連続静脈内注入により、循環するＣＤ３３陽性単球の除去が投与量に依存する形で誘発されている。３０μｇ／ｍ2／２４時間では循環するＣＤ３３陽性単球の除去はまだ検出可能ではなかったが、ＣＤ３３陽性単球数の減少へ向かう最初の傾向は、６０μｇ／ｍ2／２４時間での７日間の処理後に明らかとなった。２４０μｇ／ｍ2／２４時間では、循環するＣＤ３３陽性単球は、３日間の処理後に末梢血液からほぼ完全に除去された。１０００μｇ／ｍ2／２４時間ではさらに素早くそこまで到達しており、循環するＣＤ３３陽性単球の末梢血液からの除去は、１日の処理後にすでに完了していた。この発見は、ＣＤ３３‐ＡＦ５ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬを１２０μｇ／ｍ2／２４時間で１４日間連続注入して処理した２匹のカニクイザルにおいて、循環するＣＤ３３陽性単球がそれぞれの対応するベースラインと比較して３分の２及び５０％除去されたことを示す図３０Ｂの結果によって確認された。
この結果は、特にＡＭＬのようなＣＤ３３陽性マリグノーマの治療に対して、本発明のＣＤ３結合分子全般の、及び本発明の二重特異性ＣＤ３３指向性ＣＤ３結合分子の臨床効果を明らかに示すものである。さらに、循環する標的細胞（すなわち、ＣＤ３３陽性単球）の存在下でのＣＤ３３‐ＡＦ５ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬによる治療の開始フェーズの間のＴ細胞再分布は、図２６に示す相当数の循環する標的細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞）を持つＢ‐ＮＨＬ患者における国際公開第９９／５４４４０号に記載の従来のＣＤ１９×ＣＤ３コンストラクトによる治療の開始フェーズの間のＴ細胞再分布と比べてそれほど明白ではないように思われる。ＣＤ１９×ＣＤ３の注入の開始と共に循環からＴ細胞が完全に消滅し、末梢血液から循環するＣＤ１９陽性標的Ｂ細胞が除去されるまで再出現しないのに対し（図２６）、ＣＤ３３‐ＡＦ５ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬによる注入の開始時の循環するＴ細胞の最初の消滅は不完全であり、循環するＣＤ３３陽性標的細胞の存在下ですでにＴ細胞数は回復している（図３０Ｂ）。このことから、本発明のＣＤ３結合分子（ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε（イプシロン）鎖のエピトープに対して指向され、作製され、配列番号２、４、６、若しくは８で提供されるアミノ酸配列の一部、又は断片、又は完全長である）は、コンテクスト非依存性ＣＤ３エピトープを認識することによって、国際公開第９９／５４４４０号で提供される結合分子のようなコンテクスト依存性ＣＤ３エピトープを認識する従来のＣＤ３結合分子よりも有利なＴ細胞再分布プロファイルを示すことが確認される。
２２．実質的にコンテクスト非依存性ＣＤ３エピトープに指向される本発明のＣＤ３結合分子は、循環する標的細胞の非存在下にて循環するＴ細胞の再分布の低減を誘発することにより、治療の開始と関連する有害イベントのリスクを低下させる。
本発明の代表的な種間特異的ＣＤ３結合分子による処理の開始に続くカニクイザルにおけるＴ細胞再分布の低減
ＭＣＳＰ‐Ｇ４ ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬ（アミノ酸配列：配列番号３１３）を、配列番号３１４のコードヌクレオチド配列を用いたＣＨＯ細胞内での発現によって産生させた。（ｉ）コザックコンセンサス配列内に埋め込まれた開始コドンを含むＮ末端免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、及び（ｉｉ）停止コドンが続くＣ末端Ｈｉｓ６タグのコード配列の両方を、配列番号３１４のヌクレオチド配列へフレームを揃えて結合し、その後、遺伝子合成によって得られたこのＤＮＡ断片を発現ベクターｐＥＦ‐ＤＨＦＲのマルチクローニング部位へ挿入した（Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０）。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞の安定なトランスフェクション、ＣＤ３結合分子ＭＣＳＰ‐Ｇ４ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬを培養物の上清中へ分泌するＤＨＦＲ陽性トランスフェクタントの選択、及び発現レベルを高めるためのメトトレキサートによる遺伝子増幅は記述（Ｍａｃｋｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ （１９９５） ７０２１‐７０２５）に従って実施した。カニクイザルの処理のための試験物質は、２００リットルの発酵槽中で作製した。回収物からのタンパク質精製は、ＭＣＳＰ‐Ｇ４ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬのＣ末端Ｈｉｓ６タグを標的とするＩＭＡＣアフィニティクロマトグラフィ、及びこれに続く分取用分子ふるいクロマトグラフィ（ＳＥＣ）に基づいて行った。最終的な内毒素を含まない試験物質の総収量は４０ｍｇであった。この試験物質は、７０％の単量体、３０％の二量体、及び少量混入したこれより高い多量体から構成されていた。この試験物質の効力は、カニクイザルＭＣＳＰでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として、マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞源として用いた実施例１８で述べる細胞障害性アッセイにより測定した（図３１）。エフェクターＴ細胞による標的細胞溶解の最大半減に要するＭＣＳＰ‐Ｇ４ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの濃度（ＥＣ５０）は、１．９ｎｇ／ｍｌであると測定された。
若年（およそ３歳）の成体カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を、種々の流量（すなわち投与量レベル）によるＣＤ３結合分子ＭＣＳＰ‐Ｇ４ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの連続静脈内注入によって処理し、循環する標的細胞の非存在下での処理の開始に続く循環するＴ細胞の再分布を調べた。ＣＤ３結合分子ＭＣＳＰ‐Ｇ４ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬはカニクイザルＭＣＳＰ及びカニクイザルＣＤ３の両方を認識することができるが、ＭＣＳＰを発現する循環する血液細胞は存在しない。従って、循環血液中での考えられる唯一の相互作用は、ＭＣＳＰ‐Ｇ４ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬのＣＤ３特異的アームとＴ細胞上のＣＤ３との結合である。この状況は、実施例２０で述べるように、循環するＣＤ１９陽性標的Ｂ細胞を持たないＢ‐ＮＨＬ患者を従来のＣＤ３結合分子（Ｂ細胞上のＣＤ１９及びＴ細胞上のＣＤ３に特異的なＣＤ１９×ＣＤ３）で治療するものと同等である。
連続注入は、Ｓｗｉｖｅｌ法に従い以下のようにして実施した：サルを、静脈カテーテルを用いて大腿静脈を通して尾側大静脈へカテーテル処理する。カテーテルを、背側の肩領域まで皮下を通し、尾側の肩甲骨で外へ出す。次に、チューブをジャケット及び保護スプリングに通す。ジャケットを動物の周りに固定し、カテーテルをチューブを経由して注入ポンプへ接続する。
試験物質を含まない投与溶液（１．２５Ｍ リジン、０．１％ ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７）を処理開始前の７日間、４８ｍｌ／２４時間で連続的に注入し、動物を注入条件に順応させた。処理は、試験物質ＭＣＳＰ‐Ｇ４ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬを、試験すべき個々の各投与量レベルに要する量（すなわち、ＭＣＳＰ‐Ｇ４ ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの流量）で投与溶液へ添加することで開始した。注入リザーバーは、順応及び処理の全フェーズを通して毎日取り替えた。処理期間は７日間とした。
末梢血液中の絶対Ｔ細胞数の経時変化は、以下のように４色ＦＡＣＳ分析によって測定した。
血液サンプルの採取及びルーチン分析
血液サンプル（１ｍｌ）は、ＭＣＳＰ‐Ｇ４ ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬの連続注入前、及び注入開始後０．７５、２、６、１２、２４、３０、４８、７２時間、並びに７日間の処理の後に、ＥＤＴＡ含有Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）チューブ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて採取し、４℃で分析へ送った。作業上の理由からこれらの時間点が僅かに変更される場合もあった。リンパ球亜集団のＦＡＣＳ分析は、血液サンプル採取後２４乃至４８時間以内に実施した。血液サンプル中の白血球亜集団の絶対数は、通常の獣医学研究室にて分画血液分析によって測定した。
血液サンプルからのＰＢＭＣの単離
ＰＢＭＣ（末梢血液単核細胞）の単離は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）勾配分離プロトコルを適合させることで実施した。あらかじめＢｉｏｃｏｌｌ（商標）溶液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）１ｍｌを充填した５ｍｌのＦａｌｃｏｎ（商標）チューブへ血液を室温で移した。遠心分離は、スイングアウトローターにより、１７００×ｇ及び２２℃で１５分間、減速なしで行った。Ｂｉｏｃｏｌｌ（商標）層の上にあるＰＢＭＣを単離し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ／２％ＦＢＳ［ウシ胎仔血清；Ｂｉｏｃｈｒｏｍ］）で１回洗浄し、遠心分離し、ＦＡＣＳバッファー中へ再懸濁した。すべての洗浄工程における遠心分離は、スイングアウトローターにより、８００×ｇ及び４℃で４分間行った。必要に応じて、単離したＰＢＭＣを３ｍｌの赤血球溶解バッファー（８．２９ｇＮＨ4Ｃｌ、１．００ｇ ＫＨＣＯ3、０．０３７ｇＥＤＴＡ、ａｄ １．０ｌ Ｈ2Ｏbidest、ｐＨ７．５）中にて５分間室温でインキュベートし、続いてＦＡＣＳバッファーで洗浄することにより赤血球の溶解を行った。
細胞表面分子に対する蛍光標識抗体によるＰＢＭＣの染色
カニクイザル抗原との反応性を持つモノクローナル抗体をＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（1カタログ番号３４５７８４、2カタログ番号５５６６４７、3カタログ番号５５２８５１）、及びＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（4カタログ番号ＩＭ２４７０）より入手し、製造元の推奨事項に従って使用した。５×１０5‐１×１０6個の細胞を以下の抗体の組み合わせによって染色した：抗ＣＤ１４1（ＦＩＴＣ）×抗ＣＤ５６2（ＰＥ）×抗ＣＤ３3（ＰｅｒＣＰ）×抗ＣＤ１９4（ＡＰＣ）。細胞をＶ字型９６ウェルマルチタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中でペレット化し、上清を除去した。細胞のペレットを、ＦＡＣＳバッファーで希釈した特異的抗体を含む全量１００μｌ中に再懸濁した。インキュベーションを暗所にて４℃で３０分間行った。続いて、ＦＡＣＳバッファーでサンプルを２回洗浄し、フローサイトメトリー分析のために細胞ペレットをＦＡＣＳバッファー中へ再懸濁した。
染色されたリンパ球のＦＡＣＳによるフローサイトメトリー検出
４色ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてデータの収集を行った。各測定について、同定されたリンパ球亜集団の１×１０4個の細胞を得た。プログラムＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて統計的解析を実施することにより、リンパ球亜集団のパーセントを得ると共に、細胞表面分子の発現強度を分類した。続いて、ＦＡＣＳによって測定された全リンパ球（すなわち、ＣＤ１４染色による骨髄系細胞を除いたＢプラスＴプラスＮＫ細胞）に対する単一のリンパ球のサブセットのパーセントを分画血液分析からのリンパ球数と相関させることにより、Ｔ細胞（ＣＤ３+、ＣＤ５６-、ＣＤ１４-）の絶対細胞数を算出した。
カニクイザルを６０、２４０、及び１０００μｇ／ｍ2／２４時間の投与量レベルのＭＣＳＰ‐Ｇ４ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬで処理した際の開始フェーズの間のＴ細胞再分布を図３２に示す。これらの動物は、処理の開始フェーズの間のＴ細胞再分布は全く示さず、すなわち、Ｔ細胞数は、処理の開始と共に減少するどころかむしろ増加した。循環する標的細胞を持たない全患者の１００％で、コンテクスト依存性ＣＤ３エピトープに対する従来のＣＤ３結合分子（例：国際公開第９９／５４４４０号に記載のＣＤ１９×ＣＤ３コンストラクト）での治療開始時にＴ細胞再分布が一貫して観察されることを考えると、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン鎖に対して指向され作製された配列番号２、４、６、若しくは８のいずれか１つ、又はこれらの断片のアミノ酸配列で定義される本発明のＣＤ３結合分子により、循環する標的細胞の非存在下において治療開始時に非常に低いＴ細胞再分布を観察することができることが実証された。これは、国際公開第９９／５４４４０号に記載のコンストラクトのようなコンテクスト依存性ＣＤ３エピトープに対して指向されたＣＤ３結合分子とは明らかに対照的である。（とりわけ）配列番号２、４、６、若しくは８のいずれか１つ（又はこれらの配列の断片）で与えられるコンテクスト非依存性ＣＤ３エピトープに対する結合分子が、（有害で望ましくない）Ｔ細胞再分布のこの著しい低下をもたらす。ＣＤ３結合分子による治療の開始フェーズの間のＴ細胞再分布はＣＮＳ有害イベントの主たるリスク因子であることから、本明細書で提供されコンテクスト非依存性ＣＤ３エピトープを認識する能力を有するＣＤ３結合分子は、本技術分野で公知でありコンテクスト依存性ＣＤ３エピトープに対して指向されるＣＤ３結合分子に対して優れる大きな利点を持つ。実際、ＭＣＳＰ‐Ｇ４ＶＨ‐ＶＬ×Ｉ２Ｃ ＶＨ‐ＶＬで処理したカニクイザルでＣＮＳ症状の徴候を示したものはなかった。
ＣＤ３エピトープのコンテクスト非依存性は本発明で提供され、ＣＤ３イプシロン）の最初のＮ末端の２７アミノ酸、又はこの２７アミノ酸の範囲の断片に対応する。このコンテクスト非依存性エピトープはＣＤ３複合体内の自然の環境から取り出され、その構造の完全性を失うことなく異種アミノ酸配列へ融合される。本明細書で提供され、コンテクスト非依存性ＣＤ３エピトープに対して作製（及び指向）された抗ＣＤ３結合分子は、Ｔ細胞再分布に関して驚くべき臨床的な改善を、従って、より有利な安全性プロファイルをもたらす。理論に束縛されるものではないが、そのＣＤ３エピトープがコンテクスト非依存性であり、ＣＤ３複合体の残りの部分に大きな影響を与えることなく自律的で自己充足的であるサブドメインを形成することから、本明細書で提供するＣＤ３結合分子は、国際公開第９９／５４４４０号で提供される分子のようにコンテクスト依存性ＣＤ３エピトープを認識する従来のＣＤ３結合分子（国際公開第９９／５４４４０号で提供される分子のような）と比べてそれ程のＣＤ３コンフォメーションのアロステリックな変化を誘発しない。結果として（やはり理論に束縛されるものではないが）、本明細書で提供されるＣＤ３結合分子による細胞内ＮｃＫ２動員の誘発も低減され、その結果Ｔ細胞インテグリンのアイソフォームへの変換が減少し、内皮細胞へのＴ細胞の接着も低下する。本発明のＣＤ３結合分子の製剤（本明細書で定義するコンテクスト非依存性エピトープに対して指向され作製された）は、実質的に単量体分子から成ることが好ましい。このような単量体分子は、Ｔ細胞再分布の回避、従って治療の開始フェーズの間のＣＮＳ有害イベントのリスクの回避においてさらにより効率的（二量体又は多量体分子と比べて）である。
２３．ＣＤ３３及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の作製並びに同定
２３．１ ヒトＣＤ３３を発現するＣＨＯ細胞の作製
ＧｅｎＢａｎｋ（受託番号ＮＭ＿００１７７２）で公開されているヒトＣＤ３３のコード配列は、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位（Ｋｏｚａｋｓｉｔｅ）を含み、続いて１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて成熟ヒトＣＤ３３タンパク質のコード配列を、続いてフレームを揃えてセリングリシンジペプチドのコード配列、ヒスチジン6‐タグ、及び停止コドンを含むように設計した（コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を配列番号５２５及び５２６に挙げる）。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、５'末端にはＥｃｏＲＩ及び３'末端にはＳａｌＩであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩを介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
２３．２ マカクＣＤ３３の細胞外ドメインを発現するＣＨＯ細胞の作製
マカクＣＤ３３のｃＤＮＡ配列は、標準的なプロトコルに従って調製したマカクザル骨髄からのｃＤＮＡに３回のＰＣＲをセットで施すことによって得た。以下の反応条件：９４℃で３分間の１サイクル、続いて９４℃で１分間、５３℃で１分間、及び７２℃で２分間の３５サイクル、続いて７２℃で３分間の最終サイクル、を用い、並びに以下のプライマー：
３．フォワードプライマー：５'‐ｇａｇｇａａｔｔｃａｃｃａｔｇｃｃｇｃｔｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｃｔｇｃｃｃｃｔｇｃｔｇｔｇｇｇｃａｇｇｇｇｃｃｃｔｇｇｃｔａｔｇｇ‐３'
リバースプライマー：５'‐ｇａｔｔｔｇｔａａｃｔｇｔａｔｔｔｇｇｔａｃｔｔｃｃ‐３'
４．フォワードプライマー：５'‐ａｔｔｃｃｇｃｃｔｃｃｔｔｇｇｇｇａｔｃｃ‐３'
リバースプライマー：５'‐ｇｃａｔａｇｇａｇａｃａｔｔｇａｇｃｔｇｇａｔｇｇ‐３'５．フォワードプライマー：５'‐ｇｃａｃｃａａｃｃｔｇａｃｃｔｇｔｃａｇｇ‐３'
リバースプライマー：５'‐ａｇｔｇｇｇｔｃｇａｃｔｃａｃｔｇｇｇｔｃｃｔｇａｃｃｔｃｔｇａｇｔａｔｔｃｇ‐３'
を用いた。
これらのＰＣＲによって３個のオーバーラップ断片が作製され、これらを標準的なプロトコルに従ってＰＣＲプライマーを用いて単離及び配列決定し、それによって、成熟タンパク質のコドン＋２の二番目のヌクレオチドからコドン＋３４０の三番目のヌクレオチドまでのマカクＣＤ３３のｃＤＮＡ配列の部分を得た。マカクＣＤ３３の発現のためのコンストラクトを作製するために、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によってｃＤＮＡ断片を得た（コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を配列番号５２７及び５２８に挙げる）。このコンストラクトでは、成熟ＣＤ３３タンパク質のアミノ酸＋３から＋３４０までのマカクＣＤ３３のコード配列が、アミノ酸＋３から＋３４０までのヒトのコード配列を置換する形でヒトＣＤ３３のコード配列へ融合された。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位、並びに実質的にマカクＣＤ３３の全細胞外ドメイン、マカクＣＤ３３膜貫通ドメイン、及びマカク‐ヒトキメラ細胞内ＣＤ３３ドメインをコードするｃＤＮＡを含む断片の最初と最後に制限部位を含むようにも設計した。導入された制限部位は、５'末端にはＸｂａＩ及び３'末端にはＳａｌＩであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は次に、ＸｂａＩ及びＳａｌＩを介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへクローン化した。上述のように、このプラスミドの配列が確認されたクローンを用いて、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞をトランスフェクトした。
２３．３ ＣＤ３３及びＣＤ３種間特異的二重特異性抗体分子の作製
種間特異的結合分子のクローン化
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３３に対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性抗体分子を、以下の表６に挙げるように設計した。
ヒト及びマカクＣＤ３３に対して種間特異的である可変軽鎖（Ｌ）及び可変重鎖（Ｈ）ドメイン、並びにヒト及びマカクＣＤ３に対して種間特異的であるＣＤ３特異的ＶＨ及びＶＬの組み合わせを含む前記のコンストラクトを、遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて対応する二重特異性抗体分子のコード配列を、続いてフレームを揃えてヒスチジン6‐タグのコード配列及び停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に適切な制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位を介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
二重特異性抗体分子の発現及び精製二重特異性抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）中で発現させる。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中の真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、２０ｎＭ ＭＴＸの最終濃度まで増加する濃度のＭＴＸを添加することによって誘発した。２継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないＨｙＱＰＦ ＣＨＯ液体大豆培地（０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ‐６８含有Ｌ‐グルタミン ４．０ｍＭを含む；ＨｙＣｌｏｎｅ）により、ローラーボトル中、回収まで７日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−２０℃で保存した。別の選択肢として、コンストラクトを一過性にＨＥＫ２９３細胞中で発現させた。トランスフェクションは、２９３ｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１２３４７‐０１９）を用い、製造元のプロトコルに従って実施した。
クロマトグラフィにはＡｋｔａ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた。ＺｎＣｌ2を充填したＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ Ｃｈｅｌａｔｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を用い、製造元が提供するプロトコルに従って固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（「ＩＭＡＣ」）を実施した。バッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ）でカラムを平衡状態とし、細胞培養物の上清（５００ｍｌ）を流速３ｍｌ／分でカラム（１０ｍｌ）に適用した。バッファーＡでカラムを洗浄して非結合サンプルを除去した。結合したタンパク質を、バッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ イミダゾール）の以下に示す２段階の勾配：
段階１：６カラム分の容量の２０％バッファーＢ
段階２：６カラム分の容量の１００％バッファーＢ
を用いて溶離させた。段階２からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Ｓｉｇｍａ（ダイゼンホッフェン）又はＭｅｒｃｋ（ダルムシュタット）より購入した。
ゲル濾過クロマトグラフィを、平衡バッファー（Ｅｑｕｉ‐ｂｕｆｆｅｒ）（２５ｍＭ クエン酸塩、２００ｍＭ リジン、５％ グリセロール、ｐＨ７．２）で平衡状態としたＨｉＬｏａｄ１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ 分取グレードカラム（ＧＥ／アマーシャム）上で実施した。溶離したタンパク質サンプル（流速１ｍｌ／分）を標準的なＳＤＳ‐ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによる検出に掛けた。精製の前に、分子量測定のためにカラムを校正した（分子量マーカーキット、ＳｉｇｍａＭＷ ＧＦ‐２００）。タンパク質濃度は、ＯＤ２８０ｎｍを用いて測定した。
精製した二重特異性抗体タンパク質は、還元性条件下、４‐１２％ビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプレキャストしたＳＤＳＰＡＧＥで分析した。サンプルの調製及び適用は製造元が提供するプロトコルに従って実施した。分子量はＭｕｌｔｉＭａｒｋタンパク質スタンダード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて決定した。ゲルの染色にはコロイド状クーマシーを用いた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコル）。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって測定された単離したタンパク質の純度は＞９５％である。
ＰＢＳ中のゲル濾過によって測定する自然条件下での二重特異性抗体の分子量は約５２ｋＤａである。コンストラクトはすべてこの方法に従って精製した。
ウエスタンブロットは、Ｏｐｔｉｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ‐Ｓ８３膜及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅを用い、製造元が提供するプロトコルに従って実施した。二重特異性抗体タンパク質抗体の検出には、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いた（ＰｅｎｔａＨｉｓ，Ｑｉａｇｅｎ）。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）で標識したヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）を二次抗体として用い、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）を基質として用いた。精製された二重特異性抗体に対応する５２ｋＤに単一のバンドを検出した。
２３．４ ＣＤ３３及びＣＤ３種間特異的二重特異性抗体のフローサイトメトリー結合分析
ヒト及びマカクＣＤ３３並びにＣＤ３のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、ＦＡＣＳ分析を実施した。この目的のために、実施例２３．１で述べるようにヒトＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ（ＤＳＭＺ，ブラウンシュバイク，ＡＣＣ４８３）を用いてヒト抗原への結合について試験した。マカク抗原に対する結合反応性は、実施例２３．２で述べる作製されたマカクＣＤ３３トランスフェクタント、及びマカクＰＢＭＣ（マカクＰＢＭＣの調製は、標準的なプロトコルに従い、マカクザルからの末梢血液のＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によって行った）を用いて試験した。ＰＢＭＣのそれぞれの細胞株の２００，０００個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト（５μｇ／ｍｌ）の精製タンパク質５０μｌと共に、又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共に、３０分間氷上にてインキュベートした。細胞を２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ抗体（ＰｅｎｔａＨｉｓ抗体；Ｑｉａｇｅｎ；２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中にて１：２０に希釈）でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗Ｈｉｓ抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで１：１００に希釈したフィコエリトリンに結合したＦｃガンマ特異的抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）で検出した。トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清をネガティブコントロールとして用いた。
フローサイトメトリーはＦＡＣＳ‐Ｃａｌｉｂｕｒ装置上で実施し；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ハイデルベルク）。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のようにして実施した。
本発明のＣＤ３結合分子のヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３との特異的結合は、図３３に示すように明らかに検出可能であった。ＦＡＣＳ分析では、対応するネガティブコントロールと比較して、すべてのコンストラクトがＣＤ３及びＣＤ３３への結合を示している。二重特異性抗体のヒト及びマカクＣＤ３並びにＣＤ３３抗原への種間特異性が実証される。
２３．５ ＣＤ３３及びＣＤ３種間特異的二重特異性抗体の生物活性
作製された二重特異性抗体の生物活性を、実施例２３．１及び２３．２で述べるＣＤ３３陽性細胞株を用いるクロム５１（51Ｃｒ）放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。それぞれの図に示すように、エフェクター細胞としては、刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣ、又はマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘを用いた。
刺激されたヒトＰＢＭＣの作製は以下のようにして実施した：
ペトリ皿（直径８５ｍｍ、Ｎｕｎｃ）を、最終濃度１μｇ／ｍｌの市販の抗ＣＤ３特異的抗体（例：ＯＫＴ３，Ｏｔｈｏｃｌｏｎｅ）により３７℃にて１時間コーティングした。非結合タンパク質をＰＢＳによる１段階の洗浄によって除去した。新鮮なＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液（３０乃至５０ｍｌのヒト血液）から単離した。安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／ＩＬ‐２２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ）を含む５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中、３‐５×１０7個のＰＢＭＣを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、２日間刺激した。３日目に細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。ＩＬ‐２を添加して最終濃度を２０Ｕ／ｍｌとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度１日培養した。
標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％ＦＣＳを含む最終容量１００μｌのＲＰＭＩ中、１１．１ＭＢｑの51Ｃｒにて３７℃で４５分間標識した。続いて、標識された標的細胞を５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次に細胞障害性アッセイに用いた。アッセイは、９６ウェルプレート上、全容量２５０μｌの補足ＲＰＭＩ（上記と同様）中にて、Ｅ：Ｔ比１０：１で実施した。種間特異的二重特異性抗体分子１μｇ／ｍｌ及びその３倍希釈物２０個を適用した。アッセイの時間は１８時間とし、細胞障害性は、最大溶解（トリトンＸの添加）と自然溶解（エフェクター細胞なし）との差に関連する上清中の放出されたクロムの相対値として測定した。測定はすべて４個の反復サンプルで行った。上清中のクロムの放射能の測定は、Ｗｉｚａｒｄ３"ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ，ケルン，ドイツ）を用いて実施した。実験データの解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ４（バージョン４．０２、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）を用いて実施した。このソフトウェアによって決定されるＳ字型用量反応曲線のＲ2値は、通常＞０．９０である。この解析プログラムによって算出されるＥＣ50値を用いて生物活性を比較した。
図３４に示すように、作製された種間特異的二重特異性コンストラクトはすべて、刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣによって誘発されたヒトＣＤ３３陽性標的細胞に対する細胞障害活性、並びにマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘによって誘発されたマカクＣＤ３３陽性標的細胞に対する細胞障害活性を示している。
２４．ＣＡＩＸ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の作製並びに同定
２４．１ ヒトＣＡＩＸを発現するＣＨＯ細胞の作製
ＧｅｎＢａｎｋ（受託番号ＮＭ＿００１２１６）で公開されているヒトＣＡＩＸのコード配列は、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、そのリーダーペプチドを含むヒトＣＡＩＸタンパク質のコード配列を含むように設計した（コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を配列番号６０４及び６０５に挙げる）。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、５'末端にはＸｂａＩ及び３'末端にはＳａｌＩであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、ＸｂａＩ及びＳａｌＩを介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
２４．２ マカクＣＡＩＸを発現するＣＨＯ細胞の作製
ＧｅｎＢａｎｋ（受託番号ＸＭ＿００１０８８４８１）で公開されているマカクＣＡＩＸのコード配列は、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、そのリーダーペプチドを含むマカクＣＡＩＸタンパク質のコード配列を含むように設計した（コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を配列番号６０６及び６０７に挙げる）。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、５'末端にはＸｂａＩ及び３'末端にはＳａｌＩであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、ＸｂａＩ及びＳａｌＩを介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
２４．３ ＣＡＩＸ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
種間特異的結合分子のクローン化
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＡＩＸに対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表７に挙げるように設計した。
ヒト及びマカクＣＡＩＸに対して種間特異的である可変軽鎖（Ｌ）及び可変重鎖（Ｈ）ドメイン、並びにヒト及びマカクＣＤ３に対して種間特異的であるＣＤ３特異的ＶＨ及びＶＬの組み合わせを含む前記のコンストラクトを、遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて対応する二重特異性単鎖抗体分子のコード配列を、続いてフレームを揃えて６ヒスチジンタグのコード配列及び停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に適切な制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位を介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
２４．４ 二重特異性単鎖抗体分子の発現及び精製
二重特異性単鎖抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）中で発現させた。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中の真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、２０ｎＭ ＭＴＸの最終濃度まで増加する濃度のＭＴＸを添加することによって誘発した。２継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないＨｙＱＰＦ ＣＨＯ液体大豆培地（０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ‐６８含有Ｌ‐グルタミン ４．０ｍＭを含む；ＨｙＣｌｏｎｅ）により、ローラーボトル中、回収まで７日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−２０℃で保存した。別の選択肢として、コンストラクトを一過性にＨＥＫ２９３細胞中で発現させた。トランスフェクションは、２９３ｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１２３４７‐０１９）を用い、製造元のプロトコルに従って実施した。
クロマトグラフィにはＡｋｔａ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた。ＺｎＣｌ2を充填したＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ Ｃｈｅｌａｔｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を用い、製造元が提供するプロトコルに従って固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（「ＩＭＡＣ」）を実施した。バッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ）でカラムを平衡状態とし、細胞培養物の上清（５００ｍｌ）を流速３ｍｌ／分でカラム（１０ｍｌ）に適用した。バッファーＡでカラムを洗浄して非結合サンプルを除去した。結合したタンパク質を、バッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ イミダゾール）の以下に示す２段階の勾配：
段階１：６カラム分の容量の２０％バッファーＢ
段階２：６カラム分の容量の１００％バッファーＢ
を用いて溶離させた。段階２からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Ｓｉｇｍａ（ダイゼンホッフェン）又はＭｅｒｃｋ（ダルムシュタット）より購入した。
ゲル濾過クロマトグラフィを、平衡バッファー（２５ｍＭ クエン酸塩、２００ｍＭ リジン、５％ グリセロール、ｐＨ７．２）で平衡状態としたＨｉＬｏａｄ１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ 分取グレードカラム（ＧＥ／アマーシャム）上で実施した。溶離したタンパク質サンプル（流速１ｍｌ／分）を標準的なＳＤＳ‐ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによる検出に掛けた。精製の前に、分子量測定のためにカラムを校正した（分子量マーカーキット、ＳｉｇｍａＭＷ ＧＦ‐２００）。タンパク質濃度は、ＯＤ２８０ｎｍを用いて測定した。
精製した二重特異性単鎖抗体タンパク質は、還元性条件下、４‐１２％ビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプレキャストしたＳＤＳＰＡＧＥで分析した。サンプルの調製及び適用は製造元が提供するプロトコルに従って実施した。分子量はＭｕｌｔｉＭａｒｋタンパク質スタンダード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて決定した。ゲルの染色にはコロイド状クーマシーを用いた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコル）。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって測定された単離したタンパク質の純度は＞９５％である。
ＰＢＳ中のゲル濾過によって測定する自然条件下での二重特異性単鎖抗体の分子量は約５２ｋＤａである。コンストラクトはすべてこの方法に従って精製した。
ウエスタンブロットは、Ｏｐｔｉｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ‐Ｓ８３膜及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅを用い、製造元が提供するプロトコルに従って実施した。二重特異性単鎖抗体タンパク質抗体の検出には、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いた（ＰｅｎｔａＨｉｓ，Ｑｉａｇｅｎ）。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）で標識したヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）を二次抗体として用い、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）を基質として用いた。精製された二重特異性単鎖抗体に対応する５２ｋＤに単一のバンドを検出した。
２４．５ ＣＡＩＸ及びＣＤ３種間特異的二重特異性抗体のフローサイトメトリー結合分析
ヒト及びマカクＣＡＩＸ並びにＣＤ３のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、ＦＡＣＳ分析を実施した。この目的のために、実施例２４．１で述べるようにヒトＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ（ＤＳＭＺ，ブラウンシュバイク，ＡＣＣ４８３）を用いてヒト抗原への結合について試験した。マカク抗原に対する結合反応性は、実施例２４．２で述べる作製されたマカクＣＡＩＸトランスフェクタント、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（Ｐｒｏｆ．Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ，Ｈｙｇｉｅｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｅｒｌａｎｇｅｎ‐Ｎｕｅｒｎｂｅｒｇ、よりご提供頂いた；Ｋｎａｐｐｅ Ａ， ｅｔ ａｌ．， ａｎｄ ＦｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒＨ．， Ｂｌｏｏｄ ２０００， ９５， ３２５６‐６１、にて発表）を用いて試験した。それぞれの細胞株の２００，０００個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト（２μｇ／ｍｌ）の精製タンパク質５０μｌと共に、又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共に、３０分間氷上にてインキュベートした。２％ＦＣＳを含むＰＢＳで細胞を２回洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ抗体（ＰｅｎｔａＨｉｓ抗体；Ｑｉａｇｅｎ；２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中にて１：２０に希釈）でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗Ｈｉｓ抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで１：１００に希釈したフィコエリトリンに結合したＦｃガンマ特異的抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）で検出した。トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を、Ｔ細胞株への結合に対するネガティブコントロールとして用いた。関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを、ＣＡＩＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合に対するネガティブコントロールとして用いた。
フローサイトメトリーはＦＡＣＳ‐Ｃａｌｉｂｕｒ装置上で実施し；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ハイデルベルク）。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のようにして実施した。
ＣＡＩＸに対して種間特異的であり、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３に対して種間特異的である上記に挙げた単鎖分子の二重特異性結合は、図３５に示すように明らかに検出可能であった。ＦＡＣＳ分析では、対応するネガティブコントロールと比較して、すべてのコンストラクトがＣＤ３及びＣＡＩＸへの結合を示した。二重特異性抗体のヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３並びにＣＡＩＸ抗原に対する種間特異性が実証された。
２４．６ ＣＡＩＸ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の生物活性
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例２４．１及び２４．２で述べるＣＡＩＸ陽性細胞株を用いるクロム５１（51Ｃｒ）放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。それぞれの図に示すように、エフェクター細胞としては、刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣ、刺激されたヒトＰＢＭＣ、又はマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘを用いた。
刺激されたヒトＰＢＭＣの作製は以下のようにして実施した：
ペトリ皿（直径１４５ｍｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、最終濃度１μｇ／ｍｌの市販の抗ＣＤ３特異的抗体（例：ＯＫＴ３，Ｏｔｈｏｃｌｏｎｅ）により３７℃にて１時間コーティングした。非結合タンパク質をＰＢＳによる１段階の洗浄によって除去した。新鮮なＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液（３０乃至５０ｍｌのヒト血液）から単離した。安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／ＩＬ‐２２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ）を含む１２０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中、３‐５×１０7個のＰＢＭＣを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、２日間刺激した。３日目に細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。ＩＬ‐２を添加して最終濃度を２０Ｕ／ｍｌとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度１日培養した。
刺激されたＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣの作製は以下のようにして実施した：
ペトリ皿（直径１４５ｍｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、最終濃度１μｇ／ｍｌの市販の抗ＣＤ３特異的抗体（例：ＯＫＴ３，Ｏｔｈｏｃｌｏｎｅ）により３７℃にて１時間コーティングした。非結合タンパク質をＰＢＳによる１段階の洗浄によって除去した。新鮮なＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液（３０乃至５０ｍｌのヒト血液）から単離した。安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／ＩＬ‐２２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ）を含む１２０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中、３‐５×１０7個のＰＢＭＣを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、２日間刺激した。３日目に細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。ＩＬ‐２を添加して最終濃度を２０Ｕ／ｍｌとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度１日培養した。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞を標準的なプロトコルに従って除去することにより、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）を濃縮した。
標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％ＦＣＳを含む最終容量１００μｌのＲＰＭＩ中、１１．１ＭＢｑの51Ｃｒにて３７℃で４５分間標識した。続いて、標識された標的細胞を５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次に細胞障害性アッセイに用いた。アッセイは、９６ウェルプレート上、全容量２５０μｌの補足ＲＰＭＩ（上記と同様）中にて、それぞれの図に示す５：１から５０：１までの種々のＥ：Ｔ比で実施した。種間特異的二重特異性単鎖抗体分子１μｇ／ｍｌ及びその３倍希釈物２０個を適用した。アッセイの時間は１６時間とし、細胞障害性は、最大溶解（トリトンＸの添加）と自然溶解（エフェクター細胞なし）との差に関連する上清中の放出されたクロムの相対値として測定した。測定はすべて４個の反復サンプルで行った。上清中のクロムの放射能の測定は、Ｗｉｚａｒｄ３"ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ，ケルン，ドイツ）を用いて実施した。実験データの解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ４（バージョン４．０２、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）を用いて実施した。このソフトウェアによって決定されるＳ字型用量反応曲線のＲ2値は、通常＞０．９０である。この解析プログラムによって算出されるＥＣ50値を用いて生物活性を比較した。
図３６に示すように、作製された種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクトはすべて、刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣ又は刺激されたＰＢＭＣによって誘発されたヒトＣＡＩＸ陽性標的細胞に対する細胞障害活性、並びにマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘによって誘発されたマカクＣＡＩＸ陽性標的細胞に対する細胞障害活性を示した。
２５．ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の作製並びに同定
ＥｐＣＡＭ特異的二重特異性抗体の構築
ＥｐＣＡＭ特異的二重特異性抗体の構築のための基礎は、完全ヒトＥｐＣＡＭ特異的抗体ＨＤ６９とした（Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ． ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ （２００１） ５０： １４１以降）。ＶＨ及びＶＬは、標準的な方法に従ってＨＤ６９ ＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＶＨ及びＶＬは、標準的なプロトコルに従って順にプラスミドへクローン化され、それによって機能的ｓｃＦｖ（配向ＶＨ‐リンカー‐ＶＬ）を形成した。このｓｃＦｖコンストラクトは、次に、二重特異性抗体フォーマットへの機能的なクローン化に有用であるＮ末端ＢｓｒＧ１及びＣ末端ＢｓｐＥ１制限部位を導入するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した（５'‐ＨＤ６９‐ＢｓｒＧ１：５'‐ｇａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｔｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｃｔｃｇａｇｔｃｔｇｇ‐３'；３'‐ＨＤ６９‐ＢｓｐＥ１：５'‐ｔｇａｔａｇｔｃｃｇｇａｔｔｔｇａｔｃｔｃｃａｇｃｔｔｇｇｔｃｃ‐３'）。次にこのＰＣＲ生成物を、ヒト及びマカクＣＤ３に対して種間特異的であるＣＤ３特異的ＶＨ及びＶＬの組み合わせを各々が１つ含む３種類の適切な発現ベクターへクローン化し（それぞれ、Ｈ２ＣＨＬ、Ｆ１２Ｑ ＨＬ、及びＩ２Ｃ）、それによって、３種類の機能的二重特異性コンストラクト、ＨＤ６９ ＨＬ×Ｈ２Ｃ ＨＬ、ＨＤ６９ ＨＬ×Ｆ１２Ｑ ＨＬ、及びＨＤ６９ＨＬ×Ｉ２Ｃ ＨＬがコードされた。続いてこれらのコンストラクトを、標準的な手順に従い安定なトランスフェクションのためにエレクトロポレーションによってＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトし、結果として各々が３種類の二重特異性産物のうちの１つを発現するプールである３種類のトランスフェクトされた細胞のプールを得た。
作製された二重特異性単鎖抗体（それぞれの二重特異性コンストラクトを発現するＣＨＯ細胞の培養物の上清中）の生物活性を、トランスフェクトされたＥｐＣＡＭ陽性細胞株ＣＨＯ‐ＥｐＣＡＭ（表面に結合したヒトＥｐＣＡＭを発現、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ （２００１） ５０： １４１以降に発表）を標的細胞として用いるクロム５１放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。エフェクター細胞としては、刺激されたヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞を用いた。図３７に示すように、作製した二重特異性単鎖抗体コンストラクトはすべて、ヒトＣＤ８＋細胞によって誘発されたヒトＥｐＣＡＭ陽性標的細胞に対する細胞障害活性を示した。ネガティブコントロールとしては、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の培養物の上清を用い、これは検出可能な細胞障害性を示さなかった。
作製した二重特異性コンストラクトのＣＤ３アームへの種間特異的活性を示すためにフローサイトメトリー分析を実施し、それによって、ヒトＣＤ３を発現する細胞及びマカクＣＤ３を発現する細胞へのコンストラクトの結合を確認した。さらに、ＥｐＣＡＭ陽性細胞への特異性も調べた。
簡潔に述べると、単離されたヒトＰＢＭＣ中のヒトＥｐＣＡＭでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞を用いてヒト抗原への結合の試験を行った。マカクＣＤ３抗原に対する結合反応性は、マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（Ｐｒｏｆ．Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ，Ｈｙｇｉｅｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｅｒｌａｎｇｅｎ‐Ｎｕｅｒｎｂｅｒｇ、よりご提供頂いた；Ｋｎａｐｐｅ Ａ， ｅｔ ａｌ．， ａｎｄ ＦｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒＨ．， Ｂｌｏｏｄ ２０００， ９５， ３２５６‐６１、にて発表）を用いて試験した。それぞれの細胞株の２００，０００個の細胞を、ＣＤ３種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共に、３０分間氷上にてインキュベートした。２％ＦＣＳを含むＰＢＳで細胞を２回洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ抗体（ＰｅｎｔａＨｉｓ抗体；Ｑｉａｇｅｎ；２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中にて１：２０に希釈）でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗Ｈｉｓ抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで１：１００に希釈したフィコエリトリンに結合したＦｃガンマ特異的抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）で検出した。トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を、Ｔ細胞株への結合に対するネガティブコントロールとして用いた。
フローサイトメトリーはＦＡＣＳ‐Ｃａｌｉｂｕｒ装置上で実施し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ハイデルベルク）。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のようにして実施した。
ヒトＥｐＣＡＭに対して特異的であり、ヒト及びマカクＣＤ３に対して種間特異的である単鎖分子の二重特異性結合は、図３８に示すように明らかに検出可能であった。フローサイトメトリー分析では、対応するネガティブコントロール及びＥｐＣＡＭ／ＣＤ３陰性ＣＨＯ細胞株と比較して、すべてのコンストラクトがＣＤ３及びＥｐＣＡＭへの結合を示した。
２６．ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の作製並びに同定
２６．１ ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の作製及び発現
細胞外ドメインの２６７個のアミノ酸が欠失した変異上皮成長因子受容体（デルタＥＧＦＲ、ｄｅ２‐７ＥＧＦＲ、又はＥＧＦＲｖＩＩＩは同義で用いる）のＣ末端、膜貫通及び細胞質ドメインのコード配列（ＫｕａｎＣＴ， Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ＣＪ， Ｂｉｇｎｅｒ ＤＤ： ＥＧＦ ｍｕｔａｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖＩＩＩ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ； Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｌａｔ Ｃａｎｃｅｒ． ２００１ Ｊｕｎ；８（２）：８３‐９６）を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて２４アミノ酸リーダーペプチドのコード配列を、続いてフレームを揃えてヒトＣ末端細胞外ドメイン、膜貫通及び細胞質ドメインのコード配列、並びに停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、ＤＮＡ断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。クローン化の目的のために、ＸｂａＩ及びＳａｌＩ制限酵素認識部位を、それぞれ５'末端及び３'末端に付加した。合成遺伝子ＤＮＡは続いてＸｂａＩ及びＳａｌＩによって消化され、適切に消化された発現ベクターｐＥＦ‐ＤＨＦＲへ連結され、大腸菌へ形質転換される。確認されたヌクレオチド配列を有するクローン（組換えコンストラクトのｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を配列番号５９９及び５９８に挙げる）を、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は上記で述べるようにして実施した。
２６．２ カニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩの作製及び発現
実施例２６．１と同様に、カニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体を、細胞外ドメインの２６７個のアミノ酸の欠失及び融合部位への新規なアミノ酸グリシンの挿入（アミノ酸番号６）によって作製した。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて２４アミノ酸リーダーペプチドのコード配列を、続いてフレームを揃えてカニクイザルＣ末端細胞外ドメイン、膜貫通及び細胞質ドメイン（いずれもヒト）のコード配列、並びに停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、ＤＮＡ断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位、５'末端のＸｂａＩ及び３'末端のＳａｌＩは、以下のクローン化の手順に利用した。標準的なプロトコルに従い、断片をＸｂａＩ／ＳａｌＩで消化し、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲへクローン化した。配列が確認されているプラスミドを用いてＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ９０９６；いずれもＢｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，ベルリン，ドイツから入手した１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及びＳｉｇｍａ‐ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，タウフキルヘン（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ），ドイツから入手した細胞培養グレード試薬のストック液からのヌクレオシドを補充して最終濃度を１０μｇ／ｍｌアデノシン、１０μｇ／ｍｌデオキシアデノシン、及び１０μｇ／ｍｌチミジンとした、ＢｉｏｃｈｒｏｍＡＧ，ベルリン，ドイツから入手した安定化グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０中、インキュベーター内で３７℃、湿度９５％、及び７％ＣＯ2にて培養）をトランスフェクトした。トランスフェクションは、ＰｏｌｙＦｅｃｔトランスフェクション試薬（ＱｉａｇｅｎＧｍｂＨ，ヒルデン，ドイツ）及び５μｇのプラスミドＤＮＡを用い、製造元のプロトコルに従って実施した。２４時間の培養後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ヌクレオシド及び透析ＦＣＳ（ＢｉｏｃｈｒｏｍＡＧ，ベルリン，ドイツより入手）を補充しないこと以外は前述と同様の細胞培地で再度培養した。従って、細胞培地はヌクレオシドを含有せず、それによって選別はトランスフェクトされた細胞に適用された。トランスフェクションからおよそ１４日の後、耐性細胞の成長が観察された。さらに７乃至１４日後、トランスフェクタントはＦＡＣＳの試験によりコンストラクトの発現について陽性を示した。
２６．３ ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３抗原に対して結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原に対して結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表９に挙げるように設計した。
ヒト及びカニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩに対して種間特異的である可変軽鎖（Ｌ）及び可変重鎖（Ｈ）ドメイン、並びにヒト及びマカクＣＤ３に対して種間特異的であるＣＤ３特異的ＶＨ及びＶＬの組み合わせを含む前記のコンストラクトを、遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて対応する二重特異性単鎖抗体分子のコード配列を、続いてフレームを揃えて６ヒスチジンタグのコード配列及び停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に適切な制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位を介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲと称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。別の選択肢として、コンストラクトを、標準的なプロトコルに従ってＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へ一過性にトランスフェクトした。
ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株でＦＡＣＳ結合実験を行い、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原に対するその結合能力を評価した。カニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用いてカニクイザル組織に対する種間特異性を試験した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体で行う細胞障害性アッセイに対して、細胞株に同一の変化を適用する。これ以外は、実施例４及び５で述べるようにしてアッセイを行った。
図３９に示すように、作製されたＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体は、ヒト及びカニクイザル両方の抗原に対する結合を示し、完全に種間特異的であることが証明された。
図４０に示すように、作製された種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクトはすべて、ヒトＣＤ８＋細胞によって誘発されたヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性標的細胞に対する細胞障害活性、並びにマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘによって誘発されたカニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性標的細胞に対する細胞障害活性を示した。ネガティブコントロールとしては、関連性のない二重特異性単鎖抗体を用いた。
２７．ＩｇＥ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の作製並びに同定
２７．１ ヒト及びマカク膜結合型ＩｇＥのクローン化及び発現
ラムダ軽鎖を合成、分泌する自然重鎖欠損変異骨髄腫細胞株であるマウス細胞株Ｊ５５８Ｌ（Ｉｎｔｅｒｌａｂ Ｐｒｏｊｅｃｔ， ＩｓｔｉｔｕｔｏＮａｚｉｏｎａｌｅ ｐｅｒ ｌａ Ｒｉｃｅｒｃａ ｓｕｌ Ｃａｎｃｒｏ，ジェノバ，イタリア、より入手、ＥＣＡＣＣ ８８０３２９０２）を用い、ヒト及びマカクＩｇＥのそれぞれの膜結合型重鎖変異体で補完した。そのようなコンストラクトを作製するために、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって合成分子を得た（コンストラクトのヌクレオチド配列を配列番号５９５及び５９４に挙げる）。これらのコンストラクトでは、ヒト及びマカクＣＤ３イプシロン鎖に対するコード配列が、それぞれＩｇＥのヒト膜貫通領域と融合していた。ＶＨ鎖の組み込まれた特異性は、ハプテン（４‐ヒドロキシ‐３‐ニトロ‐フェニル）アセチル）（ＮＰ）に対して指向されている。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位、及び免疫グロブリンリーダー、及びＤＮＡの最初と最後に制限部位を含むようにも設計した。導入された制限部位は、５'末端にＥｃｏＲＩ及び３'末端にＳａｌＩであり、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲと称する発現プラスミドへのクローン化工程に利用した。配列の確認後（マカク：ＸＭ＿００１１１６７３４アカゲザル（ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）ＩｇイプシロンＣ領域、ｍＲＮＡ；ヒト：ＮＣ＿００００１４ ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）第１４番染色体、全配列、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ）、このプラスミドを用いて上述のようにしてＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞をトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施する。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発する。
２７．２ ＩｇＥ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３抗原に対して結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類ＩｇＥ抗原に対して結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表１０に挙げるように設計した。
ヒト及びマカクＩｇＥに対して種間特異的である可変軽鎖（Ｌ）及び可変重鎖（Ｈ）ドメイン、並びにヒト及びマカクＣＤ３に対して種間特異的であるＣＤ３特異的ＶＨ及びＶＬの組み合わせを含む前記のコンストラクトを、遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて対応する二重特異性単鎖抗体分子のコード配列を、続いてフレームを揃えて６ヒスチジンタグのコード配列及び停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に適切な制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位を介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲと称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。別の選択肢として、コンストラクトを、標準的なプロトコルに従ってＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へ一過性にトランスフェクトした。
ヒトＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞株でＦＡＣＳ結合実験を行い、ヒトＩｇＥに対するその結合能力を評価した。マカクＩｇＥでトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞を用いてマカクＩｇＥ陽性細胞に対する種間特異性を試験した。Ｊ５５８Ｌ細胞株は、ＩｇＥ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体で実施した細胞障害性アッセイにも用いた。この結合実験並びに細胞障害性アッセイは上述のようにして実施した。
図４１に示すように、作製されたＩｇＥ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体は、ヒト及びカニクイザル両方の抗原に対する結合を示し、完全に種間特異的であることが証明された。
図４２に示すように、作製された種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクトはすべて、ヒトＣＤ８＋細胞によって誘発されたヒトＩｇＥ陽性標的細胞に対する細胞障害活性、並びにマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘによって誘発されたマカクＩｇＥ陽性標的細胞に対する細胞障害活性を示した。ネガティブコントロールとしては、関連性のない二重特異性単鎖抗体を用いた。
２８．ＣＤ４４及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の作製並びに同定
２８．１ ヒトＣＤ４４を発現するＣＨＯ細胞の作製
ＧｅｎＢａｎｋ（受託番号ＡＪ２５１５９５）で公開されているヒトＣＤ４４のコード配列で、ＣＤ４４ｖ６エクソンも含むものを、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いてヒトＣＤ４４タンパク質のコード配列及び停止コドンを含むように設計した（コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を配列番号６０８及び６０９に挙げる）。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、５'末端にはＥｃｏＲＩ及び３'末端にはＳａｌＩであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩを介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載された）と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
２８．２ ｖ６エクソンを持たないヒトＣＤ４４を発現するＣＨＯ細胞の作製
ＧｅｎＢａｎｋ（受託番号ＡＪ２５１５９５）で公開されているヒトＣＤ４４のコード配列で、ｖ６エクソンをコードする配列が欠失したものを、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いてｖ６エクソンを持たないヒトＣＤ４４タンパク質のコード配列及び停止コドンを含むように設計した（コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を配列番号６１０及び６１１に挙げる）。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、５'末端にはＥｃｏＲＩ及び３'末端にはＳａｌＩであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩを介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
２８．３ マカクＣＤ４４を発現するＣＨＯ細胞の作製
ＧｅｎＢａｎｋ（受託番号ＸＭ＿００１１１５３５９）で公開されているマカクＣＤ４４のコード配列で、ＣＤ４４ｖ６エクソンも含むものを、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。（コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を配列番号６１２及び６１３に挙げる）。用いたコンストラクトにおいて、コード配列は、ＣＤ４４タンパク質のシグナルペプチドの５番目のアミノ酸のコドンの第１位での点変異以外はマカクＣＤ４４に対応しており、その結果、ヒト配列に対応するアルギニンからトリプトファンへの変異が得られる。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位、及び断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、５'末端にはＥｃｏＲＩ及び３'末端にはＳａｌＩであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、次に、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩを介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへクローン化した。このプラスミドの配列が確認されたクローンを用いて、上述のようにＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞をトランスフェクトした。
２８．４ ＣＤ４４ｖ６及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ４４ｖ６に対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表１１に挙げるように設計する。
ヒト及びマカクＣＤ４４に対して種間特異的である可変軽鎖（Ｌ）及び可変重鎖（Ｈ）ドメイン、並びにヒト及びマカクＣＤ３に対して種間特異的であるＣＤ３特異的ＶＨ及びＶＬの組み合わせを含む前記のコンストラクトを、遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて対応する二重特異性単鎖抗体分子のコード配列を、続いてフレームを揃えてヒスチジン6‐タグのコード配列及び停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に適切な制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位を介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
２８．５．二重特異性単鎖抗体分子の発現及び精製
二重特異性単鎖抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）中で発現させた。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中の真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、２０ｎＭ ＭＴＸの最終濃度まで増加する濃度のＭＴＸを添加することによって誘発した。２継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないＨｙＱＰＦ ＣＨＯ液体大豆培地（０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ‐６８含有Ｌ‐グルタミン ４．０ｍＭを含む；ＨｙＣｌｏｎｅ）により、ローラーボトル中、回収まで７日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−２０℃で保存した。別の選択肢として、コンストラクトを一過性にＨＥＫ２９３細胞中で発現させた。トランスフェクションは、２９３ｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１２３４７‐０１９）を用い、製造元のプロトコルに従って実施した。
クロマトグラフィにはＡｋｔａ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた。ＺｎＣｌ2を充填したＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ Ｃｈｅｌａｔｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を用い、製造元が提供するプロトコルに従って固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（「ＩＭＡＣ」）を実施した。バッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ）でカラムを平衡状態とし、細胞培養物の上清（５００ｍｌ）を流速３ｍｌ／分でカラム（１０ｍｌ）に適用した。バッファーＡでカラムを洗浄して非結合サンプルを除去した。結合したタンパク質を、バッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ イミダゾール）の以下に示す２段階の勾配：
段階１：６カラム分の容量の２０％バッファーＢ
段階２：６カラム分の容量の１００％バッファーＢ
を用いて溶離させた。段階２からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Ｓｉｇｍａ（ダイゼンホッフェン）又はＭｅｒｃｋ（ダルムシュタット）より購入した。
ゲル濾過クロマトグラフィを、平衡バッファー（２５ｍＭ クエン酸塩、２００ｍＭ リジン、５％ グリセロール、ｐＨ７．２）で平衡状態としたＨｉＬｏａｄ１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ 分取グレードカラム（ＧＥ／アマーシャム）上で実施した。溶離したタンパク質サンプル（流速１ｍｌ／分）を標準的なＳＤＳ‐ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによる検出に掛けた。精製の前に、分子量測定のためにカラムを校正した（分子量マーカーキット、ＳｉｇｍａＭＷ ＧＦ‐２００）。タンパク質濃度は、ＯＤ２８０ｎｍを用いて測定した。
精製した二重特異性単鎖抗体タンパク質は、還元性条件下、４‐１２％ビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプレキャストしたＳＤＳＰＡＧＥで分析した。サンプルの調製及び適用は製造元が提供するプロトコルに従って実施した。分子量はＭｕｌｔｉＭａｒｋタンパク質スタンダード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて決定する。ゲルの染色にはコロイド状クーマシーを用いた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコル）。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって測定された単離したタンパク質の純度は＞９５％であった。
ＰＢＳ中のゲル濾過によって測定する自然条件下での二重特異性単鎖抗体の分子量は約５２ｋＤａである。コンストラクトはすべてこの方法に従って精製した。
ウエスタンブロットは、Ｏｐｔｉｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ‐Ｓ８３膜及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅを用い、製造元が提供するプロトコルに従って実施した。用いた抗体は、ヒスチジン6‐タグ（Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ，Ｑｉａｇｅｎ）とアルカリホスファターゼ（ＡＰ）で標識したヤギ抗マウスＩｇ（Ｓｉｇｍａ）に対するものであり、基質としてＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。精製された二重特異性単鎖抗体に対応する５２ｋＤに単一のバンドを検出した。
２８．６ ＣＤ４４及びＣＤ３種間特異的二重特異性抗体のフローサイトメトリー結合分析
ヒト及びマカクＣＤ４４並びにＣＤ３のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、ＦＡＣＳ分析を実施した。この目的のために、実施例２８．１で述べるようにヒトＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ（ＤＳＭＺ，ブラウンシュバイク，ＡＣＣ４８３）を用いてヒト抗原への結合について試験した。マカク抗原に対する結合反応性は、実施例２８．３で述べる作製されたマカクＣＤ４４トランスフェクタント、及びマカクＰＢＭＣ（マカクＰＢＭＣの調製は、標準的なプロトコルに従い、マカクザルからの末梢血液のＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によって行った）を用いて試験した。ＣＤ４４のｖ６エクソンに対する特異性は、実施例２８．２で述べるようにして作製されたｖ６エクソンを持たないヒトＣＤ４４を発現するトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用いて試験した。それぞれの細胞株又はマカクＰＢＭＣの２００，０００個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト（５μｇ／ｍｌ）の精製タンパク質５０μｌと共に、又は市販の抗ＣＤ４４抗体（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ハイデルベルク；同じく５μｇ／ｍｌ）の５０μｌと共に、３０分間氷上にてインキュベートした。細胞を２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ抗体（ＰｅｎｔａＨｉｓ抗体；Ｑｉａｇｅｎ；２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中にて１：２０に希釈）でコンストラクトの結合を検出した。市販の抗ＣＤ４４抗体と共にインキュベートしたサンプルについては抗Ｈｉｓ抗体を省略した。洗浄後、結合した抗Ｈｉｓ抗体又は抗ＣＤ４４抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで１：１００に希釈したフィコエリトリンに結合したＦｃガンマ特異的抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）で検出した。２％ＦＣＳを含むＰＢＳをネガティブコントロールとして用いた。
フローサイトメトリーはＦＡＣＳ‐Ｃａｌｉｂｕｒ装置上で実施し；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ハイデルベルク）。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のようにして実施した。
ＣＤ４４に対して種間特異的でありヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３に対して種間特異的である上記で挙げた単鎖分子の二重特異性結合は、図４３に示すように明らかに検出可能であった。ＦＡＣＳ分析では、対応するネガティブコントロールと比較して、すべてのコンストラクトがＣＤ３及びＣＤ４４への結合を示した。二重特異性抗体のヒト及びマカクＣＤ３並びにＣＤ４４抗原への種間特異性が実証された。
ＣＤ４４のｖ６エクソンに対する特異性は、図４４より、ｖ６エクソンを持たないヒトＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対するコンストラクトの結合が存在しないことによって示された。これらの細胞によるＣＤ４４の発現は、これらの細胞、及び完全長ヒトＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対する市販の抗ＣＤ４４抗体の結合が同等であることによって示された。
２８．７ ＣＤ４４及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の生物活性
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例２８．１で述べるＣＤ４４陽性細胞株を用いるクロム５１（51Ｃｒ）放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。エフェクター細胞としては、刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣを用いた。
刺激されたヒトＰＢＭＣの作製は以下のようにして実施した：
ペトリ皿（直径１４５ｍｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、最終濃度１μｇ／ｍｌの市販の抗ＣＤ３特異的抗体（例：ＯＫＴ３，Ｏｔｈｏｃｌｏｎｅ）により３７℃にて１時間コーティングした。非結合タンパク質をＰＢＳによる１段階の洗浄によって除去した。新鮮なＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液（３０乃至５０ｍｌのヒト血液）から単離した。安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／ＩＬ‐２２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ）を含む１２０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中、３‐５×１０7個のＰＢＭＣを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、２日間刺激した。３日目に細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。ＩＬ‐２を添加して最終濃度を２０Ｕ／ｍｌとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度１日培養した。
ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞を標準的なプロトコルに従って除去することにより、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）を濃縮した。
標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％ＦＣＳを含む最終容量１００μｌのＲＰＭＩ中、１１．１ＭＢｑの51Ｃｒにて３７℃で４５分間標識した。続いて、標識された標的細胞を５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次に細胞障害性アッセイに用いた。アッセイは、９６ウェルプレート上、全容量２５０μｌの補足ＲＰＭＩ（上記と同様）中にて、１０：１のＥ：Ｔ比で実施した。種間特異的二重特異性単鎖抗体分子１μｇ／ｍｌ及びその３倍希釈物２０個を適用した。アッセイの時間は１８時間とし、細胞障害性は、最大溶解（トリトンＸの添加）と自然溶解（エフェクター細胞なし）との差に関連する上清中の放出されたクロムの相対値として測定した。測定はすべて４個の反復サンプルで行った。上清中のクロムの放射能の測定は、Ｗｉｚａｒｄ３"ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ，ケルン，ドイツ）を用いて実施した。実験データの解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ４（バージョン４．０２、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）を用いて実施した。このソフトウェアによって決定されるＳ字型用量反応曲線のＲ2値は、通常＞０．９０である。この解析プログラムによって算出されるＥＣ50値を用いて生物活性を比較した。
図４５に示すように、作製された種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクトは、刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣによって誘発されたヒトＣＤ４４陽性標的細胞に対する細胞障害活性を示した。
２９．ＣＤ３０及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の作製並びに同定
２９．１ ヒトＣＤ３０を発現するＣＨＯ細胞の作製
ＧｅｎＢａｎｋ（受託番号Ｍ８３５５４）で公開されているヒトＣＤ３０のコード配列を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて成熟ヒトＣＤ３０タンパク質のコード配列及び停止コドンを含むように設計した（コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を配列番号１１０３及び１１０４に挙げる）。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、５'末端にはＥｃｏＲＩ及び３'末端にはＳａｌＩであり、以下のクローン化の手順に利用した。内部制限部位を遺伝子合成断片のコード配列のサイレント変異によって除去した（ＢｓｒＧＩ：ヌクレオチド２４３ＴからＣへ；ＳａｌＩ：ヌクレオチド３２７ ＡからＧへ；ＳａｌＩ：ヌクレオチド８５２ ＡからＧへ；ＥｃｏＲＩ：ヌクレオチド１２４８ ＴからＣへ）。遺伝子合成断片は、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩを介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
２９．２ マカクＣＤ３０を発現するＣＨＯ細胞の作製
マカクＣＤ３０のｃＤＮＡ配列を、標準的なプロトコルに従って調製したマカクザル骨髄からのｃＤＮＡに４回のＰＣＲをセットで施すことによって得た。以下の反応条件：９４℃で２分間の１サイクル、続いて９４℃で１分間、５５℃で１分間、及び７２℃で１分間の３５サイクル、続いて７２℃で３分間の最終サイクル、を用い、並びに以下のプライマー：
６．フォワードプライマー：５'‐ｃｃｔｃｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇｇａｃｔｇｃ‐３'
リバースプライマー：５'‐ｇｇｔｇｃｃａｃｔｇｇａｇｇｇｔｔｃｃｔｔｇｃ‐３'
７．フォワードプライマー：５'‐ｇｃｔｔｃｔｔｃｃａｔｔｃｔｇｔｃｔｇｃｃｃａｇｃａｇｇ‐３'
リバースプライマー：５'‐ｇｇｔａｇｇｇｇａｃａｃａｇｃｇｇｇｃａｃａｇｇａｇｔｔｇｇ‐３'
８．フォワードプライマー：５'‐ｃｃｔｇｇｃａｔｇａｔｃｔｇｔｇｃｃａｃａｔｃａｇｃｃ‐３'
リバースプライマー：５'‐ｇｃｇｔｔｇａｇｃｔｃｃｔｃｃｔｇｇｇｔｃｔｇｇ‐３'
９．フォワードプライマー：５'‐ｃｃｔｃｃｃｒｇｃｃｃａａｇｃｔａｇａｇｃｔｔｇｔｇｇ‐３'
リバースプライマー：５'‐ｃｇａｃｔｃｔａｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｔｃａｃｔｔｔｃｃａｇａｇｇｃａｇｃｔｇｔｇｇｇｃａａｇｇｇｇｔｃｔｔｃｔｔｔｃｃｃｔｔｃｃ‐３'
を用いた。
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲグレードのベタインを最終濃度１Ｍまで添加した状態で実施した。これらのＰＣＲによって４個のオーバーラップ断片が作製され、これらを標準的なプロトコルに従ってＰＣＲプライマーを用いて単離及び配列決定し、それによって、リーダーペプチドのコドン１２から成熟タンパク質のコドン５６２までのマカクＣＤ３０をコードするｃＤＮＡ配列の部分を得た。マカクＣＤ３０の発現のためのコンストラクトを作製するために、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によってｃＤＮＡ断片を得た（コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を配列番号１１０５及び１１０６に挙げる）。このコンストラクトでは、リーダーペプチドのアミノ酸１２から成熟ＣＤ３０タンパク質のアミノ酸５６２までのマカクＣＤ３０のコード配列が、対応するヒトのコード配列を置換する形でヒトＣＤ３０のコード配列へ融合された。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位、並びにマカクＣＤ３０の全細胞外ドメイン、マカクＣＤ３０膜貫通ドメイン、及びマカク‐ヒトキメラ細胞内ＣＤ３０ドメインをコードするｃＤＮＡを含む断片の最初と最後に制限部位を含むようにも設計した。導入された制限部位は、５'末端にはＸｂａＩ及び３'末端にはＳａｌＩであり、以下のクローン化の手順に利用した。次に遺伝子合成断片は、ＸｂａＩ及びＳａｌＩを介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへクローン化した。上述のように、このプラスミドの配列が確認されたクローンを用いて、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞をトランスフェクトした。
２９．３ ＣＤ３０及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
種間特異的結合分子のクローン化
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３０に対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表１２に挙げるように設計した。
ヒト及びマカクＣＤ３０に対して種間特異的である可変軽鎖（Ｌ）及び可変重鎖（Ｈ）ドメイン、並びにヒト及びマカクＣＤ３に対して種間特異的であるＣＤ３特異的ＶＨ及びＶＬの組み合わせを含む前記のコンストラクトを、遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて対応する二重特異性単鎖抗体分子のコード配列を、続いてフレームを揃えて６ヒスチジンタグのコード配列及び停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に適切な制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位を介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
２９．４ 二重特異性単鎖抗体分子の発現及び精製
二重特異性単鎖抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）中で発現させた。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中の真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、２０ｎＭ ＭＴＸの最終濃度まで増加する濃度のＭＴＸを添加することによって誘発した。２継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないＨｙＱＰＦ ＣＨＯ液体大豆培地（０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ‐６８含有Ｌ‐グルタミン ４．０ｍＭを含む；ＨｙＣｌｏｎｅ）により、ローラーボトル中、回収まで７日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−２０℃で保存した。別の選択肢として、コンストラクトを一過性にＨＥＫ２９３細胞中で発現させた。トランスフェクションは、２９３ｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１２３４７‐０１９）を用い、製造元のプロトコルに従って実施した。
クロマトグラフィにはＡｋｔａ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた。ＺｎＣｌ2を充填したＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ Ｃｈｅｌａｔｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を用い、製造元が提供するプロトコルに従って固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（「ＩＭＡＣ」）を実施した。バッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ）でカラムを平衡状態とし、細胞培養物の上清（５００ｍｌ）を流速３ｍｌ／分でカラム（１０ｍｌ）に適用した。バッファーＡでカラムを洗浄して非結合サンプルを除去した。結合したタンパク質を、バッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ イミダゾール）の以下に示す２段階の勾配：
段階１：６カラム分の容量の２０％バッファーＢ
段階２：６カラム分の容量の１００％バッファーＢ
を用いて溶離させた。段階２からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Ｓｉｇｍａ（ダイゼンホッフェン）又はＭｅｒｃｋ（ダルムシュタット）より購入した。
ゲル濾過クロマトグラフィを、平衡バッファー（２５ｍＭ クエン酸塩、２００ｍＭ リジン、５％ グリセロール、ｐＨ７．２）で平衡状態としたＨｉＬｏａｄ１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ 分取グレードカラム（ＧＥ／アマーシャム）上で実施した。溶離したタンパク質サンプル（流速１ｍｌ／分）を標準的なＳＤＳ‐ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによる検出に掛けた。精製の前に、分子量測定のためにカラムを校正した（分子量マーカーキット、ＳｉｇｍａＭＷ ＧＦ‐２００）。タンパク質濃度は、ＯＤ２８０ｎｍを用いて測定した。
精製した二重特異性単鎖抗体タンパク質は、還元性条件下、４‐１２％ビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプレキャストしたＳＤＳＰＡＧＥで分析した。サンプルの調製及び適用は製造元が提供するプロトコルに従って実施した。分子量はＭｕｌｔｉＭａｒｋタンパク質スタンダード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて決定した。ゲルの染色にはコロイド状クーマシーを用いた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコル）。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって測定された単離したタンパク質の純度は＞９５％であった。
ＰＢＳ中のゲル濾過によって測定する自然条件下での二重特異性単鎖抗体の分子量は約５２ｋＤａである。コンストラクトはすべてこの方法に従って精製した。
ウエスタンブロットは、Ｏｐｔｉｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ‐Ｓ８３膜及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅを用い、製造元が提供するプロトコルに従って実施した。用いた抗体は、Ｈｉｓタグに対して指向されたもの（ＰｅｎｔａＨｉｓ，Ｑｉａｇｅｎ）、及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）で標識したヤギ抗マウスＩｇ（Ｓｉｇｍａ）、及び基質としてのＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）であった。精製された二重特異性単鎖抗体に対応する５２ｋＤに単一のバンドを検出した。
２９．５ ＣＤ３０及びＣＤ３種間特異的二重特異性抗体のフローサイトメトリー結合分析
ヒト及びマカクＣＤ３０並びにＣＤ３のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、ＦＡＣＳ分析を実施した。この目的のために、実施例２９．１で述べるようにヒトＣＤ３０でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３０陽性Ｂ細胞株ＭＥＣ‐１（ＤＳＭＺ，ブラウンシュバイク，ＡＣＣ４９７）、及びヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ（ＤＳＭＺ，ブラウンシュバイク，ＡＣＣ４８３）を用いてヒト抗原への結合について試験した。マカク抗原に対する結合反応性は、実施例２９．２で述べる作製されたマカクＣＤ３０トランスフェクタント、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（Ｐｒｏｆ．Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ，Ｈｙｇｉｅｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｅｒｌａｎｇｅｎ‐Ｎｕｅｒｎｂｅｒｇ、よりご提供頂いた；Ｋｎａｐｐｅ Ａ， ｅｔ ａｌ．， ａｎｄ ＦｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒＨ．， Ｂｌｏｏｄ ２０００， ９５， ３２５６‐６１、にて発表）を用いて試験した。それぞれの細胞株の２００，０００個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト（５μｇ／ｍｌ）の精製タンパク質５０μｌと共に、３０分間氷上にてインキュベートした。細胞を２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、マウスＰｅｎｔａＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ；２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中にて１：２０に希釈）でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗Ｈｉｓ抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで１：１００に希釈したフィコエリトリンに結合したＦｃガンマ特異的抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）で検出した。２％ＦＣＳを含むＰＢＳをネガティブコントロールとして用いた。
フローサイトメトリーはＦＡＣＳ‐Ｃａｌｉｂｕｒ装置上で実施し；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ハイデルベルク）。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のようにして実施した。
ＣＤ３０に対して種間特異的であり、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３に対して種間特異的である上記に挙げた単鎖分子の二重特異性結合は、図４６に示すように明らかに検出可能であった。ＦＡＣＳ分析では、ネガティブコントロールと比較して、すべてのコンストラクトがＣＤ３及びＣＤ３０への結合を示した。二重特異性抗体のヒト及びマカクＣＤ３並びにＣＤ３０抗原に対する種間特異性が実証された。
２９．６ ＣＤ３０及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の生物活性
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例２９．２で述べたヒトＣＤ３０陽性Ｂ細胞株ＭＥＣ‐１（ＤＳＭＺ，ブラウンシュバイク，ＡＣＣ４９７）及びマカクＣＤ３０でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用いるクロム５１（51Ｃｒ）放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。エフェクター細胞としては、刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣ、又はマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをそれぞれ用いた。
刺激されたヒトＰＢＭＣの作製は以下のようにして実施した：
ペトリ皿（直径１４５ｍｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ‐ｏｎｅ ＧｍｂＨ，クレムスミュンスター）を、最終濃度１μｇ／ｍｌの市販の抗ＣＤ３特異的抗体（例：ＯＫＴ３，Ｏｔｈｏｃｌｏｎｅ）により３７℃にて１時間コーティングした。非結合タンパク質をＰＢＳによる１段階の洗浄によって除去した。新鮮なＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液（３０乃至５０ｍｌのヒト血液）から単離した。安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／ＩＬ‐２２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ）を含む１２０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中、３‐５×１０7個のＰＢＭＣを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、２日間刺激した。３日目に細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。ＩＬ‐２を添加して最終濃度を２０Ｕ／ｍｌとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度１日培養した。
標準的なプロトコルに従ってＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞を除去することにより、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）を濃縮した。
標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％ＦＣＳを含む最終容量１００μｌのＲＰＭＩ中、１１．１ＭＢｑの51Ｃｒにて３７℃で６０分間標識した。続いて、標識された標的細胞を５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次に細胞障害性アッセイに用いた。アッセイは、９６ウェルプレート上、全容量２５０μｌの補足ＲＰＭＩ（上記のように）中にて、Ｅ：Ｔ比１０：１で実施した。種間特異的二重特異性単鎖抗体分子１μｇ／ｍｌ及びその３倍希釈物２０個を適用した。アッセイの時間は、ＭＥＣ‐１及びヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣを用いるアッセイに対しては４時間、マカクＣＤ３０でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘを用いるアッセイに対しては１８時間とした。細胞障害性は、最大溶解（トリトンＸの添加）と自然溶解（エフェクター細胞なし）との差に関連する上清中の放出されたクロムの相対値として測定した。測定はすべて４個の反復サンプルで行った。上清中のクロムの放射能の測定は、Ｗｉｚａｒｄ３"ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ，ケルン，ドイツ）を用いて実施した。実験データの解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ４（バージョン４．０２、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）を用いて実施した。このソフトウェアによって決定されるＳ字型用量反応曲線のＲ2値は、通常＞０．９０である。この解析プログラムによって算出されるＥＣ50値を用いて生物活性を比較した。
図４７に示すように、作製された種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクトはすべて、刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣによって誘発されたヒトＣＤ３０陽性標的細胞に対する細胞障害活性、並びにマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘによって誘発されたマカクＣＤ３０陽性標的細胞に対する細胞障害活性を示した。
３０．ＨＥＲ２及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の作製並びに同定
３０．１ ヒトＨＥＲ２を発現するＣＨＯ細胞の作製
ＧｅｎＢａｎｋ（受託番号Ｘ０３３６３）で公開されているヒトＨＥＲ２のコード配列を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、そのリーダーペプチドを含むヒトＨＥＲ２タンパク質のコード配列が含まれるように設計した（コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を配列番号１１０７及び１１０８に挙げる）。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、５'末端にはＸｂａＩ及び３'末端にはＳａｌＩであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、ＸｂａＩ及びＳａｌＩを介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
３０．２ マカクＨＥＲ２の細胞外ドメインを発現するＣＨＯ細胞の作製
上述のヒトＨＥＲ２のコード配列を、ＧｅｎＢａｎｋ（受託番号ＸＰ＿００１０９０４３０）で公開されているようにマカクＨＥＲ２タンパク質のアミノ酸１２３乃至１０３８をコードするように修飾した。このキメラタンパク質に対するコード配列は、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た（コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を配列番号１１０９及び１１１０に挙げる）。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位、及び断片の最初と最後に制限部位を含むようにも設計した。導入された制限部位は、５'末端にはＸｂａＩ及び３'末端にはＳａｌＩであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、ＸｂａＩ及びＳａｌＩを介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへクローン化した。このプラスミドの配列が確認されたクローンを用いて、上述のようにＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞をトランスフェクトした。
３０．３ ＨＥＲ２及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
種間特異的結合分子のクローン化
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及びマカクＨＥＲ２に対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表１３に挙げるように設計する。
ヒト及びマカクＨＥＲ２に対して種間特異的である可変軽鎖（Ｌ）及び可変重鎖（Ｈ）ドメイン、並びにヒト及びマカクＣＤ３に対して種間特異的であるＣＤ３特異的ＶＨ及びＶＬの組み合わせを含む前記のコンストラクトを、遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えてそれぞれの二重特異性単鎖抗体分子のコード配列を、続いてフレームを揃えて６ヒスチジンタグのコード配列及び停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に適切な制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位を介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
３０．４ 二重特異性単鎖抗体分子の発現及び精製
二重特異性単鎖抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）中で発現させた。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中の真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、２０ｎＭ ＭＴＸの最終濃度まで増加する濃度のＭＴＸを添加することによって誘発した。２継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないＨｙＱＰＦ ＣＨＯ液体大豆培地（０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ‐６８含有Ｌ‐グルタミン ４．０ｍＭを含む；ＨｙＣｌｏｎｅ）により、ローラーボトル中、回収まで７日間細胞を増殖させる。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−８０℃で保存した。トランスフェクションは、２９３ｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１２３４７‐０１９）を用い、製造元のプロトコルに従って実施した。
クロマトグラフィにはＡｋｔａ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた。ＺｎＣｌ2を充填したＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ Ｃｈｅｌａｔｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を用い、製造元が提供するプロトコルに従って固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（「ＩＭＡＣ」）を実施した。バッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ）でカラムを平衡状態とし、細胞培養物の上清（５００ｍｌ）を流速３ｍｌ／分でカラム（１０ｍｌ）に適用した。バッファーＡでカラムを洗浄して非結合サンプルを除去した。結合したタンパク質を、バッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ イミダゾール）の以下に示す２段階の勾配：
段階１：６カラム分の容量の２０％バッファーＢ
段階２：６カラム分の容量の１００％バッファーＢ
を用いて溶離させた。段階２からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Ｓｉｇｍａ（ダイゼンホッフェン）又はＭｅｒｃｋ（ダルムシュタット）より購入した。
ゲル濾過クロマトグラフィを、平衡バッファー（２５ｍＭ クエン酸塩、２００ｍＭ リジン、５％ グリセロール、ｐＨ７．２）で平衡状態としたＨｉＬｏａｄ１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ 分取グレードカラム（ＧＥ／アマーシャム）上で実施した。溶離したタンパク質サンプル（流速１ｍｌ／分）を標準的なＳＤＳ‐ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによる検出に掛けた。精製の前に、分子量測定のためにカラムを校正した（分子量マーカーキット、ＳｉｇｍａＭＷ ＧＦ‐２００）。タンパク質濃度は、ＯＤ２８０ｎｍを用いて測定した。
精製した二重特異性単鎖抗体タンパク質は、還元性条件下、４‐１２％ビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプレキャストしたＳＤＳＰＡＧＥで分析した。サンプルの調製及び適用は製造元が提供するプロトコルに従って実施した。分子量はＭｕｌｔｉＭａｒｋタンパク質スタンダード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて決定した。ゲルの染色にはコロイド状クーマシーを用いた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコル）。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって測定された単離したタンパク質の純度は＞９５％であった。
ＰＢＳ中のゲル濾過によって測定する自然条件下での二重特異性単鎖抗体の分子量は約５２ｋＤａである。コンストラクトはすべてこの方法に従って精製した。
ウエスタンブロットは、Ｏｐｔｉｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ‐Ｓ８３膜及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅを用い、製造元が提供するプロトコルに従って実施した。二重特異性単鎖抗体タンパク質抗体の検出には、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いた（ＰｅｎｔａＨｉｓ，Ｑｉａｇｅｎ）。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）で標識したヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）を二次抗体として用い、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）を基質として用いた。精製された二重特異性単鎖抗体に対応する５２ｋＤに単一のバンドを検出した。
３０．５ ＨＥＲ２及びＣＤ３種間特異的二重特異性抗体のフローサイトメトリー結合分析
ヒト及びマカクＨＥＲ２並びにＣＤ３のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、ＦＡＣＳ分析を実施した。この目的のために、実施例３０．１で述べるようにヒトＨＥＲ２でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ（ＤＳＭＺ，ブラウンシュバイク，ＡＣＣ４８３）を用いてヒト抗原への結合について試験する。マカク抗原に対する結合反応性は、実施例３０．２で述べる作製されたマカクＨＥＲ２トランスフェクタント、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（Ｐｒｏｆ．Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ，Ｈｙｇｉｅｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｅｒｌａｎｇｅｎ‐Ｎｕｅｒｎｂｅｒｇ、よりご提供頂いた；Ｋｎａｐｐｅ Ａ， ｅｔ ａｌ．， ａｎｄ ＦｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒＨ．， Ｂｌｏｏｄ ２０００， ９５， ３２５６‐６１、にて発表）を用いて試験した。それぞれの細胞株の２００，０００個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト（２μｇ／ｍｌ）の精製タンパク質５０μｌと共に、３０分間氷上にてインキュベートした。２％ＦＣＳを含むＰＢＳで細胞を２回洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ抗体（ＰｅｎｔａＨｉｓ抗体；Ｑｉａｇｅｎ；２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中にて１：２０に希釈）でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗Ｈｉｓ抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで１：１００に希釈したフィコエリトリンに結合したＦｃガンマ特異的抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）で検出した。２％ＦＣＳを含むＰＢＳを、Ｔ細胞株並びにＨＥＲ２でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合に対するネガティブコントロールとして用いた。
フローサイトメトリーはＦＡＣＳ‐Ｃａｌｉｂｕｒ装置上で実施し；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ハイデルベルク）。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のようにして実施した。
ＨＥＲ２に対して種間特異的であり、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３に対して種間特異的である上記に挙げた単鎖分子の二重特異性結合は、図４８に示すように明らかに検出可能であった。ＦＡＣＳ分析では、それぞれのネガティブコントロールと比較して、すべてのコンストラクトがＣＤ３及びＨＥＲ２への結合を示した。二重特異性抗体のヒト及びマカクＣＤ３並びにＨＥＲ２抗原に対する種間特異性が実証された。
３０．６ ＨＥＲ２及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の生物活性
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例３０．１及び３０．２で述べるＨＥＲ２陽性Ｂ細胞株を用いるクロム５１（51Ｃｒ）放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。エフェクター細胞としては、それぞれの図に示すように、刺激されていないヒトＣＤ５６除去ＰＢＭＣ、又はマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘを用いた。
刺激されていないヒトＣＤ５６除去ＰＢＭＣの作製は以下のようにして実施した：
新鮮なＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液（３０乃至５０ｍｌのヒト血液）から単離した。ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の除去は標準的なプロトコルに従って実施した。
標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％ＦＣＳを含む最終容量１００μｌのＲＰＭＩ中、１１．１ＭＢｑの51Ｃｒにて３７℃で４５分間標識した。続いて、標識された標的細胞を５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次に細胞障害性アッセイに用いた。アッセイは、９６ウェルプレート上、全容量２５０μｌの補足ＲＰＭＩ（上記のように）中にて、Ｅ：Ｔ比１０：１で実施した。種間特異的二重特異性単鎖抗体分子１μｇ／ｍｌ及びその５倍希釈物１５乃至２１個を適用した。アッセイの時間は１８時間とし、細胞障害性は、最大溶解（トリトンＸの添加）と自然溶解（エフェクター細胞なし）との差に関連する上清中の放出されたクロムの相対値として測定した。測定はすべて４個の反復サンプルで行った。上清中のクロムの放射能の測定は、Ｗｉｚａｒｄ３"ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ，ケルン，ドイツ）を用いて実施した。実験データの解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ４（バージョン４．０２、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）を用いて実施した。このソフトウェアによって決定されるＳ字型用量反応曲線のＲ2値は、通常＞０．９０である。この解析プログラムによって算出されるＥＣ50値を用いて生物活性を比較した。
図４９に示すように、作製された種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクトはすべて、刺激されていないＣＤ５６除去ＰＢＭＣによって誘発されたヒトＨＥＲ２陽性標的細胞に対する細胞障害活性、並びにマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘによって誘発されたマカクＨＥＲ２陽性標的細胞に対する細胞障害活性を示した。
３１．Ｎ末端アミノ酸１‐２７に対応するコンテクスト非依存性ＣＤ３イプシロンエピトープに基づくアフィニティ法による種間特異的二重特異性単鎖分子の精製
３１．１ 単離されたＮ末端アミノ酸１‐２７に対応するコンテクスト非依存性ヒトＣＤ３イプシロンエピトープを提示するアフィニティカラムの作製
上述のヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃガンマ領域と融合したヒトＣＤ３イプシロン鎖の１‐２７Ｎ末端アミノ酸から成るコンストラクト１‐２７ＣＤ３‐Ｆｃ（実施例３；組換え融合タンパク質のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を配列番号３５０及び３４９に挙げる）の発現のためのプラスミドを、このコンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。２継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないＨｙＱ ＰＦ ＣＨＯ液体大豆培地（０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ‐６８含有Ｌ‐グルタミン４．０ｍＭを含む；ＨｙＣｌｏｎｅ）により、ローラーボトル中、回収まで７日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−２０℃で保存した。融合タンパク質の単離のために、ウシ、ウマ、及びマウス血清タンパク質との交差反応が最小限である市販のアフィニティ精製ヤギ抗ヒトＩｇＧｆｃ断片特異的抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．）を用いて、ヤギ抗ヒトｆｃアフィニティカラムを標準的なプロトコルに従って調製した。このアフィニティカラムを用いて、ＡｋｔａＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ アマーシャム）上にて細胞培養物の上清から融合タンパク質を単離し、クエン酸で溶離した。溶離液を中和し、濃縮した。アミンを含まないカップリングバッファーに対する透析の後、精製された融合タンパク質を、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドＮＨＳ活性化１ｍｌＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ アマーシャム）へカップリングさせた。
カップリング後、残留ＮＨＳ基をブロックし、カラムを洗浄し、０．１％ナトリウムアジドを含有する保存バッファー中にて５℃で保存した。
３１．２ ヒトＣＤ３ペプチドアフィニティカラムを用いた種間特異的二重特異性単鎖分子の精製
種間特異的二重特異性単鎖分子を発現する細胞の細胞培養物の上清２００ｍｌに０．２μｍの滅菌ろ過を施し、Ａｋｔａ ＥｘｐｌｏｒｅｒＳｙｓｔｅｍ（ＧＥ アマーシャム）を用いてＣＤ３ペプチドアフィニティカラムへ適用した。
次にカラムをｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳで洗浄し、非結合サンプルを洗い流した。２０ｍＭクエン酸及び１Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ３．０の酸性バッファーで溶離を行った。溶離されたタンパク質は、フラクションコレクターのコレクションチューブ（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｔｕｂｅｓ）内に収容しておいたｐＨ８．３の１ＭトリスヒドロキシメチルアミンＴＲＩＳで直ちに中和した。
タンパク質の分析は、ＳＤＳ ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットで行った。
ＳＤＳ ＰＡＧＥでは、ビストリスゲル４‐１２％を用いる（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ランニングバッファーは１×ＭＥＳ‐ＳＤＳ‐Ｐｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とした。タンパク質スタンダードとしては、１５μｌの染色ＳｈａｒｐＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を適用した。電気泳動は、最大２００ボルト１２０ｍＡにて６０分間行った。ゲルを脱塩水で洗浄し、クーマシーで１時間染色した。ゲルの脱染は脱塩水中で３時間行う。画像の撮影は、ＳｙｎｇｅｎｅＧｅｌドキュメンテーションシステムで行う。
ウエスタンブロットでは、２倍のＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを作製し、タンパク質をニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。この膜をＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミンでブロックし、ビオチン化マウスＰｅｎｔａＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）と共にインキュベートした。二次試薬としては、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ複合体（ＤＡＫＯ）を用いた。ブロットは、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色させた。
図５０、５１、及び５２に示すように、上述のようにしてヒトＣＤ３ペプチドアフィニティカラムを用いることにより、細胞培養物の上清からの二重特異性単鎖分子の効率の高い精製が可能となる。二重特異性単鎖分子に含まれる種間特異的抗ＣＤ３単鎖抗体は、従って、その特異的結合特性により、精製目的のためだけに結合されるタグをまったく必要としない種間特異的二重特異性単鎖分子のための効率的で汎用的な１段階精製法を可能とする。
３２．種間特異的二重特異性単鎖分子のための汎用的な薬物動態アッセイ
３２．１ 薬物動態アッセイに用いる１‐２７ＣＤ３‐Ｆｃの作製
ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃガンマ領域と融合したヒトＣＤ３イプシロン鎖の１‐２７Ｎ末端アミノ酸のコード配列を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た（組換え融合タンパク質のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を配列番号１１１１及び１１１２に挙げる）。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖の細胞外部分の最初の２７個のアミノ酸のコード配列を、続いてフレームを揃えてヒトＩｇＧ１のヒンジ領域及びＦｃガンマ部分のコード配列、並びに停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、この融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、５'末端にはＥｃｏＲＩ及び３'末端にはＳａｌＩであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩを介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。２継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないＨｙＱ ＰＦ ＣＨＯ液体大豆培地（０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ‐６８含有Ｌ‐グルタミン４．０ｍＭを含む；ＨｙＣｌｏｎｅ）により、ローラーボトル中、回収まで７日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−２０℃で保存した。融合タンパク質の単離のために、ウシ、ウマ、及びマウス血清タンパク質との交差反応が最小限である市販のアフィニティ精製ヤギ抗ヒトＩｇＧｆｃ断片特異的抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．）を用いて、ヤギ抗ヒトｆｃアフィニティカラムを標準的なプロトコルに従って調製した。このアフィニティカラムを用いて、ＡｋｔａＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ アマーシャム）上にて細胞培養物の上清から融合タンパク質を単離し、クエン酸で溶離した。溶離液を中和し、濃縮した。
３２．２ 種間特異的二重特異性単鎖分子のための薬物動態アッセイ
このアッセイは、Ｓｅｋｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒデバイス（ＭＳＤ）上で測定するカーボンプレート上のルテニウム標識検出を用いるＥＣＬ‐ＥＬＩＳＡ法に基づくものである。第一の工程では、カーボンプレート（ＭＳＤＨｉｇｈ Ｂｉｎｄ Ｐｌａｔｅ ９６ウェル Ｃａｔ：Ｌ１５ｘＢ‐３）を、５０ｎｇ／ｍｌの実施例３２．１で述べる精製した１‐２７ＣＤ３‐Ｆｃにより５μｌ／ウェルでコーティングした。次に、プレートを２５℃で一晩乾燥した。続いて、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡ（Ｐａｅｓｅｌ＆Ｌｏｒｅｉ＃１００５６８）１５０μｌ／ウェルにより、２５℃で１時間、攪拌しながら（７００ｒｐｍ）インキュベーター中にてプレートをブロックした。次の工程では、ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎによりプレートを３回洗浄した。ＰＢＳ中５０％のマカク血清中での検量線を、このアッセイで検出すべきそれぞれの種間特異的二重特異性単鎖分子１００ｎｇ／ｍｌから始めて段階的な１：４希釈によって作成した。品質管理（ＱＣ）サンプルを、ＰＢＳ中５０％のマカク血清中にて、予想されるサンプル血清濃度に応じて、それぞれの種間特異的二重特異性単鎖分子の１ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌまでの範囲で調製した。スタンダード、ＱＣ、又は未知サンプルを１０μｌ／ウェルでカーボンプレートへ移し、２５℃で９０分間、振とうしながら（７００ｒｐｍ）インキュベーター中でインキュベートした。続いてＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎによりプレートを３回洗浄した。検出には、２５μｌ／ウェルのペンタ‐Ｈｉｓ‐ビオチン抗体（Ｑｉａｇｅｎ、ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ中２００μｇ／ｍｌ）を添加し、２５℃で１時間、振とうしながら（７００ｒｐｍ）インキュベーター中でインキュベートした。第二の検出工程では、ストレプトアビジン‐スルホタグ溶液（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ‐ＳｕｌｆｏＴａｇｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＭＳＤ；Ｃａｔ：Ｒ３２ＡＤ‐１；Ｌｏｔ：Ｗ００１０９０３）を添加し、２５℃で１時間、振とうしながら（７００ｒｐｍ）インキュベーター中でインキュベートした。続いてＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎによりプレートを３回洗浄した。最後に、１５０μｌ／ウェルのＭＳＤＲｅａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＳＤ、Ｃａｔ：Ｒ９ＺＣ‐１）を添加し、プレートをＳｅｋｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒデバイスで読み取った。
図５３及び５４は、種間特異的二重特異性単鎖分子が、マカクザル血清サンプル中の種間特異的二重特異性単鎖分子の検出に使用可能であることを示している。二重特異性単鎖分子に含まれる種間特異的抗ＣＤ３単鎖抗体は、従って、その特異的結合特性により、種間特異的二重特異性単鎖分子の検出のための高感度である汎用的なアッセイを可能とする。上記に示すアッセイは、薬剤の開発に必要である正式な毒性試験に関連して使用することができ、種間特異的二重特異性単鎖分子の臨床的応用と関連する患者のサンプルの測定に容易に適合させることができる。
３３．カニクイザルからのＥｐＣＡＭと融合した種々の非チンパンジー霊長類からのＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１‐２７である組換え膜貫通融合タンパク質の作製（１‐２７ＣＤ３‐ＥｐＣＡＭ）
３３．１ １‐２７ＣＤ３‐ＥｐＣＡＭのクローン化及び発現
種々の非チンパンジー霊長類（マーモセット、タマリン、リスザル）及びブタからＣＤ３イプシロンを単離した。ヒト成体、コモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ ｏｅｄｉｐｕｓ）、コモンリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）、及び家畜ブタ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ；ネガティブコントロールとして用いた）のＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１‐２７がＦｌａｇタグカニクイザルＥｐＣＡＭのＮ末端へ融合したもののコード配列を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た（組換え融合タンパク質のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を配列番号３５１乃至３６０に挙げる）。遺伝子合成断片は、標的発現ベクターに既に存在する１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列との正しいリーディングフレーム内での融合を可能とするためのＢｓｒＧＩ部位をまず含み、続いてフレームを揃えて成熟ＣＤ３イプシロン鎖の細胞外部分のＮ末端１‐２７アミノ酸のコード配列を、続いてフレームを揃えてＦｌａｇタグのコード配列を、続いてフレームを揃えて成熟カニクイザルＥｐＣＡＭ膜貫通タンパク質のコード配列を含むように設計した。遺伝子合成断片は、融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、５'末端にはＢｓｒＧＩ及び３'末端にはＳａｌＩであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、次にＢｓｒＧＩ及びＳａｌＩを介して、１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列をすでに含んでいるｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドの誘導体へ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。配列が確認されたプラスミドを用いて、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
標準的なプロトコルに従うＦＡＣＳアッセイにより、トランスフェクタントを、組換え膜貫通タンパク質の細胞表面発現について試験した。この目的のために、２．５×１０5個の細胞を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの抗ＦｌａｇＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ ＣｈｅｍｉｅＧｍｂＨ，タウフキルヘン，ドイツ）５０μｌと共に数多くインキュベートした。結合した抗体は、Ｒ‐フィコエリトリンと結合したアフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ‐ガンマ断片特異的、を２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中１：１００に希釈したもの（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．，ニューマーケット，サフォーク，英国）で検出した。フローサイトメトリーはＦＡＣＳ‐Ｃａｌｉｂｕｒ装置上で実施し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ハイデルベルク）。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のようにして実施した。
カニクイザルＥｐＣＡＭ、並びにヒト、マーモセット、タマリン、リスザル、及びブタのＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１‐２７のそれぞれから成るＦｌａｇタグ組換え膜貫通融合タンパク質の、トランスフェクトされた細胞上での発現は明らかに検出可能である（図５５）。
３３．２ ＩｇＧ１抗体の形での種間特異的抗ＣＤ３単鎖抗体Ｉ２Ｃ ＨＬのクローン化及び発現
種間特異的単鎖抗ＣＤ３抗体の結合の検出法を改良するために、Ｉ２Ｃ ＶＨＶＬ特異性を、マウスＩｇＧ１及びマウスカッパ定常領域を有するＩｇＧ１抗体へ転換する。ＩｇＧ抗体の重鎖をコードするｃＤＮＡ配列を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のコード配列を、続いてフレームを揃えてＧｅｎＢａｎｋ（受託番号ＡＢ０９７８４９）で公開されているマウスＩｇＧ１の重鎖定常領域のコード配列又はＧｅｎＢａｎｋ（受託番号Ｄ１４６３０）で公開されているマウスカッパ軽鎖定常領域のコード配列をそれぞれ含むように設計した。
融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの最初と最後に制限部位を導入した。制限部位は５'末端にＥｃｏＲＩ及び３'末端にＳａｌＩであり、以下のクローン化の手順に用いた。遺伝子合成断片は、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩを介し、重鎖コンストラクトに対してはｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ、及び軽鎖コンストラクトに対してはｐＥＦＡＤＡ（ｐＥＦＡＤＡについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。配列が確認されたプラスミドを用いて、軽鎖及び重鎖コンストラクトのそれぞれを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へ共トランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ、及びデオキシコホルマイシン（ｄＣＦ）の濃度を最大３００ｎＭ ｄＣＦまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。２継代の静置培養後、細胞培養物の上清を回収して続いての実験に用いた。
３３．３ ＩｇＧ１抗体の形の種間特異的抗ＣＤ３単鎖抗体Ｉ２Ｃ ＨＬの１‐２７ＣＤ３‐ＥｐＣＡＭに対する結合
実施例３３．１で述べるカニクイザルＥｐ‐ＣＡＭに融合したヒト、マーモセット、タマリン、及びリスザルのＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１‐２７のそれぞれに対する作製したＩ２ＣＩｇＧ１コンストラクトの結合を、標準的なプロトコルに従ってＦＡＣＳアッセイで試験した。この目的のために、２．５×１０5個の細胞を、実施例３３．２で述べるＩ２Ｃ ＩｇＧ１コンストラクトを含む細胞培養物の上清５０μｌ共に数多くインキュベートした。抗体の結合は、Ｒ‐フィコエリトリンと結合したアフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ‐ガンマ断片特異的、を２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中１：１００に希釈したもの（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．，ニューマーケット，サフォーク，英国）で検出した。フローサイトメトリーはＦＡＣＳ‐Ｃａｌｉｂｕｒ装置上で実施し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ハイデルベルク）。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のようにして実施した。
図５６に示すように、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合したブタのＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１‐２７から成るネガティブコントロールと比較して、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合したヒト、マーモセット、タマリン、又はリスザルのＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１‐２７から成る組換え膜貫通融合タンパク質を発現するトランスフェクタントに対するＩ２ＣＩｇＧ１コンストラクトの結合が観察された。従って、Ｉ２Ｃの多霊長類（ｍｕｌｔｉ‐ｐｒｉｍａｔｅ）種間特異性が実証された。抗ＦｌａｇＭ２抗体及びＩ２Ｃ ＩｇＧ１コンストラクトによって得られたシグナルは同等であり、このことは、ＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１‐２７に対する種間特異的特異性Ｉ２Ｃの強い結合活性を示している。
３４．Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを持つ及び持たないヒトＣＤ３イプシロン鎖に対する種間特異的抗ＣＤ３結合分子Ｉ２Ｃの結合
ＣＤ３イプシロンに特異的である実施例３３．２で述べる結合特異性Ｉ２Ｃを持つキメラＩｇＧ１抗体を、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを持つ及び持たないヒトＣＤ３イプシロンに対する結合について試験した。実施例６．１で述べるＨｉｓ６‐ヒトＣＤ３イプシロンで、及び実施例５．１で述べる野生型ヒトＣＤ３イプシロンでそれぞれトランスフェクトされたＥＬ４細胞株に対する抗体の結合を、ＦＡＣＳアッセイにより標準的なプロトコルに従って試験した。トランスフェクタントの２．５×１０5個の細胞を、Ｉ２Ｃ ＩｇＧ１コンストラクトを含む細胞培養物の上清５０μｌ共に、又は２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中５μｇ／ｍｌのそれぞれのコントロール抗体５０μｌと共にインキュベートした。ネガティブコントロールとしては適切なアイソタイプコントロールを、コンストラクトの発現に対するポジティブコントロールとしてはＣＤ３特異的抗体ＵＣＨＴ‐１をそれぞれ用いた。Ｈｉｓ６タグの検出は、ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）で行った。抗体の結合は、Ｒ‐フィコエリトリンと結合したアフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ‐ガンマ断片特異的、を２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中１：１００に希釈したもの（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．，ニューマーケット，サフォーク，英国）で検出した。フローサイトメトリーはＦＡＣＳ‐Ｃａｌｉｂｕｒ装置上で実施し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ハイデルベルク）。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のようにして実施した。
抗ヒトＣＤ３抗体ＵＣＨＴ‐１の結合が両トランスフェクタントに対して同等であることは、コンストラクトの発現がおよそ同レベルであることを示している。ペンタＨｉｓ抗体の結合により、Ｈｉｓ６タグが野生型コンストラクト上には存在しないがＨｉｓ６‐ヒトＣＤ３コンストラクト上には存在することが確認された
野生型ヒトＣＤ３イプシロンでトランスフェクトされたＥＬ４細胞株と比較して、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを持つヒトＣＤ３イプシロンに対するＩ２ＣＩｇＧ１コンストラクトの結合の明らかな喪失が検出された。これらの結果は、ＣＤ３イプシロンの遊離Ｎ末端が、ヒトＣＤ３イプシロン鎖に対する種間特異的抗ＣＤ３結合特異性Ｉ２Ｃの結合に不可欠であることを示している（図５７）。
３５．ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３、並びにＭｕｃ‐１の腫瘍特異的エピトープに指向された二重特異性単鎖抗体コンストラクト
ヒト抗体生殖系列ＶＨ配列ＶＨ３ ３‐７２（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ‐ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、ＣＤＲＨ１（配列番号１４８６）、ＣＤＲＨ２（配列番号１４８７）、及びＣＤＲＨ３（配列番号１４８８）に対するフレームワークコンテクストとして選択した。同様に、ヒト抗体生殖系列ＶＨ配列ＶＨ３３‐７３（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ‐ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、ＣＤＲＨ１（配列番号１４９２）、ＣＤＲＨ２（配列番号１４９３）、及びＣＤＲＨ３（配列番号１４９４）に対するフレームワークコンテクストとして選択した。各々のヒトＶＨについて、およそ１５乃至２０ヌクレオチドの末端区間でオーバーラップするいくつかの縮重オリゴヌクレオチドを合成する必要があった。このために、第二のプライマーはすべてアンチセンスプライマーであった。ＶＨ３３‐７２に対しては以下のオリゴヌクレオチドを用いた：
５'ＶＨ７２‐Ａ‐ＸｈｏＩ
ＧＡＡＧＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＭＴＧＡＲＡＣＴＣＴＣＴＴＧＴＧＣＴＧＣＴ
３'ＶＨ７２‐Ｂ
ＣＴＧＧＣＧＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＡＴＣＡＣＴＡＡＡＡＧＴＧＡＡＴＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＡＡＧＡＧＡＧ
５'ＶＨ７２‐Ｃ
ＧＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＫＣＴＣＣＡＧＲＧＡＡＧＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＧＴＴＧＳＴＧＡＡＡＴＴＡＧＡＡＡＣＡＡＡＧＣＣＡＡＴ
３'ＶＨ７２‐Ｄ
ＴＴＴＧＧＡＡＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＡＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＴＣＡＣＡＧＡＣＴＣＡＴＣＡＴＡＡＴＡＴＧＴＴＧＣＡＴＧＡＴＴＡＴＴＧＧＣＴＴＴＧＴＴＴＣＴ
５'ＶＨ７２‐Ｅ
ＡＧＡＧＡＴＧＡＴＴＣＣＡＡＡＡＲＴＡＧＭＳＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＷＭＡＧＣＴＴＡＡＲＡＲＣＴＧＡＡＧＡＣＡＣＴＧＳＣＳＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＣＴＧＧＧ
３'ＶＨ７２‐Ｆ‐ＢｓｔＥＩＩ
ＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＴＡＧＣＡＡＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＡＣＡＧＴＡＡＴＡ
ＶＨ３ ３‐７３に対しては以下のオリゴヌクレオチドを用いた：
５'ＶＨ７３‐Ａ‐ＸｈｏＩ
ＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣ
３'ＶＨ７３‐Ｂ
ＣＣＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＧＴＡＧＴＴＡＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＴＣＣＡＧＡＧＧＣＡＲＣＡＣＡＧＧＡＧＡＧＴＴＴＣＡＫＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＴＧ
５'ＶＨ７３‐Ｃ
ＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＫＣＴＹＣＡＧＲＧＡＡＧＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＧＴＴＧＳＴＧＡＡＡＴＴＡＧＡＴＴＧＡＡＡＴＣＴＡＡＴ
３'ＶＨ７３‐Ｄ
ＴＴＴＧＧＡＡＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＡＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＴＣＡＣＡＧＡＣＴＣＣＧＣＡＴＡＡＴＧＴＧＴＴＧＣＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＴＣＴ
５'ＶＨ７３‐Ｅ
ＡＧＡＧＡＴＧＡＴＴＣＣＡＡＡＡＲＴＡＳＴＧＹＣＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＲＣＴＴＡＡＲＡＲＣＴＧＡＡＧＡＣＡＣＴＧＳＣＲＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＣＧＧＧＡ
３'ＶＨ７３‐Ｆ‐ＢｓｔＥＩＩ
ＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡＡＧＣＡＡＡＴＴＧＴＣＣＣＡＣＴＣＣＣＧＴＡＣＡＧＴＡＡＴＡ
これらのプライマーセットの各々は、対応するＶＨ配列全体の範囲を含んでいる。
各セット内では、同量のプライマー（例：２０μｌＰＣＲ反応に対して１μｌの各プライマー（プライマーストック２０乃至１００μＭ））を混合し、ＰＣＲバッファー、ヌクレオチド、及びＴａｑポリメラーゼから成るＰＣＲ混合物へ添加した。この混合物をＰＣＲサイクラー中にて９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、及び７２℃で１０分間インキュベートした。続いて生成物をアガロースゲル電気泳動に掛け、標準的な方法に従って２００乃至４００のサイズの生成物をゲルから単離した。
次に、各ＶＨ ＰＣＲ生成物を、Ｎ末端及びＣ末端の適切なクローン化制限部位を組み込まれたプライマーを用いる標準的なＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。適切なサイズのＤＮＡ断片（ＶＨに対してはおよそ３５０ヌクレオチド）を、標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動によって単離した。この方法により、十分なＶＨＤＮＡ断片が増幅された。
ヒト抗体生殖系列ＶＬ配列ＶｋＩＩ Ａ１８（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ‐ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、ＣＤＲＬ１（配列番号１４８９）、ＣＤＲＬ２（配列番号１４９０）、及びＣＤＲＬ３（配列番号１４９１）に対するフレームワークコンテクストとして選択した。同様に、ヒト抗体生殖系列ＶＬ配列ＶＬ７７ａ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ‐ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、ＣＤＲＬ１（配列番号１４９５）、ＣＤＲＬ２（配列番号１４９６）、及びＣＤＲＬ３（配列番号１４９７）に対するフレームワークコンテクストとして選択した。各々のヒトＶＬについて、およそ１５乃至２０ヌクレオチドの末端区間でオーバーラップするいくつかの縮重オリゴヌクレオチドを合成する必要があった。このために、第二のプライマーはすべてアンチセンスプライマーであった。後のクローン化に必要であるオリゴヌクレオチド内の制限部位を除去した。ＶｋＩＩＡ１８に対しては以下のオリゴヌクレオチドを用いた：
５'Ｖｋ２Ａ１８‐Ａ‐ＳａｃＩＣＣＴＧＡＴＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＹＣＴＧＴＣＡＳＴＣＹＴＧＧＡＳＡＫＣＭＡＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣ
３'Ｖｋ２Ａ１８‐Ｂ
ＣＣＡＡＴＡＴＡＡＡＴＡＧＧＴＧＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴＴＧＴＧＴＡＣＣＡＧＧＴＴＣＴＧＡＣＴＡＧＡＴＣＴＧＣＡＡＧＡＧＡＴＧＧＡＡＧＣ
５'Ｖｋ２Ａ１８‐Ｃ
ＡＣＣＴＡＴＴＴＡＴＡＴＴＧＧＴＷＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＹＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＭＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＡＧＧＧＣＴＴＣＣＡＴＣ
３'Ｖｋ２Ａ１８‐Ｄ
ＣＴＴＧＡＧＴＧＴＧＡＡＡＴＣＴＧＴＣＹＣＴＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＴＧＡＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＡＴＣＧＧＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＴＡＴＡ
５'Ｖｋ２Ａ１８‐Ｅ
ＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＣＡＡＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＳＴＧＧＧＡＧＴＴＴＡＴＴＷＣＴＧＣＴＴＴＣＡＡＧＧＴＡＣＡＣＡＴ
３'Ｖｋ２Ａ１８‐Ｆ‐ＢｓｉＷＩ／ＳｐｅＩ
ＣＣＣＧＡＴＡＣＴＡＧＴＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＴＧＡＣＣＧＡＡＣＧＴＣＣＡＣＧＧＡＡＣＡＴＧＴＧＴＡＣＣＴＴＧＡＡＡＧＣＡ
ＶＬ７ ７ａに対しては以下のオリゴヌクレオチドを用いた：
５'Ｖｌａｍ７ａ‐Ａ‐ＳａｃＩ
ＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＹＣＴＫＣＡＣＴＣＡＣＣＲＹＡＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＲＡＡＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＣＡＣＴＴＧＴ
３'Ｖｌａｍ７ａ‐Ｂ
ＣＣＡＧＴＴＧＧＣＡＴＡＧＴＴＡＣＴＴＧＴＴＧＴＡＡＣＡＧＣＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＧＡＧＣＧＡＣＡＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＡＣＴＧＴ
５'Ｖｌａｍ７ａ‐Ｃ
ＡＡＣＴＡＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧＫＴＣＣＡＡＳＡＡＡＡＡＣＣＡＧＲＴＣＡＫＫＹＡＹＹＣＭＳＴＧＳＴＣＴＡＡＴＡＫＲＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧＡ
３'Ｖｌａｍ７ａ‐Ｄ
ＧＧＴＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＴＧＹＣＴＣＣＡＡＫＣＡＧＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＴＣＴＧＧＣＡＧＧＡＲＹＭＣＭＴＧＧＴＧＣＴＣＧＧＴＴＧＴＴＧＧＴＡＣＣ
５'Ｖｌａｍ７ａ‐Ｅ
ＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡＣＣＭＴＣＷＣＡＧＧＧＧＹＡＣＡＧＭＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＲＷＡＴＡＴＴＷＣＴＧＴＧＣＴＣＴＡＴＧＧＴＡＣＡＧＣ
３'Ｖｌａｍ７ａ‐Ｆ‐ＢｓｉＷＩ／ＳｐｅＩ
ＣＣＡＧＴＡＡＣＴＡＧＴＣＧＴＡＣＧＴＡＧＧＡＣＡＧＴＣＡＧＴＴＴＧＧＴＴＣＣＴＣＣＡＣＣＧＡＡＣＡＣＣＣＡＡＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＴＡＧＡＧＣＡＣＡ
これらのプライマーセットの各々は、対応するＶＬ配列全体の範囲を含んでいる。
各セット内では、同量のプライマー（例：２０μｌＰＣＲ反応に対して１μｌの各プライマー（プライマーストック２０乃至１００μＭ））を混合し、ＰＣＲバッファー、ヌクレオチド、及びＴａｑポリメラーゼから成るＰＣＲ混合物へ添加した。この混合物をＰＣＲサイクラー中にて９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、及び７２℃で１０分間インキュベートした。続いて生成物をアガロースゲル電気泳動に掛け、標準的な方法に従って２００乃至４００のサイズの生成物をゲルから単離した。
次に、各ＶＬ ＰＣＲ生成物を、Ｎ末端及びＣ末端の適切なクローン化制限部位を組み込まれたプライマーを用いる標準的なＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。適切なサイズのＤＮＡ断片（ＶＬに対してはおよそ３３０ヌクレオチド）を、標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動によって単離した。この方法により、十分なＶＬＤＮＡ断片が増幅された。
次に、最終的なＶＨ３ ３‐７２に基づくＶＨ ＰＣＲ生成物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＨのレパートリー）を最終的なＶｋＩＩ Ａ１８に基づくＶＬＰＣＲ生成物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＬのレパートリー）と、並びに最終的なＶＨ３ ３‐７３に基づくＶＨ ＰＣＲ生成物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＨのレパートリー）を最終的なＶＬ７７ａに基づくＶＬ ＰＣＲ生成物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＬのレパートリー）と、ファージディスプレイベクターｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ中で組み合わせて機能的ｓｃＦｖｓの２種類の異なるライブラリーを形成し、そこから、繊維状ファージ上での提示後、以下で述べるようにして抗Ｍｕｃ‐１バインダーを選別し、スクリーニングし、同定し、確認した：
軽鎖断片（ＳａｃＩ‐ＳｐｅＩで消化）４５０ｎｇをファージミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ（ＳａｃＩ‐ＳｐｅＩで消化；長断片）１４００ｎｇとライゲートさせた。次に、得られたコンビナトリアル抗体ライブラリーを、３００μｌのエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞へエレクトロポレーションによって形質転換し（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５μＦＤ、２００オーム、Ｂｉｏｒａｄ ｇｅｎｅ‐ｐｕｌｓｅｒ）、独立したクローンが１０7を超えるライブラリーサイズを得た。１時間の表現型の発現の後、ｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓベクターによってコードされたカルベニシリン耐性に対して陽性である形質転換体を１００ｍｌの液体スーパーブロス（ＳＢ）培地中で一晩選別した。次に、細胞を遠心分離によって回収し、市販のプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドの調製を行った。
ＶＬ‐ライブラリーを含むこのプラスミド‐ＤＮＡ（ＸｈｏＩ‐ＢｓｔＥＩＩで消化；長断片）２８００ｎｇを重鎖Ｖ断片（ＸｈｏＩ‐ＢｓｔＥＩＩで消化）９００ｎｇとライゲートさせ、再度エレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞３００μｌの２つのアリコートへエレクトロポレーションによって形質転換し（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５μＦＤ、２００オーム）、独立したクローンが１０7を超えるＶＨ‐ＶＬ ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）の全ライブラリーサイズを得た。
表現型の発現及びカルベニシリンへのゆるやかな適応の後、抗体ライブラリーを含む大腸菌細胞をＳＢ‐カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）選択培地へ移した。抗体ライブラリーを含む大腸菌細胞は、次にヘルパーファージＶＣＳＭ１３の粒子の感染量１０12個で感染させて繊維状Ｍ１３ファージを産生及び分泌させ、ここでファージ粒子はｓｃＦｖ断片をコードする一本鎖ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ‐ＤＮＡを含み、そして対応するｓｃＦｖタンパク質をファージコートタンパク質ＩＩＩへの翻訳融合物として提示した。抗体ライブラリーを提示するファージのこのプールを抗原結合要素の選別に用いた。
ヒトＭＵＣ‐１を発現するＣＨＯ細胞の作製
ＧｅｎＢａｎｋ（受託番号Ｊ０５５８１）で公開されているヒトＭＵＣ‐１のコード配列を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いてヒトＭＵＣ‐１タンパク質のコード配列及び停止コドンを含むように設計した（コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を配列番号１４９８及び１４９９に挙げる）。この遺伝子合成断片には、ＧｅｎＢａｎｋに受託されているバージョンでは１回分しか含まれないＭＵＣ‐１の内部反復配列（ヌクレオチド３８２から４４１）が１６回分含まれており、生理的に発現されるＭＵＣ‐１の複数の反復を反映している。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、５'末端にはＥｃｏＲＩ及び３'末端にはＳａｌＩであり、以下のクローン化の手順に利用した。内部ＸｍａＩ制限部位を遺伝子合成断片中のコード配列のサイレント変異によって除去した（ヌクレオチド４４１ＣからＴへ；これは第一の反復の最後のヌクレオチドであり、従って続く１５の反復配列において全く同様に変異された；並びに、ヌクレオチド２１６０ ＧからＣへ）。遺伝子合成断片は、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩを介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
抗原結合要素の選別のために、クローン化されたｓｃＦｖレパートリーを持つファージライブラリーを、それぞれの培養物の上清からＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈殿及び遠心分離によって回収した。およそ１０11乃至１０12のｓｃＦｖファージ粒子を０．４ｍｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に再懸濁させ、１０5乃至１０7のＭｕｃ‐１でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（例えばＭｕｃ‐１ＲｏＫを参照）と共に氷上で１時間ゆっくり攪拌しながらインキュベートした。このＭｕｃ‐１でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を前もって遠心分離によって回収し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ（Ｎａアジド含有）中に再懸濁させた。Ｍｕｃ‐１でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞と特異的に結合しないｓｃＦｖファージを、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ（Ｎａアジド含有）による最大５回の洗浄工程によって除去した。洗浄後、細胞をｐＨ２．２のＨＣｌ‐グリシン中に再懸濁させることによって（１０分間のインキュベーションとそれに続くボルテックス攪拌）結合要素を細胞から溶離させ、ｐＨ１２の２Ｍトリスによる中和の後、その溶離液を新鮮な感染させていない大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ培養物（ＯＤ６００＞０．５）の感染に用いた。ヒト／ヒト化ｓｃＦｖ断片をコードするファージミドコピーでの形質導入に成功した大腸菌細胞を含む大腸菌培養物をカルベニシリン耐性について再度選別し、続いてＶＣＭＳ１３ヘルパーファージで感染させることで、抗体提示及びインビトロ選別の第二ラウンドを開始した。通常は、合計で４乃至５ラウンドの選別を実施した。
選別後、Ｍｕｃ‐１特異的バインダーについてのスクリーニングを行うために、４及び５ラウンドのパニングに対応するプラスミドＤＮＡを大腸菌培養物から単離した。可溶性ｓｃＦｖタンパク質の作製のためにＶＨ‐ＶＬ‐ＤＮＡ断片をプラスミドから切除した（ＸｈｏＩ‐ＳｐｅＩ）。これらの断片を、元のｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓとは発現コンストラクト（例：ｓｃＦｖ）がＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）をｓｃＦｖとＨｉｓ６タグとの間に有するという点で異なる、プラスミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓへ同じ制限部位を介してクローン化し、さらなるファージタンパク質を除去した。ライゲーションの後、プラスミドＤＮＡの各プール（パニングのラウンドが異なる）を、１００μｌのヒートショックコンピテント（ｈｅａｔｓｈｏｃｋ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌ＴＧ１又はＸＬＩ ｂｌｕｅへ形質転換し、カルベニシリンＬＢ‐寒天へ播種した。単一コロニーを１００μｌのＬＢカルベニシリン（ｃａｒｂ）（５０μｇ／ｍｌ）中へ取り出した。
ＶＬ及びＶＨセグメントを含むｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓで形質転換された大腸菌は、遺伝子ＩＩＩ断片の切除及び１ｍＭ ＩＰＴＧによる誘発の後、十分な量の可溶性ｓｃＦｖを産生する。適切なシグナル配列のために、ｓｃＦｖ鎖は周辺質へ放出され、そこで機能的コンフォメーションへフォールドする。
形質転換プレートから単一の大腸菌ＴＧ１細菌コロニーを周辺質の小スケール製剤のために取り出し、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2及びカルベニシリン５０μｇ/ｍｌを補充したＳＢ培地（例：１０ｍｌ）中で増殖させ、回収後ＰＢＳ中（例：１ｍｌ）へ再溶解した。−７０℃での凍結及び３７℃での解凍を４ラウンド行うことにより、細菌の外膜を温度ショックで破壊し、ｓｃＦｖｓを含む可溶性周辺質タンパク質を上清中へ遊離させた。遠心分離によって無傷の細胞及び細胞片を除去した後、抗Ｍｕｃ‐１ｓｃＦｖｓを含む上清を回収し、それを用いてＭｕｃ‐１特異的バインダーの同定を以下のようにして行った：
ｓｃＦｖｓのＭｕｃ‐１に対する結合を、Ｍｕｃ‐１でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞上でのフローサイトメトリーで試験し；ネガティブコントロールとしてトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞を用いた。
フローサイトメトリーのために、２．５×１０5個の細胞を、５０μｌのｓｃＦｖ周辺質製剤と共に、又は２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中５μｇ／ｍｌの精製ｓｃＦｖと共にインキュベートした。ｓｃＦｖの結合は、抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ‐Ｈｉｓ抗体、ＢＳＡ非含有、ＱｉａｇｅｎＧｍｂＨ，ヒルデン，ドイツ連邦共和国）により２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中２μｇ／ｍｌにて検出した。第二の工程の試薬としては、Ｒ‐フィコエリトリンと結合したアフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ‐ガンマ断片特異的）を２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中１：１００に希釈したもの（Ｄｉａｎｏｖａ，ハンブルク，ドイツ連邦共和国）を用いる。サンプルは、ＦＡＣＳｓｃａｎ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ハイデルベルク，ドイツ連邦共和国）上で測定した。
次に単一のクローンを有利な特性及びアミノ酸配列について分析した。Ｍｕｃ‐１特異的ｓｃＦｖｓを、Ｇｌｙ4Ｓｅｒ1‐リンカーを介してＣＤ３特異的ｓｃＦｖ Ｉ２Ｃと（配列番号１８５）、又は本発明のその他のいずれかのＣＤ３特異的ｓｃＦｖと連結することで、組換え二重特異性単鎖抗体へ変換し、その結果としてドメイン配置がＶＨMuc1‐（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ1）3‐ＶＬMuc1‐Ｇｌｙ4Ｓｅｒ1‐ＶＨCD3‐（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ1）3‐ＶＬCD3又は別のドメイン配置であるコンストラクトを得た。ＣＨＯ細胞中での発現のために、（ｉ）コザックコンセンサス配列内に埋め込まれた開始コドンを含むＮ末端免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、及び（ｉｉ）停止コドンが続くＣ末端Ｈｉｓ6タグのコード配列の両方を、二重特異性単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列へフレームを揃えて結合し、その後、遺伝子合成によって得られたこのＤＮＡ断片を発現ベクターｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０）のマルチクローニング部位へ挿入した。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞の安定なトランスフェクション、二重特異性単鎖抗体を培養物の上清中へ分泌するＤＨＦＲ陽性トランスフェクタントの選別、及び発現レベルを高めるためのメトトレキサートによる遺伝子増幅は記述（Ｍａｃｋｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ （１９９５） ７０２１‐７０２５）に従って実施した。その他の最新の手順はすべて標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。
機能的二重特異性単鎖抗体コンストラクトの同定は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の培養物の上清のフローサイトメトリー分析によって行った。この目的のために、ＣＤ３結合を、ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ（ＤＳＭＺ，ブラウンシュバイク，ＡＣＣ４８３）及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ上にて試験した。腫瘍特異的Ｍｕｃ‐１エピトープに対する結合は、Ｍｕｃ‐１でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞上で試験した。それぞれの細胞株の２００，０００個の細胞を、５０μｌの細胞培養物の上清と共に３０分間氷上にてインキュベートした。細胞を２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ抗体（ＰｅｎｔａＨｉｓ抗体；Ｑｉａｇｅｎ；２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中にて１：２０に希釈）により、結合した二重特異性単鎖抗体コンストラクトを検出した。洗浄後、結合した抗Ｈｉｓ抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで１：１００に希釈したフィコエリトリンに結合したＦｃガンマ特異的抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）によって検出した。トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清をネガティブコントロールとして用いた。
フローサイトメトリーはＦＡＣＳ‐Ｃａｌｉｂｕｒ装置上で実施し；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ハイデルベルク）。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のようにして実施した。
ヒト及びマカクＣＤ３に対して、並びにＭｕｃ‐１の腫瘍特異的エピトープに対して二重特異性結合を示すコンストラクトだけを、さらなる使用のために選別した。
タンパク質の産生のために、完全に機能的である二重特異性単鎖抗体を発現し、ヌクレオシドを含まないＨｙＱ ＰＦ ＣＨＯ液体大豆培地（０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ‐６８含有Ｌ‐グルタミン ４．０ｍＭを含む；ＨｙＣｌｏｎｅ）に適応させたＣＨＯ細胞を、ヌクレオシドを含まないＨｙＱ ＰＦ ＣＨＯ液体大豆培地（０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ‐６８含有Ｌ‐グルタミン ４．０ｍＭを含む；ＨｙＣｌｏｎｅ）によりローラーボトル中にて７日間増殖させた。遠心分離により培養物の上清を細胞から除去し、精製まで−２０℃で保存した。培養物の上清からの二重特異性単鎖抗体の精製のためのクロマトグラフィ装置としては、Ａｋｔａ（登録商標）ＥｘｐｌｏｒｅｒＳｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた。ＺｎＣｌ2を充填したＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤ Ｃｈｅｌａｔｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を用い、製造元が提供するプロトコルに従って固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（「ＩＭＡＣ」）を実施した。バッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ）でカラムを平衡状態とし、細胞培養物の上清（５００ｍｌ）を流速３ｍｌ／分でカラム（１０ｍｌ）に適用した。バッファーＡでカラムを洗浄して非結合サンプルを除去した。結合したタンパク質を、バッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ イミダゾール）の以下に従う２段階の勾配：
段階１：６カラム分の容量の２０％バッファーＢ
段階２：６カラム分の容量の１００％バッファーＢ
を用いて溶離させた。段階２からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Ｓｉｇｍａ（ダイゼンホッフェン）又はＭｅｒｃｋ（ダルムシュタット）より購入した。
ゲル濾過クロマトグラフィを、平衡バッファー（２５ｍＭ クエン酸塩、２００ｍＭ リジン、５％ グリセロール、ｐＨ７．２）で平衡状態としたＨｉＬｏａｄ１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ 分取グレードカラム（ＧＥ／アマーシャム）上で実施した。溶離したタンパク質サンプル（流速１ｍｌ／分）を標準的なＳＤＳ‐ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによる検出に掛けた。精製の前に、分子量測定のためにカラムを校正した（分子量マーカーキット、ＳｉｇｍａＭＷ ＧＦ‐２００）。タンパク質濃度は、ＯＤ２８０ｎｍを用いて測定した。
精製した二重特異性抗体タンパク質は、還元性条件下、４‐１２％ビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプレキャストしたＳＤＳＰＡＧＥで分析した。サンプルの調製及び適用は製造元が提供するプロトコルに従って実施した。分子量はＭｕｌｔｉＭａｒｋタンパク質スタンダード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて決定した。ゲルの染色にはコロイド状クーマシーを用いた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコル）。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって測定された単離したタンパク質の純度は＞９５％である。
ＰＢＳ中のゲル濾過によって測定する自然条件下での二重特異性単鎖抗体の分子量は約５２ｋＤａである。コンストラクトはすべてこの方法に従って精製した。
ウエスタンブロットは、Ｏｐｔｉｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ‐Ｓ８３膜及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅを用い、製造元が提供するプロトコルに従って実施した。二重特異性単鎖抗体タンパク質抗体の検出には、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いた（ＰｅｎｔａＨｉｓ，Ｑｉａｇｅｎ）。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）で標識したヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）を二次抗体として用い、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）を基質として用いた。精製された二重特異性単鎖抗体に対応する５２ｋＤに単一のバンドを検出した。
ヒト及び非チンパンジー霊長類系において二重特異性単鎖抗体がヒト及びマカクＣＤ３と、並びにＭｕｃ‐１の腫瘍特異的エピトープと相互作用する効力を、Ｍｕｃ‐１でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として、刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣ又はマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として用いるクロム５１（51Ｃｒ）の放出に基づく細胞障害性アッセイによって測定した。
刺激されたヒトＰＢＭＣの作製は以下のようにして行った：
ペトリ皿（直径１４５ｍｍ、Ｎｕｎｃ）を、最終濃度１μｇ／ｍｌの市販の抗ＣＤ３特異的抗体（例：ＯＫＴ３，Ｏｔｈｏｃｌｏｎｅ）により３７℃で１時間コーティングした。非結合タンパク質をＰＢＳによる１段階の洗浄によって除去した。新鮮なＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液（３０乃至５０ｍｌのヒト血液）から単離した。安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／ＩＬ‐２２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ）を含む１２０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中、３‐５×１０7個のＰＢＭＣを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、２日間刺激した。３日目に細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。ＩＬ‐２を添加して最終濃度を２０Ｕ／ｍｌとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度１日培養した。
標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％ＦＣＳを含む最終容量１００μｌのＲＰＭＩ中、１１．１ＭＢｑの51Ｃｒにて３７℃で４５分間標識した。続いて、標識された標的細胞を５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次に細胞障害性アッセイに用いた。アッセイは、９６ウェルプレート上、全容量２５０μｌの補足ＲＰＭＩ（上記のように）中にて、Ｅ：Ｔ比１０：１で実施した。種間特異的二重特異性単鎖抗体分子１μｇ／ｍｌ及びその３倍希釈物２０個を適用した。アッセイの時間は１８時間とし、細胞障害性は、最大溶解（トリトンＸの添加）と自然溶解（エフェクター細胞なし）との差に関連する上清中の放出されたクロムの相対値として測定した。測定はすべて４個の反復サンプルで行った。上清中のクロムの放射能の測定は、Ｗｉｚａｒｄ３"ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ，ケルン，ドイツ）を用いて実施した。実験データの解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ４（バージョン４．０２、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）を用いて実施した。このソフトウェアによって決定されるＳ字型用量反応曲線のＲ2値は、通常＞０．９０である。この解析プログラムにより、効力の尺度としてのＥＣ50値を算出した。
３６．ＣＤ３３及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
３６．１ ＣＤ３３及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
全般的には、ヒト及びマカクＣＤ３イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及びマカクＣＤ３３に対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表１４に挙げるように設計した。
ヒト及びマカクＣＤ３３に対して種間特異的である可変軽鎖（Ｌ）及び可変重鎖（Ｈ）ドメイン、並びにヒト及びマカクＣＤ３に対して種間特異的であるＣＤ３特異的ＶＨ及びＶＬの組み合わせを含む前記のコンストラクトを、遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えてそれぞれの二重特異性単鎖抗体分子のコード配列を、続いてフレームを揃えてヒスチジン6‐タグのコード配列及び停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に適切な制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位を介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。２継代の静置培養後、細胞培養物の上清を回収して続いての実験に用いた。
３６．２ ＣＤ３３及びＣＤ３種間特異的二重特異性抗体のフローサイトメトリー結合分析
ヒト及びマカクＣＤ３３並びにＣＤ３のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、ＦＡＣＳ分析を実施する。この目的のために、実施例２３．１で述べるようにヒトＣＤ３３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、及びヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ（ＤＳＭＺ，ブラウンシュバイク，ＡＣＣ４８３）を用いてヒト抗原への結合について試験した。マカク抗原に対する結合反応性は、実施例２３．２で述べる作製されたマカクＣＤ３３トランスフェクタント、及びマカクＰＢＭＣ（マカクＰＢＭＣの調製は、標準的なプロトコルに従い、マカクザルからの末梢血液のＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によって行った）を用いて試験した。それぞれの細胞株又はＰＢＭＣの２０００００個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清５０μｌと共に、３０分間氷上にてインキュベートした。細胞を２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ抗体（ＰｅｎｔａＨｉｓ抗体；Ｑｉａｇｅｎ；２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中にて１：２０に希釈）でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗Ｈｉｓ抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで１：１００に希釈したフィコエリトリンに結合したＦｃガンマ特異的抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）で検出した。トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清をネガティブコントロールとして用いた。
フローサイトメトリーはＦＡＣＳ‐Ｃａｌｉｂｕｒ装置上で実施し；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ハイデルベルク）。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のようにして実施した。
ＣＤ３３に対して種間特異的であり、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３に対して種間特異的であった上記に挙げた単鎖分子の二重特異性結合は、図６０に示すように明らかに検出可能であった。ＦＡＣＳ分析では、それぞれのネガティブコントロールと比較して、すべてのコンストラクトがＣＤ３及びＣＤ３３への結合を示した。二重特異性抗体のヒト及びマカクＣＤ３並びにＣＤ３３抗原への種間特異性が実証された。
３６．３ ＣＤ３３及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の生物活性
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例２３．１及び２３．２で述べるＣＤ３３陽性細胞株を用いるクロム５１（51Ｃｒ）放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。それぞれの図に示すように、エフェクター細胞としては、刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣ、又はマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘを用いた。
ペトリ皿（直径１４５ｍｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ‐ｏｎｅ ＧｍｂＨ，クレムスミュンスター）を、最終濃度１μｇ／ｍｌの市販の抗ＣＤ３特異的抗体（例：ＯＫＴ３，Ｏｔｈｏｃｌｏｎｅ）により３７℃にて１時間コーティングした。非結合タンパク質をＰＢＳによる１段階の洗浄によって除去した。新鮮なＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液（３０乃至５０ｍｌのヒト血液）から単離した。安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／ＩＬ‐２２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ）を含む１２０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中、３‐５×１０7個のＰＢＭＣを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、２日間刺激した。３日目に細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。ＩＬ‐２を添加して最終濃度を２０Ｕ／ｍｌとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度１日培養した。
ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞を標準的なプロトコルに従って除去することにより、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）を濃縮した。
標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％ＦＣＳを含む最終容量１００μｌのＲＰＭＩ中、１１．１ＭＢｑの51Ｃｒにて３７℃で４５分間標識した。続いて、標識された標的細胞を５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次に細胞障害性アッセイに用いた。アッセイは、９６ウェルプレート上、全容量２５０μｌの補足ＲＰＭＩ（上記と同様）中にて、Ｅ：Ｔ比１０：１で実施した。最終濃度５０％の種間特異的二重特異性単鎖抗体分子を発現する細胞の上清、及びその３倍希釈物２０個を適用した。アッセイの時間は１８時間であり、細胞障害性は、最大溶解（トリトンＸの添加）と自然溶解（エフェクター細胞なし）との差に関連する上清中の放出されたクロムの相対値として測定した。測定はすべて４個の反復サンプルで行った。上清中のクロムの放射能の測定は、Ｗｉｚａｒｄ３"ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ，ケルン，ドイツ）を用いて実施した。実験データの解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ４（バージョン４．０２、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）を用いて実施した。このソフトウェアによって決定されるＳ字型用量反応曲線のＲ2値は、通常＞０．９０である。この解析プログラムによって算出されるＥＣ50値を用いて生物活性を比較した。
図６１に示すように、作製された種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクトはすべて、刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣによって誘発されたヒトＣＤ３３陽性標的細胞に対する細胞障害活性、並びにマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘによって誘発されたマカクＣＤ３３陽性標的細胞に対する細胞障害活性を示している。
３７． 循環する血液細胞には存在しない標的分子に指向された従来の二重特異性ＣＤ３結合分子への曝露による循環するチンパンジーＴ細胞の再分布
雄のチンパンジー一匹に、単鎖ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクト（Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ （２００５） ＣａｎｃｅｒＲｅｓ ６５： ２８８２）の静脈内注入による用量増加試験を施した。従来の単鎖ＣＤ１９／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクト（Ｌｏｆｆｌｅｒ （２０００， Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌｕｍｅ ９５， Ｎｕｍｂｅｒ ６）、又は国際公開第９９／５４４４０号）と同様に、該ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３コンストラクトのＣＤ３アームも、従来のヒト及びチンパンジーＣＤ３のコンテクスト依存性エピトープに対して指向されている。第０日には、この動物は試験物質を含まない５０ｍｌのＰＢＳ／５％ＨＳＡを受け、続いて、ＰＢＳ／５％ＨＳＡプラス１．６、２．０、３．０、及び４．５μｇ／ｋｇ単鎖ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの５０ｍｌをそれぞれ第７、１４、２１、及び２８日に受けた。注入時間は各投与につき２時間とした。各週の注入では、チンパンジーを２乃至３ｍｇ／ｋｇのＴｅｌａｚｏｌの筋肉内投与によって鎮静化させ、挿管し、平均血圧が安定したイソフルラン／Ｏ2による麻酔状態とした。第二の静脈内カテーテルを逆側の肢に配置し、循環する血液細胞のＦＡＣＳ分析のために図６２に示す時間点で（ヘパリン処理）全血サンプルを採取した。標準的な赤血球溶解の後、チンパンジーＣＤ２（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）と反応するＦＩＴＣ標識抗体でＴ細胞を染色し、全リンパ球に対するＴ細胞のパーセントをフローサイトメトリーで測定した。図６２に示すように、単鎖ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの投与すべてにおいて循環するＴ細胞の急激な低下が誘発されており、これは、実質的に循環する標的Ｂ（リンパ腫）細胞を持たないＢ‐ＮＨＬ患者内において単鎖ＣＤ１９／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトで観察されたものと同様であった。ヒト及びチンパンジーの循環血液中にはＥｐＣＡＭ‐陽性標的細胞が存在しないことから、単鎖ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトへの曝露による循環するＴ細胞の低下は、標的細胞を介しての架橋の非存在下でのコンストラクトのＣＤ３アームと従来のコンテクスト依存性ＣＤ３エピトープとの純粋な相互作用を通してＴ細胞が受けるシグナルのみに起因し得る。実質的に循環する標的Ｂ（リンパ腫）細胞を持たないＢ‐ＮＨＬ患者において単鎖ＣＤ１９／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトへの曝露を通して誘発されるＴ細胞の再分布と同様に、単鎖ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトへの曝露によるチンパンジーでのＴ細胞の再分布は、コンテクスト依存性ＣＤ３エピトープへの結合イベントに続くＣＤ３のコンフォメーションの変化、そしてさらにその結果としての一時的な血管内皮へのＴ細胞の接着性の上昇によって説明することができる（実施例２０参照）。この発見により、コンテクスト依存性ＣＤ３エピトープへ指向された従来のＣＤ３結合分子は、この相互作用のみを通して、末梢血液Ｔ細胞の再分布パターン引き起こすことができ、このことが実施例２０で述べるようにヒトのＣＮＳ有害イベントのリスクと関連していることが確認される。
３８．ヒトＣＤ３イプシロンのＮ末端に対するｓｃＦｖクローンの特異的結合
３８．１ 大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ内でのｓｃＦｖコンストラクトの細菌発現
前述のように、ＶＬ及びＶＨセグメントを含むｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ／Ｆｌａｇで形質転換された大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅは、遺伝子ＩＩＩ断片の切除及び１ｍＭＩＰＴＧによる誘発の後、十分な量の可溶性ｓｃＦｖを産生する。ｓｃＦｖ鎖は周辺質へ放出され、そこで機能的コンフォメーションへフォールドする。
本実験では、以下のｓｃＦｖクローンを選択した：
ｉ）国際公開第２００４／１０６３８０号に記載の、ＳｃＦｖｓ ４‐１０、３‐１０６、３‐１１４、３‐１４８、４‐４８、３‐１９０、及び３‐２７１
ｉｉ）本明細書で述べる、ヒト抗ＣＤ３イプシロン結合クローンＨ２Ｃ、Ｆ１２Ｑ、及びＩ２ＣからのＳｃＦｖｓ
周辺質製剤については、ペリプラズム発現を可能にするプラスミドを含むそれぞれのｓｃＦｖで形質転換された細菌細胞を、２０ｍＭのＭｇＣｌ2及びカルベニシリン５０μｇ／ｍｌを補充したＳＢ培地で増殖させ、回収後にＰＢＳへ再溶解した。−７０℃での凍結及び３７℃での解凍を４ラウンド行うことにより、細菌の外膜を温度ショックで破壊し、ｓｃＦｖｓを含む可溶性周辺質タンパク質を上清中へ遊離させた。遠心分離によって無傷の細胞及び細胞片を除去した後、ヒト抗ヒトＣＤ３‐ｓｃＦｖｓを含む上清を回収し、それをさらなる分析に用いた。ｓｃＦｖを含むこれらの粗上清を、今後周辺質製剤（ＰＰＰ）と称する。
３８．２ ヒトＣＤ３イプシロン（ａａ １‐２７）‐Ｆｃ融合タンパク質に対するｓｃＦｖｓの結合
ＥＬＩＳＡ実験を、９６ウェルプラスチックプレート（Ｎｕｎｃ，ｍａｘｉｓｏｒｂ）のウェルへヒトＣＤ３イプシロン（ａａ １‐２７）‐Ｆｃ融合タンパク質を通常は４℃にて一晩コーティングすることによって行った。次に抗原コーティング溶液を除去し、ウェルをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１回洗浄し、続いてＰＢＳ／３％ＢＳＡで少なくとも１時間ブロックした。ブロッキング溶液の除去後、ＰＰＰ及びコントロール溶液をウェルに添加し、室温にて通常は１時間インキュベートした。次にウェルをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。固定化抗原に結合したｓｃＦｖｓの検出は、ビオチン標識抗ＦＬＡＧタグ抗体（Ｍ２抗Ｆｌａｇ‐Ｂｉｏ，Ｓｉｇｍａ、通常は最終濃度１μｇ／ｍｌＰＢＳ）を用いて行い、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Ｄｉａｎｏｖａ、１μｇ／ｍｌ ＰＢＳ）で検出した。ＡＢＴＳ基質溶液を添加することでシグナルを発色させ、４０５ｎｍの波長で測定した。ブロッキング剤及び／又はヒトＣＤ３イプシロン（ａａ１‐２７）‐Ｆｃ融合タンパク質のヒトＩｇＧ１部分に対する試験サンプルの非特異的結合は、ヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上にて同一の試薬及び同一のタイミングによる同一のアッセイを実施することによって分析した。ネガティブコントロールとしてＰＢＳを用いた。
図６３に示すように、ｓｃＦｖｓ Ｈ２Ｃ、Ｆ１２Ｑ、及びＩ２Ｃは、ヒトＣＤ３イプシロン（ａａ １‐２７）‐Ｆｃ融合タンパク質に対して強い結合シグナルを示している。ヒトｓｃＦｖｓ３‐１０６、３‐１１４、３‐１４８、３‐１９０、３‐２７１、４‐１０、及び４‐４８（国際公開第２００４／１０６３８０号に記載）は、ネガティブコントロールレベルを超えるような有意な結合はまったく示していない。
ヒトＣＤ３イプシロン（ａａ １‐２７）‐Ｆｃ融合タンパク質でコーティングしたウェルに対するｓｃＦｖｓ Ｈ２Ｃ、Ｆ１２Ｑ、及びＩ２Ｃの陽性結合が、ＢＳＡ（ブロッキング剤として使用）及び／又はヒトＣＤ３イプシロン（ａａ１‐２７）‐Ｆｃ融合タンパク質のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ‐ガンマ部分によるものであり得るという可能性を排除するために、第二のＥＬＩＳＡ実験を平行して実施した。この第二のＥＬＩＳＡ実験では、ヒトＣＤ３イプシロン（ａａ１‐２７）‐Ｆｃ融合タンパク質の代わりにＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）でコーティングしたこと以外は、すべてのパラメータを第一のＥＬＩＳＡ実験と同一とした。図６４に示すように、試験したｓｃＦｖｓはいずれも、ＢＳＡ及び／又はヒトＩｇＧ１に対してバックグラウンドレベルを超えるような有意な結合をまったく示さなかった。
まとめると、これらの結果から、ＣＤ３イプシロンのコンテクスト依存性エピトープを認識する従来のＣＤ３結合分子（例：国際公開第２００４／１０６３８０号に開示）は、ヒトＣＤ３イプシロン（ａａ１‐２７）領域と特異的な結合をせず、一方ＣＤ３イプシロンのコンテクスト非依存性エピトープと結合するｓｃＦｖｓ Ｈ２Ｃ、Ｆ１２Ｑ、及びＩ２Ｃは、ヒトＣＤ３イプシロンのＮ末端の２７アミノ酸に対する特異的な結合を明らかに示すと結論付けることができる。
３９．ＣＤ４４及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
３９．１ 種間特異的結合分子のクローン化
全般的には、ヒト及びマカクＣＤ３イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及びマカクＣＤ４４に対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表１５に挙げるように設計する。
ヒト及びマカクＣＤ４４に対して種間特異的である可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン、並びにヒト及びマカクＣＤ３に対して種間特異的であるＶＨ及びＶＬドメインを含む前記のコンストラクトを、遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えてそれぞれの二重特異性単鎖抗体分子のコード配列を、続いてフレームを揃えてヒスチジン6‐タグのコード配列及び停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、適切なＮ末端及びＣ末端制限部位が導入されるようにも設計した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位を介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ標準的なプロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））に従ってクローン化した。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠失チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へトランスフェクトした。
３９．２ 二重特異性単鎖抗体分子の発現
二重特異性コンストラクトは、ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中で一過性に発現させた。簡潔に述べると、コンストラクトあたり４×１０5個の細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び細胞培養グレード試薬のストック液からのヌクレオシド（Ｓｉｇｍａ‐ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，タウフキルヘン，ドイツ）を補充して最終濃度を１０μｇ／ｍｌアデノシン、１０μｇ／ｍｌデオキシアデノシン、及び１０μｇ／ｍｌチミジンとした安定化グルタミンを含む３ｍｌのＲＰＭＩ１６４０全培地（ａｌｌｍｅｄｉｕｍ）中、インキュベーター内で３７℃、湿度９５％、及び７％ＣＯ2にてトランスフェクションの一日前に培養した。トランスフェクションは、ＦｕｇｅｎｅＨＤトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ，＃０４７０９６９１００１）を用いて製造元のプロトコルに従って行った。９４μｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び６μｌのＦｕｇｅｎｅＨＤを混合し、室温で５分間インキュベートした。続いて、コンストラクトあたり１．５μｇのＤＮＡを添加し、混合し、室温で１５分間インキュベートした。その間、ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、１．５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０全培地に再懸濁した。トランスフェクション混合物を６００μｌのＲＰＭＩ１６４０全培地で希釈し、細胞へ添加し、３７℃、湿度９５％、及び７％ＣＯ2にて一晩インキュベートした。トランスフェクションの翌日、各手法のインキュベーション容量をＲＰＭＩ１６４０全培地５ｍｌへ拡張した。３日間のインキュベーションの後、上清を回収した。
３９．３ ＣＤ４４及びＣＤ３種間特異的二重特異性抗体のフローサイトメトリー結合分析
ヒト及びマカクＣＤ４４並びにＣＤ３のそれぞれへ結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、ＦＡＣＳ分析を実施した。この目的のために、ヒトＣＤ４４でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（実施例２８．１で述べるように）、及びヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ（ＤＳＭＺ，ブラウンシュバイク，ＡＣＣ４８３）を用いてヒト抗原への結合について試験した。マカク抗原に対する結合反応性は、作製されたマカクＣＤ４４トランスフェクタント（実施例２８．３で述べる）、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（Ｐｒｏｆ．Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ，Ｈｙｇｉｅｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｅｒｌａｎｇｅｎ‐Ｎｕｅｒｎｂｅｒｇ、よりご提供頂いた；Ｋｎａｐｐｅ Ａ， ｅｔ ａｌ．， ａｎｄ ＦｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒＨ．， Ｂｌｏｏｄ ２０００， ９５， ３２５６‐６１、にて発表）を用いて試験した。種間特異的二重特異性抗体コンストラクトのＣＤ４４に対する特異性を示すために、ヒトＣＤ４４ｄｅｌｖ６（ｖ６エクソンを欠失させたＣＤ４４）に対する結合を、ヒトＣＤ４４ｄｅｌｖ６（作製法は実施例２８．２で述べる）でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いて試験した。それぞれの細胞株の２００，０００個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞上清５０μｌと共に、３０分間氷上にてインキュベートした。２％ＦＣＳを含むＰＢＳで細胞を２回洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ抗体（ＰｅｎｔａＨｉｓ抗体；Ｑｉａｇｅｎ；２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中にて１：２０に希釈）でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗Ｈｉｓ抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで１：１００に希釈したフィコエリトリンに結合したＦｃガンマ特異的抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）で検出した。トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を、Ｔ細胞株への結合に対するネガティブコントロールとして用いた。関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを、ＣＤ４４及びＣＤ４４ｄｅｌｖ６でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合に対するネガティブコントロールとして用いた。
フローサイトメトリーはＦＡＣＳ‐Ｃａｌｉｂｕｒ装置上で実施し；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ハイデルベルク）。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のようにして実施した。
ＣＤ４４に対して種間特異的であり、ヒト及びマカクＣＤ３に対して種間特異的である上記に挙げた単鎖分子の二重特異性結合は、図６５ａ‐ｄに示すように明らかに検出可能であった。図６５ｅでは、ＣＤ４４ｄｅｌｖ６に対するこの分子の結合は見られなかった。従って、二重特異性抗体のヒト及びマカクＣＤ３並びにＣＤ４４抗原に対する種間特異性が明らかに実証された。
３９．４ ＣＤ４４及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の生物活性
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例２８．１で述べるヒトＣＤ４４陽性細胞株を用いるクロム５１（51Ｃｒ）放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。それぞれの図に示すように、エフェクター細胞としては、刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣ、刺激されたヒトＰＢＭＣを用いた。
刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣの作製は以下のようにして実施した：
ペトリ皿（直径１４５ｍｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ‐ｏｎｅ ＧｍｂＨ，クレムスミュンスター）のコーティングは、最終濃度１μｇ／ｍｌの市販の抗ＣＤ３特異的抗体（例：ＯＫＴ３，Ｏｔｈｏｃｌｏｎｅ）により３７℃にて１時間行った。非結合タンパク質をＰＢＳによる１段階の洗浄によって除去した。新鮮なＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液（３０乃至５０ｍｌのヒト血液）から単離した。安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／ＩＬ‐２２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ）を含む１２０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中、３‐５×１０7個のＰＢＭＣを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、２日間刺激した。３日目に細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。ＩＬ‐２を添加して最終濃度を２０Ｕ／ｍｌとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度１日培養した。標準的なプロトコルに従ってＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞を除去することにより、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）を濃縮した。
標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％ＦＣＳを含む最終容量１００μｌのＲＰＭＩ中、１１．１ＭＢｑの51Ｃｒにて３７℃で４５分間標識した。続いて、標識された標的細胞を５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次に細胞障害性アッセイに用いた。アッセイは、９６ウェルプレート上、全容量２５０μｌの補足ＲＰＭＩ（上記のように）中にて、Ｅ：Ｔ比１０：１で実施した。種間特異的二重特異性単鎖抗体分子を含む細胞上清及びその２倍希釈物２０個をヒト細胞障害性アッセイに適用した。アッセイの時間は１８時間とし、細胞障害性は、最大溶解（トリトンＸの添加）と自然溶解（エフェクター細胞なし）との差に関連する上清中の放出されたクロムの相対値として測定した。測定はすべて４個の反復サンプルで行った。上清中のクロムの放射能の測定は、Ｗｉｚａｒｄ３"ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ，ケルン，ドイツ）を用いて実施した。実験データの解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ４（バージョン４．０２、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）を用いて実施した。このソフトウェアによって決定されるＳ字型用量反応曲線のＲ2値は、通常＞０．９０である。この解析プログラムによって算出されるＥＣ50値を用いて生物活性を比較した。
図６６に示すように、作製された種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクトはすべて、刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣによって誘発されたＣＤ４４陽性標的細胞に対する細胞障害活性を示した。
４０．ＨＣＶ抗原及びＣＤ３種間特異的二重特異性タンデム（ｔａｎｄｅｍ）単鎖抗体断片の作製
４０．１ ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質Ｅ２（ＨＣＶ遺伝子型１ａ及び１ｂ）を発現するＣＨＯ細胞の作製
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープ糖タンパク質Ｅ２（ＨＣＶ遺伝子型１ａ及び１ｂ、それぞれのサブタイプのＨＣＶ単離物；標準的なプロトコルに従って配列を決定）のコード配列を、各々ヒトＣＤ４膜貫通及び細胞内ドメインとの翻訳融合タンパク質として、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて１４アミノ酸シグナルペプチドのコード配列を、続いてＨＣＶＥ２エンベロープ糖タンパク質の最初の２７８個（遺伝子型１ａ）又は２７９個（遺伝子型１ｂ）のアミノ酸のコード配列、２倍のｍｙｃエピトープ配列、及び成熟タンパク質の３７２乃至４３３のアミノ酸に対応するヒトＣＤ４膜貫通及び細胞内ドメインのコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１２８０７で公開）、並びに停止コドンを含むように設計した（コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を、それぞれ遺伝子型１ａ及び１ｂである配列番号ＨＣＶ‐１乃至ＨＣＶ‐４に挙げた）。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、５'末端にはＥｃｏＲＩ及び３'末端にはＳａｌＩであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩを介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。最終的に、表面に発現されたＨＣＶ Ｅ２ドメイン遺伝子型１ａを有するＣＨＯ細胞株、及び表面に発現されたＨＣＶＥ２ドメイン遺伝子型１ｂを有するＣＨＯ細胞株、の２種類の細胞株が作製された。
４０．２ 種間二重特異性タンデム単鎖抗体断片のクローン化
全般的には、ヒト及びマカクＣＤ３イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにＨＣＶに対しての結合特異性を持つドメインを含む二重特異性タンデム単鎖抗体断片を、以下の表１６に挙げるように設計した。
ＨＣＶ抗原に対して特異的である可変軽鎖（Ｌ）及び可変重鎖（Ｈ）ドメイン、並びにヒト及びマカクＣＤ３に対して種間特異的であるＶＨ及びＶＬの組み合わせを含む前記のコンストラクトを、遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて二重特異性タンデム単鎖抗体断片のコード配列を、続いてフレームを揃えてヒスチジン6‐タグのコード配列及び停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に適切な制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位を介して、ｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（ｐＥＦ‐ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０、に記載されている）と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、二重特異性タンデム単鎖抗体断片の真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中での真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を最大２０ｎＭＭＴＸまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
４０．３ 二重特異性タンデム単鎖抗体断片の発現及び精製
二重特異性タンデム単鎖抗体断片は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）中で発現させた。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中の真核生物タンパク質発現は、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７‐５６６、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、２０ｎＭ ＭＴＸの最終濃度まで増加する濃度のＭＴＸを添加することによって誘発した。２継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないＨｙＱＰＦ ＣＨＯ液体大豆培地（０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ‐６８含有Ｌ‐グルタミン ４．０ｍＭを含む；ＨｙＣｌｏｎｅ）により、ローラーボトル中、回収まで７日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−２０℃で保存した。別の選択肢として、コンストラクトを一過性にＨＥＫ２９３細胞中で発現させた。トランスフェクションは、２９３ｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１２３４７‐０１９）を用い、製造元のプロトコルに従って実施する。
クロマトグラフィにはＡｋｔａ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた。ＺｎＣｌ2を充填したＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ Ｃｈｅｌａｔｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を用い、製造元が提供するプロトコルに従って固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（「ＩＭＡＣ」）を実施した。バッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ）でカラムを平衡状態とし、細胞培養物の上清（５００ｍｌ）を流速３ｍｌ／分でカラム（１０ｍｌ）に適用した。バッファーＡでカラムを洗浄して非結合サンプルを除去した。結合したタンパク質を、バッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ イミダゾール）の以下に示す２段階の勾配：
段階１：６カラム分の容量の２０％バッファーＢ
段階２：６カラム分の容量の１００％バッファーＢ
を用いて溶離させた。段階２からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Ｓｉｇｍａ（ダイゼンホッフェン）又はＭｅｒｃｋ（ダルムシュタット）より購入した。
ゲル濾過クロマトグラフィを、平衡バッファー（２５ｍＭ クエン酸塩、２００ｍＭ リジン、５％ グリセロール、ｐＨ７．２）で平衡状態としたＨｉＬｏａｄ１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ 分取グレードカラム（ＧＥ／アマーシャム）上で実施した。溶離したタンパク質サンプル（流速１ｍｌ／分）を標準的なＳＤＳ‐ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによる検出に掛けた。精製の前に、分子量測定のためにカラムを校正した（分子量マーカーキット、ＳｉｇｍａＭＷ ＧＦ‐２００）。タンパク質濃度は、ＯＤ２８０ｎｍを用いて測定した。
精製した二重特異性タンデム単鎖抗体断片は、還元性条件下、４‐１２％ビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプレキャストしたＳＤＳＰＡＧＥで分析した。サンプルの調製及び適用は製造元が提供するプロトコルに従って実施した。分子量はＭｕｌｔｉＭａｒｋタンパク質スタンダード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて決定した。ゲルの染色にはコロイド状クーマシーを用いた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコル）。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって測定された単離したタンパク質の純度は＞９５％であった。
ＰＢＳ中のゲル濾過によって測定する自然条件下での二重特異性タンデム単鎖抗体断片の分子量は約５２ｋＤａである。
ウエスタンブロットは、Ｏｐｔｉｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ‐Ｓ８３膜及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅを用い、製造元が提供するプロトコルに従って実施した。用いた抗体は、Ｈｉｓタグに対して指向されたもの（ＰｅｎｔａＨｉｓ，Ｑｉａｇｅｎ）、及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）で標識したヤギ抗マウスＩｇ（Ｓｉｇｍａ）、及び基質としてのＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）である。精製された二重特異性タンデム単鎖抗体断片に対応する５２ｋＤに単一のバンドを検出した。
４０．４ ＨＣＶ抗原及びＣＤ３種間特異的二重特異性タンデム単鎖抗体断片のフローサイトメトリー結合分析
ＨＣＶ抗原並びにヒト及びマカクＣＤ３のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性タンデム単鎖抗体断片の機能を試験するために、ＦＡＣＳ分析を実施した。この目的のために、実施例４０．１で述べる２種類の異なるＨＣＶ遺伝子型（１ａ及び１ｂ）からのＨＣＶ抗原Ｅ２でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ（ＤＳＭＺ，ブラウンシュバイク，ＡＣＣ４８３）、及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘを用いてそれぞれの抗原への結合について試験した。それぞれの細胞株の２００，０００個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清５０μｌと共に、３０分間氷上にてインキュベートした。細胞を２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ抗体（ＰｅｎｔａＨｉｓ抗体；Ｑｉａｇｅｎ；２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中にて１：２０に希釈）で二重特異性タンデム単鎖抗体断片の結合を検出した。洗浄後、結合した抗Ｈｉｓ抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで１：１００に希釈したフィコエリトリンに結合したＦｃガンマ特異的抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）で検出した。
フローサイトメトリーはＦＡＣＳ‐Ｃａｌｉｂｕｒ装置上で実施し；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ハイデルベルク）。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のようにして実施した。
ＨＣＶ抗原及び及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３に対する二重特異性タンデム単鎖抗体断片の二重特異性結合は、図６７に示すように明らかに検出可能であった。ＦＡＣＳ分析では、対応するネガティブコントロールと比較して、二重特異性タンデム単鎖抗体断片はＣＤ３及びＨＣＶ抗原への結合を示した。二重特異性タンデム単鎖抗体断片の、一方ではヒト及びマカクＣＤ３に対する種間特異性が、並びにもう一方ではＨＣＶ特異性が実証された。
４０．５ ＨＣＶ抗原及びＣＤ３種間特異的二重特異性タンデム単鎖抗体断片の生物活性
二重特異性タンデム単鎖抗体断片の生物活性を、実施例４０．１で述べるＨＣＶ抗原陽性細胞株を用いるクロム５１（51Ｃｒ）放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。エフェクター細胞としては、異なるドナー２人から採取した刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣを用いた。
ペトリ皿（直径１４５ｍｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ‐ｏｎｅ ＧｍｂＨ，クレムスミュンスター）を、最終濃度１μｇ／ｍｌの市販の抗ＣＤ３特異的抗体（例：ＯＫＴ３，Ｏｔｈｏｃｌｏｎｅ）により３７℃にて１時間コーティングした。非結合タンパク質をＰＢＳによる１段階の洗浄によって除去した。新鮮なＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液（３０乃至５０ｍｌのヒト血液）から単離した。安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／ＩＬ‐２２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ）を含む１２０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中、３‐５×１０7個のＰＢＭＣを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、２日間刺激した。３日目に細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。ＩＬ‐２を添加して最終濃度を２０Ｕ／ｍｌとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度１日培養した。
標準的なプロトコルに従ってＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞を除去することにより、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）を濃縮した。
標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％ＦＣＳを含む最終容量１００μｌのＲＰＭＩ中、１１．１ＭＢｑの51Ｃｒにて３７℃で４５分間標識した。続いて、標識された標的細胞を５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次に細胞障害性アッセイに用いた。アッセイは、９６ウェルプレート上、全容量２５０μｌの補足ＲＰＭＩ（上記のように）中にて、Ｅ：Ｔ比１０：１で実施した。７６．４μｇ／ｍｌの種間特異的二重特異性タンデム単鎖抗体断片及びその２倍希釈物２０個を適用した。アッセイの時間は１８時間とし、細胞障害性は、最大溶解（トリトンＸの添加）と自然溶解（エフェクター細胞なし）との差に関連する上清中の放出されたクロムの相対値として測定した。測定はすべて４個の反復サンプルで行った。上清中のクロムの放射能の測定は、Ｗｉｚａｒｄ３"ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ，ケルン，ドイツ）を用いて実施した。実験データの解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ４（バージョン４．０２、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）を用いて実施した。
図６８に示すように、種間特異的二重特異性タンデム単鎖抗体断片は、ヒトＨＣＶ抗原陽性標的細胞に対する細胞障害活性を示した。
４１．ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３、並びに感染した細胞の表面に提示された肝炎ウイルス抗原に指向された二重特異性タンデム単鎖抗体断片
４１．１ Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
およそ１５乃至２０ヌクレオチドの末端区間で互いにオーバーラップし、第二のプライマーがすべてアンチセンスプライマーである以下の縮重オリゴヌクレオチドを用いて、ＣＤＲＨ１（配列番号１６３４）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６３５）、及びＣＤＲＨ３（配列番号１６３６）に対するヒトＶＨ配列コンテクストを得た：
５'Ｃ８‐ＶＨ‐Ａ‐ＸｈｏＩ
ＣＣＡＣＴＴＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＣＧＳＣＧＲＡＳＴＧＭＷＧＭＡＧＣＣＴＧＧＣＧＳＣＴＣＣＳＴＧＭＲＧＳＴＧＴＣＣＴＧＣＲＭＧＧＣＣＴＣＣＧＧＣ
３'Ｃ８‐ＶＨ‐Ｂ
ＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＣＣＧＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＧＷＧＡＡＧＧＴＧＷＡＧＣＣＧＧＡＧＧＣＣＫＹＧＣＡＧＧＡ
５'Ｃ８‐ＶＨ‐Ｃ
ＣＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＭＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＲＴＧＲＧＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧ
３'Ｃ８‐ＶＨ‐Ｄ
ＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＴＡＧＴＡＣＡＳＧＧＣＧＧＴＧＴＣＣＴＣＧＧＭＣＣＧＣＡＧＧＧＡＧＹＴＣＡＫＣＴＳＣＡＫＧＴＡＣＡＳＧＧＴＧＹＴＣＫＴＧＧＡＧＫＴＧＴＣＣＣＧＧＳＴＳＡＴＴＧＴＧＡＭＣＣＧＧＣＣＣＴＴＣＡＣＧＧＡ
３'Ｃ８‐ＶＨ‐Ｅ‐ＢｓｔＥＩＩ
ＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＴＧＣＣＣＡＧＡＧＧＧＡＡＧＴＡＧＴＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＣＣＧＴＡＧＴＡＴＴＣＣＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＴＡＧＴＡ
このプライマーセットは、ＶＨ配列全体の範囲を含んでいる。このセット内で、同量のプライマー（例：２０μｌＰＣＲ反応に対して１μｌの各プライマー（プライマーストック２０乃至１００μＭ））を混合し、ＰＣＲバッファー、ヌクレオチド、及びＴａｑポリメラーゼから成るＰＣＲ混合物へ添加した。この混合物をＰＣＲサイクラー中にて９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、及び７２℃で１０分間インキュベートした。続いて生成物をアガロースゲル電気泳動に掛け、標準的な方法に従って２００乃至４００のサイズの生成物をゲルから単離した。
次に、得られたＶＨ ＰＣＲ生成物を、Ｎ末端及びＣ末端の適切なクローン化制限部位を組み込まれたプライマー（プライマー５'Ｃ８‐ＶＨ‐Ａ‐ＸｈｏＩ及びプライマー３'Ｃ８‐ＶＨ‐Ｅ‐ＢｓｔＥＩＩ）を用いる標準的なＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。適切なサイズのＤＮＡ断片（ＶＨに対してはおよそ３５０ヌクレオチド）を、標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動によって単離した。この方法により、十分なＶＨＤＮＡ断片が増幅された。
およそ１５乃至２０ヌクレオチドの末端区間で互いにオーバーラップし、第二のプライマーがすべてアンチセンスプライマーである以下の縮重オリゴヌクレオチドを用いて、ＣＤＲＨ１（配列番号１６３４）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６３５）、及びＣＤＲＨ３（配列番号１６３６）に付随するＣＤＲＬ１（配列番号１６３９）、ＣＤＲＬ２（配列番号１６４０）、及びＣＤＲＬ３（配列番号１６４１）に対するヒトＶＬ配列コンテクストを得た：
５'Ｃ８‐Ｖｌ‐Ａ‐ＳａｃＩ
ＣＣＴＣＡＡＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＴＧＡＹＧＣＡＧＣＣＴＳＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＫＣＣＣＹＴＧＧＣＭＡＧＡＣＣＧＣＣＭＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＡＣ
３'Ｃ８‐Ｖｌ‐Ｂ
ＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＧＭＣＴＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＴＧＣＡＣＧＧＡＣＴＴＧＧＡＧＣＣＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＧＴＧＡＴ
５'Ｃ８‐Ｖｌ‐ＣＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧＫＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＲＴＡＴＡＣＧＡＣＧＡＣＴＣＣＧＡＣＣＧＣＣＣＴＴＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣ
３'Ｃ８‐Ｖｌ‐Ｄ
ＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＡＧＴＡＧＴＣＧＧＣＣＴＣＧＴＣＣＭＹＧＧＣＣＴＳＣＲＣＣＣＳＧＧＡＧＡＴＧＧＴＣＡＧＧＧＴＧＲＣＧＧＴＧＫＴＧＣＣＧＧＡＧＹＴＧＧＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＣＧ
３'Ｃ８‐Ｖｌ‐Ｅ‐ＢｓｉＷＩ／ＳｐｅＩ
ＣＣＣＧＡＴＡＣＴＡＧＴＣＧＴＡＣＧＣＡＧＣＡＣＧＧＴＣＡＧＣＴＴＴＧＴＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＡＧＴＡＧＴＣＧＧＣ
このプライマーセットは、対応するＶＬ配列全体の範囲を含んでいる。このセット内で、同量のプライマー（例：２０μｌＰＣＲ反応に対して１μｌの各プライマー（プライマーストック２０乃至１００μＭ））を混合し、ＰＣＲバッファー、ヌクレオチド、及びＴａｑポリメラーゼから成るＰＣＲ混合物へ添加した。この混合物をＰＣＲサイクラー中にて９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、及び７２℃で１０分間インキュベートした。続いて生成物をアガロースゲル電気泳動に掛け、標準的な方法に従って２００乃至４００のサイズの生成物をゲルから単離する。
次に、得られたＶＬ ＰＣＲ生成物を、Ｎ末端及びＣ末端の適切なクローン化制限部位を組み込まれたプライマー（プライマー５'Ｃ８‐Ｖｌ‐Ａ‐ＳａｃＩ及びプライマー３'Ｃ８‐Ｖｌ‐Ｅ‐ＢｓｉＷＩ／ＳｐｅＩ）を用いる標準的なＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。適切なサイズのＤＮＡ断片（ＶＬに対してはおよそ３３０ヌクレオチド）を、標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動によって単離した。この方法により、十分なＶＬＤＮＡ断片が増幅された。
次に、最終的なＶＨ ＰＣＲ生成物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＨのレパートリー）を、そのそれぞれの最終的なＶＬ ＰＣＲ生成物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＬのレパートリー）と、ファージディスプレイベクターｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ中で組み合わせて機能的ｓｃＦｖ抗体断片のライブラリーを形成し、そこから、繊維状ファージ上でのディスプレイ後、以下で述べるようにして抗ＨＢＳバインダーを選別し、スクリーニングし、同定し、確認した：
軽鎖断片（ＳａｃＩ‐ＳｐｅＩで消化）４５０ｎｇをファージミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ（ＳａｃＩ‐ＳｐｅＩで消化；長断片）１４００ｎｇとライゲートさせた。次に、得られたコンビナトリアル抗体ライブラリーを、３００μｌのエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞へエレクトロポレーションによって形質転換し（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５μＦＤ、２００オーム、Ｂｉｏｒａｄ ｇｅｎｅ‐ｐｕｌｓｅｒ）、独立したクローンが１０7を超えるライブラリーサイズを得た。１時間の表現型の発現の後、ｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓベクターによってコードされたカルベニシリン耐性に対して陽性である形質転換体を１００ｍｌの液体スーパーブロス（ＳＢ）培地中で一晩選別した。次に、細胞を遠心分離によって回収し、市販のプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドの調製を行った。
ＶＬ‐ライブラリーを含むこのプラスミド‐ＤＮＡ（ＸｈｏＩ‐ＢｓｔＥＩＩで消化；長断片）２８００ｎｇを重鎖Ｖ断片（ＸｈｏＩ‐ＢｓｔＥＩＩで消化）９００ｎｇとライゲートさせ、再度エレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞３００μｌの２つのアリコートへエレクトロポレーションによって形質転換し（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５μＦＤ、２００オーム）、独立したクローンが１０7を超えるＶＨ‐ＶＬ ｓｃＦｖ抗体断片の全ライブラリーサイズを得た。
表現型の発現及びカルベニシリンへのゆるやかな適応の後、抗体ライブラリーを含む大腸菌細胞をＳＢ‐カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）選択培地へ移した。抗体ライブラリーを含む大腸菌細胞は、次にヘルパーファージＶＣＳＭ１３の粒子の感染量１０12個で感染させて繊維状Ｍ１３ファージを産生及び分泌させ、ここでファージ粒子は、ｓｃＦｖ抗体断片をコードする一本鎖ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ‐ＤＮＡを含み、そして対応するｓｃＦｖ抗体断片をファージコートタンパク質ＩＩＩへの翻訳融合物として提示した。抗体ライブラリーを提示するファージのこのプールを抗原結合要素の選別に用いた。
同様に、前述の手順を別の標的バインダーに適用した。この目的のために、およそ１５乃至２０ヌクレオチドの末端区間で互いにオーバーラップし、第二のプライマーがすべてアンチセンスプライマーである以下の縮重オリゴヌクレオチドを用いて、ＣＤＲＨ１（配列番号１６６９）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６７０）、及びＣＤＲＨ３（配列番号１６７１）に対するヒトＶＨ配列コンテクストを得た：
５'Ｃ９‐ＶＨ‐Ａ‐ＸｈｏＩ
ＣＣＡＣＴＴＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＳＡＧＲＧＧＴＧＲＷＧＭＡＧＣＣＴＧＧＧＲＳＧＴＣＣＳＴＧＡＲＡＳＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡ
３'Ｃ９‐ＶＨ‐Ｂ
ＣＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＫＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＣＣＣＡＧＴＧＴＡＴＧＣＣＡＴＡＡＴＴＡＣＴＧＡＡＧＧＴＧＷＡＴＣＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＡＣＡＧＧＡ
５'Ｃ９‐ＶＨ‐Ｃ
ＧＣＴＣＣＡＧＧＣＭＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＲＴＧＧＳＡＣＴＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡ
３'Ｃ９‐ＶＨ‐Ｄ
ＧＴＡＡＴＡＴＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＡＧＲＴＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣＡＫＴＴＳＣＡＫＡＴＭＣＡＣＣＧＴＧＹＴＣＫＴＡＧＡＡＧＴＧＴＣＴＣＴＧＧＴＳＡＴＧＧＹＧＡＭＴＣＧＧＣＣＣＴＴＣＡＣＧＧＡＧＴＣ
３'Ｃ９‐ＶＨ‐Ｅ‐ＢｓｔＥＩＩ
ＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡＧＴＣＡＡＡＴＴＣＣＣＣＣＣＡＧＴＡＣＡＡＧＧＣＡＡＴＡＣＣＣＣＣＡＧＡＴＴＴＣＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＴＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＣ
Ｎ末端及びＣ末端の適切なクローン化制限部位をＶＨへ組み込むための最後の標準的なＰＣＲ反応のためのプライマーとして、５'Ｃ９‐ＶＨ‐Ａ‐ＸｈｏＩ及び３'Ｃ９‐ＶＨ‐Ｅ‐ＢｓｔＥＩＩのオリゴヌクレオチドを用いた。
ＶＨと同様に、およそ１５乃至２０ヌクレオチドの末端区間で互いにオーバーラップし、第二のプライマーがすべてアンチセンスプライマーである以下の縮重オリゴヌクレオチドを用いて、ＣＤＲＨ１（配列番号１６６９）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６７０）、及びＣＤＲＨ３（配列番号１６７１）に付随するＣＤＲＬ１（配列番号１６７２）、ＣＤＲＬ２（配列番号１６７３）、及びＣＤＲＬ３（配列番号１６７４）に対するヒトＶＬ配列コンテクストを得た：
５'Ｃ９‐Ｖｌ‐Ａ‐ＳａｃＩ
ＣＣＴＣＡＡＧＡＧＣＴＣＧＷＡＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＡＧＹＧＧＣＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＭＧＧＹＣＡＹＧＡＴＴＴＣＣＴＧＴＧＧＧＧＧＡＡＡＣ３'Ｃ９‐Ｖｌ‐Ｂ
ＧＣＣＴＧＧＣＷＫＣＴＧＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＴＧＣＡＣＧＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＡＴＧＴＴＧＴＴＴＣＣＣＣＣＡＣＡＧＧＡＡＡＴ
５'Ｃ９‐Ｖｌ‐Ｃ
ＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＭＷＧＣＣＡＧＧＣＭＭＧＧＣＣＣＣＴＲＷＧＣＴＧＳＴＣＲＴＣＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＡＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＳＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣ
３'Ｃ９‐Ｖｌ‐Ｄ
ＣＡＣＴＴＧＡＣＡＡＴＡＡＴＡＧＴＣＧＧＣＣＴＣＡＴＣＣＣＣＧＧＹＴＴＳＧＡＳＣＣＹＧＫＴＧＡＴＧＳＹＣＡＧＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＣＣＣＡＧＡＳＴＴＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＴＣＧ
３'Ｃ９‐Ｖｌ‐Ｅ‐ＢｓｉＷＩ／ＳｐｅＩ
ＣＣＣＧＡＴＡＣＴＡＧＴＣＧＴＡＣＧＴＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＧＣＴＴＣＧＴＣＣＣＴＣＣＧＣＣＧＡＡＴＡＣＣＡＣＡＴＧＡＴＣＡＣＴＡＣＣＡＣＴＡＴＣＣＣＡＣＡＣＴＴＧＡＣＡＡＴＡＡＴＡＧＴＣ
Ｎ末端及びＣ末端の適切なクローン化制限部位をＶＬへ組み込むための最後の標準的なＰＣＲ反応のためのプライマーとして、５'Ｃ９‐Ｖｌ‐Ａ‐ＳａｃＩ及び３'Ｃ９‐Ｖｌ‐Ｅ‐ＢｓｉＷＩ／ＳｐｅＩのオリゴヌクレオチドを用いた。
抗原結合要素の選別のために、クローン化されたｓｃＦｖレパートリーを持つファージライブラリーを、それぞれの培養物の上清からＰＥＧ（ポリエチレングリコール）８０００／ＮａＣｌ沈殿及び遠心分離によって回収した。およそ１０11乃至１０12個のｓｃＦｖファージ粒子を０．４ｍｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に再懸濁させ、固定化ＨＢＳ抗原（例：ＥｎｇｅｒｉｘＲ‐Ｂ，ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，ドイツ；ＨＢｖａｘＰｒｏ（商標），ＡｖｅｎｔｉｓＰａｓｔｅｕｒ ＭＳＤ ＳＮＣ，フランス）と共に３７℃で２時間ゆっくり攪拌しながらインキュベートする。この固定化ＨＢＳ抗原（例：５μｇ／ｍｌ ＰＢＳ）をウェルにコーティングし、続いてこのウェルを標準的なプロトコルに従ってブロックした。
標的抗原に対して特異的に結合しないｓｃＦｖ抗体断片を提示するファージ粒子は、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ（洗浄の厳密性を向上させるために洗浄溶液にＴｗｅｅｎ２０を添加してもよい）による洗浄工程によって除去した。洗浄後、ｐＨ２．２のＨＣｌ‐グリシンを用いて結合要素を溶離し、ｐＨ１２の２Ｍトリスによる中和の後、その溶離液を新鮮な感染させていない大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ培養物の感染に用いた。
溶離処理したウェル中に残留する強く結合した要素を溶離するために、２００μｌの新鮮な大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ培養物（ＯＤ６００＞０．５）を溶離処理したウェルに添加し、ゆっくり攪拌しながらさらに１０分間インキュベートした。両方の大腸菌培養物を次に混合し、ヒトｓｃＦｖ抗体断片をコードするファージミドコピーでの形質導入に成功した細胞をカルベニシリン耐性について再度選別し、続いてＶＣＭＳ１３ヘルパーファージで感染させることで、抗体提示及びインビトロ選別の第二ラウンドを開始した。通常は、合計で４乃至５ラウンドの選別を実施した。
選別後、ＨＢＳ特異的バインダーについてのスクリーニングを行うために、４及び５ラウンドのパニングに対応するプラスミドＤＮＡを大腸菌培養物から単離した。可溶性ｓｃＦｖ抗体断片の産生のためにＶＨ‐ＶＬ‐ＤＮＡ断片をプラスミドから切除した（ＸｈｏＩ‐ＳｐｅＩ）。これらの断片を、元のｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓとは発現コンストラクト（例：ｓｃＦｖ抗体断片）がＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）をｓｃＦｖ抗体断片とＨｉｓ6タグとの間に有するという点で異なるプラスミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓへ同じ制限部位を介してクローン化し、さらなるファージタンパク質を除去した。ライゲーションの後、プラスミドＤＮＡの各プール（パニングのラウンドが異なる）を、１００μｌのヒートショックコンピテント（ｈｅａｔｓｈｏｃｋ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌ＴＧ１又はＸＬＩ ｂｌｕｅへ形質転換し、カルベニシリンＬＢ‐寒天へ播種した。単一コロニーを１００μｌのＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）中へ取り出した。
ＶＬ及びＶＨセグメントを含むｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓで形質転換された大腸菌は、遺伝子ＩＩＩ断片の切除及び１ｍＭ ＩＰＴＧによる誘発の後、十分な量の可溶性ｓｃＦｖ抗体断片を産生する。適切なシグナル配列のために、ｓｃＦｖ抗体断片は周辺質へ放出され、そこで機能的コンフォメーションへフォールドする。
形質転換プレートから単一の大腸菌ＴＧ１細菌コロニーを周辺質の小スケール製剤のために取り出し、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2及びカルベニシリン５０μｇ/ｍｌを補充したＳＢ培地（例：１０ｍｌ）中で増殖させ、回収後ＰＢＳ中（例：１ｍｌ）へ再溶解した。−７０℃での凍結及び３７℃での解凍を４ラウンド行うことにより、細菌の外膜を温度ショックで破壊し、ｓｃＦｖ抗体断片を含む可溶性周辺質タンパク質を上清中へ遊離させた。遠心分離によって無傷の細胞及び細胞片を除去した後、抗ＨＢＳｓｃＦｖ抗体断片を含む上清を回収し、それを用いてＨＢＳ特異的バインダーの同定を以下のようにして行った：
９６ウェルプラスチックプレート（Ｎｕｎｃ，ｍａｘｉｓｏｒｂ）のウェル上へＨＢＳ抗原を通常は４℃にて一晩コーティングした。ウェルをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１回洗浄し、続いてＰＢＳ／３％ＢＳＡで少なくとも１時間ブロックした。ブロッキング溶液の除去後、周辺質製剤及びコントロール溶液をウェルに添加し、室温にて通常は１時間インキュベートした。次にウェルをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。固定化抗原に結合したｓｃＦｖ抗体断片及びコントロール抗体の検出は、モノクローナルマウス抗Ｈｉｓ6又は抗ＦＬＡＧタグ抗体（Ｑｉａｇｅｎ 抗ＰｅｎｔａＨｉｓ及びＭ２抗Ｆｌａｇ Ｓｉｇｍａ、通常は各々最終濃度１μｇ／ｍｌ ＰＢＳ）を用いて行い、ペルオキシダーゼ標識ポリクローナルヤギ抗マウスＦａｂ断片抗体（Ｄｉａｎｏｖａ、１μｇ／ｍｌＰＢＳ）で検出した。ＡＢＴＳ基質溶液を添加することでシグナルを発色させ、４０５ｎｍの波長で測定した。ブロッキング剤に対する試験サンプルの非特異的結合は、抗原によるコーティングを行わずＢＳＡによるブロッキングだけを行ったＥＬＩＳＡプレート上にて同一の試薬及び同一のタイミングによる同一のアッセイを実施することによって分析した。
陽性の結合が、ＢＳＡ（第一のＥＬＩＳＡ実験にてブロッキング剤として使用）に対する結合によるものであり得るという可能性を排除するために、第二のＥＬＩＳＡ実験を平行して実施した。この第二のＥＬＩＳＡ実験では、抗原によるコーティングを行わずＢＳＡによるブロッキングだけを行ったこと以外は、すべてのパラメータを第一のＥＬＩＳＡ実験と同一とした。
ＥＬＩＳＡによって同定され、ＨＢＶ感染細胞の表面に提示されたＨＢＳ抗原にも結合するこれらのＨＢＳ特異的ｓｃＦｖ抗体断片を同定するために、ＦＬＡＧタグｓｃＦｖ抗体断片、及びそれに続くＨｅｐＧ２．２．１５細胞上のＦＩＴＣ結合抗ＦＬＡＧ抗体（ＢｏｈｎｅＦ， Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ Ｍ， Ｅｂｅｒｔ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００８； １３４：２３９‐４７）を用いる間接免疫蛍光法を標準的なプロトコル（例：ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００２， ｕｎｉｔ ２１．３）に従って実施した。感染させていないＨｅｐＧ２細胞をネガティブコントロールとして用いた。細胞表面にＨＢＳ抗原を最適に提示させるためのＨｅｐＧ２．２．１５細胞の培養条件は、Ｂｏｈｎｅｅｔ ａｌ．によって報告された（Ｂｏｈｎｅ Ｆ， Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ Ｍ， Ｅｂｅｒｔ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ２００８； １３４：２３９‐４７）。
ＨＢＶ感染細胞の表面上のＨＢＳ抗原に対して特異的に結合することが確認されたクローンは、次に、有利なタンパク質特性及びアミノ酸配列について分析した。ＨＢＳ特異的ｓｃＦｖ抗体断片を、Ｇｌｙ4Ｓｅｒ1‐リンカーを介してＣＤ３特異的ｓｃＦｖ抗体断片Ｉ２Ｃ（配列番号１８５）と、又は本発明のその他のいずれかのＣＤ３特異的ｓｃＦｖ抗体断片と連結することで、組換え二重特異性タンデム単鎖抗体断片へ変換し、その結果としてドメイン配置がＶＨMuc1‐（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ1）3‐ＶＬMuc1‐Ｇｌｙ4Ｓｅｒ1‐ＶＨCD3‐（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ1）3‐ＶＬCD3又は別のドメイン配置であるコンストラクトを得た。ＣＨＯ細胞中での発現のために、（ｉ）コザックコンセンサス配列内に埋め込まれた開始コドンを含むＮ末端免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、及び（ｉｉ）停止コドンが続くＣ末端Ｈｉｓ6タグのコード配列の両方を、二重特異性タンデム単鎖抗体断片をコードするヌクレオチド配列へフレームを揃えて結合し、その後、遺伝子合成によって得られたこのＤＮＡ断片を発現ベクターｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０）のマルチクローニング部位へ挿入した。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞の安定なトランスフェクション、二重特異性単鎖抗体を培養物の上清中へ分泌するＤＨＦＲ陽性トランスフェクタントの選別、及び発現レベルを高めるためのメトトレキサートによる遺伝子増幅は記述（Ｍａｃｋｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ （１９９５） ７０２１‐７０２５）に従って実施した。その他の最新の手順はすべて標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。
機能的二重特異性タンデム単鎖抗体断片は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の培養物の上清を用いるＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーによって同定した。この目的のために、ＣＤ３結合を、ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ（ＤＳＭＺ，ブラウンシュバイク，ＡＣＣ４８３）及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ上にて試験した。それぞれの細胞株の２００，０００個の細胞を、５０μｌの細胞培養物の上清と共に３０分間氷上にてインキュベートした。細胞を２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ抗体（ＰｅｎｔａＨｉｓ抗体；Ｑｉａｇｅｎ；２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中にて１：２０に希釈）により、結合した二重特異性タンデム単鎖抗体断片を検出した。洗浄後、結合した抗Ｈｉｓ抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで１：１００に希釈したフィコエリトリンに結合したＦｃガンマ特異的抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）によって検出した。トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清をネガティブコントロールとして用いた。
フローサイトメトリーはＦＡＣＳ‐Ｃａｌｉｂｕｒ装置上で実施し；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行う（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ハイデルベルク）。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のようにして実施する。ＨＢＳ抗原への結合は、上述のようにしてＥＬＩＳＡによって試験した。結合した二重特異性タンデム単鎖抗体断片の検出は、モノクローナルマウス抗Ｈｉｓ6抗体（Ｑｉａｇｅｎ 抗ＰｅｎｔａＨｉｓ、通常は最終濃度１μｇ／ｍｌ ＰＢＳ）を用い、続いてペルオキシダーゼ標識ポリクローナルヤギ抗マウスＦａｂ断片抗体（Ｄｉａｎｏｖａ、１μｇ／ｍｌＰＢＳ）を用いて行った。
ヒト及びマカクＣＤ３に対して、並びにＨＢＳ抗原に対して二重特異性結合を示すコンストラクトだけを、さらなる使用のために選別した。
タンパク質の産生のために、完全に機能的である二重特異性タンデム単鎖抗体断片を発現し、ヌクレオシドを含まないＨｙＱ ＰＦ ＣＨＯ液体大豆培地（０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ‐６８含有Ｌ‐グルタミン ４．０ｍＭを含む；ＨｙＣｌｏｎｅ）に適応させたＣＨＯ細胞を、ヌクレオシドを含まないＨｙＱ ＰＦ ＣＨＯ液体大豆培地（０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ‐６８含有Ｌ‐グルタミン ４．０ｍＭを含む；ＨｙＣｌｏｎｅ）によりローラーボトル中にて７日間増殖させた。遠心分離により培養物の上清を細胞から除去し、精製まで−２０℃で保存した。培養物の上清からの二重特異性タンデム単鎖抗体断片の精製のためのクロマトグラフィ装置としては、Ａｋｔａ（登録商標）ＥｘｐｌｏｒｅｒＳｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた。ＺｎＣｌ2を充填したＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤ Ｃｈｅｌａｔｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を用い、製造元が提供するプロトコルに従って固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（「ＩＭＡＣ」）を実施した。バッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ）でカラムを平衡状態とし、細胞培養物の上清（５００ｍｌ）を流速３ｍｌ／分でカラム（１０ｍｌ）に適用した。バッファーＡでカラムを洗浄して非結合サンプルを除去した。結合したタンパク質を、バッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ イミダゾール）の以下に従う２段階の勾配：
段階１：６カラム分の容量の２０％バッファーＢ
段階２：６カラム分の容量の１００％バッファーＢ
を用いて溶離させた。段階２からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Ｓｉｇｍａ（ダイゼンホッフェン）又はＭｅｒｃｋ（ダルムシュタット）より購入する。
ゲル濾過クロマトグラフィを、平衡バッファー（２５ｍＭ クエン酸塩、２００ｍＭ リジン、５％ グリセロール、ｐＨ７．２）で平衡状態としたＨｉＬｏａｄ１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ 分取グレードカラム（ＧＥ／アマーシャム）上で実施した。溶離したタンパク質サンプル（流速１ｍｌ／分）を標準的なＳＤＳ‐ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによる検出に掛けた。精製の前に、分子量測定のためにカラムを校正した（分子量マーカーキット、ＳｉｇｍａＭＷ ＧＦ‐２００）。タンパク質濃度は、ＯＤ２８０ｎｍを用いて測定する。
精製した二重特異性タンデム単鎖抗体断片は、還元性条件下、４‐１２％ビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプレキャストしたＳＤＳＰＡＧＥで分析した。サンプルの調製及び適用は製造元が提供するプロトコルに従って実施した。分子量はＭｕｌｔｉＭａｒｋタンパク質スタンダード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて決定した。ゲルの染色にはコロイド状クーマシーを用いた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコル）。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって測定された単離したタンパク質の純度は＞９５％である。
ＰＢＳ中のゲル濾過によって測定する自然条件下での二重特異性タンデム単鎖抗体断片の分子量は約５２ｋＤａである。コンストラクトはすべてこの方法に従って精製した。
ウエスタンブロットは、Ｏｐｔｉｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ‐Ｓ８３膜及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅを用い、製造元が提供するプロトコルに従って実施した。二重特異性タンデム単鎖抗体断片の検出には、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いた（ＰｅｎｔａＨｉｓ，Ｑｉａｇｅｎ）。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）で標識したヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）を二次抗体として用い、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）を基質として用いた。精製された二重特異性タンデム単鎖抗体断片に対応する５２ｋＤに単一のバンドを検出した。
ヒト及び非チンパンジー霊長類系において二重特異性タンデム単鎖抗体断片がヒト及びマカクＣＤ３と、並びにＨＢＳ抗原と相互作用する効力を、Ｂｏｈｎｅｅｔ ａｌ．による記述のようにＨｅｐＧ２．２．１５細胞を標的細胞として用い（Ｂｏｈｎｅ Ｆ， Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ Ｍ， Ｅｂｅｒｔ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｔｃｅｌｌｓ ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ ｉｎｆｅｃｔｅｄｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００８； １３４：２３９‐４７）、キメラＴ細胞受容体で形質導入されたＴ細胞ではなく、刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣ又はマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として用いる非放射性細胞障害性アッセイによって測定した。用量反応曲線を得るために、細胞障害性アッセイにおける各二重特異性タンデム単鎖抗体断片の濃度を（Ｂｏｈｎｅｅｔ ａｌ．による記述のＥ：Ｔ比ではなく）、固定したＥ：Ｔ比（例：１０：１又は５：１）で滴定した。
刺激されたヒトＰＢＭＣの作製は以下のようにして行った：
ペトリ皿（直径８５ｍｍ、Ｎｕｎｃ）を、最終濃度１μｇ／ｍｌの市販の抗ＣＤ３特異的抗体（例：ＯＫＴ３，Ｏｔｈｏｃｌｏｎｅ）により３７℃で１時間コーティングした。非結合タンパク質をＰＢＳによる１段階の洗浄によって除去した。新鮮なＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液（３０乃至５０ｍｌのヒト血液）から単離した。安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／ＩＬ‐２２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ）を含む５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中、３‐５×１０7個のＰＢＭＣを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、２日間刺激した。３日目に細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。ＩＬ‐２を添加して最終濃度を２０Ｕ／ｍｌとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度１日培養した。
細胞障害性アッセイからの実験データの解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ４（バージョン４．０２、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）を用いて実施した。このソフトウェアによって決定されるＳ字型用量反応曲線のＲ2値は、通常＞０．９０である。この解析プログラムにより、ＥＣ50値を効力の尺度として算出した。
４１．２ Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）
およそ１５乃至２０ヌクレオチドの末端区間で互いにオーバーラップし、第二のプライマーがすべてアンチセンスプライマーである以下の縮重オリゴヌクレオチドを用いて、ＣＤＲＨ１（配列番号１６５２）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６５３）、及びＣＤＲＨ３（配列番号１６５４）に対するヒトＶＨ配列コンテクストを得る：
５'ＨＣ１‐ＶＨ‐Ａ‐ＸｈｏＩ
ＣＡＧＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＳＧＧＧＣＧＳＡＧＧＡＣＴＧＫＴＧＭＡＧＣＣＴＫＳＧＧＲＧＴＣＣＣＴＧＡＧＷＣＴＣＴＣＣＴＧＣＧＣＴＧ
３'ＨＣ１‐ＶＨ‐Ｂ
ＣＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＧＧＭＣＴＧＧＣＧＧＡＹＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＡＣＣＡＣＴＷＡＡＧＧＴＡＭＭＡＣＣＡＫＡＧＲＣＡＧＣＧＣＡＧＧＡＧＡＧＷＣＴＣＡＧＧＧＡＣ５'ＨＣ１‐ＶＨ‐Ｃ
ＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＲＴＴＲＧＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＴＡＴＡＧＴＧＧＡＡＧＴＡＣＣＡＧＧＴＡＣＡＡＣＣＣＧＴＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＴＣＧＡＫＴＣＡＣＣＡＴＡＴＣＡ
３'ＨＣ１‐ＶＨ‐Ｄ
ＡＴＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＣＣＫＣＧＧＣＴＳＴＣＡＳＡＧＡＡＹＴＣＡＫＣＴＫＣＡＧＧＫＡＧＡＲＣＫＫＧＴＴＣＴＫＧＧＡＧＫＴＧＴＣＴＭＹＴＧＡＴＡＴＧＧＴＧＡＭＴＣＧＡＣＴＣＴＴＧ
５'ＨＣ１‐ＶＨ‐Ｅ
ＡＧＣＣＧＭＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＴＴＧＧＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＧＡＧＧＧＡＣＣＴＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣ
３'ＨＣ１‐ＶＨ‐Ｆ‐ＢｓｔＥＩＩ
ＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＣＣＴＣＧＧＣＣＣＣＡＧＡＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣ
このプライマーセットは、ＶＨ配列全体の範囲を含んでいる。このセット内で、同量のプライマー（例：２０μｌＰＣＲ反応に対して１μｌの各プライマー（プライマーストック２０乃至１００μＭ））を混合し、ＰＣＲバッファー、ヌクレオチド、及びＴａｑポリメラーゼから成るＰＣＲ混合物へ添加した。この混合物をＰＣＲサイクラー中にて９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、及び７２℃で１０分間インキュベートした。続いて生成物をアガロースゲル電気泳動に掛け、標準的な方法に従って２００乃至４００のサイズの生成物をゲルから単離した。
次に、得られたＶＨ ＰＣＲ生成物を、Ｎ末端及びＣ末端の適切なクローン化制限部位を組み込まれたプライマー（プライマー５'ＨＣ１‐ＶＨ‐Ａ‐ＸｈｏＩ及びプライマー３'ＨＣ１‐ＶＨ‐Ｆ‐ＢｓｔＥＩＩ）を用いる標準的なＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。適切なサイズのＤＮＡ断片（ＶＨに対してはおよそ３５０ヌクレオチド）を、標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動によって単離した。この方法により、十分なＶＨＤＮＡ断片が増幅された。
およそ１５乃至２０ヌクレオチドの末端区間で互いにオーバーラップし、第二のプライマーがすべてアンチセンスプライマーである以下の縮重オリゴヌクレオチドを用いて、ＣＤＲＨ１（配列番号１６５２）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６５３）、及びＣＤＲＨ３（配列番号１６５４）に付随するＣＤＲＬ１（配列番号１６５７）、ＣＤＲＬ２（配列番号１６５８）、及びＣＤＲＬ３（配列番号１６５９）に対するヒトＶＬ配列コンテクストを得た：
５'ＨＣ１‐Ｖｌ‐Ａ‐ＳａｃＩ
ＡＣＴＡＧＣＧＡＧＣＴＣＧＷＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＧ
５'ＨＣ１‐Ｖｌ‐Ｂ
ＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＧＧＹＧＴＣＡＧＫＧＡＣＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＳＧＧＹＣＡＳＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＧＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡＧＣＡＡＴＡＴＧＣ
３'ＨＣ１‐Ｖｌ‐Ｃ
ＣＣＣＴＧＡＧＧＧＣＣＴＣＴＣＡＴＴＡＴＣＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＡＳＣＡＡＣＷＹＡＧＧＧＧＣＣＫＫＧＣＣＴＧＧＣＷＫＣＴＧＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＴＡＡＧＣＡＴＡＴＴＧＣＴＴＴＧＧＣＡＡＴＧＣ
５'ＨＣ１‐Ｖｌ‐Ｄ
ＧＡＴＡＡＴＧＡＧＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＲＴＣＣＣＴＧＡＳＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＲＧＴＣＡＧＧＧＡＣＡＴＣＡＧＹＣＴＣＧＴＴＧＲＣＣＡＴＣＡＧＴＧＧＡＳＴＣＭＲＧＫＣＡＧＡＡＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡ
３'ＨＣ１‐Ｖｌ‐Ｅ‐ＢｓｉＷＩ／ＳｐｅＩ
ＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＧＴＣＧＴＡＣＧＴＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＣＴＣＣＧＣＣＧＡＡＣＡＣＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＡＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＴＴＧＡＣＡＧＴＡＡＴＡＧＴＣＡＧＣＣＴＣＧＴＣＴＴＣＴＧ
このプライマーセットは、対応するＶＬ配列全体の範囲を含んでいる。このセット内で、同量のプライマー（例：２０μｌＰＣＲ反応に対して１μｌの各プライマー（プライマーストック２０乃至１００μＭ））を混合し、ＰＣＲバッファー、ヌクレオチド、及びＴａｑポリメラーゼから成るＰＣＲ混合物へ添加した。この混合物をＰＣＲサイクラー中にて９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、及び７２℃で１０分間インキュベートした。続いて生成物をアガロースゲル電気泳動に掛け、標準的な方法に従って２００乃至４００のサイズの生成物をゲルから単離した。
次に、得られたＶＬ ＰＣＲ生成物を、Ｎ末端及びＣ末端の適切なクローン化制限部位を組み込まれたプライマー（プライマー５'ＨＣ１‐Ｖｌ‐Ａ‐ＳａｃＩ及びプライマー３'ＨＣ１‐Ｖｌ‐Ｅ‐ＢｓｉＷＩ／ＳｐｅＩ）を用いる標準的なＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。適切なサイズのＤＮＡ断片（ＶＬに対してはおよそ３３０ヌクレオチド）を、標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動によって単離した。この方法により、十分なＶＬＤＮＡ断片が増幅された。
次に、最終的なＶＨ ＰＣＲ生成物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＨのレパートリー）を、そのそれぞれの最終的なＶＬ ＰＣＲ生成物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＬのレパートリー）と、ファージディスプレイベクターｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ中で組み合わせて機能的ｓｃＦｖ抗体断片のライブラリーを形成し、そこから、繊維状ファージ上での提示後、以下で述べるようにして抗ＨＢＳバインダーを選別し、スクリーニングし、同定し、確認した：
軽鎖断片（ＳａｃＩ‐ＳｐｅＩで消化）４５０ｎｇをファージミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ（ＳａｃＩ‐ＳｐｅＩで消化；長断片）１４００ｎｇとライゲートさせる。次に、得られたコンビナトリアル抗体ライブラリーを、３００μｌのエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞へエレクトロポレーションによって形質転換し（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５μＦＤ、２００オーム、Ｂｉｏｒａｄ ｇｅｎｅ‐ｐｕｌｓｅｒ）、独立したクローンが１０7を超えるライブラリーサイズを得た。１時間の表現型の発現の後、ｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓベクターによってコードされたカルベニシリン耐性に対して陽性である形質転換体を１００ｍｌの液体スーパーブロス（ＳＢ）培地中で一晩選別した。次に、細胞を遠心分離によって回収し、市販のプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドの調製を行った。
ＶＬ‐ライブラリーを含むこのプラスミド‐ＤＮＡ（ＸｈｏＩ‐ＢｓｔＥＩＩで消化；長断片）２８００ｎｇを重鎖Ｖ断片（ＸｈｏＩ‐ＢｓｔＥＩＩで消化）９００ｎｇとライゲートさせ、再度エレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞３００μｌの２つのアリコートへエレクトロポレーションによって形質転換し（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５μＦＤ、２００オーム）、独立したクローンが１０7を超える全ＶＨ‐ＶＬ ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）ライブラリーサイズを得た。
表現型の発現及びカルベニシリンへのゆるやかな適応の後、抗体ライブラリーを含む大腸菌細胞をＳＢ‐カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）選択培地へ移した。抗体ライブラリーを含む大腸菌細胞は、次にヘルパーファージＶＣＳＭ１３の粒子の感染量１０12個で感染させて繊維状Ｍ１３ファージを産生及び分泌させ、ここでファージ粒子は、ｓｃＦｖ抗体断片をコードする一本鎖ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ‐ＤＮＡを含み、そして対応するｓｃＦｖ抗体断片をファージコートタンパク質ＩＩＩへの翻訳融合物として提示した。抗体ライブラリーを提示するファージのこのプールを抗原結合要素の選別に用いた。
この目的のために、クローン化されたｓｃＦｖ抗体断片のレパートリーを持つファージライブラリーを、それぞれの培養物の上清からＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈殿及び遠心分離によって回収した。ｓｃＦｖ抗体断片を提示するおよそ１０11乃至１０12個のファージ粒子を０．４ｍｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に再懸濁させ、実施例４０．１で述べるＨＣＶ遺伝子型１ａ及び／又は１ｂからのＨＣＶ抗原Ｅ２でトランスフェクトされた１０5乃至１０7個のＣＨＯ細胞と共に氷上で１時間ゆっくり攪拌しながらインキュベートした。このＨＣＶ抗原でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を前もって遠心分離によって回収し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ（Ｎａアジド含有）中に再懸濁させた。ＨＣＶ抗原でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞と特異的に結合しないｓｃＦｖ抗体断片を提示するファージ粒子を、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ（Ｎａアジド含有）による最大５回の洗浄工程によって除去した。洗浄後、細胞をｐＨ２．２のＨＣｌ‐グリシン中に再懸濁させることによって（１０分間のインキュベーションとそれに続くボルテックス攪拌）結合要素を細胞から溶離させ、ｐＨ１２の２Ｍトリスによる中和の後、その溶離液を新鮮な感染させていない大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ培養物（ＯＤ６００＞０．５）の感染に用いた。ヒト／ヒト化ｓｃＦｖ抗体断片をコードするファージミドコピーでの形質導入に成功した大腸菌細胞を含む大腸菌培養物をカルベニシリン耐性について再度選別し、続いてＶＣＭＳ１３ヘルパーファージで感染させることで、抗体提示及びインビトロ選別の第二ラウンドを開始した。通常は、合計で４乃至５ラウンドの選別を実施した。
選別後、ＨＣＶ抗原特異的バインダーについてのスクリーニングを行うために、４及び５ラウンドのパニングに対応するプラスミドＤＮＡを大腸菌培養物から単離した。可溶性ｓｃＦｖ抗体断片の産生のためにＶＨ‐ＶＬ‐ＤＮＡ断片をプラスミドから切除した（ＸｈｏＩ‐ＳｐｅＩ）。これらの断片を、元のｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓとは発現コンストラクト（例：ｓｃＦｖ抗体断片）がＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）をｓｃＦｖ抗体断片とＨｉｓ6タグとの間に有するという点で異なるプラスミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓへ、同じ制限部位を介してクローン化し、さらなるファージタンパク質を除去した。ライゲーションの後、プラスミドＤＮＡの各プール（パニングのラウンドが異なる）を、１００μｌのヒートショックコンピテント（ｈｅａｔｓｈｏｃｋ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌ＴＧ１又はＸＬＩ ｂｌｕｅへ形質転換し、カルベニシリンＬＢ‐寒天へ播種した。単一コロニーを１００μｌのＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）中へ取り出した。
ＶＬ及びＶＨセグメントを含むｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓで形質転換された大腸菌は、遺伝子ＩＩＩ断片の切除及び１ｍＭ ＩＰＴＧによる誘発の後、十分な量の可溶性ｓｃＦｖ抗体断片を産生する。適切なシグナル配列のために、ｓｃＦｖ抗体断片は周辺質へ放出され、そこで機能的コンフォメーションへフォールドする。
形質転換プレートから単一の大腸菌ＴＧ１細菌コロニーを周辺質の小スケール製剤のために取り出し、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2及びカルベニシリン５０μｇ/ｍｌを補充したＳＢ培地（例：１０ｍｌ）中で増殖させ、回収後ＰＢＳ中（例：１ｍｌ）へ再溶解した。−７０℃での凍結及び３７℃での解凍を４ラウンド行うことにより、細菌の外膜を温度ショックで破壊し、ｓｃＦｖ抗体断片を含む可溶性周辺質タンパク質を上清中へ遊離させる。遠心分離によって無傷の細胞及び細胞片を除去した後、抗ＨＣＶｓｃＦｖ抗体断片を含む上清を回収し、それを用いてＨＣＶ抗原特異的バインダーの同定を以下のようにして行った：ｓｃＦｖ抗体断片のＨＣＶに対する結合を、ＨＣＶ抗原でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞上でのフローサイトメトリーで試験し（実施例４０．１参照）；ネガティブコントロールとしてトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞を用いた。
フローサイトメトリーのために、２．５×１０5個の細胞を、５０μｌの周辺質製剤ｓｃＦｖ抗体断片と共に、又は２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中５μｇ／ｍｌの精製ｓｃＦｖ抗体断片と共にインキュベートした。ｓｃＦｖ抗体断片の結合は、抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ‐Ｈｉｓ抗体、ＢＳＡ非含有、ＱｉａｇｅｎＧｍｂＨ，ヒルデン，ドイツ連邦共和国）により２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中２μｇ／ｍｌにて検出した。第二の工程の試薬としては、Ｒ‐フィコエリトリンと結合したアフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ‐ガンマ断片特異的）を２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中１：１００に希釈したもの（Ｄｉａｎｏｖａ，ハンブルク，ドイツ連邦共和国）を用いた。サンプルは、ＦＡＣＳｓｃａｎ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ハイデルベルク，ドイツ連邦共和国）上で測定した。
次に単一のクローンを有利な特性及びアミノ酸配列について分析した。ＨＣＶ特異的ｓｃＦｖ抗体断片を、Ｇｌｙ4Ｓｅｒ1‐リンカーを介してＣＤ３特異的ｓｃＦｖ抗体断片Ｉ２Ｃ（配列番号１８５）と、又は本発明のその他のいずれかのＣＤ３特異的ｓｃＦｖ抗体断片と連結することで、組換え二重特異性タンデム単鎖抗体断片へ変換し、その結果としてドメイン配置がＶＨMuc1‐（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ1）3‐ＶＬMuc1‐Ｇｌｙ4Ｓｅｒ1‐ＶＨCD3‐（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ1）3‐ＶＬCD3又は別のドメイン配置であるコンストラクトを得た。ＣＨＯ細胞中での発現のために、（ｉ）コザックコンセンサス配列内に埋め込まれた開始コドンを含むＮ末端免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、及び（ｉｉ）停止コドンが続くＣ末端Ｈｉｓ6タグのコード配列の両方を、二重特異性タンデム単鎖抗体断片をコードするヌクレオチド配列へフレームを揃えて結合し、その後、遺伝子合成によって得られたこのＤＮＡ断片を発現ベクターｐＥＦ‐ＤＨＦＲ（Ｒａｕｍｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１‐１５０）のマルチクローニング部位へ挿入した。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞の安定なトランスフェクション、二重特異性タンデム単鎖抗体断片を培養物の上清中へ分泌するＤＨＦＲ陽性トランスフェクタントの選別、及び発現レベルを高めるためのメトトレキサートによる遺伝子増幅は記述（Ｍａｃｋｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ （１９９５） ７０２１‐７０２５）に従って実施した。その他の最新の手順はすべて標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。
機能的二重特異性タンデム単鎖抗体断片の同定は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の培養物の上清のフローサイトメトリー分析によって行った。この目的のために、ＣＤ３結合を、ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株ＨＰＢ‐ＡＬＬ（ＤＳＭＺ，ブラウンシュバイク，ＡＣＣ４８３）及びマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ上にて試験した。ＨＣＶへの結合は、ＨＣＶ抗原でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞上で試験した（実施例４０．１参照）。それぞれの細胞株の２００，０００個の細胞を、５０μｌの細胞培養物の上清と共に３０分間氷上にてインキュベートした。細胞を２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ抗体（ＰｅｎｔａＨｉｓ抗体；Ｑｉａｇｅｎ；２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中にて１：２０に希釈）により、結合した二重特異性タンデム単鎖抗体断片を検出した。洗浄後、結合した抗Ｈｉｓ抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで１：１００に希釈したフィコエリトリンに結合したＦｃガンマ特異的抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）によって検出した。トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清をネガティブコントロールとして用いた。
フローサイトメトリーはＦＡＣＳ‐Ｃａｌｉｂｕｒ装置上で実施し；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ハイデルベルク）。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のようにして実施した。
ヒト及びマカクＣＤ３に対して、並びにＨＣＶ抗原に対して二重特異性結合を示すコンストラクトだけを、さらなる使用のために選別した。
タンパク質の産生のために、完全に機能的である二重特異性タンデム単鎖抗体断片を発現し、ヌクレオシドを含まないＨｙＱ ＰＦ ＣＨＯ液体大豆培地（０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ‐６８含有Ｌ‐グルタミン ４．０ｍＭを含む；ＨｙＣｌｏｎｅ）に適応させたＣＨＯ細胞を、ヌクレオシドを含まないＨｙＱ ＰＦ ＣＨＯ液体大豆培地（０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ‐６８含有Ｌ‐グルタミン ４．０ｍＭを含む；ＨｙＣｌｏｎｅ）によりローラーボトル中にて７日間増殖させた。遠心分離により培養物の上清を細胞から除去し、精製まで−２０℃で保存した。培養物の上清からの二重特異性タンデム単鎖抗体断片の精製のためのクロマトグラフィ装置としては、Ａｋｔａ（登録商標）ＥｘｐｌｏｒｅｒＳｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた。ＺｎＣｌ2を充填ＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤ Ｃｈｅｌａｔｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を用い、製造元が提供するプロトコルに従って固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（「ＩＭＡＣ」）を実施した。バッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ）でカラムを平衡状態とし、細胞培養物の上清（５００ｍｌ）を流速３ｍｌ／分でカラム（１０ｍｌ）に適用した。バッファーＡでカラムを洗浄して非結合サンプルを除去した。結合したタンパク質を、バッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ イミダゾール）の以下に従う２段階の勾配：
段階１：６カラム分の容量の２０％バッファーＢ
段階２：６カラム分の容量の１００％バッファーＢ
を用いて溶離させた。段階２からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Ｓｉｇｍａ（ダイゼンホッフェン）又はＭｅｒｃｋ（ダルムシュタット）より購入する。
ゲル濾過クロマトグラフィを、平衡バッファー（２５ｍＭ クエン酸塩、２００ｍＭ リジン、５％ グリセロール、ｐＨ７．２）で平衡状態としたＨｉＬｏａｄ１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ 分取グレードカラム（ＧＥ／アマーシャム）上で実施した。溶離したタンパク質サンプル（流速１ｍｌ／分）を標準的なＳＤＳ‐ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによる検出に掛けた。精製の前に、分子量測定のためにカラムを校正した（分子量マーカーキット、ＳｉｇｍａＭＷ ＧＦ‐２００）。タンパク質濃度は、ＯＤ２８０ｎｍを用いて測定した。
精製した二重特異性タンデム単鎖抗体断片は、還元性条件下、４‐１２％ビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプレキャストしたＳＤＳＰＡＧＥで分析した。サンプルの調製及び適用は製造元が提供するプロトコルに従って実施した。分子量はＭｕｌｔｉＭａｒｋタンパク質スタンダード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて決定した。ゲルの染色にはコロイド状クーマシーを用いた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコル）。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって測定された単離したタンパク質の純度は＞９５％である。
ＰＢＳ中のゲル濾過によって測定する自然条件下での二重特異性タンデム単鎖抗体断片の分子量は約５２ｋＤａである。すべてのコンストラクトをこの方法に従って精製した。
ウエスタンブロットは、Ｏｐｔｉｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ‐Ｓ８３膜及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅを用い、製造元が提供するプロトコルに従って実施した。二重特異性タンデム単鎖抗体断片の検出には、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いた（ＰｅｎｔａＨｉｓ，Ｑｉａｇｅｎ）。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）で標識したヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）を二次抗体として用い、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）を基質として用いた。精製された二重特異性タンデム単鎖抗体断片に対応する５２ｋＤに単一のバンドを検出した。
ヒト及び非チンパンジー霊長類系において二重特異性タンデム単鎖抗体断片がヒト及びマカクＣＤ３と、並びにＨＣＶ抗原と相互作用する効力を、ＨＣＶ抗原でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として（実施例４０．１参照）、刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣ又はマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として用いるクロム５１（51Ｃｒ）の放出に基づく細胞障害性アッセイによって測定した。
刺激されたヒトＰＢＭＣの作製は以下のようにして行った：
ペトリ皿（直径８５ｍｍ、Ｎｕｎｃ）を、最終濃度１μｇ／ｍｌの市販の抗ＣＤ３特異的抗体（例：ＯＫＴ３，Ｏｔｈｏｃｌｏｎｅ）により３７℃で１時間コーティングした。非結合タンパク質をＰＢＳによる１段階の洗浄によって除去した。新鮮なＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液（３０乃至５０ｍｌのヒト血液）から単離した。安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／ＩＬ‐２２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ）を含む５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中、３‐５×１０7個のＰＢＭＣを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、２日間刺激した。３日目に細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。ＩＬ‐２を添加して最終濃度を２０Ｕ／ｍｌとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度１日培養した。
標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％ＦＣＳを含む最終容量１００μｌのＲＰＭＩ中、１１．１ＭＢｑの51Ｃｒにて３７℃で４５分間標識した。続いて、標識された標的細胞を５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次に細胞障害性アッセイに用いた。アッセイは、９６ウェルプレート上、全容量２５０μｌの補足ＲＰＭＩ（上記のように）中にて、Ｅ：Ｔ比１０：１で実施した。種間特異的二重特異性タンデム単鎖抗体断片１μｇ／ｍｌ及びその３倍希釈物２０個を適用した。アッセイの時間は１８時間とし、細胞障害性は、最大溶解（トリトンＸの添加）と自然溶解（エフェクター細胞なし）との差に関連する上清中の放出されたクロムの相対値として測定した。測定はすべて４個の反復サンプルで行った。上清中のクロムの放射能の測定は、Ｗｉｚａｒｄ３"ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ，ケルン，ドイツ）を用いて実施した。実験データの解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ４（バージョン４．０２、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）を用いて実施した。このソフトウェアによって決定されるＳ字型用量反応曲線のＲ2値は、通常＞０．９０である。この解析プログラムにより、ＥＣ50値を効力の尺度として算出した。

Claims (1)

  1. 本願明細書に記載の発明。
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