JP2017184747A - 植物におけるｄｈａおよび他のｌｃ−ｐｕｆａの生成 - Google Patents

植物におけるｄｈａおよび他のｌｃ−ｐｕｆａの生成 Download PDF

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オーウェンズ メルロ，アン
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レディー パーレディー，ダヤカー
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Abstract

【課題】遺伝子改変されたダイズ植物から得られた油の提供。【解決手段】遺伝子改変されたダイズ植物から得られた油であって、前記油が、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６，ｎ−３））またはＤＰＡ（ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５，ｎ−６またはｎ−３））を含み、前記油が、特定のアミノ酸配列を含む第１の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）シンターゼをコードする核酸分子、特定のアミノ酸配列を含む第２のＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸分子、および特定のアミノ酸配列を含む第３のＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸分子；特定のアミノ酸配列を含むホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）をコードする核酸分子、ならびに特定のアミノ酸配列を含むアシルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＡＳ）をコードする核酸分子を含む、遺伝子改変されたダイズ植物から得られた油。【選択図】なし

Description

本発明は、宿主生物における多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生成を可能にしかつ／ま
たは改善する、ＰＵＦＡシンターゼ系および１つまたは複数のアクセサリータンパク質で
遺伝子改変された組換え宿主生物（例えば植物）に一般に関する。本発明は、かかる生物
を作製および使用する方法（例えば、ＰＵＦＡを得るため）ならびにかかる生物から得ら
れた製品（例えば、油および種子）にも関する。
多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、栄養学的適用、医薬適用、産業適用および他の目的
のために有用であるとみなされている。しかし、天然供給源（例えば魚油）からおよび化
学合成からのＰＵＦＡの現在の供給は、長期の商業的要求には不十分である。
植物（例えば、油糧種子作物）から誘導される植物油は、比較的安価であり、魚油に付
随する汚染問題を有さない。しかし、商業的に開発された植物および植物油中に見出され
るＰＵＦＡには、より飽和したまたはより長い鎖のＰＵＦＡは典型的には含まれず、リノ
ール酸（１８炭素、Δ９位および１２位に２つの二重結合を有する−−１８：２Δ９，１
２）およびリノレン酸（１８：３Δ９，１２，１５）などの脂肪酸が典型的に含まれるに
過ぎない。
植物によって内因的に生成される脂肪酸の改変による、植物におけるより不飽和のまた
はより長い鎖のＰＵＦＡの生成が記載されている。例えば、脂肪酸エロンガーゼおよび／
またはデサチュラーゼをコードする種々の個々の遺伝子による植物の遺伝子改変が、顕著
なレベルのより長い鎖およびより不飽和のＰＵＦＡ、例えばエイコサペンタエン酸（ＥＰ
Ａ）を含むが、顕著なレベルのより短い鎖のおよび不飽和度が低い混合型のＰＵＦＡもま
た含む、葉または種子の生成を生じるとして記載されている（Qiら、Nature Biotech. 22
:739 (2004)；ＷＯ０４／０７１４６７；Abbadiら、Plant Cell 16:1 (2004)；Napierお
よびSayanova、Proceedings of the Nutrition Society 64:387-393 (2005)；Robertら、
Functional Plant Biology 32:473-479 (2005)；米国出願公開番号２００４／０１７２６
８２、米国出願番号６１／３４５，５３７、２０１０年５月１７日出願）。
マメ科（Fabaceae）（またはマメ科（Leguminosae））は、マメ科植物（legume）科、
エンドウマメ（pea）科、マメ（bean）科または豆類（pulse）科として一般に公知の、経
済的に重要な顕花植物の大きな科である。グリキネ属（Glycine）は、マメ科（Fabaceae
）中の１つの属であり、例えば、グリキネ・アルビカンス（Glycine albicans）、グリキ
ネ・アフィオノタ（Glycine aphyonota）、グリキネ・アレナリ（Glycine arenari）、グ
リキネ・アルギレア（Glycine argyrea）、グリキネ・カネセンス（Glycine canescens）
、グリキネ・クランデスチネ（Glycine clandestine）、グリキネ・クルヴァタ（Glycine
curvata）、グリキネ・キルトロバ（Glycine cyrtoloba）、グリキネ・ファルカテ（Gly
cine falcate）、グリキネ・グラセイ（Glycine gracei）、グリキネ・ヒルチカウリス（
Glycine hirticaulis）、グリキネ・ヒルチカウリス亜種レプトサ（Glycine hirticaulis
subsp. leptosa）、グリキネ・ラクトヴィレンス（Glycine lactovirens）、グリキネ・
ラティフォリア（Glycine latifolia）、グリキネ・ラトロベアナ（Glycine latrobeana
）、グリキネ・ミクロフィラ（Glycine microphylla）、グリキネ・モンティス−ドウグ
ラス（Glycine montis-douglas）、グリキネ・ペラトサ（Glycine peratosa）、グリキネ
・ペスカドレンシス（Glycine pescadrensis）、グリキネ・ピンダニカ（Glycine pindan
ica）、グリキネ・プレニイ（Gycine pullenii）、グリキネ・ルビギノサ（Glycine rubi
ginosa）、グリキネ・ステノフィタ（Glycine stenophita）、グリキネ・シンデティカ（
Glycine syndetika）、グリキネ・タバキナ（Glycine tabacina）、グリキネ・トメンテ
ラ（Glycine tomentella）、ツルマメ（Glycine soja）およびダイズ（Glycine max）が
含まれる。マメ科（Fabaceae）には、ラッカセイ、マメ（インゲンマメ（Phaseolus vulg
aris））、ソラマメ（Vicia faba）またはエンドウマメ（Pisum sativum）もまた含まれ
る。
殆どのダイズ油は、ヒトの消費のために生成された植物油の形態である。産業適用にお
けるダイズ油の使用に関しても、成長中の市場が存在する。
植物、植物種子または植物油中の大量（例えば、商業的な量）のより長い鎖またはより
不飽和のＰＵＦＡ、ならびに植物、植物種子または植物油中のかかるＰＵＦＡが富化され
た大量の脂質（例えば、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）およびリン脂質（ＰＬ））を
効率的かつ効果的に生成するための比較的安価な方法が、当該分野で必要とされている。
本明細書中に記載されているように、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）シンターゼおよび１
つまたは複数のアクセサリータンパク質で遺伝子改変された組換え宿主生物を提供するこ
とによって、宿主生物（例えば植物）におけるＰＵＦＡ生成を提供および改善するための
系は、当該分野におけるアプローチに対する重要な代替法である。
本発明は、（ｉ）少なくとも１種の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を生成するＰＵＦＡ
シンターゼ（例えば、藻類ＰＵＦＡシンターゼ）をコードする核酸配列；および（ｉｉ）
ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）補因子をＰＵＦＡシンターゼ系（例えば
、藻類ＰＵＦＡシンターゼ系）ＡＣＰドメインに転移させるホスホパンテテイニルトラン
スフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）をコードする核酸配列を含む、遺伝子改変された植物（例
えば、マメ科（Fabaceae）またはグリキネ属（Glycine）の植物、例えばダイズ）、子孫
、種子、細胞、組織またはそれらの一部を対象とする。
本発明のいくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、配列番号１のアミノ酸
配列に対して８０％〜９９％同一なアミノ酸配列を含むか、または配列番号１のアミノ酸
配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列は
、配列番号６の核酸配列に対して８０％〜９９％同一な核酸配列を含むか、または配列番
号６の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、配列番号
２のアミノ酸配列に対して８０％〜９９％同一なアミノ酸配列を含むか、または配列番号
２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼをコードす
る核酸配列は、配列番号７の核酸配列に対して８０％〜９９％同一な核酸配列を含むか、
または配列番号７の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼ
は、配列番号３のアミノ酸配列に対して８０％〜９９％同一なアミノ酸配列を含むか、ま
たは配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンター
ゼをコードする核酸配列は、配列番号８の核酸配列に対して８０％〜９９％同一な核酸配
列を含むか、または配列番号８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦ
Ａシンターゼは、配列番号１、２もしくは３のアミノ酸配列またはそれらの任意の組合せ
を含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列は、配
列番号６、７もしくは８の核酸配列またはそれらの任意の組合せを含む。
いくつかの実施形態において、ＰＰＴａｓｅは、配列番号５に対して８０％〜９９％同
一なアミノ酸配列を含むか、または配列番号５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形
態において、ＰＰＴａｓｅをコードする核酸配列は、配列番号１０の核酸配列に対して８
０％〜９９％同一であるか、または配列番号１０の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、（ｉ）および（ｉｉ）の核酸配列は、単一の組換え発現
ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉ）および（ｉｉ）の核酸配列
は、異なる組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉ）およ
び／または（ｉｉ）の核酸配列（複数可）は、種子特異的プロモーターに作動可能に連結
されている。いくつかの実施形態において、（ｉ）および／または（ｉｉ）の核酸配列（
複数可）は、ＰｖＤｌｅｃ２、ＰｖＰｈａｓｅｏｌｉｎ、ＬｆＫＣＳ３、ＦＡＥ１、Ｂｏ
ＡＣＰおよびＢｎａＮａｐｉｎＣから選択されるプロモーターに作動可能に連結されてい
る。いくつかの実施形態において、（ｉ）および／または（ｉｉ）の核酸配列（複数可）
は、葉特異的プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、
（ｉ）および／または（ｉｉ）の核酸配列（複数可）は、ユビキチンまたはＣｓＶＭＶプ
ロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物、子孫、種子、細胞、組織または
それらの一部は、（ｉｉｉ）長鎖ＰＵＦＡ遊離脂肪酸（ＰＦＦＡ）のアシル−ＣｏＡへの
変換を触媒するアシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＡＳ）をコードする核酸配列をさら
に含む。いくつかの実施形態において、ＡＣｏＡＳは、配列番号４に対して８０％〜９９
％同一なアミノ酸配列を含むか、または配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実
施形態において、ＡＣｏＡＳは、配列番号９の核酸配列に対して８０％〜９９％同一な核
酸配列を含むか、または配列番号９の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ａ
ＣｏＡＳをコードする核酸配列は、配列番号３４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態
において、（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の核酸配列は、単一の組換え発現
ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ
）の核酸配列は、異なる組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において
、（ｉ）および（ｉｉ）の核酸配列が単一の組換え発現ベクター中に含まれ、（ｉｉｉ）
の核酸配列が異なる組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（
ｉ）および（ｉｉｉ）の核酸配列が単一の組換え発現ベクター中に含まれ、（ｉｉ）の核
酸配列が異なる組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉｉ
）および（ｉｉｉ）の核酸配列が単一の組換え発現ベクター中に含まれ、（ｉ）の核酸配
列が異なる組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉ）、（
ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の核酸配列（複数可）は、種子特異的プロモーターに作
動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、（ｉ）、（ｉｉ）および／また
は（ｉｉｉ）の核酸配列（複数可）は、ＰｖＤｌｅｃ２、ＬｆＫＣＳ３、ＦＡＥ１、Ｂｏ
ＡＣＰおよびＢｎａＮａｐｉｎＣから選択されるプロモーターに作動可能に連結されてい
る。いくつかの実施形態において、（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の核酸配
列（複数可）は、葉特異的プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形
態において、（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の核酸配列（複数可）は、ユビ
キチンまたはＣｓＶＭＶプロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれら
の一部は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）をコードする核酸配列およ
び／または２型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）をコード
する核酸配列をさらに含む。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織、種子または
それらの一部は、ｐＤＡＢ７３６１、ｐＤＡＢ７３６２、ｐＤＡＢ７３６３、ｐＤＡＢ７
３６８、ｐＤＡＢ７３６９、ｐＤＡＢ７３７０、ｐＤＡＢ１００５１８、ｐＤＡＢ１０１
４７６、ｐＤＡＢ１０１４７７、ｐＤＡＢ９１６６、ｐＤＡＢ９１６７、ｐＤＡＢ７３７
９、ｐＤＡＢ７３８０、ｐＤＡＢ９３２３、ｐＤＡＢ９３３０、ｐＤＡＢ９３３７、ｐＤ
ＡＢ９３３８、ｐＤＡＢ９３４４、ｐＤＡＢ９３９６、ｐＤＡＢ１０１４１２、ｐＤＡＢ
７７３３、ｐＤＡＢ７７３４、ｐＤＡＢ１０１４９３、ｐＤＡＢ１０９５０７、ｐＤＡＢ
１０９５０８、ｐＤＡＢ１０９５０９、ｐＤＡＢ９１５１、ｐＤＡＢ１０８２０７、ｐＤ
ＡＢ１０８２０８、ｐＤＡＢ１０８２０９、ｐＤＡＢ９１５９、ｐＤＡＢ９１４７、ｐＤ
ＡＢ１０８２２４、およびｐＤＡＢ１０８２２５のうち少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織、種子もしく
はそれらの一部、または遺伝子改変された植物、子孫、種子、細胞、組織もしくはそれら
の一部から得られた油（例えば種子油）は、検出可能な量のＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸
（Ｃ２２：６，ｎ−３））、ＤＰＡ（ｎ−６）（ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５，ｎ−
６））および／またはＥＰＡ（エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５，ｎ−３））を含む。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織、種子もしくは
それらの一部、または遺伝子改変された植物、子孫、種子、細胞、組織もしくはそれらの
一部から得られた油（例えば種子油）は、総脂肪酸の重量で０．０１％〜１５％のＤＨＡ
、総脂肪酸の重量で０．０５％〜１０％のＤＨＡ、または総脂肪酸の重量で０．０５％〜
５％のＤＨＡを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物、子孫、細胞
、組織、種子もしくはそれらの一部、または遺伝子改変された植物、子孫、種子、細胞、
組織もしくはそれらの一部から得られた油（例えば種子油）は、総脂肪酸の重量で０．０
１％〜１０％のＥＰＡ、総脂肪酸の重量で０．０５％〜５％のＥＰＡ、または総脂肪酸の
重量で０．０５％〜１％のＥＰＡを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変され
た植物、子孫、細胞、組織、種子もしくはそれらの一部、または遺伝子改変された植物、
子孫、種子、細胞、組織もしくはそれらの一部から得られた油（例えば種子油）は、総脂
肪酸の重量で０．０１％〜１０％のＤＰＡ（ｎ-６）、総脂肪酸の重量で０．０１％〜５
％のＤＰＡ（ｎ-６）、または総脂肪酸の重量で０．０１％〜１％のＤＰＡ（ｎ-６）を含
む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織、種子もし
くはそれらの一部、または遺伝子改変された植物、子孫、種子、細胞、組織もしくはそれ
らの一部から得られた油（例えば種子油）は、総脂肪酸の重量で１：１〜１：３０または
１：１〜１：３の比率のＥＰＡ：ＤＨＡを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改
変された植物、子孫、細胞、組織、種子もしくはそれらの一部、または遺伝子改変された
植物、子孫、種子、細胞、組織もしくはそれらの一部から得られた油（例えば種子油）は
、総脂肪酸の重量で１：１〜１：１０または１：１〜１：３の比率のＤＰＡ（ｎ−６）：
ＤＨＡを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織
、種子またはそれらの一部から得られた油（例えば種子油）は、油の重量で７０％〜９９
％のトリグリセリドを含む。
いくつかの実施形態において、検出可能な量のＤＨＡ、ＤＰＡ（ｎ−６）および／また
はＥＰＡは、遺伝子改変された植物、子孫、組織、種子またはそれらの一部から得られた
穀物および／または食事においても見出される。
本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細
胞、組織またはそれらの一部から得られた油（例えば種子油）または種子を対象とする。
本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞
、組織またはそれらの一部から得られた油（例えば種子油）を含む食物製品を対象とする
。本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細
胞、組織またはそれらの一部から得られた油（例えば種子油）または種子を含む機能性食
物にも関する。本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ
）、子孫、細胞、組織または一部から得られた油（例えば種子油）または種子を含む医薬
製品を対象とする。
本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細
胞、組織またはそれらの一部から、あるいは本明細書中に記載される遺伝子改変された植
物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部の種子から油を回収する工程
を含む、少なくとも１種のＬＣ−ＰＵＦＡを含む油を生成する方法を対象とする。本発明
は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織
またはそれらの一部を成長させる工程を含む、少なくとも１種のＬＣ−ＰＵＦＡを含む油
を生成する方法にも関する。本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（
例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部の種子から油を回収する工程を含
む、種子油中の少なくとも１種のＬＣ−ＰＵＦＡを生成する方法にも関する。
本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細
胞、組織またはそれらの一部を成長させる工程を含む、種子油中の少なくとも１種のＰＵ
ＦＡを生成する方法を対象とする。本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された
植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部、本明細書中に記載される
油、本明細書中に記載される種子、本明細書中に記載される食物製品、本明細書中に記載
される機能性食物、あるいは本明細書中に記載される医薬製品を個体に提供する工程を含
む、少なくとも１種のＰＵＦＡを含むサプリメントまたは治療用製品を個体に提供する方
法にも関する。いくつかの実施形態において、かかる実施形態中に含まれるＰＵＦＡは、
ＤＨＡ、ＤＰＡ（ｎ−６）および／またはＥＰＡである。
本発明は、植物または植物細胞を、（ｉ）少なくとも１種の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦ
Ａ）を生成するＰＵＦＡシンターゼ（例えば、藻類ＰＵＦＡシンターゼ）をコードする核
酸配列；および（ｉｉ）ホスホパンテテイニル補因子をＰＵＦＡシンターゼ（例えば、藻
類ＰＵＦＡシンターゼ）ＡＣＰドメインに転移させるホスホパンテテイニルトランスフェ
ラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）をコードする核酸配列で形質転換する工程を含む、本明細書中に
記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一
部を生成する方法を対象とする。いくつかの実施形態において、この方法は、植物または
植物細胞を、（ｉｉｉ）長鎖ＰＵＦＡ遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のアシル−ＣｏＡへの変換を
触媒するアシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＡＳ）をコードする核酸配列で形質転換す
る工程をさらに含む。
本発明の種々の実施形態は、本出願の一部を形成する以下の詳細な説明、図面および添
付の配列の説明から、より完全に理解され得る。
ＰＵＦＡ ＯｒｆＡの９つの反復ドメインのそれぞれをコードする再設計されたＤＮＡ配列のＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩでのアラインメント）を示す図である。 ｐＤＡＢ７３６２のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７３６１のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７３６３のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７３６５のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７３６８のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７３６９のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７３７０のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１００５１８のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０１４７６のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０１４７７のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７３６２で形質転換された２つのダイズ事象から誘導されたＴ１植物由来の単一のＴ２ダイズ種子のＤＨＡおよびＬＣ−ＰＵＦＡ含量を示す図である。 Ｔ２ダイズ種子タンパク質抽出物中のＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢおよびＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣのウエスタンブロット検出を示す図である。 ｐＤＡＢ９１６６のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９１６７のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７３７９のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７３８０のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９３２３のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９３３０のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９３３７のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９３３８のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９３４４のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９３９６のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０１４１２のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７７３３のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７７３４のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０１４９３のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０９５０７のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０９５０８のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０９５０９のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９１５１のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０８２０７のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０８２０８のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０８２０９のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９１５９のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９１４７のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０８２２４のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０８２２５のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０１４９３、ｐＤＡＢ７３６２、ｐＤＡＢ７３６９、ｐＤＡＢ１０１４１２またはｐＤＡＢ７３８０で形質転換された個々のトランスジェニックシロイヌナズナ属（Arabidopsis）事象由来のＴ２種子のＤＨＡおよびＬＣ−ＰＵＦＡ含量を示す図である。
用語「多価不飽和脂肪酸」または「ＰＵＦＡ」とは、本明細書中で使用する場合、少な
くとも１６炭素、少なくとも１８炭素、少なくとも２０炭素または２２以上の炭素の長さ
の炭素鎖を有し、少なくとも３以上の二重結合、４以上の二重結合、５以上の二重結合ま
たは６以上の二重結合を有し、全ての二重結合がｃｉｓ立体配置である脂肪酸をいう。
用語「長鎖多価不飽和脂肪酸」または「ＬＣ−ＰＵＦＡ」は、本明細書中で使用する場
合、３以上の二重結合を含む２０以上の炭素鎖長の脂肪酸、または少なくとも３以上の二
重結合、４以上の二重結合、５以上の二重結合もしくは６以上の二重結合を有する、２２
以上の炭素の脂肪酸をいう。ω−６系列のＬＣ−ＰＵＦＡには、ジ−ホモ−γ−リノレン
酸（Ｃ２０：３ｎ−６）、アラキドン酸（Ｃ２０：４ｎ−６）、アドレン酸（ドコサテト
ラエン酸またはＤＴＡとも呼ばれる）（Ｃ２２：４ｎ−６）およびドコサペンタエン酸（
Ｃ２２：５ｎ−６）が含まれるがこれらに限定されない。ω−３系列のＬＣ−ＰＵＦＡに
は、エイコサトリエン酸（Ｃ２０：３ｎ−３）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４ｎ−
３）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５ｎ−３）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ｎ
−３）およびドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６ｎ−３）が含まれるがこれらに限定されな
い。ＬＣ−ＰＵＦＡには、Ｃ２８：８（ｎ−３）が含まれるがこれに限定されない、２２
より多い炭素および４以上の二重結合を有する脂肪酸もまた含まれる。
用語「ＰＵＦＡシンターゼ」とは、本明細書中で使用する場合、多価不飽和脂肪酸（Ｐ
ＵＦＡ）および特に長鎖ＰＵＦＡ（ＬＣ−ＰＵＦＡ）を生成する酵素、ならびに複合体中
のかかる酵素の任意のドメインをいう。用語ＰＵＦＡシンターゼには、ＰＵＦＡ生成のた
めのＰＵＦＡ ＰＫＳ系またはＰＫＳ様の系が含まれるがこれらに限定されない。いくつ
かの特定のＰＵＦＡシンターゼは、本出願中で定義されるように、「ＳｚＰＵＦＡ」シン
ターゼまたは「ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ」シンターゼなどのさらなる表記法で本明細書中に表
記される。用語「ＰＵＦＡシンターゼ系」には、異種生物において発現される場合にＰＵ
ＦＡシンターゼの機能に影響を与え得る、ＰＵＦＡシンターゼおよび任意のアクセサリー
酵素（例えば、ＰＰＴａｓｅまたはＡＣＳ）が含まれる。
用語「ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ」および「ＰＰＴａｓｅ」とは、本明
細書中で使用する場合、補酵素Ａ（ＣｏＡ）由来の補因子（例えば、４−ホスホパンテテ
イン）をＰＵＦＡシンターゼ中に存在する１つまたは複数のＡＣＰドメインに転移させる
ことによってＰＵＦＡシンターゼを活性化する酵素をいう。本明細書中に記載されるＰＵ
ＦＡシンターゼの１つまたは複数のＡＣＰドメインを活性化し得るＰＰＴａｓｅの一例は
、本明細書中で「ＮｏＨｅｔＩ」と称される、ノストック属の種（Nostoc sp.）ＰＣＣ
７１２０（以前にはアナベナ属の種（Anabaena sp.）ＰＣＣ ７１２０と呼ばれた）のＨ
ｅｔＩタンパク質である。
用語「アシル−ＣｏＡシンテターゼ」、「ＡＣｏＡＳ」および「ＡＣＳ」とは、本明細
書中で使用する場合、長鎖多価不飽和遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のアシル−ＣｏＡへの変換を
触媒する酵素をいう。いくつかの特定のアシル−ＣｏＡシンテターゼは、本出願中で定義
されるように、「ＳｚＡＣＳ−２」などのさらなる表記法で本明細書中に表記される。
用語「植物」には、本明細書中で使用する場合、任意の子孫、細胞、組織、種子、種子
油またはそれらの一部が含まれる。
「栄養補助食品」は、生理学的利益を提供するまたは疾患に対する保護を提供する、植
物から単離、精製、濃縮または生成された製品を意味し、増強されたレベルのかかる生理
学的に活性な構成要素を含むように遺伝子操作された作物から生成された食物と共に、か
かる製品を補充された加工食物が含まれる。
「機能性食物」は、（ａ）通常の食餌の一部として消費される従来型食物と見かけ上類
似しまたはかかる従来型食物であり得、（ｂ）改変されていない食物中に典型的に存在す
る構成要素の割合における改変に基づいて、増強された栄養価および／または特定の食餌
上の利益を有する食物を意味する。
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、単数形の核酸、ならびに複数形の核酸、
核酸分子もしくはフラグメント、バリアント、またはそれらの誘導体、または構築物、例
えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を包含す
る意図である。ポリヌクレオチドまたは核酸は、非翻訳５’配列および３’配列ならびに
コード配列を含む、全長ｃＤＮＡ配列またはそのフラグメントのヌクレオチド配列を含み
得る。ポリヌクレオチドまたは核酸は、改変されていないＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改
変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオ
キシリボヌクレオチドから構成され得る。例えば、ポリヌクレオチドまたは核酸は、一本
鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖およ
び二本鎖のＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、
もしくはより典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖の領域の混合物であり得るＤＮ
ＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。これらの用語は、ポリヌクレ
オチドまたは核酸の、化学的、酵素的または代謝的に改変された形態もまた包含する。
ポリヌクレオチドまたは核酸配列は、そのネイティブ環境から取り出された場合に、「
単離された」といわれ得る。例えば、ベクター中に含まれるジヒドロキシ−酸デヒドラタ
ーゼ活性を有するポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントをコードする異種ポリヌ
クレオチドまたは核酸は、本発明のために単離されたとみなされる。単離されたポリヌク
レオチドまたは核酸のさらなる例には、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオ
チド、または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドもしくは核
酸が含まれる。本発明に従う単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、合成により生
成されたかかる分子がさらに含まれる。ＤＮＡのポリマーの形態の、単離されたポリヌク
レオチドまたは核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数のセ
グメントから構成され得る。
用語「遺伝子」とは、特定のタンパク質として発現されることが可能な核酸またはその
フラグメントをいい、任意選択で、コード配列の前（５’非コード配列）および後ろ（３
’非コード配列）の調節配列を含む。
本明細書中で使用する場合、用語「コード領域」とは、特定のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡ配列をいう。「適切な調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）
、その内側またはその下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、
ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響を与える
ヌクレオチド配列をいう。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン
、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステ
ム−ループ構造が含まれ得る。
本明細書中で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、単数形の「ポリペプチド」なら
びに複数形の「ポリペプチド」およびそのフラグメントを包含する意図であり、アミド結
合（ペプチド結合としても公知）によって直鎖状に連結されたモノマー（アミノ酸）から
構成される分子をいう。用語「ポリペプチド」とは、２以上のアミノ酸の任意の鎖（単数
または複数）をいい、生成物の特定の長さをいうものではない。従って、ペプチド、ジペ
プチド、トリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アミノ酸鎖、または２以上のアミ
ノ酸の鎖（単数または複数）をいうために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド
」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、ま
たはこれらの用語と相互交換可能に使用され得る。ポリペプチドは、天然の生物学的供給
源から誘導され得るか、または組換え技術によって生成され得るが、必ずしも指定された
核酸配列から翻訳されたものである必要はない。ポリペプチドは、化学合成によるものを
含む、任意の様式で生成され得る。
「単離された」ポリペプチドもしくはフラグメント、バリアントまたはそれらの誘導体
は、その天然の環境中には存在しないポリペプチドを意図する。特定のレベルの精製は必
要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、そのネイティブまたは天然の環境か
ら取り出され得る。宿主細胞中で発現された組換え生成されたポリペプチドおよびタンパ
ク質は、任意の適切な技術によって分離、分画または部分的もしくは実質的に精製された
ネイティブポリペプチドまたは組換えポリペプチドであるとき、本発明の目的のために単
離されたとみなされる。
本明細書中で使用する場合、「ネイティブ」とは、存在する場合にはそれ自身の調節配
列を伴って天然に見出される、ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドの形態をい
う。
本明細書中で使用する場合、「内因性」とは、生物中のまたは生物のゲノム中のその天
然の位置にある、ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドのネイティブ形態をいう
。「内因性ポリヌクレオチド」には、生物のゲノム中のその天然の位置にあるネイティブ
ポリヌクレオチドが含まれる。「内因性遺伝子」には、生物のゲノム中のその天然の位置
にあるネイティブ遺伝子が含まれる。「内因性ポリペプチド」には、生物中のその天然の
位置にあるネイティブポリペプチドが含まれる。
本明細書中で使用する場合、「異種」とは、宿主生物において通常は見出されないが、
宿主生物中に導入される、ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドをいう。「異種
ポリヌクレオチド」には、対応するネイティブポリヌクレオチドとは異なる形態の、供給
源生物中に再導入される、ネイティブコード領域またはその一部分が含まれる。「異種遺
伝子」は、対応するネイティブ遺伝子とは異なる形態の、供給源生物中に再導入される、
ネイティブコード領域またはその一部分が含まれる。例えば、異種遺伝子には、ネイティ
ブ宿主中に再導入される非ネイティブ調節領域を含むキメラ遺伝子の一部分であるネイテ
ィブコード領域が含まれ得る。「異種ポリペプチド」には、対応するネイティブポリペプ
チドとは異なる形態の、供給源生物中に再導入されるネイティブポリペプチドが含まれる
。
本明細書中で使用する場合、用語「改変」とは、ポリヌクレオチドによってコードされ
るポリペプチドの低減された、実質的に除去されたまたは除去された活性を生じる、本明
細書中に開示されたポリヌクレオチドにおける変化、ならびにポリペプチドの低減された
、実質的に除去されたまたは除去された活性を生じる、本明細書中に開示されたポリペプ
チドにおける変化をいう。かかる変化は、欠失、変異導入（例えば、自然変異誘発、ラン
ダム変異誘発、ミューテーター遺伝子によって引き起こされる変異誘発、またはトランス
ポゾン変異誘発）、置換、挿入、下方調節、細胞部位の変更、ポリヌクレオチドもしくは
ポリペプチドの状態の変更（例えば、メチル化、リン酸化またはユビキチン化）、補因子
の除去、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡの導入、干渉ＲＮＡ／ＤＮＡの導入、化学的改変、
共有結合性の改変、ＵＶもしくはＸ線による照射、相同組換え、有糸分裂組換え、プロモ
ーター置換法および／またはそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない、当該分
野で周知の方法によって行われ得る。どのヌクレオチドまたはアミノ酸残基が改変され得
るかを決定する際のガイダンスは、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を
、酵母または細菌などの相同ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列と比較し、高い
相同性の領域（保存された領域）またはコンセンサス配列中で行われた改変の数を最大化
することによって、見出され得る。
用語「誘導体」とは、本明細書中で使用する場合、本発明において開示される配列の改
変をいう。かかる改変の例は、油糧種子作物種中の本明細書中に開示されるコード配列の
機能を保存する、僅かに変更する、または増加させる、本明細書中に開示されるコード配
列の核酸配列に関する１つまたは複数の塩基の置換、挿入および／または欠失である。か
かる誘導体は、例えば、配列構造を予測および最適化するためのコンピュータモデリング
技術を使用して、当業者によって容易に決定され得る。従って、用語「誘導体」には、そ
れらが本発明のＬＣ−ＰＵＦＡを生成する際に使用される開示された機能性を有すること
ができるように、本明細書中に開示されるコード配列と実質的な配列相同性を有する核酸
配列もまた含まれる。
本明細書中で使用する場合、用語「バリアント」とは、例えば変異誘発などの組換えＤ
ＮＡ技術を使用して創出される、アミノ酸の挿入、欠失、変異および置換により、本発明
の具体的に引用されたポリペプチドとは異なるポリペプチドをいう。目的の活性を破壊す
ることなくどのアミノ酸残基が置き換え、付加または欠失され得るかを決定する際のガイ
ダンスは、特定のポリペプチドの配列を、相同ポリペプチドの配列と比較し、高い相同性
の領域（保存された領域）中で行われたアミノ酸変化の数を最少化することまたはアミノ
酸をコンセンサス配列で置き換えることによって、見出され得る。
あるいは、これら同じまたは同様のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド
バリアントは、遺伝子コードの「冗長性」を使用することによって合成または選択され得
る。種々のコドン置換、例えば、種々の制限部位を生成するサイレント変化が、発現のた
めのプラスミドまたはウイルスベクター中へのクローニングを最適化するために導入され
得る。ポリヌクレオチド配列中の変異は、ポリペプチドの任意の一部の特性を改変するた
めにポリペプチドに付加されたポリペプチド中、または他のペプチドのドメイン中に反映
され得る。
アミノ酸の「置換」は、類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸
による１つのアミノ酸の置き換え、即ち、保存的アミノ酸置き換えの結果であり得るか、
あるいは異なる構造的および／または化学的特性を有するアミノ酸による１つのアミノ酸
の置き換え、即ち、非保存的アミノ酸置き換えの結果であり得る。「保存的」アミノ酸置
換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性または両親媒性の性質におけ
る類似性に基づいて、行われ得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、
ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよび
メチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイ
ン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれ；正に荷電した（塩基性）アミノ
酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれ；負に荷電した（酸性）アミノ酸
には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。あるいは、「非保存的」アミノ酸
置換は、これらのアミノ酸のいずれかの極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性または両親
媒性の性質における差異を選択することによって、行われ得る。「挿入」または「欠失」
は、組換えタンパク質によって構造的または機能的に許容される場合、バリエーションの
範囲内であり得る。許容されるバリエーションは、組換えＤＮＡ技術を使用して、ポリペ
プチド分子中のアミノ酸の挿入、欠失または置換を体系的に行い、得られた組換えバリア
ントを活性についてアッセイすることによって、実験的に決定され得る。
用語「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可
能なＤＮＡ配列をいう。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’側に位置
する。プロモーターは、その全体がネイティブ遺伝子から誘導され得るか、または天然に
見出される異なるプロモーターから誘導された異なるエレメントから構成され得るか、ま
たは合成ＤＮＡセグメントを含みさえし得る。異なるプロモーターが、異なる組織もしく
は細胞型において、または異なる発生段階で、または異なる環境的もしくは生理学的状態
に応答して、遺伝子の発現を指向し得ることが、当業者に理解される。殆どの時間で殆ど
の細胞型において遺伝子を発現させるプロモーターは、「構成的プロモーター」と一般に
呼ばれる。殆どの場合、調節配列の正確な境界は完全には規定されていないので、異なる
長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有し得ることが、さらに認識され
る。
用語「作動可能に連結される」とは、一方の機能が他方によって影響されるような、単
一の核酸フラグメント上での核酸配列の関連性をいう。例えば、プロモーターは、コード
配列（例えば、このコード配列は、プロモーターの転写制御下にある）の発現に影響を与
えることが可能である場合、このコード配列と作動可能に連結されている。コード配列は
、センス方向またはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結され得る。
用語「発現」とは、本明細書中で使用する場合、本発明の核酸フラグメントから誘導さ
れるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積をいう。発現
とは、ポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳もまたいい得る。
用語「過剰発現」とは、本明細書中で使用する場合、同じまたは関連する遺伝子の内因
性の発現よりも高い発現をいう。異種遺伝子は、その発現が匹敵する内因性遺伝子の発現
よりも高い場合、過剰発現されている。
本明細書中で使用する場合、用語「形質転換」とは、遺伝的に安定な遺伝を生じる、宿
主生物中への核酸またはフラグメントの移入をいう。形質転換された核酸フラグメントを
含む宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生
物と呼ばれる。
用語「プラスミド」および「ベクター」とは、本明細書中で使用する場合、細胞の中心
的代謝の一部ではない遺伝子をしばしば保有する、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態の
、染色体外エレメントをいう。かかるエレメントは、自律複製配列、ゲノム組込み配列、
ファージまたはヌクレオチド配列、線状または環状の、任意の供給源から誘導された一本
鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡのものであり得、ここで、多数のヌクレオチド配列
が、適切な３’非翻訳配列と共にプロモーターフラグメントおよび選択された遺伝子産物
に関するＤＮＡ配列を細胞中に導入することが可能な独自の構成へと、連結または組換え
されている。
本明細書中で使用する場合、用語「コドン縮重性」とは、コードされたポリペプチドの
アミノ酸配列に影響を与えることなくヌクレオチド配列のバリエーションを許容する遺伝
子コードの性質をいう。当業者は、所与のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使用
における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を熟知している。従って
、宿主細胞における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、コドン使用の頻度が
、宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくように、遺伝子を設計することが望まし
い。
用語「コドン最適化された」とは、種々の宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分
子のコード領域をいう場合、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変更することな
く宿主生物の典型的なコドン使用を反映するような、遺伝子または核酸分子のコード領域
中のコドンの変更をいう。かかる最適化は、少なくとも１つの、１つより多くの、または
顕著な数のコドンを、その生物の遺伝子中でより頻繁に使用される１つまたは複数のコド
ンで置き換えることを含む。
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列中の逸脱
は、その遺伝子をコードする配列におけるバリエーションを許容する。各コドンは３つの
ヌクレオチドからなり、ＤＮＡを構成するヌクレオチドは４種の特定の塩基に制限される
ので、ヌクレオチドの６４の可能な組合せが存在し、そのうち６１がアミノ酸をコードす
る（残りの３つのコドンは、翻訳を終了させるシグナルをコードする）。どのコドンがど
のアミノ酸をコードするかを示す「遺伝子コード」は、表１のように、本明細書中に再現
される。結果として、多数のアミノ酸が、１つより多いコドンによって指定される。例え
ば、アミノ酸アラニンおよびプロリンは、４種のトリプレットによりコードされ、セリン
およびアルギニンは６種のトリプレットによりコードされるが、トリプトファンおよびメ
チオニンは、たった１種のトリプレットによりコードされる。この縮重は、ＤＮＡによっ
てコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変更することなく、ＤＮＡ塩基組成が広範囲
にわたって変動することを許容する。
多数の生物が、成長中のペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードするように
、特定のコドンの使用についてバイアスを示す。コドン選択またはコドンバイアス、生物
間でのコドン使用における差異は、遺伝子コードの縮重によって提供され、多数の生物に
おいて充分に報告されている。コドンバイアスは、翻訳されるコドンの特性および特定の
トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性にとりわけ依存すると考えられてい
る、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関することが多い。細胞におけ
る選択されたｔＲＮＡの優位性は一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコ
ドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づく所与の生物における最適な
遺伝子発現のために適合させることができる。
広範な種々の動物、植物および微生物種にとって利用可能な多数の遺伝子配列を考慮す
ると、コドン使用の相対的頻度を計算することが可能である。コドン使用表は容易に入手
可能であり、多数の方法で適合され得る。Nakamuraら、Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)
を参照のこと。この表または類似の表を利用することによって、当業者は、任意の所与の
ポリペプチド配列に対してこの頻度を適用でき、ポリペプチドをコードするが所与の種に
最適なコドンを使用するコドン最適化されたコード領域の核酸フラグメントを生成できる
。本発明は、本明細書中にさらに記載されるように、本発明のＯｒｆＡ、ＯｒｆＢ、キメ
ラＯｒｆＣ、ＰＰＴａｓｅおよび／または他のアクセサリータンパク質のコドン最適化さ
れた形態に関する。
用語「パーセント同一性」は、当該分野で公知のように、配列を比較することによって
決定される、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の
関係である。当該分野において、「同一性」は、場合によってはかかる配列の文字列間の
一致によって決定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関係性の程
度もまた意味する。「同一性」および「類似性」は、１）Computational Molecular Biol
ogy (Lesk, A. M.編) Oxford University: NY (1988)；２）Biocomputing: Informatics
and Genome Projects (Smith, D. W. 編) Academic: NY (1993)；３）Computer Analysis
of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M.およびGriffin, H. G.編) Humania: NJ (19
94)；４）Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G.編) Academic (198
7)；ならびに５）Sequence Analysis Primer (Gribskov, M.およびDevereux, J.編) Stoc
kton: NY (1991)中に開示される方法が含まれるがこれらに限定されない公知の方法によ
って容易に計算できる。
同一性を決定するための方法は、試験される配列間の最良の一致を与えるように設計さ
れる。同一性および類似性を決定するための方法は、公に入手可能なコンピュータプログ
ラム中に体系化されている。配列アラインメントおよびパーセント同一性の計算は、例え
ば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）パッケージソフト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ
ｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＡｌｉｇｎＸプログラムまたはＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフ
ォマティクスコンピューティングパッケージソフト（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄ
ｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを使用して実施され得る。配列
のマルチプルアラインメントは、アラインメント法ラベル付（labeled）Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｖに対応する（HigginsおよびSharp, CABIOS. 5:151-153 (1989)；Higgins, D.G.ら、C
omput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)によって開示される）；およびＬＡＳＥＲＧＥ
ＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングパッケージソフト（ＤＮＡＳＴＡＲ
Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム中に見出される、「Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｖ法のアラインメント」を含む、いくつかの種々のアルゴリズムを包含する「Ｃｌｕｓｔ
ａｌ法のアラインメント」を使用して実施される。マルチプルアラインメントのために、
デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡ
ＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したタンパク質配列のペアワイズアラ
インメントおよびパーセント同一性の計算のためのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬ
Ｅ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＴＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ Ｓ
ＡＶＥＤ＝５である。核酸について、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ
ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４で
ある。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを使用した配列のアラインメント後、同じプログラ
ム中の「配列距離」表を見ることによって、「パーセント同一性」を得ることが可能であ
る。さらに、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ法のアラインメント」が利用可能であり、アラインメ
ント法ラベル付Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（HigginsおよびSharp, CABIOS. 5:151-153 (1989)；
Higgins, D.G.ら、Comput. Appl. Biosci. 8:189-191(1992)中に記載される）に対応し；
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングパッケージソフト（Ｄ
ＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム中に見出され
る。マルチプルアラインメントのためのデフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ
＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅ
ｎ Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｗ
ｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用した配列の
アラインメント後、同じプログラム中の「配列距離」表を見ることによって、「パーセン
ト同一性」を得ることが可能である。
用語「配列分析ソフトウェア」とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用な
任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムをいう。「配列分析ソフ
トウェア」は、市販であっても独立して開発してもよい。典型的な配列分析ソフトウェア
には、ｌ．）ＧＣＧパッケージソフトのプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇ
ｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣ
Ｇ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Al
tschulら、J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)）；３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴ
ＡＲ，Ｉｎｃ． Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｃ
ｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）；および５．）Ｓｍｉ
ｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込むＦＡＳＴＡプログラム（W. R. Pearson,
Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-
20. 編者: Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY）が含まれるが、これらに限定されな
い。本出願の文脈において、特に規定しない限り、配列分析ソフトウェアが分析に使用さ
れる場合、分析の結果は、参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解
される。本明細書中で使用する場合、「デフォルト値」は、最初に初期化される場合、そ
のソフトウェアが元々ロードする値またはパラメータの任意のセットを意味する。
本明細書中で使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該分
野で周知であり、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第３
版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2000)；およびSi
lhavyら、Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Col
d Spring Harbor, NY (1984)；およびGreene Publishing Assoc. and Wiley-Interscienc
eにより刊行されたAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology（1987年から現
在まで）に記載されている。
本明細書中に開示される組換え宿主の遺伝子操作は、標準的な遺伝子技術およびスクリ
ーニングを使用して実施され得、遺伝子操作に適した任意の宿主細胞において行われ得る
。いくつかの実施形態において、組換え宿主は、双子葉植物および単子葉植物の両方を含
む任意の高等植物、ならびに作物植物およびその油のために使用される植物を含む消費用
植物であり得るが、これらに限定されない。従って、任意の植物種または植物細胞が、以
下にさらに記載されるように選択され得る。
本発明の油は、非料理または食餌プロセスおよび組成物においても使用され得る。これ
らの使用のいくつかは、産業的使用、化粧品使用または医療的使用であり得る。本発明の
油は、本発明の油が適する任意の適用においても使用され得る。一般に、本発明の油は、
潤滑油、潤滑油添加物、金属加工流体、油圧流体および耐火性油圧流体などの種々の適用
において、例えば、鉱油、エステル、脂肪酸または動物性脂肪を置き換えるために使用さ
れ得る。本発明の油は、改変油を生成するプロセスにおける材料としても使用され得る。
本発明の油を改変するための技術の例には、分留、水素添加、油のオレイン酸またはリノ
レン酸含量の変更、および当業者に公知の他の改変技術が含まれる。
本発明の油について化粧品使用の例には、化粧品組成物中の皮膚軟化剤としての使用；
ワセリン代用品としての使用；石鹸の一部を構成するものとしてのまたは石鹸を生成する
プロセスにおける材料としての使用；経口処置溶液の一部を構成するものとしての使用；
加齢処置組成物の一部を構成するものとしての使用；および皮膚または毛髪エアロゾル泡
状調製物の一部を構成するものとしての使用が含まれる。
さらに、本発明の油は、医療的適用において使用され得る。例えば、本発明の油は、感
染に対する保護障壁において使用され得、ω−９脂肪酸が高い油は、移植片生存を増強す
るために使用され得る（米国特許第６，２１０，７００号）。
上記は、本発明の油が適する非料理使用の非限定的な例であることを理解すべきである
。上述のように、本発明の油および改変油は、当業者に公知の全ての適用において、例え
ば、鉱油、エステル、脂肪酸または動物性脂肪を置き換えるために使用され得る。
ＰＵＦＡシンターゼ
真核生物における長鎖ＰＵＦＡ（ＬＣ−ＰＵＦＡ）の合成のための「標準的な」または
「古典的な」経路は、中間鎖長の飽和またはモノ不飽和脂肪酸の伸長および不飽和化を含
み、記載されている。ＰＵＦＡシンターゼを介した長鎖ＰＵＦＡの合成のための経路もま
た記載されており、これは「標準的な」経路とは非常に異なっている。具体的には、ＰＵ
ＦＡシンターゼは、炭素供給源としてマロニル−ＣｏＡを利用し、任意の顕著な量で中間
体を放出することなしに最終ＰＵＦＡを生成する。また、ＰＵＦＡシンターゼを用いて、
適切なｃｉｓ二重結合が、酸素を必要としない機構を使用して合成の間に付加される。い
くつかの実施形態において、ＮＡＤＰＨが、合成サイクルの間に還元剤として使用される
。
本発明は、（内因的にまたは遺伝子操作により）ＰＵＦＡシンターゼを発現するように
遺伝子改変された宿主生物（例えば、ダイズなどの植物）に関する。いくつかの実施形態
において、ＰＵＦＡシンターゼを発現するように遺伝子改変された生物は、その生物によ
って内因的に発現されないＰＵＦＡシンターゼまたは別のタンパク質を用いた生物の改変
に関して、「異種」宿主生物として本明細書中で言及され得、この生物は、その生物がそ
れにより遺伝子改変されるかかる酵素または少なくとも特定のＰＵＦＡシンターゼもしく
はその一部分を天然には（遺伝子改変なしに内因的には）発現しない。本発明の遺伝子改
変は、ＰＵＦＡシンターゼを内因的に発現する宿主生物におけるＰＵＦＡ生成を改善する
ために使用され得、この生物は、異なるＰＵＦシンターゼまたはその一部分でさらに改変
されることはない。
本発明に従うＰＵＦＡシンターゼは、選択されたサイクルにおけるｔｒａｎｓ−ｃｉｓ
異性化およびエノイル還元反応を含む、脂肪酸鎖の反復性のプロセシングおよび非反復性
のプロセシングの両方を実施するために一緒になって作用できるいくつかの多機能タンパ
ク質を含み得る（および単一機能のタンパク質、特に海洋細菌由来のＰＵＦＡシンターゼ
を含み得る）。これらのタンパク質は、本明細書中でコアＰＵＦＡシンターゼ酵素複合体
またはコアＰＵＦＡシンターゼとも呼ばれ得る。これらのタンパク質内に含まれるドメイ
ンおよびモチーフの一般的な機能は、当該分野で個々に公知であり、海洋細菌および真核
生物由来の種々のＰＵＦＡシンターゼに関して詳細に記載されている（例えば、米国特許
第６，１４０，４８６号；米国特許第６，５６６，５８３号；Metzら、Science 293:290-
293 (2001)；米国出願公開番号２００２／０１９４６４１；米国出願公開番号２００４／
０２３５１２７；米国出願公開番号２００５／０１００９９５およびＷＯ２００６／１３
５８６６を参照のこと）。これらのドメインは、上述のように、単一のタンパク質（例え
ば、ドメインおよびタンパク質は同義である）として、または単一のタンパク質中の２つ
以上の（複数の）ドメインのうち１つとして見出され得る。海洋細菌およびスラウストキ
トリウム（Thraustochytrium）のメンバー由来の種々のＰＵＦＡシンターゼのドメイン構
造、ならびにかかるＰＵＦＡシンターゼを含む遺伝子およびタンパク質の構造的特徴およ
び機能的特徴は、記載されている（例えば、米国特許第６，１４０，４８６号；米国特許
第６，５６６，５８３号；Metzら、Science 293:290-293 (2001)；米国出願公開番号２０
０２／０１９４６４１；米国出願公開番号２００４／０２３５１２７；米国出願公開番号
２００５／０１００９９５およびＷＯ２００６／１３５８６６を参照のこと）。
ＰＵＦＡシンターゼ活性を有するポリヌクレオチド、遺伝子およびポリペプチドの多数
の例が当該分野で公知であり、本明細書中に開示される遺伝子改変された宿主において使
用され得る。本発明において有用なＰＵＦＡシンターゼタンパク質またはドメインには、
細菌および非細菌の両方のＰＵＦＡシンターゼが含まれ得る。非細菌ＰＵＦＡシンターゼ
は、真核生物などの、細菌ではない生物由来であるかかかる生物から誘導される系である
。細菌ＰＵＦＡシンターゼは、例えば、米国出願公開番号２００８／００５０５０５中に
記載されている。細菌ＰＵＦＡシンターゼの機能的ドメインと共に非細菌ＰＵＦＡシンタ
ーゼの機能的ドメイン、ならびに他のＰＫＳ系（Ｉ型反復性またはモジュラー、ＩＩ型ま
たはＩＩＩ型）またはＦＡＳ系由来のＰＵＦＡシンターゼの機能的ドメインまたはタンパ
ク質を組み込む本発明の遺伝子改変された植物が、生成され得る。
いくつかの実施形態において、本発明のＰＵＦＡシンターゼは、典型的には３つ、４つ
またはそれ以上のタンパク質上に含まれる以下の生物学的に活性なドメインを少なくとも
含む：（ａ）少なくとも１つのエノイル−ＡＣＰレダクターゼ（ＥＲ）ドメイン；（ｂ）
複数のアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメイン（複数可）（例えば、少なくとも１
つ〜４つ、または少なくとも５つのＡＣＰドメイン、およびいくつかの実施形態において
は、最大６つ、７つ、８つ、９つ、１０または１０より多いＡＣＰドメイン）；（ｃ）少
なくとも２つのβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＳ）ドメイン；（ｄ）少なくとも
１つのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメイン；（ｅ）少なくとも１つのβ−ケトア
シル−ＡＣＰレダクターゼ（ＫＲ）ドメイン；（ｆ）少なくとも２つのＦａｂＡ様β−ヒ
ドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ（ＤＨ）ドメイン；（ｇ）少なくとも１つの鎖長因
子（ＣＬＦ）ドメイン；および／または（ｈ）少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡ：ＡＣ
Ｐアシルトランスフェラーゼ（ＭＡＴ）ドメイン。いくつかの実施形態において、本発明
に従うＰＵＦＡシンターゼは、デヒドラターゼ（ＤＨ）の保存された活性部位モチーフを
含む少なくとも１つの領域もまた含む。
いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、以下の生物学的に活性なドメイ
ンを少なくとも含む：（ａ）少なくとも１つのエノイル−ＡＣＰレダクターゼ（ＥＲ）ド
メイン；（ｂ）少なくとも５つのアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメイン；（ｃ）
少なくとも２つのβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＳ）ドメイン；（ｄ）少なくと
も１つのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメイン；（ｅ）少なくとも１つのβ−ケト
アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＫＲ）ドメイン；（ｆ）少なくとも２つのＦａｂＡ様β−
ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ（ＤＨ）ドメイン；（ｇ）少なくとも１つの鎖長
因子（ＣＬＦ）ドメイン；および（ｈ）少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシ
ルトランスフェラーゼ（ＭＡＴ）ドメイン。いくつかの実施形態において、本発明に従う
ＰＵＦＡシンターゼは、ＦａｂＡ様ＤＨドメインの一部ではないデヒドラターゼ（ＤＨ）
の保存された活性部位モチーフを含む少なくとも１つの領域またはドメインもまた含む。
これらのドメインのそれぞれの構造的特徴および機能的特徴は、米国出願公開番号２００
２／０１９４６４１；米国出願公開番号２００４／０２３５１２７；米国出願公開番号２
００５／０１００９９５；米国出願公開番号２００７／０２４５４３１およびＷＯ２００
６／１３５８６６中に詳細に記載されている。
コアシゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＵＦＡシンターゼを形成する３つのオープン
リーディングフレームが存在しており、これらは例えば米国出願公開番号２００７／０２
４５４３１において以前に記載されている。各オープンリーディングフレームのドメイン
構造は以下のとおりである。
シゾキトリウム（Schizochytrium）オープンリーディングフレームＡ（ＯｒｆＡまたは
Ｐｆａ１）：ＯｒｆＡは、２９１０アミノ酸の配列をコードする８７３０ヌクレオチドの
配列（終止コドンを含まない）である。ＯｒｆＡ内には、１２個のドメインが存在する：
（ａ）１つのβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＳ）ドメイン；（ｂ）１つのマロニ
ル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ（ＭＡＴ）ドメイン；（ｃ）９つのアシル
キャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメイン；および（ｄ）１つのケトレダクターゼ（ＫＲ）
ドメイン。シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）ＡＴＣＣ ２０８８８およびシ
ゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）、株Ｎ２３０Ｄと称されるＡＴＣＣ ２０８
８８の娘株の両方由来のＯｒｆＡをコードするゲノムＤＮＡクローン（プラスミド）が単
離され、配列決定されている。
ゲノムクローンｐＪＫ１１２６（ｐＪＫ１１２６ ＯｒｆＡゲノムクローンと称する、
シゾキトリウム（Schizochytrium）ＡＴＣＣ ２０８８８由来の「ＯｒｆＡ」遺伝子を含
む大腸菌（E. coli）プラスミドベクターの形態）は、２００６年６月８日にＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、１０８０１
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−
２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７６４８が割り当てられた。
ゲノムクローンｐＪＫ３０６（ｐＪＫ３０６ ＯｒｆＡゲノムクローンと称する、シゾ
キトリウム属の種（Schizochytrium sp.）Ｎ２３０Ｄ由来のＯｒｆＡ遺伝子の５’部分を
含む大腸菌（E. coli）プラスミドの形態（ｐＪＫ３２０と２．２ｋＢが重複））は、２
００６年６月８日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓ
ｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７
６４１が割り当てられた。
ゲノムクローンｐＪＫ３２０（ｐＪＫ３２０ ＯｒｆＡゲノムクローンと称する、シゾ
キトリウム属の種（Schizochytrium sp.）Ｎ２３０Ｄ由来のＯｒｆＡ遺伝子の３’部分を
含む大腸菌（E. coli）プラスミドの形態（ｐＪＫ３０６と２．２ｋＢが重複））は、２
００６年６月８日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓ
ｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７
６４４が割り当てられた。
シゾキトリウム（Schizochytrium）オープンリーディングフレームＢ（ＯｒｆＢまたは
Ｐｆａ２）：ＯｒｆＢは、２０５９アミノ酸の配列をコードする６１７７ヌクレオチドの
配列（終止コドンを含まない）である。ＯｒｆＢ内には、４つのドメインが存在する：（
ａ）１つのケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＳ）ドメイン；（ｂ）１つの鎖長因子（Ｃ
ＬＦ）ドメイン；（ｃ）１つのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメイン；および（ｄ
）１つのエノイルＡＣＰ−レダクターゼ（ＥＲ）ドメイン。シゾキトリウム属の種（Schi
zochytrium sp.）ＡＴＣＣ ２０８８８およびシゾキトリウム属の種（Schizochytrium s
p.）、株Ｎ２３０Ｄと称されるＡＴＣＣ ２０８８８の娘株の両方由来のＯｒｆＢをコー
ドするゲノムＤＮＡクローン（プラスミド）が単離され、配列決定されている。
ゲノムクローンｐＪＫ１１２９（ｐＪＫ１１２９ ＯｒｆＢゲノムクローンと称する、
シゾキトリウム（Schizochytrium）ＡＴＣＣ ２０８８８由来の「ＯｒｆＢ」遺伝子を含
む大腸菌（E. coli）プラスミドベクターの形態）は、２００６年６月８日にＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、１０８０１
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−
２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７６４９が割り当てられた。
ゲノムクローンｐＪＫ３２４（ｐＪＫ３２４ ＯｒｆＢゲノムクローンと称する、シゾ
キトリウム属の種（Schizochytrium sp.）Ｎ２３０Ｄ由来のＯｒｆＢ遺伝子配列を含む大
腸菌（E. coli）プラスミドの形態）は、２００６年６月８日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ Ｕ
ＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７６４３が割り当てられた。
シゾキトリウム（Schizochytrium）オープンリーディングフレームＣ（ＯｒｆＣまたは
Ｐｆａ３）：ＯｒｆＣは、１５０２アミノ酸の配列をコードする４５０６ヌクレオチドの
配列（終止コドンを含まない）である。ＯｒｆＣ内には、３つのドメインが存在する：（
ａ）２つのＦａｂＡ様−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ（ＤＨ）ドメイン；およ
び（ｂ）１つのエノイルＡＣＰ−レダクターゼ（ＥＲ）ドメイン。シゾキトリウム属の種
（Schizochytrium sp.）ＡＴＣＣ ２０８８８およびシゾキトリウム属の種（Schizochyt
rium sp.）、株Ｎ２３０Ｄと称されるＡＴＣＣ ２０８８８の娘株の両方由来のＯｒｆＣ
をコードするゲノムＤＮＡクローン（プラスミド）が単離され、配列決定されている。
ゲノムクローンｐＪＫ１１３１（ｐＪＫ１１３１ ＯｒｆＣゲノムクローンと称する、
シゾキトリウム（Schizochytrium）ＡＴＣＣ ２０８８８由来の「ＯｒｆＣ」遺伝子を含
む大腸菌（E. coli）プラスミドベクターの形態）は、２００６年６月８日にＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、１０８０１
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−
２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７６５０が割り当てられた。
ゲノムクローンｐＢＲ００２（ｐＢＲ００２ ＯｒｆＣゲノムクローンと称する、シゾ
キトリウム属の種（Schizochytrium sp.）Ｎ２３０Ｄ由来のＯｒｆＣ遺伝子配列を含む大
腸菌（E. coli）プラスミドベクターの形態）は、２００６年６月８日にＡｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０
９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７６４２が割り当てられた。
さらに、以前に記載されたコアスラウストキトリウム（Thraustochytrium）ＰＵＦＡシ
ンターゼを形成する３つのオープンリーディングフレームが存在する。各オープンリーデ
ィングフレームのドメイン構造は以下のとおりである。
スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３ＢオープンリーディングフレームＡ（
ＯｒｆＡ）：ＯｒｆＡは、２８１１アミノ酸の配列をコードする８４３３ヌクレオチドの
配列（終止コドンを含まない）である。以下のドメインがＴｈ．２３Ｂ ＯｒｆＡ中に存
在する：（ａ）１つのβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＳ）ドメイン；（ｂ）１つ
のマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ（ＭＡＴ）ドメイン；（ｃ）８つ
のアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメイン；および（ｄ）１つのβ−ケトアシル−
ＡＣＰレダクターゼ（ＫＲ）ドメイン。
ゲノムクローンＴｈ２３ＢＯｒｆＡ＿ｐＢＲ８１２．１（Ｔｈ２３ＢＯｒｆＡ＿ｐＢＲ
８１２．１ゲノムクローンと称する、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３Ｂ
由来のＯｒｆＡ遺伝子配列を含む大腸菌（E. coli）プラスミドベクターの形態）は、２
００７年３月１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ（ＡＴＣＣ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ
．２０１１０−２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２３２が割り
当てられた。ゲノムクローンＴｈ２３ＢＯｒｆＡ＿ｐＢＲ８１１（Ｔｈ２３ＢＯｒｆＡ＿
ｐＢＲ８１１ゲノムクローンと称する、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３
Ｂ由来のＯｒｆＡ遺伝子配列を含む大腸菌（E. coli）プラスミドベクターの形態）は、
２００７年３月１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａ
ｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−
８２３１が割り当てられた。
スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３ＢオープンリーディングフレームＢ（
ＯｒｆＢ）：ＯｒｆＢは、１９３５アミノ酸の配列をコードする５８０５ヌクレオチドの
配列（終止コドンを含まない）である。以下のドメインがＴｈ．２３Ｂ ＯｒｆＢ中に存
在する：（ａ）１つのβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＳ）ドメイン；（ｂ）１つ
の鎖長因子（ＣＬＦ）ドメイン；（ｃ）１つのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメイ
ン；および（ｄ）１つのエノイル−ＡＣＰレダクターゼ（ＥＲ）ドメイン。ゲノムクロー
ンＴｈ２３ＢＯｒｆＢ＿ｐＢＲ８００（Ｔｈ２３ＢＯｒｆＢ＿ｐＢＲ８００ゲノムクロー
ンと称する、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３Ｂ由来のＯｒｆＢ遺伝子配
列を含む大腸菌（E. coli）プラスミドベクターの形態）は、２００７年３月１日にＡｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８
０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１
０−２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２７が割り当てられた
。
スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３ＢオープンリーディングフレームＣ（
ＯｒｆＣ）：ＯｒｆＣは、１４７０アミノ酸の配列をコードする４４１０ヌクレオチドの
配列（終止コドンを含まない）である。以下のドメインがＴｈ．２３Ｂ ＯｒｆＣ中に存
在する：（ａ）２つのＦａｂＡ様β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ（ＤＨ）ド
メイン、共にＦａｂＡタンパク質（ｔｒａｎｓ−２−デセノイル−ＡＣＰの合成およびこ
の生成物のｃｉｓ−３−デセノイル−ＡＣＰへの可逆的な異性化を触媒する酵素）に対し
て相同性を有する；および（ｂ）シゾキトリウム（Schizochytrium）ＯｒｆＢのＥＲドメ
インに対して高い相同性を有する１つのエノイル−ＡＣＰレダクターゼ（ＥＲ）ドメイン
。ゲノムクローンＴｈ２３ＢＯｒｆＣ＿ｐＢＲ７０９Ａ（Ｔｈ２３ＢＯｒｆＣ＿ｐＢＲ７
０９Ａゲノムクローンと称する、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３Ｂ由来
のＯｒｆＣ遺伝子配列を含む大腸菌（E. coli）プラスミドベクターの形態）は、２００
７年３月１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（
ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａ
ｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２
８が割り当てられた。
キメラまたはハイブリッドＰＵＦＡシンターゼ：いくつかの実施形態において、ＰＵＦ
Ａシンターゼは、本明細書中に記載されるドメインのいずれかから選択されるドメインを
含み、これらのドメインは、組み合わされて（例えば、混合および調和されて）、本明細
書中に記載される最低限の要件を満たす完全なＰＵＦＡシンターゼを形成する。いくつか
の実施形態において、本発明の遺伝子改変された生物は、別のＰＵＦＡシンターゼの少な
くとも１つのドメインまたは生物学的に活性なそのフラグメントによってさらに改変され
得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼのドメインのいずれかは、ＰＵ
ＦＡシンターゼ系におけるそのドメインの機能を改変または増強するために（例えば、そ
の系によって生成されるＰＵＦＡ型またはその比率を改変するために）、その天然の構造
から改変され得る。キメラＰＵＦＡシンターゼを生成するためにドメインをこのように混
合することは、本明細書中で引用される特許および刊行物中に記載されている。
いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、シゾキトリウム（Schizochytri
um）ＰＵＦＡシンターゼを含み、ここで、シゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＵＦＡシ
ンターゼ由来のＯｒｆＣは、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３Ｂ由来のＯ
ｒｆＣで置き換えられている。いくつかの実施形態において、スラウストキトリウム（Th
raustochytrium）２３Ｂ由来のかかるキメラＯｒｆＣは、シゾキトリウム（Schizochytri
um）のコドン使用のために最適化された核酸配列によってコードされる。かかるキメラＯ
ｒｆＣの非限定的な例として、プラスミドｐＴｈＯｒｆＣ−ｓｙｎＰＳ（ｐＴｈＯｒｆＣ
−ｓｙｎＰＳと称する、シゾキトリウム（Schizochytrium）または他の異種宿主における
発現のために最適化された「完全縫合（perfect stitch）」合成スラウストキトリウム（
Thraustochytrium）２３Ｂ ＰＵＦＡ ＰＫＳ ＯｒｆＣコドンを含む大腸菌（E. coli
）プラスミドベクターの形態）は、２００７年３月１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡに寄
託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２９が割り当てられた（米国出願公開番号２００
８／００２２４２２もまた参照のこと）。
本発明の遺伝子改変された生物において使用され得るＰＵＦＡシンターゼ遺伝子および
ポリペプチドの他の例には、本明細書中にさらに記載される方法によって生成された以下
のコドン最適化された配列が含まれるがこれらに限定されない：配列番号１（ＳｚＰＵＦ
Ａ ＯｒｆＡ ｖ３タンパク質）；配列番号２（ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３タンパク
質）；配列番号３（ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３タンパク質）；配列番号６（Ｓ
ｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ遺伝子）；配列番号７（ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３遺伝子）；
および配列番号８（ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３遺伝子）、ならびにかかる配列
の活性なバリアント、一部分、フラグメントまたは誘導体、ここで、かかる遺伝子がＰＵ
ＦＡシンターゼ活性をコードする、またはかかるポリペプチドもしくはタンパク質がＰＵ
ＦＡシンターゼ活性を有する。本発明は、１つまたは複数のかかる配列を含むあるいは１
つまたは複数のかかる配列からなる、単離されたポリヌクレオチドあるいはポリペプチド
を含む。
本発明において使用され得るＰＵＦＡシンターゼ遺伝子およびポリペプチドの他の例に
は、本明細書中に記載されるＰＵＦＡシンターゼ遺伝子またはポリペプチドのいずれか１
つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５
％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または
１００％の配列同一性を有するＰＵＦＡシンターゼ遺伝子またはポリペプチドが含まれる
がこれらに限定されない。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間で選択され得る（例
えば、８０％〜１００％同一、８５％〜１００％同一、９０％〜１００％同一、９５％〜
１００％同一、８０％〜９９％同一、８５％〜９９％同一、９０％〜９９％同一または９
５％〜９９％同一）。本発明の遺伝子改変された生物において使用され得るＰＵＦＡシン
ターゼ遺伝子およびポリペプチドのなお他の例には、本明細書中に記載されるＰＵＦＡシ
ンターゼまたは配列のいずれか１つの誘導体の活性なバリアント、一部分、フラグメント
が含まれるがこれらに限定されず、かかる遺伝子がＰＵＦＡシンターゼ活性をコードする
またはかかるポリペプチドがＰＵＦＡシンターゼ活性を有する。
いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、藻類ＰＵＦＡシンターゼであり
得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、配列番号１のアミノ酸配列
に対して、８０％〜１００％同一、８５％〜１００％同一、９０％〜１００％同一、９５
％〜１００％同一、８０％〜９９％同一、８５％〜９９％同一、９０％〜９９％同一また
は９５％〜９９％同一なアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦ
Ａシンターゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、
ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列は、配列番号６の核酸配列に対して、８０％〜
１００％同一、８５％〜１００％同一、９０％〜１００％同一、９５％〜１００％同一、
８０％〜９９％同一、８５％〜９９％同一、９０％〜９９％同一または９５％〜９９％同
一な核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼをコードす
る核酸配列は、配列番号６の核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦ
Ａシンターゼは、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８
５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少
なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施
形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、配列番号２のアミノ酸配列を含み得る。いくつか
の実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列は、配列番号７の核酸配
列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５
％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同
一な核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼをコードす
る核酸配列は、配列番号７の核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦ
Ａシンターゼは、配列番号３のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８
５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少
なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施
形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実
施形態において、ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列は、配列番号８の核酸配列に
対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、
少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一な
核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配
列は、配列番号８の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、配列番号１、２もしくは３のア
ミノ酸配列またはそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡ
シンターゼは、配列番号６、７もしくは８の核酸配列またはそれらの任意の組合せを含む
。いくつかの実施形態において、この核酸配列は、本明細書中に記載される配列番号１、
２もしくは３のアミノ酸配列またはそれらの任意の組合せもしくはそのパーセント同一性
をコードする。
いくつかの実施形態において、他のＰＵＦＡシンターゼ遺伝子および／またはポリペプ
チドの配列は、本明細書中に開示された当該分野で利用可能な配列を使用して、当業者に
周知の文献中およびバイオインフォマティクスデータベース中で同定され得る。例えば、
かかる配列は、既知のＰＵＦＡシンターゼ遺伝子またはポリペプチド配列を用いた、公に
利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ検索を介して同定され得る。かかる方法において、
同一性は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０
．１およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重みマトリックスのデフォルトパ
ラメータを使用するＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法のアラインメントに基づき得る。
さらに、本明細書中に開示されるまたは当該分野で公知のＰＵＦＡシンターゼ遺伝子ま
たはポリペプチド配列は、天然の他のＰＵＦＡシンターゼホモログを同定するために使用
され得る。例えば、本明細書中に開示されるＰＵＦＡシンターゼ核酸フラグメントの各々
は、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離するために使用され得る。配列依存的プロ
トコルを使用した相同遺伝子の単離は、当該分野で周知である。配列依存的プロトコルの
例には、（１）核酸ハイブリダイゼーションの方法；（２）核酸増幅技術（例えば、ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Mullisら、米国特許第４，６８３，２０２号；リガーゼ連
鎖反応（ＬＣＲ）、Tabor, S.ら、Proc. Acad. Sci. USA 82:1074 (1985)；または鎖置換
増幅（ＳＤＡ）、Walkerら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:392 (1992)）の種々の
使用によって例示されるような、ＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法；ならびに（３）相補性
によるライブラリー構築およびスクリーニングの方法、が含まれるがこれらに限定されな
い。
これら全ての方法は、標的タンパク質をコードする既知のまたは同定された配列を使用
して、当業者によって容易に実施され得る。いくつかの実施形態において、標的ＰＵＦＡ
シンターゼコード配列の周囲のＤＮＡ配列もまた、いくつかの改変手順において有用であ
り、公に利用可能なデータベースにおいて、当業者により容易に見出され得る。遺伝子変
異を創出するための方法は一般的であり、当業者に周知であり、変異を創出する実践に適
用され得る。
ホスホパンテチエニル（phosphopantethienyl）トランスフェラーゼ
ホスホパンテチエニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）は、脂肪酸合成、ポリケチ
ド合成および非リボソームペプチド合成において充分に特徴付けられた酵素のファミリー
である。特に、ＰＵＦＡシンターゼ酵素中に存在するＡＣＰドメインは、補酵素Ａ由来の
補因子（４−ホスホパンテテイン）のアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）への付着によ
る活性化を必要とする。この補因子の付着は、ＰＰＴａｓｅによって実行される。宿主生
物の内因性ＰＰＴａｓｅｓがＰＵＦＡシンターゼのＡＣＰドメインを活性化できない場合
、その機能を実行することが可能なＰＰＴａｓｅを提供することが必要である。多数のＰ
ＰＴａｓｅの配列が公知であり、結晶構造（例えば、Reuterら、EMBO J. 18:6823-31 (19
99)）ならびに活性に重要なアミノ酸残基の変異分析（Mofidら、Biochemistry 43:4128-3
6 (2004)）が決定されている。
本明細書中に記載されるＯｒｆＡ ＡＣＰドメインを基質として認識することが以前に
実証されている異種ＰＰＴａｓｅの一例は、ノストック属の種（Nostoc sp.）ＰＣＣ ７
１２０（以前にはアナベナ属の種（Anabaena sp.）ＰＣＣ ７１２０と呼ばれた）のＨｅ
ｔ Ｉタンパク質である。Ｈｅｔ Ｉは、その生物の異質細胞中に存在する糖−脂質層の
構成要素である長鎖ヒドロキシ−脂肪酸の合成を担うことが公知のノストック（Nostoc）
中の遺伝子のクラスター中に存在する（BlackおよびWolk, J. Bacteriol. 176:2282-2292
(1994)；Campbellら、Arch. Microbiol. 167:251-258 (1997)）。Ｈｅｔ Ｉは、このク
ラスター中に存在するタンパク質Ｈｇｌ ＥのＡＣＰドメインを活性化する可能性が高い
。Ｈｇｌ Ｅの２つのＡＣＰドメインは、シゾキトリウム（Schizochytrium）ＯｒｆＡお
よび他のＰＵＦＡシンターゼにおいて見出されるＡＣＰドメインに対して高い程度の配列
相同性を有する。
いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、少なくとも１つの４’−ホスホ
パンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）ドメインを含むとみなされ得るか、
またはかかるドメインは、ＰＵＦＡシンターゼに対するアクセサリードメインまたはタン
パク質であるとみなされ得る。ＰＰＴａｓｅの構造的特徴および機能的特徴は、例えば、
米国出願公開番号２００２／０１９４６４１；米国出願公開番号２００４／０２３５１２
７；および米国出願公開番号２００５／０１００９９５中に詳細に記載されている。
ＰＰＴａｓｅ活性を有する遺伝子およびポリペプチドの多数の例が、当該分野で公知で
あり、使用されている特定のＰＵＦＡシンターゼのＡＣＰドメインを活性化することが可
能である場合、本発明の遺伝子改変された生物において使用され得る。本発明の遺伝子改
変された生物において使用され得る遺伝子およびポリペプチドの例には、本明細書中にさ
らに記載される以下のコドン最適化された配列が含まれ得るがこれらに限定されない：配
列番号５（ＮｏＨｅｔＩ ｖ３タンパク質）および配列番号１０（ＮｏＨｅｔＩ ｖ３遺
伝子）。
本発明の遺伝子改変された生物において使用され得るＰＰＴａｓｅ遺伝子およびポリペ
プチドの他の例には、本明細書中に記載されるＰＰＴａｓｅまたは配列のうちいずれか１
つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５
％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または
１００％の配列同一性を有するＰＰＴａｓｅ遺伝子またはポリペプチドが含まれるがこれ
らに限定されない。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間で選択され得る（例えば、
８０％〜１００％同一、８５％〜１００％同一、９０％〜１００％同一、９５％〜１００
％同一、８０％〜９９％同一、８５％〜９９％同一、９０％〜９９％同一または９５％〜
９９％同一）。本発明の遺伝子改変された生物において使用され得るＰＰＴａｓｅ遺伝子
およびポリペプチドのなお他の例には、本明細書中に記載されるＰＰＴａｓｅ配列のいず
れか１つの活性なバリアント、フラグメント、一部分または誘導体が含まれるがこれらに
限定されず、かかる遺伝子がＰＰＴａｓｅ活性をコードするまたはかかるポリペプチドが
ＰＰＴａｓｅ活性を有する。
いくつかの実施形態において、ＰＰＴａｓｅは藻類ＰＰＴａｓｅであり得る。いくつか
の実施形態において、ＰＰＴａｓｅは、配列番号５のアミノ酸配列に対して、８０％〜１
００％同一、８５％〜１００％同一、９０％〜１００％同一、９５％〜１００％同一、８
０％〜９９％同一、８５％〜９９％同一、９０％〜９９％同一または９５％〜９９％同一
なアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＰＴａｓｅは配列番号５の
アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＰＴａｓｅをコードする核酸
配列は、配列番号１０の核酸配列に対して、８０％〜１００％同一、８５％〜１００％同
一、９０％〜１００％同一、９５％〜１００％同一、８０％〜９９％同一、８５％〜９９
％同一、９０％〜９９％同一または９５％〜９９％同一な核酸配列を含み得る。いくつか
の実施形態において、ＰＰＴａｓｅをコードする核酸配列は、配列番号１０の核酸配列を
含み得る。いくつかの実施形態において、この核酸配列は、本明細書中に記載される配列
番号５のアミノ酸配列またはその任意のパーセント同一性をコードする。
本発明のいくつかの実施形態において、ＰＰＴａｓｅは、異種宿主におけるＰＰＴａｓ
ｅの生成および／または蓄積のために提供され得る。
いくつかの実施形態において、ＰＰＴａｓｅをコードする遺伝子および／またはポリペ
プチドは、別のＰＰＴａｓｅ遺伝子および／もしくはポリペプチド配列を同定するために
使用され得る、ならびに／または他の細胞におけるＰＰＴａｓｅホモログを同定するため
に使用され得る。かかるＰＰＴａｓｅコード配列は、例えば、当業者に周知の文献中およ
び／またはバイオインフォマティクスデータベース中で同定され得る。例えば、バイオイ
ンフォマティクスを使用した別の細胞型におけるＰＰＴａｓｅコード配列の同定は、本明
細書中に提供される任意のものなどの、既知のＰＰＴａｓｅコードＤＮＡおよびポリペプ
チド配列を用いた、公に利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ（上で開示したとおり）検
索を介して、達成され得る。同一性は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮ
ＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重み
マトリックスのデフォルトパラメータを使用するＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法のアラインメント
に基づく。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、
組織またはそれらの一部は、ＰＵＦＡシンターゼおよびＰＰＴａｓｅを含む。いくつかの
実施形態において、遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそ
れらの一部は、（ｉ）および（ｉｉ）の核酸配列を単一の組換え発現ベクター中に含む。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組
織またはそれらの一部は、（ｉ）および（ｉｉ）の核酸配列を異なる組換え発現ベクター
中に含む。
アシル−ＣｏＡシンテターゼ
本発明は、長鎖ＰＵＦＡ遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のアシル−ＣｏＡへの変換を触媒するア
シル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＡＳ）タンパク質を提供する。ＰＵＦＡシンターゼに
よるＰＵＦＡの内因性生成体であるシゾキトリウム（Schizochytrium）は、そのＰＵＦＡ
シンターゼの遊離脂肪酸生成物をアシル−ＣｏＡに変換することが可能な１つまたは複数
のＡＣｏＡＳを保有する。従って、シゾキトリウム（Schizochytrium）、ならびにＰＵＦ
Ａシンターゼを内因的に含む他の生物（例えば、他のヤブレツボカビ（Thraustochytrids
））またはＰＵＦＡ ＦＦＡをアシル−ＣｏＡに変換できる他の生物（例えば、タラシオ
シラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）またはクリプテコジニウム・コーニー
（Crypthecodinium cohnii））は、異種宿主において発現されるＰＵＦＡシンターゼの生
成物の蓄積を許容するまたは増加させるのに有用な酵素をコードする遺伝子の供給源を提
示し得る。他のＡＣｏＡＳ配列は、米国出願公開番号２００７／０２４５４３１中に記載
されている。
ＡＣｏＡＳ活性を有する遺伝子およびポリペプチドの多数の例が、当該分野で公知であ
り、本発明の遺伝子改変された生物において使用され得る。本発明の遺伝子改変された生
物において使用され得る遺伝子およびポリペプチドの例には、本明細書中にさらに記載さ
れる以下のコドン最適化された配列が含まれ得るがこれらに限定されない：配列番号４（
ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３タンパク質）および配列番号９（ｈＳｚＴｈＡＣＳ−２ ｖ３遺伝
子）。
本発明の遺伝子改変された生物において使用され得るＡＣｏＡＳ遺伝子およびポリペプ
チドの他の例には、本明細書中に記載されるＡＣｏＡＳまたは配列のいずれか１つに対し
て、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少な
くとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％
の配列同一性を有するＡＣｏＡＳ遺伝子またはポリペプチドが含まれるが、これらに限定
されない。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間で選択され得る（例えば、８０％〜
１００％同一、８５％〜１００％同一、９０％〜１００％同一、９５％〜１００％同一、
８０％〜９９％同一、８５％〜９９％同一、９０％〜９９％同一または９５％〜９９％同
一）。本発明の遺伝子改変された生物において使用され得るＡＣｏＡＳ遺伝子およびポリ
ペプチドのなお他の例には、本明細書中に記載されるＡＣｏＡＳ配列のいずれか１つの活
性なバリアント、フラグメント、一部分または誘導体が含まれるがこれらに限定されず、
かかる遺伝子がＡＣｏＡＳ活性をコードするまたはかかるポリペプチドがＡＣｏＡＳ活性
を有する。
いくつかの実施形態において、ＡＣｏＡＳは藻類ＡＣｏＡＳであり得る。いくつかの実
施形態において、ＡＣｏＡＳは、配列番号４のアミノ酸配列に対して、８０％〜１００％
同一、８５％〜１００％同一、９０％〜１００％同一、９５％〜１００％同一、８０％〜
９９％同一、８５％〜９９％同一、９０％〜９９％同一または９５％〜９９％同一なアミ
ノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＣｏＡＳは、配列番号４のアミノ
酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＣｏＡＳをコードする核酸配列は、
配列番号９の核酸配列に対して、８０％〜９９％同一、８５％〜９９％同一、９０％〜９
９％同一、８０％〜９５％同一または８５％〜９５％同一な核酸配列を含み得る。いくつ
かの実施形態において、ＡＣｏＡＳをコードする核酸配列は、配列番号９の核酸配列を含
み得る。いくつかの実施形態において、ＡＣｏＡＳをコードする核酸配列は、配列番号３
４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、この核酸配列は、本明細書中に記載
される配列番号４のアミノ酸配列またはその任意のパーセント同一性をコードする。
本発明のいくつかの実施形態において、ＡＣｏＡＳは、異種宿主におけるＡＣｏＡＳの
生成および／または蓄積、ならびに内因性宿主におけるＡＣｏＡＳの改善された生成およ
び／または蓄積を提供し得る。
いくつかの実施形態において、ＡＣｏＡＳをコードする遺伝子および／またはポリペプ
チドは、別のＡＣｏＡＳ遺伝子および／またはポリペプチド配列を同定するために使用さ
れ得る、ならびに／あるいは他の細胞におけるＡＣｏＡＳホモログを同定するために使用
され得る。かかるＡＣｏＡＳコード配列は、例えば、当業者に周知の文献中および／また
はバイオインフォマティクスデータベース中で同定され得る。例えば、バイオインフォマ
ティクスを使用した別の細胞型におけるＡＣｏＡＳコード配列の同定は、本明細書中に提
供される任意のものなどの、既知のＡＣｏＡＳコードＤＮＡおよびポリペプチド配列を用
いた、公に利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ（上で開示したとおり）検索を介して、
達成され得る。同一性は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥ
ＮＡＬＴＹ＝０．１およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重みマトリックス
のデフォルトパラメータを使用するＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法のアラインメントに基づく。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、
組織またはそれらの一部は、ＰＵＦＡシンターゼおよびＡＣｏＡＳ、またはＰＵＦＡシン
ターゼ、ＰＰＴａｓｅおよびＡＣｏＡＳを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改
変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部は、単一の組換え
発現ベクター中に含まれる、（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の核酸配列またはそれ
らの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態において、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉ
ｉ）の核酸配列は、異なる組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態におい
て、（ｉ）および（ｉｉ）の核酸配列が単一の組換え発現ベクター中に含まれ、（ｉｉｉ
）の核酸配列が異なる組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、
（ｉ）および（ｉｉｉ）の核酸配列が単一の組換え発現ベクター中に含まれ、（ｉｉ）の
核酸配列が異なる組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉ
ｉ）および（ｉｉｉ）の核酸配列が単一の組換え発現ベクター中に含まれ、（ｉ）の核酸
配列が異なる組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉ）、
（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の核酸配列またはそれらの任意の組合せは、１つまたは複数
の種子特異的プロモーターの制御下にある。
遺伝子改変された生物の作製方法
顕著に高い収率の１種または複数の所望の多価不飽和脂肪酸を生成するために、植物は
、ＰＵＦＡシンターゼを植物中に導入するために遺伝子改変され得る。本発明は、かかる
遺伝子改変の有効性を改善または増強するための方法、ならびに特にＰＵＦＡシンターゼ
の最終生成物、例えばＰＵＦＡの生成および／または蓄積を改善または増強するための方
法にも関する。
植物が含まれるがこれに限定されない遺伝子改変された生物における遺伝子発現のため
の方法は、当該分野で公知である。いくつかの実施形態において、発現されるＰＵＦＡシ
ンターゼ遺伝子のコード領域は、以下に記載されるように、標的宿主細胞のためにコドン
最適化され得る。植物細胞が含まれるがこれに限定されない組換え宿主細胞における遺伝
子の発現は、目的のコード領域に作動可能に連結されたプロモーターおよび／または転写
ターミネーターを必要とし得る。種子特異的プロモーター（例えば、ＰｖＤｌｅｃ２、Ｌ
ｆＫＣＳ３、ＦＡＥ１、ＢｏＡＣＰもしくはＢｎａＮａｐｉｎＣ）または葉特異的プロモ
ーター（例えば、ユビキチンもしくはＣｓＶＭＶ）が含まれるがこれらに限定されない多
数のプロモーターが、遺伝子のためのベクターを構築する際に使用され得る。本発明にお
いて使用され得るプロモーターの他の非限定的な例には、ＷＯ１９９２／１８６３４に開
示されたアシルキャリアタンパク質プロモーター；Slightomら(Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 80: 1897-1901; 1983)；Sengupta-Gopalanら(Proc. Nat. Acad. Sci. 82: 3320-3
324; 1985)；van der Geestら(Plant Mol. Biol. 33: 553-557; 1997)およびBustosら(EM
BO J. 10: 1469-1479; 1991)に開示されたインゲンマメ（Phaseolus vulgaris）β−ファ
ゼオリンプロモーターおよび短縮バージョンが含まれる。
本発明のいくつかの実施形態において、組換えベクターは、選択された核酸配列を操作
するためのおよび宿主細胞中にかかる核酸配列を導入するためのツールとして使用される
、操作された（例えば人工的に生成された）核酸分子である。従って、組換えベクターは
、例えば宿主細胞中に選択された核酸配列を発現および／または送達することによって組
換え細胞を形成するために、選択された核酸配列をクローニング、配列決定および／また
は他の方法で操作する際に使用するのに適切である。かかるベクターは典型的に、異種核
酸配列、即ち、クローニングまたは送達される核酸配列に隣接して天然には見出されない
核酸配列を含むが、このベクターは、本発明の核酸分子に隣接して天然に見出されるまた
は本発明の核酸分子の発現に有用な調節核酸配列（例えば、プロモーター、非翻訳領域）
もまた含み得る。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかで、原核生物または真核生
物のいずれかであり得るが、典型的にはプラスミドである。ベクターは、染色体外エレメ
ント（例えばプラスミド）として維持され得るか、または組換え生物（例えば、微生物ま
たは植物）の染色体中に組み込まれ得る。ベクター全体が、宿主細胞内の適所に留まり得
、またはある特定の条件下では、本発明の核酸分子を後に残して、プラスミドＤＮＡが除
去され得る。組み込まれた核酸分子は、染色体プロモーターの制御下、ネイティブもしく
はプラスミドのプロモーターの制御下、またはいくつかのプロモーターの組合せの制御下
にあり得る。単一コピーまたは複数コピーの核酸分子が、染色体中に組み込まれ得る。本
発明の組換えベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含み得る。
いくつかの実施形態において、本発明の組換え核酸分子において使用される組換えベク
ターは、発現ベクターである。かかる実施形態において、生成される産物（例えばＰＵＦ
Ａシンターゼ）をコードする核酸配列が、組換え核酸分子を生成するために組換えベクタ
ー中に挿入される。生成されるタンパク質をコードする核酸配列が、組換え宿主細胞内の
核酸配列の転写および翻訳を可能にするベクターにおいて、この核酸配列を調節配列に作
動可能に連結させる様式で、ベクター中に挿入される。
種々の宿主生物および細胞の形質転換に有用なベクターは、一般的であり、文献中に開
示されている。典型的には、ベクターは、選択マーカー、および所望の宿主における自律
複製または染色体組込みを可能にする配列を含む。さらに、適切なベクターは、挿入され
たコード領域の発現を提供するために、それらの間にコード領域ＤＮＡフラグメントが挿
入され得る、転写開始制御を有するプロモーター領域および転写終結制御領域を含み得る
。両方の制御領域が、形質転換された宿主細胞に対して相同な遺伝子から誘導され得るが
、かかる制御領域は、生成宿主として選択された特定の種にとってネイティブではない遺
伝子からも誘導され得ることを理解すべきである。
本発明は、異種宿主におけるＰＵＦＡの生成および／または蓄積を増加させるために、
単独であるいは任意の１つまたは複数の本明細書中に記載される戦略（例えば、以下のう
ち任意の１つ、２つ、３つまたは４つ：コドン最適化、オルガネラ標的化、（例えば、Ｆ
ＡＳの阻害による）マロニルＣｏＡについてのＰＵＦＡシンターゼ競合の増強、および／
あるいは１つまたは複数のアシルトランスフェラーゼまたは関連酵素の発現）と組み合わ
せて利用される、本明細書中に記載されるＰＵＦＡシンターゼおよび外因性ＰＰＴａｓｅ
と共に、本明細書中に記載され例示される１つまたは複数のアシル−ＣｏＡシンテターゼ
の発現を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、ＰＵＦＡシンターゼ酵素、ＰＰＴａｓｅ、および／あ
るいは任意の１つまたは複数のアクセサリータンパク質および／あるいは標的化された遺
伝子改変の発現を、宿主の１つまたは複数のオルガネラに標的化することに関する。例え
ば、いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼ系およびＰＰＴａｓｅの発現は、
植物の色素体に標的化され得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼおよ
びＰＰＴａｓｅの発現は、細胞質ゾルに標的化される。いくつかの実施形態において、Ｐ
ＵＦＡシンターゼおよびＰＰＴａｓｅの発現は、植物の色素体および細胞質ゾルの両方に
標的化される。これらの実施形態のいずれかにおいて、他の標的が、色素体または細胞質
ゾルに指向され得る。
いくつかの実施形態において、アシル−ＣｏＡシンテターゼは、ＤＨＡおよび／または
他のＬＣ−ＰＵＦＡ遊離脂肪酸を、アシルトランスフェラーゼによって次に利用され得る
アシル−ＣｏＡに変換するために、細胞質ゾルにおいて発現される。
種々の色素体標的化配列が当該分野で公知であり、異種宿主が植物または植物細胞であ
る、色素体を標的化することが望まれる実施形態において使用され得る。
本発明は、異種宿主におけるＰＵＦＡの生成および／または蓄積を増加させるために、
単独であるいは任意の１つまたは複数の本明細書中に記載される戦略（例えば、以下のう
ち任意の１つ、２つ、３つまたは４つ：コドン最適化、（例えば、ＦＡＳの阻害による）
マロニルＣｏＡについてのＰＵＦＡシンターゼ競合の増強、１つまたは複数のアシル−Ｃ
ｏＡシンテターゼの発現、および／あるいは１つまたは複数のアシルトランスフェラーゼ
または関連酵素の発現）と組み合わせて利用される、本明細書中に記載されるＰＵＦＡシ
ンターゼの発現および外因性ＰＰＴａｓｅと共に、オルガネラ標的化（例えば、植物中の
色素体または葉緑体への）の使用を含む。
色素体または葉緑体への遺伝子産物の標的化は、種々のタンパク質のアミノ末端におい
て見出される、インポートの間に切断されて成熟タンパク質を生じるシグナル配列によっ
て制御される（例えば、葉緑体標的化に関して、例えば、Comaiら、J. Biol. Chem. 263:
15104-15109 (1988)を参照のこと）。これらのシグナル配列は、葉緑体中への異種産物の
インポートをもたらすために、異種遺伝子産物に融合され得る（van den Broeckら Natur
e 313:358-363 (1985)）。適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、ＲＵＢＩＳＣＯタ
ンパク質、ＣＡＢタンパク質、ＥＰＳＰシンターゼ酵素、ＧＳ２タンパク質および葉緑体
に局在化することが公知の多数の他のタンパク質をコードするｃＤＮＡから単離され得る
。
本発明のいくつかの実施形態において、本発明において使用されるタンパク質の局在化
は、細胞内区画に、例えば、色素体または葉緑体に指向される。タンパク質は、そのアミ
ノ末端に葉緑体トランジットペプチド（ＣＴＰ）を含むことによって、葉緑体に指向され
得る。同様に、タンパク質は、そのＮ末端に色素体トランジットペプチドまたはシグナリ
ングペプチドを含むことによって、色素体に指向され得る。
葉緑体インポート機構に前駆体を指向させるアミノ末端葉緑体標的化ペプチドを含むよ
り大きい前駆体タンパク質として合成される、天然に存在する葉緑体標的化タンパク質は
、当該分野で周知である。葉緑体標的化ペプチドは、葉緑体オルガネラ内に位置する特定
のエンドプロテアーゼによって一般に切断され、これにより、標的化された成熟体が放出
され、葉緑体環境中へと、前駆体から酵素を活性化できる。植物細胞の葉緑体または色素
体に遺伝子または遺伝子産物を標的化することを指向するのに適したペプチドをコードす
る配列の例には、ペチュニアＥＰＳＰＳ ＣＴＰ、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）の
ＥＰＳＰＳ ＣＴＰ２およびイントロン、ならびに当業者に公知の他の配列が含まれる。
かかる標的化配列は、それが最も効果的に機能する細胞構造に転移される所望の発現され
たタンパク質を提供する、または、所望の表現型機能に必要な細胞プロセスが濃縮される
細胞の領域へと所望の発現されたタンパク質を転移させることによる。葉緑体標的化ペプ
チドの具体的な例は、当該分野で周知であり、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）
リブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットａｔｓ１Ａトランジットペプチド、
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＥＰＳＰＳトランジットペプチド、およびトウ
モロコシ（Zea maize）リブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットトランジッ
トペプチドが含まれる。
最適化されたトランジットペプチドは、例えば、van den Broeckら、Nature, 313:358-
363 (1985)に記載されている。原核生物および真核生物のシグナル配列は、例えば、Mich
aelisら、Ann. Rev. Microbiol. 36:425 (1982)に開示されている。本発明において使用
され得るトランジットペプチドのさらなる例には、Von Heijneら、Plant Mol. Biol. Rep
. 9:104-126 (1991)；Mazurら、Plant Physiol. 85:1110 (1987)；Vorstら、Gene 65:59
(1988)に記載されるものなどの葉緑体トランジットペプチドが含まれる。ChenおよびJage
ndorf (J. Biol. Chem. 268:2363-2367 (1993))は、異種導入遺伝子のインポートのため
の、葉緑体トランジットペプチドの使用を記載している。使用されるこのペプチドは、ニ
コチアナ・プルムバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia）由来のｒｂｃＳ遺伝子
由来のトランジットペプチドである（Poulsenら Mol. Gen. Genet. 205: 193-200 (1986)
）。異種タンパク質を葉緑体に局在化させるために本明細書中で機能した１つのＣＴＰは
、セイヨウアブラナ（Brassica napus）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼから誘導された
ものである。
葉緑体または色素体に遺伝子を局在化させるための代替的手段には、葉緑体または色素
体の形質転換が含まれる。本出願において想定される分子を組み込むように葉緑体ＤＮＡ
だけが変更された組換え植物が、生成され得る。葉緑体において機能するプロモーターは
、当該分野で公知である（Hanley- Bowdenら、Trends in Biochemical Sciences 12:67-7
0 (1987)）。異種ＤＮＡが挿入された葉緑体を含む細胞を得るための方法および組成物は
、例えば、Daniellら（米国特許第５，６９３，５０７号）およびMaligaら（米国特許第
５，４５１，５１３号）に記載されている。
戦略の組合せ
本発明によれば、１種または複数の標的ＰＵＦＡの生成および蓄積のための異種宿主の
生成において、宿主におけるＰＵＦＡの生成および／または蓄積を改善するための、任意
の１つまたは複数の（任意の組合せの）本明細書中に記載される戦略が使用され得る。実
際、種々の組合せの戦略は、相加的または相乗的であり、１つまたは複数のかかる戦略の
非存在下と比較して改善されたＰＵＦＡの生成および／または蓄積を提供することが理解
される。実際、実施例は、宿主生物におけるＰＵＦＡの生成のための例示的戦略を提供す
る。
これらの改変の組合せ、または本明細書中に記載される任意の他の改変もしくは改変の
組合せを使用する任意の植物または植物細胞が、本発明により包含される。いくつかの実
施形態において、かかる植物は、宿主によるＰＵＦＡ（またはＰＵＦＡシンターゼの他の
生物活性生成物）の生成および／または蓄積の改善のための、本明細書中に記載されるア
クセサリータンパク質（例えば、ＡＣｏＡＳ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＤＡＧＡＴまたは
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ））を発現するように、さらに遺伝子改
変されたものである。さらに、標的ＰＵＦＡを含む種子または油を含む任意の生成物が、
かかる細胞または生物から誘導されるので、本明細書中に記載される任意の改変または改
変の組合せを使用する任意の宿主細胞または生物が、本発明によって包含される。
いくつかの実施形態において、本発明に従って遺伝子改変される植物（例えば植物宿主
細胞）には、双子葉植物および単子葉植物の両方を含む任意の高等植物、ならびに特に、
作物植物および特にその油のために使用される植物を含む消費用植物が含まれるがこれら
に限定されない。かかる植物には、例えば、ダイズ、ナタネ、アマニ、トウモロコシ、ベ
ニバナ、ヒマワリおよびタバコが含まれ得るがこれらに限定されない。従って、任意の植
物種または植物細胞が選択され得る。いくつかの実施形態において、植物は、マメ科（Fa
baceae）（マメ科（Leguminosae）、マメ科植物（legume）科、エンドウマメ（pea）科、
マメ（bean）科または豆類（pulse）科）の植物である。いくつかの実施形態において、
植物はグリキネ（Glycine）属の植物である。いくつかの実施形態において、植物は、グ
リキネ・アルビカンス（Glycine albicans）、グリキネ・アフィオノタ（Glycine aphyon
ota）、グリキネ・アレナリ（Glycine arenari）、グリキネ・アルギレア（Glycine argy
rea）、グリキネ・カネセンス（Glycine canescens）、グリキネ・クランデスチネ（Glyc
ine clandestine）、グリキネ・クルヴァタ（Glycine curvata）、グリキネ・キルトロバ
（Glycine cyrtoloba）、グリキネ・ファルカテ（Glycine falcate）、グリキネ・グラセ
イ（Glycine gracei）、グリキネ・ヒルチカウリス（Glycine hirticaulis）、グリキネ
・ヒルチカウリス亜種レプトサ（Glycine hirticaulis subsp. leptosa）、グリキネ・ラ
クトヴィレンス（Glycine lactovirens）、グリキネ・ラティフォリア（Glycine latifol
ia）、グリキネ・ラトロベアナ（Glycine latrobeana）、グリキネ・ミクロフィラ（Glyc
ine microphylla）、グリキネ・モンティス−ドウグラス（Glycine montis-douglas）、
グリキネ・ペラトサ（Glycine peratosa）、グリキネ・ペスカドレンシス（Glycine pesc
adrensis）、グリキネ・ピンダニカ（Glycine pindanica）、グリキネ・プレニイ（Gycin
e pullenii）、グリキネ・ルビギノサ（Glycine rubiginosa）、グリキネ・ステノフィタ
（Glycine stenophita）、グリキネ・シンデティカ（Glycine syndetika）、グリキネ・
タバキナ（Glycine tabacina）、グリキネ・トメンテラ（Glycine tomentella）、ツルマ
メ（Glycine soja）またはダイズ（Glycine max）である。いくつかの実施形態において
、植物は、ラッカセイ、マメ（インゲンマメ（Phaseolus vulgaris））、ソラマメ（Vici
a faba）またはエンドウマメ（Pisum sativum）である。
「植物の一部」には、本明細書中で使用する場合、種子（成熟種子および未成熟種子を
含む）、花粉、胚、花、果実、苗条、葉、根、茎、外植体などが含まれるがこれらに限定
されない、植物の任意の一部が含まれる。いくつかの実施形態において、遺伝子改変され
た植物は、所望の結果（例えば、増加したもしくは改変されたＰＵＦＡシンターゼならび
に／またはＰＵＦＡシンターゼを使用した所望の生成物の生成および／もしくは蓄積）が
達成されるように、その正常（例えば、野生型または天然に存在する）形態から改変（例
えば、変異または変化）されたゲノムを有する。いくつかの実施形態において、植物の遺
伝子改変は、古典的な株発生および／または分子遺伝学的技術を使用して達成され得る。
所望のアミノ酸配列をコードする組換え核酸分子が植物のゲノム中に組み込まれたトラン
スジェニック植物を生成するための方法が、当該分野で公知である。いくつかの実施形態
において、本発明に従って遺伝子改変される植物は、ヒトを含む動物による消費に適した
植物である。
特に望ましい形質、例えば、疾患抵抗性、植物形質転換の容易さ、油の含量またはプロ
ファイルなどのために最適化された、これらの植物由来の植物系統が、生成、選択または
同定され得る。いくつかの実施形態において、植物系統は、植物育種を介して、またはマ
ーカー補助された育種および耕作などの方法を介して、選択され得る。いくつかの実施形
態において、植物細胞培養物が使用され得、例えば、植物細胞培養物は、分化した植物へ
と成長せず、通常の農作業を使用して栽培されないが、その代わりに、液体培地中で成長
させ維持される。
いくつかの実施形態において、植物は油糧種子植物であり得、ここで、この油糧種子お
よび／または油糧種子中の油は、ＰＵＦＡシンターゼにより生成されるＰＵＦＡを含む。
いくつかの実施形態において、かかる油は、検出可能な量の、ＰＵＦＡシンターゼの生成
物である少なくとも１種の標的または一次ＰＵＦＡを含み得る。いくつかの実施形態にお
いて、かかる油は、標的ＰＵＦＡ生成物でも一次ＰＵＦＡ生成物でもなく、野生型植物に
おける内因性ＦＡＳ系によって天然に生成されない中間体または副生成物を、実質的に含
まないことが可能である（例えば、野生型植物は、ＦＡＳ系を介して、ある種のより短い
または中間長の鎖のＰＵＦＡ、例えば１８炭素のＰＵＦＡを生成するが、ＰＵＦＡシンタ
ーゼを用いた遺伝子改変の結果として、植物中で生成された新たなまたはさらなる脂肪酸
が存在する）。
遺伝子改変された植物の生成に関して、植物の遺伝子操作のための方法は、当該分野で
周知である。例えば、双子葉植物および単子葉植物のための生物学的および物理的な形質
転換プロトコルを含む、植物形質転換のための多数の方法が開発されている（例えば、Go
to-Fumiyukiら、Nature Biotech 17:282-286 (1999)；Mikiら、Methods in Plant Molecu
lar Biology and Biotechnology, Glick, B. R.およびThompson, J. E. 編, CRC Press,
Inc., Boca Raton, 67-88頁 (1993)）。さらに、例えばGruberら、Methods in Plant Mol
ecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R.およびThompson, J. E.編, CRC Press
, Inc., Boca Raton, 89-119頁(1993)において、植物細胞または組織の形質転換のための
ベクターおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ培養法、ならびに植物の再分化が、利用可能である。
本発明は、配列番号６〜１０から選択される核酸配列を含む単離された核酸分子、なら
びに本明細書中に記載されるかかる配列の改変または変異を含む単離された核酸分子に関
する。本発明は、配列番号１〜５から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプ
チド、ならびに改変または変異または本明細書中に記載されるかかる配列を含む単離され
たポリペプチドに関する。
本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６１を含む。本発明は、組換え発現ベクタ
ーｐＤＡＢ７３６２を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６３を含む。本
発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６５を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐ
ＤＡＢ７３６８を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６９を含む。本発明
は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３７０を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡ
Ｂ１００５１８を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０１４７６を含む。本
発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９１６６を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐ
ＤＡＢ９１６７を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３７９を含む。本発明
は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３８０を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡ
Ｂ９３２３を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９３３０を含む。本発明は、
組換え発現ベクターｐＤＡＢ９３３７を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９
３３８を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９３４４を含む。本発明は、組換
え発現ベクターｐＤＡＢ９３９６を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０１
４１２を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７７３３を含む。本発明は、組換
え発現ベクターｐＤＡＢ７７３４を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０１
４９３を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０９５０７を含む。本発明は、
組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０９５０８を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡ
Ｂ１０９５０９を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９１５１を含む。本発明
は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０８２０７を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐ
ＤＡＢ１０８２０８を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０８２０９を含む
。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９１５９を含む。本発明は、組換え発現ベクタ
ーｐＤＡＢ９１４７を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０８２２４を含む
。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０８２２５を含む。
本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６１を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織
、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６２を含
むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発
現ベクターｐＤＡＢ７３６３を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの
一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６５を含むダイズ植物、子孫、
細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７
３６８を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は
、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６９を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子また
はそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３７０を含むダイズ植
物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクター
ｐＤＡＢ１００５１８を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を
含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０１４７６を含むダイズ植物、子孫、細
胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９１
６６を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、
組換え発現ベクターｐＤＡＢ９１６７を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子または
それらの一部を含む。
本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３７９を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織
、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３８０を含
むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発
現ベクターｐＤＡＢ９３２３を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの
一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９３３０を含むダイズ植物、子孫、
細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９
３３７を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は
、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９３３８を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子また
はそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９３４４を含むダイズ植
物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクター
ｐＤＡＢ９３９６を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む
。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０１４１２を含むダイズ植物、子孫、細胞、
組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７７３３
を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換
え発現ベクターｐＤＡＢ７７３４を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれ
らの一部を含む。
本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０１４９３を含むダイズ植物、子孫、細胞、
組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０９５
０７を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、
組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０９５０８を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子ま
たはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０９５０９を含むダ
イズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベ
クターｐＤＡＢ９１５１を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部
を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０８２０７を含むダイズ植物、子孫、
細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１
０８２０８を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発
明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０８２０９を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、
種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９１５９を含む
ダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現
ベクターｐＤＡＢ９１４７を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一
部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０８２２４を含むダイズ植物、子孫
、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ
１０８２２５を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。
本明細書中で使用する場合、用語「トランスフェクション」は、外因性核酸分子（例え
ば、組換え核酸分子）が細胞中に挿入され得る任意の方法をいうために使用される。用語
「形質転換」は、藻類、細菌および酵母などの微生物細胞中または植物細胞中への核酸分
子の導入をいうためにかかる用語が使用される場合、用語「トランスフェクション」と相
互交換可能に使用され得る。微生物および植物の系において、用語「形質転換」は、微生
物または植物による外因性核酸の獲得に起因した遺伝性の変化を記述するために使用され
、用語「トランスフェクション」と本質的に同義である。いくつかの実施形態において、
トランスフェクション技術には、形質転換、パーティクルボンバードメント、拡散、能動
輸送、槽超音波処理（bath sonication）、エレクトロポレーション、マイクロインジェ
クション、リポフェクション、吸着、感染およびプロトプラスト融合が含まれるがこれら
に限定されない。
植物中に発現ベクターを導入するために広く利用される方法は、アグロバクテリウム（
Agrobacterium）の天然の形質転換系に基づいている。Horschら、Science 227:1229 (198
5)。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびアグロバクテリウ
ム・リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換するのに有用である
ことが公知の、植物病原性の土壌細菌である。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（
A. tumefaciens）のＴｉプラスミドおよびアグロバクテリウム・リゾゲネス（A. rhizoge
nes）のＲｉプラスミドはそれぞれ、植物の遺伝的形質転換を担う遺伝子を保有する。Kad
o, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991)。アグロバクテリウム（Agrobacterium
）ベクター系、およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の遺伝子移入のため
の方法の説明もまた、利用可能である。例えば、Gruberら、前出、Mikiら、前出、Molone
yら、Plant Cell Reports 8:238 (1989)および米国特許第４，９４０，８３８号および同
第５，４６４，７６３号。
植物形質転換の別の公知の方法は、微粒子（microprojectile）媒介性の形質転換であ
り、この方法では、ＤＮＡは、微粒子の表面上に担持される。この方法において、発現ベ
クターは、植物の細胞壁および細胞膜を貫通するのに充分な速度まで微粒子を加速する遺
伝子銃（biolistic）デバイスを用いて、植物組織中に導入される。Sanfordら、Part. Sc
i. Technol. 5:27 (1987)、Sanford, J. C., Trends Biotech. 6:299 (1988)、Sanford,
J. C., Physiol. Plant 79:206 (1990)、Kleinら、Biotechnology 10:268 (1992)。
植物へのＤＮＡの物理的送達のためのなお別の方法は、標的細胞の超音波処理である。
Zhangら、Bio/Technology 9:996 (1991)。また、リポソームまたはスフェロプラスト融合
が、植物中に発現ベクターを導入するために使用されてきた。Deshayesら、EMBO J., 4:2
731 (1985)、Christouら、Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:3962 (1987)。ＣａＣｌ２沈澱
、ポリビニルアルコールまたはポリ−Ｌ−オルニチンを使用したプロトプラスト中へのＤ
ＮＡの直接的取り込みもまた、報告されている。Hainら、Mol. Gen. Genet. 199:161 (19
85)およびDraperら、Plant Cell Physiol. 23:451 (1982)。プロトプラストならびに細胞
全体および組織全体のエレクトロポレーションもまた記載されている。Donnら、Abstract
s of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38,
53頁(1990)；D'Halluinら、Plant Cell 4:1495-1505 (1992)およびSpencerら、Plant Mo
l. Biol. 24:51-61 (1994)。さらに、炭化ケイ素（silicone carbide）ウィスカー（Kaep
lerら、1990, Plant Cell Reports）および例えば花浸漬（flower dipping）方法論を使
用する植物形質転換（CloughおよびBent, Plant J. 16:735-743 (1998)）もまた、使用さ
れ得る。正確な植物形質転換方法論は、形質転換のために選択される植物種および選択さ
れる植物細胞型（例えば、実生由来の細胞型、例えば、胚軸（hypocotyl）および子葉ま
たは胚性組織）にいくらか依存して変動し得る。
植物細胞中への遺伝子構築物の導入後に、植物細胞を成長させ得、苗条および根などの
分化する組織の出現に際して、成熟植物が生成され得る。いくつかの実施形態において、
複数の植物が生成され得る。植物を再分化させるための方法論は当業者に告知であり、例
えば、Plant Cell and Tissue Culture, 1994, VasilおよびThorpe編Kluwer Academic Pu
blishers、ならびにPlant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111
, 1999 Hall編Humana Press)中に見出すことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物は、発酵
培地中で培養され得るか、または土壌などの適切な培地中で成長させ得る。いくつかの実
施形態において、高等植物に適した成長培地には、土壌、砂、根の成長を支持する任意の
他の粒子状培地（例えば、バーミキュライト、パーライトなど）または水耕栽培、ならび
に高等植物の成長を最適化する適切な光、水および栄養サプリメントが含まれるがこれら
に限定されない、植物用の任意の成長培地が含まれ得る。
組換えＤＮＡ技術の使用は、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、これらの核酸
分子が転写される効率、得られた転写物が翻訳される効率、および翻訳後修飾の効率を操
作することによって、トランスフェクトされた核酸分子の発現の制御を改善し得ることが
、当業者に理解される。さらに、プロモーター配列は、ネイティブのプロモーターと比較
して、発現のレベルを改善するように遺伝子操作され得る。核酸分子の発現を制御するの
に有用な組換え技術には、１つまたは複数の宿主細胞染色体中への核酸分子の組込み、プ
ラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オ
ペレーター、エンハンサー）の置換または改変、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム
結合部位、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列）の置換または改変、宿主細胞のコドン使
用に対応するための核酸分子の改変、および転写物を不安定化する配列の欠失、が含まれ
るがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態において、植物には、医薬品、香味料、栄養補助剤、機能性食物成
分もしくは化粧品として活性な薬剤として使用される化合物を生成することが公知の植物
、またはこれらの化合物／薬剤を生成するように遺伝子操作された植物が含まれ得る。
本発明のこれらの実施形態は全て、遺伝子改変された生物ならびに本明細書中に記載さ
れるような生物を生成および使用する方法のいずれかの考察に適用される。
遺伝子改変された生物由来の生成物
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された生物は、ＥＰＡ（Ｃ２０：５
，ｎ−３）、ＤＨＡ（Ｃ２２：６，ｎ−３）、ＤＰＡ（Ｃ２２：５，ｎ−６またはｎ−３
）、ＡＲＡ（Ｃ２０：４，ｎ−６）、ＧＬＡ（Ｃ１８：３，ｎ−６）、ＡＬＡ（Ｃ１８：
３，ｎ−３）および／またはＳＤＡ（Ｃ１８：４，ｎ−３））が含まれるがこれらに限定
されない１種または複数の多価不飽和脂肪酸を生成し、いくつかの実施形態において、Ｅ
ＰＡ（Ｃ２０：５，ｎ−３）、ＤＨＡ（Ｃ２２：６，ｎ−３）、ＤＰＡ（Ｃ２２：５，ｎ
−６またはｎ−３）もしくはＤＴＡ（Ｃ２２：４，ｎ−６）またはそれらの任意の組合せ
が含まれるがこれらに限定されない１種または複数のより長い鎖のＰＵＦＡを生成する。
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物は、ＥＰＡ（Ｃ２０：５，
ｎ−３）、ＤＨＡ（Ｃ２２：６，ｎ−３）および／もしくはＤＰＡ（Ｃ２２：５，ｎ−６
またはｎ−３）またはこれらの任意の組合せが含まれるがこれらに限定されない１種また
は複数の多価不飽和脂肪酸を生成する。いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改
変された植物は、高いオレイック（oleic）背景を有さない。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された生物は、本明細書中に記載される、Ｐ
ＵＦＡシンターゼおよびＰＰＴａｓｅを組換え発現するように遺伝子改変された植物であ
る。いくつかの実施形態において、かかる植物は、宿主によるＰＵＦＡ（またはＰＵＦＡ
シンターゼの他の生物活性生成物）の生成および／または蓄積の改善のための、本明細書
中に記載されるアクセサリータンパク質（例えば、ＡＣｏＡＳ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、
ＤＡＧＡＴまたはＡＣＣａｓｅ）を発現するように、さらに遺伝子改変されたものである
。
本発明のいくつかの実施形態は、所望の鎖長および所望の数の二重結合を有する多価不
飽和脂肪酸の生成、ならびに拡張して、これらのＰＵＦＡを含む本明細書中に記載される
遺伝子改変された植物から得られた（例えば、かかる植物の油または種子から得られた）
油糧種子および油を含む。本発明によって生成され得るＰＵＦＡの例には、ＤＨＡ（ドコ
サヘキサエン酸（Ｃ２２：６，ｎ−３））、ＡＲＡ（エイコサテトラエン酸またはアラキ
ドン酸（Ｃ２０：４，ｎ−６））、ＤＰＡ（ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５，ｎ−６ま
たはｎ−３））およびＥＰＡ（エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５，ｎ−３））ならびに
それらの任意の組合せが含まれるがこれらに限定されない。本発明は、ＰＵＦＡを生成す
るＰＵＦＡシンターゼの使用を介した遺伝子改変された植物の開発によって、１種または
複数の所望の（標的または一次）ＰＵＦＡが富化した商業的に有益な脂質の生成を可能に
する。
いくつかの実施形態において、特定の生物から誘導された所与のＰＵＦＡシンターゼは
、特定の生物由来のＰＵＦＡシンターゼの選択が特定された標的または一次ＰＵＦＡの生
成を生じるように、特定のＰＵＦＡ（複数可）を生成する。いくつかの実施形態において
、ＰＵＦＡの比率は、特定のＰＵＦＡシンターゼの選択、およびそれが発現される特定の
条件にその系が如何に応答するかに依存して、異なり得る。例えば、スラウストキトリウ
ム（Thraustochytrium）２３Ｂ（ＡＴＣＣ番号２０８９２）由来のＰＵＦＡシンターゼの
使用は、標的または一次ＰＵＦＡとしてＤＨＡおよびＤＰＡ（ｎ−６）の生成もまた生じ
得る；しかし、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３Ｂの場合、ＤＨＡ対ＤＰ
Ａ（ｎ−６）の比率は、１０：１（および８：１から４０：１までの範囲であり得る）で
あるが、シゾキトリウム（Schizochytrium）では、この比率は典型的には２．５：１であ
る。いくつかの実施形態において、所与のＰＵＦＡシンターゼは、異なるＰＵＦＡシンタ
ーゼ由来のタンパク質およびドメインを混ぜることによって改変され得るか、あるいは標
的ＰＵＦＡ生成物および／または比率を変化させるために、所与のＵＦＡシンターゼのド
メインまたはタンパク質が改変され得る。
いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡを生成する酵素系の「中間体生成物」または「
副生成物」に対する言及は、その系の標的または一次ＰＵＦＡ（複数可）の生成の結果と
して酵素系によって生成されるが、一次または標的ＰＵＦＡ（複数可）ではない任意の生
成物、および特に脂肪酸生成物をいう。いくつかの実施形態において、中間体および副生
成物には、野生型植物または示された遺伝子改変のレシピエントとして使用される親植物
によって天然に生成されるが、野生型植物または示された遺伝子改変のレシピエントとし
て使用される親植物によって生成されるレベルと比較して遺伝子改変の結果としてより高
いレベルで生成されるので本明細書中では中間体または副生成物として分類される、非標
的脂肪酸が含まれ得る。いくつかの実施形態において、１つの酵素系の一次または標的Ｐ
ＵＦＡは、一次または標的生成物が異なるＰＵＦＡである異なる酵素系の中間体であり得
る。例えば、ＥＰＡを生成するための標準的な経路を使用した場合、ＧＬＡ、ＤＧＬＡお
よびＳＤＡなどの脂肪酸は、顕著な量で中間体生成物として生成される（例えば、米国出
願公開番号２００４／０１７２６８２）。同様に、また米国出願公開番号２００４／０１
７２６８２によって示されるように、ＤＨＡを生成するための標準的な経路を使用した場
合、上述の脂肪酸に加えて、ＥＴＡおよびＥＰＡ（即ち、上記第１の例における標的ＰＵ
ＦＡ）は、顕著な量で生成され得、標的ＰＵＦＡ自体よりも、総脂肪酸生成物に対して、
顕著により多い量で存在し得る。
いくつかの実施形態において、１種または複数の所望の多価不飽和脂肪酸を顕著に高い
収率で生成するために、植物は、植物中にＰＵＦＡシンターゼ系を導入するために遺伝子
改変され得る。植物は、ＰＵＦＡシンターゼを内因的に含むことが知られておらず、従っ
て、本発明は、独自の脂肪酸生成能を有する植物を生成する機会を提示する。本発明は、
同じ植物において、それらの任意の組合せを含めたＥＰＡ、ＤＨＡ、ＤＰＡ（ｎ３または
ｎ６）、ＡＲＡ、ＧＬＡ、ＳＤＡなどが含まれるがこれらに限定されない、１種または複
数のＰＵＦＡを生成するように遺伝子操作された植物を提供する。本発明は、種々の比率
および形態で多数の「デザイナー油」のうち任意の１つを創出する能力を提供する。いく
つかの実施形態において、本明細書中に記載される特定の海洋生物由来のＰＵＦＡシンタ
ーゼの使用は、ＰＵＦＡ生成の範囲を拡張でき、殆どの作物植物を成長させるのに使用さ
れる温度範囲内でかかるＰＵＦＡを首尾よく生成できる。
いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡを合成するための系の中間体または副生成物を
「実質的に含まない」、あるいは実質的な量で存在する中間体または副生成物を有さない
とは、ＰＵＦＡ（例えば、野生型植物または示された遺伝子改変のレシピエントとして使
用される親植物によって生成されない）を生成するための酵素系の導入または存在の結果
として、遺伝子改変された植物（ならびに／または植物の一部および／もしくは種子油画
分）において生成される任意の中間体または副生成物の脂肪酸（非標的ＰＵＦＡ）が、総
脂肪酸の重量で１０％未満、総脂肪酸の重量で９％未満、総脂肪酸の重量で８％未満、総
脂肪酸の重量で７％未満、総脂肪酸の重量で６％未満、総脂肪酸の重量で５％未満、総脂
肪酸の重量で４％未満、総脂肪酸の重量で３％未満、総脂肪酸の重量で２％未満、総脂肪
酸の重量で１％未満、総脂肪酸の重量で０.５％未満の量で存在し得ることを意味する。
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織また
はそれらの一部、あるいは本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれ
らの一部から得られた油または種子は、検出可能な量のＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸（Ｃ
２２：６，ｎ−３））、ＤＰＡ（ｎ−６）（ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ ｎ−６）
）またはＥＰＡ（エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５，ｎ−３））を含む。いくつかの実
施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部
、あるいは本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部から得
られた油または種子は、総脂肪酸の重量で少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％
、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０
．０６％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．０８％、少なくとも０．０９％、少な
くとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少な
くとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少な
くとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも２
．５％、少なくとも３％、少なくとも３．５％、少なくとも４％、少なくとも４．５％、
少なくとも５％、少なくとも５．５％、少なくとも６％、少なくとも６．５％、少なくと
も７％、少なくとも７．５％、少なくとも８％、少なくとも８．５％、少なくとも９％、
少なくとも９．５％、少なくとも１０％、少なくとも１０．５％、少なくとも１１％、少
なくとも１１．５％、少なくとも１２％、少なくとも１２．５％、少なくとも１３％、少
なくとも１３．５％、少なくとも１４％、少なくとも１４．５％、または少なくとも１５
％のＤＨＡを含む。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間、例えば、総脂肪酸の重量
で０．０１％〜１５％、０．０５％〜１０％および１％〜５％のＤＨＡで選択され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織また
はそれらの一部、あるいは本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれ
らの一部から得られた油または種子は、総脂肪酸の重量で少なくとも０．０１％、少なく
とも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％
、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．０８％、少なくとも０
．０９％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも
０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも
０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％
、少なくとも２．５％、少なくとも３％、少なくとも３．５％、少なくとも４％、少なく
とも４．５％、少なくとも５％、少なくとも５．５％、少なくとも６％、少なくとも６．
５％、少なくとも７％、少なくとも７．５％、少なくとも８％、少なくとも８．５％、少
なくとも９％、少なくとも９．５％、または少なくとも１０％のＥＰＡを含む。有用な範
囲は、これらの値のいずれかの間、例えば、総脂肪酸の重量で０．０１％〜１０％、０．
０５％〜５％および０.１％〜５％のＥＰＡで選択され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織また
はそれらの一部、あるいは本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれ
らの一部から得られた油または種子は、総脂肪酸の重量で少なくとも０．０１％、少なく
とも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％
、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．０８％、少なくとも０
．０９％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも
０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも
０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％
、少なくとも２．５％、少なくとも３％、少なくとも３．５％、少なくとも４％、少なく
とも４．５％、少なくとも５％、少なくとも５．５％、少なくとも６％、少なくとも６．
５％、少なくとも７％、少なくとも７．５％、少なくとも８％、少なくとも８．５％、少
なくとも９％、少なくとも９．５％、または少なくとも１０％のＤＰＡ（ｎ-６）を含む
。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間、例えば、総脂肪酸の重量で０．０１％〜１
０％、０．０１％〜５％、０．０１％〜１％、０．０１％〜０．０５％、０．０５％〜５
％および０.１％〜５％のＤＰＡ（ｎ-６）で選択され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織また
はそれらの一部、あるいは本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれ
らの一部から得られた油または種子は、総脂肪酸の重量で少なくとも１：１、少なくとも
１：１.５、少なくとも１：２、少なくとも１：２．５、少なくとも１：３、少なくとも
１：３．５、少なくとも１：４、少なくとも１：４．５、少なくとも１：５、少なくとも
１：５．５、少なくとも１：６、少なくとも１：６．５、少なくとも１：７、少なくとも
１：７．５、少なくとも１：８、少なくとも１：８．５、少なくとも１：９、少なくとも
１：１０、少なくとも１：１１、少なくとも１：１２、少なくとも１：１３、少なくとも
１：１４、少なくとも１：１５、少なくとも１：１６、少なくとも１：１７、少なくとも
１：１８、少なくとも１：１９、少なくとも１：２０、少なくとも１：２１、少なくとも
１：２１、少なくとも１：２２、少なくとも１：２３、少なくとも１：２４、少なくとも
１：２５、少なくとも１：２６、少なくとも１：２７、少なくとも１：２８、少なくとも
１：２９、または少なくとも１：３０の比率のＥＰＡ：ＤＨＡを含む。有用な範囲は、こ
れらの値のいずれかの間、例えば、総脂肪酸の重量で１：１〜１：３０、１：１〜１：２
５、１：１〜１：２０、１：１〜１：１５、１：１〜１：１０、１：１〜１：５、１：１
〜１：３および１：１〜１：２の比率のＥＰＡ：ＤＨＡで選択され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織また
はそれらの一部、あるいは本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれ
らの一部から得られた油または種子は、総脂肪酸の重量で少なくとも１：１、少なくとも
１：１．５、少なくとも１：２、少なくとも１：２．５、少なくとも１：３、少なくとも
１：３．５、少なくとも１：４、少なくとも１：４．５、少なくとも１：５、少なくとも
１：５．５、少なくとも１：６、少なくとも１：６．５、少なくとも１：７、少なくとも
１：７．５、少なくとも１：８、少なくとも１：８．５、少なくとも１：９、または少な
くとも１：１０の比率のＤＰＡ（ｎ-６）：ＤＨＡを含む。有用な範囲は、これらの値の
いずれかの間、例えば、総脂肪酸の重量で１：１〜１：１０、１：１〜１：５、１：１〜
１：３および１：１〜１：２の比率のＤＰＡ（ｎ-６）：ＤＨＡ、で選択され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織また
はそれらの一部あるいは種子から得られた油は、油の重量で少なくとも７０％、少なくと
も７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％
または少なくとも９９％のトリグリセリドを含む。いくつかの実施形態において、本発明
の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部あるいは種子から得られ
た油は、油の重量で７０％〜９９％のトリグリセリド、油の重量で７５％〜９９％のトリ
グリセリド、油の重量で８０％〜９９％のトリグリセリド、油の重量で８５％〜９９％の
トリグリセリド、または油の重量で９０％〜９９％のトリグリセリドを含む。トリグリセ
リドの精製および分析のための方法は、記載されている（例えば、Ruiz-Gutierrez Vおよ
びBarron LJ, J. Chromatogr. B. Biomed. Appl., 671:133-168, 1995）。
いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼ系の標的生成物が、長鎖ＰＵＦＡ、
例えばＤＨＡ、ＤＰＡ（ｎ−６またはｎ−３）またはＥＰＡである場合、かかるＰＵＦＡ
シンターゼ系を用いて遺伝子改変された植物の総脂質中に実質的な量で存在しない中間体
生成物および副生成物には、以下が含まれ得るがこれらに限定されない：γ−リノレン酸
（ＧＬＡ；１８：３，ｎ−６）；ステアリドン酸（ＳＴＡまたはＳＤＡ；１８：４，ｎ−
３）；ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡまたはＨＧＬＡ；２０：３，ｎ−６）、アラキ
ドン酸（ＡＲＡ，Ｃ２０：４，ｎ−６）；エイコサトリエン酸（ＥＴＡ；２０：３，ｎ−
９）および種々の他の中間体または副生成物、例えば２０：０；２０：１（Δ５）；２０
：１（Δ１１）；２０：２（Δ８，１１）；２０：２（Δ１１，１４）；２０：３（Δ５
，１１，１４）；２０：３（Δ１１，１４，１７）；ミード酸（２０：３；Δ５，８，１
１）；または２０：４（Δ５，１，１４，１７）。
本発明に従う植物の遺伝子改変は、植物による１種または複数のＰＵＦＡの精製を生じ
得る。いくつかの実施形態において、植物によって生成されるＰＵＦＡプロファイルおよ
びＰＵＦＡの比率は、ＰＵＦＡシンターゼがそこから誘導された生物によって生成される
ＰＵＦＡプロファイルおよびＰＵＦＡの比率と必ずしも同じである必要はない。
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織また
はそれらの一部は、ＰＵＦＡシンターゼの活性を介してＰＵＦＡを生成するように操作さ
れ得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡは、植物、子孫、細胞、組織またはそれ
らの一部から化合物を抽出する精製プロセスを介して回収され得る。いくつかの実施形態
において、ＰＵＦＡは、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部を収集することによ
って回収され得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡは、植物、子孫、細胞、組織
またはそれらの一部由来（例えば、油糧種子由来）の油、あるいは植物、子孫、細胞、組
織またはそれらの一部由来の種子を収集することによって回収され得る。いくつかの実施
形態において、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部はまた、その天然状態で消費
され得るか、または消費用の製品へとさらに加工され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫，細胞、組織また
はそれらの一部は、１種または複数の多価不飽和脂肪酸を生成し得る。いくつかの実施形
態において、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部は、少なくとも１種のＰＵＦＡ
（標的ＰＵＦＡ）を、（例えば、油糧種子植物である場合にはその成熟種子中に、または
油糧種子植物の種子の油中に）生成し得、ここで、ＰＵＦＡを蓄積する植物または植物の
一部（例えば、植物が油糧種子植物である場合には成熟種子、または油糧種子植物の種子
の油）中の総脂肪酸プロファイルは、検出可能な量のこのＰＵＦＡ（単数または複数）を
含む。いくつかの実施形態において、標的ＰＵＦＡは、少なくとも２０炭素のＰＵＦＡで
あり、少なくとも３つの二重結合、少なくとも４つの二重結合または少なくとも５つの二
重結合を含む。いくつかの実施形態において、標的ＰＵＦＡは、その植物によって天然に
は生成されないＰＵＦＡであり得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡを蓄積する
植物または植物の一部（植物の種子油を含む）中の総脂肪酸プロファイルは、総脂肪酸の
重量で少なくとも０．１％の標的ＰＵＦＡ（複数可）、総脂肪酸の重量で少なくとも０．
２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも１％
、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも２．５％、少なくとも３％、少なく
とも３．５％、少なくとも４％、少なくとも４．５％、少なくとも５％、少なくとも５．
５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少
なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも
５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、
少なくとも７５％の、７５％より多くの少なくとも１種の多価不飽和脂肪酸（標的ＰＵＦ
Ａ（単数または複数））、または０．１％から７５％までの任意の百分率、または０．１
％の増分で７５％より高い％（最大１００％または１００％）の標的ＰＵＦＡ（複数可）
を含む。
本明細書中で使用する場合、ＰＵＦＡの百分率量に対する言及は、特に示さない限り、
抽出された総脂肪酸の重量百分率である。いくつかの実施形態において、総脂肪酸は、脂
肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）調製物のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によって
決定されるが、総脂肪酸の決定はこの方法に限定されない。
いくつかの実施形態において、本発明の植物（および／または子孫、細胞、組織または
それらの一部あるいは種子油画分）中の総脂肪酸は、植物によって生成された総脂肪酸の
重量で１０％未満、植物によって生成された総脂肪酸の重量で９％未満、植物、子孫、細
胞、組織またはそれらの一部によって生成された総脂肪酸の重量で８％未満、植物、子孫
、細胞、組織またはそれらの一部によって生成された総脂肪酸の重量で７％未満、植物、
子孫、細胞、組織またはそれらの一部によって生成された総脂肪酸の重量で６％未満、植
物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部によって生成された総脂肪酸の重量で５％未満
、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部によって生成された総脂肪酸の重量で４％
未満、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部によって生成された総脂肪酸の重量で
３％未満、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部によって生成された総脂肪酸の重
量で２％未満、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部によって生成された総脂肪酸
の重量で１％未満の、γ−リノレン酸（ＧＬＡ；１８：３，ｎ−６）；ステアリドン酸（
ＳＴＡまたはＳＤＡ；１８：４，ｎ−３）；ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡまたはＨ
ＧＬＡ；２０：３，ｎ−６）、アラキドン酸（ＡＲＡ、Ｃ２０：４，ｎ−６）；エイコサ
トリエン酸（ＥＴＡ；２０：３，ｎ−９）および種々の他の脂肪酸、例えば２０：０；２
０：１（Δ５）；２０：１（Δ１１）；２０：２（Δ８，１１）；２０：２（Δ１１，１
４）；２０：３（Δ５，１１，１４）；２０：３（Δ１１，１４，１７）；ミード酸（２
０：３；Δ５，８，１１）；または２０：４（Δ５，１，１４，１７）から選択される脂
肪酸を、含み得る。
本発明は、本明細書中に記載される植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部によっ
て生成される任意の種子、ならびに本発明の植物、子孫、細胞、組織もしくはそれらの一
部または種子によって生成される任意の油を含む。本発明はまた、本明細書中に記載され
る植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部、種子または油を使用して生成される任意
の製品もまた含む。
本発明の遺伝子改変された生物に関する使用および生成物
本発明は、上に詳細に記載される本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織ま
たはそれらの一部（例えばダイズ）を成長させるまたは栽培することによって、ＰＵＦＡ
を生成する方法を含む。いくつかの実施形態において、かかる方法は、例えば、本明細書
中に以前に記載したような本発明に従う遺伝子改変を有する植物を、土壌などの適切な環
境中で成長させることを含む。
本発明は、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織もしくはそれらの一部か
ら、または本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織もしくはそれらの一部の種
子から油を回収する工程を含む、少なくとも１種のＰＵＦＡを含む油を生成する方法を含
む。
本発明は、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部を成
長させる工程を含む、少なくとも１種のＰＵＦＡを含む油を生成する方法を含む。本発明
は、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部の種子から油
を回収する工程を含む、種子油中の少なくとも１種のＰＵＦＡを生成する方法を含む。本
発明は、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部を成長さ
せる工程を含む、種子油中の少なくとも１種のＰＵＦＡを生成する方法を含む。
本発明は、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部、本
発明の油、本発明の種子、本発明の食物製品、本発明の機能性食物、あるいは本発明の医
薬製品をそれを必要とする個体に提供する工程を含む、少なくとも１種のＰＵＦＡを含む
サプリメントまたは治療用製品を、それを必要とする個体に提供する方法を含む。本発明
は、植物または植物細胞を、（ｉ）少なくとも１種の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を生
成する藻類ＰＵＦＡシンターゼ系をコードする核酸配列；および（ｉｉ）ホスホパンテテ
イニル補因子を藻類ＰＵＦＡシンターゼ系ＡＣＰドメインに転移させるホスホパンテテイ
ニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）をコードする核酸配列で形質転換する工程を含
む、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部を生成する方
法もまた含む。いくつかの実施形態において、この方法は、植物または植物細胞を、（ｉ
ｉｉ）アシル−ＣｏＡへの長鎖ＰＵＦＡ遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の変換を触媒するアシル−
ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＡＳ）をコードする核酸配列で形質転換する工程をさらに含
む。
いくつかの実施形態において、本発明のかかる方法のＰＵＦＡは、ＤＨＡ、ＤＰＡ（ｎ
−６）および／またはＥＰＡである。いくつかの実施形態において、本発明のかかる方法
によって生成される油は、ダイズ油である。いくつかの実施形態において、本発明のかか
る方法によって生成される油は、総脂肪酸の重量で０．０５％〜１５％のＤＨＡ、または
本明細書中にさらに記載されるその任意の量もしくは範囲を含む。いくつかの実施形態に
おいて、本発明のかかる方法によって生成される油は、総脂肪酸の重量で０．０１％〜５
％のＥＰＡ、または本明細書中にさらに記載されるその任意の量もしくは範囲をさらに含
む。いくつかの実施形態において、本発明のかかる方法によって生成される油は、総脂肪
酸の重量で０．０１％〜５％のＤＰＡ（ｎ−６）、または本明細書中にさらに記載される
その任意の量もしくは範囲をさらに含む。いくつかの実施形態において、本発明のかかる
方法によって生成される油は、総脂肪酸の重量で１：１〜１：３０の比率のＥＰＡ：ＤＨ
Ａ、総脂肪酸の重量で１：１〜１：３の比率のＥＰＡ：ＤＨＡ、または本明細書中にさら
に記載されるその任意の量もしくは範囲を含む。いくつかの実施形態において、本発明の
かかる方法によって生成される油は、総脂肪酸の重量で１：１または１：１０の比率のＤ
ＰＡ（ｎ−６）：ＤＨＡ、総脂肪酸の重量で１：１〜１：３の比率のＤＰＡ（ｎ−６）：
ＤＨＡ、または本明細書中にさらに記載されるその任意の量もしくは範囲をさらに含む。
本発明はさらに、本明細書中に記載される任意の生物またはそれらの一部（例えば、植
物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部（例えば油糧種子）、あるいはその調製
物もしくは画分）、ならびに本明細書中に記載される生物によって生成される任意の油を
、さらに含む。本発明はまた、本明細書中に記載される生物、その一部または油を使用し
て生成される任意の製品もまた含む。
本発明は、生物、その一部、あるいは本発明に従うおよび本明細書中に記載される遺伝
子改変された生物（例えば、本明細書中に記載されるように遺伝子改変された植物、子孫
、細胞、種子、組織またはそれらの一部）によって生成される油を製品に添加する工程を
含む、少なくとも１種の脂肪酸を含む製品を改変する方法に関する。本方法によって生成
される、本明細書中に記載される任意の生物、その一部または生物由来の油を一般に含む
任意の製品もまた、本発明によって包含される。
いくつかの実施形態において、この製品は、食物食餌サプリメント、医薬製剤、ヒト化
動物ミルク、調製粉乳、栄養補助食品および機能性食物から選択される。適切な医薬製剤
には、抗炎症製剤、化学療法剤、活性な賦形剤、骨粗鬆症薬物、抗うつ薬、抗痙攣薬、抗
ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）薬物、神経変性疾患の処置用の薬物、
変性性肝臓疾患の処置用の薬物、抗生物質、およびコレステロール低下製剤が含まれるが
これらに限定されない。いくつかの実施形態において、この製品は、慢性炎症、急性炎症
、胃腸障害、癌、悪液質、心臓再狭窄、神経変性障害、肝臓の変性性障害、血液脂質障害
、骨粗鬆症、変形性関節症、自己免疫疾患、妊娠高血圧腎症、早産、加齢性黄斑変性症、
肺障害およびペルオキシソーム病から選択される状態を処置するために使用される。
いくつかの実施形態において、この製品は、食物製品または機能性食物製品である。適
切な食物製品には、高級製パン商品（fine bakery ware）、パンおよびロール、朝食用シ
リアル、プロセスチーズおよび非プロセスチーズ、調味料（ケチャップ、マヨネーズなど
）、乳製品（ミルク、ヨーグルト）、プディングおよびゼラチンデザート、炭酸飲料、茶
、粉末飲料ミックス、加工魚製品、果実ベースの飲料、チューインガム、硬い菓子類（ha
rd confectionery）、冷凍乳製品、加工食肉製品、ナッツおよびナッツベースのスプレッ
ド、パスタ、加工家禽製品、グレイビーおよびソース、ポテトチップスおよび他のチップ
ス（chipsまたはcrisps）、チョコレートおよび他の菓子類、スープおよびスープミック
ス、ダイズベースの製品（例えば、豆乳、飲料、クリーム、粉状ミルク）、植物油ベース
のスプレッド、ならびに野菜ベースの飲料が含まれるがこれらに限定されない。
本発明のいくつかの実施形態において、この製品は、動物のための餌もしくは食事組成
物、または餌もしくは食事組成物用の添加物である。用語「動物」には、ヒトおよび非ヒ
トが含まれる。動物の非限定的な例は、非反芻動物（例えば、ブタ、家禽または魚）およ
び反芻動物（例えば、ウシ、ヒツジおよびウマ）である。用語餌または餌組成物とは、動
物による摂取に適したまたは動物による摂取を意図した、任意の化合物、調製物、混合物
または組成物を意味する。
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植
物、子孫、組織またはそれらの一部から得られる油、および別の油を含む油ブレンドを対
象とする。いくつかの実施形態において、この別の油は、種子油、植物油、魚油、微生物
油またはそれらの混合物である。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物、子孫、
組織またはそれらの一部から得られる油は、油中のＬＣ−ＰＵＦＡを改変するため、例え
ば、エステルを形成するためおよび／または医薬目的でＬＣ−ＰＵＦＡを精製するために
、さらに加工され得る。
本発明のいくつかの実施形態は、総脂肪酸の重量で０．０５％〜１５％のＤＨＡまたは
本明細書中にさらに記載されるその任意の範囲を含むダイズ油を対象とする。いくつかの
実施形態において、ダイズ油は、総脂肪酸の重量で０．０５％〜５％のＥＰＡをさらに含
む。いくつかの実施形態において、ダイズ油は、総脂肪酸の重量で０．０１％〜５％のＤ
ＰＡ（ｎ−６）をさらに含む。いくつかの実施形態において、ダイズ油は、総脂肪酸の重
量で３．５％より高いα−リノレン酸、または本明細書中にさらに記載されるその任意の
範囲の脂肪酸プロファイルを有する。本発明のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載
されるダイズ油を含む組成物を対象とする。いくつかの実施形態において、ダイズ油を含
む組成物は、１種または複数種の油を含む。いくつかの実施形態において、この組成物は
、ダイズではない供給源由来のＰＵＦＡ（例えばＤＨＡ）を含まない。
本発明のさらなる目的、利点および新規の特徴は、限定を意図しない以下の実施例を検
討すれば、当業者に明らかとなる。
［実施例］
ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒ
ｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ
ＨｅｔＩのコドン最適化
シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）ＡＴＣＣ＿２０８８８（ＧｅｎＢａｎｋ
ＩＤ：ＡＦ３７８３２７、ＧＩ：１５８５１８６８８）由来のＰＵＦＡシンターゼＯｒ
ｆＡ、シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）ＡＴＣＣ＿２０８８８（ＧｅｎＢａ
ｎｋ ＩＤ：ＡＦ３７８３２８、ＧＩ：１５８５１８６９０）由来のＰＵＦＡシンターゼ
ＯｒｆＢ、シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）ＡＴＣＣ＿２０８８８およびス
ラウストキトリウム（Thraustochytrium）由来のＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ（米
国出願公開番号２００８／００２２４２２）（「ハイブリッドＯｒｆＣ」とも記載される
）、シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）ＡＴＣＣ＿２０８８８由来のアシル−
ＣｏＡシンテターゼ（米国出願公開番号２００７／０２４５４３１）、ならびにノストッ
ク属の種（Nostoc sp.）ＰＣＣ ７１２０（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：Ｐ３７６９５、ＧＩ
：２０１４１３６７）由来の４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩをコ
ードするＤＮＡ配列の分析により、最適な植物発現にとって有害であり得る非最適なコド
ン組成を含むいくつかの配列モチーフの存在が明らかになった。ＰＵＦＡシンターゼＯｒ
ｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−Ｃｏ
Ａシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩタンパク質
をコードする遺伝子（複数可）の設計を、性質がより「植物様」であるＤＮＡ配列を生成
するために最適化したが、このとき、配列改変は、翻訳を妨害せず、非最適なコドン組成
を介したｍＲＮＡの不安定化を生み出すこともない。
遺伝子コードの冗長性／縮重（例えば、いくつかのアミノ酸が、１つより多いコドンに
よって特定される）によってもたらされる可塑性に起因して、異なる生物または生物のク
ラスにおけるゲノムの進化が、同義のコドンの差示的な使用を生じている。この「コドン
バイアス」は、タンパク質コード領域の平均塩基組成中に反映される。例えば、比較的低
いＧ＋Ｃ含量を有するゲノムを有する生物は、同義のコドンの３番目の位置においてＡま
たはＴを有するコドンをより多く利用するが、より高いＧ＋Ｃ含量を有するものは、３番
目の位置においてＧまたはＣを有するコドンをより多く利用する。さらに、ｍＲＮＡ内の
「マイナー」コドンの存在は、特に、マイナーコドンに対応するチャージｔＲＮＡの相対
的な豊富さが低い場合には、ｍＲＮＡの絶対的翻訳速度を低下させ得ると考えられる。こ
の論法の拡張は、個々のマイナーコドンによる翻訳速度の減少が、複数のマイナーコドン
にとって少なくとも付加的となるというものである。従って、高い相対含量のマイナーコ
ドンを有するｍＲＮＡは、対応して低い翻訳速度を有する。この速度は、対応して低いレ
ベルのコードされるタンパク質によって反映される。
双子葉植物（例えば、タバコ、ダイズ、ワタまたはキャノーラ）における発現のために
、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメ
ラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェ
ラーゼＨｅｔＩタンパク質をコードする遺伝子を操作する際に、キャノーラのコドン使用
を、公に利用可能なデータベースから評価した（表１）。
アミノ酸に対する残りのコドン選択の分布のバランスをとるために、各コドンについて
の加重平均表示を、式：Ｃ１の加重平均％＝１／（％Ｃ１＋％Ｃ２＋％Ｃ３＋など）×％
Ｃ１×１００を使用して計算し（表１）、式中、Ｃ１は問題のコドンであり、％Ｃ２、％
Ｃ３などは、表１の残りの同義のコドンの、キャノーラについての％値の平均（関連する
コドンについての平均％値は、列ＣおよびＧからとる）を示す。各コドンについての加重
平均％値は、表１の列ＤおよびＨに与えられる。
植物発現のためのコード領域を設計する際に、植物によって好まれる一次（「第１選択
の」）コドンを決定し、複数の選択が存在する場合には好ましいコドンの第２選択、第３
選択、第４選択などを決定した。次いで、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンタ
ーゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホ
スホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩの本質的に同じアミノ酸配列をコードす
るが、アミノ酸配列内の各位置においてアミノ酸を特定するために、植物（第１に好まし
い、第２に好ましい、第３に好ましい、または第４に好ましい、など）コドンの置換によ
って元のＤＮＡ配列（ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵ
ＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテ
イニルトランスフェラーゼＨｅｔＩをコードする）とは異なっている、新しいＤＮＡ配列
を設計した。
次いで、この新しい配列を、配列中の改変によって創出された制限酵素部位について分
析した。次いで、第１、第２、第３または第４選択の好ましいコドンによってコドンを置
き換えることによって、同定された部位を改変した。次いでこの配列をさらに分析し、Ｔ
ＡまたはＧＣダブレットの頻度を低減するために改変した。
これらの配列の分析により、新たなＤＮＡ配列が、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵ
ＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテタ
ーゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩタンパク質のアミノ酸
配列を本質的にコードするが、キャノーラ遺伝子において見出される頻繁に使用されるコ
ドンのバランスのとれたコドン分布を使用する双子葉植物における最適な発現のためにそ
れぞれ設計されたものであることが明らかになった。特に、新たなＤＮＡ配列は、タンパ
ク質のアミノ酸配列内の各位置において適切なアミノ酸を特定するために、植物（第１に
好ましい、第２に好ましい、第３に好ましい、または第４に好ましい）コドンの置換によ
って、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼ
キメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランス
フェラーゼＨｅｔＩをコードする元のＤＮＡ配列とは異なっていた。
植物に最適化されたＤＮＡ配列の設計を、表１、列ＤおよびＨから構築したキャノーラ
コドンバイアス表を使用して、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ（配列番号１）、ＰＵＦＡシ
ンターゼＯｒｆＢ（配列番号２）、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ（配列番号３）、
アシル−ＣｏＡシンテターゼ（配列番号４）および４’ホスホパンテテイニルトランスフ
ェラーゼＨｅｔＩ（配列番号５）のタンパク質配列の逆翻訳によって開始した。アシル−
ＣｏＡシンテターゼ（配列番号４）のタンパク質配列を、元の配列から変更した；このと
き、２番目のアミノ酸アラニンをタンパク質から除去した。次いで、制限酵素認識部位を
除去または付加するため、高度に安定な鎖内二次構造を除去するため、および植物中の操
作された遺伝子のクローニング操作または発現にとって有害であり得る他の配列を除去す
るために、コドン変化（全体的な加重平均コドン表示を保持したまま）を補償することに
よって、最初の配列を改変した。次いで、このＤＮＡ配列を、改変によって創出された可
能性がある制限酵素認識部位について再分析した。第１、第２、第３または第４選択の好
ましいコドンによって適切なコドンを置き換えることによって、同定された部位をさらに
改変した。目的の遺伝子の転写または翻訳に影響を与え得る配列中の他の部位には、エキ
ソン：イントロン接合部（５’または３’）、ポリＡ付加シグナルまたはＲＮＡポリメラ
ーゼ終結シグナルが含まれる。改変された配列をさらに分析し、さらに改変して、ＴＡま
たはＣＧダブレットの頻度を低減し、ＴＧまたはＣＴダブレットの頻度を増加させた。こ
れらのダブレットに加えて、［Ｇ＋Ｃ］または［Ａ＋Ｔ］の約６より多く連続する残基を
有する配列ブロックが、配列の転写または翻訳に影響を与え得る。従って、第１または第
２選択などのコドンを他の好ましい選択されたコドンで置き換えることによって、これら
の配列ブロックもまた改変した。コドン組成自体とは異なる設計基準（例えば、制限酵素
認識部位の付加または欠失）を適応させることが必要な場合にのみ使用される、稀に使用
されるコドンは、遺伝子設計においてかなりの程度まで含まれない。
ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡによってコードされるタンパク質は、１７から２９アミノ
酸までのサイズ範囲の反復する「プロリン−アラニン」ドメインを１０個含む。プロリン
−アラニン反復間には、８７アミノ酸を含む９つのより長い反復配列ドメインが散在した
。これらの反復のアミノ酸配列は、４つの位置でのみ変動し、バリアント位置のそれぞれ
において２つのコドン選択だけが存在した。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗコンピュータプログラム
を使用して９つの反復のアミノ酸配列を分析したところ、１００％の相同性値および９５
．４％の同一性値が得られた。ＤＮＡレベルで、９つの反復をコードする配列は、１００
％相同、８９．７％同一であり、各反復をコードする２６１塩基中の２７の位置でのみ変
動する（２７の変化のうち２３が「サイレントな」差異であり、同じアミノ酸についての
同義のコドンが相互交換される）。
標準的な遺伝子設計プロセスは、このサイズの複数の反復のために新たなコドンバイア
スのかかったＤＮＡ配列の開発を容易に適応させることはできないが、これは、高度に関
連するＤＮＡ配列が生じるのを回避するために、コドン選択が他の８つの反復中の同じ位
置で行われた、個々の反復中の全てのコドン選択のバランスを継続的にとる必要があるか
らである。８７残基の反復のそれぞれについて、同じアミノ酸配列をコードする４．５×
１０４３より多くの可能なＤＮＡ配列が存在した（配列中の各アミノ酸についての同義の
コドンの数の積として計算される）。従って、同一にコードするＤＮＡ配列を生成するた
めに利用可能な非常に大きい計算空間（computing space）が存在した。以下のプロトコ
ルは、各個々の反復についての（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）複数配列設計を生成し、その後、
全ての配列バージョンをバルクで比較して、反復をコードする高度に多様な配列を示すセ
ットを同定するために使用される方法を記載している：
工程１：別個の配列として各反復されたアミノ酸ドメインをコードするネイティブＤＮ
Ａ配列を抽出する。
工程２：遺伝子設計プログラム（例えば、ＯＰＴＧＥＮＥ（商標）、Ｏｃｉｍｕｍ Ｂ
ｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｈｙｄｅｒａｂａｄ、Ｉｎｄｉａ）中に、個々の反復されたＤ
ＮＡ配列を別個の配列としてインポートする。工程３〜５は、各配列に対して個別に実施
される。
工程３：標準的な遺伝子コードを使用してＤＮＡ配列を翻訳する。
工程４：標準的な遺伝子コードおよび適切なコドンバイアス表を使用して、翻訳された
タンパク質の配列を逆翻訳する。この例において、５３０のセイヨウアブラナ（Brassica
napus）タンパク質コード領域から集められたバイアスがかかったコドン表を使用し、各
生成された配列は、「ｎａｐ」（「ｎａｐｕｓ」の代わり）＋バージョン番号でコード名
化した。従って、反復１についての、第１の逆翻訳されたコドンバイアスがかかった配列
は、「ｒｐｔ１ ｎａｐ１」と命名した。この例示において、このプロセスを１０回実施
して、反復１のタンパク質配列をコードする１０のＤＮＡ配列バージョンを生成した。
工程５：１０の配列バージョンを、対応する数のテキストファイルにエクスポートする
。
工程６：他の反復した配列ドメインのそれぞれについて工程３〜５を反復する。この例
示において、合計９０の「ｎａｐ」配列バージョンを生成した（各反復されたエレメント
について１０）。
工程７：９０の配列ファイルをＣｌｕｓｔａｌ ＷプログラムＭｅｇａ ３．１（Ｍｅ
ｇａｓｏｆｔｗａｒｅにおいてアクセスされる）中にインポートし、９０全ての配列をイ
ンプットとして使用してマルチプル配列アラインメントを実施する。これらの配列はタン
パク質コード領域のセグメントであるので、ギャップを許容せずにアラインメントを実施
する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント後、近隣結合ツリーを組み上げて可視化し、タ
ンパク質中の９つの反復したドメインのそれぞれについて１０のコドン最適化された配列
のうち１つを、視覚により選別する。各選択された配列バージョンを、最も深く枝分かれ
したツリーの区画から選択する。
工程８：各反復されたドメインについて選択された配列を、各特定の反復について適切
な位置において、タンパク質全体をコードするコドン最適化されたＤＮＡ配列中に組み込
む。
工程９：個別に設計された多様な反復エレメントを含む、コドン最適化された配列全体
の最終的な分析を実施して、望ましくないモチーフ、制限酵素認識部位などの非存在を保
証する。
ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡコード配列のコドン最適化と共にこの方法を使用すること
は、反復される配列の不安定性を回避するために充分に多様化された反復されたプロリン
−アラニン配列の選択を生じる。これらの配列を、近接結合ツリーの最も深い枝（即ち、
この配列セット中の互いに最も遠く関連するもの）から選択した。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｓｓ
ｅｒｍａｎグローバルアラインメントを、全てのペアワイズの組合せについて実施したと
ころ、７６〜７７％の起こりうる中央値で、相同性の範囲は７４〜８１％であった（表２
）。
９つの反復されたドメインについての選択された９つの新たに設計されたコード領域の
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ
ａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が、図１に示される。全体として、これらの配列は、１００％相
同および８９．７％同一な元の配列と比較して、９３．１％相同、６１．７％同一である
。より大きい配列の分岐は、１０より多い配列反復（iteration）を使用し、（視覚的に
配列を選択する代わりに）コンピュータプログラムまたは数学的アルゴリズムを使用して
これらの配列から選択することによって、達成され得る。それにもかかわらず、例示され
た配列は高度に分岐しており、安定なポリヌクレオチドフラグメントを生成した。
新たに設計されたキャノーラに最適化されたＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシ
ンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼお
よび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩのＤＮＡ配列を、それぞれ、
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０で列挙する。これ
らのコドン最適化された配列は、明細書全体にわたりバージョン３（ｖ３）と特定される
が、コドン最適化されていない配列は、明細書全体にわたりバージョン２（ｖ２）という
。
得られたＤＮＡ配列は、より高い程度のコドン多様性、望ましい塩基組成を有し、戦略
的に配置された制限酵素認識部位を含み、遺伝子の転写または産物ｍＲＮＡの翻訳を妨害
し得る配列を欠く。表３、表４、表５、表６および表７は、表１、列ＤおよびＨから計算
されるように、元の遺伝子、植物に最適化されたバージョンおよび植物に最適化された配
列についての推奨されるコドン組成において見出されるＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、Ｐ
ＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテ
ターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩタンパク質のコード
領域のコドン組成の比較を示す。
コード領域配列のコドン最適化が完了した後、この最適化されたコード領域配列にさら
なるヌクレオチド配列を付加した。クローニングを容易にするための制限部位、Ｋｏｚａ
ｋ配列およびさらなる終止コドンを、植物に最適化されたコード配列に付加した。さらに
、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）リブロース二リン酸カルボキシラーゼ小鎖１
Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿２０２３６９．２）由来の葉緑体標的化配列を含む、
第２シリーズのＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシ
ンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよびホスホパンテテイニルトラ
ンスフェラーゼＨｅｔＩコード配列を設計した。この配列、配列番号２８を、ＰＵＦＡシ
ンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣお
よびホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩの上記コード配列に付加した。配
列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号１０から最初のメチオニンを除去し、
葉緑体標的化配列で置き換えた。葉緑体標的化配列を含む配列は、明細書全体にわたりバ
ージョン４（ｖ４）と特定される。
第２の葉緑体トランジットペプチドを、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンタ
ーゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩのコード配列に付加した。これらのコ
ード配列は、アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：Ｘ７３８４９
．１）由来の葉緑体標的化配列を含むように設計した。この配列、配列番号２９を、ＰＵ
ＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒ
ｆＣおよびホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩの上記コード配列に付加し
た。配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号１０から最初のメチオニンを除
去し、葉緑体標的化配列で置き換えた。葉緑体標的化配列を含む配列は、明細書全体にわ
たりバージョン５（ｖ５）と特定される。
シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）由来のアシル−ＣｏＡシンテターゼ遺伝
子の代替的バージョンを、ネイティブ遺伝子配列を改変して余分なオープンリーディング
フレームを除去することによって創出した。このバージョンを「ＳｚＡＣＳ−２ ｖ４」
と標識し、配列番号３０として列挙する。得られた遺伝子は「ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３」と
して上記されるアシル−ＣｏＡシンテターゼ発現遺伝子配列を置き換えるために使用され
る。
植物に最適化されたＤＮＡ配列が書類上またはｉｎ ｓｉｌｉｃｏで一旦設計されると
、実際のＤＮＡ分子を、設計された配列に対して配列が正確に対応するように、実験室に
おいて合成することができる。かかる合成ＤＮＡ分子は、クローニングでき、天然または
ネイティブの供給源から誘導されたかのように他の方法で正確に操作できる。上記さらな
る配列を含む配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含
むＤＮＡフラグメントの合成は、供給業者（Ｇｅｎｅａｒｔ Ａｇ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒ
ｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が実施した。次いで、合成ＤＮＡを発現ベクター中にクローニング
し、実施例２および３に記載したように、アグロバクテリウム（Agrobacterium）および
ダイズ中に形質転換した。
ｐＤＡＢ７３６２のプラスミド構築
ｐＤＡＢ７３６２バイナリープラスミド（図２；配列番号１１）を、マルチサイトＧａ
ｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ７３６２は、３つのＰＵＦ
ＡシンターゼＰＴＵ（上記ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、
ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ遺伝子を発現する）、１つのアシル−ＣｏＡシンテタ
ーゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩ ＰＴＵおよびホ
スフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦ
ＡシンターゼＰＴＵは、短縮型インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）フィトヘマグルチニ
ン−Ｌ遺伝子プロモーター（ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号
Ｘ０６３３６）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＡＴ２Ｓ３遺伝子５’非翻訳
領域（２Ｓ ５’ＵＴＲ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１１８８５０）、シゾキトリウ
ム属の種（Schizochytrium sp.）多価不飽和脂肪酸シンターゼオープンリーディングフレ
ームＡ（ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３）およびシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana
）２Ｓアルブミン遺伝子３’非翻訳領域ターミネーター（Ａｔ２Ｓ ＳＳＰターミネータ
ーｖ１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２２０３５）を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴ
Ｕは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、シゾキトリウム属の種（Sc
hizochytrium sp.）多価不飽和脂肪酸シンターゼオープンリーディングフレームＢ（Ｓｚ
ＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３）およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３の
ＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、シ
ゾキトリウム（Schizochytrium）およびスラウストキトリウム種（Thraustochytrium sp.
）の多価不飽和脂肪酸シンターゼオープンリーディングフレームＣ（ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ
ＯｒｆＣ ｖ３）、ならびにＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。アシル−Ｃ
ｏＡシンテターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、シゾ
キトリウム属の種（Schizochytrium sp.）アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＳｚＡＣＳ−２
ｖ３）およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトラ
ンスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ノスト
ック属の種（Nostoc sp.）４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩ（Ｎｏ
ＨｅｔＩ ｖ３）およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３３４、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ７３３
９およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７３６２を形成した。具体的には、上記
５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＡＣＳ
−２ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、Ｏｖｅｒｄｒｉｖｅ（To
roら、PNAS 85(22): 8558-8562; 1988）およびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄ
ｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ；Gardnerら、Science 231:725-727; 1986
および国際公開公報ＷＯ２００１／０２５４５９Ａ１）などの他の調節エレメントに加え
て、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：キャッサバ葉脈モザイクウ
イルス（Cassava vein Mosaic Virus）プロモーター（ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２；Ver
daguerら、Plant Molecular Biology 31:1129- 1139; 1996）、ホスフィノトリシンアセ
チルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ ｖ５；Wohllebenら、Gene 70:25- 37; 1988）および
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＯＲＦ１ ３’
非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４；Huangら、J. Bacteriol. 172:1814-18
22; 1990）もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵
素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例２．１：発現を駆動するためのＰｖＤｌｅｃ２プロモーターを使用するさらなる
プラスミドの構築
ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメ
ラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェ
ラーゼＨｅｔＩ導入遺伝子の発現を駆動するためにＰｖＤｌｅｃ２プロモーターを使用す
るさらなる構築物を設計し、構築した。これらの構築物に対する種々の変更が、発現レベ
ルを増加するために行われている。これらの変化には、コドン最適化されていない遺伝子
配列の使用、葉緑体トランジットペプチドの組込み、およびアシル−ＣｏＡシンテターゼ
ＰＴＵの除去が含まれる。
新たに構築されたプラスミドを使用して、ダイズ植物を安定に形質転換する。トランス
ジェニックダイズ植物を単離し、分子的に特徴付ける。これらの代替的構築物の使用は、
より多い量のＤＨＡおよびＬＣ−ＰＵＦＡを含むダイズ植物を生じる。得られたＬＣ−Ｐ
ＵＦＡ蓄積を決定し、０．０１％〜１５％のＤＨＡまたは０．０１％〜１５％のＬＣ−Ｐ
ＵＦＡを生成するダイズ植物を同定する。
実施例２．２：ｐＤＡＢ７３６１の構築
ｐＤＡＢ７３６１は、ネイティブのコドン最適化されていないバージョンのＳｚＰＵＦ
Ａ ＯｒｆＡ ｖ２を含むように構築されたバイナリープラスミドであり、残りの遺伝子
配列はコドン最適化されている（ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ
ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３）。ｐＤＡＢ７３６１
プラスミド（図３；配列番号３１）は、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応
を使用して構築した。ｐＤＡＢ７３６１は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのア
シル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴ
ＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第
１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ
、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ２およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第
２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ
、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第
３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ
、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含
む。アシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５
’ＵＴＲ、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３遺伝子およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含
む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ
２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１
を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３５５、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ７３３
９およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７３６１を形成した。具体的には、上記
５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
２、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＡＣＳ
−２ ｖ３ ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、Ｏｖｅｒｄｒｉｖｅおよ
びＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ
Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラー
ゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ
ｖ４もまた含む。次いで、６つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化
およびＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例２．３：ＤＡＢ７３６３の構築
ｐＤＡＢ７３６３は、コード配列のアミノ末端に融合されたリブロース二リン酸カルボ
キシラーゼ小鎖１Ａ（ＳＳＵ−ＴＰ ｖ１と標識される）をその全てが含む、コドン最適
化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ４、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ
ｖ４、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ４およびＮｏＨｅｔＩ ｖ４を含むように構築
されたバイナリープラスミドである。さらに、このプラスミドは、コドン最適化された再
構築バージョンのＳｚＡＣＳ−２ ｖ３を含む。ｐＤＡＢ７３６３プラスミド（図４；配
列番号３２）は、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。
ｐＤＡＢ７３６３は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテタ
ーゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノト
リシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンター
ゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ Ｏｒ
ｆＡ ｖ４およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンター
ゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ Ｏｒ
ｆＢ ｖ４およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンター
ゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ
ＯｒｆＣ ｖ４およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。アシル−ＣｏＡシ
ンテターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＡＣＳ
−２ ｖ３遺伝子およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイ
ニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ
、ＮｏＨｅｔＩ ｖ４およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３４０、ｐＤＡＢ７３４１、ｐＤＡＢ７３４２、ｐＤＡＢ７３４
４およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７３６３を形成した。具体的には、上記
５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
４、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ４、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ４、ＳｚＡＣＳ
−２ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ４である。ｐＤＡＢ７３３３は、Ｏｖｅｒｄｒｉｖｅおよ
びＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ
Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラー
ゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ
ｖ４もまた含む。次いで、６つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化
およびＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例２．４：ｐＤＡＢ７３６５の構築
ｐＤＡＢ７３６５は、ネイティブのコドン最適化されていないバージョンのＳｚＰＵＦ
Ａ ＯｒｆＡ ｖ２、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ２、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ
ｖ２、ＳｚＡＣＳ-２ ｖ２およびＮｏＨｅｔＩ ｖ２を含むように構築されたバイナリ
ープラスミドである。ｐＤＡＢ７３６５プラスミド（図５；配列番号３３）は、マルチサ
イトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ７３６５は、３つ
のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホ
パンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフ
ェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ
２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ２およびＡｔ２Ｓ
ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ
２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ２およびＡｔ２Ｓ
ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ
２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ２およびＡｔ２Ｓ
ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。アシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅ
ｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ２遺伝子およびＡｔ２Ｓ
ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは
、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ２およびＡｔ
２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３５５、ｐＤＡＢ７３５６、ｐＤＡＢ７３５７、ｐＤＡＢ７３６
０およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７３６５を形成した。具体的には、上記
５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
２、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ２、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ２、ＳｚＡＣＳ−２
ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ ｖ２である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖
ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）な
どの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴ
Ｕ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４も
また含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化および
ＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例２．５：ｐＤＡＢ７３６８の構築
ｐＤＡＢ７３６８は、ネイティブのコドン最適化されていないバージョンのＳｚＰＵＦ
Ａ ＯｒｆＡ ｖ２、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ２、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ
ｖ２およびＮｏＨｅｔＩ ｖ２を含むように構築されたバイナリープラスミドである。こ
の構築物はＳｚＡＣＳ−２コード配列を含まない。ｐＤＡＢ７３６８プラスミド（図６；
配列番号３４）は、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した
。ｐＤＡＢ７３６８は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテ
ターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノ
トリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンタ
ーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ Ｏ
ｒｆＡ ｖ２およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンタ
ーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ Ｏ
ｒｆＢ ｖ２およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンタ
ーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ Ｏ
ｒｆＣ ｖ２およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニル
トランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、Ｎ
ｏＨｅｔＩ ｖ２およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３５５、ｐＤＡＢ７３５６、ｐＤＡＢ７３５７、ｐＤＡＢ７３５
９およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７３６８を形成した。具体的には、上記
４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
２、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ２、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ ｖ
２である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮ
Ａ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメント
に加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモー
ターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つ
のＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて
５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例２．６：ｐＤＡＢ７３６９の構築
ｐＤＡＢ７３６９は、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ
ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＮ
ｏＨｅｔＩ ｖ３を含むように構築されたバイナリープラスミドである。この構築物はＳ
ｚＡＣＳ−２コード配列ＰＴＵを含まない。ｐＤＡＢ７３６９プラスミド（図７；配列番
号３５）は、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤ
ＡＢ７３６９は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼ
ＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシ
ンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰ
ＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ
ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰ
ＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ
ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰ
ＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ Ｏ
ｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニル
トランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、Ｎ
ｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３３４、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ７３３
８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７３６９を形成した。具体的には、上記
４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔ
Ｉ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ
−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレ
メントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプ
ロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで
、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を
用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例２．７：ｐＤＡＢ７３７０の構築
ｐＤＡＢ７３７０は、コード配列のアミノ末端に融合されたリブロース二リン酸カルボ
キシラーゼ小鎖１Ａ（ＳＳＵ−ＴＰ ｖ１と標識される）を含む、コドン最適化された再
構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ４、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ４、ｈＳ
ｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ４およびＮｏＨｅｔＩ ｖ４を含むように構築されたバイ
ナリープラスミドである。この構築物はＳｚＡＣＳ−２コード配列ＰＴＵを含まない。ｐ
ＤＡＢ７３７０プラスミド（図８；配列番号３６）は、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ
−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ７３７０は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰ
ＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランス
フェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。
具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２
Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ４およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーター
ｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２
Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ４およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーター
ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２
Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ４およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネ
ーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２
プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ４およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰター
ミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３４０、ｐＤＡＢ７３４１、ｐＤＡＢ７３４２、ｐＤＡＢ７３４
３およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７３７０を形成した。具体的には、上記
４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
４、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ４、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ４、ＮｏＨｅｔ
Ｉ ｖ４である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ
−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレ
メントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプ
ロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで
、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を
用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例２．８：ｐＤＡＢ１００５１８の構築
ｐＤＡＢ１００５１８は、コード配列のアミノ末端に融合されたアシル−ＡＣＰ−チオ
エステラーゼ由来の葉緑体トランジットペプチド（チオエステラーゼトランジットペプチ
ドと標識される）を含む、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ Ｏｒｆ
Ａ ｖ５、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ５、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ５および
ＮｏＨｅｔＩ ｖ５を含むように構築されたバイナリープラスミドである。さらに、この
プラスミドは、葉緑体トランジットペプチドを保有しないＳｚＡＣＳ−２ ｖ３コード配
列ＰＴＵを含む。ｐＤＡＢ１００５１８プラスミド（図９；配列番号３７）は、マルチサ
イトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１００５１８は、
３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホ
スホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトラン
スフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌ
ｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ５およびＡｔ
２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌ
ｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ５およびＡｔ
２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌ
ｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ５およ
びＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。アシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵは、
ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３遺伝子およ
びＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラー
ゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ５
およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ１００５１７、ｐＤＡＢ１００５１４、ｐＤＡＢ１００５１１、ｐ
ＤＡＢ１００５１５およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１００５１８を形成し
た。具体的には、上記５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖
ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰ
ＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ５、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ５、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ Ｏｒｆ
Ｃ ｖ５、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ５である。ｐＤＡＢ７３３３は、Ｏ
ｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−Ｄ
ＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセ
チルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯ
ＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、６つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを
単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験
した。
実施例２．９：ｐＤＡＢ１０１４７６の構築
ｐＤＡＢ１０１４７６は、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ Ｏｒ
ｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およ
びＮｏＨｅｔＩ ｖ３を含むように構築されたバイナリープラスミドである。このＳｚＡ
ＣＳ−２ ｖ２遺伝子配列は、ネイティブのコドン最適化されていないバージョンである
。ｐＤＡＢ１０１４７６プラスミド（図１０；配列番号３８）は、マルチサイトＧａｔｅ
ｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０１４７６は、３つのＰＵＦ
ＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテ
イニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ
ＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモ
ーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰ
ターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモ
ーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰ
ターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモ
ーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ
ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。アシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ
２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ２遺伝子およびＡｔ２Ｓ
ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、
ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２
Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３３４、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ１０１
４７１およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０１４７６を形成した。具体的に
は、上記５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダ
ー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ Ｏｒ
ｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、Ｓ
ｚＡＣＳ−２ ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、Ｏｖｅｒｄｒｉ
ｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒ
ｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランス
フェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’
ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、６つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限
酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例２．１０：ｐＤＡＢ１０１４７７の構築
ｐＤＡＢ１０１４７７は、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ Ｏｒ
ｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およ
びＮｏＨｅｔＩ ｖ３を含むように構築されたバイナリープラスミドである。ｐＤＡＢ１
０１４７７プラスミド（図１１；配列番号３９）は、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−
Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０１４７７は、３つのＰＵＦＡシンターゼ
ＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトラン
スフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む
。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、
２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネータ
ーｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、
２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネータ
ーｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、
２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミ
ネーターｖ１を含む。アシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモータ
ーｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ４遺伝子およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミ
ネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ
２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰタ
ーミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３３４、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ１０１
４７２およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０１４７７を形成した。具体的に
は、上記５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダ
ー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ Ｏｒ
ｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、Ｓ
ｚＡＣＳ−２ ｖ４、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、Ｏｖｅｒｄｒｉ
ｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒ
ｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランス
フェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’
ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、６つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限
酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
ダイズ形質転換
ダイズ子葉節外植体のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の形質転換を介し
て、トランスジェニックダイズ（Glycine max）を生成した。ｐＤＡＢ７３６２として上
記されるバイナリーベクターを保有する無害化したアグロバクテリウム（Agrobacterium
）株ＤＡ２５５２（米国出願番号６１／３６８，９６５、２０１０年７月２９日出願）を
使用して、形質転換を開始した。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の形質転換を、Zengら（Zeng P., Vadnai
s D.A., Zhang Z., Polacco J.C., (2004), Plant Cell Rep., 22(7): 478-482）の改変
１／２子葉節手順を使用して実施した。簡潔に述べると、ダイズ種子（栽培品種Ｍａｖｅ
ｒｉｃｋ）を、基本培地上で発芽させ、子葉節を単離して、アグロバクテリウム（Agroba
cterium）を感染させた。苗条開始、苗条伸長および発根培地に、アグロバクテリウム（A
grobacterium）の除去のために、セフォタキシム、チメンチンおよびバンコマイシンを補
充した。グルホシネート選択を使用して、形質転換されていない苗条の成長を阻害した。
選択された苗条を、根の発生のために発根培地に移し、次いで、小植物の順化のために土
壌ミックスに移した。
選択された小植物の頂小葉を、グルホシネートを用いて局所的に処理して（葉彩色技術
）、推定形質転換体についてスクリーニングした。スクリーニングされた小植物を温室に
移して順化させ、次いでグルホシネートで葉を彩色して、耐性を再確認した。これらの推
定の形質転換されたＴ０植物をサンプリングし、分子分析を使用して、ＰＡＴ、ならびに
ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラ
ＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラ
ーゼＨｅｔＩ導入遺伝子の存在を確認した。Ｔ０植物を温室中で自家受精させ、Ｔ１種子
を生成した。
第２のダイズ形質転換法を使用して、さらなるトランスジェニックダイズ植物を生成し
た。ｐＤＡＢ７３６２として上記されるバイナリーベクターを保有する無害化したアグロ
バクテリウム（Agrobacterium）株ＤＡ２５５２（米国仮特許出願番号６１／３６８，９
６５）を使用して、形質転換を開始した。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の形質転換を、Pazら、（Paz M., Martin
ez J., Kalvig A., Fonger T.およびWang K., (2005) Plant Cell Rep., 25: 206-213）
の改変半種子手順を使用して実施した。簡潔に述べると、成熟ダイズ種子を、塩素ガスで
一晩滅菌し、無菌Ｈ２Ｏに２０時間浸し、その後アグロバクテリウム（Agrobacterium）
媒介性の植物形質転換を行った。種子を臍に沿った縦方向切断によって半分に切断して種
子を分離し、種皮を除去した。胚軸（embryonic axis）を切り出し、任意の軸方向の苗条
/芽を子葉節から除去した。得られた半種子外植体にアグロバクテリウム（Agrobacterium
）を感染させた。苗条開始、苗条伸長および発根培地に、アグロバクテリウム（Agrobact
erium）の除去のために、セフォタキシム、チメンチンおよびバンコマイシンを補充した
。グルホシネート選択を使用して、形質転換されていない苗条の成長を阻害した。選択さ
れた苗条を、根の発生のために発根培地に移し、次いで、小植物の順化のために土壌ミッ
クスに移した。
選択された小植物の頂小葉を、グルホシネートを用いて局所的に処理して（葉彩色技術
）、推定形質転換体についてスクリーニングした。スクリーニングされた小植物を温室に
移して順化させ、次いでグルホシネートで葉を彩色して、耐性を再確認した。これらの推
定の形質転換されたＴ０植物をサンプリングし、分子分析を使用して、ＰＡＴ、ならびに
ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラ
ＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラ
ーゼＨｅｔＩ導入遺伝子の存在を確認した。７つの事象を、ｐＤＡＢ７３６２由来の導入
遺伝子を含むと同定した。これらのＴ０植物をさらなる分析に進め、温室中で自家受精さ
せて、Ｔ１種子を得た。
ダイズ事象の分子分析
選択されたｐＤＡＢ７３６２ダイズ事象の導入遺伝子コピー数を、比較定量リアルタイ
ムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法を使用して定量した。葉組織サンプルを成熟ダイズ植物の上部お
よび下部の葉から採取し、これらのサンプルを合わせて、ゲノムＤＮＡを単離した。ゲノ
ムＤＮＡを、製造業者の指示に従ってＢｉｏＳｐｒｉｎｔ ９６ ＤＮＡ Ｐｌａｎｔ
ＫｉｔおよびＢｉｏＳｐｒｉｎｔ ９６磁気粒子自動化プラットフォーム（Ｑｉａｇｅｎ
、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して単離した。抽出されたゲノムＤＮＡを、定量リア
ルタイムＰＣＲ反応（ｑＰＣＲ）においてテンプレートとして使用するために、ｄｄＨ２
０で１：５希釈した。
Ｒｏｃｈｅ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｅｎｔｅｒ（ｗｗｗ．ｕｎｉｖｅｒｓａｌ
ｐｒｏｂｅｌｉｂｒａｒｙ．ｃｏｍ）を使用することによって、ｐＤＡＢ７３６２ダイズ
植物中のＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＴｈＳｚＰ
ＵＦＡ ＯｒｆＣｖ３、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＰＡＴ ｖ５
導入遺伝子を検出するためにｑＰＣＲアッセイを設計した。アッセイにおいて使用したプ
ライマーおよびプローブを表８に記載する。標的遺伝子の存在を、フルオレセイン−アミ
ダイト（ＦＡＭ）標識したＵＰＬプローブ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎ
ｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて検出した。これらのアッセイを、シアニン−５（
Ｃｙ−５）蛍光色素で標識されたダイズ内部参照ＧＭＦＬ０１−２５−Ｊ１９、ＧｅｎＢ
ａｎｋ：ＡＫ２８６２９２．１（表８中でＧＭＳ１１６と言及される）を用いて二重の反
応で実施した。
リアルタイムＰＣＲ反応を、標準的なプロトコルを使用してＬＣ４８０ＩＩリアルタイ
ムＰＣＲサーマルサイクラー（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）で実施し
た。ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＴｈＳｚＰＵＦ
Ａ ＯｒｆＣｖ３、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＰＡＴ ｖ５、Ｆ
ＡＭ標識されたアッセイについてのデータを、５３３ｎｍの発光フィルターおよび４８３
ｎｍの励起シグナルを使用して収集した。ＧＭＳ１１６ Ｃｙ５標識された参照アッセイ
についてのデータを、６６０ｎｍのフィルターおよび６１８ｎｍの励起シグナルを使用し
て収集した。クロッシングポイント値（Ｃｐ値）および標的対参照比を、ＬＣ４８０ＩＩ
ソフトウェアの「Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
」分析ワークフローを使用して自動的に計算した。各サンプルについての標的対参照比を
、標準的な「ΔΔＣｔ」法を使用して計算した。サンプルの標的−参照比を、ダイズ内部
参照ＧＭＦＬ０１−２５−Ｊ１９の標的−参照比を用いて標準化することによって、概算
コピー数を決定した。
ＰＡＴ ｖ５選択マーカーおよびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）導入遺伝子（ＳｚＰＵ
ＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＴｈＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＣ
ｖ３、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３）の概算コピー数を、７つのｐ
ＤＡＢ７３６２事象由来のＴ１植物において決定した。２つの事象７３６２［７１０］−
７１００６および７３６２［７１０］−７１０１０由来の植物は、ＰＡＴ ｖ５選択マー
カーまたはＤＨＡ遺伝子標的配列のいずれも含まなかった。残りの事象；７３６２［７１
０］−７０９０３、７３６２［７１０］−７１００５、７３６２［７１０］−７１００８
および７３６２［７１０］−７１００９由来の植物は、１〜１０の範囲のコピー数でＰＡ
Ｔ ｖ５選択マーカーおよび５つのＤＨＡ導入遺伝子を含んでいた。事象７３６２［７０
８］−７０８０１は、単一の分離した遺伝子座を示す、０、１または２コピーのＰＡＴ
ｖ５遺伝子を有するＴ１植物を生成し、事象７３６２［７１０］−７１００５は、２つの
連鎖していない遺伝子座の分離を示唆する０と４との間のコピー数のＰＡＴ ｖ５を有す
るＴ１植物を生成した。
トランスジェニックダイズ植物のＴ１子葉の脂質分析
限定量のＴ１種子の破壊的分析を回避するために、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）
分析を、Ｔ１植物の発芽後緑色子葉に対して実施した。ＦＡＭＥの精製および分析のため
の方法が記載されている（例えば、Nightingale, ZDら、(1999) Purification of fatty
acid methyl esters by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr. B. B
iomed. Sci. Appl. 732(2):495-500；およびW.W Christieによる「Gas chromatography a
nd lipids: a practical guide」, 1989, The Oily Press）。Ｔ１子葉中の油プロファイ
ルの特徴付けは、乾燥Ｔ１種子中の油プロファイルを示す（Wilson, RF およびKwanyuen,
P., (1986) Triacylglycerol synthesis and metabolism in germinating soybean coty
ledons, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Lipids and Lipid Metabolism, 877(2
):231-237）。
実施例５．１：トランスジェニックキャノーラの分析を介したＴ１子葉中のＤＨＡの発
芽後検出の検証
発芽後緑色子葉中の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）の検証および検出を、Ｄ
ＨＡ産生キャノーラ種子を用いて実施して、Ｔ１子葉中の油プロファイルの特徴付けが成
熟Ｔ１種子内の油プロファイルの存在を示すかどうかを評価した。バイナリープラスミド
ｐＤＡＢ７３６２を保有するトランスジェニックキャノーラ種子を、水で飽和させたペー
パータオル上で室温で発芽させ、３日後に収集し、この時点で、組織を凍結乾燥させた。
この組織を直接メチル基転移したが、ヘキサンでの事前抽出はしなかった。ＬＣ−ＰＵＦ
Ａ含量（重量での％ＦＡＭＥ）を計算し、成熟種子と比較した。３０のキャノーラの現れ
た子葉からの平均ＤＨＡ含量は０．７１％（総ＬＣ−ＰＵＦＡ＝０．９７％）であり、油
含量は５３．０％であった。発芽前の４８の成熟キャノーラ種子の平均ＤＨＡ含量は０．
４９％（総ＬＣ−ＰＵＦＡ＝０．７３％）であり、油含量は４４．３％であった。この研
究により、ＬＣ−ＰＵＦＡが、発芽した緑色子葉において発芽後に検出され得ること、発
芽した緑色子葉におけるＬＣ−ＰＵＦＡの検出が、ＬＣ−ＰＵＦＡが種子中に存在するこ
とを示すことが実証されている。
実施例５．２：Ｔ１ダイズ子葉におけるＤＨＡの発芽後検出
ＦＡＭＥ分析を、定植の３〜５日後にサンプリングしたダイズ実生当たり１つの切り取
った緑色子葉に対して実施した。植物材料を凍結乾燥させ、鋼鉄のボールおよびボールミ
ルを使用してホモジナイズし、ヘキサンで３回脱脂した。プールしたヘキサン画分を蒸発
させ、乾燥残渣を計量し、ヘプタン中で再構成した。既知量の油残渣を、代用品トリヘプ
タデカノイン（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ、Ｅｌｙｓｉａｎ、ＭＮ）の存在下でメタノー
ル中０．２５Ｍの新たに調製したナトリウムメトキシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いてメチル基転移させた。この反応を、穏やかな加熱下（
４０℃）で一定に震盪しながら実施し、得られたＦＡＭＥをヘプタンで抽出した。反応の
完了を、反応したヘプタデカン酸メチルエステル代用品の回収によって確認した。ＦＡＭ
Ｅ抽出物を、Ａｇｉｌｅｎｔ ６８９０ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ（Ａｇｉ
ｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）およびＳＧＥ（
Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）の１５ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ ＢＰＸ ７０キャピラリ
ーカラムを使用したＧＣ−ＦＩＤによって分析した。各ＦＡＭＥピークをその保持時間に
よって同定し、Ｍａｔｒｅｙａ ＬＬＣ（Ｐｌｅａｓａｎｔ Ｇａｐ、ＰＡ）のナタネ油
参照ミックスの注入によって定量した。較正標準は、Ｎｕ−ＣｈｅｋのＤＨＡ、ＥＰＡお
よびＤＰＡ（ｎ−６）メチルエステルの個々に添加された標準を含んでいた。データ分析
を、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ４ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して実施した。２
つの事象由来のＴ１子葉は、ＤＨＡを含んでいた；ｐＤＡＢ７３６２［７０８］−７０８
０１．００１およびｐＤＡＢ７３６２［７１０］−７１００５．００１（表９）。
事象ｐＤＡＢ７３６２［７０８］−７０８０１．００１由来の４０の種子を発芽させ、
切り取った緑色子葉中のＬＣ−ＰＵＦＡの存在についてスクリーニングした。４０の種子
のうち６つに由来する子葉が、０．７８％〜１．５８％の範囲（平均１．１２％）でＬＣ
−ＰＵＦＡを含んでいた。ＤＨＡ含量は０．４８％〜０．９３％の範囲（平均０．６８％
）であり、ＤＰＡ（ｎ−６）含量は０．３％〜０．６５％の範囲（平均０．４４％）であ
った。
事象ｐＤＡＢ７３６２［７１０］−７１００５．００１由来の３９の種子を発芽させ、
切り取った緑色子葉中のＬＣ−ＰＵＦＡの存在についてスクリーニングした。３９の種子
のうち３７に由来する子葉が、０．７０％〜１１．９８％の範囲（平均３．９１％）でＬ
Ｃ−ＰＵＦＡを含んでいた。総ＬＣ−ＰＵＦＡのうち、ＤＨＡ含量は０．３６％〜８．０
０％の範囲（平均２．２４％）であり、ＤＰＡ（ｎ−６）含量は０．３４％〜３．９８％
の範囲（平均１．６８％）であった。
ＬＣ−ＰＵＦＡの同定を、Ｐｅｇａｓｕｓ ＩＩＩ ＧＣ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｌｅｃｏ、
Ｓｔ．Ｊｏｓｅｐｈ、ＭＩ）を使用して、陰性対照と比較して標準ＰＵＦＡメチルエステ
ル（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ、Ｅｌｙｓｉａｎ、ＭＮ）の特異的フラグメント化を評価
することによって確認した。
トランスジェニックダイズ事象由来の成熟Ｔ２種子の脂質分析
２つの事象７３６２［７０８］−７０８０１．００１および７３６２［７１０］−７１
００５．００１由来のＴ１植物を、温室中で成熟するまで成長させた。Ｔ１子葉中に高い
レベルのＬＣ−ＰＵＦＡ、および１または２コピーのＰＡＴ ｖ５、およびＤＨＡ生成の
ための付随する５つの遺伝子を含む植物を選択した。これらの植物を自家受精させ、得ら
れたＴ２種子を成熟の時点で収集した。単一の種子をＦＡＭＥ ＧＣ−ＦＩＤで分析して
、このＴ２ダイズ種子中のＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡ含量を決定した。植物当たり１２
個の成熟種子全体を、圧力によって種子を粉砕し、鋼鉄のボールおよびボールミルを使用
してホモジナイズすることによって、個々に分析した。組織をヘキサンで３回脱脂し、プ
ールしたヘキサン画分を乾燥するまで蒸発させ、残渣を計量し、上の実施例で記載したよ
うにＦＡＭＥ分析を実施するために、ヘプタン中に再構成した。
単一コピーのＰＡＴ ｖ５を保有する事象７３６２［７０８］−７０８０１．００１の
Ｔ１植物（図１２中で７３６２［７０８］−７０８０１．Ｓｘ．０２１と記載される）由
来の単一のＴ２種子は、０％〜０．７３％のＤＨＡ（０％〜１．１９％の総ＬＣ−ＰＵＦ
Ａ）を含んでいた。単一コピーのＰＡＴ ｖ５を保有する事象７３６２［７１０］−７１
００５．００１の２つのＴ１植物（図１２中で７３６２［７１０］−７１００５．Ｓｘ．
００６および７３６２［７１０］−７１００５．Ｓｘ．０．３５と記載される）由来の単
一のＴ２種子は、０％〜２．０８％のＤＨＡ（０％〜３．５６％の総ＬＣ−ＰＵＦＡ）を
含んでいた。２コピーのＰＡＴ ｖ５を含有する事象７３６２［７１０］−７１００５．
００１由来の７つのＴ１植物（図１２中で７３６２［７１０］−７１００５．Ｓｘ．０１
０、７３６２［７１０］−７１００５．Ｓｘ．０１２、７３６２［７１０］−７１００５
．Ｓｘ．０１３、７３６２［７１０］−７１００５．Ｓｘ．０１６、７３６２［７１０］
−７１００５．Ｓｘ．０１８、７３６２［７１０］−７１００５．Ｓｘ．０２５および７
３６２［７１０］−７１００５ Ｓｘ．０３１と記載される）由来の単一のＴ２種子は、
０％〜２．８４％のＤＨＡ（０％〜４．７７％の総ＬＣ−ＰＵＦＡ）を含んでいた。最も
高いＤＨＡ生成系統（７３６２［７１０］−７１００５．Ｓｘ．０２５）由来のＴ２種子
の平均ＤＨＡ含量は、１．８３％（３．１１％の総ＬＣ−ＰＵＦＡ）であった。個々のＴ
１植物由来の各Ｔ２種子のＤＨＡ含量は図１２に示される。
ＤＨＡは、ＬＣ−ＰＵＦＡを含むこれらのＴ２種子中の総ＬＣ−ＰＵＦＡ含量の６０％
を構成していた。２つの新規ＬＣ−ＰＵＦＡであるＤＨＡおよびＤＰＡ（ｎ−６）だけが
、Ｔ２ダイズ種子において検出された。ダイズ種子中に見出されると予測される脂肪酸は
正常レベルで検出されたが、総Ｃ１８脂肪酸は、ＬＣ−ＰＵＦＡの存在に起因して、比例
してより低かった。ＤＨＡおよびＤＰＡ（ｎ−６）以外の他の異なる脂肪酸は、これらの
トランスジェニックダイズ種子においては検出されなかった。トランスジェニック種子の
油含量（個々のＦＡＭＥの質量の合計を、種子質量によって除算する）およびトランスジ
ェニックＴ１系統によって生成される種子の数は、同じ条件下で同時に温室中で成長させ
た非トランスジェニックＷｉｌｌｉａｍｓ８２対照栽培品種のものと有意には異ならなか
った。
ダイズ事象７３６２［７０８］−７０８０１．００１および７３６２［７１０］−７１
００５．００１由来の個々のＴ２種子の完全ＦＡＭＥプロファイルを表１０に示す。
実施例６．１：２つのトランスジェニックダイズ事象由来の成熟Ｔ３種子の脂質分析
２つのＴ２ダイズ植物事象７３６２［７０８］−７０８０１．００１および７３６２［
７１０］−７１００５．００１を、温室中で成熟するまで成長させた。各事象の複数の植
物を温室中で成長させ、スクリーニングして、Ｔ２子葉中で高レベルのＬＣ−ＰＵＦＡを
生成し、導入遺伝子の単一のホモ接合性挿入物を含む個々の植物を同定した。同定された
植物を自家受精させ、得られたＴ３種子を、種子が成熟に達した時点で収集した。単一の
成熟Ｔ３種子をＦＡＭＥ ＧＣ−ＦＩＤで分析して、このＴ３ダイズ種子中のＤＨＡおよ
びＬＣ−ＰＵＦＡ含量を決定した（図１２ａ）。植物当たり１２個の成熟種子全体を、圧
力によって種子を粉砕し、粉砕された種子材料を鋼鉄のボールおよびボールミルを使用し
てホモジナイズすることによって、個々に分析した。組織をヘキサンで３回脱脂し、プー
ルしたヘキサン画分を乾燥するまで蒸発させ、残渣を計量し、上の実施例で記載したよう
にＦＡＭＥ分析を実施するために、ヘプタン中に再構成した。ＤＨＡレベルをＴ３種子か
ら決定し、以前にアッセイしたＴ２のＤＨＡレベルと比較した（表１１）。
表１１に示すように、ダイズ種子中のＤＨＡの相対的百分率は、ダイズの後続の世代に
おいて、一定のままであるか、または増加していた（Ｔ２およびＴ３から）。事象７３６
２［７０８］−７０８０１．００１（この系統は、分子的に特徴付けられ、ＰＡＴの単一
のヘミ接合性コピーを保有することが見出されたものである）のＴ２植物の自家受精から
生成された単一のＴ３種子をＦＡＭＥ分析でアッセイし、種子が、０％〜０．９３％のＤ
ＨＡ（０％〜１．３７％の総ＬＣ−ＰＵＦＡ）を含むことを決定した。比較として、事象
７３６２［７０８］−７０８０１．００１から生成されたＴ２種子をＦＡＭＥ分析でアッ
セイし、種子が、０％〜０．７３％のＤＨＡを含むことを決定した。Ｔ２植物事象７３６
２［７１０］−７１００５．００１−１−３５（この系統は、分子的に特徴付けられ、Ｐ
ＡＴの単一のヘミ接合性コピーを保有することが見出されたものである）の自家受精由来
の単一のＴ３種子をＦＡＭＥ分析でアッセイし、種子が、０％〜３．１０％のＤＨＡ（０
％〜５．４５％の総ＬＣ−ＰＵＦＡ）を含むことを決定した。比較として、事象７３６２
［７１０］−７１００５．００１−１−３５から生成されたＴ２種子をＦＡＭＥ分析でア
ッセイし、種子が、０％〜２．８４％のＤＨＡを含むことを決定した。さらに、事象７３
６２［７１０］−７１００５．００１−１−１３、７３６２［７１０］−７１００５．０
０１−１−１８および７３６２［７１０］−７１００５．００１−１−２５（各事象は、
ＰＡＴの単一のホモ接合性コピーを含むと決定されたものである）から生成された単一の
Ｔ３種子は、０．７９％〜４．２４％のＤＨＡ（１．２６％〜６．５％の総ＬＣ−ＰＵＦ
Ａ）を含んでいた。比較として、事象７３６２［７１０］−７１００５．００１−１−１
３、７３６２［７１０］−７１００５．００１−１−１８および７３６２［７１０］−７
１００５．００１−１−２５から生成されたＴ２種子をＦＡＭＥ分析でアッセイし、種子
が、０．７９％〜２．８４％のＤＨＡを含むことを決定した。これらのトランスジェニッ
ク事象を対照植物と比較したところ、植物当たりの収量（種子の数）および総油含量（％
）が、トランスジェニック系統と同様の条件において、Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２対照と類似
していることが見出された。
試験した全ての系統について、Ｔ２世代およびＴ３世代についてダイズ種子において生
成および測定されたＤＨＡおよびＬＣ−ＰＵＦＡの百分率は、Ｔ２世代からＴ３世代まで
、レベルにおいて一貫していたまたは増加していた。これらの結果は、この形質が遺伝す
ること、およびこの形質のさらなる世代への伝達が、減少したＤＨＡ生成を生じないこと
を示している。
トランスジェニックダイズ種子におけるＰＵＦＡシンターゼタンパク質のウエスタンブ
ロット検出
ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ（ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３遺伝子によりコードされ
る）、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ（ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３遺伝子によりコード
される）、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ（ｈＴｈＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３遺
伝子によりコードされる）およびＨｅｔＩ（ノストック属の種（Nostoc sp.）ＰＣＣ ７
１２０、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：Ｐ３７６９５、ＧＩ：２０１４１３６７由来）を、ウエ
スタンブロット分析によって成熟トランスジェニック種子サンプルにおいて検出した。残
余のダイズＴ２種子ケイクサンプルを、ＦＡＭＥ分析のためのヘキサン抽出後に保持した
。粉末化種子ケイクを、単一の４．５ｍｍステンレス鋼ボールを有するチューブ中に配置
し、抽出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ）を添加した。
サンプルチューブを、３０分間穏やかに揺らし、３，０００ｒｃｆで１５分間遠心分離し
、上清を分析に使用した。種子抽出物中の総可溶性タンパク質の量を、６６０ｎｍ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によ
って決定した。サンプルを、１．２５ｍｇ／ｍｌの総可溶性タンパク質に対して標準化し
、１レーン当たり１６．２５μｇの総可溶性タンパク質の標準化されたロードのために、
５０ｍＭ ＤＴＴを含むＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａ
ｄ、ＣＡ）中で調製した。サンプルを、３％〜８％のＴｒｉｓ−アセテートゲル（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において電気泳動し、ＰＵＦＡシンターゼＯ
ｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢおよびＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣの検出の
ためにニトロセルロースメンブレンに移した。サンプルを、４％〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒ
ｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において電気泳動し、Ｈｅ
ｔＩの検出のためにニトロセルロースメンブレンに移した。
ブロットを、ブロッキング緩衝液中でインキュベートし、次いで、異なるＰＵＦＡシン
ターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣおよ
びＨｅｔＩポリペプチドに対する抗体でプロ−ビングした。シゾキトリウム（Schizochyt
rium）ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ（ＳｚＰＵＦＳ−Ａ）のＡ２領域に対するウサギ抗Ａ
２−Ａ、シゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ（ＳｚＰＵＦＳ
−Ｂ）のＢ３領域に対するウサギ抗Ｂ３−Ａ、および全長ＨｅｔＩポリペプチドに対する
ウサギ抗ＨｅｔＩを使用した。領域Ｂ３は、ＯｒｆＢのエノイルレダクターゼ（ＥＲ）ド
メインを含む。ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ中にも相同なＥＲドメインが存在する
ので、この抗血清は、ウエスタンブロット上のＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢおよびＰＵＦ
ＡシンターゼキメラＯｒｆＣの両方を認識する。抗ウサギ蛍光標識二次抗体（Ｇｏａｔ
Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＡＦ６３３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ
））を検出のために使用した。ブロットを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ蛍光画
像機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ＮＪ）で可視化し
た。
事象７３６２［７０８］−７０８０１および７３６２［７１０］−７１００５由来の成
熟Ｔ２種子由来のタンパク質抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロットにより、ＰＵ
ＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒ
ｆＣおよびＨｅｔＩ特異的抗血清でプロ−ビングした場合に、適切なサイズにおけるバン
ドが示された（図１３）。ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢお
よびＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣのバンドは、クマシーブルーによる直接的染色に
よっても見ることができる。
代替的プロモーターを使用した、藻類ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子スイートの発現
ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメ
ラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェ
ラーゼＨｅｔＩタンパク質をコードする遺伝子（複数可）を発現するためのさらなる転写
調節エレメントの使用は、ダイズ種子内のＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡ含量をさらに増加
させ得る。トリアシルグリセロールの生合成および堆積の間に、ならびに延長された期間
にわたり、発生において初期に発現する転写調節エレメントの同定および使用は、種子発
生の初期段階（例えば、１５〜２５ＤＡＰにおける）においてＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨ
Ａ生合成遺伝子の転写を促進し、従ってＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡの生成の期間を延長
させることによって、ダイズ種子内のＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡのレベルを増加させ得
る。かかる転写調節領域の例には、レスケレラ・フェンドレリ（Lesquerella fendleri）
ＫＣＳ（ＬｆＫＣＳ３）プロモーター（米国特許第７，２５３，３３７号）およびＦＡＥ
１プロモーター（米国特許第６，７８４，３４２号）およびブラッシカ・オレラセア（Br
assica oleracea）アシルキャリアタンパク質（ＢｏＡＣＰ）プロモーター（国際公開公
報ＷＯ１９９２／１８６３４）が含まれるがこれらに限定されない。さらに、他の種子特
異的プロモーター、例えば、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）由来のファゼオリンプ
ロモーター（米国特許第５，５０４，２００号）が、ダイズ種子内のＬＣ−ＰＵＦＡおよ
びＤＨＡのレベルを増加させるために、種子発生の間に延長した期間にわたり異種遺伝子
の発現を確実に駆動するために使用され得る。最後に、強い構成的プロモーター、例えば
、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２）は、発
生の全ての段階を通じて異種遺伝子の発現を駆動し、それによってダイズ種子および他の
植物組織内のＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡのレベルを増加させるために使用され得る。
これらのプロモーターは、プラスミドｐＤＡＢ７３６２において以前に記載されたＰＵ
ＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒ
ｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ
ＨｅｔＩ発現カセットの発現を駆動するために、単独でまたは組み合わせて使用される。
プラスミド内の転写調節領域を置き換えるための方法は、当該分野で周知である。このよ
うに、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２を含むポリヌクレオチドフラグメントをｐＤＡＢ
７３６２（またはｐＤＡＢ７３６２を構築するために使用した上述のプラスミド）から除
去し、新たなプロモーター領域で置き換える。新たに構築されたプラスミドを使用して、
ダイズ植物を安定に形質転換する。トランスジェニックダイズ植物を単離し、分子的に特
徴付ける。得られたＬＣ−ＰＵＦＡ蓄積を、本明細書中に記載される方法を使用して脂質
プロファイル（ＦＡＭＥ）を分析することによって決定し、総脂肪酸の重量で０．０１％
〜１５％のＤＨＡ、総脂肪酸の重量で０．０１％〜１０％のＤＰＡ（ｎ−６）、または総
脂肪酸の重量で０．０１％〜１０％のＥＰＡを生成するダイズ植物を同定する。
種子発生において初期に発現するプロモーターの使用
実施例８．１：ｐＤＡＢ９１６６の構築
ｐＤＡＢ９１６６プラスミド（図１４；配列番号４０）は、マルチサイトＧａｔｅｗａ
ｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ９１６６は、３つのＰＵＦＡシンタ
ーゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノト
リシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンター
ゼＰＴＵは、ＬｆＫＣＳ３プロモーターｖ１、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ
ｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＬｆＫＣ
Ｓ３プロモーターｖ１、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔｕＯｒｆ２３ ３’Ｕ
ＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＬｆＫＣＳ３プロモーターｖ１
、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含
む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＬｆＫＣＳ３プロモーターｖ１
、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９１６１、ｐＤＡＢ９１６２、ｐＤＡＢ９１６３、ｐＤＡＢ１０１
４８４およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９１６６を形成した。具体的には、
上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領
域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ
ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨ
ｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列
（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節
エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭ
Ｖプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次
いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決
定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例８．２：ｐＤＡＢ９１６７の構築
ｐＤＡＢ９１６７プラスミド（図１５；配列番号４１）は、マルチサイトＧａｔｅｗａ
ｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ９１６７は、３つのＰＵＦＡシンタ
ーゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノト
リシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンター
ゼＰＴＵは、ＬｆＫＣＳ３プロモーターｖ１、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ
ｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＢｏＡＣ
Ｐプロモーターｖ１、ＢｏＡＣＰ ５’ＵＴＲ ｖ１、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３お
よびＡｔｕＯｒｆ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、
ＬｆＫＣＳ３プロモーターｖ１、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔｕＯＲ
Ｆ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、
ＢｏＡＣＰプロモーターｖ１、ＢｏＡＣＰ ５’ＵＴＲ ｖ１、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およ
びＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９１６１、ｐＤＡＢ９１６５、ｐＤＡＢ９１６３、ｐＤＡＢ１０１
４８５およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９１６７を形成した。具体的には、
上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領
域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ
ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨ
ｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列
（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節
エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭ
Ｖプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次
いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決
定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
ファゼオリンプロモーターを含むプラスミド
実施例８．３：ｐＤＡＢ７３７９の構築
ｐＤＡＢ７３７９は、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ
、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣおよびＮｏＨｅｔＩを含むよ
うに構築されたバイナリープラスミドである。ＳｚＡＣＳ−２遺伝子配列はこの構築物中
には含まれない。ｐＤＡＢ７３７９プラスミド（図１６；配列番号４２）を、マルチサイ
トＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。
ｐＤＡＢ７３７９は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル
トランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ
を含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ
３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３
３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモー
ターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔｕＯＲ
Ｆ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプ
ロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およ
びＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラー
ゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ
ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３７１、ｐＤＡＢ７３７２、ｐＤＡＢ７３７３、ｐＤＡＢ７３７
４およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７３７９を形成した。具体的には、上記
４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔ
Ｉ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ
−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレ
メントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプ
ロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで
、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を
用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例８．４：ｐＤＡＢ７３８０の構築
ｐＤＡＢ７３８０は、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ
、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣおよびＮｏＨｅｔＩを含むよ
うに構築されたバイナリープラスミドである。ＳｚＡＣＳ−２遺伝子配列はこの構築物中
には含まれない。この構築物において使用されるファゼオリンプロモーターのバージョン
を、Bustosら、1989 (The Plant Cell, Vol. 1; 839-853)に記載されるように本質的に改
変したが、このとき、プロモーターの５’部分を短縮させ、ファゼオリンの５’非翻訳領
域をインタクトなままにした。ｐＤＡＢ７３８０プラスミド（図１７；配列番号４３）を
、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。
ｐＤＡＢ７３８０は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル
トランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ
を含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ
４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３
３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモー
ターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔｕＯＲ
Ｆ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプ
ロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およ
びＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラー
ゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ５、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ
ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３７５、ｐＤＡＢ７３７６、ｐＤＡＢ７３７７、ｐＤＡＢ７３７
８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７３８０を形成した。具体的には、上記
４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔ
Ｉ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ
−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレ
メントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプ
ロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで
、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を
用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例８．５：ｐＤＡＢ９３２３の構築
ｐＤＡＢ９３２３は、ネイティブのコドン最適化されていないバージョンのＳｚＰＵＦ
Ａ ＯｒｆＡ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ、ＳｚＡＣＳ−
２およびＮｏＨｅｔＩを含むように構築されたバイナリープラスミドである。ｐＤＡＢ９
３２３プラスミド（図１８；配列番号４４）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組
換え反応を使用して構築した。
ｐＤＡＢ９３２３は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテ
ターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノ
トリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンタ
ーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦ
Ａ ＯｒｆＡ ｖ２、ＰｖＰｈａｓ ３’ ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡ
Ｒ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第２のＰＵＦＡシン
ターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵ
ＦＡ ＯｒｆＢ ｖ２、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡ
Ｒ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第３のＰＵＦＡシン
ターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵ
ＦＡ ＯｒｆＣ ｖ２、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡ
Ｒ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。アシル−ＣｏＡシン
テターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＡ
ＣＳ−２ ｖ２遺伝子、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡ
Ｒ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。ホスホパンテテイニ
ルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’Ｕ
ＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ２、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’
ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９３０７、ｐＤＡＢ９３１１、ｐＤＡＢ９３１５、ｐＤＡＢ９３２
２およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９３２３を形成した。具体的には、上記
５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
２、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ２、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ ｖ
２である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮ
Ａ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメント
に加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモー
ターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、６つ
のＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて
６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例８．６：ｐＤＡＢ９３３０の構築
ｐＤＡＢ９３３０は、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ
、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ、ＳｚＡＣＳ−２およびＮｏ
ＨｅｔＩを含むように構築されたバイナリープラスミドである。ｐＤＡＢ９３３０プラス
ミド（図１９；配列番号４５）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使
用して構築した。ｐＤＡＢ９３３０は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル
−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵお
よびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１の
ＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴ
Ｒ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈ
ａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第２
のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’Ｕ
ＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲおよびＰｖＰｈａｓ
３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第３のＰＵ
ＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、
ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈ
ａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。アシ
ル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’
ＵＴＲ、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３遺伝子、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈ
ａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。ホス
ホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰ
ｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖ
Ｐｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９３２４、ｐＤＡＢ９３２５、ｐＤＡＢ９３２６、ｐＤＡＢ９３２
９およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９３３０を形成した。具体的には、上記
５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＡＣＳ
−２ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、Ｏｖｅｒｄｒｉｖｅおよ
びＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ
Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラー
ゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ
ｖ４もまた含む。次いで、６つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化
およびＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例８．７：ｐＤＡＢ９３３７の構築
ｐＤＡＢ９３３７は、ファゼオリンプロモーターによって駆動される、コドン最適化さ
れた再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ、ｈＳｚＴｈ
ＰＵＦＡ ＯｒｆＣおよびＮｏＨｅｔＩ発現を含むように構築されたバイナリープラスミ
ドである。ｐＤＡＢ９３３７プラスミド（図２０；配列番号４６）を、マルチサイトＧａ
ｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。
ｐＤＡＢ９３３７は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル
トランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ
を含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ
３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’
ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテート
されていない）を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーター
ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’
ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテート
されていない）を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーター
ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ
３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノ
テートされていない）を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、Ｐｖ
Ｐｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ＰｖＰｈ
ａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上に
アノテートされていない）を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９３２４、ｐＤＡＢ９３２５、ｐＤＡＢ９３２６、ｐＤＡＢ９３２
８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９３３７を形成した。具体的には、上記
４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔ
Ｉ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ
−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレ
メントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプ
ロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで
、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を
用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例８．８：ｐＤＡＢ９３３８の構築
ｐＤＡＢ９３３８は、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ
、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣおよびＮｏＨｅｔＩを含むよ
うに構築されたバイナリープラスミドである。ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡの発現を駆動する
ためにファゼオリンプロモーターを使用し、他の導入遺伝子を駆動するためにＰｖＤｌｅ
ｃ２プロモーターを使用する。ｐＤＡＢ９３３８プラスミド（図２１；配列番号４７）を
、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。
ｐＤＡＢ９３３８は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル
トランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ
を含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ
３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’Ｕ
ＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートさ
れていない）を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーター
ｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミ
ネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーター
ｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰ
ターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤ
ｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ Ｓ
ＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９３２４、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ７３３
８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９３３８を形成した。具体的には、上記
４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔ
Ｉ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ
−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレ
メントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプ
ロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで
、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を
用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例８．９：ｐＤＡＢ９３４４の構築
ｐＤＡＢ９３４４は、コード配列のアミノ末端に融合されたリブロース二リン酸カルボ
キシラーゼ小鎖１Ａ（ＳＳＵ−ＴＰ ｖ１と標識される）をその全てが含む、コドン最適
化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ、ｈＳｚ
ＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣおよびＮｏＨｅｔＩを含むように構築されたバイナリープラスミ
ドである。ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡの発現を駆動するためにファゼオリンプロモーターを
使用し、他の導入遺伝子を駆動するためにＰｖＤｌｅｃ２プロモーターを使用する。
ｐＤＡＢ９３４４プラスミド（図２２；配列番号４８）を、マルチサイトＧａｔｅｗａ
ｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ９３４４は、３つのＰＵＦＡシンタ
ーゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノト
リシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンター
ゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ
ＯｒｆＡ ｖ４、ＰｖＰｈａｓ ３’ ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ
ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第２のＰＵＦＡシンタ
ーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦ
Ａ ＯｒｆＢ ｖ４、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ
ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第３のＰＵＦＡシンタ
ーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈ
ＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ４、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’
ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。ホスホパンテテ
イニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５
’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ４、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ
３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９３４３、ｐＤＡＢ９３４２、ｐＤＡＢ９３４０、ｐＤＡＢ９３３
１およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９３４４を形成した。具体的には、上記
４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
４、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ４、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ４、ＮｏＨｅｔ
Ｉ ｖ４である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ
−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレ
メントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプ
ロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで
、６つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を
用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例８．１０：ｐＤＡＢ９３９６の構築
ｐＤＡＢ９３９６は、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ
、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ、ＳｚＡＣＳ−２およびＮｏ
ＨｅｔＩを含むように構築されたバイナリープラスミドである。ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ
およびＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢの発現を駆動するためにファゼオリンプロモーターを使用
する。他の導入遺伝子；ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ、ＳｚＡＣＳ−２およびＮｏＨｅ
ｔＩを駆動するためにＰｖＤｌｅｃ２プロモーターを使用する。
ｐＤＡＢ９３９６プラスミド（図２３；配列番号４９）を、マルチサイトＧａｔｅｗａ
ｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ９３９６は、３つのＰＵＦＡシンタ
ーゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノト
リシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンター
ゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ
ＯｒｆＡ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ
ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第２のＰＵＦＡシンタ
ーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ Ｏ
ｒｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンタ
ーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦ
Ａ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。アシル−ＣｏＡ
シンテターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、Ｓ
ｚＡＣＳ−２ ｖ３遺伝子、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’
ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。ホスホパンテテ
イニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴ
Ｒ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９３２４、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ７３３
９およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９３３８を形成した。具体的には、上記
５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＡＣＳ
−２ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、Ｏｖｅｒｄｒｉｖｅおよ
びＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ
Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラー
ゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ
ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化
およびＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例８．１１：ｐＤＡＢ１０１４１２の構築
ｐＤＡＢ１０１４１２は、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ Ｏｒ
ｆＡ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ、ＳｚＡＣＳ−２および
ＮｏＨｅｔＩを含むように構築されたバイナリープラスミドである。この構築物において
使用されるファゼオリンプロモーターのバージョンを、Bustosら、1989 (The Plant Cell
, Vol. 1; 839-853)に記載されるように本質的に改変したが、このとき、プロモーターの
５’部分を短縮させ、ファゼオリンの５’非翻訳領域をインタクトなままにした。短縮型
ファゼオリンプロモーター配列は、本出願を通じてバージョン４（ｖ４）、バージョン５
（ｖ５）およびバージョン６（ｖ６）と特定される。ｐＤＡＢ１０１４１２プラスミド（
図２４；配列番号５０）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して
構築した。
ｐＤＡＢ１０１４１２は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシ
ンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフ
ィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシ
ンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰ
ＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２のＰＵ
ＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、
ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３
のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’Ｕ
ＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１
を含む。アシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰ
ｈａｓ ５’ＵＴＲ、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３遺伝子およびＡｔｕＯＲ
Ｆ２３ ５’ＵＴＲ ｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、
ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ５、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３および
ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３７５、ｐＤＡＢ７３７６、ｐＤＡＢ７３７７、ｐＤＡＢ７３９
８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０１４１２を形成した。具体的には、
上記５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領
域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ
ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＡ
ＣＳ-２ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、Ｏｖｅｒｄｒｉｖｅ
およびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅ
ｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェ
ラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴ
Ｒ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素
消化およびＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
種子発生において初期に発現するプロモーターを用いたダイズ形質転換
これらのプラスミドを使用して、上記のプロトコルを使用してダイズ植物を安定に形質
転換する。トランスジェニックダイズ植物を単離し、分子的に特徴付ける。代替的構築物
の使用は、より多い量のＤＨＡおよびＬＣ−ＰＵＦＡを含むダイズ植物を生じる。得られ
たＬＣ−ＰＵＦＡ蓄積を決定し、０．０１％〜１５％のＤＨＡまたは０．０１％〜１５％
のＬＣ−ＰＵＦＡを生成するダイズ植物を同定する。
代替的構築物設計を使用した藻類ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子スイートの発現
調節エレメントの重複を低減させるためにプロモーター多様性を導入する
遺伝子サイレンシングは、トランスジェニックダイズ事象の後代世代において観察され
ている現象である。Waterhouseら、2001 (Nature 411:834-842)、VaucheretおよびFagard
, 2001 (Trends in Genetics 17(l):29-35、ならびにOkamotoおよびHirochika, 2001 (Tr
ends in Plant Sci. 6 (11): 527-534)などのいくつかの総説論文が、転写型遺伝子サイ
レンシング（ＴＧＳ）および転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を考察している。
植物において、遺伝子サイレンシングは、トランスジェニックポリヌクレオチド配列の重
複（縦列反復導入遺伝子配列、逆方向反復導入遺伝子配列、または染色体中への複数の挿
入）によって、または標的遺伝子配列に対して相同な配列が感染性植物ウイルス、もしく
はアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のＴ−ＤＮＡ
のいずれかによって保有される場合に、誘発され得る。
さらに、導入遺伝子ポリヌクレオチド配列の重複は、構築物の不安定性の誘発因子とし
て作用し得る。高いレベルの配列類似性を共有する複数の導入遺伝子配列は、互いに折り
返すことができる。再編成は相同組換えを介して生じ得、このときＤＮＡの介在配列が切
り出される。結果として、反復された導入遺伝子ポリヌクレオチド配列間に位置するＤＮ
Ａのフラグメントが切り出される。
プラスミドベクターを設計する際の１つの戦略は、各導入遺伝子の高レベルの発現を維
持する複数の独自の種子特異的プロモーターを組み込むことによって、構築物にプロモー
ター多様性を導入することである。プラスミドベクターにプロモーター配列多様性を導入
することは、遺伝子サイレンシングを低減させ、プラスミド安定性を改善することができ
る。複数の種子特異的プロモーターには、ＰｖＤｌｅｃ２、ファゼオリンおよびＮａｐｉ
ｎが含まれる（米国特許第５，６０８，１５２号）。これらのプロモーターは、例えば組
織特異性、発現のレベル、発現の持続時間などのプロモーター活性において、比較的匹敵
する。
実施例９．１：ｐＤＡＢ７７３３の構築
ｐＤＡＢ７７３３プラスミド（図２５；配列番号５１）を、マルチサイトＧａｔｅｗａ
ｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ７７３３は、３つのＰＵＦＡシンタ
ーゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノト
リシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンター
ゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ
ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシ
ンターゼＰＴＵは、ＢｎａＮａｐｉｎＣプロモーターｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎＣ ５’Ｕ
ＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＢｎａＮａｐｉｎＣ ３’ＵＴＲ ｖ１を含
む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’
ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ
１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモータ
ーｖ５、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯｒｆ２３ ３’
ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３７５、ｐＤＡＢ７７３１、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ７３７
８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７７３３を形成した。具体的には、上記
４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔ
Ｉ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ
−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレ
メントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプ
ロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで
、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を
用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．２：ｐＤＡＢ７７３４の構築
ｐＤＡＢ７７３４バイナリープラスミド（図２６；配列番号５２）を、マルチサイトＧ
ａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ７７３４は、３つのＰＵ
ＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホ
スフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦ
ＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵ
ＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦ
ＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、Ｓ
ｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３の
ＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＢｎａＮａｐｉｎＣプロモーターｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎ
Ｃ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＢｎａＮａｐｉｎＣ ３’
ＵＴＲ ｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ
２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰタ
ーミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３３４、ｐＤＡＢ７３７６、ｐＤＡＢ７７３２、ｐＤＡＢ７３３
８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７７３４を形成した。具体的には、上記
４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔ
Ｉ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ
−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレ
メントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプ
ロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで
、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を
用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．３：ｐＤＡＢ１０１４９３の構築
ｐＤＡＢ１０１４９３バイナリープラスミド（図２７；配列番号５３）を、マルチサイ
トＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０１４９３は、３
つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵ
およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１
のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、
ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２
のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’Ｕ
ＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む
。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’Ｕ
ＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１
を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーター
ｖ５、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯｒｆ２３ ３’Ｕ
ＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３３４、ｐＤＡＢ７３７６、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ７３７
８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０１４９３を形成した。具体的には、
上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領
域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ
ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨ
ｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列
（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節
エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭ
Ｖプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次
いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決
定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．４：ｐＤＡＢ１０９５０７の構築
ｐＤＡＢ１０９５０７プラスミド（図２８；配列番号５４）を、マルチサイトＧａｔｅ
ｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０９５０７は、３つのＰＵＦ
ＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホス
フィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡ
シンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、Ｓｚ
ＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ
３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第２のＰＵ
ＦＡシンターゼＰＴＵは、ＢｎａＮａｐｉｎＣプロモーターｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎＣ
５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＢｎａＮａｐｉｎＣ ３’ＵＴＲ ｖ
１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ
５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネー
ターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＢｏＡＣＰプロモ
ーター／５’ＵＴＲ ｖ１、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯｒｆ２３ ３’ＵＴＲ
ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９３２４、ｐＤＡＢ７７３１、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ１０１
４８５およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０９５０７を形成した。具体的に
は、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダ
ー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ Ｏｒ
ｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、Ｎ
ｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー
配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の
調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：Ｃｓ
ＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む
。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配
列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．５：ｐＤＡＢ１０９５０８の構築
ｐＤＡＢ１０９５０８プラスミド（図２９；配列番号５５）を、マルチサイトＧａｔｅ
ｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０９５０８は、３つのＰＵＦ
ＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホス
フィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡ
シンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、Ｓｚ
ＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ
３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第２のＰＵ
ＦＡシンターゼＰＴＵは、ＢｎａＮａｐｉｎＣプロモーターｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎＣ
５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＢｎａＮａｐｉｎＣ ３’ＵＴＲ ｖ
１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ
５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネー
ターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プ
ロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミ
ネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９３２４、ｐＤＡＢ７７３１、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ７３３
８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０９５０８を形成した。具体的には、
上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領
域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ
ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨ
ｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列
（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節
エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭ
Ｖプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次
いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決
定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．６：ｐＤＡＢ１０９５０９の構築
ｐＤＡＢ１０９５０９プラスミド（図３０；配列番号５６）を、マルチサイトＧａｔｅ
ｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０９５０９は、３つのＰＵＦ
ＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホス
フィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡ
シンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦ
Ａ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡ
シンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦ
Ａ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡ
シンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈ
ＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパ
ンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＢｏＡＣＰプロモーター／５’ＵＴＲ ｖ１
、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯｒｆ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３３４、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ１０１
４８５およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０９５０９を形成した。具体的に
は、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダ
ー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ Ｏｒ
ｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、Ｎ
ｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー
配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の
調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：Ｃｓ
ＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む
。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配
列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
長い遺伝子配列のフラグメント化を低減するための、バイナリー構築物ＰＴＵの順序の
再編成
ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ＰＴＵを、バイナリー構築物の３’末端に配置して、ＰＴＵ
カセットの順序が単離されたトランスジェニック事象においてフラグメント化および再編
成を低減させ得るかどうかを試験した。ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡは、９つの縦列アシルキ
ャリアタンパク質反復を含む大きいオープンリーディングフレーム（約８，７００塩基対
）である。完成した構築物の第１シリーズにおいて、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ＰＴＵを
、植物染色体中に最初に組み込まれるように位置付けた。分子サイズが減少するので、Ｓ
ｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ＰＴＵには、残りのＰＵＦＡ合成関連遺伝子ＰＴＵを後に続けた
。ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡコード領域の分子分析により、いくつかのトランスジェニック
キャノーラおよびシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）事象がフラグメント化された
挿入物を含むことが示された。ＰＵＦＡシンターゼＰＴＵの順序が、以下の立体配置；ｈ
ＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ＰＴＵ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ＰＴＵ、ＮｏＨｅｔＩ
ＰＴＵ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ＰＴＵおよびＰＡＴ ＰＴＵへと変化した、代替的
構築物設計が記載される。単離されたトランスジェニック事象におけるフラグメント化お
よび再編成を低減させるために、バイナリー構築物上のＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ＰＴＵ
の位置を変化させることを完了させる。
実施例９．７：ｐＤＡＢ９１５１の構築
ｐＤＡＢ９１５１プラスミド（図３１；配列番号５７）を、マルチサイトＧａｔｅｗａ
ｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ９１５１は、３つのＰＵＦＡシンタ
ーゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノト
リシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンター
ゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ Ｏｒ
ｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンター
ゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ
ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイ
ニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ
、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。最後のＰＵＦ
ＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵ
ＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９１４８、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ９１４９、ｐＤＡＢ９１５
０およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９１５１を形成した。具体的には、上記
４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ Ｏｒｆ
Ｃ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ Ｏｒｆ
Ａ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ
−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレ
メントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプ
ロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで
、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を
用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
構築物多様性を導入するためにバイナリー構築物ＰＴＵの転写方向を変化させる
代替的構築物設計は、ＰＵＦＡシンターゼＰＴＵの順序および遺伝子発現カセットの転
写方向を変化させることを含む。完成した構築物の第１シリーズにおいて、各遺伝子発現
カセットを同じ方向で位置付けた（「ヘッドトゥーテール」、このとき、１つの遺伝子発
現カセットのプロモーターは、第２の遺伝子発現カセットの３’ＵＴＲに隣接して位置す
る）。以下の構築物は、遺伝子発現カセットが異なる方向で位置付けられる、代替的プロ
モーターを利用する戦略を記載している。これらの例において、両方の遺伝子発現カセッ
トのプロモーターが互いに隣接して操作されるように、遺伝子発現カセットは、第２の遺
伝子発現カセットに対してｔｒａｎｓに位置する。この立体配置は、「ヘッドトゥーヘッ
ド」立体配置と記載される。両方の遺伝子発現カセットの３’ＵＴＲが互いに隣接して操
作されるように、１つの遺伝子発現カセットが第２の遺伝子発現カセットに対してｔｒａ
ｎｓに位置する例において、他の立体配置が記載される。この立体配置は「テールトゥー
テール」立体配置と記載される。かかる設計の潜在的なリードスルーを軽減するために、
二方向Ｏｒｆ２３／２４ターミネーターが、これら２つのＰＴＵ間に配置されている。こ
れらの立体配置は、導入遺伝子の発現を増加させることにより、ＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤ
ＨＡ脂肪酸のより高い濃度および含量を生じるために、提唱される。
実施例９．８：ｐＤＡＢ１０８２０７の構築
ｐＤＡＢ１０８２０７プラスミド（図３２；配列番号５８）を、マルチサイトＧａｔｅ
ｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０８２０７は、３つのＰＵＦ
ＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホス
フィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡ
シンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦ
Ａ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテ
イニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ６、ＰｖＰｈａｓ ５
’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ
３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第２のＰＵ
ＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚ
ＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、Ａｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１およびＡｔｕＯＲ
Ｆ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプ
ロモーターｖ６、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ＰｖＰｈ
ａｓ ３’ＵＴＲおよびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテ
ートされていない）ならびにＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３３４、ｐＤＡＢ１０１４８９、ｐＤＡＢ１０８２０５、ｐＤＡ
Ｂ１０８２０６およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０８２０７を形成した。
具体的には、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にＳ
ｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３をテールトゥーテール方向で配置
し；ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３をヘッドトゥーヘッ
ド方向で配置し；ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢを
、テールトゥーテール方向で配置する。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３
、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ
ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−
ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメ
ントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロ
モーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、
５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用
いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．９：ｐＤＡＢ１０８２０８の構築
ｐＤＡＢ１０８２０８プラスミド（図３３；配列番号５９）を、マルチサイトＧａｔｅ
ｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０８２０８は、３つのＰＵＦ
ＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホス
フィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡ
シンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦ
Ａ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテ
イニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５
’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２
のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、
ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む
。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ５、ＰｖＰｈａｓ
５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ、ＰｖＰｈａｓ
３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）ならびにＡｔｕＯ
ＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ１０８２００、ｐＤＡＢ１０１４９０、ｐＤＡＢ１０８２０１、ｐ
ＤＡＢ１０８２０２およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０８２０８を形成し
た。具体的には、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３をヘッドトゥーヘッド方向で
配置し；ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３をテールトゥー
テール方向で配置し；ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＳｚＰＵＦＡ Ｏｒｆ
Ｂを、ヘッドトゥーヘッド方向で配置する。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ
ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ Ｏｒ
ｆＢ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（
Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エ
レメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶ
プロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次い
で、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定
を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．１０：ｐＤＡＢ１０８２０９の構築
ｐＤＡＢ１０８２０９プラスミド（図３４；配列番号６０）を、マルチサイトＧａｔｅ
ｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０８２０９は、３つのＰＵＦ
ＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホス
フィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡ
シンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦ
Ａ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテ
イニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５
’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２
のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、
ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む
。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ５、ＰｖＰｈａｓ
５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲおよびＰｖＰｈ
ａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）ならびにラン
ダムＤＮＡスペーサーを含む。
プラスミドｐＤＡＢ１０８２００、ｐＤＡＢ１０８２０４、ｐＤＡＢ１０８２０１、ｐ
ＤＡＢ１０８２０２およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０８２０９を形成し
た。具体的には、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３をヘッドトゥーヘッド方向で
配置し；ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３をテールトゥー
テール方向で配置し；ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＳｚＰＵＦＡ Ｏｒｆ
Ｂを、ヘッドトゥーヘッド方向で配置する。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ
ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ Ｏｒ
ｆＢ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（
Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エ
レメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶ
プロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次い
で、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定
を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
転写干渉を最小化するために、３’ＵＴＲを倍化し、スペーサーＤＮＡを含める。
複数の遺伝子が一続きでスタックすることによって、下流の遺伝子の発現低減が生じる
場合に、転写干渉が生じ得る。この現象は、次のプロモーター−転写単位への３’ＵＴＲ
およびターミネーターの転写リードスルーから生じる。転写干渉および転写干渉を最小化
するための２つの戦略からなる代替的構築物設計を記載する。第１の戦略は、次の遺伝子
発現カセットへのリードスルーを制限するために、個々のＤＨＡ遺伝子発現カセット間に
スタックされた２つのターミネーター／３’ＵＴＲの使用を配備する。第２の戦略は、遺
伝子発現カセット間に約１０００塩基対のスペーサーＤＮＡを挿入することによって、転
写干渉を最小化する。
実施例９．１１：ｐＤＡＢ１０８２０７の構築
ｐＤＡＢ１０８２０７プラスミド（図３２；配列番号５８）を、マルチサイトＧａｔｅ
ｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０８２０７は、３つのＰＵＦ
ＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホス
フィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡ
シンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦ
Ａ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡ
シンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、Ｓｚ
ＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ、ＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ
２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴ
Ｒ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２
、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、Ａｔ２Ｓ ＳＳＰターミネ
ーターｖ１およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。ホスホパンテテイニルト
ランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ６、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ
、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡ
Ｒ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３３４、ｐＤＡＢ１０１４８９、ｐＤＡＢ１０８２０５、ｐＤＡ
Ｂ１０８２０６およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０８２０７を形成した。
具体的には、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にＳ
ｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３をテールトゥーテール方向で配置
し、ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲを２つのＰＴＵ間に配置し；ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およ
びｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３をヘッドトゥーヘッド方向で配置し；ｈＳｚＴｈ
ＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢをヘッドトゥーテール方向で配
置し、ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲを２つのＰＴＵ間に配置する。遺伝子の順序は：Ｓ
ｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ
３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、Ｏｖｅｒｄｒｉｖｅお
よびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ
Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラ
ーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ
ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消
化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．１２：ｐＤＡＢ１０８２０８の構築
ｐＤＡＢ１０８２０８プラスミド（図３３；配列番号５９）を、マルチサイトＧａｔｅ
ｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０８２０８は、３つのＰＵＦ
ＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテ
イニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ
ＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモ
ーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰ
ターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモー
ターｖ５、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ
３’ＵＴＲ、ＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされて
いない）およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼ
ＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ
ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニ
ルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’Ｕ
ＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ１０８２００、ｐＤＡＢ１０１４９０、ｐＤＡＢ１０８２０１、ｐ
ＤＡＢ１０８２０２およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０８２０８を形成し
た。具体的には、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３をヘッドトゥーヘッド方向で
配置し；ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３をテールトゥー
テール方向で配置し、ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲを、２つのＰＴＵ間に配置し；ｈＳ
ｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢを、ヘッドトゥーヘッド
方向で配置する。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３
、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３である。ｐＤＡ
Ｂ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ
ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフ
ィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ
ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組
換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組
込みについて試験した。
実施例９．１３：ｐＤＡＢ１０８２０９の構築
ｐＤＡＢ１０８２０９プラスミド（図３４；配列番号６０）を、マルチサイトＧａｔｅ
ｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０８２０９は、３つのＰＵＦ
ＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシルＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイ
ニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰ
ＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモー
ターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰタ
ーミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモータ
ーｖ５、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３
’ＵＴＲ、ＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされてい
ない）およびランダムＤＮＡスペーサーを含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、Ｐ
ｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ
３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフ
ェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨ
ｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ１０８２００、ｐＤＡＢ１０８２０４、ｐＤＡＢ１０８２０１、ｐ
ＤＡＢ１０８２０２およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０８２０９を形成し
た。具体的には、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３をヘッドトゥーヘッド方向で
配置し；ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３をテールトゥー
テール方向で配置し、１０００塩基対のスペーサーを２つのＰＴＵ間に配置し；ｈＳｚＴ
ｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢを、ヘッドトゥーヘッド方向
で配置する。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ｈ
ＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３である。ｐＤＡＢ７
３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ａ
およびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノ
トリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ
５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換え
プラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込み
について試験した。
転写リードスルーを制限するための代替的３’ＵＴＲ−ターミネーターの使用
アグロバクテリウム（Agrobacterium）ＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ−ターミネーターは、
上記構築物の多くにおいて転写を終結させるために第一に使用される。ＺｍＬｉｐａｓｅ
３’ＵＴＲ−ターミネーターは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）において転
写リードスルーを終結させる際により有効であることが最近示された。このように、１つ
のバージョンの構築物は、この３’ＵＴＲが上流遺伝子の転写リードスルーを低減するこ
とによって転写干渉を低減できるかどうかを試験するために、ＰｖＤｌｅｃ２プロモータ
ーと組み合わせてＺｍＬｉｐａｓｅ ３’ＵＴＲ−ターミネーターを利用する。
実施例９．１４：ｐＤＡＢ９１５９の構築
ｐＤＡＢ９１５９プラスミド（図３５；配列番号６１）を、マルチサイトＧａｔｅｗａ
ｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ９１５９は、３つのＰＵＦＡシンタ
ーゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノト
リシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンター
ゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ Ｏｒ
ｆＡ ｖ３およびＺｍＬｉｐ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ
は、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ Ｏｒｆ
Ｂ ｖ３およびＺｍＬｉｐ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは
、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ
ｖ３およびＺｍＬｉｐ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラ
ーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔ
Ｉ ｖ３およびＺｍＬｉｐ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９１５２、ｐＤＡＢ９１５３、ｐＤＡＢ９１５４、ｐＤＡＢ９１５
５およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９１５９を形成した。具体的には、上記
４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔ
Ｉ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ
−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレ
メントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプ
ロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで
、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を
用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．１５：ｐＤＡＢ９１４７の構築
ｐＤＡＢ９１４７プラスミド（図３６；配列番号６２）を、マルチサイトＧａｔｅｗａ
ｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ９１４７は、３つのＰＵＦＡシンタ
ーゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノト
リシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンター
ゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ Ｏｒ
ｆＡ ｖ３、Ａｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１およびＺｍＬｉｐ３’ＵＴＲ ｖ１を
含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５
’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を
含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５
’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーター
ｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモ
ーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネー
ターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９１４６、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ７３３
８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９１４７を形成した。具体的には、上記
４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内
にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ
３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔ
Ｉ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ
−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレ
メントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプ
ロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで
、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を
用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
２つの別個のＴ−ＤＮＡ上でのＤＨＡ遺伝子の送達
代替的構築物設計は、２つの別個のバイナリーベクターを構築することからなり、第１
のベクターは１つのＴ−ＤＮＡ上にＰＵＦＡシンターゼ遺伝子のサブセットを含み、第２
のバイナリーベクターは、第２のＴ−ＤＮＡ上に残りのＰＵＦＡシンターゼ遺伝子を含む
。これらのバイナリーベクターは、性的に交雑される植物を形質転換するために個々に使
用され、それによって全てのＰＵＦＡシンターゼ遺伝子発現構築物を含む後代を生じる。
トランスジェニック植物を生成するための代替的方法は、ダイズ組織中に両方のバイナリ
ーベクターを同時形質転換し、両方のＴ鎖を含む単一の植物を選択またはスクリーニング
することである。
実施例９．１６：ｐＤＡＢ１０８２２４の構築
ｐＤＡＢ１０８２２４プラスミド（図３７；配列番号６３）を、マルチサイトＧａｔｅ
ｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０８２２４は、１つのＰＵＦ
ＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホス
フィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡ
シンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦ
Ａ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテ
イニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５
’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ１０８２１６、ｐＤＡＢ１０８２２１およびｐＤＡＢ７３３３を組
換えて、ｐＤＡＢ１０８２２４を形成した。具体的には、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３
およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３を、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボ
ーダー領域内にヘッドトゥーヘッド方向で配置する。遺伝子の順序は、ＳｚＰＵＦＡ Ｏ
ｒｆＡ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、Ｏｖｅｒｄｒｉｖｅお
よびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ
Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラ
ーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ
ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消
化およびＤＮＡ配列決定を用いて３つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．１７：ｐＤＡＢ１０８２２５の構築
ｐＤＡＢ１０８２２５プラスミド（図３８；配列番号６４）を、マルチサイトＧａｔｅ
ｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０８２２５は、２つのＰＵＦ
ＡシンターゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む
。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、
２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネータ
ーｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、Ｓ
ｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ１０８２１７、ｐＤＡＢ１０８２２２およびｐＤＡＢ７３３３を組
換えて、ｐＤＡＢ１０８２２５を形成した。具体的には、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３
およびｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３を、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３
３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーヘッド方向で配置する。遺伝子の順序は、
ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３である。ｐＤＡＢ
７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ
ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィ
ノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ
ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換
えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて３つのＰＴＵの組込
みについて試験した。
代替的設計を含む構築物によるダイズ形質転換
これらのプラスミドを使用して、上記プロトコルを使用してダイズ植物を安定に形質転
換する。トランスジェニックダイズ植物を単離し、分子的に特徴付ける。代替的構築物の
使用は、より多い量のＤＨＡおよびＬＣ−ＰＵＦＡを含むダイズ植物を生じる。得られた
ＬＣ−ＰＵＦＡ蓄積を決定し、０．０１％〜１５％のＤＨＡまたは０．０１％〜１５％の
ＬＣ−ＰＵＦＡを生成するダイズ植物を同定する。
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の形質転換ならびにＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤ
ＨＡの引き続く生成のために使用される代替的構築物設計
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物を、ｐＤＡＢ１０１４９３、ｐＤＡＢ７
３６２、ｐＤＡＢ７３６９、ｐＤＡＢ１０１４１２またはｐＤＡＢ７３８０バイナリーベ
クターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株
で形質転換した。CloughおよびBent (1998)に記載される花浸漬（floral dipping）形質
転換プロトコルを形質転換に使用した。CloughおよびBent、「Floral dip: a simplified
method for agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thalia」、Plant
J., 16:735-743, 1998。形質転換されたシロイヌナズナ属（Arabidopsis）植物を得、導
入遺伝子の存在の分子的確認を完了した。トランスジェニックシロイヌナズナ属（Arabid
opsis）事象由来のＴ１植物を、温室中で成熟するまで成長させた。これらの植物を自家
受精させ、得られたＴ２種子を成熟の時点で収集した。Ｔ２種子（１０ｍｇ）をＦＡＭＥ
ＧＣ−ＦＩＤで分析して、Ｔ２シロイヌナズナ属（Arabidopsis）種子中のＬＣ−ＰＵ
ＦＡおよびＤＨＡ含量を決定した。組織を、上述の実施例に記載されたＦＡＭＥ ＧＣ−
ＦＩＤ法で分析した。シロイヌナズナ属（Arabidopsis）植物のＴ１植物由来のＴ２種子
は、０％〜０．９５％のＤＨＡおよび０％〜１．５０％の総ＬＣ−ＰＵＦＡを含んでいた
。個々のＴ１植物由来のＴ２種子のＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡ含量は図３９に示される
。
ダイズ内での藻類ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子スイートとのＤＧＡＴ２またはＡＣＣａｓ
ｅの同時発現
ダイズ植物内の油含量を、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）または２
型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）をコードし発現するキ
メラＤＮＡ分子の形質転換によってさらに改変する。これらの遺伝子を、ＡＣＣａｓｅま
たはＤＧＡＴ２発現カセットを含むダイズ植物をＰＵＦＡシンターゼ遺伝子を含むダイズ
植物と交配すること；あるいはＡＣＣａｓｅまたはＤＧＡＴ２およびＰＵＦＡシンターゼ
遺伝子を含む遺伝子スタックでダイズ植物を形質転換することのいずれかによって、上記
藻類ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子と同時発現させる。ＡＣＣａｓｅまたはＤＧＡＴ２コード
配列の発現に必要な調節エレメントには、上記のものが含まれ得る。当該分野で公知のさ
らなる調節エレメント発現配列もまた使用され得る。ＡＣＣａｓｅおよびＤＧＡＴ２発現
カセットを、上記形質転換プロトコルを使用してダイズ中に形質転換する。形質転換は、
ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆ
Ｃ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨ
ｅｔＩ発現カセットと組み合わせたＡＣＣａｓｅまたはＤＧＡＴ２発現カセットの分子ス
タックとして；あるいは選択マーカーに連結され、次いでＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、
ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテター
ゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩ発現カセットを含むダイ
ズ植物と引き続いて交雑される独立したＡＣＣａｓｅまたはＤＧＡＴ２発現カセットとし
て、行い得る。陽性形質転換体を単離し、分子的に特徴付ける。形質転換されていない対
照ダイズ植物と比較して、植物、植物の種子または植物油濃縮物におけるＬＣ−ＰＵＦＡ
の増加した蓄積を含むダイズ植物を同定する。かかる増加は、１．２倍から２０倍までの
範囲の増加であり得る。
細胞質におけるＡＣＣａｓｅの過剰発現は、より高いレベルのマロニル−ＣｏＡを生成
し得る。増加したレベルの細胞質マロニル−ＣｏＡを含むダイズ植物または種子は、藻類
ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子が存在し発現される場合、より高いレベルの長鎖多価不飽和脂
肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）を引き続いて生成し得る。ダイズ植物内で発現されるＤＧＡＴ２
遺伝子は、トリアシルグリセロール中に顕著な量のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）および
エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を優先的に取り込むことが可能であり得る。ＬＣ−ＰＵ
ＦＡに対する基質選択性を有するＤＧＡＴ２遺伝子（例えば、ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ２
００９／０８５１６９ Ａ２を参照のこと）は、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）中へ
のこれらの脂肪酸の取り込みを増加させ得る。かかるＤＧＡＴ遺伝子は、ＴＡＧ中へのＬ
Ｃ−ＰＵＦＡ、特にＤＨＡの取り込みを指向させるため、ならびに植物および他の生物に
おけるＴＡＧの生成を増加させるために有用である。
ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子の発現のための代替的構築物設計で形質転換されたシロイヌ
ナズナ属（Arabidopsis）種子におけるＤＨＡの生成
種々の植物発現エレメントの制御下にＰＵＦＡシンターゼ遺伝子およびＨｅｔＩ（およ
びある場合にはＳｚＡＣＳ−２）をコードするプラスミドを保有するアグロバクテリウム
・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）で形質転換されたシロイヌナズナ属
（Arabidopsis）Ｔ１事象を、CloughおよびBent (Plant J., 1998 16(6):735-43)に本質
的に記載される花浸漬（floral dip）法を使用して生成した。得られたＴ１種子を収集し
、播種した。形質転換されたＴ１植物を、ホスフィノトリシンを噴霧することによって選
択して、選択マーカーとして機能的ＰＡＴ遺伝子を含む植物について選択した。生存Ｔ１
植物由来の葉組織をサンプリングし、ＰＡＴ遺伝子に特異的な定量ＰＣＲ反応によって分
析して、単一コピーの選択マーカー（および関連する導入遺伝子）を含む植物を同定した
。これらの植物を成熟するまで成長させ、Ｔ２種子を収集し、ＬＣ−ＰＵＦＡ含量につい
て（抽出可能な総ＦＡＭＥの％として）分析した。ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子をコードす
る種々の構築物を用いて生成された事象由来のデータのまとめを表１２に示す。
これらのデータは、ある特定の構築物立体配置とプロモーターとの組合せが、Ｔ２種子
においてより高い割合のＬＣ−ＰＵＦＡ含有事象を生成することを示している（ｐＤＡＢ
１０９５０７について全ての単一コピー事象の７７％がＤＨＡを生成し、ｐＤＡＢ１０８
２０７について全ての単一コピー事象の８６％がＤＨＡを生成した）。またある特定の構
築物は、＞１％のＬＣ−ＰＵＦＡ含量を生成する事象をより高い割合で生成する（ｐＤＡ
Ｂ１０９５０７について全ての単一コピー事象の３３％、およびｐＤＡＢ１０８２０７に
ついて全ての単一コピー事象の３４％）。種々の事象由来のＴ２種子の最大ＬＣ−ＰＵＦ
Ａ含量は、異なる構築物について０．２４％〜２．０３％までの範囲であった。同様に、
ある特定の構築物は、より高いレベルのω−３ ＬＣ−ＰＵＦＡを生成する。生成した全
ての構築物および事象にわたり、最大ＤＨＡ含量は０．１７％〜１．４５％までの範囲で
あり、最大ＥＰＡ含量は０％〜０．２６％までの範囲であった。これらのデータは、プロ
モーター立体配置が変化した構築物設計の変更により、ｐＤＡＢ７３６２で形質転換され
たトランスジェニック植物と比較して増加したＬＣ−ＰＵＦＡを示すトランスジェニック
植物が生じたことを示している。このように、構築物設計が変更されたこれらの構築物は
、作物の形質転換に望ましい。
高ＬＣ−ＰＵＦＡ生成事象由来のＴ２種子を定植し、成長する植物由来の葉組織を、定
量ＰＣＲを使用してサンプリングして、ＰＡＴ遺伝子および他の導入遺伝子をアッセイし
た。２コピーの導入遺伝子を含む植物（即ち、ホモ接合体）を同定し、成熟するまで成長
させた。得られたＴ３種子を収集し、ＬＣ−ＰＵＦＡ含量について分析した。反復したプ
ロモーター／３’ＵＴＲ発現エレメントを含む、ｐＤＡＢ７３６２およびｐＤＡＢ１０９
５０９などのいくつかの構築物は、引き続くＴ３種子世代において安定性の乏しいＬＣ−
ＰＵＦＡ形質を示した。しかし、異なる構築物立体配置および／または多様化された発現
エレメント（例えば、ｐＤＡＢ１０８２０７、１０９５０８および７７３４）で形質転換
されたいくつかの事象は、表１３に示すように、Ｔ３種子世代において顕著に改善された
安定性のＬＣ−ＰＵＦＡ形質を生じた。これらのデータは、ある特定の構築物が引き続く
世代においてＤＨＡ形質の安定性を維持し得ること、およびかかる構築物が作物の形質転
換に好ましいことを示している。
本発明の上述の記載は、例示および説明を目的として提示されている。さらに、この記
載は、本発明を本明細書中に開示される形態に限定する意図ではない。
本明細書中に記載される種々の態様、実施形態および選択肢の全ては、任意のおよび全
てのバリエーションで組み合わされ得る。
本明細書中で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許
または特許出願が具体的かつ個々に参照により組み込まれると示されるのと同程度まで、
参照により本明細書中に組み込まれる。

Claims (73)

  1. （ｉ）少なくとも１種の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を生成するＰＵＦＡシンターゼ
    をコードする核酸配列を含む核酸分子；および
    （ｉｉ）ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）をコードする配列
    を含む核酸分子
    を含む、遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  2. ＰＵＦＡシンターゼが、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一なア
    ミノ酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、
    種子またはそれらの一部。
  3. ＰＵＦＡシンターゼが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の遺伝子改
    変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  4. ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列が、配列番号６の核酸配列に対して少なくと
    も８０％同一な核酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、
    細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  5. ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列が、配列番号６の核酸配列を含む、請求項４
    に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  6. ＰＵＦＡシンターゼが、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一なア
    ミノ酸配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物
    、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  7. ＰＵＦＡシンターゼが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の遺伝子改
    変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  8. ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列が、配列番号７の核酸配列に対して少なくと
    も８０％同一な核酸配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の遺伝子改変され
    たダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  9. ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列が、配列番号７の核酸配列を含む、請求項８
    に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  10. ＰＵＦＡシンターゼが、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一なア
    ミノ酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物
    、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  11. ＰＵＦＡシンターゼが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の遺伝子
    改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  12. ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列が、配列番号８の核酸配列に対して少なくと
    も８０％同一な核酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の遺伝子改変され
    たダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  13. ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列が、配列番号８の核酸配列を含む、請求項１
    ２に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  14. ＰＵＦＡシンターゼが、配列番号１〜３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝
    子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  15. ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列が、配列番号６〜８の核酸配列を含む、請求
    項１に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部
    。
  16. ＰＰＴａｓｅが、配列番号５に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含む、請
    求項１から１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織
    、種子またはそれらの一部。
  17. ＰＰＴａｓｅが、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の遺伝子改変さ
    れたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  18. ＰＰＴａｓｅをコードする核酸配列が、配列番号１０の核酸配列に対して少なくとも８
    ０％同一である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物
    、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  19. ＰＰＴａｓｅをコードする核酸配列が、配列番号１０の核酸配列を含む、請求項１８に
    記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  20. （ｉ）および（ｉｉ）の核酸配列が、単一の組換え発現ベクター中に含まれる、請求項
    １から１９のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種
    子またはそれらの一部。
  21. （ｉ）または（ｉｉ）の核酸配列が、種子特異的プロモーターまたは葉特異的プロモー
    ターに作動可能に連結されている、請求項１から２０のいずれか一項に記載の遺伝子改変
    されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  22. （ｉ）または（ｉｉ）の核酸配列が、ＰｖＤｌｅｃ２、ＬｆＫＣＳ３、ＦＡＥ１、Ｂｏ
    ＡＣＰ、ＢｎａＮａｐｉｎＣ、ユビキチンまたはＣｓＶＭＶプロモーターに作動可能に連
    結されている、請求項１から２０のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、
    子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  23. （ｉｉｉ）アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＡＳ）をコードする核酸配列を含む核
    酸分子
    をさらに含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、
    子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  24. ＡＣｏＡＳが、配列番号４に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含む、請求
    項２３に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一
    部。
  25. ＡＣｏＡＳが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の遺伝子改変され
    たダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  26. ＡＣｏＡＳをコードする核酸配列が、配列番号９の核酸配列に対して少なくとも８０％
    同一な核酸配列を含む、請求項２３に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、
    組織、種子またはそれらの一部。
  27. ＡＣｏＡＳをコードする核酸配列が、配列番号９の核酸配列を含む、請求項２６に記載
    の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  28. （ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の核酸配列が、単一の組換え発現ベクター中に含ま
    れる、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、
    細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  29. （ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の核酸配列が、種子特異的プロモーターまたは葉特
    異的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項２３から２７のいずれか一項に記
    載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  30. （ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の核酸配列が、ＰｖＤｌｅｃ２、ＬｆＫＣＳ３、Ｆ
    ＡＥ１、ＢｏＡＣＰ、ＢｎａＮａｐｉｎＣ、ユビキチンまたはＣｓＶＭＶプロモーターに
    作動可能に連結されている、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変され
    たダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  31. アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）をコードする核酸配列または２型ジ
    アシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）をコードする核酸配列をさ
    らに含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫
    、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  32. ｐＤＡＢ７３６１、ｐＤＡＢ７３６２、ｐＤＡＢ７３６３、ｐＤＡＢ７３６８、ｐＤＡ
    Ｂ７３６９、ｐＤＡＢ７３７０、ｐＤＡＢ１００５１８、ｐＤＡＢ１０１４７６、ｐＤＡ
    Ｂ１０１４７７、ｐＤＡＢ９１６６、ｐＤＡＢ９１６７、ｐＤＡＢ７３７９、ｐＤＡＢ７
    ３８０、ｐＤＡＢ９３２３、ｐＤＡＢ９３３０、ｐＤＡＢ９３３７、ｐＤＡＢ９３３８、
    ｐＤＡＢ９３４４、ｐＤＡＢ９３９６、ｐＤＡＢ１０１４１２、ｐＤＡＢ７７３３、ｐＤ
    ＡＢ７７３４、ｐＤＡＢ１０１４９３、ｐＤＡＢ１０９５０７、ｐＤＡＢ１０９５０８、
    ｐＤＡＢ１０９５０９、ｐＤＡＢ９１５１、ｐＤＡＢ１０８２０７、ｐＤＡＢ１０８２０
    ８、ｐＤＡＢ１０８２０９、ｐＤＡＢ９１５９、ｐＤＡＢ９１４７、ｐＤＡＢ１０８２２
    ４、およびｐＤＡＢ１０８２２５のうち少なくとも１つを含む、遺伝子改変されたダイズ
    植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  33. 検出可能な量のＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６，ｎ−３））、ＤＰＡ（ｎ−
    ６）（ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５，ｎ−６））またはＥＰＡ（エイコサペンタエン
    酸（Ｃ２０：５，ｎ−３））を含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の遺伝子改
    変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  34. 総脂肪酸の重量で０．０１％〜１５％のＤＨＡを含む、請求項３３に記載の遺伝子改変
    されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  35. 総脂肪酸の重量で０．０５％〜１０％のＤＨＡを含む、請求項３４に記載の遺伝子改変
    されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  36. 総脂肪酸の重量で０．０５％〜５％のＤＨＡを含む、請求項３５に記載の遺伝子改変さ
    れたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  37. 総脂肪酸の重量で０．０１％〜１０％のＥＰＡを含む、請求項１から３６のいずれか一
    項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  38. 総脂肪酸の重量で０．０５％〜５％のＥＰＡを含む、請求項３７に記載の遺伝子改変さ
    れたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  39. 総脂肪酸の重量で０．０５％〜１％のＥＰＡを含む、請求項３８に記載の遺伝子改変さ
    れたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  40. 総脂肪酸の重量で０．０１％〜１０％のＤＰＡ（ｎ-６）を含む、請求項１から３９の
    いずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれ
    らの一部。
  41. 総脂肪酸の重量で０．０１％〜５％のＤＰＡ（ｎ-６）を含む、請求項４０に記載の遺
    伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  42. 総脂肪酸の重量で０．０１％〜１％のＤＰＡ（ｎ-６）を含む、請求項１から３４およ
    び３９から４７のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織
    、種子またはそれらの一部。
  43. 総脂肪酸の重量で１：１〜１：３０の比率のＥＰＡ：ＤＨＡを含む、請求項１から３３
    のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそ
    れらの一部。
  44. 総脂肪酸の重量で１：１〜１：３の比率のＥＰＡ：ＤＨＡを含む、請求項４３に記載の
    遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  45. 総脂肪酸の重量で１：１〜１：１０の比率のＤＰＡ（ｎ−６）：ＤＨＡを含む、請求項
    １から３３のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種
    子またはそれらの一部。
  46. 総脂肪酸の重量で１：１〜１：３の比率のＤＰＡ（ｎ−６）：ＤＨＡを含む、請求項４
    ５に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  47. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、
    組織、種子またはそれらの一部から得られた油。
  48. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、
    組織またはそれらの一部から得られた種子。
  49. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、
    組織、種子もしくはそれらの一部から得られた油、または請求項１から４６のいずれか一
    項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織もしくはそれらの一部から得
    られた種子を含む食物製品。
  50. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、
    組織、種子もしくはそれらの一部から得られた油、または請求項１から４６のいずれか一
    項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織もしくはそれらの一部から得
    られた種子を含む機能性食物。
  51. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、
    組織、種子もしくはそれらの一部から得られた油、または請求項１から４６のいずれか一
    項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織もしくはそれらの一部から得
    られた種子を含む医薬製品。
  52. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、
    組織、種子もしくはそれらの一部から、または請求項１から４６のいずれか一項に記載の
    遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織もしくはそれらの一部の種子から油を回
    収する工程を含む、少なくとも１種のＰＵＦＡを含む油を生成する方法。
  53. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、
    組織、種子またはそれらの一部を成長させる工程を含む、少なくとも１種のＰＵＦＡを含
    む油を生成する方法。
  54. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、
    組織またはそれらの一部の種子から油を回収する工程を含む、種子油中の少なくとも１種
    のＰＵＦＡを生成する方法。
  55. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、
    組織、種子またはそれらの一部を成長させる工程を含む、種子油中の少なくとも１種のＰ
    ＵＦＡを生成する方法。
  56. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、
    組織、種子もしくはそれらの一部、請求項４７に記載の油、請求項４８に記載の種子、請
    求項４９に記載の食物製品、請求項５０に記載の機能性食物、または請求項５１に記載の
    医薬製品を個体に提供する工程を含む、少なくとも１種のＰＵＦＡを含むサプリメントま
    たは治療用製品を個体に提供する方法。
  57. ＰＵＦＡがＤＨＡである、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. ＰＵＦＡがＥＰＡである、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の方法。
  59. ＰＵＦＡがＤＰＡ（ｎ-６）である、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の方法
    。
  60. ダイズ植物または植物細胞を、（ｉ）藻類ＰＵＦＡシンターゼをコードする配列を含む
    核酸分子；および（ｉｉ）ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）を
    コードする配列を含む核酸分子で形質転換する工程を含む、請求項１から４６のいずれか
    一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部を生成
    する方法。
  61. ダイズ植物または植物細胞を、（ｉｉｉ）アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＡＳ）
    をコードする配列を含む核酸分子で形質転換する工程をさらに含む、請求項６０に記載の
    方法。
  62. 総脂肪酸の重量で０．０５％〜１５％のＤＨＡを含むダイズ油。
  63. 総脂肪酸の重量で０．０５％〜５％のＥＰＡをさらに含む、請求項６２に記載のダイズ
    油。
  64. 総脂肪酸の重量で０．０１％〜５％のＤＰＡ（ｎ-６）をさらに含む、請求項６２また
    は６３に記載のダイズ油。
  65. 総脂肪酸の重量で１：１〜１：３０の比率のＥＰＡ：ＤＨＡを含むダイズ油。
  66. 総脂肪酸の重量で１：１〜１：３の比率のＥＰＡ：ＤＨＡを含む、請求項６５に記載の
    ダイズ油。
  67. 総脂肪酸の重量で１：１〜１：１０の比率のＤＰＡ（ｎ−６）：ＤＨＡを含むダイズ油
    。
  68. 総脂肪酸の重量で１：１〜１：３の比率のＤＰＡ（ｎ−６）：ＤＨＡを含む、請求項６
    ７に記載のダイズ油。
  69. 請求項４７および５８から６８のいずれか一項に記載の油を含む組成物。
  70. ダイズ植物または植物細胞を、（ｉ）ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列を含む
    核酸分子；（ｉｉ）アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＡＳ）をコードする核酸配列を
    含む核酸分子；および（ｉｉｉ）ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓ
    ｅ）をコードする配列を含む核酸分子を含む発現カセットで形質転換する工程を含む、請
    求項１から４２のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織
    、種子またはそれらの一部を生成する方法。
  71. 請求項４７および５８から６８のいずれか一項に記載の油、ならびに別の油を含む油ブ
    レンド。
  72. 別の油が、植物油、魚油、微生物油またはそれらの混合物である、請求項７１に記載の
    油ブレンド。
  73. 請求項４７および５８から６８のいずれか一項に記載の油を含む餌または食事組成物。
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