JP2017194427A - 分離材及びカラム - Google Patents

Abstract

【課題】タンパク質の非特異吸着を低減し、カラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れ、さらには疎水性低分子化合物の吸着を抑制できる分離材、及び、該分離材を備えるカラムを提供すること。
【解決手段】多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する多糖類及び水酸基を有する水溶性界面活性剤を含む被覆層と、を備える、分離材。
【選択図】なし

Description

本発明は、分離材及びカラムに関する。

従来、タンパク質に代表される生体高分子を分離精製する場合、一般的には多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体、親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体等が用いられている。多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体の場合、塩濃度による体積変化が小さいため、カラムに充填してクロマトグラフィーで用いると、通液時の耐圧性に優れる傾向にある。しかし、このイオン交換体を、タンパク質等の分離に用いると、疎水的相互作用に基づく不可逆吸着等の非特異吸着が起きるため、ピークの非対称化が発生する、又は、疎水的相互作用でイオン交換体に吸着されたタンパク質が吸着されたまま回収できないという問題点がある。

一方、デキストラン、アガロース等の多糖に代表される親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体の場合、タンパク質の非特異吸着がほとんどないという利点がある。ところが、このイオン交換体は、水溶液中で著しく膨潤し、溶液のイオン強度による体積変化、及び、遊離酸形と負荷形との体積変化が大きく、機械的強度も十分ではないという欠点を有する。特に、架橋ゲルをクロマトグラフィーで使用する場合、通液時の圧力損失が大きく、通液によりゲルが圧密化するといった欠点がある。

親水性天然高分子の架橋ゲルの欠点を克服するため、例えば、多孔性高分子の細孔内に天然高分子ゲル等のゲルを保持した複合体が、ペプチド合成の分野で知られている（例えば、特許文献１参照）。このような複合体を用いることにより、反応性物質の負荷係数を高め、高収率の合成が可能となる。また、硬質な合成高分子物質でゲルを包囲するため、カラムベッドの形態で使用しても、容積変化がなく、カラムを通過するフロースルーの圧力が変化しないという利点を有する。

セライト等の無機多孔質体にデキストラン、セルロースといった多糖等のキセロゲルを保持させた分離材が知られている（例えば、特許文献２及び３参照）。このゲルには収着性能を付加するために、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基等が付与されており、ヘモグロビンの除去に用いられる。このような分離材は、カラムでの通液性が良好である。

マクロネットワーク構造のコポリマの細孔を、モノマから合成した架橋共重合体のゲルで埋めたハイブリッドコポリマのイオン交換体が知られている（例えば、特許文献４参照）。架橋共重合体ゲルは、架橋度が低い場合、圧力損失、体積変化等の問題があるが、ハイブリッドコポリマにすることで通液特性が改善され、圧力損失が少なく、イオン交換容量が向上し、リーク挙動が改善される。

また、有機合成ポリマ基体の細孔内に巨大網目構造を有する親水性天然高分子の架橋ゲルを充填した複合化充填材が提案されている（例えば、特許文献５及び６参照）。さらに、メタクリル酸グリシジルとアクリル架橋モノマとの共重合により形成される多孔質粒子の合成が知られている（例えば、特許文献７参照）。

米国特許第４９６５２８９号明細書 米国特許第４３３５０１７号明細書 米国特許第４３３６１６１号明細書 米国特許第３９６６４８９号明細書 特開平１−２５４２４７号公報 米国特許第５１１４５７７号明細書 特開２００９−２４４０６７号公報

しかしながら、従来の分離材は、タンパク質の非特異吸着を低減し、かつ、カラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れるといった特性を充分なレベルで兼ね備えるものではない。また、タンパク質を培養した液には脂肪酸等の疎水性低分子化合物が含まれることがあり、疎水性低分子化合物がカラムに吸着してしまうことで、タンパク質の吸着を阻害してしまうことがある。

そこで、本発明は、タンパク質の非特異吸着を低減し、カラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れ、さらには疎水性低分子化合物の吸着を抑制できる分離材、及び、該分離材を備えるカラムを提供することを目的とする。

本発明は、下記［１］〜［９］に記載の分離材及び下記［１０］に記載のカラムを提供する。
［１］多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する多糖類及び水酸基を有する水溶性界面活性剤を含む被覆層と、を備える、分離材。
［２］界面活性剤の分子量が２００００以下である、［１］に記載の分離材。
［３］比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上である、［１］又は［２］に記載の分離材。
［４］細孔径分布におけるモード径が０．０５〜０．６μｍである、［１］〜［３］のいずれかに記載の分離材。
［５］平均粒径が１０〜３００μｍである、［１］〜［４］のいずれかに記載の分離材。
［６］多糖類がアガロース又はデキストランである、［１］〜［５］のいずれかに記載の分離材。
［７］多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり、３０〜４５０ｍｇの被覆層を備える、［１］〜［６］のいずれかに記載の分離材。
［８］カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液流速が８００ｃｍ／ｈ以上である、［１］〜［７］のいずれかに記載の分離材。
［９］陽イオン交換基又は陰イオン交換基を有する、［１］〜［８］のいずれかに記載の分離材。
［１０］［１］〜［９］のいずれかに記載の分離材を備えるカラム。

本発明によれば、タンパク質の非特異吸着を低減し、カラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れ、さらには疎水性低分子化合物の吸着を抑制できる分離材を提供することが可能となる。

以下、本発明の好適な実施形態について説明をするが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではない。

＜分離材＞
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する多糖類及び水酸基を有する水溶性界面活性剤を含む被覆層と、を備えるものである。なお、本明細書中、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。また、本明細書中、（メタ）アクリル酸とはアクリル酸又はメタクリル酸を意味し、（メタ）アクリレート等の他の類似の表現においても同様である。

［多孔質ポリマ粒子］
本実施形態に係る多孔質ポリマ粒子は、多孔質化剤の存在下で、溶解性粒子を含んでいてもよいモノマを硬化させた粒子であり、例えば、従来の懸濁重合、乳化重合等によって合成することができる。モノマとしては、特に限定されないが、スチレン系モノマ、（メタ）アクリル系モノ等を使用することができる。具体的なモノマとしては、以下の多官能性モノマ、単官能性モノマ等が挙げられる。

多官能性モノマとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン等のジビニル化合物；（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）テトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の（ポリ）アルキレングリコール系ジ（メタ）アクリレート；トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタントリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルプロパントリアクリレート等の３官能以上の（メタ）アクリレート；エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、プロポキシ化エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、トリシクロデカンジメタノールジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタンジ（メタ）アクリレート、エトキシ化シクロヘキサンジメタノールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリレート；ジアリルフタレート及びその異性体；トリアリルイソシアヌレート及びその誘導体が挙げられる。これらモノマの中でも、新中村化学工業株式会社製のＮＫエステル（Ａ−ＴＭＰＴ−６Ｐ０、Ａ−ＴＭＰＴ−３Ｅ０、Ａ−ＴＭＭ−３ＬＭＮ、Ａ−ＧＬＹシリーズ、Ａ−９３００、ＡＤ−ＴＭＰ、ＡＤ−ＴＭＰ−４ＣＬ、ＡＴＭ−４Ｅ、Ａ−ＤＰＨ）等が、商業的に入手可能である。これらの多官能性モノマは、１種を単独で又は２種類以上を組み合わせて用いることができる。上記の中でも、耐久性及び膨潤性の観点から、モノマがジビニルベンゼンを含有することが好ましい。すなわち、多孔質ポリマ粒子は、ジビニルベンゼンに由来する構造単位を有するポリマを含むことが好ましい。

上記多孔質ポリマ粒子は、モノマ単位としてジビニルベンゼンを含む場合、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で５０質量％以上含むことが好ましく、６０質量％以上含むことがより好ましく、７０質量％以上含むことが更に好ましい。ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で５０質量％以上含むことにより、分離材の膨潤度低くし、カラム圧を抑えることができる。

単官能性モノマとしては、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレン及びその誘導体；アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ｎ−オクチル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸２−クロロエチル、アクリル酸フェニル、α−クロロアクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸ｎ−オクチル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸ステアリル等の（メタ）アクリル酸エステル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、安息香酸ビニル、酪酸ビニル等のビニルエステル；Ｎ−ビニルピロール、Ｎ−ビニルカルバゾール、Ｎ−ビニルインドール、Ｎ−ビニルピロリドン等のＮ−ビニル化合物；フッ化ビニル、フッ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレン、アクリル酸トリフルオロエチル、アクリル酸テトラフルオロプロピル等の含フッ素化モノマ；ブタジエン、イソプレン等の共役ジエンが挙げられる。これらの単官能性モノマは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。上記の中でも耐酸及び耐アルカリ性に優れるという観点から、スチレンを使用することが好ましい。また、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体も使用することができる。

多孔質化剤としては、重合時に相分離を促し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒である脂肪族又は芳香族の炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類等が挙げられる。具体的には、トルエン、ジエチルベンゼン、キシレン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、イソアミルアルコール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられる。これらの多孔質化剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。多孔質化剤として水を取り込み易い性質を有するものを用いると、粒子の内部に大きな細孔を形成し易くなる傾向にある。

上記多孔質化剤は、モノマ全質量に対して０〜２００質量％使用できる。多孔質化剤の量によって、多孔質ポリマ粒子の空隙率をコントロールできる。さらに、多孔質化剤の種類によって、多孔質ポリマ粒子の細孔の大きさ及び形状をコントロールすることができる。

溶媒として使用する水を多孔質化剤とすることもできる。水を多孔質化剤とする場合は、モノマに油溶性界面活性剤を溶解させ、水を吸収することによって、粒子を多孔質化させることが可能である。

多孔質化に使用される油溶性界面活性剤としては、分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のソルビタンモノエステル、例えば、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノミリステート又はヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル、例えば、ジグリセロールモノオレエート（例えば、Ｃ１８：１（炭素数１８個、二重結合数１個）脂肪酸のジグリセロールモノエステル）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレート又はヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコール又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル；及びこれらの混合物が挙げられる。

これらのうち、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）２０、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノラウレート）、ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）８０、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノオレエート）、ジグリセロールモノオレエート（例えば、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノオレエート）、ジグリセロールモノイソステアレート（例えば、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノイソステアレート）、ジグリセロールモノミリステート（例えば、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノミリステート）、ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリル基、ミリストイル基等）エーテル、又はこれらの混合物が好ましい。

これらの油溶性界面活性剤は、モノマ全質量に対して５〜８０質量％の範囲で用いることが好ましい。油溶性界面活性剤の含有量が５質量％以上であると、水滴の安定性が充分になることから、大きな単一孔を形成し易くなる。また、油溶性界面活性剤の含有量が８０質量％以下であると、重合後に多孔質ポリマ粒子が形状をより保持し易くなる。

溶解性粒子とは、例えば、酸、アルカリ、溶剤等によって溶解させることが可能な粒子である。具体的には、炭酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、シリカ、ポリマ、金属コロイド等が使用することができる。除去のし易さの観点より、炭酸カルシウム又は第三リン酸カルシウムを用いることが好ましい。溶解性粒子の粒径は０．６〜５μｍであることが好ましい。粒子内の通液性を向上させる観点より１〜５μｍであることが好ましい。

重合反応に用いられる水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。

アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩、アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）、アルキルリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩などが挙げられる。

カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の第四級アンモニウム塩が挙げられる。

ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤、シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤、パーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤が挙げられる。

両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤及び亜リン酸エステル系界面活性剤が挙げられる。

界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記界面活性剤の中でも、モノマ重合時の分散安定性の観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。

必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物が挙げられる。重合開始剤は、モノマ１００質量部に対して、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。

重合温度は、モノマ及び重合開始剤の種類に応じて、適宜選択することができる。重合温度は、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。

多孔質ポリマ粒子の合成において、粒子の分散安定性を向上させるために、高分子分散安定剤を添加してもよい。

高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、ポリビニルピロリドンが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤の添加量は、モノマ１００質量部に対して１〜１０質量部が好ましい。

モノマが単独で重合することを抑えるために、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。

多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、好ましくは３００μｍ以下、より好ましくは１５０μｍ以下、更に好ましくは１００μｍ以下である。また、多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、通液性の向上の観点から、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上、更に好ましくは５０μｍ以上である。

多孔質ポリマ粒子の粒径の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、通液性の向上の観点から、３〜１５％であることが好ましく、５〜１５％であることがより好ましく、５〜１０％であることが更に好ましい。Ｃ．Ｖ．を低減する方法としては、マイクロプロセスサーバー（株式会社日立製作所）等の乳化装置により単分散化することが挙げられる。

多孔質ポリマ粒子又は分離材の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．は、以下の測定法により求めることができる。
１）粒子を、超音波分散装置を使用して水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の多孔質ポリマ粒子を含む分散液を調製する。
２）粒度分布計（シスメックスフロー、シスメックス株式会社製）を用いて、上記分散液中の粒子約１万個の画像により平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．を測定する。

多孔質ポリマ粒子の細孔容積（空隙率）は、多孔質ポリマ粒子の全体積基準で３０体積％以上７０体積％以下であることが好ましく、５０体積％以上７０体積％以下であることがより好ましい。多孔質ポリマ粒子は、細孔径が０．０１μｍ以上０．６μｍ未満である細孔、すなわちマクロポアー（マクロ孔）を有することが好ましい。多孔質ポリマ粒子の細孔径として、より好ましくは０．１μｍ以上０．６μｍ未満である。細孔径が０．０１μｍ以上であると、細孔内に物質が入り易くなる傾向にあり、細孔径が０．６μｍ未満であると、比表面積が充分なものになる。これらは上述の多孔質化剤により調整可能である。

多孔質ポリマ粒子の比表面積は、３０ｍ^２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ^２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ^２／ｇ以上であることが更に好ましい。比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。

［被覆層］
本実施形態に係る被覆層は、水酸基を有する多糖類及び水酸基を有する水溶性界面活性剤を含む。水酸基を有する多糖類及び水酸基を有する水溶性界面活性剤で多孔質ポリマ粒子を被覆することによりカラム圧の向上を抑制することができるとともに、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となる上、分離材のタンパク質吸着量を向上させることが可能となる。さらに、水酸基を有する多糖類が架橋されていると、カラム圧の上昇をより抑制することが可能となる。

（水酸基を有する多糖類）
水酸基を有する多糖類としては、アガロース、デキストラン、セルロース、キトサン等が挙げられる。タンパク質の吸着能の観点から、水酸基を有する多糖類は、アガロース又はデキストランであることが好ましい。水酸基を有する多糖類としては、重量平均分子量１万〜２０万程度のものが使用できる。これらの水酸基を有する多糖類は、単独で使用しても２種以上を併用してもよい。

水酸基を有する多糖類は、界面吸着能を向上させる観点から、疎水基により変性された変性体であってもよい。疎水基としては、例えば、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基等が挙げられる。炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられる。炭素数６〜１０のアリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。疎水基は、水酸基と反応する官能基（例えば、エポキシ基）及び疎水基を有する化合物（例えば、グリシジルフェニルエーテル）を、水酸基を有する多糖類と従来公知の方法で反応させることにより、導入することができる。

（水酸基を有する多糖類を含む被覆層の形成方法）
本実施形態に係る被覆層は、例えば、以下に示す方法により形成することができる。

まず、水酸基を有する多糖類の溶液を多孔質ポリマ粒子表面に吸着させる。当該溶液の溶媒としては、水酸基を有する多糖類を溶解することのできるものであれば、特に限定されないが、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、５〜２０（ｍｇ／ｍＬ）が好ましい。

この溶液を、多孔質ポリマ粒子に含浸させる。含浸方法は、水酸基を有する多糖類の溶液に多孔質ポリマ粒子を加えて一定時間放置する。含浸時間は多孔質体の表面状態によっても変わるが、通常一昼夜含浸すれば高分子濃度が多孔質体の内部で外部濃度と平衡状態となる。その後、水、アルコール等の溶媒で洗浄し、未吸着分の水酸基を有する多糖類を除去する。

（架橋処理）
次いで、架橋剤を加えて多孔質ポリマ粒子表面に吸着された水酸基を有する多糖類を架橋反応させて、架橋体を形成する。このとき、架橋体は、水酸基を有する３次元架橋網目構造を有する。

架橋剤としては、例えばエピクロルヒドリン等のエピハロヒドリン、グルタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物、メチレンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジル化合物などのような水酸基に活性な官能基を２個以上有する化合物が挙げられる。また、水酸基を有する多糖類としてキトサンのようなアミノ基を有する化合物を使用する場合には、ジクロロオクタンのようなジハライドも架橋剤として使用できる。

この架橋反応には通常触媒が用いられる。該触媒は架橋剤の種類に合わせて適宜従来公知のものを用いることができるが、例えば、架橋剤がエピクロルヒドリン等の場合には水酸化ナトリウム等のアルカリが有効であり、ジアルデヒド化合物の場合には塩酸等の鉱酸が有効である。

架橋剤による架橋反応は、通常、分離材を適当な媒体中に分散、懸濁させた系に架橋剤を添加することによって行われる。架橋剤の添加量は、水酸基を有する多糖類において、単糖類の１単位を１モルとすると、それに対して０．１〜１００モル倍の範囲内で、分離材の性能に応じて選定することができる。一般に、架橋剤の添加量を少なくすると、被覆層が多孔質ポリマ粒子から剥離し易くなる傾向にある。また、架橋剤の添加量が過剰で、かつ、水酸基を有する多糖類との反応率が高い場合、原料の水酸基を有する多糖類の特性が損なわれる傾向にある。

また、触媒の使用量としては、架橋剤の種類により異なるが、通常、水酸基を有する多糖類において、多糖類を形成する単糖類の１単位を１モルとすると、これに対して０．０１〜１０モル倍の範囲、更に好ましくは０．１〜５モル倍で使用される。

例えば、該架橋反応条件を温度条件とした場合、反応系の温度を上げ、その温度が反応温度に達すれば架橋反応が生起する。

水酸基を有する多糖類の溶液等を含浸させた多孔質ポリマ粒子を分散、懸濁させる媒体としては含浸させた高分子溶液から高分子、架橋剤等を抽出してしまうことなく、かつ、架橋反応に不活性なものである必要がある。その具体例としては水、アルコール等が挙げられる。

架橋反応は、通常、５〜９０℃の温度で、１〜１０時間かけて行うことができる。架橋反応の温度は、好ましくは３０〜９０℃である。

架橋反応終了後、生成した粒子を濾別し、次いで水、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒で洗浄し、未反応の高分子、懸濁用媒体等を除去すれば、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部が、水酸基を有する多糖類を含む被覆層により被覆された分離材が得られる。

本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜４５０ｍｇの被覆層を備えることが好ましく、５０〜４００ｍｇの被覆層を備えることがより好ましく、１００〜４００ｍｇの被覆層を備えることが更に好ましい。被覆層の割合が多孔質ポリマ粒子１ｇに対して４５０ｍｇ以下であると、被覆層を薄膜とすることができ、カラムとして用いたときの通液性がより向上する傾向にある。また、被覆層の割合が多孔質ポリマ粒子１ｇに対して３０ｍｇ以上であると、タンパク質吸着量がより高まる傾向にある。被覆層の量は熱分解の重量減少等で測定することができる。

被覆層における水酸基を有する多糖類の含有量は、被覆層全質量を基準として、８０〜９９質量％であることが好ましい。

（イオン交換基の導入）
被覆層を備える分離材は、イオン交換基、リガンド（プロテインＡ）等を有していてもよい。分離材はこれらを表面上の水酸基等を介して導入することによりイオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。

ハロゲン化アルキル化合物としては、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸及びそのナトリウム塩、ジエチルアミノエチルクロライド等のハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する１級、２級又は３級アミン、ハロゲン化アルキル基を有する４級アンモニウムの塩酸塩などが挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物は、臭化物又は塩化物であることが好ましい。ハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、イオン交換基を付与する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。

イオン交換基の導入には、反応を促進させるために、有機溶媒を用いることが有効である。有機溶媒としては、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、イソペンタノール等のアルコール類が挙げられる。

通常、イオン交換基の導入は、分離材表面の水酸基に行われるので、湿潤状態の粒子を、ろ過等により水切りした後、所定濃度のアルカリ性水溶液に浸漬し、一定時間放置した後、水−有機溶媒混合系で、上記ハロゲン化アルキル化合物を添加して反応させる。この反応は温度４０〜９０℃で、０．５〜１２時間行うことが好ましい。上記の反応で使用されるハロゲン化アルキル化合物の種類により、付与されるイオン交換基が決定される。

本実施形態の分離材は、イオン交換基として、陽イオン交換基又は陰イオン交換基を有していてもよい。陽イオン交換基としては、例えば、カルボキシ基、スルホン酸基が挙げられる。陰イオン交換基としては、例えば、アミノ基、４級アンモニウム基が挙げられる。

イオン交換基として、弱塩基性基であるアミノ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物のうち、水素原子の一部が塩素原子に置換されたアルキル基を少なくとも１つ有する、モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミン、モノ−、ジ−又はトリ−アルカノールアミン、モノアルキル−モノアルカノールアミン、ジアルキル−モノアルカノールアミン、モノアルキル−ジアルカノールアミン等を反応させる方法が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。反応条件は、４０〜９０℃で、０．５〜１２時間であることが好ましい。

イオン交換基として、強塩基性基の４級アンモニウム基を導入する方法としては、まず、３級アミノ基を導入し、該３級アミノ基にエピクロルヒドリン等のハロゲン化アルキル化合物を反応させ、４級アンモニウム基に変換させる方法が挙げられる。また、４級アンモニウムの塩酸塩等を分離材に反応させてもよい。

イオン交換基として、弱酸性基であるカルボキシ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物として、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸又はそのナトリウム塩を反応させる方法が挙げられる。これらハロゲン化アルキル化合物の使用量は、イオン交換基を導入する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。

イオン交換基として、強酸性基であるスルホン酸基の導入方法としては、分離材に対してエピクロロヒドリン等のグリシジル化合物を反応させ、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩又は重亜硫酸塩の飽和水溶液に分離材を添加する方法が挙げられる。反応条件は、３０〜９０℃で１〜１０時間であることが好ましい。

一方、スルホン酸基の導入方法として、アルカリ性雰囲気下で、分離材に１，３−プロパンスルトンを反応させる方法も挙げられる。１，３−プロパンスルトンは、分離材の全質量に対して０．４質量％以上使用することが好ましい。反応条件は、０〜９０℃で０．５〜１２時間であることが好ましい。

（水酸基を有する水溶性界面活性剤）
水酸基を有する水溶性界面活性剤を、水酸基を有する多糖類の多孔質ポリマ粒子への吸着時、吸着後、又は、架橋処理後に添加することによって、多孔質ポリマ粒子の表面の多糖類によって被覆されていない部分を被覆することができ、本実施形態の分離材の非特異吸着を更に抑制することができる。

本実施形態の水溶性界面活性剤としては、水酸基を一つ以上有しており、かつ、水溶性を示す界面活性剤であれば特に限定されない。本実施形態において、界面活性剤が水溶性であるとは、２５℃の水に界面活性剤を溶解させた際に水溶液が白濁せずに、界面活性剤が分散することをいう。このような界面活性剤としては、ショ糖又はポリグリセリンのラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等のエステル化合物、ポリビニルアルコール、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル等のポリエチレングリコール鎖を有する化合物などが挙げられる。これらの界面活性剤は単独で使用しても２種以上を併用してもよい。

水溶性界面活性剤の分子量は、２００００以下であることが好ましく、５００〜２００００であることがより好ましく、６００〜１９０００であることが更に好ましい。水溶性界面活性剤の分子量が２００００以下であると、多糖類によって被覆されていない部分に吸着され易い傾向にある。

水溶性界面活性剤の分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、質量分析計等により測定することができる。

被覆層における水溶性界面活性剤の含有量は、被覆層全質量を基準として、１〜２０質量％であることが好ましい。

（水溶性界面活性剤を含む被覆層の形成方法）
水酸基を有する多糖類と同時にこのような水溶性界面活性剤を吸着（被覆）させる場合、被覆されている多糖類全質量に対して１０質量％以下になるように調整することが好ましい。１０質量％以下であると、先に被覆された多糖類を剥離することなく、吸着させることができる。多糖類の吸着後に水溶性界面活性剤を吸着させる場合においても、被覆されている多糖類全質量に対して、１０質量％以下になるように調整することが好ましい。多糖類の架橋処理後に界面活性剤を吸着させる場合は、多糖類が架橋され剥離する可能性が低いことから、被覆されている多糖類全質量に対して１０〜１００質量％で被覆してもよい。吸着した水溶性界面活性剤は、更に架橋処理されていてもよい。架橋処理は、上述の水酸基を有する多糖類と同様の架橋処理を行うことができる。

本実施形態の分離材又は多孔質ポリマ粒子の細孔径分布におけるモード径（細孔径分布の最頻値、最大頻度細孔径）及び比表面積は、水銀圧入測定装置（オートポア：株式会社島津製作所製）にて測定した値であり、以下のようにして測定する。試料約０．０５ｇを、標準５ｍＬ粉体用セル（ステム容積０．４ｍＬ）に加え、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定する。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０°、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍに設定する。また、細孔径０．０５〜５μｍの範囲に限定してそれぞれの値を算出する。

本実施形態の分離材は、タンパク質を静電的相互作用による分離、アフィニティ精製に用いるのに好適である。例えば、タンパク質を含む混合溶液の中に本実施形態の分離材を添加し、静電的相互作用によりタンパク質だけを分離材に吸着させた後、該分離材を溶液からろ別し、塩濃度の高い水溶液中に添加すれば、分離材に吸着しているタンパク質を容易に脱離、回収できる。また、本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーにおいて、使用することも可能である。

本実施形態の分離材を用いて分離できる生体高分子としては、水溶性物質が好ましい。具体的には、血清アルブミン、免疫グロブリン等の血液タンパク質などのタンパク質、生体中に存在する酵素、バイオテクノロジーにより生産されるタンパク質生理活性物質、ＤＮＡ、生理活性をするペプチド等の生体高分子などであり、好ましくは分子量が２００万以下、より好ましくは５０万以下である。また、公知の方法に従い、タンパク質の等電点、イオン化状態等によって、分離材の性質、条件等を選ぶ必要がある。公知の方法としては、例えば、特開昭６０−１６９４２７号公報等に記載の方法が挙げられる。

本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子上の被覆層を架橋処理後、分離材の表面にイオン交換基、プロテインＡを導入することにより、タンパク質等の生体高分子の分離において、天然高分子からなる粒子又は合成ポリマからなる粒子のそれぞれの利点を有する。特に本実施形態の分離材における多孔質ポリマ粒子は、上述の方法で得られるものであるため、耐久性及び耐アルカリ性を有する。また、本実施形態の分離材は、タンパク質の非特異吸着を低減し、タンパク質の吸脱着が起こり易い傾向にある。さらに、本実施形態の分離材は、同一流速下でのタンパク質等の吸着量（動的吸着量）が大きい傾向にある。

本明細書における通液流速とは、φ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに本実施形態の分離材を充填し、液を通した際の通液速度を表す。本実施形態の分離材は、カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液流速が８００ｃｍ／ｈ以上であることが好ましい。カラムクロマトグラフィーでタンパク質の分離を行う場合、タンパク質溶液等の通液速度としては、一般に４００ｃｍ／ｈ以下の範囲であるが、本実施形態の分離材を使用した場合は、通常のタンパク質分離用の分離材よりも速い通液流速８００ｃｍ／ｈ以上で使用することができる。

本実施形態の分離材の平均粒径は、１０〜３００μｍであることが好ましい。分取用又は工業用のクロマトグラフィーでの使用には、カラム内圧の極端な増加を避けるために、１０〜１００μｍであることが好ましい。

本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーでカラム充填材として使用した場合、使用する溶出液の性質に依らず、カラム内での体積変化がほとんどないため、操作性に優れる。

分離材の細孔径分布におけるモード径は、０．０５〜０．６μｍであることが好ましく、０．０５〜０．５μｍであることがより好ましく、０．１〜０．５μｍであることが更に好ましい。細孔径分布におけるモード径が０．０５μｍ以上であると、細孔内に物質が入り易くなる傾向にあり、細孔径分布におけるモード径が０．６μｍ以下であると、比表面積が充分なものになる。

分離材の比表面積は、３０ｍ^２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ^２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ^２／ｇ以上であることが更に好ましい。比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。分離材の比表面積の上限値は、５００ｍ^２／ｇ以下とすることができる。

分離材の細孔径分布におけるモード径、比表面積等は、多孔質ポリマ粒子の原料、多孔質化剤、水酸基を有する多糖類、水酸基を有する水溶性界面活性剤等を適宜選択することによって、調整することができる。

本実施形態の分離材は、カラムに用いることができる。すなわち、本実施形態のカラムは、上記分離材を備える。なお、本実施形態では、イオン交換基を導入する形態の分離材について説明したが、イオン交換基を導入しなくても分離材として用いることができる。このような分離材は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーに利用することができる。

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（多孔質ポリマ粒子１の合成）
５００ｍＬの三口フラスコに、モノマとして純度９６％のジビニルベンゼン（新日鉄住金化学株式会社製、商品名「ＤＶＢ９６０」）を１６ｇ、多孔質化剤としてスパン８０を６ｇ、開始剤として過酸化ベンゾイルを０．６４ｇ加え、分散相とした。更にポリビニルアルコールを０．５質量％含む水溶液を連続相として使用した。これらの分散液を、マイクロプロセスサーバーを使用して乳化後（モノマ濃度２５体積％）、得られた乳化液をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、撹拌機を用いて約８時間撹拌した。得られた粒子をろ過後、アセトンで洗浄を行い、多孔質ポリマ粒子１を得た。多孔質ポリマ粒子１の粒径をフロー型粒径測定装置（ＦＰＩＡ−３０００、シスメックス株式会社製）で測定し、平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を算出した。結果を表１に示す。

（多孔質ポリマ粒子２の合成）
スパン８０の使用量を７ｇに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子２を合成した。

（多孔質ポリマ粒子３の合成）
スパン８０の使用量を８ｇに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子３を合成した。

（多孔質ポリマ粒子４）
市販のアガロース粒子（ＧＥヘルスケアジャパン株式会社、商品名「Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ」）を使用した。

（多孔質ポリマ粒子５の合成）
モノマとして２，３−ジヒドロキシプロピルメタクリレートを１１．２ｇ、エチレングリコールジメタクリレートを４．８ｇ、多孔質化剤としてスパン８０を５ｇ使用した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子５を合成した。

［実施例１］
＜水酸基を有する多糖類の吸着及び架橋＞
アガロース水溶液（２質量％）１００ｍＬに水酸化ナトリウム４ｇ及びグリシジルフェニルエーテル０．１４ｇを投入して７０℃で１２時間反応させ、アガロースにフェニル基を導入した。得られた変性アガロースをイソプロピルアルコールで再沈殿させ、洗浄した。次に、２０ｍｇ／ｍＬの変性アガロース水溶液に多孔質ポリマ粒子１を、水溶液７０ｍＬに対して多孔質ポリマ粒子１を１ｇの割合で投入し、５５℃で２４時間撹拌して、多孔質ポリマ粒子１に変性アガロースを吸着させた。吸着後、ろ過を行い、熱水で洗浄した。多孔質ポリマ粒子１ｇ当たりのアガロースの被覆量は、ろ液中の変性アガロースの濃度から算出して求めた。結果を表２に示す。

変性アガロースは次のようにして架橋した。まず、エチレングリコールジグリシジルエーテル及び水酸化ナトリウムの濃度がそれぞれ０．６４Ｍ、０．４Ｍである水溶液３５ｍＬに対して変性アガロースが吸着した多孔質ポリマ粒子１を１ｇの割合で投入し、２４時間室温にて撹拌した。その後、２質量％の熱ドデシル硫酸ナトリウム水溶液で洗浄後、純水で洗浄した。

＜水溶性界面活性剤の吸着＞
水溶性界面活性剤であるデカグリセリオレイン酸エステル水溶液（０．１質量％）１００ｇ中で架橋した多孔質ポリマ粒子を３時間撹拌し、水溶性界面活性剤を吸着させた。得られた粒子を水で洗浄後、エチレングリコールジグリシジルエーテル及び水酸化ナトリウムの濃度がそれぞれ０．６４Ｍ、０．４Ｍである水溶液３５ｍＬに対して水溶性界面活性剤が吸着した多孔質ポリマ粒子を１ｇの割合で投入し、６時間室温で撹拌した。その後、２質量％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液の熱水で洗浄後、純水で洗浄した。

（タンパク質の非特異吸着能評価）
得られた粒子０．５ｇをＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｕｂｕｍｉｎ）濃度２０ｍｇ／ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍＬに投入し、２４時間室温で撹拌した。その後、遠心分離を行って上澄み液をとった。分光光度計で上澄み液の２８０ｎｍの吸光度を測定することによって求めた上澄み液中のＢＳＡ濃度から、粒子に吸着したＢＳＡ量を算出した。結果を表３及び表４に示す。

（疎水性低分子化合物の吸着量評価）
得られた粒子０．５ｇを疎水性低分子化合物のモデル化合物として疎水基を有するオクチルフェノールエトキシレート（平均鎖長９．５単位、和光純薬工業株式会社、商品名「Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００」）の濃度５０ｍｇ／ｍＬに５０ｍＬに投入し、３時間室温で撹拌した。その後、上澄みをとり、分光光度計でろ液の吸光度より、粒子に吸着したオクチルフェノールエトキシレート量を算出した。オクチルフェノールエトキシレートの濃度は分光光度計により２６９ｎｍ付近のフェニル基の吸光度から確認した。結果を表３及び表４に示す。

＜イオン交換基の導入＞
変性アガロース及び水溶性界面活性剤が架橋された粒子を含む水懸濁液から粒子をろ別した。得られた粒子（乾燥重量２０ｇ）を５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬに投入し、室温で１時間放置した。別途、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩の所定量（６０ｇ）を２００ｍＬの水に添加し、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩の水溶液を調製した。この水溶液を、上記水酸化ナトリウム水溶液に加え、温度を７０℃まで上げ、撹拌しながら２時間反応させた。反応終了後、生成物をろ別、水洗して、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有する（ＤＥＡＥ変性）分離材を得た。得られた分離材の細孔径分布におけるモード径及び比表面積を水銀圧入法にて測定した。また、得られた分離材を乾燥後、熱重量分析により被覆層の質量（被覆量）を測定した。結果を表２に示す。

（カラム特性評価）
分離材を濃度３０質量％のスラリー（溶媒：メタノール）としてφ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムにて１５分充填した。その後、カラムに流速を変えて水を通し、流速とカラム圧との関係を測定し、０．３ＭＰａ時の通液速度（線流速）を測定した。結果を表３及び表４に示す。

動的吸着量は以下のようにして測定した。２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）をカラムに１０カラム容量通した。その後、ＢＳＡ濃度２ｍｇ／ｍＬの２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を８００ｃｍ／ｈで通し、ＵＶ測定によってカラム出口でのＢＳＡ濃度を測定した。カラム入口と出口のＢＳＡ濃度が一致するまで緩衝液を通し、５カラム容量分の１Ｍ ＮａＣｌ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液で希釈した。１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的結合容量は以下の式を用いて算出した。結果を表３及び表４に示す。
ｑ_１０＝ｃ_ｆＦ（ｔ_１０−ｔ_０）／Ｖ_Ｂ
ｑ_１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的結合容量（ｍｇ／ｍＬ ｗｅｔ ｒｅｓｉｎ）
ｃｆ：注入しているＢＳＡ濃度
Ｆ：流速（ｍＬ／ｍｉｎ）
Ｖ_Ｂ：ベッド体積（ｍＬ）
ｔ_１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける時間
ｔ_０：ＢＳＡ注入開始時間

［実施例２］
界面活性剤としてショ糖オレイン酸エステルを使用したこと以外は、実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。

［実施例３］
水溶性界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を使用したこと以外は、実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。

［実施例４］
水溶性界面活性剤としてラウリルアルコ−ル（ＥＯ）１５グリシジルエ−テル（ナガセケムテックス株式会社、分子量９７１）を使用した以外は、実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。

［実施例５］
水溶性界面活性剤としてポリビニルアルコール（分子量１９０００）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。

［実施例６］
多孔質ポリマ粒子２を用いたこと以外は、実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。

［実施例７］
多孔質ポリマ粒子３を用いたこと以外は、実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。

［比較例１］
界面活性剤を吸着させなかったこと以外は、実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。

［比較例２］
多糖類を吸着させなかったこと以外は、実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。

［比較例３］
多孔質ポリマ粒子４をそのまま分離材として用い、実施例１と同様に評価した。

［比較例４］
４ｇの多孔質ポリマ粒子５を、デキストラン（重量平均分子量１５万）１ｇ、水酸化ナトリウム０．６ｇ、及び水素化ホウ素ナトリウム０．１５ｇを蒸留水に溶解させた水溶液６ｇに加えて、多孔質ポリマ粒子の細孔内に含浸させた。得られたデキストラン含浸させた多孔質ポリマ粒子を、エチルセルロース１質量％トルエン溶液１Ｌに加えて撹拌し、懸濁液を得た。得られた懸濁液に、エピクロルヒドリン５ｍＬを加えて５０℃に昇温し、この温度で６時間撹拌して、多孔質ポリマ粒子内のデキストランを架橋させた。反応後、懸濁液をろ取してゲル状物を分離し、トルエン、エタノール、蒸留水で順次洗浄した。実施例１と同様にジエチルアミノエチル基を導入して分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。

表３及び表４に示すとおり、本願実施例１〜７は、比較例１〜４に比べて、タンパク質の非特異吸着を低減し、耐久性に優れ、さらには疎水性低分子化合物（例えば、分子量１０００以下の疎水性化合物）の吸着を抑制でき、かつカラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れることが判明した。

Claims (10)

1. 多孔質ポリマ粒子と、
   該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する多糖類及び水酸基を有する水溶性界面活性剤を含む被覆層と、
   を備える、分離材。
2. 前記界面活性剤の分子量が２００００以下である、請求項１に記載の分離材。
3. 比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上である、請求項１又は２に記載の分離材。
4. 細孔径分布におけるモード径が０．０５〜０．６μｍである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分離材。
5. 平均粒径が１０〜３００μｍである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離材。
6. 前記多糖類がアガロース又はデキストランである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分離材。
7. 前記多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり、３０〜４５０ｍｇの前記被覆層を備える、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分離材。
8. カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液流速が８００ｃｍ／ｈ以上である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分離材。
9. 陽イオン交換基又は陰イオン交換基を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分離材。
10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の分離材を備えるカラム。