JP2017195884A - ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３由来足場およびその使用方法 - Google Patents

ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３由来足場およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ＣＤ４０Ｌに特異的に結合するテネイシン−３ＦｎＩＩＩドメインベース足場の提供。
【解決手段】ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場であって、前記モノマーサブユニットは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと命名される７つのベータ鎖、ならびにＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧと命名される６つのループ領域を含み、前記Ｔｎ３足場は、ヒト由来の特定のＣＤ４０Ｌエピトープに特異的に結合する。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、部分的には、２０１１年１０月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／５４６，０２８号明細書、２０１０年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／３２３，７０８号明細書；２０１１年４月１２日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３２１８４号明細書；２０１１年４月１２日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３２１８８号明細書；および２００８年１０月１０日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１２３９８号明細書に関連し、国際公開第２００９／０５８３７９Ａ２号パンフレットとして公開された主題を含有する。上記参照出願のそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、２０１２年１０月３日に作成され、２３２キロバイトのサイズを有する表題「ＣＤ４０Ｌ−１０１ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔ」のテストファイル（ｔｅｓｔ ｆｉｌｅｄ）としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介するアプリケーションを用いて提出された配列表を参照により組み込む。
本発明は、一般に、抗体模倣体の分野、具体的には、例えば、新規結合特性を有する産物の生成に有用なヒトテネイシンＣの第３フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに由来する足場に関する。特に、本発明は、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場、そのような足場を作製する方法、ならびに全身性エリテマトーデスならびに他の自己免疫および／または炎症障害の診断および治療に使用する方法に関する。
本発明は、例えば、自己免疫および／または炎症障害の治療に有用なＣＤ４０Ｌに結合するＣＤ４０Ｌ特異的タンパク質足場に関する。
所望の標的エピトープに特異的に結合し得る生体分子は、治療、研究、および医用診断ツールとして非常に重要である。このクラスの分子の周知の例は、抗体である。ほとんど全ての構造的エピトープに特異的に親和性を有して結合する抗体を選択することができる。しかしながら、古典的な抗体は、構造的に複雑なヘテロテトラマー分子であり、単純な真核系中で発現させるのは困難である。結果として、ほとんどの抗体は、複雑で高価な哺乳動物細胞発現系を使用して産生される。
相対的に定義された三次元構造を有し、一般にタンパク質足場と称されるタンパク質は、遺伝子操作産物の設計のための試薬として使用することができる。このような足場が有用な１つの特定の領域は、抗体模倣体設計の分野である。抗体模倣体、すなわち、小分子非抗体タンパク質治療薬は、抗体および抗体断片の利点、例えば、標的の高親和性結合ならびに低免疫原性および毒性を利用する一方、不十分な点の一部、例えば、抗体断片が凝集し全長ＩｇＧよりも安定性が低い傾向を回避する。
これらの欠点は、抗体ネイティブフォールドの一部の除去により作出される抗体断片を使用することにより対処することができる。しかしながら、これは、通常、疎水性環境、例えば、可変および定常ドメイン間の界面に埋もれているアミノ酸残基が溶媒に曝される場合、凝集を引き起こすことが多い。足場ベース抗体模倣体の一例は、門およびタンパク質クラスにわたり、例えば、哺乳動物血液および構造タンパク質において広く見出されるドメインであるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦｎＩＩＩ）の構造に基づく。ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインに由来するＦｎＩＩＩ足場の設計および使用は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３２１８４号明細書およびＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３２１８８号明細書に記載されており、その両方は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
ＣＤ４０Ｌは、主として活性化Ｔ細胞（例として、Ｔｈ０、Ｔｈ１、およびＴｈ２サブタイプ上で発現される分子のＴＮＦファミリーのメンバーであり、このファミリーの他のメンバーと類似のホモトリマーを形成する。さらに、ＣＤ４０Ｌは、マスト細胞、および活性化好塩基球および好酸球上で発現されることも見出されている。ＣＤ４０Ｌは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＣＤ４０受容体（ＣＤ４０Ｒ）に結合し、標的細胞型に応じて多くの効果をもたらす。一般に、ＣＤ４０Ｌは、共刺激分子の役割を担い、ＡＰＣ上のＭＨＣ分子によるＴ細胞受容体刺激に伴いＡＰＣにおける活性化を誘導する。
ＣＤ４０ＬによるＣＤ４０受容体を介するシグナリングは、ＣＤ４０受容体担持細胞の活性化および最適なＣＤ４＋Ｔ細胞のプライミングをもたらすイベントのカスケードを開始させる。より具体的には、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０受容体とのコグネート相互作用は、Ｂ細胞の抗体分泌細胞およびメモリーＢ細胞への分化を促進する（Ｂｕｒｋｌｙ，Ｉｎ Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．，Ｖｏｌ．４８９．，Ｄ．Ｍ．Ｍｏｎｒｏｅ，Ｕ．Ｈｅｄｎｅｒ，Ｍ．Ｒ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｃ．Ｎｅｇｒｉｅｒ，Ｇ．Ｆ．Ｓａｖｉｄｇｅ，ａｎｄ Ｇ．Ｃ．Ｉ．Ｗｈｉｔｅ，ｅｄｓ．Ｋｌｏｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００１，ｐ．１３５）。さらに、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０受容体との相互作用は、マクロファージおよび樹状細胞の活性化ならびにナチュラルキラー細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球の生成を介して細胞媒介免疫を促進する（Ｂｕｒｋｌｙ、前掲参照）。
ＣＤ４０ＬとＣＤ４０受容体との相互作用は、いくつかの実験誘導自己免疫疾患、例えば、コラーゲン誘導関節炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎、卵巣炎、大腸炎、薬物誘導性ループス腎炎において重要であることが示されている。具体的には、これらのモデルの全てにおける疾患誘導を抗原投与時においてＣＤ４０Ｌアンタゴニストにより遮断することができることが示されている。抗ＣＤ４０Ｌアンタゴニストを使用する疾患の遮断は、自発性自己免疫疾患、例として、インスリン依存性糖尿病およびループス腎炎の動物モデル、ならびに移植片対宿主病、移植、肺線維症、およびアテローム性動脈硬化症疾患モデルにおいても確認されている。
ＣＤ４０Ｌ遮断を介するＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０Ｒ経路の破壊は、多くの自己免疫介在性疾患（例えば、限定されるものではないが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および同種移植片拒絶反応において有益であることが示されている。例えば、抗ＣＤ４０Ｌ抗体による治療は、コラーゲン誘導関節炎マウスモデルにおいて腎炎を予防または改善した（Ｍｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１５４：１４７０）。さらに、抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、腎炎が樹立されたＳＮＦ１マウスにおいて腎機能を保存した（Ｋａｌｌｅｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１６０：２１５８）。ＣＤ４０Ｌレベルは、非ヒトおよびヒトの両方において臨床疾患重症度（すなわち、炎症の低減）、および標的組織の損傷と密接に相関する。
ＳＬＥは、進行性および場合により致死性の自己免疫疾患である。ループスの多様な症候は、発疹および関節炎から貧血および血小板減少症からさらには精神病に及ぶ。多くの免疫系のアームが腎臓、皮膚、脳疾患および血栓症をもたらす炎症プロセスに関与することを示す明確な証拠が存在する。ＳＬＥの１つの特徴的な特性はＢ細胞トレランスの損失であり、自己抗体がこの疾患を有する患者において顕著である。ループス腎疾患において、抗二本鎖ＤＮＡ自己抗体は、抗体ヌクレオソーム複合体を形成し得、腎糸球体基底膜中に沈降する。これらの免疫複合体は、次いで補体を活性化し、糸球体腎炎をもたらし得る。
ＣＤ４０ＲおよびＣＤ４０Ｌの発現は、ＳＬＥを有する患者において上昇することが見出されている。共刺激シグナルの増加は、ＳＬＥにおいて見出される病理学的炎症応答に寄与する可能性が高い。ＳＬＥ Ｔ細胞は、自己抗原に対する活性化の閾値の低減に伴う、自発的に増加した活性化を有する。さらに、これらの細胞は、さらなる抗原性刺激に低応答性であり、アポトーシスに耐性であり、活性化後の生存率の増加を有し、多くの変化した細胞内シグナリング経路を有する。Ｔ細胞ＣＤ４０ＬによるＡＰＣ上でのＣＤ４０Ｒ活性化後、ＡＰＣおよびＴ細胞の両方が活性化され、サイトカインを産生し、ＳＬＥにおいて病原性自己抗体の産生および組織損傷（ループス腎炎）に寄与する。ＣＤ４０Ｒ／ＣＤ４０Ｌ経路の遮断は、ループスモデルマウスにおける疾患の遮断において単独または組合せで有効である。ＳＬＥを有する患者において、ヒト化ＣＤ４０Ｌ抗体は、抗ｄｓＤＮＡおよびＢ細胞、タンパク尿を低減させ、ＳＬＥ疾患重症度を改善した。
しかしながら、従来の抗体によるＣＤ４０Ｌの標的化は、顕著な安全性の懸念を生じさせている。例えば、慢性難治性特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）を罹患する患者における抗ＣＤ４０Ｌ抗体５ｃ８（ＢＩＯＧＥＮ（登録商標））を用いる試験は、血栓閉塞性合併症が報告されたため、保留された（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈ Ｒｈｅｕ，４３：Ｓ２７１）。さらに、ＣＤ４０Ｌに対して指向される代替抗体を用いる追加の試験は、他の血栓性関連合併症を生じさせた（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈ Ｒｈｅｕ，４３：Ｓ２８１；Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７７：７１７）。ＣＤ４０Ｌの抗体指向アンタゴニズムにより合併症が生じるため、非抗体代替物によりＣＤ４０Ｌを標的化およびアンタゴナイズする要求は満たされてない。したがって、Ｔｎ３ベース足場によるＣＤ４０Ｌの標的化は、Ｆａｂ２および／またはＦｃ媒介血小板凝集ならびに下流の副作用を回避することによる魅力的な代替策である。
本明細書における参照文献の引用および考察は、それらが本発明に対する先行技術であることを認めるものと解釈すべきではない。
ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３２１８４号明細書 ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３２１８８号明細書
Ｂｕｒｋｌｙ，Ｉｎ Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．，Ｖｏｌ．４８９．，Ｄ．Ｍ．Ｍｏｎｒｏｅ，Ｕ．Ｈｅｄｎｅｒ，Ｍ．Ｒ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｃ．Ｎｅｇｒｉｅｒ，Ｇ．Ｆ．Ｓａｖｉｄｇｅ，ａｎｄ Ｇ．Ｃ．Ｉ．Ｗｈｉｔｅ，ｅｄｓ．Ｋｌｏｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００１，ｐ．１３５ Ｍｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１５４：１４７０ Ｋａｌｌｅｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１６０：２１５８ Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈ Ｒｈｅｕ，４３：Ｓ２７１ Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈ Ｒｈｅｕ，４３：Ｓ２８１；Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７７：７１７
本発明は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場であって、モノマーサブユニットは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと命名される７つのベータ鎖、ならびにＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧと命名される６つのループ領域を含み、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合するＴｎ３足場を提供する。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、単一のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、タンデムに連結されている２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。一部の具体的な実施形態において、Ｔｎ３足場は、直接連結されている２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。
一部の実施形態において、２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、リンカーにより連結されている。他の実施形態において、リンカーは、フレキシブルペプチドリンカーであり得るペプチドリンカーを含む。一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、（ＧｍＸ）ｎ配列（式中、Ｘは、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、またはバリン（Ｖ）であり；ｍおよびｎは、整数値であり；ｍは、１、２、３または４であり；ｎは、１、２、３、４、５、６、または７である）を含む。一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１４２または配列番号１４３を含む。
一部の実施形態において、２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場のＣＤ４０Ｌへの結合は、単一のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場のそれと比べて改善される。他の実施形態において、２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場のＣＤ４０Ｌへの結合は、標的に対する作用を単一のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場のそれと比べて改善する。他の実施形態において、Ｔｎ３足場のＣＤ４０Ｌへの結合の改善は、結合親和性の改善、結合アビディティーの改善、またはその両方である。ある実施形態において、２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場のＣＤ４０Ｌへの結合親和性およびＴｎ３足場タンパク質安定性は、単一のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場のそれらと比べて改善される。一部の実施形態において、２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場のＣＤ４０Ｌについての結合アビディティーおよびＴｎ３足場タンパク質安定性は、単一のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場のそれらと比べて改善される。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場中の少なくとも１つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、リンカーに、または異種部分に結合している。他の実施形態において、Ｔｎ３足場中のリンカーまたは異種部分は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットのＮ末端またはＣ末端にコンジュゲートしている。ある実施形態において、Ｔｎ３足場中のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットに結合しているリンカーは、一部の実施形態においてはフレキシブルペプチドリンカーであり得るペプチドリンカーを含む。このペプチドリンカーは、ある実施形態において、（ＧｍＸ）ｎ配列（式中、Ｘは、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、またはバリン（Ｖ）であり；ｍおよびｎは、整数であり；ｍは、１、２、３または４であり；ｎは、１、２、３、４、５、６、または７である）を含み得る。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場中のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットに結合しているペプチドリンカーは、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１４２、または配列番号１４３を含む。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、機能的部分を含むリンカーを含む。一部の実施形態において、この機能的部分は、免疫グロブリンまたはその断片である。ある実施形態において、この免疫グロブリンまたはその断片は、Ｆｃドメインを含む。一部の実施形態において、このＦｃドメインは、少なくとも１つのＦｃγＲ媒介エフェクター機能を誘導し得ない。一部の実施形態において、この少なくとも１つのＦｃγＲ媒介エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、異種部分に結合している少なくとも１つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。一部の実施形態において、この異種部分は、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、薬物、毒素、細胞傷害剤、造影剤、放射性核種、放射性化合物、有機ポリマー、無機ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＳＡ ＦｃＲｎ結合部分、抗体、抗体のドメイン、抗体断片、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩ足場、エピトープタグ、組換えポリペプチドポリマー、サイトカイン、および前記部分の２つ以上の組合せからなる群から選択される組成物を含む。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＰＥＧにコンジュゲートしている少なくとも１つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、アルブミンにコンジュゲートしている少なくとも１つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。ある実施形態において、このアルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。他の実施形態において、このＨＳＡは、バリアントＨＳＡである。一部の具体的な実施形態において、バリアントＨＳＡのアミノ酸配列は、配列番号１３３である。他の実施形態において、バリアントＨＳＡは、ネイティブＨＳＡまたはネイティブＨＳＡ断片と比較して少なくとも１つの改善された特性を有する。ある実施形態において、改善された特性は、ネイティブＨＳＡまたはネイティブＨＳＡ断片の血漿半減期と比較して変化した血漿半減期である。一部の実施形態において、変化した血漿半減期は、ネイティブＨＳＡまたはネイティブＨＳＡ断片の血漿半減期と比較して長い血漿半減期である。他の実施形態において、変化した血漿半減期は、ネイティブＨＳＡまたはネイティブＨＳＡ断片の血漿半減期と比較して短い血漿半減期である。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＨＳＡバリアントに融合している。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、全長成熟ＨＳＡ（配列番号１３３または１３８）の配列またはその断片を含むＨＳＡバリアントに融合しており、但し、４０７、４１５、４６３、５００、５０６、５０８、５０９、５１１、５１２、５１５、５１６、５２１、５２３、５２４、５２６、５３５、５５０、５５７、５７３、５７４、および５８０からなる群から選択される位置における全長成熟ＨＳＡ中の位置に対して番号付与される少なくとも１つのアミノ酸置換を除き；少なくとも１つのアミノ酸置換は、５７３位におけるリジン（Ｋ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換を含まず、Ｔｎ３足場は、このようなＨＳＡバリアントにコンジュゲートしていないＴｎ３足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＨＳＡバリアントに融合しており、全長成熟ＨＳＡ中の位置に対して番号付与される少なくとも１つのアミノ酸置換は、４６３、５０８、５２３、および５２４からなる群から選択される位置におけるものであり、前記Ｔｎ３足場は、前記ＨＳＡバリアントにコンジュゲートしていないＴｎ３足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する。一部の実施形態において、ＨＳＡバリアントは、全長成熟ＨＳＡ（配列番号１３３または１３８）の配列またはその断片を含み、但し、（ａ）４０７位におけるロイシン（Ｌ）のアスパラギン（Ｎ）またはチロシン（Ｙ）への置換；（ｂ）４１５位におけるバリン（Ｖ）のトレオニン（Ｔ）への置換；（ｃ）４６３位におけるロイシン（Ｌ）のアスパラギン（Ｎ）への置換；（ｄ）５００位におけるリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）への置換；（ｅ）５０６位におけるトレオニン（Ｔ）のチロシン（Ｙ）への置換；（ｆ）５０８位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）への置換；（ｇ）５０９位におけるフェニルアラニン（Ｆ）のメチオニン（Ｍ）またはトリプトファン（Ｗ）への置換；（ｈ）５１１位におけるアラニン（Ａ）のフェニルアラニン（Ｆ）への置換；（ｉ）５１２位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のチロシン（Ｙ）への置換；（ｊ）５１５位におけるトレオニン（Ｔ）のグルタミン（Ｑ）への置換；（ｋ）５１６位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）またはトリプトファン（Ｗ）への置換；（ｌ）５２１位におけるアルギニン（Ｒ）のトリプトファン（Ｗ）への置換；（ｍ）５２３位におけるイソロイシン（Ｉ）のアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）への置換；（ｎ）５２４位におけるリジン（Ｋ）のロイシン（Ｌ）への置換；（ｏ）５２６位におけるグルタミン（Ｑ）のメチオニン（Ｍ）への置換；（ｐ）５３５位におけるヒスチジン（Ｈ）のプロリン（Ｐ）への置換；（ｑ）５５０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換；（ｒ）５５７位におけるリジン（Ｋ）のグリシン（Ｇ）への置換；（ｓ）５７３位におけるリジン（Ｋ）のフェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、プロリン（Ｐ）、トリプトファン（Ｗ）、またはチロシン（Ｙ）への置換；（ｔ）５７４位におけるリジン（Ｋ）のアスパラギン（Ｎ）への置換；（ｕ）５８０位におけるグルタミン（Ｑ）のリジン（Ｋ）への置換；および（ｖ）前記置換の２つ以上の組合せからなる群から選択される全長成熟ＨＳＡ中の位置に対して番号付与される少なくとも１つのアミノ酸置換を除き、前記Ｔｎ３足場は、前記ＨＳＡバリアントにコンジュゲートしていないＴｎ３足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、全長成熟ＨＳＡ（配列番号１３３または１３８）の配列またはその断片を含むＨＳＡバリアントに融合しており、但し、（ａ）４６３位におけるロイシン（Ｌ）のアスパラギン（Ｎ）への置換；（ｂ）５０８位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）への置換；（ｃ）５２３位におけるイソロイシン（Ｉ）のアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）への置換；（ｄ）５２４位におけるリジン（Ｋ）のロイシン（Ｌ）への置換；および（ｅ）前記置換の２つ以上の組合せからなる群から選択される全長成熟ＨＳＡ中の位置に対して番号付与される少なくとも１つのアミノ酸置換を除き、前記Ｔｎ３足場は、前記ＨＳＡバリアントにコンジュゲートしていないＴｎ３足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、少なくとも２つの同一のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、少なくとも２つの異なるＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０受容体アゴニストである。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０受容体アンタゴニストである。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、同一のＣＤ４０Ｌエピトープに特異的に結合する少なくとも２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、異なるＣＤ４０Ｌエピトープに特異的に結合する少なくとも２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。一部の実施形態において、これらの異なるＣＤ４０Ｌエピトープは、非重複エピトープである。他の実施形態において、これらの異なるＣＤ４０Ｌエピトープは、重複エピトープである。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、少なくとも２つのＣＤ４０Ｌ分子に結合する。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、少なくとも２つのＣＤ４０Ｌ分子に結合するＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場の少なくとも１つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットのベータ鎖は、配列番号３のベータ鎖と少なくとも９０％の配列同一性を有する。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、配列番号１１を含むＡベータ鎖を含み、または少なくとも１つの突然変異を除き配列番号１１を含むＡベータ鎖を含むＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、配列番号１２を含むＢベータ鎖を含み、または少なくとも１つの突然変異を除き配列番号１２を含むＢベータ鎖を含むＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、配列番号１３もしくは１４を含むＣベータ鎖を含み、または少なくとも１つの突然変異を除き配列番号１３もしくは１４を含むＣベータ鎖を含むＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、配列番号１３のシステインも配列番号１４のシステインも置換されていない。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、配列番号１５を含むＤベータ鎖を含み、または少なくとも１つの突然変異を除き配列番号１５を含むＤベータ鎖を含むＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、配列番号１６を含むＥベータ鎖を含み、または少なくとも１つの突然変異を除き配列番号１６を含むＥベータ鎖を含むＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、配列番号１７を含むＦベータ鎖を含み、または少なくとも１つの突然変異を除き配列番号１７を含むＦベータ鎖を含むＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、配列番号１７のシステインは置換されていない。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、配列番号１８を含むＧベータ鎖を含み、または少なくとも１つの突然変異を除き配列番号１８を含むＧベータ鎖を含むＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、アミノ酸配列：
ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＥＴＦＴＴ
（式中、ＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループの配列中に存在するアミノ酸残基を表し；Ｘ１は、アミノ酸残基ＡまたはＴを表し；ループの長さｎは、２から２６の整数である）
を含むＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＡＢループの配列は、配列番号４または配列番号１３６を含み、ＣＤループの配列は、配列番号６を含み、ＥＦループの配列は、配列番号８または配列番号１３７を含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、および１６８からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＤＥループの配列は、配列番号９４、９５、９６、９７、９８、および１６９からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＦＧループの配列は、配列番号９、９９、１３９、および１７０からなる群から選択される配列を含む。
他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、および１７４からなる群から選択される配列を含む。ある実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＤＥループの配列は、配列番号１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、および１７５からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９、１３０、および１７７からなる群から選択される配列を含む。ある実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＡＢループの配列は、配列番号４および１３６からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号８３を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９４を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号８３を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９４を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９９を含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号８４を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９５を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号８５を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９４を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号８６を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９６を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号８７を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９７を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号８８を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９５を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号８９を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９４を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号９０を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９４を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。
他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号９１を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９５を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号９２を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９８を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号９３を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９４を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１００を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１１８を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０１を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１１９を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０２を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２０を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０３を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２１を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含む。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０４を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２２を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０５を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２１を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０６を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２３を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含む。
ある実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０７を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２３を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０８を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１１８を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０９を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２３を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。一部の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号１１０を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２１を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含む。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１１１を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２３を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１３０を含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０８を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２１を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１１２を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２４を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１１３を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２５を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含む。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１１４を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１１８を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１１５を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２６を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１１６を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２７を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＢＣループの配列は、配列番号１１７を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２８を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含む。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および１４６からなる群から選択される配列を含むＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、アミノ酸配列：
ＩＥＶＫＤＶＴＤＴＴＡＬＩＴＷＸ１ＤＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＣＥＬＴＹＧＩＫＤＶＰＧＤＲＴＴＩＤＬＷＸ９ＨＸ１０ＡＸ１１ＹＳＩＧＮＬＫＰＤＴＥＹＥＶＳＬＩＣＲＸ１２ＧＤＭＳＳＮＰＡＫＥＴＦＴＴ（配列番号１６７）
（式中、（ａ）Ｘ１は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）またはロイシン（Ｌ）を表し；（ｂ）Ｘ２は、アミノ酸残基アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し；（ｃ）Ｘ３は、アミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）を表し；（ｄ）Ｘ４は、アミノ酸残基アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；（ｅ）Ｘ５は、アミノ酸残基グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはアスパラギン（Ｎ）を表し；（ｆ）Ｘ６は、アミノ酸残基フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；（ｇ）Ｘ７は、アミノ酸残基イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；（ｈ）Ｘ８は、アミノ酸残基グリシン（Ｇ）、トリプトファン（Ｗ）またはバリン（Ｖ）を表し；（ｉ）Ｘ９は、アミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；（ｊ）Ｘ１０は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、メチオニン（Ｍ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；（ｋ）Ｘ１１は、アミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；（ｌ）Ｘ１２は、アミノ酸残基アルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）を表す）
を含むＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、配列番号４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、および８２からなる群から選択される配列を含むＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、アミノ酸配列：
ＩＥＶＸ１ＤＶＴＤＴＴＡＬＩＴＷＸ２Ｘ３ＲＳＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＣＥＬＸ１１ＹＧＩＫＤＶＰＧＤＲＴＴＩＤＬＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５ＹＶＨＹＳＩＧＮＬＫＰＤＴＸ１６ＹＥＶＳＬＩＣＬＴＴＤＧＴＹＸ１７ＮＰＡＫＥＴＦＴＴ（配列番号１７１）
（式中、
（ａ）Ｘ１は、アミノ酸残基リジン（Ｋ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し；
（ｂ）Ｘ２は、アミノ酸残基トレオニン（Ｔ）またはイソロイシン（Ｉ）を表し；
（ｃ）Ｘ３は、アミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）またはアラニン（Ａ）を表し；
（ｄ）Ｘ４は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｅ）Ｘ５は、アミノ酸残基チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）またはセリン（Ｓ）を表し；
（ｆ）Ｘ６は、アミノ酸残基チロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｇ）Ｘ７は、アミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｈ）Ｘ８は、アミノ酸残基ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｉ）Ｘ９は、アミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｊ）Ｘ１０は、アミノ酸残基グリシン（Ｇ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｋ）Ｘ１１は、アミノ酸残基アラニン（Ａ）またはトレオニン（Ｔ）を表し；
（ｌ）Ｘ１２は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｒ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｍ）Ｘ１３は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアラニン（Ａ）を表し；
（ｎ）Ｘ１４は、アミノ酸残基プロリン（Ｐ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）またはアラニン（Ａ）またはアミノ酸無しを表し；
（ｏ）Ｘ１５は、アミノ酸残基イソロイシン（Ｉ）またはアミノ酸無しを表し；
（ｐ）Ｘ１６は、アミノ酸残基グルタミン酸（Ｅ）またはリジン（Ｋ）を表し；
（ｑ）Ｘ１７は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）を表す）
を含むＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、配列番号１３４、１３５、２０５、２０６、２０７および２０８からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、配列番号１３４、１３５、２０５、２０６、２０７および２０８からなる群から選択される配列からなる。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、配列番号２０１、２０２、２０３、および２０４からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、配列番号２０１、２０２、２０３、および２０４からなる群から選択される配列からなる。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、前記ＣＤ４０Ｌ特異性は、ヒトＣＤ４０Ｌに関する。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、前記ＣＤ４０Ｌ特異性は、膜結合ＣＤ４０Ｌ（配列番号１）、可溶性ＣＤ４０Ｌ（配列番号２）、またはその断片に向けられる。一部の具体的な実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌに結合し、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を妨害する。
本発明はまた、ＣＤ４０Ｌ発現細胞をＴｎ３足場と接触させることを含みＣＤ４０Ｌ発現細胞の活性を変化させる方法であって、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌに結合し、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を妨害する方法を提供する。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、約１μＭ以下、または約５００ｎＭ以下、または約１００ｎＭ以下、または約５０ｎＭ以下、または約２５ｎＭ以下、または約１０ｎＭ以下、または約５ｎＭ以下、または約２ｎＭ以下の親和性（Ｋｄ）でＣＤ４０Ｌに結合する。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、配列番号２の１４２から１５５、２００から２３０、または２４７から２５１位に局在するアミノ酸を含むＣＤ４０Ｌエピトープに特異的に結合するＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌアミノ酸Ｅ１４２、Ｙ１４６、Ｍ１４８、Ｎ１５１、Ｌ１５５、Ｒ２００、Ｒ２０３、およびＥ２３０と相互作用するＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌアミノ酸Ｒ２０３、Ｉ２０４、Ｖ２４７、Ｈ２４９、およびＴ２５１と相互作用するＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、第１のＣＤ４０Ｌ分子中に局在するＣＤ４０Ｌアミノ酸Ｅ１４２、Ｙ１４６、Ｍ１４８、Ｎ１５１、Ｌ１５５と、および第２のＣＤ４０Ｌ分子中に局在するＣＤ４０Ｌアミノ酸Ｒ２００、Ｒ２０３、およびＥ２３０と相互作用するＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、第１のＣＤ４０Ｌ分子中に局在するＣＤ４０Ｌアミノ酸Ｒ２０３およびＩ２０４と、および第２のＣＤ４０Ｌ分子中に局在するＣＤ４０Ｌアミノ酸Ｖ２４７、Ｈ２４９、およびＴ２５１と相互作用するＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。
本発明はまた、１つ以上のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーを含むポリペプチド、例として、限定されるものではないが、本明細書に記載の血清アルブミン融合体を提供する。
本発明はまた、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場をコードする単離核酸分子、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場を含むコードする核酸分子を含む発現ベクター、およびこのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、核酸分子によりコードされるＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場が発現される条件下で宿主細胞を培養することを含む、Ｔｎ３足場を産生する方法を提供する。
本発明はまた、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、自己免疫疾患の予防、治療、改善、または管理が必要とされる患者における自己免疫疾患を予防、治療、改善、または管理する方法を提供する。
本発明はまた、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場を含む治療有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、自己免疫を有する患者に投与されるコルチコステロイドの頻度および量を低減させる方法を提供する。
ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場の投与により治療される自己免疫疾患は、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、シェーグレン症候群、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、加齢性黄斑変性、血管新生性緑内障、血管腫、甲状腺過形成（グレーブス病を含む）、角膜および他の組織移植、ならびに慢性炎症、敗血症、関節リウマチ、腹膜炎、クローン病、再灌流損傷、敗血症、内毒素ショック、嚢胞性線維症、心内膜炎、乾癬、関節炎（例えば、乾癬性関節炎）、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流損傷、脊髄損傷および同種移植片拒絶反応。自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄多発性神経障害、チャーグストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、１型または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、例えば、疱疹状皮膚炎血管炎、白斑およびウェゲナー肉芽腫症であり得る。
一部の具体的な実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場の投与により治療される自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。
ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場により治療する方法は、追加の治療法、例えば、免疫療法、生物療法、化学療法、放射線療法、または小分子薬物療法をさらに含み得る。
本発明はまた、可溶性ＣＤ４０Ｌ（配列番号２）との複合体中の配列番号２０からなるＴｎ３足場を含むタンパク質結晶であって、Ｐ２１２１２１斜方晶空間群およびａ＝８５．６９Å、ｂ＝９０．６４Å、ｃ＝９５．５６Åの単位格子寸法、＋／−０．１％における結晶格子を有するタンパク質結晶を提供する。一部の実施形態において、結晶の非対称単位は、ＣＤ４０ＬのトリマーおよびＴｎ３足場の３つの分子を含む。他の実施形態において、結晶は、構造座標の決定のためのＸ線を３．２Å以下の値の分解能に回折させる。
本発明はまた、可溶性ＣＤ４０Ｌ（配列番号２）との複合体中の配列番号６８からなるＴｎ３足場を含むタンパク質結晶であって、Ｐ２１３立方晶空間群およびａ＝ｂ＝ｃ＝９７．６２Åの単位格子寸法、＋／−０．１％における結晶格子を有するタンパク質結晶を提供する。一部の実施形態において、結晶の非対称単位は、１つのＣＤ４０Ｌ分子および１つのＴｎ３足場分子を含む。他の実施形態において、結晶は、構造座標を決定するためのＸ線を２．７Å以下の値の分解能に回折させる。
本発明はまた、可溶性ＣＤ４０Ｌ（配列番号２）との複合体中の配列番号２８または１４６からなるＴｎ３足場を含むタンパク質結晶であって、Ｐ３２１空間群およびａ＝９５．５３Å、ｂ＝９３．５３Å、ｃ＝６６．６９Åの単位格子寸法、＋／−０．１％における結晶格子を有するタンパク質結晶を提供する。一部の実施形態において、結晶の非対称単位は、１つのＣＤ４０Ｌ分子および１つのＴｎ３足場分子を含む。他の実施形態において、結晶は、構造座標を決定するためのＸ線を２．８Å以下の値の分解能に回折させる。
本発明はまた、可溶性ＣＤ４０Ｌ（配列番号２）との複合体中の配列番号６８および配列番号２８または１４６からなる２つの異なるＴｎ３足場を含むタンパク質結晶であって、Ｐ２１立方晶空間群およびａ＝８０．３２Å、ｂ＝１４３．４８Å、ｃ＝１１１．２７Å、β＝９８．２２Åの単位格子寸法、＋／−０．１％における結晶格子を有するタンパク質結晶を提供する。一部の実施形態において、結晶の非対称単位は、２つのＣＤ４０Ｌトリマーおよび６つのそれぞれのＴｎ３足場分子を含む。他の実施形態において、結晶は、構造座標を決定するためのＸ線を１．９Å以下の値の分解能に回折させる。
一部の実施形態において、タンパク質結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散を使用することにより産生される。本発明はまた、（ａ）ＣＤ４０Ｌとの複合体中のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場を含むある容量の液体を、沈殿剤を含むある容量のリザーバー溶液と混合すること；および（ｂ）工程（ａ）において得られた混合物を密閉容器中で、タンパク質結晶が形成するまで結晶化に好適な条件下でインキュベートすることを含む、タンパク質結晶を作製する方法を提供する。一部の実施形態において、タンパク質結晶を産生する方法は、シッティングドロップ蒸気拡散を使用することを含む。
一部の実施形態において、タンパク質結晶を作製する方法は、配列番号２０、配列番号２８、配列番号６８または配列番号１４６のＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３モノマーサブユニットを含む結晶を産生するために使用される。
本発明はまた、（ａ）データを、ＣＤ４０Ｌと複合体化されたＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場のタンパク質結晶の一部の構造についてのグラフ三次元表示に変換するための；および（ｂ）前記グラフ三次元表示の表示をもたらすための、機械可読命令が符号化されたデータ保存材料を含む機械可読データ保存媒体を提供する。一部の実施形態において、このようなＴｎ３足場は、配列番号２０、配列番号２８、配列番号６８または配列番号１４６を含む。他の実施形態において、このようなタンパク質結晶は、
（ａ）可溶性ＣＤ４０Ｌ（配列番号２）との複合体中の配列番号２０からなるＴｎ３足場を含むタンパク質結晶であって、Ｐ２１２１２１斜方晶空間群およびａ＝８５．６９Å、ｂ＝９０．６４Å、ｃ＝９５．５６Åの単位格子寸法、＋／−０．１％における結晶格子を有するタンパク質結晶；
（ｂ）可溶性ＣＤ４０Ｌ（配列番号２）との複合体中の配列番号６８からなるＴｎ３足場を含むタンパク質結晶であって、Ｐ２１３立方晶空間群およびａ＝ｂ＝ｃ＝９７．６２Åの単位格子寸法、＋／−０．１％における結晶格子を有するタンパク質結晶；または
（ｃ）配列番号２０からなるＴｎ３足場および配列番号６８からなるＴｎ３足場を含むタンパク質結晶であって、両方のＴｎ３足場は、可溶性ＣＤ４０Ｌ（配列番号２）との複合体中に存在するタンパク質結晶
（ｄ）可溶性ＣＤ４０Ｌ（配列番号２）との複合体中の配列番号２８または１４６からなるＴｎ３足場を含むタンパク質結晶であって、Ｐ３２１空間群およびａ＝９５．５３Å、ｂ＝９３．５３Å、ｃ＝６６．６９Åの単位格子寸法、＋／−０．１％における結晶格子を有するタンパク質結晶
（ｅ）可溶性ＣＤ４０Ｌ（配列番号２）との複合体中の配列番号６８および配列番号２８または１４６からなる２つ異なるＴｎ３足場を含むタンパク質結晶であって、Ｐ２１立方晶空間群およびａ＝８０．３２Å、ｂ＝１４３．４８Å、ｃ＝１１１．２７Å、β＝９８．２２Åの単位格子寸法、＋／−０．１％における結晶格子を有するタンパク質結晶
である。
本発明を説明する目的のため、本発明のある実施形態を図面に示す。しかしながら、本発明は、図面中に示される実施形態の正確な配置および手段に限定されるものではない。
Ｄ１０Ｇ４．１／ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）アッセイを使用して計測されたネズミＣＤ４０Ｌ（ＭｕＣＤ４０Ｌ）誘導ＣＤ８６発現の阻害を示す。Ｍ１３マウスＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場、そのＭ３１親和性最適化バリアント（約２０倍の親和性改善）、抗ＣＤ４０Ｌ ＭＲ１モノクローナル抗体、および陰性対照をアッセイした。ＩＣ５０値も示す。 ネズミＮｆｋＢアッセイにおけるＣＤ４０Ｌ阻害を示す。アッセイは、ネズミＣＤ４０Ｒを発現し、ＮｆｋＢ−ルシフェラーゼレポーター構築物を含有するＮＩＨＴ３Ｔ細胞を使用する。ＣＤ４０Ｌの添加は、ＭＲ１抗ＣＤ４０Ｌ抗体、およびＭ３１ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場の両方により阻害される（ルシフェラーゼ活性により計測される）シグナリングをもたらす。 ＣＤ４０Ｌ特異的タンデム二価Ｔｎ３足場および血清アルブミン（ＳＡ）融合構築物の設計を示す。 精製一価Ｍ１３構築物（ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３構築物）、または２つのＭ１３Ｔｎ３モノマーサブユニットを結合する１、３、５もしくは７つのＧｌｙ４Ｓｅｒ単位（ＧＳと示す）を含有するリンカーを有するタンデム二価足場のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。一価Ｍ１３構築物をレーン２に流し、１つのＧＳ単位を有するダイマー構築物（Ｃ１）をレーン３および７に流し、３つのＧＳ単位を有するダイマー構築物（Ｃ２）をレーン４および８に流し、５つのＧＳ単位を有するダイマー構築物（Ｃ３）をレーン５および９に流し、７つのＧＳ単位を有するダイマー構築物（Ｃ４）をレーン６および１０に流した。試料を非還元条件（レーン２〜６）または還元条件（レーン７〜１０）のいずれかで流した。 ネズミＣＤ４０Ｌ特異的一価（Ｍ１３）または二価タンデム足場（１、３、５または７つのＧｌｙ４Ｓｅｒ単位を含有するリンカーを有する二価足場に対応するＭ１３−ｘＧＳ−Ｍ１３（式中、ｘは、１、３、５または７である））による、バイオセンサーチップ上に固定化されたネズミＣＤ４０受容体へのネズミＣＤ４０Ｌ結合の競合阻害を示す。種々の構築物についての半最大阻害濃度（ＩＣ５０）も示す。 Ｂ細胞上のネズミＣＤ４０Ｌ誘導ＣＤ８６発現に対するネズミＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３一価（Ｍ１３）および二価タンデム足場の阻害効果を示す。全てのＴｎ３構築物について、およびＭＲ１抗ネズミＣＤ４０Ｌ抗体についてのＩＣ５０値を提供する。 ＨＥＫ２９３細胞中のマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に融合しているネズミＣＤ４０Ｌ特異的タンデム二価Ｔｎ３足場の高い発現レベルを示す。これらの構築物は、Ｔｎ３足場単位間のリンカー中の１つの（Ｇ４Ｓ）リピートおよびＴｎ３足場とＭＳＡとの間のリンカー中の３つの（Ｇ４Ｓ）リピートを有する。さらに、構築物は、潜在的なＮ結合グリコシル化部位を除去するようにＭ１３およびＭ３１足場のそれぞれの中にＮ４９Ｑ突然変異を含有する。形質移入３または６日後に採取された１０μｌの培養上清を、既知量の精製タンパク質とともにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流した。発現レベルは、形質移入６日後に２００ｍｇ／ｌと推定した。精製は、Ｃ末端Ｈｉｓタグを介するＩＭＡＣにより実施した。 Ｄ１０Ｇ４．１／ＰＢＭＣ細胞アッセイを使用して計測されたネズミＣＤ４０Ｌ（ＭｕＣＤ４０Ｌ）誘導ＣＤ８６発現の阻害を示す。ＣＤ４０Ｌ特異的タンデム二価Ｔｎ３足場（Ｍ１３−１ＧＳ−Ｍ１３）、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に融合している同一の構築物（Ｍ１３−１ＧＳ−Ｍ１３−ＭＳＡ）、およびＭＲ１抗ネズミＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体をアッセイした。全ての構築物についてのＩＣ５０値を提供する。 Ｄ１０Ｇ４．１／ＰＢＭＣ細胞アッセイを使用して計測されたネズミＣＤ４０Ｌ（ＭｕＣＤ４０Ｌ）誘導ＣＤ８６発現の阻害を示す。マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に融合しているＣＤ４０Ｌ特異的タンデム二価Ｔｎ３足場（Ｍ１３−１ＧＳ−Ｍ１３）（Ｍ１３−１ＧＳ−Ｍ１３−ＭＳＡ）、ＭＳＡにコンジュゲートしているＭ１３足場の親和性成熟バリアント（Ｍ３１Ｍｏｎｏ−ＭＳＡ）、ＭＳＡにコンジュゲートしているＭ３１親和性最適化バリアントを含むタンデム二価足場（Ｍ３１−１ＧＳ−Ｍ３１−ＭＳＡ）、ネズミＣＤ４０Ｌに結合しない陰性対照タンデム二価足場（Ｄ１−１ＧＳ−Ｄ１−ＭＳＡ）、およびＭＲ１モノクローナル抗体をアッセイした。ＩＣ５０値を提供する。 ＥＬＩＳＡにより測定されたマウスにおけるいくつかのネズミＣＤ４０Ｌ特異的構築物の薬物動態を示す。それぞれの構築物についての血漿半減期（ｔ１／２）値を示す。 ＥＬＩＳＡにより測定されたカニクイザルにおけるヒトＣＤ４０Ｌ特異的３４２−ＨＳＡおよび４６３位におけるＬｅｕのＡｓｎによる置換（Ｌ４６３Ｎ）および５２４位におけるＬｙｓのＬｅｕによる置換（Ｋ５２４Ｌ）を含む３４２−ＨＳＡバリアントの薬物動態を示す。 ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）免疫化アッセイからの胚中心（ＧＣ）におけるＢ細胞成熟を示す。ＭＲ１モノクローナル抗ネズミＣＤ４０Ｌ抗体をアッセイした。 ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）免疫化アッセイからの胚中心（ＧＣ）におけるＢ細胞成熟を示す。ＭＳＡに融合しているＭ３１由来一価および二価構築物をアッセイした。ＭＳＡにコンジュゲートしているＤ１−Ｄ１二価構築物を陰性対照として使用した。 ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）免疫化アッセイからの末梢（非ＧＣ）におけるＢ細胞成熟を示す。ＭＳＡに融合しているＭ３１由来一価および二価構築物をアッセイした。ＭＳＡにコンジュゲートしているＤ１−Ｄ１二価構築物を陰性対照として使用した。 ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）免疫化アッセイからのＣＤ４陽性細胞の割合（％ＣＤ４）および数（＃ＣＤ４）を示す。ＭＳＡに融合しているＭ３１由来一価および二価構築物、ならびにＭＲ１抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体をアッセイした。ＭＳＡにコンジュゲートしているＤ１−Ｄ１二価構築物を陰性対照として使用した。 ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）免疫化アッセイからのＣＤ４４ｈｉ陽性細胞の割合（％ＣＤ４４ｈｉ）および数（＃ＣＤ４４ｈｉ）を示す。ＭＳＡに融合しているＭ３１由来一価および二価構築物、ならびにＭＲ１抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体をアッセイした。ＭＳＡにコンジュゲートしているＤ１−Ｄ１二価構築物を陰性対照として使用した。 ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）免疫化アッセイからの抗ＳＲＢＣ ＩｇＧの量を示す。ＭＳＡに融合しているＭ３１由来一価および二価構築物をアッセイした。ＭＳＡにコンジュゲートしているＤ１−Ｄ１二価構築物を陰性対照として使用した。 ＫＬＨ特異的Ｔ細胞依存性抗体応答（ＴＤＡＲ）モデルからの抗ＫＬＨ ＩｇＭ力価を示す。ＨＳＡに融合している３４２由来一価および二価構築物をアッセイした。 ＫＬＨ特異的Ｔ細胞依存性抗体応答（ＴＤＡＲ）モデルからの抗ＫＬＨ ＩｇＧ力価を示す。ＨＳＡに融合している３４２由来一価および二価構築物をアッセイした。 Ｊｕｒｋａｔ Ｄ１．１細胞により刺激されたＣＤ１９陽性ヒトＰＢＭＣ上のヒトＣＤ４０Ｌ誘導ＣＤ８６発現に対するヒトＣＤ４０Ｌ特異的一価Ｔｎ３モノマー足場３０９および３１１の阻害効果を示す。 ヒトＣＤ４０Ｌ刺激Ｂ細胞増殖に対するヒトＣＤ４０Ｌ特異的一価Ｔｎ３モノマー足場３０９および３１１の阻害効果を示す。 Ｔ／Ｂ細胞共培養物中の形質細胞数に対するヒトＣＤ４０Ｌ特異的一価Ｔｎ３モノマー足場３０９および３１１の阻害効果を示す。Ｔｎ３足場３０９は、ＦＡＣＳにより活性化初代Ｔ細胞に結合することも示された（データ示さず）。Ｄ１足場（「Ｎｅｇ Ｔｎ３」）を対照として使用した。ａＣＤ４０Ｌ（ＲＥ）およびａＣＤ４０Ｌ（Ｂｉｏ）（Ｂｉｏｇｅｎ製５ｃ８抗ヒトＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体）と命名されるＣＤ４０Ｌに対する２つのモノクローナル抗体も対照として使用した。 ヒトＣＤ４０Ｌ特異的一価Ｔｎ３足場３０９および３１１が類似の生物物理学的特性を有することを示す。両方の足場は、ＳＥＣにより計測されるとおり単分散される。 ヒトＣＤ４０Ｌ特異的一価Ｔｎ３足場３０９および３１１が類似の生物物理学的特性を有することを示す。両方の足場は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により計測されるとおり親Ｔｎ３足場（グラフ中でＴｎ３（野生型）と命名）と類似の熱安定性を有する。 Ｊｕｒｋａｔ Ｄ１．１細胞により刺激されたＣＤ１９陽性ヒトＰＢＭＣ上のヒトＣＤ４０Ｌ誘導ＣＤ８６発現の阻害を示す。一価（３１１）および二価（３１１＿３ＧＳおよび３１１＿７ＧＳ）ヒトＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場をアッセイした。それぞれの構築物についてのＩＣ５０値を示す。 Ｊｕｒｋａｔ Ｄ１．１細胞により刺激されたＣＤ１９陽性ヒトＰＢＭＣ上のヒトＣＤ４０Ｌ誘導ＣＤ８６発現の阻害を示す。一価（３０９）および二価（３０９＿３ＧＳおよび３０９＿７ＧＳ）ヒトＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場、ならびにＢｉｏｇｅｎ製５ｃ８抗ヒトＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体をアッセイした。それぞれの構築物および抗体についてのＩＣ５０値を示す。 代表的なヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に融合しているヒトＣＤ４０Ｌ特異的タンデム二価Ｔｎ３足場の設計を示す。「ＧＧＧＧＧ」（配列番号１４８）および「ＧＧＧＧＡ」（配列番号１４９）は、「ＧＧＧＧＳ」リンカー（配列番号１４７）の代替リンカーである。 ＩＥＸカラム上での２９３Ｆ細胞からの試験精製を示す。ショルダー分画（メジャーピークの＜１０％）は、リンカー中に存在するセリン残基に結合しているＯ−グリコシル化タンパク質を含有する。 Ｊｕｒｋａｔ Ｄ１．１細胞により刺激されたＣＤ１９陽性ヒトＰＢＭＣ上のヒトＣＤ４０Ｌ誘導ＣＤ８６発現の阻害を示す。二価（３０９）ヒトＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場、ＨＳＡに融合している同一足場、およびＢｉｏｇｅｎ製５ｃ８抗ヒトＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体をアッセイした。 Ｊｕｒｋａｔ Ｄ１．１細胞により刺激されたＣＤ１９陽性ヒトＰＢＭＣ上のヒトＣＤ４０Ｌ誘導ＣＤ８６発現の阻害を示す。３つの二価（３０９）ヒトＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場を試験した。３つ（Ｇ４Ｓ）リピートがヒトＣＤ４０Ｌ特異的サブユニット（本実施例における３０９）間のリンカー中に存在した一方、３０９サブユニットとＨＳＡとの間のリンカーは１から３つの（Ｇ４Ｓ）リピートで変動させた。Ｂｉｏｇｅｎ製５ｃ８抗ヒトＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体もアッセイした。 ＣＤ４０Ｌ結合に対する３０９（左パネル）および３１１（右パネル）のループ配列の突然変異の効果を示す。結合は、結合アッセイにおけるシグナル強度を示す。ＷＴは、元のリード配列（親Ｔｎ３配列）を有するバリアントである一方、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧは、ＢＣ、ＤＥ、またはＦＧループ配列をヒトテネイシンＣ中に存在する親Ｔｎ３配列に変化させたバリアントを示す。 Ｊｕｒｋａｔ Ｄ１．１細胞により刺激されたＣＤ１９陽性ヒトＰＢＭＣ上のヒトＣＤ４０Ｌ誘導ＣＤ８６発現により計測された親和性最適化足場のパネルの阻害プロファイルを示す。ヒトＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３クローン３０９モノマーを親和性最適化した。親和性最適化モノマーは、クローン３４０からクローン３４９として設計される。クローン３０９ｗｔＦＧ構築物は、親Ｔｎ３足場のＦＧループにより置き換えられているＦＧループ全体を有した。５ｃ８抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体もアッセイした。 Ｊｕｒｋａｔ Ｄ１．１細胞により刺激されたＣＤ１９陽性ヒトＰＢＭＣ上のヒトＣＤ４０Ｌ誘導ＣＤ８６発現により計測された阻害プロファイルを示す。ヒトＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３ ３１１モノマー、そのＫ４Ｅバリアント、および陰性対照のプロファイルを示す。 は、Ｊｕｒｋａｔ Ｄ１．１細胞により刺激されたＣＤ１９陽性ヒトＰＢＭＣ上のヒトＣＤ４０Ｌ誘導ＣＤ８６発現により計測された阻害プロファイルを示す。ヒトＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３ ３１１Ｋ４Ｅモノマー、親和性最適化３１１Ｋ４Ｅ＿１２モノマー、および５ｃ８抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体のプロファイルを示す。２つの構築物および抗体についてのＩＣ５０も提示する。 親ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場３０９、３０９ＦＧｗｔバリアント、および親和性最適化バリアント３４０から３４９の多重配列アラインメントを示す。アミノ酸残基１から４２を図１１Ａに示し、アミノ酸残基４３から８３を図１１Ｂに示す。バリアントループを陰影により示す。コンセンサスアミノ酸配列を、多重配列アラインメント下方に提示する。アラインされた配列は、Ｔｎ３足場クローン３０９（配列番号２０）、３０９ＦＧｗｔ（配列番号２２）、３４０（配列番号２４）、３４１（配列番号２６）、３４２（配列番号２８）、３４３（配列番号３０）、３４４（配列番号３２）、３４５（配列番号３４）、３４６（配列番号３６）、３４７（配列番号３８）、３４８（配列番号４０）、および３４９（配列番号４２）のアミノ酸配列に対応する。 親ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場３０９、３０９ＦＧｗｔバリアント、および親和性最適化バリアント３４０から３４９の多重配列アラインメントを示す。アミノ酸残基１から４２を図１１Ａに示し、アミノ酸残基４３から８３を図１１Ｂに示す。バリアントループを陰影により示す。コンセンサスアミノ酸配列を、多重配列アラインメント下方に提示する。アラインされた配列は、Ｔｎ３足場クローン３０９（配列番号２０）、３０９ＦＧｗｔ（配列番号２２）、３４０（配列番号２４）、３４１（配列番号２６）、３４２（配列番号２８）、３４３（配列番号３０）、３４４（配列番号３２）、３４５（配列番号３４）、３４６（配列番号３６）、３４７（配列番号３８）、３４８（配列番号４０）、および３４９（配列番号４２）のアミノ酸配列に対応する。 親ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場３１１、３１１Ｋ４Ｅバリアント、および親和性最適化バリアント３１１Ｋ４Ｅ＿１から３１１Ｋ４Ｅ＿２１の多重配列アラインメントを示す。アミノ酸残基１から４４を図１２Ａに示し、アミノ酸残基４５から８７を図１２Ｂに示す。バリアントループを陰影により示す。陰影が付されたループ外側のアミノ酸変動を枠で囲む。コンセンサス配列を、多重配列アラインメント下方に提示する。アラインされた配列は、Ｔｎ３足場クローン３１１（配列番号４４）、３１１Ｋ４Ｅ（配列番号４６）、３１１Ｋ４Ｅ＿１（配列番号４８）、３１１Ｋ４Ｅ＿２（配列番号５０）、３１１Ｋ４Ｅ＿２（配列番号５２）、３１１Ｋ４Ｅ＿３（配列番号５４）、３１１Ｋ４Ｅ＿４（配列番号５６）、３１１Ｋ４Ｅ＿５（配列番号５８）、３１１Ｋ４Ｅ＿７（配列番号６０）、３１１Ｋ４Ｅ＿８（配列番号６２）、３１１Ｋ４Ｅ＿９（配列番号６４）、３１１Ｋ４Ｅ＿１０（配列番号６６）、３１１Ｋ４Ｅ＿１１（配列番号６８）、３１１Ｋ４Ｅ＿１２（配列番号７０）、３１１Ｋ４Ｅ＿１３（配列番号７２）、３１１Ｋ４Ｅ＿１４（配列番号７４）、３１１Ｋ４Ｅ＿１５（配列番号７６）、３１１Ｋ４Ｅ＿１６（配列番号７８）、３１１Ｋ４Ｅ＿１９（配列番号８０）、３１１Ｋ４Ｅ＿２０（配列番号８２）、および３１１Ｋ４Ｅ＿２１（配列番号８４）のアミノ酸配列に対応する。 親ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場３１１、３１１Ｋ４Ｅバリアント、および親和性最適化バリアント３１１Ｋ４Ｅ＿１から３１１Ｋ４Ｅ＿２１の多重配列アラインメントを示す。アミノ酸残基１から４４を図１２Ａに示し、アミノ酸残基４５から８７を図１２Ｂに示す。バリアントループを陰影により示す。陰影が付されたループ外側のアミノ酸変動を枠で囲む。コンセンサス配列を、多重配列アラインメント下方に提示する。アラインされた配列は、Ｔｎ３足場クローン３１１（配列番号４４）、３１１Ｋ４Ｅ（配列番号４６）、３１１Ｋ４Ｅ＿１（配列番号４８）、３１１Ｋ４Ｅ＿２（配列番号５０）、３１１Ｋ４Ｅ＿２（配列番号５２）、３１１Ｋ４Ｅ＿３（配列番号５４）、３１１Ｋ４Ｅ＿４（配列番号５６）、３１１Ｋ４Ｅ＿５（配列番号５８）、３１１Ｋ４Ｅ＿７（配列番号６０）、３１１Ｋ４Ｅ＿８（配列番号６２）、３１１Ｋ４Ｅ＿９（配列番号６４）、３１１Ｋ４Ｅ＿１０（配列番号６６）、３１１Ｋ４Ｅ＿１１（配列番号６８）、３１１Ｋ４Ｅ＿１２（配列番号７０）、３１１Ｋ４Ｅ＿１３（配列番号７２）、３１１Ｋ４Ｅ＿１４（配列番号７４）、３１１Ｋ４Ｅ＿１５（配列番号７６）、３１１Ｋ４Ｅ＿１６（配列番号７８）、３１１Ｋ４Ｅ＿１９（配列番号８０）、３１１Ｋ４Ｅ＿２０（配列番号８２）、および３１１Ｋ４Ｅ＿２１（配列番号８４）のアミノ酸配列に対応する。 ヒトＣＤ４０受容体を発現し、ＮｆｋＢ−ルシフェラーゼレポーター構築物を含有するＨＥＫ２９３細胞を使用するヒトＮｆｋＢ阻害アッセイを示す。ヒトＣＤ４０Ｌの添加は、ＣＤ４０Ｌ結合分子により阻害することができる（ルシフェラーゼ活性により計測される）シグナリングをもたらす。ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場３４０および３４２、ならびに５ｃ８抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体をアッセイした。 ２４時間抗ＣＤ３／２８活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞へのヒトＣＤ４０特異的Ｔｎ３足場の結合を示す。ＨＳＡに融合している一価３４２足場（３４２−ＨＳＡと命名）およびＨＳＡに融合している二価３４２足場（３４２−３４２−ＨＳＡと命名）をアッセイした。 ３日目における初代ヒトＴ／Ｂ細胞増殖の阻害を示す。ＨＳＡに融合している一価３４０足場（３４０−ＨＳＡ）、ＨＳＡに融合している一価３４２足場（３４２−ＨＳＡ）、およびＨＳＡに融合している二価３４２足場（３４２−３４２−ＨＳＡ）をアッセイした。それぞれの構築物についてのＩＣ５０値を示す。 洗浄血小板に対する凝集アッセイを示す。グラフは、ドナーについての代表的なＡＤＰ誘導凝集陽性対照（それぞれ、上の３つのトレース）ＡＤＰ：０．５μＭ、１μＭ、および２μＭ）を、５ｃ８モノクローナル抗体（６００ｎＭ）および可溶性ヒトＣＤ４０Ｌ（２００ｎＭ）の免疫複合体（ＩＣ）とともに示す。 洗浄血小板に対する凝集アッセイを示す。グラフは、事前形成された３０９−３０９二価足場（ＨＳＡに融合していない）および可溶性ＣＤ４０Ｌの免疫複合体を使用した場合の凝集の欠損を示す。ヒトＣＤ４０Ｌ（可溶性形態）の濃度を６００ｎＭに一定に保持し、足場構築物の濃度を２００ｎＭから８００ｎＭに変動させた。 洗浄血小板に対する凝集アッセイを示す。グラフは、事前形成されたＨＳＡに融合している３４２一価足場および可溶性ヒトＣＤ４０Ｌの免疫複合体を使用した場合の凝集の欠損を示す。ヒトＣＤ４０Ｌ（可溶性形態）の濃度を６００ｎＭに一定に保持し、足場構築物の濃度を１００ｎＭから４００ｎＭに変動させた。グラフは、Ｂｉｏｇｅｎ５ｃ８モノクローナル抗体および可溶性ヒトＣＤ４０Ｌの免疫複合体により誘導された急速な凝集も示す。 ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３ ３０９モノマー足場との複合体中の可溶性ＣＤ４０Ｌの結晶構造のリボン表示を示す。ＣＤ４０Ｌは、トリマー（ポリペプチドＡ、ＢおよびＣ）を形成する。それぞれの３０９足場（ポリペプチドＤ、ＥおよびＦ、丸印）は、２つのＣＤ４０Ｌポリペプチドと接触する。それぞれの３０９足場と第１および第２のＣＤ４０Ｌポリペプチドとの間の特異的接触を列記する。これは、構造の「トップダウン」図である。 ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３ ３１１Ｋ４Ｅ＿１２モノマー足場との複合体中の可溶性ＣＤ４０Ｌの結晶構造のリボン表示を示す。ＣＤ４０Ｌは、トリマー（ポリペプチドＡ、ＢおよびＣ）を形成する。それぞれの３１１Ｋ４Ｅ＿１２モノマー足場（ポリペプチドＤ、ＥおよびＦ、丸印）は、２つのＣＤ４０Ｌポリペプチドと接触する。それぞれの３１１Ｋ４Ｅ＿１２モノマー足場と第１および第２のＣＤ４０Ｌポリペプチドとの間の特異的接触を列記する。これは、構造の「トップダウン」図である。 ３１１Ｋ４Ｅ＿１２および３０９足場（丸印）が、ＣＤ４０Ｌトリマー複合体の異なる部分中に局在する異なるエピトープに結合することを説明するリボン表示を示す。両方の足場は、ＣＤ４０受容体と相互作用する同一の溝中で結合する。これは、構造の「側面」図である。 ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３ ３４２モノマー足場との複合体中の可溶性ＣＤ４０Ｌの結晶構造のリボン表示を示す。１つのみのＣＤ４０Ｌおよび１つの３４２モノマー足場を示す。３４２モノマー足場と第１のＣＤ４０Ｌポリペプチドとの間の特異的接触を列記する。 ３４２および３１１Ｋ４Ｅ＿１２足場が、ＣＤ４０Ｌトリマー複合体の異なる部分中に局在する異なるエピトープに同時に結合し得ることを説明するリボン表示を示す。両方の足場は、ＣＤ４０受容体と相互作用する同一の溝中で結合する。これは、構造の「側面」図である。 図１７Ａに示されるＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３ ３１１Ｋ４Ｅ＿１２モノマー足場（配列番号６８）および可溶性ＣＤ４０Ｌ（配列番号２）分子により形成されるトリマー中のアミノ酸間の接触の局在を示す。それぞれの足場は、２つのＣＤ４０Ｌ分子と接触する。ＣＤ４０Ｌ配列（配列番号２）を示す。点線下線＝細胞質ドメイン；実線下線＝シグナルアンカーＩＩ型膜タンパク質；二重下線＝Ｔｎ３足場と共結晶化した部分；暗色陰影＝Ｔｎ３に接触する第１のＣＤ４０Ｌ上の残基；淡色陰影＝Ｔｎ３に接触する第２のＣＤ４０Ｌ上の残基。 図１７Ｂに示されるＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３ ３０９モノマー足場およびＣＤ４０Ｌトリマー中のアミノ酸間の接触の局在を示す。それぞれの足場は、２つのＣＤ４０Ｌ分子と接触する。ＣＤ４０Ｌ配列（配列番号２）を示す。点線下線＝細胞質ドメイン；実線下線＝シグナルアンカーＩＩ型膜タンパク質；二重下線＝Ｔｎ３足場と共結晶化した部分；暗色陰影＝Ｔｎ３に接触する第１のＣＤ４０Ｌ上の残基；淡色陰影＝Ｔｎ３に接触する第２のＣＤ４０Ｌ上の残基；二重に囲まれた残基は、野生型ＦＧループを有するクローン中で保存されていない可能性が高い３０９足場のＦＧループと接触する。 パネルＡは、サイズ排除Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬカラムからのＴｎ３足場（３０９または３１１Ｋ４Ｅ＿１２）、ＣＤ４０Ｌおよびそれら間の複合体の溶出の例示的クロマトグラムを示す。パネルＢは、３０９−ＣＤ４０Ｌ複合体の結晶を示す。示される結晶は、最大０．１５×０．１５×０．１ｍｍの寸法に成長した。パネルＣは３１１Ｋ４Ｅ＿１２−ＣＤ４０Ｌの複合体の結晶を示す。
定義
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、具体的な組成物またはプロセス工程が変動し得るため、それらに限定されないことを理解すべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が特に明記しない限り、複数参照対象を含むことに留意しなければならない。「ａ」（また「ａｎ」）という用語、ならびに「１つ以上の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書において同義に使用することができる。
さらに、本明細書において使用される「および／または」は、他方を含め、または含めない、２つの規定の特性または構成要素のそれぞれの具体的開示と解釈すべきである。したがって、本明細書の語句、例えば、「Ａおよび／またはＢ」において使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、語句、例えば、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」において使用される「および／または」という用語は、以下の実施形態のそれぞれを包含することが意図される：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。
特に定義の無い限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が関連する分野の当業者により一般に理解されているものと同一の意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本発明において使用されている多くの用語の一般的辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞、および記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）により認められた形態で示される。数値の範囲は、範囲を定義する数値を含む。特に記載の無い限り、アミノ酸配列は、左から右へアミノからカルボキシの方向へ記述される。本明細書において提供される表題は、本発明の種々の態様または実施形態を限定するものではなく、それらは明細書への全体としての参照により把握することができる。したがって、直後に定義される用語は、明細書への全体としての参照により、より完全に定義される。
実施形態が、本明細書において「〜を含む」という用語を用いて記載される場合は常に、「〜からなる」および／または「本質的に〜からなる」の用語で記載される他の点で類似の実施形態も提供されることが理解される。
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨されているそれらの一般に公知の３文字記号または１文字記号のいずれかにより参照される。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般に認められている１文字コードにより参照される。
本明細書において使用される「エピトープ」という用語は、本発明の足場に結合し得るタンパク質決定因子を指す。エピトープは、通常、化学的に活性な表面分子集団、例えば、アミノ酸または糖側鎖からなり、通常、特異的三次元構造特性、および特異的電荷特性を有する。立体構造および非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下で立体構造エピトープへの結合が失われ、非立体構造エピトープへの結合は失われない点で区別される。
「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦｎＩＩＩ）ドメイン」、「ＦｎＩＩＩドメイン」および「ＦｎＩＩＩ足場」という用語は、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに相同なポリペプチドを指し、これは少なくとも７つのベータ鎖を有し、それらのベータ鎖は２つのベータシート間に分布し、それら自体で互いに集合してタンパク質のコアを形成し、さらにベータ鎖を相互に連結する溶媒露出ループを含有する。ベータシートサンドイッチのそれぞれの端部に少なくとも３つのこのようなループが存在し、この端部は、ベータ鎖の方向に垂直なタンパク質の境界である。ある特定の実施形態において、ＦｎＩＩＩドメインは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧと命名される６つのループ領域に結合しているＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと命名される７つのベータ鎖を含み、ループ領域は、それぞれのベータ鎖を連結する。
本明細書において使用される「Ｔｎ３足場」という用語は、少なくとも１つのＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は、配列番号１１を含み、Ｂベータ鎖は、配列番号１２を含み、Ｃベータ鎖は、配列番号１３または１４を含み、Ｄベータ鎖は、配列番号１５を含み、Ｅベータ鎖は、配列番号１６を含み、Ｆベータ鎖は、配列番号１７を含み、ベータ鎖Ｇは、配列番号１８を含み、少なくとも１つのループは、「親Ｔｎ３足場」中のループの非天然バリアントである分子を指す。ある実施形態において、Ｔｎ３分子のベータ鎖の１つ以上は、Ｃベータ鎖（例えば、配列番号１３のシステインも１４のシステインも）およびＦベータ鎖（配列番号１７）のシステイン残基が置換されていないことを除き少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
本明細書において使用される「親Ｔｎ３」という用語は、配列番号３を含むＦｎＩＩＩ足場、すなわち、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインに由来する熱安定化システイン遺伝子操作ＦｎＩＩＩ足場を指す。
「マルチマー」または「マルチマー足場」という用語は、会合する少なくとも２つのＦｎＩＩＩ足場を含む分子を指す。マルチマー足場を形成する足場は、それぞれの足場が独立して機能することを可能とするリンカーを介して結合していてよい。
「モノマー」、「モノマーサブユニット」または「モノマー足場」という用語は、１つのみのＦｎＩＩＩ足場を含む分子を指す。
本明細書において使用される「ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニット」という用語は、ＣＤ４０Ｌまたはその断片、例えば、ＣＤ４０Ｌの可溶性形態に特異的に結合する、「親Ｔｎ３」に由来するＴｎ３モノマーを指す。
「ＤＮＡ」という用語は、２つ以上の共有結合している天然または改変デオキシリボヌクレオチドの配列を指す。
「融合タンパク質」という用語は、（ｉｉ）第２の異なるタンパク質（すなわち、「異種」タンパク質）に結合している（ｉ）本発明の１つ以上の足場を含むタンパク質を指す。
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本発明において「異種部分」という用語は、本発明の足場への組成物の添加を示すために使用され、その組成物は、ＦｎＩＩＩドメインの通常の部分ではない。例示的な異種部分には、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、薬物、毒素、造影剤、放射性化合物、有機および無機のポリマー、ならびにＦｎＩＩＩドメイン自体に固有ではない活性を提供し得る任意の他の組成物、例として、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、細胞傷害剤、放射性核種、造影剤、ビオチン、ダイマー化ドメイン（例えば、ロイシンジッパードメイン）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）もしくはそのＦｃＲｎ結合部分、抗体のドメインもしくは断片（例えば、抗体可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、Ｃカッパドメイン、Ｃラムダドメイン、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメイン）、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、ＩｇＧ分子、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩ足場、エピトープタグ、組換えポリペプチドポリマー、サイトカインなどが含まれる。
本明細書において使用される「リンカー」という用語は、２つ以上の足場を結合またはこれらを連結する任意の分子集合体を指す。リンカーは、機能が足場中のモジュール間の「スペーサー」として作用することである分子であり得、または追加の機能を有する分子（すなわち、「機能的部分」）でもあり得る。「異種部分」の定義に含まれる分子もリンカーとして機能し得る。
「結合している」および「融合している」という用語は、同義に使用される。これらの用語は、あらゆる手段、例として、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段により２つ以上の足場、異種部分、またはリンカーを一緒に結合することを指す。
「ドメイン」または「タンパク質ドメイン」という用語は、多くの場合、タンパク質の残部と独立して安定な三次元構造にフォールドし得、特定の機能を付与することができるタンパク質の領域を指す。この構造は、元のタンパク質内のドメインの機能に関連する規定の機能、例えば、酵素活性、別の分子についての認識モチーフの作出またはタンパク質が、タンパク質の特定の環境中で存在するために必要な構造構成要素を提供することを維持する。タンパク質ファミリーおよび関連タンパク質スーパーファミリーの両方の中で、タンパク質ドメインは、進化的に保存された領域であり得る。マルチマー足場の構成要素を記載する場合、「ドメイン」、「モノマー足場」、「モノマーサブユニット」および「モジュール」という用語は同義に使用することができる。「ネイティブＦｎＩＩＩドメイン」は、生物によりコードされる任意の非組換えＦｎＩＩＩドメインを意味する。
「タンパク質配列」または「アミノ酸配列」は、アミノ末端からカルボキシル末端方向のポリペプチド中のアミノ酸成分の直鎖状表示を意味し、その表示中で相互に隣接する残基は、ポリペプチドの一次構造中で連続する。
「核酸」という用語は、任意の２つ以上の共有結合しているヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体または誘導体を指す。本明細書において使用されるこの用語には、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡが含まれる。「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において同義に使用される。
「ポリヌクレオチド」という用語は、単一の核酸および複数の核酸を包含することが意図され、単離核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。「単離」核酸またはポリヌクレオチドという用語は、自然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。例えば、ベクター中に含有される例えば本発明の足場をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されているとみなされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞中に維持された組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の（部分的にまたは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離ＲＮＡ分子には、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物が含まれる。本発明による単離ポリヌクレオチドまたは核酸には、合成により産生されたそのような分子がさらに含まれる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節エレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターであり得、またはそれらを含み得る。
「薬学的に許容可能な」という用語は、顕著な医学的悪影響を示さず動物（例えば、哺乳動物）に投与することができる化合物またはタンパク質を指す。
「生理学的に許容可能な担体」という用語は、治療されている宿主に顕著な有害な影響を与えず、ともに投与される化合物の治療特性を保持する担体を指す。１つの例示的な生理学的に許容可能な担体は、生理食塩水である。他の生理学的に許容可能な担体およびその配合物は当業者には公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（１８ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ），ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．に記載されている。
「ポリペプチド」は、長さ、翻訳後修飾、または機能にかかわらず、アミド結合（ペプチド結合）により直鎖状に結合している２つ以上のアミノ酸の任意の配列を意味する。「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において同義に使用される。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、またはオリゴペプチドは、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかに代え、またはそれらと同義的に使用することができる。「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例として、限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク分解性開裂、または非天然アミノ酸による修飾の産物を指すことも意図される。ポリペプチドは、天然生物源に由来し得、または組換え技術により産生することができるが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳される必要はない。ポリペプチドは、任意の様式で、例として化学合成により生成することができる。
本発明のポリペプチドとして、上記のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、またはバリアント、およびそれらの任意の組合せも含まれる。バリアントは、天然でも非天然でもよい。非天然バリアントは、当分野において公知の変異誘発技術を使用して産生することができる。バリアントポリペプチドは、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。「誘導体」として、２０種の標準アミノ酸の１つ以上の天然アミノ酸誘導体を含有するペプチドも含まれる。
「ランダム化された」または「突然変異した」は、テンプレート配列に対して１つ以上のアミノ酸変化、例として、欠失、置換または付加を含むことを意味する。「ランダム化する」または「突然変異させる」は、このようなアミノ酸変化を配列中に導入するプロセスを意味する。ランダム化または突然変異は、一般に、核酸コード配列の意図的、ブラインド、または自発的配列変化を介して達成することができ、任意の技術、例えば、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲ、または化学的ＤＮＡ合成により行うことができる。「ランダム化する」、「ランダム化された」、「突然変異させる」、「突然変異した」などの用語は、本明細書において同義に使用される。
「コグネート」または「コグネート非突然変異タンパク質」は、バリアントタンパク質がランダム化または突然変異導入される場合のバリアントタンパク質中に導入されたアミノ酸突然変異を除き、バリアントタンパク質に対する配列が同一であるタンパク質を意味する。
「ＲＮＡ」は、２つ以上の共有結合している天然または改変リボヌクレオチドの配列を意味する。この用語に含まれる改変ＲＮＡの一例は、ホスホロチオエートＲＮＡである。
本明細書において使用される１つまたは複数の「本発明の足場」という用語は、マルチマーＴｎ３足場およびモノマーＴｎ３足場を指す。「標的」という用語は、本発明の特異的足場により認識される化合物を指す。「標的」および「抗原」という用語は、本明細書において同義に使用される。例えば、本明細書において使用される「特異的に結合する」または「特異的結合」という用語中の「特異的」という用語は、本発明のＴｎ３足場が１つ以上の抗原結合ドメインを介して１つ以上の抗原に結合する相対的親和性を指し、その結合は１つ以上の抗原結合ドメインと１つ以上の抗原の間のいくらかの相補性を必要とする。この定義によれば、本発明のＴｎ３足場は、ランダムな非関連エピトープに結合するよりも容易にエピトープに結合する場合、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。
「親和性成熟」足場は、変化を有さない親Ｔｎ３足場と比較してエピトープについてのＴｎ３足場の親和性の改善をもたらす一般にループ中の１つ以上の変化を有する足場である。
本明細書において使用される「親和性」という用語は、本発明のあるＴｎ３足場の個々のエピトープへの結合の強度の尺度を指す。
本明細書において使用される「アビディティー」という用語は、本発明のＴｎ３足場集団とあるエピトープとの間の複合体の全体的安定性、すなわち、機能的に組み合わされた複数のＴｎ３足場の抗原との結合強度を指す。アビディティーは、個々の抗原結合ドメインの特異的エピトープとの親和性、およびさらには本発明の足場の価数の両方に関連する。
「標的に対する作用」という用語は、本発明のＴｎ３足場の１つ以上の標的への結合、およびこのような結合から得られる生物学的効果を指す。この点に関して、Ｔｎ３足場中の複数の抗原結合単位は、種々の標的および／またはエピトープと相互作用し得、例えば、２つの標的を物理的により接近させ、区別される標的との相互作用を介して代謝カスケードを誘発させるなどし得る。ＣＤ４０Ｌに関して、「標的に対する作用」は、例えば、ＣＤ４０Ｌの１つ以上の生物学的活性の向上、刺激または活性化により達成される効果を指す。
本明細書において使用される「価数」という用語は、潜在的な抗原結合モジュールの数、例えば、多くの本発明の足場中のＦｎＩＩＩモジュールの数を指す。本発明のＴｎ３足場が２つ以上の抗原結合モジュールを含む場合、それぞれの結合モジュールは、例えば、同一の標的または異なる標的中の同一エピトープまたは異なるエピトープに特異的に結合し得る。
本明細書において使用される「ジスルフィド結合」という用語は、２つの硫黄原子間で形成された共有結合を含む。アミノ酸システインは、第２のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成し得るチオール基を含む。
「免疫グロブリン」および「抗体」という用語は、生化学的に区別することができる種々の広範なクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類されることを認識する。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして決定するのは、この鎖の性質である。これらのクラスのそれぞれの改変形は、当業者には容易に識別可能である。本明細書において使用される「抗体」という用語には、限定されるものではないが、インタクト抗体、改変抗体、抗体ＶＬまたはＶＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、Ｃカッパドメイン、Ｃラムダドメイン、Ｆｃドメイン（以下参照）、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメインが含まれる。
本明細書において使用される「Ｆｃドメイン」ドメインという用語は、抗体定常領域の一部を指す。慣習的に、Ｆｃドメインという用語は、抗体の対合されたＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域を包含するプロテアーゼ（例えば、パパイン）開裂産物を指す。本開示に関して、ＦｃドメインまたはＦｃという用語は、産生の手段にかかわらず、免疫グロブリンポリペプチドのＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域の全部または一部を含む任意のポリペプチド（またはこのようなポリペプチドをコードする核酸）を指す。
本明細書において使用される「改変抗体」という用語には、非天然の、例えば、少なくとも２つの重鎖部分を含むが、２つの完全な重鎖を含まない抗体（例えば、ドメイン欠失抗体またはミニボディーのような）となるように変化させた合成形態の抗体；２つ以上の抗原または単一抗原の異なるエピトープに結合するように変化させた多重特異的形態の抗体（例えば、二重特異性、三重特異性など）が含まれる）。さらに、「改変抗体」という用語には、多価形態の抗体（例えば、三価、四価など、同一抗原の３つ以上のコピーに対する抗体）が含まれる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＆ Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，２０１０，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ参照）。
「インビボ半減期」という用語は、その通常の意味、すなわち、ポリペプチドの生物学的活性の５０％が身体／標的器官中に依然として存在する時間、またはポリペプチドの活性がその初期値の５０％になる時間の意味で使用される。機能的インビボ半減期を測定する代替法として、「血清半減期」、すなわち、クリアランスされる前、ポリペプチド分子の５０％が血漿または血流中を循環する時間を測定することができる。血清半減期の測定は、機能的インビボ半減期の測定よりも簡単なことが多く、血清半減期の大きさは、通常、機能的インビボ半減期の大きさの良好な指標である。血清半減期の代替用語には、「血漿半減期」、循環（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）半減期、循環（ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ）半減期、血清クリアランス、血漿クリアランス、およびクリアランス半減期が含まれる。保持すべき機能は、通常、凝血促進性、タンパク分解性、補因子結合、受容体結合活性、または特定のタンパク質に関連する他の型の生物学的活性から選択される。
機能的インビボ半減期または血漿半減期に関する「増加した」という用語は、ポリペプチドの関連する半減期が参照分子（例えば、非改変ポリペプチド）のそれと比べて同等の条件下で測定して統計的に有意に増加することを示すために使用される。
機能的インビボ半減期または血漿半減期に関する「減少した」という用語は、ポリペプチドの関連する半減期が参照分子（例えば、非改変ポリペプチド）のそれと比べて同等の条件下で測定して統計的に有意に減少することを示すために使用される。
本明細書において使用される「発現」という用語は、遺伝子が生化学物質、例えば、本発明の足場またはその断片を産生するプロセスを指す。このプロセスは細胞内の遺伝子の機能的存在の任意の顕在化、例として、限定されるものではないが、遺伝子ノックダウンならびに一過的発現および安定的発現の両方を含む。限定されるものではないが、それは遺伝子の１つ以上のｍＲＮＡへの転写、およびこのようなｍＲＮＡの１つ以上のポリペプチドへの翻訳を含む。最終所望産物が生化学物質である場合、発現は、その生化学物質および任意の前駆体の作出を含む。
「発現産物」は、核酸、例えば、遺伝子の転写により産生されるメッセンジャーＲＮＡ、またはポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載の発現産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を受けた核酸、または転写後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク分解性開裂などを受けたポリペプチドをさらに含む。
本明細書において使用される「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、本発明により宿主細胞中に導入し、所望発現産物を発現させるためのビヒクルとして使用されるベクターを意味するために使用される。当業者に公知であるとおり、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から容易に選択することができる。一般に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、所望核酸のクローニングを容易にするための適切な制限酵素部位、ならびに真核または原核細胞中への流入能および／またはその中での複製能を含む。
「宿主細胞」という用語は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築され、少なくとも１つの発現産物をコードするベクターを保有する細胞を指す。組換え宿主から発現産物を単離するプロセスの記載において、特に明記の無い限り、「細胞」および「細胞培養物」という用語は、発現産物の源を示すために同義に使用され、すなわち、「細胞」からの発現産物の回収は、遠心沈殿全細胞からの回収、または培地および懸濁細胞の両方を含有する細胞培養物からの回収のいずれかを意味する。
本明細書において使用される「治療する」または「治療」という用語は、治療法上の治療および防止または予防措置の両方を指し、その目的は、対象における不所望な生理学的変化または障害、例えば、炎症性疾患または病態の進行を予防し、または減速させる（弱める）ことである。有益または所望臨床的結果には、限定されるものではないが、検出可能か検出不可能かにかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の縮小、病状の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進行の遅滞化または遅延、病状の改善または緩和、および寛解（部分または完全を問わない）が含まれる。
「治療」という用語は、治療を受けていない場合に予期される生存に比べての生存の延長も意味する。治療が必要とされる者には、既に病態もしくは障害を有する者および病態もしくは障害を有する傾向がある者、または病態もしくは障害を予防すべき者が含まれる。
「対象」、「個体」、「動物」、「患者」、または「哺乳動物」という用語は、診断、予後診断、または治療が望まれる任意の個体、患者または動物、特に、哺乳動物の対象を指す。哺乳動物の対象には、ヒト、ドメスティックアニマル、家畜、および動物園の動物、競技用動物または愛玩動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシなどが含まれる。
本明細書において使用される「ＣＤ４０Ｌ」という用語は、限定されるものではないが、Ｔ細胞の表面上で発現されたＣＤ４０Ｌ、組換え発現されたＣＤ４０Ｌ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または他の好適な組換えタンパク質発現系から発現および精製されたＣＤ４０Ｌ、非グリコシル化ＣＤ４０Ｌ、ならびにＣＤ４０Ｌの可溶性断片を指す。本明細書において使用される「ＣＤ４０Ｌ」は、ＭｅｇａＣＤ４０Ｌも指す。ＭｅｇａＣＤ４０Ｌ（商標）は、２つのトリマーＣＤ４０リガンドがＡＣＲＰ３０／アディポネクチンのコラーゲンドメインを介して人工的に結合している高活性構築物である。この構築物は、インビボでのＣＤ４０Ｌの天然膜支援凝集を極めて効率的にシミュレートする。これは、［ＣＤ４０Ｌ＋エンハンサー］組合せ（Ａｌｅｘｉｓ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の簡易で均等に強力な代替物を提供する。「ＣＤ４０Ｌ」という用語は、ＣＤ４０Ｌのモノマー形態およびオリゴマー形態、例えば、トリマーＣＤ４０Ｌを指す。
「ＣＤ４０Ｌ」という用語は、全長ＣＤ４０Ｌおよび可溶性断片、例えば、タンパク質分解から得られるＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン形態の両方を指す。ヒトＣＤ４０Ｌ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｐ２９９６５）の膜結合および可溶性形態のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および配列番号２に示す。
「ＣＤ４０Ｌアンタゴニスト」または「アンタゴニスト」という用語は、最も広い意味で使用され、それには、インビトロ、インサイチュー、またはインビボにおいてＣＤ４０Ｌの１つ以上の生物学的活性を部分的または完全に阻害し、減少させまたは不活性化させる任意の分子、および生物学的に活性なそのバリアントが含まれる。例えば、ＣＤ４０Ｌアンタゴニストは、ＣＤ４０Ｌへのその結合の結果として、インビボ、インビトロまたはインサイチューにおいて１つ以上のＣＤ４０Ｌ分子、またはＣＤ４０もしくは他の標的に結合している１つ以上のＣＤ４０Ｌ分子の１つ以上の生物学的活性を部分的または完全に阻害し、減少させまたは不活性化させるように機能し得る。
「ＣＤ４０Ｌアゴニスト」または「アゴニスト」という用語は、最も広い意味で使用され、それには、インビトロ、インサイチュー、またはインビボにおいてＣＤ４０Ｌの１つ以上の生物学的活性を部分的または完全に向上させ、刺激しまたは活性化させる任意の分子、および生物学的に活性なそのバリアントが含まれる。例えば、ＣＤ４０Ｌアゴニストは、ＣＤ４０Ｌへのその結合の結果として、インビボ、インビトロまたはインサイチューにおいて１つ以上のＣＤ４０Ｌ分子、またはＣＤ４０Ｒもしくは他の標的に結合している１つ以上のＣＤ４０Ｌ分子の１つ以上の生物学的活性を部分的または完全に向上させ、刺激しまたは活性化させるように機能し得る。
本明細書において使用される「結晶」という用語は、原子が三次元で周期的に繰り返すパターンで配置され、典型的には格子を形成する物質の固体状態の一形態を指す。
本明細書において使用される「空間群対称性」という用語は、結晶格子の並進対称性を点群対称性と組み合わせる結晶の全対称性を指す。「空間群」は、格子群を識別する大文字（Ｐ、Ａ、Ｆなど）に続く回転および反射要素がらせん軸および映進面を含むように拡張される点群記号により指定される。所与の空間群についての点群対称性は、空間群の格子中心記号を除去し、全てのらせん軸を類似の回転軸により置き換え、全ての映進面を鏡面により置き換えることにより決定することができることが留意されたい。空間群についての点群対称性は、その逆格子の真の対称性を説明する。
本明細書において使用される「単位格子」という用語は、規則的な繰り返しパターンで配置される結晶中の原子を意味し、それにおいて最小繰り返し単位が単位格子と称される。構造全体を、３つの長さ（ａ、ｂ、およびｃ）および３つの角度（α、β、およびγ）により特性決定される単位格子の情報から再構築することができる。量ａおよびｂは、格子の底辺の長さであり、γは、これら２辺間の角度である。量ｃは、単位格子の高さである。角度αおよびβは、単位格子の底辺と垂直辺との間の角度を説明する。
本明細書において使用される「機械可読データ保存媒体」という用語は、機械可読データが符号化されたデータ保存材料であって、機械がこのようなデータを使用するための命令によりプログラムされ、データを所望のフォーマット、例えば、分子または分子複合体のグラフ三次元表示で表示し得るデータ保存材料を意味する。
「Ｘ線回折パターン」という用語は、結晶中の分子または原子の周期的集合体のＸ線散乱から得られるパターンを意味する。Ｘ線結晶学は、Ｘ線が結晶により回折される事実を利用する技術である。Ｘ線は、同等サイズの原子の電子雲により散乱される適正な波長（オングストローム範囲、約１０−８ｃｍ）を有する。結晶中の分子または原子の周期的集合体のＸ線散乱から得られる回折パターンに基づき、電子密度を再構築することができる。追加の位相情報は、回折データからまたは再構築を完了させるための補足回折実験から抽出することができる（結晶学の位相問題）。モデルを実験的電子密度に進行的に組み込み、データに対してリファインして正確な分子構造を取得する。Ｘ線構造座標は、空間中の点の特有の構成を定義する。当業者は、タンパク質またはタンパク質−リガンド複合体、またはその一部についての構造座標の集合が相対的な点集合を定義し、次いでそれが三次元中の構成を定義することを理解する。類似または同一の構成を、全く異なる座標の集合により定義することができ、但し、座標間の距離および角度が本質的に同一のままであることを条件とする。さらに、点の構成は、座標間の距離をスカラー因子により増加または減少させる一方、角度を本質的に同一に保持することにより定義することができる。
本明細書において使用される「結晶構造」という用語は、結晶質材料中の繰り返し原子または分子単位の三次元または格子間隔配置を指す。結晶質材料の結晶構造は、Ｘ線結晶学的方法により決定することができ、例えば、“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｘ−Ｒａｙ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ”ｂｙ Ｊａｎ Ｄｒｅｎｔｈ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｘｔｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９９，ＩＳＢＮ：０３８７９８５８７５、および“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ”ｂｙ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｏｃｔ．１８，２００２，ＩＳＢＮ：０４７１２５１２２４参照。
「エフェクター機能」という用語は、抗体または抗体のＦｃ領域（ネイティブＦｃ領域またはアミノ酸配列バリアントＦｃ領域）に起因する抗体断片のそれらの生物学的活性を指し、抗体アイソタイプにより変動する。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節；およびＢ細胞活性化が含まれる。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」という用語は、ある細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合した分泌Ｉｇが、それらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、続いて標的細胞を細胞毒素により殺傷することを可能とする細胞傷害の形態を指す。
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明する。ＦｃＲは、ネイティブ配列ヒトＦｃＲであり得る。ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合し得、それにはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体、例として、これらの受容体のアレルバリアントおよび代替スプライシング形態が含まれる。この用語には、新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる。
「コンセンサス配列」という用語は、複数の配列がアラインされた後に特定位置における最も共通するアミノ酸を示すタンパク質配列を指す。コンセンサス配列は、関連配列が互いに比較される多重配列アラインメントの結果を表す手法である。コンセンサス配列は、それぞれに位置におけるアラインメント中でどの残基が最も豊富であるか、およびそれぞれの位置における変動性の程度を示す。
緒言
ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４、ＣＤ４０リガンド、ｇｐ３９またはＴＢＡＭとしても公知）は、３３ｋＤａのＩＩ型膜糖タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２９９６５）である。さらに、より短い１８ｋＤａのＣＤ４０Ｌ可溶性形態が存在する（ｓＣＤ４０Ｌまたは可溶性ＣＤ４０Ｌとしても公知）。これらのＣＤ４０Ｌの可溶性形態は、膜結合タンパク質のタンパク質分解プロセシングにより生成されるが、可溶性種の細胞活性は、より高次のオリゴマー化（例えば、トリマー化）を除き弱い。
本発明は、ＣＤ４０Ｌに結合し得る組換え非天然タンパク質足場（Ｔｎ３足場）のファミリーを提供する。特に、本明細書に記載のタンパク質は、抗体可変領域の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）に相似の定義されたループをディスプレイするために使用することができる。これらのループは、ランダム化または制限進化（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）に供して多数の標的化合物に結合し得る多様性を生成することができる。Ｔｎ３足場は、モノマーとして使用することができ、またはＣＤ４０Ｌに結合し得るマルチマー足場にアセンブルすることができる。
具体的な実施形態において、本発明は、疾患、例えば、限定されるものではないが、自己免疫疾患の予防改善、検出、診断、またはモニタリングに有用なＣＤ４０Ｌ特異的結合剤を提供する。他の具体的な実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、自己免疫疾患および病態の治療に有用である。一部の実施形態において、自己免疫疾患には、限定されるものではないが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および同種移植片拒絶反応が含まれ得る。
本発明のＴｎ３足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合が遺伝子操作されたヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインに由来するＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。本発明のＴｎ３足場を構成するモノマーサブユニットは、互いに独立して正確にフォールドし、それらの結合特異性および親和性を保持し、モノマー足場のそれぞれは、その機能特性を保持する。モノマーサブユニットが高い価数のマルチマーＴｎ３足場にアセンブルされる場合、モノマーサブユニットは、互いに独立して正確にフォールドし、それらの結合特異性および親和性を保持し、モノマーのそれぞれはその機能特性を保持する。
２つ以上のモノマーサブユニットを含む本発明のＴｎ３足場は、複数のエピトープに結合し得、例えば、（ｉ）単一標的中の複数のエピトープに結合、（ｉｉ）複数の標的中の単一エピトープに結合、（ｉｉｉ）１つの標的の異なるサブユニット上に局在する複数のエピトープに結合、または（ｉｖ）複数の標的上の複数のエピトープに結合し得、したがってアビディティーを増加させる。
さらに、リンカーを介する複数のモノマー間の距離を変動させる可能性に起因して、マルチマーＴｎ３足場は、表面上（同一細胞／表面上または異なる細胞／表面中）の複数の標的分子に結合し得る。本発明のＴｎ３マルチマー足場は、２つ以上の標的へのそれらの自発結合能の結果として、複数の経路をモジュレートするため、細胞表面上の受容体を架橋するため、別個の細胞上の細胞表面受容体を結合させるため、および／または標的分子もしくは細胞を基質に結合させるために使用することができる。
さらに、本発明は、規定の標的についての足場の親和性が突然変異を介してモジュレートされる親和性成熟足場を提供する。さらに、本発明は、本発明の足場を産生する方法および所望の物理化学的、薬理学的、または免疫学的特性を有するように足場を遺伝子操作する方法を提供する。さらに、本発明は、治療、防止、および診断使用のための、このような足場および方法についての使用を提供する。
ＦｎＩＩＩ構造モチーフ
本発明のＴｎ３足場は、生物およびウイルス、ならびに多数のタンパク質クラスの３つ全ての領域にわたり広く見出されているドメインであるＩＩＩ型フィブロネクチンモジュール（ＦｎＩＩＩ）の構造をベースとする。具体的な実施形態において、本発明の足場は、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインに由来する（国際公開第２００９／０５８３７９号パンフレットとして公開されている国際出願第国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１２３９８号明細書；国際公開第２０１１／１３０３２４号パンフレットとして公開されているＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３２１８４号明細書；および国際公開第２０１１１３０３２８号パンフレット参照として公開されている国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３２１８８号明細書）。
１つの具体的な実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、親Ｔｎ３足場に由来するＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。モノマーの全三次元フォールドは、ラクダおよびラクダ科（例えば、ラマ）の単一ドメイン抗体中で抗原認識単位全体を含む最小機能抗体断片の重鎖の可変領域（ＶＨ）のそれと密接に関連する。
本発明のＴｎ３モノマーサブユニットおよびテネイシンＣからのネイティブＦｎＩＩＩドメインは、同一の三次元構造、すなわち、６つのループ領域により連結されている、一方の側面上の３つのベータ鎖（Ａ、Ｂ、およびＥ）および他方の側面上の４つのベータ鎖（Ｃ、Ｄ、Ｆ、およびＧ）を有するベータサンドイッチ構造を特徴とする。これらのループ領域は、それぞれのループのＮおよびＣ末端に連結されているベータ鎖に従って命名される。したがって、ＡＢループは、ベータ鎖ＡＢ間に局在し、ＢＣループは、鎖ＢＣ間に局在し、ＣＤループは、ベータ鎖ＣＤ間に局在し、ＤＥループは、ベータ鎖ＤＥ間に局在し、ＥＦループは、ベータ鎖ＥＦ間に局在し、ＦＧループは、ベータ鎖ＦＧ間に局在する。ＦｎＩＩＩドメインは、高い親和性で特異的標的に結合し得るタンパク質足場の多様なプールの生成を容易にする、ランダム化にトレラントな溶媒露出ループを有する。
本発明の一態様において、Ｔｎ３モノマーサブユニットは、抗体可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）に相似のループの１つ以上をランダム化するように設計される指向進化に供される。このような指向進化アプローチは、関心対象の標的、例えば、ＣＤ４０Ｌについて高い親和性を有する抗体様分子の産生をもたらす。
さらに、一部の実施形態において、本発明に記載のＴｎ３足場は、定義される露出ループ（例えば、既にランダム化され、標的結合に基づき選択されたループ）をディスプレイしてこのような導入ループに結合する分子の進化を指向するために使用することができる。この型の選択は、任意の個々のＣＤＲ様ループについての、または非線形エピトープ結合部分に合わされた２つもしくは３つ全てのＣＤＲ様ループの認識についての認識分子を同定するために実施することができる。特異的標的結合を付与し得る３つのループ（ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧと命名）の組は、それぞれＢＣ鎖間；ＤＥ鎖間、およびＦＧベータ鎖間に及ぶ。ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインのＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループは、それぞれ９、６、および１０アミノ酸残基長である。これらのループの長さは、抗体重鎖中に見出されるコグネート抗原認識ループの狭い範囲内、すなわち、それぞれ７〜１０、４〜８、および４〜２８アミノ酸長に収まる。同様に、ループの第２の組であるＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループ（それぞれ、７、７、および８アミノ酸長）は、それぞれＡＢベータ鎖間；ＣＤベータ鎖間；およびＥＦベータ鎖間に及ぶ。
Ｔｎ３モノマー足場中のループは、ランダム化され、標的への高親和性結合について選択されると、抗体中のコグネートＣＤＲループの接触に等価の標的との接触をなし得る。したがって、一部の実施形態において、ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループは、ランダム化され、１つ以上の標的、例えば、ＣＤ４０Ｌへの高親和性結合について選択される。一部の実施形態において、このランダム化および選択プロセスをＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループのランダム化と並行して実施することができる一方、他の実施形態において、このランダム化および選択プロセスは連続して実施される。
ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニット
本発明は、複数のループ領域に結合している複数のベータ鎖ドメインを含むＣＤ４０Ｌ特異的組換え非天然Ｔｎ３足場であって、前記ループ領域の１つ以上は、野生型Ｔｎ３（配列番号３）（表１参照）中のコグネートループからの少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換または付加により変動するＴｎ３足場を提供する。
新規結合特性を有する改善されたＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３モノマーサブユニットを生成するため、親Ｔｎ３は、アミノ酸付加、欠失または置換に供される。ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３モノマーサブユニットの配列を親Ｔｎ３の配列と比較する場合、ベータ鎖およびループの同一の定義が利用されることが理解される。一部の実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３モノマーサブユニットは、アミノ酸配列：
ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＥＴＦＴＴ
（式中、
（ａ）ＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループの配列中に存在するアミノ酸残基を表し；
（ｂ）Ｘ１は、アミノ酸残基アラニン（Ａ）またはトレオニン（Ｔ）を表し；
（ｃ）ループの長さｎは、２から２６の整数である）
を含む。
Figure 2017195884
一部の実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３モノマーサブユニットは、アミノ酸配列：
ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＥＴＦＴＴ
（式中、
（ａ）ＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループの配列中に存在するアミノ酸残基を表し；
（ｂ）Ｘ１は、アミノ酸残基アラニン（Ａ）またはトレオニン（Ｔ）を表し；
（ｃ）ループの長さｎは、２から２６の整数である）
からなる。
一実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３モノマー足場のベータ鎖は、親Ｔｎ３足場（配列番号３）のベータ鎖と少なくとも９０％の配列同一性を有する。配列同一性のこのような割合を計算するため、当分野において公知の方法を適用してアミノ酸配列をアラインする。配列同一性の割合は、（ａ）配列アラインメント中で同一であるベータ鎖中に局在するアミノ酸の数と、（ｂ）ベータ鎖中に局在するアミノ酸の総数との比として定義される。
一実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号４または配列番号１３６を含む。別の実施形態において、ＣＤループの配列は、配列番号６を含む。別の実施形態において、ＥＦループの配列は、配列番号８または配列番号１３７を含む。一実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号４または配列番号１３６からなる。別の実施形態において、ＣＤループの配列は、配列番号６からなる。別の実施形態において、ＥＦループの配列は、配列番号８または配列番号１３７からなる。
一実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２および９３からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２および９３からなる群から選択される配列からなる。
一実施形態において、ＤＥループの配列は、配列番号９４、９５、９６、９７および９８からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態において、ＤＥループの配列は、配列番号９４、９５、９６、９７および９８からなる群から選択される配列からなる。
一実施形態において、ＦＧループの配列は、配列番号９、９９、および１３９からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態において、ＦＧループの配列は、配列番号９、９９、および１３９からなる群から選択される配列からなる。
一実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６および１１７からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６および１１７からなる群から選択される配列からなる。
一部の実施形態において、ＤＥループの配列は、配列番号１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７および１２８からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、ＤＥループの配列は、配列番号１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７および１２８からなる群から選択される配列からなる。
一部の実施形態において、ＦＧループの配列は、配列番号１２９および１３０からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、ＦＧループの配列は、配列番号１２９および１３０からなる群から選択される配列からなる。
一部の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号８３を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９４を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。一部の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号８３からなり、ＤＥループの配列は、配列番号９４からなり、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９からなる。
一部の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号８３を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９４を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９９を含む。他の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号８３からなり、ＤＥループの配列は、配列番号９４からなり、ＦＧループの配列は、配列番号９９からなる。
一部の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号８４を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９５を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。他の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号８４からなり、ＤＥループの配列は、配列番号９５からなり、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９からなる。
一部の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号８５を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９４を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。他の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号８５からなり、ＤＥループの配列は、配列番号９４からなり、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９からなる。
一部の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号８６を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９６を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。他の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号８６からなり、ＤＥループの配列は、配列番号９６からなり、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９からなる。
一部の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号８７を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９７を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。他の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号８７からなり、ＤＥループの配列は、配列番号９７からなり、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９からなる。
一部の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号８８を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９５を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。他の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号８８からなり、ＤＥループの配列は、配列番号９５からなり、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９からなる。
一部の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号８９を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９４を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。他の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号８９からなり、ＤＥループの配列は、配列番号９４からなり、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９からなる。
一部の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号９０を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９４を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。他の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号９０からなり、ＤＥループの配列は、配列番号９４からなり、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９からなる。
一部の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号９１を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９５を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。他の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号９１からなり、ＤＥループの配列は、配列番号９５からなり、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９からなる。
一部の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号９２を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９８を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。他の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号９２からなり、ＤＥループの配列は、配列番号９８からなり、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９からなる。
一部の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号９３を含み、ＤＥループの配列は、配列番号９４を含み、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含む。他の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号９３からなり、ＤＥループの配列は、配列番号９４からなり、ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９からなる。
一部の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号１６８を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１６９を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１７０を含む。他の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号１６８からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１６９からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１７０からなる。
一部の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号１００を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１１８を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号１００からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１１８からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１２９からなる。
一部の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０１を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１１９を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は、配列番号１０１からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１１９からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１２９からなる。
一部の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０２を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２０を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は、配列番号１０２からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１２０からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１２９からなる。
一部の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０３を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２１を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は、配列番号１０３からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１２１からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１２９からなる。
一部の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０４を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２２を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は、配列番号１０４からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１２２からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１２９からなる。
一部の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０５を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２１を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は、配列番号１０５からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１２１からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１２９からなる。
一部の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０６を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２３を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は、配列番号１０６からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１２３からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１２９からなる。
一部の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０７を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２３を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は、配列番号１０７からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１２３からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１２９からなる。
一部の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０８を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１１８を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は、配列番号１０８からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１１８からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１２９からなる。
一部の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０９を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２３を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は、配列番号１０９からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１２３からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１２９からなる。
一部の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は、配列番号１１０を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２１を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は、配列番号１１０からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１２１からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１２９からなる。
一部の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は、配列番号１１１を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２３を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１３０を含む。他の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は、配列番号１１１からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１２３からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１３０からなる。
一部の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は、配列番号１０８を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２１を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は、配列番号１０８からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１２１からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１２９からなる。
一部の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は、配列番号１１２を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２４を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は、配列番号１１２からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１２４からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１２９からなる。
一部の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は、配列番号１１３を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２５を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は、配列番号１１３からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１２５からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１２９からなる。
一部の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は、配列番号１１４を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１１８を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は、配列番号１１４からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１１８からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１２９からなる。
一部の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は、配列番号１１５を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２６を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は、配列番号１１５からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１２６からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１２９からなる。
一部の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は、配列番号１１６を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２７を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は、配列番号１１６からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１２７からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１２９からなる。
一部の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は、配列番号１１７を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１２８を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１２９を含む。他の実施形態において、ＡＢループの配列は、配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は、配列番号１１７からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１２８からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１２９からなる。
一部の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号１７４を含み、ＤＥループの配列は、配列番号１７５を含み、ＦＧループの配列は、配列番号１７７を含む。他の実施形態において、ＢＣループの配列は、配列番号１７４からなり、ＤＥループの配列は、配列番号１７５からなり、ＦＧループの配列は、配列番号１７７からなる。
一部の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および１４６からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および１４６からなる群から選択される配列からなる。
一部の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、配列番号２８または１４６を含む。他の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、配列番号２８または１４６からなる。
一部の実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３モノマーサブユニットは、アミノ酸配列：
ＩＥＶＫＤＶＴＤＴＴＡＬＩＴＷＸ１ＤＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＣＥＬＴＹＧＩＫＤＶＰＧＤＲＴＴＩＤＬＷＸ９ＨＸ１０ＡＸ１１ＹＳＩＧＮＬＫＰＤＴＥＹＥＶＳＬＩＣＲＸ１２ＧＤＭＳＳＮＰＡＫＥＴＦＴＴ（配列番号１６７）
（式中、
（ａ）Ｘ１は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）またはロイシン（Ｌ）を表し；
（ｂ）Ｘ２は、アミノ酸残基アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し；
（ｃ）Ｘ３は、アミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）を表し；
（ｄ）Ｘ４は、アミノ酸残基アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｅ）Ｘ５は、アミノ酸残基グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはアスパラギン（Ｎ）を表し；
（ｆ）Ｘ６は、アミノ酸残基フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｇ）Ｘ７は、アミノ酸残基イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｈ）Ｘ８は、アミノ酸残基グリシン（Ｇ）、トリプトファン（Ｗ）またはバリン（Ｖ）を表し；
（ｉ）Ｘ９は、アミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｊ）Ｘ１０は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、メチオニン（Ｍ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｋ）Ｘ１１は、アミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｌ）Ｘ１２は、アミノ酸残基アルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）を表す）
を含む。
一部の実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３モノマーサブユニットは、アミノ酸配列：
ＩＥＶＫＤＶＴＤＴＴＡＬＩＴＷＸ１ＤＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＣＥＬＴＹＧＩＫＤＶＰＧＤＲＴＴＩＤＬＷＸ９ＨＸ１０ＡＸ１１ＹＳＩＧＮＬＫＰＤＴＥＹＥＶＳＬＩＣＲＸ１２ＧＤＭＳＳＮＰＡＫＥＴＦＴＴ（配列番号１６７）
（式中、
（ａ）Ｘ１は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）またはロイシン（Ｌ）を表し；
（ｂ）Ｘ２は、アミノ酸残基アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し；
（ｃ）Ｘ３は、アミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）を表し；
（ｄ）Ｘ４は、アミノ酸残基アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｅ）Ｘ５は、アミノ酸残基グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはアスパラギン（Ｎ）を表し；
（ｆ）Ｘ６は、アミノ酸残基フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｇ）Ｘ７は、アミノ酸残基イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｈ）Ｘ８は、アミノ酸残基グリシン（Ｇ）、トリプトファン（Ｗ）またはバリン（Ｖ）を表し；
（ｉ）Ｘ９は、アミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｊ）Ｘ１０は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、メチオニン（Ｍ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｋ）Ｘ１１は、アミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｌ）Ｘ１２は、アミノ酸残基アルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）を表す）
からなる。
一部の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、配列番号４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、および８２からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、配列番号４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、および８２からなる群から選択される配列からなる。
一部の実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３モノマーサブユニットは、アミノ酸配列：
ＩＥＶＸ１ＤＶＴＤＴＴＡＬＩＴＷＸ２Ｘ３ＲＳＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＣＥＬＸ１１ＹＧＩＫＤＶＰＧＤＲＴＴＩＤＬＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５ＹＶＨＹＳＩＧＮＬＫＰＤＴＸ１６ＹＥＶＳＬＩＣＬＴＴＤＧＴＹＸ１７ＮＰＡＫＥＴＦＴＴ（配列番号１７１）
（式中、
（ａ）Ｘ１は、アミノ酸残基リジン（Ｋ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し；
（ｂ）Ｘ２は、アミノ酸残基トレオニン（Ｔ）またはイソロイシン（Ｉ）を表し；
（ｃ）Ｘ３は、アミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）またはアラニン（Ａ）を表し；
（ｄ）Ｘ４は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｅ）Ｘ５は、アミノ酸残基チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）またはセリン（Ｓ）を表し；
（ｆ）Ｘ６は、アミノ酸残基チロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｇ）Ｘ７は、アミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｈ）Ｘ８は、アミノ酸残基ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｉ）Ｘ９は、アミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｊ）Ｘ１０は、アミノ酸残基グリシン（Ｇ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｋ）Ｘ１１は、アミノ酸残基アラニン（Ａ）またはトレオニン（Ｔ）を表し；
（ｌ）Ｘ１２は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｒ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｍ）Ｘ１３は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアラニン（Ａ）を表し；
（ｎ）Ｘ１４は、アミノ酸残基プロリン（Ｐ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）またはアラニン（Ａ）またはアミノ酸無しを表し；
（ｏ）Ｘ１５は、アミノ酸残基イソロイシン（Ｉ）またはアミノ酸無しを表し；
（ｐ）Ｘ１６は、アミノ酸残基グルタミン酸（Ｅ）またはリジン（Ｋ）を表し；
（ｑ）Ｘ１７は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）を表す）
を含む。
一部の実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３モノマーサブユニットは、アミノ酸配列：
ＩＥＶＸ１ＤＶＴＤＴＴＡＬＩＴＷＸ２Ｘ３ＲＳＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＣＥＬＸ１１ＹＧＩＫＤＶＰＧＤＲＴＴＩＤＬＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５ＹＶＨＹＳＩＧＮＬＫＰＤＴＸ１６ＹＥＶＳＬＩＣＬＴＴＤＧＴＹＸ１７ＮＰＡＫＥＴＦＴＴ（配列番号１７１）
（式中、
（ａ）Ｘ１は、アミノ酸残基リジン（Ｋ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し；
（ｂ）Ｘ２は、アミノ酸残基トレオニン（Ｔ）またはイソロイシン（Ｉ）を表し；
（ｃ）Ｘ３は、アミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）またはアラニン（Ａ）を表し；
（ｄ）Ｘ４は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｅ）Ｘ５は、アミノ酸残基チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）またはセリン（Ｓ）を表し；
（ｆ）Ｘ６は、アミノ酸残基チロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｇ）Ｘ７は、アミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｈ）Ｘ８は、アミノ酸残基ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｉ）Ｘ９は、アミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｊ）Ｘ１０は、アミノ酸残基グリシン（Ｇ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｋ）Ｘ１１は、アミノ酸残基アラニン（Ａ）またはトレオニン（Ｔ）を表し；
（ｌ）Ｘ１２は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｒ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｍ）Ｘ１３は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアラニン（Ａ）を表し；
（ｎ）Ｘ１４は、アミノ酸残基プロリン（Ｐ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）またはアラニン（Ａ）またはアミノ酸無しを表し；
（ｏ）Ｘ１５は、アミノ酸残基イソロイシン（Ｉ）またはアミノ酸無しを表し；
（ｐ）Ｘ１６は、アミノ酸残基グルタミン酸（Ｅ）またはリジン（Ｋ）を表し；
（ｑ）Ｘ１７は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）を表す）
からなる。
一部の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマー足場は、ベータ鎖の１つ以上が、ＣおよびＦベータ鎖（それぞれ配列番号１３または１４；および配列番号１７）中のシステイン残基が置換され得ないことを除き少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＴｎ３モジュールを含む。
ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットの種々のベータ鎖を連結するループは、長さおよび／または配列多様性についてランダム化することができる。一実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、長さおよび／または配列多様性にについてランダム化された少なくとも１つのループを有する。一実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つのループが、長さおよび／または配列多様性についてランダム化される。一実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットの少なくとも１つのループは、一定に保持される一方、少なくとも１つの追加のループは、長さおよび／または配列多様性についてランダム化される。別の実施形態において、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てが一定に保持される一方、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てが長さまたは配列多様性についてランダム化される。別の実施形態において、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦのの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つ全てがランダム化される一方、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てが長さおよび／または配列多様性についてランダム化される。さらに別の実施形態において、ループＡＢ、ＣＤ、ＥＦ、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つのループ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つ全てが長さまたは配列多様性についてランダム化される。
一部の実施形態において、ループ内の１つ以上の残基が一定に保持される一方、他の残基が長さおよび／または配列多様性についてランダム化される。一部の実施形態において、ループ内の１つ以上の残基が所定の限られた数の異なるアミノ酸に保持される一方、他の残基が長さおよび／または配列多様性についてランダム化される。したがって、本発明のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、縮重コンセンサス配列および／または１つ以上の不変アミノ酸残基を有する１つ以上のループを含み得る。
一実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、ランダム化されたＡＢループを含む。別の実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、ランダム化されたＢＣループを含む。一実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、ランダム化されたＣＤループを含む。一実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、ランダム化されたＤＥループを含む。一実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、ランダム化されたＥＦループを含む。
ある実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインのコグネートＦＧループよりも短い少なくとも１つのアミノ酸残基であるように保持され、さらに１つ以上の位置においてランダム化されたＦＧループを含む。
具体的な実施形態において、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧの少なくとも１つは、ランダム化され、Ａベータ鎖は、配列番号１０または１１を含み、Ｂベータ鎖は、配列番号１２を含み、Ｃベータ鎖は、配列番号１３または１４を含み、Ｄベータ鎖は、配列番号１５を含み、Ｅベータ鎖は、配列番号１６を含み、Ｆベータ鎖は、配列番号１７を含み、Ｇベータ鎖は、配列番号１８を含み、ＡＢループは、配列番号４または１３６を含み、ＣＤループは、配列番号６を含み、ＥＦループは、配列番号８または１３７を含む。
他の具体的な実施形態において、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦの少なくとも１つは、ランダム化され、Ａベータ鎖は、配列番号１０または１１を含み、Ｂベータ鎖は、配列番号１２を含み、Ｃベータ鎖は、配列番号１３または１４を含み、Ｄベータ鎖は、配列番号１５を含み、Ｅベータ鎖は、配列番号１６を含み、Ｆベータ鎖は、配列番号１７を含み、Ｇベータ鎖は、配列番号１８を含み、ＢＣループは、配列番号５を含み、ＤＥループは、配列番号７を含み、ＦＧループは、配列番号９または１３９を含む。
足場安定性の向上
本発明のＴｎ３足場の安定性は、多くの異なるアプローチにより増加させることができる。一部の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、Ｎおよび／またはＣ末端領域の伸長により安定化することができる。Ｎおよび／またはＣ末端領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個以上のアミノ酸だけ伸長することができる。他の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、本明細書に記載のとおり血清半減期を増加させる変化を導入することにより安定化することができる。さらに別の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、足場の疎水性コアを安定化するための少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換を含む。
本発明のＴｎ３足場は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３２１８４号明細書に開示のとおり、非天然ジスルフィド結合を遺伝子操作することにより有効に安定化することができる。一部の実施形態において、本発明の足場は、ＰＣＴ公開国際公開第２００９／０５８３７９号パンフレットに記載のとおり、非天然ジスルフィド結合を含む。ジスルフィド結合の遺伝子操作に好適な候補位置を同定するためにバイオインフォマティクスアプローチを利用するができる。
一実施形態において、本発明のＴｎ３モノマー足場は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの非天然分子内ジスルフィド結合を含む。一実施形態において、本発明のＴｎ３モノマーサブユニットは、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、前記少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合は、モノマーを安定化する。さらに別の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合を含み、結合は、２つの区別されるモノマーまたはマルチマーＴｎ３足場間に局在し、すなわち、ジスルフィド結合は、分子間ジスルフィド結合である。例えば、ジスルフィド結合は、区別される足場（例えば、２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマー足場）、Ｔｎ３足場およびリンカー、Ｔｎ３足場およびＦｃドメイン、またはＴｎ３足場および抗体もしくはその断片を結合させ得る。
一部の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、Ｔｎ３モノマーサブユニットおよび単離異種部分、Ｔｎ３モノマーサブユニットおよび同一のＴｎ３足場に融合もしくはコンジュゲートしている異種部分、またはＴｎ３モノマーサブユニットおよび異なるＴｎ３足場に融合もしくはコンジュゲートしている異種部分を結合させる少なくとも１つの非天然分子間ジスルフィド結合を含む。
同一の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたはそれを超えるモノマーサブユニットのＴｎ３マルチマー足場を形成するジスルフィド結合を含む。
別の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、Ｎおよび／またはＣ末端領域の伸長を含み得る。一実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、本明細書に記載のとおり血清半減期を増加させるための変化を含む。さらに別の実施形態において、本発明の足場は、足場の疎水性コアを安定化するための少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換を含む。
安定性の計測
単離され、またはマルチマーＴｎ３足場の一部としての本発明のＴｎ３モノマーサブユニットの安定性は、当分野において周知の技術、例えば、熱（Ｔｍ）およびカオトロピック変性（例えば、尿素、またはグアニジン塩による処理）、プロテアーゼ処理（例えば、サーモリシンによる処理）またはタンパク質安定性を測定する当分野において認められた別の方法により容易に計測することができる。タンパク質安定性を計測するために使用される技術の包括的考察は、例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”および“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ”ｂｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ．２００７に見出すことができる。
マルチマーＴｎ３足場
本発明の一態様は、タンデムに連結されている少なくとも２つの本発明のＴｎ３モノマーサブユニットを含むＴｎ３マルチマー足場であって、モノマーの少なくとも１つは、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットであるＴｎ３マルチマー足場を提供する。このようなマルチマーＴｎ３足場は、複数のフォーマットにアセンブルすることができる。具体的な態様において、本発明は少なくとも２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットがペプチドリンカーを介してタンデムに連結されているマルチマーＴｎ３足場を提供する。一部の実施形態において、マルチマーＴｎ３足場は、標的結合の価数および／もしくはアビディティー、または標的の他の作用の増加を示す。一部の実施形態において、複数のモノマーサブユニットが同一標的に結合する場合に標的結合の価数および／またはアビディティーの増加が達成される。一部の実施形態において、価数の増加により、標的に対する特異的作用、例えば、標的タンパク質のダイマー化の増加が改善される。
具体的な実施形態において、本発明のマルチマーＴｎ３足場は、タンデムに連結されている少なくとも２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、それぞれのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、少なくとも１つの標的に結合し、それぞれのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、複数のループ領域に結合している複数のベータ鎖を含み、少なくとも１つのループは、親Ｔｎ３足場（配列番号３）中のコグネートループの非天然バリアントである。
一実施形態において、マルチマーＴｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニット間の共有結合を介して、例えば、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを直接結合させることにより、またはリンカー、例えば、ペプチドリンカーを含めることにより生成される。特定の例において、共有結合Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットをコードする融合遺伝子を構築することにより、またはシステイン残基についてのコドンをＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニット中へ遺伝子操作し、ジスルフィド結合形成を発現産物間で生じさせることにより生成される。
一実施形態において、本発明のマルチマーＴｎ３足場は、いかなる追加の介在アミノ酸も有さない、互いに直接連結されている少なくとも２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。別の実施形態において、本発明のマルチマーＴｎ３足場は、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを介してタンデムに連結されている少なくとも２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。
具体的な実施形態において、本発明のマルチマーＴｎ３足場は、ペプチドリンカーを介してタンデムに連結されている少なくとも２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ペプチドリンカーは、１から約１０００、または１から約５００、または１から約２５０、または１から約１００、または１から約５０、または１から約２５個のアミノ酸を含む。具体的な実施形態において、本発明のマルチマーＴｎ３足場は、ペプチドリンカーを介してタンデムに連結されている少なくとも２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、ペプチドリンカーは、１から約２０、または１から約１５、または１から約１０、または１から約５個のアミノ酸を含む。
具体的な実施形態において、本発明のマルチマーＴｎ３足場は、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを介してタンデムに連結されている少なくとも２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、リンカーは、機能的部分である。機能的部分は、マルチマーＴｎ３足場の所望の機能および／または特徴に基づき選択される。例えば、精製に有用な機能的部分（例えば、ヒスチジンタグ）は、リンカーとして使用することができる。リンカーとして有用な機能的部分には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、細胞傷害剤、放射性核種、造影剤、ビオチン、ダイマー化ドメイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはそのＦｃＲｎ結合部分、抗体のドメインまたは断片、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、ＩｇＧ分子、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非Ｔｎ３足場、エピトープタグ、組換えポリペプチドポリマー、サイトカインなどが含まれる。リンカーとして使用することができる具体的なペプチドリンカーおよび機能的部分は、以下に開示される。
具体的な実施形態において、機能的部分は、免疫疾患またはその断片である。一部の実施形態において、免疫グロブリンまたはその断片は、Ｆｃドメインを含む。一部の実施形態において、Ｆｃドメインは、少なくとも１つのＦｃγＲ媒介エフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性傷害）を誘導し得ない。Ｆｃドメインは、少なくとも１つのＦｃγＲ媒介エフェクター機能を低減させまたは排除するように変化させることができることが当分野において公知であり、例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書および米国特許第６，７３７，０５６号明細書参照。
一部の実施形態において、マルチマーＴｎ３足場は、１つ以上のリンカーを介して連結されている少なくとも２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み、それぞれのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニット間に挟まれるリンカーは、同一のリンカーでも異なるリンカーでもよい。一部の実施形態において、リンカーは、複数のリンカーを含み得、それらは同一のリンカーでも異なるリンカーでもよい。一部の実施形態において、複数のリンカーが鎖状に連結されている場合、一部または全部のリンカーが機能的部分であり得る。
足場結合化学量論
一部の実施形態において、モノマーまたはマルチマーＴｎ３足場は、単一のＣＤ４０Ｌ分子上または異なるＣＤ４０Ｌ標的分子上の異なるエピトープであり得る、異なるエピトープに特異的なＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み得る。一部の実施形態において、マルチマーＴｎ３足場は、それぞれのサブユニットが１つ以上のＣＤ４０Ｌ分子上の１つ以上の異なるエピトープを標的化するＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含み得る。
他の実施形態において、モノマーまたはマルチマーＴｎ３足場は、同一のＣＤ４０Ｌ分子上の２つ以上の異なるエピトープに結合し得る。一部の実施形態において、異なるエピトープは、非重複エピトープである。他の実施形態において、異なるエピトープは、重複エピトープである。
さらに別の具体的な実施形態において、モノマーまたはマルチマーＴｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ分子上の１つ以上のエピトープに結合し、第２のＣＤ４０Ｌ分子上の１つ以上のエピトープにさらに結合し得る。一部の実施形態において、異なる標的分子は、オリゴマー複合体、例えば、トリマーＣＤ４０Ｌ複合体の一部である。
さらに別の具体的な実施形態において、モノマーまたはマルチマーＴｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌトリマー上の単一のエピトープに結合し得る。さらに別の具体的な実施形態において、モノマーまたはマルチマーＴｎ３足場は、少なくとも２つのＣＤ４０Ｌトリマー上の同一のエピトープに結合し得る。
ある実施形態において、モノマーまたはマルチマーＴｎ３足場は、隣接細胞表面上のＣＤ４０Ｌ分子の２つ以上のコピー上の同一のエピトープに結合し得る。ある実施形態において、モノマーまたはマルチマーＴｎ３足場は、溶液中のＣＤ４０Ｌ分子の２つ以上のコピー上の同一のエピトープに結合し得る。一部の実施形態において、モノマーまたはマルチマーＴｎ３足場は、同一または異なる結合親和性および／またはアビディティーでＣＤ４０Ｌ上の同一のエピトープまたは異なるエピトープに結合し得る。
別の実施形態において、モノマーまたはマルチマーＴｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌの１つ以上のコピー上のエピトープに結合し、標的に対する所望の作用を達成しまたは向上（例えば、相乗的に）させ、例えば、受容体への結合を妨害し、またはオリゴマー化を妨害し得る。
さらに、本発明のモノマーまたはマルチマーＴｎ３足場が複数のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニット、例えば、それぞれのモノマーがＣＤ４０Ｌ上の異なるエピトープを標的化する異なるモノマーを含む場合、このようなモノマーサブユニットは、ある生物学的効果を達成しまたは向上させるためにあるパターンまたは空間配向に従って配置することができる。モノマーサブユニットのこのような組合せをアセンブルし、続いて当分野において公知の方法を使用して評価することができる。
融合体
本発明は、少なくとも１つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが異種部分に融合していてよいＴｎ３足場を提供する。これに関して、異種部分は、スペーサーとして足場を結合させるために使用されるのではなく、Ｔｎ３足場に追加の機能を提供し得る。一部の実施形態において、異種部分は、リンカーとしても機能し得る。本発明は、１つ以上の異種部分、例として、限定されるものではないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣剤、合成薬物、無機分子、および有機分子にコンジュゲートまたは融合しているＴｎ３足場の使用を包含する。したがって、本発明は、１つ以上のＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３モノマー、例として、限定されるものではないが、本明細書に記載の融合タンパク質を含むポリペプチドを提供する。
本発明は、異種タンパク質またはポリペプチドまたはその断片に組換え融合または化学的にコンジュゲートしているＴｎ３足場の使用を包含する。コンジュゲーションには、共有結合および非共有結合コンジュゲーションの両方が含まれる。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも５００、または少なくとも１０００個のアミノ酸）のポリペプチドに融合または化学的にコンジュゲートさせて融合タンパク質を生成することができる。
１つ以上の異種部分へのマルチマーＴｎ３足場の融合またはコンジュゲーションは、直接的、すなわち、Ｔｎ３足場と異種部分の間に挟まれるリンカーを有さず、または１つ以上の本明細書に記載のリンカー配列を介するものであり得る。一部の実施形態において、足場は、Ｔｎ３足場を標的細胞中の特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に融合またはコンジュゲートさせることにより、インビトロまたはインビボにおいて異種ポリペプチドに特定の細胞型を標的化させるために使用することができる。
異種ポリペプチドに融合またはコンジュゲートしているＴｎ３足場は、当分野で公知の方法を使用するインビトロイムノアッセイおよび精製法に使用することもできる。例えば、国際公開第９３／２１２３２号パンフレット；欧州特許第４３９，０９５号明細書；Ｎａｒａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９、１９９４；米国特許第５，４７４，９８１号明細書；Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２，１９９２；およびＦｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２，１９９１参照、これらは参照により全体として組み込まれる。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、足場を免疫グロブリンまたはそのドメイン、例として、限定されるものではないが、ＩｇＧ（Ｆｃ）の定常領域と、例えば、ＮまたはＣ末端を介して融合またはコンジュゲートさせることにより、ヒト免疫応答に統合することができる。同様に、Ｔｎ３足場と補体タンパク質、例えば、ＣＩｑの間の融合体は、細胞を標的化するために使用することができる。
種々の刊行物は、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドを分子中に導入することにより（例えば、国際公開第９７／４３３１６号パンフレット；米国特許第５，８６９，０４６号明細書；米国特許第５，７４７，０３５号明細書；国際公開第９６／３２４７８号パンフレット；および国際公開第９１／１４４３８号パンフレット参照）、ＦｃＲｎ結合親和性が保存されているが、他のＦｃ受容体についての親和性は大きく低減している抗体と分子を融合させることにより（例えば、国際公開第９９／４３７１３号パンフレット参照）、または分子を抗体のＦｃＲｎ結合ドメインと融合させることにより（例えば、国際公開第００／０９５６０号パンフレット；米国特許第４，７０３，０３９０号明細書参照）、半減期が改変された生理学的に活性な分子を得る方法を記載している。生理学的に活性な分子の半減期を増加させる具体的な技術および方法は、米国特許第７，０８３，７８４号明細書に見出すこともできる。具体的には、Ｔｎ３足場は、ＩｇＧからのＦｃ領域に融合させることができ、Ｆｃ領域は、アミノ酸残基突然変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６ＥまたはＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ／Ｙ４３６Ｈを含み、アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ番号付与スキームに従い命名されることが企図される。ＦｃドメインバリアントへのＴｎ３足場の融合体は、ＡＤＣＣを誘導し得ないことが具体的に企図される。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場の半減期は、Ｔｎ３足場を本質的に決まった構造を取らない組換えポリペプチド（例えば、ＸＴＥＮ（商標）ポリペプチド）と遺伝子融合させることにより、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのコンジュゲーションにより増加させることができる。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、インビボまたは血清半減期を増加または延長させる分子と融合させることができる。一部の実施形態において、足場は、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、その新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合断片、ＰＥＧ、多糖、抗体、補体、ヘモグロビン、結合ペプチド、リポタンパク質ならびに血流中のその半減期および／またはその組織浸透を増加させる他の因子に融合またはコンジュゲートさせることができる。これらの融合体のいずれも、標準的な方法、例えば、公に利用可能な遺伝子配列を使用して構築された組換え融合遺伝子からの融合タンパク質の発現により生成することができる。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場の特性は、ＨＳＡバリアント、すなわち、少なくともアミノ酸置換、欠失、または配列トランケーションを含む全長ＨＳＡ（配列番号１３９）に由来する分子へのコンジュゲーションまたは融合により改善することができる。
一部の実施形態において、ＨＳＡバリアントとのコンジュゲーションにより改善される特性は、血漿半減期である。Ｔｎ３足場の血漿半減期の改善は、その特性の変化、例えば、血漿半減期の増加もしくは減少、または他の薬物動態パラメーターの変化であり得る。一部の実施形態において、ＨＳＡバリアントは、全長ＨＳＡ（配列番号１３８）に由来する突然変異体である。具体的な実施形態において、ＨＳＡバリアントは、３４位におけるシステインのセリンへの置換を含む（配列番号１３３）。Ｔｎ３足場の血漿半減期を改変するために使用することができるＨＳＡバリアントは、例えば、国際公開第２０１１／１０３０７６号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０５１４８９号パンフレットに記載されており、これらは両方とも参照により全体として組み込まれる。一部の実施形態において、本発明のＴｎ３足場の血漿半減期は、それを、ＨＳＡのドメインＩＩＩ中の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＨＳＡバリアントと融合させることにより増加される。
一部の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、全長成熟ＨＳＡ（配列番号１３８）の配列またはその断片を含むＨＳＡバリアントを含み、但し、４０７、４１５、４６３、５００、５０６、５０８、５０９、５１１、５１２、５１５、５１６、５２１、５２３、５２４、５２６、５３５、５５０、５５７、５７３、５７４、および５８０からなる群から選択される位置における全長成熟ＨＳＡ中の位置に対して番号付与される少なくとも１つのアミノ酸置換を除き；少なくとも１つのアミノ酸置換は、５７３位におけるリジン（Ｋ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換を含まず、Ｔｎ３足場は、ＨＳＡバリアントにコンジュゲートしていないＴｎ３足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する。
一部の他の実施形態において、全長成熟ＨＳＡ中の位置に対して番号付与される少なくとも１つのアミノ酸置換は、４６３、５０８、５２３、および５２４からなる群から選択される位置におけるものであり、Ｔｎ３足場は、ＨＳＡバリアントにコンジュゲートしていないＴｎ３足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する。
他の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、全長成熟ＨＳＡ（配列番号１３３または１３８）の配列またはその断片を含むＨＳＡバリアントを含み、但し、
（ａ）４０７位におけるロイシン（Ｌ）のアスパラギン（Ｎ）またはチロシン（Ｙ）への置換；
（ｂ）４１５位におけるバリン（Ｖ）のトレオニン（Ｔ）への置換；
（ｃ）４６３位におけるロイシン（Ｌ）のアスパラギン（Ｎ）への置換；
（ｄ）５００位におけるリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）への置換；
（ｅ）５０６位におけるトレオニン（Ｔ）のチロシン（Ｙ）への置換；
（ｆ）５０８位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）への置換；
（ｇ）５０９位におけるフェニルアラニン（Ｆ）のメチオニン（Ｍ）またはトリプトファン（Ｗ）への置換；
（ｈ）５１１位におけるアラニン（Ａ）のフェニルアラニン（Ｆ）への置換；
（ｉ）５１２位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のチロシン（Ｙ）への置換；
（ｊ）５１５位におけるトレオニン（Ｔ）のグルタミン（Ｑ）への置換；
（ｋ）５１６位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）またはトリプトファン（Ｗ）への置換；
（ｌ）５２１位におけるアルギニン（Ｒ）のトリプトファン（Ｗ）への置換；
（ｍ）５２３位におけるイソロイシン（Ｉ）のアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）への置換；
（ｎ）５２４位におけるリジン（Ｋ）のロイシン（Ｌ）への置換；
（ｏ）５２６位におけるグルタミン（Ｑ）のメチオニン（Ｍ）への置換；
（ｐ）５３５位におけるヒスチジン（Ｈ）のプロリン（Ｐ）への置換；
（ｑ）５５０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換；
（ｒ）５５７位におけるリジン（Ｋ）のグリシン（Ｇ）への置換；
（ｓ）５７３位におけるリジン（Ｋ）のフェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、プロリン（Ｐ）、トリプトファン（Ｗ）、またはチロシン（Ｙ）への置換；
（ｔ）５７４位におけるリジン（Ｋ）のアスパラギン（Ｎ）への置換；
（ｕ）５８０位におけるグルタミン（Ｑ）のリジン（Ｋ）への置換；および
（ｖ）前記置換の２つ以上の組合せ
からなる群から選択される全長成熟ＨＳＡ中の位置に対して番号付与される少なくとも１つのアミノ酸置換を除き、
前記Ｔｎ３足場は、前記ＨＳＡバリアントにコンジュゲートしていないＴｎ３足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する。
一部の実施形態において、Ｔｎ３足場は、全長成熟ＨＳＡ（配列番号１３３または１３８）の配列またはその断片を含むＨＳＡバリアントを含み、但し、
（ａ）４６３位におけるロイシン（Ｌ）のアスパラギン（Ｎ）への置換；
（ｂ）５０８位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）への置換；
（ｃ）５２３位におけるイソロイシン（Ｉ）のアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）への置換；
（ｄ）５２４位におけるリジン（Ｋ）のロイシン（Ｌ）への置換；および
（ｅ）前記置換の２つ以上の組合せ
からなる群から選択される全長成熟ＨＳＡ中の位置に対して番号付与される少なくとも１つのアミノ酸置換を除き、
前記Ｔｎ３足場は、前記ＨＳＡバリアントにコンジュゲートしていないＴｎ３足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する。
さらに、本発明のＴｎ３足場は、マーカー配列、例えば、精製を容易にするためのペプチドに融合させることができる。一部の実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、ポリヒスチジンペプチド（Ｈｉｓタグ）、例えば、オクタヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−８−タグ）またはヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−６−タグ）、例えば、多くが市販されているベクターのうち、ｐＱＥ発現ベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ，９１３１１）中に提供されるタグである。Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４，１９８９に記載のとおり、例えば、ポリヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグには、限定されるものではないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ（例えば、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ３７：７６７，１９８４参照）、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、ＧＦＰタグ、ＡＵ１タグ、ＡＵ５タグ、ＥＣＳタグ、ＧＳＴタグ、またはＯＬＬＡＳタグが含まれる。
本発明のＴｎ３足場を含む追加の融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エキソンシャフリング、および／またはコドンシャフリング（まとめて「ＤＮＡシャフリング」と称される）の技術を介して生成することができる。
ＤＮＡシャフリングは、標的に対するＴｎ３足場の作用を変化させるために（例えば、より高い親和性およびより低い解離速度を有する足場を生成するために）用いることができる。Ｔｎ３足場は、組換え前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法によるランダム突然変異誘発により変化させることができる。特異的標的に結合する、足場をコードするポリヌクレオチドの１つ以上の部分は、１つ以上の異種分子の１つ以上の構成要素、モチーフ、区画、部分、ドメイン、断片などにより組換えることができる。
抗体およびＦｃドメイン融合体
一部の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、抗体（例えば、ＩｇＧ）のドメインまたは断片、例として、限定されるものではないが、Ｆｃドメインに融合しているＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。
一部の実施形態において、１つのみのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、抗体のドメインまたは断片にコンジュゲートまたは融合している。例えば、単一のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを、抗体のドメインまたは断片（例えば、抗体の重鎖または軽鎖）のポリペプチドのＮ末端に融合させることができる。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、１つ以上のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを、抗体のドメインまたは断片（例えば、抗体の重鎖および／もしくは軽鎖、またはＦｃドメイン）のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に融合またはコンジュゲートさせることにより作出される。
一部の実施形態において、抗体のドメインまたは断片に融合しているＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットの一部または全部は、同一である。一部の他の実施形態において、抗体のドメインまたは断片に融合しているＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットの一部または全部は、異なる。
具体的な実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、Ｆｃドメインに融合している１つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。他の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、Ｆｃドメインに融合している少なくとも２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。１つの具体的な実施形態において、Ｆｃドメインに融合しているＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットの２つは同一である。１つの具体的な実施形態において、Ｆｃドメインに融合しているＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットの２つは異なる。１つの具体的な実施形態において、Ｆｃドメインに融合している２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、互いにタンデムに連結されており、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットの一方は、Ｆｃドメインに融合している。
一部の実施形態において、本発明の異なるＴｎ３足場は、ヘテロダイマーの形成を助けるＦｃドメイン突然変異の使用によりダイマー化することができる。Ｆｃ領域のバリアント（例えば、アミノ酸置換および／または付加および／または欠失）が抗体のエフェクター機能を向上または縮小させ、抗体の薬物動態特性（例えば、半減期）を変化させ得ることが当分野において公知である。したがって、ある実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、Ｔｎ３足場の機能および／または薬物動態特性を変化させるために１つ以上の変化がＦｃ領域中でなされた変化したＦｃ領域を含むＦｃドメインを含む。ある実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、少なくとも１つのＦｃ Ｒ媒介エフェクター機能を低減させまたは排除するために１つ以上の変化がＦｃ領域中でなされた変化したＦｃ領域を含むＦｃドメインを含む。
エフェクター機能および／または抗炎症活性を増加または減少させるためにＦｃ領域のグリコシル化を改変することができることも公知である。したがって、一実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、Ｔｎ３足場の細胞傷害および／または抗炎症特性を変化させるためにアミノ酸残基の変化したグリコシル化を有するＦｃ領域を含む。
Ｔｎ３足場トポロジー
本発明のＴｎ３足場は、任意の好適な空間配置でＦｃドメイン、抗体軽鎖、および抗体重鎖のＣ末端に融合させることができる。例えば、企図される足場トポロジーの詳細な説明について国際公開ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３２１８４号明細書参照。
本発明の足場の生成
本明細書に記載のＴｎ３足場は、新たなまたは改善された標的結合タンパク質を進化させる任意の技術において使用することができる。１つの特定の例において、標的を固体支持体、例えば、カラム樹脂またはマイクロタイタープレートウェル上に固定化し、標的を候補足場ベース結合タンパク質のライブラリーと接触させる。このようなライブラリーは、ＣＤＲ様ループの配列および／または長さのランダム化を介してＴｎ３足場から構築されたクローンからなり得る。
これに関して、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、１つの周知技術であり、これは大きなオリゴペプチドライブラリーをスクリーニングして標的に特異的に結合し得るこれらのライブラリーのメンバーを同定することを可能とする。ファージディスプレイは、バリアントポリペプチドがバクテリオファージ粒子表面上のコートタンパク質への融合体としてディスプレイされる技術である（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６）。天然ＦｎＩＩＩドメインのループ長さおよび多様性の優先度を測定するため、バイオインフォマティクスアプローチを用いることができる。この分析を使用して、ループ長さおよび配列多様性についての優先度は、「制限ランダム化（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）」アプローチを開発するために用いることができる。この制限ランダム化において、相対ループ長さおよび配列の優先度が、ライブラリー戦略の開発に組み込まれる。ループ長さおよび配列多様性分析のライブラリー開発への統合は、制限ランダム化（すなわち、アミノ酸が存在し得るランダム化ループ内のある位置が限定される）をもたらす。
本発明はまた、非天然Ｔｎ３足場の多様な集団を含む組換えライブラリーを提供する。一実施形態において、ライブラリーは、複数のループ領域に結合している複数のベータ鎖ドメインを含む非天然Ｔｎ３足場を含み、前記ループの１つ以上は、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換または付加により変動する。具体的な実施形態において、ライブラリーは、野生型Ｔｎ３足場に由来するＴｎ３足場を含む。
上記で詳細に説明したとおり、足場の種々のベータ鎖を連結するループは、長さおよび／または配列多様性についてランダム化することができる。一実施形態において、本発明のライブラリーは、長さおよび／または配列多様性についてランダム化された少なくとも１つのループを有するＴｎ３足場を含む。一実施形態において、Ｔｎ３足場の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つのループが、長さおよび／または配列多様性についてランダム化される。一実施形態において、少なくとも１つのループが、一定に保持される一方、少なくとも１つの追加のループが、長さおよび／または配列多様性についてランダム化される。別の実施形態において、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てが一定に保持される一方、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てが長さまたは配列多様性についてランダム化される。別の実施形態において、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つ全てがランダム化される一方、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てが長さおよび／または配列多様性についてランダム化される。
具体的な実施形態において、本発明のライブラリーは、ＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は、配列番号１０または１１を含み、Ｂベータ鎖は、配列番号１２を含み、Ｃベータ鎖は、配列番号１３または１４を含み、Ｄベータ鎖は、配列番号１５を含み、Ｅベータ鎖は、配列番号１６を含み、Ｆベータ鎖は、配列番号１７を含み、Ｇベータ鎖は配列番号１８を含む。
具体的な実施形態において、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は、配列番号１０または１１からなり、Ｂベータ鎖は、配列番号１２からなり、Ｃベータ鎖は、配列番号１３または１４からなり、Ｄベータ鎖は、配列番号１５からなり、Ｅベータ鎖は、配列番号１６からなり、Ｆベータ鎖は、配列番号１７からなり、Ｇベータ鎖は、配列番号１８からなる。
具体的な実施形態において、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は、本質的に配列番号１０または１１からなり、Ｂベータ鎖は、本質的に配列番号１２からなり、Ｃベータ鎖は、本質的に配列番号１３または１４からなり、Ｄベータ鎖は、本質的に配列番号１５からなり、Ｅベータ鎖は、本質的に配列番号１６からなり、Ｆベータ鎖は、本質的に配列番号１７からなり、Ｇベータ鎖は、本質的に配列番号１８からなる。
上記で詳細に説明したとおり、ループ内の１つ以上の残基を一定に保持することができる一方、他の残基が長さおよび／または配列多様性についてランダム化される。場合により、または代替的に、ループ内の１つ以上の残基を所定の限られた数の異なるアミノ酸に保持することができる一方、他の残基が長さおよび／または配列多様性に関してランダム化される。したがって、本発明のライブラリーは、縮重コンセンサス配列および／または１つ以上の不変アミノ酸残基を有する１つ以上のループを含み得るＴｎ３足場を含む。別の実施形態において、本発明のライブラリーは、ランダム化されたＢＣループを有するＴｎ３足場を含む。別の実施形態において、本発明のライブラリーは、ランダム化されたＢＣループを有するＴｎ３足場を含む。さらに別の実施形態において、本発明のライブラリーは、ランダム化されたＢＣループを有するＴｎ３足場を含む。
一実施形態において、本発明のライブラリーは、ランダム化されたＤＥループをＴｎ３足場を含む。一実施形態において、本発明のライブラリーは、ランダム化されたＦＧループを有するＴｎ３足場を含む。別の実施形態において、本発明のライブラリーは、ランダム化されたＦＧループを有するＦｎＩＩＩ足場を含む。
具体的な実施形態において、本発明のライブラリーは、アミノ酸配列：
ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＥＴＦＴＴ
（式中、
（ａ）ＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループの配列中に存在するアミノ酸残基を表し；
（ｂ）Ｘ１は、アミノ酸残基ＡまたはＴを表し；
（ｃ）ループの長さｎは、２から２６の整数である）
を含む足場を含む。
一部の実施形態において、本発明のライブラリーは、アミノ酸配列：
ＩＥＶＫＤＶＴＤＴＴＡＬＩＴＷＸ１ＤＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＣＥＬＴＹＧＩＫＤＶＰＧＤＲＴＴＩＤＬＷＸ９ＨＸ１０ＡＸ１１ＹＳＩＧＮＬＫＰＤＴＥＹＥＶＳＬＩＣＲＸ１２ＧＤＭＳＳＮＰＡＫＥＴＦＴＴ（配列番号１６７）
（式中、
（ａ）Ｘ１は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）またはロイシン（Ｌ）を表し；
（ｂ）Ｘ２は、アミノ酸残基アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し；
（ｃ）Ｘ３は、アミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）を表し；
（ｄ）Ｘ４は、アミノ酸残基アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｅ）Ｘ５は、アミノ酸残基グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはアスパラギン（Ｎ）を表し；
（ｆ）Ｘ６は、アミノ酸残基フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｇ）Ｘ７は、アミノ酸残基イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｈ）Ｘ８は、アミノ酸残基グリシン（Ｇ）、トリプトファン（Ｗ）またはバリン（Ｖ）を表し；
（ｉ）Ｘ９は、アミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｊ）Ｘ１０は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、メチオニン（Ｍ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｋ）Ｘ１１は、アミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｌ）Ｘ１２は、アミノ酸残基アルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）を表す）
を含む本発明のＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３モノマーサブユニットを含む。
一部の実施形態において、本発明のライブラリーは、アミノ酸配列：
ＩＥＶＸ１ＤＶＴＤＴＴＡＬＩＴＷＸ２Ｘ３ＲＳＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＣＥＬＸ１１ＹＧＩＫＤＶＰＧＤＲＴＴＩＤＬＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５ＹＶＨＹＳＩＧＮＬＫＰＤＴＸ１６ＹＥＶＳＬＩＣＬＴＴＤＧＴＹＸ１７ＮＰＡＫＥＴＦＴＴ（配列番号１７１）
（式中、
（ａ）Ｘ１は、アミノ酸残基リジン（Ｋ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し；
（ｂ）Ｘ２は、アミノ酸残基トレオニン（Ｔ）またはイソロイシン（Ｉ）を表し；
（ｃ）Ｘ３は、アミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）またはアラニン（Ａ）を表し；
（ｄ）Ｘ４は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｅ）Ｘ５は、アミノ酸残基チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）またはセリン（Ｓ）を表し；
（ｆ）Ｘ６は、アミノ酸残基チロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｇ）Ｘ７は、アミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｈ）Ｘ８は、アミノ酸残基ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｉ）Ｘ９は、アミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｊ）Ｘ１０は、アミノ酸残基グリシン（Ｇ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｋ）Ｘ１１は、アミノ酸残基アラニン（Ａ）またはトレオニン（Ｔ）を表し；
（ｌ）Ｘ１２は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｒ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｍ）Ｘ１３は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアラニン（Ａ）を表し；
（ｎ）Ｘ１４は、アミノ酸残基プロリン（Ｐ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）またはアラニン（Ａ）またはアミノ酸無しを表し；
（ｏ）Ｘ１５は、アミノ酸残基イソロイシン（Ｉ）またはアミノ酸無しを表し；
（ｐ）Ｘ１６は、アミノ酸残基グルタミン酸（Ｅ）またはリジン（Ｋ）を表し；
（ｑ）Ｘ１７は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）を表す）
を含む本発明のＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３モノマーサブユニットを含む。
本発明は、本発明のライブラリーをスクリーニングすることにより、標的、例えば、ＣＤ４０Ｌに結合し、親Ｔｎ３足場と比較して増加した安定性または標的、例えば、ＣＤ４０Ｌに対する改善された作用を有する組換えＴｎ３足場を同定する方法をさらに提供する。
ある実施形態において、親Ｔｎ３足場と比較して増加したタンパク質安定性を有し、特異的に標的に結合する組換えＴｎ３足場を同定する方法は、
標的リガンドを本発明のライブラリーと、足場：標的リガンド複合体の形成に好適な条件下で接触させること；
複合体から標的リガンドに結合する足場を得ること；
工程（ｂ）において得られた足場の安定性が野生型Ｔｎ３足場のそれよりも大きいかどうかを判定すること
を含む。
同一の方法を使用して標的に対する改善された結合親和性、アビディティーなどを有する組換えＴｎ３足場を同定することができる。一実施形態において、工程（ａ）において、本発明の足場ライブラリーを固定化標的とインキュベートする。一実施形態において、工程（ｂ）において、足場：標的リガンド複合体を洗浄して非特異的結合剤を除去し、最も強固な結合剤を極めてストリンジェントな条件下で溶出させ、ＰＣＲに供して配列情報を回収する。工程（ｂ）において得られた結合剤および／または配列情報は、本明細書に開示の方法または当業者に公知の方法を使用して新たなライブラリーを作出するために使用することができ、さらなる配列の突然変異誘発を用いてまたは用いずに選択プロセスを繰り返すために使用することができることが具体的に企図される。一部の実施形態において、抗原についての十分な親和性を有する結合剤が得られるまで多くの選択のラウンドを実施することができる。
本発明のさらなる実施形態は、本発明および上記の足場を含むライブラリーをコードする単離核酸分子の回収物である。
本発明の足場は、親和性成熟に供することができる。この当分野において認められたプロセスにおいて、特異的結合タンパク質を、特異的標的についての増加した親和性について選択するスキームに供する（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５（１１）：６０３７−４２参照）。得られる本発明の足場は、親和性成熟前の足場と比較して少なくとも同程度の大きさの結合特性を示し得る。
本発明はまた、標的に結合して足場：標的複合体を形成し得るタンパク質足場のアミノ酸配列を同定する方法を提供する。一実施形態において、この方法は、（ａ）本発明のライブラリーを固定化または分離可能な標的と接触させること；（ｂ）足場：標的複合体を遊離足場から分離すること；（ｃ）（ｂ）の分離された足場の複製を引き起こし、低下した多様性を有することにより、および標的に結合し得るディスプレイされた足場の濃縮により（ａ）におけるものとは区別される新たなポリペプチドディスプレイライブラリーをもたらすこと；ｄ）場合により、工程（ａ）、および（ｂ）を（ｃ）の新たなライブラリーを用いて繰り返すこと；ならびにｅ）（ｄ）からの種のディスプレイされた足場をコードする領域の核酸配列を決定し、それにより標的に結合し得るペプチド配列を推定することを含む。
別の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、ライブラリースクリーンからの同定後にさらにランダム化することができる。一実施形態において、本発明の方法は、本明細書に記載の方法を使用してライブラリーから同定された足場の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つのループをさらにランダム化することを含む。別の実施形態において、さらにランダム化された足場を、標的に結合し得る足場を同定する後続の方法に供する。この方法は、（ａ）前記さらにランダム化された足場を固定化または分離可能な標的と接触させること、（ｂ）さらにランダム化された足場：標的複合体を遊離足場から分離すること、（ｃ）（ｂ）の分離された足場の複製を引き起こし、場合により、工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返すこと、および（ｄ）前記さらにランダム化された足場をコードする領域の核酸配列を決定し、それにより標的に結合し得るペプチド配列を推定することを含む。
さらなる実施形態において、さらにランダム化された足場は、最初のライブラリーにおいて事前にランダム化された少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのランダム化ループを含む。代替的なさらなる実施形態において、さらにランダム化された足場は、最初のライブラリーにおいて事前にランダム化されなかった少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのランダム化ループを含む。
本発明はまた、少なくとも１つ以上の標的に結合する少なくとも２つのＴｎ３足場を得る方法を提供する。この方法は、特定の応答を誘発するように協調して作用する薬剤のスクリーニングを可能とする。２つ以上の足場の協調を要求するアゴニスト活性が要求される場合、このようなスクリーンを使用することは有利であり得る。この方法は、ライブラリーを再フォーマット化してマルチマー複合体を形成することなく協調薬剤のスクリーニングを可能とする。一実施形態において、本発明の方法は、標的リガンドを本発明のライブラリーと、足場：標的リガンド複合体の形成を可能とする条件下で接触させること、前記足場を架橋剤（少なくとも２つの同一または区別される足場を近接して合わせる薬剤と定義）と会合させ、足場の架橋が検出可能な応答を誘発すること、および複合体から、前記標的に結合する足場を得ることを含む。さらなる実施形態において、架橋剤は、足場特異的抗体、またはその断片、エピトープタグ特異的抗体またはその断片、ダイマー化ドメイン、例えば、Ｆｃ領域、コイルドコイルモチーフ（例えば、限定されるものではないが、ロイシンジッパー）、化学架橋剤、または当分野において公知の別のダイマー化ドメインである。
本発明はまた、本発明のＴｎ３足場を利用して化合物を検出する方法を提供する。ライブラリースクリーニングにより得られたＴｎ３足場の結合特異性に基づき、このようなＴｎ３足場をアッセイにおいて、例えば、診断法に使用して試料中の特異的標的を検出することが可能である。一実施形態において、化合物を検出する方法は、試料中の前記化合物を本発明のＴｎ３足場と、化合物：足場複合体の形成を可能とする条件下で接触させること、および前記足場を検出し、それにより試料中の前記化合物を検出することを含む。さらなる実施形態において、足場を標識（すなわち、放射標識、蛍光、酵素結合または比色標識）して化合物の検出を容易にする。
本発明はまた、本発明のＴｎ３足場を利用して化合物を捕捉する方法を提供する。ライブラリースクリーニングにより得られたＴｎ３足場の結合特異性に基づき、試料中の特異的標的を捕捉するためのアッセイにおいて、例えば、精製法にこのようなＴｎ３足場を使用することが可能である。一実施形態において、試料中の化合物を捕捉する方法は、試料中の前記化合物を本発明の足場と、化合物：足場複合体の形成を可能とする条件下で接触させること、および前記複合体を試料から取り出し、それにより前記試料中の前記化合物を捕捉することを含む。さらなる実施形態において、Ｔｎ３足場を固定化して化合物：足場複合体の取り出しを容易にする。
一部の実施形態において、本発明のライブラリーから単離されたＴｎ３足場は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、またはそれを超えるランダム化ループを含む。一部の実施形態において、単離Ｔｎ３足場ループ配列を、ドナー足場からＦｎＩＩＩレシーバー足場、例として、限定されるものではないが、Ｔｎ３レシーバー足場中の任意のループとスワッピングすることができる（例えば、ドナー足場からのＦＧループ配列を、レシーバーＦｎＩＩＩ足場中の任意のループに移すことができる）。具体的な実施形態において、単離ループ配列を、レシーバー足場のコグネートループに移すことができる（例えば、ドナー足場からのＦＧループ配列を、ＦＧループ位置中のＦｎＩＩＩレシーバー足場に移すことができる）。一部の実施形態において、単離ループ配列は、種々のレシーバー足場とランダムに「混合し、一致させる」ことができる。
他の実施形態において、単離Ｔｎ３足場配列は、ループ配列により同定することができる。例えば、ライブラリーを使用して特定の標的に対してパニングし、特異的結合剤の回収物を単離する。ランダム化ループ配列は、Ｔｎ３足場バックグラウンド（すなわち、配列番号ＸのＦＧループ配列を含む、標的Ｘに結合する足場）とは独立して特異的配列として特性決定することができる。代替的実施形態において、足場が標的Ｘに結合する２つのループ配列を示す場合、ループ配列は、足場配列の不存在下で結合標的Ｘとして特性決定することができる。言い換えれば、特定の標的に結合するライブラリーから単離された足場は、足場骨格とは独立した標的に結合する可変ループ配列として発現させることができることが企図される。このプロセスは、抗体の可変領域のＣＤＲの概念と類似する。
親和性成熟
本発明のＴｎ３足場の開発は、１つ以上のインビトロまたはインビボ親和性成熟工程を含み得る。一部の実施形態において、Ｔｎ３モノマーサブユニットは、単一の親和性成熟の工程を受け得る。他の実施形態において、Ｔｎ３モノマーサブユニットは、２つ以上の親和性成熟の工程を受け得る。一般に、親和性成熟Ｔｎ３足場の所望抗原への結合を改善する親Ｔｎ３足場中のアミノ酸変化、または具体的には親Ｔｎ３足場ループ中のアミノ酸変化をもたらす任意の親和性成熟アプローチを用いることができる。
これらのアミノ酸変化は、例えば、ランダム突然変異誘発、「ウォークスルー（ｗａｌｋ ｔｈｒｏｕｇｈ）」突然変異誘発、および「ルックスルー（ｌｏｏｋ ｔｈｒｏｕｇｈ）」突然変異誘発を介して達成することができる。このような突然変異誘発は、ＦｎＩＩＩベース結合分子の全部または一部のアブイニシオ合成の間に、例えば、エラープローンＰＣＲ、酵母または細菌の「突然変異誘発遺伝子」株、ランダムまたは規定核酸変化の組込みを使用することにより達成することができる。親和性成熟および／または突然変異誘発を実施する方法は、例えば、米国特許第７，１９５，８８０号明細書；米国特許第６，９５１，７２５号明細書；米国特許第７，０７８，１９７号明細書；米国特許第７，０２２，４７９号明細書；米国特許第５，９２２，５４５号明細書；米国特許第５，８３０，７２１号明細書；米国特許第５，６０５，７９３号明細書；米国特許第５，８３０，６５０号明細書；米国特許第６，１９４，５５０号明細書；米国特許第６，６９９，６５８号明細書；米国特許第７，０６３，９４３号明細書；米国特許第５，８６６，３４４号明細書およびＰＣＴ公開国際公開第０６０２３１４４号パンフレットに記載されている。
このような親和性成熟法は、抗原結合スクリーニングアッセイのストリンジェンシーを増加させて抗原についての改善された親和性を有するＴｎ３足場を選択することをさらに要求し得る。タンパク質−タンパク質相互作用アッセイのストリンジェンシーを増加させる当分野において承認された方法を本明細書において使用することができる。一実施形態において、アッセイ条件の１つ以上を変動させ（例えば、アッセイ緩衝液の塩濃度）所望抗原についてのＴｎ３足場の親和性を低減させる。別の実施形態において、Ｔｎ３足場が所望抗原に結合するのに許容される時間の長さを低減させる。
別の実施形態において、競合的結合工程をタンパク質−タンパク質相互作用アッセイに追加することができる。例えば、最初に、Ｔｎ３足場を所望の固定化抗原に結合させることができる。次いで、固定化抗原と結合について競合するように機能する規定濃度の非固定化抗原を添加し、それにより、抗原について最低の親和性を有するＴｎ３足場を固定化抗原から溶離させ、改善された抗原結合親和性を有するＴｎ３足場の選択をもたらす。アッセイ条件のストリンジェンシーは、アッセイに添加される非固定化抗原の濃度を増加させることによりさらに増加させることができる。
スクリーニング法は、改善された抗原結合を有する１つ以上のＴｎ３足場を濃縮するために、複数の選択ラウンドも要求し得る。一実施形態において、それぞれの選択ラウンドにおいて、さらなるアミノ酸突然変異をＴｎ３足場中に導入する。別の実施形態において、それぞれの選択ラウンドにおいて、所望抗原への結合のストリンジェンシーを増加させて抗原についての増加した親和性を有するＴｎ３足場が選択される。
一部の実施形態において、親和性成熟は、Ｔｎ３のＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループ一部の飽和突然変異誘発により実施する。一部の実施形態において、飽和突然変異誘発は、Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発を使用して実施する。他の実施形態において、飽和突然変異誘発は、ＰＣＲを使用して実施する。
一部の実施形態において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つ以上の親和性成熟ラウンドを適用する。一部の実施形態において、飽和突然変異誘発を１つのみのループに適用する一方、一部の他の実施形態において、１つのみのループまたはループの一部を１つの親和性成熟ラウンドの間に突然変異させる。一部の実施形態において、２つ以上のループまたは１つ以上のループの一部を、同一の親和性成熟ラウンドの間に突然変異させる。
他の実施形態において、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループを、同一の親和性成熟ラウンドの間に同時に突然変異させる。
モノマーを同一標的の異なるエピトープに結合するマルチマーＴｎ３足場にアセンブルする場合、または二重特異性Ｔｎ３足場の場合、それぞれの結合特異性を独立してスクリーニングすることができる。
一部の実施形態において、ループはファージディスプレイライブラリーを使用してランダム化させる。一部の実施形態において、Ｔｎ３足場の所望標的への結合は、当分野において承認された方法を使用して測定することができる。また、スクリーンにおいて同定されたＴｎ３足場のアミノ酸配列は、当分野において承認された方法を使用して決定することができる。
一部の実施形態において、本発明のモノマー親和性成熟足場は、表面プラズモン共鳴または当分野において公知の他のアッセイにより計測して、親和性成熟前の同一のＴｎ３足場と比較して少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも６０倍、少なくとも８０倍、または少なくとも１００倍またはそれを超えるＣＤ４０Ｌについての親和性の増加を示す。一部の実施形態において、本発明のモノマー親和性成熟足場は、表面プラズモン共鳴または当分野において公知の他のアッセイにより計測して５μＭ未満、１μＭ未満、５００μＭ未満、２５０μＭ未満、１００μＭ未満、または５０μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する。
これらの親和性成熟法は、望ましい改善された結合特性、例えば、増加した親和性、または他の望ましい特徴、例えば、好ましい薬物動態特性、高効力、低免疫原性、増加もしくは減少した交差反応性などを有するＴｎ３足場を開発するために適用することができる。
タンデムリピートの生成
２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを結合させることにより形成されるダイマーであるタンデム構築物の結合は、当分野において公知の制限酵素、例として、限定されるものではないが、ＩＩ型およびＩＩＳ型制限酵素を使用する制限酵素部位におけるオリゴヌクレオチドのライゲーションにより生成することができる。
本発明のマルチマーＴｎ３足場は、Ｃ末端および／またはＮ末端において、および／または本明細書に記載のドメイン間にリンカーを含み得る。さらに、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つまたはポリペプチド足場を含む本発明の足場は、ダイマー化ドメイン、例として、限定されるものではないが、以下から選択される抗体部分に融合またはコンジュゲートさせることができる：
（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦａｂ断片；
（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端において１つ以上のシステイン残基を有するＦａｂ断片であるＦａｂ’断片；
（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；
（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＣＨ１ドメインのＣ末端における１つ以上のシステイン残基を有するＦｄ’断片；
（ｖ）抗体単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖ断片；
（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片；
（ｖｉｉ）単離ＣＤＲ領域；
（ｖｉｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により結合している２つのＦａｂ’断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；
（ｉｘ）単鎖抗体分子（例えば、単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）；
（ｘ）同一ポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結されている重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する「ダイアボディー」；
（ｘｉ）相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒になって一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む「直鎖抗体」；
（ｘｉｉ）全長抗体；ならびに
（ｘｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３を含み、ヒンジ領域および／またはＣＨ１領域の全部または一部をさらに含み得るＦｃ領域。
Ｔｎ３足場の産生
本発明のＴｎ３足場の組換え発現は、Ｔｎ３足場をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を要求する。Ｔｎ３足場をコードするポリヌクレオチドを得たら、Ｔｎ３足場産生のためのベクターを当分野において周知の技術を使用する組換えＤＮＡ技術により産生することができる。したがって、ヌクレオチド配列をコードするＴｎ３足場を含有するポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製する方法が本明細書に記載される。当業者に周知の方法を使用して足場ポリペプチドコード配列ならびに適切な転写および転写制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換え技術が含まれる。したがって、本発明は、プロモーターに作動可能に結合している本発明のＴｎ３足場をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。
発現ベクターは、慣用の技術により宿主細胞に移し、次いで形質移入された細胞を慣用の技術により培養して本発明のＴｎ３足場を産生する。したがって、本発明は、異種プロモーターに作動可能に結合している本発明の足場をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。好適な宿主細胞には、限定されるものではないが、微生物、例えば、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））が含まれる。
種々の宿主発現ベクター系を、本発明のＴｎ３足場を発現させるために利用することができる。このような宿主発現系は、関心対象のコード配列を産生し、続いて精製することができるビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換または形質移入された場合、本発明の足場をインサイチューで発現し得る細胞も表す。これらには、限定されるものではないが、微生物、例えば、足場コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））または哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳＯ、および３Ｔ３細胞）が含まれる。
本発明のＴｎ３足場の産生に有用な方法は、例えば、国際特許出願公開の国際公開第２００９／０５８３７９号パンフレットに開示されている。本発明の足場を組換え発現により産生したら、それをタンパク質の精製について当分野において公知の任意の方法により精製することができる。
一部の実施形態において、本発明の足場は、組換え発現の間にグリコシル化され得るアミノ酸残基を置き換えることにより非グリコシル化形態で産生することができる。１つの具体的な実施形態において、グリシン−セリンリンカー（例えば、配列番号１３１または配列番号１３２）中のセリンアミノ酸を、他のアミノ酸残基、例えば、アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシンまたはバリン（例えば、配列番号１４０、１４１、１４２および１４３参照）、により置き換えて組換え発現の間のグリコシル化を妨害することができる。一部の具体的な実施形態において、Ｎ−グリコシル化部位を本発明のＴｎ３足場から除去する。他の実施形態において、本発明の足場は、組換え発現後に脱グリコシル化することができる。例えば、酵素カクテルを使用する組換え発現後のインビトロ脱グリコシル化の方法は、当分野において公知である（例えば、ＱＡ−ｂｉｏ，Ｐａｌｍ Ｄｅｓｅｒｔ，ＣＡから市販されているＰＦＧａｓｅ Ｆ、Ｅｎｏｄｏ Ｆ Ｍｕｌｔｉ、Ｏｒｅｌａ Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃａｎ Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ＣａｒｂｏＲｅｌｅａｓｅ、およびＥｎｚｙｍａｔｉｃ ＤｅＧｌｙｃｏＭｘ脱グリコシル化キット）。
研究室における本発明のＴｎ３足場の産生は、米国特許出願公開第２０１０−０２９８５４１Ａ１号明細書に記載のとおり、分析スケールのリアクターまたは生産スケールのリアクターで足場を産生するためにスケールアップすることができる。
分泌Ｔｎ３足場のスケーラブル産生
本発明のＴｎ３足場は、細胞内で、または分泌形態として産生することができる。一部の実施形態において、分泌足場は、適正にフォールドされ、完全に機能的である。本発明のＴｎ３足場は、スケーラブルプロセスにより産生することができる。一部の実施形態において、足場は、スケールアップして本発明の足場を分析スケールのバイオリアクター（例えば、限定されるものではないが、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、３０Ｌ、または５０Ｌバイオリアクター）で産生可能な、研究室における本発明のスケーラブルプロセスにより産生することができる。他の実施形態において、Ｔｎ３足場は、スケールアップして本発明のＴｎ３足場を生産スケールのバイオリアクター（例えば、限定されるものではないが、７５Ｌ、１００Ｌ、１５０Ｌ、３００Ｌ、または５００Ｌ）で産生することができる、研究室における本発明のスケーラブルプロセスにより産生することができる。一部の実施形態において、本発明のスケーラブルプロセスは、研究室において実施される産生プロセスと比較して生産効率の低減をほとんど、または全くもたらさない。
リンカー
マルチマーＴｎ３足場中のモノマーサブユニットは、タンパク質および／または非タンパク質リンカーにより連結することができ、それぞれのリンカーは、少なくとも２つのモノマーサブユニットに融合される。好適なリンカーは、タンパク質リンカー、非タンパク質リンカー、およびそれらの組合せからなっていてよい。リンカーの組合せは、ホモマーであってもヘテロマーであってもよい。一部の実施形態において、本発明のマルチマーＴｎ３足場は、複数のモノマーサブユニットを含み、全てのリンカーは、同一である。他の実施形態において、マルチマーＴｎ３足場は、複数のモノマーサブユニットを含み、リンカーの少なくとも１つは、残りのリンカーとは機能的にまたは構造的に異なる。一部の実施形態において、リンカーは、標的への結合に直接的または間接的に関与することにより、それ自体でマルチマーＴｎ３足場の活性に寄与し得る。
一部の実施形態において、タンパク質リンカーは、ポリペプチドである。リンカーポリペプチドは、２つ以上のモノマーサブユニットを、それらが所望活性を保持できるように互いに対して正確な立体構造を呈するように結合させるために適切な長さを有するべきである。
一実施形態において、ポリペプチドリンカーは、１から約１０００アミノ酸残基、１から約５０アミノ酸残基、１〜２５アミノ酸残基、１〜２０アミノ酸残基、１〜１５アミノ酸残基、１〜１０アミノ酸残基、１〜５アミノ酸残基、１〜３アミノ酸残基を含む。本発明は、ポリペプチドリンカー配列をコードする核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方の組合せをさらに提供する。ポリペプチドリンカー中に含めるために選択されるアミノ酸残基は、本発明のマルチマーＴｎ３足場の活性とも機能とも顕著に干渉しない特性を示すべきである。したがって、ポリペプチドリンカーは全体として、本発明のＴｎ３マルチマー足場の活性とも機能とも一致しない電荷も、内部フォールディングと干渉する電荷も、本発明のＴｎ３マルチマー足場のＣＤ４０Ｌへの結合を大きく害するモノマーサブユニットの１つ以上のアミノ酸残基と結合を形成する電荷も、それらとの他の相互作用を形成する電荷も示すべきではない。
ポリペプチドを新規結合融合ポリペプチドに連結するための、天然および人工ペプチドリンカーの使用は、文献において周知である。したがって、２つ以上のモノマーサブユニットを融合しているリンカーは、天然リンカー、人工リンカー、またはそれらの組合せである。一部の実施形態において、本発明のＴｎ３マルチマー足場中に存在する全てのペプチドリンカーのアミノ酸配列は、同一である。他の実施形態において、本発明のマルチマーＴｎ３足場中に存在するペプチドリンカーの少なくとも２つのアミノ酸配列は、異なる。
一部の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、立体構造のフレキシビリティを有する。一部の実施形態において、ポリペプチドリンカー配列は、（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｘ）ｍアミノ酸配列を含み、式中、Ｘは、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）またはバリン（Ｖ）であり、ｍは、正の整数である（例えば、配列番号２０９参照）。具体的な実施形態において、ポリペプチドリンカー配列は、（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ）ｍアミノ酸配列を含み、式中、ｍは、正の整数である（例えば、配列番号１４７参照）。別の具体的な実施形態において、ポリペプチドリンカー配列は、（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ）ｍアミノ酸配列を含み、式中、ｍは、正の整数である（例えば、配列番号１４８参照）。さらに別の具体的な実施形態において、ポリペプチドリンカー配列は、（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ）ｍアミノ酸配列を含む、式中、ｍは、正の整数である（例えば、配列番号１４９参照）。一部の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、本質的に決まった構造を取らない天然または人工ポリペプチドである（例えば、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：１１８６−１１９０、２００９参照；さらにＳｉｃｋｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：Ｄ７８６−９３、２００７参照）。
ペプチドリンカーは、非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基が導入されるように改変することができる。このようなアミノ酸残基の例は、（続いて非ポリペプチド部分が結合される）システイン残基であり得、またはアミノ酸配列は、インビボＮ−グリコシル化部位を含み得る（それにより、糖部分（インビボで）をペプチドリンカーに結合させる）。
一部の実施形態において、ポリペプチドマルチマー中に存在する全てのペプチドリンカーのアミノ酸配列は、同一である。あるいは、ポリペプチドマルチマー中に存在する全てのペプチドリンカーのアミノ酸配列は、異なり得る。
Ｔｎ３足場の標識またはコンジュゲーション
本発明のＴｎ３足場は、非コンジュゲート形態で使用することができ、または標的検出を容易にするために、または画像化もしくは治療法のために、種々の異種部分の少なくとも１つにコンジュゲートさせることができる。Ｔｎ３足場は、精製を実施する場合、精製の前または後のいずれかで標識しまたはコンジュゲートさせることができる。
多くの異種部分は、本発明のＴｎ３足場を結合させることができる好適な官能基を欠く。したがって、一部の実施形態において、リンカーを介してエフェクター分子を足場に結合させ、リンカーは、コンジュゲーションのための反応性基を含む。一部の実施形態において、本発明のＴｎ３足場にコンジュゲートしている異種部分は、リンカーとして機能し得る。他の実施形態において、この部分は、開裂可能または開裂不能であり得るリンカーを介してＴｎ３足場にコンジュゲートさせる。一実施形態において、開裂可能な結合分子は、酸化還元開裂可能結合分子であり、その結果その結合分子は、より低い酸化還元電位を有する環境、例えば、細胞質および遊離スルフヒドリル基を有するより高濃度の分子を有する他の領域中で開裂可能である。酸化還元電位の変化に起因して開裂され得る結合分子の例には、ジスルフィドを含有する分子が含まれる。
一部の実施形態において、本発明のＴｎ３足場を、コンジュゲーションのための反応性基を提供するように遺伝子操作する。このような足場において、Ｎ末端および／またはＣ末端は、コンジュゲーションのための反応性基を提供するようにも機能し得る。他の実施形態において、Ｎ末端は、ある部分（例えば、限定されるものではないが、ＰＥＧ）にコンジュゲートさせることができる一方、Ｃ末端は、別の部分（例えば、限定されるものではないが、ビオチン）にコンジュゲートさせ、またはその逆も可能である。
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」という用語は、カップリング剤、カップリングまたは活性化部分を有しまたは有さない（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはマレイミド部分を有する）ポリエチレングリコール化合物またはその誘導体を意味する。「ＰＥＧ」という用語は、例えば、末端のＯＨ基がメトキシ基（ｍＰＥＧと称される）により置き換えられた、５００から１５０，０００Ｄａの分子量のポリエチレングリコール（その類似体を含む）を示すことが意図される。
本発明のＴｎ３足場は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により誘導体化することができる。ＰＥＧは、２つの末端ヒドロキシル基を有するエチレンオキシド繰り返し単位の直鎖水溶性ポリマーである。ＰＥＧは、典型的には約５００ダルトンから約４０，０００ダルトンに及ぶそれらの分子量により分類される。具体的な実施形態において、用いられるＰＥＧは、５，０００ダルトンから約２０，０００ダルトンに及ぶ分子量を有する。本発明の足場にカップリングされたＰＥＧは、分枝鎖でも非分枝鎖でもよい。例えば、Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ６：６２−６９参照。ＰＥＧは、Ｎｅｋｔａｒ Ｉｎｃ．，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．および他の会社から市販されている。このようなＰＥＧには、限定されるものではないが、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルスクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、およびモノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）が含まれる。
簡潔に述べると、用いられる親水性ポリマー、例えば、ＰＥＧを、非反応性基、例えば、メトキシ基またはエトキシ基により一端においてキャッピングする。その後、ポリマーを、好適な活性化剤、例えば、ハロゲン化シアヌル（例えば、塩化、臭化またはフッ化シアヌル）、カルボニルジイミダゾール、無水物試薬（例えば、無水ジハロコハク酸、例えば、無水ジブロモコハク酸）、アシルアジド、ｐ−ジアゾニウムベンゾイルエーテル、３−（ｐ−ジアゾニウムフェノキシ）−２−ヒドロキシプロピルエーテル）などとの反応により他端において活性化させる。次いで、活性化ポリマーを本明細書に記載のポリペプチドと反応させてポリマーにより誘導体化されたポリペプチドを産生する。あるいは、本発明のＴｎ３足場中の官能基は、ポリマーとの反応のために活性化させることができ、または２つの基は、公知のカップリング法を使用する協調カップリング反応で結合させることができる。本発明のポリペプチドは、当業者に公知であり、当業者により使用される多数の他の反応スキームを使用してＰＥＧにより誘導体化することができることは容易に認識される。ＰＥＧは、Ｔｎ３足場のいずれかの末端またはＴｎ３足場内の１つ以上の官能基の位置において、本発明の足場にカップリングすることができる。ある実施形態において、ＰＥＧは、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかにおいてカップリングされる。
他の実施形態において、本発明のＴｎ３足場、その類似体または誘導体は、診断剤または検出剤にコンジュゲートさせることができる。このようなＴｎ３足場は、臨床試験手順の一部として疾患の発症または進行のモニタリングまたは予後診断に、例えば、特定の治療法の効力を決定するために有用であり得る。
本発明は、治療部分にコンジュゲートしているＴｎ３足場の使用をさらに包含する。Ｔｎ３足場は、治療部分、例えば、細胞毒素、例えば、静菌剤もしくは殺細胞剤、治療剤または放射性金属イオン、例えば、α線放射体にコンジュゲートさせることができる。細胞毒素または細胞傷害剤には、細胞に有害である任意の薬剤が含まれる。
Ｔｎ３足場のアッセイ
Ｔｎ３足場の抗原への結合親和性および他の結合特性は、当分野において公知の種々のインビトロアッセイ法、例として、例えば、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはカイネティクス（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析）、ならびに他の方法、例えば、間接結合アッセイ、競合結合アッセイ、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）により測定することができる。これらのおよび他の方法は、試験されている構成要素の１つ以上に対する標識を利用し、および／または種々の検出法、例として、限定されるものではないが、発色、蛍光、発光、または同位体標識を用い得る。結合親和性およびカイネティクスについての詳細な説明は、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，ｅｄ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９）に見出すことができる。
一部の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、規定のカイネティクスで標的に特異的に結合する。一部の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、１×１０−２Ｍ、１×１０−３Ｍ、１×１０−４Ｍ、１×１０−５Ｍ、１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、１×１０−１３Ｍ、１×１０−１４Ｍ未満または１×１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有し得る。具体的な実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（登録商標）により、または当分野において公知の他のアッセイにより測定して５００μＭ、１００μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、またはそれ未満のＫｄを有する。
代替的な実施形態において、本発明のＴｎ３足場の親和性は、少なくとも１×１０２Ｍ−１、１×１０３Ｍ−１、１×１０４Ｍ−１、１×１０５Ｍ−１、１×１０６Ｍ−１、１×１０７Ｍ−１、１×１０８Ｍ−１、１×１０９Ｍ−１、１×１０１０Ｍ−１ １×１０１１Ｍ−１ １×１０１２Ｍ−１、１×１０１３Ｍ−１、１×１０１４Ｍ−１、１×１０１５Ｍ−１、または少なくとも５×ｌ０１５Ｍ−１のｋｏｎ／ｋｏｆｆ比として算出される会合定数（Ｋａ）を単位として記載される。
ある実施形態において、本発明のＴｎ３足場が標的エピトープから解離する速度は、ＫｄまたはＫａの値よりも適切であり得る。一部の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、１０−３ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０−４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満、または１０−１０ｓ−１未満のｋｏｆｆを有する。
ある他の実施形態において、本発明のＴｎ３足場が標的エピトープと会合する速度は、ＫｄまたはＫａの値よりも適切であり得る。この場合、本発明のＴｎ３足場は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０９Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ速度で標的に結合する。
本発明のＴｎ３足場は、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用な固体支持体に結合させることもできる。このような固体支持体には、限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが含まれる。
ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場
本発明は、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合するＴｎ３足場を提供する。具体的な実施形態において、本発明の足場は、ヒトＣＤ４０Ｌに特異的に結合する。他の具体的な実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、マウス、ニワトリ、アカゲザル、カニクイザル、ラット、またはウサギからのＣＤ４０Ｌ相同体に結合する。一部の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌの露出エピトープに結合する。このような実施形態には、細胞上で内因的に発現したＣＤ４０Ｌおよび／または受容体を異所的に発現するように形質移入された細胞が含まれる。
一部の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、モノマーＣＤ４０Ｌ上でディスプレイされたエピトープを認識する。他の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌのトリマー形態上でディスプレイされたエピトープを認識する。他の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、膜結合ＣＤ４０Ｌ上でディスプレイされたエピトープを認識する。他の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、可溶性ＣＤ４０Ｌ上でディスプレイされたエピトープを認識する。
さらに他の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、モノマーＣＤ４０Ｌに結合し、ＣＤ４０Ｌ分子のオリゴマー化を妨害または干渉する。さらに他の実施形態において、本発明の足場は、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０との相互作用を低減させまたは阻害する。他の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌにより媒介される細胞シグナリングをアゴナイズする。さらに他の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌにより媒介される細胞シグナリングをアンタゴナイズする。
本発明はまた、本明細書に記載のＴｎ３足場を使用してＣＤ４０Ｌ活性をモジュレートする方法を提供する。一部の実施形態において、本発明の方法は、ＣＤ４０ＬをＣＤ４０Ｌ特異的足場と接触させること、およびＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの相互作用を遮断することを含む。他の実施形態において、本発明の方法は、ＣＤ４０Ｌ発現細胞をＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場と接触させること、および細胞表面からのＣＤ４０Ｌのタンパク質分解開裂を妨害することを含む。他の実施形態において、本発明の方法は、ＣＤ４０ＬモノマーをＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場と接触させること、およびＣＤ４０Ｌオリゴマー化を妨害することを含む。他の実施形態において、ＣＤ４０Ｌのダイマー化またはオリゴマー化は、マルチマーＴｎ３足場の使用を介して達成することができる。
一部の実施形態において、本発明の方法は、当分野において公知の定型アッセイにより計測してＣＤ４０媒介免疫応答（例えば、Ｅｌｑｕｅｔａ ｅｔ ａｌ．２２９：１５２−１７２，２００９参照）、またはＣＤ４０ＬへのＣＤ４０結合により開始される下流シグナリング経路を低減させるＣＤ４０Ｌ特異的足場の投与を含む。
任意の特定の理論により拘束されるものではないが、本発明のＣＤ４０Ｌ足場は、ＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合を妨害することにより、可溶性ＣＤ４０Ｌを結合および封鎖することにより、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０との相互作用を変化させるが結合を妨害しないことにより、可溶性ＣＤ４０Ｌを生じさせるための細胞表面からのＣＤ４０Ｌのメタロプロテアーゼ媒介酵素的開裂を妨害または向上させることにより、細胞表面ＣＤ４０Ｌエンドサイトーシスを妨害または向上させることなどにより機能し得る。
特異的ＣＤ４０Ｌ結合配列
一部の実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのＣＤ４０Ｌに結合するループ配列を含むＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む。
一部の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、以下から選択されるＣＤ４０Ｌ結合モノマークローンの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのループ配列を含む：３０９（ナイーブＴｎ３ライブラリーから単離された親３０９ファミリークローン；配列番号２０）、３０９ＦＧｗｔ（ヒト化ＦＧループを有する親３０９クローン；配列番号２２）、３４０（親和性成熟３０９クローン；配列番号２４）、３４１（親和性成熟３０９クローン；配列番号２６）、３４２（親和性成熟３０９クローン；配列番号２８または配列番号１４６）、３４３（親和性成熟３０９クローン；配列番号３０）、３４４（親和性成熟３０９クローン；配列番号３２）、３４５（親和性成熟３０９クローン；配列番号３４）、３４６（親和性成熟３０９クローン；配列番号３６）、３４７（親和性成熟３０９クローン；配列番号３８）、３４８（親和性成熟３０９クローン；配列番号４０）、３４９（親和性成熟３０９クローン；配列番号４２）、３１１（ナイーブＴｎ３ライブラリーから単離された親３１１ファミリークローン；配列番号４４）、３１１Ｋ４Ｅ（第１の親和性成熟ラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号４６）；３１１Ｋ４Ｅ＿１（第２の親和性成熟ラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号４８）、３１１Ｋ４Ｅ＿２（第２の親和性成熟のラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号５０）、３１１Ｋ４Ｅ＿３（第２の親和性成熟ラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号５２）、３１１Ｋ４Ｅ＿４（第２の親和性成熟ラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号５４）、３１１Ｋ４Ｅ＿５（第２の親和性成熟ラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号５６）、３１１Ｋ４Ｅ＿７（第２の親和性成熟ラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号５８）、３１１Ｋ４Ｅ＿８（第２の親和性成熟ラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号６０）、３１１Ｋ４Ｅ＿９（第２の親和性成熟ラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号６２）、３１１Ｋ４Ｅ＿１０（第２の親和性成熟ラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号６４）、３１１Ｋ４Ｅ＿１１（第２の親和性成熟ラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号６６）、３１１Ｋ４Ｅ＿１２（第２の親和性成熟ラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号６８）、３１１Ｋ４Ｅ＿１３（第２の親和性成熟ラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号７０）、３１１Ｋ４Ｅ＿１４（第２の親和性成熟ラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号７２）、３１１Ｋ４Ｅ＿１５（第２の親和性成熟ラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号７４）、３１１Ｋ４Ｅ＿１６（第２の親和性成熟ラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号７６）、３１１Ｋ４Ｅ＿１９（第２の親和性成熟ラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号７８）、３１１Ｋ４Ｅ＿２０（第２の親和性成熟ラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号８０）、および３１１Ｋ４Ｅ＿２１（第２の親和性成熟ラウンドからのバリアント３１１ファミリークローン；配列番号８２）。
一部の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、表２に列記されるループ配列から選択される少なくとも１つのループ配列を含む。他の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、表２に列記されるＢＣループ配列から選択される少なくとも１つのＢＣループ配列を含む。他の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、表２に列記されるＤＥループ配列から選択される少なくとも１つのＤＥループ配列を含む。他の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、表２に列記されるＦＧループ配列から選択される少なくとも１つのＦＧループ配列を含む。
一部の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、表２に列記されるＢＣループ配列から選択されるＢＣループ配列；および表２に列記されるＤＥループ配列から選択されるＤＥループ配列を含む。他の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、表２に列記されるＢＣループ配列から選択されるＢＣループ配列；および表２に列記されるＦＧループ配列から選択されるＦＧループ配列を含む。他の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、表２に列記されるＤＥループ配列から選択されるＤＥループ配列；および表２に列記されるＦＧループ配列から選択されるＦＧループ配列を含む。一部の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットは、１、２または３つの異なるＴｎ３クローンからのループ配列に対応するループ配列を含む。
ある実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的モノマー足場配列が配列のＣ末端においてリンカーおよび／またはヒスチジンタグ（例えば、Ｈｉｓ−８タグ）、または追加のＮ末端アミノ酸を含有する場合、これらのＣ末端リンカーおよび／またはヒスチジンタグならびに追加のＮ末端アミノ酸を除去することができ、したがって、対応するアミノ酸配列は、Ｃ末端リンカーおよびＨｉｓタグ配列ならびに１つまたは複数のＮ末端追加アミノ酸の欠失を含有する。
一部の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、単一のモノマーサブユニット、例えば、３４２クローン配列（親和性成熟３０９クローン；配列番号２８および／または配列番号１４６）を含む。他の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的足場は、２つ以上のモノマーサブユニット、例えば、２つの３４２クローンモノマーサブユニット（配列番号２８および／または配列番号１４６）をタンデムで（例えば、配列番号１３５参照）含む。具体的な実施形態において、本発明のＴｎ３足場は、バリアントＨＳＡにコンジュゲートしている（例えば、配列番号１３４および配列番号１３５参照）。さらなる実施形態において、ＨＳＡは、マルチマーＴｎ３足場のＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいてコンジュゲートさせることができる。
具体的な実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、単一の３１１Ｋ４Ｅ＿１２モノマーサブユニット、ＧＳリンカー、およびＣ３４Ｓ ＨＳＡバリアント（例えば、配列番号２０１参照）を含む。別の具体的な実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、ベータ鎖Ｃ ＣＥＬＴＹＧバリアントを有する単一の３１１Ｋ４Ｅ＿１２モノマーサブユニット、全グリシンリンカー、およびＣ３４Ｓ ＨＳＡバリアント（例えば、配列番号２０２参照）を含む。別の具体的な実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、タンデムの２つの３１１Ｋ４Ｅ＿１２サブユニットおよび２つのＧＳリンカーを含み、一方のＧＳリンカーはサブユニットを互いに連結し、第２のＧＳリンカーは一方のサブユニットをＣ３４Ｓ ＨＳＡバリアントに連結する（例えば、配列番号２０３参照）。さらに別の具体的な実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、タンデムの２つの３１１Ｋ４Ｅ＿１２サブユニット、および２つの全グリシンリンカーを含み、一方の全グリシンリンカーはサブユニットを互いに連結し、第２の全グリシンリンカーは一方のサブユニットをＣ３４Ｓ ＨＳＡバリアントに連結する（例えば、配列番号２０４参照）。
１つの具体的な実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、ＧＳリンカーを介してタンデムに連結されている２つの３０９サブユニットを含む（例えば、配列番号２０５参照）。別の具体的な実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、Ｃ３４Ｓ ＨＳＡバリアントに連結されている単一の３０９サブユニットを含む（例えば、配列番号２０６参照）。別の具体的な実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、タンデムの２つの３０９サブユニット、および２つのＧＳリンカーを含み、一方のＧＳリンカーはサブユニットを互いに連結し、第２のＧＳリンカーは一方のサブユニットをＣ３４Ｓ ＨＳＡバリアントに連結する（例えば、配列番号２０７参照）。
具体的な実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、単一の３４２モノマーサブユニット、ＧＳリンカー、およびＣ３４Ｓ ＨＳＡバリアントを含む（例えば、配列番号１３４参照）。別の具体的な実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、単一の３４２モノマーサブユニット、全グリシンリンカー、およびＣ３４Ｓ ＨＳＡバリアントを含む（例えば、配列番号１４４参照）。別の具体的な実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、タンデムの２つの３４２サブユニット、および２つのＧＳリンカーを含み、一方のＧＳリンカーはサブユニットを互いに連結し、第２のＧＳリンカーは一方のサブユニットをＣ３４Ｓ ＨＳＡバリアントに連結する（例えば、配列番号１３５参照）。さらに別の具体的な実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、タンデムの２つの３４２サブユニット、および２つの全グリシンリンカーを含み、一方の全グリシンリンカーはサブユニットを互いに連結し、第２の全グリシンリンカーは一方のサブユニットをＣ３４Ｓ ＨＳＡバリアントに連結する（例えば、配列番号１４５参照）。さらに別の具体的な実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、ＧＳリンカーによりタンデムに連結されている２つの３４２サブユニットを含む（例えば、配列番号２０８参照）。
具体的な実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は含み、別の具体的な実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、３１１サブユニット、または３１１に由来するサブユニット（例えば、３１１Ｋ４Ｅ＿１２）および３０９サブユニット、またはタンデムの３０９に由来するサブユニット（例えば、３４２）および２つのＧＳリンカーを含み、一方のＧＳリンカーはサブユニットを互いに連結し、第２のＧＳリンカーは一方のサブユニットをＣ３４Ｓ ＨＳＡバリアントに連結する（例えば、配列番号１３５参照）。さらに別の具体的な実施形態において、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、３１１サブユニット、または３１１に由来するサブユニット（例えば、３１１Ｋ４Ｅ＿１２）および３０９サブユニット、またはタンデムの３０９に由来するサブユニット（例えば、３４２）、および２つの全グリシンリンカーを含み、一方の全グリシンリンカーはサブユニットを互いに連結し、第２の全グリシンリンカーは一方のサブユニットをＣ３４Ｓ ＨＳＡバリアントに連結する（例えば、配列番号１４５参照）。
ＣＤ４０Ｌ特異的タンデム二価Ｔｎ３足場および血清アルブミン（ＳＡ）融合体の例を図２Ａ（図９Ａも参照）に示す。具体的なリンカーを図２Ａに提供するが、本明細書に提供されるとおり他のリンカーが企図される。野生型成熟ＳＡ、例えば、ネズミ血清アルブミン（ＭＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を使用することができるが、成熟ＳＡ中の１つ以上のシステイン（Ｃ）アミノ酸残基を例えば、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）などにより置換することができることが企図される。
代表的な構築物を以下に示す。ＳＡの配列を下線により示す。リンカーを枠で囲む。多数の変動が本発明の範囲内であることが理解される。例えば、リンカーは変化させることができ（いくつかの非限定的な例が本明細書に提供される）、最初の１または２つのＮ末端アミノ酸残基（ＳＱ）は不存在および／または代替アミノ酸残基により置換されていてよく、タグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ）を組み込むことができ、代替ＣＤ４０Ｌ特異的足場（例えば、フィブロネクチンの第１０Ｆｎ３ドメインをベースとする足場）を類似の構築物などの中で利用することができる。
Figure 2017195884
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医薬組成物
別の態様において、本発明は、組成物、例えば、限定されるものではないが、薬学的に許容可能な担体と一緒に配合された、本発明のＴｎ３足場の１つまたは組合せを含有する医薬組成物を提供する。このような組成物は、例えば、限定されるものではないが、本発明の２つ以上の異なるＴｎ３足場の１つまたは組合せを含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合し、または相補的な活性を有するＴｎ３足場の組合せを含み得る。具体的な実施形態において、医薬組成物は、本発明の単一のモノマーＴｎ３足場を含む。具体的な実施形態において、医薬組成物は、本発明のマルチマーＴｎ３足場を含む。さらに別の具体的な実施形態において、医薬組成物は、本発明のダイマーＴｎ３足場を含む。
本発明の医薬組成物は、例えば、他の薬剤と組み合わせた組合せ療法において投与することもできる。例えば、組合せ療法は、免疫療法、化学療法、放射線療法、または薬物療法であり得る少なくとも１つの他の治療法と組み合わせた本発明のＴｎ３足場を含み得る。本発明の医薬化合物は、１つ以上の薬学的に許容可能な塩を含み得る。
足場の使用方法
本発明のＴｎ３足場は、インビトロおよびインビボにおいて診断および治療有用性を有する。例えば、これらの分子を、培養物中の細胞に、例えば、インビトロもしくはエキソビボで、または対象中に、例えば、インビボで投与して種々の障害を治療、予防または診断することができる。
本発明はまた、本発明のＴｎ３足場を使用する方法を提供する。本発明はまた、疾患、疾患の障害または障害、例として、限定されるものではないが、癌、炎症および自己免疫疾患、感染性疾患に伴う１つ以上の症状の予防、診断、管理、治療または改善のための、単独または他の治療法との組合せのいずれかでの本発明のＴｎ３足場の使用を包含する。本発明はまた、疾患、障害または感染、例として、限定されるものではないが、癌、炎症および自己免疫疾患、感染性疾患に伴う１つ以上の症状の予防、診断、管理、治療または改善のための、単独または他の治療法との組合せのいずれかでの、部分（例えば、治療剤または薬物）にコンジュゲートまたは融合している本発明のＴｎ３足場の使用を包含する。
本発明はまた、慣習的な抗体によっては容易に達成されないエピトープを標的化する方法を提供する。例えば、一実施形態において、本発明のＴｎ３足場を使用して隣接抗原を最初に標的化することができ、結合の間、別の結合ドメインが潜在抗原に会合し得る。
本発明はまた、区別される細胞型を一緒にするために本発明のＴｎ３足場を使用する方法を提供する。一実施形態において、本発明のタンパク質は、１つの結合ドメインを有する標的細胞に結合し、別の結合ドメインを介して別の細胞を動員し得る。別の実施形態において、第１の細胞は癌細胞であり得、第２の細胞は免疫エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞である。別の実施形態において、本発明のＴｎ３足場を使用して２つの区別される細胞間、例えば、免疫応答をブーストする可能性がある抗原提示細胞とＴ細胞との相互作用を強化することができる。
本発明はまた、細胞集団を枯渇させるためにＴｎ３足場を使用する方法を提供する。一実施形態において、本発明の方法は、以下の細胞型の枯渇において有用である：好酸球、好塩基球、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、単球および腫瘍細胞。
本発明はまた、診断試薬としてＴｎ３足場を使用する方法を提供する。このような診断試薬は、ＣＤ４０Ｌの存在もしくは不存在、ＣＤ４０受容体の存在、ＣＤ４０受容体へのＣＤ４０Ｌの結合効率、患者中の遊離ＣＤ４０Ｌ、試料中の遊離ＣＤ４０Ｌ、または試料中のＣＤ４０受容体に結合したＣＤ４０Ｌについて試験するために使用することができる。
本発明のＴｎ３足場およびそれを含む組成物は、多くの目的に、例えば、広範な慢性および急性疾患および障害、例として、限定されるものではないが、自己免疫および／または炎症疾患に対する治療剤として有用である。本明細書に記載の本発明の組成物および方法は、自己免疫障害および／または炎症障害の予防または治療に有用である。
自己免疫および／または炎症性障害の例には、限定されるものではないが、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、シェーグレン症候群、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、加齢性黄斑変性、血管新生性緑内障、血管腫、甲状腺過形成（グレーブス病を含む）、角膜および他の組織移植、ならびに慢性炎症、敗血症、関節リウマチ、腹膜炎、クローン病、再灌流損傷、敗血症、内毒素ショック、嚢胞性線維症、心内膜炎、乾癬、関節炎（例えば、乾癬性関節炎）、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流損傷、脊髄損傷および同種移植片拒絶反応。自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄多発性神経障害、チャーグストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、１型または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、例えば、疱疹状皮膚炎血管炎、白斑、およびヴェゲナー肉芽腫が含まれる。
炎症障害の例には、限定されるものではないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー障害、敗血性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルスまたは細菌感染から生じる慢性炎症が含まれる。本発明の組成物および方法を、上記疾患を予防、管理または治療するために使用される１つ以上の慣用の治療法とともに使用することができる。
本発明は、癌、自己免疫、炎症または感染疾患またはそれらの１つ以上の症状または１つ以上の症状を予防、管理、治療または改善する方法であって、それが必要とされる対象に、本発明の１つ以上のＴｎ３足場を、癌治療剤ではない治療剤（別称、非癌治療法）の１つ以上との組合せで投与することを含む方法を提供する。
このような薬剤の例には、限定されるものではないが、制吐剤、抗真菌剤、抗細菌剤、例えば、抗生物質、抗炎症剤、および抗ウイルス剤が含まれる。制吐剤の非限定例には、メトピマジンおよびメトクロプラミドが含まれる。抗真菌剤の非限定例には、アゾール薬、イミダゾール、トリアゾール、ポリエン、アンホテリシンおよびリリミジン（ｒｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）が含まれる。抗細菌剤の非限定例には、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン、ミトラマイシン、セファロスポリン、イミペネム、アクストレオナム（ａｘｔｒｅｏｎａｍ）、バンコマイシン、シクロセリン、バシトラシン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、トリメトプリム、ノルフロキサシン、レファンピン（ｒｅｆａｍｐｉｎ）、ポリミキシン、アンホテリシンＢ、ナイスタチン、ケトカナゾール（ｋｅｔｏｃａｎａｚｏｌｅ）、イソニアジド、メトロニダゾールおよびペンタミジンが含まれる。抗ウイルス剤の非限定例には、ヌクレオシド類似体（例えば、ジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダルビン（ｖｉｄａｒｂｉｎｅ）、イドクスウリジン、トリフルリジンおよびリバビリン）、フォスカレット（ｆｏｓｃａｒｅｔ）、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナビル、インターフェロン（「ＩＦＮ」）−α、βまたはγおよびＡＺＴが含まれる。抗炎症剤の非限定例には、非ステロイド抗炎症薬（「ＮＳＡＩＤ」）、ステロイド抗炎症薬、ベータ−アゴニスト、抗コリン剤およびメチルキサンチンが含まれる。
一実施形態において、本発明は、慢性炎症を治療し得る組成物を含む。一実施形態において、組成物は、破壊または不活性化のための免疫細胞の標的化において有用である。一実施形態において、組成物は、活性化Ｔ細胞、休止Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、または樹状細胞の標的化において有用である。別の実施形態において、本発明は、免疫細胞機能を減少させ得る組成物を含む。別の実施形態において、組成物は、免疫細胞機能を除去し得る。
別の実施形態において、本発明は、胃腸管の疾患の治療に有用な組成物を含む。本発明の足場は、低ｐＨ条件下で高レベルの安定性を示す。低ｐＨにおける安定性は、組成物が種々の胃腸障害、例えば、過敏性腸症候群、胃食道逆流、腸偽閉塞、ダンピング症候群、難治性悪心、消化性潰瘍、虫垂炎、虚血性大腸炎、潰瘍性大腸炎、胃炎、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）疾患、クローン病、ウィップル病、セリアックスプルー、憩室炎、憩室症、嚥下障害、裂孔ヘルニア、感染性食道障害、しゃっくり、反芻などのための経口投与に好適であることを示唆する。
本発明はさらに、組合せ組成物および疾患またはその症状の予防、治療、低減、または改善におけるそのような組成物の使用方法を提供する。本発明のＴｎ３足場を、疾患またはその症状の予防、治療、低減または改善に好適な慣用の治療法と組み合わせることができる。例示的な慣用の治療法は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（５６ｔｈ ｅｄ．，２００２および５７ｔｈ ｅｄ．，２００３）に見出すことができる。一部の実施形態において、本発明のＴｎ３足場を、化学療法、放射線療法、外科手術、生物剤（抗体もしくはペプチド）を用いる免疫療法、小分子、または当分野において公知の別の治療法と組み合わせることができる。一部の実施形態において、組合せ療法は一緒に施す。他の実施形態において、組合せ療法は別個に施す。
本発明はまた、疾患を診断する方法を提供する。疾患と関連する特異的標的に結合する本発明のＴｎ３足場を、前記疾患を診断するために使用される方法に組み入れることができる。一実施形態において、本発明のＴｎ３足場を、対象における疾患を診断する方法であって、対象から試料を得ること、標的をＴｎ３足場と、標的：足場相互作用の形成を可能とする条件下で試料中で接触させること、標的：足場複合体を同定し、およびそれにより試料中の標的を検出することを含む方法において使用する。他の実施形態において、診断すべき疾患は本明細書に記載される。
本発明はまた、特異的標的を画像化する方法を提供する。一実施形態において、画像化剤、例えば、緑色蛍光タンパク質、他の蛍光タグ（Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミンなど）、ビオチン、または放射性核種にコンジュゲートしている本発明のＴｎ３足場を、特異的標的の存在、局在、または進行を画像化する方法において使用することができる。一部の実施形態において、本発明のＴｎ３足場を含む標的を画像化する方法をインビトロで実施する。他の実施形態において、本発明のＴｎ３足場を含む標的を画像化する方法をインビボで実施する。他の実施形態において、本発明のＴｎ３足場を含む標的を画像化する方法を、ＭＲＩ、ＰＥＴ走査、Ｘ線、蛍光検出により、または当分野において公知の他の検出法により実施する。
本発明はまた、本発明の足場を使用して疾患の進行、再発、治療、または改善をモニタリングする方法も提供する。一実施形態において、疾患の進行、再発、治療、または改善をモニタリングする方法を、本明細書に提供されるとおり画像化、診断する方法、または化合物／標的を本発明のＴｎ３足場と接触させることにより達成する。
医薬投薬および投与
本発明のＴｎ３足場を含む医薬組成物または滅菌組成物を調製するため、足場を、薬学的に許容可能な担体または賦形剤と混合する。投与のため、組成物は、好ましくは発熱物質不含であり、エンドトキシンおよび／または関連する発熱物質を実質的に含まない。治療剤のための投与計画の選択は、いくつかの要因、例として、実体の血清または組織ターンオーバー速度、症状のレベル、実体の免疫原性、および生体マトリックス中の標的細胞の接近性に依存する。ある実施形態において、投与計画は、許容可能なレベルの副作用と一致する患者に送達される治療剤の量を最大化する。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に対して毒性を示すことなく、特定の患者、組成物、および投与様式について所望の治療応答を達成するために有効である活性成分の量を得るために変動させることができる。選択される投与量レベルは、種々の薬物動態要因、例として、用いられる本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられている特定の化合物の排泄速度、治療期間、用いられる特定の組成物との組合せにおける他の薬物、化合物および／または材料、治療されている患者の年齢、性別、体重、病態、全身健康状態および既往歴、ならびに医学分野において周知の同様の要因に依存する。
本発明の組成物は、当分野において公知の種々の方法の１つ以上を使用して１つ以上の投与経路を介して投与することもできる。ある実施形態において、本発明のＴｎ３足場をインビボでの適正な分布を確保するように配合することができる。
均等物
当業者は、定型以下の実験を使用して本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。
本明細書に挙げられる全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別的に参照により本明細書に組み込まれると示されるのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
ここで本発明を以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は説明にすぎず、本発明は、決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、本明細書に提供される技術の結果として明らかになる任意および全ての変形を包含すると解釈されるべきである。
実施例１
親Ｔｎ３足場に基づく３ループライブラリーの構築
ライブラリーは、「Ｔｎ３ＳＳ４」と命名される国際特許出願公開の国際公開第２００９／０５８３７９号パンフレットに記載の親Ｔｎ３足場に基づき構築した。ライブラリーは、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループのランダム化領域を含有した。この設計は、天然ＦｎＩＩＩドメインについて記載される多様性のパターン、ＢＣおよびＦＧループについての３つの異なる長さと一致する特性決定された配列およびループ長さの多様性をＴｎ３ライブラリー中に組み込み、多様性をライブラリー中に導入するための「ＮＨＴ」混合コドンスキームを使用した（Ｈ＝Ａ、Ｔ、Ｃ）。このスキームは、１２／２０個のアミノ酸（表３参照）をコードする１２個のコドンを生成し、すなわち、それぞれのコドンは、特有のアミノ酸をコードした。さらに、停止コドンもシステイン（Ｃｙｓ）コドンも存在しなかった。
Figure 2017195884
ライブラリー多様性は、表４に示される縮重オリゴヌクレオチドを使用して生成した。
Figure 2017195884
ライブラリーは、表５に示されるオリゴヌクレオチドを使用してアセンブルした。
Figure 2017195884
縮重オリゴヌクレオチド（等モル比のＢＣおよびＦＧループにそれぞれ対応するオリゴヌクレオチド）、ＢＣＸ−ＤＥブリッジｖ２、ＤＥ−ＦＧＸブリッジｖ２、およびＫｐｎＩ ａｍｐ ｒｅｖ ｖ２の混合物は、２０サイクルのＰＣＲ反応において過剰の外部プライマーを用いることなくアセンブルした。この産物を希釈し、プライマーＢＣライブラリーａｍｐ ｖ２およびＫｐｎＩリバースｖ２を使用するレギュラーＰＣＲ反応において増幅させた。得られたＰＣＲ産物は、完全なＴｎ３遺伝子を生成し、次いでそれをＮｃｏＩおよびＫｐｎＩにより消化し、ファージディスプレイベクター（国際公開第２００９／０５８３７９号パンフレットに記載）中にライゲートした。ＤＮＡをエレクトロポレーションにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に形質転換した。ライブラリーの最終多様性は、約７．９×１０１０個のメンバーであると推定した。
エレクトロポレーション後、ライブラリーを３７℃において振とうしながら１時間インキュベートした。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加し、１時間後、細胞をより大きい容量に希釈し、３７℃において振とうしながら一晩増殖させた。翌日、ファージを取り出し、ＰＥＧ８０００による沈殿により上清から濃縮した。
実施例２
ヒトＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場についてのライブラリーのパニング
＞１０１０個のユニーク配列を含有するファージディスプレイされたＴｎ３ライブラリーを、ＣＤ４０Ｌに対してパニングした。これらのライブラリーの多様性は、抗体可変ドメイン内の３つのＣＤＲループと相似のＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの配列および長さの変動性に由来した。リードＴｎ３タンパク質の選択は、組換えビオチン化ヒトＣＤ４０ＬおよびＣＤ４０Ｌ過剰発現ＣＨＯ細胞系に対するライブラリーのパニングにより実施した。これら２つの試薬に対する交互のパニングラウンドを使用してリードが組換え細胞外ドメインおよびネイティブ膜固定ＣＤ４０Ｌを認識することを確保した。
組換えヒトＣＤ４０Ｌ（ヒトＭｅｇａＣＤ４０Ｌ；Ａｘｘｏｒａ）は、５倍モル過剰のビオチン化試薬を使用してＥＺ−Ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によりビオチン化した。室温において１時間インキュベートした後、試料をＰＢＳ中で一晩透析して未コンジュゲートビオチンを除去した。１０μｇのビオチン化ＣＤ４０ＬをＭ２８０ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上で固定化し、次いで１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＰＢＳ中で２時間ブロッキングした。インプットは、実施例１に記載のとおり開発されたライブラリーまたはさらに標準的な構築技術、例えば、国際公開第２００９／０５８３７９号パンフレットに記載のものを使用して開発されたライブラリーからなるものであった。
ファージは、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＰＢＳ中で２時間ブロッキングした。ブロッキングされたインプットをブロッキングされたＭ２８０ストレプトアビジン対照ビーズ（標的を有さない）に添加し、ロッカー上で室温において２時間インキュベートしてビーズに対する結合剤のライブラリーを枯渇させた。次いで、枯渇ライブラリーをＣＤ４０Ｌコートビーズに添加し、ロッキングプラットフォーム上で室温において２時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ）により３回洗浄して未結合ファージを除去した後、ビーズを指数関数的に増殖する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞に添加し、続いてそれにＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する６０ｍｌの２×ＹＴ培地中で同時感染させた。ファージを振とうしながら３７℃において一晩増殖させた後、一晩培養培地からＰＥＧ沈殿により回収した。
第２のパニングラウンド（ラウンド２）は、ＣＤ４０Ｌ過剰発現ＣＨＯ細胞系に対して実施した。ファージライブラリーは、３％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で室温においてロッキングしながら１時間ブロッキングした。細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により剥離し、５ｍｌのＰＢＳにより２回洗浄し、１０７個の細胞を１ｍｌの３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で室温においてロッキングしながら３０分間ブロッキングした。ブロッキングされた細胞を５００×ｇにおいて５分間回転沈降させ、ブロッキングされたファージライブラリー溶液中で穏やかに再懸濁し、室温において１時間インキュベートした。未結合ファージは、細胞を１ｍｌの３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で３回、およびＰＢＳ中で１回穏やかに洗浄し、細胞をそれぞれの洗浄について新たなＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブを使用して微小遠心機中で５００×ｇで５分間遠心分離することによりペレット化することにより除去した。細胞ペレットを指数関数的に増殖する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ−１Ｂｌｕｅに直接添加し、次いでそれをラウンド１に記載のとおり処理した。
パニングラウンド３は、ラウンド１に記載のとおり実施し、但し結合ファージを、１００ｍＭのＨＣｌを添加し、次いで１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８により中和することにより溶出させた。溶出され、中和されたファージを使用してラウンド１に記載のとおり大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞に感染させた。
パニングラウンド４も、ラウンド２に記載のとおり細胞に対して実施し、但し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中での５回の洗浄を実施した。ラウンド５は、５μｇのビオチン化ＭｅｇａＣＤ４０Ｌを使用して行ったが、その他はラウンド３に記載のとおりであった。
５つのパニングラウンド後、可溶性タンパク質としての得られたＴｎ３バリアントのスクリーニングを実施した。増幅され、ＰＥＧ沈殿したファージ原液をＰＣＲにおいて使用してコードされるＴｎ３配列を包含する断片のプールを増幅させた。この断片プールをＮｃｏＩ＋ＫｐｎＩにより消化し、プラスミドｐＳｅｃ−ｏｐｐＡ（Ｌ２５Ｍ）−Ｔｎ３の対応するＮｃｏＩ−ＫｐｎＩ部位中にクローニングした（例えば、国際公開第２００９／０５８３７９号パンフレット参照）。９６ウェル深ウェルプレート中でカルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する自己誘導ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ｐＳｅｃ−ｏｐｐＡ（Ｌ２５Ｍ）−Ｔｎ３由来構築物により形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＤＥ３細胞を接種した。培養物を３７℃において振とうしながら１８時間増殖させ、細胞を遠心分離により培地から分離した。分泌された可溶性Ｔｎ３バリアントを含有する培地を、ＣＤ４０Ｌ結合についてのスクリーニングアッセイにおいて直接使用した。
１０セットの９６個のクローンをスクリーニングして組換えＣＤ４０Ｌに特異的に結合したＴｎ３タンパク質を同定した。簡潔に述べると、スクリーニングアッセイは、マイクロプレートのウェル中に固定化された抗Ｈｉｓ抗体への結合を介する、培地中に分泌された可溶性Ｈｉｓタグ付Ｔｎ３バリアントの捕捉を利用した。捕捉後、培地および過剰のタンパク質を洗浄除外し、捕捉されたＴｎ３バリアントとＣＤ４０Ｌとの相互作用を、ビオチン化ヒトＭｅｇａＣＤ４０Ｌを利用し、ＳＡ−ＨＲＰおよび慣用のＥＬＩＳＡ試薬により残留標的（プレート洗浄後）を計測することによりモニタリングした。
捕捉工程において、固定化された抗Ｈｉｓ抗体をＴｎ３により飽和させ、それぞれのウェル中の捕捉されたＴｎ３のモル量は、個々のクローンの発現レベルに関係なく実質的に同一になった。Ｔｎ３レベルのこの標準化は、標的相互作用の効率に比例し、タンパク質発現レベルの潜在的な差異により影響を受けないアッセイレベルをもたらした。
このアッセイからの陽性物を配列決定して組換えＣＤ４０Ｌに結合する３４個のユニークＴｎ３配列を同定した。ユニークＣＤ４０Ｌ結合Ｔｎ３配列のパネルから、ロバストなアッセイシグナルおよび培養物上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判断して良好な発現レベルを有する２４個のクローンのサブセットを再発現および小スケール精製に供した。
簡潔に述べると、１％のグルコース）を有するカルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＳｕｐｅｒｂｒｏｔｈ培地に、ｐＳｅｃ−ｏｐｐＡ（Ｌ２５Ｍ）−Ｔｎ３由来構築物により形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＤＥ３細胞を接種した。培養物を３７℃において０．５〜０．８の光学密度（Ｏ．Ｄ．）に増殖させ、次いで０．２ｍＭのＩＰＴＧにより誘導した。３７℃において５時間振とうした後、細胞を遠心分離により培地から分離した。培地からのＴｎ３足場の精製は、Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するバッチ精製により行い、２０ｍＭのイミダゾールを有する２×ＰＢＳ中で洗浄し、２５０ｍＭのイミダゾールを有する２×ＰＢＳにより溶出させた。試料をＰＢＳ中で透析し、Ｇｉｌｌ ａｎｄ ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：３１９，１９８９）に従って濃度を２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度により測定した。
アッセイランキングおよびＳＥＣ挙動に基づき、８つのリードの発現をスケールアップし、機能細胞アッセイにおける試験のために低エンドトキシンレベル（＜１ＥＵ／ｍｇ）に精製した。
２つのＴｎ３クローン（３０９および３１１と命名）は、生化学および細胞ベースアッセイにおいて類似の活性を示し（図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ）、最も近縁の競合クローンよりも３〜５倍強力であった。
ヒトＣＤ４０Ｌ特異的一価Ｔｎ３足場３０９および３１１は、総Ｂ細胞数、形質細胞数およびＩｇクラススイッチを阻害した（図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ）。図６Ａは、Ｊｕｒｋａｔ Ｄ１．１細胞により刺激されたＣＤ１９陽性ヒトＰＢＭＣ上のＨｕＣＤ４０Ｌ誘導ＣＤ８６発現に対する３０９および３１１の阻害効果を示し；図６Ｂは、３０９および３１１によるＨｕＣＤ４０Ｌ刺激Ｂ細胞増殖の阻害を示し；図６ＣＣは、Ｔ／Ｂ細胞共培養物における形質細胞数の阻害を示す。３０９は、ＦＡＣＳにより活性化初代Ｔ細胞に結合することも示した（データ示さず）。ＰＢＭＣは、組換えヒトＭｅｇａＣＤ４０Ｌ（Ａｘｘｏｒａ）またはヒトＣＤ４０Ｌ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｄ１．１，ＡＴＣＣ）により刺激し、２４時間後にＣＤ１９＋／ＣＤ８６＋細胞の割合をＦＡＣＳにより計測した。
３０９および３１１リードクローンは単分散され、精製試料のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析により測定されたとおり、溶液中でより高次のオリゴマーを凝集させる傾向も形成する傾向も全く示さなかった（図７Ａ）。
３０９および３１１リードクローンの熱安定性は、ＰＢＳ ｐＨ７．２中１ｍｇ／ｍＬにおけるタンパク質試料を使用する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により測定し、親Ｔｎ３タンパク質の熱安定性と比較した（図７Ｂ）。３０９および３０１１リードクローンは、７０±１℃のＴｍを有し、それは親Ｔｎ３のＴｍ（７２℃）をわずかに下回るにすぎなかった。
ネズミ交差反応性クローンが同定されなかったため、上記の類似のパニングプロセスを実施してＭ１３と命名されるネズミ特異的Ｔｎ３を同定した。Ｍ１３は、ＰＢＭＣ細胞ベースアッセイにおける活性も示した（図１Ａ参照）。
実施例３
ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場リード最適化
親和性最適化を使用して選択されたＴｎ３リードの効力を増加させた。一般に、標的に接触するＴｎ３ループ内の１つ以上の突然変異誘発ラウンドを実施し、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーから改善されたバリアントを選択した。
３．１ ループスワッピング
２つのリード中の３つのどのループがＣＤ４０Ｌとの相互作用に関与するのかを決定するため、それぞれの単一ループ配列をヒトテネイシンＣに見出される親Ｔｎ３ループ配列に変化させた構築物を生成した。突然変異バリアントの活性を、上記スクリーニングアッセイに記載のとおり実施された結合アッセイにおいて元のバリアントと比較した（図１０Ａ）。両方のリードについて、ＢＣおよびＤＥループの突然変異は、ＣＤ４０Ｌへの結合の完全な損失をもたらした一方、親Ｔｎ３配列へのＦＧループの変化は、結合に対する効果を有さず（３０９について）または限定された効果を有した（３１１）。したがって、ＢＣおよびＤＥループが主としてＣＤ４０Ｌへの接触を担う配列を含有すると考えられ、したがって最初に親和性最適化のために選択した。
３．２ ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場３０９リード最適化
ループスワッピング実験は３０９ＦＧループ配列を親Ｔｎ３ＦＧループ配列により結合効力の実質的な損失なしで親Ｔｎ３ＦＧループ配列により置換することができることを示したため、この構築物（３０９ＦＧｗｔと称する）を親和性成熟のための骨格として使用することが決定された。これは、親テネイシンＣ配列から逸脱する非必須突然変異を排除して考えられる免疫原性リスクを低減させる。親Ｔｎ３ＦＧループ配列は、最終リード分子中の突然変異により後に排除されるＲＧＤモチーフを含有したことに留意すべきである。３つのＢＣループライブラリーおよび１つのＤＥループライブラリーを生成した。
３つのＢＣループライブラリーについて、縮重オリゴＢＣ９ＰＣＲ、ＢＣ９−ループＮＮＫおよび３０９ＢＣ−ループＮＮＫドープ（表６）をリバースプライマーＫｐｎ１ ａｍｐ ｒｅｖ ｖ２（表５）と一緒に使用し、ＢＣループコドンが停止コドンにより置き換えられた３０９ＦＧｗｔ由来テンプレートを使用して３つのＰＣＲラウンドを行った。続いて、プライマーＢＣライブラリーａｍｐ ｖ２（表５）およびＫｐｎＩリバースｖ２を用いるそれらの断片のＰＣＲ増幅により、全長Ｔｎ３ライブラリー断片を得た。
ＤＥループライブラリーについて、３０９ＦＧｗｔ由来テンプレート（ＤＥ−ループコドンが停止コドンにより置き換えられている）に対するＤＥ ＰＣＲおよびＫｐｎＩ ａｍｐリバースｖ２を用いるＰＣＲ増幅により、ランダム化ＤＥループおよび野生型Ｔｎ３ＦＧループを含有する断片を得、３０９テンプレートに対するＢＣライブラリーａｍｐ ｖ２およびＢＣＸ−ＤＥブリッジｖ２を用いてＰＣＲにより生成されたＤＥループ上流のＴｎ３領域をコードする断片と組み合わせた。２つの断片を、外部プライマーＢＣライブラリーａｍｐ ｖ２およびＫｐｎＩリバースｖ２を用いる重複ＰＣＲにおいて結合させた。
Figure 2017195884
ＮｃｏＩ−ＫｐｎＩ断片をファージディスプレイベクター中にクローニングし、および実施例１に記載のとおりファージライブラリーを生成した。
４つのライブラリーを、実施例２の第１のラウンドに記載のとおりビオチン化ヒトＭｅｇａＣＤ４０Ｌに対して別個にパニングし、ラウンド１において４μｇのＣＤ４０Ｌを、ラウンド２において１μｇを使用した。ラウンド２後のファージアウトプットの増幅後、Ｑｉａｇｅｎ Ｓｐｉｎ Ｍ１３キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して一本鎖ＤＮＡを単離し、ＢＣ ｌｉｂ ａｍｐ ｖ２およびＢＣシャフルｒｅｖを使用してＢＣループライブラリーからの断片を含有するＢＣループのプールを増幅させた一方、プライマーＤＥ−シャフルＦＷＤおよびＫｐｎＩリバースｖ２を使用してＤＥループ含有断片のプールをＤＥループライブラリーから増幅させた。ＰＣＲ断片をゲル精製し、外部プライマーＢＣ ｌｉｂ ａｍｐ ｖ２およびＫｐｎＩリバースｖ２を使用してそれらの重複配列を介してアセンブルした。得られたＰＣＲ断片を使用して上記のとおりファージベクター中のライブラリーを生成した。このライブラリーを、実施例２に記載のとおりビオチン化ヒトＭｅｇａＣＤ４０Ｌに対して合計５つのラウンドについてパニングし、但し、ライブラリーをラウンド１から４について、５０ｎＭ、２０ｎＭ、２０ｎＭ、および１０ｎＭ（５０μｌの総容量中）の濃度において最初に標的と２時間接触させてからブロッキングされたＭ２８０ストレプトアビジン化磁気ビーズと１０分間インキュベートし、次いで洗浄した。
アウトプットを、プラスミドｐＳｅｃ−ｏｐｐＡ（Ｌ２５Ｍ）−Ｔｎ３ｐＳｅｃのＮｃｏＩ−ＫｐｎＩ部位中にプールクローニングし、上記スクリーニングアッセイにおいて可溶性タンパク質を使用して１６個の９６ウェルプレートをＣＤ４０Ｌ結合についてスクリーニングした。２７０個の最高評価クローンを選び、再アッセイし、配列決定した。１０個のクローンを、結合アッセイおよび配列決定に基づくさらなる特性決定のために選択した。これは、ＰＢＭＣアッセイにおける効力の評価、バイオセンサーアッセイにおけるＣＤ４０Ｌへの結合についてのＫｄ測定、示差走査熱量測定により測定される熱力学安定性、およびサイズ排除クロマトグラフィー分析による溶液中でのより高次のオリゴマーの凝集または形成傾向を含んだ。結果を表７にまとめる。１０個の最適化クローン（３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８および３４９と命名）とアラインさせた３０９および３０９ＦＧｗｔクローンの配列を図１１Ａおよび１１Ｂに示す。
親和性成熟バリアントは、３０９クローンよりも１〜３ｌｏｇ高い効力を示し、ＤＳＣにより計測されるとおり高い安定性を保持し、ＳＥＣにより計測されるとおりほとんどは単分散された。
Figure 2017195884
ＰＢＭＣアッセイは、ヒトＣＤ４０Ｌ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｄ１．１，ＡＴＣＣ）によりＰＢＭＣを刺激することにより実施し、２４時間後にＣＤ１９＋／ＣＤ８６＋細胞の割合をＦＡＣＳにより計測した。このアッセイを使用してリーディングＴｎ３足場のパネルを試験およびランキングして生化学的基準に基づく優先順位付けから浮上させた。ＰＢＭＣアッセイの結果を図１０Ｂに示し、表７にまとめる。
親和性計測は、ＧＬＣセンサーチップを２５℃で用いるＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６タンパク質相互作用アレイシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で実施した。０．００５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４を有するＰｒｏｔｅＯｎリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）をランニング緩衝液として使用した。ヒトＭｅｇａＣＤ４０Ｌをチップ上で約２３００ＲＵの表面密度において固定化した。Ｔｎ３バリアント（３４０、３４２、３４３、３４５、３４６、３４７、３４８、および３４９）の２倍希釈物を、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．４中で調製した（１５０から４．７ｎＭ）。それぞれの濃度の試料を６つの分析チャネル中に３０μｌ／分の流速において３００秒間注入した。Ｋｄは、ＰｒｏｔｅＯｎソフトウェア内の平衡分析設定を使用することにより測定した。結果を表７に示す。
１０個のＴＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３バリアントを、ＤＳＣにより安定性について分析した。簡潔に述べると、ＤＳＣ計測をＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ（ＭｉｃｒｏＣａｌ）上で実施した。タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に大規模透析を介して交換し、ＤＳＣ分析のために０．２５〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調整した。試料を２０〜９５℃において９０℃／時間の走査速度において走査し、走査を繰り返さなかった。結果を表７に示す。
リード最適化ライブラリー生成に使用された３０９と比べてＩＣ５０の最大３００倍の改善が、および３０９ＦＧｗｔ骨格と比べて１０００倍超の改善が最良のクローンについて得られた。７つのクローンは、一桁のｎＭ範囲のＫｄを有した。
３．３ ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場３１１リード最適化
上記ループ使用実験（図１０Ａ）を実施する前に、リード最適化ライブラリーにおける最初の試みは、３１１のＦＧループ中での多様性の導入、得られたファージディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングにフォーカスした。スクリーニングは、上記ビオチン化ヒトＭｅｇａＣＤ４０Ｌに対する４つのパニングラウンド後に実施し、大多数の陽性ヒットがＢＣループ上流のＴｎ３のＮ末端定常領域中の残基Ｋ４からＥへの偶発的突然変異を含有することが見出された。陽性ヒットのＦＧループ配列の中で明らかなコンセンサスは検出されなかった。３１１中への単一のＫ４Ｅ突然変異の導入は、ＰＢＭＣアッセイにおいて効力（約４μＭから３６ｎＭ）の約１００倍の増加をもたらした（図１０Ｃ参照）。
ループスワップ実験は、ＢＣおよびＤＥループ配列がＣＤ４０Ｌへの結合に要求されることを示したため、次いでこれらのループをさらなる親和性成熟のために３１１Ｋ４Ｅ骨格中で標的化した。２つの別個のライブラリーを生成した。一方のライブラリーは、それぞれの残基が野生型３１１配列である５０％の可能性、および他の１１個のＮＨＴコード残基の１つである約５０％の可能性を有する戦略でＢＣループを標的化した。他方のライブラリーは、６残基ＤＥループを完全にランダム化した。
ＢＣループライブラリーについて、オリゴヌクレオチドＢＣ１１−３１１ＧｌｙおよびＢＣ１１−３１１ＮＨＴ（表８）を、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む断片を生成するためにＢＣループコドンが停止コドンにより置き換えられた３１１由来テンプレートに対するリバースプライマーＫｐｎＩ ａｍｐ ｒｅｖ ｖ２（表５）を用いるＰＣＲ反応において使用した。最後に、プライマーＢＣライブラリーａｍｐ Ｋ４ＥおよびＫｐｎＩ ａｍｐ ｒｅｖ ｖ２を用いるこれらの断片の１：１混合物の増幅により、全長Ｔｎ３ライブラリー断片を得た。
ＤＥ−ループライブラリーは、上記３０９ＦＧｗｔ ＤＥ−ループライブラリーとして生成し、但し、３１１由来テンプレートをＰＣＲ反応において使用し、ＢＣライブラリーａｍｐ Ｋ４Ｅプライマーを最終ＰＣＲ増幅において使用した。
Figure 2017195884
全長ライブラリー断片をＮｃｏＩおよびＫｐｎＩにより消化し、ファージディスプレイベクター中にクローニングし、ファージライブラリーを実施例１に記載のとおり生成した。
２つのライブラリーを実施例１に記載のビオチン化ヒトＭｅｇａＣＤ４０Ｌに対して別個にパニングし、ラウンド１において１０ ｇのタンパク質、ラウンド２において５ ｇ、およびラウンド３において５ ｇを使用した。ラウンド３後のファージアウトプットの増幅後、Ｑｉａｇｅｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して一本鎖ＤＮＡを単離し、２つのライブラリーを３０９ＦＧｗｔライブラリーに記載のとおりシャフリングした。シャフリングされたライブラリーを合計５つのラウンドについて３０９ＦＧｗｔシャフリングライブラリーについて上記のとおりビオチン化ヒトＭｅｇａＣＤ４０Ｌに対してパニングし、ラウンド１から５について１００ｎＭ、２０ｎＭ、４ｎＭ、１ｎＭおよび１ｎＭの標的を使用した。
アウトプットを上記のとおり可溶性分泌ベクター中にプールクローニングし、上記の可溶性タンパク質スクリーニングアッセイを使用して５つの９６ウェルプレートをＣＤ４０Ｌ結合についてスクリーニングした。陽性ヒットは、３１１Ｋ４Ｅ骨格バリアントについて得られるシグナルに対して同定した。１８個の最高評価ユニーククローンを３１１Ｋ４Ｅ＿１、３１１Ｋ４Ｅ＿２、３１１Ｋ４Ｅ＿３、３１１Ｋ４Ｅ＿４３１１Ｋ４Ｅ＿５、３１１Ｋ４Ｅ＿７、３１１Ｋ４Ｅ＿８、３１１Ｋ４Ｅ＿９、３１１Ｋ４Ｅ＿１０、３１１Ｋ４Ｅ＿１１、３１１Ｋ４Ｅ＿１２、３１１Ｋ４Ｅ＿１３、３１１Ｋ４Ｅ＿１４、３１１Ｋ４Ｅ＿１５、３１１Ｋ４Ｅ＿１６、３１１Ｋ４Ｅ＿１９、３１１Ｋ４Ｅ＿２０および３１１Ｋ４Ｅ＿２１（図１２Ａおよび図１２Ｂに示される配列）と命名し、粗製未精製タンパク質としてオフ速度ランキングについてアッセイした。未精製Ｔｎ３足場のオフ速度推定は、チップ上で固定化されたＣＤ４０Ｌを用いるバイオセンサーアッセイにおいてＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６タンパク質相互作用アレイシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で実施した。ＭｅｇａヒトＣＤ４０ＬをＧＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）上で固定化し、全てのバリアントを８０ｎＭの推定濃度に希釈し、３０μｌ／分の流速において３００秒間注入し、解離時間を１２００秒に設定した。ＰＢＳ、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０、３ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４をランニング緩衝液として使用した。オフ速度は、センサーグラムの可視調査によりランキングした。最も遅いオフ速度を示した４つのバリアント、３１１Ｋ４Ｅ＿３、３１１Ｋ４Ｅ＿１１、３１１Ｋ４Ｅ＿１２および３１１Ｋ４Ｅ＿１５のサブセットを精製し、Ｋｄ値が１．１から６．４ｎＭであることが測定された（表９）。
Figure 2017195884
図１０Ｄに示されるとおり、３１１Ｋ４Ｅ＿１２のＫｄの減少（１８ｎＭから１ｎＭ）は、３１１Ｋ４Ｅ骨格に対するＰＢＭＣアッセイの効力の１２倍の増加に対応する。
まとめると、ナイーブライブラリーからの最初のヒット３０９および３１１のリード最適化試験は、ＣＤ４０Ｌの一桁のｎＭの結合剤をもたらした。
類似の最適化試験を、ネズミ特異的Ｍ１３分子に対して実施した（データ示さず）。得られた最適化ネズミＣＤ４０Ｌ特異的分子（Ｍ３１と命名）は、親分子と比べてＰＢＭＣアッセイにおける効力の約２０倍の増加を示した（図１Ａ）。
実施例４
タグ無しＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３−ＨＳＡ融合体の発現および精製
図２Ａおよび９Ａに概説されるＨＳＡに融合しているＴｎ３構築物を、哺乳動物２９３Ｆ細胞系中で一過的形質移入により発現させた。Ｔｎ３−ＨＳＡ融合発現構築物は、インハウス生成哺乳動物発現ベクターに基づき生成した。産物均一性を増加させるため、未対合の部分露出システイン３４がセリンに突然変異されたＨＳＡの突然変異形態（ＨＳＡ Ｃ３４Ｓと命名）（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．７２：４０５−１１）を用いた。
融合タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）により１工程精製で精製することができる。塩勾配によるＱ−ＨＰカラム（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）からの３０９−３０９−ＨＳＡの溶出の例を図９Ｂに示す。メインピークに加え、後に溶出するマイナーピークが確認された（総ピーク面積の１０％未満を構成）。質量分析は、これらのマイナーサイドピークがＯ−グリコシル化３０９−３０９−ＨＳＡ種について濃縮されることを示した。メインピークを含有する分画をプールし、後続の活性アッセイに使用した。
大スケール精製のため、上記ＩＥＸ工程に先行して培養物上清からのＴｎ３−ＨＳＡ融合体を、ＨＳＡ親和性マトリックス、例えば、ＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ ＨＰ（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）を使用する親和性クロマトグラフィーにより捕捉した。洗浄後、ＨＳＡ融合タンパク質は、オクテン酸含有緩衝液により溶出することができた。溶出物をリン酸緩衝液中で３倍希釈した後にＱ−ＨＰカラム上にロードした。
マイナーピークの分析により、Ｏ−結合炭水化物部分の存在が明らかになった。Ｏ−グリカンは、以下に示される既に報告されたＯ−キシロシル化コア構造（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：５４３６−５４４２）に由来する炭水化物の異種混合物であることが提案された。
Figure 2017195884
主要な結合部位は、Ｔｎ３ドメイン間のＧＧＧＧＳリンカー中に存在すると決定された。グリカンは、Ｔｎ３とＨＳＡとの間に見出されるＧＧＧＧＳリンカー中でより少ない程度で存在することも見出された。したがって、Ｏ−グリカンのレベルは、一価構築物と比較して二価構築物において高く、ＣＨＯ細胞と比較してＨＥＫ細胞中で産生される材料において高かった。このレベルは、異なるＴｎ３構築物間でも変動した。したがって、Ｏ−グリカンのレベルは、慎重な宿主細胞セクション、例えば、ＣＨＯ細胞またはより低レベルのＯ−グリカンを有する材料を産生することが見出された他の細胞の使用を介して低減させることができる。さらに、Ｏ−グリカンを含有する材料は、精製法を介して除去してＯ−グリカンを欠くより均一な産物を得ることができる。あるいは、リンカーは、例えば、Ｓｅｒ残基をＧｌｙに突然変異させることにより主要なＯ−グリカン結合部位を除去するように改変することができる。いくつかの構築物中のリンカーは、１つ以上のＧＧＧＧＧリンカーを有するように再遺伝子操作した。ＧＧＧＧＧリンカーを有する材料中でいかなる型のＯ−グリカンも検出されず、活性の差異は確認されなかった（データ示さず）。
実施例５
ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場の血清半減期の拡張
血清アルブミンへの融合体を、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場の血清半減期を拡張するための戦略として利用した。ネズミＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３−ＭＳＡ融合体の薬物動態（ＰＫ）特性を測定するため、マウスＰＫアッセイを実施した。ＭＳＡ融合体は、対応するＨＳＡ融合体に対するサロゲート分子の試験について選択した。それというのも、マウスＦｃＲｎはＨＳＡにそれがＭＳＡに結合するよりもかなり弱く結合し、エンドソームからの再循環の減少および結果的にターンオーバーの増加をもたらすためである（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，４８２６−４８３６，２０１０）。
ＨＥＫ２９３細胞を、ＭＳＡに融合しているマウスＣＤ４０Ｌ特異的タンデム二価Ｔｎ３足場の発現に使用した。高レベルの発現が観察された（図３Ａ）。これらの構築物は、Ｔｎ３足場単位間の（Ｇ４Ｓ）リンカーおよび足場とＭＳＡとの間のリンカー中の３つの（Ｇ４Ｓ）リピートとの間にリンカーを有した。さらに、Ｎ４９Ｑ突然変異をＭ１３およびＭ３１足場のそれぞれに導入して潜在的なＮ結合グリコシル化部位を除去した。この突然変異は、これらの足場の効力に影響しなかった（データ示さず）。発現レベルは、形質移入６日後に２００ｍｇ／Ｌに推定された。精製は、Ｃ末端Ｈｉｓタグを介してＩＭＡＣにより実施した。精製タンパク質の収量は、１Ｌの培養物上清当たり１２５ｍｇであると推定された。
ＭＳＡを二価Ｍ１３足場に融合させた場合、ＭＳＡを有さないＭ１３ダイマー足場と比較して効力の８倍の減少が観察された（図３Ｂ）。ＭＳＡに融合している親和性成熟Ｍ３１を含む二価足場は、ＭＳＡに融合している対応する二価Ｍ１３足場よりも１４０倍強力であり、一価Ｍ３１ＭＳＡ融合体よりも約９００倍強力であり、ＭＲ１抗ネズミＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体と同等の効力を有した（図３Ｃ）。
ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３−ＭＳＡ融合体のＰＫ特性を測定するため、マウスＰＫ分析を実施した。タンパク質構築物を、１０ｍｇ／ｋｇにおいて５〜７週齢雌ＣＤ−１マウス中に静脈内投与した。それぞれのマウスを種々の時点において１５０μｌ採血し、Ｔｎ３−ＨＳＡ融合体の血清濃度をＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。簡潔に述べると、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ａｇｉｌｅｎｔ）によりコートし、ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）中４％のミルク中でブロッキングし、ネズミＭｅｇａＣＤ４０Ｌ（Ａｘｘｏｒａ）とインキュベートした。ＭｅｇａＣＤ４０Ｌは、そのＦＬＡＧタグを介して固定化した。血清試料およびタンパク質標準物を４％のミルクＰＢＳＴ中で希釈し、ＰＢＳＴ中でプレートを洗浄した後に添加した。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴ中で洗浄し、ウサギ抗ＴＮ３ポリクローナル抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）を使用し、標準ＥＬＩＳＡプロトコルにおいてヤギ抗ウサギＨＲＰ−コンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用してＴｎ３−ＨＳＡ融合構築物を検出した。血清試料中の濃度は、同一のＴｎ３−ＨＳＡ融合構築物の希釈物のアッセイにより作成された標準曲線の線形回帰に基づき測定した。濃度は、３匹の異なるマウスについての平均として測定した。
図４Ａにおいて確認されるとおり、Ｍ３１−ＭＳＡおよびＭ１３−Ｍ１３−ＭＳＡは、それぞれ３８および３１時間の半減期を有した一方、Ｍ３１−Ｍ３１−ＨＳＡ構築物は１２時間の半減期を有した。比較において、Ｍ１３−Ｍ１３タンデム構築物自体（ＭＳＡに融合していない）は、３０分間の半減期を示した（示さず）。
マウス足場における観察とは対照的に、ＨＳＡをヒトＣＤ４０Ｌ特異的足場に融合させた場合、効力の顕著な減少は存在しなかった。図９Ｃは、ＰＭＢＣアッセイにおいて計測されるとおり、２つの３０９モノマーを含むヒトＣＤ４０Ｌ特異的二価Ｔｎ３足場をＨＳＡに融合させることによる効力の顕著な減少が存在しなかったことを示す。
ヒトＣＤ４０Ｌ特異的３４２−ＨＳＡモノマー構築物のＰＫ特性を、単回静脈内注射後にカニクイザルにおける血清半減期を向上させるための２つの置換（Ｌ４６３ＮおよびＫ５２４Ｌ）を含む３４２−ＨＳＡバリアントのそれと比較した。タンパク質構築物を、スローボーラス注射を介して１０ｍｇ／ｋｇにおいて体重２〜５ｋｇの雄カニクイザルに投与した。１ｍＬの血液／動物／時点を投薬前、投薬５分および３０分後；投薬２、１２、２４、および４８時間後；ならびに４、８、１１、１５、２２、２９、３６、４３および５７日目に末梢血管から回収した。Ｔｎ３−ＨＳＡ融合体の血清濃度をＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。簡潔に述べると、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ａｇｉｌｅｎｔ）によりコートし、ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）中４％のミルク中でブロッキングし、ヒトＭｅｇａＣＤ４０Ｌ（Ａｘｘｏｒａ）とインキュベートした。ＭｅｇａＣＤ４０Ｌは、そのＦＬＡＧタグを介して固定化した。血清試料およびタンパク質標準物を４％のミルクＰＢＳＴ中で希釈し、ＰＢＳＴ中でプレートを洗浄した後に添加した。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴ中で洗浄し、ウサギ抗ＴＮ３ポリクローナル抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）を使用し、標準ＥＬＩＳＡプロトコルにおいてヤギ抗ウサギＨＲＰ−コンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用してＴｎ３−ＨＳＡ融合構築物を検出した。血清試料中の濃度は、同一のＴｎ３−ＨＳＡ融合構築物の希釈物のアッセイにより作成された標準曲線の線形回帰に基づき測定した。濃度を図４Ｂにプロットする。３４２−ＨＳＡ構築物の半減期は約７日間であった一方、３４２−ＨＳＡ Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌバリアント構築物は、最初の線形期の間に１３〜１７日間の増加した半減期を示した（図４Ｂ）。３０日後、３４２−ＨＳＡ Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌバリアント構築物の血清濃度は、野生型ＨＳＡ構築物と比較して急激に降下した。これらの観察は、サルにおいてこの構築物のいくらかの免疫原性を示し得る。
実施例６
ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場の特性決定
６．１ 実験的方法
６．１．１ ＰＢＭＣ刺激アッセイ：血液は、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ安全ガイドラインに従って健常ドナーから得た。ＰＢＭＣは、ＣＰＴチューブを介して単離し（２０分間における１５００ｇの回転）、１×１０６個のＰＢＭＣ（条件当たり）を組換えヒトＭｅｇａＣＤ４０Ｌ（Ａｘｘｏｒａ）またはヒトＣＤ４０Ｌ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｄ１．１，ＡＴＣＣ）により刺激した。ＣＤ１９＋／ＣＤ８６＋細胞の割合を刺激２４時間後にＦＡＣＳにより計測した。このアッセイを使用してリーディングＴｎ３足場のパネルを試験およびランキングして生化学的基準に基づく優先順位付けから浮上させた。このアッセイは、ネズミＣＤ４０Ｌ発現細胞系（Ｄ１０．Ｇ４）またはネズミＭｅｇａＣＤ４０Ｌ（Ａｘｘｏｒａ ＡＬＸ５２２１２０）をヒト細胞または組換えタンパク質刺激に代えて用いて実施することもできる。それというのも、ネズミリガンドはヒト受容体と交差反応するためである。
６．１．２ ネズミＣＤ４０Ｒ／ＮＦκＢアッセイ：ＮＦκＢレポーターＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｐａｎｏｍｉｃｓ ＮＦκＢレポーター系およびインハウスｍＣＤ４０Ｒ形質移入）を、ネズミＭｅｇａＣＤ４０Ｌ（Ａｘｘｏｒａ，カタログ番号ＡＬＸ５２２１２０）組換えタンパク質またはＣＤ４０Ｌ過剰発現Ｄ１０．Ｇ４細胞（ＡＴＣＣ）により、Ｔｎ３足場を用いてまたは用いずに２４時間刺激した。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏｗ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ２６１０）を、製造業者の指示書に従って添加した。リードアウトは、ＥｎＶｉｓｉｏｎシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で実施されるＮＦκＢレポーター活性化を介するルミネッセンス（７００）であった。
６．１．３ ヒトＣＤ４０Ｒ／ＮＦκＢアッセイ：レポーターＨＥＫ２９３細胞（Ｐａｎｏｍｉｃｓおよびインハウス）を、ＭｅｇａＣＤ４０Ｌ（Ａｘｘｏｒａ ＡＬＸ５２２１１０）組換えタンパク質またはＣＤ４０Ｌ過剰発現Ｄ１．１ Ｊｕｒｋａｔサブクローン細胞（ＡＴＣＣ）によりＴｎ３足場を用いてまたは用いずに２４時間刺激した。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏｗ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ２６１０）を、製造業者の指示書に従って添加した。リードアウトは、ＥｎＶｉｓｉｏｎシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で実施されるＮＦκＢレポーター活性化を介するルミネッセンス（７００）であった。
６．１．４ 二重細胞アッセイ：初代Ｔ／Ｂ細胞を、種々のドナーから単離した。抗ＣＤ３刺激マイトマイシンＣ処理ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０５個）を、精製ヒトＢ細胞（５×１０４個）と培養した。リードアウトは、以下のとおりであった：２日目：活性化マーカー（ＦＡＣＳ）、５日目：Ｂ細胞増殖（ＡＴＰ代謝産物、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、７日目：形質細胞分化（ＦＡＣＳ）７日目：Ｉｇ産生（ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
６．１．５血小板凝集アッセイ：アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）は、Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ（Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）製であった。全ての他の製品は、少なくとも試薬グレードであった。血液試料を、健常被験者から１２．９ｍＭのクエン酸ナトリウム中で採取し、１５０×ｇにおいて１５分間遠心分離してＰＲＰ（多血小板血漿）を得た。ＰＲＰの分離後、チューブを１，２００×ｇにおいて１５分間再度遠心分離してＰＰＰ（乏血小板血漿）を得た。Ｍｕｓｔａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２２：１９３−２０４，１９７２）により記載される方法を使用して血小板を洗浄し、ＣａＣｌ２２ｍＭ、ＭｇＣｌ２１ｍＭ、０．１％のデキストローズ、０．３５％のウシ血清アルブミン、０．０５Ｕ／ｍＬのアピラーゼを含有するタイロード液、ｐＨ７．３５中で再懸濁させた。血小板凝集は、光透過凝集計（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ ７００−４ＤＲ，Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用して試験し、記載されるとおり示される血小板アゴニストによる血小板の刺激後１０分間記録した。Ｔｎ３足場は、可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）とプレインキュベートして添加前に免疫複合体を形成した。
６．１．６免疫化アッセイ：ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）をＣｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ（Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）から購入し、使用直前にＨＢＳＳ培地中で１０倍希釈した。マウスを０日目に０．２ｍｌの希釈ＳＲＢＣにより免疫化した。チャレンジマウスにおける一次胚中心（ＧＣ）応答を、ＦＡＣＳを介して免疫化１４日後にアッセイした（ＧＣ Ｂ細胞、非ＧＣ Ｂ細胞、および全てのＴ細胞サブセット）。Ｔｎ３足場および対照を９〜１３日目に示されるとおり２４時間漸増させて投与した。
６．１．７ ＫＬＨ特異的Ｔ細胞依存性抗体応答（ＴＤＡＲ）アッセイ：中国産の体重３．１〜４．６ｋｇのカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ａｌｉｃｅ ＴＸ）に、示される用量（０．５、５、４０ｍｇ／ｋｇ）の阻害剤（３４２−モノマー−Ｔｎ３−ＨＳＡおよび３４２−３４２二価−Ｔｎ３−ＨＳＡまたは対照／ビヒクルを週１回静脈内投薬（伏在静脈または橈側皮静脈）した。ＫＬＨ（ロット番号ＭＤ１５８６７８Ａ，Ｓｕｐｐｌｉｅｒ Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を、適切量の注射用滅菌水（Ｓｕｐｐｌｉｅｒ Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｕｐｐｌｙ，Ｎｏｒｒｉｓｔｏｗｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を用いて滅菌条件下で再構成した。バイアルを回転混合し、次いで滅菌バイアル中に一緒にプールした。１ｍＬのＫＬＨ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれの動物の背中上で、２つの時点（１日目および２９日目）に正中線の左側に試験または対照品投与終了後１時間以内に皮下投与した。さらなる分析のための血液試料を全ての動物から以下の時点において得た：試験前、４、６、８、１１、１５、２２、２５、３２、３４、３６、３９、４３、４６、５０および５７日目。８、１５および２２日目に回収された試料は、投薬前に採取した。ＬＨ特異的ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体力価の評価を８、１１および１５日目において行った。１５日目におけるＫＬＨ特異的ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体の力価をそれぞれ図５Ｇおよび５Ｈに示す。カットポイント力価測定法は、サル血清中の抗ＫＬＨ抗体を検出するためのＥＬＩＳＡフォーマットを利用した。試料をＥＬＩＳＡプレート上で固定化されたＫＬＨとインキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄し、結合抗体をヤギ抗サルＩｇＧ−ＨＲＰまたはＩｇＭ−ＨＲＰにより検出し、次いでテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）により可視化した。
動物を利用する全ての実験について、良好な畜産の現在許容可能な実務は、例えば、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１１に従った。Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅａｓｔ Ｍｉｌｌｓｔｏｎｅ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙは、国際実験動物管理公認協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（ＡＡＡＬＡＣ）により十分公認されている。動物は、考えられる獣医学的ケアを要求する任意の条件について技術スタッフによりモニタリングし、必要により治療した。
６．２ ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌ：ＣＤ４０相互作用を機能的に中和する。
ＣＤ４０Ｌ発現Ｔ細胞は、ＣＤ４０発現Ｂ細胞に会合し、ＮＦκＢシグナリング経路の活性化をもたらす（Ｚａｎｇａｎｉ，２００９）。したがって、ＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター細胞系を使用して抗ＣＤ４０Ｌ−Ｔｎ３分子がＣＤ４０会合の下流のシグナリングを阻害し得るか否かを判定した。ヒトＣＤ４０Ｌおよびレポーターを発現するＨＥＫ２９３細胞を、ヒトまたはネズミＭｅｇａＣＤ４０ＬのいずれかによりＥＣ９０（９０％の阻害剤をもたらす有効濃度；すなわち、ヒトＭｅｇａＣＤ４０Ｌについて１．５μｇ／ｍｌ、およびネズミＭｅｇａＣＤ４０Ｌについて３μｇ／ｍｌ）において刺激した。
ヒト特異的３４２分子は、ヒトＣＤ４０Ｌ誘導ＮＦκＢ活性を１．５ｎＭのＩＣ５０で阻害した（図１３）。ネズミ特異的Ｍ３１分子は、ネズミＣＤ４０Ｌ誘導ＮＦκＢ活性をＩＣ５０＝１．６ｎＭで中和した（図１Ｂ）。陽性対照抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体５ｃ８（抗ヒトＣＤ４０Ｌ）およびＭＲ１（抗ネズミＣＤ４０Ｌ）は両方とも、モノマーＴｎ３足場よりも約１０倍良好に機能し、ＩＣ５０は０．２００ｎＭ＋／−ＳＤ（アッセイの最低閾値）であった。このことは、部分的には、モノクローナル抗体のそれぞれのＣＤ４０Ｌとの相互作用のアビディティーに寄与するモノクローナル抗体の二価性質に起因し得た。
６．３ ダイマーＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、結合の改善を示す。
実験データは、ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３二価足場の結合がＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３モノマー足場のそれと比べて改善されたことを示す。ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３二価足場のＣＤ４０Ｌへの結合は、一部の場合、図２Ｃおよび図２Ｄ（ネズミ）、ならびに図８Ａおよび図８Ｂ（ヒト）に示されるとおり、インビトロにおいて標的に対する作用をＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３モノマー足場のそれと比べて約３ｌｏｇだけ改善した。
図２Ｃは、ネズミＣＤ４０Ｌ特異的一価（Ｍ１３）または二価タンデム足場によるバイオセンサーチップ上で固定化されたネズミＣＤ４０受容体へのネズミＣＤ４０Ｌ結合の競合阻害を示す。Ｍ１３モノマーは、１つ（１ＧＳ）、３つ（３ＧＳ）、５つ（５ＧＳ）または７つ（７ＧＳ）の「ＧＧＧＧＳ」リピートを含む変動する長さのペプチドリンカーにより結合させた。Ｍ１３−１ＧＳ−Ｍ１３足場のＩＣ５０は２９ｎＭであった一方、モノマーＭ１３足場のＩＣ５０は７１ｎＭであった。より長いリンカーを用いる二価Ｍ１３足場のＩＣ５０は、大幅に低かった（５〜６ｎＭ）。
図２Ｄは、Ｂ細胞上のネズミＣＤ４０Ｌ誘導ＣＤ８６発現に対するネズミＣＤ４０Ｌ特異的一価（Ｍ１３）または二価タンデム足場の阻害効果を示す。二価足場は、一価足場よりも約３ｌｏｇ強力であった。
図８Ａおよび８Ｂは、示されるヒトＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場３０９および３１１が二価タンデムフォーマットの効力を向上させたことを示す。二価３１１足場（図８Ａ）および二価３０９足場（図８Ｂ）は、Ｊｕｒｋａｔ Ｄ１．１細胞により刺激されたＣＤ１９陽性ヒトＰＢＭＣ上のヒトＣＤ４０Ｌ誘導発現の阻害においてそれぞれ約７倍および５００〜１０００倍の改善を示した。二価３０９足場は、Ｂｉｏｇｅｎ製５ｃ８抗ヒトＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体と効力が同等であった。
溶解度、安定性および精製容易性は、１つ（１ＧＳ）、３つ（３ＧＳ）、５つ（５ＧＳ）または７つ（７ＧＳ）の「ＧＧＧＧＳ」リピートを含む変動する長さのペプチドリンカーの添加によっては影響を受けなかった（図２Ｂ参照）。
６．４ ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場結合および機能
上記生化学的結合に加え、これらの新規Ｔｎ３足場が初代Ｔ細胞上で活性化後に発現される内因性ＣＤ４０Ｌに結合し得ることを確認することが重要であった。Ｔ細胞を複数のドナーから単離し、上記のとおり活性化させた。２４時間後、５ｃ８（ヒト特異的）モノクローナル抗体およびＭＲ１（ネズミ特異的）モノクローナル抗体による染色により判定されるとおりＣＤ４０Ｌ発現が上方調節された（データ示さず）。ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場分子は、モノクローナル抗体と同等レベルのＣＤ４０Ｌ発現を検出し得、これらの分子がネイティブタンパク質に結合し得ることを確認した。
ＣＤ４０Ｌ：ＣＤ４０相互作用の機能的結果の１つは、Ｂ細胞上の共刺激分子の上方調節である（Ｙｅｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６：１８５７−１８６４，１９９５）。ＣＤ４０Ｌ指向Ｔｎ３分子を、それらのその妨害能について試験した。ヒトまたはネズミＣＤ４０Ｌを内因的に発現する細胞系（それぞれＤ１．１ ＪｕｒｋａｔサブクローンまたはＤ１０．Ｇ４）を使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激した。刺激したら、フローサイトメトリーを介してＣＤ１９＋Ｂ細胞によるＣＤ８６上方調節の割合を計測することによりＢ細胞の活性化を評価した。このアッセイにおいて、陽性対照モノクローナル抗体は、ＣＤ８６発現を有する細胞のＣＤ１９＋割合を０．１７０ｎＭ（５ｃ８）および０．２３０ｎＭ（ＭＲ１）のＩＣ５０で阻害し得た。ヒト特異的最適化Ｔｎ３、３４２は、ＣＤ８６上方調節をＩＣ５０値＝０．７００ｎＭ（ｎ＝５人のドナー）でアンタゴナイズし得た（図１０Ｂおよび表７参照）。
ネズミ特異的最適化Ｔｎ３Ｍ３１は、１．５ｎＭのＩＣ５０を有した。これらの類似の結果は、Ｍｅｇａ−ＣＤ４０Ｌ組換えタンパク質を使用してＰＢＭＣを刺激した場合に観察された。実験データは、両方の分子が、ネズミ特異的かヒト特異的かにかかわらず細胞内の主なシグナリング経路（ＮＦκＢ）だけでなく、その最も重要な機能的役割の１つ：Ｔ−Ｂ細胞相互作用を阻害し得たことを実証した。この阻害作用は、多くの自己免疫疾患および病態におけるＣＤ４０Ｌの寄与を減衰させ得る。
６．５ 抗ＣＤ４０Ｌ Ｔｎ３は、Ｔ／Ｂ共培養後にＢ細胞増殖および形質細胞分化を阻害する。
Ｔ細胞上のＣＤ４０ＬとＣＤ４０発現Ｂ細胞との相互作用は、適応的免疫応答の発生を容易にするＴ細胞ヘルプの根本的態様である（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，１９９４；Ｏｘｅｎｉｕｓ，１９９６，ｖａｎ Ｋｏｏｔｅｎ ＆ Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，１９９７）。これをモデリングするため、３４０、３４２および３４２−３４２ダイマーの抗ｈＣＤ４０Ｌ Ｔｎ３−ＨＳＡ融合体を、抗ＣＤ３刺激マイトマイシンＣ処理ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を精製ヒトＢ細胞と培養したＴ細胞およびＢ細胞の初代細胞共培養において評価した。Ｂ細胞の４日目において増殖して７日目までに形質細胞（ＰＣ）に分化し、それらの産生抗体クラスをスイッチする能力を計測した（ＰＣおよび抗体データ示さず）（図１５）（Ｅｔｔｉｎｇｅｒ，２００７）。ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場３４２−３４２−ＨＳＡは、Ｔ細胞誘導増殖を足場の不存在下または非特異的対照足場の存在下でのＢ細胞の細胞増殖と比較して少なくとも５０％だけ低減し得た。増殖は、ＣＤ４０Ｌ：ＣＤ４０ライゲーション時の形質細胞分化の前駆シグナルの１つである。形質細胞分化および抗体クラススイッチの阻害（データ示さず）も観察された。
６．６ ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ軸のインビボ破壊
Ｔ依存性免疫応答におけるＣＤ４０Ｌ：ＣＤ４０Ｒ相互作用の中心的役割は、十分特性決定されている（Ｎｏｅｌｌｅ，１９９２；Ｒｅｎｓｈａｗ，１９９４，Ｗｙｋｅｓ，２００３）。ネズミＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場Ｍ３１（Ｍ３１−ＭＳＡおよびＭ３１−Ｍ３１−ＭＳＡ）を使用して０日目にマウスをヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）により免疫化（静脈内）することによりＴ依存性免疫化モデルにおけるこれらの新規分子の効果を評価した。
９〜１３日目、マウスに示される用量の阻害剤を毎日、腹腔内注射し、１４日目に脾臓およびリンパ節ＧＣ Ｂ細胞を定量した。インビボでのこの分子の３１時間の短いＴ１／２を所与とすると毎日の投薬が要求された（図４）。ＣＤ４０Ｌは、液性応答、例えば、解剖学的部位、例えば、脾臓およびリンパ節における胚中心の生成を制御することが事前の知見から十分に確立されている（Ｊａｃｏｂ，１９９１）。ここで、その形成へのＣＤ４０Ｌ：ＣＤ４０軸の寄与の破壊が、ＧＣ Ｂ細胞の割合により示されるとおり、ナイーブまたは本発明者らの非特異的対照Ｄ１−ＭＳＡに対してＭ３１−ＭＳＡについて用量依存的に観察された。
Ｍ３１−ＭＳＡは、１０ｍｇ／ｋｇにおいてもＧＣ Ｂ細胞（図５Ｂ）の割合をＭＲ１モノクローナル抗体（図５Ａ）と同様に消失させた。細胞の他の下位集団、例として特異的Ｔ細胞集団は正常を呈し、観察結果はＴ細胞枯渇に起因しないことが確認された（図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ）。さらに、抗ＳＲＢＣ Ｉｇ ＥＬＩＳＡデータからの結果は、胚中心Ｂ細胞データのそれを反映した（図５Ｆ）。まとめると、これらのデータは、ネズミ特異的Ｔｎ３足場Ｍ３１−ＭＳＡがＣＤ４０シグナリングを介して推進される反応を解消させ得ることを示した。
同様に、ヒトＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場３４２（３４２−ＨＳＡおよび３４２−３４２−ＨＳＡ）を使用してカニクイザルのＫＬＨ特異的Ｔ細胞依存性抗体応答（ＴＤＡＲ）モデルにおけるこれらの新規分子の効果を評価した。ここで、ＣＤ４０Ｌ：ＣＤ４０軸の破壊は、ＫＬＨ抗原に対する抗体生成の抑制を用量依存的にもたらす。図５Ｇおよび５Ｈに示されるとおり、３４２−二価構築物は、ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体のレベルを０．５ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）において抑制し、ほぼ完全な抑制は５ｍｇ／ｋｇにおいて確認された。３４２−モノマー構築物も、ＩｇＭおよびＩｇＧのレベルを抑制したが、より高濃度において、４０ｍｇ／ｋｇにおいてほぼ完全な抑制が確認された。これらのデータは、ヒト特異的Ｔｎ３足場構築物３４２−ＨＳＡおよび３４２−３４２−ＨＳＡが両方ともＣＤ４０シグナリングを介して推進される反応を解消し得ることを示した。
６．７ ヒトＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場は、血小板凝集を誘導しない。
抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体を用いるヒト臨床試験は、数人の患者において血栓塞栓症が発症した場合に中止された（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈ Ｒｈｅｕ，４３：Ｓ２７１）。後続の前臨床分析は、これが抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体のオンターゲットクラス効果であることを示唆した。したがって、血小板凝集アッセイにおいてヒトＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場を試験することが重要であった。
生理学的ＣＤ４０Ｌの３つの分子と抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体の１つの分子との比を使用した場合、凝集促進効果がクエン酸化多血小板血漿（ＰＲＰ）、洗浄血小板、および全血において観察された（図１６Ａ）。これらの効果は、ＣＤ４０Ｌ結合後にモノクローナル抗体Ｆｃドメイン依存性相互作用により媒介された（データ示さず）。Ｆｃドメイン融合体の不存在下、凝集は観察されなかった。凝集は、ダイマーとしてまたはＨＳＡ融合タンパク質としてのヒトＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３足場のいずれについても複数のドナーにおいて観察されなかった（図１６Ｂおよび図１６Ｃ）。
臨床試験において観察される有害副作用は、血小板の存在下で可溶性ＣＤ４０Ｌ／抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体免疫複合体を作出することにより観察された（図１６Ａおよび図１６Ｃ上の５Ｃ８トレース）。この別の例は、トランスジェニックヒトＦｃγＲＩＩａネズミ試験の組織構造において確認することができる（Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。可溶性ＣＤ４０Ｌ／モノクローナル抗体免疫複合体の投与時、多数の血栓が投与数分以内に肺組織内で確認された。しかしながら、正常組織構造は、抗ＣＤ４０Ｌ Ｔｎ３足場により重複させた場合、対照試料と一致して肺中で存在した（データ示さず）。
実施例７
ＣＤ４０Ｌに結合するように遺伝子操作されたフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン：２つの複合体のクローニング、発現、精製、結晶化および予備Ｘ線回折分析
組換えヒト可溶性ＣＤ４０Ｌを、両方ともＣＤ４０Ｌ結合剤としてファージディスプレイライブラリーから単離された２つのＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３モノマー足場３０９および３１１Ｋ４Ｅ−１２と共結晶化した。結晶は、それぞれ３．１および２．９Åに回折した。さらに、組換えヒト可溶性ＣＤ４０Ｌを、最適化Ｔｎ３モノマー３４２単独ならびに３４２モノマーおよび３１１Ｋ４Ｅ＿１２モノマーの両方と共結晶化した。これらの構造についての結晶は、それぞれ２．８および１．９Åに回折した。対応する結晶構造は、Ｔｎ３足場とＣＤ４０Ｌとの相互作用の理解を支援し、より高い親和性のＣＤ４０Ｌ結合剤および複数のエピトープに結合するタンデム構築物を設計するために使用することができる。
７．１ Ｔｎ３分子およびヒト可溶性ＣＤ４０Ｌの発現および精製
結晶化のためにタグ無しＴｎ３分子を産生するため、組換え発現タンパク質をペリプラズム空間中に分泌するように設計されたインハウスＩＰＴＧ誘導性ベクターを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でタンパク質を発現させた。このベクターは、Ｐｔａｃプロモーター、ＯｐｐＡシグナルペプチド突然変異体Ｌ２５／Ｍ（ＭＴＮＩＴＫＲＳＬＶＡＡＧＶＬＡＡＬＭＡＧＮＶＡＭＡ）（配列番号２１０）、Ｃ末端８×Ｈｉｓタグをトロンビン開裂部位に加えて有する。Ｔｎ３配列を、シグナルペプチドとトロンビン開裂部位との間でサブクローニングした。
発現された分泌Ｈｉｓタグ付きタンパク質は、製造業者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）に従ってＮｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して精製し、次いでトロンビンにより開裂させ、次いでＮｉ−ＮＴＡ親和性精製を再度行って未切断インタクトタンパク質および切断Ｈｉｓタグ付き断片を除去した。この精製工程に次いで、Ａｅｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）上で実施されるＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）を使用するイオン交換工程を行った。精製されたタグ無しＴｎ３タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ結果に基づき９５％超の純度および均一性を示す。
ヒト可溶性ＣＤ４０Ｌ（１１３−２６１、ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ２９９６５）遺伝子をＮ末端６×Ｈｉｓタグを用いてＧｅｎｅＡｒｔにより合成し、サイトメガロウイルス主要前初期（ｈＣＭＶｉｅ）プロモーターの制御下でインハウス哺乳動物発現ベクター中にクローニングした（Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４１：５２１-５３０，１９８５）。ＣＤ４０Ｌ遺伝子をインフレームでＣＤ３３シグナルペプチドとクローニングした。タンパク質発現を増加させるためにベクター中のＥＢＮＡおよびＯｒｉＰ遺伝子を使用した。ＣＤ４０Ｌ遺伝子はＳＶ４０ポリＡ配列も取り込んでそのｍＲＮＡ３’末端の適正なプロセシングを可能とした。構築物を２９３Ｆ懸濁細胞（２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地中で２９３Ｆｅｃｔｉｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡを使用して増殖させたヒト胚腎細胞［ＨＥＫ］）中に一過的に形質移入した。細胞を、標準プロトコルを使用して増殖させ、培地を４および８日後に回収した。次いで、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して可溶性ＣＤ４０Ｌタンパク質を精製し、次いでＨｉ−Ｔｒａｐ ＳＰ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）を使用するイオン交換工程および５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌに対する透析を行った。
複合体を調製するため、Ｔｎ３分子、３０９または３１１Ｋ４Ｅ＿１２もしくは３４２のいずれかを、ＣＤ４０Ｌと１．１：１の比で混合し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ濃縮器３０，０００Ｄａカットオフ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）を使用して約１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３により予備平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供した（図１９、パネルＡ）。分離工程後、複合体を１８ｍｇ／ｍｌに濃縮し、結晶化に供した。３４２−３１１Ｋ４Ｅ＿１２−ＣＤ４０Ｌ複合体は、本質的に上記のとおり３つの構成要素の１．１：１．１：１の比を使用して調製した。
７．２ 結晶化スクリーニングおよび最適化
シッティングドロップ結晶化実験は、３００ｎＬの容量のウェル溶液およびタンパク質複合体溶液を液滴区画中で混合し、それを５０μＬのウェル溶液に対して平衡させることによりＰｈｏｅｎｉｘ結晶化ロボット（Ａｒｔ Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して９６ウェルＩｎｔｅｌｌｉプレート（Ａｒｔ Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）中で設定した。Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）、Ｅｍｅｒａｌｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｌａｎｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ（Ａｐｏｐｋａ，Ｆｌｏｒｉｄａ，ＵＳＡ）からの市販の結晶化スクリーンを使用した。
３０９−ＣＤ４０Ｌ、３４２−ＣＤ４０Ｌおよび３４２−３１１Ｋ４Ｅ＿１２−ＣＤ４０Ｌ複合体の結晶化はそれぞれ、Ａｄｄｉｔｉｖｅ Ｓｃｒｅｅｎ ＨＴ（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用する追加のスクリーニングを含む最適化工程を要求した。最適化工程において、９６ウェルプレートのウェル溶液に最初のスクリーニングからの８０％の成功溶液および２０％のそれぞれの添加剤を充填した。液滴は、３００ｎＬのタンパク質溶液および３００ｎＬの新たなウェル溶液から後者の完全に混合した後に構成した。回折質結晶を９６ウェルプレートから直接回収した。冷凍保存のため、増加グリセロール濃度を有する母液の３つの連続溶液中に結晶を移した。
回折質３１１−ＣＤ４０Ｌ結晶は、冷凍剤の添加を要求しない溶液からの最初のスクリーンにおいて成長した。
７．３ Ｘ線回折およびデータ収集
３０９−ＣＤ４０Ｌ複合体についてのＸ線回折パターンを、ＡＤＳＣ Ｑ３１５Ｒ ＣＣＤ Ｘ−Ｒａｙ検出器（Ａｒｅａ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｗａｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を備えるＬａｗｒｅｎｃｅ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）におけるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ ＳｏｕｒｃｅのＢｅａｍｌｉｎｅ５．０．３において単結晶から収集した。０．５°の振動範囲を有する３６０個の連続画像を、３００ｍｍの結晶から検出器の距離および０．８秒の曝露時間において収集した。
３１１Ｋ４Ｅ＿１２−ＣＤ４０Ｌ、３４２−ＣＤ４０Ｌおよび３４２−３１１Ｋ４Ｅ＿１２−ＣＤ４０Ｌ複合体についてのＸ線回折パターンを、Ｒａｙｏｎｉｘ２２５ＨＥ検出器（Ｒａｙｏｎｉｘ ＬＬＣ，Ｅｖａｎｓｔｏｎ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）を備えるＡｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）におけるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ ＳｏｕｒｃｅのＢｅａｍｌｉｎｅ３１−ＩＤ−Ｄにおいて単結晶から収集した。１°の振動範囲を有する１８０個の連続画像を、３００ｍｍの結晶から検出器の距離および０．８秒の曝露時間において収集した。
全てのデータセットについてのリダクションおよびスケーリングは、ＨＫＬ２０００パッケージソフト（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ ＆ Ｍｉｎｏｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２７６：３０７−３２６．１９９７）を使用して実施した。
７．４ 結果および考察
３０９−ＣＤ４０Ｌ複合体の最も再現性の高い結晶化条件は、Ｐｅｇ／Ｉｏｎ Ｓｃｒｅｅｎ（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）におけるＢ５（０．２ＭのＮａＮＯ３、２０％のＰＥＧ３３５０）であると考えられた。Ａｄｄｉｔｉｖｅ Ｓｃｒｅｅｎを用いるさらなる最適化により、Ａ１条件（０．１ＭのＢａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）からの回折質結晶を得た。図１９、パネルＢに示される結晶を９６ウェルプレートから回収し、２０％のグリセロールを補給した母液に移した後に液体窒素中で冷却した。
空間群対称性：結晶は、斜方晶空間群Ｐ２１２１２１に属し、格子定数ａ＝８５．６９Å、ｂ＝９０．６４Å、ｃ＝９５．５６Åであり、３．１Åに回折した。非対称単位は、ＣＤ４０Ｌのトリマーおよび３つの３０９分子を含有し、ＶＭ値は約２．３Å３／Ｄａであることが予期される。
３１１Ｋ４Ｅ＿１２−ＣＤ４０Ｌ結晶化について、ＣｒｙｏＩ＆ＩＩスクリーン（Ｅｍｅｒａｌｄ ＢｉｏＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）により、最適化も冷凍保存も要求しない条件の数を得た。条件Ｆ７（４０％のＰＥＧ６００、０．１ＭのＣＨ３ＣＯＯＮａ、０．２ＭのＭｇＣｌ２）からの単結晶（図１９、パネルＣ）をデータ収集に使用した。
空間群対称性：結晶は正方晶空間群Ｐ２１３に属し、格子定数９７．６２Åであり、２．６Åに回折した。非対称単位は、１つのＣＤ４０Ｌおよび１つの３１１Ｋ４Ｅ＿１２分子を含有し、ＶＭ値は約２．９Å３／Ｄａである。
３４２−ＣＤ４０Ｌ空間群対称性：結晶は空間群Ｐ３２１に属し、格子定数ａ＝９３．５３Å、ｂ＝９３．５３Å、ｃ＝６６．６９Å、分解能２．８Åであった。非対称性単位は、１つのＣＤ４０Ｌモノマーおよび１つの３４２モノマーを含有する。
３４２−３１１Ｋ４Ｅ＿１２−ＣＤ４０Ｌ空間群対称性：結晶は空間群Ｐ２１に属し、格子定数ａ＝８０．３２Å、ｂ＝１４３．４８Å、ｃ＝１１１．２７Å、β＝９８．２２°、分解能１．９Åであった。非対称単位は、２つのＣＤ４０トリマー、６つの３４２モノマー、および６つの３１１Ｋ４Ｅ−１２モノマーを含有する。
全ての構造についてのデータ統計値を表１０に示す。
Figure 2017195884
ＣＤ４０Ｌは、トリマー（図１７ＡのポリペプチドＡ、Ｂ、およびＣ）を形成した。それぞれの３０９Ｔｎ３足場（図１７ＡのポリペプチドＤ、Ｅ、およびＦ）は、２つのＣＤ４０Ｌポリペプチドに接触した。結晶構造は、それぞれの３０９足場と第１および第２のＣＤ４０Ｌポリペプチドとの間に６つの特異的接触が存在することを明らかにした。ＢＣ中のアスパラギン酸１７は、第１のＣＤ４０Ｌ中のトレオニン２５１と接触する。ＢＣループ中のグルタミン酸１８は、第１のＣＤ４０Ｌ中のアルギニン２０３と、および第２のＣＤ４０Ｌ中のイソロイシン２０４と接触する。ＤＥループ中のセリン４７は、第１のＣＤ４０Ｌ中のヒスチジン２４９と接触する。ＤＥループ中のトリプトファン４９は、第１のＣＤ４０Ｌ中のバリン２４７と接触する。ＦＧループ中のアスパラギン酸７０は、第２のＣＤ４０Ｌ中のセリン１８５と接触する（図１７Ａ参照）。３１１足場に接触するＣＤ４０Ｌアミノ酸残基も図１８Ａに示す。
３０９の場合、それぞれの３１１Ｋ４Ｅ＿１２モノマー足場（図１７ＢのポリペプチドＡ、Ｂ、およびＣ）は、２つのＣＤ４０Ｌポリペプチドと接触する。結晶構造は、それぞれの３１１Ｋ４Ｅ＿１２足場と第１および第２のＣＤ４０Ｌポリペプチドとの間に１９個の特異的接触が存在することを明らかにした。ＢＣループ中のアスパラギン１７は、第１のＣＤ４０Ｌ中のチロシン１４６およびグルタミン酸１４２と接触する。ＢＣループ中のアルギニン１８は、第１のＣＤ４０Ｌ中のグルタミン酸１４２、チロシン１４６、およびメチオニン１４８と接触する。ＢＣループ中のセリン１９は、第１のＣＤ４０Ｌ中のグルタミン酸１４２およびロイシン１５５と接触する。ＢＣループ中のセリン２２は、第１のＣＤ４０Ｌ中のアスパラギン１５１と接触する。ＢＣループ中のヒスチジン１５は、第１のＣＤ４０Ｌ中のチロシン１４６と接触する。ＤＥループ中のヒスチジン５１は、第１のＣＤ４０Ｌ中のチロシン１４６と、および第２のＣＤ４０Ｌ中のグルタミン酸２３０と接触する。ＤＥループ中のバリン５０は、第２のＣＤ４０Ｌ中のグルタミン酸２３０と接触する。３１１Ｋ４Ｅ＿１２モノマー足場のＮ末端領域は、第２のＣＤ４０Ｌに連結されている。第２のＣＤ４０Ｌ中のアルギニン２００は、３１１Ｋ４Ｅ＿１２のＮ末端領域中のトレオニン７、アスパラギン酸８、およびトレオニン１０と接触する。第２のＣＤ４０Ｌ中のアルギニン２０３は、グルタミン酸４およびアスパラギン酸５と接触する。３０９足場に接触するＣＤ４０Ｌアミノ酸残基も図１８Ｂに示す。
３０９および３１１Ｋ４Ｅ＿１２との複合体中のＣＤ４０Ｌの結晶構造は、３１１Ｋ４Ｅ＿１２および３０９モノマー足場がＣＤ４０Ｌトリマー複合体の異なる部分中に局在する異なるエピトープに結合することを示した（図１７Ｃ）。構造は、両方の足場が、ＣＤ４０受容体と相互作用する同一の溝中で結合することを示した。
ＣＤ４０Ｌを有する３４２の結晶構造を図１７Ｄに提供し、この構造は、３４２がＣＤ４０Ｌの同一部分上で結合するが、親３０９クローンと比較して接触残基の特異的変化が確認されることを示した。具体的には、３４２においてＢＣループ中のアスパルテート１８はＣＤ４０Ｌのトレオニン２５１と接触し、ＤＥループのヒスチジン４７はＣＤ４０Ｌのヒスチジン２４９と接触し、ＤＥループのヒスチジン４８はＣＤ４０Ｌのヒスチジン２４９、セリン２４５およびセリン２４８と接触し、ＤＥループのヒスチジン５０はＣＤ４０Ｌのバリン２４７と接触する。
ＣＤ４０Ｌを有する３４２および３１１Ｋ４Ｅ＿１２の結晶構造は、両方の足場が、ＣＤ４０Ｌトリマー複合体の異なる部分中に局在するそれらのそれぞれのエピトープに同時に結合し得ることを実証する（図１７Ｅ）。別個の足場のそれぞれについての接触（上記）は維持される。
上記の実施例は、本発明および本発明の方法の実施の種々の態様を説明する。これらの実施例は、本発明の多くの異なる実施形態の網羅的な説明を提供することが意図されない。したがって、本発明を理解の明確化の目的で説明および実施例によりある程度詳細に記載してきたが、当業者は、それに対して多くの変更および改変を添付の特許請求の範囲の趣旨からも範囲からも逸脱することなく行うことができることが容易に理解する。
本明細書に挙げられる全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別的に参照により本明細書に組み込まれると示されるのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の実施形態として、例えば以下を挙げることができる。
(1) ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場であって、前記モノマーサブユニットは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと命名される７つのベータ鎖、ならびにＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧと命名される６つのループ領域を含み、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合するＴｎ３足場。
(2) 単一のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む、(1)に記載のＴｎ３足場。
(3) タンデムに連結されている２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む、(1)に記載のＴｎ３足場。
(4) 前記２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、直接連結されている、(3)に記載のＴｎ３足場。
(5) 前記２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、リンカーにより連結されている、(3)に記載のＴｎ３足場。
(6) 前記リンカーは、ペプチドリンカーを含む、(5)に記載のＴｎ３足場。
(7) 前記ペプチドリンカーが、フレキシブルペプチドリンカーである、(6)に記載のＴｎ３足場。
(8) 前記ペプチドリンカーが、（ＧｍＸ）ｎ配列（式中、
（ａ）Ｘは、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、またはバリン（Ｖ）であり；
（ｂ）ｍおよびｎは、整数であり；
（ｃ）ｍは、１、２、３または４であり；
（ｄ）ｎは、１、２、３、４、５、６、または７である）
を含む、(7)に記載のＴｎ３足場。
(9) 前記ペプチドリンカーが、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１４２または配列番号１４３を含む、(8)に記載のＴｎ３足場。
(10) 前記足場のＣＤ４０Ｌへの結合は、単一のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場のそれと比べて改善される、(3)に記載のＴｎ３足場。
(11) 前記足場のＣＤ４０Ｌへの結合は、標的に対する作用を単一のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場のそれと比べて改善する、(3)に記載のＴｎ３足場。
(12) 前記ＣＤ４０Ｌへの結合の改善は、結合親和性の改善、結合アビディティーの改善、またはその両方である、(10)に記載のＴｎ３足場。
(13) ＣＤ４０Ｌについての結合親和性およびタンパク質安定性が、単一のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場のそれらと比べて改善される、(10)に記載のＴｎ３足場。
(14) ＣＤ４０Ｌについての結合アビディティーおよびタンパク質安定性が、単一のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場のそれらと比べて改善される、(10)に記載のＴｎ３足場。
(15) 少なくとも１つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、リンカーに、または異種部分に結合している、(1)〜(9)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(16) リンカーまたは異種部分が、前記足場のＮ末端またはＣ末端にコンジュゲートしている、(15)に記載のＴｎ３足場。
(17) 前記リンカーが、ペプチドリンカーを含む、(15)または(16)に記載のＴｎ３足場。(18) 前記ペプチドリンカーが、フレキシブルペプチドリンカーである、(17)に記載のＴｎ３足場。
(19) 前記ペプチドリンカーが、（ＧｍＸ）ｎ配列（式中、
（ａ）Ｘは、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、またはバリン（Ｖ）であり；
（ｂ）ｍおよびｎは、整数であり；
（ｃ）ｍは、１、２、３または４であり；
（ｄ）ｎは、１、２、３、４、５、６、または７である）
を含む、(17)または(18)に記載のＴｎ３足場。
(20) 前記ペプチドリンカーが、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１４２、または配列番号１４３を含む、(19)に記載のＴｎ３。
(21) 前記リンカーが、機能的部分を含む、(15)に記載のＴｎ３足場。
(22) 前記機能的部分が、免疫グロブリンまたはその断片である、(21)に記載のＴｎ３足場。
(23) 前記免疫グロブリンまたはその断片が、Ｆｃドメインを含む、(22)に記載のＴｎ３足場。
(24) 前記Ｆｃドメインが、少なくとも１つのＦｃγＲ媒介エフェクター機能を誘導し得ない、(23)に記載のＴｎ３足場。
(25) 前記少なくとも１つのＦｃγＲ媒介エフェクター機能が、ＡＤＣＣである、(24)に記載のＴｎ３足場。
(26) 少なくとも１つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、異種部分に結合している、(15)に記載のＴｎ３足場。
(27) 前記異種部分が、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、薬物、毒素、細胞傷害剤、造影剤、放射性核種、放射性化合物、有機ポリマー、無機ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＳＡ ＦｃＲｎ結合部分、抗体、抗体のドメイン、抗体断片、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩ足場、エピトープタグ、組換えポリペプチドポリマー、サイトカイン、および前記部分の２つ以上の組合せからなる群から選択される組成物を含む、(15)または(26)に記載のＴｎ３足場。
(28) 少なくとも１つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、ＰＥＧにコンジュゲートしている、(27)に記載のＴｎ３足場。
(29) 少なくとも１つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、アルブミンにコンジュゲートしている、(27)に記載のＴｎ３足場。
(30) 前記アルブミンが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である、(29)に記載のＴｎ３足場。
(31) 前記ＨＳＡが、バリアントＨＳＡである、(30)に記載のＴｎ３足場。
(32) 前記バリアントＨＳＡのアミノ酸配列が、配列番号１３３である、(31)に記載のＴｎ３足場。
(33) 前記バリアントＨＳＡが、ネイティブＨＳＡまたはネイティブＨＳＡ断片と比較して少なくとも１つの改善された特性を有する、(31)に記載のＴｎ３足場。
(34) 前記改善された特性が、ネイティブＨＳＡまたはネイティブＨＳＡ断片の血漿半減期と比較して変化した血漿半減期である、(33)に記載のＴｎ３足場。
(35) 前記変化した血漿半減期が、ネイティブＨＳＡまたはネイティブＨＳＡ断片の血漿半減期と比較して長い血漿半減期である、(34)に記載のＴｎ３足場。
(36) 前記変化した血漿半減期が、ネイティブＨＳＡまたはネイティブＨＳＡ断片の血漿半減期と比較して短い血漿半減期である、(34)に記載のＴｎ３足場。
(37) 前記ＨＳＡバリアントが、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、(31)または(33)〜(36)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(38) 前記ＨＳＡバリアントが、全長成熟ＨＳＡ（配列番号１３３または１３８）の配列をまたはその断片を含み、但し、４０７、４１５、４６３、５００、５０６、５０８、５０９、５１１、５１２、５１５、５１６、５２１、５２３、５２４、５２６、５３５、５５０、５５７、５７３、５７４、および５８０からなる群から選択される位置における全長成熟ＨＳＡ中の位置に対して番号付与される少なくとも１つのアミノ酸置換を除き；前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、５７３位におけるリジン（Ｋ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換を含まず、前記ＨＳＡバリアントにコンジュゲートしていないＴｎ３足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する、(31)または(33)〜(37)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(39) 全長成熟ＨＳＡ中の位置に対して番号付与される前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、４６３、５０８、５２３、および５２４からなる群から選択される位置におけるものであり、前記ＨＳＡバリアントにコンジュゲートしていないＴｎ３足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する、(38)に記載のＴｎ３足場。
(40) 前記ＨＳＡバリアントが、全長成熟ＨＳＡ（配列番号１３３または１３８）の配列またはその断片を含み、但し、
（ａ）４０７位におけるロイシン（Ｌ）のアスパラギン（Ｎ）またはチロシン（Ｙ）への置換；
（ｂ）４１５位におけるバリン（Ｖ）のトレオニン（Ｔ）への置換；
（ｃ）４６３位におけるロイシン（Ｌ）のアスパラギン（Ｎ）への置換；
（ｄ）５００位におけるリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）への置換；
（ｅ）５０６位におけるトレオニン（Ｔ）のチロシン（Ｙ）への置換；
（ｆ）５０８位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）への置換；
（ｇ）５０９位におけるフェニルアラニン（Ｆ）のメチオニン（Ｍ）またはトリプトファン（Ｗ）への置換；
（ｈ）５１１位におけるアラニン（Ａ）のフェニルアラニン（Ｆ）への置換；
（ｉ）５１２位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のチロシン（Ｙ）への置換；
（ｊ）５１５位におけるトレオニン（Ｔ）のグルタミン（Ｑ）への置換；
（ｋ）５１６位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）またはトリプトファン（Ｗ）への置換；
（ｌ）５２１位におけるアルギニン（Ｒ）のトリプトファン（Ｗ）への置換；
（ｍ）５２３位におけるイソロイシン（Ｉ）のアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）への置換；
（ｎ）５２４位におけるリジン（Ｋ）のロイシン（Ｌ）への置換；
（ｏ）５２６位におけるグルタミン（Ｑ）のメチオニン（Ｍ）への置換；
（ｐ）５３５位におけるヒスチジン（Ｈ）のプロリン（Ｐ）への置換；
（ｑ）５５０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換；
（ｒ）５５７位におけるリジン（Ｋ）のグリシン（Ｇ）への置換；
（ｓ）５７３位におけるリジン（Ｋ）のフェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、プロリン（Ｐ）、トリプトファン（Ｗ）、またはチロシン（Ｙ）への置換；
（ｔ）５７４位におけるリジン（Ｋ）のアスパラギン（Ｎ）への置換；
（ｕ）５８０位におけるグルタミン（Ｑ）のリジン（Ｋ）への置換；および
（ｖ）前記置換の２つ以上の組合せ
からなる群から選択される全長成熟ＨＳＡ中の位置に対して番号付与される少なくとも１つのアミノ酸置換を除き、
前記ＨＳＡバリアントにコンジュゲートしていないＴｎ３足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する、(31)または(33)〜(38)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(41) 前記ＨＳＡバリアントが、全長成熟ＨＳＡ（配列番号１３３または１３８）の配列またはその断片を含み、但し、
（ａ）４６３位におけるロイシン（Ｌ）のアスパラギン（Ｎ）への置換；
（ｂ）５０８位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）への置換；
（ｃ）５２３位におけるイソロイシン（Ｉ）のアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）への置換；
（ｄ）５２４位におけるリジン（Ｋ）のロイシン（Ｌ）への置換；および
（ｅ）前記置換の２つ以上の組合せ
からなる群から選択される全長成熟ＨＳＡ中の位置に対して番号付与される少なくとも１つのアミノ酸置換を除き、
前記ＨＳＡバリアントにコンジュゲートしていないＴｎ３足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する、(40)に記載のＴｎ３足場。
(42) 少なくとも２つの同一のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む、(3)〜(14)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(43) 少なくとも２つの異なるＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む、(3)〜(15)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(44) ＣＤ４０受容体アゴニストである、(1)〜(43)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(45) ＣＤ４０受容体アンタゴニストである、(1)〜(44)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(46) 少なくとも２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、同一のＣＤ４０Ｌエピトープに特異的に結合する、(3)〜(14)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(47) 少なくとも２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、異なるＣＤ４０Ｌエピトープに特異的に結合する、(3)〜(14)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(48) 前記異なるＣＤ４０Ｌエピトープが、非重複エピトープである、(47)に記載のＴｎ３足場。
(49) 前記異なるＣＤ４０Ｌエピトープが、重複エピトープである、(47)に記載のＴｎ３足場。
(50) 少なくとも２つのＣＤ４０Ｌ分子に結合する、(1)〜(49)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(51) 単一のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、少なくとも２つのＣＤ４０Ｌ分子に結合する、(1)〜(50)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(52) 少なくとも１つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットのベータ鎖が、配列番号３のベータ鎖と少なくとも９０％の配列同一性を有する、(1)に記載のＴｎ３足場。
(53) 前記Ａベータ鎖が、少なくとも１つの突然変異を除き配列番号１１を含む、(1)に記載のＴｎ３足場。
(54) 前記Ｂベータ鎖が、少なくとも１つの突然変異を除き配列番号１２を含む、(1)に記載のＴｎ３足場。
(55) 前記Ｃベータ鎖が、少なくとも１つの突然変異を除き配列番号１３または１４を含み、配列番号１３のシステインも配列番号１４のシステインも置換されていない、(1)に記載のＴｎ３足場。
(56) 前記Ｄベータ鎖が、少なくとも１つの突然変異を除き配列番号１５を含む、(1)に記載のＴｎ３足場。
(57) 前記Ｅベータ鎖が、少なくとも１つの突然変異を除き配列番号１６を含む、(1)に記載のＴｎ３足場。
(58) 前記Ｆベータ鎖が、少なくとも１つの突然変異を除き配列番号１７を含み、配列番号１７のシステインが置換されていない、(1)に記載のＴｎ３足場。
(59) 前記Ｇベータ鎖が、少なくとも１つの突然変異を除き配列番号１８を含む、(1)に記載のＴｎ３足場。
(60) 前記ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、アミノ酸配列：
ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＥＴＦＴＴ
（式中、
（ａ）ＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれ前記ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループの配列中に存在するアミノ酸残基を表し；
（ｂ）Ｘ１は、アミノ酸残基ＡまたはＴを表し；
（ｃ）ループの長さｎは、２から２６の整数である）
を含む、(1)〜(59)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(61) 前記ＡＢループの配列が、配列番号４または配列番号１３６を含み、前記ＣＤループの配列が、配列番号６を含み、前記ＥＦループの配列が、配列番号８または配列番号１３７を含む、(60)に記載のＴｎ３足場。
(62) 前記ＢＣループの配列が、配列番号８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２からなる群から選択される配列を含む、(60)に記載のＴｎ３足場。
(63) 前記ＤＥループの配列が、配列番号９４、９５、９６、９７、９８、および１６９からなる群から選択される配列を含む、(60)に記載のＴｎ３足場。
(64) 前記ＦＧループの配列が、配列番号９、９９、１３９、および１７０からなる群から選択される配列を含む、(60)に記載のＴｎ３足場。
(65) 前記ＢＣループの配列が、配列番号１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、および１７４からなる群から選択される配列を含む、(60)に記載のＴｎ３足場。
(66) 前記ＤＥループの配列が、配列番号１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、および１７５からなる群から選択される配列を含む、(60)に記載のＴｎ３足場。
(67) 前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９、１３０、および１７７からなる群から選択される配列を含む、(60)に記載のＴｎ３足場。
(68) （ａ）前記ＢＣループの配列が、配列番号８３を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９４を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
（ｂ）前記ＢＣループの配列が、配列番号８３を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９４を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９９を含み；
（ｃ）前記ＢＣループの配列が、配列番号８４を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９５を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
（ｄ）前記ＢＣループの配列が、配列番号８５を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９４を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
（ｅ）前記ＢＣループの配列が、配列番号８６を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９６を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
（ｆ）前記ＢＣループの配列が、配列番号８７を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９７を含み、前記ＦＧループの配列は、配列番号９または１３９を含み；
（ｇ）前記ＢＣループの配列が、配列番号８８を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９５を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
（ｈ）前記ＢＣループの配列が、配列番号８９を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９４を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
（ｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号９０を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９４を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
（ｊ）前記ＢＣループの配列が、配列番号９１を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９５を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
（ｋ）前記ＢＣループの配列が、配列番号９２を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９８を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；または
（ｌ）前記ＢＣループの配列が、配列番号９３を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９４を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含む、
(60)に記載のＴｎ３足場。
(69) （ａ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１００を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１１８を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
（ｂ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０１を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１１９を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
（ｃ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０２を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２０を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
（ｄ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０３を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２１を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
（ｅ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０４を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２２を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
（ｆ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０５を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２１を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
（ｇ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０６を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２３を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
（ｈ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０７を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２３を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
（ｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０８を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１１８を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
（ｊ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０９を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２３を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
（ｋ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１１０を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２１を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
（ｌ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１１１を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２３を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１３０を含み；
（ｍ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０８を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２１を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
（ｎ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１１２を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２４を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
（ｏ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１１３を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２５を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
（ｐ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１１４を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１１８を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
（ｑ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１１５を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２６を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
（ｒ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１１６を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２７を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；または
（ｓ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１１７を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２８を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含む、
(60)に記載のＴｎ３足場。
(70) 前記ＡＢループが、配列番号１３６を含む、(69)に記載のＴｎ３足場。
(71) 前記ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および１４６からなる群から選択される配列を含む、(68)に記載のＴｎ３足場。
(72) 前記ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、アミノ酸配列：
ＩＥＶＫＤＶＴＤＴＴＡＬＩＴＷＸ１ＤＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＣＥＬＴＹＧＩＫＤＶＰＧＤＲＴＴＩＤＬＷＸ９ＨＸ１０ＡＸ１１ＹＳＩＧＮＬＫＰＤＴＥＹＥＶＳＬＩＣＲＸ１２ＧＤＭＳＳＮＰＡＫＥＴＦＴＴ（配列番号１６７）
（式中、
（ａ）Ｘ１は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）またはロイシン（Ｌ）を表し；
（ｂ）Ｘ２は、アミノ酸残基アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し；
（ｃ）Ｘ３は、アミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）を表し；
（ｄ）Ｘ４は、アミノ酸残基アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｅ）Ｘ５は、アミノ酸残基グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはアスパラギン（Ｎ）を表し；
（ｆ）Ｘ６は、アミノ酸残基フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｇ）Ｘ７は、アミノ酸残基イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｈ）Ｘ８は、アミノ酸残基グリシン（Ｇ）、トリプトファン（Ｗ）またはバリン（Ｖ）を表し；
（ｉ）Ｘ９は、アミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｊ）Ｘ１０は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、メチオニン（Ｍ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｋ）Ｘ１１は、アミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｌ）Ｘ１２は、アミノ酸残基アルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）を表す）
を含む、(60)に記載のＴｎ３足場。
(73) 前記ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、配列番号４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、および８２からなる群から選択される配列を含む、(69)に記載のＴｎ３足場。
(74) 前記ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、アミノ酸配列：
ＩＥＶＸ１ＤＶＴＤＴＴＡＬＩＴＷＸ２Ｘ３ＲＳＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＣＥＬＸ１１ＹＧＩＫＤＶＰＧＤＲＴＴＩＤＬＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５ＹＶＨＹＳＩＧＮＬＫＰＤＴＸ１６ＹＥＶＳＬＩＣＬＴＴＤＧＴＹＸ１７ＮＰＡＫＥＴＦＴＴ（配列番号１７１）
（式中、
（ａ）Ｘ１は、アミノ酸残基リジン（Ｋ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し；
（ｂ）Ｘ２は、アミノ酸残基トレオニン（Ｔ）またはイソロイシン（Ｉ）を表し；
（ｃ）Ｘ３は、アミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）またはアラニン（Ａ）を表し；
（ｄ）Ｘ４は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｅ）Ｘ５は、アミノ酸残基チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）またはセリン（Ｓ）を表し；
（ｆ）Ｘ６は、アミノ酸残基チロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｇ）Ｘ７は、アミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｈ）Ｘ８は、アミノ酸残基ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｉ）Ｘ９は、アミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｊ）Ｘ１０は、アミノ酸残基グリシン（Ｇ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｋ）Ｘ１１は、アミノ酸残基アラニン（Ａ）またはトレオニン（Ｔ）を表し；
（ｌ）Ｘ１２は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｒ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｍ）Ｘ１３は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアラニン（Ａ）を表し；
（ｎ）Ｘ１４は、アミノ酸残基プロリン（Ｐ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）またはアラニン（Ａ）またはアミノ酸無しを表し；
（ｏ）Ｘ１５は、アミノ酸残基イソロイシン（Ｉ）またはアミノ酸無しを表し；
（ｐ）Ｘ１６は、アミノ酸残基グルタミン酸（Ｅ）またはリジン（Ｋ）を表し；
（ｑ）Ｘ１７は、アミノ酸残基セリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）を表す）
を含む、(60)に記載のＴｎ３足場。
(75) 配列番号１３４、１３５、２０５、２０６、２０７および２０８からなる群から選択される配列を含むＴｎ３足場。
(76) 配列番号１３４、１３５、２０５、２０６、２０７および２０８からなる群から選択される配列からなるＴｎ３足場。
(77) 配列番号２０１、２０２、２０３、および２０４からなる群から選択される配列を含むＴｎ３足場。
(78) 配列番号２０１、２０２、２０３、および２０４からなる群から選択される配列からなるＴｎ３足場。
(79) 前記ＣＤ４０Ｌが、ヒトＣＤ４０Ｌである、(1)〜(78)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(80) 前記ＣＤ４０Ｌが、膜結合ＣＤ４０Ｌ（配列番号１）、可溶性ＣＤ４０Ｌ（配列番号２）、またはその断片である、(79)に記載のＴｎ３足場。
(81) ＣＤ４０Ｌに結合し、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を妨害する、(1)〜(80)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(82) ＣＤ４０Ｌに結合し、ＣＤ４０媒介シグナリングを破壊する、(1)〜(81)のいずれか一項に記載のＴｎ３足場。
(83) ＣＤ４０Ｌ発現細胞を(1)〜(82)のいずれかに記載のＴｎ３足場と接触させることを含むＣＤ４０Ｌ発現細胞の活性を変化させる方法であって、前記Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌに結合し、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を妨害する方法。
(84) ＣＤ４０Ｌ発現細胞を(1)〜(82)のいずれかに記載のＴｎ３足場と接触させることを含むＣＤ４０媒介シグナリング応答を変化させる方法であって、前記Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌに結合し、ＣＤ４０媒介シグナリングを破壊する方法。
(85) 前記ＣＤ４０媒介シグナリング応答が、Ｔ依存性免疫応答である、(84)に記載の方法。
(86) 約１μＭ以下、または約５００ｎＭ以下、または約１００ｎＭ以下、または約５０ｎＭ以下、または約２５ｎＭ以下、または約１０ｎＭ以下、または約５ｎＭ以下、または約２ｎＭ以下の親和性（Ｋｄ）でＣＤ４０Ｌに結合する、(1)〜(82)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(87) ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、配列番号２の１４２から１５５、２００から２３０、または２４７から２５１位に局在するアミノ酸を含むＣＤ４０Ｌエピトープに特異的に結合する、(1)〜(82)および(86)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(88) ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、ＣＤ４０Ｌアミノ酸Ｅ１４２、Ｙ１４６、Ｍ１４８、Ｎ１５１、Ｌ１５５、Ｒ２００、Ｒ２０３、およびＥ２３０と相互作用する、(1)〜(61)、(65)〜(67)、(69)、(70)、(73)、(74)、(77)、および(78)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(89) ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、ＣＤ４０Ｌアミノ酸Ｒ２０３、Ｉ２０４、Ｖ２４７、Ｈ２４９、およびＴ２５１と相互作用する、(1)〜(64)、(68)、(71)、(72)、(75)および(76)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(90) ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、ＣＤ４０Ｌアミノ酸Ｓ２４５、Ｖ２４７、Ｈ２４９、およびＴ２５１と相互作用する、(1)〜(64)、(68)、(71)、(72)、(75)および(76)のいずれかに記載のＴｎ３足場。
(91) ＣＤ４０Ｌアミノ酸Ｅ１４２、Ｙ１４６、Ｍ１４８、Ｎ１５１、Ｌ１５５が、第１のＣＤ４０Ｌ分子中に局在し、アミノ酸Ｒ２００、Ｒ２０３、およびＥ２３０が、第２のＣＤ４０Ｌ分子中に局在する、(88)に記載のＴｎ３足場。
(92) ＣＤ４０Ｌアミノ酸Ｒ２０３およびＩ２０４が、第１のＣＤ４０Ｌ分子中に局在し、ＣＤ４０Ｌアミノ酸Ｖ２４７、Ｈ２４９、およびＴ２５１が、第２のＣＤ４０Ｌ分子中に局在する、(89)に記載のＴｎ３足場。
(93) (1)〜(82)および(86)〜(92)のいずれかに記載のＴｎ３足場をコードする単離核酸分子。
(94) (93)に記載の核酸を含む発現ベクター。
(95) (94)に記載のベクターを含む宿主細胞。
(96) 前記核酸分子によりコードされるＴｎ３足場が発現される条件下で(95)に記載の宿主細胞を培養することを含む、Ｔｎ３足場を産生する方法。
(97) (1)〜(82)および(86)〜(92)のいずれかに記載のＴｎ３足場および薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物。
(98) 有効量の(96)に記載の組成物を投与することを含む、自己免疫疾患の予防、治療、改善、または管理が必要とされる患者における自己免疫疾患を予防、治療、改善、または管理する方法。
(99) 治療有効量の(93)に記載の組成物を患者に投与することを含む、自己免疫疾患を有する患者に投与されるコルチコステロイドの頻度および量を低減させる方法。
(100) 前記自己免疫疾患が、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、シェーグレン症候群、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、加齢性黄斑変性、血管新生性緑内障、血管腫、甲状腺過形成（グレーブス病を含む）、角膜および他の組織移植、ならびに慢性炎症、敗血症、関節リウマチ、腹膜炎、クローン病、再灌流損傷、敗血症、内毒素ショック、嚢胞性線維症、心内膜炎、乾癬、関節炎（例えば、乾癬性関節炎）、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流損傷、脊髄損傷および同種移植片拒絶反応、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄多発性神経障害、チャーグストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、１型または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、例えば、疱疹状皮膚炎血管炎、白斑およびウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される、(98)または(99)のいずれかに記載の方法。
(101) 前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、(98)または(99)のいずれかに記載の方法。
(102) 追加の治療法をさらに含み、前記治療法は、免疫療法、生物療法、化学療法、放射線療法、または小分子薬物療法である、(98)または(99)のいずれかに記載の方法。
(103) 可溶性ＣＤ４０Ｌ（配列番号２）との複合体中の配列番号２０からなるＴｎ３足場を含むタンパク質結晶であって、Ｐ２１２１２１斜方晶空間群およびａ＝８５．６９Å、ｂ＝９０．６４Å、ｃ＝９５．５６Åの単位格子寸法、＋／−０．１％における結晶格子を有するタンパク質結晶。
(104) 前記結晶の非対称単位が、ＣＤ４０ＬのトリマーおよびＴｎ３足場の３つの分子を含む、(103)に記載のタンパク質結晶。
(105) 構造座標の決定のためのＸ線を、３．２Å以下の値の分解能に回折させる、(103)に記載のタンパク質結晶。
(106) 可溶性ＣＤ４０Ｌ（配列番号２）との複合体中の配列番号６８からなるＴｎ３足場を含むタンパク質結晶であって、Ｐ２１３立方晶空間群およびａ＝ｂ＝ｃ＝９７．６２Åの単位格子寸法、＋／−０．１％における結晶格子を有するタンパク質結晶。
(107) 前記結晶の非対称単位が、１つのＣＤ４０Ｌ分子および１つのＴｎ３足場分子を含む、(106)に記載のタンパク質結晶。
(108) 構造座標を決定するためのＸ線を、２．７Å以下の値の分解能に回折させる、(106)に記載のタンパク質結晶。
(109) 可溶性ＣＤ４０Ｌ（配列番号２）との複合体中の配列番号２８または１４６からなるＴｎ３足場を含むタンパク質結晶であって、Ｐ３２１空間群および、ａ＝９５．５３Å、ｂ＝９３．５３Å、ｃ＝６６．６９Åの単位格子寸法、＋／−０．１％における結晶格子を有するタンパク質結晶。
(110) 前記結晶の非対称単位が、１つのＣＤ４０Ｌ分子および１つのＴｎ３足場分子を含む、(109)に記載のタンパク質結晶。
(111) 構造座標を決定するためのＸ線を、２．８Å以下の値の分解能に回折させる、(109)に記載のタンパク質結晶。
(112) 可溶性ＣＤ４０Ｌ（配列番号２）との複合体中の配列番号６８および配列番号２８または１４６からなる２つの異なるＴｎ３足場を含むタンパク質結晶であって、Ｐ２１立方晶空間群およびａ＝８０．３２Å、ｂ＝１４３．４８Å、ｃ＝１１１．２７Å、β＝９８．２２Åの単位格子寸法、＋／−０．１％における結晶格子を有するタンパク質結晶。
(113) 前記結晶の非対称単位が、２つのＣＤ４０Ｌトリマーおよび６つのそれぞれのＴｎ３足場分子を含む、(112)のタンパク質結晶。
(114) 構造座標を決定するためのＸ線を、１．９Å以下の値の分解能に回折させる、(112)に記載のタンパク質結晶。
(115) シッティングドロップ蒸気拡散により結晶化されている、(103)〜(114)のいずれか一項に記載のタンパク質結晶。
(116) （ａ）ＣＤ４０Ｌとの複合体中のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場を含むある容量の液体を、沈殿剤を含むある容量のリザーバー溶液と混合すること；および
（ｂ）工程（ａ）において得られた混合物を密閉容器中で、タンパク質結晶が形成するまで結晶化に好適な条件下でインキュベートすること
を含む、タンパク質結晶を作製する方法。
(117) 前記タンパク質結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散により産生する、(116)に記載の方法。
(118) 前記Ｔｎ３足場が、配列番号２０、配列番号２８、配列番号６８または配列番号１４６を含む、(116)に記載の方法。
(119) （ａ）データを、ＣＤ４０Ｌと複合体化されたＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場のタンパク質結晶の一部の構造についてのグラフ三次元表示に変換するための；および
（ｂ）前記グラフ三次元表示の表示をもたらすための、
機械可読命令が符号化されたデータ保存材料を含む機械可読データ保存媒体。
(120) 前記Ｔｎ３足場が、配列番号２０、配列番号２８、配列番号６８または配列番号１４６を含む、(119)に記載の機械可読データ保存媒体。
(121) 前記タンパク質結晶が、(103)に記載の結晶、(106)に記載の結晶、(118)に記載の結晶、またはそれらの任意の組合せである、(119)に記載の機械可読データ保存媒体。
配列
Figure 2017195884
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Claims (15)

  1. ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含むＴｎ３足場であって、前記モノマーサブユニットは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと命名される７つのベータ鎖、ならびにＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧと命名される６つのループ領域を含み、前記Ｔｎ３足場は、配列番号２の１４２から１５５、２００から２３０、または２４７から２５１位に局在するアミノ酸を含むＣＤ４０Ｌエピトープに特異的に結合する、前記Ｔｎ３足場。
  2. 単一のＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットまたは、場合によりペプチドリンカーによりタンデムに連結されている２つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットを含む、請求項１に記載のＴｎ３足場。
  3. 前記足場がＣＤ４０Ｌに結合し、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を妨害するおよび／またはＣＤ４０媒介シグナリングを破壊する、請求項１または２に記載のＴｎ３足場。
  4. 少なくとも１つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、薬物、毒素、細胞傷害剤、造影剤、放射性核種、放射性化合物、有機ポリマー、無機ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＳＡ ＦｃＲｎ結合部分、抗体、抗体のドメイン、抗体断片、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩ足場、エピトープタグ、組換えポリペプチドポリマーおよびサイトカインからなる群から選択される異種部分に融合またはコンジュゲートしている、請求項１、２または３に記載のＴｎ３足場。
  5. 少なくとも１つのＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、ＰＥＧにコンジュゲートしているか、またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に融合している、請求項４に記載のＴｎ３足場。
  6. 前記ＨＳＡが、バリアントＨＳＡである、請求項５に記載のＴｎ３足場。
  7. 前記ＨＳＡバリアントが、配列番号１３３のアミノ酸配列を有するか、または前記ＨＳＡバリアントが、４０７、４１５、４６３、５００、５０６、５０８、５０９、５１１、５１２、５１５、５１６、５２１、５２３、５２４、５２６、５３５、５５０、５５７、５７３、５７４、および５８０からなる群から選択される位置における全長成熟ＨＳＡ中の位置に対して番号付与される少なくとも１つのアミノ酸置換を除いて、全長成熟ＨＳＡ（配列番号１３３または１３８）の配列またはその断片を含み、；前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、５７３位におけるリジン（Ｋ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換を含まず、前記Ｔｎ３足場が、前記ＨＳＡバリアントにコンジュゲートしていないＴｎ３足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する、請求項６に記載のＴｎ３足場。
  8. 前記ＣＤ４０Ｌ特異的モノマーサブユニットが、アミノ酸配列：
    ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＥＴＦＴＴ
    （式中、
    （ａ）ＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれ前記ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループの配列中に存在するアミノ酸残基を表し；
    （ｂ）Ｘ１は、アミノ酸残基ＡまたはＴを表し；
    （ｃ）ループの長さｎは、２から２６の整数である）
    を含み、場合により前記ＡＢループの配列が、配列番号４または配列番号１３６を含み、前記ＣＤループの配列が、配列番号６を含み、前記ＥＦループの配列が、配列番号８または配列番号１３７を含み；さらに
    または場合により
    （ｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号８３を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９４を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
    （ｉｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号８３を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９４を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９９を含み；
    （ｉｉｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号８４を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９５を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
    （ｉｖ）前記ＢＣループの配列が、配列番号８５を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９４を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
    （ｖ）前記ＢＣループの配列が、配列番号８６を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９６を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
    （ｖｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号８７を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９７を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
    （ｖｉｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号８８を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９５を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
    （ｖｉｉｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号８９を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９４を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
    （ｉｘ）前記ＢＣループの配列が、配列番号９０を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９４を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
    （ｘ）前記ＢＣループの配列が、配列番号９１を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９５を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
    （ｘｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号９２を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９８を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
    （ｘｉｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号９３を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号９４を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号９または１３９を含み；
    （ｘｉｉｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１００を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１１８を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
    （ｘｉｖ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０１を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１１９を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
    （ｘｖ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０２を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２０を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
    （ｘｖｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０３を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２１を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
    （ｘｖｉｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０４を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２２を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
    （ｘｖｉｉｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０５を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２１を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
    （ｘｉｘ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０６を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２３を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
    （ｘｘ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０７を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２３を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
    （ｘｘｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０８を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１１８を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
    （ｘｘｉｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０９を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２３を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
    （ｘｘｉｉｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１１０を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２１を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
    （ｘｘｉｖ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１１１を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２３を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１３０を含み；
    （ｘｘｖ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１０８を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２１を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
    （ｘｘｖｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１１２を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２４を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
    （ｘｘｖｉｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１１３を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２５を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
    （ｘｘｖｉｉｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１１４を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１１８を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
    （ｘｘｉｘ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１１５を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２６を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；
    （ｘｘｘ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１１６を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２７を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含み；または
    （ｘｘｘｉ）前記ＢＣループの配列が、配列番号１１７を含み、前記ＤＥループの配列が、配列番号１２８を含み、前記ＦＧループの配列が、配列番号１２９を含む、
    請求項１〜７のいずれか一項に記載のＴｎ３足場。
  9. 配列番号１３４、１３５、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７および２０８からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＴｎ３足場。
  10. ＣＤ４０Ｌ発現細胞を請求項１〜９のいずれか一項に記載のＴｎ３足場と接触させることを含むＣＤ４０媒介シグナリング応答を変化させる方法であって、前記Ｔｎ３足場は、ＣＤ４０Ｌに結合し、ＣＤ４０媒介シグナリングを破壊する、前記方法。
  11. 前記ＣＤ４０媒介シグナリング応答が、Ｔ依存性免疫応答である、請求項１０に記載の方法。
  12. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＴｎ３足場をコードする単離核酸分子。
  13. 請求項１２に記載の核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、前記核酸分子によりコードされるＴｎ３足場が発現される条件下で培養することを含む、Ｔｎ３足場を産生する方法。
  14. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＴｎ３足場および薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物。
  15. 1) 自己免疫疾患の予防、治療、改善、または管理が必要とされる患者における自己免疫疾患を予防、治療、改善、または管理する方法；または
    2) 自己免疫疾患を有する患者に投与されるコルチコステロイドの頻度または量を低減させる方法であって、場合により
    前記自己免疫疾患が、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、シェーグレン症候群、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、加齢性黄斑変性、血管新生性緑内障、血管腫、甲状腺過形成（グレーブス病を含む）、角膜および他の組織移植、ならびに慢性炎症、敗血症、関節リウマチ、腹膜炎、クローン病、再灌流損傷、敗血症、内毒素ショック、嚢胞性線維症、心内膜炎、乾癬、関節炎（例えば、乾癬性関節炎）、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流損傷、脊髄損傷および同種移植片拒絶反応、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄多発性神経障害、チャーグストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、１型または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、例えば、疱疹状皮膚炎血管炎、白斑およびウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される、前記方法
    において使用するための、請求項１４に記載の組成物。
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