RS60828B1 - Cd40l-specifične konstrukcije izvedene iz tn3 i metode za njihovu primenu - Google Patents

Description

Opis

OSNOVA PRONALASKA

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se uopšteno odnosi na polje mimetika antitela, posebno na konstrukcije dobijene od trećeg domena fibronektina tip III humanog tenascina C korisna, na primer, za dobijanje proizvoda koji imaju nove karakteristike vezivanja. Konkretno, pronalazak se odnosi na CD40L-specifične Tn3 konstrukcije, metode za izradu takvih konstrukcija i metode primene za dijagnozu i lečenje sistemskog eritemskog lupusa i drugih autoimunskih i/ili inflamatornih poremećaja.

Naučna osnova

[0002] Ovaj pronalazak se odnosi na CD40L-specifične proteinske konstrukcije koje se vezuju za CD40L, i korisne su, na primer, za lečenje autoimunskih i/ili inflamatornih poremećaja.

[0003] Biomolekuli koji mogu specifično da se vežu za željeni ciljni epitop su veoma značajni alati za terapeutiku, istraživanje i medicinsku dijagnostiku. Dobro poznat primer za ovu klasu molekula je antitelo. Mogu biti odabrana antitela koja se specifično vezuju, i koja imaju afinitet prema skoro svakom strukturnom epitopu. Međutim, klasična antitela su strukturno kompleksni heterotetramerni molekuli koji se teško eksprimiraju u jednostavnim eukariotskim sistemima. Usled toga, većina antitela se proizvodi koristeći složene i skupe ekspresione sisteme ćelija sisara.

[0004] Proteini sa relativno definisanim trodimenzionalnim strukturama, koji se obično nazivaju proteinske konstrukcije, mogu da se koriste kao reagensi za dizajn konstruisanih proizvoda. Jedna posebna oblast u kojoj su takve konstrukcije korisne je oblast dizajna mimetika antitela. Mimetici antitela, tj. mali proteinski terapeutici koji nisu antitela, koriste prednosti antitela i fragmenata antitela, kao što je vezivanje ciljeva sa velikim afinitetom i mala imunogenost i toksičnost, uz izbegavanje nekih nedostataka, kao što je težnja fragmenata antitela da stvaraju agregate i da budu manje stabilni od IgG pune dužine.

[0005] Ovi nedostaci se mogu otkloniti upotrebom fragmenata antitela napravljenih uklanjanjem nativnih presavijenih delova antitela. Međutim, to često izaziva agregaciju kada ostaci aminokiselina koji bi normalno bili zatrpani u hidrofobnom okruženju, kao što je međupovršina između varijabilnog i kostantnog domena, postanu izloženi rastvaraču. Jedan primer mimetika antitela na bazi konstrukcije je zasnovan na strukturi domena fibronektina tip III (FnIII), koji je rasprostranjen u redovima i klasama proteina, kao što su proteini u krvi i strukturni proteini sisara. Dizajn i primena FnIII konstrukcija dobijenih od trećeg FnIII domena humanog tenascina C opisani su u PCT aplikacijama PCT/US2011/032184 i PCT/US2011/032188.

[0006] CD40L je član TNF porodice molekula koji se prvenstveno eksprimira na aktiviranim T ćelijama (uključujući podtipove Th0, Th1 i Th2, i gradi homotrimere slične drugim članovima porodice. Nadalje, nađeno je da je CD40L takođe eksprimiran na mastocitima, i aktiviranim bazofilima i eozinofilima. CD40L se vezuje za CD40 receptor (CD40R) na antigen-prezentujućim ćelijama (APC), što izaziva mnoge efekte, u zavisnosti od tipa ciljne ćelije. Generalno, CD40L ima ulogu kostimulišućeg molekula i indukuje aktivaciju kod APC u vezi sa stimulacijom receptora T ćelija od strane molekula MHC na APC.

[0007] Signalizacija putem CD40 receptora od strane CD40L aktivira kaskadu događaja koja dovodi do aktivacije ćelija koje nose CD40 receptor i optimalnog kondicioniranja CD4+ T ćelije. Konkretnije, srodna interakcija između CD40L i CD40 receptora promoviše diferencijaciju B ćelija u ćelije koje luče antitelo i memorijske B ćelije (Burkly, u Adv. Exp. Med. Bio., Vol.489., D. M. Monroe, U. Hedner, M. R. Hoffman, C. Negrier, G. F. Savidge, i G. C. I. White, izd. Klower Academic/Plenum Publishers, 2001, str. 135). Pored toga, interakcija između CD40L i CD40 receptora promoviše imunitet posredovan ćelijom putem aktivacije makrofaga i dendritskih ćelija i stvaranje ćelija prirodnih ubica i citotoksičnih T limfocita (vidite Burkly, iznad).

[0008] Pokazalo se da je interakcija između CD40L i CD40 receptora značajna kod nekoliko eksperimentalno izazvanih autoimunskih bolesti, kao što je kolagenom indukovani artritis, eksperimentalni alergijski encefalomijelitis, ooforitis, kolitis, lekom indukovani lupusni nefritis. Posebno, pokazalo se da indukcija bolesti na svim ovim modelima može biti blokirana antagonistima CD40L u vreme primene antigena. Blokiranje bolesti pomoću anti-CD40L antagonista je takođe primećeno na životinjskim modelima spontane autoimunske bolesti, uključujući insulin-zavisni dijabetes i lupusni nefritis, kao i kod modela bolesti „kalem protiv domaćina“, transplantata, fibroze pluća i ateroskleroze.

[0009] Pokazalo se da je prekidanje puta CD40L/CD40R putem blokade CD40L korisno kod mnogih autoimunskih bolesti (na primer, ali bez ograničenja na sistemski eritemski lupus (SLE), reumatoidni artritis (RA), multiplu sklerozu (MS), inflamatornu bolest creva (IBC) i odbacivanje alografta. Na primer, lečenje anti-CD40L antitelima je sprečilo ili poboljšalo nefritis na mišjem modelu kolagenom indukovanog artritisa (Mohan et al. J. Immuno.

154:1470). Pored toga, anti-CD40L antitela su očuvala funkciju bubrega kod SNF1 miševa sa potvrđenim nefritisom. (Kalled et al. J. Immuno.160:2158). Nivoi CD40L su u tesnoj korelaciji sa težinom kliničke bolesti (tj. smanjenjem zapaljenja) i oštećenjem ciljnog tkiva kod neljudskih ispitanika i kod ljudi.

[0010] SLE je progresivna i ponekad fatalna autoimunska bolest. Različite prezentacije lupusa idu od osipa i artritisa preko anemije i trombocitopenije, pa čak do psihoze. Postoji jasan dokaz da su mnoge grane imunskog sistema uključene u inflamatorni proces koji dovodi do bolesti bubrega, kože, mozga i tromboze. Jedna karakteristika SLE je gubitak tolerancije B ćelija, a autoantitela su izražena kod pacijenata sa ovom bolešću. Kod lupusa bubrega, autoantitela na dvolančanu DNK mogu da formiraju komplekse antitelo nukleozom i da se talože u bazalnoj membrani glomerula bubrega. Ovi imunski kompleksi zauzvrat aktiviraju komplement, što može dovesti do glomerulonefritisa.

[0011] Kod pacijenata sa SLE nađena je povećana ekspresija CD40R, kao i CD40L. Povećan kostimulišući signal verovatno doprinosi patološkom inflamatornom odgovoru nađenom kod SLE. T ćelije SLE spontano povećavaju aktivaciju povezanu sa sniženim pragom aktivacije za sopstvene antigene. Nadalje, ove ćelije su hiporesponsivne na dalju antigensku stimulaciju, otporne su na apoptozu, imaju povećano preživljavanje nakon aktivacije i imaju mnoge izmenjene intracelularne signalne puteve. Nakon aktivacije CD40R na APC od strane CD40L T ćelija, aktiviraju se APC i T ćelije, proizvode citokine i kod SLE doprinose proizvodnji patogenih autoantitela i povredi tkiva (lupusni nefritis). Delotvorna je blokada CD40R/CD40L puta, sama ili u kombinaciji, kod blokiranja bolesti miševa sklonih lupusu. Kod pacijenata sa SLE, humanizovano anti-CD40L antitelo je redukovalo anti-dsDNK i B ćelije, proteinuriju, i poboljšalo je ozbiljnost bolesti SLE.

[0012] Law et al., Therapeutic Targets of the TNF superfamily, Landes Bioscience and Springer Science Business Media (2009), vol.647, str.8-36 opisuju terapeutske intervencije koje ciljaju CD40L (CD154) i CD40.

[0013] Međutim, ciljanje CD40L tradicionalnim antitelima je izazvalo značajne bezbednosne nedoumice. Na primer, studija sa anti-CD40L antitelom 5c8 (BIOGEN®) kod pacijenata koji imaju hroničnu refraktornu idiopatsku trombocitopenijsku purpuru (ITP) odložena je zbog prijavljenih tromboembolijskih komplikacija (Davidson et al. Arth Rheu, 43:S271). Nadalje, dodatna ispitivanja sa alternativnim antitelima usmerenim na CD40L izazvala su druge komplikacije povezane sa trombozom (Davis et al. Arth Rheu, 43:S281; Schuler, Transplantation, 77:717). S obzirom na komplikacije sa antagonizmom CD40L usmerenim na antitelo, postoji neispunjena potreba za ciljanje i antagonizam CD40L alternativnim agensom koji nije antitelo. Tako, ciljanje CD40Lpomoću konstrukcije na bazi Tn3 predstavlja privlačnu alternativu uz izbegavanje Fab2 i/ili Fc-posredovane agregacije trombocita i nishodnih neželjenih dejstava.

[0014] Citiranje ili rasprava o ovim referencama neće se tumačiti kao priznanje da je to prethodno stanje tehnike u ovom pronalasku.

SAŽETAK PRONALASKA

[0015] Pronalazak obezbeđuje Tn3 konstrukciju koja obuhvata CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačenu time što monomerna podjedinica sadrži sedam beta lanaca označenih kao A, B, C, D, E, F i G, i šest regiona petlje označenih kao AB, BC, CD, DE, EF i FG, i naznačeno time što se Tn3 konstrukcija specifično vezuje za CD40L. U nekim aspektima, Tn3 konstrukcija sadrži jednu CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži dve CD40L-specifične monomerne podjedinice povezane u tandem. U nekim specifičnim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži dve CD40L-specifične monomerne podjedinice koje su direktno povezane.

[0016] U nekim otelotvorenjima, CD40L-specifične monomerne podjedinice su povezane putem linkera. U drugim otelotvorenjima, linker sadrži peptidni linker, koji može biti fleksibilni peptidni linker. U nekim otelotvorenjima, peptidni linker sadrži sekvencu (GmX)n, naznačenu time što je X serin (S), alanin (A), glicin (G), Leu (L), izoleucin (I), ili valin (V); m i n su celi brojevi; m je 1, 2, 3 ili 4; a n je 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7. U nekim otelotvorenjima, peptidni linker sadrži SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 142, ili SEQ ID NO: 143.

[0017] U nekim otelotvorenjima, vezivanje Tn3 konstrukcije koja sadrži dve CD40L-specifične monomerne podjedinice za CD40L je poboljšano u odnosu na Tn3 konstrukciju koja sadrži jednu CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu. U drugim otelotvorenjima, vezivanje Tn3 konstrukcije koja sadrži dve CD40L-specifične monomerne podjedinice za CD40L poboljšava dejstvo na cilj u odnosu na Tn3 konstrukciju koja sadrži jednu CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu. U drugim otelotvorenjima, poboljšanje vezivanja Tn3 konstrukcije za CD40L predstavlja poboljšanje afiniteta vezivanja, poboljšanje aviditeta vezivanja, ili oba. U nekim otelotvorenjima, afinitet vezivanja Tn3 konstrukcije koja sadrži dve CD40L-specifične monomerne podjedinice za CD40L i stabilnost proteina Tn3 konstrukcije su poboljšani u odnosu na Tn3 konstrukciju koja sadrži jednu CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu. U nekim otelotvorenjima, aviditet vezivanja Tn3 konstrukcije koja sadrži dve CD40L-specifične monomerne podjedinice za CD40L i stabilnost proteina Tn3 konstrukcije su poboljšani u odnosu na Tn3 konstrukciju koja sadrži jednu CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu.

[0018] U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna CD40L-specifična monomerna podjedinica u Tn3 konstrukciji je vezana za linker, ili za heterologni ostatak. U drugim otelotvorenjima, linker ili heterologni ostatak u Tn3 konstrukciji je konjugovan sa N-terminusom ili C-terminusom CD40L-specifične monomerne podjedinice. U nekim otelotvorenjima, linker vezan za CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu u Tn3 konstrukciji sadrži peptidni linker, koji u nekim otelotvorenjima može biti fleksibilni peptidni linker. Ovaj peptidni linker u nekim otelotvorenjima može da sadrži sekvencu (GmX)n, naznačenu time što je X serin (S), alanin (A), glicin (G), leucin (L), izoleucin (I), ili valin (V); m i n su celi brojevi; m je 1, 2, 3 ili 4; a n je 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7. U nekim otelotvorenjima, peptidni linker vezan za CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu u Tn3 konstrukciji sadrži SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 142 ili SEQ ID NO: 143.

[0019] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži linker koji sadrži funkcionalni ostatak. U nekim otelotvorenjima, ovaj funkcionalni ostatak je imunoglobulin ili njegov fragment. U nekim otelotvorenjima, ovaj imunoglobulin ili njegov fragment sadrži Fc domen. U nekim otelotvorenjima, ovaj Fc domen ne uspeva da indukuje najmanje jednu FcyR-posredovanu efektorsku funkciju. U nekim otelotvorenjima, ova najmanje jedna FcyR-posredovana efektorska funkcija je ADCC.

[0020] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži najmanje jednu CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu vezanu za heterologni ostatak. U nekim otelotvorenjima, ovaj heterologni ostatak sadrži jedinjenje odabrano iz grupe koja se sastoji od: proteina, peptida, proteinskog domena, linkera, leka, toksina, citotoksičnog agensa, agensa za snimanje, radioizotopa, radioaktivnog jedinjenja, organskog polimera, neorganskog polimera, polietilen glikola (PEG), biotina, albumina, albumina iz humanog seruma (HSA), HSA FcRn vezujućeg dela, antitela, domena antitela, fragmenta antitela, jednolančanog antitela, domena antitela, albumin vezujućeg domena, enzima, liganda, receptora, vezujućeg peptida, konstrukcije koja nije FnIII, oznake epitopa, rekombinantnog polipeptidnog polimera, citokina, i kombinacije dva ili više pomenutih ostataka.

[0021] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži najmanje jednu CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu konjugovanu sa PEG. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži najmanje jednu CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu konjugovanu sa albuminom. U nekim otelotvorenjima, ovaj albumin je albumin iz humanog seruma (HSA). U drugim otelotvorenjima, ovaj HSA je varijantni HSA. U nekim specifičnim otelotvorenjima, aminokiselinska sekvenca varijantnog HSA je SEQ ID NO: 133. U drugim otelotvorenjima, varijantni HSA ima najmanje jedno poboljšano svojstvo u poređenju sa nativnim HSA ili fragmentom nativnog HSA. U nekim otelotvorenjima, poboljšano svojstvo je izmenjen poluživot u plazmi u poređenju sa poluživotom u plazmi nativnog HSA ili fragmenta nativnog HSA. U nekim otelotvorenjima, izmenjen poluživot u plazmi je duži poluživot u plazmi u poređenju sa poluživotom u plazmi nativnog HSA ili fragmenta nativnog HSA. U drugim otelotvorenjima, izmenjen poluživot u plazmi je kraći poluživot u plazmi u poređenju sa poluživotom u plazmi nativnog HSA ili fragmenta nativnog HSA.

[0022] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija je fuzionisana sa varijantom HSA koja sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u HSA domenu III. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija je fuzionisana sa varijantom HSA koja sadrži sekvencu zrelog HSA pune dužine (SEQ ID NO: 133 ili 138) ili njegov fragment, osim najmanje jedne aminokiselinske supstitucije, numerisane u odnosu na poziciju u zrelom HSA pune dužine, na poziciji odabranoj iz grupe koja se sastoji od 407, 415, 463, 500, 506, 508, 509, 511, 512, 515, 516, 521, 523, 524, 526, 535, 550, 557, 573, 574 i 580; naznačeno time što najmanje jedna aminokiselinska supstitucija ne uključuje lizin (K) u glutaminsku kiselinu (E) na poziciji 573, i naznačeno time što Tn3 konstrukcija ima poluživot u plazmi duži od poluživota u plazmi Tn3 konstrukcije koja nije konjugovana sa takvom varijantom HSA.

[0023] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija je fuzionisana sa varijantom HSA naznačenom time što je najmanje jedna aminokiselinska supstitucija numerisana u odnosu na poziciju u zrelom HSA pune dužine, na poziciji odabranoj iz grupe koja se sastoji od 463, 508, 523 i 524, naznačeno time što pomenuta Tn3 konstrukcija ima poluživot u plazmi duži od poluživota u plazmi Tn3 konstrukcije koja nije konjugovana sa pomenutom varijantom HSA. U nekim otelotvorenjima, varijanta HSA sadrži sekvencu zrelog HSA pune dužine (SEQ ID NO: 133 ili 138) ili njegovog fragmenta, osim najmanje jedne aminokiselinske supstitucije, numerisane u odnosu na poziciju u zrelom HSA pune dužine, odabrane iz grupe koja se sastoji od: (a) supstitucije leucina (L) na poziciji 407 asparaginom (N) ili tirozinom (Y); (b) supstitucije valina (V) na poziciji 415 treoninom (T); (c) supstitucije leucina (L) na poziciji 463 asparaginom (N); (d) supstitucije lizina (K) na poziciji 500 argininom (R); (e) supstitucije treonina (T) na poziciji 506 tirozinom (Y); (f) supstitucije treonina (T) na poziciji 508 argininom (R); (g) supstitucije fenilalanina (F) na poziciji 509 metioninom (M) ili triptofanom (W); (h) supstitucije alanina (A) na poziciji 511 fenilalaninom (F); (i) supstitucije asparaginske kiseline (D) na poziciji 512 tirozinom (Y); (j) supstitucije treonina (T) na poziciji 515 glutaminom (Q); (k) supstitucije leucina (L) na poziciji 516 treoninom (T) ili triptofanom (W); (1) supstitucije arginina (R) na poziciji 521 triptofanom (W); (m) supstitucije izoleucina (I) na poziciji 523 asparaginskom kiselinom (D), glutaminskom kiselinom (E), glicinom (G), lizinom (K), ili argininom (R); (n) supstitucije lizina (K) na poziciji 524 leucinom (L); (o) supstitucije glutamina (Q) na poziciji 526 metioninom (M); (p) supstitucije histidina (H) na poziciji 535 prolinom (P); (q) supstitucije asparaginske kiseline (D) na poziciji 550 glutaminskom kiselinom (E); (r) supstitucije lizina (K) na poziciji 557 glicinom (G); (s) supstitucije lizina (K) na poziciji 573 fenilalaninom (F), histidinom (H), prolinom (P), triptofanom (W), ili tirozinom (Y); (t) supstitucije lizina (K) na poziciji 574 asparaginom (N); (u) supstitucije glutamina (Q) na poziciji 580 lizinom (K); i, (v) kombinacije dve ili više pomenutih supstitucija, naznačeno time što pomenuta Tn3 konstrukcija ima poluživot u plazmi duži od poluživota u plazmi Tn3 konstrukcije koja nije konjugovana sa pomenutom varijantom HSA.

[0024] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija je fuzionisana sa varijantom HSA koja sadrži sekvencu zrelog HSA pune dužine (SEQ ID NO: 133 ili 138) ili njegovog fragmenta, osim najmanje jedne aminokiselinske supstitucije, numerisane u odnosu na poziciju u zrelom HSA pune dužine, odabrane iz grupe koja se sastoji od: (a) supstitucije leucina (L) na poziciji 463 asparaginom (N); (b) supstitucije treonina (T) na poziciji 508 argininom (R); (c) supstitucije izoleucina (I) na poziciji 523 asparaginskom kiselinom (D), glutaminskom kiselinom (E), glicinom (G), lizinom (K), ili argininom (R); (d) supstitucije lizina (K) na poziciji 524 leucinom (L); i, (e) kombinacije dve ili više pomenutih supstitucija, naznačeno time što pomenuta Tn3 konstrukcija ima poluživot u plazmi duži od poluživota u plazmi Tn3 konstrukcije koja nije konjugovana sa pomenutom varijantom HSA.

[0025] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži najmanje dve iste CD40L-specifične monomerne podjedinice. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži najmanje dve različite CD40L-specifične monomerne podjedinice. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija je agonist CD40 receptora. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija je antagonist CD40 receptora.

[0026] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži najmanje dve CD40L-specifične monomerne podjedinice koje se specifično vezuju za isti epitop CD40L. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži najmanje dve različite CD40L-specifične monomerne podjedinice koje se specifično vezuju za različite epitope CD40L. U nekim otelotvorenjima, ovi različiti epitopi CD40L su nepreklapajući epitopi. U drugim otelotvorenjima, ovi različiti epitopi CD40L su preklapajući epitopi.

[0027] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija se vezuje za najmanje dva molekula CD40L. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu koja se vezuje za najmanje dva molekula CD40L.

[0028] U nekim otelotvorenjima, beta lanci najmanje jedne CD40L-specifične monomerne podjedinice Tn3 konstrukcije imaju najmanje 90% identičnost sekvence sa beta lancima SEQ ID NO: 3. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu koja sadrži A beta lanac koji sadrži SEQ ID NO: 11, ili koja sadrži A beta lanac koji sadrži SEQ ID NO: 11, osim najmanje jedne mutacije. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu koja sadrži B beta lanac koji sadrži SEQ ID NO: 12, ili koja sadrži B beta lanac koja sadrži SEQ ID NO: 12, osim najmanje jedne mutacije. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu koja sadrži C beta lanac koji sadrži SEQ ID NO: 13 ili 14, ili koja sadrži C beta lanac koji sadrži SEQ ID NO: 13 ili 14 osim najmanje jedne mutacije, i naznačeno time što cistein u SEQ ID NO: 13 ili 14 nije supstituisan. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu koja sadrži D beta lanac koji sadrži SEQ ID NO: 15, ili koja sadrži D beta lanac koji sadrži SEQ ID NO: 15, osim najmanje jedne mutacije.

[0029] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu koja sadrži E beta lanac koji sadrži SEQ ID NO: 16, ili koja sadrži E beta lanac koji sadrži SEQ ID NO: 16, osim najmanje jedne mutacije. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu koja sadrži F beta lanac koji sadrži SEQ ID NO: 17, ili koja sadrži F beta lanac koji sadrži SEQ ID NO: 17 osim najmanje jedne mutacije, i naznačeno time što cistein u SEQ ID NO: 17 nije supstituisan. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu koja sadrži G beta lanac koji sadrži SEQ ID NO: 18, ili koja sadrži G beta lanac koji sadrži SEQ ID NO: 18, osim najmanje jedne mutacije.

[0030] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu:

naznačeno time što: XAB, XBC, XCD, XDE, XEFi XFGpredstavljaju aminokiselinske ostatke prisutne u sekvencama AB, BC, CD, DE, EF, odnosno FG petlji; X1predstavlja aminokiselinski ostatak A ili T; i, dužina petlje n je ceo broj od 2 do 26.

1

[0031] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 4, ili SEQ ID NO: 136, sekvenca CD petlje sadrži SEQ ID NO: 6, i sekvenca EF petlje sadrži SEQ ID NO: 8, ili SEQ ID NO: 137. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačenu time što sekvenca BC petlje sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 i 168. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačenu time što sekvenca DE petlje sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 94, 95, 96, 97, 98 i 169. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačenu time što sekvenca FG petlje sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 9, 99, 139 i 170.

[0032] U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačenu time što sekvenca BC petlje sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 i 174. U određenim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačenu time što sekvenca DE petlje sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 i 175. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačenu time što sekvenca FG petlje sadrži sekvencu odabranu iz grupa koja se sastoji od SEQ ID NO: 129, 130 i 177. U određenim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačenu time što sekvenca AB petlje sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4 i 136.

[0033] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 83, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 94, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 83, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 94, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 99. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 84, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 95, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139.

[0034] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 85, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 94, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 86, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 96, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 87, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 97, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139.

[0035] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 88, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 95, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 89, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 94, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 90, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 94, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139.

[0036] U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 91, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 95, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 92, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 98, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 93, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 94, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139.

[0037] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 100, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 118, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 101, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 119, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 102, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 120, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 103, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 121, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136.

[0038] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 104, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 122, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 105, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 121, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 106, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 123, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136.

[0039] U određenim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 107, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 123, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 108, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 118, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 109, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 123, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U nekim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 110, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 121, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136.

1

[0040] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 111, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 123, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 130. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 108, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 121, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 112, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 124, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 113, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 125, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136.

[0041] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 114, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 118, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 115, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 126, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 116, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 127, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 117, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 128, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136.

[0042] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu koja sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 i 146. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu: naznačeno time što: (a) X1predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S) ili leucin (L); (b) X2predstavlja aminokiselinski ostatak asparaginsku kiselinu (D) ili glutaminsku kiselinu (E); (c) X3predstavlja aminokiselinski ostatak histidin (H), izoleucin (I), valin (V), fenilalanin (F) ili triptofan (W); (d) X4predstavlja aminokiselinski ostatak alanin (A), glicin (G), glutaminsku kiselinu (E) ili asparaginsku kiselinu (D); (e) X5predstavlja aminokiselinski ostatak glutaminsku kiselinu (E), leucin (L), glutamin (Q), serin (S), asparaginsku kiselinu (D) ili asparagin (N); (f) X6predstavlja aminokiselinski ostatak fenilalanin (F) ili tirozin (Y); (g) X7predstavlja aminokiselinski ostatak izoleucin (I), valin (V), histidin (H), glutaminsku kiselinu (E) ili asparaginsku kiselinu (D); (h) X8predstavlja aminokiselinski ostatak glicin (G), triptofan (W) ili valin (V); (i) X9predstavlja aminokiselinski ostatak triptofan (W), fenilalanin (F) ili tirozin (Y); (j) X10predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S), glutamin (Q), metionin (M) ili histidin (H); (k) X11predstavlja aminokiselinski ostatak triptofan (W) ili histidin (H); i, (1) X12predstavlja aminokiselinski ostatak arginin (R) ili serin (S).

[0043] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu koja sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 i 82.

[0044] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu:

naznačeno time što:

(a) X1predstavlja aminokiselinski ostatak lizin (K) ili glutaminsku kiselinu (E);

(b) X2predstavlja aminokiselinski ostatak treonin (T) ili izoleucin (I);

(c) X3predstavlja aminokiselinski ostatak asparagin (N) ili alanin (A);

(d) X4predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S), leucin (L), alanin (A), fenilalanin (F) ili tirozin (Y);

(e) X5predstavlja aminokiselinski ostatak tirozin (Y), alanin (A), glicin (G), valin (V), izoleucin (I) ili serin (S);

(f) X6predstavlja aminokiselinski ostatak tirozin (Y), serin (S), alanin (A) ili histidin (H);

1

(g) X7predstavlja aminokiselinski ostatak asparagin (N), asparaginsku kiselinu (D), histidin (H) ili tirozin (Y);

(h) X8predstavlja aminokiselinski ostatak leucin (L), fenilalanin (F), histidin (H) ili tirozin (Y); (i) X9predstavlja aminokiselinski ostatak histidin (H), prolin (P), serin (S), leucin (L) ili asparaginsku kiselinu (D);

(j) X10predstavlja aminokiselinski ostatak glicin (G), fenilalanin (F), histidin (H) ili tirozin (Y); (k) X11predstavlja aminokiselinski ostatak alanin (A) ili treonin (T);

(l) X12predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S), asparagin (N), glutaminsku kiselinu (E), asparagin (R) ili asparaginsku kiselinu (D);

(m) X13predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S), glutamin (Q), treonin (T), asparagin (N) ili alanin (A);

(n) X14predstavlja aminokiselinski ostatak prolin (P), valin (V), izoleucin (I) ili alanin (A) ili nema aminokiseline;

(o) X15predstavlja aminokiselinski ostatak izoleucin (I) ili nema aminokiseline;

(p) X16predstavlja aminokiselinski ostatak glutaminsku kiselinu (E) ili lizin (K); i,

(q) X17predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S) ili asparagin (N).

[0045] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 134, 135, 205, 206, 207 i 208. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 134, 135, 205, 206, 207 i 208.

[0046] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, 202, 203 i 204. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, 202, 203 i 204. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu naznačenu time što je pomenuta CD40L-specifičnost usmerena na humani CD40L. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što je pomenuta CD40L-specifičnost usmerena na membranski vezani CD40L (SEQ ID NO: 1), rastvorni CD40L (SEQ ID NO: 2), ili njegov fragment. U nekim specifičnim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija vezuje CD40L i sprečava vezivanje CD40L za CD40.

1

[0047] Pronalazak takođe obezbeđuje metodu za izmenu aktivnosti u ćeliji koja eksprimira CD40L, koja obuhvata dovođenje ćelije u kontakt sa Tn3 konstrukcijom, naznačeno time što Tn3 konstrukcija vezuje CD40L i sprečava vezivanje CD40L za CD40. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija se vezuje za CD40L sa afinitetom (Kd) od oko 1 µM ili manje, ili oko 500 nM ili manje, ili oko 100 nM ili manje, ili oko 50 nM ili manje, ili oko 25 nM ili manje, ili oko 10 nM ili manje, ili oko 5 nM ili manje, ili oko 2 nM ili manje.

[0048] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija obuhvata CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu koja se specifično vezuje za epitop CD40L koja sadrži aminokiseline na pozicijama 142 do 155, 200 do 230, ili 247 do 251 sekvence SEQ ID NO: 2. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija obuhvata CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu koja interaguje sa aminokiselinama CD40L: E142, Y146, M148, N151, L155, R200, R203 i E230. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija obuhvata CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu koja interaguje sa aminokiselinama CD40L: R203, 1204, V247, H249 i T251. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija obuhvata CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu koja interaguje sa aminokiselinama CD40L: E142, Y146, M148, N151, L155, koje se nalaze u prvom molekulu CD40L, i sa aminokiselinama CD40L: R200, R203 i E230, koje se nalaze u drugom molekulu CD40L. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija obuhvata CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu koja interaguje sa aminokiselinama CD40L: R203 i 1204, koje se nalaze u prvom molekulu CD40L, i sa aminokiselinama CD40L: V247, H249 i T251, koje se nalaze u drugom molekulu CD40L.

[0049] Pronalazak takođe obezbeđuje polipeptide koji sadrže jedan ili više CD40L-specifičnih Tn3 monomera, uključujući, bez ograničenja, ovde opisane fuzije albumina iz seruma.

[0050] Pronalazak takođe obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira CD40L-specifičnu Tn3 konstrukciju, ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira CD40L-specifičnu Tn3 konstrukciju, i ćeliju domaćina koja sadrži takav vektor. Pronalazak takođe obezbeđuje metodu za proizvodnju Tn3 konstrukcije koji obuhvata uzgajanje ćelije domaćina pod uslovima u kojima se eksprimira CD40L-specifična Tn3 konstrukcija koju kodira molekul nukleinske kiseline.

[0051] Otkriće takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži CD40L-specifičnu Tn3 konstrukciju i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. Otkriće takođe obezbeđuje metodu za

1

prevenciju, lečenje, poboljšavanje autoimunske bolesti ili upravljanje njome kod pacijenta kome je to potrebno, koja obuhvata davanje delotvorne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži CD40L-specifičnu Tn3 konstrukciju.

[0052] Otkriće takođe obezbeđuje metodu za smanjenje učestalosti ili količine kortikosteroida koja se daje pacijentu sa autoimunskom bolešću, koja obuhvata davanje pacijentu terapeutski delotvorne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži CD40L-specifičnu Tn3 konstrukciju.

[0053] Autoimunska bolest lečena primenom CD40L-specifične Tn3 konstrukcije može biti alopecija areata, ankilozirajući spondilitis, antifosfolipidni sindrom, autoimunska Adisonova bolest, autoimunske bolesti nadbubrežne žlezde, autoimunska hemolitička anemija, autoimunski hepatitis, autoimunski ooforitis i orhitis, Šegrenov sindrom, psorijaza, ateroskleroza, dijabetesna retinopatija i druge retinopatije, retrolentalna fibroplazija, starosna degeneracija makule, neovaskularni glaukom, hemangiomi, hiperplazije štitaste žlezde (uključujući Grejvsovu bolest), transplantacija rožnjače i drugog tkiva, i hronična inflamacija, sepsa, reumatoidni artritis, peritonitis, Kronova bolest, reperfuziona povreda, septikemija, endotoksični šok, cistična fibroza, endokarditis, psorijaza, artritis (npr. psorijatični artritis), anafilaktički šok, ishemija organa, reperfuziona povreda, povreda kičmene moždine i odbacivanje alografta, autoimunska trombocitopenija, Behčetova bolest, bulozni pemfigoid, kardiomiopatija, celijakijski dermatitis, sindrom hroničnog umora i imunske disfunkcije (CFIDS), hronična inflamatorna demijelinizujuća polineuropatija, Čurg-Štrausov sindrom, cikatrizirajući pemfigoid, CREST sindrom, bolest hladnog aglutinina, Kronova bolest, diskoidni lupus, esencijalna mešana krioglobulinemija, fibromijalgija-fibromiozitis, glomerulonefritis, Grejvsova bolest, Gijen-Bar, Hašimotov tireoiditis, idiopatska fibroza pluća, idiopatska trombocitopenija purpura (ITP), IgA neuropatija, juvenilni artritis, lihen planus, eritemski lupus, Menijerova bolest, mešovita bolest vezivnog tkiva, multipla skleroza, tip 1 ili imunološki posredovan dijabetes melitus, mijastenija gravis, pemfigus vulgaris, perniciozna anemija, poliarteritis nodoza, polihrondritis, poliglandularni sindromi, reumatska polimijalgija, polimiozitis i dermatomiozitis, primarna agamaglobulinemija, primarna bilijarna ciroza, psorijaza, psorijatični artritis, Rejnoov fenomen, Rajterov sindrom, reumatoidni artritis, sarkoidoza, skleroderma, Šegrenov sindrom, sindrom ukočenosti mišića, sistemski eritemski lupus, eritemski lupus, takajasu arteritis, temporalni arteritis/arteritis džinovskih ćelija, ulcerozni kolitis, uveitis, vaskulitisi kao što je dermatitis herpetiformis vaskulitis, vitiligo, i Vegenerova granulomatoza.

1

[0054] U nekim specifičnim otelotvorenjima, autoimunska bolest koja se leči primenom CD40L-specifične Tn3 konstrukcije je sistemski eritemski lupus (SEL).

[0055] Metode za lečenje CD40L-specifičnim Tn3 konstrukcijama dalje mogu da uključuju dodatnu terapiju, kao što je imunoterapija, biološka terapija, hemioterapija, zračna terapija, ili terapija lekovima - malim molekulima.

[0056] Otkriće takođe obezbeđuje proteinski kristal koji sadrži Tn3 konstrukciju koja se sastoji od SEQ ID NO: 20 u kompleksu sa rastvornim CD40L (SEQ ID NO: 2) naznačeno time što kristal ima kristalnu rešetku u ortorombičnoj prostornoj grupi P212121i dimenzije jedinične ćelije, a=85,69 Å, b=90,64 Å, c=95,56 Å, /- 0,1%. U nekim aspektima, asimetrična jedinica kristala sadrži trimer CD40L i tri molekula Tn3 konstrukcije. U drugim otelotvorenjima, kristali difraktuju rendgenske zrake za određivanje koordinata strukture do rezolucije čija je vrednost jednaka ili manja od 3,2 Å.

[0057] Otkriće takođe obezbeđuje proteinski kristal koji sadrži Tn3 konstrukciju koja se sastoji od SEQ ID NO: 68 u kompleksu sa rastvornim CD40L (SEQ ID NO: 2) naznačeno time što kristal ima kristalnu rešetku u kubnoj prostornoj grupi P213 i dimenzije jedinične ćelije, a=b=c=97,62 Å, /- 0,1%. U nekim aspektima, asimetrična jedinica kristala sadrži jedan molekul CD40L i jedan molekul Tn3 konstrukcije. U drugim aspektima, kristal difraktuje rendgenske zrake za određivanje koordinata strukture do rezolucije čija je vrednost jednaka ili manja od 2,7 Å.

[0058] Otkriće takođe obezbeđuje proteinski kristal koji sadrži Tn3 konstrukciju koja se sastoji od SEQ ID NO: 28 ili 146 u kompleksu sa rastvornim CD40L (SEQ ID NO: 2) naznačeno time što kristal ima kristalnu rešetku u prostornoj grupi P321 i dimenzije jedinične ćelije, a=95,53 Å, b=93,53 Å, c=66,69 Å, /- 0,1%. U nekim aspektima, asimetrična jedinica kristala sadrži jedan molekul CD40L i jedan molekul Tn3 konstrukcije. U drugim aspektima, kristal difraktuje rendgenske zrake za određivanje koordinata strukture do rezolucije čija je vrednost jednaka ili manja od 2,8 Å

[0059] Otkriće takođe obezbeđuje proteinski kristal koji sadrži dve različite Tn3 konstrukcije koje se sastoje od SEQ ID NO: 68 i SEQ ID NO: 28 ili 146 u kompleksu sa rastvornim CD40L

1

(SEQ ID NO: 2) naznačeno time što kristal ima kristalnu rešetku u kubnoj prostornoj grupi P21i dimenzije jedinične ćelije, a=80,32 Å, b=143,48 Å, c=111,27 Å, β=98,22 Å, /- 0,1%. U nekim otelotvorenjima, asimetrična jedinica kristala sadrži dva trimera CD40L i šest od svakog molekula Tn3 konstrukcije. U drugim aspektima, kristal difraktuje rendgenske zrake za određivanje koordinata strukture do rezolucije čija je vrednost jednaka ili manja od 1,9 Å.

[0060] U nekim aspektima, proteinski kristal se dobija korišćenjem difuzije pare iz sedeće kapi. Otkriće takođe obezbeđuje metodu za izradu proteinskog kristala, koja uključuje: (a) mešanje zapremine rastvora koji sadrži Tn3 konstrukciju koja sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu u kompleksu sa CD40L sa zapreminom rastvora iz rezervoara koja sadrži precipitant; i (b) inkubaciju smeše dobijene u koraku (a) u zatvorenoj posudi, pod uslovima pogodnim za kristalizaciju dok se ne formira kristal proteina. U nekim aspektima, metoda za proizvodnju proteinskog kristala uključuje korišćenje difuzije pare iz sedeće kapi.

[0061] U nekim aspektima, metoda za izradu proteinskog kristala se koristi za dobijanje kristala koji sadrži CD40L-specifične Tn3 monomerne podjedinice SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 68, ili SEQ ID NO: 146.

[0062] Otkriće takođe obezbeđuje medijum za čuvanje podataka koji se može mašinski očitati, koji sadrži materijal podataka za čuvanje kodiran sa uputstvom koje se može mašinski očitati, za: (a) transformisanje podataka u grafički trodimenzionalni prikaz strukture dela proteinskog kristala Tn3 konstrukcije koja sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu u kompleksu sa CD40L; i (b) izazivanje prikazivanja pomenutog grafičkog trodimenzionalnog prikaza. U nekim otelotvorenjima, takva Tn3 konstrukcija sadrži SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 68, ili SEQ ID NO: 146. U drugim aspektima, takav proteinski kristal je:

(a) proteinski kristal koji sadrži Tn3 konstrukciju koja se sastoji od SEQ ID NO: 20 u kompleksu sa rastvornim CD40L (SEQ ID NO: 2) naznačeno time što kristal ima kristalnu rešetku u ortorombičnoj prostornoj grupi P212121i dimenzije jedinične ćelije, a=85,69 Å, b=90,64 Å, c=95,56 Å, /- 0,1%;

(b) proteinski kristal koji sadrži Tn3 konstrukciju koja se sastoji od SEQ ID NO: 68 u kompleksu sa rastvornim CD40L (SEQ ID NO: 2) naznačeno time što kristal ima kristalnu rešetku u kubnoj prostornoj grupi P213 i dimenzije jedinične ćelije, a=b=c=97,62 Å, /- 0,1%; ili

2

(c) proteinski kristal koji sadrži Tn3 konstrukciju koja se sastoji od SEQ ID NO: 20 i Tn3 konstrukciju koja se sastoji od SEQ ID NO: 68, naznačeno time što su obe Tn3 konstrukcije u kompleksu sa rastvornim CD40L (SEQ ID NO: 2)

(d) proteinski kristal koji sadrži Tn3 konstrukciju koja se sastoji od SEQ ID NO: 28 ili 146 u kompleksu sa rastvornim CD40L (SEQ ID NO: 2) naznačeno time što kristal ima kristalnu rešetku u prostornoj grupi P321 i dimenzije jedinične ćelije, a=95,53 Å, b=93,53 Å, c=66,69 Å, /- 0,1%.

(e) proteinski kristal koji sadrži dve različite Tn3 konstrukcije koje se sastoje od SEQ ID NO: 68 i SEQ ID NO: 28 ili 146 u kompleksu sa rastvornim CD40L (SEQ ID NO: 2) naznačeno time što kristal ima kristalnu rešetku u kubnoj prostornoj grupi P21i dimenzije jedinične ćelije, a=80,32 Å, b=143,48 Å, c=111,27 Å, β=98,22 Å, /- 0,1%.

[0063] Tekući pronalazak se takođe odražava u sledećim stavkama.

1. Konstrukcija tenascina 3 (Tn3) koja sadrži dve CD40L-specifične monomerne podjedinice povezane u tandem,

naznačeno time što monomerna podjedinica sadrži sedam beta lanaca označenih sa A, B, C, D, E, F i G, i šest regiona petlje označenih sa AB, BC, CD, DE, EF i FG, i naznačeno time što se Tn3 konstrukcija specifično vezuje za CD40L,

naznačeno time što CD40L-specifična monomerna podjedinica sadrži aminokiselinsku sekvencu:

IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFT T naznačeno time što:

(a) XAB, XBC, XCD, XDE, XEFi XFGpredstavljaju aminokiselinske ostatke prisutne u sekvencama petlji AB, BC, CD, DE, EF, odnosno FG;

(b) X1predstavlja aminokiselinski ostatak A ili T; i,

(c) dužina petlje n je ceo broj od 2 do 26,

naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 86, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 96, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139.

2 Tn3 konstrukcija iz stavke 1, naznačena time što sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 4, ili SEQ ID NO: 136, sekvenca CD petlje sadrži SEQ ID NO: 6, i sekvenca EF petlje sadrži SEQ ID NO: 8, ili SEQ ID NO: 137.

3. Tn3 konstrukcija iz stavke 1 ili 2, naznačena time što CD40L-specifična monomerna podjedinica sadrži sekvencu SEQ ID NO: 28 ili 146.

4 Tn3 konstrukcija iz bilo koje od stavki 1-3, naznačena time što su dve CD40L-specifične monomerne podjedinice direktno povezane.

5. Tn3 konstrukcija iz bilo koje od stavki 1-4, naznačena time što su dve CD40L-specifične monomerne podjedinice povezane putem linkera.

6. Tn3 konstrukcija iz stavke 5, naznačena time što linker uključuje peptidni linker.

7 Tn3 konstrukcija iz stavke 5 ili 6, naznačena time što peptidni linker sadrži sekvencu (GmX)n, naznačenu time što:

(a) X je serin (S), alanin (A), glicin (G), Leu (L), izoleucin (I), ili valin (V);

(b) m i n su celi brojevi;

(c) m je 1, 2, 3 ili 4; i

(d) n je 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7.

8 Tn3 konstrukcija iz stavke 7, naznačena time što peptidni linker sadrži SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 142, ili SEQ ID NO: 143.

9 Tn3 konstrukcija iz bilo koje od stavki 1-8, naznačena time što je najmanje jedna CD40L-specifična monomerna podjedinica vezana za linker, ili za heterologni ostatak.

10. Tn3 konstrukcija iz stavke 9, naznačena time što je najmanje jedna CD40L-specifična monomerna podjedinica konjugovana sa PEG ili albuminom.

11. Tn3 konstrukcija iz stavke 10, naznačena time što, albumin je albumin iz humanog seruma (HSA).

12 Tn3 konstrukcija iz bilo koje od stavki 1-11, naznačena time što Tn3 konstrukcija sadrži sekvencu, ili se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 145.

13. Tn3 konstrukcija iz bilo koje od prethodnih stavki za primenu u metodi za izmenu CD40 posredovanog signalnog odgovora koji obuhvata dovođenje u kontakt ćelije koja eksprimira CD40L sa Tn3 konstrukcijom, naznačeno time što Tn3 konstrukcija vezuje CD40L i sprečava CD40 posredovanu signalizaciju.

14. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira Tn3 konstrukciju iz bilo koje od stavki 1-12.

15. Metoda za proizvodnju Tn3 konstrukcije koja obuhvata uzgajanje ćelije domaćina, pri čemu pomenuta ćelija domaćin sadrži ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline iz stavke 14, pod uslovima u kojima se eksprimira Tn3 konstrukcija koju kodira molekul nukleinske kiseline.

16. Kompozicija koja sadrži Tn3 konstrukciju iz bilo koje od stavki 1-12 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

17. Kompozicija iz stavke 16 za primenu u:

1) metodi za prevenciju, lečenje ili poboljšavanje autoimunske bolesti kod pacijenta kome je to potrebno; ili

2) metodi za smanjenje učestalosti ili količine kortikosteroida date pacijentu sa autoimunskom bolešću, opciono

naznačeno time što je autoimunska bolest odabrana iz grupe koja obuhvata alopeciju areata, ankilozirajući spondilitis, antifosfolipidni sindrom, autoimunsku Adisonovu bolest, autoimunske bolesti nadbubrežne žlezde, autoimunsku hemolitičku anemiju, autoimunski hepatitis, autoimunski ooforitis i orhitis, Šegrenov sindrom, psorijazu, aterosklerozu, dijabetesnu retinopatiju i druge retinopatije, retrolentalnu fibroplaziju, starosnu degeneraciju makule, neovaskularni glaukom, hemangiome, tireoidne hiperplazije (uključujući Grejvsovu bolest), transplantaciju rožnjače i drugog tkiva, i hroničnu inflamaciju, sepsu, reumatoidni artritis, peritonitis, Kronovu bolest, reperfuzionu povredu, septikemiju, endotoksični šok, cističnu fibrozu, endokarditis, psorijazu, artritis (npr. psorijatični artritis), anafilaktički šok, ishemiju organa, reperfuzionu povredu, povredu kičmene moždine i odbacivanje alografta, autoimunsku trombocitopeniju, Behčetovu bolest, bulozni pemfigoid, kardiomiopatiju, celijakijski dermatitis, sindrom hroničnog umora i imunske disfunkcije (CFIDS), hroničnu inflamatornu demijelinizujuću polineuropatiju, Čurg-Štrausov sindrom, cikatrizirajući pemfigoid, CREST sindrom, bolest hladnog aglutinina, Kronovu bolest, diskoidni lupus, esencijalnu mešanu krioglobulinemiju, fibromijalgiju-fibromiozitis, glomerulonefritis, Grejvsovu bolest, Gijen-Bar, Hašimotov tiroiditis, idiopatsku fibrozu pluća, idiopatsku trombocitopeniju purpura (ITP), IgA neuropatiju, juvenilni artritis, lihen planus, eritemski lupus, Menijerovu bolest, mešovitu bolest vezivnog tkiva, multiplu sklerozu, tip 1 ili imunološki posredovan dijabetes melitus, mijasteniju gravis, pemfigus vulgaris, pernicioznu anemiju, poliarteritis nodosa, polihrondritis, poliglandularne sindrome, reumatsku polimijalgiju, polimiozitis i dermatomiozitis, primarnu agamaglobulinemiju, primarnu bilijarnu cirozu, psorijazu, psorijatični artritis, Rejnoov fenomen, Rajterov sindrom, reumatoidni artritis, sarkoidozu, sklerodermu, Šegrenov sindrom, sindrom ukočenosti mišića, sistemski eritemski lupus, eritemski lupus, takajasu arteritis, temporalni arteritis/arteritis džinovskih ćelija, ulcerozni kolitis, uveitis, vaskulitide kao što je dermatitis herpetiformis vaskulitis, vitiligo, i Vegenerovu granulomatozu.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0064] U svrhu ilustrovanja pronalaska, ovde su na crtežima opisana neka otelotvorenja pronalaska.

2

SL. 1A prikazuje inhibiciju mišjim CD40L (MuCD40L) indukovane ekspresije CD86 određene pomoću testa D10G4.1/PBMC (mononuklearne ćelije periferne krvi). Ispitana je M13 mišja CD40L-specifična Tn3 konstrukcija, njena M31 varijanta sa optimizovanim afinitetom (poboljšanje afiniteta oko 20x), anti-CD40L MR1 monoklonsko antitelo i negativna kontrola. Takođe su prikazane vrednosti IC50.

SL. 1B prikazuje inhibiciju CD40L u testu sa mišjim NfkB. U testu se koriste NIHT3T ćelije koje eksprimiraju mišji CD40R i sadrže konstrukt reportera NfkB-luciferaze. Dodavanje CD40L dovodi do signalizacije (određene putem aktivnosti luciferaze) koju inhibira MR1 anti-CD40L antitelo, kao i M31 CD40L-specifična Tn3 konstrukcija.

SL. 2A prikazuje dizajn fuzionih konstrukata CD40L-specifičnog tandema dvovalentnih Tn3 konstrukcija i albumina iz seruma (SA).

SL. 2B prikazuje analizu SDS-PAGE prečišćenog jednovalentnog M13 konstrukta (CD40L-specifični Tn3 konstrukt), ili tandema dvovalentnih konstrukcija sa linkerima koji sadrže 1, 3, 5 ili 7 jedinica Gly4Ser (označenih kao GS) koji spajaju dve monomerne podjedinice M13 Tn3. Jednovalentni M13 konstrukt je propušten u traci 2, dimerni konstrukt sa 1 GS jedinicom (C1) je propušten u trakama 3 i 7, dimerni konstrukt sa 3 GS jedinice (C2) je propušten u trakama 4 i 8, dimerni konstrukt sa 5 GS jedinica (C3) je propušten u trakama 5 i 9, i dimerni konstrukt sa 7 GS jedinica (C4) je propušten u trakama 6 i 10. Uzorci su propušteni u neredukujućim uslovima (trake 2-6) ili redukujućim uslovima (trake 7-10).

SL. 2C prikazuje kompetitivnu inhibiciju mišjeg CD40L koji se vezuje za mišji receptor CD40L imobilisan na biosenzorskom čipu, od strane mišje CD40L-specifične jednovalentne (M13) ili dvovalentne tandem konstrukcije (M13-xGS-M13, naznačeno time što, x je 1, 3, 5 ili 7, što odgovara dvovalentnim konstrukcijama sa linkerima koji sadrže 1, 3, 5 ili 7 jedinica Gly4Ser). Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) za različite konstrukte je takođe navedena.

SL. 2D prikazuje inhibitorni efekat mišje CD40L-specifične Tn3 jednovalentne (M13) i dvovalentne tandem konstrukcije, na CD40L-indukovanu ekspresiju CD86 na B ćelijama. Vrednosti IC50su date za sve Tn3 konstrukte i za MR1 antimišje CD40L antitelo.

SL. 3A prikazuje visoke nivoe ekspresije mišje CD40L-specifične tandem dvovalentne Tn3 konstrukcije fuzionisane sa albuminom iz mišjeg seruma (MSA) u HEK 293 ćelijama. Ovi konstrukti imaju 1 (G4S) ponavljanje linkera između jedinica Tn3 konstrukcije i 3 (G4S) ponavljanja linkera između jedinica Tn3 konstrukcije i MSA. Pored toga, konstrukt sadrži N49Q mutaciju u svakoj M13 i M31 konstrukciji da bi se uklonilo potencijalno N-vezano mesto glikozilacije.10 µl supernatanta kulture uzeto 3 ili 6 dana nakon transfekcije propušteno je na SDS-PAGE gelu uz poznate količine prečišćenog proteina. Procenjeno je da nivo ekspresije iznosi 200 mg/l 6 dana posle transfekcije. Prečišćavanje je izvedeno putem IMAC preko C-terminalne His-oznake.

SL. 3B prikazuje inhibiciju mišjim CD40L (MuCD40L) indukovane ekspresije CD86 određene pomoću testa D10G4.1/PBMC ćelija. Ispitani su CD40L-specifična tandem dvovalentna Tn3 konstrukcija (M13-1GS-M13), isti konstrukt fuzionisan sa albuminom iz mišjeg seruma (MSA) (M13-1GS-M13-MSA), i MR1 antimišje CD40L monoklonsko antitelo. Date su IC50vrednosti za sve konstrukte.

SL. 3C prikazuje inhibiciju mišjim CD40L (MuCD40L) indukovane ekspresije CD86 određene pomoću testa D10G4.1/PBMC ćelija. Ispitani su CD40L-specifična tandem dvovalentna Tn3 konstrukcija (M13-1GS-M13) fuzionisana sa albuminom iz mišjeg seruma (MSA) (M13-1GS-M13-MSA), afinitetno zrela varijanta M13 konstrukcije konjugovane sa MSA (M31Mono-MSA), tandem dvovalentna konstrukcija koja sadrži M31 varijantu sa optimizovanim afinitetom konjugovanu sa MSA (M31-1GS-M31-MSA), negativna kontrola tandem dvovalentna konstrukcija koja ne vezuje mišji CD40L (D1-1GS-D1-MSA), i MR1 monoklonsko antitelo. Takođe su date vrednosti IC50.

SL 4A prikazuje farmakokinetiku nekoliko mišjih CD40L specifičnih konstrukata kod miša, određenu ELISA testom. Navedene su vrednosti poluživota u plazmi (t1/2) za svaki konstrukt. SL. 4B prikazuje farmakokinetiku humanih CD40L specifičnih varijanti 342-HSA i 342-HSA koje sadrže supstituciju Leu na poziciji 463 sa Asn (L463N) i supstituciju Lys na poziciji 524 sa Leu (K524L) kod majmuna cinomolgus, određenu ELISA testom.

SL. 5A prikazuje sazrevanje B ćelija u germinativnim centrima (GC) iz testa imunizacije ovčjim eritrocitima (SRBC). Testirano je MR1 monoklonsko antimišje antitelo CD40L.

SL. 5B prikazuje sazrevanje B ćelija u germinativnim centrima (GC) iz testa imunizacije ovčjim eritrocitima (SRBC). Testirani su jednovalentni i dvovalentni konstrukti izvedeni iz M31 fuzionisani sa MSA. D1-D1 dvovalentni konstrukt konjugovan sa MSA je korišćen kao negativna kontrola.

SL. 5C prikazuje sazrevanje B ćelija na periferiji (nonGC) iz testa imunizacije ovčjim eritrocitima (SRBC). Testirani su jednovalentni i dvovalentni konstrukti izvedeni iz M31 fuzionisani sa MSA. D1-D1 dvovalentni konstrukt konjugovan sa MSA je korišćen kao negativna kontrola.

SL. 5D prikazuje procenat (% CD4) i broj (br. CD4) CD4 pozitivnih ćelija iz testa imunizacije ovčjim eritrocitima (SRBC). Testirani su jednovalentni i dvovalentni konstrukti fuzionisani sa

2

MSA izvedeni iz M31 i MR1 anti-CD40L monoklonska antitela. D1-D1 dvovalentni konstrukt konjugovan sa MSA je korišćen kao negativna kontrola.

SL. 5E prikazuje procenat (% CD44hi) i broj (br. CD44hi) CD44hi pozitivnih ćelija iz testa imunizacije ovčjim eritrocitima (SRBC). Testirani su jednovalentni i dvovalentni konstrukti fuzionisani sa MSA izvedeni iz M31 i MR1 anti-CD40L monoklonska antitela. D1-D1 dvovalentni konstrukt konjugovan sa MSA je korišćen kao negativna kontrola

SL. 5F prikazuje količinu anti-SRBC IgG iz testa imunizacije ovčjim eritrocitima (SRBC). Testirani su jednovalentni i dvovalentni konstrukti izvedeni iz M31 fuzionisani sa MSA. D1-D1 dvovalentni konstrukt konjugovan sa MSA je korišćen kao negativna kontrola.

SL. 5G prikazuje anti-KLH IgM titar iz modela KLH-specifičnog odgovora antitela zavisnog od T ćelije (TDAR). Testirani su jednovalentni i dvovalentni konstrukti izvedeni iz 342 fuzionisani sa HSA.

SL. 5H prikazuje titre anti-KLH IgG iz modela KLH-specifičnog odgovora antitelima zavisnog od T ćelija (TDAR). Testirani su jednovalentni i dvovalentni konstrukti izvedeni iz 342 fuzionisani sa HSA.

SL. 6A prikazuje inhibitorski efekat humanih CD40L-specifičnih jednovalentnih Tn3 monomernih konstrukcija 309 i 311 na humanim CD40L-indukovanu ekspresiju CD86 na CD19-pozitivnim humanim PBMC stimulisanim Jurkatovim D1.1 ćelijama.

SL. 6B prikazuje inhibitorski efekat humanih CD40L-specifičnih jednovalentnih Tn3 monomernih konstrukcija 309 i 311 na proliferaciju humanih CD40L-stimulisanih B ćelija. Sl. 6C prikazuje inhibitorski efekat humanih CD40L-specifičnih jednovalentnih Tn3 monomernih konstrukcija 309 i 311 na broj plazmocita u kokulturi T/B ćelija. Takođe, pokazano je da Tn3 konstrukcija 309 vezuje aktivirane primarne T ćelije putem FACS (podaci nisu prikazani). D1 konstrukcija („Neg Tn3“) korišćena je kao kontrola. Dva monoklonska antitela na CD40L, označena kao aCD40L(RE) i aCD40L(Bio) (Biogen, 5c8 antihumano CD40L monoklonsko antitelo) takođe su korišćena kao kontrola.

SL. 7A prikazuje da humane CD40L-specifične jednovalentne Tn3 konstrukcije 309 i 311 imaju slične biofizičke karakteristike. Obe konstrukcije su monodisperzne, što je određeno pomoću SEC.

SL. 7B prikazuje da humane CD40L-specifične jednovalentne Tn3 konstrukcije 309 i 311 imaju slične biofizičke karakteristike. Obe konstrukcije imaju sličnu termostabilnost kao matična Tn3 konstrukcija (na dijagramu označena kao Tn3(divlji tip)), kao što je određeno diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC).

2

SL. 8A prikazuje inhibiciju humanim CD40L-indukovane ekspresije CD86 na CD19-pozitivnim humanim PBMC stimulisanim Jurkatovim D1.1 ćelijama. Testirane su jednovalentne (311) i dvovalentne (311_3GS i 311_7GS) humane CD40L-specifične Tn3 konstrukcije. Prikazane su vrednosti IC50za svaki konstrukt.

SL. 8B prikazuje inhibiciju humanim CD40L-indukovane ekspresije CD86 na CD19-pozitivnim humanim PBMC stimulisanim Jurkatovim D1.1 ćelijama. Testirane su jednovalentne (309) i dvovalentne (309_3GS i 309_7GS) humane CD40L-specifične Tn3 konstrukcije, kao i 5c8 antihumano CD40L monoklonsko antitelo kompanije Biogen. Prikazane su vrednosti IC50za svaki konstrukt i antitelo.

SL. 9A prikazuje dizajn reprezentativne humane CD40L-specifične tandem dvovalentne Tn3 konstrukcije fuzionisane sa albuminom iz humanog seruma (HSA). „GGGGG“ (SEQ ID NO: 148) i „GGGGA“ (SEQ ID NO: 149) su alternativni linkeri „GGGGS“ linkerima (SEQ ID NO: 147).

Sl. 9B prikazuje test prečišćavanja 293F ćelija na koloni IEX. Frakcija prevoja (<10% od glavnog pika) sadrži O-glikozilovani protein vezan za serinski ostatak prisutan u linkerima. SL. 9C prikazuje inhibiciju kod humanim CD40L-indukovane ekspresije CD86 na CD19-pozitivnim humanim PBMC stimulisanim Jurkatovim D1.1 ćelijama. Testirani su dvovalentna (309) humana CD40L-specifična Tn3 konstrukcija, ista konstrukcija fuzionisana sa HSA, i 5c8 antihumano CD40L monoklonsko antitelo kompanije Biogen.

SL. 9D prikazuje inhibiciju kod humanim CD40L-indukovane ekspresije CD86 na CD19-pozitivnim humanim PBMC stimulisanim Jurkatovim D1.1 ćelijama. Testirane su tri dvovalentne (309) humane CD40L-specifične Tn3 konstrukcije. Tri (G4S) ponavljanja su bila prisutna u linkeru između humanih CD40L-specifičnih podjedinica (309 u ovom primeru) dok je linker između podjedinica 309 i HSA variran od 1 do 3 (G4S) ponavljanja. Takođe je testirano 5c8 antihumano CD40L monoklonsko antitelo kompanije Biogen.

SL. 10A prikazuje efekat mutacije sekvenci petlje 309 (levi panel) i 311 (desni panel) na vezivanje CD40L. Vezivanje ukazuje na jačinu signala u testu vezivanja. WT je varijanta sa originalnom vodećom sekvencom (matična sekvenca Tn3), dok BC, DE i FG označava varijante u kojima je sekvenca petlje BC, DE ili FG promenjena u matičnu sekvencu Tn3 kao što je prisutna u humanom tenascinu C.

SL. 10B prikazuje profile inhibicije panela afinitetno optimizovanih konstrukcija, kao što je određeno pomoću humanim CD40L indukovanom ekspresijom CD86 na CD19 pozitivnim humanim PBMC stimulisanim Jurkatovim D1.1 ćelijama. Monomeri humanog CD40L-specifičnog Tn3 klona 309 su afinitetno optimizovani. Afinitetno optimizovani monomeri su

2

označeni kao klon 340 do 349. Konstrukt klona 309wtFG je imao celu FG petlju zamenjenu FG petljom matične Tn3 konstrukcije. Takođe je testirano 5c8 anti-CD40L monoklonsko antitelo.

SL. 10C prikazuje profile inhibicije određene pomoću humanim CD40L-indukovane ekspresije CD86 na CD19-pozitivnim humanim PBMC stimulisanim Jurkatovim D1.1 ćelijama. Prikazan je profil humanog CD40L-specifičnog Tn3 monomera 311, njegove varijante K4E i negativne kontrole.

SL. 10D prikazuje profile inhibicije određene pomoću humanim CD40L-indukovane ekspresije CD86 na CD19-pozitivnim humanim PBMC stimulisanim Jurkatovim D1.1 ćelijama. Prikazan je profil humanog CD40L-specifičnog Tn3 monomera 311K4E, afinitetno optimizovanog monomera 311K4E_12, i 5c8 anti-CD40L monoklonskog antitela. Takođe su prikazani IC50za dva konstrukta i antitelo.

SL. 11A i SL. 11B prikazuju višestruko poravnavanje sekvence matične CD40L-specifične Tn3 konstrukcije 309, varijante 309FGwt i afinitetno optimizovanih varijanti 340 do 349. Aminokiselinski ostaci 1 do 42 prikazani su na SL. 11A, a aminokiselinski ostaci 43 do 83 prikazani su na SL.11B. Varijante petlji su osenčene. Aminokiselinska sekvenca konsenzusa je predstavljena ispod višestrukog poravnavanja sekvence. Poravnate sekvence odgovaraju aminokiselinskim sekvencama Tn3 konstrukcije klonova 309 (SEQ ID NO: 20), 309FGwt (SEQ ID NO: 22), 340 (SEQ ID NO: 24), 341 (SEQ ID NO: 26), 342 (SEQ ID NO: 28), 343 (SEQ ID NO: 30), 344 (SEQ ID NO: 32), 345 (SEQ ID NO: 34), 346 (SEQ ID NO: 36), 347 (SEQ ID NO: 38), 348 (SEQ ID NO: 40), i 349 (SEQ ID NO: 42).

SL. 12A i SL. 12B prikazuju višestruko poravnavanje sekvence matične CD40L-specifične Tn3 konstrukcije 311, varijante 311K4E i afinitetno optimizovanih varijanti 311K4E_1 do 311K4E_21. Aminokiselinski ostaci 1 do 44 prikazani su na SL.12A, a aminokiselinski ostaci 45 do 87 prikazani su na SL.12B. Varijante petlji su osenčene. Varijacije aminokiselina izvan osenčenih petlji su uokvirene. Sekvenca konsenzusa je predstavljena ispod višestrukog poravnavanja sekvence. Poravnate sekvence odgovaraju aminokiselinskim sekvencama Tn3 konstrukcije klonova 311 (SEQ ID NO: 44), 311K4E (SEQ ID NO: 46), 311K4E_1 (SEQ ID NO: 48), 311K4E_2 (SEQ ID NO: 50), 311K4E_2 (SEQ ID NO: 52), 311K4E_3 (SEQ ID NO: 54), 311K4E_4 (SEQ ID NO: 56), 311K4E_5 (SEQ ID NO: 58), 311K4E_7 (SEQ ID NO: 60), 311K4E_8 (SEQ ID NO: 62), 311K4E_9 (SEQ ID NO: 64), 311K4E_10 (SEQ ID NO: 66), 311K4E_11 (SEQ ID NO: 68), 311K4E_12 (SEQ ID NO: 70), 311K4E_13 (SEQ ID NO: 72), 311K4E_14 (SEQ ID NO: 74), 311K4E_15 (SEQ ID NO: 76), 311K4E_16 (SEQ ID NO: 78), 311K4E_19 (SEQ ID NO: 80), 311K4E_20 (SEQ ID NO: 82), i 311K4E_21 (SEQ ID NO: 84).

2

SL. 13 prikazuje test inhibicije humanog NfkB u kome se koriste HEK293 ćelije koje eksprimiraju humani CD40 receptor i sadrže konstrukt reportera NfkB-luciferaze. Dodatak humanog CD40L dovodi do signalizacije (određena preko aktivnosti luciferaze) koju mogu da inhibiraju vezujući molekuli CD40L. Testirane su CD40L-specifične Tn3 konstrukcije 340 i 342, kao i 5c8 i anti-CD40L monoklonsko antitelo.

SL. 14 prikazuje vezivanje humanih CD40L-specifičnih Tn3 konstrukcija za humane CD4+ T ćelije aktivirane 24 h sa anti-CD3/28. Testirana je jednovalentna konstrukcija 342 fuzionisana sa HSA (označena sa 342-HSA) i dvovalentna konstrukcija 342 fuzionisana sa HSA (označena kao 342-342-HSA).

SL. 15 prikazuje inhibiciju proliferacije primarne humane T/B ćelije 3. dana. Testirana je jednovalentna konstrukcija 340 fuzionisana sa HSA (označena sa 340-HSA), jednovalentna konstrukcija 342 fuzionisana sa HSA (342-HSA) i dvovalentna konstrukcija 342 fuzionisana sa HSA (označena sa 342-342-HSA). Prikazane su vrednosti IC50za svaki konstrukt.

SL. 16A prikazuje test agregacije na ispranim trombocitima. Dijagram prikazuje reprezentativnu pozitivnu kontrolu ADP-indukovane agregacije za davaoca (gornje tri trake redom) ADP: 0,5 µM, 1 µM i 2 µM) zajedno sa imunskim kompleksom (IC) monoklonskog antitela 5c8 (600 nM) i rastvornog humanog CD40L (200 nM).

SL. 16B prikazuje test agregacije na ispranim trombocitima. Dijagram prikazuje nedostatak agregacije kada se koriste prethodno formirani imunokompleksi 309-309 dvovalentnih konstrukcija (nisu fuzionisani sa HSA) i rastvornog humanog CD40L. Koncentracija humanog CD40L (rastvorni oblik) održavana je konstantnom na 600 nM a koncentracija konstrukata konstrukcije je menjana od 200 nM do 800 nM.

SL. 16C prikazuje test agregacije na ispranim trombocitima. Dijagram prikazuje nedostatak agregacije kada se koriste prethodno formirani imunokompleksi 342 dvovalentnih konstrukcija fuzionisanih sa HSA i rastvornog humanog CD40L. Koncentracija humanog CD40L (rastvorni oblik) održavana je konstantnom na 600 nM a koncentracija konstrukata konstrukcije je menjana od 100 nM do 400 nM. Dijagram takođe prikazuje brzu agregaciju indukovanu imunskim kompleksom monoklonskog antitela 5c8 i rastvornog humanog CD40L.

SL. 17A daje trakasti prikaz kristalne strukture rastvornog CD40L u kompleksu sa konstrukcijom CD40L-specifičnog Tn3 309 monomera. CD40L gradi trimer (polipeptidi A, B i C). Svaka konstrukcija 309 (polipeptidi D, E i F, zaokruženi) uspostavlja kontakt sa dva CD40L polipeptida. Navedeni su specifični kontakti između svake konstrukcije 309 i prvog i drugog CD40L polipeptida. Ovo je pogled na strukturu „odozgo naniže“.

2

SL. 17B daje trakasti prikaz kristalne strukture rastvornog CD40L u kompleksu sa konstrukcijom CD40L-specifičnog Tn3 monomera 311K4E_12. CD40L gradi trimer (polipeptidi A, B i C). Svaka konstrukcija monomera 311K4E_12 (polipeptidi D, E i F, zaokruženi) uspostavlja kontakt sa dva CD40L polipeptida. Navedeni su specifični kontakti između svake konstrukcije monomera 311K4E_12 i prvog i drugog CD40L polipeptida. Ovo je pogled na strukturu „odozgo naniže“.

SL. 17C daje trakasti prikaz koji ilustruje da se konstrukcije 311K4E_12 i 309 (zaokružene) vezuju za različte epitope koji se nalaze u različitim delovima kompleksa CD40L trimera. Obe konstrukcije se vezuju za isto udubljenje koje bi interagovalo sa CD40 receptorom. Ovo je „bočni“ pogled na strukturu.

SL. 17D daje trakasti prikaz kristalne strukture rastvornog CD40L u kompleksu sa konstrukcijom CD40L-specifičnog Tn3 monomera 342. Prikazana je samo jedna konstrukcija CD40L i jedna 342 monomera. Navedeni su specifični kontakti između konstrukcije monomera 342 i prvog CD40L polipeptida.

SL. 17E daje trakasti prikaz koji ilustruje da konstrukcije 342 i 311K4E_12 mogu istovremeno da se vežu za različite epitope koji se nalaze u različitim delovima kompleksa CD40L trimera. Obe konstrukcije se vezuju za isto udubljenje koje bi interagovalo sa CD40 receptorom. Ovo je „bočni“ pogled na strukturu.

SL. 18A prikazuje mesto kontakta između aminokiselina u konstrukciji CD40L-specifičnog Tn3 311K4E_12 monomera (SEQ ID NO: 68) i trimera koji formiraju rastvorni CD40L (SEQ ID NO: 2) molekuli, kao što prikazuje SL.17A. Svaka konstrukcija uspostavlja kontakt sa 2 molekula CD40L. Sekvenca CD40L (SEQ ID NO: 2) je prikazana. Tačkasta linija = domen citoplazme; puna linija = signalni membranski ankerski protein tipa II; dvostruka puna linija = deo kokristalisan sa Tn3 konstrukcijom; tamno osenčeno = ostaci na 1. CD40L u kontaktu sa Tn3; svetlo osenčeno = ostaci na 2. CD40L u kontaktu sa Tn3.

SL. 18B prikazuje mesto kontakta između aminokiselina u konstrukciji CD40L-specifičnog Tn3 monomera 309 i CD40L trimera, kako je prikazano na SL. 17B. Svaka konstrukcija uspostavlja kontakt sa 2 molekula CD40L. Sekvenca CD40L (SEQ ID NO: 2) je prikazana. Tačkasta linija = domen citoplazme; puna linija = signalni membranski ankerski protein tipa II; dvostruka puna linija = deo kokristalisan sa Tn3 konstrukcijom; tamno osenčeno = ostaci na 1. CD40L koji je u kontaktu sa Tn3; svetlo osenčeno = ostaci na 2. CD40L koji je u kontaktu sa Tn3; dvostruko uokvireni ostatak predstavlja kontakt sa FG petljom konstrukcije 309, koja verovatno nije konzervirana u klonovima koji imaju FG petlju divljeg tipa.

SL. 19. Panel A prikazuje primer hromatograma elucije Tn3 konstrukcije (309 ili 311K4E_12), CD40L i njihovog kompleksa sa kolone za gel hromatografiju Superdex 20010/300 GL. Panel B prikazuje kristale kompleksa 309-CD40L. Prikazani kristal je rastao do dimenzija 0,15 × 0,15 × 0,1 mm. Panel C prikazuje kristale kompleksa 311K4E_12-CD40L.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Definicije

[0065] Treba napomenuti da, kao što se koriste u ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici za jedninu uključuju množinu, ako kontekst izričito ne nalaže drugačije. Termini „jedan“ (ili „jedna“), kao i „jedan ili više“ i „najmanje jedan“ ovde mogu naizmenično da se koriste.

[0066] Nadalje, „i/ili“, kada se ovde koristi, treba shvatiti kao specifično otkriće svake od dve naznačene karakteristike ili komponente, sa onom drugom ili bez nje. Tako, predviđeno je da termin „i/ili“, kako se koristi u frazi kao što je „A i/ili B“, uključuje „A i B“, „A ili B“, (samo) „A“ i (samo) „B“. Slično tome, predviđeno je da termin „i/ili“, kako se koristi u frazi kao što je „A, B i/ili C“, obuhvata svako od sledećih otelotvorenja: A, B i C; A, B ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; (samo) A; (samo) B; i (samo) C.

[0067] Ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što ga obično shvata stručnjak sa prosečnim znanjem u oblasti na koju se ovaj pronalazak odnosi. Na primer, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2. izd., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3. izd., 1999, Academic Press; i Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, prerađeno izdanje, 2000, Oxford University Press, obezbeđuju stručnjaku opšti rečnik sa mnogim pojmovima upotrebljenim u ovom pronalasku.

[0068] Jedinice, prefiksi i simboli su navedeni u prihvaćenom obliku koji se nalazi u Système International de Unites (SI). Numerički opsezi uključuju i krajnje brojeve koji definišu opseg. Ako nije drugačije naznačeno, aminokiselinske sekvence su napisane sleva nadesno, u smeru od amino ka karboksi. Ovde dati naslovi ne predstavljaju ograničenje različitih aspekata ili otelotvorenja pronalaska, koja se mogu dobiti uvidom u specifikaciju u celini. Prema tome,

1

termini definisani neposredno u nastavku su kompletnije definisani uvidom u specifikaciju u celini.

[0069] Podrazumeva se da, svuda gde su otelotvorenja ovde opisana izrazom „uključujući“, takođe su obezbeđena i analogna otelotvorenja opisana terminima „koji se sastoji od“ i/ili „koji se suštinski sastoji od“.

[0070] Aminokiseline se ovde navode ili prema opštepoznatim troslovnim simbolima, ili prema jednoslovnim simbolima koje preporučuje Komisija za biohemijsku nomenklaturu IUPAC-IUB. Slično tome, nukleotidi se pominju po svojim opšteprihvaćenim jednoslovnim šiframa.

[0071] Termin „epitop“, kao što se ovde koristi, odnosi se na proteinsku determinantu koja može da veže konstrukciju iz pronalaska. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija u molekulu, kao što su bočni lanci aminokiselina ili šećera, i obično imaju specifične trodimenzionalne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje prvih, ali ne i drugih, prekida u prisustvu denaturišućih rastvarača.

[0072] Termini „domen fibronektina tip III (FnIII)“, „domen FnIII“, i „konstrukcija FnIII“ odnose se na polipeptide homologne domenu humanog fibronektina tip III koji ima najmanje 7 beta lanaca koji su raspoređeni između dve beta ravni, koje se slažu jedna pored druge i formiraju srž proteina, i nadalje sadrže petlje izložene rastvaraču koje međusobno povezuju beta lance. Ima najmanje tri takve petlje na svakoj ivici sendviča beta ravni, gde ivica predstavlja granicu proteina upravno na smer beta lanca. U nekim otelotvorenjima, FnIII domen sadrži 7 beta lanaca označenih sa A, B, C, D, E, F i G povezanih sa šest regiona petlje označenih sa BC, CD, DE, EF i FG, naznačenih time što region petlje povezuje svaki beta lanac.

[0073] Termin „Tn3 konstrukcija“ koji se ovde koristi, ukazuje na molekule koji sadrže najmanje jednu FnIII konstrukciju, naznačenu time što A beta lanac sadrži SEQ ID NO: 11, B beta lanac sadrži SEQ ID NO: 12, C beta lanac sadrži SEQ ID NO: 13 ili 14, D beta lanac sadrži SEQ ID NO: 15, E beta lanac sadrži SEQ ID NO: 16, F beta lanac sadrži SEQ ID NO: 17, i beta lanac G sadrži SEQ ID NO: 18, naznačeno time što je najmanje jedna petlja neprirodna varijanta petlje u „matičnoj Tn3 konstrukciji“. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više beta lanaca modula Tn3 sadrži najmanje jednu supstituciju aminokiseline, osim što

2

cisteinski ostaci u C beta lancu (npr, cistein u SEQ ID NO: 13 ili 14) i F beta lancima (SEQ ID NO: 17) nisu supstituisani.

[0074] Termin „matična Tn3 konstrukcija“, kao što se ovde koristi, odnosi se na FnIII konstrukciju koja sadrži SEQ ID NO: 3, tj. termički stabilizovanu FnIII konstrukciju sa dizajniranim cisteinom izvedenu iz 3. FnIII domena humanog tenascina C.

[0075] Termini „multimer“ ili „multimerna konstrukcija“ odnose se na molekul koji sadrži najmanje dve FnIII konstrukcije koje su povezane. Konstrukcije koje grade multimernu konstrukciju mogu biti povezane preko linkera koji omogućava da svaka konstrukcija nezavisno funkcioniše.

[0076] Termini „monomer“, „monomerna podjedinica“ ili „monomerna konstrukcija“ odnose se na molekul koji sadrži samo jednu FnIII konstrukciju.

[0077] Termin „CD40L-specifična monomerna podjedinica“, kao što se ovde koristi, odnosi se na monomer Tn3 izveden iz „matičnog Tn3“, naznačen time što se monomer Tn3 specifično vezuje za CD40L ili njegov fragment, npr. rastvorni oblik CD40L.

[0078] Termin „DNK“ odnosi se na sekvencu dva ili više kovalentno vezanih, prirodnih ili modifikovanih dezoksiribonukleotida.

[0079] Termin „fuzioni protein“ odnosi se na protein koji obuhvata (i) jednu ili više konstrukcija iz pronalaska povezanu sa (ii) drugim, različitim proteinom (tj. „heterolognim proteinom“).

TABELA 1: Sekvence i SEQ ID NO „matičnog Tn3“

N

T

[0080] Termin „heterologni ostatak“ ovde se koristi da označi dodavanje kompozicije Tn3 konstrukcije iz pronalaska, naznačeno time što kompozicija normalno nije deo FnIII domena.

4

Primeri za heterologne ostatke uključuju proteine, peptide, proteinske domene, linkere, lekove, toksine, agense za snimanje, radioaktivna jedinjenja, organske i neorganske polimere, i sve druge kompozicije koje mogu da obezbede aktivnost koja nije svojstvena samom FnIII domenu, uključujući, bez ograničenja, polietilen glikol (PEG), citotoksični agens, radioizotop, agens za snimanje, biotin, dimerizacioni domen (npr. domen leucinskog zatvarača), albumin iz humanog seruma (HSA) ili njegov FcRn vezujući deo, domen ili fragment antitela (npr. varijabilni domen antitela, CH1 domen, Ckapa domen, Clambda domen, CH2 ili CH3 domen), jednolančano antitelo, domensko antitelo, albumin vezujući domen, IgG molekule, enzim, ligand, receptor, vezujući peptid, ne-FnIII konstrukciju, oznaku epitopa, polimer rekombinantnog polipeptida, citokin i slično.

[0081] Termin „linker“, kako se ovde koristi, odnosi se na svaki molekulski skup koji spaja ili povezuje dve ili više konstrukcija. Linker može biti molekul čija funkcija je da deluje kao „razmak“ između modula u konstrukciji, ili takođe može biti molekul sa dodatnom funkcijom (npr. „funkcionalni ostatak“). Molekul obuhvaćen definicijom „heterolognog ostatka“ takođe može imati funkciju linkera.

[0082] Termini „povezan“ i „fuzionisan“ koriste se naizmenično. Ovi termini se odnose na spajanje dve ili više konstrukcija, heterolognih ostataka ili likera na bilo koji način, uključujući hemijsku konjugaciju ili rekombinantna sredstva.

[0083] Termini „domen“ ili „proteinski domen“ odnose se na region proteina koji može da se savije u stabilnu trodimenzionalnu strukturu, često nezavisno od ostatka proteina, i koji može imati posebnu funkciju. Ova struktura održava posebnu funkciju povezanu sa funkcijom domena u originalnom proteinu, npr. enzimsku aktivnost, stvaranje motiva za prepoznavanje za drugi molekul, ili da se obezbede potrebne strukturne komponente za protein kako bi postojao u posebnom okruženju proteina. U okviru familije proteina i u okviru povezanih superfamilija proteina, domeni proteina mogu biti evoluciono konzervirani regioni. Kada se opisuju komponente multimerne konstrukcije, termini „domen“, „monomerna konstrukcija“, „monomerna podjedinica“ i „modul“ mogu naizmenično da se koriste. Pod „nativnim domenom FnIII“ podrazumeva se svaki nerekombinantni domen FnIII kodiran živim organizmom.

[0084] „Proteinska sekvenca“ ili „aminokiselinska sekvenca“ označava linearni prikaz konstituenata aminokiseline u polipeptidu u smeru od amino kraja ka karboksi kraju, u kome se susedni ostaci u primarnoj strukturi nalaze jedan pored drugog u primarnoj strukturi polipeptida.

[0085] Termin „nukleinska kiselina“ odnosi se na dva ili više kovalentno vezanih nukleotida ili nukleotidnih analoga ili derivata. Kao što se ovde koristi, ovaj termin uključuje, bez ograničenja, DNK, RNK i PNK. „Nukleinska kiselina“ i „polinukleotid“ se ovde naizmenično koriste.

[0086] Termin „polinukleotid“ nameravano obuhvata pojedinačnu nukleinsku kiselinu kao i više nukleinskih kiselina, i odnosi se na izolovani molekul nukleinske kiseline ili konstrukta, npr, informacionu RNK (iRNK) ili DNK plazmida (pDNK). Termin „izolovana“ nukleinska kiselina ili polinukleotid odnosi se na molekul nukleinske kiseline, DNK ili RNK, koji je uklonjen iz svog prirodnog okruženja. Na primer, rekombinantni polinukleotid koji kodira, npr. konstrukciju iz pronalaska, sadržan u vektoru, smatra se izolovanim u svrhu predmetnog pronalaska. Dalji primeri za izolovani polinukleotid uključuju rekombinantne polinukleotide koji se održavaju u heterolognim ćelijama domaćinima ili prečišćene (delimično ili suštinski) polinukleotide u rastvoru. Izolovani molekuli RNK uključuju in vivo ili in vitro RNK transkripte polinukleotida iz predmetnog pronalaska. Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku dalje uključuju takve molekule koji su veštački proizvedeni. Pored toga, polinukleotid ili nukleinska kiselina može biti regulatorni element kao što je promoter, mesto vezivanja ribozoma, ili transkripcioni terminator, ili može da ga uključuje.

[0087] Termin „farmaceutski prihvatljiv“ odnosi se na jedinjenje ili protein koji se može primeniti na životinji (na primer, sisaru) bez značajnih neželjenih medicinskih posledica.

[0088] Termin „fiziološki prihvatljiv nosač“ odnosi se na nosač koji nema značajno štetan uticaj na lečenog domaćina, i koji zadržava terapeutska svojstva jedinjenja sa kojim se primenjuje. Jedan primer za fiziološki prihvatljiv nosač je fiziološki rastvor. Drugi fiziološki prihvatljivi nosači i njihove formulacije su poznati stručnjacima, i opisani su, na primer, u Remington's Pharmaceutical Sciences, (18. izdanje), izd. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pa.

[0089] Pod „polipeptidom“ se podrazumeva svaka sekvenca dve ili više aminokiselina linearno povezanih amidnim vezama (peptidnim vezama) nezavisno od dužine, posttranslacione modifikacije ili funkcije. „Polipeptid“, „peptid“ i „protein“ se ovde naizmenično koriste. Tako, peptidi, dipeptidi, tripeptidi, ili oligopeptidi su obuhvaćeni definicijom „polipeptida“, a termin „polipeptid“ može da se koristi umesto svih ovih termina, ili naizmenično sa njima. Termin „polipeptid“ takođe treba da se odnosi na proizvode postekspresionih modifikacija polipeptida, uključujući, bez ograničenja, glikozilaciju, acetilovanje, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičko cepanje ili modifikaciju aminokiselina koje se ne nalaze u prirodi. Polipeptid se može dobiti iz prirodnog biološkog izvora ili se proizvodi rekombinantnom tehnologijom, ali ne mora biti translatovan sa naznačene sekvence aminokiselina. Polipeptid može da se dobije na bilo koji način, uključujući hemijsku sintezu.

[0090] Takođe su kao polipeptidi iz predmetnog pronalaska uključeni fragmenti, derivati, analozi ili varijante prethodnih polipeptida, i sve njihove kombinacije. Varijante mogu da postoje u prirodi ili mogu da budu neprirodnog porekla. Varijante neprirodnog porekla mogu da se proizvedu koristeći tehnike mutageneze poznate u struci. Varijante polipeptida mogu da obuhvate konzervativne ili nekonzervativne supstitucije aminokiselina, delecije ili adicije. Takođe, kao „derivati“ su uključeni oni peptidi koji sadrže jedan ili više prirodnih derivata aminokiselina od dvadeset standardnih aminokiselina.

[0091] Pod „randomizovanim“ ili „mutiranim“ se podrazumeva jedna ili više izmena aminokiselina, uključujući deleciju, supstituciju ili adiciju, u odnosu na sekvencu šablona. Pod „randomizacijom“ ili „mutacijom“ se podrazumeva proces uvođenja takve izmene aminokiselina u sekvencu. Randomizacija ili mutacija može da se postigne putem namernog, nasumičnog ili spontanog variranja sekvence, generalno sekvence koja kodira nukleinsku kiselinu, i može da se izvede bilo kojom tehnikom, na primer, PCR, PCR sklone greškama, ili hemijskom sintezom DNK. Termini „randomizujući“, „randomizovan“, „mutirajući“, „mutiran“, i slično, ovde se koriste naizmenično.

[0092] Pod „srodnim“ ili „srodnim nemutiranim proteinom“ podrazumeva se protein koji je po sekvenci identičan varijantnom proteinu, osim aminokiselinskih mutacija uvedenih u varijantni protein, naznačeno time što je varijantni protein randomizovan ili mutiran.

[0093] Pod „RNK“ se podrazumeva sekvenca dva ili više kovalentno vezanih, prirodnih ili modifikovanih ribonukleotida. Jedan primer za modifikovanu RNK obuhvaćen ovim terminom je fosforotioatna RNK.

[0094] Termini „konstrukcija iz pronalaska“ ili „konstrukcije iz pronalaska“, kao što se ovde koriste, odnose se na multimerne Tn3 konstrukcije, kao i monomerne Tn3 konstrukcije. Termin „cilj“ odnosi se na jedinjenje koje prepoznaje specifična konstrukcija iz pronalaska. Termini „cilj“ i „antigen“ ovde se koriste naizmenično. Termin „specifičnost“, kao što se ovde koristi, npr. u terminima „specifično vezuje“ ili „specifično vezivanje“ odnosi se na relativni afinitet kojim se Tn3 konstrukcija iz pronalaska vezuje za jedan ili više antigena preko jednog ili više antigen vezujućih domena, i to vezivanje zahteva izvesnu komplementarnost između jednog ili više antigen vezujućih domena i jednog ili više antigena. Prema ovoj definiciji, kaže se da se Tn3 konstrukcija iz pronalaska „specifično vezuje“ za epitop kada se vezuje za taj epitop lakše nego što bi se vezala za nasumični, nevezani epitop.

[0095] „Afinitetno sazrela“ konstrukcija je konstrukcija sa jednom ili više izmena, generalno u petlji, što dovodi do poboljšanja afiniteta Tn3 konstrukcije prema epitopu u poređenju sa matičnom Tn3 konstrukcijom koja nema te izmene.

[0096] Termin „afinitet“, kao što se ovde koristi, odnosi se na meru jačine vezivanja neke Tn3 konstrukcije iz pronalaska za pojedinačni epitop.

[0097] Termin „aviditet“, kao što se ovde koristi, odnosi se na ukupnu stabilnost kompleksa između populacije Tn3 konstrukcija iz pronalaska i nekog epitopa, tj. funkcionalno kombinovane jačine vezivanja većeg broja Tn3 konstrukcija sa antigenom. Aviditet je povezan sa afinitetom pojedinačnih antigen vezujućih domena sa specifičnim epitopima, kao i sa valencom konstrukcije iz pronalaska.

[0098] Termin „delovanje na cilj“ odnosi se na vezivanje Tn3 konstrukcije iz pronalaska za jedan ili više ciljeva i na biološke efekte proistekle iz takvog vezivanja. U tom smislu, jedinice za višestruko vezivanje antigena u Tn3 konstrukciji mogu da interaguju sa raznim ciljevima i/ili epitopima i, na primer, mogu fizički da približe dva cilja, aktiviraju metaboličke kaskade putem interakcije sa posebnim ciljem, itd. Vezano za CD40L, „dejstvo na cilj“ odnosi se na efekat postignut, na primer, povećanjem, stimulacijom ili aktivacijom jedne ili više bioloških aktivnosti CD40L.

[0099] Termin „valenca“, kao što se ovde koristi, odnosi se na broj potencijalnih antigen vezujućih modula, npr. broj modula FnIII u konstrukciji iz pronalaska. Kada Tn3 konstrukcija iz pronalaska sadrži više od jednog antigen vezujućeg modula, svaki vezujući modul može specifično da veže, npr. isti epitop ili različiti epitop, na istom cilju ili različitim ciljevima.

[0100] Termin „disulfidna veza“, kao što se ovde koristi, uključuje kovalentnu vezu nastalu između dva atoma sumpora. Aminokiselina cistein sadrži tiolnu grupu koja može da formira disulfidnu vezu ili most sa drugom tiolnom grupom.

[0101] Termin „imunoglobulin“ i „antitelo“ obuhvata različite velike klase polipeptida koje se mogu biohemijski razlikovati. Stručnjaci će znati da su teški lanci klasifikovani kao gama, mi, alfa, delta ili epsilon. Priroda ovih lanaca određuje da „klasa“ antitela bude IgG, IgM, IgA IgG, odnosno IgE. Vešt stručnjak će takođe lako prepoznati modifikovane verzije svake klase. Kao što se ovde koristi, termin „antitelo“ obuhvata, bez ograničenja, netaknuto antitelo, modifikovano antitelo, VL antitela ili VL domen, CH1 domen, Ckapa domen, Clambda domen, Fc domen (vidite dole), CH2 ili CH3 domen.

[0102] Kao što se ovde koristi, termin „Fc domen“ odnosi se na deo konstantnog regiona antitela. Tradicionalno, termin Fc domen odnosi se na proizvod cepanja proteaze (npr. papaina) koji obuhvata sparene CH2, CH3 regione i region šarke antitela. U kontekstu ovog otkrića, termin Fc domen ili Fc odnosi se na svaki polipeptid (ili nukleinsku kiselinu koja kodira takav polipeptid), bez obzira na način proizvodnje, koji uključuje cele CH2, CH3 regione i region šarke polipeptida imunoglobulina, ili samo njihov deo.

[0103] Kao što se ovde koristi, termin „modifikovano antitelo“ obuhvata sintetičke oblike antitela koja su izmenjena tako da nisu prirodna, npr. antitela koja sadrže najmanje dva dela teškog lanca, ali ne dva kompletna teška lanca (kao, npr. antitela sa ukinutim domenom ili minitela); multispecifične oblike antitela (npr. bispecifična, trispecifična, itd) koja su izmenjena tako da se vezuju za dva ili više antigena ili za različite epitope jednog antigena). Pored toga, termin „modifikovano antitelo“ obuhvata polivalentne oblike antitela (npr.

trovalentna, četvorovalentna, itd, antitela koja su za tri ili više kopija istog antigena). (vidite, npr. Antibody Engineering, Kontermann & Dubel, izd.2010, Springer Protocols, Springer).

[0104] Termin „poluživot in vivo“ koristi se u svom normalnom značenju, tj. vreme u kome je 50% biološke aktivnosti polipeptida još uvek prisutno u telu/ciljnom organu, ili vreme u kome je aktivnost polipeptida 50% od njene početne vrednosti. Kao alternativa određivanju funkcionalnog poluživota in vivo, može biti određen „poluživot u serumu“, tj. vreme u kome 50% molekula polipeptida kruži u plazmi ili krvotoku pre eliminacije. Određivanje poluživota u serumu je često jednostavnije od određivanja funkcionalnog poluživota in vivo, i veličina poluživota u serumu je obično dobra indikacija veličine funkcionalnog poluživota in vivo. Alternativni termini poluživotu u serumu uključuju „poluživot u plazmi“, poluživot u cirkulaciji, poluživot u krvotoku, klirens iz seruma, klirens iz plazme i poluživot klirensa. Funkcija koju treba zadržati se obično bira od prokoagulantne, proteolitičke, kofaktora vezivanja, aktivnosti vezivanja receptora, ili druge vrste biološke aktivnosti vezane za određeni protein.

[0105] Termin „produžen“ kada se odnosi na funkcionalni poluživot in vivo ili poluživot u plazmi koristi se da ukaže da je relevantni poluživot polipeptida statistički značajno povećan u odnosu na poluživot referentnog molekula (na primer, nemodifikovanog polipeptida), koji je određen pod uporedivim uslovima.

[0106] Termin „skraćen“ kada se odnosi na funkcionalni poluživot in vivo ili poluživot u plazmi, koristi se da ukaže da je relevantni poluživot polipeptida statistički značajno smanjen u odnosu na poluživot referentnog molekula (na primer, nemodifikovanog polipeptida), koji je određen pod uporedivim uslovima.

[0107] Termin „ekspresija“, kako se ovde koristi, odnosi se na proces u kome gen proizvodi biohemijski agens, na primer, konstrukciju iz pronalaska ili njen fragment. Proces uključuje sve manifestacije funkcionalnog prisustva gena u ćeliji uključujući, bez ograničenja, nokdaun gena, kao i prolaznu i stabilnu ekspresiju. On uključuje, bez ograničenja, transkripciju gena u jednu ili više iRNK, i translaciju takvih iRNK u jedan ili više polipeptida. Ako je finalni željeni proizvod biohemijski agens, ekspresija uključuje stvaranje tog biohemijskog agensa i svih prekursora.

4

[0108] „Proizvod ekspresije“ može biti bilo nukleinska kiselina, npr. informaciona RNK dobijena transkripcijom gena, ili polipeptid. Ovde opisani proizvodi ekspresije dalje uključuju nukleinsku kiselinu sa posttranskripcionim modifikacijama, npr. poliadenilacijom, ili polipeptide sa posttranslacionim modifikacijama, npr. metilovanjem, glikozilovanjem, adicijom lipida, vezivanjem sa drugim proteinskim podjedinicama, proteolitičkim cepanjem i slično.

[0109] Termin „vektor“ ili „ekspresioni vektor“ ovde se koriste da označi vektore upotrebljene prema predmetnom pronalasku kao sredstvo za uvođenje i ekspresiju željenog ekspresionog proizvoda u ćeliju domaćina. Kao što je poznato stručnjacima, takvi vektori lako mogu da se odaberu iz grupe koja se sastoji od plazmida, faga, virusa i retrovirusa. Generalno, vektori kompatibilni sa sadašnjim otkrićem sadrže selekcioni marker, odgovarajuća restrikciona mesta za olakšavanje kloniranja željene nukleinske kiseline, i imaju sposobnost da uđu u eukariotsku ili prokariotsku ćeliju i/ili da se u njoj replikuju.

[0110] Termin „ćelije domaćini“ odnosi se na ćelije koje poseduju vektore konstruisane koristeći tehnike rekombinacije DNK i kodiranje najmanje jednog ekspresionog proizvoda. U opisima procesa za izolovanje ekspresionog proizvoda iz rekombinantnih domaćina, termini „ćelija“ i „ćelijska kultura“ koriste se naizmenično da označe izvor ekspresionog proizvoda ako nije jasno naznačen na drugi način, tj. regenerisanje ekspresionog proizvoda iz „ćelija“ znači izolovanje iz celih ćelija istaloženih centrifugiranjem, ili izolovanje iz ćelijske kulture koja sadrži medijum i suspendovane ćelije.

[0111] Termini „lečiti“ ili „lečenje“ ovde se odnose na terapeutski tretman i profilaktičke ili preventivne mere, naznačeno time što je cilj da se spreči ili uspori (smanji) neželjena fiziološka promena ili poremećaj kod ispitanika, kao što je progresija inflamatorne bolesti ili stanja. Korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, bez ograničenja, ublažavanje simptoma, smanjenje obima bolesti, stabilizovano (tj. bez pogoršavanja) stanje bolesti, odlaganje ili usporavanje napredovanja bolesti, poboljšavanje ili palijaciju stanja bolesti, i remisiju (delimičnu ili potpunu), bilo da može ili ne može da se detektuje.

[0112] Termin „lečenje“ takođe podrazumeva produžavanje preživljavanja u poređenju sa očekivanim preživljavanjem bez primene lečenja. Osobe kojima je potrebno lečenje uključuju one koje već imaju stanje ili poremećaj, kao i one koje su sklone da imaju stanje ili poremećaj, ili one kod kojih treba sprečiti stanje ili poremećaj.

[0113] Termini „ispitanik“, „pojedinac“, „životinja“, „pacijent“ ili „sisar“ odnose se na svakog pojedinca, pacijenta ili životinju, posebno ispitanika koji je sisar, za koga je potrebna dijagnoza, prognoza ili lečenje. Ispitanik koji je sisar uključuje ljude, domaće životinje, životinje sa farme i iz zoološkog vrta, kao što su psi, mačke, zamorčići, zečevi, pacovi, miševi, konji, stoka, krave, i tako dalje.

[0114] Termin „CD40L“, kao što se ovde koristi, odnosi se, bez ograničenja, na CD40L eksprimiran na površini T ćelija, rekombinantno eksprimirani CD40L, CD40L eksprimiran i prečišćen iz E. coli ili drugog pogodnog sistema za ekspresiju rekombinantnog proteina, aglikozilovani CD40L i rastvorne fragmente CD40L. Kao što se ovde koristi „CD40L“ se takođe odnosi na MegaCD40L. MegaCD40L™ je konstrukt velike aktivnosti u kome su dva trimerna CD40 liganda veštački povezana preko domena kolagena ACRP30/adiponektina. Ovaj konstrukt veoma efikasno simulira prirodnu membranom asistiranu agregaciju CD40L in vivo. On obezbeđuje jednostavnu i podjednako potentnu alternativu kombinacijama [CD40L+pojačavač] (Alexis biochemicals). Termin „CD40L“ se odnosi na monomerne oblike CD40L, kao i oligomerne oblike, npr. trimerni CD40L.

[0115] Termin „CD40L“ se odnosi na CD40L pune dužine, kao i na rastvorne fragmente, npr. oblike ekstracelularnog domena CD40L dobijene proteolizom. Aminokiselinske sekvence membranski vezanih i rastvornih oblika humanog CD40L (Swissprot: P29965) prikazane su u SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2, tim redom.

[0116] Termini „antagonist CD40L“ ili „antagonist“ koriste se u najširem smislu, i uključuju svaki molekul koji delimično ili potpuno inhibira, smanjuje ili inaktivira jednu ili više bioloških aktivnosti CD40L, i njegovih biološki aktivnih varijanti, in vitro, in situ, ili in vivo. Na primer, antagonist CD40L može funkcionisati tako da delimično ili potpuno inhibira, smanjuje ili inaktivira jednu ili više bioloških aktivnosti jednog ili više molekula CD40L, ili jednog ili više molekula CD40L vezanih za CD40L ili druge ciljeve, in vivo, in vitro ili in situ, usled vezivanja za CD40L.

[0117] Termin „agonist CD40L“ ili „agonist“ koristi se u najširem smislu, i uključuje svaki molekul koji delimično ili potpuno povećava, stimuliše ili aktivira jednu ili više bioloških aktivnosti CD40L, i njegovih biološki aktivnih varijanti, in vitro, in situ, ili in vivo. Na primer, agonist CD40L može funkcionisati tako da delimično ili potpuno povećava, stimuliše ili aktivira jednu ili više bioloških aktivnosti jednog ili više molekula CD40L, ili jednog ili više molekula CD40L vezanih za CD40R ili druge ciljeve, in vivo, in vitro ili in situ, usled njegovog vezivanja za CD40L.

[0118] Termin „kristal“, kao što se ovde koristi, odnosi se na jedan oblik čvrstog stanja materije kod koga su atomi raspoređeni po šablonu koji se periodično ponavlja u tri dimenzije, i tipično gradi rešetku.

[0119] Termin „simetrija prostorne grupe“, kao što se ovde koristi, odnosi se na celu simetriju kristala koja kombinuje translacionu simetriju kristalne rešetke sa tačkastom grupom simetrije. „Prostorna grupa“ je označena velikim slovom koje identifikuje grupu rešetke (P, A, F, itd) nakon koga sledi simbol tačkaste grupe kod koje su elementi rotacije i refleksije prošireni tako da obuhvate ose uvrtanja i ravni klizanja. Treba zapaziti da tačkasta grupa simetrije za datu prostornu grupu može da se odredi uklanjanjem simbola centriranja ćelije prostorne grupe i zamenom svih osa uvrtanja sličnim osama rotacije i zamenom svih ravni klizanja refleksionim ravnima. Tačkasta grupa simetrije za prostornu grupu opisuje stvarnu simetriju njene recipročne rešetke.

[0120] Termin „jedinična ćelija“, kao što se ovde koristi, označava atome u kristalu koji su raspoređeni po šablonu koji se pravilno ponavlja, kod koga se najmanja jedinica ponavljanja zove jedinična ćelija. Cela struktura se može rekonstruisati na osnovu poznavanja jedinične ćelije, koja je okarakterisana pomoću tri dužine (a, b i c) i tri ugla (α, β i γ). Veličine a i b su dužine bočnih strana osnove ćelije, a γ je ugao između te dve strane. Veličina c je visina jedinične ćelije. Uglovi α i β opisuju uglove između osnove i vertikalnih strana jedinične ćelije.

[0121] Termin „medijum za čuvanje podataka koji se može mašinski očitati“, kao što se ovde koristi, označava materijal za čuvanje podataka kodiran podacima koji se mogu mašinski očitati, naznačeno time što je mašina programirana pomoću uputstva za upotrebu takvih podataka, i može da prikaže podatke u željenom formatu, na primer, grafički trodimenzionalni prikaz molekula ili molekulskih kompleksa.

4

[0122] Termin „obrazac difrakcije rendgenskih zraka“ označava obrazac dobijen rasipanjem rendgenskih zraka periodičnog skupa molekula ili atoma u kristalu. Rendgenska kristalografija je tehnika koja koristi činjenicu da kristali difraktuju rendgenske zrake. Rendgenski zraci imaju odgovarajuću talasnu dužinu (u rangu angstrema, oko 10<-8>cm) da se rasipaju na elektronskom oblaku atoma uporedive veličine. Na osnovu difrakcionog obrasca dobijenog rasipanjem rendgenskih zraka periodičnog skupa molekula ili atoma u kristalu, može se rekonstruisati elektronska gustina. Dodatne fazne informacije se mogu dobiti iz difrakcionih podataka ili iz dopunskih difrakcionih eksperimenata da bi se upotpunila rekonstrukcija (fazni problem u kristalografiji). Model je progresivno ugrađen u eksperimentalnu gustinu podataka, prečišćen u odnosu na podatke da bi se dobila tačna molekulska struktura. Koordinate elektronske strukture definišu jedinstvenu konfiguraciju tačaka u prostoru. Stručnjaci će znati da komplet strukturnih koordinata za protein ili kompleks protein-ligand, ili njegov deo, definiše relativni komplet tačaka koje, zauzvrat, definišu konfiguraciju u tri dimenzije. Slična ili identična konfiguracija može da se definiše potpuno različitim kompletom koordinata, pod uslovom da rastojanja i uglovi između koordinata ostanu suštinski isti. Pored toga, konfiguracija tačaka može biti definisana povećanjem ili smanjenjem rastojanja između koordinata za skalarni faktor, dok uglovi ostaju suštinski isti.

[0123] Termin „kristalna struktura“, kao što se ovde koristi, odnosi se na trodimenzionalni prostorni raspored ili rešetku ponavljajućih atomskih ili molekulskih jedinica u kristalnoj supstanci. Kristalna struktura kristalne supstance može da se odredi metodama rendgenske kristalografije, vidite, na primer, „Principles of Protein X-Ray Crystallography“, Jan Drenth, Springer Advanced Texts in Chemistry, Springer Verlag, 2. izd, februar 199, ISBN: 0387985875, i „Introduction to Macromolecular Crystallography“, Alexander McPherson, Wiley-Liss, 18. okt.2002, ISBN: 0471251224.

[0124] Termin „efektorska funkcija“ odnosi se na one biološke aktivnosti antitela ili fragmenta antitela koje se mogu pripisati Fc regionu (nativni Fc region ili Fc region varijante aminokiselinske sekvence) antitela, i varira sa izotipom antitela. Primeri za efektorske funkcije antitela uključuju: C1q vezivanje i citotoksičnost zavisnu od komplementa; vezivanje Fc receptora; ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); fagocitozu; nishodnu regulaciju receptora ćelijske površine (npr. receptora B ćelije); i aktivaciju B ćelije.

[0125] Termin „ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela“ ili „ADCC“ odnosi se na oblik citotoksičnosti kod koje sekretovani Ig vezan za Fc receptore (FcR) prisutne na nekim citotoksičnim ćelijama (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili i makrofagi) omogućava da se te citotoksične efektorske ćelije specifično vežu za ciljnu ćeliju koja nosi antigen, i zatim da ubiju ciljnu ćeliju citotoksinima.

[0126] Termin „Fc receptor“ ili „FcR“ opisuje receptor koji se vezuje za Fc region antitela. FcR može biti humani FcR nativne sekvence. FcR može da se veže za IgG antitelo (gama receptor) i uključuje receptore potklasa FcyRI, FcyRII i FcyRIII, uključujući alelne varijante i alternativno splajsovane oblike ovih receptora. Termin takođe uključuje neonatalni receptor FcRn.

[0127] Termin „sekvenca konsenzusa“ odnosi se na sekvencu proteina koja pokazuje najčešće aminokiseline na konkretnoj poziciji nakon poravnavanja više sekvenci. Sekvenca konsenzusa je način da se prikažu rezultati poravnavanja više sekvenci, gde se povezane sekvence međusobno porede. Sekvenca konsenzusa pokazuje koji ostaci su najobilniji u poravnavanju na svakoj poziciji, i stepen varijabilnosti na svakoj poziciji.

Uvod

[0128] CD40L (poznat i kao CD154, CD40 ligand, gp39 ili TBAM) predstavlja membranski glikoprotein od 33 kDa, tip II (Swiss-ProtAcc-No P29965). Pored toga, postoje kraći oblici CD40L od 18 kDa (poznati i kao sCD40L ili rastvorni CD40L). Ovi rastvorni oblici CD40L nastaju proteolitičkom obradom membranski vezanog proteina, ali je ćelijska aktivnost rastvorne vrste slaba u odsustvu oligomerizacije višeg reda (npr. trimerizacije).

[0129] Predmetni pronalazak obezbeđuje familiju rekombinantnih, neprirodnih konstrukcija proteina (Tn3 konstrukcija) koje mogu da se vežu za CD40L. Konkretno, ovde opisani proteini mogu da se koriste za prikaz definisanih petlji koje su analogne regionima koji određuju komplementarnost („CDR“) varijabilnog regiona antitela. Ove petlje mogu da se podvrgnu randomizaciji ili restriktivnoj evoluciji da bi se dobila raznovrsnost sposobna za vezivanje mnogih ciljnih komponenata. Tn3 konstrukcije mogu da se koriste kao monomeri, ili mogu da se udruže u multimerne konstrukcije sposobne da se vežu za CD40L.

4

[0130] U specifičnim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje CD40L-specifične vezivače koji su korisni za prevenciju, poboljšavanje, detektovanje, dijagnostikovanje ili praćenje bolesti, kao što su, bez ograničenja, autoimunske bolesti. U drugim specifičnim otelotvorenjima, CD40L-specifične Tn3 konstrukcije iz pronalaska su korisne za lečenje autoimunskih bolesti i stanja. U nekim otelotvorenjima, autoimunske bolesti mogu da uključuju, bez ograničenja, sistemski eritemski lupus (SLE), reumatoidni artritis (RA), multiplu sklerozu (MS), inflamatornu bolest creva (IBC) i odbacivanje alografta.

[0131] Tn3 konstrukcije iz pronalaska sadrže CD40L-specifične monomerne podjedinice izvedene iz trećeg domena FnIII humanog tenascina C, kod koga je konstruisana najmanje jedna neprirodna intramolekulska disulfidna veza. Monomerne podjedinice koje čine Tn3 konstrukcije iz pronalaska pravilno se savijaju nezavisno jedna od druge, zadržavaju svoju specifičnost i afinitet vezivanja, i svaka monomerna konstrukcija zadržava svoja funkcionalna svojstva. Kada su monomerne podjedinice udružene u visokovalentne Tn3 konstrukcije, monomerne podjedinice se pravilno savijaju nezavisno jedna od druge, zadržavaju svoju specifičnost i afinitet vezivanja, i svaki monomer zadržava svoja funkcionalna svojstva.

[0132] Tn3 konstrukcije iz pronalaska koje sadrže više od jedne monomerne podjedinice mogu da se vežu za više epitopa, npr. (i) vezuju se za više epitopa u okviru jednog cilja, (ii) vezuju se za jedan epitop u okviru više ciljeva, (iii) vezuju se za više epitopa koji se nalaze na različitim podjedinicama jednog cilja, ili (iv) vezuju se za više epitopa u okviru više ciljeva, i tako povećavaju aviditet.

[0133] Pored toga, usled mogućnosti menjanja rastojanja između više monomera putem linkera, multimerne Tn3 konstrukcije mogu da se vežu za više ciljnih molekula na površini (bilo na istoj ćeliji/površini ili na različitim ćelijama/površinama). Usled svoje sposobnosti da se istovremeno vežu za više od jednog cilja, multimerne Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu da se koriste za modulaciju više puteva, umrežavanje receptora na ćelijskoj površini, vezivanje receptora ćelijske površine za odvojene ćelije, i/ili vezivanje ciljnih molekula ili ćelija za supstrat.

[0134] Pored toga, predmetni pronalazak obezbeđuje afinitetno sazrele konstrukcije, naznačeno time što je afinitet konstrukcije prema specifičnom cilju modulisan putem mutacije. Takođe, otkriće obezbeđuje metode za proizvodnju konstrukcija iz pronalaska, kao i metode

4

za dizajniranje konstrukcija sa poželjnim fizičko-hemijskim, farmakološkim ili imunološkim svojstvima. Nadalje, predmetni pronalazak obezbeđuje primenu za takve konstrukcije i metode za terapeutsku, profilaktičku i dijagnostičku primenu.

Strukturni motiv FnIII

[0135] Tn3 konstrukcije iz predmetnog pronalaska su na bazi strukture modula fibronektina tip III (FnIII), domena koji se često sreće kod sva tri domena živih bića i virusa, i u mnogim klasama proteina. U specifičnim otelotvorenjima, konstrukcije iz pronalaska su izvedene iz trećeg FnIII domena humanog tenascina C (vidite Internacionalnu prijavu br. Internacionalnu prijavu br. PCT/US2008/012398, objavljenu kao WO 2009/058379; PCT/US2011/032184, objavljenu kao WO 2011/130324; i Internacionalnu prijavu br. PCT/US2011/032188, objavljenu kao WO2011130328).

[0136] U jednom specifičnom otelotvorenju, Tn3 konstrukcije iz pronalaska sadrže CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu izvedenu od matične Tn3 konstrukcije. Ukupno trodimenzionalno savijanje monomera je tesno povezano sa savijanjem najmanjeg funkcionalnog fragmenta antitela, varijabilnog regiona teškog lanca (VH), koji u antitelima sa jednim domenom kamila i kamelida (npr. lama) obuhvata celu jedinicu za prepoznavanje antigena.

[0137] Monomerne podjedinice Tn3 iz pronalaska i nativni FnIII domen iz tenascina C odlikuju se istom trodimenzionalnom strukturom, a to je beta sendvič struktura sa tri beta lanca (A, B i E) sa jedne strane i četiri beta lanca (C, D, F i G) sa druge strane, povezana sa šest regiona petlje. Ti regioni petlje se označavaju prema beta lancima povezanim sa N i C terminusom svake petlje. Prema tome, AB petlja se nalazi između beta lanaca A i B, BC petlja se nalazi između beta lanaca B i C, CD petlja se nalazi između beta lanaca C i D, DE petlja se nalazi immeđu beta lanaca D i E, EF petlja se nalazi između beta lanaca E i F, i FG petlja se nalazi između beta lanaca F i G. FnIII domeni imaju petlje izložene rastvaraču koje tolerišu randomizaciju, što olakšava stvaranje različitih skupova proteinskih konstrukcija sposobnih za vezivanje specifičnih ciljeva sa velikim afinitetom.

[0138] U jednom aspektu pronalaska, monomerne podjedinice Tn3 se podvrgavaju usmerenoj evoluciji osmišljenoj da bi se randomizovala jedna ili više petlji koje su analogne regionima koji određuju komplementarnost („CDR“) varijabilnog regiona antitela. Takav pristup

4

usmerene evolucije dovodi do proizvodnje molekula nalik na antitela sa velikim afinitetom prema željenom cilju, npr. CD40L.

[0139] Pored toga, u nekim otelotvorenjima, ovde opisane Tn3 konstrukcije se mogu koristiti za prikaz definisanih izloženih petlji (na primer, petlji koje su prethodno randomizovane i odabrane na osnovu vezivanja cilja) da bi se usmerila evolucija molekula koji se vezuju za takve uvedene petlje. Ova vrsta selekcije može da se izvede kako bi se identifikovali molekuli za prepoznavanje za svaku pojedinačnu petlju nalik na CDR ili, alternativno, za prepoznavanje dve ili sve tri petlje nalik na CDR kombinovane u nelinearnom ostatku koji vezuje epitop. Komplet od tri petlje (označene sa BC, DE i FG), koji može da pruži specifično vezivanje cilja, ide između B i C lanca; D i E lanca, i F i G lanca. BC, DE i FG petlje trećeg FnIII domena humanog tenascina C su dužine 9, 6, odnosno 10 aminokiselinskih ostataka. Dužina ovih petlji se nalazi u uskom opsegu srodnih petlji koje prepoznaju antigen, koje se nalaze u teškim lancima antitela, i ta dužina iznosi 7-10, 4-8, odnosno 4-28 aminokiselina. Slično, drugi komplet petlji, AB, CD i EF petlje (dužine 7, 7, odnosno 8 aminokiselina) proteže se između A i B beta lanca; C i D beta lanca, odnosno E i F beta lanca.

[0140] Kada se randomizuju i odaberu prema velikom afinitetu vezivanja za cilj, petlje u konstrukciji Tn3 monomera mogu da uspostave kontakt sa ciljevima ekvivalentan kontaktima srodnih CDR petlji u antitelima. Prema tome, u nekim otelotvorenjima, AB, CD i EF petlje su randomizovane i odabrane prema velikom afinitetu vezivanja za jedan ili više ciljeva, npr. CD40L. U nekim otelotvorenjima, ovaj proces randomizacije i selekcije može da se izvodi paralelno sa randomizacijom BC, DE i FG petlji, dok se u drugim otelotvorenjima ovaj proces randomizacije i selekcije izvodi serijski.

CD40L-specifične monomerne podjedinice

[0141] Pronalazak obezbeđuje CD40L-specifične rekombinantne neprirodne Tn3 konstrukcije koje sadrže više domena beta lanca povezanih sa više regiona petlje, naznačeno time što se jedan ili više pomenutih regiona petlje razlikuje po deleciji, supstituciji ili adiciji najmanje jedne aminokiseline u odnosu na srodne petlje kod divljeg tipa Tn3 (SEQ ID NO: 3) (vidite TABELU 1).

[0142] Da bi se generisale poboljšane CD40L-specifične monomerne podjedinice Tn3 sa novim karakteristikama vezivanja, matični Tn3 se podvrgava adiciji, deleciji ili supstituciji

4

aminokiselina. Podrazumeva se da, kada se porede sekvence CD40L-specifične monomerne podjedinice Tn3 sa sekvencom matičnog Tn3, koristi se ista definicija beta lanaca i petlji. U nekim otelotvorenjima, CD40L-specifične monomerne podjedinice Tn3 iz pronalaska sadrže aminokiselinsku sekvencu:

naznačeno time što:

(a) XAB, XBC, XCD, XDE, XEFi XFGpredstavljaju aminokiselinske ostatke prisutne u sekvencama petlji AB, BC, CD, DE, EF, odnosno FG;

(b) X1predstavlja aminokiselinski ostatak alanina (A) ili treonina (T); i,

(c) dužina petlje n je ceo broj od 2 do 26.

TABELA 2: Sekvence petlji Tn3 klonova korišćenih u ovoj studiji

4

† Klonovi koji sadrže C beta lanac i imaju sekvencu CELAYGI (SEQ ID NO:

14), svi drugi klonovi sadrže C beta lanac i imaju sekvencu CELTYGI (SEQ

ID NO: 13).

* U nekim varijantama u familiji 309, npr.342, FG petlja može biti zamenjena sa SEQ ID NO: 139. ;* U nekim varijantama u familiji 311, BC petlja može biti dizajnirana da zameni tirozin na poziciji 21. Posebno se razmatra da zamena aminokiselinskih ostataka može da ima mali bočni niz.

[0143] U nekim otelotvorenjima, CD40L-specifične monomerne podjedinice Tn3 iz pronalaska sastoje se od aminokiselinske sekvence:

naznačeno time što:

(a) XAB, XBC, XCD, XDE, XEFi XFGpredstavljaju aminokiselinske ostatke prisutne u sekvencama petlji AB, BC, CD, DE, EF, odnosno FG;

(b) X1predstavlja aminokiselinski ostatak alanina (A) ili treonina (T); i,

(c) dužina petlje n je ceo broj od 2 do 26.

[0144] U jednom otelotvorenju, beta lanci CD40L-specifične monomerne Tn3 konstrukcije imaju najmanje 90% identičnost sekvence sa beta lancima matične Tn3 konstrukcije (SEQ ID

1

NO: 3). Da bi se izračunao takav procenat identičnosti sekvence, aminokiselinske sekvence se poravnavaju koristeći metode poznate u struci. Procenat identičnosti sekvence je definisan kao odnos između (a) broja aminokiselina koje se nalaze u beta lancima koje su identične pri poravnavanju sekvence i (b) ukupnog broja aminokiselina koje se nalaze u beta lancima.

[0145] U jednom otelotvorenju, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 4, ili SEQ ID NO: 136. U drugom otelotvorenju, sekvenca CD petlje sadrži SEQ ID NO: 6. U drugom otelotvorenju, sekvenca EF petlje sadrži SEQ ID NO: 8, ili SEQ ID NO: 137. U jednom otelotvorenju, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 4, ili SEQ ID NO: 136. U drugom otelotvorenju, sekvenca CD petlje sastoji se od SEQ ID NO: 6. U drugom otelotvorenju, sekvenca EF petlje sastoji se od SEQ ID NO: 8, ili SEQ ID NO: 137.

[0146] U jednom otelotvorenju, sekvenca BC petlje sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 i 93. U drugom otelotvorenju, sekvenca BC petlje se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 i 93.

[0147] U jednom otelotvorenju, sekvenca DE petlje sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 94, 95, 96, 97 i 98. U drugom otelotvorenju, sekvenca DE petlje se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 94, 95, 96, 97 i 98.

[0148] U jednom otelotvorenju, sekvenca FG petlje sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 9, 99 i 139. U drugom otelotvorenju, sekvenca FG petlje se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 9, 99 i 139.

[0149] U jednom otelotvorenju, sekvenca BC petlje sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116 i 117. U drugom otelotvorenju, sekvenca BC petlje se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116 i 117.

[0150] U nekim otelotvorenjima, sekvenca DE petlje sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 i 128. U drugim

2

otelotvorenjima, sekvenca DE petlje se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 i 128.

[0151] U nekim otelotvorenjima, sekvenca FG petlje sadrži sekvencu odabranu iz grupa koje se sastoje od SEQ ID NO: 129 i 130. U drugim otelotvorenjima, sekvenca FG petlje se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 129 i 130.

[0152] U nekim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 83, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 94, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139. U nekim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 83, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 94, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 9 ili 139.

[0153] U nekim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 83, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 94, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 99. U drugim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 83, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 94, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 99.

[0154] U nekim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 84, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 95, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139. U drugim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 84, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 95, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 9 ili 139.

[0155] U nekim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 85, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 94, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139. U drugim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 85, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 94, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 9 ili 139.

[0156] U nekim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 86, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 96, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139. U drugim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 86, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 96, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 9 ili 139.

[0157] U nekim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 87, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 97, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139. U drugim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 87, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 97, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 9 ili 139.

[0158] U nekim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 88, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 95, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139. U drugim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 88, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 95, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 9 ili 139.

[0159] U nekim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 89, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 94, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139. U drugim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 89, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 94, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 9 ili 139.

[0160] U nekim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 90, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 94, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139. U drugim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 90, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 94, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 9 ili 139.

[0161] U nekim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 91, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 95, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139. U drugim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 91, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 95, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 9 ili 139.

[0162] U nekim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 92, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 98, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139. U drugim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 92, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 98, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 9 ili 139.

[0163] U nekim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 93, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 94, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139. U drugim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 93, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 94, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 9 ili 139.

4

[0164] U nekim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 168, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 169, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 170. U drugim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 168, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 169, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 170.

[0165] U nekim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 100, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 118, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 100, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 118, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 129.

[0166] U nekim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 101, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 119, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 101, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 119, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 129.

[0167] U nekim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 102, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 120, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 102, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 120, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 129.

[0168] U nekim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 103, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 121, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 103, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 121, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 129.

[0169] U nekim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 104, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 122, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 104, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 122, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 129.

[0170] U nekim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 105, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 121, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 105, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 121, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 129.

[0171] U nekim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 106, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 123, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 106, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 123, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 129.

[0172] U nekim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 107, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 123, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 107, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 123, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 129.

[0173] U nekim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 108, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 118, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 108, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 118, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 129.

[0174] U nekim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 109, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 123, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 109, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 123, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 129.

[0175] U nekim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 110, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 121, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 110, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 121, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 129.

[0176] U nekim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 111, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 123, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 130. U drugim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 111, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 123, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 130.

[0177] U nekim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 108, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 121, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 108, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 121, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 129.

[0178] U nekim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 112, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 124, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 112, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 124, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 129.

[0179] U nekim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 113, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 125, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 113, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 125, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 129.

[0180] U nekim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 114, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 118, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 114, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 118, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 129.

[0181] U nekim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 115, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 126, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 115, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 126, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 129.

[0182] U nekim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 116, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 127, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 116, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 127, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 129.

[0183] U nekim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 117, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 128, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 129. U drugim otelotvorenjima, sekvenca AB petlje sastoji se od SEQ ID NO: 136, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 117, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 128, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 129.

[0184] U nekim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 174, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 175, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 177. U drugim otelotvorenjima, sekvenca BC petlje sastoji se od SEQ ID NO: 174, sekvenca DE petlje sastoji se od SEQ ID NO: 175, i sekvenca FG petlje sastoji se od SEQ ID NO: 177.

[0185] U nekim otelotvorenjima, CD40L-specifična monomerna podjedinica sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 i 146. U drugim otelotvorenjima, CD40L-specifična monomerna podjedinica se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 i 146.

[0186] U nekim otelotvorenjima, CD40L-specifična monomerna podjedinica sadrži SEQ ID NO: 28 ili 146. U drugim otelotvorenjima, CD40L-specifična monomerna podjedinica se sastoji od SEQ ID NO: 28 ili 146.

[0187] U nekim otelotvorenjima, CD40L-specifične monomerne podjedinice Tn3 iz pronalaska sadrže aminokiselinsku sekvencu:

naznačeno time što:

(a) X1predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S) ili leucin (L);

(b) X2predstavlja aminokiselinski ostatak asparaginsku kiselinu (D) ili glutaminsku kiselinu (E);

(c) X3predstavlja aminokiselinski ostatak histidin (H), izoleucin (I), valin (V), fenilalanin (F) ili triptofan (W);

(d) X4predstavlja aminokiselinski ostatak alanin (A), glicin (G), glutaminsku kiselinu (E) ili asparaginsku kiselinu (D);

(e) X5predstavlja aminokiselinski ostatak glutaminsku kiselinu (E), leucin (L), glutamin (Q), serin (S), asparaginsku kiselinu (D) ili asparagin (N);

(f) X6predstavlja aminokiselinski ostatak fenilalanin (F) ili tirozin (Y);

(g) X7predstavlja aminokiselinski ostatak izoleucin (I), valin (V), histidin (H), glutaminsku kiselinu (E) ili asparaginsku kiselinu (D);

(h) X8predstavlja aminokiselinski ostatak glicin (G), triptofan (W) ili valin (V);

(i) X9predstavlja aminokiselinski ostatak triptofan (W), fenilalanin (F) ili tirozin (Y);

(j) X10predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S), glutamin (Q), metionin (M) ili histidin (H); (k) X11predstavlja aminokiselinski ostatak triptofan (W) ili histidin (H); i,

(l) X12predstavlja aminokiselinski ostatak arginin (R) ili serin (S).

[0188] U nekim otelotvorenjima, CD40L-specifične monomerne podjedinice Tn3 iz pronalaska sastoje se od aminokiselinske sekvence:

naznačeno time što:

(a) X1predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S) ili leucin (L);

(b) X2predstavlja aminokiselinski ostatak asparaginsku kiselinu (D) ili glutaminsku kiselinu (E);

(c) X3predstavlja aminokiselinski ostatak histidin (H), izoleucin (I), valin (V), fenilalanin (F) ili triptofan (W);

(d) X4predstavlja aminokiselinski ostatak alanin (A), glicin (G), glutaminsku kiselinu (E) ili asparaginsku kiselinu (D);

(e) X5predstavlja aminokiselinski ostatak glutaminsku kiselinu (E), leucin (L), glutamin (Q), serin (S), asparaginsku kiselinu (D) ili asparagin (N);

(f) X6predstavlja aminokiselinski ostatak fenilalanin (F) ili tirozin (Y);

(g) X7predstavlja aminokiselinski ostatak izoleucin (I), valin (V), histidin (H), glutaminsku kiselinu (E) ili asparaginsku kiselinu (D);

(h) X8predstavlja aminokiselinski ostatak glicin (G), triptofan (W) ili valin (V);

(i) X9predstavlja aminokiselinski ostatak triptofan (W), fenilalanin (F) ili tirozin (Y);

(j) X10predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S), glutamin (Q), metionin (M) ili histidin (H); (k) X11predstavlja aminokiselinski ostatak triptofan (W) ili histidin (H); i,

(l) X12predstavlja aminokiselinski ostatak arginin (R) ili serin (S).

[0189] U nekim aspektima, CD40L-specifična monomerna podjedinica sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 i 82. U nekim aspektima, CD40L-specifična monomerna podjedinica se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 i 82.

[0190] U nekim otelotvorenjima, CD40L-specifične monomerne podjedinice Tn3 iz pronalaska sadrže aminokiselinsku sekvencu:

naznačeno time što:

(a) X1predstavlja aminokiselinski ostatak lizin (K) ili glutaminsku kiselinu (E);

(b) X2predstavlja aminokiselinski ostatak treonin (T) ili izoleucin (I);

(c) X3predstavlja aminokiselinski ostatak asparagin (N) ili alanin (A);

(d) X4predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S), leucin (L), alanin (A), fenilalanin (F) ili tirozin (Y);

(e) X5predstavlja aminokiselinski ostatak tirozin (Y), alanin (A), glicin (G), valin (V), izoleucin (I) ili serin (S);

(f) X6predstavlja aminokiselinski ostatak tirozin (Y), serin (S), alanin (A) ili histidin (H); (g) X7predstavlja aminokiselinski ostatak asparagin (N), asparaginsku kiselinu (D), histidin (H) ili tirozin (Y);

(h) X8predstavlja aminokiselinski ostatak leucin (L), fenilalanin (F), histidin (H) ili tirozin (Y); (i) X9predstavlja aminokiselinski ostatak histidin (H), prolin (P), serin (S), leucin (L) ili asparaginsku kiselinu (D);

(j) X10predstavlja aminokiselinski ostatak glicin (G), fenilalanin (F), histidin (H) ili tirozin (Y); (k) X11predstavlja aminokiselinski ostatak alanin (A) ili treonin (T);

(l) X12predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S), asparagin (N), glutaminsku kiselinu (E), asparagin (R) ili asparaginsku kiselinu (D);

(m) X13predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S), glutamin (Q), treonin (T), asparagin (N) ili alanin (A);

(n) X14predstavlja aminokiselinski ostatak prolin (P), valin (V), izoleucin (I) ili alanin (A) ili nema aminokiseline;

(o) X15predstavlja aminokiselinski ostatak izoleucin (I) ili nema aminokiseline;

(p) X16predstavlja aminokiselinski ostatak glutaminsku kiselinu (E) ili lizin (K); i,

(q) X17predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S) ili asparagin (N).

[0191] U nekim otelotvorenjima, CD40L-specifične monomerne podjedinice Tn3 iz pronalaska sastoje se od aminokiselinske sekvence:

naznačeno time što:

(a) X1predstavlja aminokiselinski ostatak lizin (K) ili glutaminsku kiselinu (E);

(b) X2predstavlja aminokiselinski ostatak treonin (T) ili izoleucin (I);

(c) X3predstavlja aminokiselinski ostatak asparagin (N) ili alanin (A);

(d) X4predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S), leucin (L), alanin (A), fenilalanin (F) ili tirozin (Y);

(e) X5predstavlja aminokiselinski ostatak tirozin (Y), alanin (A), glicin (G), valin (V), izoleucin (I) ili serin (S);

(f) X6predstavlja aminokiselinski ostatak tirozin (Y), serin (S), alanin (A) ili histidin (H); (g) X7predstavlja aminokiselinski ostatak asparagin (N), asparaginsku kiselinu (D), histidin (H) ili tirozin (Y);

(h) X8predstavlja aminokiselinski ostatak leucin (L), fenilalanin (F), histidin (H) ili tirozin (Y);

1

(i) X9predstavlja aminokiselinski ostatak histidin (H), prolin (P), serin (S), leucin (L) ili asparaginsku kiselinu (D);

(j) X10predstavlja aminokiselinski ostatak glicin (G), fenilalanin (F), histidin (H) ili tirozin (Y); (k) X11predstavlja aminokiselinski ostatak alanin (A) ili treonin (T);

(l) X12predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S), asparagin (N), glutaminsku kiselinu (E), asparagin (R) ili asparaginsku kiselinu (D);

(m) X13predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S), glutamin (Q), treonin (T), asparagin (N) ili alanin (A);

(n) X14predstavlja aminokiselinski ostatak prolin (P), valin (V), izoleucin (I) ili alanin (A) ili nema aminokiseline;

(o) X15predstavlja aminokiselinski ostatak izoleucin (I) ili nema aminokiseline;

(p) X16predstavlja aminokiselinski ostatak glutaminsku kiselinu (E) ili lizin (K); i,

(q) X17predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S) ili asparagin (N).

[0192] U nekim otelotvorenjima, CD40L-specifična monomerna konstrukcija sadrži Tn3 modul, naznačeno time što jedan ili više beta lanaca sadrži najmanje jednu supstituciju aminokiseline, osim što cisteinski ostaci u C i F beta lancu (SEQ ID NO: 13 ili 14; i SEQ ID NO: 17, tim redom) ne moraju biti supstituisani.

[0193] Petlje koje povezuju različite beta lance CD40L-specifične monomerne podjedinice mogu biti randomizovane prema razlici po dužini i/ili sekvenci. U jednom otelotvorenju, CD40L-specifična monomerna podjedinica ima najmanje jednu petlju koja je randomizovana prema razlici po dužini i/ili sekvenci. U jednom otelotvorenju, najmanje jedna petlja, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri petlje, najmanje pet ili najmanje šest petlji CD40L-specifične monomerne podjedinice je randomizovano prema razlici po dužini i/ili sekvenci. U jednom otelotvorenju, najmanje jedna petlja CD40L-specifične monomerne podjedinice se održava konstantnom dok je najmanje jedna dodatna petlja randomizovana prema razlici po dužini i/ili sekvenci. U drugom otelotvorenju, najmanje jedna petlja, najmanje dve, ili sve tri petlje AB, CD i EF se održavaju konstantnim, dok su najmanje jedna petlja, najmanje dve, ili sve tri petlje BC, DE i FG randomizovane prema razlici po dužini i/ili sekvenci. U drugom otelotvorenju, najmanje jedna petlja, najmanje dve, ili sve tri petlje AB, CD i EF su randomizovane, dok su najmanje jedna petlja, najmanje dve, ili sve tri petlje BC, DE i FG randomizovane prema razlici po dužini i/ili sekvenci. U daljem otelotvorenju, najmanje jedna petlja, najmanje dve, najmanje

2

tri, najmanje 4 petlje, najmanje pet ili svih šest petlji AB, CD, EF, BC, DE i FG su randomizovane prema razlici po dužini i/ili sekvenci.

[0194] U nekim otelotvorenjima, jedan ili više ostataka u petlji se održavaju konstantnim, dok su ostali ostaci randomizovani prema razlici po dužini i/ili sekvenci. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više ostataka u petlji se održavaju na prethodno određenom i ograničenom broju aminokiselina, dok su ostali ostaci randomizovani prema razlici po dužini i/ili sekvenci. Prema tome, CD40L-specifična monomerna podjedinica iz pronalaska može da sadrži jednu ili više petlji koje imaju degenerisanu sekvencu konsenzusa i/ili jedan ili više nepromenljivih ostataka aminokiselina.

[0195] U jednom otelotvorenju, CD40L-specifična monomerna podjedinica iz pronalaska sadrži AB petlju koja je randomizovana. U drugom otelotvorenju, CD40L-specifična monomerna podjedinica iz pronalaska sadrži BC petlju koja je randomizovana. U jednom otelotvorenju, CD40L-specifična monomerna podjedinica iz pronalaska sadrži CD petlju koja je randomizovana. U jednom otelotvorenju, CD40L-specifična monomerna podjedinica iz pronalaska sadrži DE petlju koja je randomizovana. U jednom otelotvorenju, CD40L-specifična monomerna podjedinica iz pronalaska sadrži EF petlju koja je randomizovana.

[0196] U nekim otelotvorenjima, CD40L-specifična monomerna podjedinica iz pronalaska sadrži FG petlju koja se održava da bude najmanje jedan aminokiselinski ostatak kraća od srodne FG petlje trećeg FnIII domena humanog tenascina C i dalje je randomizovana na jednoj ili više pozicija.

[0197] U specifičnim otelotvorenjima, najmanje jedna od petlji BC, DE i FG je randomizovana, naznačeno time što beta lanac A sadrži SEQ ID NO:10 ili 11, beta lanac B sadrži SEQ ID NO:12, beta lanac C sadrži SEQ ID NO:13 ili 14, beta lanac D sadrži SEQ ID NO:15, beta lanac E sadrži SEQ ID NO:16, beta lanac F sadrži SEQ ID NO:17, i beta lanac G sadrži SEQ ID NO:18, AB petlja sadrži SEQ ID NO:4 ili 136, CD petlja sadrži SEQ ID NO:6, i EF petlja sadrži SEQ ID NO:8 ili 137.

[0198] U drugim specifičnim otelotvorenjima, najmanje jedna od petlji AB, CD i EF je randomizovana, naznačeno time što beta lanac A sadrži SEQ ID NO:10 ili 11, beta lanac B sadrži SEQ ID NO:12, beta lanac C sadrži SEQ ID NO:13 ili 14, beta lanac D sadrži SEQ ID NO:15, beta lanac E sadrži SEQ ID NO:16, beta lanac F sadrži SEQ ID NO:17, i beta lanac G sadrži SEQ ID NO:18, BC petlja sadrži SEQ ID NO:5, DE petlja sadrži SEQ ID NO:7, i FG petlja sadrži SEQ ID NO:9 ili 139.

Povećana stabilnost konstrukcije

[0199] Stabilnost Tn3 konstrukcija iz pronalaska može biti povećana na više različitih načina. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu da se stabilizuju produžavanjem N- i/ili C-terminalnih regiona. N- i/ili C-terminalni regioni mogu biti produženi za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 aminokiselina. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu da se stabilizuju uvođenjem izmene koja produžava poluživot u serumu, kao što je ovde opisano. U još jednom otelotvorenju, Tn3 konstrukcije iz pronalaska sadrže adiciju, deleciju ili supstituciju najmanje jednog aminokiselinskog ostatka da bi se stabilizovalo hidrofobno jezgro konstrukcije.

[0200] Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu delotvorno da se stabilizuju dizajniranjem neprirodnih disulfidnih veza, kao što je objavljeno u Internacionalnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2011/032184. U nekim otelotvorenjima, konstrukcije iz pronalaska sadrže neprirodne disulfidne veze, kao što je opisano u PCT prijavi br: WO 2009/058379. Može se koristiti bioinformatički pristup da bi se identifikovale pozicije kandidati pogodne za dizajniranje disulfidnih veza.

[0201] U jednom otelotvorenju, Tn3 monomerna podjedinica iz pronalaska sadrži najmanje jednu, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri ili najmanje pet neprirodnih intramolekulskih disulfidnih veza. U jednom otelotvorenju, Tn3 monomerna podjedinica iz pronalaska sadrži najmanje jednu neprirodnu intramolekulsku disulfidnu vezu, naznačeno time što pomenuta najmanje jedna neprirodna disulfidna veza stabilizuje monomer. U još jednom otelotvorenju, Tn3 konstrukcije iz pronalaska sadrže najmanje jednu neprirodnu disulfidnu vezu, naznačeno time što se veza nalazi između dve posebne monomerne ili multimerne Tn3 konstrukcije, tj. disulfidna veza je intermolekulska disulfidna veza. Na primer, disulfidna veza može da povezuje posebne konstrukcije (na primer, dve CD40L-specifične monomerne konstrukcije), Tn3 konstrukciju i linker, Tn3 konstrukciju i Fc domen, ili Tn3 konstrukciju i antitelo ili njegov fragment.

4

[0202] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska sadrže najmanje jednu neprirodnu intermolekulsku disulfidnu vezu koja povezuje Tn3 monomernu podjedinicu i izolovani heterologni ostatak, Tn3 monomernu podjedinicu i heterologni ostatak fuzionisan ili konjugovan sa istom Tn3 konstrukcijom, ili Tn3 monomernu podjedinicu i heterologni ostatak fuzionisan ili konjugovan sa istom ili različitom Tn3 konstrukcijom.

[0203] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska sadrže disulfidnu vezu koja gradi Tn3 multimernu podjedinicu od najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4 ili više monomernih podjedinica.

[0204] U drugom otelotvorenju, Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu da sadrže produžetak N-i/ili C-terminalnih regiona. U jednom otelotvorenju, Tn3 konstrukcija iz pronalaska sadrži izmenu koja produžava poluživot u serumu, kao što je ovde opisano. U još jednom otelotvorenju, konstrukcije iz pronalaska sadrže adiciju, deleciju ili supstituciju najmanje jednog aminokiselinskog ostatka da bi se stabilizovalo hidrofobno jezgro konstrukcije.

Merenje stabilnosti

[0205] Stabilnost monomernih podjedinica Tn3 iz pronalaska, izolovanih ili kao deo multimerne Tn3 konstrukcije, može se lako odrediti tehnikama poznatim u struci, kao što su toplotna (Tm) i haotropna denaturacija (kao što je tretiranje ureom, ili solima guanidina), tretiranje proteazom (kao što je tretiranje termolizinom) ili druga metodologija prihvaćena u struci za određivanje stabilnosti proteina. Opširan pregled tehnika koje se koriste za određivanje stabilnosti proteina može se naći, na primer, u „Current Protocols in Molecular Biology“ i „"Current Protocols in Protein Science“ kompanije John Wiley and Sons. 2007.

Multimerne Tn3 konstrukcije

[0206] Jedan aspekt predmetnog pronalaska obezbeđuje multimerne Tn3 konstrukcije koje sadrže najmanje dve monomerne podjedinice Tn3 iz pronalaska spojene u tandem, i naznačene time što je najmanje jedan od monomera CD40L-specifična monomerna podjedinica. Takve multimerne Tn3 konstrukcije mogu da budu sklopljene u više formata. U specifičnom aspektu, pronalazak obezbeđuje multimerne Tn3 konstrukcije, naznačene time što su najmanje dve CD40L-specifične monomerne podjedinice povezane u tandem preko peptidnog linkera. U nekim otelotvorenjima, multimerna Tn3 konstrukcija pokazuje porast valence i/ili aviditeta vezivanja cilja, ili druge akcije cilj(ev)a. U nekim otelotvorenjima, porast valence i/ili aviditeta vezivanja cilja se postiže kada se više monomernih podjedinica veže za isti cilj. U nekim otelotvorenjima, porast valence poboljšava specifično delovanje na cilj, kao što je povećanje dimerizacije ciljnog proteina.

[0207] U specifičnom otelotvorenju, multimerna Tn3 konstrukcija iz pronalaska sadrži najmanje dve CD40L-specifične monomerne podjedinice povezane u tandem, naznačeno time što svaka CD40L-specifična monomerna podjedinica vezuje najmanje jedan cilj, i naznačeno time što svaka CD40L-specifična monomerna podjedinica sadrži veći broj beta lanaca povezanih sa većim brojem regiona petlje, naznačeno time što najmanje jedna podjedinica je neprirodna varijanta srodne petlje u matičnoj Tn3 konstrukciji (SEQ ID NO: 3).

[0208] U jednom otelotvorenju, multimerne Tn3 konstrukcije se dobijaju putem kovalentne veze između CD40L-specifičnih monomernih podjedinica, na primer, direktnim vezivanjem CD40L-specifičnih monomernih podjedinica, ili uključivanjem linkera, npr., peptidnog linkera. U konkretnim primerima, kovalentno vezane Tn3 konstrukcije se dobijaju konstruisanjem fuzionih gena koji kodiraju CD40L-specifične monomerne podjedinice ili, alternativno, dizajniranjem kodona za cisteinske ostatke u CD40L-specifičnim monomernim podjedinicama i dopuštanjem da se formira disulfidna veza između proizvoda ekspresije.

[0209] U jednom otelotvorenju, multimerne Tn3 konstrukcije iz pronalaska sadrže najmanje dve CD40L-specifične monomerne podjedinice koje su direktno međusobno povezane bez dodatnih uključenih aminokiselina. U drugom otelotvorenju, multimerne Tn3 konstrukcije iz pronalaska sadrže najmanje dve CD40L-specifične monomerne podjedinice koje su povezane u tandem putem linkera, npr. peptidnog linkera.

[0210] U specifičnom otelotvorenju, multimerne Tn3 konstrukcije iz pronalaska sadrže najmanje dve CD40L-specifične monomerne podjedinice koje su povezane u tandem putem peptidnog linkera, naznačeno time što peptidni linker sadrži 1 do oko 1000, ili 1 do oko 500, ili 1 do oko 250, ili 1 do oko 100, ili 1 do oko 50, ili 1 do oko 25, aminokiselina. U specifičnom otelotvorenju, multimerna Tn3 konstrukcija sadrži najmanje dve CD40L-specifične monomerne podjedinice koje su povezane u tandem putem peptidnog linkera, naznačeno time što peptidni linker sadrži 1 do oko 20, ili 1 do oko 15, ili 1 do oko 10, ili 1 do oko 5, aminokiselina.

[0211] U specifičnom otelotvorenju, multimerna Tn3 konstrukcija sadrži najmanje dve CD40L-specifične monomerne podjedinice koje su povezane u tandem putem linkera, npr. peptidnog linkera, naznačeno time što je linker funkcionalni ostatak. Funkcionalni ostatak će biti odabran na osnovu željene funkcije i/ili karakteristika multimerne Tn3 konstrukcije. Na primer, funkcionalni ostatak koristan za prečišćavanje (npr. histidinska oznaka) može da se koristi kao linker. Funkcionalni ostaci korisni kao linkeri uključuju, bez ograničenja, polietilen glikol (PEG), citotoksični agens, radioizotop, agens za snimanje, biotin, dimerizacioni domen, albumin iz humanog seruma (HSA) ili njegov FcRn vezujući deo, domen ili fragment antitela, jednolančano antitelo, domen antitela, albumin vezujući domen, molekul IgG, enzim, ligand, receptor, vezujući peptid, ne-Tn3 konstrukciju, oznaku epitopa, polimer rekombinantnog polipeptida, citokin i slično. Specifični peptidni linkeri i funkcionalni ostaci koji se mogu koristiti kao linkeri objavljeni su u nastavku.

[0212] U specifičnim otelotvorenjima, funkcionalni ostatak je imunoglobulin ili njegov fragment. U nekim otelotvorenjima, imunoglobulin ili njegov fragment sadrži Fc domen. U nekim otelotvorenjima, Fc domen ne uspeva da indukuje najmanje jednu FcyR-posredovanu efektorsku funkciju, kao što je ADCC (ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela). U struci je poznato da Fc domen može biti izmenjen tako da redukuje ili eliminiše najmanje jednu FcyR-posredovanu efektorsku funkciju, vidite, na primer, U.S. Pat. br.5,624,821 i 6,737,056.

[0213] U nekim otelotvorenjima, multimerna Tn3 konstrukcija sadrži najmanje dve CD40L-specifične monomerne podjedinice koje su povezane putem jednog ili više linkera, naznačeno time što linkeri umetnuti između svake CD40L-specifične monomerne podjedinice mogu biti isti linkeri ili različiti linkeri. U nekim otelotvorenjima, linker može da sadrži više linkera, koji mogu biti isti linker ili različiti linkeri. U nekim otelotvorenjima, kada je povezano više linkera, neki ili svi linkeri mogu biti funkcionalni ostaci.

Stehiometrija vezivanja konstrukcije

[0214] U nekim otelotvorenjima, monomerna ili multimerna Tn3 konstrukcija može da sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu specifičnu za različite epitope, koji mogu biti različiti epitopi na jednom molekulu CD40L ili na različitim ciljnim molekulima CD40L. U nekim otelotvorenjima, multimerna Tn3 konstrukcija može da sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu, naznačeno time što svaka podjedinica cilja jedan ili više različitih epitopa na jednom ili više molekula CD40L.

[0215] U drugim otelotvorenjima, monomerna ili multimerna Tn3 konstrukcija može da veže dva ili više različitih epitopa na istom molekulu CD40L. U nekim otelotvorenjima, različiti epitopi su nepreklapajući epitopi. U drugim otelotvorenjima, različiti epitopi su preklapajući epitopi.

[0216] U još jednom otelotvorenju, monomerna ili multimerna Tn3 konstrukcija može da veže jedan ili više epitopa na molekulu CD40L i dodatno da veže jedan ili više epitopa na drugom molekulu CD40L. U nekim otelotvorenjima, različiti ciljni molekuli su deo oligomernog kompleksa, npr. trimernog kompleksa CD40L.

[0217] U još jednom specifičnom otelotvorenju, monomerna ili multimerna Tn3 konstrukcija može da se veže za jedan epitop na CD40L trimeru. U još jednom otelotvorenju, monomerna ili multimerna Tn3 konstrukcija može da se veže za isti epitop na najmanje dva CD40L trimera.

[0218] U nekim otelotvorenjima, monomerna ili multimerna Tn3 konstrukcija može da se veže za isti epitop na dve ili više kopija molekula CD40L na površini susedne ćelije. U nekim otelotvorenjima, monomerna ili multimerna Tn3 konstrukcija može da se veže za isti epitop na dve ili više kopija molekula CD40L u rastvoru. U nekim otelotvorenjima, monomerna ili multimerna Tn3 konstrukcija može da se veže za isti epitop ii različite epitope na CD40L sa istim ili različitim afinitetom vezivanja i/ili aviditetom.

[0219] U drugom otelotvorenju, monomerne ili multimerne Tn3 konstrukcije mogu da se vežu za epitope na jednoj ili više kopija CD40L i postignu ili poboljšaju (npr. sinergistički) željeno dejstvo na cilj, npr. da spreče vezivanje za receptor ili da spreče oligomerizaciju.

[0220] Pored toga, kada monomerna ili multimerna Tn3 konstrukcija iz ponalaska sadrži više CD40L-specifičnih monomernih podjedinica, npr. različite monomere, naznačene time što svaki monomer cilja različite epitope na CD40L, takve monomerne podjedinice mogu da se rasporede prema nekom šablonu ili posebnoj orijentaciji da bi se postigao ili povećao neki biološki efekat. Takve kombinacije monomernih podjedinica mogu da se sklope i zatim procene koristeći metode poznate u struci.

Fuzije

[0221] Pronalazak obezbeđuje Tn3 konstrukcije kod kojih najmanje jedna CD40L-specifična monomerna podjedinica može biti fuzionisana sa heterolognim ostatkom. U ovom kontekstu, heterologni ostatak se ne koristi da poveže konstrukcije kao spejser, već može da obezbedi dodatnu funkcionalnost Tn3 konstrukciji. U nekim otelotvorenjima, heterologni ostatak takođe može imati funkciju linkera. Predmetni pronalazak obuhvata upotrebu Tn3 konstrukcija konjugovanih ili fuzionisanih sa jednim ili više heterolognih ostataka, uključujući, bez ograničenja, peptide, polipeptide, proteine, fuzione proteine, molekule nukleinske kiseline, male molekule, mimetike, sintetske lekove, neorganske molekule i organske molekule. Prema tome, pronalazak takođe obezbeđuje polipeptide koji sadrže jedan ili više CD40L-specifičnih Tn3 monomera, uključujući, bez ograničenja, ovde opisane fuzione proteine.

[0222] Predmetni pronalazak obuhvata upotrebu Tn3 konstrukcija rekombinantno fuzionisanih ili hemijski konjugovanih sa heterolognim proteinom ili polipeptidom ili njegovim fragmentom. Konjugacija uključuje kovalentnu i nekovalentnu konjugaciju. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija može biti fuzionisana ili hemijski vezana sa polipeptidom koji ima najmanje 10, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 40, najmanje 50, najmanje 60, najmanje 70, najmanje 80, najmanje 90, najmanje 100, najmanje 200, najmanje 300, najmanje 500, ili najmanje 1000 aminokiselina) da bi se dobili fuzioni proteini.

[0223] Fuzija ili konjugacija Tn3 konstrukcije sa jednim ili više heterolognih ostataka može biti direktna, tj. bez linkera umetnutog između Tn3 konstrukcije i heterolognog ostatka, ili preko jedne ili više ovde opisanih sekvenci linkera. U nekim otelotvorenjima, konstrukcije mogu da se koriste za ciljanje heterolognih polipeptida za posebne vrste ćelija, bilo in vitro ili in vivo, fuzionisanjem ili konjugacijom Tn3 konstrukcija sa antitelima specifičnim za konkretne površinske ćelijske receptore u ciljnoj ćeliji.

[0224] Tn3 konstrukcije fuzionisane ili konjugovane sa heterolognim polipeptidima takođe mogu da se koriste u in vitro imunotestovima i metodama prečišćavanja koristeći metode poznate u struci. Vidite, na primer, Internacionalnu publikaciju br. WO 93/21232; Evropski patent br. EP 439,095; Naramura et al., Immunol. Lett.39:91-99, 1994; U.S. Pat. br.5,474,981; Gillies et al., PNAS 89:1428-1432, 1992; i Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452, 1991.

[0225] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije mogu biti integrisane sa humanim imunskim odgovorom fuzionisanjem ili konjugacijom konstrukcija sa imunoglobulinom ili njegovim domenom, uključujući, bez ograničenja, konstantni region IgG (Fc), npr. preko N ili C-terminusa. Slično tome, fuzija između Tn3 konstrukcije i proteina komplementa, kao što je CIq, može da se koristi za ciljanje ćelija.

[0226] Razne publikacije opisuju metode za dobijanje fiziološki aktivnih molekula čiji poluživot je modifikovan uvođenjem FcRn-vezujućih polipeptida u molekul (vidite, npr. WO 97/43316; U.S. Pat. br. 5,869,046; U.S. Pat. br. 5,747,035; WO 96/32478; i WO 91/14438), fuzionisanjem molekula sa antitelima čiji FcRn-vezujući afinitet je sačuvan, ali je afinitet prema drugim Fc receptorima veoma smanjen (vidite, npr. WO 99/43713), ili fuzionisanjem molekula sa FcRn vezujućim domenima antitela (vidite, npr. WO 00/09560; U.S. Pat. No.

4,703,039). Specifične tehnike i metode za povećanje poluživota fiziološki aktivnih molekula mogu se takođe naći u U.S. patentu br.7,083,784. Posebno, razmatra se da Tn3 konstrukcije mogu biti fuzionisane sa Fc regionom IgG, naznačeno time što Fc region sadrži mutacije aminokiselinskog ostatka M252Y/S254T/T256E ili H433K/N434F/Y436H, naznačeno time što su pozicije aminokiselina označene prema Kabatovoj šemi numeracije. Posebno se razmatra fuzija Tn3 konstrukcije sa varijantom Fc domena koja ne može da indukuje ADCC.

[0227] U nekim otelotvorenjima, poluživot Tn3 konstrukcija može da se poveća genetskom fuzijom Tn3 konstrukcije sa suštinski nestrukturisanim rekombinantnim polipeptidom (npr. XTEN™ polipeptidom) ili konjugacijom sa polietilen glikolom (PEG).

[0228] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija može biti fuzionisana sa molekulima koji povećavaju ili produžavaju poluživot in vivo ili u serumu. U nekim otelotvorenjima, konstrukcija može biti fuzionisana ili konjugovana sa albuminom, kao što je albumin iz humanog seruma (HSA), neonatalnim Fc receptorom (FcRn), njegovim vezujućim fragmentom, PEG, polisaharidima, antitelima, komplementom, hemoglobinom, vezujućim peptidom, lipoproteinima i drugim faktorima koji povećavaju njen poluživot u krvotoku i/ili prodiranje u tkivo. Svaka od ovih fuzija može biti generisana standardnim tehnikama, na primer, ekspresijom fuzionog proteina iz rekombinantnog fuzionog gena konstruisanog koristeći javno dostupne sekvence gena.

[0229] U nekim otelotvorenjima, svojstvo Tn3 konstrukcije može biti poboljšano konjugacijom ili fuzijom sa varijantom HSA, tj. molekulom izvedenim iz HSA pune dužine (SEQ ID NO: 139) koji sadrži najmanje supstituciju, deleciju, ili skraćivanje sekvence aminokiseline.

[0230] U nekim otelotvorenjima, svojstvo poboljšano konjugacijom sa varijantom HSA je poluživot u plazmi. Poboljšanje poluživota Tn3 konstrukcije u plazmi može biti izmena tog svojstva, kao što je produženje ili skraćenje poluživota u plazmi, ili promene drugih farmakokinetičkih parametara. U nekim otelotvorenjima, varijanta HSA je mutant izveden iz HSA pune dužine (SEQ ID NO: 138). U specifičnom otelotvorenju, varijanta HSA sadrži supstituciju cisteina na poziciji 34 serinom (SEQ ID NO: 133). Varijante HSA koje se mogu koristiti za modifikovanje poluživota Tn3 konstrukcije u plazmi opisane su, npr. u Internacionalnim publikacijama WO 2011/103076 i WO 2011/051489. U nekim otelotvorenjima, poluživot Tn3 konstrukcije u plazmi je produžen njenom fuzijom sa varijantom HSA koja sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u domenu III HSA.

[0231] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija iz pronalaska sadrži varijantu HSA koja sadrži sekvencu zrelog HSA pune dužine (SEQ ID NO: 138) ili njegov fragment, osim najmanje jedne aminokiselinske supstitucije, numerisane u odnosu na poziciju u zrelom HSA pune dužine, na poziciji odabranoj iz grupe koja se sastoji od 407, 415, 463, 500, 506, 508, 509, 511, 512, 515, 516, 521, 523, 524, 526, 535, 550, 557, 573, 574 i 580; naznačeno time što najmanje jedna aminokiselinska supstitucija ne uključuje lizin (K) u glutaminsku kiselinu (E) na poziciji 573, i naznačeno time što Tn3 konstrukcija ima poluživot u plazmi duži od poluživota u plazmi Tn3 konstrukcije koja nije konjugovana sa varijantom HSA.

[0232] U nekim drugim otelotvorenjima, najmanje jedna aminokiselinska supstitucija, numerisana u odnosu na poziciju u zrelom HSA pune dužine, nalazi se na poziciji odabranoj iz grupe koja se sastoji od 463, 508, 523 i 524, naznačeno time što Tn3 konstrukcija ima poluživot u plazmi duži od poluživota u plazmi Tn3 konstrukcije koja nije konjugovana sa varijantom HSA.

[0233] U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija iz pronalaska sadrži varijantu HSA koja sadrži sekvencu zrelog HSA pune dužine (SEQ ID NO: 133 ili 138) ili njegovog fragmenta, osim najmanje jedne aminokiselinske supstitucije, numerisane u odnosu na poziciju u zrelom HSA pune dužine, odabrane iz grupe koja se sastoji od:

(a) supstitucije leucina (L) na poziciji 407 asparaginom (N) ili tirozinom (Y);

1

(b) supstitucije valina (V) na poziciji 415 treoninom (T);

(c) supstitucije leucina (L) na poziciji 463 asparaginom (N);

(d) supstitucije lizina (K) na poziciji 500 argininom (R);

(e) supstitucije treonina (T) na poziciji 506 tirozinom (Y);

(f) supstitucije treonina (T) na poziciji 508 argininom (R);

(g) supstitucije fenilalanina (F) na poziciji 509 metioninom (M) ili triptofanom (W);

(h) supstitucije alanina (A) na poziciji 511 fenilalaninom (F);

(i) supstitucije asparaginske kiseline (D) na poziciji 512 tirozinom (Y);

(j) supstitucije treonina (T) na poziciji 515 glutaminom (Q);

(k) supstitucije leucina (L) na poziciji 516 treoninom (T) ili triptofanom (W);

(l) supstitucije arginina (R) na poziciji 521 triptofanom (W);

(m) supstitucije izoleucina (I) na poziciji 523 asparaginskom kiselinom (D), glutaminskom kiselinom (E), glicinom (G), lizinom (K), ili argininom (R);

(n) supstitucije lizina (K) na poziciji 524 leucinom (L);

(o) supstitucije glutamina (Q) na poziciji 526 metioninom (M);

(p) supstitucije histidina (H) na poziciji 535 prolinom (P);

(q) supstitucije asparaginske kiseline (D) na poziciji 550 glutaminskom kiselinom (E);

(r) supstitucije lizina (K) na poziciji 557 glicinom (G);

(s) supstitucije lizina (K) na poziciji 573 fenilalaninom (F), histidinom (H), prolinom (P), triptofanom (W), ili tirozinom (Y);

(t) supstitucije lizina (K) na poziciji 574 asparaginom (N);

(u) supstitucije glutamina (Q) na poziciji 580 lizinom (K); i,

(v) kombinacije dve ili više pomenutih supstitucija,

naznačeno time što pomenuta Tn3 konstrukcija ima poluživot u plazmi duži od poluživota u plazmi Tn3 konstrukcije koja nije konjugovana sa pomenutom varijantom HSA.

[0234] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija sadrži varijantu HSA koja sadrži sekvencu zrelog HSA pune dužine (SEQ ID NO: 133 ili 138) ili njegovog fragmenta, osim najmanje jedne aminokiselinske supstitucije, numerisane u odnosu na poziciju u zrelom HSA pune dužine, odabrane iz grupe koja se sastoji od:

(a) supstitucije leucina (L) na poziciji 463 asparaginom (N);

(b) supstitucije treonina (T) na poziciji 508 argininom (R);

(c) supstitucije izoleucina (I) na poziciji 523 asparaginskom kiselinom (D), glutaminskom kiselinom (E), glicinom (G), lizinom (K), ili argininom (R);

2

(d) supstitucije lizina (K) na poziciji 524 leucinom (L); i,

(e) kombinacije dve ili više pomenutih supstitucija,

naznačeno time što pomenuta Tn3 konstrukcija ima poluživot u plazmi duži od poluživota u plazmi Tn3 konstrukcije koja nije konjugovana sa pomenutom varijantom HSA.

[0235] Pored toga, Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu da se fuzionišu sa sekvencama markera, kao što su peptidi, radi olakšavanja prečišćavanja. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinska sekvenca marker je polihistidinski peptid (his-oznaka), npr. oktahistidinska oznaka (His-8-oznaka) ili heksahistidinska oznaka (His-6-oznaka) kao što je oznaka obezbeđena u pQE ekspresionom vektoru (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif, 91311), između ostalih vektora, od kojih su mnogi komercijalno dostupni. Kao što su, na primer, opisali Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, 1989, polihistidin obezbeđuje pogodno prečišćavanje fuzionog proteina. Druge peptidne oznake korisne za prečišćavanje uključuju, bez ograničenja, hemaglutininsku oznaku („HA“), koja odgovara epitopu izvedenom iz proteina hemaglutinina influence (vidite, npr. Wilson et al., Cell 37:767, 1984), FLAG oznaku, strep-oznaku, myc-oznaku, V5 oznaku, GFP-oznaku, AU1-oznaku, AU5-oznaku, ECS-oznaku, GST-oznaku, ili OLLAS oznaku.

[0236] Dodatni fuzioni proteini koji sadrže Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu da se dobiju tehnikama mešanja gena, mešanja motiva, mešanja egzona i/ili mešanja kodona (jednim imenom se zovu „mešanje DNK“).

[0237] Mešanje DNK može da se koristi da se izmeni dejstvo Tn3 konstrukcija na cilj (npr. dobijanje konstrukcija sa većim afinitetom i manjom brzinom disocijacije). Tn3 konstrukcije mogu da se izmene nasumičnom mutagenezom pomoću PCR sklone greškama, nasumičnim umetanjem nukleotida, ili drugim metodama pre rekombinacije. Jedan ili više delova polinukleotida koji kodiraju konstrukciju, koja se vezuje za specifičan cilj mogu da se rekombinuju sa jednom ili više komponenata, motiva, odeljaka, delova, domena, fragmenata, itd. jednog ili više heterolognih molekula.

Fuzije antitela i Fc domena

[0238] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija iz pronalaska sadrži CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu fuzionisanu sa domenom ili fragmentom antitela (npr. IgG), uključujući, bez ograničenja, Fc domen.

[0239] U nekim otelotvorenjima, samo jedna CD40L-specifična monomerna podjedinica je konjugovana ili fuzionisana sa domenom ili fragmentom antitela. Na primer, jedna CD40L-specifična monomerna podjedinica može biti fuzionisana sa N-terminusom polipeptida domena ili fragmenta antitela (npr. teškog lanca ili lakog lanca antitela). U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije se dobijaju fuzionisanjem ili konjugovanjem jedne ili više CD40L-specifičnih monomernih podjedinica sa N-terminusom i/ili C-terminusom polipeptida domena ili fragmenta antitela (npr. teškog lanca i/ili lakog lanca antitela, ili Fc domena).

[0240] U nekim otelotvorenjima, neke ili sve CD40L-specifične monomerne podjedinice fuzionisane sa domenom ili fragmentom antitela su identične. U nekim drugim otelotvorenjima, neke ili sve CD40L-specifične monomerne podjedinice fuzionisane sa domenom ili fragmentom antitela su različite.

[0241] U specifičnom otelotvorenju, Tn3 konstrukcija iz pronalaska sadrži jednu CD40L-specifičnu monomernu podjedinicu fuzionisanu sa Fc domenom. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija iz pronalaska sadrži najmanje dve različite CD40L-specifične monomerne podjedinice fuzionisane sa Fc domenom. U jednom specifičnom otelotvorenju, dve CD40L-specifične monomerne podjedinice fuzionisane sa Fc domenom su identične. U jednom specifičnom otelotvorenju, dve CD40L-specifične monomerne podjedinice fuzionisane sa Fc domenom su različite. U jednom specifičnom otelotvorenju, dve CD40L-specifične monomerne podjedinice fuzionisane sa Fc domenom su međusobno povezane u tandem, i jedna od CD40L-specifičnih monomernih podjedinica je fuzionisana sa Fc domenom.

[0242] U nekim otelotvorenjima, različite Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu biti dimerizovane upotrebom mutacija Fc domena koje favorizuju formiranje heterodimera. U struci je poznato da varijante Fc regiona (npr. aminokiselinske supstitucije i/ili adicije i/ili delecije) povećavaju ili smanjuju efektorsku funkciju antitela i mogu da izmene farmakokinetička svojstva (npr. poluživot) antitela. Tako, u nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska sadrže Fc domen(e) koji sadrži(e) izmenjeni Fc region u kome je napravljena jedna ili više izmena u Fc regionu da bi se promenila funkcionalna i/ili farmakokinetička svojstva Tn3 konstrukcije. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska sadrže Fc domen(e) koji sadrži(e) izmenjeni Fc region u kome je napravljena jedna

4

ili više izmena u Fc regionu da bi se smanjila ili eliminisala najmanje jedna FcR-posredovana efektorska funkcija.

[0243] Takođe je poznato da glikozilacija Fc regiona može biti modifikovana da se poveća ili smanji efektorska funkcija i/ili antiinflamatorna aktivnost. Prema tome, u jednom otelotvorenju, Tn3 konstrukcija iz pronalaska sadrži Fc region sa izmenjenom glikozilacijom aminokiselinskih ostataka da bi se izmenila citotoksična i/ili antiinflamatorna svojstva Tn3 konstrukcija.

Topologija Tn3 konstrukcija

[0244] Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu biti fuzionisane sa C-terminusom Fc domena, lakim lancima antitela, i teškim lancima antitela u svakom pogodnom prostornom rasporedu. Vidite, npr. detaljan opis razmatranih topologija konstrukcija u Internacionalnoj publikaciji PCT/US2011/032184.

Dobijanje konstrukcija iz pronalaska

[0245] Ovde opisane Tn3 konstrukcije mogu da se koriste u svakoj tehnici za razvijanje novih ili poboljšanih ciljnih vezujućih proteina. U jednom posebnom primeru, cilj je imobilisan na čvrstoj podlozi, kao što je smola za kolonu ili bunarčić mikrotitarske ploče, i cilj je doveden u kontakt sa bibliotekom vezujućih proteina na bazi konstrukcija kandidata. Takva biblioteka može da se sastoji od klonova konstruisanih od Tn3 konstrukcije, putem randomizacije sekvence i/ili dužine petlji nalik na CDR.

[0246] U tom pogledu, prikaz bakteriofaga (faga) je dobro poznata tehnika koja omogućava da se pretraže velike biblioteke oligopeptida da bi se prepoznali članovi tih biblioteka koji mogu specifično da se vežu za cilj. Prikaz faga je tehnika kojom se varijantni polipeptidi prikazuju kao fuzioni proteini na proteinu omotača na površini čestica bakteriofaga (Scott, J. K. and Smith, G. P. (1990) Science 249: 386). Može se primeniti bioinformatički pristup da se odredi dužina petlje i poželjna raznovrsnost prirodnih FnIII domena. Primenom ove analize, poželjne dužine petlje i raznovrsnost sekvence mogu da se koriste da se razvije pristup „ograničene randomizacije“. U ovoj ograničenoj randomizaciji, relativna dužina petlje i poželjne sekvence su uključene u razvoj strategije biblioteke. Integrisanje dužine petlje i analize raznovrsnosti sekvence u razvoj biblioteke dovodi do ograničene randomizacije (tj. ograničene su neke pozicije u randomizovanoj petlji u tome koja aminokiselina može da se nalazi u toj poziciji).

[0247] Pronalazak takođe obezbeđuje rekombinantne biblioteke koje sadrže različite populacije neprirodnih Tn3 konstrukcija. U jednom otelotvorenju, biblioteke sadrže neprirodne Tn3 konstrukcije koje sadrže više domena beta lanca povezanih sa više regiona petlje, naznačeno time što se jedna ili više pomenutih petlji razlikuje po deleciji, supstituciji ili adiciji najmanje jedne aminokiseline. U specifičnom otelotvorenju, biblioteke sadrže Tn3 konstrukcije izvedene iz Tn3 konstrukcija divljeg tipa.

[0248] Kao što je gore detaljno opisano, petlje koje povezuju različite beta lance konstrukcija mogu biti randomizovane prema dužini i/ili raznovrsnosti sekvence. U jednom otelotvorenju, biblioteke iz pronalaska sadrže Tn3 konstrukcije koje imaju najmanje jednu petlju koja je randomizovana prema dužini i/ili raznovrsnosti sekvence. U jednom otelotvorenju, najmanje jedna petlja, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri petlje, najmanje pet ili najmanje šest petlji Tn3 konstrukcije je randomizovano prema razlici po dužini i/ili sekvenci. U jednom otelotvorenju, najmanje jedna petlja se održava konstantnom dok je najmanje jedna dodatna petlja randomizovana prema razlici po dužini i/ili sekvenci. U drugom otelotvorenju, najmanje jedna petlja, najmanje dve, ili sve tri petlje AB, CD i EF se održavaju konstantnim, dok su najmanje jedna petlja, najmanje dve, ili sve tri petlje BC, DE i FG randomizovane prema razlici po dužini i/ili sekvenci. U drugom otelotvorenju, najmanje jedna petlja, najmanje dve, ili sve tri petlje AB, CD i EF su randomizovane, dok su najmanje jedna petlja, najmanje dve, ili sve tri petlje BC, DE i FG randomizovane prema razlici po dužini i/ili sekvenci.

[0249] U specifičnom otelotvorenju, biblioteke iz pronalaska sadrže FnIII konstrukcije, naznačene time što A beta lanac sadrži SEQ ID NO: 10 ili 11, B beta lanac sadrži SEQ ID NO: 12, C beta lanac sadrži SEQ ID NO: 13 ili 14, D beta lanac sadrži SEQ ID NO: 15, E beta lanac sadrži SEQ ID NO: 16, F beta lanac sadrži SEQ ID NO: 17, i G beta lanac sadrži SEQ ID NO: 18.

[0250] U specifičnom otelotvorenju, biblioteke iz pronalaska sadrže FnIII konstrukcije, naznačene time što se A beta lanac sastoji od SEQ ID NO: 10 ili 11, B beta lanac se sastoji od SEQ ID NO: 12, C beta lanac se sastoji od SEQ ID NO: 13 ili 14, D beta lanac se sastoji od SEQ ID NO: 15, E beta lanac se sastoji od SEQ ID NO: 16, F beta lanac se sastoji od SEQ ID NO: 17, i G beta lanac se sastoji od SEQ ID NO: 18.

[0251] U specifičnom otelotvorenju, biblioteke iz pronalaska sadrže FnIII konstrukcije, naznačene time što se A beta lanac suštinski sastoji od SEQ ID NO: 10 ili 11, B beta lanac se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 12, C beta lanac se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 13 ili 14, D beta lanac se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 15, E beta lanac se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 16, F beta lanac se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 17, i G beta lanac se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 18.

[0252] Kao što je gore detaljno opisano, jedan ili više ostataka u petlji može da se održava konstantnim, dok su ostali ostaci randomizovani prema razlici po dužini i/ili sekvenci. Opciono ili alternativno, jedan ili više ostataka u petlji može da se održava na prethodno određenom i ograničenom broju različitih aminokiselina, dok su ostali ostaci randomizovani prema razlici po dužini i/ili sekvenci. Prema tome, biblioteke iz pronalaska sadrže Tn3 konstrukcije koje mogu da sadrže jednu ili više petlji koje imaju degenerisanu sekvencu konsenzusa i/ili jedan ili više nepromenljivih ostataka aminokiselina. U drugom otelotvorenju, biblioteke iz pronalaska sadrže Tn3 konstrukcije koje imaju BC petlje koje su randomizovane. U drugom otelotvorenju, biblioteke iz pronalaska sadrže Tn3 konstrukcije koje imaju BC petlje koje su randomizovane. U još jednom otelotvorenju, biblioteke iz pronalaska sadrže Tn3 konstrukcije koje imaju BC petlje koje su randomizovane.

[0253] U jednom otelotvorenju, biblioteke iz pronalaska sadrže Tn3 konstrukcije koje imaju DE petlje koje su randomizovane. U jednom otelotvorenju, biblioteke iz pronalaska sadrže Tn3 konstrukcije koje imaju FG petlje koje su randomizovane. U drugom otelotvorenju, biblioteke iz pronalaska sadrže FnIII konstrukcije koje imaju FG petlje koje su randomizovane.

[0254] U specifičnom otelotvorenju, biblioteke iz pronalaska sadrže konstrukcije, naznačeno time što konstrukcije sadrže aminokiselinsku sekvencu:

naznačeno time što:

(a) XAB, XBC, XCD, XDE, XEFi XFGpredstavljaju aminokiselinske ostatke prisutne u sekvencama petlji AB, BC, CD, DE, EF, odnosno FG;

(b) X1predstavlja aminokiselinski ostatak A ili T; i,

(c) dužina petlje n je ceo broj od 2 do 26.

[0255] U nekim otelotvorenjima, biblioteke iz pronalaska sadrže CD40L-specifične monomerne podjedinice Tn3 iz pronalaska koje sadrže aminokiselinsku sekvencu:

naznačeno time što:

(a) X1predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S) ili leucin (L);

(b) X2predstavlja aminokiselinski ostatak asparaginsku kiselinu (D) ili glutaminsku kiselinu (E);

(c) X3predstavlja aminokiselinski ostatak histidin (H), izoleucin (I), valin (V), fenilalanin (F) ili triptofan (W);

(d) X4predstavlja aminokiselinski ostatak alanin (A), glicin (G), glutaminsku kiselinu (E) ili asparaginsku kiselinu (D);

(e) X5predstavlja aminokiselinski ostatak glutaminsku kiselinu (E), leucin (L), glutamin (Q), serin (S), asparaginsku kiselinu (D) ili asparagin (N);

(f) X6predstavlja aminokiselinski ostatak fenilalanin (F) ili tirozin (Y);

(g) X7predstavlja aminokiselinski ostatak izoleucin (I), valin (V), histidin (H), glutaminsku kiselinu (E) ili asparaginsku kiselinu (D);

(h) X8predstavlja aminokiselinski ostatak glicin (G), triptofan (W) ili valin (V);

(i) X9predstavlja aminokiselinski ostatak triptofan (W), fenilalanin (F) ili tirozin (Y);

(j) X10predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S), glutamin (Q), metionin (M) ili histidin (H); (k) X11predstavlja aminokiselinski ostatak triptofan (W) ili histidin (H); i,

(l) X12predstavlja aminokiselinski ostatak arginin (R) ili serin (S).

[0256] U nekim otelotvorenjima, biblioteke iz pronalaska sadrže CD40L-specifične monomerne podjedinice Tn3 iz pronalaska koje sadrže aminokiselinsku sekvencu:

naznačeno time što:

(a) X1predstavlja aminokiselinski ostatak lizin (K) ili glutaminsku kiselinu (E);

(b) X2predstavlja aminokiselinski ostatak treonin (T) ili izoleucin (I);

(c) X3predstavlja aminokiselinski ostatak asparagin (N) ili alanin (A);

(d) X4predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S), leucin (L), alanin (A), fenilalanin (F) ili tirozin (Y);

(e) X5predstavlja aminokiselinski ostatak tirozin (Y), alanin (A), glicin (G), valin (V), izoleucin (I) ili serin (S);

(f) X6predstavlja aminokiselinski ostatak tirozin (Y), serin (S), alanin (A) ili histidin (H); (g) X7predstavlja aminokiselinski ostatak asparagin (N), asparaginsku kiselinu (D), histidin (H) ili tirozin (Y);

(h) X8predstavlja aminokiselinski ostatak leucin (L), fenilalanin (F), histidin (H) ili tirozin (Y); (i) X9predstavlja aminokiselinski ostatak histidin (H), prolin (P), serin (S), leucin (L) ili asparaginsku kiselinu (D);

(j) X10predstavlja aminokiselinski ostatak glicin (G), fenilalanin (F), histidin (H) ili tirozin (Y); (k) X11predstavlja aminokiselinski ostatak alanin (A) ili treonin (T);

(l) X12predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S), asparagin (N), glutaminsku kiselinu (E), asparagin (R) ili asparaginsku kiselinu (D);

(m) X13predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S), glutamin (Q), treonin (T), asparagin (N) ili alanin (A);

(n) X14predstavlja aminokiselinski ostatak prolin (P), valin (V), izoleucin (I) ili alanin (A) ili nema aminokiseline;

(o) X15predstavlja aminokiselinski ostatak izoleucin (I) ili nema aminokiseline;

(p) X16predstavlja aminokiselinski ostatak glutaminsku kiselinu (E) ili lizin (K); i,

(q) X17predstavlja aminokiselinski ostatak serin (S) ili asparagin (N).

[0257] Pronalazak dalje obezbeđuje metode za identifikovanje rekombinantne Tn3 konstrukcije koja vezuje cilj, npr. CD40L, i ima povećanu stabilnost ili poboljšano dejstvo na cilj, npr. CD40L, u poređenju sa matičnom Tn3 konstrukcijom pretraživanjem biblioteka iz pronalaska.

[0258] U nekim otelotvorenjima, metoda za identifikovanje rekombinantne Tn3 konstrukcije koja je povećala stabilnost proteina u poređenju sa matičnom Tn3 konstrukcijom, i koja specifično vezuje cilj, obuhvata:

[0259] dovođenje u kontakt ciljnog liganda sa bibliotekom iz pronalaska pod uslovima pogodnim za formiranje kompleksa konstrukcija:ciljni ligand;

[0260] dobijanje iz kompleksa, konstrukcije koja vezuje ciljni ligand;

[0261] određivanje da li je stabilnost konstrukcije dobijene u koraku (b) veća od stabilnosti Tn3 konstrukcije divljeg tipa.

[0262] Ista metoda može da se koristi za identifikovanje rekombinantne Tn3 konstrukcije sa poboljšanim afinitetom vezivanja, aviditetom, itd. prema cilju. U jednom otelotvorenju, u koraku (a) biblioteka konstrukcije iz pronalaska se inkubira sa imobilisanim ciljem. U jednom otelotvorenju, u koraku (b) kompleks konstrukcija:ciljni ligand se ispira da se uklone nespecifični vezivači, a najjači vezivači se uklanjaju pod vrlo strogim uslovima i podvrgavaju se PCR postupku da bi se regenerisala informacija o sekvenci. Specifično se razmatra da vezivači i/ili informacije o sekvenci dobijene u koraku (b) mogu da se koriste za stvaranje nove biblioteke koristeći ovde objavljene metode ili one poznate stručnjacima, koje mogu da se koriste za ponavljanje postupka selekcije, sa dodatnom mutagenezom sekvence ili bez nje. U nekim otelotvorenjima, može se izvesti više ciklusa selekcije dok se ne dobiju vezivači dovoljnog afiniteta prema antigenu.

[0263] Dalje otelotvorenje pronalaska je kolekcija molekula izolovanih nukleinskih kiselina koje kodiraju biblioteku koja sadrži konstrukcije iz pronalaska i kao što je gore opisano.

[0264] Konstrukcije iz pronalaska mogu da se podvrgnu afinitetnom sazrevanju. U ovom postupku prihvaćenom u struci, specifični vezujući protein je podvrgnut šemi kojom se odabira povećan afinitet prema specifičnom cilju (vidite Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

95(11):6037-42). Rezultujuće konstrukcije iz pronalaska mogu da ispolje karakteristike vezivanja najmanje toliko velike kao konstrukcije pre afinitetnog sazrevanja.

[0265] Pronalazak takođe obezbeđuje metode za identifikovanje aminokiselinske sekvence proteinske konstrukcije koja može da se veže za cilj tako da se formira kompleks konstrukcija:cilj. U jednom otelotvorenju, metoda sadrži: (a) dovođenje u kontakt biblioteke iz pronalaska sa imobilisanim ili odvojivim ciljem; (b) razdvajanje kompleksa konstrukcija:cilj od slobodnih konstrukcija; (c) izazivanje replikacije razdvojenih konstrukcija iz (b) tako da se dobije nova biblioteka prikaza polipeptida koja se razlikuje od one pod (a) po tome što ima smanjenu raznovrsnost i obogaćena je prikazanim konstrukcijama koje mogu da vežu cilj; d) opciono ponavljanje koraka (a) i (b) sa novom bibliotekom (c); i e) određivanje sekvence nukleinskih kiselina regiona koji kodira prikazanu konstrukciju vrste iz (d) i time izvođenje peptidne sekvence koja može da se vezuje za cilj.

[0266] U drugom otelotvorenju, Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu biti dalje randomizovane nakon identifikacije iz pretraživanja biblioteke. U jednom otelotvorenju, metoda iz pronalaska sadrži dalju randomizaciju najmanje jedne petlje, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri petlje, najmanje pet ili najmanje šest petlji konstrukcije identifikovane iz biblioteke koristeći ovde opisanu metodu. U drugom otelotvorenju, dalje randomizovana konstrukcija se podvrgava narednoj metodi identifikovanja konstrukcije koja može da veže cilj. Ova metoda obuhvata (a) dovođenje u kontakt pomenute dalje randomizovane konstrukcije sa imobilisanim ili odvojivim ciljem, (b) razdvajanje dalje randomizovanih kompleksa konstrukcija:cilj od slobodnih konstrukcija; (c) izazivanje replikacije razdvojenih konstrukcija (b), opciono ponavljanje koraka (a)-(c), i (d) određivanje sekvence nukleinskih kiselina regiona koji kodira pomenutu dalju randomizovanu konstrukciju i time izvođenje peptidne sekvence koja može da se vezuje za cilj.

[0267] U daljem otelotvorenju, dalje randomizovane konstrukcije sadrže najmanje jednu, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet ili najmanje šest randomizovanih petlji koje su prethodno randomizovane u prvoj biblioteci. U alternativnom daljem otelotvorenju, dalje randomizovane konstrukcije sadrže najmanje jednu, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet ili najmanje šest randomizovanih petlji koje nisu prethodno randomizovane u prvoj biblioteci.

[0268] Pronalazak takođe obezbeđuje metodu za dobijanje najmanje dve Tn3 konstrukcije koje se vezuju za najmanje jedan ili više ciljeva. Ova metoda omogućava skrining agenasa koji deluju zajedno da izazovu poseban odgovor. Može biti korisno da se koristi takav skrining kada je potrebna agonistička aktivnost koja zahteva kooperaciju više od jedne konstrukcije. Ova metoda omogućava skrining kooperativnih agenasa bez preformatiranja biblioteke da bi se formirali multimerni kompleksi. U jednom otelotvorenju, metoda iz pronalaska obuhvata dovođenje u kontakt ciljnog liganda sa bibliotekom iz pronalaska pod uslovima koji omogućavaju da se formira kompleks konstrukcija:ciljni ligand, povezujući pomenute konstrukcije sa agensom za unakrsno povezivanje (definisanim kao agens koji dovodi u veliku blizinu najmanje dve identične ili različite konstrukcije) naznačeno time što unakrsno

1

povezivanje konstrukcija izaziva odgovor koji može da se detektuje i dobijanje iz kompleksa pomenutih konstrukcija koje vezuju cilj. U daljem otelotvorenju, agens za unakrsno povezivanje je antitelo specifične konstrukcije ili njegov fragment, specifično antitelo oznake epitopa ili njegov fragment, domen za dimerizaciju, kao što je Fc region, motiv spiralnog namotaja (na primer, ali bez ograničenja, leucinski zatvarač), hemijski agens za unakrsno povezivanje, ili drugi dimerizacioni domen poznat u struci.

[0269] Pronalazak takođe obezbeđuje metode za detektovanje jedinjenja koje koristi Tn3 konstrukcije iz pronalaska. Na osnovu specifičnosti vezivanja Tn3 konstrukcija dobijenih pretraživanjem biblioteke, moguće je koristiti takve Tn3 konstrukcije u testovima za detektovanje specifičnog cilja u uzorku, kao što su dijagnostičke metode. U jednom otelotvorenju, metoda za detektovanje jedinjenja obuhvata dovođenje u kontakt pomenutog jedinjenja u uzorku sa Tn3 konstrukcijom iz pronalaska, pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa jedinjenje:konstrukcija i detektovanje pomenute konstrukcije, i time detektovanje pomenutog jedinjenja u uzorku. U daljim otelotvorenjima, konstrukcija je obeležena (tj. radiološka oznaka, fluorescentna, enzimski vezana ili kolorimetrijska oznaka) da bi se olakšala detekcija jedinjenja.

[0270] Pronalazak takođe obezbeđuje metode za hvatanje jedinjenja koristeći Tn3 konstrukcije iz pronalaska. Na osnovu specifičnosti vezivanja Tn3 konstrukcija dobijenih pretraživanjem biblioteke, moguće je koristiti takve Tn3 konstrukcije u testovima za hvatanje specifičnog cilja u uzorku, kao što su metode za prečišćavanje. U jednom otelotvorenju, metoda za hvatanje jedinjenja u uzorku obuhvata dovođenje u kontakt pomenutog jedinjenja u uzorku sa konstrukcijom iz pronalaska, pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa jedinjenje:konstrukcija i uklanjanje pomenutog kompleksa iz uzorka, i time hvatanje pomenutog jedinjenja u pomenutom uzorku. U daljim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcija je imobilisana da bi se olakšalo uklanjanje kompleksa jedinjenje:konstrukcija.

[0271] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije izolovane iz biblioteka iz pronalaska sadrže najmanje jednu, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest ili više randomizovanih petlji. U nekim otelotvorenjima, izolovane sekvence petlje Tn3 konstrukcije mogu biti zamenjene iz konstrukcije donora u svaku petlju u FnIII konstrukciji primaocu, uključujući, bez ograničenja, Tn3 konstrukciju primaoca (na primer, sekvenca FG petlje iz konstrukcije donora može biti prebačena u bilo koju petlju u FnIII konstrukciji

2

primaocu). U specifičnom otelotvorenju, izolovane sekvence petlje mogu biti prenete na srodnu petlju u konstrukciji primaocu (na primer, sekvenca FG petlje iz konstrukcije donora može biti prebačena u bilo koju petlju u FnIII konstrukciji primaocu). U nekim otelotvorenjima, izolovane sekvence petlje mogu biti „pomešane i uparene“ nasumično sa različitim konstrukcijama primaocima.

[0272] U nekim otelotvorenjima, izolovane sekvence Tn3 konstrukcije mogu biti identifikovane prema sekvenci petlje. Na primer, biblioteka se koristi za panovanje u odnosu na konkretan cilj i izoluje se kolekcija specifičnih vezivača. Randomizovane sekvence petlje mogu biti okarakterisane kao specifične sekvence nezavisno od osnove Tn3 konstrukcije (tj. konstrukcije koja vezuje cilj X, naznačeno time što pomenuta konstrukcija sadrži FG petlju sekvence SEQ ID NO:X). U alternativnim otelotvorenjima, kada konstrukcija ima dve sekvence petlje koje vezuju cilj X, sekvence petlje mogu biti okarakterisane kao vezujuće za cilj X u odsustvu sekvence konstrukcije. Drugim rečima, razmatra se da konstrukcije izolovane iz biblioteke koje vezuju konkretan cilj mogu da budu eksprimirane kao varijabilne sekvence petlje koje vezuju takav cilj nezavisno od skeleta konstrukcije. Ovaj proces može biti analogan konceptu CDR-a u varijabinim regionima antitela.

Afinitetno sazrevanje

[0273] Razvoj Tn3 konstrukcije iz pronalaska može da uključuje jedan ili više koraka sazrevanja in vitro ili in vivo. U nekim otelotvorenjima, monomerne podjedinice Tn3 mogu da pretrpe jedan korak afinitetnog sazrevanja. U drugim otelotvorenjima, monomerne podjedinice Tn3 mogu da pretrpe dva ili više koraka afinitetnog sazrevanja. Može da se primeni svaki pristup afinitetnog sazrevanja koji generalno dovodi do izmene aminokiselina u petlji matične Tn3 konstrukcije, ili posebno do izmene aminokiselina u petlji matične Tn3 konstrukcije koja poboljšava vezivanje afinitetno sazrele Tn3 konstrukcije za željeni antigen.

[0274] Te izmene aminokiselina mogu, na primer, da se postignu putem nasumične mutageneze, „walk through“ i „look through“ mutageneze. Takva mutageneza može da se postigne korišćenjem, na primer, PCR sklone greškama, „mutatorskih“ sojeva kvasnica ili bakterija, inkorporacije nasumičnih ili definisanih izmena nukleinskih kiselina tokom ab initio sinteze svih vezujućih molekula na bazi FnIII ili njihovih delova. Metode za izvođenje afinitetnog sazrevanja i/ili mutageneze opisane su, na primer, u U.S. Pat. br. 7,195,880; 6,951,725; 7,078,197; 7,022,479; 5,922,545; 5,830,721; 5,605,793, 5,830,650; 6,194,550; 6,699,658; 7,063,943; 5,866,344 i PCT publikaciji WO06023144.

[0275] Za takve metode afinitetnog sazrevanja može dalje biti potrebno da se striktnost skrining testa vezivanja antigena poveća tako da se izaberu Tn3 konstrukcije sa povećanim afinitetom prema antigenu. Ovde mogu da se koriste metode priznate u struci za povećanje striktnosti testa protein-protein interakcije. U jednom otelotvorenju, varira se jedan ili više uslova testa (na primer, koncentracija soli test pufera) da bi se smanjio afinitet Tn3 konstrukcije prema željenom antigenu. U drugom otelotvorenju, skraćuje se dozvoljeno vreme vezivanja Tn3 konstrukcije za željeni antigen.

[0276] U drugom otelotvorenju, testu protein-protein interakcije može da se doda konkurentski korak vezivanja. Na primer, može se prvo dopustiti da se Tn3 konstrukcija veže za željeni imobilisani antigen. Onda se dodaje specifična koncentracija neimobilisanog antigena koja služi da se takmiči u vezivanju sa imobilisanim antigenom tako da se Tn3 konstrukcije sa najmanjim afinitetom prema antigenu eluiraju sa imobilisanog antigena, dovodeći do selekcije Tn3 konstrukcija sa poboljšanim afinitetom vezivanja antigena. Striktnost uslova testa se može dodatno povećati povećavanjem koncentracije neimobilisanog antigena koja se dodaje u test.

[0277] Za metode skrininga može takođe biti potrebno više ciklusa selekcije kako bi se postiglo obogaćivanje Tn3 konstrukcijom sa poboljšanim vezivanjem antigena. U jednom otelotvorenju, u svakom ciklusu selekcije se uvode dodatne aminokiselinske mutacije u Tn3 konstrukciju. U drugom otelotvorenju, u svakom ciklusu selekcije se povećava striktnost vezivanja za željeni antigen, kako bi se odabrale Tn3 konstrukcije sa povećanim afinitetom prema antigenu.

[0278] U nekim otelotvorenjima, afinitetno sazrevanje se izvodi saturacionom mutagenezom delova BC, DE i FG petlji Tn3. U nekim otelotvorenjima, saturaciona mutageneza se izvodi korišćenjem Kunkelove mutageneze. U drugim otelotvorenjima, saturaciona mutageneza se izvodi korišćenjem PCR.

[0279] U nekim otelotvorenjima, primenjuje se najmanje jedan, najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, ili više od pet ciklusa afinitetnog sazrevanja. U nekim otelotvorenjima, saturaciona mutageneza se primenjuje na samo jednu petlju, dok se kod drugih otelotvorenja mutira samo jedna petlja ili deo petlje tokom jednog ciklusa afinitetnog

4

sazrevanja. U nekim otelotvorenjima, tokom istog ciklusa afinitetnog sazrevanja se mutira više od jedne petlje ili delova jedne ili više petlji.

[0280] U drugim otelotvorenjima, BC, DE i FG petlje su mutirane istovremeno tokom istog ciklusa afinitetnog sazrevanja.

[0281] U slučaju monomera koji se udružuju u multimerne Tn3 konstrukcije koje se vezuju za različite epitope istog cilja, svaka specifičnost vezivanja može nezavisno da se pretražuje.

[0282] U nekim otelotvorenjima, petlje su randomizovane koristeći biblioteku prikaza faga. U nekim otelotvorenjima, vezivanje Tn3 konstrukcije za željeni cilj može da se odredi koristeći metode poznate u struci. Takođe, aminokiselinske sekvence Tn3 konstrukcija identifikovanih u pretraživanju mogu da se odrede korišćenjem metoda priznatih u struci.

[0283] U nekim otelotvorenjima, monomerne afinitetno sazrele konstrukcije iz pronalaska pokazuju povećan afinitet prema CD40L koji je najmanje 5 puta, najmanje 10 puta, najmanje 20 puta, najmanje 40 puta, najmanje 60 puta, najmanje 80 puta, ili najmanje 100 puta ili više veći u odnosu na istu Tn3 konstrukciju pre afinitetnog sazrevanja, izmereno površinskom plazmonskom rezonancom ili drugim testovima poznatim u struci. U nekim otelotvorenjima, monomerne afinitetno sazrele konstrukcije iz pronalaska imaju konstantu disocijacije (Kd) manju od 5 µM, manju od 1 µM, manju od 500 µM, manju od 250 µM, manju od 100 µM, ili manju od 50 µM, izmereno površinskom plazmonskom rezonancom ili drugim testovima poznatim u struci.

[0284] Ove metode afinitetnog sazrevanja mogu da se primene da se razviju Tn3 konstrukcije sa željenim pobojšanim svojstvima vezivanja, kao što je povećan afinitet ili druge poželjne karakteristike, kao što su poželjna farmakokinetička svojstva, velika potentnost, mala imunogenost, povećana ili smanjena unakrsna reaktivnost, itd.

Generisanje ponavljanja tandema

[0285] Povezivanje konstrukata tandema, dimera dobijenog povezivanjem dve CD40L-specifične monomerne podjedinice, može se generisati ligiranjem oligonukleotida na restrikcionim mestima koristeći restrikcione enzime poznate u struci, uključujući, bez ograničenja, restrikcione enzime tip II i tip IIS.

[0286] Multimerne Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu da sadrže linker na C-terminusu i/ili N-terminusu i/ili između domena, kako je opisano. Nadalje, konstrukcije iz pronalaska koje sadrže najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8 ili polipeptidne konstrukcije mogu biti fuzionisane ili konjugovane sa dimerizacionim domenom, uključujući, bez ograničenja, ostatak antitela odabran od:

(i) fragmenta Fab, koji ima VL, CL, VH i CH1 domene;

(ii) fragmenta Fab', koji je fragment Fab sa jednim ili više cisteinskih ostataka na C-terminusu CH1 domena;

(iii) fragmenta Fd, koji ima VH i CH1 domene;

(iv) fragmenta Fd', koji ima VH i CH1 domene i jedan ili više cisteinskih ostataka na C-terminusu CH1 domena;

(v) fragmenta Fv koji ima VL i VH domene jednog kraka antitela;

(vi) fragmenta dAb koji se sastoji od VH domena;

(vii) izolovanih CDR regiona;

(viii) fragmenata F(ab')2, dvovalentnog fragmenta koji obuhvata dva Fab' fragmenta povezana disulfidnim mostom u regionu šarke;

(ix) molekula jednolančanog antitela (npr. jednolančani Fv; scFv);

(x) „dijatela“ sa dva antigen vezujuća mesta, koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu;

(xi) „linearnog antitela“ koje sadrži par tandem Fd segmenata (VH-CH1-VH-CH1) koji, zajedno sa komplementarnim polipeptidima lakog lanca, grade par antigen vezujućih regiona; (xii) antitela pune dužine; i

(xiii) Fc regiona koji sadrži CH2-CH3, koji dodatno može da sadrži ceo region šarke i/ili CH1 region ili samo njegov deo.

Proizvodnja Tn3 konstrukcije

[0287] Rekombinantna ekspresija Tn3 konstrukcije iz pronalaska zahteva konstruisanje ekspresionog vektora koji sadrži polinukleotid koji kodira Tn3 konstrukciju. Kada se dobije polinukleotid koji kodira Tn3 konstrukciju, vektor za proizvodnju Tn3 konstrukcije se može proizvesti tehnologijom rekombinacije DNK koristeći tehnike dobro poznate u struci. Tako, ovde su opisane metode za pripremu proteina putem ekspresije polinukleotida koji sadrži Tn3 konstrukciju koji kodira sekvencu nukleotida. Metode dobro poznate stručnjacima mogu da se koriste za konstruisanje ekspresionih vektora koji sadrže polipeptid konstrukcije koji kodira sekvence i odgovarajuće transkripcione i translacione upravljačke signale. Te metode uključuju, na primer, tehnike in vitro rekombinacije DNK, sintetičke tehnike i in vivo genetsku rekombinaciju. Pronalazak tako obezbeđuje vektore koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira Tn3 konstrukciju iz pronalaska, operativno povezanu sa promoterom.

[0288] Ekspresioni vektor se prenosi u ćeliju domaćina klasičnim tehnikama, a transficirane ćelije se onda uzgajaju klasičnim tehnikama da se dobije Tn3 konstrukcija iz pronalaska. Tako, pronalazak uključuje ćelije domaćine koje sadrže polinukleotid koji kodira konstrukciju iz pronalaska, operativno povezan sa heterolognim promoterom. Pogodne ćelije domaćini uključuju, bez ograničenja, mikroorganizme kao što su bakterije (npr. E. coli i B. subtilis).

[0289] Mogu se koristiti raznovrsni sistemi domaćin-ekspresioni vektor da bi se eksprimirale Tn3 konstrukcije iz pronalaska. Takvi sistemi domaćin-ekspresioni vektor predstavljaju sredstvo kojim se može dobiti željene kodirajuće sekvence i zatim prečistiti, ali takođe predstavljaju ćelije koje mogu, kada se transformišu ili transficiraju odgovarajućim sekvencama za kodiranje nukleotida, da eksprimiraju konstrukciju iz pronalaska in situ. Oni uključuju, bez ograničenja, mikroorganizme kao što su bakterije (npr. E. coli i B. subtilis) transformisane ekspresionim vektorima rekombinantne DNK bakteriofaga, plazmidne DNK ili kozmidne DNK koji sadrže konstrukcije koje kodiraju sekvence ili ćelijske sisteme sisara (npr. COS, CHO, BHK, 293, NSO i 3T3 ćelije).

[0290] Metode korisne za proizvodnju Tn3 konstrukcija iz pronalaska su objavljene, na primer, u Internacionalnoj patentnoj prijavi pubilikaciji br. WO 2009/058379. Kada se proizvede konstrukcija iz pronalaska putem rekombinantne ekspresije, ona se može prečistiti bilo kojim postupkom za prečišćavanje proteina poznatim u struci.

[0291] U nekim otelotvorenjima, konstrukcije iz pronalaska mogu da se proizvedu u aglikozilovanom obliku zamenom aminokiselinskih ostataka koji mogu biti glikozilovani tokom rekombinantne ekspresije. U jednom specifičnom otelotvorenju, serinske aminokiseline u linkeru glicin-serin (npr. SEQ ID NO: 131, ili SEQ ID NO: 132) mogu da se zamene drugim aminokiselinskim ostacima, kao što je alanin, glicin, leucin, izoleucin ili valin (vidite, npr. SEQ ID NO: 140, 141, 142 i 143) da bi se sprečila glikozilacija tokom rekombinantne ekspresije. U nekim specifičnim otelotvorenjima, mesto N-glikozilacije se uklanja iz Tn3 konstrukcije iz pronalaska. U drugim otelotvorenjima, konstrukcija iz pronalaska može biti deglikozilovana nakon rekombinantne ekspresije. Metode za in vitro deglikozilaciju nakon rekombinantne ekspresije koristeći, npr. enzimske koktele, poznate su u struci (na primer, kompleti za deglikozilaciju PFGaza F, Endo F Multi, Orela O-vezani reagens za oslobađanje glikana, enzimski CarboRelease, i enzimski DeGlycoMx koje prodaje QA-bio, Palm Desert, CA).

[0292] Proizvodnja Tn3 konstrukcija iz pronalaska u istraživačkoj laboratoriji može da bude zapreminski povećana da bi se dobile konstrukcije u reaktorima analitičkog obima ili proizvodnog obima, kao što opisuje U.S. patentna publikacija br. US 2010-0298541 A1.

Proizvodnja promenljivog obima sekretovanih Tn3 konstrukcija

[0293] Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu da se proizvedu intracelularno ili kao sekretovani oblik. U nekim otelotvorenjima, sekretovane konstrukcije su pravilno savijene i kompletno funkcionalne. Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu da se proizvedu procesom promenljivog obima. U nekim otelotvorenjima, konstrukcije mogu da se proizvedu u istraživačkoj laboratoriji procesom promenljivog obima iz pronalaska, koji može da se proširi tako da se proizvode konstrukcije iz pronalaska u bioreaktorima analitičkog obima (na primer, bez ograničenja, bioreaktori od 5 l, 10 l, 15 l, 30 l ili 50 l). U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije mogu da se proizvedu u istraživačkoj laboratoriji procesom promenljivog obima iz pronalaska, koji može da se proširi tako da se proizvode Tn3 konstrukcije iz pronalaska u bioreaktorima proizvodnog obima (na primer, bez ograničenja, bioreaktori od 75 l, 100 l, 150 l, 300 l ili 500 l). U nekim otelotvorenjima, proces promenljivog obima iz pronalaska dovodi do malog ili nikakvog smanjenja efikasnosti u poređenju sa proizvodnim procesom izvedenim u istraživačkoj laboratoriji.

Linkeri

[0294] Monomerne podjedinice u multimernoj Tn3 konstrukciji mogu da se povežu proteinskim i/ili neproteinskim linkerima, naznačeno time što je svaki linker fuzionisan sa najmanje dve monomerne podjedinice. Pogodni linker može da se sastoji od proteinskog linkera, neproteinskog linkera i njihovih kombinacija. Kombinacije linkera mogu biti homomerne il heteromerne. U nekim otelotvorenjima, multimerna Tn3 konstrukcija iz pronalaska sadrži više monomernih podjedinica, naznačeno time što su svi linkeri identični. U drugim otelotvorenjima, multimerna Tn3 konstrukcija iz pronalaska sadrži više monomernih podjedinica, naznačeno time što je najmanje jedan linker funkcionalno ili strukturno različit od ostatka linkera. U nekim otelotvorenjima, sami linkeri mogu da doprinesu aktivnosti multimerne Tn3 konstrukcije direktnim ili indirektnim učestvovanjem u vezivanju za cilj.

[0295] U nekim otelotvorenjima, proteinski linker je polipeptid. Polipeptidni linker treba da ima dužinu odgovarajuću za povezivanje dve ili više monomernih podjedinica na takav način da one zauzmu pravilnu međusobnu konformaciju tako da zadrže željenu aktivnost.

[0296] U jednom otelotvorenju, polipeptidni linker sadrži 1 do oko 1000 aminokiselinskih ostataka, 1 do oko 50 aminokiselinskih ostataka, 1-25 aminokiselinskih ostataka, 1-20 aminokiselinskih ostataka, 1-15 aminokiselinskih ostataka, 1-10 aminokiselinskih ostataka, 1-5 aminokiselinskih ostataka, 1-3 aminokiselinska ostatka. Pronalazak dalje obezbeđuje nukleinske kiseline, kao što je DNK, RNK, ili njihova kombinacija, koje kodiraju sekvencu polipeptidnog linkera. Aminokiselinski ostaci odabrani za uključivanje u polipeptidni linker treba da pokazuju svojstva koja značajno ne ometaju aktivnost ili funkciju multimerne Tn3 konstrukcije iz pronalaska. Tako, polipeptidni linker u celini ne treba da ima naelektrisanje koje nije u skladu sa aktivnošću ili funkcijom multimernih Tn3 konstrukcija iz pronalaska, niti da ometa interno savijanje, ili da formira veze ili druge interakcije sa aminokiselinskim ostacima u jednoj ili više monomernih podjedinica koje bi ozbiljno ometale vezivanje multimerne Tn3 konstrukcije iz pronalaska za CD40L.

[0297] Upotreba prirodnih, kao i veštačkih peptidnih linkera za povezivanje peptida u nove vezane fuzione polipeptide dobro je poznata u literaturi. Prema tome, linkeri koji spajaju dve ili više monomernih podjedinica su prirodni linkeri, veštački linkeri, ili njihova kombinacija. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske sekvence svih peptidnih linkera prisutnih u multimernoj Tn3 konstrukciji iz pronalaska su identične. U drugim otelotvorenjima, aminokiselinske sekvence najmanje dva peptidna linkera prisutna u multimernoj Tn3 konstrukciji iz pronalaska su različite.

[0298] U nekim otelotvorenjima, polipeptidni linker ima fleksibilnu konformaciju. U nekim otelotvorenjima, sekvenca polipeptidnog linkera sadrži aminokiselinsku sekvencu (G-G-G-G-X)m, gde je X alanin (A), serin (S), glicin (G), izoleucin (I), leucin (L) ili valin (V,) a m je pozitivan ceo broj (vidite, npr. SEQ ID NO: 209). U specifičnom otelotvorenju, sekvenca polipeptidnog linkera sadrži aminokiselinsku sekvencu (G-G-G-G-S)m, gde je m pozitivan ceo broj (vidite, npr. SEQ ID NO: 147). U drugom specifičnom otelotvorenju, sekvenca polipeptidnog linkera sadrži aminokiselinsku sekvencu (G-G-G-G-G)m, gde je m pozitivan ceo broj (vidite, npr. SEQ ID NO: 148). U još jednom specifičnom otelotvorenju, sekvenca polipeptidnog linkera sadrži aminokiselinsku sekvencu (G-G-G-G-A)m, gde je m pozitivan ceo broj (vidite, npr. SEQ ID NO: 149). U nekim otelotvorenjima, polipeptidni linker je suštinski nestrukturisan prirodni ili veštački polipeptid (vidite, npr. Schellenberger et al., Nature Biotechnol. 27:1186-1190, 2009; takođe vidite Sickmeier et al., Nucleic Acids Res.35:D786-93, 2007).

[0299] Peptidni linker može biti modifikovan tako da se uvede aminokiselinski ostatak koji sadrži vezivnu grupu za nepolipeptidni ostatak. Primer za takve aminokiselinske ostatke može biti cisteinski ostatak (za koji se zatim vezuje nepolipeptidni ostatak) ili aminokiselinska sekvenca može da uključuje in vivo mesto N-glikozilacije (kojim se ostatak šećera (in vivo) vezuje za peptidni linker).

[0300] U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske sekvence svih peptidnih linkera prisutnih u polipeptidnom multimeru su identične. Alternativno, aminokiselinske sekvence svih peptidnih linkera prisutnih u polipeptidnom multimeru mogu biti različite.

Označavanje ili konjugacija Tn3 konstrukcija

[0301] Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu da se koriste u nekonjugovanom obliku ili konjugovane sa najmanje jednim od različitih heterolognih ostataka da bi se olakšalo detektovanje cilja ili za snimanje ili terapiju. Tn3 konstrukcije mogu biti označene ili konjugovane bilo pre ili posle prečišćavanja, kada se vrši prečišćavanje.

[0302] Mnogi heterologni ostaci nemaju pogodne funkcionalne grupe za koje mogu da se vežu Tn3 konstrukcije iz pronalaska. Tako, u nekim otelotvorenjima, efektorski molekul je vezan za konstrukciju preko linkera, naznačeno time što linker sadrži reaktivne grupe za konjugaciju. U nekim otelotvorenjima, heterologni ostatak konjugovan sa Tn3 konstrukcijom iz pronalaska može da funkcioniše kao linker. U drugim otelotvorenjima, ostatak je konjugovan sa Tn3 konstrukcijom preko linkera koji može biti raskidiv ili neraskidiv. U jednom otelotvorenju, raskidivi vezujući molekul je redoks raskidivi vezujući molekul, takav da je vezujući molekul raskidiv u okruženju sa nižim redoks potencijalom, kao što je citoplazma i drugi regioni sa višim koncentracijama molekula sa slobodnim sulfhidril grupama. Primeri za vezujuće molekule koji mogu da se raskinu usled promene redoks potencijala uključuju one koji sadrže disulfide.

[0303] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska su dizajnirane da obezbede reaktivne grupe za konjugaciju. U takvim konstrukcijama, N-terminus i/ili C-terminus takođe može da služi da obezbedi reaktivne grupe za konjugaciju. U drugim otelotvorenjima, N-terminus može biti konjugovan sa jednim ostatkom (kao što je, bez ograničenja, PEG) dok je C-terminus konjugovan sa drugim ostatkom (kao što je, bez ograničenja, biotin).

[0304] Termin „polietilen glikol“ ili „PEG“ označava jedinjenje polietilen glikol ili njegov derivat, sa agensom za kuplovanje, ostatkom za kuplovanje ili aktivaciju, ili bez njega (npr. sa ostatkom tiola, triflata, trezilata, aziridina, oksirana, N-hidroksisukcinimida ili maleimida). Podrazumeva se da „PEG“ označava polietilen glikol molekulske mase od 500 do 150.000 Da, uključujući njegove analoge, naznačeno time što je, na primer, krajnja OH grupa zamenjena metoksi grupom (naziva se mPEG).

[0305] Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu da se derivatizuju polietilen glikolom (PEG). PEG je linearni polimer rastvoran u vodi sa ponavljajućim jedinicama etilen oksida i dve terminalne hidroksi grupe. PEG je klasifikovan prema svojoj molekulskoj masi koja je obično od oko 500 daltona do oko 40.000 daltona. U specifičnom otelotvorenju, upotrebljeni PEG ima molekulsku masu od oko 5000 daltona do oko 20.000 daltona. PEG kuplovan sa konstrukcijom iz pronalaska može biti razgranat ili nerazgranat. Vidite, na primer, Monfardini, C. et al. 1995 Bioconjugate Chem 6:62-69. PEG je komercijalno dostupan od kompanije Nektar Inc., Sigma Chemical Co. i drugih. Takav PEG uključuje, bez ograničenja, monometoksipolietilen glikol (MePEG-OH), monometoksipolietilen glikol sukcinat (MePEG-S), monometoksipolietilen glikol sukcinimidil sukcinat (MePEG-S- NHS), monometoksipolietilen glikol amin (MePEG-NH2), monometoksipolietilen glikol-trezilat (MePEG-TRES) i monometoksipolietilen glikol imidazolil karbonil (MePEG-IM).

[0306] Ukratko, hidrofilni polimer koji se koristi, na primer, PEG, završava se na jednom kraju nereaktivnom grupom, kao što je metoksi ili etoksi grupa. Nakon toga, polimer se aktivira na drugom kraju reakcijom sa pogodnim agensom za aktivaciju, kao što su cijanuril halidi (na primer, cijanuril hlorid, bromid ili fluorid), karbonildiimidazol, anhidridni reagens (npr. dihalo sukcinil anhidrid, kao što je dibromosukcinil anhidrid), acil azid, p-diazonijumbenzil etar, 3-

1

(p-diazonijumfenoksi)-2-hidroksipropiletar) i slično. Aktivirani polimer se zatim podvrgava reakciji sa polipeptidom, kao što je ovde opisano, dajući polipeptid derivatizovan polimerom. Alternativno, funkcionalna grupa u Tn3 konstrukcijama iz pronalaska može da se aktivira za reakciju sa polimerom, ili dve grupe mogu da se spoje u usaglašenoj reakciji kuplovanja, koristeći poznate metode kuplovanja. Lako će se shvatiti da polipeptidi iz pronalaska mogu biti derivatizovani pomoću PEG koristeći mnoštvo drugih reakcionih šema koje su poznate i koriste ih stručnjaci. PEG može biti kuplovan sa konstrukcijom iz pronalaska na jednoj ili više funkcionalnih grupa na bilo kom kraju Tn3 konstrukcije ili u Tn3 konstrukciji. U nekim otelotvorenjima, PEG je kuplovan bilo na N-terminusu ili na C-terminusu.

[0307] U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska, njihovi analozi ili derivati mogu biti konjugovani sa agensom za dijagnostikovanje ili detekciju. Takve Tn3 konstrukcije mogu biti korisne za praćenje ili predviđanje razvoja ili napredovanja bolesti u okviru procedure kliničkih testova, kao što je određivanje efikasnosti konkretnog lečenja.

[0308] Predmetni pronalazak dalje obuhvata primenu Tn3 konstrukcija konjugovanih sa terapeutskim ostatkom. Tn3 konstrukcija može biti konjugovana sa terapeutskim ostatkom, kao što je citotoksin, npr. citostatski ili citocidni agens, terapeutski agens, ili radioaktivni jon metala, npr. alfa emiteri. Citotoksin ili citotoksični agens uključuje svaki agens koji je štetan za ćelije.

Testiranje Tn3 konstrukcija

[0309] Afinitet vezivanja i druga vezujuća svojstva Tn3 konstrukcije za antigen mogu da se odrede raznovrsnim in vitro test metodama poznatim u struci, uključujući, na primer, ravnotežne metode (npr. test sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA) ili kinetičke (npr. BIACORE® analiza) i druge metode, kao što je test indirektnog vezivanja, testovi kompetitivnog vezivanja, gel elektroforeza i hromatografija (npr. gel filtracija). U ovim i drugim metodama mogu da se koriste oznake na jednoj ili više komponenata koje se ispituju i/ili da se koriste raznovrsne metode za detekciju, uključujući, bez ograničenja, hromogene, fluorescentne, luminescentne ili izotopske oznake. Detaljan opis afiniteta vezivanja i kinetike može se naći u Paul, W.E., izd, Fundamental Immunology, 4. izd, Lippincott-Raven, Philadelphia (1999).

[0310] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska specifično vezuju cilj sa specifičnom kinetikom. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu da

2

imaju konstantu disocijacije ili Kd(koff/kon) manju od 1×10<-2>M, 1×10<-3>M, 1×10<-4>M, 1×10<-5>M, 1×10<-6>M, 1×10<-7>M, 1×10<-8>M, 1×10<-9>M, 1×10<-10>M, 1×10<-11>M, 1×10<-12>M, 1×10<-13>M, 1×10<-14>M ili manju od 1×10<-15>M. U specifičnim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu da imaju Kdod 500 µM, 100 µM, 500 nM, 100 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM ili manje, kako je određeno testom BIAcore assay® ili drugim testom poznatim u struci.

[0311] U alternativnom otelotvorenju, afinitet Tn3 konstrukcije iz pronalaska je opisan preko konstante asocijacije (Ka), koja se izračunava kao odnos kon/koff, od najmanje 1×10<2>M<-1>, 1×10<3>M<-1>, 1×10<4>M-1, 1×10<5>M<-1>, 1×10<6>M<-1>, 1×10<7>M<-1>, 1×10<8>M<-1>, 1×10<9>M<-1>, 1×10<10>M<-1>1×10<11>M<-1>1×10<12>M<-1>, 1×10<3>M<-1>, 1×10<14>M<-1>, 1×10<15>M-1, ili najmanje 5 X 10<15>M<-1>.

[0312] U nekim otelotvorenjima, brzina kojom Tn3 konstrukcije iz pronalaska disosuju sa ciljnog epitopa može biti značajnija od vrednosti Kdili Ka. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska imaju koffmanju od 10<-3>s<-1>, manju od 5x10<-3>s<-1>, manju od 10<-4>s<-1>, manju od 5x10<-4>s<-1>, manju od 10<-5>s<-1>, manju od 5x10<-5>s<-1>, manju od 10<-6>s<-1>, manju od 5x10<-6>s<-1>, manju od 10<-7>s<-1>, manju od 5x10<-7>s<-1>, manju od 10<-8>s<-1>, manju od 5x10<-8>s<-1>, manju od 10<-9>s<-1>, manju od 5x10<-9>s<-1>, ili manju od 10<-10>s<-1>.

[0313] U nekim drugim otelotvorenjima, brzina kojom se Tn3 konstrukcije iz pronalaska asociraju sa ciljnim epitopom može biti značajnija od vrednosti Kdili Ka. U ovom slučaju, Tn3 konstrukcije iz pronalaska se vezuju za cilj brzinom konod najmanje 10<5>M<-1>s<-1>, najmanje 5x10<5>M<-1>s<-1>, najmanje 10<6>M<-1>s<-1>, najmanje 5 x 10<6>M<-1>s<-1>, najmanje 10<7>M<-1>s<-1>, najmanje 5 x 10<7>M<-1>s<-1>, ili najmanje 10<8>M<-1>s<-1>, ili najmanje 10<9>m<-1>s<-1>.

[0314] Tn3 konstrukcije iz pronalaska takođe mogu da se vežu za čvrst nosač, što je posebno korisno za imunotestove ili prečišćavanje ciljnog antigena. Takav čvrsti nosač uključuje, bez ograničenja, staklo, celulozu, poliakrilamid, najlon, polistiren, polivinil hlorid ili polipropilen.

CD40L-specifične Tn3 konstrukcije

[0315] Pronalazak obezbeđuje Tn3 konstrukcije koje se specifično vezuju za CD40L. U specifičnim otelotvorenjima, konstrukcije iz pronalaska se specifično vezuju za humani CD40L. U drugim specifičnim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska se vezuju za homologe CD40L miša, pileta, rezusa, cinomolgusa, pacova ili zeca. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska se vezuju za izloženi epitop CD40L. Takva otelotvorenja uključuju CD40L endogeno eksprimiran na ćelijama i/ili ćelijama transficiranim da ektopično eksprimiraju receptor.

[0316] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska prepoznaju epitope prikazane na monomernom obliku CD40L. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska prepoznaju epitope prikazane na trimernom obliku CD40L. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska prepoznaju epitope prikazane na membranski vezanom CD40L. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska prepoznaju epitope prikazane na rastvornom CD40L.

[0317] U još nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska vezuju monomerni CD40L i sprečavaju ili ometaju oligomerizaciju molekula CD40L. U još nekim otelotvorenjima, konstrukcije iz pronalaska smanjuju ili inhibiraju interakciju CD40L sa CD40. U drugim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska agonizuju ćelijsku signalizaciju posredovanu putem CD40L. U još nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska antagonizuju ćelijsku signalizaciju posredovanu putem CD40L.

[0318] Otkriće takođe obezbeđuje metode za modulaciju aktivnosti CD40L koristeći ovde opisane Tn3 konstrukcije. U nekim otelotvorenjima, metode iz pronalaska obuhvataju dovođenje u kontakt CD40L sa CD40L-specifičnim Tn3 konstrukcijama i blokiranje interakcije između CD40 i CD40L. U nekim otelotvorenjima, metode iz pronalaska obuhvataju dovođenje u kontakt ćelije koja eksprimira CD40L sa CD40L-specifičnom Tn3 konstrukcijom i sprečavanje proteolitičkog cepanja CD40L sa ćelijske površine. U drugim otelotvorenjima, metode iz pronalaska obuhvataju dovođenje u kontakt CD40L monomera sa CD40L-specifičnom Tn3 konstrukcijom i sprečavanje oligomerizacije CD40L. U drugim otelotvorenjima, dimerizacija ili oligomerizacija CD40L može da se postigne upotrebom multimernih Tn3 konstrukcija.

[0319] U nekim otelotvorenjima, metode iz pronalaska obuhvataju primenu CD40L specifične konstrukcije koja smanjuje CD40-posredovani imunski odgovor (vidite, npr. Elqueta et al.229: 152-172, 2009), ili nishodni put signalizacije aktiviran vezivanjem CD40 za CD40L, mereno rutinskim testovima poznatim u struci.

4

[0320] Ne želeći da se vežemo za određenu teoriju, CD40L konstrukcije iz predmetnog pronalaska mogu da funkcionišu sprečavajući vezivanje CD40 za CD40L, vezujući i odvajajući rastvorni CD40L, menjajući interakciju CD40L sa CD40 ali ne sprečavajući vezivanje, sprečavajući ili povećavajući metaloproteazama posredovano enzimsko cepanje CD40L sa ćelijske površine da se dobije rastvorni CD40L, sprečavajući ili povećavajući endocitozu CD40L sa ćelijske površine, itd.

Specifične CD40L vezujuće sekvence

[0321] U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska sadrže CD40L-specifične monomerne podjedinice, koje sadrže najmanje jednu, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, ili najmanje šest sekvenci petlje koje se vezuju za CD40L.

[0322] U nekim otelotvorenjima, CD40L-specifične monomerne podjedinice sadrže najmanje jednu, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, ili najmanje šest sekvenci petlje klonova CD40L vezujućeg monomera odabranog od: 309 (matični klon familije 309 izolovan iz naivne biblioteke Tn3; SEQ ID NO: 20), 309FGwt (matični klon 309 sa humanizovanom FG petljom; SEQ ID NO: 22), 340 (afinitetno sazreli klon 309; SEQ ID NO: 24), 341 (afinitetno sazreli klon 309; SEQ ID NO: 26), 342 (afinitetno sazreli klon 309; SEQ ID NO: 28, ili SEQ ID NO: 146), 343 (afinitetno sazreli klon 309; SEQ ID NO: 30), 344 (afinitetno sazreli klon 309; SEQ ID NO: 32), 345 (afinitetno sazreli klon 309; SEQ ID NO: 34), 346 (afinitetno sazreli klon 309; SEQ ID NO: 36), 347 (afinitetno sazreli klon 309; SEQ ID NO: 38), 348 (afinitetno sazreli klon 309; SEQ ID NO: 40), 349 (afinitetno sazreli klon 309; SEQ ID NO: 42) 311 (matični klon familije 311 izolovan iz naivne biblioteke Tn3; SEQ ID NO: 44), 311K4E (varijanta klona familije 311 iz prvog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 46), 311K4E_1 (varijanta klona familije 311 iz drugog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 48), 311K4E_2 (varijanta klona familije 311 iz drugog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 50), 311K4E _3 (varijanta klona familije 311 iz drugog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 52), 311K4E_4 (varijanta klona familije 311 iz drugog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 54), 311K4E_5 (varijanta klona familije 311 iz drugog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 56), 311K4E_7 (varijanta klona familije 311 iz drugog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 58), 311K4E_8 (varijanta klona familije 311 iz drugog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 60), 311K4E_9 (varijanta klona familije 311 iz drugog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 62), 311K4E_10 (varijanta klona familije 311 iz drugog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 64), 311K4E_11 (varijanta klona familije 311 iz drugog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 66), 311K4E_12 (varijanta klona familije 311 iz drugog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 68), 311K4E_13 (varijanta klona familije 311 iz drugog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 70), 311K4E_14 (varijanta klona familije 311 iz drugog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 72), 311K4E_15 (varijanta klona familije 311 iz drugog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 74), 311K4E_16 (varijanta klona familije 311 iz drugog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 76), 311K4E_19 (varijanta klona familije 311 iz drugog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 78), 311K4E_20 (varijanta klona familije 311 iz drugog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 80), i 311K4E_21 (varijanta klona familije 311 iz drugog ciklusa afinitetnog sazrevanja; SEQ ID NO: 82).

[0323] U nekim otelotvorenjima, CD40L-specifične monomerne podjedinice sadrže najmanje jednu sekvencu petlje izabranu od sekvenci petlje navedenih u TABELI 2. U drugim otelotvorenjima, CD40L-specifične monomerne podjedinice sadrže najmanje jednu sekvencu BC petlje izabranu od sekvenci BC petlje navedenih u TABELI 2. U drugim otelotvorenjima, CD40L-specifične monomerne podjedinice sadrže najmanje jednu sekvencu DE petlje izabranu od sekvenci DE petlje navedenih u TABELI 2. U drugim otelotvorenjima, CD40L-specifične monomerne podjedinice sadrže najmanje jednu sekvencu FG petlje izabranu od sekvenci FG petlje navedenih u TABELI 2.

[0324] U nekim otelotvorenjima, CD40L-specifične monomerne podjedinice sadrže sekvencu BC petlje izabranu od sekvenci BC petlje navedenih u TABELI 2; i sekvencu DE petlje izabranu od sekvenci DE petlje navedenih u TABELI 2. U drugim otelotvorenjima, CD40L-specifične monomerne podjedinice sadrže sekvencu BC petlje izabranu od sekvenci BC petlje navedenih u TABELI 2; i sekvencu FG petlje izabranu od sekvenci FG petlje navedenih u TABELI 2. U drugim otelotvorenjima, CD40L-specifične monomerne podjedinice sadrže sekvencu DE petlje izabranu od sekvenci DE petlje navedenih u TABELI 2; i sekvencu FG petlje izabranu od sekvenci FG petlje navedenih u TABELI 2. U nekim otelotvorenjima, CD40L-specifične monomerne podjedinice sadrže sekvence petlji koje odgovaraju sekvencama petlji iz jednog, dva ili tri različita Tn3 klona.

[0325] U nekim otelotvorenjima, gde sekvenca CD40L-specifične monomerne konstrukcije sadrži linker i/ili histidinsku oznaku (npr. his-8 oznaku) na C-terminusu sekvence, ili dodatnu N-terminalnu aminokiselinu, taj C-terminalni linker i/ili histidinska oznaka i dodatna Nterminalna aminokiselina mogu da se uklone, pa odgovarajuća aminokiselinska sekvenca sadrži deleciju sekvenci C-terminalnog linkera i his oznake i dodatnu N-terminalnu aminokiselinu ili aminokiseline.

[0326] U nekim otelotvorenjima, CD40L-specifična Tn3 konstrukcija sadrži jednu monomernu podjedinicu, npr. sekvencu klona 342 (afinitetno sazreli klon 309; SEQ ID NO: 28 i/ili SEQ ID NO: 146). U drugim otelotvorenjima, CD40L-specifična Tn3 konstrukcija sadrži više od jedne monomerne podjedinice, npr. dve monomerne podjedinice klona 342 (SEQ ID NO: 28 i/ili SEQ ID NO: 146) u tandemu (vidite, npr. SEQ ID NO: 135). U specifičnim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska su konjugovane sa varijantom HSA (vidite, npr. SEQ ID NO: 134 i SEQ ID NO: 135). U dodatnim otelotvorenjima, HSA može biti konjugovan sa N-terminusom ili C-terminusom multimerne Tn3 konstrukcije.

[0327] U specifičnom otelotvorenju, CD40L-specifična Tn3 konstrukcija sadrži jednu monomernu podjedinicu 311K4E_12, GS linker, i varijantu HSA C34S (vidite, npr. SEQ ID NO: 201). U drugom specifičnom otelotvorenju, CD40L-specifična Tn3 konstrukcija sadrži jednu monomernu podjedinicu 311K4E_12 sa beta lancem C CELTYG varijante, i kompletno glicinskim linkerom, i varijantu HSA C34S (vidite, npr. SEQ ID NO: 202). U drugom specifičnom otelotvorenju, CD40L-specifična Tn3 konstrukcija sadrži dve monomerne 311K4E_12 podjedinice u tandemu, i dva GS linkera, naznačeno time što jedan GS linker međusobno povezuje podjedinice, a drugi GS linker povezuje jednu podjedinicu sa varijantom HSA C34S (vidite, npr. SEQ ID NO: 203). U još jednom specifičnom otelotvorenju, CD40L-specifična Tn3 konstrukcija sadrži dve monomerne 311K4E_12 podjedinice u tandemu, i dva kompletno glicinska linkera, naznačeno time što jedan kompletno glicinski linker međusobno povezuje podjedinice, a drugi kompletno glicinski linker povezuje jednu podjedinicu sa varijantom HSA C34S (vidite, npr. SEQ ID NO: 204).

[0328] U jednom specifičnom otelotvorenju, CD40L-specifična Tn3 konstrukcija sadrži dve podjedinice 309 povezane u tandem preko GS linkera (vidite, npr. SEQ ID NO: 205). U drugom specifičnom otelotvorenju, CD40L-specifična Tn3 konstrukcija sadrži jednu monomernu podjedinicu 309 povezanu sa varijantom HSA C34S (vidite, npr. SEQ ID NO: 206). U drugom specifičnom otelotvorenju, CD40L-specifična Tn3 konstrukcija sadrži dve podjedinice 309 u tandemu, i dva GS linkera, naznačeno time što jedan GS linker međusobno povezuje podjedinice, a drugi GS linker povezuje jednu podjedinicu sa varijantom HSA C34S (vidite, npr. SEQ ID NO: 207).

[0329] U specifičnom aspektu, CD40L-specifična Tn3 konstrukcija sadrži jednu monomernu podjedinicu 342, GS linker, i varijantu HSA C34S (vidite, npr. SEQ ID NO: 134). U drugom specifičnom aspektu, CD40L-specifična Tn3 konstrukcija sadrži jednu monomernu podjedinicu 342, kompletno glicinski linker, i varijantu HSA C34S (vidite, npr. SEQ ID NO: 144). U drugom specifičnom otelotvorenju, CD40L-specifična Tn3 konstrukcija sadrži dve podjedinice 342 u tandemu, i dva GS linkera, naznačeno time što jedan GS linker međusobno povezuje podjedinice, a drugi GS linker povezuje jednu podjedinicu sa varijantom HSA C34S (vidite, npr. SEQ ID NO: 135). U još jednom specifičnom otelotvorenju, CD40L-specifična Tn3 konstrukcija sadrži dve monomerne podjedinice 342 u tandemu, i dva kompletno glicinska linkera, naznačeno time što jedan kompletno glicinski linker međusobno povezuje podjedinice, a drugi kompletno glicinski linker povezuje jednu podjedinicu sa varijantom HSA C34S (vidite, npr. SEQ ID NO: 145). U još jednom specifičnom otelotvorenju, CD40L-specifična Tn3 konstrukcija sadrži dve 342 podjedinice povezane u tandem preko GS linkera (vidite, npr. SEQ ID NO: 208).

[0330] U specifičnom otelotvorenju, CD40L-specifična Tn3 konstrukcija sadrži U drugom specifičnom otelotvorenju, CD40L-specifična Tn3 konstrukcija sadrži podjedinicu 311, ili podjedinicu izvedenu iz 311 (npr.311K4E_12) i podjedinicu 309, ili podjedinicu izvedenu iz 309 (npr. 342) u tandemu i dva GS linkera, naznačeno time što jedan GS linker međusobno povezuje podjedinice, a drugi GS linker povezuje jednu podjedinicu sa varijantom HSA C34S (vidite, npr. SEQ ID NO: 135). U još jednom specifičnom otelotvorenju, CD40L-specifična Tn3 konstrukcija sadrži podjedinicu 311, ili podjedinicu izvedenu iz 311 (npr.311K4E_12), i podjedinicu 309, ili podjedinicu izvedenu iz 309 (npr. 342) u tandemu, i dva kompletno glicinska linkera, naznačeno time što jedan kompletno glicinski linker međusobno povezuje podjedinice, a drugi kompletno glicinski linker povezuje jednu podjedinicu sa varijantom HSA C34S (vidite, npr. SEQ ID NO: 145).

[0331] Primeri za fuzije CD40L-specifične tandem dvovalentne Tn3 konstrukcije i albumina iz seruma (SA) prikazani su na SL.2A (vidite i SL.9A). Mada su specifični linkeri dati na SL.

2A, razmatrani su drugi linkeri kao što su ovde obezbeđeni. Iako može da se koristi zreli SA divljeg tipa, npr. albumin iz mišjeg seruma (MSA) ili albumin iz humanog seruma (HSA), razmatrano je da jedan ili više aminokiselinskih ostataka cisteina (C) u zrelom SA može biti supstituisano, na primer, serinom (S), alaninom (A), glicinom (G), itd.

[0332] Reprezentativni konstrukti su prikazani u nastavku. Sekvenca SA je podvučena. Linkeri su uokvireni. Podrazumeva se da brojne varijacije ulaze u obim pronalaska. Na primer, linkeri mogu biti izmenjeni (ovde je dato nekoliko neograničavajućih primera), prvi ili dva N-terminalna aminokiselinska ostatka (SQ) mogu biti odsutni i/ili supstituisani alternativnim aminokiselinskim ostacima, može biti uključena oznaka (npr.6xHis oznaka), mogu se koristiti alternativne CD40L-specifične konstrukcije (npr. one na bazi 10. Fn3 domena fibronektina) u sličnom konstruktu, itd.

342 Jednovalentni HSA konstrukt 1 (SEQ ID NO: 134)

342 Jednovalentni HSA konstrukt 2 (SEQ ID NO: 144)

K4E_12 Dvovalentni HSA konstrukt 1 (SEQ ID NO: 203)

1

Farmaceutske kompozicije

[0333] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju, na primer, bez ograničenja, farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži jednu Tn3 konstrukciju ili kombinaciju Tn3 konstrukcija iz predmetnog pronalaska, formulisanu zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Takve kompozicije mogu da uključuju jednu Tn3 konstrukciju ili kombinaciju dve ili više, bez ograničenja, Tn3 konstrukcija iz pronalaska. Na primer, farmaceutska kompozicija iz pronalaska može da sadrži kombinaciju Tn3 konstrukcija koje se vezuju za različite epitope na ciljnom antigenu ili imaju komplementarne aktivnosti. U specifičnom aspektu, farmaceutska kompozicija sadrži Tn3 konstrukciju jednog monomera iz pronalaska. U specifičnom aspektu, farmaceutska kompozicija sadrži multimernu Tn3 konstrukciju iz pronalaska. U još jednom specifičnom aspektu, farmaceutska kompozicija sadrži dimer Tn3 konstrukcije iz pronalaska.

[0334] Farmaceutske kompozicije iz pronalaska takođe mogu da se primene u kombinovanoj terapiji, kao što je kombinacija sa drugim agensima. Na primer, kombinovana terapija može da uključuje Tn3 konstrukciju iz predmetnog pronalaska u kombinaciji sa najmanje jednom drugom terapijom, naznačeno time što terapija može biti imunoterapija, hemioterapija,

1 1

radijaciona terapija, ili terapija lekovima. Farmaceutska jedinjenja iz pronalaska mogu da uključuju jednu ili više farmaceutski prihvatljivih soli.

Metode za upotrebu konstrukcija iz tekućeg pronalaska

[0335] Tn3 konstrukcije iz predmetnog pronalaska mogu da se koriste kao sredstva za in vitro i in vivo dijagnostiku i terapiju. Na primer, ti molekuli mogu da se primene na ćelije u kulturi, npr. in vitro ili ex vivo, ili u ispitaniku, npr. in vivo, za lečenje, prevenciju ili dijagnostikovanje raznih poremećaja.

[0336] Pronalazak takođe obezbeđuje metode za upotrebu Tn3 konstrukcija iz pronalaska. Predmetno otkriće takođe obuhvata upotrebu Tn3 konstrukcija iz pronalaska za prevenciju, dijagnozu, kontrolisanje, lečenje ili poboljšavanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolestima, poremećajima bolesti ili poremećajima, uključujući, bez ograničenja, rak, inflamatorne i autoimunske bolesti, infektivne bolesti, posebno ili u kombinaciji sa drugim terapijama. Otkriće takođe obuhvata upotrebu Tn3 konstrukcija iz pronalaska konjugovanih ili fuzionisanih sa ostatkom (npr. terapeutskim agensom ili lekom) za prevenciju, kontrolisanje, lečenje ili poboljšavanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolestima, poremećajima ili infekcijama, uključujući, bez ograničenja, rak, inflamatorne i autoimunske bolesti, infektivne bolesti, bilo posebno ili u kombinaciji sa drugim terapijama.

[0337] Otkriće takođe obezbeđuje metode za ciljanje epitopa koje se ne može jednostavno postići tradicionalnim antitelima. Na primer, u jednom aspektu Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu da se koriste prvo za ciljanje susednog antigena, i tokom vezivanja drugi vezujući domen može da angažuje kriptični antigen.

[0338] Otkriće takođe obezbeđuje metode za upotrebu Tn3 konstrukcija za približavanje različitih tipova ćelija. U jednom aspektu, proteini iz pronalaska mogu da vežu ciljnu ćeliju sa jednim vezujućim domenom i angažuju drugu ćeliju putem drugog vezujućeg domena. U drugom aspektu, prva ćelija može biti ćelija raka a druga ćelija je imunska efektorska ćelija, kao što je NK ćelija. U drugom aspektu, Tn3 konstrukcija iz pronalaska može da se koristi za ojačavanje interakcije između dve odvojene ćelije, kao što je antigen prezentujuća ćelija i T ćelija, da bi se po mogućnosti povećao imunski odgovor.

1 2

[0339] Otkriće takođe obezbeđuje metode za upotrebu Tn3 konstrukcija za iscrpljivanje ćelijske populacije. U jednom aspektu, metode iz pronalaska su korisne za iscrpljivanje sledećih tipova ćelija: eozinofila, bazofila, neutrofila, T ćelija, B ćelija, mastocita, monocita i tumorskih ćelija.

[0340] Pronalazak takođe obezbeđuje metode za upotrebu Tn3 konstrukcija i kao dijagnostičkih reagenasa. Takvi dijagnostički reagensi mogu da se koriste da se ispita prisustvo ili odsustvo CD40L, prisustvo CD40 receptora, efikasnost vezivanja CD40L za CD40 receptor, slobodni CD40L kod pacijenta, slobodni CD40L u uzorku, ili vezani CD40L za CD40 receptor u uzorku.

[0341] Tn3 konstrukcije iz pronalaska i kompozicije koje ih sadrže korisne su za mnoge svrhe, na primer, kao terapeutici za širok opseg hroničnih i akutnih bolesti i poremećaja, uključujući, bez ograničenja, autoimunske i/ili inflamatorne bolesti. Ovde opisane kompozicije i metode iz pronalaska korisne su za prevenciju ili lečenje autoimunskih i/ili inflamatornih poremećaja.

[0342] Primeri za autoimunske i/ili inflamatorne poremećaje uključuju, bez ograničenja, alopeciju areata, ankilozirajući spondilitis, antifosfolipidni sindrom, autoimunsku Adisonovu bolest, autoimunske bolesti nadbubrežne žlezde, autoimunsku hemolitičku anemiju, autoimunski hepatitis, autoimunski ooforitis i orhitis, Šegrenov sindrom, psorijazu, aterosklerozu, dijabetesnu retinopatiju i druge retinopatije, retrolentalnu fibroplaziju, starosnu degeneraciju makule, neovaskularni glaukom, hemangiome, tireoidne hiperplazije (uključujući Grejvsovu bolest), transplantaciju rožnjače i drugog tkiva, i hroničnu inflamaciju, sepsu, reumatoidni artritis, peritonitis, Kronovu bolest, reperfuzionu povredu, septikemiju, endotoksični šok, cističnu fibrozu, endokarditis, psorijazu, artritis (npr. psorijatični artritis), anafilaktički šok, ishemiju organa, reperfuzionu povredu, povredu kičmene moždine i odbacivanje alografta, autoimunsku trombocitopeniju, Behčetovu bolest, bulozni pemfigoid, kardiomiopatiju, celijakijski dermatitis, sindrom hroničnog umora i imunske disfunkcije (CFIDS), hroničnu inflamatornu demijelinizujuću polineuropatiju, Čurg-Štrausov sindrom, cikatrizirajući pemfigoid, CREST sindrom, bolest hladnog aglutinina, Kronovu bolest, diskoidni lupus, esencijalnu mešanu krioglobulinemiju, fibromijalgiju-fibromiozitis, glomerulonefritis, Grejvsovu bolest, Gijen-Bar, Hašimotov tireoiditis, idiopatsku fibrozu pluća, idiopatsku trombocitopeniju purpura (ITP), IgA neuropatiju, juvenilni artritis, lihen planus, eritemski lupus, Menijerovu bolest, mešovitu bolest vezivnog tkiva, multiplu sklerozu, tip 1 ili

1

imunološki posredovan dijabetes melitus, mijasteniju gravis, pemfigus vulgaris, pernicioznu anemiju, poliarteritis nodosa, polihrondritis, poliglandularne sindrome, reumatsku polimijalgiju, polimiozitis i dermatomiozitis, primarnu agamaglobulinemiju, primarnu bilijarnu cirozu, psorijazu, psorijatični artritis, Rejnoov fenomen, Rajterov sindrom, reumatoidni artritis, sarkoidozu, sklerodermu, Šegrenov sindrom, sindrom ukočenosti mišića, sistemski eritemski lupus, eritemski lupus, takajasu arteritis, temporalni arteritis/arteritis džinovskih ćelija, ulcerativni kolitis, uveitis, vaskulitide kao što je dermatitis herpetiformis vaskulitis, vitiligo, i Vegenerovu granulomatozu.

[0343] Primeri za inflamatorne bolesti uključuju, bez ograničenja, astmu, encefalitis, inflamatornu bolest creva (IBC), hroničnu opstruktivnu bolest pluća (HOBP), alergijske poremećaje, septički šok, plućnu fibrozu, nediferenciranu spondiloartropatiju, nediferenciranu artropatiju, artritis, inflamatornu osteolizu i hroničnu inflamaciju usled hroničnih virusnih ii bakterijskih infekcija. Kompozicije i metode iz pronalaska mogu da se koriste sa jednom ili više klasičnih terapija koje se koriste za prevenciju, kontrolisanje ili lečenje gornjih bolesti.

[0344] Otkriće obezbeđuje metode za prevenciju, kontrolisanje, lečenje ili poboljšavanje raka, autoimunskih, inflamatornih ili infektivnih bolesti ili jednog ili više simptoma ili jednog ili više njihovih simptoma, pri čemu pomenute metode obuhvataju primenu na ispitaniku kome je to potrebno jedne ili više Tn3 konstrukcija iz pronalaska u kombinaciji sa jednim ili više terapeutskih agenasa koji nisu terapeutici za rak (poznate i kao netumorske terapije).

[0345] Primeri za takve agense uključuju, bez ograničenja, antiemetike, antifungalne agense, antibakterijske agense. kao što su antibiotici, antiinflamatorne agense i antivirusne agense. Neograničavajući primeri za antiemetike uključuju metopimazin i metoklopramid. Neograničavajući primeri za antifungalne agense uključuju azolne lekove, imidazol, triazole, polien, amfotericin i ririmidin. Neograničavajući primeri za antibakterijske agense uključuju daktinomicin, bleomicin, eritromicin, penicilin, mitramicin, cefalosporin, imipenem, akstreonam, vankomicin, cikloserin, bacitracin, hloramfenikol, klindamicin, tetraciklin, streptomicin, tobramicin, gentamicin, amikacin, kanamicin, neomicin, spektinomicin, trimetoprim, norfloksacin, refampin, polimiksin, amfotericin B, nistatin, ketokonazol, izonijazid, metronidazol i pentamidin. Neograničavajući primeri za antivirusne agense uključuju nukleozidne analoge (npr. zidovudin, aciklivir, gangciklivir, vidarbin, idoksuridin, trifluridin i ribavirin), foskaret, amantadin, rimantadin, sakvinavir, indinavir, ritonavir,

1 4

interferon („IFN“)-α,β ili γ i AZT. Neograničavajući primeri za antiinflamatorne agense uključuju nesteroidne antiinflamatorne lekove („NSAIL“), steroidne antiinflamatorne lekove, beta agoniste, antiholinergijske agense i metilksantine.

[0346] U jednom aspektu, otkriće uključuje kompozicije koje mogu da leče hroničnu inflamaciju. U jednom aspektu, kompozicije su korisne u ciljanju imunskih ćelija radi uništavanja ili deaktivacije. U jednom aspektu, kompozicije su korisne u ciljanju aktiviranih T ćelija, mirujućih T ćelija, B ćelija, neutrofila, eozinofila, bazofila, mastocita ili dendritskih ćelija. U drugom aspektu, otkriće uključuje kompozicije koje mogu da smanje imunsku ćelijsku funkciju. U drugom aspektu, kompozicije mogu da uklone imunsku ćelijsku funkciju.

[0347] U drugom aspektu, otkriće uključuje kompozicije korisne za lečenje bolesti gastrointestinalnog trakta. Konstrukcije iz pronalaska pokazuju visok stepen stabilnosti u uslovima niskog pH. Stabilnost na niskom pH sugeriše da će kompozicija biti pogodna za oralnu primenu za razne gastrointestinalne poremećaje, kao što je sindrom iritabilnog creva, gastroezofagealni refluks, intestinalne pseudoopstrukcije, damping sindrom, uporna mučnina, peptički ulkus, upala slepog creva, ishemijski kolitis, ulcerozni kolitis, gastritis, bolest Helicobacter pylori, Kronova bolest, Viplova bolest, celijakija, divertikulitis, divertikuloza, disfagija, hijatus hernija, infekcije ezofagealni poremećaji, štucanje, ruminacija, i drugi.

[0348] Pronalazak dalje obezbeđuje kombinatorne kompozicije i metode za upotrebu takvih kompozicija u prevenciji, lečenju, smanjenju ili poboljšanju bolesti ili njenih simptoma. Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu da se kombinuju sa klasičnim terapijama pogodnim za prevenciju, lečenje, smanjenje ili poboljšanje bolesti ili njenih simptoma. Primer klasičnih terapija se može naći u Physician's Desk Reference (56. izd.2002. i 57. izd.2003.). U nekim aspektima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu da se kombinuju sa hemioterapijom, radijacionom terapijom, hirurgijom, imunoterapijom biološkim agensom (anitelo ili peptid), malim molekulima, ili drugom terapijom poznatom u struci. U nekim aspektima, kombinatorna terapija se primenjuje zajedno. U drugim aspektima, kombinatorna terapija se primenjuje odvojeno.

[0349] Pronalazak takođe obezbeđuje metode za dijagnostikovanje bolesti. Tn3 konstrukcije iz pronalaska koje vezuju specifični cilj povezan sa bolešću mogu da se primene u metodi koja se koristi za dijagnostikovanje pomenute bolesti. U jednom aspektu, Tn3 konstrukcije iz

1

pronalaska se koriste u metodi za dijagnostikovanje bolesti kod ispitanika, pri čemu pomenuta metoda uključuje dobijanje uzorka od ispitanika, dovođenje cilja u kontakt sa Tn3 konstrukcijom u pomenutom uzorku pod uslovima koji dopuštaju nastajanje interakcije cilj:konstrukcija, identifikovanje kompleksa cilj:konstrukcija i detektovanje cilja u uzorku. U drugim aspektima, ovde je opisana bolest koja se djagnostikuje.

[0350] Pronalazak takođe obezbeđuje metode za snimanje specifičnih ciljeva. U jednom aspektu, Tn3 konstrukcije iz pronalaska konjugovane sa agensima za snimanje, kao što su zeleno fluorescentni proteini, druge fluorescentne oznake (Cy3, Cy5, rodamin i druge), biotin, ili radioizotopi mogu da se koriste u metodama za snimanje prisustva, lokacije ili progresije specifičnog cilja. U nekim aspektima, metoda snimanja cilja koja uključuje Tn3 konstrukciju iz pronalaska izvodi se in vitro. U drugim aspektima, metoda snimanja cilja koja uključuje Tn3 konstrukciju iz pronalaska izvodi se in vivo. U drugim aspektima, metoda snimanja cilja koja uključuje Tn3 konstrukciju iz pronalaska izvodi se putem MR, PET skeniranja, rendgena, detekcije fluorescencije ili drugim metodama detekcije poznatim u struci.

[0351] Pronalazak takođe obezbeđuje metode za praćenje progresije, relapsa, lečenja ili poboljšavanja bolesti koristeći konstrukcije iz pronalaska. U jednom aspektu, metode za praćenje progresije, relapsa, lečenja ili poboljšavanja bolesti se postižu metodama snimanja, dijagnostikovanja ili dovođenja u kontakt jedinjenja/cilja sa Tn3 konstrukcijom iz pronalaska kao što je ovde prikazana.

Farmaceutsko doziranje i primena

[0352] Da bi se pripremile farmaceutske ili sterilne kompozicije koje uključuju Tn3 konstrukciju iz pronalaska, konstrukcija se meša sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijensom. Za primenu, kompozicije su poželjno bez pirogena, suštinski bez endotoksina i/ili povezanih pirogenih supstanci. Izbor režima primene za terapeutik zavisi od nekoliko faktora, uključujući brzinu konverzije entiteta u serumu ili tkivu, stepen simptoma, imunogenost entiteta i pristupačnost ciljnih ćelija u biološkoj matrici. U nekim aspektima, režim primene maksimizuje količinu terapeutika isporučenu pacijentu u skladu sa prihvatljivim nivoom neželjenih dejstava.

[0353] Stvarni dozni nivoi aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama iz predmetnog pronalaska mogu da variraju tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za

1

postizanje željenog terapeutskog odgovora za konkretnog pacijenta, kompoziciju i režim primene, bez toksičnosti po pacijenta. Odabrani dozni nivo zavisiće od raznih farmakokinetičkih faktora, uključujući aktivnost konkretnih upotrebljenih kompozicija iz predmetnog pronalaska, ili njihovog estra, soli ili amida, načina primene, vremena primene, brzine izlučivanja konkretnog jedinjenja koje se koristi, trajanje lečenja, druge lekove, jedinjenja i/ili supstance upotrebljene u kombinaciji sa konkretnom upotrebljenom kompozicijom, starost, pol, težinu, stanje, opšte zdravlje i prethodnu medicinsku istoriju pacijenta koji se leči, i slične faktore dobro poznate u medicini.

[0354] Kompozicija iz predmetnog pronalaska takođe može da se primeni preko jednog ili više načina primene koristeći jednu ili više raznih metoda poznatih u struci. U nekim otelotvorenjima, Tn3 konstrukcije iz pronalaska mogu da se formulišu kako bi se obezbedila pravilna distribucija in vivo.

Ekvivalenti

[0355] Stručnjaci će znati, ili će moći da utvrde koristeći rutinske eksperimente, mnoge ekvivalente ovde opisanih specifičnih otelotvorenja iz pronalaska.

PRIMERI

[0356] Pronalazak će sada biti opisan u odnosu na sledeće primere.

Primer 1

Konstrukcija biblioteke 3 petlje na matičnoj konstrukciji Tn3

[0357] Konstruisana je biblioteka na bazi matične konstrukcije Tn3, opisana u međunarodnoj patentnoj prijavi publ. br. WO 2009/058379, gde je označena sa „Tn3 SS4“. Biblioteka sadrži randomizovane regione petlji BC, DE i FG. Ovaj dizajn je uključio okarakterisanu sekvencu i različite dužine petlje u biblioteku Tn3 u saglasnosti sa šablonima raznovrsnosti opisanim za prirodne FnIII domene, tri različite dužine za petlje BC i FG, i koristio je mešanu „NHT“ šemu kodona za uvođenje raznovrsnosti u biblioteku (H = A, T, C). Prema ovoj šemi je dobijeno 12 kodona koji su kodirali 12/20 aminokiselina (vidi TABELU 3), to jest, svaki kodon je kodirao jednu aminokiselinu. Štaviše, nije bilo stop kodona ili kodona cisteina (Cys).

1

TABELA 3

[0358] Raznovrsnost biblioteke je postignuta koristeći degenerisane oligonukleotide prikazane u TABELI 4.

TABELA 4

1

Oligo Petlja Sekvenca SEQ ID

[0359] Biblioteka je sastavljena koristeći oligonukleotide prikazane u TABELI 5. TABELA 5

1

[0360] Smeša degenerisanih oligonukleotida (ekvimolarni odnosi oligonukleotida koji odgovaraju petlji BC, odnosno FG), BCX-DE most v2, DE-FGX most v2 i Kpnl amp rev v2, sakupljena je u 20 ciklusa PCR reakcije bez viška eksternih prajmera. Ovaj proizvod je razblažen i amplifikovan regularnom PCR reakcijom koristeći prajmere BC biblioteke amp v2 i KpnI reverzni v2. Dobijeni PCR proizvod je stvorio kompletni gen Tn3 koji je zatim digestovan sa NcoI i KpnI i ligiran u vektor prikaza faga (opisan u WO 2009/058379). DNK je transformisana u E. coli putem elektroporacije. Procenjuje se da finalna raznovrsnost biblioteke ima oko 7,9 x 10<10>članova.

[0361] Posle elektroporacije, biblioteka je inkubirana tokom 1 sata na 37 °C uz mućkanje. Dodat je pomoćni fag M13K07, i ćelije su posle jednog sata razblažene na veću zapreminu i uzgajane na 37 °C uz trešenje preko noći. Sledećeg dana, fag je uklonjen i koncentrovan iz supernatanta taloženjem sa PEG 8000.

Primer 2

Panovanje biblioteka za humane CD40L-specifične Tn3 konstrukcije

[0362] Biblioteke Tn3 prikazane na fagu koje sadrže >10<10>jedinstvenih sekvenci panovane su na CD40L. Raznovrsnost u tim bibliotekama potiče od varijabilnosti sekvence i dužine petlji BC, DE i FG koje su analogne trima petljama CDR u varijabilnom domenu antitela. Selekcija vodećih Tn3 proteina izvršena je panovanjem biblioteka na rekombinantnom biotinilovanom humanom CD40L i ćelijskom linijom CHO sa prekomernom ekspesijom CD40L. Alternativni ciklusi panovanja na ova dva reagensa su korišćeni kako bi se obezbedilo da vodeći proteini prepoznaju rekombinantni ekstracelularni domen, kao i nativni CD40L ankerisan na membrani.

11

[0363] Rekombinantni humani CD40L (Human MegaCD40L; Axxora) biotinilovan je pomoću EZ-Link sulfo-NHS-biotina (Pierce, Rockford, IL) koristeći 5-struki molski višak reagensa za biotinilovanje. Posle inkubacije tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, uzorak je dijalizovan u PBS preko noći da se ukloni nekonjugovani biotin.10 µg biotinilovanog CD40L je imobilisano na M280 streptavidinskim perlicama (Dynal, Carlsbad, CA), a zatim blokirano u PBS-u koji sadrži 10 mg/ml BSA tokom 2 sata. Unos se sastojao od biblioteka razvijenih kako je opisano u Primeru 1, ili su biblioteke dodatno razvijene koristeći standardne tehnike za konstruisanje, kao što je opisano u WO 2009/058379.

[0364] Fagovi su blokirani u PBS-u koji sadrži 10 mg/ml BSA tokom 2 sata. Blokirani unos je dodat u blokirane M280 streptavidinske kontrolne perlice (bez mete) i inkubiran na tresilici tokom 2 sata na sobnoj temperaturi da se potroši biblioteka vezivača na perlicama. Potrošena biblioteka je zatim dodata u perlice premazane sa CD40L i inkubirana tokom 2 sata na sobnoj temperaturi na platformi za ljuljanje. Nakon tri ispiranja pomoću PBST (PBS 0,1% Tween) da se ukloni nevezani fag, perlice su dodate u eksponencijalno rastuće ćelije E. coli XL-1 Blue, koje su zatim koinficirane pomoćnim fagom M13K07 u 60 ml 2xYT medijuma koji sadrži 50 µg/ml karbenicilina. Nakon rasta preko noći na 37 °C uz trešenje, fagovi su sakupljeni taloženjem pomoću PEG iz medijuma dobijenog uzgajanjem preko noći.

[0365] Drugi ciklus panovanja (2. ciklus) izveden je na CHO ćelijskoj liniji koja prekomerno eksprimira CD40L. Biblioteka faga je blokirana u 3% BSA/PBS ljuljanjem na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Ćeije su odvojene pomoću akutaze (Invitrogen), isprane 2x sa 5 ml PBS, i 10<7>ćelija je blokirano u 1 ml 3% BSA/PBS ljuljanjem na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Blokirane ćelije su centrifugirane na 500xg, 5 minuta, pažljivo ponovo suspendovane u rastvoru blokirane biblioteke faga, i inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi. Nevezani fag je uklonjen pažljivim ispiranjem ćelija 3 puta sa 1 ml 3% BSA/PBS i jednom sa PBS-om, peletiranjem ćelija centrifugiranjem na 500xg tokom 5 minuta u mikrocentrifugi koristeći čistu Ependorf epruvetu za svako ispiranje. Ćelijski pelet je direktno dodat u eksponencijalno rastuće ćelije E. coli XL-1 Blue, koje su zatim obrađene kao što je opisano za 1. ciklus.

[0366] Panovanje u 3. ciklusu izvedeno je kao što je opisano za 1. ciklus, osim što su vezani fagovi eluirani dodatkom 100 mM HC1 i neutralizacijom sa 1 M Tris-HC1, pH 8. Eluirani, neutralizovani fag je korišćen za inficiranje ćelija E. coli XL1 Blue, kao što je opisano za 1. ciklus.

[0367] Panovanje u 4. ciklusu je ponovo izvedeno na ćelijama kao što je opisano za 2. ciklus, osim što je izvršeno 5 ispiranja sa 3% BSA/PBS. 5. ciklus je izveden koristeći 5 µg of biotinilovanog MegaCD40L, sve drugo je kao što je opisano za 3. ciklus.

[0368] Nakon 5 ciklusa panovanja, izvršen je skrining dobijenih varijanti Tn3 kao rastvornog proteina. Zalihe amplifikovanih faga istaloženih pomoću PEG korišćene su kod PCR za amplifikaciju objedinjenih fragmenata koji obuhvataju kodirane sekvence Tn3. Ovaj skup fragmenata je digestovan sa NcoI KpnI i kloniran u odgovarajuća mesta NcoI KpnI plazmida pSec-oppA(L25M)-Tn3 (vidite, na primer, WO 2009/058379). Autoindukujući MagicMedia (Invitrogen) koji sadrži karbenicilin (100 µg/ml) na pločama sa 96 dubokih bunarčića inokuliran je ćelijama E. coli BL21 DE3 transformisanim konstruktom pSecoppA(L25M) izvedenim iz Tn3. Kulture su uzgajane tokom 18 sati uz trešenje na 37 °C, a ćelije si odvojene od medijuma centrifugiranjem. Medijum koji sadrži izlučene, rastvorne varijante Tn3 korišćen je direktno u skrining testu za vezivanje CD40L.

[0369] Deset kompleta od 96 klonova je pretraženo da bi se identifikovali proteini Tn3 koji se specifično vezuju za rekombinantni CD40L. Ukratko, u skrining testu je korišćeno hvatanje rastvornih His-označenih varijanti Tn3 izlučenih u medijum putem vezivanja za anti-His antitelo imobilisano u bunarčićima mikroploča. Nakon hvatanja, medijum i višak proteina su uklonjeni ispiranjem, a interakcija između uhvaćenih varijanti Tn3 i CD40L je praćena korišćenjem biotinilovanog humanog MegaCD40L i određivanjem preostalog cilja (posle pranja ploče) pomoću SA-HRP i klasičnih reagenasa za ELISA.

[0370] U koraku hvatanja, imobilisano anti-his antitelo je zasićeno sa Tn3, i molski odnos uhvaćenog Tn3 u svakom bunarčiću je postao gotovo identičan nezavisno od nivoa ekspresije pojedinačnih klonova. Ova normalizacija nivoa Tn3 dala je nivoe testa srazmerne efikasnosti ciljne interakcije bez uticaja moguće razlike nivoa ekspresije proteina.

[0371] Pozitivni uzorci iz ovog testa su sekvencirani, i identifikovane su 34 jedinstvene sekvence Tn3 koje vezuju rekombinantni CD40L. Iz panela jedinstvenih CD40L-vezujućih sekvenci Tn3, podgrupa od 24 klona sa snažnim signalom na testu i dobrim nivoima ekspresije na osnovu SDS-PAGE supernatanata kulture podvrgnuta je ponovnoj ekspresiji i prečišćavanju u malom obimu.

[0372] Ukratko, Superbroth medijum koji sadrži karbenicilin (100 µg/ml) sa 1% glukoze) inokulisan je ćelijama E. coli BL21 DE3 transformisanim pSec-oppA(L25M)-Tn3 izvedenim konstruktima. Kulture su uzgajane na 37 °C do optičke gustine (O.D.) od 0,5-0,8, a zatim su indukovane sa 0,2 mM IPTG. Nakon trešenja na 37 °C tokom 5 sati, ćelije su odvojene od medijuma putem centrifugiranja. Prečišćavanje Tn3 konstrukcija iz medijuma izvršeno je šaržnim prečišćavanjem koristeći Ni-NTA Superflow (Qiagen), ispiranjem sa 2x PBS sa 20 mM imidazola, i eluiranjem sa 2x PBS sa 250 mM imidazola. Uzorci su dijalizovani u PBS-u, i koncentracija je određena preko UV apsorpcije na 280 nm prema postupku koji su dali Gill i von Hippel (Anal. Biochem.182: 319, 1989).

[0373] Na osnovu rangiranja na testu i ponašanja prilikom SEC, ekpresija 8 vodećih uzoraka je urađena u povećanom obimu i prečišćena do niskog nivoa endotoksina (< 1 EU/mg) radi ispitivanja na testu funkcionalnosti ćelije.

[0374] Dva Tn3 klona (označena kao 309 i 311) pokazala su sličnu aktivnost na biohemijskim testovima i testovima na bazi ćelija (SL.6A, 6B, 6C), i bili su 3-5 puta potentniji od najbližeg konkurentskog klona.

[0375] Humane CD40L-specifične jednovalentne Tn3 konstrukcije 309 i 311 inhibirale su ukupan broj B ćelija, broj plazmocita i prebacivanje klase Ig (SL. 6A, 6B i 6C). SL. 6A prikazuje inhibitorni efekat 309 i 311 na HuCD40L-indukovanu CD86 ekspresiju na CD19 pozitivnim humanim PBMC stimulisanim Jurkatovim D1.1 ćelijama; SL. 6B prikazuje inhibiciju HuCD40L stimulisane proliferacije B ćelija od strane 309 i 311; i SL.6C prikazuje inhibiciju broja plazmocita u kokulturama T/B ćelija. Pokazano je da 309 vezuje aktivirane primarne T ćelije putem FACS (podaci nisu prikazani). PBMC su stimulisane od strane rekombinantnog humanog MegaCD40L (Axxora) ili Jurkatovih ćelija koje eksprimiraju humani CD40L (D1.1, ATCC), a procenat CD19+/CD86+ ćelija je izmeren putem FACS nakon 24 sata.

[0376] Vodeći klonovi 309 i 311 su monodispergovani i nisu pokazali težnju ka agregaciji niti su formirali oligomere višeg reda u rastvoru, što je određeno gel hromatografijom (SEC) prečišćenih uzoraka (SL.7A).

11

[0377] Toplotna stabilnost vodećih klonova 309 i 311 određena je diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC) koristeći uzorke proteina koncentracije 1 mg/ml u PBS-u pH 7,2 i upoređena je sa toplotnom stabilnošću matičnog proteina Tn3 (Sl.7B). Vodeći klonovi 309 i 3011 imali su Tm70 ± 1 °C što je neznatno niže od Tmmatičnog Tn3 (72 °C).

[0378] Pošto nisu identifikovani mišji unakrsno reaktivni klonovi, sličan proces panovanja kao što je gore opisan sproveden je da bi se identifikovali mišji specifični Tn3 označeni sa M13. M13 je takođe ispoljio aktivnost na testu na bazi PBMC ćelija (vidite SL.1A)

Primer 3

Optimizacija vodećih klonova CD40L-specifičnih Tn3 konstrukcija

[0379] Optimizacija afiniteta je upotrebljena za povećanje potentnosti odabranih vodećih klonova Tn3. Generalno, izveden je jedan ili više ciklusa mutageneze u okviru Tn3 petlji koje dolaze u kontakt sa ciljem, uz odabir poboljšanih varijanti iz kombinatornih biblioteka displeja faga.

3.1 Zamena petlji

[0380] Da bi se odredilo koja od 3 petlje u dva vodeća klona je uključena u interakciju sa CD40L, napravljeni su konstrukti u kojima je svaka pojedinačna sekvenca petlje zamenjena matičnom sekvencom Tn3 petlje, koja se nalazi u humanom tenascinu C. Aktivnosti mutiranih varijanti su upoređene sa originalnim varijantama u testu vezivanja izvedenom kako je opisano za gornji skrining test (SL.10A). Za oba vodeća klona, mutacije BC i DE petlje su dovele do potpunog gubitka vezivanja za CD40L, dok zamena FG petlje matičnom sekvencom Tn3 nije imala efekta (za 309) ili je imala ograničen efekat (311) na vezivanje. Tako, izgleda da petlje BC i DE sadrže sekvence koje su uglavnom odgovorne za kontakt sa CD40L, i zato su primarno odabrane za optimizaciju afiniteta.

3.2 Optimizacija vodećih klonova CD40L-specifičnih Tn3 konstrukcija 309

[0381] Pošto je eksperiment zamene petlji pokazao da sekvenca 309 FG petlje može biti zamenjena matičnom sekvencom FG petlje Tn3 bez značajnog gubitka potentnosti vezivanja, odlučeno je da se ovaj konstrukt (nazvan 309FGwt) koristi kao skelet za afinitetno sazrevanje. Time bi se eliminisale nesuštinske mutacije koje odstupaju od matične sekvence tenascina C, kako bi se smanjio rizik od moguće imunogenosti. Treba napomenuti da matična sekvenca FG petlje Tn3 sadrži motiv RGD koji je kasnije eliminisan mutacijom u finalnim vodećim molekulima. Napravljene su tri biblioteke BC petlje i jedna biblioteka DE petlje.

[0382] Za tri biblioteke BC petlje sprovedena su tri ciklusa PCR koristeći degenerisane oligonukleotide BC9 PCR, BC 9-petlja NNK, i 309 BC-petlja NNKdope (TABELA 6) sa reversnim prajmerom Kpn1 amp rev v2 (TABELA 5) koristeći šablon izveden iz 309FGwt u kome su kodoni BC petlje zamenjeni stop kodonima. Zatim je PCR amplifikacijom tih fragmenata sa prajmerima BC biblioteke amp v2 (TABELA 5) i KpnI reverzna v2 dobijena puna dužina fragmenta biblioteke Tn3.

[0383] Kod biblioteke DE petlje, PCR amplifikacijom sa DE PCR i KpnI amp reverzna v2 koristeći šablon izveden iz 309FGwt (u kome su kodoni DE petlje zamenjeni stop kodonima) dobijen je fragment koji sadrži randomizovaanu DE petlju i FG petlju Tn3 divljrg tipa koja je kombinovana sa fragmentom koji kodira Tn3 region ushodno od DE petlje dobijene putem PCR sa BC bibliotekom amp v2 i BCX-DE most v2 na šablonu 309. Dva fragmenta su spojena putem PCR sa preklapanjem, sa eksternim prajmerima BC biblioteke amp v2 i KpnI reverzni v2.

TABELA 6: DNK oligonukleotidi korišćeni za stvaranje biblioteke 309FGwt LO

Oligo Sekvenca SEQ ID

11

[0384] Fragmenti Ncol-Kpnl su klonirani u vektor prikaza faga, i napravljena je biblioteka faga kao što je opisano u Primeru 1.

[0385] Četiri biblioteke su odvojeno panovane na biotinilovanom humanom MegaCD40L, kao što je opisano za prvi ciklus u Primeru 2, koristeći 4 µg CD40L u 1. ciklusu i 1 µg u 2. ciklusu. Nakon amplifikacije izlaza faga posle 2. ciklusa. jednolančana DNK je izolovana koristeći komplet Qiagen Spin M13 (Qiagen, Valencia, CA), a skupovi fragmenata koji sadrže BC petlju iz biblioteka BC petlji su amplifikovani koristeći BC bibl amp v2 i BC mešanje rev, pri čemu je skup fragmenata koji sadrže DE petlju amplifikovan iz biblioteke DE petlji pomoću prajmera DE-mešanje FWD i KpnI reverzni v2. PCR fragmenti su prečišćeni na silika gelu i spojeni preko svoje preklapajuće sekvence koristeći eksterne prajmere BC lib amp v2 i KpnI reverzni v2. Dobijeni PCR fragment je korišćen za dobijanje biblioteke u vektoru faga, kao što je prethodno opisano. Ova biblioteka je panovana u ukupno 5 ciklusa na biotinilovanom humanom MegaCD40L, kao što je opisano u Primeru 2, osim što su biblioteke prvobitno dovedene u kontakt sa ciljem pri koncentraciji od 50 nM, 20 nM, 20 nM i 10 nM (u ukupnoj

11

zapremini od 50 µl) od 1. do 4. ciklusa tokom 2 sata pre inkubacije blokiranim M280 streptavidinskim magnetnim perlicama tokom 10 minuta, a zatim isprane.

[0386] Izlazi su grupno klonirani u NcoI - KpnI mesta plazmida pSec-oppA(L25M)-Tn3 pSec, i šesnaest ploča sa 96 bunarčića je pretraženo na vezivanje CD40L koristeći rastvorni protein u goreopisanom skrining testu. 270 klonova sa najvišim rezultatom je izdvojeno, ponovo testirano i sekvencirano. Odabrano je deset klonova za dalju karakterizaciju na bazi testa vezivanja i analize sekvenci. To je uključivalo ocenjivanje potentnosti u testu sa PBMC, određivanje Kdza vezivanje za CD40L na testu biosenzora, termodinamičku stabilnost određenu diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom, i težnju ka agregaciji ili formiranju oligomera višeg reda u rastvoru pomoću gel hromatografije. Rezultati su sažeti u TABELI 7. Sekvence klonova 309 i 309FGwt poravnate sa deset optimizovanih klonova (označenih kao 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348 i 349) prikazane su na SL.11A i 11B.

[0387] Afinitetno sazrele varijante su imale 1-3 reda veličine veću potentnost od klona 309, zadržale su veliku stabilnost, izmereno putem DSC, i većina je monodispergovana, kao što je određeno putem SEC.

TABELA 7

Varijanta PBMC IC50 (nM) Kd (nM) SEC profil Tm, DSC (°C)

11

[0388] Testovi sa PBMC su izvedeni stimulacijom PBMC Jurkatovim ćelijama koje eksprimiraju humani CD40L (D1.1, ATCC), i procenat CD19+/CD86+ ćelija je izmeren putem FACS nakon 24 sata. Ovaj test je korišćen da se ispita i rangira panel vodećih Tn3 konstrukcija koji proizilazi iz favorizovanja na bazi biohemijskih kriterijuma. Rezultati testova sa PBMC su prikazani na SL.10B, i sažeti u TABELI 7.

[0389] Merenja afiniteta su izvedena na sistemu nizova za proteinsku interakciju ProteOn XPR36 (Bio-Rad, Hercules, CA) sa GLC senzorskim čipom na 25 °C. Kao radni pufer je korišćen ProteOn fiziološki rastvor puferovan fosfatom sa 0,005% Tween 20, pH 7,4 (PBS/Tween). Humani MegaCD40L je imobilisan na čipu pri površinskoj gustini od oko 2300 RU. Dvostruka razblaženja varijanti Tn3 (340, 342, 343, 345, 346, 347, 348 i 349) pripremljena su u PBS/Tween/0,5 mg/ml BSA, pH 7,4 (od 150 do 4,7 nM). Uzorci svake koncentracije su injektovani u šest kanala analita pri protoku od 30 µl/min tokom 300 sekundi. Kdje određena koristeći postavku ravnotežne analize u softveru ProteOn. Rezultati su prikazani u TABELI 7.

[0390] Stabilnost deset TCD40L-specifičnih varijanti Tn3 je analizirana pomoću DSC. Ukratko, merenje DSC je izvedeno na VP kapilarnom DSC (MicroCal). Proteini su izmenjeni u PBS (pH 7,2) putem opsežne dijalize, i podešeni na koncentraciju od 0,25-0,5 mg/ml za DSC analizu. Uzorci su skenirani od 20-95 °C pri brzini skeniranja od 90 °C/sat, bez ponavljanja. Rezultati su prikazani u TABELI 7.

[0391] Za najbolje klonove je dobijeno poboljšanje IC50do 300 puta u odnosu na 309, i više od 1000-struko poboljšanje u odnosu na skelet 309FGwt korišćen za stvaranje biblioteke za optimizaciju vodećih klonova. Sedam klonova je imalo Kdu jednocifrenom nanometarskom opsegu.

3.3 Optimizacija vodećih klonova CD40L-specifičnih Tn3 konstrukcija 311

Pre izvođenja prethodno pomenutog eksperimenta korišćenja petlje (vidite SL. 10A) [0392] Prvi pokušaj vezan za biblioteku za optimizaciju vodećih klonova fokusirao se na uvođenje raznovrsnosti u FG petlji 311, stvaranje i pretraživanje rezultujuće biblioteke prikaza faga. Skrining je izveden nakon 4 ciklusa panovanja biotinilovanog humanog MegaCD40L kao što je prethodno opisano, i nađeno je da najveći broj pozitivnih rezultata sadrži slučajnu mutaciju ostatka K4 u E u N-terminalnom konstantnom regionu Tn3, ushodno od BC petlje. Nije detektovan očigledni konsenzus među sekvencama FG petlje pozitivnih rezultata.

11

Uvođenje jedne mutacije K4E u 311 dovelo je do oko 100-strukog povećanja potentnosti (od oko 4 µM do 36 nM) na testu sa PBMC (vidite SL.10C).

[0393] Pošto je eksperiment zamene petlji pokazao da su za vezivanje za CD40L potrebne sekvence BC i DE petlji, te petlje su zatim ciljane u skeletu 311K4E radi dodatnog afinitetnog sazrevanja. Napravljene su dve odvojene biblioteke. Jedna biblioteka je ciljala BC petlju sa strategijom u kojoj svaki ostatak ima 50% šanse da bude sekvenca 311 divljeg tipa, i oko 50% šanse da bude jedan od preostalih 11 NHT kodiranih ostataka. Druga biblioteka je potpuno randomizovala DE petlju sa 6 ostataka.

[0394] Kod biblioteke DE petlje, oligonukleotidi BC11-311Gly i BC11-311NHT (TABELA 8) upotrebljeni su u PCR reakcijama sa reverznim prajmerom KpnI amp rev v2 (TABELA 5) na šablonu dobijenom od 311 u kome su kodoni BC petlje zamenjeni stop kodonima da bi se dobili fragmenti koji uključuju BC, DE i FG petlje. Najzad, amplifikacijom smeše 1:1 tih fragmenata sa prajmerima BC biblioteke amp K4E i KpnI rev v2 dobijena je puna dužina fragmenta biblioteke Tn3.

[0395] Biblioteka DE petlje je napravljena kao goreopisana biblioteka 309FGwt DE petlje, osim što je šablon izveden iz 311 korišćen u PCR reakcijama a BC biblioteka i K4E prajmer su korišćeni u finalnoj PCR amplifikaciji.

TABELA 8. Oligonukleotidi upotrebljeni za stvaranje biblioteke za optimizaciju vodećeg kodona 311K4E.

11

Oligo Sekvenca SEQ

[0396] Fragmenti biblioteke pune dužine su digestovani sa Ncol i Kpnl, klonirani u vektor prikaza faga, i napravljene su biblioteke faga kao što je opisano u Primeru 1.

[0397] Dve biblioteke su odvojeno panovane na biotinilovanom humanom MegaCD40L, kao što je opisano u Primeru 1, koristeći 10 g proteina u 1. ciklusu, 5 g u 2. ciklusu i 5 g u 3. ciklusu. Nakon amplifikacije izlaza faga posle 3. runde, jednolančana DNK je izolovana koristeći komplet Qiagen (Qiagen, Valencia, CA), i dve biblioteke su pomešane kao što je opisano za bilioteke 309FGwt. Pomešana biblioteka je panovana ukupno 5 ciklusa na biotinilovanom

12

humanom MegaCD40L, kao što je opisano iznad za pomešanu biblioteku 309FGwt koristeći 100 nM, 20 nM, 4 nM, 1 nM i InM cilja za 1-5. ciklus.

[0398] Izlazi su grupno klonirani u rastvoran sekrecioni vektor, kao što je već opisano, i pet ploča sa 96 bunarčića je pretraženo na vezivanje CD40L koristeći prethodno opisani skrining test za rastvorne proteine. Pozitivni rezultati su identifikovani u odnosu na signal dobijen sa varijantom skeleta 311K4E. 18 jedinstvenih klonova sa najvišim rezultatom, označeni kao 311K4E_1, 311K4E_2, 311K4E_3, 311K4E_4311K4E_5, 311K4E_7, 311K4E_8, 311K4E_9, 311K4E_10, 311K4E_11, 311K4E_12, 311K4E_13, 311K4E_14, 311K4E_15, 311K4E_16, 311K4E_19, 311K4E_20 i 311K4E_21 (sekvence prikazane na SL.12A i SL.12B) ispitani su kao sirovi neprečišćeni proteini radi rangiranja povratne brzine. Procene povratne brzine neprečišćenih Tn3 konstrukcija izvršene su na sistemu nizova za proteinsku interakciju ProteOn XPR36 (Bio-Rad, Hercules, CA) na testu biosenzora sa CD40L imobilisanim na čipu. Mega humani CD40L je imobilisan na GLC čipu (BioRad) i sve varijante su razblažene do procenjene koncentracije od 80 nm, injektovane pri protoku od 30 µl/min tokom 300 sekundi, s vremenom disocijacije podešenim na 1200 sekundi. Kao radni pufer korišćen je PBS, 0,005% Tween20, 3mM EDTA, pH 7,4. Povratne brzine su rangirane vizuelnim pregledom senzorgrama. Podskup od četiri varijante koje su prikazale najsporije povratne brzine, 311K4E_3, 311K4E_11, 311K4E_12 i 311K4E_15, prečišćen je, i Kdvrednosti su iznosile od 1,1 do 6,4 nM (TABELA 9).

TABELA 9. Kdza vezivanje 311K4E i 4 afinitetno prečišćene varijante za humani CD40L.

[0399] Kao što je prikazano na SL.10D, snižena Kd(od 18 nM do 1 nM) 311K4E_12 odgovara 12-strukom povećanju potentnosti u PBMC testu u odnosu na skelet 311K4E.

[0400] Kao zaključak, kampanje za optimizaciju vodećih klonova početnih pogodaka kod 309 i 311 iz naivnih biblioteka dovode do vezivača CD40L u jednocifrenom nanometarskom opsegu.

[0401] Slična kampanja optimizacije je izvedena na mišje-specifičnom molekulu M13 (podaci nisu prikazani). Rezultujući dobijeni optimizovani CD40L-specifični molekul (označen sa M31) pokazao je oko 20-struko povećanje potentnosti u testu sa PBMC u odnosu na matični molekul (SL.1A).

Primer 4

Ekspresija i prečišćavanje neobeleženih CD40L-specifičnih Tn3-HSA fuzionih proteina [0402] Tn3 konstrukti fuzionisani sa HSA, kao što je naznačeno na SL.2A i 9A, eksprimirani su u ćelijskoj liniji sisara 293F prolaznom transfekcijom. Ekspresioni konstrukti fuzije Tn3-HSA su napravljeni na bazi interno kreiranih ekspresionih vektora sisara. Da bi se poboljšala homogenost proizvoda, korišćen je mutantni oblik HSA (označen kao HSA C34S) u kome je nespareni, delimično izloženi cistein 34 mutiran u serin (Zhao et al., 2009, Eur. J. Pharm. Biopharm. 72: 405-11).

[0403] Fuzioni protein može da se prečisti u jednom koraku jonoizmenjivačkom hromatografijom. Primer za eluiranje 309-309-HSA sa kolone Q-HP (GE HealthCare) pomoću gradijenta soli prikazan je na SL.9B. Pored glavnog pika, vide se manji pikovi koji se kasnije eluiraju (koji čine manje od 10% ukupne površine pika). Masena spektrometrija je pokazala da su ti manji sporedni pikovi obogaćeni vrstama 309-309-HSA. Frakcije koje sadrže glavni pik su objedinjene i korišćene u narednim testovima aktivnosti.

[0404] Kod prečiščavanja u većem obimu, gorepomenutom koraku IEX je prethodilo hvatanje fuzija Tn3-HSA iz supernatanta kulture afinitetnom hromatografijom koristeći afinitetne matrice za HSA, npr. HiTrap Blue HP (GE HealthCare). Nakon ispiranja, HSA fuzioni protein je mogao da se eluira pomoću pufera koji sadrži oktensku kiselinu. Eluat je 3-struko razblažen u fosfatom puferu i nanet na kolonu Q-HP.

[0405] Analizom manjeg pika (jednog ili više) otkriveno je prisustvo O-vezanih ugljovodoničnih ostataka. Pretpostavljeno je da je O-glikan heterogena smeša ugljenih hidrata dobijenih od prethodno objavljene O-ksilozilovane osnovne strukture (Wakabayashi et al., 1999, J. Biol. Chem.274:5436-5442) prikazane u nastavku:

galaktoza

galaktoza

ksiloza

protein

Određeno je da se preovlađujuće mesto vezivanja nalazi u linkeru GGGGS između domena Tn3. Takođe je nađeno da je glikan prisutan u manjoj meri u linkeru GGGGS nađenom između Tn3 i HSA. Nivoi O-glikana su tako viši u dvovalentnom konstruktu u poređenju sa jednovalentnim konstruktima, i viši su u supstanci proizvedenoj u HEK ćelijama u poređenju sa CHO ćelijama. Nivoi su takođe varirali kod različitih Tn3 konstrukata. Tako, nivo O-glikana može biti snižen pažljivim izborom ćelije domaćina, na primer, upotrebom CHO ćelija ili drugih ćelija za proizvodnju supstance sa nižim nivoom O-glikana. Pored toga, supstanca koja sadrži O-glikan može biti uklonjena metodama prečišćavanja kako bi se dobio homogeniji proizvod koji nema O-glikan. Alternativno, linker može biti modifikovan da bi se uklonilo primarno mesto (ili mesta) vezivanja O-glikana, na primer, mutacijom ostatka Ser u Gly. Linkeri kod nekoliko konstrukata su ponovo konstruisani da se dobije jedan ili više linkera GGGGG. Nikakvi O-glikani nisu detektovani u supstanci sa linkerom (linkerima) GGGGG, i nije primećena razlika u aktivnosti (podaci nisu prikazani).

Primer 5

Produženje poluživota u serumu CD40L-specifičnih Tn3 konstrukcija

[0406] Istraživana je fuzija sa albuminom iz seruma kao strategija za produženje poluživota u serumu CD40L-specifičnih Tn3 konstrukcija. Da bi se odredila farmakokinetička (FK) svojstva mišjih CD40L specifičnih Tn3-MSA fuzija, sproveden je FK test na mišu. Za ispitivanje surogatnih molekula odabrane su MSA fuzije umesto odgovarajućih HSA fuzija jer mišji FcRn vezuje HSA znatno slabije nego što vezuje MSA, što dovodi do smanjenog recikliranja iz endozoma i usled toga do povećane konverzije (Andersen et al. J. Biol. Chem.

285, 4826-4836, 2010).

[0407] Korišćene su HEK 293 ćelije za ekspresiju mišje CD40L-specifične tandem dvovalentne Tn3 konstrukcije fuzionisane sa MSA. Primećeni su visoki nivoi ekspresije (SL.

12

3A). Ovi konstrukti imaju (G4S) linker između jedinica Tn3 konstrukcije i 3 (G4S) ponavljanja linkera između konstrukcije i MSA. Pored toga, uvedena je mutacija N49Q u svaku M13 i M31 konstrukciju da se ukloni potencijalno N-vezano mesto glikozilacije. Ova mutacija ne utiče na potentnost ovih konstrukcija (podaci nisu prikazani). Procenjeno je da nivo ekspresije iznosi 200 mg/l 6 dana posle transfekcije. Prečišćavanje je izvedeno putem IMAC preko C-terminalne His-oznake. Procenjeno je da prinos prečišćenog proteina iznosi 125 mg/l supernatanta kulture.

[0408] Kada je MSA fuzionisan sa dvovalentnim konstrukcijama M13, primećeno je 8-struko smanjenje potentnosti u poređenju sa M13 dimernom konstrukcijom bez MSA (SL. 3B). Dvovalentna konstrukcija koja sadrži afinitetno zreli M31 fuzionisan sa MSA bila je 140 puta potentnija od odgovarajuće M13 dvovalentne konstrukcije fuzionisane sa MSA, oko 900 puta puta potentnija od jednovalentne fuzije M31 MSA, i imala je potentnost uporedivu sa MR1 antimišjim CD40L monoklonskim antitelom (SL.3C).

[0409] Da bi se odredila FK svojstva CD40L specifičnih Tn3-MSA fuzija, sproveden je FK test na mišu. Proteinski konstrukti su primenjeni intravenski sa 10 mg/kg kod ženki CD-1 miševa starih 5-7 nedelja. Svakom mišu je uzeto 150 µl krvi u različitim terminima, i koncentracijeTn3-HSA fuzije u serumu su određene ELISA testom. Ukratko, ploče Nunc MaxiSorp su prekrivene anti-FLAG M2 antitelom (Agilent), blokirane u 4% mleku u PBS+0.1%Tween (PBST) i inkubirane sa mišjim MegaCD40L (Axxora). MegaCD40L je imobilisan preko svoje FLAG oznake. Uzorci seruma i standardi proteina su razblaženi u 4% mleku PBST i dodati nakon ispiranja ploče sa PBST. Nakon inkubacije, ploče su isprane sa PBST, i zečje anti-TN3 poliklonsko antitelo (Covance) je korišćeno za detektovanje konstrukata Tn3-HSA fuzije koristeći kozje antizečje HRP-konjugovano antitelo (Jackson ImmunoResearch) prema standardnom protokolu za ELISA test. Koncentracije u uzorcima seruma su određene na bazi linearne regresije standardnih krivih dobijenih testovima razblaživanja istog konstrukta fuzije Tn3-MSA. Koncentracije su određene kao srednja vrednost za 3 različita miša.

[0410] Kao što se vidi na SL.4A, M31-MSA i M13-M13-MSA su imali poluživot od 38 sati, odnosno 31 sat, dok je konstrukt M31-M31-HSA imao poluživot od 12 sati. Poređenja radi, sam M13-M13 tandem konstrukt (bez fuzije sa MSA) imao je poluživot od 30 minuta (nije prikazano).

[0411] Nasuprot zapažanjima kod mišjih konstrukcija, kada je HSA fuzionisan sa humanim CD40L specifičnim konstrukcijama nije bilo značajnog smanjenja potentnosti. SL. 9C pokazuje da nema značajnog smanjenja potentnosti prilikom fuzionisanja humane CD40L-specifične dvovalentne Tn3 konstrukcije koja sadrži dva monomera 309 sa HSA, mereno PMBC testom.

[0412] FK osobine konstrukta humanog CD40L-specifičnog 342-HSA monomera upoređene su sa osobinama varijante 342-HSA koja sadrži dve supstitucije (L463N i K524L) radi povećanja poluživota u serumu kod majmuna cinomolgus nakon jedne intravenske injekcije. Proteinski konstrukti su primenjeni putem spore bolusne injekcije sa 10 mg/kg na mužjacima majmuna cinomolgus težine 2-5 kg. 1 ml krvi/životinji/terminu sakupljeno je iz perifernog krvnog suda pre davanja doze, 5 minuta i 30 minuta posle doze; 2, 12, 24 i 48 sati posle doze, i 4, 8, 11, 15, 22, 29, 36, 43. i 57. dana. Koncentracija Tn3-HSA fuzije u serumu određena je ELISA testom. Ukratko, ploče Nunc MaxiSorp su prekrivene anti-FLAG M2 antitelom (Agilent), blokirane u 4% mleku u PBS+0.1%Tween (PBST) i inkubirane sa humanim MegaCD40L (Axxora). MegaCD40L je imobilisan preko svoje FLAG oznake. Uzorci seruma i standardi proteina su razblaženi u 4% mleku PBST i dodati nakon ispiranja ploče sa PBST. Nakon inkubacije, ploče su isprane sa PBST, i zečje anti-TN3 poliklonsko antitelo (Covance) je korišćeno za detektovanje konstrukata Tn3-HSA fuzije koristeći kozje antizečje HRP-konjugovano antitelo (Jackson ImmunoResearch) prema standardnom protokolu za ELISA test. Koncentracije u uzorcima seruma su određene na bazi linearne regresije standardnih krivih dobijenih testovima razblaživanja istog konstrukta fuzije Tn3-HSA. Koncentracije su prikazane na SL. 4B. Poluživot konstrukta 342-HSA bio je oko 7 dana, dok je varijanta konstrukta 342-HSA L463N/K524L imala povećan poluživot od 13-17 dana tokom početne linearne faze (SL.4B). Nakon 30 dana, koncentracije u serumu varijante konstrukta 342-HSA L463N/K524L opadale su brže u poređenju sa HSA konstruktom divljeg tipa. Ova zapažanja mogu da ukažu na izvesnu imunogenost ovog konstrukta kod majmuna.

Primer 6

Karakterizacija CD40L-specifičnih Tn3 konstrukcija

6.1 Eksperimentalne metode

[0413] 6.1.1 Test stimulacije PBMC: Krv je dobijena od zdravih davalaca prema bezbednosnim smernicama Medlmmune. PBMC su izolovane pomoću CPT epruveta (centrifuga 1500g tokom 20 minuta) i 1 x 10<6>PBMC (po stanju) stimulisano je pomoću

12

rekombinantnog humanog MegaCD40L (Axxora) ili Jurkatovim ćelijama koje eksprimiraju humani CD40L (D1.1, ATCC). Procenat CD19+/CD86+ ćelija je izmeren putem FACS nakon 24 sata stimulacije. Ovaj test je korišćen da se ispita i rangira panel vodećih Tn3 konstrukcija koji proizilazi iz favorizovanja na bazi biohemijskih kriterijuma. Test takođe može biti izveden pomoću mišje CD40L-eksprimirajuće ćelijske linije (D10.G4) ili mišjeg MegaCD40L (Axxora ALX522120) umesto humane ćelije ili stimulacije rekombinantnim proteinom, jer mišji ligand unakrsno reaguje sa humanim receptorom.

[0414] 6.1.2 Test sa mišjim CD40R/NFκB: NFκB reporterske NIH3T3 ćelije (Panomics NFκB reporter sistem i interna mCD40R transfekcija) stimulisane su mišjim MegaCD40L (Axxora, kat. ALX522120) rekombinantnim proteinom ili CD40L prekomerno eksprimirajućim D10.G4 ćelijama (ATCC) tokom 24 sata sa Tn3 konstrukcijama ili bez njih. Dodat je Bright-Glow (Promega E2610) prema uputstvu proizvođača. Očitana je luminescencija (700) preko aktivacije NFκB reportera na sistemu EnVision (Perkin Elmer).

[0415] 6.1.3 Test sa humanim CD40R/NFκB: Reporterske HEK293 ćelije (Panomics i interne) stimulisane su MegaCD40L (Axxora ALX522110) rekombinantnim proteinom ili D1.1 Jurkatovim potkloniranim ćelijama koje prekomerno eksprimiraju CD40L (ATCC) tokom 24 sata sa Tn3 konstrukcijama ili bez njih. Dodat je Bright-Glow (Promega E2610) prema uputstvu proizvođača. Očitana je luminescencija (700) preko aktivacije NFκB reportera na sistemu EnVision (Perkin Elmer).

[0416] 6.1.4 Test sa dvojnim ćelijama: Primarne T/B ćelije su izolovane od različitih davalaca. Anti-CD3 stimulisane humane CD4+ T ćelije (1x10<5>) tretirane mitomicinom uzgajane su sa prečišćenim humanim B ćelijama (5x10<4>). Očitavanja su bila sledeća: 2. dan: Aktivacioni markeri (FACS), 5. dan: Proliferacija B ćelija (ATP metabolit, Cell-Titer Glo, Invitrogen), 7. dan: diferencijacija plazmocita (FACS) 7. dan: Proizvodnja Ig (ELISA, R&D Systems).

[0417] 6.1.5 Test agregacije trombocita: Adenozin difosfat (ADP) nabavljen je od Chrono-Log (Havertown, PA, USA). Svi drugi proizvodi su bili najmanje stepena čistoće za hemijsku analizu. Uzorci krvi su sakupljeni od zdravih dobrovoljaca u 12,9 mM natrijum citratu, i centrifugirani na 150xg tokom 15 minuta da se dobije PRP (plazma bogata trombocitima). Nakon razdvajanja PRP, epruvete su ponovo centrifugirane na 1200xg tokom 15 minuta, radi dobijanja PPP (plazma siromašna trombocitima). Trombociti su isprani prema metodi koju su

12

opisali Mustard et al. (Br. J. Haematol. 22:193-204, 1972), i ponovo suspendovani u Tirodeovom rastvoru koji sadrži 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 0,1% dekstroze, 0,35% albumina goveđeg seruma, 0,05 U/mL apiraze, pH 7,35. Agregacija trombocita je proučavana koristeći agregometar sa transmisijom svetlosti (Chrono-Log 700-4DR, Chrono-Log Corporation, Havertown, PA, USA) i snimljena 10 min nakon stimulacije trombocita naznačenim agonistima trombocita, kao što je opisano. Tn3 konstrukcije su prethodno inkubirane sa rastvornim CD40L (sCD40L) dajući imunokomplekse pre dodavanja.

[0418] 6.1.6 Test imunizacije: Ovčji eritrociti (Sheep Red Blood Cells, SRBC) su nabavljeni od kompanije Colorado Serum (Denver, CO) i razblaženi 10-struko u HBSS medijumu neposredno pre upotrebe. Miševi su imunizovani sa 0,2 ml razblaženih SRBC 0. dana. Odgovor primarnog germinativnog centra (GC) kod izazvanih miševa testiran je 14 dana posle imunizacije putem FACS (GC B ćelije, ne-GC B-ćelije i svi podskupovi T ćelija). Tn3 konstrukcije i kontrole su davane od 9-13. dana u razmacima od 24 sata, kao što je naznačeno.

[0419] 6.1.7 Test odgovora antitela zavisan od KLH-specifičnih T ćelija (TDAR): Majmuni cinomolgus (Macaca fascicularis) poreklom iz Kine, težine 3,1-4,6 kg, (Covance Research Products, Alice TX) dobijali su intravensku dozu (safenska ili cefalična vena) jednom nedeljno, u navedenoj dozi (0,5, 5, 40 mg/kg) inhibitora (342-monomer-Tn3-HSA i 342-342 dvovalentni-Tn3-HSA ili kontrola/sredstvo za uvođenje. KLH (ser. br. MD158678A, dobavljača Pierce Biotechnologies, Rockford, Illinois) rekonstituisan je sa odgovarajućom količinom sterilne vode za injekciju (dobavljača Midwest Veterinary Supply, Norristown, Pennsylvania) pod sterilnim uslovima. Bočice su promućkane i objedinjenje u sterilnoj bočici.

1 ml rastvora KLH (10 mg/ml) primenjeno je potkožno u leđa svake životinje, sa leve strane središnje linije dva puta (1. dana i 29. dana) u roku od 1 sata od završetka testa ili primene kontrolnog uzorka. Uzorci krvi za dalju analizu dobijeni su od svih životinja u sledećim terminima: pre testa, 4, 6, 8, 11, 15, 22, 25, 32, 34, 36, 39, 43, 46, 50. i 57. dana. Uzorci prikupljeni 8, 15 i 22. dana su uzeti pre davanja doze. Određivanje titra KLH-specifičnih IgM i IgG antitela je izvršeno 8, 11. i 15. dana. Titri KLH-specifičnih IgM i IgG antitela 15. dana prikazani su na slikama 5G, odnosno 5H. U metodi tačke završetka titracije korišćen je ELISA format da se detektuju anti-KLH antitela u serumu majmuna. Uzorci su inkubirani sa KLH, koji je imobilisan na ploči za ELISA. Nakon inkubacije, ploče su isprane, a vezana antitela su detektovana kozjim antimajmunskim IgG-HRP ili IgM-HRP i zatim vizuelizovana tetrametilbenzidinom (TMB).

12

[0420] Kod svih eksperimenata na životinjama, pridržavali smo se trenutno prihvatljive dobre prakse uzgajanja životinja npr. Vodiča za negu i upotrebu laboratorijskih životinja; National Academy Press, 2011. Organizacija Huntingdon Life Sciences, East Millstone, New Jersey je kompletno akreditovana od strane Međunarodnog udruženja za procenu i akreditaciju nege laboratorijskih životija (Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International, AAALAC). Životinje su praćene od strane tehničkog osoblja u pogledu svih uslova zbog kojih bi mogla biti potrebna veterinarska nega, i lečene po potrebi.

6.2 CD40L specifične Tn3 konstrukcije funkcionalno neutrališu CD40L: CD40 interakcije.

[0421] T ćelije koje eksprimiraju CD40L angažuju CD40-eksprimirajuće B ćelije, što dovodi do aktivacije NFκB signalnog puta (Zangani, 2009). Tako, ćelijska linija reportera NFκB-luciferaze je korišćena da se odredi da li anti-CD40L-Tn3 molekuli mogu da inhibiraju signalizaciju nishodno od angažovanja CD40. HEK293 ćelije koje eksprimiraju humani CD40L i reporter stimulisane su bilo humanim ili mišjim MegaCD40L pri EC90(efektivna koncentracija koja izaziva inhibiciju 90%; tj.1,5 µg/ml za humani MegaCD40L i 3 µg/ml za mišji MegaCD40L).

[0422] Humano specifični molekul 342 inhibirao je aktivnost NFκB indukovanu humanim CD40L, a IC50je bila 1,5 nM (SL.13). Mišje specifični molekul M31 neutralisao je aktivnost NFκB indukovanu mišjim CD40L, a IC50je bila 1,6 nM (SL. 1B). Pozitivna kontrola anti-CD40L monoklonska antitela 5c8 (anti humani CD40L) i MR1 (anti mišji CD40L) imali su učinak oko 10-struko bolji od monomernih Tn3 konstrukcija sa vrednošću IC50od 0,200 nM /- SD (najniži prag testa). To može delimično biti posledica dvovalentne prirode monoklonskih antitela koja doprinosi avidnosti interakcije sa odgovarajućim CD40L.

6.3 Dimerne CD40L specifične Tn3 konstrukcije pokazuju poboljšano vezivanje.

[0423] Eksperimentalni podaci pokazuju da je vezivanje CD40L-specifične Tn3 dvovalentne konstrukcije poboljšano u odnosu na vezivanje CD40L-specifične Tn3 monomerne konstrukcije. Vezivanje CD40L-specifične Tn3 dvovalentne konstrukcije za CD40L poboljšava dejstvo na cilj, u nekim slučajevima za oko 3 reda veličine u odnosu na CD40L specifičnu Tn3 monomernu konstrukciju in vitro, kako je prikazano na SL.2C i SL.2D (mišja) i SL.8A i SL.8B (humana).

12

[0424] SL. 2C prikazuje kompetitivnu inhibiciju vezivanja mišjeg CD40L za mišji CD40 receptor imobilisan na biosenzorskom čipu od strane mišje CD40L-specifične jednovalentne (M13) ili dvovalentne tandem konstrukcije. M13 monomeri su vezani za peptidne linkere različite dužine koji sadrže jedno (1GS), tri (3GS), pet (5GS) ili sedam (7GS) ponavljanja „GGGGS“. IC50konstrukcije M13-1GS-M13 iznosi 29 nM, dok je IC50monomera M13 bila 71 nM. IC50dvovalentnih M13 konstrukcija sa dužim linkerima je drastično manja (5-6 nM).

[0425] SL. 2D prikazuje inhibitorni efekat mišje CD40L-specifične jednovalentne (M13) ili dvovalentne tandem konstrukcije na CD40L-indukovanu ekspresiju CD86 na B ćelijama. Dvovalentne konstrukcije su otprilike za 3 reda veličine potentnije od jednovalentnih konstrukcija.

[0426] SL.8A i 8B pokazuju da humane CD40L-specifične Tn3 konstrukcije 309 i 311 imaju povećanu potentnost u formatu dvovalentnog tandema. Dvovalentne konstrukcije 311 (SL.8A) i dvovalentne konstrukcije 309 (SL.8B) pokazale su poboljšanje za oko 7 puta, odnosno 500-1000 puta, za inhibiciju ekspresije indukovane humanim CD40L na CD19 pozitivnim humanim PBMC stimulisanim Jurkatovim ćelijama D1.1. Dvovalentne konstrukcije 309 imaju sličnu potentnost kao Biogen 5c8 antihumano CD40L monoklonsko antitelo.

[0427] Rastvorljivost, stabilnost i lakoća prečišćavanja nisu narušeni dodatkom peptidnih linkera različite dužine koji sadrže jedno (1GS), tri (3GS), pet (5GS) ili sedam (7GS) ponavljanja „GGGGS“ (vidite SL.2B).

6.4 Vezivanje i funkcija CD40L specifičnih Tn3 konstrukcija.

[0428] Pored goreopisanog biohemijskog vezivanja, važno je proveriti da li ove nove Tn3 konstrukcije mogu da vezuju endogeni CD40L eksprimiran na primarnim T ćelijama nakon aktivacije. T ćelije su izolovane od više davalaca, i aktivirane kako je opisano. Nakon 24 sata, ekspresija CD40L je povećana, kako je određeno bojenjem 5c8 (humano specifičnim) monoklonskim antitelom i MR1 (mišje specifičnim) monoklonskim antitelom (podaci nisu prikazani). CD40L specifični molekuli Tn3 konstrukcije su mogli da detektuju uporedive nivoe ekspresije CD40L kao monoklonska antitela, potvrđujući da ti molekuli mogu da vežu nativni protein.

12

[0429] Jedna funkcionalna posledica interakcije CD40L:CD40 je povećanje regulacije kostimulišućih molekula na B ćelijama (Yellin et al., J. Exp. Med. 6:1857-1864, 1995). CD40L-usmereni molekuli Tn3 su ispitani na sposobnost da to spreče. Ćelijske linije koje endogeno eksprimiraju humani ili mišji CD40L (D1.1 potklonovi Jurkatovih ćelija, odnosno D10.G4) korišćene su da stimulišu mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC). Posle stimulacije, aktivacija B ćelija je određena merenjem procenta povećane regulacije CD86 od strane CD19+ B ćelija putem protočne citometrije. U ovom testu, monoklonska antitela pozitivne kontrole su mogla da inhibiraju CD19+ procenat ćelija sa CD86 sa ekspresijom IC50S koja iznosi 0,170 nM (5c8) i 0,230 nM (MR1). Humano specifični optimizovani Tn3, 342, mogao je da antagonizuje povećanu regulaciju CD86 sa IC50= 0,700 nM (n = 5 davalaca) (vidite SL.10B i TABELU 7).

[0430] Mišje specifični optimizovani Tn3 M31 imao je IC501,5 nM. Ovi slični rezultati su primećeni kada je rekombinantni protein Mega-CD40L korišćen da stimuliše PBMC. Eksperimentalni podaci su pokazali da oba molekula, bilo mišje ili humano specifični, ne mogu da inhibiraju samo glavni put signalizacije u ćeliji (NFκB), nego jednu od njegovih najvažnijih funkcionalnih uloga: interakcije T-B ćelije. Ovo inhibirajuće dejstvo može da neutrališe doprinos CD40L kod mnogih autoimunskih bolesti i stanja.

6.5 Anti-CD40L Tn3 inhibiraju proliferaciju B ćelija i diferencijaciju plazmocita nakon kokulture T/B.

[0431] Interakcije CD40L na T ćelijama sa CD40-eksprimirajućim B ćelijama predstavljaju osnovni aspekt pomoći T ćelija koja olakšava razvoj adaptivnog imunskog odgovora (Banchereau, 1994; Oxenius, 1996, van Kooten i Banchereau, 1997). Da bi se to prikazalo, anti-hCD40L Tn3-HSA fuzije 340, 342 i 342-342 dimera su ocenjene u kokulturama primarnih T ćelija i B ćelija, gde su anti-CD3 stimulisane humane CD4+ T ćelije tretirane mitomicinom C uzgajane sa prečišćenim humanim B ćelijama. Određena je sposobnost B ćelija za proliferaciju četvrtog dana da bi se diferencirale u plazmocite (pC) do sedmog dana i promenila njihova klasa antitela u proizvodnji (podaci za PC i antitelo nisu prikazani) (SL.15) (Ettinger, 2007). CD40L-specifična Tn3 konstrukcija 342-342-HSA mogla je da smanji proliferaciju indukovanu T ćelijama za najmanje 50% u poređenju sa ćelijskom proliferacijom B ćelija u odsustvu konstrukcije, ili u prisustvu nespecifične kontrolne konstrukcije. Proliferacija je prekursor, prvi signal, za diferencijaciju plazmocita, nakon ligacije CD40L:CD40. Takođe je praćena inhibicija diferencijacije plazmocita i promena klase antitela (podaci nisu prikazani).

1

6.6 In vivo prekidanje osovine CD40:CD40L.

[0432] Centralna uloga interakcija CD40L:CD40R u T-zavisnom imunskom odgovoru je dobro okarakterisana (Noelle, 1992; Renshaw, 1994, Wykes, 2003). Mišja CD40L-specifična Tn3 konstrukcija M31 (M31-MSA i M31-M31-MSA) korišćena je za određivanje efekata tih novih molekula na modelu T-zavisne imunizacije imunizovanjem miša (intravenski) nultog dana ovčjim eritrocitima (SRBC).

[0433] Od 9-13. dana, miševi su svakodnevno intraperitonealno dobijali injekciju naznačenom dozom inhibitora, a 14. dana su kvantifikovane GC B ćelije slezine i limfnog čvora. Potrebna je svakodnevna doza, zbog malog T1/2ovog molekula in vivo, 31 sat (SL.4). Dobro je poznato da CD40L upravlja humoralnim odgovorom, kao što je stvaranje germinativnih centara na anatomskim mestima, kao što je slezina i limfni čvorovi iz prethodnih otkrića (Jacob, 1991). Ovde je doprinos prekidanja CD40L:CD40 osovine tom formiranju primećen na dozno zavisan način, sa M31-MSA u odnosu na naivne ćelije ili našu nespecifičnu kontrolu, D1-MSA, kao što pokazuje procenat GC B ćelija.

[0434] Čak je i 10 mg/kg M31-MSA bilo dovoljno da poništi procenat GC B ćelija (SL.5B), kao i monoklonskih antitela MR1 (SL.5A). Druge subpopulacije ćelija su izgledale normalno, uključujući specifične populacije T-ćelija, što obezbeđuje da primećeni rezultati nisu posledica deplecije T ćelija (SL. 5C, SL. 5D, SL. 5E). Pored toga, rezultati dobijeni od anti-SRBC Ig ELISA odražavali su rezultate podataka germinativnog centra B ćelija (SL. 5F). Ovi podaci zajedno ukazuju da mišje specifična Tn3 konstrukcija M31-MSA može da ukine reakcije koje aktivira CD40 signalizacija.

[0435] Slično tome, humana CD40L-specifična Tn3 konstrukcija 342 (342-HSA i 342-342-HSA) korišćena je za određivanje efekata ovih novih molekula na modelu KLH-specifičnog T ćelijski zavisnog odgovora antitela (TDAR) kod majmuna cinomolgusa. Ovde prekidanje CD40L:CD40 osovine dovodi do supresije stvaranja antitela na KLH antigen na dozno zavisan način. Kao što je prikazano na slikama 5G i 5H, dvovalentni konstrukt 342 je suzbijao nivoe IgM i IgG antitela pri 0,5 mg/kg (mpk) i gotovo potpuno suzbijanje je primećeno pri 5 mg/kg. Konstrukt monomera 342 je takođe suzbijao nivoe IgM i IgG, ali pri višim koncentracijama, i primećena je gotovo potpuna supresija pri 40 mg/kg. Ovi podaci ukazuju da humano specifični

1 1

konstrukti Tn3 konstrukcije 342-HSA i 342-342-HSA mogu da ukinu reakcije koje aktivira CD40 signalizacija.

6.7 Humane CD40L-specifične Tn3 konstrukcije ne indukuju agregaciju trombocita.

[0436] Klinička ispitivanja na ljudima, sa anti-CD40L monoklonskim antitelima prekinuta su kada se kod nekoliko pacijenata pojavila tromboembolija (Davidson et al. Arth Rheu, 43:S271). Kasnije pretkliničke analize su nagovestile da je to efekat na klasu cilja anti-CD40L monoklonskih antitela. Tako, bilo je značajno da se ispitaju humane CD40L-specifične Tn3 konstrukcije u testu agregacije trombocita.

[0437] Kada je primenjen odnos tri molekula fiziološkog CD40L na jedan molekul anti-CD40L monoklonskog antitela, primećeni su proagregatorski efekti na citratnoj plazmi bogatoj trombocitima (PRP), ispranim trombocitima i punoj krvi (SL.16A). Ovi efekti su posredovani interakcijama zavisnim od Fc domena monoklonskog antitela nakon vezivanja CD40L (podaci nisu prikazani). U odsustvu fuzije Fc domena, nije primećena agregacija. Nije primećena agregacija kod više davalaca sa bilo kojim humanim CD40L specifičnim Tn3 konstrukcijama bilo kao dimerima ili kao HSA fuzionim proteinima (SL.16B i SL.16C).

[0438] Štetna neželjena dejstva, kao u kliničkim ispitivanjima, primećena su stvaranjem imunokompleksa rastvorni CD40L/anti-CD40L monoklonsko antitelo u prisustvu trombocita (SL. 16A i trag 5C8 na SL.16C). Drugi primer se može videti u histologiji studije transgenog humanog FcγRIIa na miševima (Francis et al., 2010). Nakon primene imunokompleksa rastvorni CD40L/monoklonsko antitelo, primećeno je mnoštvo trombova u plućnom tkivu u roku od nekoliko minuta nakon primene. Međutim, kada je dupliran anti-CD40L Tn3 konstrukcijama, u plućima je postojala normalna histologija u skladu sa kontrolnim uzorcima (podaci nisu prikazani).

Primer 7

Domeni fibronektina tip III dizajnirani da vezuju CD40L: kloniranje, ekspresija, prečišćavanje, kristalizacija i preliminarna difrakcija rendgenskih zraka dva kompleksa.

[0439] Rekombinantni humani rastvorni CD40L je kokristalisan sa dve CD40L-specifične Tn3 monomerne konstrukcije, 309 i 311K4E-12, obe izolovane kao vezivači CD40L iz biblioteka displeja faga. Kristali su difraktovali na 3,1 odnosno 2,9 Å. Pored toga, rekombinantni humani rastvorni CD40L je kokristalisan samo sa optimizovanim Tn3 monomerom 342, i sa oba

1 2

monomera, 342 i 311K4E_12. Kristali za ove strukture su difraktovali na 2,8 odnosno 1,9 Å. Odgovarajuće kristalne strukture su pomogle da se razume interakcija između Tn3 konstrukcija i CD40L, i mogu se koristiti za konstruisanje vezivača CD40L sa većim afinitetom i tandem konstrukata koji vezuju više epitopa.

7.1 Ekspresija i prečišćavanje molekula Tn3 i humanog rastvornog CD40L

[0440] Da bi se dobili molekuli Tn3 bez oznake za kristalizaciju, proteini su eksprimirani u E. coli koristeći interni IPTG-inducibilni vektor dizajniran da luči rekombinantno eksprimirane proteine u periplazmatski prostor. Ovaj vektor ima Ptac promoter, mutant OppA signalnog peptida L25/M (MTNITKRSLVAAGVLAALMAGNVAMA) (SEQ ID NO: 210), C-terminalnu 8xHis-oznaku, pored mesta cepanja trombina. Sekvence Tn3 su potklonirane između signalnog peptida i mesta cepanja trombina.

[0441] Eksprimirani sekretovani his-označeni proteini su prečišćeni pomoću Ni-NTA smole prema uputstvu proizvođača (Qiagen, Valencia, California, SAD), a zatim pocepani trombinom i ponovo podvrgnuti afinitetnom prečišćavanju sa Ni-NTA da se ukloni nepocepani netaknuti protein i isečeni his-označeni fragment. Ovaj korak prečišćavanja je prethodio koraku jonske izmene pomoću kolona HiTrap Q (GE Healthcare, Piscataway, New Jersey, SAD) izvedenom na prečistaču Äkta Purifier (GE Healthcare, Piscataway, New Jersey, SAD). Prečišćeni neoznačeni Tn3 proteini imaju čistoću veću od 95% i homogenost na osnovu rezultata SDS-PAGE i SEC.

[0442] Humani rastvorni CD40L (113-261, UNIPROT: P29965) gen sintetisan je u GeneArt sa N-terminalnom 6xHis-oznakom, i kloniran je u interni ekspresioni vektor sisara pod kontrolom neposrednog ranog (hCMVie) promotera citomegalovirusa major (Boshart et al., Cell 41: 521-530,1985). Gen CD40L je kloniran u okviru sa CD33 signalnim peptidom. Geni EBNA i Ori P u vektoru su korišćeni da povećaju ekspresiju proteina. Gen CD40L je takođe uključivao sekvencu SV40 poli-A da se omogući pravilna obrada njegovog 3' kraja iRNK. Konstrukt je prolazno transficiran u suspenziju ćelija 293F (ćelije bubrega ljudskog embriona [HEK] uzgajene u medijumu 293 Freestyle i koristeći fektin 293, Invitrogen, Carlsbad, California, SAD). Ćelije su uzgajane prema standardnom protokolu, i medijum je sakupljen nakon 4 i 8 dana. Rastvorni CD40L protein je zatim prečišćen pomoću Ni-NTA smole i posle toga jonskom izmenom na koloni Hi-Trap SP FF (GE Healthcare, Piscataway, New Jersey, SAD) i dijalizom prema 50 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl.

1

[0443] Da bi se pripremili kompleksi, molekul Tn3, bilo 309 ili 311K4E_12 ili 342, pomešan je sa CD40L u odnosu 1,1:1, koncentrovan pomoću koncentratora Vivaspin (presek 30.000 Da; GE Healthcare, Piscataway, New Jersey, SAD) do oko 10 mg/ml i podvrgnut gel hromatografiji (SEC) na koloni Superdex 20010/300 GL (GE Healthcare, Piscataway, New Jersey, SAD) prethodno ekvilibrisanoj sa 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,02% NaN3 (SL. 19, panel A). Posle koraka separacije, kompleks je koncentrovan do 18 mg/ml i podvrgnut kristalizaciji. Kompleks 342-311K4E_12-CD40L je suštinski pripremljen kako je gore opisano, uz odnos tri komponente 1,1:1,1:1.

7.2 Skrining i optimizacija kristalizacije

[0444] Eksperimenti kristalizacije u sedećoj kapi su postavljeni na Intelli pločama sa 96 bunarčića (Art Robbins Instruments, Sunnyvale, California, SAD) koristeći robota za kristalizaciju Phoenix (Art Robbins Instruments, Sunnyvale, California, SAD) mešanjem zapremina od 300 nl rastvora iz bunarčića i rastvora kompleksa proteina u pregradi za kapljicu, i njenim uravnotežavanjem u odnosu na 50 µl rastvora iz bunarčića. Korišćeni su komercijalni postupci za ispitivanje kristalizacije kompanija Hampton Research (Aliso Viejo, California, SAD), Emerald BioSystems (Bainbridge Island, Washington, SAD) i Molecular Dimensions (Apopka, Florida, SAD).

[0445] Za kristalizaciju svakog od kompleksa 309-CD40L, 342-CD40L i 342-311K4E_12-CD40L bio je potreban korak optimizacije koji uključuje dodatni skrining pomoću kompleta Additive Screen HT (Hampton Research, Aliso Viejo, California, SAD). U koraku optimizacije, rastvor iz bunarčića ploče sa 96 bunarčića napunjen je sa 80% uspešnog rastvora iz početnog skrininga i 20% odgovarajućeg aditiva. Kapljica je napravljena od 300 nl rastvora proteina i 300 nl novog rastvora iz bunarčića nakon njegovog temeljnog mešanja. Kristali kvaliteta pogodnog za difrakciju sakupljeni su direktno sa ploče sa 96 bunarčića. Za krioprezervaciju, kristal je prenet u tri uzastopna rastvora matičnog luga sa rastućom koncentracijom glicerola.

[0446] Kristali 311-CD40L kvaliteta pogodnog za difrakciju rasli su na početnom ispitivanju iz rastvora kome nije bio potreban dodatak krioagensa.

7.3 Rendgenska difrakcija i prikupljanje podataka

1 4

[0447] Obrasci rendgenske difrakcije za kompleks 309-CD40L prikupljeni su od jednog kristala na uređaju Beamline 5.0.3 ustanove Advanced Light Source u Nacionalnoj laboratoriji Lorens Berkli (Univerzitet Kalifornija; Berkli) opremljenim detektorom rendgenskih zraka ADSC Q315R CCD (Area Detector Systems Corporation, Poway, California, SAD). Prikupljeno je 360 uzastopnih slika sa obimom oscilacije od 0,5°, pri rastojanju od kristala do detektora od 300 nm, i vremenom ekspozicije od 0,8 sekundi.

[0448] Obrasci difrakcije rendgenskih zraka za komplekse 311K4E_12-CD40L, 342-CD40L and 342-311K4E_12-CD40L prikupljeni su od jednog kristala na uređaju Beamline 31-ID-D ustanove Advanced Photon Source u Argonne National Laboratory (University of Chicago, Chicago, IL) opremljenim detektorom Rayonix 225 HE (Rayonix LLC, Evanston, Illinois, USA). Prikupljeno je 180 uzastopnih slika sa obimom oscilacije od 1°, pri rastojanju od kristala do detektora od 300 nm, i vremenom ekspozicije od 0,8 sekundi.

[0449] Smanjenje i povećavanje svih kompleta podataka je izvršeno pomoću programskog paketa HKL2000 suite (Otwinowski i Minor, Methods in Enzymology, 276:307-326.1997).

7.4 Rezultati i diskusija

[0450] Najreproduktivniji uslov kristalizacije kompleksa 309-CD40L bio je B5 (0,2 M NaNO3, 20% PEG3350) u sistemu Peg/Ion (Hampton Research). Dalja optimizacija sa dodatnim sistemima dala je kristal kvaliteta za difrakciju iz uslova A1 (0,1 M BaC12·2H2O). Kristal prikazan na SL. 19, panel B, prikupljen je sa ploče sa 96 bunarčića, i ohlađen u tečnom azotu nakon prenosa u rastvor matičnog luga uz dodatak 20% glicerola.

[0451] Simetrija prostorne grupe: Kristal je pripadao ortorombičnoj prostornoj grupi P212121 sa parametrima ćelije a=85,69 Å, b=90,64 Å, c=95,56 Å i difraktovan je do 3,1 Å. Očekivano je da asimetrična jedinica sadrži trimer CD40L i tri molekula 309 sa VM vrednošću oko 2,3 Å3/Da.

[0452] Kod kristalizacije 311K4E_12-CD40L, sistem Cryo I i II (Emerald BioStructures) dao je niz uslova za koje nije bila potrebna optimizacija niti krioprezervacija. Za prikupljanje podataka je korišćen jedan kristal (SL. 19, panel C) iz uslova F7 (40% PEG 600, 0,1 M CH3COONa, 0,2 M MgCl2).

1

[0453] Simetrija prostorne grupe: Kristal je pripadao kubičnoj prostornoj grupi P213 sa parametrima ćelije 97,62 Å i difraktovan je do 2,6 Å. Asimetrična jedinica sadrži jedan molekul CD40L i jedan molekul 311K4E_12 sa VM vrednošću oko 2,9 Å3/Da.

[0454] Simetrija prostorne grupe 342-CD40L: Kristal je pripadao prostornoj grupi P321 sa parametrima ćelije a=93,53 Å, b=93,53 Å, c=66,69 Å, rezolucija 2,8 Å. Asimetrična jedinica sadrži jedan monomer CD40L i jedan monomer 342.

[0455] Simetrija prostorne grupe 342-311K4E_12-CD40L: Kristal je pripadao prostornoj grupi P21 sa parametrima ćelije a=80,32 Å, b=143,48 Å, c=111,27 Å, β=98,22°, rezolucija 1,9 Å. Asimetrična jedinica je sadržala dva trimera CD40, šest monomera 342 i šest monomera 311K4E-12.

[0456] Statistički podaci za sve strukture prikazani su u TABELI 10.

1

[0457] CD40L gradi trimer (polipeptidi A, B i C na SL. 17A). Svaka Tn3 konstrukcija 309 (polipeptidi D, E i F na SL. 17A) uspostavlja kontakt sa dva CD40L polipeptida. Kristalna struktura otkriva da ima šest specifičnih kontakata između svake konstrukcije 309 i prvog i drugog polipeptida CD40L. Asparaginska kiselina 17 u BC uspostavlja kontakt sa treoninom 251 u prvom CD40L. Glutaminska kiselina 18 u BC petlji uspostavlja kontakt sa argininom 203 u prvom CD40L i sa izoleucinom 204 u drugom CD40L. Serin 47 u DE petlji uspostavlja kontakt sa histidinom 249 u prvom CD40L. Triptofan 49 u DE petlji uspostavlja kontakt sa valinom 247 u prvom CD40L. Asparaginska kiselina 70 u FG petlji uspostavlja kontakt sa serinom 185 u drugom CD40L (videti SL.17A). Aminokiselinski ostaci CD40L u kontaktu sa konstrukcijom 311 takođe su prikazani na SL.18A.

[0458] U slučaju 309, svaka monomerna konstrukcija 311K4E_12 (polipeptidi A, B i C na SL.

17B) uspostavlja kontakt sa dva polipeptida CD40L. Kristalna struktura otkriva da ima 19 specifičnih kontakata između svake konstrukcije 311K4E_12 i prvog i drugog polipeptida CD40L. Asparagin 17 u BC petlji uspostavlja kontakt sa tirozinom 146 i glutaminskom kiselinom 142 u prvom CD40L. Arginin 18 u BC petlji gradi kontakt sa glutaminskom kiselinom 142, tirozinom 146 i metioninom 148 u prvom CD40L. Serin 19 u BC petlji uspostavlja kontakt sa glutaminskom kiselinom 142 i leucinom 155 u prvom CD40L. Serin 22 u BC petlji uspostavlja kontakt sa asparaginom 151 u prvom CD40L. Histidin 15 u BCE petlji uspostavlja kontakt sa tirozinom 146 u prvom CD40L. Histidin 51 u DE petlji uspostavlja kontakt sa tirozinom 146 u prvom CD40L i sa glutaminskom kiselinom 230 u drugom CD40L. Valin 50 u DE petlji uspostavlja kontakt sa glutaminskom kiselinom 230 u drugom CD40L. N-terminalni region monomerne konstrukcije 311K4E_12 povezan je sa drugim CD40L. Arginin 200 u drugom CD40L uspostavlja kontakt sa treoninom 7, asparaginskom kiselinom 8 i treoninom 10 u N-terminalnom regionu 311K4E_12. Arginin 203 u drugom CD40L uspostavlja kontakt sa glutaminskom kiselinom 4 i asparaginskom kiselinom 5. Aminokiselinski ostaci CD40L u kontaktu sa konstrukcijom 309 takođe su prikazani na SL.

18B.

[0459] Kristalne strukture CD40L u kompleksima sa 309 i 311K4E_12 pokazuju da se monomerne konstrukcije 311K4E_12 i 309 vezuju za različite epitope koji se nalaze na različitim delovima kompleksa CD40L trimera (SL. 17C). Strukture pokazuju da se obe konstrukcije vezuju za isto udubljenje koje bi interagovalo sa CD40 receptorom.

1

[0460] Kristalna struktura 342 sa CD40L data je na slici 17D, i pokazuje da, mada se 342 vezuje za isti deo CD40L, mogu se videti specifične promene ostataka u kontaktu u poređenju sa matičnim klonom 309. Konkretno, u 342 aspartat 18 u BC petlji uspostavlja kontakt sa treoninom 251 iz CD40L, i histidin 47 iz DE petlje uspostavlja kontakt sa histidinom 249 iz CD40L, histidin 48 iz DE petlje uspostavlja kontakt sa histidinom 249, serinom 245 i serinom 248 iz CD40L, i histidin 50 iz DE petlje uspostavlja kontakt sa valinom 247 iz CD40L.

[0461] Kristalna struktura 342 i 311K4E_12 sa CD40L pokazuje da obe konstrukcije mogu istovremeno da se vežu za svoje odgovarajuće epitope koji se nalaze na različitim delovima kompleksa CD40L trimera (SL 17E). Održavaju se kontakti za svaku posebnu konstrukciju (kako je gore opisano).

[0462] Gornji primeri ilustruju različite aspekte pronalaska i prakse metoda iz pronalaska. Ovi primeri nisu namenjeni da obezbede iscrpan opis mnogih različitih aspekata otkrića.

1

1

14

14

14

14

14

14

14

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

2

21

22

2

24

2

2

2

2

�

21

21

21

21

21

21

21

22

22

22

22

22

22

22

�

21

22

�

24

2

2

�

�

2

��

24

��

��

24

��

��

�

21

22

�

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

�

24

�

�

2

�

�

2

21

22

2

��

�

2

2

�

�

2

21

22

2

24

Claims (17)

Patentni zahtevi

1. Konstrukcija tenascina 3 (Tn3) koja sadrži dve CD40L-specifične monomerne podjedinice povezane u tandem,

naznačeno time što monomerna podjedinica sadrži sedam beta lanaca označenih sa A, B, C, D, E, F i G, i šest regiona petlje označenih sa AB, BC, CD, DE, EF i FG, i naznačeno time što se Tn3 konstrukcija specifično vezuje za CD40L,

naznačeno time što CD40L-specifična monomerna podjedinica sadrži aminokiselinsku sekvencu:

IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFT T naznačeno time što:

(a) XAB, XBC, XCD, XDE, XEFi XFGpredstavljaju aminokiselinske ostatke prisutne u sekvencama petlji AB, BC, CD, DE, EF, odnosno FG;

(b) X1predstavlja aminokiselinski ostatak A ili T; i,

(c) dužina petlje n je ceo broj od 2 do 26,

naznačeno time što sekvenca BC petlje sadrži SEQ ID NO: 86, sekvenca DE petlje sadrži SEQ ID NO: 96, i sekvenca FG petlje sadrži SEQ ID NO: 9 ili 139.

2. Tn3 konstrukcija iz zahteva 1, naznačena time što sekvenca AB petlje sadrži SEQ ID NO: 4, ili SEQ ID NO: 136, sekvenca CD petlje sadrži SEQ ID NO: 6, i sekvenca EF petlje sadrži SEQ ID NO: 8, ili SEQ ID NO: 137.

3. Tn3 konstrukcija iz zahteva 1 ili 2, naznačena time što CD40L-specifična monomerna podjedinica sadrži sekvencu SEQ ID NO: 28 ili 146.

4. Tn3 konstrukcija iz bilo kog od zahteva 1-3, naznačena time što su dve CD40L-specifične monomerne podjedinice direktno vezane.

5. Tn3 konstrukcija iz bilo kog od zahteva 1-4, naznačena time što su dve CD40L-specifične monomerne podjedinice vezane putem linkera.

6. Tn3 konstrukcija iz zahteva 5, naznačena time što linker uključuje peptidni linker.

2

7. Tn3 konstrukcija iz zahteva 5 ili 6, naznačena time što peptidni linker sadrži sekvencu (GmX)n, naznačenu time što:

(a) X je serin (S), alanin (A), glicin (G), Leu (L), izoleucin (I), ili valin (V);

(b) m i n su celi brojevi;

(c) m je 1, 2, 3 ili 4; i

(d) n je 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7.

8. Tn3 konstrukcija iz zahteva 7, naznačena time što peptidni linker sadrži SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 142, ili SEQ ID NO: 143.

9. Tn3 konstrukcija iz bilo kog od zahteva 1-8, naznačena time što je najmanje jedna CD40L-specifična monomerna podjedinica vezana za linker, ili za heterologni ostatak.

10. Tn3 konstrukcija iz zahteva 9, naznačena time što je najmanje jedna CD40L-specifična monomerna podjedinica konjugovana sa PEG ili albuminom.

11. Tn3 konstrukcija iz zahteva 10, naznačena time što, albumin je albumin iz humanog seruma (HSA).

12. Tn3 konstrukcija iz bilo kog od zahteva 1-11, naznačena time što Tn3 konstrukcija sadrži sekvencu, ili se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 145.

13. Tn3 konstrukcija iz bilo kog od prethodnih zahteva za primenu u metodi za izmenu CD40 posredovanog signalnog odgovora koji obuhvata dovođenje u kontakt ćelije koja eksprimira CD40L sa Tn3 konstrukcijom, naznačeno time što Tn3 konstrukcija vezuje CD40L i sprečava CD40 posredovanu signalizaciju.

14. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira Tn3 konstrukciju iz bilo kog od zahteva 1-12.

15. Metoda za proizvodnju Tn3 konstrukcije koja obuhvata uzgajanje ćelije domaćina, pri čemu pomenuta ćelija domaćin sadrži ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline iz zahteva 14, pod uslovima u kojima se eksprimira Tn3 konstrukcija koju kodira molekul nukleinske kiseline.

16. Kompozicija koja sadrži Tn3 konstrukciju iz bilo kog od zahteva 1-12 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

17. Kompozicija iz zahteva 16 za primenu u:

1) metodi za prevenciju, lečenje ili poboljšavanje autoimunske bolesti kod pacijenta kome je to potrebno; ili

2) metodi za smanjenje učestalosti ili količine kortikosteroida date pacijentu sa autoimunskom bolešću, opciono

naznačeno time što je autoimunska bolest odabrana iz grupe koja obuhvata alopeciju areata, ankilozirajući spondilitis, antifosfolipidni sindrom, autoimunsku Adisonovu bolest, autoimunske bolesti nadbubrežne žlezde, autoimunsku hemolitičku anemiju, autoimunski hepatitis, autoimunski ooforitis i orhitis, Šegrenov sindrom, psorijazu, aterosklerozu, dijabetesnu retinopatiju i druge retinopatije, retrolentalnu fibroplaziju, starosnu degeneraciju makule, neovaskularni glaukom, hemangiome, tireoidne hiperplazije (uključujući Grejvsovu bolest), transplantaciju rožnjače i drugog tkiva, i hroničnu inflamaciju, sepsu, reumatoidni artritis, peritonitis, Kronovu bolest, reperfuzionu povredu, septikemiju, endotoksični šok, cističnu fibrozu, endokarditis, psorijazu, artritis (npr. psorijatični artritis), anafilaktički šok, ishemiju organa, reperfuzionu povredu, povredu kičmene moždine i odbacivanje alografta, autoimunsku trombocitopeniju, Behčetovu bolest, bulozni pemfigoid, kardiomiopatiju, celijakijski dermatitis, sindrom hroničnog umora i imunske disfunkcije (CFIDS), hroničnu inflamatornu demijelinizujuću polineuropatiju, Čurg-Štrausov sindrom, cikatrizirajući pemfigoid, CREST sindrom, bolest hladnog aglutinina, Kronovu bolest, diskoidni lupus, esencijalnu mešanu krioglobulinemiju, fibromijalgiju-fibromiozitis, glomerulonefritis, Grejvsovu bolest, Gijen-Bar, Hašimotov tiroiditis, idiopatsku fibrozu pluća, idiopatsku trombocitopeniju purpura (ITP), IgA neuropatiju, juvenilni artritis, lihen planus, eritemski lupus, Menijerovu bolest, mešovitu bolest vezivnog tkiva, multiplu sklerozu, tip 1 ili imunološki posredovan dijabetes melitus, mijasteniju gravis, pemfigus vulgaris, pernicioznu anemiju, poliarteritis nodosa, polihrondritis, poliglandularne sindrome, reumatsku polimijalgiju, polimiozitis i dermatomiozitis, primarnu agamaglobulinemiju, primarnu bilijarnu cirozu, psorijazu, psorijatični artritis, Rejnoov fenomen, Rajterov sindrom, reumatoidni artritis, sarkoidozu, sklerodermu, Šegrenov sindrom, sindrom ukočenosti mišića, sistemski eritemski lupus, eritemski lupus, takajasu arteritis, temporalni arteritis/arteritis

2

džinovskih ćelija, ulcerozni kolitis, uveitis, vaskulitide kao što je dermatitis herpetiformis vaskulitis, vitiligo, i Vegenerovu granulomatozu.

2