JP2017196544A - 分離材及びカラム - Google Patents

Abstract

【課題】タンパク質の非特異吸着が低減され、カラムに充填したときの通液性に優れる分離材を提供すること。【解決手段】疎水性高分子粒子と、該疎水性高分子粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備え、上記被覆層が、水酸基及び水酸基以外の官能基を有する官能基含有高分子を含む、分離材。【選択図】なし

Description

本発明は、分離材及びカラムに関する。

従来、タンパク質に代表される生体高分子を分離精製する場合、一般的には、多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体、親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体等が用いられている。上記の多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体の場合、塩濃度による体積変化が小さいため、カラムに充填してクロマトグラフィーで用いた場合、通液時の耐圧性に優れる傾向がある。しかし、このイオン交換体は、タンパク質等の分離に用いた場合、疎水的相互作用に基づく不可逆吸着等の非特異吸着が起こるため、ピークの非対称化が発生する、又は該疎水的相互作用でイオン交換体に吸着されたタンパク質が吸着されたまま回収できないという問題点がある。

一方、デキストラン、アガロース等の多糖に代表される親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体の場合、タンパク質の非特異吸着が殆どないという利点がある。ところが、このイオン交換体は、水溶液中で著しく膨潤し、溶液のイオン強度による体積変化、及び遊離酸形と負荷形との体積変化が大きく、機械的強度も十分ではないという欠点を有する。特に、架橋ゲルをクロマトグラフィーで使用する場合、通液時の圧力損失が大きく、通液によりゲルが圧密化するといった欠点がある。

親水性天然高分子の架橋ゲルが持つ欠点を克服するため、これをいわば「骨格」となる剛直な物質と組み合わせる試みがこれまでになされている（例えば、特許文献１〜７）。

米国特許第４９６５２８９号明細書 米国特許第４３３５０１７号明細書 米国特許第４３３６１６１号明細書 米国特許第３９６６４８９号明細書 特開平１−２５４２４７号公報 米国特許第５１１４５７７号明細書 特開２００９−２４４０６７号公報

しかしながら、従来の分離材は、タンパク質の非特異吸着が多く、かつカラムに充填したときの通液性に劣るという問題がある。

そこで、本発明は、タンパク質の非特異吸着が低減され、カラムに充填したときの通液性に優れる分離材を提供することを目的とする。

本発明の具体的態様を以下に示す。
［１］ 疎水性高分子粒子と、該疎水性高分子粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備え、上記被覆層が、水酸基及び水酸基以外の官能基を有する官能基含有高分子を含む、分離材。
［２］ 上記水酸基以外の官能基が、カルボキシ基、エポキシ基、又はアミノ基である、［１］に記載の分離材。
［３］ 水中での５％圧縮変形弾性率が７０ＭＰａ以上である、［１］又は［２］に記載の分離材。
［４］ カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液速度が５００ｃｍ／ｈ以上である、［１］〜［３］のいずれかに記載の分離材。
［５］ 上記疎水性高分子粒子が、スチレン系モノマに由来する構造単位を有する疎水性高分子を含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の分離材。
［６］ 上記官能基含有高分子が、多糖類又はその変性体に由来する構造を含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の分離材。
［７］ 上記官能基含有高分子が、アガロース又はその変性体に由来する構造を含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の分離材。
［８］ 上記官能基含有高分子が、架橋されている、［１］〜［７］のいずれかに記載の分離材。
［９］ 上記疎水性高分子粒子の平均粒径が１０〜５００μｍである、［１］〜［８］のいずれかに記載の分離材。
［１０］ 上記疎水性高分子粒子が多孔構造を有する、［１］〜［９］のいずれかに記載の分離材。
［１１］ ［１］〜［１０］のいずれかに記載の分離材を備えるカラム。

本発明によれば、タンパク質の非特異吸着が低減され、カラムに充填したときの通液性に優れる分離材及び当該分離材を備えるカラムを提供することができる。

以下、本発明の好適な実施形態について説明をするが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではない。

＜分離材＞
本実施形態の分離材は、疎水性高分子粒子と、該疎水性高分子粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備え、上記被覆層が、水酸基及び水酸基以外の官能基を有する官能基含有高分子を含む。なお、例えば、疎水性高分子粒子が多孔構造を有するような態様である場合において、「疎水性高分子粒子の表面」とは、疎水性高分子粒子の外側の表面のみでなく、疎水性高分子粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。本実施形態の分離材によれば、タンパク質の非特異吸着が低減されると共に、カラムに充填したときに優れた通液性を有する。また、本実施形態の分離材は、耐久性、耐アルカリ性及び耐圧性にも優れ、カラムに充填したときの吸着量（動的吸着量）も実用上充分に高いと考えられる。

本実施形態の分離材が上述の効果を発揮する理由を、本発明者らは、以下のように推測している。

本実施形態の分離材は、上記疎水性高分子粒子と、上記被覆層とを備えることにより、疎水性高分子粒子及び上記官能基含有高分子の双方の利点を有すると考えられる。例えば、本実施形態の分離材は、上記疎水性高分子粒子を備えることにより、耐久性、耐アルカリ性及び耐圧性に優れ、かつカラムに充填したときに優れた通液性を発揮すると考えられる。また、本実施形態の分離材は、上記被覆層を備えることにより、タンパク質の非特異吸着が低減されると共に、タンパク質等の吸脱着が起こり易く、同一流速下でのタンパク質等の吸着量（動的吸着量）が大きいと考えられる。

（疎水性高分子粒子）
本実施形態に係る疎水性高分子粒子は、疎水性を有する高分子（以下、場合により「疎水性高分子」という）を含む粒子である。疎水性高分子粒子の製造方法に特に制限はないが、例えば、疎水性を有する高分子を形成可能なモノマを重合させる方法が挙げられる。モノマとしては、疎水性を有する高分子を形成可能なものであれば、特に限定されないが、例えば、スチレン系モノマが挙げられる。すなわち、上記疎水性高分子粒子は、例えば、スチレン系モノマに由来する構造単位を有する疎水性高分子を含んでいてもよい。

本実施形態に係る疎水性高分子粒子は、多孔構造を有していてもよい。すなわち、本実施形態に係る疎水性高分子粒子は、例えば、疎水性の多孔質高分子粒子であってもよい。多孔質高分子粒子は、例えば、多孔質化剤の存在下でモノマを重合させて得られるポリマを含む粒子であり、従来の懸濁重合、乳化重合等により合成することができる。

スチレン系モノマとしては、以下のような多官能性モノマ、単官能性モノマ等が挙げられる。

多官能性モノマとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、ジビニルフェナントレン等のジビニル化合物が挙げられる。これらの多官能性モノマは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。上記の中でも耐久性、耐酸性、耐アルカリ性に優れる観点から、ジビニルベンゼンが好ましい。

単官能性モノマとしては、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレン及びその誘導体が挙げられる。これらの単官能性モノマは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。上記の中でも、耐酸性及び耐アルカリ性に優れる観点から、スチレンが好ましい。モノマは、カルボキシ基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体であってもよい。

多孔質化剤としては、重合時に相分離を促し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒である脂肪族又は芳香族の炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類等が挙げられる。多孔質化剤の具体例は、トルエン、キシレン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール、ジエチルベンゼン等を含む。これらの多孔質化材は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

上記多孔質化剤の配合量は、モノマ全質量に対して、例えば、０〜２００質量％であってもよい。多孔質化剤の量によって、疎水性高分子粒子の空隙率をコントロールできる。さらに、多孔質化剤の種類によって、疎水性高分子粒子の細孔の大きさ及び形状をコントロールすることができる。

溶媒として使用する水を多孔質化剤とすることもできる。水を多孔質化剤とする場合は、モノマに油溶性界面活性剤を溶解させ、水を吸収することによって、粒子を多孔質化することが可能である。

多孔質化に使用される油溶性界面活性剤としては、分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のソルビタンモノエステル、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノミリステート又はヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル、例えば、ジグリセロールモノオレエート（例えば、Ｃ１８：１（炭素数１８個、二重結合数１個）脂肪酸のジグリセロールモノエステル）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレート又はヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール（例えば、ゲルベアルコール）、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコール又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル；及びこれらの混合物が挙げられる。

これらのうち、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）２０、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、更に好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノラウレート）；ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）８０、好ましくは純度約４０％、より好ましくは純度約５０％、更に好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノオレエート）；ジグリセロールモノオレエート（例えば、純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、更に好ましくは純度約７０％を超えるジグリセロールモノオレエート）；ジグリセロールモノイソステアレート（例えば、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、更に好ましくは純度約７０％を超えるジグリセロールモノイソステアレート）；ジグリセロールモノミリステート（好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、更に好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノミリステート）；ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリル基、ミリストイル基等）エーテル；及びこれらの混合物が好ましい。

これらの油溶性界面活性剤は、モノマ全質量に対して、５〜８０質量％の範囲で用いることが好ましい。油溶性界面活性剤の含有量が５質量％以上であると、水滴の安定性が充分となることから、大きな単一孔を形成し易くなる。また、油溶性界面活性剤の含有量が８０質量％以下であると、重合後に疎水性高分子粒子が形状をより保持し易くなる。

上記重合反応には、水性媒体を用いることもできる。上記水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。

アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩、アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）、アルキルリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩及びポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩が挙げられる。

カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩、及びラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の第四級アンモニウム塩が挙げられる。

ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤、シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤、及びパーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤が挙げられる。

両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤、及び亜リン酸エステル系界面活性剤が挙げられる。

界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記界面活性剤の中でも、モノマ重合時の分散安定性の観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。

上記重合反応においては、必要に応じて、重合開始剤を添加することもできる。上記重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；及び２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物が挙げられる。重合開始剤は、モノマ１００質量部に対して、例えば、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。

重合温度は、モノマ及び重合開始剤の種類に応じて、適宜選択することができる。重合温度は、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。

疎水性高分子粒子の合成において、粒子の分散安定性を向上させるために、高分子分散安定剤を用いてもよい。

高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、及びポリビニルピロリドンが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤の添加量は、モノマ１００質量部に対して１〜１０質量部が好ましい。

モノマが単独で重合することを抑えるために、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。

上記疎水性高分子粒子の平均粒径は、通液性が更に向上する観点から、１０μｍ以上が好ましい。上記疎水性高分子粒子の平均粒径は、カラムの分離性の観点から、５００μｍ以下が好ましい。これらの観点から、上記疎水性高分子粒子の平均粒径は、例えば、１０〜５００μｍであってもよい。

疎水性高分子粒子の粒径の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、通液性が更に向上する観点から、３〜１５％であることが好ましく、５〜１５％であることがより好ましく、５〜１０％であることが更に好ましい。Ｃ．Ｖ．を低減する方法としては、マイクロプロセスサーバー（株式会社日立製作所製）等の乳化装置により単分散化することが挙げられる。

疎水性高分子粒子又は分離材の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）は、以下の測定法により求めることができる。
１）粒子又は分離材を、超音波分散装置を使用して水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の粒子又は分離材を含む分散液を調製する。
２）粒度分布計（シスメックスフロー、シスメックス株式会社製）を用いて、上記分散液中の粒子又は分離材約１万個の画像により平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）を測定する。

疎水性高分子粒子が、多孔構造を有する場合、当該粒子の空隙率（細孔容積）は、疎水性高分子粒子の全体積基準で３０体積％以上７０体積％以下であることが好ましく、４０体積％以上７０体積％以下であることがより好ましい。また、疎水性高分子粒子は、細孔径分布におけるモード径（細孔径分布の最頻値、最大頻度細孔径）が０．１μｍ以上０．５μｍ未満である細孔、すなわちマクロポアー（マクロ孔）を有することが好ましい。疎水性高分子粒子の細孔径分布におけるモード径として、より好ましくは、０．２μｍ以上０．５μｍ未満である。細孔径分布におけるモード径が０．１μｍ以上であると、細孔内に物質が入り易くなる傾向にあり、細孔径分布におけるモード径が０．５μｍ未満であると、比表面積が充分なものになる。これらは上述の多孔質化剤により調整可能である。

疎水性高分子粒子の比表面積は、３０ｍ^２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ^２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ^２／ｇ以上であることが更に好ましい。比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。

本実施形態に係る疎水性高分子粒子又は分離材の細孔径分布におけるモード径、比表面積及び空隙率は、水銀圧入測定装置（オートポア：株式会社島津製作所製）にて測定した値であり、以下のようにして測定する。試料約０．０５ｇを、標準５ｍＬ粉体用セル（ステム容積０．４ｍＬ）に加え、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定する。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０°、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍに設定する。また、細孔径０．１〜３μｍの範囲に限定してそれぞれの値を算出する。

（被覆層）
本実施形態に係る被覆層は、水酸基及び水酸基以外の官能基を有する官能基含有高分子を含む。なお、上記官能基含有高分子において、上記官能基は化学結合により高分子に結合している。被覆層がこのようなものであると、イオン交換性又はリガンドとの結合性が付与される。

上記官能基としては、例えば、カルボキシ基、エポキシ基、アミノ基、４級アンモニウム基、スルホン酸基等が挙げられる。上記官能基は、カルボキシ基、エポキシ基、又はアミノ基であることが好ましい。アミノ基の具体例は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を含む。

上記官能基含有高分子は、例えば、下記式（ａ）又は（ｂ）で表される基を含んでいてもよい。

式（ａ）中、Ｘは、カルボキシ基を含む基を表す。Ｘの具体例は、カルボキシ基で置換されたアルキル基を含む。

式（ｂ）中、Ｙは、アミノ基を含む基、又はエポキシ基を含む基を示す。Ｙの具体例は、グリシジル基、及びジエチルアミノエチル基を含む。

上記官能基含有高分子は、親水性高分子であってもよい。

上記官能基含有高分子は、親水性が向上する観点から、水酸基を有する高分子又はその変性体に由来する構造を含んでいてもよい。例えば、上記官能基含有高分子は、水酸基を有する高分子又はその変性体から１つ以上の水酸基を除いた構造を有するものであってもよい。水酸基を有する高分子は、１分子中に２個以上の水酸基を有することが好ましく、親水性高分子であることがより好ましい。水酸基を有する高分子としては、例えば、多糖類及びポリビニルアルコールが挙げられる。多糖類としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロース、及びキトサンが挙げられる。すなわち、上記官能基含有高分子は、多糖類又はその変性体に由来する構造を含んでいてもよく、アガロース又はその変性体に由来する構造を含んでいてもよい。

水酸基を有する高分子の重量平均分子量（Ｍｗ）は、例えば、１００００〜２０００００程度であってもよい。

水酸基を有する高分子の変性体としては、例えば、水酸基を有する高分子を疎水基で変性したもの（以下、「疎水基変性体」ともいう）が挙げられる。上記官能基含有高分子が、このような変性体に由来する構造を含むと、界面吸着能が向上する傾向にある。疎水基としては、例えば、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基等が挙げられる。炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、及びプロピル基が挙げられる。炭素数６〜１０のアリール基としては、例えば、フェニル基、及びナフチル基が挙げられる。疎水基は、例えば、水酸基と反応する官能基（例えば、エポキシ基）及び疎水基を有する化合物（例えば、グリシジルフェニルエーテル）を、水酸基を有する高分子と従来公知の方法で反応させることにより、導入することができる。

疎水基変性体において、疎水基変性体を構成する全構成単位の総モル量（疎水基を含有する構成単位及び疎水基を含有しない構成単位のモル量の総和）に対する、疎水基を含有する構成単位の含有割合は、官能基含有高分子を疎水性高分子粒子の表面に吸着させるための疎水的相互作用力の保持と、タンパク質の非特異吸着の抑制とのバランスの観点から、５〜３０％であることが好ましく、１０〜２０％であることがより好ましく、１２〜１７％であることが更に好ましい。

カラム圧の上昇がより抑制される観点から、上記官能基含有高分子は架橋されていてもよい。

（被覆層の形成方法）
本実施形態に係る被覆層は、例えば、疎水性高分子粒子表面に、水酸基を有する高分子又はその変性体を吸着させる工程（吸着処理工程）と、上記水酸基を有する高分子又はその変性体を架橋する工程（架橋処理工程）と、架橋された水酸基を有する高分子又はその変性体に官能基を導入する工程（官能基導入工程）と、を備える方法により形成できる。以下、これらの工程について、具体的に説明する。

（吸着処理工程）
吸着処理工程においては、例えば、水酸基を有する高分子又はその変性体の溶液に、疎水性高分子粒子を含浸させることにより、疎水性高分子粒子表面に、水酸基を有する高分子又はその変性体を吸着させる。これにより、疎水性高分子粒子表面に、水酸基を有する高分子又はその変性体が固定化される。水酸基を有する高分子又はその変性体の溶液の溶媒としては、水酸基を有する高分子又はその変性体を溶解することのできるものであれば、特に限定されないが、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、５〜２０（ｍｇ／ｍＬ）が好ましい。

含浸方法としては、例えば、水酸基を有する高分子又はその変性体の溶液に疎水性高分子粒子を加えて一定時間放置する方法が挙げられる。含浸時間は疎水性高分子粒子の表面状態によっても変わるが、例えば、疎水性高分子粒子が多孔構造を有する場合でも、通常一昼夜含浸すれば、高分子濃度が多孔質体の内部で外部濃度と平衡状態となる。

次いで、水、アルコール等の溶媒で洗浄し、未吸着分の水酸基を有する高分子又はその変性体を除去する。

（架橋処理工程）
架橋処理工程においては、例えば、架橋剤を用いて、疎水性高分子粒子表面に吸着された水酸基を有する高分子又はその変性体を架橋反応させて、これらの架橋体を形成する。当該架橋体は、例えば、水酸基を有する３次元架橋網目構造を有する。

架橋剤としては、例えば、エピクロルヒドリン等のエピハロヒドリン、グルタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物、メチレンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物、及びエチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジル化合物などのような水酸基に活性な官能基を２個以上有する化合物が挙げられる。また、水酸基を有する高分子又はその変性体が、例えば、アミノ基を有する化合物（キトサン又はその変性体等）である場合には、ジクロロオクタンのようなジハライド化合物も架橋剤として使用できる。

この架橋反応には通常触媒が用いられる。該触媒は架橋剤の種類に合わせて適宜従来公知のものを用いることができるが、例えば、架橋剤がエピクロルヒドリン等の場合には水酸化ナトリウム等のアルカリが有効であり、ジアルデヒド化合物の場合には塩酸等の鉱酸が有効である。

架橋剤による架橋反応は、通常、水酸基を有する高分子又はその変性体が吸着された疎水性高分子粒子を、適当な媒体中に分散、懸濁させた系に架橋剤を添加することによって行われる。架橋剤の添加量は、水酸基を有する高分子として多糖類を使用した場合、単糖類の１単位を１モルとすると、それに対して、例えば、０．１〜１００モル倍の範囲内で、分離材の性能に応じて選定することができる。架橋剤の添加量が、上記下限値以上であると、被覆層が疎水性高分子粒子上に良好に保持される傾向にある。また、架橋剤の添加量が上記上限値以下であれば、水酸基を有する高分子又はその変性体の反応率が高い場合でも、水酸基を有する高分子又はその変性体の特性が損なわれ難い。

触媒の使用量としては、架橋剤の種類により異なるが、通常、水酸基を有する高分子として多糖類を使用する場合に、多糖類を形成する単糖類の１単位を１モルとすると、これに対して、例えば、０．０１〜１０モル倍の範囲、好ましくは０．１〜５モル倍の範囲で使用される。

例えば、架橋反応条件を温度条件とした場合、反応系の温度を上げ、その温度が反応温度に達すれば架橋反応が生起する。

水酸基を有する高分子又はその変性体が吸着された疎水性高分子粒子を分散、懸濁させる媒体は、例えば、高分子成分、架橋剤等を抽出してしまうことなく、かつ、架橋反応に不活性なものであることができる。上記媒体の具体例としては、水、トルエン、ジクロルベンゼン、ニトロメタン等が挙げられる。

架橋反応は、例えば、１〜９０℃の範囲の温度で行ってもよい。また、反応時間は、例えば、１〜３６時間であってもよく、１〜２４時間であってもよく、１〜１０時間であってもよい。

架橋度を調整する場合、架橋反応を段階的に行うことができる。例えば、一度架橋反応を行った後、再度架橋反応させることによって、架橋の進行度を調整できる。

架橋度は、熱分解による５％重量減少温度を測定し、その値から評価することができる。架橋度が高い場合、重量減少開始温度は高くなり、架橋度が低い場合、重量減少開始温度も低くなる。熱分解による５％重量減少温度は、例えば、示差熱熱重量測定装置を用いて測定できる。

架橋反応終了後、得られた粒子をろ別し、次いで、水、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒で洗浄し、未反応の高分子、懸濁用媒体等を除去する。これにより、疎水性高分子粒子の表面の少なくとも一部に、水酸基を有する高分子又はその変性体の架橋体を含む被覆層が形成された、架橋体被覆粒子を作製できる。

（官能基導入工程）
官能基導入工程は、上記架橋体に官能基を導入する工程である。上記架橋体に官能基を導入する方法に特に制限はなく、任意の方法を選択できる。上記架橋体に官能基を導入する方法としては、例えば、上記架橋体に官能基を直接導入する方法、及び上記架橋体が有する水酸基を介して官能基を導入する方法が挙げられる。官能基の導入方法に特に制限はなく、官能基の種類等により適宜選択できる。水酸基を介して官能基を導入する方法としては、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。なお、水酸基を介して官能基を導入する場合、官能基は、架橋体が有する水酸基のうちの少なくとも一部に導入されていればよい。

ハロゲン化アルキル化合物としては、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸及びそのナトリウム塩、ジエチルアミノエチルクロライド等のハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する１級、２級又は３級アミン等が挙げられる。ハロゲン化アルキル化合物は、硫黄化合物、臭化物又は塩化物であってもよい。

官能基として、弱酸性基であるカルボキシ基を導入する方法としては、例えば、上記ハロゲン化アルキル化合物として、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸又はそのナトリウム塩を反応させる方法が挙げられる。これらハロゲン化アルキル化合物の使用量は、架橋体被覆粒子の全質量に対して、０．２質量％以上であることが好ましい。

官能基としてカルボキシ基を導入する方法は、例えば、上記架橋体が有する水酸基に、エピクロルヒドリン等のハロゲン基含有グリシジル化合物を反応させ、エポキシ基を導入した後、当該エポキシ基に、カルボン酸又はその塩を反応させる方法であってもよい。カルボン酸又はその塩としては、例えば、メルカプトプロピオン酸、及びメルカプト酢酸ナトリウムが挙げられる。

官能基として、エポキシ基を導入する方法としては、例えば、上記架橋体に、エピハロヒドリン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，２，３，４−ジエポキシブタン等のエポキシ基含有化合物を反応させる方法が挙げられる。エピハロヒドリンとして好ましいものとしては、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、エピヨードヒドリン、β−メチルエピクロロヒドリン、α−メチルエピクロロヒドリン、γ−メチルエピクロロヒドリン等が挙げられる。これらのエポキシ基含有化合物の使用量は、架橋体被覆粒子の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。反応条件は、４０〜９０℃で０．５〜１２時間であることが好ましい。

官能基としてエポキシ基を導入する方法は、例えば、上記架橋体が有する水酸基に、エピクロルヒドリン等のハロゲン基含有グリシジル化合物を反応させる方法であってもよい。

官能基として、アミノ基を導入する方法としては、例えば、上記ハロゲン化アルキル化合物のうち、水素原子の一部が塩素原子に置換されたアルキル基を少なくとも１つ有する、モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミン、モノ−、ジ−又はトリ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミン等を反応させる方法が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、架橋体被覆粒子の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。反応条件は、４０〜９０℃で、０．５〜１２時間であることが好ましい。当該方法に用いられるハロゲン化アルキル化合物の具体例は、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩を含む。

官能基として、強酸性基であるスルホン酸基の導入方法としては、上記架橋体に対してエピクロロヒドリン等のグリシジル化合物を反応させ、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩又は重亜硫酸塩の飽和水溶液に架橋体被覆粒子を添加する方法等が挙げられる。反応条件は、３０〜９０℃で１〜１０時間であることが好ましい。

また、アルカリ性雰囲気下で、上記架橋体に１，３−プロパンスルトンを反応させる方法によっても、上記架橋体に官能基を導入し得る。１，３−プロパンスルトンは、架橋体被覆粒子の全質量に対して０．４質量％以上使用することが好ましい。反応条件は、０〜９０℃で０．５〜１２時間であることが好ましい。

本実施形態の分離材において、乾燥状態の分離材１ｇ当たりの官能基のモル量（ｍｍｏｌ）は、吸着させるタンパク質のサイズ、分離材の表面積、比重等に応じて適宜調整することが好ましい。

本実施形態の分離材は、イオン交換担体として好適に使用し得る。また、本実施形態の分離材は、アフィニティ精製、タンパク質の静電的相互作用による分離等にも好適に使用し得る。例えば、タンパク質を含む混合溶液の中に本実施形態の分離材を添加し、静電的相互作用によりタンパク質だけを分離材に吸着させた後、該分離材を溶液からろ別し、塩濃度の高い水溶液中に添加すれば、分離材に吸着しているタンパク質を容易に脱離、回収できる。また、本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィー（例えば、液体クロマトグラフィー）において、使用することも可能である。より具体的には、本実施形態の分離材は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー分野（特に抗体医薬品精製の分野）にも好適に利用できる。

本実施形態の分離材を用いて分離できる生体高分子としては、水溶性物質が好ましい。具体的には、血清アルブミン、免疫グロブリン等の血液タンパク質などのタンパク質、生体中に存在する酵素、バイオテクノロジーにより生産されるタンパク質生理活性物質、ＤＮＡ、生理活性をするペプチド等の生体高分子などであり、好ましくは分子量が２００万以下、より好ましくは５０万以下である。また、公知の方法に従い、タンパク質の等電点、イオン化状態等によって、分離材の性質、条件等を選ぶ必要がある。公知の方法としては、例えば、特開昭６０−１６９４２７号公報等に記載の方法が挙げられる。

本実施形態の分離材は、疎水性高分子粒子１ｇ当たり３０〜６００ｍｇの被覆層を備えると好ましい。被覆層の量は熱分解の重量減少等で測定することができる。

本実施形態の分離材の水中での５％圧縮変形弾性率（湿潤状態での５％圧縮変形弾性率）は、例えば、７０ＭＰａ以上であってもよく、７５ＭＰａ以上であってもよく、８０ＭＰａ以上であってもよい。

本明細書において、分離材の水中での５％圧縮変形弾性率（分離材が５％圧縮変形したときの圧縮弾性率、５％Ｋ値ともいう）は、以下の方法により算出された値をいう。
微小圧縮試験機（Ｆｉｓｈｅｒ製）を用いて、室温（２０〜２５℃）条件にて荷重負荷速度１ｍＮ／秒で、四角柱の平滑な端面（５０μｍ×５０μｍ）により、予め水中に浸漬させた分離材を５０ｍＮまで圧縮したときの荷重及び圧縮変位を測定する。得られた測定値から、分離材が５％圧縮変形したときの圧縮弾性率（５％Ｋ値）を下記式により求める。また、上記測定中の変位量が最も大きく変化する点の荷重を破壊強度（ｍＮ）とする。
５％Ｋ値（ＭＰａ）＝（３／２^１／２）・Ｆ・Ｓ^−３／２・Ｒ^−１／２
Ｆ：分離材が５％圧縮変形したときの荷重（ｍＮ）
Ｓ：分離材が５％圧縮変形したときの圧縮変位（ｍｍ）
Ｒ：分離材の半径（ｍｍ）

本実施形態の分離材は、カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液速度が５００ｃｍ／ｈ以上であることが好ましい。カラムクロマトグラフィーでタンパク質の分離を行う場合、タンパク質溶液等の通液速度としては、一般に４００ｃｍ／ｈ以下の範囲であるが、本実施形態の分離材を使用した場合は、通常のタンパク質分離用の分離材よりも速い通液速度５００ｃｍ／ｈ以上で使用することができる。なお、本明細書における通液速度とは、φ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに本実施形態の分離材を充填し、液を通した際の通液速度を表す。

分離材の、平均細孔径、比表面積等は、疎水性高分子粒子の原料、多孔質化剤、水酸基を有する高分子等を適宜選択することによって、調整することができる。

本実施形態の分離材には、上記官能基を介して又は上記官能基とは別に、例えば、リガンド（例えば、プロテインＡ）又はイオン交換基を導入することもできる。リガンド又はイオン交換基が更に導入された分離材は、例えば、アフィニティ精製、イオン交換精製等の用途に好適に使用し得る。

本実施形態のカラムは、本実施形態の分離材を備えるものである。本実施形態のカラムは、例えば、カラムに本実施形態の分離材を充填することで製造できる。カラムに本実施形態の分離材を充填する方法は特に制限されるものではなく、例えば、公知の方法を採用することができる。

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
（疎水性の多孔質高分子粒子の合成）
５００ｍＬの三口フラスコに、モノマとしての純度９６％のジビニルベンゼン（新日鉄住金株式会社製、商品名：ＤＶＢ９６０）１６ｇ、多孔質化剤としてのヘキサノール１６ｇ及びジエチルベンゼン１６ｇ、並びに開始剤としての過酸化ベンゾイル０．６４ｇをポリビニルアルコール（０．５質量％）分散剤水溶液に混合して、混合液を得た。得られた混合液を、マイクロプロセスサーバーを使用して乳化した後、得られた乳化液をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、撹拌機を用いて約８時間撹拌して粒子を得た。得られた粒子をろ別して、更にアセトンで洗浄し、疎水性の多孔質高分子粒子１を得た。得られた多孔質高分子粒子１の粒径をフロー型粒径測定装置で測定し、平均粒径を算出した。結果を表１に示す。

（水酸基を有する高分子への疎水基の導入）
アガロース水溶液（濃度２質量％）４８０ｍＬに水酸化ナトリウム０．９８ｇ、及びグリシジルフェニルエーテル４．９０ｇを投入して６０℃で６時間反応させ、アガロースにフェニル基を導入した。得られた変性アガロースをイソプロピルアルコールで再沈殿させ、洗浄した。変性アガロースの疎水基含有量を下記方法により算出したところ、１４．２％であった。

（変性アガロースの疎水基含有量の評価）
乾燥状態の粉末アガロース（変性されていないアガロース）と、揮発分０．１質量％未満まで乾燥させた変性アガロースとをそれぞれ７０℃の純水に溶解させ、０．０５質量％の水溶液サンプルを調製した。

分光光度計により各水溶液の２６９ｎｍの吸光度を測定して濃度を求め、下記式より疎水基含有量を算出した。
・疎水基含有量（％）＝（Ｃ_ＡＧ／（Ｃ_ＨＡＧ＋Ｃ_ＡＧ））×１００
・Ｃ_ＡＧ：変性されているアガロース構成単位の濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）
＝Ａ／ε_ＧＰＥ×１０００
・Ｃ_ＨＡＧ：変性されていないアガロース構成単位の濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）
＝（変性されてないアガロース構成単位の濃度（ｇ／Ｌ）／アガロース構成単位（３０６ｇ／ｍｏｌ））×１０００
・Ａ：疎水基導入アガロースの真の吸光度
＝疎水基を導入したアガロースの吸光度−変性されていないアガロースの吸収
・ε_ＧＰＥ：グリシジルフェニルエーテルの吸光係数
＝１３７２（Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ））
・変性されていないアガロースの吸収＝変性されてないアガロースの吸光度×（変性アガロースのサンプル濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）／変性されてないアガロースのサンプル濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ））
・変性されてないアガロース構成単位の濃度（ｇ／Ｌ）＝変性アガロースのサンプル濃度（質量％）×１０−変性されているアガロース構成単位の濃度（ｇ／Ｌ）
・変性されているアガロース構成単位の濃度（ｇ／Ｌ）＝（Ｃ_ＡＧ×変性されているアガロース構成単位（４５６ｇ／ｍｏｌ））／１０００

（水酸基を有する高分子の変性体の粒子へのコーティング）
２０ｍｇ／ｍＬの変性アガロース水溶液に多孔質高分子粒子１を７０ｍＬ／粒子ｇの濃度で投入し、５５℃で２４ｈ撹拌して、多孔質高分子粒子１に変性アガロースを吸着させた。次いで、変性アガロースを吸着させた多孔質高分子粒子１をろ別して、更に熱水で洗浄した。

（コーティングした水酸基を有する高分子の変性体の架橋）
多孔質高分子粒子１の表面及び細孔内部に吸着した変性アガロースを次のようにして架橋した。変性アガロースが吸着した粒子１０ｇを０．４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に分散させ、０．０２Ｍエピクロロヒドリンを添加し、２４時間室温にて撹拌した。その後、２質量％の熱ドデシル硫酸ナトリウム水溶液で洗浄後、純水で更に洗浄し、乾燥させることで、変性アガロースの架橋体を被覆層として有する架橋体被覆粒子を得た。

（タンパク質の非特異吸着能の評価）
得られた架橋体被覆粒子０．２ｇを、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）濃度２４ｍｇ／ｍＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍＬに加え、２４時間室温で撹拌した。その後、遠心分離で上澄み液を採取し、分光光度計で上澄み液の２８０ｎｍの吸光度を測定することによって求めた上澄み液のＢＳＡ濃度より、粒子に吸着したＢＳＡ量を算出した。粒子１ｍＬあたりのＢＳＡ量吸着量が、１ｍｇ以下である場合を「Ａ」、１ｍｇ超５ｍｇ未満である場合を「Ｂ」、５ｍｇ以上である場合を「Ｃ」として評価した。結果を表１に示す。

（カルボキシ基の導入）
得られた架橋体被覆粒子（乾燥質量１ｇ）を、０．４Ｍの水酸化ナトリウム水溶液１０ｍＬに加えた後、エピクロロヒドリン０．６ｇを更に加え、室温で撹拌しながら３時間反応させた。反応終了後、粒子をろ別し、５００ｍＬの水で洗浄して、架橋体にエポキシ基を導入した。次いで、粒子に、水１０ｍＬ、及び１Ｍのメルカプト酢酸ナトリウム水溶液１０ｍＬを加え、室温で２４時間撹拌し、反応させた。反応終了後、粒子をろ別し、１０００ｍＬの水で洗浄して、架橋体にカルボキシ基を導入した。これにより本実施形態の分離材を得た。なお、本実施例における官能基導入剤は、メルカプト酢酸ナトリウムである。

（カルボキシ基量の測定）
得られた分離材の官能基量を以下のように測定した。湿潤状態の分離材０．５ｇに、０．１Ｎの塩酸水溶液２０ｇを加え、室温で３０分撹拌した。撹拌後の分離材を吸引してろ別し、さらに、水５００ｍＬで洗浄し、洗浄液のｐＨが５以上であることを確認した。洗浄後の分離材に０．５Ｍの塩化ナトリウム水溶液１０ｇを加え、室温で３０分撹拌した。撹拌後の分離材の懸濁液を０．０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７を終点として滴定することにより、乾燥状態の分離材１ｇ当たりのカルボキシ基のモル量（ｍｍｏｌ）を測定した。この結果を官能基密度（ｍｍｏｌ／粒子ｇ）として、表１に示す。

（リガンドの固定化）
得られた分離材０．０９ｇに、プロテインＡを０．０２ｇ、ＷＳＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）を０．０２ｇ、及びｐＨ５．８に調整した５０ｍＭのＰＢＳを２ｍｌ加えたのち、室温で２４時間撹拌した。その後、粒子をろ別及び洗浄することによりリガンド固定化粒子を得た。

（リガンド固定化量の算出）
２４時間撹拌後の反応溶液から粒子をろ別した後、所定濃度の粒子を含む試料を調製した。当該試料の吸光度（２８０ｎｍ）を測定し、予め作成した検量線により、リガンド固定化量を算出した。結果を表１に示す。

（水中での５％圧縮変形弾性率の算出）
得られた分離材の水中での５％圧縮変形弾性率を以下のようにして算出した。結果を表１に示す。

微小圧縮試験機（Ｆｉｓｈｅｒ製）を用いて、室温（２０〜２５℃）条件にて荷重負荷速度１ｍＮ／秒で、四角柱の平滑な端面（５０μｍ×５０μｍ）により、予め水中に浸漬させた分離材を５０ｍＮまで圧縮したときの荷重及び圧縮変位を測定する。得られた測定値から、分離材が５％圧縮変形したときの圧縮弾性率（５％Ｋ値）を下記式により求めることができる。また、上記測定中の変位量が最も大きく変化する点の荷重を破壊強度（ｍＮ）とする。

５％Ｋ値（ＭＰａ）＝（３／２^１／２）・Ｆ・Ｓ^−３／２・Ｒ^−１／２
Ｆ：分離材が５％圧縮変形したときの荷重（ｍＮ）
Ｓ：分離材が５％圧縮変形したときの圧縮変位（ｍｍ）
Ｒ：分離材の半径（ｍｍ）

（カラム特性評価）
得られた分離材を、濃度３０質量％のスラリー（溶媒：メタノール）として、φ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに、１５分充填した。その後、カラムに流速を変えながら水を通し、流速とカラム圧との関係を測定し、０．３ＭＰａ時の通液速度（線流速）を測定した。結果を表１に示す。

（実施例２）
実施例１と同様にして、架橋体被覆粒子を作製した。

（カルボキシ基の導入）
得られた架橋体被覆粒子（乾燥質量１ｇ）を、０．４Ｍの水酸化ナトリウム水溶液１０ｍＬに加えた後、エピクロロヒドリン０．６ｇを更に加え、室温で撹拌しながら３時間反応させた。反応終了後、粒子をろ別し、５００ｍＬの水で洗浄して、架橋体にエポキシ基を導入した。次いで、粒子に、水酸化ナトリウム５ｇを水１５ｍＬに溶解させた水酸化ナトリウム水溶液１５ｍＬと、メルカプトプロピオン酸５ｇとを加え、室温で２４時間撹拌し、反応させた。反応終了後、粒子をろ別し、１０００ｍＬの水で洗浄して、架橋体にカルボキシ基を導入した。これにより本実施形態の分離材を得た。なお、本実施例における官能基導入剤は、メルカプトプロピオン酸である。

また、実施例１と同様にして、平均粒径、タンパク質の非特異吸着能、カルボキシ基量（官能基密度）、水中での５％圧縮変形弾性率、及びカラム特性（通液速度）を評価した。また、実施例１と同様にして、リガンドの固定化を行い、リガンド固定化量を算出した。結果を表１に示す。

（実施例３）
実施例１と同様にして、架橋体被覆粒子を作製した。

（エポキシ基の導入）
得られた架橋体被覆粒子（乾燥質量１ｇ）を、０．４Ｍの水酸化ナトリウム水溶液１０ｍＬに加えた後、エピクロロヒドリン０．６ｇを更に加え、室温で撹拌しながら３時間反応させた。反応終了後、粒子をろ別し、５００ｍＬの水で洗浄し、架橋体にエポキシ基を導入した。これにより本実施形態の分離材を得た。

（エポキシ基量の測定）
得られた分離材の官能基量を以下のように測定した。湿潤状態の分離材０．５ｇに水１０ｇ，１Ｎの塩酸水溶液１ｇ加え、７０℃で１時間撹拌し、反応させた。反応後、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで中和滴定することにより、乾燥状態の分離材１ｇ当たりのエポキシ基のモル量（ｍｍｏｌ）を測定した。この結果を官能基密度（ｍｍｏｌ／粒子ｇ）として、表１に示す。

（リガンドの固定化）
得られた分離材０．０９ｇに、プロテインＡを０．０２ｇ、及びｐＨ１０の０．５Ｍ炭酸バッファー（和光純薬工業社製の炭酸水素ナトリウム及び炭酸ナトリウムと、ＲＯ水とで調製）を２ｍＬ加え、３０℃で２４時間撹拌した。その後、粒子をろ別及び洗浄することによりリガンド固定化粒子を得た。

（リガンド固定化量の算出）
２４時間撹拌後の反応溶液から粒子をろ別した後、所定濃度の粒子を含む試料を調製した。当該試料の吸光度（２８０ｎｍ）を測定し、予め作成した検量線により、リガンド固定化量を算出した。結果を表１に示す。

また、実施例１と同様にして、平均粒径、タンパク質の非特異吸着能、水中での５％圧縮変形弾性率、及びカラム特性（通液速度）を評価した。結果を表１に示す。

（実施例４）
実施例１と同様にして、架橋体被覆粒子を作製した。

（アミノ基の導入）
得られた架橋体被覆粒子（乾燥質量２０ｇ）を、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬに加え、室温で１時間放置した。別途、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩の所定量（１０ｇ）を２００ｍＬ添加し、水溶液の温度を７０℃まで上げ、撹拌しながら２時間反応させた。反応終了後、ろ過、水／エタノール（体積比５／１）で３回洗浄し、架橋体にジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を導入した。これにより本実施形態の分離材を得た。

（アミノ基量の測定）
得られた分離材の官能基量を以下のように測定した。湿潤状態の分離材０．５ｇを０．１Ｎ水酸化ナトリウム２０ｍＬに１時間浸漬し、室温で撹拌した。その後、溶液のｐＨが７以下となるように水で洗浄を行った。洗浄後の分離材を０．１Ｎ塩酸２０ｍＬに浸漬し、１時間撹拌させた。撹拌後の分離材をろ別後、塩酸水溶液を中和滴定することにより、乾燥状態の分離材１ｇ当たりのアミノ基のモル量（ｍｍｏｌ）を測定した。この結果を官能基密度（ｍｍｏｌ／粒子ｇ）として、表１に示す。

また、実施例１と同様にして、平均粒径、タンパク質の非特異吸着能、水中での５％圧縮変形弾性率、及びカラム特性（通液速度）を評価した。結果を表１に示す。

（比較例１）
市販のアガロース粒子（Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ（ＧＥヘルスケア製、商品名））をそのまま分離材として用い、実施例１と同様に、平均粒径、タンパク質の非特異吸着能、水中での５％圧縮変形弾性率、及びカラム特性（通液速度）を評価した。結果を表１に示す。

（比較例２）
多孔質高分子粒子１をそのまま分離材として用い、実施例１と同様に、平均粒径、タンパク質の非特異吸着能、水中での５％圧縮変形弾性率、及びカラム特性（通液速度）を評価した。結果を表１に示す。

表１の結果から、実施例１〜４の分離材は、タンパク質の非特異吸着が低減され、カラムに充填したときの通液性に優れていることがわかる。また、実施例１〜４の分離材は、水中での５％圧縮変形弾性率も高いことがわかる。

Claims (11)

1. 疎水性高分子粒子と、
   該疎水性高分子粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備え、
   前記被覆層が、水酸基及び水酸基以外の官能基を有する官能基含有高分子を含む、分離材。
2. 前記水酸基以外の官能基が、カルボキシ基、エポキシ基、又はアミノ基である、請求項１に記載の分離材。
3. 水中での５％圧縮変形弾性率が７０ＭＰａ以上である、請求項１又は２に記載の分離材。
4. カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液速度が５００ｃｍ／ｈ以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分離材。
5. 前記疎水性高分子粒子が、スチレン系モノマに由来する構造単位を有する疎水性高分子を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離材。
6. 前記官能基含有高分子が、多糖類又はその変性体に由来する構造を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分離材。
7. 前記官能基含有高分子が、アガロース又はその変性体に由来する構造を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分離材。
8. 前記官能基含有高分子が、架橋されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分離材。
9. 前記疎水性高分子粒子の平均粒径が１０〜５００μｍである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分離材。
10. 前記疎水性高分子粒子が多孔構造を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の分離材。
11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の分離材を備えるカラム。