JPH055731A

JPH055731A - アフイニテイクロマトグラフイー用担体

Info

Publication number: JPH055731A
Application number: JP3158420A
Authority: JP
Inventors: Kazuyuki Oishi; 和之大石
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1991-06-28
Filing date: 1991-06-28
Publication date: 1993-01-14
Anticipated expiration: 2015-06-12
Also published as: JP3050951B2

Abstract

(57)【要約】【構成】疎水性架橋重合体粒子の表面に、厚さ１０から
３００オングストロームの親水性重合体の層が形成され
たアフィニティクロマトグラフィー用担体粒子。この親
水性重合体は、アフィニティクロマトグラフィーにおけ
るリガンドまたはスペーサーを固定化できる官能基（例
えば、水酸基、カルボニル基、アミノ基、グリシジル
基、シアノ基）を有する重合体である。【効果】耐圧性に優れ、膨潤および収縮の度合が少な
く、かつタンパク質の非特異的吸着がない担体が得られ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アフィニティクロマト
グラフィー用担体に関する。

【０００２】

【従来の技術】アフィニティクロマトグラフィーとは、
不溶性の天然または合成の高分子からなる担体に、分離
・精製を目的とする物質と特異的に結合する物質（リガ
ンド）を固定化し、得られたリガンド固定化担体を充填
したカラムを用いるクロマトグラフィーであり、特に生
体関連物質の分離・精製に用いられる。

【０００３】従来より用いられているアフィニティクロ
マトグラフィー用の担体には、無機系担体としては多孔
性シリカゲル粒子がある。有機系担体としては天然およ
び合成高分子系の担体があり、天然物由来の担体として
はアガロース、デキストラン、セルロースなどの多糖類
でなる粒子が、そして合成高分子系の担体としてはポリ
スチレン、ポリアクリルアミドなどでなる粒子がある。

【０００４】担体としての理想的な条件は、一般に次の
通りである：(1) 担体自体がタンパク質などの生体物質
一般に対して非特異吸着をしないこと；(2)多孔性の度
合が高いこと；(3)穏和な条件下でリガンドまたはスペ
ーサーを固定化できる官能基を有すること、またその固
定化容量が大きいこと；(4) リガンド固定化後も化学的
および物理的安定性が保たれること；および(5) カラム
への充填およびクロマトグラフィー操作を行うための充
分な機械的強度を有すること。しかし、これらの条件を
満たす担体は未だ開発されていない（「アフィニティク
ロマトグラフィー」大沢利昭、寺尾允男、共編、蛋白質
核酸酵素別冊NO.22,1980,pp5 〜10）。

【０００５】例えば、上記の従来の担体のうち、無機系
の多孔性シリカゲル粒子は物理的強度が強く、分離の良
い担体ではあるが、非特異吸着の度合が高いという欠点
があるため実際に使用されている例は極めて少ない。一
方、有機系担体のうち天然の担体としては、多孔性のア
ガロース粒子（商品名：Sepharose ）およびデキストラ
ン粒子（商品名：Sephadex）に各種官能基を導入したも
のが市販されており、現在ではこれらが最も汎用されて
いる。アガロースゲルは担体として、排除できる不純物
の限界分子量がデキストランやアクリルアミドよりも大
きいため、高分子量の生物学的物質を扱う場合に適して
いると言われる。しかし、これらの親水性担体に共通し
ている欠点は、物理的強度が小さいため耐圧性に欠け、
高流速分析つまり短時間で分析操作を行うことが困難な
点である。特開昭62-23437号公報には、無機または有機
高分子でなる芯粒子の表面にアガロースゲルが被覆され
たクロマトグラフィー用担体が開示されている。この担
体の芯粒子の平均粒径は５〜１０００μｍであり、アガ
ロースゲルの厚みは芯粒子の平均粒径の０．０５〜０．
７５倍である。しかし、この担体においてはアガロース
ゲルの厚みが比較的厚いため十分な物理的強度を得るこ
とができない。

【０００６】合成高分子系では、ポリアクリルアミドゲ
ル（商品名：Bio-Gel P、バイオラッド社）、ポリスチ
レン、エチレン−無水マレイン酸共重合物などでなる粒
子が開発されている。しかし、これらの高分子はその疎
水性のため、生体関連物質の非特異的吸着が起こり易い
欠点がある。合成高分子系担体の開発目的は、天然多糖
類系担体の性能を保持したまま、物理的強度を向上させ
ることであり、このような目的の達成のため種々の改善
が試みられている。しかし、物理的強度の向上のために
は、多孔性の度合を低減したり、架橋度を増大させるこ
とが必要である。これらの対応策は比表面積の減少や親
水性の低下を招くためおのずと限界があり、十分な性能
が得られないのが現状である（「アフィニティークロマ
トグラフィー」山崎誠、石井信一、岩井浩一共編、講
談社、1975、pp9〜19）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記従来の欠
点を解決するものであり、その目的とするところは、耐
圧性が高く、膨潤および収縮の度合が小さい、従って、
高速分離が可能で、十分な親水性を有し、被分離物質以
外のタンパク質などの非特異的吸着が極めて少ないアフ
ィニティクロマトグラフィー用担体を提供することにあ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明のアフィニティク
ロマトグラフィー用担体は、疎水性架橋重合体粒子の表
面部分に、親水性重合体の層が形成された被覆重合体で
なり、該親水性重合体の層の厚さが１０から３００オン
グストロームであり、そして、該親水性重合体は、アフ
ィニティクロマトグラフィーにおけるリガンドまたはス
ペーサーを固定化し得る官能基を有する重合体である。

【０００９】本発明の担体は、疎水性架橋重合体粒子を
骨格とし、親水性重合体で該疎水性架橋重合体粒子の表
面部分が被覆された、二層構造の重合体である。疎水性
架橋重合体粒子の素材としては、疎水性架橋性単量体を
（共）重合させて得られる（共）重合体、または疎水性
架橋性単量体と疎水性非架橋性単量体との共重合体が挙
げられる。これらの（共）重合体は、疎水性架橋性単量
体の単独重合体、あるいは２種以上の架橋性単量体より
なる共重合体である。さらに必要に応じて、１種以上の
疎水性非架橋性単量体を添加することもできる。

【００１０】本発明に使用される疎水性架橋性単量体と
しては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリ
レート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレー
ト、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポ
リプロピレングリコール（メタ）アクリレートなどのジ
（メタ）アクリル酸エステル；テトラメチロールメタン
トリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテ
トラ（メタ）アクリレートなどの多価アルコールのポリ
（メタ）アクリル酸エステル；ジビニルベンゼン、ジビ
ニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレン
などの２個以上のビニル基を有する芳香族系化合物など
が挙げられる。必要に応じて加えられ得る疎水性非架橋
性の単量体としては、例えば、メチル（メタ）アクリレ
ート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）
アクリレート、イソプロピル(メタ）アクリレート、ブ
チル（メタ）アクリレート、t-ブチル（メタ）アクリレ
ートなどの（メタ）アクリル酸エステル；酢酸ビニル、
プロピオン酸ビニル、酪酸ビニル、カプロン酸ビニルな
どのカルボン酸ビニル類；およびスチレン、メチルスチ
レンなどのスチレン系単量体が挙げられる。上記の架橋
性および非架橋性単量体を混合して用いる場合には、架
橋性単量体が全単量体１００重量部に対して１０重量部
以上、好ましくは２０重量部以上となるように使用され
る。この疎水性架橋重合体粒子の粒径は、通常２〜１０
００μｍ、好ましくは、５〜５００μｍである。

【００１１】本発明に使用される疎水性架橋重合体粒子
を被覆する親水性重合体は、リガンド固定化のために用
いられ得る官能基（以下、固定化用官能基という）を有
する親水性単量体を、重合して得られる。固定化用官能
基としては、例えば、次の基が挙げられる。-OH基、-CO
OH基、-NH₂基、グリシジル基、-CN基。分子内に同一の
官能基を２個以上有する単量体、および／または異なる
官能基を２種以上有する単量体も使用可能である。-OH
基を有する親水性単量体としては、2-ヒドロキシメチル
（メタ）アクリレート、2-ヒドロキシエチル（メタ）ア
クリレート、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、
ポリエチレングリコ−ルモノ（メタ）アクリレートなど
が挙げられる。-COOH基を有する親水性単量体としては
（メタ）アクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フタル
酸、2-カルボキシエチル（メタ）アクリレートなどが挙
げられる。-NH₂ 基を有する親水性単量体としては、
（メタ）アクリルアミド、マレイン酸アミド、フマル酸
アミド、アクリルアミンなどが挙げられる。グリシジル
基を有する親水性単量体としては、グリシジル（メタ）
アクリレート、オキシラニルメチル（メタ）アクリレー
ト、オキシラニルノニル（メタ）アクリレートなどが挙
げられる。-CN基を有する親水性単量体としては、（メ
タ）アクリロニトリル、シアノアクリレートなどが挙げ
られる。

【００１２】上記親水性単量体は、必要に応じて２種以
上が混合して用いられ得る。親水性単量体の使用量は単
量体の種類によって異なるが、被覆すべき疎水性架橋重
合体粒子１００重量部に対して５〜５０重量部の割合で
ある。

【００１３】化学反応により、上記固定化用官能基に変
換し得る官能基をもつ単量体も使用可能である。これら
の単量体としては、メチル（メタ）アクリレート、プロ
ピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレー
トなどのアルキル（メタ）アクリレート類；酢酸ビニ
ル、プロピオン酸ビニル、酪酸ビニルなどのカルボン酸
ビニル類などがある。これらは加水分解反応により、-C
OOH基または-OH基に変換され得る。ジアセトンアクリル
アミドカルボニルなどカルボニル基をもつ単量体は、こ
のカルボニル基の還元により-OH基に、あるいは末端の
メトキシ基をもつのはハロホルム反応により-COOH基に
変換され得る。塩化アリルは含水エタノール中でアルカ
リ金属のシアン化物を反応させることにより、末端に-C
N基をもつシアン化ニトリルに変換され得る。

【００１４】これらの単量体を用いた場合は、上記の化
学反応はあくまで固定化用官能基に変換するためのみに
作用し、疎水性架橋重合体そのものを分解しない条件で
行う必要がある。例えば、アクリル酸メチルを疎水性架
橋重合体粒子の存在下で重合させて、該粒子の表面に重
合体の被覆層が形成された場合には、アルカリ性の条件
下で加水分解すれば形成されたアクリル酸メチル重合体
は容易にアクリル酸重合体に変換される。しかし、疎水
性架橋重合体中にエステル結合が存在する場合は、この
エステル結合までも開裂する恐れがあるため、疎水性架
橋重合体粒子の素材として、非加水分解性のスチレン、
ジビニルベンゼンなどを選択することが好ましい。

【００１５】次に、本発明の担体を調製するための代表
的な製造方法について説明する。但し、本発明の担体の
調製は、下記の方法に限定されない。

【００１６】本発明のアフィニティクロマトグラフィー
用担体を調製するには、最初に疎水性架橋重合体粒子が
調製される。まず上記の疎水性単量体（疎水性架橋性単
量体および必要に応じて疎水性非架橋性単量体）と、重
合開始剤とを希釈剤に溶解させる。この場合に用いられ
る重合開始剤および得られた疎水性架橋重合体粒子に含
浸させる重合開始剤（後述）は、ラジカルを発生する触
媒であり、疎水性であること以外は限定されない。例え
ば、ベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイ
ドなどの有機過酸化物；アゾビスイソブチロニトリル、
アゾビスイソブチロアミドのようなアゾ化合物；などの
既知のラジカル発生触媒のいずれもが使用され得る。上
記希釈剤は多孔形成剤として添加するものであり、上記
単量体を溶解させ、かつその重合体を溶解させない有機
溶媒のいずれもが使用可能である。例えば、トルエン、
キシレン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼンのよう
な芳香族炭化水素類；ヘキサン、ヘプタン、オクタン、
デカンのような飽和炭化水素類；イソアミルアルコー
ル、ヘキシルアルコール、オクチルアルコールのような
アルコール類；が挙げられる。その使用量は限定されな
いが、上記の単量体混合物１００重量部に対して１５〜
２００重量部の割合であることが好ましい。

【００１７】上記単量体混合物（単量体、重合開始剤お
よび希釈剤）を、ポリビニルアルコール、リン酸カルシ
ウムなどの懸濁安定剤を溶解した水相に添加し、窒素置
換後、攪拌しながら４０〜１００℃に加熱することによ
り懸濁重合を行う。希釈剤を添加して重合を行った場合
は、得られた重合体粒子中には希釈剤である有機溶媒が
分散して存在するので、重合終了後に有機溶媒を除去す
ることにより多孔性の球状粒子が得られる。希釈剤とし
て上記疎水性単量体混合物と相溶性の異なる種々の有機
溶媒を使用することにより、多孔性重合体の細孔の大き
さを任意に変化させることが可能である。次に、得られ
た疎水性架橋重合体粒子に重合開始剤を含浸させる。重
合開始剤を含浸させるには、この重合開始剤を、低沸点
でかつ疎水性架橋重合体と親和性の良い溶媒に溶解さ
せ、これに上記の疎水性架橋重合体粒子を浸漬する。こ
のことにより重合開始剤が粒子中に浸透する。これを必
要に応じて重合開始剤の分解点以下の温度で加熱して溶
媒を除去することによりその内部に重合開始剤を含有す
る疎水性架橋重合体粒子を得る。この重合開始剤含有粒
子を、上記親水性単量体を溶解させた水性分散媒中に分
散させ、あるいは、この粒子を分散させた水性分散媒中
に上記親水性単量体を添加し、溶解させて、窒素置換
後、攪拌しながら加熱して重合を行う。この重合によ
り、親水性単量体が疎水性架橋重合体粒子の表面で重合
して、粒子表面を被覆する。上記の水性分散媒には疎水
性架橋重合体の分散性を安定させるため、カルボキシメ
チルセルロース、ポリビニルアルコールなどの分散安定
剤を添加することもできる。重合の温度および時間は、
反応させる親水性単量体の種類と重合開始剤の種類によ
っても異なるが、４０〜１００℃で０．５〜４０時間程
度である。以上の方法により上記の二層構造の重合体粒
子が調製される。

【００１８】上記の重合開始剤を含浸させた架橋重合体
粒子を親水性単量体の重合反応に供する方法の他、疎水
性架橋重合体粒子の調製に引き続いて親水性単量体を反
応させる連続法によっても上記二層構造の重合体粒子が
調製され得る。この方法においては、まず上記疎水性架
橋重合体粒子を調製するための重合反応を開始させる。
重合がある程度進行し、かつ未反応の重合開始剤が残存
している時に上記親水性単量体を反応系に加える。この
ような状態においては、系内の有機相および生成した疎
水性架橋重合体粒子内部に重合開始剤が存在するため、
引き続いて親水性単量体の重合が起こり、しかもこの疎
水性架橋重合体粒子の表面部分を被覆する形で親水性重
合体の層が形成される。従ってこの連続法によっても、
上記と同様の重合体粒子が得られる。

【００１９】上記各々の反応においては、被覆層の平均
厚みが１０〜３００オングストロームとなるように、単
量体の量、反応条件などが調整されることが好ましい。
被覆層が３００オングストロームを越えると、被覆層部
の膨潤および収縮効果が無視できないほど大きくなり、
そのため分離能が低下したり、カラムの圧力が上昇する
ことがある。さらに、この被覆層は疎水性架橋重合体の
表面を完全に被覆するようにコントロールする必要があ
る。疎水性架橋重合体が露出している部分があると、そ
の部分がアフィニティクロマトグラフィーにおける被分
離物質（例えば、タンパク質）と接触すると、非特異的
な吸着がおこる可能性がある。

【００２０】上記の各々の方法で得られた重合体粒子を
熱水および有機溶媒で十分に洗浄し、粒子に含有されて
いるか、あるいは付着している懸濁安定剤、溶媒および
残存単量体などを除去する。さらに、必要に応じて粒子
を分級してアフィニティクロマトグラフィー用の担体を
得る。

【００２１】このようにして得られた担体粒子の粒径、
被覆層の厚み、均一性などについての観察および測定は
次のようにして行われる。試料とする担体粒子からミク
ロトームによって厚さ１０００オングストローム以下の
切片を作成する。この切片を、試料中の官能基に特異的
なラベル化剤または染色試薬を用いて処理し、透過型電
子顕微鏡で観察する。

【００２２】本発明の担体をアフィニティクロマトグラ
フィーに用いる際には、担体表面の固定化用官能基に、
リガンドを、直接あるいはスペーサーを介して固定化す
る。リガンドとしては、担体表面の官能基と化学反応に
より共有結合で結合され得る官能基を有する従来のスペ
ーサーがいずれも用いられ得る。例えば、糖、脂質、ア
ミノ酸、ペプチド、ポリヌクレオチド、並びに各種の抗
原および抗体が挙げられる。

【００２３】これらのリガンドの担体への固定化法とし
ては、公知の方法が用いられる。例えば、表面に−OH基
を有する担体にタンパク質を固定化する場合にはCNBr法
がよく用いられる。この方法によれば、まず、担体をア
ルカリ性下でCNBrにより処理して担体に存在する官能基
を活性化させ（イミドカルボネート；C=NHが生成す
る）、得られた活性化担体に弱アルカリ性下でリガンド
を作用させる。リガンドがタンパク質である場合には、
活性化部位とタンパク質のアミノ基が反応して、その結
果、このタンパク質がC-N結合（一部 C=N 結合）により
固定される。他の方法には、-COOH基と-NH₂基の縮合試
薬（カルボジイミド）を用いる方法、さらに担体および
リガンドと反応可能な官能基を有するスペーサーを導入
する方法などがある。スペーサーの例としては、分子両
末端にアミノ基を有するエチレンジアミン、ヘキシルジ
アミンのようなアルキルジアミン類；分子の一方の末端
にアミノ基、他方の末端にカルボキシル基を有するε-
アミノカプロン酸のようなアミノ脂肪酸類；が挙げられ
る。

【００２４】このようにリガンドが同定された担体は、
該リガンドに特異的に結合する物質の分離・精製のため
のクロマトグラフィー用担体として使用される。

【００２５】

【作用】本発明のアフィニティクロマトグラフィー用担
体は、上記のように、疎水性架橋重合体微粒子を核粒子
とし、親水性重合体でこの粒子の表面が被覆された二層
構造の重合体粒子である。核となる部分に架橋度の高い
重合体が用いられるため、機械的強度が極めて大きい耐
圧性に優れたアフィニティクロマトグラフィー用の担体
を得ることができる。この担体の核部分には親水性基が
存在しないので膨潤および収縮の度合が極めて小さい。
表面は親水性の重合体で被覆されているのでタンパク質
などの非特異的吸着がない。適当な親水性単量体を選択
することにより、粒子表面に所望の官能基を付与するこ
とができるので、固定化するリガンドの種類に応じた所
望の担体が得られる。この担体は広いｐＨ範囲において
使用することが可能である。さらに、上記のように耐圧
性が大きく、膨潤および収縮の度合が極めて低いため、
粒径を小さくすることが可能であり、その結果、高精度
での分離が可能であり、迅速分析がなされ得る。これに
対して、一般に耐圧性が小さく、膨潤および収縮の度合
が大きい担体では、粒径を小さくすると粒子が破壊され
たり液が流れなくなる。

【００２６】

【実施例】以下に本発明を実施例につき説明する。

【００２７】以下の実施例および比較例において得られ
た担体の物性測定および性能評価の方法は次の通りであ
る。

【００２８】（被覆層の厚さの測定方法）試料とする担
体粒子をエポキシ樹脂に包埋後、Reichert-Jung社製ミ
クロトーム ULTRACUTE を用いて９００オングストロー
ムの切片を作成する。得られた切片のうち、-COOH基を
有する担体の切片は硝酸銀溶液（容量分析用、和光純薬
工業（株）製）を用いてラベル化する。-NH₂ 基および-
OH基を有する担体切片はオスミウム酸溶液（電子顕微鏡
用、和光純薬工業（株）製）を用いて染色し、日本電子
（株）製透過型電子顕微鏡 JEM100Sにて観察および写
真撮影して、親水性基の分布状態および被覆層の厚さを
測定する。

【００２９】（アフィニティクロマトグラフィーによる
評価方法）試料とする担体粒子を、内径６ｍｍおよび長
さ７５ｍｍのステンレス製カラムに充填し、耐圧性およ
びに水に対する膨潤性を調べる。耐圧性は、種々の流速
でカラムに精製水を通し、流速と圧力損失との関係を調
べることにより測定する。膨潤性は、イオン強度の異な
る液を流したときのカラム圧の変化を調べることにより
測定する。アフィニティクロマトグラフィーは、積水化
学工業（株）製液体クロマトグラフシステムSSLC-20を
用いて行なう。

【００３０】（実施例１）トリエチレングリコールジメ
タクリレート（疎水性架橋性単量体）２５０ｇと、テト
ラメチロールメタンテトラアクリレート（疎水性架橋性
単量体）５０ｇと、ベンゾイルパーオキシド（重合開始
剤）１ｇとをトルエン（希釈剤）２００ｇに溶解させ
た。これを４％ポリビニルアルコール水溶液２．５Ｌに
添加して、攪拌しながら調粒した後、窒素置換下で８０
℃に加熱して懸濁重合を行った。８０℃で８時間重合し
た後、生成物を熱水およびアセトンで順次洗浄し、乾燥
して微小の疎水性架橋重合体粒子を得た。この疎水性架
橋重合体粒子２００ｇをベンゾイルパーオキシド（重合
開始剤）０．５ｇが溶解しているアセトン１Ｌに浸漬し
て、この重合開始剤を含浸させた。次に、アセトンを２
０℃において減圧下で留去した。１％ポリビニルアルコ
ール水溶液２．５Ｌに上記の含浸処理した疎水性架橋重
合体を分散させ、攪拌しながらメタクリル酸（親水性単
量体）５０ｇを添加し、窒素置換後８０℃で５時間重合
反応を行った。生成物を熱水およびアセトンで順次洗浄
し、乾燥した。得られた微小のポリマー粒子を日鉄鉱業
（株）製空気分級機ELBOW-JET LABO EJ-L-3 型により分
級して、粒径が８〜１２μｍの粒子を集めた。このよう
にして粒子表面に-COOH基を有するアフィニティクロマ
トグラフィー用担体を得た。

【００３１】前述の方法により、上記担体の耐圧性およ
び膨潤性の評価を行った。耐圧性の評価においては、１
２０ｋｇ／ｃｍ² まで圧力損失と流速とが比例した。膨
潤性の評価においては、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝
液から２００ｍＭのリン酸緩衝液に変えたところ、カラ
ム圧力の上昇は認められなかった。被覆層の厚さを前述
の方法に従って測定したところ約５０オングストローム
であった。

【００３２】得られた担体に、リガンドとして3-アミノ
フェニルボロン酸（以下ＡＰＢという）を固定化した。
固定化法は水溶性カルボジイミド［１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩；和光純薬製］を用いたカルボジイミド法により、次
のように行った（「タンパク質化学１」赤堀四郎、金子
武夫、成田耕造共編、共立出版、1979、pp524〜52
8）。担体約５ｇを６ｍＭ水溶性カルボジイミド溶液４
０ｍＬ中に分散し、４℃で３０分間攪拌した。その後、
６ｍＭＡＰＢ溶液を加えて４℃で５時間反応させた。
得られたリガンド固定化担体（以下、充填剤という）を
内径６ｍｍおよび長さ７５ｍｍのステンレス製カラムに
充填した。充填は精製水３０ｍＬに充填剤２ｇを取り１
０分間攪拌した後、２．０ｍＬ／分で定流量充填するこ
とにより行った。

【００３３】得られたカラムを用いて糖化ヘモグロビン
の分離を次のように行った。健常人血２ｍＬをヘパリン
入り真空採血管（積水化学工業株式会社製）で採血し
た。この血液を４℃で遠心分離することによって血球血
漿分離後、赤血球を生理食塩水１０ｍＬで３回洗浄し
た。次に洗浄赤血球に、１．５容の蒸留水および０．５
容のトルエンを加え、強く振盪して溶血した。これを４
℃、３０００ｒｐｍで、１５分間遠心分離し、溶血層の
上澄を４℃でホスフェート-シアニド緩衝液（NaH₂PO₄・H
₂O ４．５９ｇ／Ｌ、Na₂HPO₄ １．１９ｇ／Ｌ、KCN
０．６５ｇ／Ｌ）にて２４時間透析（日本医理化プラス
チック製透析チューブ使用）した。この透析した溶血液
１μＬを試料として液体クロマトグラフに注入した。吸
着液としてはｐＨ８．０の５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１０
ｍＭＭｇＣｌ緩衝液を用い、脱着液としては５０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭＥＤＴＡ２Ｎａ、１００ｍ
Ｍソルビトール溶液を用いた。吸着液で糖化物を吸着さ
せ、かつ非糖化分のヘモグロビンを溶離した後、脱着液
で吸着している糖化分を溶出させた。検出は４１５ｎｍ
の可視光の吸光度測定にて行った。本実施例で得られた
カラムを用いて分析を行った結果を図１に示す。図１、
および後述の図２、図３において、ピーク１は非糖化ヘ
モグロビン、ピーク２は糖化ヘモグロビンを示す。

【００３４】（実施例２）スチレン（疎水性非架橋性単
量体）１５０ｇと、ジビニルベンゼン（疎水性架橋性単
量体；ｐー体とｍー体の混合品４５％およびエチルビニル
ベンゼンを５５％でなる製品）１５０ｇとベンゾイルパ
ーオキシド（重合開始剤）１ｇとをトルエン（希釈剤）
２００ｇに溶解させた。これを４％ポリビニルアルコー
ル水溶液２．５Ｌに添加して、攪拌しながら調粒した
後、窒素置換下で８０℃に加熱して懸濁重合を行った。
８０℃で８時間重合した後、生成物を熱水およびアセト
ンで順次洗浄し、乾燥して微小の疎水性架橋重合粒子を
得た。この疎水性架橋重合粒子２００ｇとアクリル酸
（親水性単量体）５０ｇとを用い、実施例１に準じて担
体を調製して、その評価を行った。

【００３５】耐圧性の評価においては、１００ｋｇ／ｃ
ｍ² まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤性の評価に
おいては、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２００
ｍＭのリン酸緩衝液に変えたとき、カラム圧力の上昇は
認められなかった。硝酸銀溶液で処理して被覆層厚を測
定したところ約１００オングストロームであった。実施
例１と同様に、ＡＰＢをカルボジイミド法により固定化
した。得られた充填剤を実施例１と同様に充填し、糖化
ヘモグロビンの分析を行った。得られたクロマトグラム
は図１と同様であった。

【００３６】（実施例３）この実施例では、疎水性架橋
重合体粒子の調製に続いて親水性単量体を反応させる連
続法を採用した。

【００３７】テトラエチレングリコールジメタクリレー
ト（疎水性架橋性単量体）１５０ｇおよびテトラメチロ
ールメタントリアクリレート（疎水性架橋性単量体１５
０ｇの混合液にベンゾイルパーオキサイド（重合開始
剤）１ｇを溶解し、４％ポリビルアルコール水溶液２．
５Ｌに添加して、攪拌しながら調粒後、窒素置換下で８
０℃に加熱して重合を行った。８０℃で２時間重合した
後、アクリル酸（親水性単量体）５０ｇを添加し、さら
に８０℃で２時間重合した。得られた生成物を熱水およ
びアセトンで順次洗浄し、乾燥して分級した。得られた
微小のポリマー粒子を実施例１と同様の方法で評価し
た。

【００３８】耐圧性の評価においては、３５０ｋｇ／ｃ
ｍ²以上まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤性の評
価においては、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２
００ｍＭのリン酸緩衝液に変えたところ、カラムの圧力
上昇は認められなかった。硝酸銀溶液で処理して被覆層
厚を測定したところ、約８０オングストロームであっ
た。実施例１と同様に、ＡＰＢをカルボジイミド法によ
り固定化した。得られた充填剤を実施例１と同様に充填
して糖化ヘモグロビンの分析を行った。得られたクロマ
トグラムは図１と同様であった。

【００３９】（比較例１）スチレン（疎水性非架橋性単
量体）１００ｇと、ジビニルベンゼン（疎水性架橋性単
量体）２００ｇと、アクリル酸（親水性単量体）１００
ｇと、ベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤）１ｇと
をトルエン（希釈剤）２７０ｇに溶解して、４％ポリビ
ニルアルコール水溶液２．５Ｌに添加して攪拌しながら
調粒した後、窒素置換下８０℃で８時間重合反応を行っ
た。重合終了後、生成物を実施例１と同様の操作によ
り、分級し、充填して評価を行った。

【００４０】耐圧性の評価においては、５０ｋｇ／ｃｍ
² まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤性の評価にお
いては、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２００ｍ
Ｍのリン酸緩衝液に変えたところ、カラム圧力が２０ｋ
ｇ／ｃｍ² 上昇した。硝酸銀溶液で処理して被覆層厚の
測定を試みたところ、カルボキシル基は担体粒子の内部
にも一様に分布していた。実施例１と同様に、ＡＰＢを
カルボジイミド法により固定化した。得られた充填剤を
実施例１と同様に充填し、糖化ヘモグロビンの分析を行
った。得られたクロマトグラムを図２に示す。図１との
比較から、明らかに分離が悪く、測定時間も長くかかる
ことがわかった。

【００４１】（比較例２）トリエチレングリコールジメ
タクリレート（疎水性架橋性単量体）２５０ｇと、テト
ラエチレングリコールトリアクリレート（疎水性架橋性
単量体）５０ｇとを用いて、実施例１に準じて疎水性架
橋重合体を調製した。さらに、アクリル酸（親水性単量
体）３００ｇを用いて、実施例１と同様に重合を試みた
ところ、反応中に凝集が起こり軟質の微小のポリマー粒
子が得られた。

【００４２】このポリマー粒子を実施例１と同様に分級
して充填を試みたところ、粒子が軟質のため充填液が流
れず充填できなかった。硝酸銀溶液で処理して担体粒子
の被覆層厚を測定すると、約４００オングストロームで
あった。

【００４３】（比較例３）トリエチレングリコールジメ
タクリレート（疎水性架橋性単量体）２５０ｇと、テト
ラエチレングリコールトリアクリレート（疎水性架橋性
単量体）５０ｇとを用いて、実施例１に準じて疎水性架
橋重合体を調製した。さらに、アクリル酸（親水性単量
体）１０ｇを用いて、実施例１と同様にして担体を得
て、その評価を行った。耐圧性の評価においては、１５
０ｋｇ／ｃｍ² まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤
性の評価においては、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液
から２００ｍＭのリン酸緩衝液に変えたところ、カラム
圧の上昇は認められなかった。硝酸銀溶液で処理して被
覆層厚を測定すると、約８オングストロームであり、表
面の一部に被覆されていない箇所が観察された。

【００４４】実施例１と同様に、ＡＰＢをカルボジイミ
ド法により固定化した。得られた充填剤を実施例１と同
様に充填して、糖化ヘモグロビンの分析を行った。得ら
れたクロマトグラムを図３に示す。図１との比較から、
溶出したヘモグロビン量は少なく、回収率が低下してい
ることがわかった。これは、試料中のタンパク質などが
担体粒子の非被覆部分に疎水結合によって非特異的に吸
着したためと思われる。

【００４５】（実施例４）トリエチレングリコールジメ
タクリレート（疎水性架橋性単量体）２５０ｇと、テト
ラエチレングリコールトリアクリレート（疎水性架橋性
単量体）５０ｇとを用いて、実施例１に準じて疎水性架
橋重合体を調製した。さらに、オクタエチレンゴリコー
ルモノメタクリレート（親水性単量体）５０ｇを用い
て、実施例１と同様にして、表面のみに-ＯＨ基を有す
る担体を得て、その評価を行った。

【００４６】耐圧性の評価については、１５０ｋｇ／ｃ
ｍ² まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤性の評価に
ついては、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２００
ｍＭのリン酸緩衝液に変えたところ、カラムの圧力の上
昇は認められなかった。オスミウム酸で染色して被覆層
厚を測定したところ、約８０オングストロームであっ
た。

【００４７】得られた担体粒子に、CNBr法によってＡＰ
Ｂを固定化した。まず担体を２Ｍ Na₂CO₃ 溶液に分散さ
せ、これにCNBrのアセトニトリル溶液を添加し、２分間
室温で攪拌した。その後、緩衝液で速やかに洗浄した。
次に、固定化するＡＰＢを添加して、４℃で１５時間攪
拌しながら反応させた。最後に残存官能基をエタノール
アミンでブロックし、ＡＰＢ固定化充填剤を実施例１と
同様に充填し、糖化ヘモグロビンの分析を行った。得ら
れたクロマトグラムは図１と同様であった。

【００４８】（実施例５）本実施例では、実施例１で得
られた担体にスペーサーを導入した例を示す。まず実施
例１で得られた担体を上記カルボジイミド法により活性
化し、この活性化担体にヘキサメチレンジアミン溶液
（ｐＨ１０）を添加して４℃で１２時間攪拌して、Ｃ₆
炭素鎖の末端に-NH₂ 基を有する担体を得た。次に、こ
の担体を緩衝液で十分に洗浄し、CNBr法によりＡＰＢを
固定化した。実施例１に準じて糖化ヘモグロビンの測定
を行ったところ、図１と同様のクロマトグラムが得られ
た。

【００４９】（実施例６）実施例５で得られた担体に、
エチレンジアミン二酢酸を上記と同様の条件でカルボジ
イミド法により固定化した。得られた充填剤を用いてリ
ボヌクレオチド類の分離を行った。その結果を図４に示
す。ピーク３はシチジン、ピーク４はグアノシン、ピー
ク５はアデノシン（和光純薬工業（株）製）を示す。溶
離はｐＨ５．６の酢酸エチルモルホリンを用いて行っ
た。

【００５０】

【発明の効果】本発明によれば、このように、耐圧性に
優れ、膨潤および収縮の度合が少なく、さらにタンパク
質の非特異的吸着の起こらない担体が得られる。このよ
うな担体は、アフィニティクロマトグラフィー用担体と
して各種生体関連物質の分離および精製に広く利用され
得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られた担体を用いて充填剤を調製
し、この充填剤を用いて糖化ヘモグロビンの分離を行っ
たときに得られたクロマトグラムである。

【図２】比較例１で得られた担体を用いて充填剤を調製
し、この充填剤を用いて糖化ヘモグロビンの分離を行っ
たときに得られたクロマトグラムである。

【図３】比較例３で得られた担体を用いて充填剤を調製
し、この充填剤を用いて糖化ヘモグロビンの分離を行っ
たときに得られたクロマトグラムである。

【図４】実施例６で得られた担体を用いて充填剤を調製
し、この充填剤を用いてリボヌクレオチドの分離を行っ
たときに得られたクロマトグラムである。

Claims

【特許請求の範囲】【請求項１】疎水性架橋重合体粒子の表面部分に、親水
性重合体の層が形成された被覆重合体でなり、該親水性
重合体の層の厚さが１０から３００オングストロームで
あり、そして、該親水性重合体が、アフィニティクロマ
トグラフィーにおけるリガンドまたはスペーサーを固定
化し得る官能基を有する重合体である、アフィニティク
ロマトグラフィー用担体。