JP2017503486A - エンベロープウイルス又はウイルスベクターを精製するためのプロセス - Google Patents

Abstract

本発明は、エンベロープウイルスを精製するための方法に関する。本発明の方法は、ＧＭＰを遵守しかつ臨床等級のウイルスを得ることを可能とする条件下でのエンベロープウイルスの大規模な回収に有用である。

Description

本発明は、エンベロープウイルスを精製するためのプロセスに関する。本発明のプロセスは、ＧＭＰに従いかつ臨床等級のウイルスを得ることを可能とする条件下でのエンベロープウイルスの大規模な回収に有用である。

ヒト免疫不全ウイルス（特にＨＩＶ−１）由来のレンチウイルスベクターは、遺伝子療法に最も使用されるベクターの一部である。これらのベクターは、一般的に、他のウイルス：テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ：（ＧａＬＶ−ＴＲ糖タンパク質））、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−ｇ）、麻疹ウイルス（すなわちＭＶ）に由来する糖タンパク質を用いてシュードタイプ化されている。ＶＳＶ−Ｇタンパク質を用いてシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターの臨床バッチを精製するためのプロセスが記載されている（非特許文献１）。しかしながら、他のエンベロープタンパク質、より詳細にはＧａＬＶ又はＭＶ由来の糖タンパク質、を用いてシュードタイプ化されたウイルスベクターは広くは使用されていない。なぜなら、満足できる精製プロトコールが現時点で全く得られていないからである。このタイプのシュードタイプ化ベクターの精製を主に制限している障壁は、特定の膜糖タンパク質の不安定性及び脆弱性に関連している。しかしながら、これらのベクターは、ＶＳＶ−Ｇタンパク質を用いてシュードタイプ化されたベクターよりも指向性が狭い点で特に興味深い。例えば、ＧＡＬＶに由来する糖タンパク質を用いてシュードタイプ化されたベクターは、より限定された指向性を有し、より詳細には造血幹細胞を標的とする。それ故、ＧＡＬＶ糖タンパク質を用いてシュードタイプ化されたベクターを精製するための効率的なプロセスを利用可能とすることは、遺伝子療法の分野において大きな課題である。

Schweizer and Merten, 2010

それ故、本発明者らは、臨床使用のためのウイルス調製物の産生を目指した、エンベロープウイルス、特にエンベロープ糖タンパク質ＧａＬＶを用いて又は他のエンベロープタンパク質によってシュードタイプ化されたウイルスを精製するためのプロセスの開発を提案した。

〔発明の概要〕
本発明は、前記精製の収率に対する、エンベロープウイルスの精製中に使用される溶液のｐＨの影響、及び特定の添加剤のプラスの影響の、本発明者らによってなされた予期せぬ観察からもたらされる。

本発明は特に、酸性緩衝液が陰イオン交換クロマトグラフィー中に使用される場合の、エンベロープウイルスの精製の顕著な改善の観察からもたらされる。それ故、本発明の目的は、陰イオン交換クロマトグラフィーを含むエンベロープウイルスを精製するためのプロセスであり、該クロマトグラフィー中に使用される緩衝液のｐＨは６未満である。

特に、ｐＨは、５．５と６との間に特に含まれ得る。一代替によると、陰イオン交換クロマトグラフィー中に使用される緩衝液のｐＨは６以上であり、更にポリオールを含む。

本発明者らは、エンベロープウイルスを精製するためのプロセスの１つ又はいくつかの工程中に使用される１つ又はいくつかの緩衝液中にポリオールを添加することによって、精製収率の実質的な増加を得ることが可能であったことを示すことができた。特に、限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程、次いで陰イオン交換クロマトグラフィーを含む精製の収率の改善は、このクロマトグラフィー中に使用される緩衝液がポリオールを含む場合に観察される。

本発明者らはまた、精製中に使用される陰イオン交換クロマトグラフィー工程及び限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程、特にタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）の順序の逆転を提案する。陰イオン交換クロマトグラフィーの前に限外ろ過／ダイアフィルトレーション、特にＴＦＦを適用することにより、エンベロープベクターの精製収率の実質的な改善が可能となる。それ故、本発明は、限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程、特にＴＦＦ工程、次いで陰イオン交換クロマトグラフィー工程をこの順序で含む、エンベロープウイルスを精製するためのプロセスに関する。

更に、本発明は、エンベロープウイルスを精製するためのプロセスに関し、該プロセスは、限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程、特にＴＦＦ工程を含み、該工程は、ポリオールを含有する緩衝液を使用することによって行なわれる。

本発明はより詳細には、ＧａＬＶに由来する糖タンパク質を用いてシュードタイプ化されたウイルスの精製に適合される。本発明が利用できるようになるまでは、このタイプの糖タンパク質を用いてシュードタイプ化されたウイルスは、「精製不可能」と考えられていた。これらのウイルスベクターに対して行なわれた様々な研究は、ＧａＬＶシュードタイプ化ベクターの脆弱性のために、未精製ベクターの生調製物を適用した。予期せぬことに、本発明者らは、本発明のプロセスを用いて精製収率の実質的な改善を示すことができた。本発明者らはまた、このプロセスが、他のエンベロープ糖タンパク質を用いて、特にＶＳＶ−Ｇ及びＭＶ糖タンパク質を用いてシュードタイプ化されたウイルスの精製収率の改善も可能とすることを示すこともできた。

ＬＶ−ＧａＬＶ−ＴＲレンチウイルス粒子を精製するための２つのプロセス：プロセス（Ａ）は、タンジェンシャルフローろ過工程後に１回の排除クロマトグラフィー工程（ゲルろ過）を適用する単純化されたプロセスであり；プロセス（Ｂ）は、例えば臨床使用のためのベクターを産生する目的で、プロセス（Ａ）の使用中よりも高い純度を得ることを目的としたより精巧なプロセスである。 混入タンパク質の除去における、５００ｋＤａ及び７５０ｋＤａのカットオフ値を有する膜の比較（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（上）及びウェスタンブロット抗ｐ２４（下））。ウェスタンブロット上の全ての試料について、２４／２５ｋＤａバンド（＝ｐ２４）がよく見られる：１）サイズマーカー；２）７５０ｋＤａでのダイアフィルトレーション（ａ）（試験１）；３）７５０ｋＤａでのダイアフィルトレーション（ｂ）（試験２）；４）６８，３３８ｇで３時間の超遠心分離（培養培地Ｘ−ｖｉｖｏ ２０への再懸濁）；５）５００ｋＤａでのダイアフィルトレーション（ａ）（試験１）；６）５００ｋＤａでのダイアフィルトレーション（ｂ）（試験２）；７）ＬＶ−ＧａＬＶ−ＴＲベクターを含有する培養上清。 室温で保存された、ＧＦＰをコードするＬＶ−ＧａＬＶ−ＴＲベクターの安定性に対するＮａＣｌの影響。ベクターを室温（ＲＴ）でｐＨ７．０（ＰＢＳ）で４時間インキュベートした。陰イオン交換クロマトグラフィー工程を最適化するために、本発明者らは生理食塩水ＮａＣｌ培地中でベクターの安定性を試験した。このために、ベクターを、ＵＦ／ＤＦ工程後に、様々なＮａＣｌ濃度を有するｐＨ７．０のＰＢＳ緩衝液中で、室温で４時間インキュベートした。次に、ベクターをＨＣＴ１１６細胞上で滴定した。４８時間後、細胞をＦＡＣＳ（フローサイトメトリー）に通過させ、ＧＦＰの発現率を測定した。 陰イオン交換クロマトグラフィー工程後の感染性レンチウイルスベクターの精製収率に対する、溶出緩衝液のｐＨ及び塩分の影響。ベクターの調製物を、（低級）陰イオン交換クロマトグラフィーの様々な基材の評価に使用するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって産生し、清澄化し、そしてＴＦＦによる濃縮／ダイアフィルトレーションにかけた。様々な基材を評価した：トヨパール６５０Ｃ ＤＥＡＥ、ＣＩＭ Ｄ（ＤＥＡＥ）及びＰｏｒｏｓＤ。１００％の収率は、先に行なわれたＴＦＦ工程後の感染力価に等しい。 排除クロマトグラフィー（Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ７００）によるＧａＬＶ−ＴＲレンチウイルスベクター調製物の精製。レンチウイルス調製物３mLを濃縮／ダイアフィルトレーションにかけ、次いで、Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ７００（４．５mL）カラムを通した。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）、５％スクロース、２mM ＭｇＣｌ_２を、カラム及び製剤の平衡化のためにこの工程中に使用した。画分１mLを収集し、ベクター濃度（ＴＵ）について分析した：ａ）画分ごとの力価（ＴＵ）、画分４〜９についてのベクターの累積量、及び画分４〜９についての累積回収率（％）を示す、クロマトグラム； ｂ）全ての画分のウェスタンブロット；ｃ）全ての画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。 ＭＯＩ ２０由来のＨＩＶ−ＧａＬＶ−ＴＲベクターを用いてのＣＤ３４＋ＳＣ細胞（臍帯血）の形質導入。未精製：粗生成物ＨＩＶ−ＧａＬＶ−ＴＲを用いて形質導入されたＣＤ３４＋細胞のフローサイトメトリーによって決定されたＧＦＰを発現している細胞の比率；ＤＦ／ＵＦ：粗生成物のＴＦＦによる精製及び濃縮後に得られたＨＩＶ−ＧａＬＶ−ＴＲベクターの調製物を用いて形質導入されたＣＤ３４＋細胞のフローサイトメトリーによって決定されたＧＦＰを発現している細胞の比率。

〔発明の詳細な説明〕
エンベロープウイルス及びベクターの産生
エンベロープウイルス又はベクターの産生は当技術分野の技術水準において周知である。当業者は、特にAnsorge et al. 2010; Schweizer and Merten 2010; Rodrigues et al. 2011によって示されたこの分野における一般的な知識を参照し得る。

産生されたウイルスは、特に、エンベロープウイルスベクターである。ウイルスベクターは、特に、レトロウイルス、特にレンチウイルスに由来する。産生されたレトロウイルスベクターは特に、アルファレトロウイルス（例えばトリ白血病ウイルスに対するＡＬＶ）、ベータレトロウイルス（例えばマウス乳癌ウイルスに対するＭＭＴＶ）、ガンマレトロウイルス（例えばマウス白血病ウイルスに対する様々なタイプのＭＬＶ）、デルタレトロウイルス（例えばヒトＴリンパ球向性ウイルスに対する様々なタイプのＨＴＬＶ）、イプシロンレトロウイルス（例えばウォールアイ皮膚肉腫ウイルスに対するＷＤＳＶ）、スプーマウイルス（例えばヒト泡沫状ウイルスに対するＨＦＶ、及びサル泡沫状ウイルスに対するＳＦＶ）、霊長類レンチウイルス、例えば様々なタイプのヒト免疫不全ウイルス（ヒト免疫不全ウイルスに対するＨＩＶ）、様々なタイプのサル免疫不全ウイルス（サル免疫不全ウイルスに対するＳＩＶ）、又は非霊長類の哺乳動物レンチウイルス、例えばウマ伝染性貧血ウイルス（ウマ伝染性貧血ウイルスに対するＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ネコ免疫不全ウイルスに対するＦＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ヤギ関節炎脳炎ウイルスに対するＣＡＥＶ）、又はヒツジ・ビスナ・マエディウイルス（ビスナマエディウイルスに対するＶＭＶ）に由来する。

特定の実施態様によると、エンベロープウイルス、特にレトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターはシュードタイプ化されている、すなわち、それは、レトロウイルス粒子が由来するウイルスとは異なるウイルスに由来するエンベロープ糖タンパク質、改変されたエンベロープ糖タンパク質、又はキメラエンベロープ糖タンパク質を含む。特定の実施態様によると、レトロウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）、麻疹ウイルス（麻疹ウイルスに対するＭＶ）、又は改変されたＭＶウイルス（特に抗ＣＭＨＩＩ抗体を用いて改変された）、ヒヒ内在性ウイルス（ＢａＥＶ）、又はテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）に由来するエンベロープ糖タンパク質を用いてシュードタイプ化されているが、当業者は、他のウイルスエンベロープ糖タンパク質の使用も考え得る（Frecha et al. 2008）。特定の実施態様によると、エンベロープウイルス、特にレトロウイルスベクター、より詳細にはレンチウイルスベクターは、改変されたエンベロープ糖タンパク質、例えばＧＡＬＶＴＲ（ＧＡＬＶエンベロープ糖タンパク質、ここではビリオン内のＣ末端が、両種指向性ヒト白血病ウイルスＡ−ＭＬＶのエンベロープ糖タンパク質のＣ末端で置換され、これにより、レンチウイルス粒子へのエンベロープ糖タンパク質の非常に効率的な取り込みが可能となる）を用いてシュードタイプ化されている（Christodoulopoulos and Cannon 2001）。特定の実施態様によると、エンベロープウイルス、特にレトロウイルスベクター、より詳細にはレンチウイルスベクターは、標的細胞の表面の所定の受容体の特異的標的化を可能とするための、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする融合タンパク質（一本鎖可変フラグメントではｓｃＦｖ）又はアンキリンリピートドメインを含むタンパク質（設計アンキリンリピートタンパク質に対するＤＡＲＰｉｎｓ）が挿入されている麻疹ウイルスのエンベロープ糖タンパク質などのキメラエンベロープ糖タンパク質を用いてシュードタイプ化される（Anliker et al. 2010; Muench et al. 2011）。特定の実施態様によると、レンチウイルスベクターは、ＧＡＬＶウイルス、水疱性口内炎ウイルス（例えばＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質）、又は麻疹ウイルスに由来するエンベロープを用いてシュードタイプ化されているが、当業者は他のエンベロープタンパク質の使用も考え得る。

エンベロープウイルスは更に、そのゲノムに導入された目的の導入遺伝子を含有し得る。勿論、目的の導入遺伝子は、エンベロープウイルスベクターが意図される具体的な用途に依存する。例えば、治療用ＲＮＡをコードする目的の導入遺伝子（例えば、標的ＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列のアンチセンス相補的ＲＮＡをコードする目的の導入遺伝子）、病態を患う被験体において欠損若しくは欠失しているタンパク質をコードする遺伝子療法の導入遺伝子、又はＤＮＡを用いてのワクチン法のために使用される導入遺伝子、すなわち、その発現が該タンパク質に対するレシピエント生体のワクチン法を誘導するタンパク質をコードする導入遺伝子に言及する。特定の実施態様によると、遺伝子療法に使用され得るエンベロープウイルスベクターが産生され、次いで精製される。使用される産生プロセスは有利には、ＧＬＰに適合し、エンベロープウイルスベクター、特にレトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクター、特にシュードタイプ化レンチウイルスベクター（特に、レトロウイルスについてはＧＡＬＶエンベロープタンパク質、又はレンチウイルス、ＶＳＶ−Ｇ、若しくはＭＶについてはＧＡＬＶＴＲを用いてシュードタイプ化された）の大規模な産生を企画する可能性を与える。

レンチウイルスベクターの産生のための好ましい実施態様によると、４つの以下の配列を宿主細胞に導入する：レンチウイルス遺伝子ｇａｇｐｏｌを含む発現カセット、レンチウイルス遺伝子ｒｅｖを含む発現カセット、レンチウイルスＬＴＲ−５’とレンチウイルスＬＴＲ−３’との間に含まれる目的の導入遺伝子の発現カセット、及びエンベロープ糖タンパク質（単数又は複数）の発現カセット。

特定の実施態様では、エンベロープウイルス、特にレトロウイルスベクター、より詳細にはレンチウイルスベクターは、エンベロープウイルスの産生のために必要とされる１つ又はいくつかの配列を発現している安定な株（Miller 2001; Rodrigues et al. 2011）、例えばエンベロープ糖タンパク質ＶＳＶ−Ｇを用いてシュードタイプ化されたＨＩＶ−１に由来するレンチウイルスベクターを構成的に産生するヒト産生株ＧＰＲＧ−ＥＦ１α−ｈγ_ｃＯＰＴ（Greene et al. 2012）、又は例えばエンベロープ糖タンパク質ＧａＬＶを用いてシュードタイプ化されたＭＬＶガンマレトロウイルスベクターを構成的に発現するマウス産生株ＰＧ１３−ＭＦＧ−ＧＦＰ（Miller et al. 1991）から産生される。特定の実施態様では、エンベロープウイルスは、ウイルスの産生に必要とされる配列をコードする１つ又はいくつかのプラスミドを用いて一過性にトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞から産生される。レンチウイルスベクターの産生を可能とする一代替によると、該配列を、４つのプラスミドを用いて細胞に導入する：レンチウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子を含む発現カセットを有する１つのプラスミド、レンチウイルスｒｅｖ遺伝子を含む発現カセットを有する１つのプラスミド、レンチウイルスＬＴＲ−５’とＬＴＲ−３’との間に含まれる目的の導入遺伝子の発現カセットを含む１つの導入プラスミド、及びエンベロープ糖タンパク質（単数又は複数）の発現カセットを有する１つのプラスミド。

宿主細胞は、エンベロープウイルスの産生を可能とする任意の細胞から選択され得る。特定の実施態様によると、該細胞は、ヒト細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、Ｔｅ６７１、ＨＴ１０８０、ＣＥＭ）、ネズミ科細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）、イタチ科細胞（Ｍｐｆ）、イヌ科細胞（Ｄ１７）から選択される（Miller and Chen 1996; Miller 2001; Merten 2004; Rodrigues et al. 2011; Stacey and Merten 2011）。

細胞を、哺乳動物細胞の培養に適しかつエンベロープウイルスの産生に適した培地中で培養する。培地に更に、適切な濃度で添加された、当技術分野において周知である添加剤、例えば抗生物質、血清（特にウシ胎児血清など）を補充し得る。使用される培地は、特に、血清を含んでいても、無血清でもよい。哺乳動物細胞のための培養培地は当技術分野において周知である。そのようなものとして、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＲＰＭＩ１６４０又は様々な培養培地の混合物、例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２、又は無血清培地、例えばｏｐｔｉＭＥＭ（登録商標）、ｏｐｔｉＰＲＯ（登録商標）、ｏｐｔｉ−ＳＦＭ（登録商標）、ＣＤ２９３（登録商標）、FreestyleF17（登録商標）（Life Technologies）、又はＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）２９３（Sigma-Aldrich）を言及することができる。

一過性にトランスフェクトされた細胞を使用したプロセスにおいて、プラスミドのトランスフェクションを可能とする任意の薬剤を使用し得る。特に、リン酸カルシウム又はポリエチレンイミンが使用され得るが、他の薬剤も当業者によって考えられ得る（Ansorge et al. 2010）。条件（特にプラスミド（単数又は複数）の量、プラスミド間の比、プラスミド（単数又は複数）とトランスフェクション剤の比、培地の種類など）及びトランスフェクション時間は、産生されるウイルスの特徴及び／又は導入用プラスミドに導入された導入遺伝子に応じて当業者によって適応され得る。

次いで、エンベロープウイルスを、当技術分野において周知である方法に従って培養上清から収集する。

特定の実施態様によると、使用される培養培地は、細胞を培養してウイルスを産生するために当技術分野の技術水準において慣用的に使用される中性ｐＨ（例えば、７と７．４との間に含まれ、特に７、７．１、７．２、７．３又は７．４）を有する。特定の実施態様によると、使用される産生プロセスは、やや酸性の培地中における産生細胞の培養を含む。当技術分野の技術水準は、細胞の最適な培養並びにエンベロープウイルス及びベクターの最適な産生のための必要条件として培養培地の中性を示しているが、やや酸性の条件が、逆に、エンベロープウイルス、特にレンチウイルス、特にシュードタイプ化レンチウイルス（例えば、タンパク質ＧａＬＶ（又はＧａＬＶＴＲ）、ＶＳＶ−Ｇ、又は麻疹ウイルスエンベロープタンパク質を用いてシュードタイプ化）の産生を有意に向上させる可能性を与えたことが発見された。

一代替によると、エンベロープベクターの産生は、やや酸性の条件下で達成される。「やや酸性の条件」という表現は、５と６．８との間、特に５．５と６．５との間、より詳細には５．８と６．２との間に含まれる水性溶液のｐＨを示す。特定の実施態様によると、培養培地のｐＨは約６である。選択されたｐＨはまた、使用される培養培地の緩衝力にも依存し、当業者は一般的な知識を考慮して容易に決定することができる。当業者は、溶液のｐＨを、特に細胞培養培地のｐＨを変更することができる。当業者は特に、該溶液に、酸性、特に強酸、例えば塩酸の溶液を導入し得る。必要であれば、塩基、特に強塩基、例えば水酸化ナトリウムの溶液を、所望の値を達成するためにｐＨを上昇させることによってｐＨを再調整するために使用することができる。

特定の実施態様によると、エンベロープウイルスの産生は、以下の工程を含む：
−該エンベロープベクターの産生のために、又は構成的に若しくは誘導後にベクターを産生する安定な産生細胞の使用のために必要とされる、配列をコードする、１つ又はいくつかのプラスミドを用いてのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクション；
−ｐＨが約６又は約７である適切な培地中での該細胞の培養；
−培養上清中へのエンベロープウイルスの収集。

この実施態様の一代替によると、産生されたエンベロープウイルスは、４つのプラスミドを用いて細胞をトランスフェクションした後に産生されたレンチウイルスである：レンチウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子を含む発現カセットを有する１つのプラスミド、レンチウイルスｒｅｖ遺伝子を含む発現カセットを有する１つのプラスミド、レンチウイルスＬＴＲ−５’とＬＴＲ−３’との間に含まれる目的の導入遺伝子の発現カセットを含む１つの導入用プラスミド、及びエンベロープ糖タンパク質（単数又は複数）の発現カセットを有する１つのプラスミド。一代替によると、エンベロープタンパク質は、ＧａＬＶウイルスに由来するか（特にレンチウイルスベクターのために改変された糖タンパク質ＧａＬＶＴＲ）、ＶＳＶウイルスに由来するか（特にＶＳＶ−Ｇエンベロープ）、又は麻疹ウイルスに由来する（ＭＶ）。

エンベロープウイルス及びベクターの精製
本出願の実施例から分かるように、産生されたエンベロープウイルスの精製収率は、該精製中に使用される緩衝液のｐＨ条件を適応させることによって顕著に改善され得る。

特に、エンベロープウイルスは、非常に有利には、陰イオン交換クロマトグラフィー中の酸性緩衝液の使用を含む、新規プロセスに従って精製され得る。したがって、本発明は特に、エンベロープウイルスを精製するためのプロセスに関し、該プロセスは、陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含み、この陰イオン交換クロマトグラフィー工程中に使用される緩衝液（単数又は複数）のｐＨは６．９以下である。エンベロープウイルスは特に、該エンベロープウイルスを産生している細胞の細胞培養物の培養培地から精製され得る。特定の実施態様では、陰イオン交換クロマトグラフィー工程中に使用される緩衝液（単数又は複数）のｐＨは、４．５と６．２との間（特に、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１又は６．２に等しい）、より詳細には５と６との間（特に５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９又は６．０に等しい）に含まれる。特定の実施態様によると、ｐＨは５と６との間、又は５と５．９との間に含まれ、ｐＨはより詳細には５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８又は５．９に等しい。特に、ｐＨは５．５と６との間（例えば５．５、５．６、５．７、５．８、５．９又は６．０に等しい）に含まれ、ｐＨはより詳細には約５．５（例えば５．４、５．５又は５．６）又は６（例えば５．９、６、又は６．１）、更により詳細には５．５である。陰イオン交換クロマトグラフィーの前に又は後に、好ましくは前に、限外ろ過工程、特に限外ろ過／ダイアフィルトレーション、特にタンジェンシャルフローろ過を行ない得る。一実施態様によると、陰イオン交換クロマトグラフィーが、限外ろ過よりも先である。代替的な実施態様によると、限外ろ過は陰イオン交換クロマトグラフィーよりも先であり、後者の実施態様が好ましい。

本発明者らはまた、緩衝液のｐＨが６以上、特にｐＨが６と８との間（特に、ｐＨが６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９又は８．０に等しい）に含まれる場合に、陰イオン交換クロマトグラフィー中に使用される該緩衝液中へのポリオール、特にスクロースの使用の利点を示した。それ故、本発明はまた、限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程、次いで陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含む、エンベロープウイルスを精製するためのプロセスに関し、該クロマトグラフィーは、ポリオールを含有している、ｐＨが６以上、特にｐＨが６と８との間、より詳細には７と８との間に含まれる（特にｐＨが７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９又は８．０に等しい）緩衝液を使用することによって行なわれる。

限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程、より詳細にはＴＦＦ中に使用される緩衝液（単数又は複数）はまた、酸性、中性、又は塩基性の緩衝液であり得る。

当業者は、エンベロープウイルスの精製工程中に使用される溶液のｐＨ、特に緩衝液のｐＨを変更することができる。当業者は特に、ｐＨを下げるために又はｐＨを調整するために、該溶液中に、酸、特に強酸、例えば塩酸の溶液を導入し得る。必要であれば、塩基、特に強塩基、例えば水酸化ナトリウムの溶液を、塩基性ｐＨを得るために、又は所望の酸性値を得るためにｐＨを上げることによってｐＨを再調整するために使用し得る。勿論、当業者は、所望のｐＨで適切な緩衝力を有する溶液を得るための適切な製剤の使用を確保する。

限外ろ過／ダイアフィルトレーション装置上に若しくはその中に、又は陰イオン交換クロマトグラフィーカラム上にローディングされた溶液は、ベンゾナーゼを用いて、及び／又は低速遠心分離及び／又は清澄化で前処理されていてもよい、細胞培養上清に対応し得る。前処理されていてもよい培養上清は、「精製緩衝液」には対応しないことが理解される。しかしながら、そのｐＨはまた、必要であればそれをローディングする前に調整され得る。産生が、中性又は酸性のｐＨで行なわれた場合、前処理されていてもよい培養上清は直接ローディングされ得るか、又は、そのｐＨをそれをローディングする前に下げるか若しくは上げてもよい。それをローディングする前に前処理されていてもよい培養上清への添加剤の添加を企画することも可能である。例えば、この工程後直ちに、ポリオール、抗酸化剤（特にＬ−ヒスチジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、グルタチオン、又はビタミンＣ）、金属塩、特にマグネシウム塩、例えばＭｇＣｌ_２若しくはＭｇＳＯ_４、又は任意の他の適切な添加剤を加えることが可能である。

特定の実施態様によると、前処理されていてもよい培養上清を、ｐＨを調整することなく、添加剤を添加することなく、限外ろ過／ダイアフィルトレーション装置上に若しくはその中に、又はクロマトグラフィーカラム上に直接ローディングする。酸性、塩基性、又は中性のｐＨ緩衝液が、限外ろ過／ダイアフィルトレーション装置の平衡化のために、及び／又は限外ろ過／ダイアフィルトレーション若しくは陰イオン交換クロマトグラフィーそれ自体を行なうために事前に使用されてもよく、好ましくは使用される。

一代替によると、限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程は、ＴＦＦ工程である。この代替では、ダイアフィルトレーションは緩衝液を用いて達成され、その緩衝液のｐＨは上記に考察された条件に従って調整されている。したがって、使用される緩衝液は、酸性緩衝液、特にｐＨが６未満の緩衝液、又は４．５と６．２との間（特に、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１又は６．２に等しい）、特に５と６との間（特に５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９又は６．０に等しい）に含まれるｐＨを有する緩衝液、特にｐＨ５．５〜６を有する緩衝液（特に５．５、５．６、５．７、５．８、５．９又は６．０に等しい）、より詳細にはｐＨ５．５の緩衝液であり得る。一代替では、使用される緩衝液は、ポリオールを含む、６以上、特に６と８との間（特に、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７.０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９又は８．０に等しいｐＨ）、より詳細には７と８との間（特に７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９又は８．０に等しいｐＨ）に含まれるｐＨを有する緩衝液である。

限外ろ過工程中及びダイアフィルトレーション工程中に使用される緩衝液は、異なっていても同一でもよい。特定の実施態様では、限外ろ過工程は、ｐＨが約７の緩衝液（特に、６．８と７．２との間のｐＨ（例えば６．８、６．９、７．０、７．１又は７．２に等しい）、より詳細にはｐＨ７を有する緩衝液）を用いて成し遂げられ、ダイアフィルトレーションは、４．５と６．２との間のｐＨ（特に４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１又は６．２に等しい）、特に５と６との間に含まれるｐＨ（特に５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９又は６．０に等しい）、より詳細には５．５と６との間に含まれるｐＨ（特に５．５、５．６、５．７、５．８、５．９又は６．０に等しい）を有する緩衝液、特に５．５に等しいｐＨを有する緩衝液を用いて成し遂げられる。

一実施態様では、精製プロセスは、陰イオン交換クロマトグラフィー工程、次いで限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程を含む。別の実施態様では、精製プロセスは、限外ろ過工程、次いで陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含む。

特定の実施態様では、精製プロセスは：
（ａ）細胞培養培地の清澄化；
（ｂ）限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程；
（ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー；
（ｄ）排除クロマトグラフィー
を含み、工程（ｂ）及び（ｃ）は逆でもよい。好ましい実施態様では、工程（ｃ）は工程（ｂ）の後である。

本出願の図１は、本発明に記載の精製プロセスの好ましい実施態様の工程を要約する。

特定の実施態様によると、１回目の清澄化工程は、捕捉閾値が０．２と０．８μmとの間に含まれるフィルター、特に０．４５μmのフィルター上での培養上清のろ過によって、及び、ろ液へのエンベロープウイルスの回収によって行なわれる。一実施態様によると、清澄化は、様々な捕捉閾値を有するフィルターがつながっているもの、例えば０．８、０．４５、及び０．２μm、又はさもなければ０．６５及び０．２μmのフィルターが連続しているものを用いて成し遂げられる。この清澄化工程の前に、培養上清の低速遠心分離工程を行なってもよい。この工程における遠心分離速度は、特に、５００×ｇと１，０００×ｇとの間に含まれ得る。

特定の実施態様によると、限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程は、特に、タンジェンシャルフローろ過によって成し遂げられる。この実施態様によると、タンジェンシャルフローろ過は、孔の排除サイズが３００と８００ｋＤａとの間、特に５００と７５０ｋＤａとの間の、中空糸膜、又は平面膜、又はスパイラル型膜カセットを用いて行なわれ得る。別の実施態様によると、孔の排除サイズは、少なくとも３００、４００、５００、６００、又は７００ｋＤａであるか、又は８００ｋＤａである。好ましい実施態様によると、タンジェンシャルフローろ過のために使用される膜は、７５０ｋＤａの孔の排除サイズによって特徴付けられる。特定の実施態様によると、限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程の終了時に、エンベロープウイルス、特に清澄化工程のろ液中に存在するエンベロープウイルスは、可能な最小限の容量まで、例えば少なくとも５倍、少なくとも１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、又は６０倍濃縮される。例えば、エンベロープウイルスは、限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程の終了時に３６．６倍又は５０倍濃縮される。別の実施態様によると、限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程は、混入物の積載量を７０％超、８０％超、８５％超、９０％超、又は９５％超で減少させることを可能とする。特定の実施態様によると、限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程は、以下のように行なわれる：１回目の濃縮、例えば、２５倍の濃縮（特に、５００mLの容量から２０mLの容量となることによって）を行ない、続いて、ポリオール及び／又は１つ若しくはいくつかの抗酸化剤を含有している又は含有していない少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は更には少なくとも１０倍容量の酸性緩衝液、例えば１０倍容量の緩衝液を用いてのダイアフィルトレーションを行ない、次いでこの工程の後に、２回目の濃縮工程が、特に可能な最小限の容量となるまで、例えば５０倍の濃縮を達成するために行なわれる。

陰イオン交換クロマトグラフィー基材は、当技術分野において周知である。本発明はより詳細には、カラム上又は膜上に、より詳細にはカラム上に陰イオン交換クロマトグラフィーを適用する。好ましい実施態様は、低級陰イオン交換クロマトグラフィー（特にＤＥＡＥ（Ｄ）−ジエチルアミノエチル、ＰＩ−ポリエチレンイミン）の適用を含む。したがって、ＤＥＡＥカラムから選択された基材の使用を言及することができる。一例として、モノリスＣＩＭ Ｄ（BIAseparation）、ＰｏｒｏｓＤ５０（Life Technologies）、サルトバインド（Sartorius）、トヨパール６５０Ｃ ＤＥＡＥ（Tosoh）の基材などを言及することができる。好ましい実施態様では、陰イオン交換クロマトグラフィーの基材は、圧縮性の基材よりも良好な収率が得られる可能性を与える、圧縮不可能な基材、例えばモノリスＣＩＭ Ｄ及びＰｏｒｏｓＤ５０基材である。陰イオン交換クロマトグラフィー中に使用される緩衝液のｐＨが６未満である場合、該緩衝液はポリオールを含有しているか又は含有していない。特に、この工程中におけるｐＨ５．５の緩衝液の使用によって、ポリオールの添加を必要とすることなく、約１００％の収率のＧＡＬＶＴＲシュードタイプ化レンチウイルスベクターを得ることができたことが観察された。この優れた収率レベルは今日まで得られておらず、以前に考察された理由のために特に有利であるこのタイプのベクターの大規模使用を企画する可能性を与える。ポリオールの添加は、この収率に対してプラス又はマイナスな影響を全く示さなかったが、しかしその添加は、溶出されたベクターの安定化のために企画され得る。使用される緩衝液のｐＨが６以上、特に６と８との間に含まれる場合には、ポリオールの添加は精製収率を有意に向上させる。したがって、本発明によると、陰イオン交換クロマトグラフィー緩衝液のｐＨが約６と約８との間に含まれる場合、前記のｐＨのものはポリオールを含有している。

一実施態様では、限界ろ過工程から、より詳細には限界ろ過／ダイアフィルトレーションから精製及びろ過された溶液を、まずポリオールを含有していてもよいｐＨ６未満の平衡緩衝液を用いて平衡化させておいたクロマトグラフィー基材に堆積させる。平衡緩衝液及びローディング緩衝液は特に、０と２５０mMとの間に含まれるＮａＣｌ濃度を含有し得る。これらの緩衝液は、特に、ｐＨ５〜６（例えば、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９又は６．０、特にｐＨ５．５）、５％スクロース、２mM ＭｇＣｌ_２を有するビス−トリス２０mM緩衝液、又は、ポリオールを含有する、６以上、特に６と８との間に含まれるｐＨ（６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９又は８．０に等しいｐＨ）を有する平衡緩衝液、例えばｐＨ７、５％スクロースを有するＰＢＳ緩衝液、又はｐＨ８、５％スクロース、２mM ＭｇＣｌ_２を有するビス−トリス−プロパンに対応する、化合物であり得る。緩衝液を適切な速度（例えば１カラム容量／分、又は４cm／分）で導入する。次いで、カラムを平衡緩衝液を用いて洗浄し、最後に溶出する。特定の実施態様によると、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムの溶出は、ポリオールを含むか又は含まない緩衝液を用いて、特に０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０mMビス−トリス（ｐＨ５〜６、特に５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９又は６．０に等しい、特にｐＨ５．５）、５％スクロース、２mM ＭｇＣｌ_２を有する緩衝液を用いて２工程で行なわれ、ベクターの溶出は、ポリオールを含むより大きなイオン力を有する緩衝液を用いて、特に６５０mM ＮａＣｌ、２０mMビス−トリス（ｐＨ６）、５％スクロース、２mM ＭｇＣｌ_２を有する緩衝液を用いて行なわれる。それ故、本発明によるプロセスは有利には、従来使用される塩濃度と比較して、カラムからベクターを溶出するのに必要とされる塩の量の低減を可能とする。特定の実施態様によると、溶出は、４５０mMと１，０００mMとの間に含まれるＮａＣｌ濃度を含む緩衝液を用いて行なわれる。この実施態様の一代替によると、溶出緩衝液は、４５０と８００mMとの間のＮａＣｌ、２％と８％との間の、より詳細には５％のポリオール（特にスクロース）を含有し、該緩衝液は５．５と６との間のｐＨを有する（特に２mM ＭｇＣｌ_２を含有していてもよいビス−トリス緩衝液）。

別の実施態様によると、陰イオン交換クロマトグラフィー基材の溶出は、２段階で行なわれ、第一工程は、産物の混入物を除去するために、適用された事前溶出に相当する。１回目の溶出の緩衝液は、例えば、０と４５０mMとの間に含まれる濃度のＮａＣｌを含む（特に、緩衝液が、６以下、特に５と６との間に含まれるｐＨ、より詳細には５．５又は６．０に等しいｐＨを有する場合には、０と３５０mMとの間；又は、緩衝液が７以上のｐＨを有する場合には、０と４５０mMとの間）。次いで、２回目の溶出は、クロマトグラフィー基材からウイルス（例えばウイルスベクター）を回収するために適用される。２回目の溶出緩衝液のｐＨが５と６との間に含まれ、より詳細にはｐＨ５．５を有する場合、例えば、塩濃度は４５０と８００mMとの間に含まれ得る。２回目の溶出緩衝液のｐＨが７以上である場合、塩濃度は６００と１，０００mMとの間に含まれ得る。

陰イオン交換クロマトグラフィー基材のための１回の溶出工程を含む、特定の実施態様によると、以下の工程が適用される：
ｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー基材上に、限外ろ過工程の終了時に得られた溶液をローディング、該溶液は特に以下である：
−５．５と６との間に含まれるｐＨであり、かつ０と２００mMとの間のＮａＣｌ濃度を含むか；
−又は、ｐＨ７であり、ＮａＣｌ濃度が０と３５０mMとの間に含まれるか；のいずれか
ｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー基材からウイルス、特にウイルスベクターを緩衝液を用いて溶出：
−又は、５．５と６との間のｐＨであり、かつ４５０と８００mMとの間に含まれるＮａＣｌ濃度を含むか；
−又は、ｐＨ７であり、ＮａＣｌ濃度が６００と１，０００mMとの間に含まれる。

陰イオン交換クロマトグラフィー基材のための２つの溶出工程を含む、別の特定の実施態様によると、以下の工程が適用される：
ｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー基材上に、限外ろ過工程の終了時に得られた溶液をローディング、該溶液は加えられたＮａＣｌを全く含まない、
ｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー基材の１回目の溶出（混入物を除去するために）、１回目の溶出緩衝液は、
−５．５と６との間に含まれるｐＨであり、０と３５０mMとの間のＮａＣｌ濃度を含むか；
−又は、ｐＨ７であり、ＮａＣｌ濃度が０と４５０mMとの間に含まれるか；のいずれか
ｉｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー基材の２回目の溶出（ウイルス、特にウイルスベクターを回収するために）、２回目の溶出緩衝液は：
−５．５と６との間に含まれるｐＨであり、かつ４５０と８００mMとの間のＮａＣｌ濃度を含むか；
−又は、ｐＨ７であり、ＮａＣｌ濃度が６００と１，０００mMとの間に含まれるか；のいずれか。

画分の評価のために及び画分の選択のために続いて精製プロセスにかけられ、カラムには、出口に、ＵＶ２８０nm吸光度リーダー、伝導率計、プロッタ、及びフラクションコレクターの装備されたクロマトグラフが装備されていてもよい。

排除クロマトグラフィー工程は優先的には、陰イオン交換クロマトグラフィー工程の直後に行なわれる。使用された排除樹脂は、３００と１，０００ｋＤａとの間、特に５００と８００ｋＤａとの間に含まれる排除サイズを有する。特定の実施態様によると、使用された排除クロマトグラフィーカラムは、５００、７００、又は８００ｋＤａの排除サイズによって規定される。更に、特定の実施態様では、この工程のために使用されるカラムは、マルチモード樹脂、特に、排除ゲル及び吸着ゲルの２つの機能（疎水性相互作用によって並びに基材の正電荷によって）を有する樹脂を含む。このようなものとして、カラムＣａｐｔｏ Ｃｏｒｅ７００（GE HealthCare）を言及することができる。一実施態様では、クロマトグラフィーゲルは圧縮不可能な基材である。陰イオン交換クロマトグラフィーからのエンベロープウイルス又はベクターの試料をカラムにローディングし、次いで、製剤化用緩衝液を適切な速度で、例えば０．５mL／分の速度で注入する。回収しようとする画分を、２８０nmのＵＶ吸光度リーダーを用いてカラムの出口で測定する。

１つの態様によると、本発明は、限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程、特にＴＦＦを含む、エンベロープウイルスを精製するためのプロセスに関し、該工程は、ポリオールを含有している緩衝液を用いて行なわれる。本発明者らは、限外ろ過／ダイアフィルトレーション緩衝液中にポリオールを加えることによって、精製収率（実施例中の、以下の表２）を有意に増加させることができることを示し、これはこれまで報告されたことがなかった。この工程中に使用され得るポリオール及びその濃度を以下に明記する。限外ろ過工程中及びダイアフィルトレーション工程中に使用される緩衝液は、異なっていても同じでもよい。特定の実施態様では、限外ろ過工程は、ｐＨ約７を有する緩衝液（特に６．８と７．２との間に含まれるｐＨ（例えば６．８、６．９、７．０、７．１又は７．２に等しい）、より詳細にはｐＨ７の緩衝液）を用いて行なわれ、ダイアフィルトレーションは、６未満のｐＨ、又は４．５と６．２との間（特に４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１又は６．２に等しい）に含まれるｐＨを揺する緩衝液、特に５と６との間に含まれるｐＨ、より詳細には５．５と６との間に含まれるｐＨを有する緩衝液（特に５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９又は６．０に等しい）、より詳細には５．５又は６に等しいｐＨを有する緩衝液、特に５．５に等しいｐＨを有する緩衝液を用いて行なわれる。タンジェンシャルフローろ過は、中空糸膜、又は平面膜、又はスパイラル型膜カセットを用いて行なわれ得、その孔排除サイズは３００と８００ｋＤａとの間、特に５００と７５０ｋＤａとの間に含まれる。別の実施態様によると、孔排除サイズは、少なくとも３００、４００、５００、６００、又は７００ｋＤａ、又は８００ｋＤａである。好ましい実施態様によると、タンジェンシャルフローろ過のために使用される膜は、７５０ｋＤａの孔排除サイズによって特徴付けられる。特定の実施態様によると、限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程の終了時に、エンベロープウイルス、特に清澄化工程のろ液に存在するエンベロープウイルスは、可能な最小限の容量まで、例えば少なくとも５倍、少なくとも１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、又は６０倍濃縮される。例えば、エンベロープウイルスは、限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程の終了時に３６．６倍又は５０倍濃縮される。別の実施態様によると、限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程は、混入物の積載量を７０％超、８０％超、８５％超、９０％超、又は９５％超だけ減少させる。特定の実施態様によると、限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程は、以下のように行なわれる：１回目の濃縮、例えば、２５倍の濃縮（特に、５００mLの容量から２０mLの容量とすることによって）を行ない、次いで、ポリオール及び／又は１つ若しくはいくつかの抗酸化剤を含有しているか又は含有していない、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は更には少なくとも１０倍の容量の酸性緩衝液を用いての、例えば１０倍容量の緩衝液を用いてのダイアフィルトレーションを行ない、次いでこの工程の後に２回目の濃縮工程を、特に可能な最小限の容量になるまで行ない、例えば５０倍の濃縮を成し遂げる。

限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程の後に又は前に、陰イオン交換クロマトグラフィー工程を行ない得るか、又は、上記に詳述された条件に従って排除クロマトグラフィー工程を行ない得る。

特定の実施態様によると、精製プロセスは、研究等級のエンベロープウイルスの産生のためである。この場合、陰イオン交換クロマトグラフィー工程は省略してもよい（よって、プロセスは、例えば、上記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）を含む）。別の実施態様によると、プロセスは、臨床等級のウイルスを精製するためである。後者の場合、陰イオン交換クロマトグラフィー工程が好ましくは含まれる。更に、排除クロマトグラフィー工程の後に、特にろ過膜を用いて、特に０．２２μm以下の捕捉閾値を有する膜を用いての、滅菌ろ過工程を行ない得る。

本発明の内容において、「ポリオール」という用語は、少なくとも３〜６個のヒドロキシル基、特に８個のヒドロキシル基で置換された、３〜１８個の炭素原子、特に３〜１２個の炭素原子を含む、鎖状、環状、又は二環式炭素質分子を定義する。ポリオールは、例えば、アルドース又はケトース単糖、特にテトロース、ペントース、又はヘキソースであり得る。特に、以下の単糖ポリオールを言及することができる：エリトロース、トレオース、リボース、アラビノ―ス、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、フルクトース、プシコース、ソルボース、タガトース。ポリオールは、本発明の実施に使用され得る、他のポリオールの非制限的なリストを形成する、以下の二糖又は三糖から選択され得る：セロビオース、ゲンチオビオース、イヌロビオース、イソマルトース、イソマルツロース、コージビオース、ラクトース、ラクツロース、ラミナリビオース、ロイクロース、マルトース、マルツロース、メリビオース、ニゲロース、ロビノース、ルチノース、スクロース、ソホロース、トレハロース、トレハルロース、ツラノース、エルロース、フコシルラクトース、ゲンチアノース、イヌロトリオース、１−ケストース、６−ケストース、マルトトリオース、マンノトリオース、メレジトース、ネオケストース、パノース、ラフィノース、ラムニノース（rhamninose）。特定の実施態様では、ポリオールは、ラフィノース、イソマルトトリオース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、グルコース、及びグリセロールから選択される。特定の実施態様では、ポリオールはスクロースである。

ポリオール濃度は非常に変化し得、特に、この工程中に適用される様々な緩衝液のそれぞれに対して異なり得る。ポリオール濃度は、特に、１％と１５％（ｗ／ｖ）との間、特に１．５％と１０％との間、特に２％と８％との間、より詳細には２％と５％との間に含まれ得る。特定の実施態様では、陰イオン交換クロマトグラフィーの１つ又はいくつかの緩衝液中のポリオール濃度は５％（ｗ／ｖ）である。特定の実施態様では、精製プロセス中に使用される全ての緩衝液は、ポリオール、特にスクロースを特に５％（ｗ／ｖ）で含む。したがって、この実施態様によると、該プロセスは、ＴＦＦ工程、陰イオン交換クロマトグラフィー工程、及び排除クロマトグラフィー工程を含み得、その工程中に使用される全ての緩衝液はポリオールを含む。別の実施態様では、ＴＦＦ工程及び陰イオンクロマトグラフィーの緩衝液はポリオールを含むが、排除クロマトグラフィーカラムの平衡化及び溶出のために使用される緩衝液は、全くポリオールを含まず、これらの緩衝液は、組成が治療の目的及び完成品の投与法に大きく依存するであろう製剤化用緩衝液に相当する。

別の実施態様では、本発明のプロセス中に使用される１つ又はいくつかの緩衝液、特に限外ろ過／ダイアフィルトレーション及び／又は陰イオン交換クロマトグラフィー中に使用される緩衝液は、マグネシウム塩、特に塩化マグネシウム又は硫酸マグネシウムを含む。各々の緩衝液中のマグネシウム塩の濃度、特に塩化マグネシウム又は硫酸マグネシウムの濃度は、各々の緩衝液とは独立して、０．１mMと５mMとの間、特に１と３mMとの間に含まれ得、特に２mMであり得る。

別の実施態様では、本発明のプロセス中に使用される１つ又はいくつかの緩衝液は、フリーラジカルを失活させるために、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｃｙｓ、グルタチオン、又はビタミンＣを含む。各々の緩衝液中のこれらの成分の濃度は、各々の緩衝液とは独立して、０．１mMと２０mMとの間に含まれ得る。

本発明に記載の精製プロセスはまた、試料（単数又は複数）をヌクレアーゼ、特にベンゾナーゼで処理する１つ又はいくつかの工程を含み得る。ヌクレアーゼは、各工程の前又は後に使用され得る。一実施態様では、ヌクレアーゼ、特にベンゾナーゼは、プラスミドトランスフェクション工程後に産生細胞の培養培地中に使用される。

一実施態様によると、１つ又はいくつかの精製工程は、室温未満の温度で、特に２と１２℃との間、より詳細には４℃と１０℃との間に含まれる温度で行なわれる。特定の実施態様によると、１つ、いくつか、又は全ての精製工程は約４℃で行なわれる。

一実施態様によると、本発明の方法に従って精製されたエンベロープウイルスは、エンベロープ組換えウイルスである。好ましくは、エンベロープウイルスは、シュードタイプ化組換えレトロウイルス、より詳細にはレンチウイルスであり、ここでのエンベロープタンパク質は、ＧａＬＶウイルスに由来するか（特に、レンチウイルスベクターのために改変されたＧａＬＶＴＲ糖タンパク質）、ＶＳＶウイルスに由来するか（特にＶＳＶ−Ｇエンベロープ）、又は麻疹ウイルスに由来する（ＭＶ）。特に好ましい一代替では、本発明の方法に従って精製されたエンベロープウイルスはシュードタイプ化組換えレトロウイルス、より詳細にはレンチウイルスであり、ここでのエンベロープタンパク質は、ＧａＬＶウイルスに由来する（特に、レンチウイルスベクターのために改変されたＧａＬＶＴＲ糖タンパク質）。

本出願に報告された研究は、第７次欧州共同体フレームワーク計画（ＦＰ７／２００７−２０１３）を介して２２２８７８番の下で助成金による恩典を受けた。

材料及び方法
細胞：
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株及びＨＣＴ１１６細胞株（結腸直腸癌細胞ＣＣＬ−２４７；入手源：ＡＴＣＣ）を、２〜１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Life Technologies）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Gibco）（ＤＭＥＭ＋グルタマックス）中で５％ＣＯ_２の存在下で３７℃で培養する。培養培地：塩酸（ＨＣｌ３７％、Sigma-Aldrich）の添加によってｐＨ６．０で緩衝化し、次いで、Corning（登録商標）１，０００mLのフィルター（０．２２μmＰＥＳ（ポリエーテルスルホン））を用いてろ過した、ＤＭＥＭ／ＦＣＳ。

ウイルスベクターの産生：
様々な糖タンパク質を用いてシュードタイプ化されたＨＩＶ−１由来のウイルスベクターは、Merten et al.（2011）によって記載されているような４つのプラスミドによる、２９３Ｔ細胞におけるリン酸カルシウムを用いての一過性の四重トランスフェクションによって産生される。２×１０^８個の２９３Ｔ細胞を、１，７６０cm^２のハイパーフラスコ（Corning）中のＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ ５５０mLに蒔いた（Kutner et al. 2009）。２４時間後、培養培地を、トランスフェクション培地の中でＤＮＡ／ＣａＣｌ_２／ＨＢＳ複合体を合わせることによって、該トランスフェクション培地と交換する。４つのプラスミド：ｇａｇｐｏｌ（ｐＫＬｇａｇｐｏｌ）１３６μg、ｒｅｖ（ｐＫｒｅｖ）５２．２５μg、トランスジェニックプラスミド（ｐＣＣＬ−ｅＧＦＰ）２０６．８μg、各シュードタイプに対して適切なエンベローププラスミド：ＬＶ−ＧａＬＶ−ＴＲを作製するためのＧａＬＶ−ＴＲ：ｐＢＡ．ＧＡＬＶ−ＴＲ／Ａｍｐｈｏ−Ｋａｎａ（テナガザル白血病ウイルス）２２３μg；ＬＶ−ＶＳＶ−ｇを作製するためのＶＳＶ−ＧｐＭＤＧ（水疱性口内炎ウイルス−ｇ）６８．１３μg；ＬＶ−ＭＶを作製するためのｐＦΔ３０及びｐＨＣＭＨ２（麻疹ウイルスの改変されたエンベロープタンパク質）４０μg及び１４μg；十分量のＨ_２Ｏ １８mL及びＴＥ０．１× ８．９mLを、ＣａＣｌ_２（２．５Ｍ）３mLと混合し、次いでＨＢＳ２Ｘ ３０mLを加え、複合体の形成を４分間待ち、混合物を培養培地に加える。１６時間後、上清を、２％ＦＣＳ １５Ｕベンゾナーゼ（Merck）及び２mM ＭｇＣｌ_２（Sigma-Aldrich）の新たな培地と交換する。トランスフェクションから４８時間後に収集を行ない、酢酸セルロース（ＣＡ）１Ｌ（Corning）中の上清を０．４５μmのフィルターでろ過する。

レトロウイルスベクターＭＬＶ−ＧａＬＶはＰＧ１３細胞によって産生される。これらは、ＭＬＶ−ＧａＬＶベクターを産生する細胞であり（Miller et al. 1991）、細胞を、２〜１０％ＦＣＳを補充したダルベッコ改変イーグル培地（Gibco）（ＤＭＥＭ＋グルタマックス）中で３７℃で５％ＣＯ_２で維持する。ベクターの収集は、培養培地を交換してから２４時間後に行なう。次に、酢酸セルロース（Corning）中の産物の上清を、０．４５μmのフィルターで清澄化する。

タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）によるウイルスベクターの濃縮
この工程は、産物の上清を濃縮し、次いでプロセスの継続のために培養培地を適切な緩衝液と交換することからなる。

限外ろ過（ＵＦ）は、ＵＦカセットの調製、及び０．５バールで２０℃での標準水透過性能ＮＷＰの決定後に行なわれる。次いで、膜を、他のｐＨでの濃縮／ダイアフィルトレーションを行なうために（例えば、ＰＢＳ、ｐＨ７．０、５％スクロース、２mM ＭｇＣｌ_２）、ｐＨ６．０、５％スクロース、２mM ＭｇＣｌ_２のビス−トリス緩衝液、又は、他の緩衝液を用いて平衡化する。全プロセスは約４℃で行なわれ、濃縮しようとする産物のタンクをアイスボックスに入れる。

原理：まず２０mLの容量まで濃縮し、次いでイオン交換クロマトグラフィーにローディングするために１０倍容量の緩衝液（この場合、１０×２０mL）を用いてのダイアフィルトレーションが行なわれる。これらの工程の後に、可能な最小限の容量（この場合では１０mL）まで２回目の濃縮を行なう。

Kros-Flow research II TFFシステム（Spectrum）を使用することによる、７５０ｋＤａ、４１０cm²の膜：「中空糸膜カートリッジ」（GE Healthcare、参照番号：UFP750-E3MA）。

膜の完全性を確認した後、ベクターの濃縮は初期容量５００mLの粗上清から始め、５００mLから２０mLまで膜によって濃縮する。

濃縮された産物を、緩衝液Ａ ２００mL（濃縮液２０mLを１０回ダイアフィルトレーションすることを目的として）に対してダイアフィルトレーションする。これは、２５倍の濃縮係数を示す。ダイアフィルトレート液の最終容量は１０mLである。この場合、濃縮係数は５０倍である。

陰イオン交換クロマトグラフィー：
第一の手順では、陰イオン交換クロマトグラフィー工程を、ＴＦＦの下流で行なう。いくつかのクロマトグラフィー基材を試験する：一体型カラムＣＩＭＤ ＤＥＡＥ、ＣＩＭＤ Ｑ（BIAseparation, Villach, Austria）、カラム容量：１mL；サルトバインドＤ ７５ＭＡ、容量：２．１mL（Sartorius Stedim Biotech）；Ｐｏｒｏｓ ＰＩ、カラム容量：４mL；Ｐｏｒｏｓ Ｄ ５０、カラム容量：４mL、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、カラム容量：４mL（LifeTechnologies）、トヨパール６５０Ｃ ＤＥＡＥ、カラム容量：２mL（Tosoh）。

試験しようとするカラムを、２８０ＵＶ吸光度リーダー、伝導率計、プロッタ（Chart recorder 1327, Bio-Rad）、及びフラクションコレクター（Model 2110, Bio-Rad）の装備されたBiologic-LPクロマトグラフ（Biorad）に接続する。

５カラム容量（５ＣＶ）の緩衝液Ａを２mL／分で用いてカラムを平衡化する。試料をカラムにローディングした後、カラムを、所望のｐＨに依存して、表Ａに従って、５ＣＶの適切な平衡緩衝液で洗浄する。次いで２工程の溶出を行なう：ベクターの溶出のための、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０mMビス−トリス、５％スクロース、２mM ＭｇＣｌ_２（ｐＨ６．０）及び次いで６５０mM ＮａＣｌ、２０mMビス−トリス、５％スクロース、２mM ＭｇＣｌ_２（ｐＨ６．０）。５％スクロース及びＭｇＣｌ_２（２mM）の存在下（５％）並びに非存在下で適切な緩衝液（例えばビス−プロパン、ＰＢＳ、Ｌ−Ｈｉｓなどの緩衝液を含む）を使用することによって、３つの他のｐＨも試験する（ｐＨ５．５、７．０、及び８．０）。

最後に、画分を、６５０mM ＮａＣｌでベクターと共に溶出する混入している塩及びタンパク質を除去するためにゲルろ過カラム（排除クロマトグラフィー）に直ちにローディングする。

第二の手順では、清澄化された産物の上清を、これらの条件下におけるクロマトグラフィーの収率を評価するために、事前の限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程を全く行なうことなく、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＰｏｒｏｓＤにローディングする。使用される平衡緩衝液のｐＨは５．５であり、５％スクロース及び２mM ＭｇＣｌ_２を含有する。

排除クロマトグラフィー：
これは、プロセスＡ及びＢのための滅菌ろ過前の最終工程である（図１）。この工程は、使用されるゲル（例えば、７５０ｋＤａ、又はさもなくば５００ｋＤａ）よりも小さなサイズを有する混入物を除去することからなる。Ｃａｐｔｏｃｏｒｅ７００カラムをこの工程のために使用した。これは以下の２つの機能を有するゲルである：排除クロマトグラフィー及び吸着ゲルクロマトグラフィー。

ローディングを開始する前に、カラムを１Ｍ ＮａＯＨを用いて衛生的にし、製剤化用緩衝液を用いて平衡化する。ＵＦ／ＤＦ産物（プロセスＡ）、又は陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＸＣ）のクロマトグラフィーピークに対応する画分（プロセスＢ）を、カラムにローディングする。８mL（ＵＦ／ＤＦ、又はＡＸＣ画分）を、０．５mL／分の流速でローディングする。次に、製剤化用緩衝液を、０．５mL／分（５ＣＶの製剤化用緩衝液）で注入する。画分はＵＶピークに対応し、収集し（約１６mL）、次いで０．２２μmのフィルター上でろ過する（滅菌ろ過）。試料を−８０℃で保存する。

ウイルスベクターの滴定：
レポーター遺伝子ｅＧＦＰを有するベクターの形質導入単位（ＴＵ）でのウイルス力価を、ＨＣＴ１１６細胞の形質導入によって分析する。形質導入から７２時間後に、細胞を、以前に記載されているように（Pfeifer et al. 2009）、力価（ＴＵ／mL）を決定するためにＦＡＣＳに通す。ウイルス粒子の物理的分析のために、キットＥＬＩＳＡｐ２４（PerkinElmer）を、業者の説明書に従ってレンチウイルスのキャプシドタンパク質ｐ２４を定量するのに使用した。

臍帯血液細胞ＣＤ３４＋の形質導入：
ＣＤ３４＋細胞を、免疫磁気選択法（Miltenyi Biotec）によって臍帯血から単離する。ＣＤ３４＋細胞の培養及び形質導入は、記載のように（Charrier et al. 2011）成し遂げられる：まず細胞を、培地Ｘ−Ｖｉｖｏ２０（Lonza）中で一晩かけて予め刺激し、サイトカインを補充する。予め活性化された細胞を４８ウェルプレートに蒔く（５×１０^４個の細胞／１００μl）。形質導入は、８μg/mLのベクトフシン（vectofusine）−１の存在下で精製されたベクター１００μl（１０^６のＴＵ）を添加することによって成し遂げられる。６時間のインキュベート後、分化培地１mL（１０％血清を、記載のように（Charrier et al. 2011）サイトカイン（ｈＳＣＦ、ｈ−Ｉｌ−３ ｈ−Ｆｌｔ３ ｈ−Ｉｌ−６）の存在下で補充されたＸ−ＶＩＶＯ−２０）を各ウェルに加え、５日後に、形質導入効率を、ＦＡＣＳによってＧＦＰの発現を測定することによって評価する（FC500, BD Biosciences）。

ＳＤＳ−Ｐａｇｅウェスタンブロット：
レンチウイルスベクターを含有している培養試料又は精製された試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによって分析して、ｐ２４キャプシドタンパク質の存在を検出する。ｐ２４タンパク質の顕現を、ＬＩ−ＣＯＲによって開発された方法に従って、Odyssey装置及びOdyssey2.1ソフトウェアパッケージを用いて行なう。使用される一次抗体は、ＨＩＶのｐ２４キャプシドタンパク質の検出のための抗ｐ２４抗体（Santa-Cruz 番号ＳＣ−５７８２３）である。抗体を、０．１％ＰＢＳ１×−Ｔｗｅｅｎ＋ブロッカーOdyssey（１：１）中１／２００の希釈度で使用する。Ｌｉ−ＣＯＲの蛍光色素「Ｄｅｙ８００」と結合させて使用される二次ヤギ抗体は、一次抗体に対して指向される。

残留タンパク質及び特定の残留ＤＮＡの定量：
全タンパク質を、標準物質として血清アルブミンを用いてブラッドフォード法（Bio-Rad）によって定量する。試験は、業者の説明書に従って実施される。

残留ＤＮＡ：プラスミドを起源とする及び／又は宿主細胞から生じる残留ＤＮＡの定量は、定量ＰＣＲによって成し遂げられる。試料をプロテイナーゼＫ（Roche）で処理し、次いでＤＮＡをシステム：ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＡＤＮ及びウイルスＮＡ小容量キット（MagNA Pure 96 Roche）を使用することによって抽出する。次いで、定量リアルタイムＰＣＲをカナマイシンの遺伝子のための特異的プライマーを用いて行ない、プラスミドを起源とする残留ＤＮＡを検出する。宿主細胞に由来する残留ＤＮＡを検出するために、Ｅ１Ａ遺伝子を標的化するプライマーを使用する。絶対的な定量は、定量ＰＣＲによって増幅された領域を含有し、かつコピー数が公知である、基準プラスミドと比較して行なわれる。

結果
本発明は、精製されたウイルス粒子の良好な収率及び良好な品質を確保しつつ、ＧａＬＶ−ＴＲ、ＶＳＶ−Ｇ、麻疹ウイルスなどの様々なエンベロープ糖タンパク質を有する、一過性トランスフェクションによって又は安定でシュードタイプ化された産生細胞を用いて産生された、ＨＩＶ−１に由来するか又は他のレトロウイルスに由来するレンチウイルスベクター、及びＰＧ１３などの安定な細胞から産生されたγ−レトロウイルスベクターＧａＬＶのための新規精製プロトコールの開発及び確立に関する。この開発は、本質的にであって排他的ではないが、以下の３つの精製技術に基づく：ＴＦＦ（タンジェンシャルフローろ過）、陰イオン交換クロマトグラフィー、及び排除クロマトグラフィー。様々な組合せを図１に示す。

細胞の培養及び清澄化：
これらの工程は、定期的に培地が交換され、レンチウイルスベクターの産生を誘導するために３個又は４個のプラスミド（レンチウイルスの「ヘルパー」機能及び組換えベクターの配列を与える）でトランスフェクトされなければならないＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３Ｔなどの細胞を用いての連続培養における、レトロウイルスベクターの安定かつ持続的な産生によって特徴付けられる、ＰＧ１３などの安定な細胞を使用することによる、レトロウイルス及びレンチウイルスベクターの産生からなる。一過性産生は時間が限られ、トランスフェクションから数日後における１回又は数回の収集が可能である。力価は一般的に、ベクターの構成（配列）に依存するがエンベロープタンパク質にも依存する。以下の力価は、これらの産生系を用いて得ることができる（表１）。

あらゆる更に他の処理の前に、産物の上清中に存在する細胞片及び凝集物を除去することが可能である。従来的には、０．４５μmのフィルター（酢酸セルロース）を使用する。この工程の収率は８０±５％である。しかしながら、当業者は、類似の挙動及び収率によって特徴付けられる、他の膜又は連続した膜を使用してもよい。

タンジェンシャルフローろ過：
タンジェンシャルフローろ過は、限外ろ過及びダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）の２つの連続した工程を含む。これらの両方の工程は、サイズが、使用される膜の孔の排除サイズよりも小さい大部分の混入物を除去する可能性を与える。このＵＦ／ＤＦ工程はまた、ウイルス粒子を濃縮し、精製しようとする産物の容量を減少させる可能性を与える。７５０ｋＤａの孔の排除サイズを有する１１０cm^２の膜（GE HealthCare）を使用した。ＵＦを開始するために、様々な濃度のスクロース（特に５％スクロース（重量／容量））、及び様々な濃度のＭｇＣｌ_２（特に２mM ＭｇＣｌ_２（最終濃度））を、清澄化した産物に加える。次に、ＵＦ濃縮工程を、流速８０mL／分、７プサイグで行なう。ＴＦＦタンクをアイスボックスに入れ、ＵＦ／ＤＦ中の低温を確保する。ダイアフィルトレーション工程は、ＵＦ中に５００mLから２０mLへと容量を減少させた後に開始する。ＤＦのために、２００mL（濃縮産物の１０倍容量）のダイアフィルトレーション緩衝液：ＰＢＳ、５％スクロース、２mM ＭｇＣｌ_２を使用する。この工程の終了時に、２０mLのＵＦ／ＤＦ産物を５０mLのCorningチューブに回収する。緩衝液の選択は、調製物の用途又は濃縮／ダイアフィルトレーション後の工程の最適条件に依存する（例えば、この場合、他の緩衝液、例えばビス−トリス（ｐＨ６．０）、５％スクロース、２mM ＭｇＣｌ_２を使用し得る）（表Ａ参照）。試料を、Fenard et al.（2013）によって記載されているようなＨＣＴ１１６細胞上で滴定する。

濃縮／ダイアフィルトレーション条件の最適化のための研究：
１．レンチウイルス粒子は、８０〜１２０nmの範囲の直径を有し、このことは濃縮／ダイアフィルトレーションのために使用され得る膜の孔サイズは、最大で約５０nm（又は７５０ｋＤａ）までの範囲であり得ることを意味する。本発明の範囲内において、５００ｋＤａ及び７５０ｋＤａのカットオフサイズを評価した。収率（ＴＵ）は以下であった：７５０ｋＤａの膜については６４％の収率（ＴＵ）に対して、５００ｋＤａの膜については３４％の収率（ＴＵ）。

図２は、５００ｋＤａ及び７５０ｋＤａのカットオフ値を有する膜を使用することによるタンジェンシャルろ過後のベクターの調製物についての電気泳動ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット）を示す。７５０ｋＤａの膜を使用した時に得られたより高い収率に加えて、７５０ｋＤａのカットオフ値（図２、第２列、第３列）は、混入しているタンパク質の除去に関して、５００ｋＤａの膜（図２、第５列、第６列）の使用と比較してプラスの効果を有することは明らかである。更に、７５０ｋＤａの膜を用いて作製された濃縮液は、粗上清で観察されたよりもはるかに弱いタンパク質バンドを含有している。

２．タンジェンシャルろ過工程は、レトロウイルス／レンチウイルス粒子の失活をもたらすずり磁場の発生によって特徴付けられるので、これらのベクターの機能を維持するためにこの工程を最適化することが必要であった。タンジェンシャルろ過の有害条件からレンチウイルスベクターを保護するために、様々な濃度のポリオールの添加が評価された。

これらの結果は明らかに、スクロース及びＭｇＣｌ_２の存在下でＬＶ−ＧａＬＶ−ＴＲベクターを含有している上清の濃縮／ダイアフィルトレーションを行なう利点を示す。最善の収率は、２％〜５％の濃度のスクロースで得られる（表２）。

更に、中程度のスクロース濃度の使用は、濃縮しようとする試料がより粘性が低いという利点を有する。なぜなら、高いスクロース濃度（１０％〜１５％）は粘度の増加をもたらすからである。

３．機能的ベクターのタンジェンシャルろ過及び収率に対する、ｐＨ及びその影響の評価
本出願人によって提出された出願ＦＲ１３５８９０９において、様々なエンベロープタンパク質を用いてシュードタイプ化されたエンベロープベクターの産生が、ｐＨ６．０の使用時に増加する（２倍まで）ことが示された。タンジェンシャルろ過の効率に対する、レンチウイルスベクターを含有している上清のｐＨの選択の影響を評価することを決断した。この脈絡において、２つの異なるｐＨを、ＧａＬＶ−ＴＦシュードタイプ化レンチウイルスベクターの濃縮／ダイアフィルトレーション中に評価した（ｐＨ６及びｐＨ７）（表３）。７．０から６．０へのｐＨの低減により、収率は約１０％低減した（７３．６％から６４％に）。しかしながら、この収率は依然として許容されるものであり、それ故、酸性ｐＨでの濃縮／ダイアフィルトレーションを想定することが可能である。

４．ＧａＬＶ−ＴＲレンチウイルスベクターの濃縮／ダイアフィルトレーションのための最善条件の同定
ＧａＬＶ−ＴＲレンチウイルスに関して、最善の濃縮／ダイアフィルトレーション（タンジェンシャルろ過）条件は以下であった：ＬＶ−ＧａＬＶ−ＴＲベクター（１Ｌ）を、５％スクロース及び２mM ＭｇＣｌ_２の存在下で０．４５μmの酢酸セルロース膜を通して清澄化し、続いてＴＦＦ工程（カートリッジ７５０ｋＤａ、４１０cm^２）を行ない、容量を低減させて２０mL（５０倍）に達する。次いでダイアフィルトレーション工程を、容量２００mLの適切な緩衝液（例えば、ビス−トリス２０mM ｐＨ６．０、５％スクロース、及び２mM ＭｇＣｌ_２、又はＰＢＳ ｐＨ７．０、５％スクロース及び２mM ＭｇＣｌ_２）に対して行なう。

ＬＶ−ＧａＬＶ−ＴＲベクターのためのこの工程の収率は、５５０mLの初期容量の粗生成物に対して８６％±５％である。濃縮生成物の容量は１５mLであり、濃縮係数は３６．６倍であり、混入物の除去は９０％超を達成した。

５．様々なエンベロープタンパク質を用いてシュードタイプ化された他のレトロウイルス及びレンチウイルスベクターの濃縮／ダイアフィルトレーションのために確立されたタンジェンシャルろ過条件の評価
科学文献において、レトロウイルス及びレンチウイルスベクターの指向性を研究及び改良するために、様々なエンベロープタンパク質が評価された。この脈絡において、ＧａＬＶ−ＴＲレンチウイルスベクターの濃縮／ダイアフィルトレーションのために確立された条件を、様々なエンベロープタンパク質を用いてシュードタイプ化されたレトロウイルス及びレンチウイルスベクターの濃縮／ダイアフィルトレーションについて評価した（表４）。ＧａＬＶ−ＴＲシュードタイプ化レンチウイルスベクターを用いて得られた結果が基準として示されている。

表４で提示された結果は、様々なエンベロープタンパク質を用いてシュードタイプ化されたレトロウイルス又はレンチウイルスベクターを、ｐＨ７．０でスクロース及びＭｇＣｌ_２の存在下において濃縮し得、これにより、ＬＶ−ＧａＬＶ−ＴＲについては約７４％から、ＶＳＶｇについては約１００％までの範囲の収率が得られることを示す。ｐＨ６．０の使用に関しては、ＶＳＶｇを用いてシュードタイプ化されたベクターについては全く差異が観察されなかった。

ＧａＬＶ−ＴＲシュードタイプ化レンチウイルスベクターに関して、これらのベクターは、タンジェンシャルろ過中にｐＨ７．０においてより安定であることが判明する。濃縮／ダイアフィルトレーション収率は９０％超であったが、ＧａＬＶ−ＴＲレンチウイルスベクターについての収率は約７４％であった。

陰イオン交換クロマトグラフィー：
タンジェンシャルフローろ過による濃縮／ダイアフィルトレーション工程は、タンパク質及びＤＮＡの積載量をかなり低減させ（上記参照）、このことはクロマトグラフィーのリガンドへの接近に関して精製しようとするベクターの競合物質であり得る混入物のかなりの割合が低減されることを意味する。原則的に、その後の用途に応じて、精製を検討する際に２つの異なる方法を想像することが可能である。それらは図１に示されている：１回の排除クロマトグラフィー工程を適用する単純化されたプロセス（図１のＡ）、及び臨床使用のためのレンチウイルスベクターを調製するための追加の陰イオン交換クロマトグラフィー工程を適用するより精巧なプロセス（図１のＢ）。

様々なクロマトグラフィーの可能性が続いて展開されている：
ＴＦＦ ＵＦ／ＤＦ工程後に、混入物を低減させ、ウイルス粒子を良好に分離するために、陰イオン交換クロマトグラフィー工程を追加する。この技術は、ｐＨ及び塩濃度に応じて、その等電点に従って生体分子の分離を可能とする。それ故、所与のｐＨ値において、捕捉された生体分子を脱離するために特定の塩濃度（しばしばＮａＣｌ）が必要とされ、この濃度は、生体分子とリガンドとの間の相互作用力に従って選択されなければならない：この相互作用が大きいほど、塩濃度（塩分）は高くなければならない。更に、クロマトグラフィー緩衝液のｐＨが、精製しようとする生体分子種の等電点に近いほど、クロマトグラフィーリガンドから生体分子を脱離するために必要とされる塩は少ない。しかしながら、レトロウイルス及びレンチウイルスベクターは、塩濃度に依存してその感染力を急速に失うことが知られている（Segura et al. 2006によって概説されている）。それ故、第一段階で、様々なＮａＣｌ濃度に対するレンチウイルスベクターの安定性を評価した。

１．ＧａＬＶ−ＴＲレンチウイルスベクターの安定性に対する塩分の影響：
上記に示されているように、クロマトグラフィーカラムによって捕捉された生体分子の溶出はしばしば、塩勾配（ＮａＣｌを含有している緩衝液）を用いて又は塩濃度（ＮａＣｌ）を増加させる工程を用いて成し遂げられる。それ故、ＮａＣｌ濃度の影響を評価するために、ＴＦＦ後のレンチウイルスベクターのインキュベーション試験を、５０mMから１，５００mMの範囲の様々なＮａＣｌ濃度で室温で４時間かけて行なった。図３は、ＮａＣｌ濃度による室温でのレンチウイルスベクターの感染力を、全くＮａＣｌを加えない条件又はＮａＣｌを加えずに４℃でインキュベートされた同じベクター調製物と比較して示す。この試験は明らかに、５０mMと１Ｍとの間に含まれるＮａＣｌ濃度が、ＧａＬＶ−ＴＲレンチウイルスベクターの安定性に対してやや有害な作用を及ぼし、感染力は２９．５２％（５０mM ＮａＣｌ）から４３．８６％（１Ｍ ＮａＣｌ）（４℃で保存された調製物に対する比率）の範囲で低下することを示す。他方で、１．５Ｍ ＮａＣｌの濃度は、ベクターの調製物を室温で４時間保存した場合には６３．８％の感染力の低下をもたらす。ＮａＣｌを加えずに２０℃（室温）で４時間保存しても、４℃での保存と比較して、ベクターの感染力は約２３％とある程度減少することを注記すべきである。

これらの結果は、最大の感染力を維持するために、可能な最も低い塩分を用いて、それ故、理想的には１Ｍ未満のＮａＣｌを用いて、クロマトグラフィー基材のＧａＬＶ−ＴＲレンチウイルスベクターを溶出することが不可欠であることを意味する。更に、また、低温（理想的には４℃〜１０℃）で精製全体（全工程）を行なうことが好ましい。

２．様々な陰イオン交換クロマトグラフィー基材（ＡＥＸ）の評価：
本発明者らは、低級陰イオン交換クロマトグラフィー基材（ＤＥＡＤ（Ｄ））を使用して、特にクロマトグラフィーカラムから該ベクターを脱離させるために必要とされる塩濃度を減少させようと試みることによって、このタイプの基材によるベクターの失活を制限することが可能であるかどうかを決定した。ＰＧ１３細胞（ＭＬＶ−ＧａＬＶ）の培養物から濃縮された上清を使用した予備試験においては、ＤＥＡＥ（東ソーＴＳＫゲルＤＥＡＥ ５ＰＷ）に基づいたクロマトグラフィー基材の使用により、収率が僅か１６％であった（溶出中に失活を引き起こす強力すぎる相互作用に因る）強力な交換体（GE HealthCareのＱセファロースＦＦ）の使用中よりも高い約７１％という感染性ベクターの収率をもたらすことを示すことが可能であった。この例では、レトロウイルスベクターの脱離のために必要とされる塩濃度は、それぞれ６５５mM及び９１５mMであった。これらの結果に基づいて、低級陰イオン交換体が、展開の継続のために選択された：いくつかのクロマトグラフィー基材を評価した：モノリスＣＩＭ Ｄ（ＤＥＡＥ）、ＰｏｒｏｓＤ５０（Life Technologies）、サルトバインド（Sartorius）（Bandeira et al. 2012）、トヨパール６５０Ｃ ＤＥＡＥ（Merten et al. 2011）。

予備試験として、ＧａＬＶ−ＴＲレンチウイルスベクターの精製を目的として、３つの基材をｐＨ５．５又は６．０及び７．０において評価した。ｐＨ５．５又は６．０及び７．０で試験された全ての基材について、低いｐＨの選択（５．５又は６．０）が、感染性ベクターの収率の点で有益であった：ＣＩＭ Ｄ ＤＥＡＥ基材に関しては、収率は、クロマトグラフィーに使用される緩衝液のｐＨを７．０から６．０へと減少させる間に２３％（ｐＨ７．０）から６４％（ｐＨ６．０）まで増加した（図４）。類似した結果が、サルトバインド７５Ｄ（５．８％から１５．６％まで収率が増加）及びＰｏｒｏｓＤの基材（３２％（ｐＨ７．０）から８０．２％（ｐＨ６．０）及び約１００％（ｐＨ５．５）まで収率が増加）、並びにトヨパール６５０Ｃゲル（２３％（ｐＨ７．０）から８９％（ｐＨ５．５）まで収率が増加）について観察された（図４）。更に、基材からベクターを脱離するために、溶出緩衝液の塩分は、ｐＨ６．０でのクロマトグラフィー中により低くあることが可能であった（それ故、レンチウイルスベクターにとってはより穏やかである）。ｐＨ６．０で使用されるＰｏｒｏｓＤ基材に関しては、ベクターの溶出は６５０mM ＮａＣｌで達成される（以下参照）。全体的な効率の点では、「現代的な」基材（より最近になって開発され、クロマトグラフィー中により少ないずり応力（本質的には他の基材よりも大きな多孔度に起因する）を発生し、モノリスＣＩＭ Ｄ ＤＥＡＥ又はＰｏｒｏｓＤのような、緩衝液の流速の変更中における基材の非圧縮性によって特徴付けられる）は、膜（サルトバインド７５Ｄ）を有する基材又は圧縮性ゲル（トヨパール６５０Ｃ）に基づいた基材の収率よりも高い収率を示した。

最後に、最近の基材で選択が行なわれた。なぜなら、ベクターを分離し回収するその効率が、より従来の基材と比較してより高かったからであった。それ故、これらのどちらの支持体もより広く評価され、レンチウイルスベクターを精製するためにその使用が最適化された。ＣＩＭ Ｄ ＤＥＡＥ及びＰｏｒｏｓＤのどちらの支持体も、６０％を超える興味深い収率を有する。溶出は、６５０mM ＮａＣｌ、ビス−トリス、５％スクロース、２mM ＭｇＣｌ_２、ｐＨ６．０で行なわれる。溶出緩衝液（ＰＢＳ）のｐＨを７．０まで上昇させることにより、７％未満の数値まで収率の低下が引き起こされるが、ＰＢＳに５％スクロースを添加することにより、約７％から４０％への有意な増加が引き起こされる。しかしながらこの場合、１Ｍを超えるＮａＣｌ濃度を使用することが必要である。実際に、ｐＨ７．０ではベクターを溶出するために（追加のスクロースを含まない緩衝液）、約１．５ＭのＮａＣｌがＰＢＳ中に必要であることが観察され、これがおそらく低収率の原因である。ウイルス粒子の安定性に対する塩濃度のマイナス効果が知られている（Segura et al. 2005）。

３．ＰｏｒｏｓＤ基材を使用することによるクロマトグラフィーの効率に対する様々なｐＨ値の評価：
ｐＨを、５％スクロースの存在下及び非存在下において５．５〜８．０の範囲内で変化させた。５％スクロースの存在は、ｐＨが５．５を超える場合には陰イオン交換クロマトグラフィー工程中の収率にプラスの効果を及ぼす（例：ＰｏｒｏｓＤ）（表５）。収率に対するスクロースの存在のプラスの効果は、ｐＨ５．５ではもはや観察されない。他方で、スクロースの存在は、ｐＨ８．０においては、約５８％の感染性ベクターの回収のために不可欠である。６．０から７．０の範囲のｐＨの使用中に、収率は５２〜６５％であり、最善の収率（約１００％）はｐＨ５．５で得られる。

一般的に、５％スクロースの存在は、レンチウイルスベクターの溶出を開始するのに必要とされる塩分の減少と、必要とされるＮａＣｌ濃度の約２５mMの減少をもたらす。

４．第一工程として陰イオン交換クロマトグラフィーを含む代替的な手順の評価：
本発明者らは、清澄化工程の直後に陰イオン交換クロマトグラフィー工程を適用した時に得られた収率を評価した。これらの条件下で観察された収率は、限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程を、清澄化と陰イオン交換クロマトグラフィーとの間に適用した場合よりも低い。それ故、後者の手順が、その後の精製のために選択された。

排除クロマトグラフィー：
排除クロマトグラフィーは、その分子サイズに従って生体分子を分離するために選択された方法であり、これにより、粒子を混入物から分離することが可能となる。

ろ過用ゲルＣａｐｔｏ Ｃｏｒｅ７００（GE HealthCare）を使用したが、他の基材も考えられ得る。この工程は、前の工程の緩衝液を所望の製剤化用緩衝液で置換し、７５０ｋＤａ未満のサイズの混入分子を除去し、ローディングしようとする試料の希釈を回避することを可能とする。このクロマトグラフィー工程は、タンジェンシャルフローろ過後に（濃縮／ダイアフィルトレーション−プロセスＡ）又は陰イオン交換クロマトグラフィー工程後に（プロセスＢ）直接使用され得る（図１）。レンチウイルスベクターを含有しているタンジェンシャルフローろ過からの試料又は陰イオン交換クロマトグラフィー画分からの試料を、排除クロマトグラフィーカラムにローディングする。どちらの場合においても、この工程の収率は、その後の使用のために保持された画分に応じて８６％±４である。

図５は、ゲル（Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅ７００）ろ過によるレンチウイルスベクター（タンジェンシャルフローろ過によって濃縮及びダイアフィルトレーションにかけられた）の精製を示す。ベクターの溶出ピークは、緩衝液の前の通路に見られ、画分４〜９でカラムから出て、これはカラムに最初にローディングされたベクターの量の約７０％を網羅する（図５ａ）。図５Ｂ及び５Ｃは、電気泳動（ウェスタンブロット、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による各画分の分析を示し、これは明らかに混入しているバンドがないこと（図５ｃ）及びレンチウイルスベクターのキャプシドタンパク質ｐ２４に相当する２４〜２５ｋＤａにおけるバンドの存在を示す。

収率及び純度：
最も重要なパラメーターは、全収率、並びに、混入タンパク質及び混入ＤＮＡの積載量の低減時のレンチウイルスベクター調製物の純度に関する。

臨床使用のためのレンチウイルスベクターの精製を目的とした手順Ｂ（ＴＦＦ、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）及び排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を含む）に関して（図１）、収率は約５０％であり、この手順は混入タンパク質の９９．９％除去及び混入ＤＮＡの９９．９％除去を可能とする。

研究に使用するためのレンチウイルスベクターの精製を目的とした手順Ａ（ＴＦＦ及び排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を含む）（図１）はより単純である。なぜなら、それは陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含まないからである。全収率は、精製工程数の減少のためにより高く、６０．２％を達成し、この単純化された手順の残留ＤＮＡ混入物の除去は９６．１７％の次元であり、混入タンパク質の９９．６３％の減少が観察される。

標的細胞の形質導入の実践例：
ＣＤ３４＋細胞の形質導入：
精製ベクターの品質を決定するために、臍帯血細胞ＣＤ３４＋を形質導入する。細胞を、サイトカインで予め刺激した１８時間後に解凍する。形質導入を６時間かけて行なう。次に、細胞を、５日間、分化培地に入れる。次いで細胞を、ＧＦＰの発現率を測定するために、ＦＡＣＳ ＦＣ５００（BD Biosciences）に通過させる。以下の結果が典型的には得られる（図６）：レンチウイルスベクター（ＧａＬＶ−ＴＲ）の濃縮／ダイアフィルトレーションによる精製により、ＣＤ３４＋細胞の形質導入効率（ＧＦＰを発現している細胞の比率として表現される）は、粗上清の使用時の９％から、濃縮／ダイアフィルトレーションにかけられたＬＶベクターの調製物の使用時の７０％まで増加する。

麻疹ウイルスの改変されたエンベロープを用いてシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターの精製
麻疹ウイルスのエンベロープの改変された糖タンパク質を用いてシュードタイプ化（ＭＶシュードタイプ化）されたレンチウイルスベクターの精製プロセスをここに記載する。上記に示された手順に従って産生されたＬＶ−ＭＶ−ＣＭＨＩＩ（ＣＭＨＩＩ＝抗ＣＭＨＩＩ抗体）レンチウイルスベクターを、以下の工程に従って精製する：

１）ＴＦＦ工程を用いての濃縮／ダイアフィルトレーション
−使用する膜：１リットルの産物の精製のための、ＧＥ 番号ＵＦＰ−７５０−Ｅ−３ＭＡ １１０cm²
−ダイアフィルトレーション緩衝液：ＰＢＳ（（ｐＨ７．０）、２mM ＭｇＣｌ_２、５％スクロース）
−容量の低減：５００mL／１，０００mLから２０mLへ、緩衝液をダイアフィルトレーション緩衝液と交換する。
−感染性ベクターの収率：６４〜７０％。

２）排除クロマトグラフィー（ゲルろ過）：
−使用するカラム：ＣａｐｔｏＣｏｒｅ７００ ４．７mL
−製剤化用緩衝液：ＰＢＳ、５％スクロース、２mm ＭｇＣｌ_２、又はさもなくば５％スクロース及び２mM ＭｇＣｌ_２を含有しているＸ−ｖｉｖｏ又はＨＡＮＫＳ
−１０ＣＶの製剤用緩衝液を用いてのカラムの平衡化
−ＴＦＦからの濃縮液を、０．５mL／分の速度でＣａｐｔｏＣｏｒｅ７００カラムにローディング
−２０ＣＶの製剤化用緩衝液を用いてのカラムの洗浄
−ＯＤピークに対応する試料の収集（５０倍で容量２１mL）
−感染性ベクターの収率：９０％超（ＴＵ）。

この精製の全収率は、感染性ベクター６０〜６３％であり、これは、精製についての、それ故、改変されたＭＶ糖タンパク質を用いてシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターの利用についての大きな進歩を示す。

参考文献

Claims (19)

1. 陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含む、エンベロープウイルスを精製するためのプロセスであって、該クロマトグラフィー中に使用される緩衝液が、
   −ｐＨが６未満、又は
   −ｐＨが６以上であり、かつ更にポリオールを含む、プロセス。
2. 前記陰イオン交換クロマトグラフィーの緩衝液（単数又は複数）のｐＨが６未満であり、かつポリオールも含む、請求項１記載のプロセス。
3. 前記緩衝液のｐＨが５．５と６との間に含まれ、ｐＨがより詳細には５．５又は６に等しい、請求項１記載のプロセス。
4. 前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程の前に、限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程、特にタンジェンシャルフローろ過を行なう、先行する請求項のいずれか一項記載のプロセス。
5. 前記限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程が、ポリオールを含んでいてもよい５．５と７．５との間に含まれるｐＨを有する１つ又はいくつかの緩衝液の使用を含む、請求項４記載のプロセス。
6. エンベロープウイルスを産生する細胞の細胞培養物の培養培地からエンベロープウイルスを精製するための、先行する請求項のいずれか一項記載のプロセスであって、
   （ａ）該細胞培養培地の清澄化；
   （ｂ）清澄化されたウイルスのための限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程；
   （ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー；
   （ｄ）排除クロマトグラフィー
   を含む、プロセス。
7. 工程（ａ）が、捕捉閾値が０．２と０．４５μmとの間に含まれる捕捉フィルター上での培養培地のろ過によって行なわれる、請求項６記載のプロセス。
8. 工程（ｂ）が、タンジェンシャルフローろ過を用いて行なわれる、請求項６又は７記載のプロセス。
9. 工程（ｄ）が、３００と１，０００ｋＤａとの間に含まれる排除サイズを有する排除樹脂の使用を含む、請求項６〜８のいずれか一項記載のプロセス。
10. 前記排除クロマトグラフィーに使用される樹脂が、排除及び吸着の２つの機能を有するマルチモード樹脂である、請求項６〜９のいずれか一項記載のプロセス。
11. 限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程、特にＴＦＦ工程を含む、エンベロープウイルスを精製するためのプロセスであって、該工程が、ポリオールを含有する緩衝液を使用することによって行なわれる、プロセス。
12. 精製されたウイルスが、中性培地中で、又は、特にｐＨ６とｐＨ７との間に含まれるｐＨのやや酸性の培地中で産生される、請求項１〜１１のいずれか一項記載のプロセス。
13. ポリオールが、スクロース、マンニトール、ソルビトール、及びトレハロースから選択される、請求項１〜１２のいずれか一項記載のプロセス。
14. ポリオールが、緩衝液中に、１．５重量％と１５重量％との間に含まれる濃度、特に２重量％と５重量％との間に含まれる濃度、より詳細には５重量％の濃度で存在する、先行する請求項のいずれか一項記載のプロセス。
15. ポリオールが、タンジェンシャルフローろ過及び陰イオン交換クロマトグラフィー中に使用される緩衝液中に存在する、請求項１〜１４のいずれか一項記載のプロセス。
16. ポリオールが、精製プロセスの全工程における緩衝液中に存在する、先行する請求項のいずれか一項記載のプロセス。
17. 前記プロセス中に使用される緩衝液がまた、特に０．１mMと５mMとの間に含まれる濃度、特に１と３mMとの間に含まれる濃度、より詳細には２mMの濃度で、マグネシウム塩、特に塩化マグネシウムを含む、先行する請求項のいずれか一項記載のプロセス。
18. ＧａＬＶ、ＧａＬＶ−ＴＲ、ＶＳＶ−ｇ又はＭＶエンベロープ糖タンパク質を用いてシュードタイプ化された、エンベロープウイルス、特にレトロウイルス、特にレンチウイルスの精製のための、先行する請求項のいずれか一項記載のプロセス。
19. 前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、弱陰イオン交換カラムクロマトグラフィー及び／又は陰イオン交換カラムクロマトグラフィーである、請求項１〜１０及び１５〜１８のいずれか一項記載のプロセス。