JP2017515475A - ＨｂＡ１ｃの酵素的定量法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）量を決定する方法、即ち、サンプル中の赤血球を必要に応じて溶血し、その後放出されたヘモグロビンを必要に応じてタンパク質分解剤に接触させ、このように又は他の態様で得られた糖化ヘモグロビン分解物を定量化する方法に関する。【解決手段】このようなプロセス、並びに、このプロセスに使用可能な試薬であって、必要不可欠な化学化合物が十分に安定的であるという特徴を有するプロセス並びに試薬を提供するために、必要なタンパク質分解剤を、不活性化したプロテアーゼとして提供し、その後、その場で再活性化させることを提案する。本発明の特定の実施形態では、１〜３の範囲の非常に低いｐＨでアンフォールドされるヘモグロビンを安定化するために、少なくとも１種の適切な安定化剤を溶血溶液中に含有させる。更に、本発明の当該実施形態においては、ＨｂＡ１ｃ量の決定に関しロイコ染料を使用し、本発明は、後者のロイコ染料を特定のホスフィン化合物及び／又はチオ化合物によって安定化することを提案する。【選択図】図１

Description

本発明は、サンプル中の糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）量を決定する方法、及びサンプル中の糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）量を決定する方法に使用可能な試薬キットに関する。

ＩＦＣＣ（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine、国際臨床化学連合）の定義によれば、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）とは、ヘモグロビンのβ鎖のＮ末端バリンにグルコースが結合することによって生成される安定した生成物をいう。ヘモグロビン総量に対するＨｂＡ１ｃの量（全ヘモグロビンの１モル当りのＨｂＡ１ｃのｍｍｏｌ）は、血液サンプルを採取する前直近の８週間における平均血糖値を示し、従って、「長期血糖」とも呼ばれる。ＨｂＡ１ｃ値は通常、２０ｍｍｏｌ／ｍｏｌ〜４２ｍｍｏｌ／ｍｏｌの範囲内にあるべきことから、糖尿病の診断及び治療のための重要な指標である。

ＨｂＡ１ｃ定量方法として、例えば、免疫アッセイ（例えば、免疫比濁法（ＴＩＡ））及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が知られている。糖化ヘモグロビンのフルクトシルアミノ酸オキシドレダクターゼ（ＦＡＯＤ）との反応を定量化する酵素法も時には利用可能である。

酵素調査法おいては、他の全てのＨｂＡ１ｃ法と同様に、第一工程で、血液サンプル中の赤血球を破壊し溶血して、そこに含まれているＨｂＡ１ｃを放出させる。次いで、放出された糖化ヘモグロビンを、タンパク質分解剤に接触させて糖化ヘモグロビン分解物を生成する。これらのタンパク質分解によって生成された分解物には、フルクトシル・バリン（Ｆｒｕ−Ｖａｌ）及びフルクトシル・バリン・ヒスチジン（Ｆｒｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ）又はより鎖長が長いフルクトシルペプチドが含まれ、これらは、糖化ヘモグロビンのβ鎖のアミノ末端から切断される。このフルクトシルアミノ酸又はフルクトシルペプチドは、酵素フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＸ）や酵素フルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ）といった酵素の活性によって酸化される。この酸化工程の結果、過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）が生成される。

上記酸化工程によって生成された過酸化水素の量は、フルクトシル化したアミノ酸又はペプチドの量と相関している。それゆえ、この工程によって生成された過酸化水素の量は、サンプル中のＨｂＡ１ｃ量の目安とされる。従って、ＨｂＡ１ｃ量の最終的な決定は、例えば発色反応に基づいて過酸化水素の量を定量化することによって行うことができるが、この発色反応は、測光法で評価され、過酸化水素の量と化学量論的に相関するものである。もっとも、原則的に、サンプル中の過酸化水素の量を定量化する他の任意の分析方法も同様に使用できる。

過酸化水素を定量化するある方法においては、ロイコ染料還元体を過酸化水素で酸化する。しかしながら、この方法では、ロイコ染料が自動的に酸化することによって、不特定なブランク値のシグナルが生じ、且つ、スペクトル背景値が上昇して、検体シグナルの正確な測光が難しくなるという困難を伴う。他方で、ロイコ染料には通常、他の染料よりも高い分子吸収係数を有するという利点がある。また、多くのロイコ染料は、例えばビリルビンやヘモグロビンのような血液成分との相互作用による光学的な影響を一般的に無視できるほど高い吸収極大値を有している。

化学試薬及び診断試薬の長期安定性が問題であり、特に、輸送、貯蔵及び／又は処理の際にこれらの試薬が特に高い温度又は特に低い温度及び／或いは激しい温度変化に曝される場合に解決困難な問題となる。このことが、上述のロイコ染料や、ＨｂＡ１ｃ試験に使用される酵素及び他の試薬にも同様にあてはまることは理解されよう。

しかしながら、同時に、検査する出発原料の安定性、並びに、反応の中間体及び最終生成物の安定性を確保することも、結果を確実に再現可能とするためには非常に重要である。

従って、本発明者らは、サンプル中の糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）量を定量化する方法、並びに、この方法に使用可能な試薬を、反応に必要不可欠な化学化合物が十分に安定した形態で存在するように提供することを目的とした。
好ましくは、本発明に係る方法及び本発明に係る試薬は、全ヘモグロビンの定量とＨｂＡ１ｃ量の決定を同時に可能とすることを目的とする。

実施例におけるプロテアーゼの安定化、ＳＤＳゲル電気泳動に関する説明図である。 実施例における２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートポリマーを添加しない場合のＴｒｕＣａｌ ＨｂＡ１ｃレベル１のグラフである。 実施例における２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートポリマーを添加した場合のＴｒｕＣａｌ ＨｂＡ１ｃレベル１のグラフである。 実施例における２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートポリマーを添加しない場合の低ＨｂＡ１ｃ、中ヘモグロビンのグラフである。 実施例における２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートポリマーを添加した場合の低ＨｂＡ１ｃ、中ヘモグロビンのグラフである。

本発明によって、上述の目的は、以下詳細に説明する種々の特徴によって達成される。また、これらの特徴は通常、以下の方法工程が実施される、サンプル中のＨｂＡ１ｃ量を決定する方法を構成する共通点を有している：
ａ）サンプル中の赤血球を溶血して、そこに含まれるＨｂＡ１ｃを含むヘモグロビンを放出させ、
ｂ）方法工程ａ）で放出させたＨｂＡ１ｃを含むヘモグロビンを、糖化ヘモグロビン分解物を生成するためのタンパク質分解作用剤に接触させ、
ｃ）方法工程ｂ）で生成された糖化ヘモグロビン分解物を定量化することによってＨｂＡ１ｃ量を決定する。

本発明との関連で使用されるサンプルという用語は、分析作業のために準備され、ヘモグロビン及び／又はＨｂＡ１ｃの分析される一部を含有する全ての原料を意味する。多くの場合、サンプルは、新鮮な全血サンプルである。もっとも、本発明では、例えば、保存血液、精製血液、凍結乾燥全血、赤血球濃縮物、溶血前の血液サンプル、ヘモグロビン標準溶液、ＨｂＡ１ｃ標準溶液、及び例えば合成ＨｂＡ１ｃ分解物のような合成ヘモグロビン分解物を含有する標準溶液のようなサンプルも含む。

分析されるサンプル中にＨｂＡ１ｃが予め遊離して存在する場合、方法工程ａ）は必須ではない。また、合成ヘモグロビン又はＨｂＡ１ｃ分解物を含有する標準溶液の場合に、方法工程ｂ）も必須ではない。ヘモグロビン又はそこに本質的に含まれているＨｂＡ１ｃ又はこれらの分解物が分析されるサンプル溶液中に予め存在していない場合、通常、工程ａ）の前又はその間にこれらを水溶液に入れる。

赤血球の溶血は、基本的に、赤血球が完全に溶血すると当業者に知られている全ての機械的、化学的若しくは浸透溶血手段又は方法によって行うことができる。本発明に係る手段又は方法の１つとして、細胞膜を破壊して赤血球に含まれるヘモグロビンを周囲媒体に移動させ、赤血球を溶解させる溶血作用が考えられる。

当業者に知られている溶血作用手段又は方法の例として、超音波処理、又は溶血洗剤若しくは強低張塩溶液を添加することがある。

溶血作用洗剤を使用する本発明の実施形態では、溶血作用洗剤は、例えば、イオン性、アニオン性、及び両性洗剤の中から選択できる。ここで、本明細書において使用される洗剤という用語は、液体の表面張力又は２つの相の間の界面張力を低下させる物質を含むことを意味する。

ある実施形態では使用される溶血作用洗剤は、例えば、以下の中から選択される：溶血性ポリエチレングリコール（ＰＥＧｓ）、溶血性グリコシド及びエステル、溶血性ポリオキシエチレンアルキルエーテル、溶血性ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、溶血性ポリオキシエチレングリコール、溶血性ポリオキシプロピレンポリオキシエチレントリブロックコポリマー（ポロキサマー、プルロニック）、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグリコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグリコシド、サッカロースラウリン酸塩、サッカロースカプリン酸塩、サッカロースリノール酸塩、サッカロースパルミチン酸塩、サッカロースコール酸塩、及び上記化合物の誘導体、及びこれらの混合物。

原則として、当業者に知られている全てのタンパク質分解作用手段は、例えばプロテアーゼのようなものとみなす。ここで、本発明に係る手段は、ペプチド結合に対する加水分解によってタンパク質を切断するタンパク質分解効果を有する。

タンパク質分解剤がプロテアーゼである実施形態では、原則として、真核生物又は原核生物から組み換えられて得られるプロテアーゼ、又は生物種から内因的に得られるプロテアーゼ、或いは生物成分由来のセリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、金属又は未知の種類のプロテアーゼ、例えば、アクロシン、アミノペプチダーゼＢ、ブロメライン、カルパインＩ、カルボキシペプチダーゼＡ、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、キモトリプシン、コラゲナーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ４、ディスパーゼ、エラスターゼ、第ＩＩａ因子、第Ｘａ因子、フィシン、ｇｐｒ−エンドペプチダーゼ、ＨＩＶ−プロテアーゼ、カリクレイン、ＭＢＴＰＳ１、ブロメライン、パパイン、ペプシン、プラスミン、ＩＶ型プレピリンペプチダーゼ、プロリル−オリゴペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、プロテアソーム、レニン、セクレターゼ（α−、β−及びγ−セクレターゼ）、テルモリシン（ＥＣ ３，４，２４，２７）、トロンビン、トリプシン、ウロキナーゼ、バシラス属種由来のプロテアーゼＮ、アスペルギルス属種由来のプロテアーゼＰ、ストレプトマイセス属種由来のプロテアーゼＸＩＶ、及びバシラス ステアロサーモフィラス由来プロテアーゼＳから内因的に得られるプロテアーゼの全てから選択できる。

本発明のある実施形態では、ＨｂＡ１ｃを特異的に切断するプロテアーゼを使用する点において関連する利点があり得る。しかしながら、本発明では一般に、プロテアーゼが糖化ヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンとの間の差異について特異的であることを要しない。従って、この点において、ＨｂＡ１ｃ及び非糖化ヘモグロビンを特異的に区別しないプロテアーゼを使用することも可能である。多くの実施形態では、同様の態様では特異的に作用しないプロテアーゼを使用することが明示的に望まれることもある。

本発明の多くの特徴において、分解物を生じさせるプロテアーゼを使用する必要はない。しかしながら、本発明の多くの実施形態では、糖化ヘモグロビンのβ鎖のアミノ末端からフルクトシル・バリン・ヒスチジン又はフルクトシル・バリンを放出させるタンパク質分解活性を有するプロテアーゼが特に使用される。

方法工程ｂ）で生成された糖化ヘモグロビン分解物に対する、ＨｂＡ１ｃ量の決定は、基本的に、当業者に知られている全ての定量化手順によって（上述したように、例えばＨＰＬＣ分析又は酵素定量法により）行うことができる。

上述の方法の他に、本発明は、サンプル中のＨｂＡ１ｃ量を決定する方法に使用される試薬キットも提案する。これらの試薬キットは、少なくとも２つの異なる溶液を別個の容器に備え、少なくとも２つの異なる溶液はそれぞれ以下詳細に説明する本発明の種々の特徴を実現する組成物からなることを特徴とする。

特徴１−プロテアーゼの安定化
第一の特徴によれば、本発明の上述の目的が、方法工程ａ）〜ｃ）が必要に応じて実施される、サンプル中のＨｂＡ１ｃ量を決定する方法を提案する点において達成される。

本発明のこの特徴によれば、方法工程ｂ）で使用されるタンパク質分解作用剤は、少なくとも２つの異なる溶液をＨｂＡ１ｃに接触させることにより活性化する。このうちの１つの溶液は１〜８の範囲にあるｐＨ値を有し、且つ、
ｉ）少なくとも１種のプロテアーゼ、
ｉｉ）プロテアーゼ１０００ｋＵ／ｌ当り０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜２ｍｍｏｌ／ｌの、二価金属イオンに対するキレーター、及び
ｉｉｉ）０．５ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌのＣａ²⁺又は０．５ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌのＭｇ²⁺
を含有する。ここで、キレーター：Ｃａ²⁺又はキレーター：Ｍｇ²⁺のモル比は、１：２〜１：２０の範囲にある。他の溶液は、Ｆｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＺｎ²⁺から選択される二価金属イオンを１００μｍｏｌ／ｌ〜５０００μｍｏｌ／ｌ含有する。

また、以下のことを特徴とした、サンプル中のＨｂＡ１ｃを定量する方法に使用される試薬キットを提案する。即ち、この試薬キットは、少なくとも２つの異なる溶液を別個の容器に備える。このうち１つの溶液は、１〜８の範囲にあるｐＨ値を有し、且つ、上記成分ｉ）〜ｉｉｉ）を含有する。なおキレーター：Ｃａ²⁺又はキレーター：Ｍｇ²⁺のモル比は、１：２〜１：２０の範囲にある。他の溶液は、Ｆｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＺｎ²⁺から選択される二価金属イオンを１００μｍｏｌ／ｌ〜５０００μｍｏｌ／ｌ含有する。

本発明のある実施形態では、プロテアーゼを含有する溶液のｐＨ値は、少なくとも４及び／又は多くとも６である。本発明の他の実施形態では、プロテアーゼを含有する溶液のｐＨ値は、４より大きく及び／又は６未満である。本発明の特定の実施形態では、この溶液のｐＨ値は、４．５〜５．５の範囲にあり、更に特定の実施形態ではは、４．９〜５．１の範囲にある。

金属プロテアーゼの活性は、Ｆｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺又はＺｎ²⁺のような二価金属イオンの存在に依存する。現時点において、５４の金属プロテアーゼファミリーが１５のクランに分類され、３９のファミリーの属するクランＭＡに傑出して重要である。これら３９のファミリーのうちたった１９のファミリーが、いわゆる中性亜鉛金属プロテアーゼに関連していると言える。他の金属プロテアーゼは、マンガン又はコバルトに依存する。

とりわけ、以下の金属プロテアーゼがクランＭＡに属している：膜アラニルアミノペプチダーゼ、ぺプチジルジペプチダーゼＡ、チメットオリゴペプチダーゼ、オリゴペプチダーゼＦ（ラクトコッカス属）、ミコリシン、免疫インヒビターＡ（Ｉｍｍｕｎ−Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ａ）（バシラス属）、非中性ストレプトマイセスプロテアーゼ、レイシマノリシン、微生物コラゲナーゼ、コラゲナーゼｃｏｌＡ、マトリクスメタロペプチダーゼ１、セラリシン、フラギリシン、オートリシン（クラミドモナス）、アスタシン、リプロリシン、ネプリライシン、ＩｇＡ特異的メタロエンドペプチダーゼ、テントキシリシン、テルモリシン、中性ブドウ球菌プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼｔ ａｑ、炭疽菌致死因子、ドイテロリシン、ファンガリシン（Ｆｕｎｇａｌｙｓｉｎ）、細胞切断タンパク質ｆｔｓＨ、サイトファガリシン（Ｃｙｔｏｐｈａｇａｌｙｓｉｎ）、パッパリシン１、Ｓｔｅ２４−エンドペプチダーゼ（サッカロミケス属）、ＨｔｐＸ−エンドペプチダーゼ（大腸菌）、アルカエリシン（Ａｒｃｈａｅｌｙｓｉｎ）、ペプチダーゼｂｌａＲ１、ペプチダーゼｐｒｔＢ、エンハンシン（Ｅｎｈａｎｃｉｎ）、グリシルアミノペプチダーゼ（スフィンゴモナス カプスラータ）、ペプチダーゼＩｇＡ（クロストリジウム ラモスム）、ペプチダーゼｓｔｃＥ（大腸菌）、ぺプチジル−ａｓｐ−メタロエンドペプチダーゼ（緑膿菌）、及びＩｍｍＡ−ペプチダーゼ。

プロテアーゼが長期間その活性形態にあると、自己消化によってこの酵素の大部分が破壊されてしまう恐れがある。この点、酵素の自己消化を回避できるのであれば、プロテアーゼの酵素活性を一時的に不活性化することが多くの場合望ましい。

プロテアーゼの自己消化の問題自体は、当該技術分野において既に知られている。この問題を解決するために、当該技術分野では、例えば、キレーター（特に、ＳＨ基含有試薬）又は単純に過剰なＥＤＴＡによって、テルモリシンから亜鉛を除去したプロテアーゼテルモリシンが提案されている。

しかし、本発明者らは、キレーターが過剰に存在すると、プロテアーゼの安定性に悪影響を与え得ることを発見した。これは、キレーターが、プロテアーゼから、触媒活性に必要不可欠なコファクターを望んだように除去するだけでなく、大部分のＣａ²⁺及び／又はＭｇ²⁺も除去してしまうからである。なお、多くのプロテアーゼにおいて、その安定性及び構造完全性にＭｇ²⁺又はＣａ²⁺の存在が必要とされている。また、本発明者らは、特定のｐＨ値の試薬区画に不活性形態のプロテアーゼを用意し、且つ、そのプロテアーゼを、第二試薬区画に用意した、Ｆｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＺｎ²⁺から選択される二価金属イオンによって再活性化することが、活性の多くを失うことなくプロテアーゼを長期保存する最良の形態であることを見出した。

カルシウムイオン又はマグネシウムイオンがプロテアーゼのタンパク質構造の安定性に極めて重要であるので、キレーターを過剰に使用すると、結果的にプロテアーゼタンパク質が不安定になる。しかし、本発明者らは、大量のＣａ²⁺及び／又はＭｇ²⁺を用意することによってこのような不安定化の対策となり得ることを見出した。即ち、これにより、プロテアーゼの非活性化に必要な量のキレーターを使用しても、プロテアーゼのタンパク質構造の不安定化は起こらない。

これに関連して特に重要なことは、使用されるカルシウムイオン又はマグネシウムイオンのキレーターの使用量に対するモル比である。このモル比によって、Ｆｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＺｎ²⁺から選択される二価金属イオンがキレーターとのキレート錯体から置換されることなく、プロテアーゼのタンパク質構造が安定化するのに十分な量のカルシウムイオン又はマグネシウムイオンが存在することが確保される。

本発明で適切な二価金属イオンのキレーターの例としては、アセチルアセトン、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′−三酢酸三ナトリウム塩（ＨＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’四酢酸（ＥＧＴＡ）、２−（２−アミノエ
チルアミノ）エタノール、ジエチレントリアミン、イミノ二酢酸、トリエチレンテトラミン、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、トリアミノトリエチルアミン、ニトリロ三酢酸、ビス（サリチリデン）エチレンジアミン、エチレンジアミノ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸、オキサレート、タータラート、シトラート、ジメチルグリオキシム、８−ヒドロキシキノリン、２，２’−ビピリジン、１，１
０−フェナントロリン、ジメルカプトコハク酸、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタンがある。

Ｆｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＺｎ²⁺から選択される二価金属イオンに対して使用されるキレーターは、カルシウムイオン又はマグネシウムイオンに対してよりもＦｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＺｎ²⁺から選択される二価金属イオンに対して高い親和性で結合する。好ましくは、使用されるキレーターは、カルシウムイオン又はマグネシウムイオンの場合と比較して少なくとも１０³倍高い結合力でＦｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＺｎ²⁺から選択される二価金属イオンに結合する。

キレーター濃度は、プロテアーゼの量に応じて上記特定の範囲内から自由に選択できる。一実施形態では、上記溶液は、プロテアーゼ１０００ｋＵ／ｌ当り０．５ｍｍｏｌ／ｌ〜１．５ｍｍｏｌ／ｌのキレーターを含有する。別の実施形態では、この溶液は、プロテアーゼ１０００ｋＵ／ｌ当り０．９ｍｍｏｌ／ｌ〜１．１ｍｍｏｌ／ｌのキレーターを含有する。

カルシウムイオン又はマグネシウムイオンの量も、上記濃度範囲内から自由に選択できる。一実施形態では、カルシウムイオン又はマグネシウムイオンの濃度は、３ｍｍｏｌ／ｌ〜８ｍｍｏｌ／ｌの範囲にある。別の実施形態では、カルシウム濃度又はマグネシウム濃度は、４ｍｍｏｌ／ｌ〜７ｍｍｏｌ／ｌの範囲にある。

金属イオンは、採用される試薬溶液において、任意の適切な塩の形態で使用できるが、選択した塩の形態が、バッチにおいて必要量の金属イオンを溶解することが条件となる。塩の形態の例としては、塩化物、硝酸塩、硫酸塩、ギ酸塩及び酢酸塩がある。バッチにおいて金属イオンであるＣａ²⁺又はＭｇ²⁺が利用可能となる実施形態では、使用される試薬溶液中にその目的に応じて存在するカルシウム塩又はマグネシウム塩は、ある実施形態では、カルシウムの塩化物、硝酸塩、ギ酸塩、酢酸塩又はこれらに対応するＭｇ²⁺塩である。二価金属イオンがＦｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＺｎ²⁺から選択される実施形態では、使用される試薬溶液中に目的に応じて用意された金属塩は、例えば、塩化鉄、硝酸マンガン、ギ酸コバルト又は酢酸亜鉛でもよい。

キレーター：Ｃａ²⁺又はキレーター：Ｍｇ²⁺のモル比は、各実施形態に応じて、１：２〜１：２０の範囲から自由に選択し得る。本発明のある実施形態では、キレーター：Ｃａ²⁺及びキレーター：Ｍｇ²⁺のモル比は、１：４〜１：１０の範囲にある。多くの実施形態では、キレーター：Ｃａ²⁺及びキレーター：Ｍｇ²⁺の比は、１：４〜１：８の範囲にある。他の実施形態では、この比は、１：５〜１：７の範囲にある。

上述の態様の不活性プロテアーゼの再活性化は、本発明によれば、使用される各プロテアーゼの酵素活性に必要不可欠な１００μｍｏｌ／ｌ〜５０００μｍｏｌ／ｌの金属イオン（Ｆｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺又はＺｎ²⁺）を溶液に添加することによって行われる。本発明者らは、キレーター及びカルシウムイオン又はマグネシウムイオンが同時に大量に存在しても、各二価金属イオンがこの特定量あれば、プロテアーゼのタンパク質構造における部位を再占拠するのに十分であることを見出した（この占拠はプロテアーゼの活性化に必要となる）。活性化溶液の金属イオン含有量は、関係する各実施形態に応じて特定の範囲内から自由に選択できる。ある実施形態では、金属イオンの含有量は５００μｍｏｌ／Ｌ〜２０００μｍｏｌ／Ｌの範囲にある。他の実施形態では、金属イオンの含有量は、２００μｍｏｌ／ｌ〜４００μｍｏｌ／ｌの範囲にある。

本発明の一実施形態では、Ｆｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＺｎ²⁺から選択される二価金属イオンの１種を含有する溶液は、方法工程ａ）でサンプルに添加される溶血溶液であり、この溶血溶液は、溶血洗剤を含有する。より具体的には、本発明の目的の１つは、ＨｂＡ１ｃ定量作業に使用される可能な限り多くの試薬を最少の試薬混合溶液として組み合わせることでもある。これに関連して、Ｆｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＺｎ²⁺から選択され、プロテアーゼのその後の活性化に必要とされる二価金属イオンは、プロテアーゼを含有するものとは別の試薬溶液に存在していてもよいことを見出した。例えば、本発明の多くの実施形態では、Ｆｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＺｎ²⁺から選択される二価金属イオンは、ＦＰＯＸ又はＦＡＯＸが加えられた溶液（下記Ｒ１参照）にも、又は、ＨｂＡ１ｃ分析手順の開始時にも使用される溶血溶液にも存在している。

本発明の一実施形態では、ＨｂＡ１ｃ定量に使用される各種試薬を、別個の容器に用意される以下の溶液形態で集める：
−溶血洗剤と、Ｆｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＺｎ²⁺から選択される二価金属イオンを１００μｍｏｌ／ｌ〜５０００μｍｏｌ／ｌ含有する溶血溶液（Ｈ）、
−ＦＰＯＸ又はＦＡＯＸと、ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄｉｓｅ）とを含有する第一試薬溶液（Ｒ１）、及び
−プロテアーゼと、プロテアーゼ１０００ｋＵ／ｌ当り０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜２ｍｍｏｌ／ｌの、二価金属イオンに対するキレーターと、１ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌのＣａ²⁺又はＭｇ²⁺と、ロイコ染料とを更に含有する第二試薬溶液（Ｒ２）。ここで、キレーター：Ｃａ²⁺及びキレーター：Ｍｇ²⁺のモル比はそれぞれ、１：２〜１：２０の範囲にある。

上記試薬キットは、以下の態様でＨｂＡ１ｃ定量方法に使用できる。まず、必要に応じて、全血が溶血溶液と混合されたサンプルを準備する。次いで、この結果得られた溶血液に、第一試薬溶液（Ｒ１）を添加する。この結果、第一試薬溶液に含まれるＦＰＯＸは、存在し得る内因性フルクトシルペプチドを分解しても、ＨｂＡ１ｃ定量に関係する末端がフルクトシル化したペプチドは分解しない。これは、このペプチドが、まだ放出されていないためである。

この反応が実質的に完了した後、インキュベーション前の溶血液の全ヘモグロビン含有量に対して測光決定を行う。次いで、インキュベーション前の溶血液に第二試薬溶液（Ｒ２）を添加して実際にインキュベーションを行う。そこに含まれているプロテアーゼアポ酵素（例えば、テルモリシンアポ酵素）を、既に溶血溶液から組成物に更に加えれられた二価金属イオン（例えば、亜鉛イオン）によって活性化し、とりわけ、Ｎ末端糖化ペプチドをヘモグロビンのβ鎖から切断する。そして、切断した糖化ペプチドをＦＰＯＸを用いて反応させる。ここで、糖化ペプチドをペプチド及びグルコソンへと切断すると過酸化水素が生成される。

生じた過酸化水素の存在下で、既に第一試薬溶液（Ｒ１）から組成物に導入されたペルオキシダーゼによってロイコ染料を発色酸化形態に酸化する。次いで、実際の測光法によるＨｂＡ１ｃ定量作業を、第二試薬溶液（Ｒ２）の添加後、すなわち、ＦＰＯＸにより誘発される反応が起こる直前に、例えば直ちに（測定装置の性能に応じて、例えば１０秒〜３０秒）行うことができ、またその後（各測定装置の性能に応じて、例えば２分〜１５分後）、Ｒ２の添加後、すなわち、過酸化水素により誘発されるロイコ染料の酸化が完了した後にもう一度、行うことができる。最終的に、ＨｂＡ１ｃ含有量の決定は、これらの２つの測定の差を考慮し、ＨｂＡ１ｃの含有量と既に定量されている全ヘモグロビンの商を計算して行われる。しかし、測定間隔は、採用される各分析器や光度計等に大きく依存する。それゆえ、２分〜１５分後の測定を直接一回のみ行うことも可能である。

特徴２−アンフォールド（aufgefalteten）ヘモグロビンの安定化
プロテアーゼの安定化の他、本発明者らは、サンプル中に含まれるＨｂＡ１ｃを含むヘモグロビンを可能な限りアンフォールドすること、及びこれをアンフォールド形態で安定化させることも目的として設定した。こうして、例えば、プロテアーゼによってヘモグロビンを最も効率的に消化し、そのヘモグロビンを測光法で測定可能な安定した形態にすることが可能となる。

当該技術分野において、溶血液中のｐＨ値が低下するとヘモグロビンはある程度アンフォールドすることが知られている。従来のＨｂＡ１ｃ量決定方法では、約５のｐＨ値においてアンフォールディングを行う。しかしながら、ｐＨ値が大きく低下すると、このように処理されたヘモグロビンがその形態のまま大きく変性、凝集、沈殿して、もはやプロテアーゼによる消化に適切した形態にならない点で不利である。

しかし、本発明者らは、非常に低いｐＨ値において、極めて速く効率的なアンフォールディング、及びアンフォールドヘモグロビンのその後の安定化が達成できる方式を見出した。本発明のこの特徴の目的から、以下のことを特徴とした、方法工程ａ）〜ｃ）が必要に応じて実地される、サンプル中のＨｂＡ１ｃ量を決定する方法を提案する。即ち、この方法において、溶血溶液（Ｈ）を添加することによって、方法工程ａ）の溶血が行われる。この溶血溶液は、１〜３の範囲にあるｐＨ値を有し、且つ、溶血洗剤及び少なくとも１種の安定化剤を含有する。この少なくとも１種の安定化剤は、ホスファチジルコリン、２−（メタクリロイルオキシエチル）−２'−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートのポリマー又はコポリマー、或いはこれらの混合物から選択される。

本明細書において使用されるホスファチジルコリンという用語は、一般式（１）の化合物を意味する：

式中、Ｒ₁及びＲ₂は、完全飽和又は一価／多価不飽和の直鎖又は分枝鎖脂肪酸残基から選択される。多価不飽和脂肪酸残基がある実施形態では、これらは好ましくは、二重、三重又は四重不飽和であり、ある実施形態では、飽和度と関係なく、脂肪酸残基は、Ｃ８〜Ｃ２２の範囲にある鎖長をもつもの又はＣ１６〜Ｃ２２の範囲にある鎖長をもつものから選択される（例えば、１、２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）。

本明細書において使用される２−（メタクリロイルオキシエチル）−２'−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートのポリマー又はコポリマーという用語は、一般式（２）の反復単位をもつポリマー又はコポリマーを意味する：

コポリマーの形態で存在する実施形態では、上記特定した一般式（２）をもつ単位の他に、更に脂肪族又は芳香族残基でエステル化されたメタクリレート単位を含む。

溶血溶液を加えた後の溶血液のｐＨ値は、溶血溶液のそれに対応している。このことは、溶血溶液の適切なバッファーによって達成される。本発明のこの特徴によれば、溶血溶液は１〜３の範囲にあるｐＨ値を有する。従って、溶血したサンプル（＝溶血液）のｐＨ値も、１〜３の範囲のｐＨ値に設定される。安定化洗剤を併用した溶血液が常に低いｐＨ値を有する結果、アンフォールドヘモグロビンを速く、効果的に分解できる。

また、サンプル中のＨｂＡ１ｃ量を決定する方法に使用される以下の試薬キットを提案する。即ち、この試薬キットは、溶血作用洗剤及び２−（メタクリロイルオキシエチル）−２'−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートポリマー、ホスファチジルコリン又はこれらの混合物を有し、且つ、１〜３の範囲にあるｐＨ値を有する少なくとも１つの溶血溶液を備える。

ｐＨ値が１〜３の範囲に低下すると、ヘモグロビンが非常に速く且つ強くアンフォールドされる。しかしながら、既に述べたように、ヘモグロビンが変性、凝集、沈殿する恐れがある。これは、例えばトリクロロ酢酸を添加しても起こり得る。しかし、本発明者らは、溶血溶液が、２−（メタクリロイルオキシエチル）−２'−（トリメチルアンモニウムエチル）、ホスファチジルコリン又はこれらの混合物を更に含有していれば、ヘモグロビンの変性、沈殿及び凝集は回避可能であることを見出した。

本発明のこの特徴との関連で使用される、「アンフォールディング」という用語は、二次構造及び三次構造の部分的な溶解を意味するが、ヘモグロビンは沈殿しない。従って、本発明に従ってアンフォールドされたヘモグロビンは、変性したヘモグロビンとは対照的に、溶液中にとどまる。従って、本発明において使用される、変性したヘモグロビンという用語は、例えばトリクロロ酢酸処理によっても起こるような、タンパク質が沈殿且つ凝集する程度にタンパク質構造が溶解したヘモグロビンを意味する。

上述のヘモグロビンの強いアンフォールディング及びそれと同時のアンフォールド生成物の安定化は、驚くべきことに、たった５秒〜１５秒以内という速さで起こる。また、この効果は、２−（メタクリロイルオキシエチル）−２'−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートポリマー、ホスファチジルコリン又はこれらの混合物の存在下で、且つ、請求に係る１〜３までの全てのｐＨ値範囲で達成できる。本発明のある実施形態では、このｐＨ値は２〜３の範囲にある。一実施形態では、溶血溶液のｐＨ値は２．４〜２．６の範囲にある。

特徴３−ロイコ染料の安定化
本発明者らが設定した更なる目的は、ロイコ染料を使用するサンプル中のＨｂＡ１ｃ量の決定方法におけるそのロイコ染料の安定化である。

本明細書において使用されるロイコ染料という用語は、少なくとも１つの酸化物質及び／又はペルオキシダーゼ活性をもつ物質との反応により、無色のロイコ開始形態から測光法で測定可能な発色形態に変換する物質を意味する。本発明に適切なロイコ染料の例としては、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’
，４’’−トリアミノトリフェニルメタンヘキサナトリウム塩（ＴＰＭ−ＰＳ）、Ｎ−（
カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニル
アミンナトリウム塩（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ６７）、２，２'−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）及びトリフェニルアミン、フェノチアジン、フェノキサジン、ベンジジン、トリアリルイミダゾール、ｏ−フェニレンジアミン誘導体、トリフェニルメタン及びロイコ染料の上記特性をもつｏ−トリジン誘導体、並びに、４−アミノアンチピリンとフェノール化合物又はＮ，Ｎ−ジ置換アニリン化合物との組み合わせ及び３−メチルベンゾチアゾリノンヒドロゾン（ＭＢＴＨ）とアニリン化合物との組み合わせがある。更に、本発明に適切なロイコ染料の例としては、ＥＰ ００３８２０５、ＥＰ ０１２４２８７及びＥＰ ００４５２２０に記載のジフェニルアミン誘導体がある。

本発明の特徴において、ロイコ染料の安定化は、サンプル中のＨｂＡ１ｃ量を決定する方法において行われる。この方法において、方法工程ａ）〜ｃ）が実施され、糖化ヘモグロビン分解物の定量化が方法工程ｃ）で行われる。ここで、ＦＰＯＸ又はＦＡＯＸによって酸化させて、過酸化水素が生成じ、生じた過酸化水素の量を決定する。過酸化水素の量は、ペルオキシダーゼ存在下のロイコ染料の発色反応に基づいて定量化する。また、ロイコ染料は、この染料の安定化のために一般式（Ｉ）の化合物を含有する溶液内で生成される：

（式中、Ｐはリン原子を示し、Ｘ₁、Ｘ₂及びＸ₃はそれぞれ独立して、置換又は無置換の直鎖又は分枝鎖Ｃ₁〜Ｃ₈アルキル残基、置換又は無置換のシクロヘキシル残基、及び置換又は無置換のフェニル残基から選択される。）

本明細書の冒頭部において既に述べたように、ロイコ染料の原理は、検出される物質が存在により無色のロイコ開始形態から発色形態に変換するロイコ染料によってその物質が検出されることに基づいている。実際の検出反応の実施前にこの変換が予め起こらないことを確保する観点から、ロイコ染料が無色還元形態で安定していれば、これにより実際の検出反応に悪影響が及ぶことないため、有益である。

本発明者らは、一般式（Ｉ）の化合物を添加することによって、これにより実際の検出反応（本件の場合、酵素ペルオキシダーゼの存在下での過酸化水素の検出）に悪影響を及ぼすことも阻害することもなく、ロイコ染料の有効な安定化が達成できることを見出した。

一般式（Ｉ）の化合物の例としては、トリス（２−カルボキシエチル）ホスファチン（ＴＣＥＰ）、ビス（ｐ−スルホナトフェニル）フェニルホスフィン二水和物二カリウム塩、１，３，５−トリアザ−７−ホスフィンアダマンタン、トリス（３−スルホナトフェニル）ホスフィン水和物ナトリウム塩、トリス（４，６−ジメチル−３−スルホナトフェニル）ホスフィン三ナトリウム塩水和物、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン、ジ−ｔ−ブチル（３−スルホナトプロピル）ホスフィン、ジフェニル（ｍ−スルホナトフェニル）ホスフィン二水和物ナトリウム塩、及び［２−ジシクロヘキシルホスフィノ）エチル］−トリメチルアンモニウムクロリドがあるが、本発明がこれらの化合物とのみ実施されることを意図するものではない。これらの化合物は、例として挙げただけである。

或いは、ロイコ染料を安定化するために、チオ化合物、より具体的には、１つ又は複数のチオアルコール、チオエーテル、チオケトン又はこれらの混合物を添加することも可能である。このようなチオ化合物の例としては、チオジグリコール、チオリンゴ酸、チオニコチンアミド、チオＮＡＤ及びこれらの混合物があるが、例をこれらに特定する結果、本発明が限定されることを意図するものではない。

上記チオ化合物は、単独でも、上記一般式（Ｉ）の化合物と組み合わせても使用できる。それゆえ、本発明のある実施形態では、ロイコ染料を、この染料の安定化のために例えばＴＣＥＰのような少なくとも１種の一般式（Ｉ）の化合物及び例えばチオジグリコールのような少なくとも１種のチオ化合物を含有する溶液内で生成する。

それゆえ、本発明は、以下のことを特徴とした、サンプル中のＨｂＡ１ｃ量を決定する方法に使用される試薬キットにも関する。即ち、この試薬キットは、ロイコ染料並びにロイコ染料の安定化のための少なくとも１種の一般式（Ｉ）の化合物及び／又は少なくとも１種のチオ化合物を含有する少なくとも１つの試薬溶液を備える。

一実施形態では、一般式（Ｉ）の安定化剤化合物の濃度は、試薬溶液に含有されるロイコ染料１モル当り１０ｍｏｌ〜２０ｍｏｌの範囲にある。特別の実施形態では、一般式（Ｉ）の安定化剤化合物の量は、ロイコ染料１モル当り１０ｍｏｌ〜１５ｍｏｌの範囲にある。

上述のサンプル中のＨｂＡ１ｃ量を決定する方法において、例えば上記チオ化合物のようなＳＨ基を含有する試薬が多くの場合使用される。しかしながら、このようなＳＨ基含有化合物は実際のＨｂＡ１ｃ検出反応に干渉しかねない。より具体的には、ＦＰＯＸ又はＦＡＯＸがフルクトシル化したアミノ酸又はペプチドを反応させる部位に干渉して、過酸化水素を形成し、この結果生じた過酸化水素が定量化されてしまう。この点、本発明者らは、上記検出反応を乱すＳＨ基を可能な限り多く阻止しなければならないことを突き止めた。

従って、本発明は、実際のＨｂＡ１ｃ検出反応の最適化ために、例えばＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）のようなＳＨ基捕捉剤を添加して、反応を乱すＳＨ基を阻止することを提案する。それゆえ、ＳＨ基捕捉剤は、ＨｂＡ１ｃ検出反応を行う直前に遅くとも添加されるべきである。

所定の実施形態では、ＳＨ基捕捉剤、例えばＮＥＭを、溶血溶液に含有させる。代替実施形態では、ＳＨ基捕捉剤、例えばＮＥＭを、チオアルコールによって安定化したロイコ染料が存在する試薬溶液とは別に維持された試薬溶液に含有させ、添加する。

所望の場合、本発明に係る方法を、全ヘモグロビン濃度を方法工程ａ）〜ｃ）の際又はこれらの方法工程間に決定するように行うこともできる。それゆえ、本方法は、好ましくは、ＨｂＡ１ｃ濃度を相対量として、例えばｍｍｏｌ／ｍｏｌで、直接特定できるように全ヘモグロビン濃度を決定する工程を含む。

試薬キットの特別の実施形態
本出願に記載の本発明の一実施形態では、少なくとも以下の３つの溶液を別個の容器に備える試薬キットが提供される：
−溶血作用洗剤を含有する溶血溶液（Ｈ）、
−ＦＰＯＸ又はＦＡＯＸを含有する第一試薬溶液（Ｒ１）、及び
−プロテアーゼを含有する第二試薬溶液（Ｒ２）。ここで、
ａ）溶血溶液（Ｈ）は、１〜３の範囲にあるｐＨ値を有し、且つ、２−（メタクリロイルオキシエチル）−２−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートポリマー、ホスファチジルコリン又はこれらの混合物を有し、並びに／或いは
ｂ）溶血溶液（Ｈ）は、Ｆｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＺｎ²⁺から選択される二価金属イオンを１００μｍｏｌ／ｌ〜５０００μｍｏｌ／ｌ含有し、並びに、第二試薬溶液（Ｒ２）は、糖化ヘモグロビンのβ鎖のアミノ末端からフルクトシル・バリン・ヒスチジン又はフルクトシル・バリンを放出させるタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含有し、且つ、プロテアーゼ１０００ｋＵ／ｌ当り０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜２ｍｍｏｌ／ｌの、二価金属イオンに対するキレーター、及び０．５ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌのＣａ²⁺又は０．５ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌのＭｇ²⁺を含有し（キレーター：Ｃａ²⁺及びキレーター：Ｍｇ²⁺のモル比はそれぞれ、１：２〜１：２０の範囲にある）、並びに／或いは
ｃ）第二試薬溶液（Ｒ２）は、ロイコ染料、このロイコ染料の安定化のためのある割合の一般式（Ｉ）の化合物、及び／又はロイコ染料の安定化のためのある割合の少なくとも１種のチオ化合物を含有する。

ＨｂＡ１ｃの定量的決定が、検出反応で形成される過酸化水素に基づいて最終的に行われる実施形態では、上記試薬溶液の少なくとも１つがペルオキシダーゼを含有し、少なくとも他の試薬溶液がロイコ染料を含有する。これらの実施形態では、試薬溶液の１つが例えばＮＥＭのようなＳＨ基捕捉剤も選択的に含有する。ここで、ＳＨ基捕捉剤は、ロイコ染料を含有していない１つの試薬溶液に含有される。

本発明の特別の実施形態では、試薬キットは、以下の成分を有する３つの試溶液を備える：
−溶血作用洗剤と、２−（メタクリロイルオキシエチル）−２−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートポリマー、ホスファチジルコリン又はこれらの混合物と、上記必要量のＦｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＺｎ²⁺から選択される金属イオンを調製するための金属塩と、例えばＮＥＭのようなＳＨ基捕捉剤とを含有する溶血溶液、
−ＦＰＯＸ又はＦＡＯＸとペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）とを含有する第一試薬溶液（Ｒ１）、及び
−糖化ヘモグロビンのβ鎖のアミノ末端からフルクトシル−バリン−ヒスチジン又はフルクトシル−バリンを放出させるタンパク質分解活性を有するプロテアーゼと、それぞれ上記必要量のＣａ²⁺塩又はＭｇ²⁺塩及び二価金属イオンのキレーターと、ロイコ染料と、ロイコ染料の安定化のための一般式（Ｉ）の化合物及び／又はロイコ染料の安定化のためのチオ化合物とを含有する第二試薬溶液（Ｒ２）。

当初の開示目的のため、当業者であれば、本明細書、図面及び請求項からわかる全ての特徴は、他のある特徴との関連でのみ専門的な用語で説明されていても、本明細書に開示した他の特徴又は特徴群と個々に組み合わせることも任意の組み合わせで組み合わせることもできることを指摘する。ただし、明示的に除外されている場合、技術的にこのような組み合わせが不可能若しくは無意味である場合はこの限りではない。全ての考え得る特徴の組み合わせの包括的で明示的な代表例はここでは省略するが、このことは単に説明の簡潔さ及び読みやすさのためである。

更に、以下の実施例による実施形態が、本発明の例として設計される本発明の可能な実施形態の例とする説明にのみ資することは当業者にとって自明であることを指摘しておく。従って、当業者であれば、請求項に記載されたような本発明に係る特徴又は特徴の組み合わせを有する他の全ての実施形態も、本発明の保護の範囲内にあることが容易に理解されよう。全ての考え得る実施形態の包括的で明示的な代表例はここでは省略するが、このことは単に説明の簡潔さ及び読みやすさのためである。

１．プロテアーゼの安定化
ａ）プロテアーゼの安定化、ＳＤＳゲル電気泳動による分析：
プロテアーゼテルモリシンを液体として又は試薬中に２〜８℃で又はより高温で保存すると、時間の経過と共に自己タンパク質分解によって分解する傾向が強い。これにより、長期間品質の均一性が求められる安定した液状試薬としてのプロテアーゼの使用が制限される。プロテアーゼテルモリシンはＺｎ²⁺に依存しており、本発明者らは、キレーターによってプロテアーゼを不活性化すると同時にＣａ²⁺依存的な構造の安定化によってテルモリシン及び関連する金属プロテアーゼを臨床化学診断においてより活用できることを示すことができた。

プロテアーゼの安定化可能性を証明するために、異なる量又は比のキレーター及びＣａ²⁺を、プロテアーゼテルモリシンを含有した試薬ベースマトリクスに導入した。今回試薬２に使用されたＥＤＴＡ及びカルシウムの濃度を、以下の表１に示す。

この結果得られたバッチ（上記表を参照）を分けて、それぞれ４℃及び３７℃で７日間保存した。これらのバッチからそれぞれ同量のサンプルを取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで使用するバッファーと混合し、タンパク質組成物を変性させてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてクマシー染色によって視覚化した（図１参照）。

ゲルの他のバンドと比較してバンド４及び５に、非常に大量のプロテアーゼテルモリシンが明らかに見える。それゆえ、他の組成物よりもこの組成物において、プロテアーゼテルモリシンが、温度とは無関係に自己消化から顕著に良好に保護されている。Ｅ４１１／１３Ｂ番のバッチとの比較によって、自己消化から保護するためにＥＤＴＡの存在が必要不可欠であることが示される。Ｅ４１１／１３Ａ番及びＥ４１１／１３Ｃ番のバッチとＥ４１１／１３Ｂ番のバッチとの比較によって、ある最少量のＥＤＴＡが必要とされること、及びある最少量のカルシウムイオンも存在しなければならないことが示される。

また、以下のデータによって、長期間４℃及び３７℃でそれぞれ保存した場合の特定の組成物のテルモリシン安定化作用が証明される。

ｂ）ＨｂＡ１ｃ試験系におけるプロテアーゼ安定化の分析。
図１に示すタンパク質分析レベルのプロテアーゼの安定化を、例えばＨｂＡ１ｃ試薬マトリクスで実施した。このため、例示プロテアーゼテルモリシンは同量としたが、カルシウムイオン及びＥＤＴＡは様々な組み合わせの濃度で試薬ベースマトリクス２に添加した。これらのバッチをそれぞれ分けて、直接測定（新規）又は試薬２を１１日間２℃〜８℃で保存した（１１日／２℃〜８℃）。また、試薬２を７日間３７℃で保存後更に４日間２℃〜８℃で保存した（７日／３７℃＋４日／２℃〜８℃）。

次いで、これらの対応する試薬ベースマトリクス２を、ＢＭ６０１０ｃ臨床化学分析器系においてそれぞれ同一の溶血溶液及び同一の試薬１と共に測定した。

校正にはダイアシスキャリブレーターＴｒｕＣａｌ ＨｂＡ１ｃネット（製品番号１ ３３５０）を使用した。異なる試薬マトリクス２によるＨｂＡ１ｃ定量において、表２に示す異なる温度にて時間の経過と共に測定及び評価を行い、保存した。ここで、ΔｍＥは、ｍＥで示されるキャリブレーターレベル２のキャリブレーターレベル１に対する差に対応する。

ここで、測定の基礎となる基本的な組成は以下の通りである。個々の試験において、以下に示す表に特定されたように個々の成分（酢酸カルシウム／ＥＴＤＡ）を変化させた：

溶血溶液：
グリシン、６０ｍｏｌ／ｌ
Ｎ−エチルマレイミド、７．５ｍｍｏｌ／ｌ
２−（メタクリロイルオキシエチル）−２'−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートポリマー、５０ｇ／Ｌ
塩化亜鉛、１２００μｍｏｌ／Ｌ
ｐＨ値、２．５

試薬溶液１：
ビストリス（ＢＩＳ−ＴＲＩＳ）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ、０．８ｋＵ／Ｌ超
ＰＯＤ、５０ｋＵ／Ｌ超
ｐＨ値、７．２

試薬溶液２：
酢酸ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／ｌ
ＮａＣｌ、１００ｍｍｏｌ／ｌ
酢酸カルシウム、濃度については表２参照
ＴＣＥＰ、０．１ｍｍｏｌ／ｌ
ＤＡ−６７、０．０８ｍｍｏｌ／ｌ
Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ／ＥＤＴＡ、濃度については表２参照
プロテアーゼ（テルモリシン）、１０００Ｕ／ｍｌ
ｐＨ値、５．０

ここで、測定の基礎となる使用態様は以下の通りである：
試薬１： ９０μＬ
試薬２： ３０μＬ
溶血サンプル： １５μＬ
溶血工程： ５μＬサンプル＋１００μＬ溶血溶液
波長（ＨｂＡ１ｃ定量）： ６５８ｎｍ（主）／８０５ｎｍ（副）
測定サイクル： ２２／２３〜４１／４２

表２Ａ）から、亜鉛イオンの非存在下では、カルシウムイオン及びＥＤＴＡの濃度とは無関係にＨｂＡ１ｃ定量はできないことが推察される。異なる保存条件におけるレベル１及びレベル２のシグナルの違いは、２つのキャリブレーターの異なるヘモグロビン濃度に起因する。

これに対して、表２Ｂ）は、カルシウムイオンとＥＤＴＡとの比が異なる場合の亜鉛イオンの存在下でのテルモリシンの機能性を示す。表２Ｃ）は、異なる保存条件下における個々のキャリブレーターのΔｍＥの喪失を示す。６ｍｍｏｌ／ｌのカルシウムイオンが存在したバッチでは両者とも、０．５ｍｍｏｌ／ｌのカルシウムイオンが存在したバッチとは対照的に、シグナル喪失が顕著に小さい。

具体的には、７日／３７℃＋４日／２℃〜８℃の保存条件において、ＥＤＴＡ濃度が同じでも、２つのカルシウム濃度の差は有意である。ここで示された結果は、印象深いことに、様々な温度及び時間における、液体試薬マトリクス中での、不活性化して構造的に安定したテルモリシンの保存性、並びにその再活性化を証明する。

２．アンフォールドヘモグロビンの安定化
前述のヘモグロビンの効率的なアンフォールディング及びこのアンフォールド形態の安定化も、ヘモグロビン（Ｈｂ）及びＨｂＡ１ｃの正確な測定に極めて重要である。溶血洗剤による溶血においてアンフォールドヘモグロビンを安定化させるために、例えば２−（メタクリロイルオキシエチル）−２'−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートポリマーを例として以下の試験において溶血溶液ベースマトリクスに添加した。ここでは、ｐＨ値を１〜３の範囲に設定した。

添加剤を添加又は添加していない様々な溶血溶液の変形例を、同一の試薬１及び試薬２を用いて（１ｂで特定したような試薬組成物を使用した）日立９１２形臨床化学分析器で測定した。表に記載されているように対応させて修正した。溶血液の安定性を評価するために、溶血液を手動で生成し（５０μＬの全血液サンプル＋１０００μＬの溶血溶液（添加剤である２−（メタクリロイルオキシエチル）−２'−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートポリマーは有り又は無し）、直接測定した。次いで、溶血液を装置内で１５℃〜２５℃の開放状態で保存し、溶血液の生成後最長２４０分まで様々な時点において測定した。そして、ＨｂＡ１ｃ定量シグナルを分析器で２４０分の期間にわたって測定し、それぞれ新たに確認されたＨｂＡ１ｃ値と関連付けした。ここで、以下の使用態様を日立９１２形による測定の基礎とした：
試薬１： ２４０μＬ
試薬３： ８０μＬ
溶血サンプル： ４０μＬ
波長（ＨｂＡ１ｃ定量）： ６６０ｎｍ（主）／８００ｎｍ（副）
測定サイクル： １８〜３１

図２ａ〜ｄに示す結果には、図２ａ〜ｄの２−（メタクリロイルオキシエチル）−２'−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートポリマーのない（添加せず）サンプルと比較して、２−（メタクリロイルオキシエチル）−２'−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートポリマーのある（添加した）様々なサンプル原料の安定性が顕著に向上したことが示されている。詳細には、以下のバッチの結果を図２に示す：
図２ａ）添加しない場合のＴｒｕＣａｌ ＨｂＡ１ｃレベル１
図２ｂ）添加した場合のＴｒｕＣａｌ ＨｂＡ１ｃレベル１
図２ｃ）添加しない場合の低ＨｂＡ１ｃ、中ヘモグロビン
図２ｄ）添加した場合の低ＨｂＡ１ｃ、中ヘモグロビン

図示した結果から、上記条件下で溶血溶液に２−（メタクリロイルオキシエチル）−２'−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートポリマーを添加すると、各新たに測定されたＨｂＡ１ｃ定量の１０％限界線（破線＋／−１０％）で特定されるヘモグロビン分子の安定化が顕著に改善することが明らかに示された。

３．ホスフィンによるロイコ染料の安定化
試薬マトリクス中のロイコ染料の安定性を改善するため、様々な水溶性安定物質をこれらのロイコ染料安定化作用について確認した。ここで、安定化添加剤のない試薬組成物をネガティブ対照とした。また、１，３，５−トリアザ−７−ホスファアダマンタンが構造的要件を満たさないため、この物質をコントロール物質とした。

以下の試薬調製物を例として生成した：
２０ｍＭ ビストリスバッファー（ＢＩＳ−ＴＲＩＳ：ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン）
２０ｍＭ 酢酸Ｎａ
１００ｍＭ ＮａＣｌ
６ｍＭ 酢酸Ｃａ
１５ｇ／Ｌ トリトンＸ ４０５（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ ４０５）
０．０８ｍＭ ＤＡ６７（ロイコ染料）
１０００Ｕ／ｍｌ テルモリシン
１ｍＭ ＥＤＴＡ

ここで、同濃度の異なる安定化剤を、上述の安定化剤のない試薬ベースマトリクスに添加した。ここで、安定化物質のないアリコートを対照とした。

各試薬組成物の６６０ｎｍにおける固有の吸収について、光度計を使用してそれぞれ測定した。各組成物について、開始直後（新規）及び４日間３７℃で保存後に測定した（ローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）測定）。ここで、６６０ｎｍの吸光度の経時的増加は、染料のロイコ形態からその発色体への変換の目安となり、従って、ロイコ形態の酸化による不安定化の目安となる。
上記特定条件下で、表３に示す結果が得られた。

４．チオ化合物によるロイコ染料の安定化
複数のチオ化合物をこれらの染料安定化作用について確認した。このため、ロイコ染料ＤＡ６７を含有する試薬溶液（マトリクス：ＮａＣｌ、酢酸Ｃａ、トリトンＸ ４０５＋テルモリシン、この点において、組成３参照）の固有の発色を、２℃〜８℃及び３７℃で保存後調べた。この場合の２℃〜８℃での保存について、表４に示す結果が得られた。

３７℃での保存について、表５に示す結果が得られた。

５．チオ化合物と併用したＴＣＥＰによるロイコ染料の安定化
ＴＣＥＰと併用した複数のチオ化合物をこれらの染料安定化作用について確認した。このため、ロイコ染料ＤＡ６７を含有する試薬溶液（マトリクス：バッファーＮａＣｌ、酢酸Ｃａ、トリトンＸ ４０５＋テルモリシン、この点において、組成３参照）の固有の発色を、２℃〜８℃及び３７℃で保存後調べた。この場合の２℃〜８℃での保存について、表６ａ及び６ｂに示す結果が得られた。

３７℃での保存について、表７ａ及び７ｂに示す結果が得られた。

６．チオジグリコール単独又はＴＣＥＰを併用した場合のシグナル安定化効果
チオグリコール単独又はＴＣＥＰを併用した存在下でＨｂＡ１ｃ校正シグナルを調べた。

試薬２ベースマトリクス（１ｂで特定したような試薬組成物を使用し、表に記載されているように対応させて修正した）を、１０ｇ／Ｌのβ−チオジグリコールと混合した。このベースマトリクスの一部をそれぞれ異なる濃度のＴＣＥＰと混合した。

これらの試薬２変形例をそれぞれ異なる溶血溶液及び試薬１と共に、ＢＭ６０１０ｃで測定した。このため、目的に応じたダイアシスキャリブレーターＴｒｕＣａｌ ＨｂＡ１ｃネット（製品番号１ ３３５０）を使用した。そして、各ＨｂＡ１ｃ定量の測定及び評価を行った。

ＢＭ６０１０ｃ測定の基礎となる使用態様は、この場合、以下の通りである：
試薬１： ９０μＬ
試薬３： ３０μＬ
溶血サンプル： １５μＬ
溶血工程： ５μＬサンプル＋１００μＬ溶血溶液
波長（ＨｂＡ１ｃ定量）： ６５８ｎｍ（主）／８０５ｎｍ（副）
測定サイクル： ２２／２３〜４１／４２
ここで、表８に示す結果が得られた。

７日／２℃〜８℃及び７日／３７℃のＨｂＡ１ｃ定量において、チオジグリコールのみが使用されたときシグナルが低下したことは明らかである。他方で、示された結果は、異なるＴＣＥＰ濃度におけるＴＣＥＰとチオジグリコールとが併用できることを明確に証明している。

Ｈ 溶血溶液
Ｒ１ 第一試薬溶液
Ｒ２ 第二試薬溶液

Claims (15)

1. サンプル中の糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）量を決定する方法において、以下の方法工程：
   ａ）サンプル中の赤血球を溶血して、そこに含まれているＨｂＡ１ｃを放出させ、
   ｂ）方法工程ａ）で放出させたＨｂＡ１ｃを、糖化ヘモグロビン分解物を生成するためのタンパク質分解剤に接触させ、
   ｃ）方法工程ｂ）で生成された糖化ヘモグロビン分解物を定量化することによってＨｂＡ１ｃ量を決定する
   が実施される方法であって、
   前記方法工程ｂ）で使用されるタンパク質分解剤は、少なくとも２つの異なる溶液を方法工程ａ）で放出させたＨｂＡ１ｃに接触させるように製造され、
   前記溶液の１つは、１〜８の範囲にあるｐＨ値を有し、且つ、
   ｉ）プロテアーゼ、
   ｉｉ）プロテアーゼ１０００ｋＵ／ｌ当り０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜２ｍｍｏｌ／ｌの、二価金属イオンに対するキレーター、及び
   ｉｉｉ）０．５ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌのＣａ²⁺又は０．５ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌのＭｇ²⁺
   を含有し、
   キレーター：Ｃａ²⁺又はキレーター：Ｍｇ²⁺のモル比は、１：２〜１：２０の範囲にあり、
   他の前記溶液は、Ｆｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＺｎ²⁺から選択される二価金属イオンを１００μｍｏｌ／ｌ〜５０００μｍｏｌ／ｌ含有する
   ことを特徴とする方法。
2. 前記Ｆｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＺｎ²⁺から選択される二価金属イオンを１００μｍｏｌ／ｌ〜５０００μｍｏｌ／ｌ含有する溶液が、溶血作用洗剤を含有し、方法工程ａ）でサンプルに添加される溶血溶液である、
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 方法工程ａ）の前記溶血が、溶血溶液（Ｈ）を添加することによって行われ、
   該溶血溶液は、溶血作用洗剤及び２−（メタクリロイルオキシエチル）−２'−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートポリマー、ホスファチジルコリン又はこれらの混合物を有し、且つ、１〜３の範囲にあるｐＨ値を有する
   ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
4. 方法工程ｃ）で行われる糖化ヘモグロビン分解物の定量化は、この分解物をフルクトシルペプチドオキシダーゼ又はフルクトシルアミノ酸オキシダーゼによって酸化させて過酸化水素を生成し、生じた過酸化水素の量を決定することによって行われ、
   過酸化水素の量は、ペルオキシダーゼ存在下のロイコ染料の発色反応から定量化され、
   該ロイコ染料は、この染料の安定化のための一般式（Ｉ）の化合物を含有する溶液内に調製されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
   

   

   （式中、Ｐはリン原子を示し、Ｘ₁、Ｘ₂及びＸ₃はそれぞれ独立して、置換又は無置換の直鎖又は分枝鎖Ｃ₁〜Ｃ₈アルキル残基、置換又は無置換のシクロヘキシル残基、及び置換又は無置換のフェニル残基から選択される。）
5. 前記ロイコ染料を含有する溶液が、この染料の安定化のために少なくとも１種のチオ化合物を含有することを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 前記少なくとも１種のチオ化合物が、チオジグリコール、チオリンゴ酸、チオニコチンアミド、チオＮＡＤ及びこれらの混合物から選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
7. 方法工程ｃ）でＨｂＡ１ｃ量決定作業を行う前に、ＳＨ基捕捉剤を反応混合物に添加することを特徴とする請求項５及び６のいずれか一項に記載の方法。
8. 全ヘモグロビン濃度を決定する作業を、方法工程ａ）〜ｃ）の際又はこれらの方法工程間に行うことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. サンプル中の糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）量を決定する方法に使用される試薬キットにおいて、
   該試薬キットが、少なくとも２つの異なる溶液を別個の容器に備え、
   前記溶液の１つは、１〜８の範囲にあるｐＨ値を有し、且つ、プロテアーゼと、プロテアーゼ１０００ｋＵ／ｌ当り０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜２ｍｍｏｌ／ｌの、二価金属イオンに対するキレーターと、０．５ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌのＣａ²⁺又は０．５ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌのＭｇ²⁺とを含有し、
   キレーター：Ｃａ²⁺又はキレーター：Ｍｇ²⁺のモル比は、１：２〜１：２０の範囲にあり、
   他の前記溶液は、Ｆｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＺｎ²⁺から選択される二価金属イオンを１００μｍｏｌ／ｌ〜５０００μｍｏｌ／ｌ含有する
   ことを特徴とする試薬キット。
10. 少なくとも以下の溶液を別個の容器に備えることを特徴とする請求項９に記載の試薬キット。
    −溶血作用洗剤と、Ｆｅ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＺｎ²⁺から選択される二価金属イオンを１００μｍｏｌ／ｌ〜５０００μｍｏｌ／ｌ含有する溶血溶液（Ｈ）、
    −フルクトシルペプチドオキシダーゼ又はフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと、ペルオキシダーゼとを含有する第一試薬溶液（Ｒ１）、及び
    −プロテアーゼと、プロテアーゼ１０００ｋＵ／ｌ当り０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜２ｍｍｏｌ／ｌの、二価金属イオンに対するキレーターと、０．５ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌのＣａ²⁺又は０．５ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌのＭｇ²⁺と、ロイコ染料とを更に含有し、キレーター：Ｃａ²⁺及びキレーター：Ｍｇ²⁺のモル比が、１：２〜１：２０の範囲にある第二試薬溶液（Ｒ２）
11. 前記溶液（Ｈ）が、溶血作用洗剤及び２−（メタクリロイルオキシエチル）−２'−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートポリマー、ホスファチジルコリン又はこれらの混合物を含有し、且つ、１〜３の範囲にあるｐＨ値を有する溶血溶液であることを特徴とする請求項９及び１０のいずれか一項に記載の試薬キット。
12. 前記溶液（Ｒ２）が、染料の安定化のために少なくとも１種の一般式（Ｉ）の化合物を含有することを特徴とする請求項１０及び１１のいずれか一項に記載の試薬キット。
    

    

    （式中、Ｐはリン原子を示し、Ｘ₁、Ｘ₂及びＸ₃はそれぞれ独立して、置換又は無置換の直鎖又は分枝鎖Ｃ₁〜Ｃ₈アルキル残基、置換又は無置換のシクロヘキシル残基、及び置換又は無置換のフェニル残基から選択される。）
13. 前記溶液（Ｒ２）が、ロイコ染料を安定化するために少なくとも１種のチオ化合物を含有し、
    該少なくとも１種のチオ化合物は、好ましくはチオジグリコール、チオリンゴ酸、チオニコチンアミド、チオＮＡＤ及びこれらの混合物から選択される
    ことを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の試薬キット。
14. 前記溶液（Ｒ１）がＳＨ基捕捉剤を含有し、
    該ＳＨ基捕捉剤は、好ましくはＮ−エチルマレイミドである
    ことを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の試薬キット。
15. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法に使用されることを特徴とする請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の試薬キット。

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