JP2017518295A - ナノ粒子 - Google Patents

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Abstract

本発明は、１０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲のナノ粒子サイズ分布において最大値である直径を有するナノ粒子であって、ａ）リン酸カルシウムナノ粒子コアａ）、ｂ）リン酸カルシウムナノ粒子コアａ）上の活性成分コーティングｂ）、ｃ）活性成分コーティングｂ）上の乳酸ポリマーコーティングｃ）、ｄ）ポリエチレン−イミン、キトサン及び１４〜３０個のアミノ酸の長さを有するヒトラクトフェリン由来ペプチドの群から選択される乳酸ポリマーコーティングｃ）上のカチオン性ポリマーコーティングｄ）を含む、前記ナノ粒子に言及する。

Description

発明の属する技術分野
本出願は、活性成分を生きた哺乳動物細胞に送達するための、リン酸カルシウム−乳酸ポリマー−ナノ粒子、それぞれの複合ナノ粒子に関する。
技術的な背景
乳酸ポリマー、例えばポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー（ＰＬＧＡ）は、生分解性ポリマーであり、例えば欧州特許第１４６８０３５号明細書（EP1468035）、米国特許第６７０６８５４号明細書（US6706854）、国際公開第２００７／００９９１９号（WO2007/009919A2）、欧州特許出願公開第１９０７０２３号明細書（EP1907023A）、欧州特許出願公開第２２６３７０７号明細書（EP2263707A）、欧州特許第２１４７０３６号明細書（EP2147036）、欧州特許第０４２７１８５号明細書（EP0427185）又は米国特許第５６１０２６６号明細書（US5610266）からよく知られている。
米国特許出願公開第２００５／００５３５９０号明細書（US 2005/0053590A1）は、内皮機能障害を回復させるための内皮標的ナノ粒子を記載している。細胞機能障害を改善する方法は、内皮細胞及び核酸に特異的に結合する標的リガンドを含む機能不全内皮細胞を特異的に標的とする組成物を提供する工程、及び前記組成物を、細胞内テトラヒドロビオプテリン濃度を上昇させる条件下で細胞に送達する工程を含む。本組成物は、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）又はそこに記載された異なるナノ粒子タイプの組み合わせから配合されたリン酸カルシウムナノ粒子及び生分解性ナノ粒子を含む適切なタイプのナノ粒子の長いリストから選択されるナノ粒子を更に含み得る。
国際公開第２００７／０４８５９９号（WO 2007/048599）は、生物学的障壁を通って輸送するための少なくとも１つのシグナル物質と少なくとも１つの活性成分が含まれ、ここで担体、シグナル物質及び活性成分が互いに共有結合を示さないことを特徴とする、ポリマー担体に基づく粒状薬物送達システムを記載している。シグナル物質（細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ））は、ラクトフェリン又はラクトフェリン由来のペプチドである。
特に好ましい実施態様では、以下のアミノ酸配列：
ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲ（配列番号１（＝国際公開第２００７／０４８５９９号（WO 2007/048599）中では配列番号３））、
ＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣ（配列番号２（＝国際公開第２００７／０４８５９９号（WO2007/048599）中では配列番号４））、
ＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳ（配列番号３（＝国際公開第２００７／０４８５９９号（WO 2007/048599）中では配列番号５））、
ＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲ（配列番号４（＝国際公開第２００７／０４８５９９号（WO 2007/048599）中では配列番号６））、
ＫＣＲＲＷＱＷＲＭＫＫＬＧＡＰＳＩＴＣＶＲＲ（配列番号５（＝国際公開第２００７／０４８５９９号（WO 2007/048599）中では配列番号２９））及び
ＣＲＲＷＱＷＲＭＫＫＬＧＡＰＳＩＴＣ（配列番号６（＝国際公開第２００７／０４８５９９号（WO 2007/048599）中では配列番号３０））
を有するシグナルペプチド
又はその誘導体。
好ましい実施態様では、国際公開第２００７／０４８５９９号（WO 2007/048599）の細胞浸透性ペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号２９又は配列番号３０あるいは少なくとも４０％の同一性、好ましくは少なくとも５０％の同一性、特に好ましくは７５％を上回る同一性又はより良く９０％を上回る同一性を有する対応する配列において、国際公開第２００７／０４８５９９号（WO 2007/048599）に示されるようなアミノ酸配列を含んでいる。
国際公開第２００７／０７６９０４号（WO 2007/076904A1）は、ヒトラクトフェリンタンパク質又はウシラクトフェリンタンパク質のうち少なくとも８個の連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチドを記載しており、それによってペプチドは細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）として作用するのに適している。国際公開第２００７／０７６９０４号（WO 2007/076904A1）及び国際公開第２００７／０４８５９９号（WO 2007/048599）に記載されているペプチドの多くは同一である。
実施例において最良の効果を有する最も有望な細胞浸透性ペプチドは、ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲ（＝国際公開第２００７／０４８５９９号（WO 2007/048599）及び国際公開第２００７／０７６９０４号（WO 2007/076904A1）における配列番号３）である。
ラクトフェリン由来の細胞浸透性ペプチドは、カーゴ分子の輸送を可能にすることが意図されており、これらの分子はワクチン接種のためのＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド又は抗原などの活性医薬成分であり、生物学的膜を介して経口摂取され、従ってヒト又は動物の生物におけるこれらの分子の効率的な取り込みを可能にする。
国際公開第２０１４／１４１２８８号（WO2014/141288A1）（国際公開日：２０１４年９月１８日）には、放射能、ラマン散乱、近赤外（ＮＩＲ）蛍光、パラ又は超常磁性及びＸ線吸収などの多機能性を示すナノマテリアルが記載されている。多機能ナノ造影剤は、球形又は非球形であり、１ｎｍ〜２００ｎｍのサイズを有し、且つ静脈内、筋肉内又は経口で送達することができる。ナノ材料はリン酸カルシウムナノ粒子に基づくものである。ナノ粒子は、ビスホスホネート、化学薬品、抗癌遺伝子治療薬、ＲＮＡ断片（ｓｉＲＮＡ、ｍｉ−ＲＮＡ）、感光薬、小分子阻害薬、抗生物質などの薬物分子を結合又は装填し得る多機能ナノ造影剤として機能する。リン酸カルシウムナノ粒子は、薬物を含有する生分解性ポリマーのポリマーシェルに配合され得る。生分解性ポリマーは、特にポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、キトサン又はカルボキシメチルキトサンであり得る。ナノ粒子は、その表面で、葉酸、抗体、ペプチド、アプタマー又は炭水化物などの標的リガンドと結合され得る。クエン酸塩などのキャッピング剤、ＰＥＧ、ポリエチレンイミン、ビホスホネートなどのポリマーが添加され得る。
Norihiro Watanabeらは、“Transgenic Expression of a Novel Immunosuppressive Signal Converter on T-cells”, Molecular Therapy, 第21巻, 2013-05-01, p. s153-S153, (XP055131645)を記載している。
Ping Zengらは、”Chitosan-modified poly/,-lactide-co-glycolide) nanospheres for plasmid DNA delivery and HBV gene silencing”, International Journal of Pharmaceutics, Elsevier BV, NL, 第415巻, 2011-05-20, 259〜266頁 (XP028099873, ISSN: 0378-5173)を記載している。Ping Zengらは、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）送達のためにポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を用いて配合されたナノ粒子を記載している。Jie Tangらは、Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (2): 298 - 304に、コア／シェル（ＣＳ）構造においてポリ（ラクチド−コ−グリコリド）−コポリマー（ＰＬＧＡ）にカプセル化されたリン酸カルシウム−ｐＤＮＡナノ粒子（ｐＤＮＡ−ＣａＰｉ）の調製及びインビトロ評価を記載している。コア／シェル構造粒子（ＣＳ−ｐＤＮＡ−ＣａＰｉ−ＰＬＧＡ−ＮＰｓ）を、組み込まれたＣａＰｉ修飾ＰＬＧＡナノ粒子（組み込まれたｐＤＮＡ−ＣａＰｉ−ＰＬＧＡ−ＮＰ）と比較する。コア／シェル構造ナノ粒子（ＣＳ−ｐＤＮＡ−ＣａＰｉ−ＰＬＧＡ−ＮＰｓ）は、球形であり、１５５±４．５ｎｍの平均粒子径、−０．３８±０．１ｍＶのゼータ電位、８０．５６±２．５％の捕捉効率及び１．１６±０．０４％の負荷効率を有する。コア／シェル構造の粒子は、放出培地中で安定であり、ヌクレアーゼ分解からｐＤＮＡを保護することができた。それらもインビトロでｐＤＮＡの徐放性を示した。インビトロでのＣＳ−ｐＤＮＡ−ＣａＰｉ−ＰＬＧＡ−ＮＰｓの最高遺伝子トランスフェクション効率は、７２時間のトランスフェクション後に（２４．６６±０．４６）％に到達し、これは遊離ｐＤＮＡ［（０．３３±０．０４）％、Ｐ＜０．０１］及びｐＤＮＡ−ＰＬＧＡ−ＮＰｓ［（１．５±０．０７）％、Ｐ＜０．０１］よりも有意に高かった。トランスフェクションは組み込まれたｐＤＮＡ−ＣａＰｉ−ＰＬＧＡ−ＮＰｓよりも長時間続き、細胞毒性はポリエチレン−イミン（ＰＥＩ）よりも有意に低かった。従ってＣＳ−ｐＤＮＡ−ＣａＰｉ−ＰＬＧＡ−ＮＰｓは有望な非ウイルス遺伝子ベクターであると考えられている。
Jie Tangら：“Calcium phosphate embedded PLGA nanoparticles: A promising gene delivery vector with high gene loading and transfection efficiency”, International Journal of Phramaceutics, Elsevier BV, NL, 第431巻, 2012-04-17, 210〜221頁 (XP028503199, ISSN: 0378-5173)。Jie Tangらは、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）−コポリマー（ＰＬＧＡ）に封入されたリン酸カルシウム−ｐＤＮＡナノ粒子（ｐＤＮＡ−ＣａＰｉ）の調製及びインビトロ評価を記載している。これらのナノ粒子のヒト胚腎臓細胞へのトランスフェクション効率は、ｐＤＮＡが充填されたＰＬＧＡナノ粒子又はＣａＰｉ−ｐＤＮＡが組み込まれたＰＬＧＡ微粒子よりもずっと高いことが判明した。
Mingzehn Zangら：Nano-structured composites based on calcium phosphatefor cellular delivery of therapeutic and diagnostic agents”, Nano today, 第4巻, 第6号, 2009-12-01, 508〜517頁 (XP055153407; ISSN: 1748-0132)。特にｓｉＲＮＡなどの核酸のためのＰＥＧ化リン酸カルシウム送達システムに重点を置いたナノ構造のリン酸カルシウム複合体の使用が記載されている。
課題と解決策
Tang J.らは、Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (2): 298〜304頁において、コア／シェル（ＣＳ）構造においてポリ（ラクチド−コ−グリコシド）コポリマー（ＰＬＧＡ）にカプセル化されたリン酸カルシウム−ｐＤＮＡナノ粒子（ｐＤＮＡ−ＣａＰｉ−ＮＰ）の調製及びインビトロ評価を記載している。ＣＳ−ｐＤＮＡ−ＣａＰｉ−ＰＬＧＡナノ粒子は、有望な非ウイルス遺伝子ベクターであると考えられている。
本発明の課題は、活性成分、特にペプチドタンパク質又は核酸の生細胞への促進された送達のためのベクターを得るために、ＣＳ−ｐＤＮＡ−ＣａＰｉ−ＰＬＧＡ−ＮＰｓの送達伝達効率を改善することであった。もう一つの課題は、ｓｉＲＮＡを介した遺伝子サイレンシング効率を高めることであった。同時に、送達ベクターの毒性を高めるべきではない。
この課題は、特許請求されている成分ａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）から組み合わされ、従って「複合ナノ粒子」とも呼ばれ、１０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲のナノ粒子サイズ分布において最大値である直径を有するナノ粒子であって、
ａ）リン酸カルシウムナノ粒子コアａ）、
ｂ）リン酸カルシウムナノ粒子コアａ）上の活性成分コーティングｂ）、
ｃ）活性成分コーティングｂ）上の乳酸ポリマーコーティングｃ）、
ｄ）ポリエチレン−イミン、キトサン及び１４〜３０個のアミノ酸の長さを有するヒトラクトフェリン由来ペプチドの群から選択される乳酸ポリマーコーティングｃ）上のカチオン性ポリマーコーティングｄ）、
を含む、前記ナノ粒子によって解決された。
詳細な説明
ナノ粒子（複合ナノ粒子）
本発明のナノ粒子は、特許請求されている成分ａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）から組み合わされ、従って「複合ナノ粒子」と呼ばれ得る。本発明のナノ粒子は、球形であり得る。ナノ粒子は、１０ｎｍ〜６００ｎｍ、２０ｎｍ〜５００ｎｍ、５０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲の平均直径を有し、それによって平均直径は好ましくは動的光散乱法（ＤＬＳ、強度％）によって決定される。ナノ粒子は、１０ｎｍ〜３００ｎｍ、２０ｎｍ〜２５０ｎｍ、８０ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲のナノ粒子サイズ分布（ピーク値）において最大値である直径を有し、それによってナノ粒子サイズ分布の最大値は好ましくは動的光散乱法（ＤＬＳ、数値）によって決定される。ナノ粒子の多分散指数（ＤＬＳ）は、０〜０．８、０．０５〜０．７、０．１〜０．７、０．３〜０．７の範囲にあり得る。
リン酸カルシウムナノ粒子コアａ）
本発明のナノ粒子は、活性成分ｂ）がその上にコーティングされたリン酸カルシウムナノ粒子コアａ）を含む。活性成分ｂ）がその上にコーティングされたリン酸カルシウムナノ粒子コアａ）は、１０ｎｍ〜４００ｎｍ、２０ｎｍ〜３００ｎｍ、５０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。平均直径は、好ましくは動的光散乱法（ＤＬＳ）によって決定される。活性成分ｂ）がその上にコーティングされたリン酸カルシウムナノ粒子コアａ）の多分散指数は、０〜０．７、０．０５〜０．７、０．１〜０．７、０．３〜０．７の範囲であり得る。
活性成分コーティングｂ）
本発明のナノ粒子は、活性成分がリン酸カルシウムナノ粒子ａ）上にコーティングされた活性成分コーティングｂ）を含む。活性成分コーティングは、活性成分を含むか又は活性成分からなるコーティングである。「コーティングされた」とは、リン酸カルシウムナノ粒子の「表面に結びつく」又は「表面に結合する」という意味も有し得る。リン酸カルシウムナノ粒子ａ）は、好ましくはリン酸カルシウムナノ粒子の凝集又は更なる成長を防止する活性成分のコーティング層によって安定化され得る。コーティング又はコーティング層は、リン酸カルシウムナノ粒子の表面にイオン間相互作用又は静電相互作用によって付着される。
活性成分コーティングｂ）を有するリン酸カルシウムナノ粒子コアａ）は、カルシウムイオン及びリン酸イオンを含む水溶液と、好ましくは活性成分を添加した水溶液とを、少なくとも１秒、好ましくは１秒〜５秒又は１秒〜６０秒の滞留（核形成）時間にわたり混合することによって調製され得る。滞留時間の後又はその間に、活性成分がそこにコーティングされたリン酸カルシウムナノ粒子が、沈殿プロセスの過程で又はその後に形成される。
本出願の意味における活性成分とは、治療効果を達成する及び／又は疾患を治療するために、哺乳動物又は人体に送達され得る物質である。好ましくは、活性成分は水溶性である。活性成分は、好ましくはペプチド、タンパク質又は核酸である。
活性成分は、好ましくは、カチオン性ポリマーコーティングｄ）として使用され得るヒトラクトフェリン由来のペプチドとは異なり且つ本発明の意味における活性成分とはみなされないペプチドであり得る。
適切なペプチドの例は、例えば、ヒト成長ホルモンなどのペプチドホルモンである。
適切なタンパク質の例は、例えば、抗体、インターロイキン、インターフェロン、タンパク質ベースのワクチンなどである。
活性成分は、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）などの核酸であり得る。
活性成分はｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）であり得る。
「ｓｉＲＮＡ」との用語は当業者によく知られている。典型的なｓｉＲＮＡは、約１９〜２３塩基対長さの２本鎖ＲＮＡと定義され、その際、１本の鎖は２ヌクレオチドの３’末端で重複し得る。ｓｉＲＮＡは、生細胞内での複製中にウイルスから生成された細胞ｍＲＮＡ又はＲＮＡなどの大きな二本鎖ＲＮＡからの切断産物である。これらのＲＮＡの型は、例えば、ＩＩＩ型ＲＮａｓｅである酵素「Ｄｉｃｅｒ」によってｓｉＲＮＡに切断され得る。ｓｉＲＮＡは転写後遺伝子サイレンシングプロセスにおいて重要な役割を果たす。より長いｓｉＲＮＡ、例えば６０塩基対以上は、発現ベクターによっても合成され得る。従って、ｓｉＲＮＡは、特定の治療効果を達成するために及び／又は特定の疾患を治療するために、活性成分として使用されることに大きな関心が示されている。
乳酸ポリマーコーティングｃ）
本発明のナノ粒子は、それぞれ、リン酸カルシウムナノ粒子コアａ）上に、その上にコーティングされている活性成分ｂ）を有し、活性成分コーティングｂ）上に乳酸ポリマーコーティングｃ）を含む。乳酸ポリマーコーティングは、乳酸ポリマーを含む、本質的に含む又はそれらからなるコーティングである。
活性成分を含むリン酸カルシウムナノ粒子コアａ）は、水中油中水型（Ｗ１／Ｏ／Ｗ２）エマルションの内部水相（Ｗ１）として使用されてよく、ここで乳酸ポリマーコーティングｃ）のための乳酸ポリマーが、超音波処理下で、その上に活性成分ｂ）を有するリン酸カルシウムナノ粒子コアａ）を含有する水相（Ｗ１）に有機溶液中で添加されて油中水型エマルション（Ｗ１／Ｏ）が得られてよく、油中水型エマルション（Ｗ１／Ｏ）が、超音波処理下で過剰の別の水相（Ｗ２）に添加されて水中油中水型エマルション（Ｗ１／Ｏ／Ｗ２）が得られてよく、有機溶媒が除去されて第１の分散液が得られてよく、第１の分散液の固形分が遠心分離又は接線流濾過によって集められてよく、水に再分散され且つ乾燥されて固体粒子が得られてよい。
「乳酸ポリマー」との用語は、重合された乳酸単位又はラクチド単位、好ましくは少なくとも１０質量％、少なくとも２０質量％、少なくとも３０質量％、少なくとも４０質量％、少なくとも５０質量％、少なくとも６０質量％、少なくとも７０質量％又は１００質量％までの重合した乳酸又はラクチド単位を含むポリマー又はコポリマーを意味する。ラクチドは乳酸の環状ジエステルである。ラクチドという用語には、Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、又はＤ，Ｌ−ラクチドが含まれる。ラクチドのポリ乳酸ポリマーへの重合は、開環条件での重縮合によって実施され得る。乳酸又はラクチドとそれぞれ重合され得る適切なコモノマーは、グリコリド、イプシロンカプロラクトン、トリメチレンカーボネート又はジオキサノンである。乳酸ポリマーは、乳酸ポリマーから選択されたＡブロックとポリエチレングリコールポリマーから選択されたＢブロックを含むＡＢ−又はＡＢＡ−ブロックコポリマーも含み得る。
乳酸ポリマーは、好ましくは、以下のａ）〜ｌ）からなる群から選択されるモノマー成分から合成された若しくはモノマー成分の混合物から合成された乳酸ポリマー又はコポリマーから選択され得る：
ａ）Ｄ−及びＬ−ラクチド、
ｂ）Ｌ−ラクチド及びグリコリド、
ｃ）Ｄ，Ｌ−ラクチド及びグリコリド、
ｄ）Ｌ−ラクチド及びイプシロン−カプロラクトン、
ｅ）Ｌ−ラクチド及びジオキサノン、
ｆ）Ｌ−ラクチド及びトリメチレンカーボネート、
ｇ）Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド又はＤ，Ｌ−ラクチド、
ｈ）Ｌ−ラクチド、
ｉ）ＤＬ−ラクチド、
ｊ）Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド又はＤ，Ｌ−ラクチド及びイプシロン−カプロラクトンの統計的に分布したモノマー単位、
ｋ）Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド又はＤ，Ｌ−ラクチド及びジオキサノンの統計的に分布したモノマー単位、
ｌ）Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド又はＤＬ−ラクチド及びトリメチレンカーボネートの統計的に分布したモノマー単位。
これらの種類の「乳酸ポリマー」は生分解性ポリマーであり、例えば、欧州特許第１４６８０３５号明細書（EP1468035）、米国特許第６７０６８５４号明細書（US6706854）、国際公開第２００７／００９９１９号（WO2007/009919A2）、欧州特許出願公開第１９０７０２３号明細書（EP1907023A）、欧州特許出願公開第２２６３７０７号明細書（EP2263707A）、欧州特許第２１４７０３６号明細書（EP2147036）、欧州特許第０４２７１８５号明細書（EP0427185）又は米国特許第５６１０２６６号明細書（US5610266）から当該技術分野でよく知られている。
好ましくは、乳酸ポリマーはラクチド−グリコリドコポリマーである。
好ましくは、乳酸ポリマーは、０．１〜２．０［ｄＬ／ｇ］、０．１２〜１．２［ｄＬ／ｇ］、０．１４〜１．０［ｄＬ／ｇ］、０．１６〜０．４４［ｄＬ／ｇ］、０．１６〜０．２４［ｄＬ／ｇ］の固有粘度ＩＶを有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーである。
好ましい乳酸ポリマーは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーにおいてＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリドの比率が８０：２０〜２０：８０、７０：３０〜３０：７０、６０：４０〜４０：６０又は８０：２０〜６０：４０質量部であり、ここでＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリドの部が合計１００質量部（１００％）であるポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーである。
好ましい乳酸ポリマーは、４５：５５〜５５：４５、好ましくは５０：５０のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比率を有し且つ０．１６〜０．４４［ｄＬ／ｇ］又は０．１６〜０．２４［ｄＬ／ｇ］の範囲の固有粘度ＩＶを有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）−コポリマーであるＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０２（エステル末端基）又はＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０２Ｈ（酸末端基）の型のものである。
乳酸コポリマーの分子量（Ｍｗ）は、１，０００〜１０００，０００ｇ／モルの範囲、好ましくは２，０００〜１００，０００ｇ／モルの範囲、好ましくは３，０００〜２５，０００ｇ／モルの範囲であり得る。分子量（Ｍｗ＝平均重量分子量）を決定するための分析方法は当業者によく知られている。一般に、分子量Ｍｗは、ゲル透過クロマトグラフィー又は光散乱法によって測定することができる（例えば、H.F. Markら、Encyclopedia of Polymer Science and Engineering、第２版、１０巻、１頁以降、J. Wiley、１９８９年を参照のこと）。
乳酸ポリマーは、約３０℃〜約６０℃、約３５℃〜約５５℃のガラス転移温度Ｔｇを特徴とし得る。
乳酸ポリマーは一般に「生体吸収性」であり、これはポリマーが、体液と接触させて人体又は動物の体内に注入又は注射された後に、ゆっくりとした加水分解反応でオリゴマーに分解されることを意味する。乳酸又はグリコール酸などの加水分解最終生成物は、二酸化炭素と水に代謝される。しばしば使用される「生体吸収性ポリエステル」との用語の他の交換可能な表現は、「吸収性ポリエステル」、「生分解性ポリエステル」、又は「吸着性ポリエステル」である。
カチオン性ポリマーコーティングｄ）
複合ナノ粒子は、ポリエチレンイミン、キトサン及び１４個〜３０個のアミノ酸長さを有するヒトラクトフェリン由来のペプチドの群から選択される乳酸ポリマーコーティングｃ）上にカチオン性ポリマーコーティングｄ）を含む。従って、本発明の意味における「カチオン性ポリマーコーティング」とは、１つ以上のカチオン性基、それぞれの１つ以上のカチオン性側基又は特定のｐＨ範囲で、好ましくはｐＨ７．０で又はｐＨ７．０未満でカチオン性（正に荷電）であり得る１つ以上の基若しくは１つ以上の側基を有する、ポリマーによるコーティングを意味する。
その上に活性成分ｂ）がコーティングされたリン酸カルシウムナノ粒子コアａ）及び乳酸ポリマーコーティングｃ）を含む乾燥固体粒子が水に再分散されてよく、またカチオン性ポリマーコーティングｄ）のためのカチオン性ポリマーが、撹拌下で添加され且つ少なくとも１０分間又は１０分〜３０分間インキュベーションされて、複合ナノ粒子を固形分として含む第２の分散液が得られてよい。第２の分散液の固形分が、遠心分離によって集められ、再分散されるか又は乾燥されて、複合ナノ粒子を含む水性分散液又は乾燥調製物が得られてよい。
ポリエチレンイミン
ポリエチレンイミンは生物学的細胞摂取促進機能を示し得るが、このことは活性成分（活性医薬成分（ＡＰＩ））と同時に送達される時に、ポリエチレンイミンが細胞内でのＡＰＩの取り込みを容易にし且つ促進することを意味する。
分子量のより低いポリエチレンイミンは、より良いトランスフェクション効率をもたらし且つより低い細胞毒性を有すると思われる。好ましいポリエチレンイミンは、５，０００〜５０，０００ｇモル−１、２０，０００〜３０，０００ｇモル−１の範囲の分子量（Ｍｗ）を有し得る。
分子量（Ｍｗ＝平均重量分子量）を決定するための分析方法は当業者によく知られている。一般に、分子量Ｍｗは、ゲル透過クロマトグラフィー又は光散乱法によって測定することができる（例えば、H.F. Markら、Encyclopedia of Polymer Science and Engineering、第２版、１０巻、１頁以降、J. Wiley、１９８９年を参照のこと）。
キトサン
キトサンとの用語は、全ての種類のキトサンを含む。キトサンはランダムに分布したβ−（１−４）結合Ｄ−グルコサミンとＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの直鎖多糖類である。キトサンは、アルカリ性水酸化ナトリウムで処理することによってエビ又は他の甲殻類の殻から得てもよい。
適切なキトサンは、好ましくは約２０，０００〜２５０，０００ダルトン、より好ましくは４０，０００〜２００，０００ダルトンの分子量（Ｍｗ）を有する低分子量キトサンであり得る。これは、得られたナノ粒子のサイズがより小さいサイズを対象にし得るという利点を有する。適切なキトサンは、５０〜１００％、好ましくは７０〜９０％の程度までアセチル化され得る。
ヒトラクトフェリン由来ペプチド（ＨＬｆ）。
ヒトラクトフェリン由来ペプチドは、生物学的細胞浸透機能（細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、例えば国際公開第２００７／０４８５９９号（WO 2007/048599）又は国際公開第２００７／０７６９０４号（WO 2007/076904A1））を示し得るが、このことは活性医薬成分（ＡＰＩ）と同時にヒト細胞に送達される時に、ヒトラクトフェリン由来ペプチドが細胞内でのＡＰＩの取り込みを容易にし且つ促進することを意味する。
ヒトラクトフェリン由来ペプチドは、その細胞浸透機能のコードである配列領域内で天然のヒトラクトフェリンタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の類似性を有すると見出されるアミノ酸配列を示し得る。
ヒトラクトフェリン由来ペプチドは、少なくともｐＨ７又はｐＨ７未満でカチオン性になり得る（水性環境で陽性に荷電され得る）側基を有する１つ以上のアミノ酸（例えば、アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ））を含むカチオン性ポリマーである。ヒトラクトフェリン由来ペプチド自体は本発明の意味における活性成分とはみなされていない。
ヒトラクトフェリン由来ペプチドは、１４〜３０個、１９〜３０個、２０〜２５個、２１〜２３個又は２２個のアミノ酸長さを有し得る。好ましくは、ヒトラクトフェリン由来ペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも２個又は２個のシステイン残基を含み得る。
好ましくは、ヒトラクトフェリン由来ペプチドのアミノ酸配列は、内部システイン−システイン架橋（シスチン架橋）を形成し得る少なくとも２つ又は２つのシステイン残基を含み得る。好ましくは、内部シスチン架橋を形成する２つのシステイン残基は酸化型で存在する。
適切なヒトラクトフェリン由来ペプチドは、１４〜３０個、１９〜３０個、２０〜２５個、２１〜２３個、又は２２個のアミノ酸長さを有してよく、且つｐＨ７で又はｐＨ７未満で、陽性に荷電した側鎖を有する少なくとも４個、少なくとも６個、４〜８個、５〜７個又は６個のアミノ酸、好ましくはアルギニン及び／又はリジンを含有し得る。
適切なヒトラクトフェリン由来ペプチドは、１４〜３０個、１９〜３０個、２０〜２５個、２１〜２３個又は２２個のアミノ酸長さを有してよく且つ配列番号１によるアミノ酸配列ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲ又は８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個又は１個を超えるアミノ酸位置が配列番号１の配列と異なっていない配列を含み得る。
「アミノ酸位置が異なる」との用語は、配列番号１の配列と比較して、特定の位置に異なるアミノ酸が存在すること又は特定の位置にアミノ酸が存在しないこと又は配列内に存在するか又は配列に追加された追加のアミノ酸が存在すること又はこれらの場合の組み合わせの意味で理解されている。
最も好ましくは、ヒトラクトフェリン由来ペプチドは、配列番号１の配列と８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個又は１個を超えてアミノ酸位置が異なることはなく、それによって少なくとも２個のシステイン又は２個のシステイン残基が存在し、好ましくは配列番号１の位置２及び位置１９による２つのシステインが存在する。好ましくは、システイン残基は、内部システイン−システイン架橋（シスチン架橋）を形成する酸化型で存在する。
ヒトラクトフェリン由来ペプチドは、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲ又はその配列と少なくとも８０％又は９０％相同である配列を有するペプチドであり得る。好ましくは、配列番号１の位置２及び位置１９のシステイン残基、又は類似の位置若しくはそれに準じる位置のシステイン残基が存在する。
医薬組成物
本出願は、先に説明した複合ナノ粒子であるナノ粒子を含む医薬組成物を更に開示する。
複合ナノ粒子の調製方法
本出願は、本発明のナノ粒子、それぞれの複合ナノ粒子の製造方法を更に開示する。
複合ナノ粒子の製造方法は、好ましくは、リン酸カルシウムナノ粒子コアａ）を、カルシウムイオンを含む水溶液と、リン酸イオンを含む水溶液とを好ましくは少なくとも１秒間又は１〜３秒間、又は１〜６０秒間混合することによって調製し、混合前に、混合中に又は好ましくは混合後に活性成分ｂ）を添加して、活性成分コーティングｂ）を有するリン酸カルシウムナノ粒子コアａ）をもたらすことで実施され得る。カルシウムイオンを含む水溶液は、水溶性カルシウム塩、例えば、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、カルシウム−Ｌ−乳酸塩（Ｃａ（ＣＨ３−ＨＣＯＨ−ＣＯＯ）２）又は硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ３）２）を含む水溶液であり得る。リン酸イオンを含む水溶液は、水溶性リン酸塩、例えば、リン酸水素ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）又はリン酸水素二アンモニウム（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４）を含む水溶液であり得る。
２つの水溶液は、好ましくは長さが５ｍｍ〜２０ｍｍのＹ字型アダプターで最初に一緒にされてよく、ここで、混合溶液は、それらを（例えば、Ｖｏｒｔｅｘ（登録商標）によって）連続的に混合する前に、好ましくは１０〜３０μｌ／秒の流速で、少なくとも１秒又は１〜３秒、又は１〜６０秒の滞留（核生成）時間を有し得る。
好ましくは、カルシウムイオンを含む水溶液はリン酸イオンを含まない。好ましくは、リン酸イオンを含む水溶液は、カルシウムイオンを含まない。
活性成分、好ましくは、水溶性活性成分、例えば、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ又はＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、（低分子干渉ＲＮＡ）は、これらの溶液の混合前に、混合中に又は混合後に、カルシウムイオン又はリン酸イオンを含む水溶液のうちの１つに又はその両方に既に添加され得る。
カルシウムイオンとリン酸イオンと活性成分とを含む混合水溶液は、水中油中水型（Ｗ１／Ｏ／Ｗ２）エマルション（Ｏ＝油相、Ｗ２＝水相２）のための内部水相１（Ｗ１＝水相１）として使用されてよく、ここでポリマーコーティングｃ）のための乳酸ポリマーが有機溶液中で好ましくは超音波処理によって水相（Ｗ１）に添加されて、油中水型エマルション（Ｗ１／Ｏ）が得られ、油中水型エマルション（Ｗ１／Ｏ）が、好ましくは超音波処理によって更なる水相２（Ｗ２）に、好ましくは過剰の（過剰量の）更なる水相２（Ｗ２）に添加されて、水中油中水型（Ｗ１／Ｏ／Ｗ２）エマルションが得られ、有機溶媒が除去されて第１の分散液が得られ、第１の分散液の固形分が、好ましくは遠心分離によって集められ、水に再分散され且つ乾燥されて固体粒子が得られ、乾燥された固体粒子が水に再分散され、カチオン性ポリマーコーティングｄ）のためのカチオン性ポリマーが、好ましくは少なくとも１０分間のインキュベーション時間で、撹拌下で添加され、複合ナノ粒子を固形分として含む第２の分散液が得られ、第２の分散液の固形分が遠心分離によって集められ、再分散又は乾燥されて複合ナノ粒子を含む水性分散液又は乾燥調製物が得られる。
使用
本出願は、ナノ粒子に含まれる活性成分を経口送達又は非経口送達するのに適した医薬組成物の製造方法における本発明のナノ粒子の使用を更に開示する。
実施例
材料
ＰＬＧＡ＝ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）５０：５０（Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）ＲＧ５０２Ｈ、Ｍｗ＝７，０００〜１７，０００ｇモル−１、Evonik Industries AG（ダルムシュタット））。ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、Ｍｗ＝３０，０００〜７０，０００ｇモル−１、８７〜９０％加水分解）、キトサン（低分子量、７５〜８５％脱アセチル化）及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｍｗ＝２５，０００ｇモル−１）をシグマ−アルドリッチから購入した。抗ｅＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（ｅＧＦＰ＝強化型緑色蛍光タンパク質（enhanced Green Fluorescent Protein））を用いた遺伝子サイレンシング実験では、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製の脱塩した二本鎖ｓｉＲＮＡ、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）（カールスバッド、米国）、センス、５’−ＧＣＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵ−３’（配列番号７）及びアンチセンス、５’−ＡＵＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡＧＣＵＵＧＣ−３’（配列番号８）（Ｍｗ＝１４，０１９．５ｇモル−１）を使用した。プラスミドＤＮＡを用いたトランスフェクション実験の場合、強化型蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードするｐｃＤＮＡ３−ｅＧＦＰを、NucleobondエンドトキシンフリープラスミドＤＮＡキット（Macherey-Nagel、デューレン、独国）を用いて、大腸菌（Echerichia coli）から単離した。他の全ての化学物質は分析用のものであり、更に精製することなく使用した。
実施例で使用したヒトラクトフェリン由来ペプチド（ＨＬｆ）は、配列番号１のアミノ酸配列ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲを有する合成ペプチドであった。
機器
油中水型及び水中油中水型エマルションの形成のために、音波処理（超音波）をHielscher UP50H装置、sonotrode MS2、振幅７０％、パルス０．７を用いて２０秒間行った。動的光散乱とゼータ電位の測定を、Smoluchowski近似を用いて且つMalvern softwareからのデータを更に補正せずに取得してZetasizer nanoseries装置（Malvern社製のNano-ZS、レーザー：λ＝５３２ｎｍ）を用いて行った。粒度データは、散乱強度分布（ｚ平均）を意味する。共焦点レーザー走査顕微鏡検査を、６３倍の水の対物レンズを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡（SP5 LCSM、Leica）を用いて行った。遠心分離をHeraeus Fresco 21装置（Thermo Scientific）を用いて４℃で行った。トランスフェクションと遺伝子サイレンシング効率を、Carl Zeiss Axiovert 40 CFL装置を用いて透過光と蛍光分光法によって測定した。細胞の生存率を、Multiscan FC装置（ThermoFisher scientific、Vantaa、Finland）を用いて、λ＝５７０ｎｍでの分光光度分析によるＭＴＴ試験によって分析した。凍結乾燥をChrist社製のAlpha 2-4 LSC装置を用いて行った。
実施例の概要
実施例１：リン酸カルシウム（ＣａＰ）−活性成分ナノ粒子の合成
実施例１ａ：ＣａＰ−ｅＧＦＰ−ＤＮＡナノ粒子の合成
実施例１ｂ：ＣａＰ−抗ｅＧＦＰ−ｓｉＲＮＡナノ粒子の合成
実施例２：ＣａＰ−活性成分−ＰＬＧＡ−ナノ粒子の合成
実施例２ａ：ＣａＰ−（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）−ＰＬＧＡナノ粒子の合成
実施例２ｂ：ＣａＰ−抗ｅＧＦＰ−ｓｉＲＮＡナノ粒子の合成
実施例２ｃ：ＣａＰ−ｅＧＦＰ−ＤＮＡ−ＰＬＧＡナノ粒子の合成
実施例３：ＣａＰ−抗ｅＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＰＬＧＡ−カチオン性ポリマーナノ粒子の合成
実施例３ａ：ＣａＰ−抗ｅＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＰＬＧＡ−ＰＥＩナノ粒子の合成
実施例３ｂ：ＣａＰ−抗ｅＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＰＬＧＡ−キトサンナノ粒子の合成
実施例３ｃ：ＣａＰ−抗ｅＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＰＬＧＡ−ＨＬｆナノ粒子の合成
実施例４：細胞取り込み（ＨｅＬａ細胞）
実施例５：遺伝子サイレンシング
実施例１：ＣａＰ活性成分ナノ粒子の合成
リン酸カルシウムナノ粒子を急速沈殿法で合成した。核酸がリン酸カルシウムナノ粒子の表面に吸着する。このため、結晶成長が阻害され、リン酸カルシウムナノ粒子が静電的に安定する。この場合、ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡは、活性成分として及び分散液を凝集から保護する安定剤として作用する。
実施例１ａ：ＣａＰ−ｅＧＦＰ−ＤＮＡナノ粒子の合成
硝酸カルシウム（６．２５ｍＭ、１０５μＬ）とリン酸水素二アンモニウム（３．７４ｍＭ、１０５μＬ）の水溶液を、シリンジポンプを備えた管反応器内でＹアダプターを通して混合し、連続混合（ボルテックス）下でｅＧＦＰ−ＤＮＡの水溶液（２．５ｍｇ ｍＬ−１、４０μＬ）にポンプした。溶液の流速は１６．６μＬ ｓ−１であり、Ｙアダプター（長さ７ｍｍ）での滞留（核生成）時間は１．３秒であった。沈殿が完了した後、ナノ粒子（コア：リン酸カルシウム；シェル：核酸）の分散液を氷で冷却し、これをＰＬＧＡナノ粒子へのカプセル化のために５分間インキュベーションしてから使用した。
実施例１ｂ：ＣａＰ−抗ｅＧＦＰ−ｓｉＲＮＡナノ粒子の合成
硝酸カルシウム（６．２５ｍＭ、１０５μＬ）とリン酸水素二アンモニウム（３．７４ｍＭ、１０５μＬ）の水溶液を、シリンジポンプを備えた管反応器内でＹアダプターを通して混合し、連続混合（ボルテックス）下で抗ｅＧＦＰ−ｓｉＲＮＡの溶液（３．９ｍｇ ｍＬ−１、４０μＬ）にポンプした。両溶液の流速は１６．６μＬ ｓ−１であり、Ｙアダプター（長さ７ｍｍ）での滞留（核生成）時間は１．３秒であった。沈殿が完了した後、ナノ粒子（コア：リン酸カルシウム；シェル：核酸）の分散液を氷で冷却し、これをＰＬＧＡナノ粒子へのカプセル化のために５分間インキュベーションしてから使用した。
実施例２：ＣａＰ−活性成分−ＰＬＧＡナノ粒子の合成
ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡの外殻をＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅなどの分解酵素から保護し、粒子に徐放プロファイルを付与するために、リン酸カルシウム−ＤＮＡ又はリン酸カルシウム−ｓｉＲＮＡナノ粒子を、次に実施例２ｂ、２ｃにおいてそれぞれＰＬＧＡのマトリックスに封入した。水性リン酸カルシウム−ＤＮＡ又はリン酸カルシウム−ｓｉＲＮＡ分散液を、エマルションプロセスにおいて内部水相（Ｗ１）として使用した。ポリマーをジクロロメタン（Ｏ）に溶かした。超音波処理により、油相に微細な水滴を含む（リン酸カルシウムナノ粒子を含む）一次のＷ１／Ｏエマルションが得られる。連続水相（水中のＰＶＡ）に添加し、続いて超音波処理することにより、安定したＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションが得られる。減圧下で有機溶媒を蒸発させると、ほぼ透明な分散液が得られる。
実施例２ａ：ＣａＰ−（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）−ＰＬＧＡナノ粒子の合成
蛍光によるナノ粒子の細胞摂取を示すために、ＦＩＴＣ−ＢＳＡ（フルオレセインイソチオシアネート標識ウシ血清アルブミン）でナノ粒子を標識するべきである。従ってマーカー分子ＦＩＴＣ−ＢＳＡを用いて機能化するため、リン酸カルシウムをエマルションプロセス中に一次のＷ１／Ｏ−エマルションに沈殿させた。これが必要とされるのは、ＦＩＴＣ−ＢＳＡがリン酸カルシウムナノ粒子に吸着するが（ＤＮＡ又はＲＮＡを除いて）それらをコロイド的に安定化しないためであった。
２つのＷ１／Ｏ−エマルション（ＡとＢ）を第１段階で調製した。エマルションＡは、リン酸塩溶液及び内部水滴中の生体分子を含有し、ＰＬＧＡを有機相に溶解した。エマルションＢは、内部水相にカルシウム塩溶液を含有し、また有機相に溶解したＰＬＧＡも含有した。両方のエマルションを超音波処理下で混合すると、内部水滴にリン酸カルシウムの沈殿が生じる。合わせたＷ１／Ｏエマルションを連続水相（水中のＰＶＡ）に添加して超音波処理すると、安定したＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションが得られる。有機溶媒を減圧下で蒸発させると、ほぼ透明な黄色の分散液が得られた。この方法では、有機溶媒中の水滴（マイクロリアクター）の体積が小さいことにより結晶成長が制限された。
リン酸カルシウム−ＦＩＴＣ−ＢＳＡ−ＰＬＧＡナノ粒子を、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルション溶媒蒸発法で合成した。最初に、２つのＷ／Ｏエマルション（ＡとＢ）を超音波処理によって調製した。エマルションＡの場合、６２５μｇのＦＩＴＣ−ＢＳＡを１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液１２５μＬに溶解した。これをジクロロメタン中のＰＬＧＡの溶液（１３．３ｍｇ ｍＬ−１、３７５μＬ）に分散させた。エマルションＢの場合、６２５μｇのＦＩＴＣ−ＢＳＡを１．２５ＭのＣａＣｌ２溶液１２５μＬ（１．２５Ｍ、１２５μＬ）に溶解した。これをジクロロメタン中のＰＬＧＡの溶液（１３．３ｍｇ ｍＬ−１、３７５μＬ）に分散させた。次に、エマルションＡとＢを超音波処理（１０秒）によって混合してエマルションＣを形成した。このＷ１／Ｏエマルションを次に分散剤として３０ｍｇのＰＶＡを含む連続水相（３ｍＬ）に滴加し、再び超音波処理（ソノトロード）して黄色の乳状のＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを形成した。ジクロロメタンを減圧下（２００〜６００ミリバール）で除去した後、リン酸カルシウム−ＦＩＴＣ−ＢＳＡナノ粒子をＰＬＧＡ粒子に組み込んだ。過剰のＰＶＡとＦＩＴＣ−ＢＳＡを、遠心分離（１４，８００ｒｐｍで３０分間）し且つ超音波処理（ソノトロード）により超純水中に３回再分散させることにより除去した。ＦＩＴＣ−ＢＳＡのカプセル化効率を測定するために、溶解したＦＩＴＣ−ＢＳＡで予め較正した後、上清を４６０ｎｍでのＵＶ／Ｖｉｓ分光法により分析した。得られた分散液を液体窒素で急速凍結し、最後に０．３１ミリバール及び−１０℃で７２時間凍結乾燥した。粒子は穏やかに振り混ぜることにより水に容易に再分散可能であった。
リン酸カルシウム−ＰＬＧＡナノ粒子は、原子吸光分析によって決定された５％のリン酸カルシウム（カルシウムの含有量から計算）を含んでいた。
実施例２ｂ：ＣａＰ−抗ｅＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＰＬＧＡナノ粒子の合成
抗ｅＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ機能化リン酸カルシウムナノ粒子のＰＬＧＡナノ粒子へのカプセル化のために、水中油中水型（Ｗ１／Ｏ／Ｗ２）二重エマルション溶媒蒸発法を適用した。７５０μＬのジクロロメタンに溶解した１０ｍｇのＰＬＧＡの溶液に、２５０μＬの実施例１ｂからのリン酸カルシウム／核酸ナノ粒子の分散液を加えた。次に２００μｇのＲＮａｓｅを含まないアセチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を分散剤として４０μＬの水に溶かした溶液を加えた。混合物を超音波処理（ソノトロード、１５秒）して、一次の乳状の白色Ｗ１／Ｏエマルションを形成した。Ｗ１／Ｏ−エマルションを次に分散剤として３０ｍｇのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含む連続水相（３ｍＬ）に直ちに注ぎ、再び超音波処理（ソノトロード、１５秒）した。
最後に、ジクロロメタンをロータリーエバポレーター内で減圧（２００〜６００ミリバール）下で除去した後、ＰＬＧＡナノ粒子を沈殿させた。これにより、ｓｉＲＮＡを担持したリン酸カルシウムナノ粒子をＰＬＧＡのナノ粒子マトリックスに組み込んだ。過剰のＰＶＡを、遠心分離（１４，８００ｒｐｍで３０分間）し且つ粒子を超純水中に３回再分散させることにより除去した。核酸のカプセル化効率を決定するために、残りの上清を、標準プロトコルに従って２６０ｎｍでのＵＶ／Ｖｉｓ分光法により分析した。得られた分散液を液体窒素で急速凍結し、最後に０．３１ミリバール及び−１０℃で７２時間凍結乾燥した。粒子は、穏やかに振り混ぜることにより水に容易に再分散可能であった。
実施例２ｃ：ＣａＰ−ｅＧＦＰ−ＤＮＡ−ＰＬＧＡナノ粒子の合成
ｅＧＦＰ−ＤＮＡ機能化リン酸カルシウムナノ粒子のＰＬＧＡナノ粒子へのカプセル化のために、水中油中水型（Ｗ１／Ｏ／Ｗ２）二重エマルション溶媒蒸発法を適用した。７５０μＬのジクロロメタンに溶解した１０ｍｇのＰＬＧＡの溶液に、実施例１ａからのリン酸カルシウム／核酸ナノ粒子の分散液２５０μＬを加えた。次に２０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含まないアセチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を分散剤として水に溶かした溶液４０μＬを加えた。混合物を超音波処理（ソノトロード、１５秒）して、一次の乳状の白色Ｗ１／Ｏエマルションを形成した。Ｗ１／Ｏ−エマルションを次いで分散剤として３０ｍｇのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含む連続水相（３ｍＬ）に直ちに注ぎ、再び超音波処理（ソノトロード、１５秒）した。
最後に、ジクロロメタンをロータリーエバポレーター内で減圧（２００〜６００ミリバール）下で除去した後、ＰＬＧＡナノ粒子を沈殿させた。これにより、ＤＮＡを担持したリン酸カルシウムナノ粒子をＰＬＧＡのナノ粒子マトリックスに組み込んだ。過剰のＰＶＡを、遠心分離（１４，８００ｒｐｍで３０分間）し且つ粒子を超純水中に３回再分散させることにより除去した。核酸のカプセル化効率を決定するために、残りの上清を、標準プロトコルに従って２６０ｎｍでのＵＶ／Ｖｉｓ分光法により分析した。得られた分散液を液体窒素で急速凍結し、最後に０．３１ミリバール及び−１０℃で７２時間凍結乾燥した。粒子は、穏やかに振り混ぜることにより水に容易に再分散可能であった。
実施例３：ＣａＰ−ｓｉＲＮＡ−ＰＬＧＡ−カチオン性ポリマーナノ粒子の合成
リン酸カルシウム−ＰＬＧＡナノ粒子の細胞内取り込みを促進するために、キトサン、ＰＥＩ及びＨＬｆなどのカチオン性ポリマーの層ごとの堆積により、表面電荷を逆転させることができる。更に、ポリマー（キトサン及びＰＥＩ）はプロトンスポンジ効果を誘発することが可能である。このことは、ナノ粒子のエンドソーム脱出を促進し、治療効率を高める。ゼータ電位測定で示されるように、リン酸カルシウム−ＰＬＧＡナノ粒子の表面電荷を、約−２４ｍＶから＋５０ｍＶまで（キトサン）、＋３１ｍＶまで（ＰＥＩ）又は＋１０ｍＶまで（ＨＬｆ）カチオン性ポリマーの層ごとの堆積によって容易に逆転させることができた。ＨＬｆ修飾されたＣａＰ−ｓｉＲＮＡ−ＰＬＧＡ粒子のＳＥＭ画像は球状のナノ粒子を示す。ナノ粒子のサイズと形態は大きく変化しなかった。
実施例３ａ：ＣａＰ−ｓｉＲＮＡ−ＰＬＧＡ−ＰＥＩナノ粒子の合成
実施例２ｂからの凍結乾燥粒子１．５ｍｇを、超純水１ｍＬに再懸濁し、ＰＥＩ水溶液（１ｍＬ中２ｍｇ）に連続的に撹拌しながら滴加した。室温で３０分間連続撹拌した後、分散液を、遠心分離（１４，８００ｒｐｍで３０分）し且つ超純水中に再分散（振盪、超音波処理は不要）させることにより３回精製した。細胞培養実験の場合、粒子を最後に細胞培養培地に再分散させた。
実施例３ｂ：ＣａＰ−ｓｉＲＮＡ−ＰＬＧＡ−キトサンナノ粒子の合成
実施例２ｂからの凍結乾燥粒子１．５ｍｇを超純水１ｍＬに再懸濁し、連続的に撹拌しながらキトサン水溶液（１ｍＬ中５ｍｇ、ｐＨを酢酸で５に調整）に滴加した。室温で３０分間連続撹拌した後、分散液を、遠心分離（１４，８００ｒｐｍで３０分）し且つ超純水中に再分散（振盪、超音波処理は不要）させることにより３回精製した。細胞培養実験の場合、粒子を最後に細胞培養培地に再分散させた。
実施例３ｃ：ＣａＰ−ｓｉＲＮＡ−ＰＬＧＡ−ＨＬｆナノ粒子の合成
実施例２ｂからの凍結乾燥粒子３ｍｇを超純水３ｍｌに再懸濁し、連続的に撹拌しながら２時間、ヒトラクトフェリンの溶液３ｍｌ（２ｍｇ／ｍｌ）に加えた。処理した粒子を凍結乾燥した。細胞培養実験の場合、粒子を再分散させ、超純水中で遠心分離（１４，８００ｒｐｍで３０分間）により精製し、最後に細胞培養培地に再分散させた。
実施例４：細胞取り込み（ＨｅＬａ）
ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００ＵｍＬ−１ペニシリン、及び１００ＵｍＬ−１のストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％のＣＯ２雰囲気下で培養した。
細胞摂取実験を、使用前２４時間、８ウェルプレートに播種して培養した細胞を用いて行った。ＣａＰ−（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）−ＰＬＧＡナノ粒子溶液（改変していないもの（実施例２ｂ）、キトサン、ＰＥＩ又はＨＬｆで改変したもの（実施例３））を細胞に１時間及び３時間添加した。蛍光顕微鏡法の場合、細胞核をＤＡＰＩで着色した。蛍光顕微鏡画像により、改変ＣａＰ−（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）−ＰＬＧＡナノ粒子がＨｅＬａ細胞によって効率的に取り込まれたことが明らかに示される。ＰＥＩ改変ＣａＰ−（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）−ＰＬＧＡナノ粒子を１時間後に効率よく蓄積させ、キトサン又はＨＬｆ改変ＣａＰ−（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）−ＰＬＧＡナノ粒子の取り込みを３時間後に効率よく示すことができた。
共局在実験の場合、ＨｅＬａ細胞を８ウェルプレート（Ｌａｂ−Ｔｅｋ）に播種し、２４時間培養した。次に、ＨｅＬａ細胞を、製造業者の指示に従って５０ｎｇのＬａｍｐ１−ＲＦＰプラスミドＤＮＡと０．３μｌのリポフェクタミン（Lipofectamine）２０００（Life technology）を用いてトランスフェクションした。４時間後、細胞培養培地を交換し、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で数回洗浄した。更に１６時間後、細胞をナノ粒子分散液（２０μＬ、１ｍｇナノ粒子ｍＬ−１）で処理し、異なる時点で共焦点レーザー走査顕微鏡で検査した。
リン酸カルシウム（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）−ＰＬＧＡナノ粒子の細胞内取り込み研究と、Ｌａｍｐ１−ＲＦＰ発現ＨｅＬａ細胞による共局在実験により、ナノ粒子が細胞によって効率的に取り込まれたことが示された。負の表面電荷を有するナノ粒子は、細胞膜との親和性が低く、適度に取り込まれただけであるが、正の表面電荷を有するナノ粒子（キトサン又はＰＥＩ機能化ナノ粒子）は、負に帯電した細胞膜とナノ粒子のカチオン性表面との静電相互作用のために１時間のインキュベーション後に細胞膜を覆った。また、負に帯電したリン酸カルシウム−（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）−ＰＬＧＡナノ粒子の大部分は、Ｌａｍｐ１−ＲＦＰとＦＩＴＣ−ＢＳＡの緑色蛍光との共局在によって示されるように、エンドソーム内で終わった。対照的に、キトサン及びＰＥＩ機能化リン酸カルシウム−（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）−ＰＬＧＡナノ粒子（陽性表面電荷）は、３時間のインキュベーション後にサイトゾル中の拡散緑色蛍光によって示されるようにプロトンスポンジ効果を誘発し、エンドソームを脱出した。
実施例５：遺伝子サイレンシング
ＨｅＬａ−ｅＧＦＰ細胞（強化型緑色蛍光タンパク質を発現した遺伝子改変ＨｅＬａ細胞、ｅＧＦＰ）を、３７℃及び５％のＣＯ２雰囲気で、１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）、１００Ｕ ｍＬ−１ペニシリン、１００Ｕ ｍＬ−１ストレプトマイシン、及び５０μｇ ｍＬ−１ジェネティシンを加えたＤＭＥＭ中で培養した。ナノ粒子を添加する１２時間前に、細胞をトリプシン処理し、２４ウェルプレートに２．５×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。
トランスフェクションの前に、細胞培養培地を新しい細胞培養培地に再分散したナノ粒子に置き換えた（０．５ｍＬ中のナノ粒子０．１ｍｇは、１ウェル当たり０．８μｇ〜１μｇのｓｉＲＮＡに相当する）。７時間のインキュベーション後、トランスフェクション培地を新しい細胞培養培地に交換した。光学顕微鏡と蛍光顕微鏡でナノ粒子を添加してから７２時間後に遺伝子サイレンシングの効率を測定した。
対照として、製造業者によって推奨されるリポフェクタミン（登録商標）２０００で細胞をトランスフェクションした。簡単に説明すると、５０μＬのＤＭＥＭ（ＦＣＳなし）を１μＬのリポフェクタミン（登録商標）２０００と混合し、室温で５分間インキュベートした。抗ｅＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（２０ｐｍｏｌ、０．２８μｇ）を５０μＬのＤＭＥＭ（ＦＣＳなし）に加えた。次に、両溶液を混合し、２０分間インキュベートしてから、この溶液１００μＬと更に４００μＬのＤＭＥＭを各ウェルに加えた。７時間インキュベートした後、トランスフェクション培地を新しい細胞培養培地と交換した。
抗ｅＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ機能化リン酸カルシウム−ＰＬＧＡナノ粒子による遺伝子サイレンシング実験の効率を蛍光顕微鏡画像から計算し、以下のように計算した：
Figure 2017518295
同じ条件で培養したが全く処理していないＨｅＬａ−ｅＧＦＰ細胞を対照として用いた。
抗ｅＧＦＰ−ｓｉＲＮＡで機能化されたリン酸カルシウム−ＰＬＧＡナノ粒子は、ｅＧＦＰ発現ＨｅＬａ細胞においてｅＧＦＰコード遺伝子を効率的にノックダウンした。キトサン、ＰＥＩ又はＨＬｆのいずれかでコーティングしたカチオン性リン酸カルシウム−ＰＬＧＡ−ｓｉＲＮＡナノ粒子は、それぞれ２８％、５０％又は５１％の遺伝子サイレンシング効率を示した。トランスフェクション実験によれば、リン酸カルシウム−ＰＬＧＡナノ粒子による処理後の細胞の活力は、リポフェクタミン（登録商標）などのリポソームトランスフェクション剤と比較してその範囲内であるか又はそれよりも更に高かった。キトサン、ＰＥＩ又はＨＬｆのいずれかでコーティングしたカチオン性リン酸カルシウム−ＰＬＧＡ−ｓｉＲＮＡナノ粒子は、ＰＥＩがその細胞毒性で知られているが、良好な細胞生存率を示した。結果を表１にまとめる。
Figure 2017518295

Claims (8)

  1. １０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲のナノ粒子サイズ分布において最大値である直径を有するナノ粒子であって、
    ａ）リン酸カルシウムナノ粒子コアａ）、
    ｂ）リン酸カルシウムナノ粒子コアａ）上の活性成分コーティングｂ）、
    ｃ）活性成分コーティングｂ）上の乳酸ポリマーコーティングｃ）、
    ｄ）ポリエチレン−イミン、キトサン及び１４〜３０個のアミノ酸の長さを有するヒトラクトフェリン由来ペプチドの群から選択される乳酸ポリマーコーティングｃ）上のカチオン性ポリマーコーティングｄ）、
    を含む、前記ナノ粒子。
  2. 活性成分がペプチド、タンパク質又は核酸である、請求項１に記載のナノ粒子。
  3. 活性成分がｓｉＲＮＡである、請求項１又は２に記載のナノ粒子。
  4. ヒトラクトフェリン由来ペプチドが、配列番号１によるアミノ酸配列ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲ又は８個を超えるアミノ酸位置が配列番号１と異なっていない配列を有するペプチドである、請求項１から３までのいずれか１項に記載のナノ粒子。
  5. ヒトラクトフェリン由来ペプチドのアミノ酸配列に少なくとも２個のシステイン残基が存在する、請求項４に記載のナノ粒子。
  6. 請求項１から５までのいずれか１項に記載のナノ粒子を含む医薬組成物。
  7. 請求項１から５までのいずれか１項に記載のナノ粒子の製造方法であって、その上に活性成分コーティングｂ）を有するリン酸カルシウムナノ粒子コアａ）を、カルシウムイオンを含む水溶液とリン酸イオンを含む水溶液とを混合することによって調製し、ここで活性成分を添加して、水中油中水型（Ｗ１／Ｏ／Ｗ２）エマルションの内部水相（Ｗ１）として使用される活性成分コーティングｂ）を有するリン酸カルシウムナノ粒子コアａ）を生じさせ、ポリマーコーティングｃ）のための乳酸ポリマーを有機溶液中で水相（Ｗ１）に添加して油中水型エマルション（Ｗ１／Ｏ）を生じさせ、油中水型エマルション（Ｗ１／Ｏ）を更なる水相（Ｗ２）に添加して水中油中水型エマルション（Ｗ１／Ｏ／Ｗ２）を生じさせ、有機溶媒を除去して第１の分散液を生じさせ、第１の分散液の固形分を集めて水に再分散させ、且つ乾燥させて固体粒子を生じさせ、乾燥した固体粒子を水に再分散させ、且つカチオン性ポリマーコーティングｄ）のためのカチオン性ポリマーを撹拌下で添加して固形分としてナノ粒子を含む第２の分散液を生じさせ、第２の分散液の固形分を遠心分離又は接線流濾過によって集め、再分散又は乾燥させてナノ粒子を含む水性分散液又は乾燥調製物を得る、前記製造方法。
  8. 請求項１から５までのいずれか１項に記載のナノ粒子の、複合ナノ粒子に含まれる活性成分の経口又は非経口送達に適した医薬組成物の製造方法における使用。
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