JP2017523018A - 滅菌熱ゲル化組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｎ−アセチル−グルコサミン単位、グルコサミン単位、及びＮ−アセチル−グルコサミン単位以外の置換されたグルコサミン単位を有する置換されたキトサンを含有する滅菌熱ゲル化組成物、その調製及びその用途に関し、当該置換されたキトサンのグルコサミン単位の置換率は好ましくは１０〜５０％（全単位のモル数に対する置換基のモル数の割合として表す）である。【選択図】なし

Description

本発明は、滅菌熱ゲル化組成物に関する。より具体的には、本発明は、そのような蒸気滅菌組成物、及びそのような組成物を調製する滅菌方法、及びそれらの使用、特に医療分野における使用、又はヒト若しくは動物の体内に注射するための使用に関する。

ヒト又は動物の身体と接触して設置しなければならない、装置、試料及び他のデバイスは、滅菌することが推奨される。そのような滅菌を産業レベルで達成するためには、蒸気を用いた滅菌が有利である。

しかしながら、幾つかの特定の場合において、蒸気滅菌は不適切である。

これらは、滅菌すべき要素が、温度上昇や蒸気の存在を支持しない場合、又は滅菌条件によって滅菌された要素が変化してそれが目的の用途におけるその使用に適さなくなる場合に、顕著である。

ＥＰ２３６１６４０が示すように、キトサンに基づく熱ゲル化組成物は、蒸気によって滅菌できないことが周知である。特に、そのような滅菌は、ハイドロゲルの機能的特徴及び構造に、及び当該組成物がゲル化する、又は最初の流動形態に戻る能力に、影響するからである。従って、キトサン及びその誘導体のハイドロゲルを滅菌するのに、そのような蒸気滅菌の使用は推奨されない。Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ （Ａｐｐｌ Ｂｉｏｍａｔｅｒ）， ２０１１， ５８， １２７-１３５）は、キトサンの溶液の予備滅菌、そしてその後のそれら自体も別個に滅菌されるベータグリセロールリン酸ナトリウム等のハイドロゲルの他の化合物の添加を教示する。この滅菌手順は最終産物に介入せず、溶液の混合が滅菌的に実施されることを強いるもので、これは、産業的観点から有利ではない。ＵＳ ６，３４４，４８８において、キトサンの熱ゲル化組成物は熱感受性であるため、蒸気による滅菌は推奨されていない。キトサンの溶液は、ゲル化剤を添加する前に蒸気で滅菌される。Ｃｈｅｎｇｄｏｎｇ Ｊｉ ｅｔ ａｌ．は、グリセロールリン酸の存在下でキトサンを滅菌することを記載しているが（Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ， Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２０１２， ７２，１１０-１１２）、機械的特性は試験されなかった。滅菌キトサンゲルが、特に特定の流れ及び／又は機械的特性が探索される場合、薬物担体として以外に使用され得るかどうかを決定することは出来ない。（Ｉｒｒａｄｉａｔｉｎｇ ｏｒ ａｕｔｏｃｌａｖｉｎｇ ｃｈｉｔｏｓａｎ／ｐｏｌｙｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ： ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅｒｍｏｇｅｌｌｉｎｇ ｃｈｉｔｏｓａｎ−β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ， ２００２， ５０（１０）， １３３５ −１３４０）も、キトサンゲルに対する蒸気滅菌の効果を試験している。それらは、ポリオールの有益な能力を示唆している。そのような熱ゲル化組成物のｐＨは７．２未満である。最後に、ＵＳ ６，３４４，４８８は、キトサンの熱ゲル化組成物（「ｔｈｅｒｍｏｇｅｌｓ」）のゾル−ゲル転位は、ｐＨが６．９を上回ると不可逆になることを提示している。これらのゾル−ゲル転位が不可逆であるサーモゲルは、組成物がそれらの使用前にゲル化しないように温度上昇又は蒸気により滅菌出来ないという難点を有している。

本発明は、これらの技術的課題を解決することを目的とする。

特に、ヒト又は動物の生理的温度でゲル化し、治療又は美容用途における良好な物理化学的特性を有する、熱ゲル化滅菌組成物を提供する需要が存在する。

本発明の目的は、特に、容易に注入され得、ヒトの生理的温度でゲル化する、滅菌熱ゲル化組成物を提供することである。そのような滅菌組成物は、特に３７℃で、治療又は美容用途における良好な物理化学的特性を有するべきである。より具体的には、そのような滅菌組成物は、目的の治療又は美容用途における所望の目的に可能な限り近くなるように、目的の用途に応じて成形され得る粘弾特性を有し得るべきである。

本発明の目的は、ｐＨが目的の治療又は美容用途に許容される、熱ゲル化滅菌組成物を提供することでもある。より具体的には、そのような滅菌組成物は、生理的ｐＨに可能な限り近くなるように、所望の用途に応じて変更され得るｐＨを有し得るべきである。

本発明の目的は、浸透圧が目的の治療又は美容用途における生理的な浸透圧に近い、特に１００〜７００ ｍｏｓｍ／ｋｇ、及び特に２００〜５００ ｍｏｓｍ／ｋｇ （「ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ」とも表記する）の、熱ゲル化滅菌組成物を提供することでもある。

あるいは、本発明の目的は、特に保存や輸送条件が厳格な温度調整を要さないように、又はその組成物が蒸気又は複数回の蒸気滅菌サイクルによって滅菌され得るように、ゾル−ゲル転位が可逆的である、滅菌組成物を提供することでもある。

本発明の目的は、更に、特に滑液内に注入される、又はこれと混合される、粘性添加物（ｖｉｓｃｏｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）として使用され得る組成物を提供することである。特に本発明の目的は、再建滑液、即ち、特に関節に運動中のショックを吸収する、又は少なくとも静止中に潤滑する能力を提供することにより、関節の機能を保存する組成物を提供することである。

更に、本発明の目的は、滑液、特にヒトの滑液と混合するのに良好な特性を有する組成物を提供することである。有利なことに、本発明の目的は、弾性係数Ｇ´及び静止時の粘性を保持する観点で、炎症環境中での分解に良好な耐性を有する組成物を提供することである。

本発明は、驚くべきことに、蒸気の解決すべき課題の幾つかを克服する。

驚くべきことに、Ｎ−アセチル−グルコサミン単位、グルコサミン単位及びＮ−アセチル−グルコサミン以外の置換されたグルコサミン単位を有するキトサンを含有するときにそのような組成物が調製され得ることが見出され、ここで、当該置換されたキトサンは、好ましくは、全単位のモル数に対する置換基のモル数で１０〜５０％の範囲のグルコサミン単位の置換度を有する。

特定の態様において、グルコサミン単位は、Ｄ−グルコサミン単位（Ｄ−グルコサミン単位、置換されたＤ−グルコサミン単位、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位及び任意で置換されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位）である。

他の態様において、キトサンは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位Ｄ−グルコサミン単位、及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位以外の置換されたＤ−グルコサミン単位、及び任意で置換されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位を有する。

Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位以外の置換されたＤ−グルコサミン単位とは、置換されたＤ−グルコサミン単位が置換後にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位を形成しないことを意味する。

他の態様において、置換されたキトサンは、Ｄ−グルコサミン単位を１つだけ有する。

他の態様において、置換されたキトサンは、Ｄ−グルコサミン単位の置換とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位を同時に有し、ここで、置換基は、他の態様においてキトサンのアミン基のみと、又は他の態様において、キトサンのアミン基とヒドロキシル基と同時に、共有結合している。

一つの態様において、置換されたキトサンの全単位（置換されている、又はされていない、Ｄ−グルコサミン及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位）のモル数に対するＤ−グルコサミン単位のモル数として表される、Ｄ−グルコサミン単位の置換の度合は、０．１〜０．５％である。

特定の他の態様において、置換されたキトサンのグルコサミン及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の全モル数に対する、共有結合により置換基が結合したグルコサミン単位のモル数として表現される、グルコサミン単位の置換度が、０．１〜０．５の場合に、任意に、ゲル化剤、例えばポリオール又は糖塩、より具体的にはグリセロールリン酸塩の存在下、目的の要素に具体的に適合した範囲内でのｐＨ及び温度で、有利に、置換されたキトサンの可溶化を可能とすることが見出された。後で説明するように、キトサンに対する出発試薬のモル比又は質量比により置換度を表現することが、より単純であり得る。

他の態様において、置換されたキトサンは、例えばリン酸塩緩衝剤（ＰＢＳ）でｐＨ７に緩衝された水溶液中の溶解度により可溶性であってもよく、当該溶液は、溶液の全質量に対して置換キトサン濃度が１質量％、ｐＨは８℃で測定される。

他の態様において、特に置換されたキトサンが双性イオン性の特性を有する場合、その中では当該置換されたキトサンが溶解しない狭いｐＨ範囲が存在する。この特異性は、置換されたキトサンが本発明の所望の関連するｐＨで可溶化するように、従来技術に従い、例えばポリオール又は糖塩、より具体的にはグリセロールリン酸塩等のゲル化剤を添加することにより回避される。

キトサンを置換することにより、無置換のキトサンはｐＨが５．５〜６．５でしか溶解しない一方、ｐＨが広い範囲で変化する水溶液中で、置換されたキトサンの溶液を調製することが可能となった。当該置換されたキトサンの水溶液は、一般にｐＨが６．５〜８．５であり得る。この本発明の溶液は、ゲル化し得る。ゾル−ゲル転位又はゲル化は、従って、キトサンはｐＨ７で安定でなく、アミン基のｐＫａが約５．５である（従ってアミン基がプロトン化されないｐＨ７で荷電しない）にもかかわらず、中性のｐＨ又は生理的ｐＨ、例えば７〜８．５で達成され得る。従って、置換されたキトサンは、その可溶性プロフィールを改変する置換基の存在によって、様々なｐＨで可溶化する能力を有する。驚くべきことに、低低分子量又は平均的な分子量の、特に低濃度の、特に非常に低濃度の置換されたキトサンを用いて、熱ゲル化組成物を調製することが可能であった。このキトサンは、可逆的なゾル−ゲル転位を有し、得られたゲルの特性は、想定される用途に、特に滑液の粘性添加物として適している。そのような置換されたキトサンを含有する組成物は、温度が上昇したとき、ゾル−ゲル転位を有する。従って、非常に有利な場合、ゾル−ゲル転位、即ち流動状態の液体からゲル状態への移行は、このゾル−ゲル転位が所望のｐＨ，浸透圧及び温度の条件下で顕著に起こるように、置換度に依存して調整され得る。従って、本発明は、他の態様において、使用時の温度未満、典型的には生理的温度、例えば３７℃未満の温度で流動熱ゲル化組成物を調製することを可能とし、これは、使用時の温度で、典型的には生理的温度、例えば３７℃で、中性のｐＨ（例えばｐＨ７）又は生理的ｐＨ、及び例えば７〜８．５で、想定される使用に適した浸透圧で、ゲル化する。この浸透圧は、例えば生理的浸透圧である。

他の代替において、本発明は、使用前の、典型的には室温、例えば保存温度（例えば４〜８℃）、及び使用温度で、典型的には生理的温度、例えば３７℃で、中性ｐＨ（ｐＨ７）又は生理的ｐＨ、例えば７〜８．５で、想定される使用に適した浸透圧、例えば生理的浸透圧で、ゲルとして存在する、熱ゲル化組成物に関する。

熱ゲル化組成物又はサーモゲルは、流体、特に溶液であって、温度の変化、好ましくは温度の増大、尚も好ましくは温度のヒト又は動物の生理的体温までの増大によりゾル−ゲル転位を起こすため、注入又は移植後に生理的温度でゲルとして存在する能力を有するものを意味する。本発明の熱ゲル化組成物は、ハイドロゲル、即ち水性ゲルとして存在し得る。

本発明において、ゲルは、自身の重さで流動しない、より具体的には、それを納めた容器を例えば３０秒間転倒することによる外部的刺激の非存在下何ら流動を呈しない、及び損失係数Ｇ´´よりも大きい弾性係数Ｇ´により特徴付けられる、組成物を意味する。これらの係数は、「Ｃｏｕｅｔｔｅ」ジオメトリーを有するレオメーターにより、又は平面ジオメトリー及び低振幅振動モードでの掃引を用いるレオメーター（例えばレオメーターＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｈｙｂｒｉｄ ＤＨＲ−２（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））により、レオロジーによって測定される。ゲルの係数Ｇ´とＧ´´との間の違いは、ゲルの粘着特性である。

本発明において、流体は、それを納めた容器を例えば３０秒間転倒したとき自身の重さで流動する、及び損失係数Ｇ´´よりも小さい弾性係数Ｇ´により特徴付けられる、組成物を意味する。これらの係数は、「Ｃｏｕｅｔｔｅ」せん断（２つの同軸シリンダー間の流体のせん断）を有するロータリーレオメーターによりレオロジーによって測定される。

有利なことに、Ｄ−グルコサミン単位の置換度は、ゾル−ゲル転位を調整する能力をもたらすことが見出された。特に、Ｄ−グルコサミン単位の置換度は、グリセロール塩等の何らかのゲル化剤無しで熱ゲル化組成物の形成を可能とすることが見出された。従って、本発明は、置換されたキトサンが熱ゲル化組成物中に溶解するようにキトサンの置換度の最小値が選択される、熱ゲル化組成物を提供する可能性をもたらす。また、様々な緩衝剤中での溶解度もチェックされる。「水中での溶解」は、置換されたキトサンが裸眼で視認し得る濁りを有しないことを意味する。より具体的には、測定する試料に使用される水溶液のみを含有し置換されたキトサンを欠くものを参照タンクとして、０．５Ｍ酢酸ナトリウム等の関連するｐＨの緩衝剤で任意で緩衝した水を含有する試料を、６００ｎｍの波長でＵＶ−可視スペクトロメトリーにより測定したとき、光学密度が０．５未満、好ましくは０．２未満であることにより、濁度の欠如を確認することが可能である。キトサンが充分に置換されていない場合、室温で、満足なｐＨ範囲、例えばｐＨ７〜８．５で溶解しないため、温度が増大したときに熱ゲル化し得ない。

本発明は、ゾル−ゲル転位が使用温度、好ましくは生理的温度、例えば３７℃の温度で実行されるように、キトサンの置換度の最大値が選択される、熱ゲル化組成物を提供する可能性をもたらす。ゾル−ゲル転位は、本発明に定義される方法に従い、計数Ｇ´及びＧ´´を複合して確認され得る。

有利なことに、置換度は、磁気共鳴スペクトロメーター、例えば周波数４００ｍＨｚのＢｒｕｋｅｒスペクトロメーターを用いて、水性媒体中の溶液中のプロトンの核磁気共鳴スペクトロメトリーによって決定され得る。試料は、以下のように調製される。５〜６ｍｇの置換されたキトサンを１ｍｌの重水素化水に溶解する。１２Ｍの濃度の重水素化塩酸２μｌを、解析に適したｐＨゾーンに達するように、置換されたキトサンの溶液に添加する。安定なｐＨゾーンは、置換基の性質に影響する。安定なｐＨ領域は、置換基の性質に依存する。スペクトルは７０℃で記録され、走査数は６４〜２５６で、緩和時間は１〜８秒である。得られたスペクトルをデコンボリューションによって処理して、置換されたキトサンの置換度を算出できるように所望のシグナルの面積の積分値を決定する。

試料を調製する方法、ＮＭＲスペクトルを記録する条件、及び置換度を算出するのに用いる数式は、それらは置換基の位置や性質に依存するため、置換されたキトサンの各種類によって適合されなければならない。

置換度（ＤＳ）の算出の例として、Ｄ−グルコサミン単位のアミン基に置換したスクシニル基で置換されたキトサンの場合を下記に示す（キトサンスクシンアミド、式１）。各略称の意味を以下に示す。Ｉ_Ｈ２は、位置２におけるＤ−グルコサミン単位のプロトンのシグナルの面積の積分に等しい。Ｉ_{ＣＨ２ ｓｕｃｃｉ}は、Ｄ−グルコサミン単位に結合した（アミド基のアルファ及びベータ位の炭素原子上）スクシニル置換基の２つのＣＨ２基のプロトンのシグナルの面積の積分に等しい。Ｉ_{ＣＨ３ ａｃｅｔｙｌ}は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位のアセチル基のプロトンのシグナルの面積の積分に等しい。

キトサンスクシンアミドのＮＭＲスペクトル例及びキトサンスクシンアミドの構造式を、図１に示す。

式１は、プロトンＮＭＲによるスクシニル基で置換したキトサンの置換度の計算式を示す。

もし置換度を推定するのに他のＮＭＲ手法がより有利である場合、そのような方法を使用すべきである。上記の式は、特に置換度を計算するのに用いるシグナルの解像度、ロバスト性及びプロトンの位置に依存して、試料の調製及び積分されるシグナルに関して、当業者によって適合されるべきである。

有利な場合、組成物は熱可逆性ゾル−ゲル転位を有する。

有利な場合、本発明は、低濃度の置換されたキトサンを含有する組成物を提供する可能性をもたらす。

有利な場合、キトサン濃度は、組成物の全質量に対して４％未満、例えば３％未満、又は例えば２％未満である（ｍ／ｍ）。

他の特定の態様において、置換されたキトサンの濃度は、最終組成物の質量に対して１．９％（ｍ／ｍ）未満である。有利な場合、置換されたキトサンの濃度は、最終組成物の質量に対して０．５〜１．５％（ｍ／ｍ）である。他の特定の態様において、置換されたキトサンの濃度は、最終組成物の質量に対して約１．２％（ｍ／ｍ）である。

他の特定の態様において、置換されたキトサンの濃度は、最終組成物の質量に対して約２．５％（ｍ／ｍ）である。

他の特定の態様において、置換されたキトサンの濃度は、最終組成物の質量に対して約２．０％（ｍ／ｍ）である。

他の特定の態様において、置換されたキトサンの濃度は、最終組成物の質量に対して約１．５％（ｍ／ｍ）である。

他の特定の態様において、置換されたキトサンの濃度は、最終組成物の質量に対して約１．３％（ｍ／ｍ）である。

他の特定の態様において、置換されたキトサンの濃度は、最終組成物の質量に対して約１．１％（ｍ／ｍ）である。

他の特定の態様において、置換されたキトサンの濃度は、最終組成物の質量に対して約１．０％（ｍ／ｍ）である。

他の特定の態様において、置換されたキトサンの濃度は、最終組成物の質量に対して約０．９％（ｍ／ｍ）である。

更に、Ｄ−グルコサミン単位の置換度は、有利な場合、キトサンを安定化するために酸性ｐＨ（典型的には５．０〜５．５）の溶液を使用しない、及びｐＨを約７に上げるために、グリセロールリン酸塩等のポリオール塩又は糖を添加する必要が無い可能性をもたらす。対照的に、本発明は、有利に、その中で置換されたキトサンが溶解し、故に例えばキトサンの安定化のために酸性溶液の添加を必要としないという利点も有する、例えば６．２〜８．５等の生理的ｐＨや中性ｐＨの溶液を直接調製する可能性をもたらす。これは、熱ゲル化組成物に使用され得るｐＨの範囲がより自由になり、故に熱ゲル化組成物が中性又は生理的ｐＨで調製され得るという長所を有する。例えば、ｐＨを調整するための酸又は塩基である緩衝剤を使用できる。例えば、塩基性緩衝剤が使用され、熱ゲル化組成物のｐＨは、弱酸で調整され得る。

有利な他の態様において、熱ゲル化組成物は、ゲル化剤を含有しない。この態様において、熱ゲル化組成物は、置換されてキトサンのみの存在によってゲル化する能力を有する。特に、この態様において、当該組成物は、本発明で規定するゲル化剤を含有しない。特に、好ましい態様において、本発明の熱ゲル化組成物は、グリセロール塩、特にグリセロールリン酸塩（グリセロリン酸塩とも表記する）を含有しない。この代替は、その技術的効果がゲルの機械的特性に対するものだけであるグリセロールリン酸塩又は他の同等のゲル化剤の存在を回避する可能性をもたらす。この態様において、治療態様の身体と生物学的／化学的特性との何らかの相互作用又は治療的利益を有しないゲル化剤等の化合物の使用を回避するのが好ましい。

他の態様において、前記組成物は、ゲル化剤、好ましくは組成物のゾル−ゲル転位を誘導するゲル化剤、例えばグリセロールリン酸塩のナトリウムやカルシウム塩、例えばその五水和物等を含有し、当該ゲル化剤は、好ましくは、最終組成物の全質量に対して、１〜２０％、好ましくは３〜９％の濃度で組成物中に存在する（ｍ／ｍ）。

ゲル化剤は、有利な場合、１つ以上のポリオール又は糖塩であり、それらの任意の混合物を含む。

ポリオール又は糖塩の中で、リン酸塩、特に二塩基性ポリオール又は糖一リン酸塩に注目されたい。例えばポリオール又は糖一硫酸塩等の硫酸塩にも注目されたい。リン酸塩の中で、特に、二塩基性グリセロール一リン酸塩、例えばグリセロール-２-リン酸塩、ｓｎ-グリセロール３-リン酸塩および１-グリセロール-３-リン酸塩にも注目されたい。他の態様において、これはベータ−グリセロールリン酸塩である。そのような塩におけるポリオール及び糖の中で、以下のポリオール及び糖に注目されたい。ヒスチジノール、アセトール、ジエチルスチルベストロール、インドールグリセロール、ソルビトール、リビトール、キシリトール、アラビニトール、エリスリトール、イノシトール、マンニトール、グルシトール、パルミトイル-グリセロール、リノレオイル-グリセロール、オレイル-グリセロール、アラキドノイル-グリセロール、フルクトース、ガラクトース、リボース、グルコース、キシロース、ラムヌロース、ソルボース、エリスルロース、デオキシ-リボース、ケトース、マンノース、アラビノース、フクロース、フルクトピラノース、ケトグルコース、セドヘプツロース、トレハロース、タガトース、スクロース、アロース、スレオース、キシルロース、ヘキソース、メチルチオ-リボースまたはメチルチオ-デオキシ-リブロース、又はそれらの混合物。

他の特定の態様において、ポリオール又は糖塩の濃度、及び好ましくはグリセロール塩の濃度は、好ましくは、１〜１０％である。有利な場合、ポリオール又は糖塩の濃度、及び好ましくはグリセロール塩の濃度は、好ましくは、１〜７％である。有利な場合、ポリオール又は糖塩の濃度は、２〜５％である。これらの値は、組成物の全質量に基づく質量として表現される。

他の態様において、グリセロール塩はグリセロールリン酸塩、より具体的にはナトリウム塩、例えばグリセロールリン酸二ナトリウムである。

ポリオール又は糖塩、好ましくはグリセロールリン酸塩は、ｐＨを塩基性にするのに用いられ、そして組成物のｐＨは、酸を添加して調整される。これは、ｐＨが非常に容易かつ正確に調整され得るので、熱ゲル化組成物を提供するのに有利である。

熱ゲル化組成物がゲル化剤を含有しない場合、ｐＨは、弱有機酸や強鉱酸（塩酸）等の酸によって調整され得る。例えば組成物のｐＨ調整に使用される弱有機酸は、酢酸又はグルタミン酸である。

従って、本発明の組成物のｐＨは７以上、例えば７．１以上、例えば７．２〜８．５である。

ｐＨは、最終熱ゲル化組成物の液体、即ちゾル−ゲル転位前に測定される。ｐＨはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ （ＥＰ ２．２．３）に記載の方法に従って決定される。使用されるｐＨメーターは、複合ガラス電極を備えたＳａｒｔｏｒｉｕｓ範囲のｐＨメーターである（ＰＹ−Ｐ１１）。ｐＨ測定は、２０〜２５℃で実施される。

有利なことに、ｐＨは６．５〜８．０の広い範囲で調整可能である。他の態様において、ｐＨは７．４０を上回る。特定の他の態様において、ｐＨは７．５０ ＋／− ０．０５である。特定の他の態様において、ｐＨは７．２０ ＋／− ０．０５である。特定の他の態様において、ｐＨは７．００ ＋／− ０．０５である。

好ましい他の態様において、本発明の組成物は、３０℃で、好ましくは３０〜５０℃で、好ましくは３２〜４５℃で、更に好ましくは３５〜４０℃で、ゾル−ゲル転位を有する。

有利なことに、本発明の熱ゲル化組成物は、室温、即ち２０〜２５℃で流動状態である。

好ましい態様において、本発明の組成物は、３７℃未満で、好ましくは３５℃未満で、尚も好ましくは２℃〜２０℃で流体である。他の態様において、本発明の組成物は、保存温度、例えば２〜８℃、又は拡大された室温、例えば１５〜３０℃で、流体である。

他の態様において、本発明の熱ゲル化組成物は、０℃超で流体で、１０℃以上でゲルである。他の態様において、本発明の組成物は、０℃超で流体で、５℃以上でゲルである。

一つの態様において、組成物の浸透圧は１００〜７００ ｍｏｓｍ／ｋｇ、好ましくは２００〜６５０ ｍｏｓｍ／ｋｇ、例えば２００〜６００ ｍｏｓｍ／ｋｇ、又は更に例えば２００〜５５０ ｍｏｓｍ／ｋｇ、好ましくは２００〜５００ ｍｏｓｍ／ｋｇである。浸透圧はｍｏｓｍ／Ｌで表されても良いが、これは、浸透圧と呼ばれる。それが水性組成物であるとき、密度は約１に近く、浸透圧は、本発明の組成物と同様に、浸透圧と実質的に等しくなる。

他の態様において、本発明の熱ゲル化組成物は、等張（ｉｓｏ−ｏｓｍｏｌａｒ）である。

他の態様において、本発明の組成物が人類の血漿内に注入することを想定する場合、好ましくは、浸透圧は、２５０〜４００、より具体的には２８０〜３５０ｍｏｓｍ／ｋｇである。

他の態様において、本発明の組成物が人類の滑液内に注入することを想定する場合、好ましくは、浸透圧は、３００〜４９０、好ましくは３６０〜４７０ｍｏｓｍ／ｋｇである。

溶液の浸透圧の決定は、自動マイクロオスモメーター（Ｌｏｓｅｒ ＭｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋのＯｓｍｏｍｅｔｅｒ Ｔｙｐｅ １５Ｍ）を用いて達成される。この装置の部分は、３００ｍｏｓｍ／ｋｇの溶液を用いて前もって校正される。試料はこの目的で備えられる容器中に置かれ、標準的な測定温度に設定される。

有利なことに、本発明の熱ゲル化組成物は、流体の状態で、２０〜８００ｍＰａ．ｓ、例えば４０〜５００ｍＰａ．ｓの動的見掛け粘度（ｄｙｎａｍｉｃ ａｐｐａｒｅｎｔ ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）を有する。

動的見掛け粘度は、回転するモビール（ｒｏｔａｔｉｎｇ ｍｏｂｉｌｅ）を有する粘度計によって測定される。例えば、５ｒｐｍの速度及び８℃の温度でＳ１８型のスピンドルを有するＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄの回転するモビールを備える粘度計を用いる。

他の態様において、本発明の組成物は、例えばシリンジ等の注入デバイス中にそれを充填するときに容易に注入できる見掛け粘度を有する。他の態様において、本発明の組成物は、細い針、例えば２２ゲージの針を通して、室温で、容易に注入できる見掛け粘度を有する。「容易な」注入は、好ましくは、２２ゲージの針を通して熱ゲル化組成物を流すためにシリンジを押す力が、５０ニュートン未満、好ましくは２０ニュートン未満であることを意味する。

本発明の熱ゲル化組成物は、任意で緩衝された水等で希釈されてもよい。例えば、本発明の組成物は、ｐＨを生理的ｐＨに調整し得る緩衝剤で希釈され得る。より具体的には、例えば、本発明の組成物は、ｐＨを約７．５に調整するために、酢酸緩衝剤（例えば１０ｍＭの酢酸ナトリウム三水和物緩衝剤）で希釈され得る。

ゲルにおいて、係数Ｇ´はＧ´´よりも大きい。溶液において、係数Ｇ´はＧ´´よりも小さい。ゾル−ゲル転位は、Ｇ´及びＧ´´の係数の交差により特徴付けられる。

溶液が熱ゲル化能力を有する場合、係数Ｇ´は、特定の温度を超えると、特に生理的温度（即ち製品が注入又は移植される温度）未満の温度で、又は生理的温度の体内に移植又は注入後所定の時間で、係数Ｇ´´を上回る。

温度が上昇すると、係数Ｇ´とＧ´´は交差する。

係数Ｇ´とＧ´´は、例えば、２つの同軸シリンダーの間の流体のせん断を適用するＣｏｕｅｔｔｅせん断を用いるロータリーレオメーター、例えばＲｈｅｏｍｅｔｒｉｃｓのレオメーターＡＲＥＳを用いて、例えば１Ｈｚの頻度、５％の変形量で、測定される。係数Ｇ´とＧ´´の測定は、所定の温度で実施され得る。ここで示す係数の測定は、所定の温度、例えば製品の保存温度の４℃の製品から出発して実施される。この製品は自然に所定の温度、例えば生理的温度、例えば３７℃に達するまで放置され、温度が上昇する速度は調整されない。

有利な場合、貯蔵係数Ｇ´は０．００１〜１０００で、損失係数Ｇ´´は、０．００１〜１０００で、生理的温度、例えば３７℃で、ゲル化後、Ｇ´はＧ´´よりも大きい。

他の態様において、有利な場合、貯蔵係数Ｇ´は０．００１〜１０００で、損失係数Ｇ´´は、０．００１〜１０００で、Ｇ´は保存温度及び／又は室温でＧ´´よりもより小さく、Ｇ´は、生理的温度、例えば３７℃で、ゲル化後、Ｇ´´よりも大きい。

有利な場合、貯蔵Ｇ´及び損失Ｇ´´係数は、製品が冷蔵庫内の保存温度、例えば２又は４℃又は室温、例えば１８〜２５℃から生理的温度、例えば３７℃に移行するときに交差し、これはゾル−ゲル転位を意味し、このシステムの熱ゲル化特性は、目的の用途に適合してゾル−ゲル転位時間を有する。

ゲル化は、それをキトサン溶液をゲル化する十分な温度及び十分な期間維持することにより達成され得る。このゲル化は、例えば、４０℃のオーブンで維持することにより実施される。他の態様において、本発明の熱ゲル化組成物は、１５℃でゲル形態である。本発明において、ゲル化はｉｎ ｓｉｔｕで、即ち例えばヒト又は動物（恒温）の体内に注入後に起こる。特にゲル化は、局所的にゲルを配置する可能性をもたらす。

より具体的には、ゾル−ゲル転位に要する時間は、一般に、２〜４℃（保存温度）から３７℃（生理的温度）に切り替えてから、即ち溶液をヒト又は動物の体内に注入してから、１秒〜４８時間である。

他の態様において、ゾル−ゲル転位は、温度を２〜４℃から３７℃に切り替えてから、５秒〜４８時間、好ましくは４時間以内、尚も好ましくは２時間以内に完了する。

他の態様において、ゲル化は即座に起こる（ゲル化は温度が増大すると（そして測定前に）直ちに起こる）。

他の態様において、熱ゲル化組成物はゲル形態で存在する。例えば本発明の組成物は、ゲル形態でシリンジ中で保管される。

他の態様において、組成物は注入シリンジ内でゲルではないが、所望の位置でゲル化する。本発明の組成物は可逆的なゾル−ゲル転位を有するため、数回のゾル−ゲル転位を実施することが出来る。有利なことに、これは、温度の上昇、即ち典型的にはオートクレーブによる本発明の組成物の滅菌を可能とする。これは、有利なことに、ゲル化が、特に保存、移送又は滅菌の過程での温度の変化に影響されない、熱ゲル化組成物を提供する可能性をもたらす。

本発明の組成物は特に注射を想定しているため、ゲル化特性は、目的の用途に依存して様々なサイズ、例えば１９〜３０ゲージ、例えば２２ゲージの針を有するシリンジによって注射されるように適合される。通常、注射を実施する者は、シリンジのピストンを手で押す。従って、ゲル化していない流体の圧迫に対する抵抗は、出来るだけ容易な注射を可能としなければならない。注射されるとき、組成物は、所望の粘弾特性を有するようにゲル化すべきである。

他の態様において、２２ゲージ針の管の中を流動組成物が流れるのに要する力は、１〜２０ニュートンである。好ましくは、この力は、２〜１５ニュートンである。他の態様において、この力は２〜８ニュートンである。

他の態様において、２５ゲージ針の管の中を流動組成物が流れるのに要する力は、２〜１５ニュートンである。他の態様において、この力は２〜１０ニュートンである。

他の態様において、２７ゲージ針の管の中を流動組成物が流れるのに要する力は、１〜２０ニュートンである。好ましくは、この力は、２〜１５ニュートンである。他の態様において、この力は２〜１０ニュートンである。この注射性は、機械的特性を測定する試験ベンチ、例えば５００Ｎのロードセルを有するＩｎｓｔｒｏｎ Ｂｌｕｅｈｉｌｌ製のものによって測定される。この注射システムは、所望の直径の針を有するシリンジのピストンを押して溶液の注射を達成するのに要する力を測定するのに特に設計されている。このシステムは、幅４ｃｍの垂直スロットを有する高さ１５ｃｍの金属シリンダーを有する。シリンダーは、１０ｃｍ四方の正方形の金属板に乗っている。このプレートは、中央に半径０．５ｃｍの穴が開いている。２２ゲージの針を付けたシリンジを４℃に設定する。シリンジのピストンを押し込む定常速度は、１秒あたり１ｍｍとする。

他の態様において、組成物は、緩衝剤、例えば酢酸緩衝剤又はリン酸緩衝剤を含有する。

緩衝剤は当業者に公知である。

好ましくは、組成物は還元糖、例えばマンニトール又はソルビトールを含有する。

他の態様において、本発明は、０．１〜５質量％の置換されたキトサン、及び好ましくは１〜７質量％のポリオール又は糖塩、例えばグリセロールリン酸塩、及び任意で０．１〜１０％の還元糖を含有する、熱ゲル化組成物に関する。

有利な場合、本発明の組成物は、組成物の全質量に対して０．１〜１．９質量％の置換されたキトサン、及び２〜６質量％のグリセロール、好ましくはグリセロールリン酸塩、及び任意で０．１〜２．５質量％の還元糖を含有する。有利な場合、本発明の組成物は、組成物の全質量に対して０．１〜２．５質量％の置換されたキトサン、任意で０．１〜２．５質量％の還元糖、及び任意で０．１〜５質量％、好ましくは０．５〜２．５質量％のヒアルロン酸を含有する。好ましくは当該組成物はグリセロール又はグリセロール塩を含有しない。

本発明の組成物において、１つ以上のポリオールを使用するのが有利である（存在する場合グリセロールリン酸塩等のポリオール塩に加えて）。

そのようなポリオールは、例えば、以下から選択され得る。イソプロパノール、ソルビトール、アルカリグリコール、例えばプロピレングリコール、ポリ（アルキルグリコール）、例えばポリ（エチレングリコール）、フルクトース、ガラクトース、リボース、グルコース、キシロース、ラムヌロース、ソルボース、エリスルロース、デオキシリボース、ケトース、マンノース、アラビノース、フクロース、フルクトピラノース、ケトグルコース、セドヘプツロース、トレハロース、タガトース、スクロース、アロース、スレオース、キシルロース、ヘキソース、メチルチオ−リボース、メチルチオ−デオキシ−リブロース、及びそれらの混合物のいずれか。

他の特定の態様において、置換を可能とする試薬は、無水コハク酸である。この他の特定の態様において、置換されたキトサンはキトサンスクシミニド、即ち、キトサンは、Ｄ−グルコサミン単位のアミン基の窒素原子にスクシニル基が共有結合している。

キトサンは、キトサン及び置換剤を含む反応に従い置換により修飾され、その中で、キトサンと置換剤が反応して、Ｄ−グルコサミンが置換されたキトサンが得られる。

本発明は、置換されたキトサンを調製する方法にも関する。

この方法は、特に：
−水溶液、好ましくは水に、好ましくはｐＨをキトサンが溶解するｐＨに調整することにより、キトサンを溶解する工程；
−キトサンを置換剤と置換反応させる工程；
−例えば反応媒体のｐＨを変化させる、又は置換キトサンが溶解しない「不溶媒（ｎｏｎ−ｓｏｌｖｅｎｔ）」中にキトサンを沈殿させることにより、好ましくは全単位のモル数に対する置換基のモル数で１０〜５０％のキトサンの置換度で置換反応を停止する工程；
−置換されたキトサンを精製する工程；
を含む。

不溶媒は、キトサンが溶解しない、即ち裸眼で濁りが観察される溶媒を意味する。そのような溶媒は、例えば、エタノール、メタノール、アセトン等の極性溶媒である。

水溶液中にキトサンを溶解する工程は、適切な酸を水に加えることにより達成され得る。

反応工程の間、置換剤の量は、置換されたキトサンの所望の置換度に従って調整され得る。反応工程の間、反応時間は、置換されたキトサンの所望の置換度に従って調整され得る。有利な場合、当該反応は、置換されたキトサンの所望の置換度に従ってキトサンの置換反応が終了するように停止される。

キトサンを置換する様々な反応が公知である。例えば、ＷＯ２０１０／１４２５０７は、キトサン誘導体の調製に関して特に参照され得る。

置換されたキトサンは、Ｄ−グルコサミン及びＮ−アセチル−グルコサミン単位を有し得て、少なくとも幾つかの単位は、同一又は異なる１つ以上の官能基が埋め込まれ（又は共役され）ている。

他の態様において、置換されたキトサンは、グルコサミン単位及びＮ−アセチル−グルコサミン単位を有し、当該単位は、１つ以上の官能基を有する。例えば、Ｎ−アセチル−グルコサミン単位の１つ以上の官能基、即ちヒドロキシル基、及び／又はアミン基、及び／又はグルコサミン単位、即ちヒドロキシ基及び／又はアミン基、と共役することにより、化学的修飾が行われる。

特定の態様において、置換されたキトサン上に存在する官能基は、限定されないが、疎水性官能基、親水性官能基、イオン性官能基及びそれらの組み合わせを含む群から選択される。特定の他の態様において、疎水性官能基は、アルキル、アルケニル、アラルキル、アルカリル基、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。これらの基は、一般に、１〜１００個、より一般的には１〜５０個、例えば１〜２５個、更に１〜１０個の炭素原子を有し、１つ以上の炭素原子が例えばホウ素、窒素、酸素、硫黄、ケイ素、ゲルマニウム、エステル、アミド、尿素、ウレタン基又はそれらの組み合わせから選択されるヘテロ原子及び／又は原子で置換されてもよく、１つ以上の水素原子は、例えば、ハロゲン原子、アルコキシ、アミド基及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるヘテロ原子及び／又は原子で置換され得る。

他の態様において、疎水性官能基は、カルボン酸、オルガノスルホン酸、ポリエーテル、アミンポリエーテル、ポリエステル、ステロール、ポルフィリン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

他の態様において、親水性官能基は、ジアミン、ポリアミン、ジオール、ポリオール、二酸、多酸、クラウンエーテル、グリム、ポリアルケニルエーテル、ポリアルケニルアミン、ポリアルケニルエーテルアミン、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

他の特定の態様において、イオン性官能基は、金属塩、アンモニウム塩、ホスホニウム塩、硫酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、カルボン二酸（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ｄｉａｃｉｄ）、ポリカルボン酸、キトサンと共有結合を形成するために使用されるカルボン酸基、ジアミン、ポリアミン、キトサンと共有結合を形成するために使用されるアミン官能基、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

特定の他の態様において、キトサンを置換する官能基は、アミノアルキル基である。例えば、キトサンを置換する官能基は、アミノエチル基である。

他の態様において、置換されたキトサンは：
−例えばアミノエチルキトサン等のアミノアルキルキトサン、及びそれらと同等のもの；
−疎水化Ｎ−アルキル又はＯ−アルキルキトサン、例えばエタノイル、プロパノイル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル、ノナノイル、デカノイル、又はドデカノイルキトサン及びそれらと同等のもの；
−正電荷キトサン、例えばトリアルキルアンモニウムキトサン（例えばトリメチルキトサン又はＴＭＣ）及びそれらと同等のもの；
−Ｎ−（２−ヒドロキシ）プロピル−３−トリメチルアンモニウムキトサン及びその対イオン、例えばその塩化物及びそれらと同等のもの；
−負電荷キトサン、例えばキトサンスクシンイミド（スクシニルキトサン）、Ｎ，Ｏ−カルボキシアルキルキトサン、Ｎ，Ｏ−スルホアルキルキトサン及びそれらと同等のもの；
−中性キトサン、例えばＮ，Ｏ−アセチルキトサン、Ｎ，Ｏ−アルキルキトサン、エタノイル、プロパノイル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル、ノナノイル、デカノイル、ドデカノイルキトサン及びそれらと同等のもの；
−双性イオン性キトサン、例えば疎水性ポリマー、例えば油性ポリエステル、例えば乳酸の、グリコール酸の、イプシロンカプロラクトンの、油性及び／又は芳香族ポリエステルのｐ−ジオキサノンの；油性ポリアミドの；ホモポリマー及びコポリマー等；エリスレンポリマー及びそれらのコポリマー；ポリマー及びプロピレンポリマー及びコポリマー；ポリカルボネート；ポリアクリレートおおｙ日それらの同等のもの；を含有するキトサンである。

特定の態様において、本発明の範囲内で他の誘導体が使用され得、それらは、グルコサミン及び／又はＮ−アセチル−グルコサミン単位のヒドロキシル基において置換が達成されるＯ−置換されたキトサンを含む。

他の態様において、キトサンは、置換基として疎水性ポリマーを有し、好ましくは、油性ポリエステル及び油性ポリアミド、アルケンホモポリマー又はコポリマー、例えばエチレン又はプロピレンのポリマー、ポリカルボネート、ポリアクリレート、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

他の態様において、キトサンは、置換基として、油性ポリエステル、特にポリアクチドを有する。

キトサンの置換方法として、米国特許ＵＳ ７，８３８，６４３に記載の反応及びその結果得られるキトサンに注目されたい。

米国特許ＵＳ ３，９５３，６０８にも注目されたい。

他の態様において、置換剤として、例えば、任意で１つ以上の不飽和を含み、任意で、１つ以上のヘテロ原子及び／又は官能基（例えばエーテル、チオエーテル、カルボキシ、エステル、アミド等）を含み、任意で１つ以上の置換基（アルキル、アミン、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボン酸基等）を含む、Ｎ−アルキル化剤、又は無水アルキルを使用することが出来る。

他の態様において、無水コハク酸の例として、無水グルタミン酸、無水アセトキシコハク酸、無水メチルコハク酸、無水ジアセチル酒石酸、無水ジグリコール酸、無水マレイン酸、無水イタコン酸、無水シトラコン酸、及びそれらの混合物に注目されたい。

理論的には、中性又は生理的ｐＨで、最終組成物中に溶解するキトサンを提供する能力をもたらす任意の薬剤が適切であり得る。

反応を停止する工程が沈殿によって達成される場合、精製は、不溶性の置換されたキトサンと不溶媒とを分離することから成り得る。

精製後、本発明の方法は、置換されたキトサンを乾燥し、任意で粉砕して粉末を取得する工程を含み得る。

特定の他の態様において、置換剤は無水コハク酸である。置換されたキトサンは、キトサンスクシンイミドである。

キトサンスクシンイミドは、以下の方法によって取得され得る：
−キトサンをｐＨ６．５未満の水溶液に溶解する。
−当該溶液を０℃〜１００℃、好ましくは２０℃〜５０℃、更に好ましくは２５℃〜３５℃の温度で維持する。
−キトサンの溶解後、当該キトサン溶液に例えば粉末の無水コハク酸を添加する。無水コハク酸の量及び無水コハク酸の添加の回数は、置換されたキトサンの所望の置換度に依存して適合される。
−最小の置換度が達成されるのに十分な時間後、例えば１５分後、反応を停止する。反応は、例えば、反応媒体のｐＨを変化させて、又はエタノール、メタノール、アセトン等の不溶媒中での沈殿工程により停止され得る。
−当該置換されたキトサンを、有利な場合、例えば透析技術により、又は不溶媒中での沈殿／可溶化サイクルにより、又は接線濾過技術（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）により、精製する。
−精製した産物を、好ましくは乾燥させる。当該産物は、例えばスプレー乾燥（噴霧化）、又はオーブン中で（ｉｎ ｖａｃｕｏ又は大気圧で）、又は更に凍結乾燥により、乾燥され得る。

キトサンの水溶液のｐＨは、キトサンを溶解するために、例えば弱酸、例えば酢酸、乳酸等の溶液を用いて調整され得る。

キトサンの置換度は、有利な場合、１０〜３０％、好ましくは１５〜３０％、尚も好ましくは１５〜２５％であり、これらは全単位のモル数に対する置換基のモル数として表される。特に、本発明は、置換度が１０〜３０％、好ましくは１５〜３０％、尚も好ましくは１５〜２５％である置換されたキトサンを含有する熱ゲル化組成物に関し、当該組成物は、グリセロール組成物を含有しない。

キトサンスクシンイミドの置換度は、反応開始時のキトサンと試薬の質量比に関連する。他の態様において、キトサンスクシンイミドの場合において０．１３を超える試薬の質量比の使用が好ましい。他の態様において、キトサンスクシンイミドの場合において０．２未満試薬の質量比の使用が好ましい。

特定の他の態様において、置換剤は、Ｄ−グルコサミン単位のアミン基をアルキル化する薬剤である。有利な場合、置換されたキトサンは、Ｄ−グルコサミン単位上のアルキル化キトサンである。アルキル化剤として、ハロゲノアルキル、例えばハロゲノメチル、メチルヨーダイド、メチルブロマイド、アシルクロライド、例えば１つ以上のカルボキシメチル、アミノエチル及び／又はトリメチル基等を担持するものに注目されたい。

他の態様において、置換されたキトサンは、Ｎ−アルキルキトサンである。特定の他の態様において、置換されたキトサンは、トリメチル置換基を担持するキトサンである（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン、略称ＴＭＣ）。

他の態様において、アルキル化キトサン、好ましくはＴＭＣは、０．１〜０．３５、好ましくは０．１５〜０．３０の試薬のモル比で取得され、これらのモル比は、キトサンに最初に存在するアミン基のモル数に対するアルキル化剤のモル数で表される。

キトサンは、例えばＣＡＳ ９０１２−７６−４の番号で参照される。

本発明に使用されるキトサンは、有利な場合、真菌起源であり、好ましくはＡｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ型、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、及び／又は真菌Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ、及び特にＬｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ （シイタケ）及び／又はＡｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ（マッシュルーム）真菌の菌糸体由来である。好ましくは、キトサンはＡｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓに由来する。琴さんは好ましくは高純度、即ち真菌由来の不純物を殆ど含有せず、インプラント又は医薬組成物としてのその使用に適合した微生物学的品質を満たす。キトサンを調製する方法は、例えば特許ＷＯ ０３／０６８８２４ （ＥＰ １ ４８３ ２９９； ＵＳ ７，５５６，９４６）に記載されている。

調製されたキトサンの分子量は様々であってよく、一般に１０，０００〜３００，０００である。

他の態様において、平均分子量は２０，０００〜６０，０００である。

他の態様において、平均分子量は６０，０００〜１００，０００である。

他の態様において、平均分子量は１００，０００〜１２０，０００である。

他の態様において、平均分子量は１２０，０００〜１５０，０００である。

他の態様において、平均分子量は１５０，０００〜２２０，０００である。

その分子量を減少させるために、キトサンを加水分解することが可能である。

好ましくは、平均分子量は、Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋ式に従い固有粘度から算出される、粘度における平均分子量（Ｍｖ）である。固有粘度は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ｍｏｎｏｇｒａｐｈｙ ＥＰ２．２．９の方法に従い、Ｕｂｂｅｌｏｈｄｅ型のキャピラリー粘度計を用いてキャピラリー粘度測定によって測定される。適切なキャピラリー管（Ｌａｕｄａ、例えば直径０．５３ｍｍのＵｂｂｅｌｏｈｄｅ ５１０ ０１キャピラリー管）を通る溶液の通過時間が、自動粘度計Ｌａｕｄａ Ｖｉｓｃによって測定される。ＥＰ２．２．９の方法の推奨に従い、例えば最初に初期のキトサン濃度、そして幾つかの希釈物について測定される。減少する固有粘度がそれから各濃度において推定される。減少する粘度は温度に対してプロットされ、濃度０における値は、それから固有粘度を推定するために推定される。例えば、ｉ希釈の減少する粘度（η_ｒｅｄ、ｍｌ／ｇ）は、式５に従い、ｉ希釈（ｇ／ｍｌ）の濃度Ｃに対してプロットされる。
式２． ［η_ｒｅｄ］ ＝ （ｔ_１ − ｔ_０） − （１ − Ｃ）

平均粘度測定質量（ｖｉｓｃｏｓｉｍｅｔｒｉｃ ｍａｓｓ）を算出するために、Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋ式には、下記の３つの式の１つに示すように、キトサンのＤＡに従い、Ｒｉｎａｕｄｏ ｅｔ ａｌ． （Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ， １９９３， １５， ２８１−２８５）により推奨されるように、係数ｋ及びアルファが適用される。
式３． Ｍｖ ＝ （［η］／０，０８２）^{（１／０，７６）}ＤＡ２％の場合
式４． Ｍｖ ＝ （［η］／０，０７６）^{（１／０，７６）}ＤＡ１０％の場合（例えば１１．５％）
式５． Ｍｖ ＝ （［η］／０，０７４）^{（１／０，７６）}ＤＡ２０％の場合（例えば２１％）

中間のＤＡ値において、平均粘度測定質量（Ｍｖ）を計算するために、線形補間が行われる。

好ましくは、使用されるキトサンの平均分子量は、１２０，０００〜１５０，０００、又は更に１５０，０００〜２２０，０００である。

特定の他の態様において、置換されたキトサンの平均分子量は１５０，０００〜２２０，０００であり、置換度は１０〜５０％であり、分子量は好ましくは置換前のものを表す。

特定の他の態様において、置換されたキトサンの平均分子量は１２０，０００〜１５０，０００であり、置換度は１２〜４０％、好ましくは１２〜３０％、又は２０〜３０％であり、分子量は好ましくは置換前のものを表す。

有利な場合、キトサンのアセチル化度（ＤＡ）は、５〜５０％である。アセチル化度は、存在するＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びＤ−グルコサミン単位の全個数に対するＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの数として表される。

他の態様において、アセチル化度は５〜２０％である。

他の態様において、アセチル化度は１５〜２５％である。

他の態様において、アセチル化度は２０〜３０％である。

他の態様において、アセチル化度は２５〜４０％である。

アセチル化度は、電位差測定法によって決定される。キトサンは、塩酸溶液中に溶解される。キトサンのアミン基と反応しなかった過剰の塩酸は、水酸化ナトリウムの滴定された溶液によってアッセイされる。従って、キトサン中に存在するＤ−グルコサミン単位のモル数は、それから推定され、よって差し引きによってアセチル化度が導き出される。

有利な場合、キトサンのアセチル化度は調整される。キトサンのアセチル化度の調整とは、産物のアセチル化度、即ちＮ−アセチル−グルコサミン単位の割合が調整され得ることを意味する。

有利な場合、本発明の組成物は、置換されたキトサン以外の生体ポリマーをも含有し得る。有利な他の態様において、生体ポリマーは、多糖類、例えばヒアルロン酸又はヒアルロン酸ナトリウムである。

ヒアルロン酸の分子量は、最大で４ＭＤａであり得る。ヒアルロン酸の分子量は、その固有粘度によって反映され得る。ヒアルロン酸の固有粘度は１〜４ｍ^３／ｋｇで有り得、例えば、低分子量（例えば約１〜２ｍ^３／ｋｇ）又は高分子量（例えば約２〜４ｍ^３／ｋｇ）として特徴付けられ得る。

有利な場合、ヒアルロン酸濃度は、組成物の全質量に対して４％未満、例えば３％未満、更に例えば２％未満である（ｍ／ｍ）。

特定の他の態様において、ヒアルロン酸の濃度は、最終組成物の質量に対して１．９％未満である（ｍ／ｍ）。有利な場合、ヒアルロン酸の濃度は、最終組成物の質量に対して０．５〜１．５％である（ｍ／ｍ）。特定の他の態様において、ヒアルロン酸の濃度は、最終組成物の質量に対して約０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．５％である（ｍ／ｍ）。

キトサンとヒアルロン酸の比率は、例えば置換されたキトサンが５〜９５％、例えば１０〜９０％、更に例えば３０〜７０％、及びヒアルロン酸が５〜９５％、例えば１０〜９０％、更に例えば３０〜７０％であってもよく、パーセンテージは置換されたキトサンの乾燥重量／ヒアルロン酸の乾燥重量として表される。他の態様において、このキトサンとヒアルロン酸の比率は１／１（即ちキトサン５０％及びヒアルロン酸５０％）である。他の態様において、キトサンとヒアルロン酸の比率は１．５／０．５（即ちキトサン７５％及びヒアルロン酸２５％）である。

有利なことに、置換されたキトサンに基づく熱ゲル化組成物は、ヒアルロン酸の存在下、ゲルを形成する。有利なことに、この他の態様において、熱ゲル化組成物の流動特性は、濃度、キトサンとヒアルロン酸の比率、及びヒアルロン酸の分子量によって調整され得る。

有利な場合、ゲルの特性は、ヒアルロン酸の存在下で保持される。

有利なことに、任意でヒアルロン酸と混合された置換されたキトサンを含有するゲルは、良好な粘着性を有し、低い振動数、例えば歩行中の膝の滑液が晒されるのに類似の頻度で（Ｇ´係数０．６Ｈｚによって表される）、ゲルの衝撃を吸収する能力、及び関節の潤滑の能力（安静時粘度によって表される）に優れた、ゲルをもたらす。

本発明は、本発明の熱ゲル化組成物を調製する方法にも関する。

他の態様において、前記方法は、典型的には：
−置換されたキトサンを、好ましくは水であり、任意で緩衝され、好ましくはｐＨ６．２〜８．５、好ましくは６．５〜７．５である、水溶液に溶解する工程；
−任意でｐＨを、例えば緩衝剤を添加して、生理的ｐＨに調整する工程；
−任意で組成物の浸透圧を調整する工程；
−任意で組成物の粘度を調整する工程；
を含む。

他の態様において、前記方法は、典型的には：
−置換されたキトサンを、好ましくは水であり、任意で緩衝され、好ましくはｐＨ６．２〜８．５、好ましくは６．５〜７．５である、水溶液に溶解する工程；
−任意でｐＨを生理的ｐＨに調整する工程；
−糖又はポリオール塩の溶液、例えばグリセロールリン酸塩の溶液と混合する工程；
−任意でｐＨを、例えば緩衝剤を添加して、生理的ｐＨに調整する工程；
−任意で組成物の浸透圧を調整する工程；
−任意で組成物の粘度を調整する工程；
を含む。

前記方法は、必要な場合、組成物の他の成分を添加する工程を含む。

他の態様において、キトサンの溶解は、還元糖、例えばマンニトールを含有する水中で実施される。

他の態様において、緩衝剤は酢酸緩衝剤である。

他の態様において、緩衝剤はリン酸緩衝剤である。

有利な場合、前記方法は、シリンジ等の注入デバイスを本発明の組成物で充填する後続の工程を含む。有利なことに、当該注入デバイス、例えばシリンジは、蒸気による滅菌に供され得る。このデバイス、例えばシリンジは、好ましくは滅菌的に包装され得る。

所望の用途に十分な純度を有するキトサンを使用するのが有利である。

更に具体的には、本発明は、本発明の熱ゲル化組成物を含有する注射用組成物に関する。

他の態様において、本発明の組成物は、注射用医薬組成物として、又は注射用若しくは移植用医療デバイスとして使用される。

より具体的には、本発明は、例えば皮下、真皮内、眼球内又は関節内経路で、例えば修復又は充填を要する１つ以上の身体組織を修復又は充填するために、治療的処置に使用される、本発明の組成物に関する。

他の態様において、身体組織は、声帯、筋肉、靭帯、腱、軟骨、生殖器、骨、関節、眼球、真皮又はそれらの任意の組み合わせ、より具体的には関節に属する組織から選択される。

本発明は、より具体的には、例えば滑液内に注入することにより、又は血液及び軟骨内の移植物と混合した後に注入することによる、関節症の治療のための、又は軟骨の機能不全を修復するための、本発明の組成物に関する。

より具体的には、本発明は、本発明の組成物を含有することを特徴とする、例えば医療用移植物等の医療用デバイスに関する。

本発明は、その特性の調整が可能な１つ以上の添加物又は賦形剤をも含み得る。特定の他の態様において、本発明の組成物は、粒子の懸濁物、例えば固体粒子又はゲルを含有する。

本発明は、真皮を充填することにより美容的処置又は治療方法に使用される、本発明の組成物にも関する。これは、特に、例えば、皮下又は真皮内経路を経て本発明の組成物を注入することである。

また、本発明は、真皮内経路を経て複数回注射により皮膚の表面を処置する方法における使用のための、本発明の組成物に関する。そのような組成物は、典型的には、美容目的の処置のような皮膚科学において使用され得る。例えばそのような方法は、皺のある外観を緩める（皺の治療）ように皮膚に再び張りをもたらす目的を有する。そのような方法は、皮膚の若返りを望む対象に対して実施され得る。

本発明は、美容ケア又は治療方法における使用のための本発明の組成物にも関する。ここで、当該組成物は、粘性添加剤である。例えば、本発明の組成物は、関節のいずれかの側に位置する滑膜の摩擦を制限するために関節内に注入される。

本発明は、１つ以上の細胞種及び／又は１つ以上の有効成分の細胞運搬体として使用される本発明の組成物にも関する。これらは、医薬的又は生物学的観点から有効成分であり得る。本発明の組成物は、実際に、細胞、好ましくは生細胞の存在に適したものであり得る。所望の生細胞の中で、例えば：軟骨細胞（関節軟骨）、線維軟骨細胞（半月板）、歯根膜線維芽細胞（歯根膜）、皮膚線維芽細胞（皮膚）、腱細胞（腱）、筋線維芽細胞（筋肉）、間葉系幹細胞、赤血球（血液）及びケラチノサイト（皮膚）に注目されたい。本発明の組成物は、標的化送達用、又は１つ以上の治療剤の調整放出用の治療用運搬体として用いられても良い。

他の態様において、血液又は結晶又は血小板溶解物又は多血小板血漿又は任意の生体液が、本発明の組成物に添加されて、例えば製品の性能が向上し得る。

他の態様において、本発明の組成物は、移植されると可溶化する固体形態（例えばフィルム又は多孔質フォーム）に製剤化される。

他の態様において、組成物は、噴霧組成物（スプレー）として製剤化される。

本発明は、火傷等の高温に晒された１つ以上の組織又は器官の治療又は美容ケア方法において使用される本発明の組成物に関する。

本発明は、本発明の熱ゲル化組成物を含有する人工滑液としての組成物にも関する。

本発明の組成物は、シリンジに充填するのに容易に注入でき、又は人体又は動物の体内に注入されつつ、その衝撃吸収特性（弾性係数Ｇ´によって特定される）を改善しようとすることにより健康な又は不健康な滑液を改善する、又は健康な滑液を模倣する可能性をもたらす。示唆されるように、健康な滑液の弾性係数Ｇ´は４０〜１００Ｐａであり、損失係数Ｇ´´は、１〜１０Ｐａである。

他の態様において、熱ゲル化組成物は流動形態で注入され、ｉｎ ｓｉｔｕでゲル化する。

他の態様において、熱ゲル化組成物はゲルとして注入される。有利な場合、この他の態様において、ゲルは細い針を通って容易に注入できる。

一般に、生体医療的用途において想定される浸透圧及びｐＨの範囲は、以下の数値に近くなる。
−浸透圧：
−血漿と等張：２８５〜２９５ｍｏｓｍ／ｋｇ；
・滑液と等張：４０４＋／−５７ｍｏｓｍｌ／ｋｇ（Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｓ， １９８８， ２３５， ２８９−９５ ≫ ａｎｄ ≪ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ， ２０１２， ４２２， ４５５-４６１）
−ｐＨ：

生理的ｐＨは一般に６．８以上、特に７．０以上、特に７．４である（血漿又は滑液と同様）。

血漿のｐＨは、一般に７．４である。滑液のｐＨは一般に７．７６８＋／−０．０４４（Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ｂｒ， １９５９， ４１−Ｂ（２）， ３８８−４００）；又は７．３（Ａｃｔａ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｃａｎｄ， １９６９， ４０， ６３４-６４１、若しくはＣｌｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２００６， ２５， ８８６-８８８）である。

変形性関節症における滑液のｐＨは、一般に健康な滑液よりも低くなると考えられている。

驚くべきことに、本発明の熱ゲル化組成物は、滑液、特に骨関節症に罹患しているヒトの膝から取った滑液と混合して、非常に良好な特性を有する。

ヒアルロン酸に基づく従来技術の組成物は、ヒアルロン酸が骨関節症に罹患している患者の滑液で希釈されると、粘性添加物としての特性は低下する。一方、本発明の熱ゲル化組成物は、滑液中に希釈されても、そのゲル特性を保持する。更に驚くべきことに、本発明の熱ゲル化組成物は、滑液、特に骨関節症に罹患しているヒトの膝から取った滑液と混合すると、レオロジー的特性が強化される。

これは、本発明の熱ゲル化組成物と滑液との間の相乗効果と称され得る。

従って、本発明は、滑液と本発明の熱ゲル化組成物との混合物に関し、例えば、熱ゲル化組成物と滑液の体積比は２０／８０〜８０／２０（ｖ／ｖ）、例えば５０／５０である。

有利な場合、本発明の組成物は滅菌される。非常に有利な場合、本発明の組成物は、温度上昇により、好ましくはオートクレーブにより、滅菌される。

他の態様において、本発明の組成物は、透明又は半透明である。

「半透明（ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｔ）」は、観察者の目と物体との間にその組成物が置かれたときにその物体が判別可能であることを意味する。「透明（ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ）」は、その組成物が観察者の目と観察される英数文字との間に置かれたとき、その英数文字が判別可能であることを意味する。一般に、この評価は、約１ｃｍの厚さの組成物を用いて行われる。

他の態様において、本発明の組成物は無色、即ち特に裸眼の観察者がその組成物に特定の色を認識しない。

特に、本発明は、本発明の熱ゲル化組成物を予め充填した１つ以上の注入デバイスを有する、好ましくは滅菌済みの物品又は包装に関する。これらは、典型的には充填済みのシリンジである。

本発明の組成物は、有利な場合、滅菌されている。他の態様において、本発明の組成物は、滅菌に十分な時間、例えば一般に１５〜２０分間、オートクレーブ中で、１００℃以上、好ましくは１２０℃以上、例えば１２１〜１３８℃に温度を上げること等により、蒸気で滅菌される。

特に、本発明は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位、Ｄ−グルコサミン単位、及び置換されたＤ−グルコサミン単位、あるいはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位及び任意で置換されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位を含有する、滅菌熱ゲル化組成物を包含する。

有利な場合、置換された熱ゲル化組成物は可逆的なゾル−ゲル転位を有する。

他の態様において、前記組成物は蒸気で滅菌される。

他の態様において、組成物は好ましくはオートクレーブ中で温度上昇により滅菌される。

有利な場合、他の態様において、滅菌熱ゲル化組成物は、滅菌後にゲル化しない。

有利な場合、他の態様において、滅菌熱ゲル化組成物は、滅菌前又は後に、１０℃又は１５℃以上でゲル化する。

他の態様において、溶液は本発明の熱ゲル化組成物からなり、又はこれを含有する。

他の態様において、組成物は、好ましくは閉じたチャンバー中で１００℃以上に温度を上げて蒸気によって滅菌される。有利な場合、それは、オートクレーブ中で温度を１２０℃以上に上げて滅菌される。

他の側面の本発明は、そのような組成物を滅菌する方法に関する。

より具体的には、本発明は、熱ゲル化組成物を滅菌する方法に関し、当該方法は、少なくとも以下の工程：
−オートクレーブのチャンバー中にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位、Ｄ−グルコサミン単位、及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位以外の置換されたＤ−グルコサミン単位を有する置換されたキトサンを含有する熱ゲル化組成物を置く工程；
−当該オートクレーブのチャンバーの温度を滅菌温度まで上げ、滅菌時間の間その温度を維持し、当該温度及び滅菌時間は、当該熱ゲル化組成物を滅菌するのに十分である工程；
−当該オートクレーブのチャンバーの温度を下げる工程；
−当該オートクレーブのチャンバーから当該熱ゲル化組成物を取り出す工程；
を含むことを特徴とする。

他の態様において、チャンバーの温度は、６０℃以上、好ましくは１００℃以上、好ましくは１２０℃以上に維持される。

他の態様において、滅菌温度は１２０〜１４０℃である。有利な場合、滅菌時間は３分以上、好ましくは１０分以上、好ましくは１５分以上、尚も好ましくは２０分以上である。

滅菌時間は、一般に、処理される試料の体積に依存する。

参考までに、他の態様において、滅菌時間は１５分又は２０分である。

より具体的には、一般に、滅菌は、ＩＳＯ１７６６５標準に従い、３〜３０分間、１２１℃〜１３８℃で維持しながら実施されることが推奨される。

他の態様において、滅菌温度は１２１℃〜１３８℃で約２０分間維持される。

オートクレーブのチャンバー中の圧力は、閉じたチャンバー中の蒸気の圧力と等しい。一般に、滅菌時間において２バール以上である。尚もより具体的には、滅菌は、１５分間大気圧よりも１００ｋＰａ大きい圧力でのオートクレーブ中で実施されるのが推奨される。

より具体的には、蒸気による滅菌は、全ての細菌及び／又はコンタミナントを除去する目的を有する。

有利な場合、冷却工程は、室温（２０〜２５℃）まで冷却することを含む。有利な場合、この工程は、圧力を大気圧まで下げることも含む。

他の態様において、滅菌方法は、１回以上の蒸気滅菌サイクルを含む。

ヒト又は動物の体内に注入又は適用されることを意図する滅菌製品に適した任意の種類のオートクレーブが使用され得る。そのようなオートクレーブは、当業者に公知である。

他の態様において、使用されるオートクレーブは、生物及び／又は医療製品の滅菌用のオートクレーブである。

有利な場合、本発明の組成物は、容器中、より具体的にはそれをヒト又は動物の体内に注射することを可能とするデバイス中で滅菌される。

有利な場合、注射デバイス、具体的にはシリンジに充填するために、ゲルが溢れずにデバイス中に保持されるように、充填オリフィスの反対側で逆圧が掛けられる。

他の態様において、本発明の組成物を含有するシリンジは、滅菌のためにオートクレーブのチャンバー中に置かれる。

こうして、本発明の滅菌組成物を含有する充填済みの滅菌シリンジが取得される。

特に、本発明は、特に濾過滅菌（０．２２μｍフィルター）が粘度のため利用出来ないため、濾過により滅菌出来ない熱ゲル化組成物に関する。

他の態様において、本発明の熱ゲル化組成物の粘度は、２００ｍＰａ．ｓである。

更に、本発明は、本発明の凍結乾燥組成物を包含する。凍結乾燥は、滅菌前又は後にされてもよい。

更に本発明は、乾燥形態、特に凍結乾燥形態の本発明の組成物を包含する。

特に、使用前に、この凍結乾燥組成物を（再）分散することが出来る。

本発明は、本発明の組成物の注入を含む、治療方法をも包含する。

本発明は、特に治療的処置、例えばより具体的には本発明によって規定される治療的処置のための、医薬組成物を調製するための、本発明の組成物の使用をも包含する。

本発明は、本発明の組成物の使用又は注入を含む、美容的ケア方法、あるいは非治療的方法をも包含する。例えば、これは、皺を伸ばすことや例えば事故又は外科的治療後の１つ以上の損傷を受けた外見的な組織を美容目的で充填することである。

組織は、機能的集団として纏められた、即ち同一の機能に貢献する、類似の細胞及び同一の起源の細胞の集団である。組織の中でも、特に上皮組織、結合組織、筋組織及び神経組織に注目されたい。

「本発明の組成物」又はこれに相当する語句は、本発明に規定される組成物を意味し、任意の他の態様、特定の態様を含み、独立して、それらの任意の組み合わせを含み、好ましい態様を含む。

図１は、本発明のキトサンスクシンイミドのプロトン核磁気共鳴スペクトルを図示する。

本発明の他の目的、特徴及び利点は、実施例に示す例示的記載を参照して、当業者にとって明確になり得る。実施例は例示のみを目的とし、如何なる場合も本発明の範囲を限定しない。

実施例は、本発明の不可欠な部分であり、実施例を含む全体として取り上げられる記載から従来技術の何らかの言及に対して新規であると認められる任意の特徴は、その機能及び一般性において本発明の不可欠な部分である。

従って、各実施例は一般的な範囲を有する。

一方、実施例において、他の言及が無い限り全てのパーセンテージは質量パーセントで、他の言及が無い限り温度は摂氏で、他の言及が無い限り圧力は大気圧である。

本発明の置換されたキトサンの前駆体キトサンは、表１の範囲内に在る、平均的な粘度における分子量（Ｍｖ、キャピラリー粘度計によって決定される）、及びアセチル化度（ＤＡ、電位差滴定により決定されるＮ−アセチル−グルコサミン単位の比率）を有する。キトサンの分子量も、１％（ｖ／ｖ）の酢酸中の１％（ｍ／ｍ）キトサン溶液の動的粘度によって規定されてもよく、動的粘度は、上記のように、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度計のような、回転するモビール（ｒｏｔａｔｉｎｇ ｍｏｂｉｌｅ）を有する粘度計によって測定される。

実施例１−置換されたキトサン（キトサンスクシンイミド、ＣＳＳ）の調製
表２の参照ＣＳＳ５のキトサンスクシンイミドを取得するため、既知の分子量のキトサン１０ｇとＤＡを酢酸１％（ｖ／ｖ）水溶液２６６ｍｌに溶解した。この溶液を３０℃で維持した。無水コハク酸（ＳＡ）を６．７５ｇ添加し、これは無水コハク酸対キトサンの質量比（ＳＡ／キトサン）が０／６７５に対応し、無水キトサン対キトサンＮＨ２基のモル比が１／７に対応する。１５分後、反応媒体中のｐＨを任意で３０％ソーダを添加して７．５に調整してもよい。この溶液を２．５リットルのエタノールから沈殿させる。この沈殿物を回収し、再び水に溶解させる。置換されたキトサンは、エタノールからのこれらの沈殿工程及び水への溶解を３回行う。最後の沈殿のとき、沈殿物を回収し、圧縮し、オーブン中で大気圧６０℃で乾燥させる。キトサンスクシンイミドが乾燥したら、これを粉砕して粉末を取得する。キトサンの置換度は、上記の方法に従いプロトンＮＭＲによって決定される。ＮＭＲスペクトルを図１に示す。

実施例で使用するキトサンスクシンイミドのバッチは、表２に示すパラメーターを用いて、同様に調製された。
注：ベータ−グリセロールリン酸ナトリウム（６５％、Ｓａｌｆｉｃ−Ａｌｃａｎ、ＧＰと略す）の添加は、ＣＳＳを水溶性の上限を超えて溶解させる可能性をもたらす。ＣＳＳは両性イオン性の特性を有するが、ＣＳＳの溶解特性を再び見出すために低濃度のＧＰを添加出来るので、これは問題ではない。

実施例２−置換されたキトサン（トリメチルキトサン、ＴＭＣ）の調製
８００ｍｌの水にキトサン５０ｇを懸濁する。この懸濁物を９５℃に加熱する。この媒体に、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド試薬（ＣＨＴＡＣと略す）２６．２７ｍｌを滴下により添加して、ＣＨＴＡＣ／キトサンの質量及びモル比をそれぞれ０．３１及び０．５とする。４時間反応後、反応媒体を４００ｍｌの水で希釈し、８．４リットルのエタノールから沈殿させる。この沈殿物を回収し、再び水に溶解させる。置換されたキトサンは、エタノールからのこれらの沈殿工程及び水への溶解を３回行う。最後の沈殿のとき、沈殿物を回収し、圧縮し、オーブン中で大気圧６０℃で乾燥させる。トリメチルキトサンが乾燥したら、これを粉砕して粉末を取得する。

実施例で用いるトリメチルキトサンは、表３２に示すパラメーターを用いて、同様に調製された。
注：これらの全てのトリメチルキトサンはＤＳ範囲１６〜７５％で水に完全に溶解する。

実施例３−熱ゲル化組成物の調製の例
実施例１で取得したキトサンスクシンイミド（ＣＳＳ２）を、以下の比率で水に溶解する：０．５％（ｍ／ｍ）のマンニトールを含有する水１４．８０９ｇの水にキトサンスクシンイミドＣＳＳ２を０．１９５ｇ。ベータ−グリセロールリン酸ナトリウムの溶液（６５％、Ｓａｌｆｉｃ−Ａｌｃａｎ、ＧＰと略す）を３９．７％（ｍ／ｍ）で調製する。磁気的又は機械的に撹拌しながら、ＧＰ溶液１．４９ｍｌを、キトサンスクシンイミド溶液に添加する。このキトサンスクシンイミド／ＧＰ溶液に、０．３２５ｍｌの酢酸緩衝剤０．５Ｍ（ｐＨ３）を、所望のｐＨ、例えば表４の溶液Ｎｏ．２の場合７．５、になるまで添加する。最終溶液の浸透圧を測定する。

実施例４−最終濃度１．１４％（ｍ／ｍ）のキトサンスクシンイミド溶液のゲル化能力
表４の溶液は、実施例３に記載の方法に従い調製された。

熱ゲル化溶液のゲル化能力は、特に置換度に依存する。置換度は、キトサン上に存在するアミン基の間のモル比や、置換反応の間に使用されるコハク酸無水物の量に直接関連する。置換度が高すぎると、ゲル化が起こらない（溶液Ｎｏ．５）。置換度が低すぎると、ゲル化が起こらない（溶液Ｎｏ．１）。

表４は、キトサンスクシンイミドにおいて、熱ゲル化能力をもたらす最適なＡＳ／キトサン質量比が０．１２〜０．２６、ＤＳ範囲では１０〜４５％であることを示す。

更に、表５の熱ゲル化溶液は、ＤＳを１４〜１８ｍｏｌ％に納める可能性をもたらす質量比０．１３のハイドロゲルの調製の再現性を実証するために、キトサンスクシンイミドの異なるバッチから出発して調製された。最終溶液の浸透圧は３６３〜４４７ｍｏｌ％であり、全ての溶液は注入が容易で熱ゲル化能力を有していた。マンニトールの存在（熱ゲル化能力においては任意的）は、浸透圧を増大させた。

実施例５−最終濃度０．９％（ｍ／ｍ）での置換されたキトサンＴＭＣのゲル化能力
「中」分子量のトリメチルキトサンの場合、例えば低濃度の０．９％（ｍ／ｍ）で、熱ゲル化の製剤における最適の置換度は、１０〜３６％である（表６）。

実施例６−低濃度、浸透圧及び生理的ｐＨ値でのキトサンスクシンイミド溶液のゲル化能力
無置換キトサン（ＣＳ）に基づく溶液の溶解度、注入性及び熱ゲル化性を、実施例２の方法に従い調製された置換されたキトサン（キトサンスクシンイミドＣＳＳ）に基づく溶液と比較する（表７）。

従来技術の無置換キトサンに関し、ｐＨ、水溶性、注射性及び３７℃で同時にゲル化する能力の、要求仕様は観察できない。

スクシニル基で置換されたキトサンにおいて、最初のポリマーが水に溶解する置換されたキトサンであるため、ＧＰ濃度が低い（ポリマー濃度と同等）場合であっても、溶解性、注入性及びゾル−ゲル特性を得ることが可能であり、ＧＰ濃度は、所望のゲル化特性、浸透圧及びｐＨを得るために調整されてもよい。

実施例７−広いｐＨ範囲での最終濃度０．８８％のキトサンスクシンイミドのゲル化能力
この実施例において、溶液のｐＨが、ハイドロゲルの希釈を模倣するために、酢酸（９６％ｍ／ｖ）を添加して調整された。全ての溶液は溶解し容易に注入される。

所定の分子量及び置換度において、例えばｐＨ７．２〜８．０の広いｐＨ範囲で、例えば「中」分子量のＣＳＳから出発して、及び０．１３３の質量比で、ゲル化を得ることが出来る。

実施例８−溶液のゲル化能力を維持して置換されたキトサン（ＣＳＳ）の濃度を低下させる能力

特定の利用において、生理的温度、例えば７．５でゲルを形成する能力を保持しつつ、例えば１％未満、例えば０．８５％等の低濃度で置換されたキトサンの溶液を形成するのが有利な場合がある。

実施例９−室温での市販製品並びに置換されたキトサン及びＧＰの溶液の注射性
この実施例は、産物が、真皮内又は関節内経路を経る注射に使用される細い針を有するシリンジを通して容易に注射されるかを評価する。特に、手の関節のような小さい関節に容易に注射できることが重要である。

２２ゲージの針を通じて室温で溶液を注射するのに必要な力は、本願で記載された手順に従い評価される。約１５ｍｍシリンジのピストンを動かして注射するのに必要な力が測定され、それは、互いに異なる産物の比較が容易に可能である。市販能関節内注射を想定したヒアルロン酸の溶液が試験され、「中」分子量で様々な濃度のキトサンスクシンイミドの溶液と比較された。

キトサンスクシンイミド溶液は、市販のヒアルロン酸溶液（Ａ）と比較して容易に、市販のヒアルロン酸の溶液（Ｃ）と比較して更に容易に、２２ゲージ針を通じて注射される。

実施例１０−キトサンスクシンイミドに基づく熱ゲル化溶液とヒアルロン酸に基づく市販品の流動特性
ヒアルロン酸に基づく市販品の係数Ｇ´及びＧ´´は、実験時間中、４℃〜３７℃の範囲で、ＡＲＥＳレオメーターを用いて、上記の方法に従い測定される。係数Ｇ´及びＧ´´の数値は、６０分で決定される（表１１）

本発明の組成物において、例えば、ｐＨ７．５のキトサンスクシンイミド及びＧＰに基づく組成物において、係数Ｇ´は数秒後に係数Ｇ´´と交差し、この交差が起こった時点を超えるとＧ´はＧ´´よりも大きくなる。これは、産物が４℃から３７℃になるときの急速なゾル−ゲル転位を特徴付ける。

ヒアルロン酸に基づく試験された市販組成物は、熱ゲル性ではない。

実施例１１−前靭帯離断後のウサギにおけるキトサンスクシンイミドの溶液の関節内移植の効果
この実施例の溶液は、置換度１５％及び「中」分子量（表２のＮｏ． ＣＳＳ１６）のキトサンスクシンイミド１．２％（ｍ／ｍ）、ＧＰ３．５％（ｍ／ｍ）、Ｄ−マンニトール０．４％（ｍ／ｍ）及び酢酸ナトリウム三水和物１１ｍｍｏｌ／ｌを含有する滅菌溶液である。この溶液をオートクレーブを用いて蒸気滅菌し、１．３３倍に希釈して濃度を調整し、この溶液をシリンジ中に調整する。滅菌及び希釈後、ｐＨは７．５に等しく、浸透圧は３８０ｍｏｓｍ／ｋｇに等しく、見掛けの動的粘度は９℃で１２６ ｍＰａ．ｓに等しい。

前靭帯の離断（前十字靭帯離断（ＡＣＬＴ））後、ウサギにおいて、変形性関節症（ＯＡ）の兆候性の変化が、持続的及び十分に裏付けられた形で起こり、即ち、軟骨の亀裂、関節の全体の高さにかけて軟骨の欠損を伴わない滑膜の顕著な病変及び炎症が起こる。このモデルは、関節内注射された粘性添加物のような新規治療法の、軟骨の構造に対する効果を試験するのに特に使用され、初期の病変は高度に異なる起源及び性質を有する（Ｌａｖｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ． Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒ Ｃａｒｔｉｌ， ２０１０； Ｅｄｏｕａｒｄ ｅｔ ａｌ． Ｐｈｙｓ Ｔｈｅｒ Ｓｐｏｒｔ， ２０１３； Ｍａｉｎｉｌ−Ｖａｒｌｅｔ ｅｔ ａｌ． Ｃａｒｔｉｌａｇｅ， ２０１３； Ｏｐｒｅｎｙｅｓｚｋ ｅｔ ａｌ． Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒ Ｃａｒｔｉｌ， ２０１３）。

このモデルにおいて、軟骨の浸食は、右膝の前靭帯の離断の実施を含む外科的介入から早くて４週間後に見られる。この試験は、大腿顆の４０％以上において軟骨の浸食を得る可能性をもたらす、介入後８週間以内に実施することを推奨する。試験する産物の関節内注射は、骨関節症の第一のサインが見られた後、即ち離断が行われた膝に対する手術後１週間で試験されるべきである。試験群の１０頭の動物の右膝に、試験すべき熱ゲル化溶液６００μｌを注射する。「対象」群の９頭の動物の右膝には、０．９％生理食塩水６００μｌを注射する。産物は、２２ゲージ針を付けたシリンジを通してウサギに膝関節内に注射される。

手術により誘導される関節症の進行を遅延又は停止する製品の能力は、ＯＡＲＳＩにより推奨されるスコア（Ｌａｖｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ． Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒ Ｃａｒｔｉｌ ２０１０）に従い特徴付けられる、幾つかの肉眼的、組織学的及び放射線学的指標を試験することにより特徴付けられる。関節の放射線学の結果は、骨棘や関節内間隙の存在に基づくＫｅｌｌｇｒｅｎ ＆ Ｌａｗｒｅｎｃｅスケールによって評価される。

この試験は、二重盲検試験、即ち手術を実施し、試験する製品を注射する者も、動物が生きている間、及びそれらを安楽死させるときに肉眼的に観察する者も、肉眼的又は組織学的結果を解析し、統計学的計算を実施する者も、動物の数と試験される製品あたりの群の数との間の関連性を知らない。この関連性は、計算が完了して独立した個人によって書き上げられてから与えられる。その結果を表１１〜１３に示す。

生理食塩溶液の注射と比較して、熱ゲル化溶液ＨＧの注射は、８週間時点で全ての骨関節症の指標を統計学的に有意に減少させる可能性をもたらす。これは、放射線学的試験における視認できる関節内間隙及び骨棘の減少（表１２、Ｋｅｌｌｇｒｅｎ ＆ Ｌａｗｒｅｎｃｅスケールによる）、関節外側に生じる軟骨の病変の重症度及びサイズの減少（表１３）及び滑膜の炎症性浸潤の減少（表１４）によって示される。対照群と比較して熱ゲル化溶液の不都合な二次的作用は検出されず、試験条件下での製品の良好な耐容性が示される。

実施例１２−２４
実施例１２〜２４において、以下の方法及び手順が使用された。

流動特性
流動特性は、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｐｌａｔｅ及び溶媒トラップを備えたレオメーターＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｈｙｂｒｉｄ ＤＨＲ−２（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ；例えば： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ．ｃｏｍ）によって測定される。使用されるジオメトリーは直径２５ｍｍの鉄製Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｐｌａｔｅ、及びプレートとＰｅｌｔｉｅｒとの間の距離は０．７ｍｍに設定される。測定は、実施例１２に記載の温度掃除試験（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｗｅｅｐｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）を除いて３７℃で実施される。測定は以下の手順で行われる。

−変形掃除（ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｗｅｅｐｉｎｇ）による粘弾性線形領域の同定
変形掃除試験は、第一に、３７℃で各製品の粘弾性線形領域（ＬＶＥＲ）を同定するために実施される。

−低振動モードでの頻度掃除（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｓｗｅｅｐｉｎｇ）
０．０１ｒａｄ／ｓ〜１００ｒａｄ／ｓの頻度掃除は、各製品のＬＶＥＲ領域において、低振動モード（「小振動数振動せん断」、ＳＡＯＳ）で３７℃で実施される。以下の特性が、掃除頻度に対して測定される：男性係数（Ｇ´）、損失係数（Ｇ´´）、粘度（η＊）。特に、弾性係数Ｇ´は、振動数０．６Ｈｚで決定され、これは、歩行中の膝の滑液に適用される頻度に対応する。

−流動掃除（Ｆｌｏｗ ｓｗｅｅｐｉｎｇ）
静止時の粘度は、流動掃除モードによって決定される。製品は１分間３７℃で調整される。粘度対せん断速度を測定するために、０．００１ｓ^−１〜１０ｓ^−１のせん断速度が適用される。このせん断速度範囲に渡って取得された曲線から、静止時粘度が、ゼロせん断での粘度の値を推定することにより決定される。相関係数が０．９８未満のとき、より低いせん断速度（０．００１ｓ^−１）での粘度が報告される。

−置換度（ＮＭＲ測定）
置換度は、磁気共鳴スペクトロメーター、例えば振動数４００ｍＨｚのＢｒｕｋｅｒスペクトロメーターを用いて、水性媒体中の溶液においてプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）が続く実施例において決定される。試料は以下のように調製される。５〜６ｍｇの置換されたキトサンを１ｍｌの重水素化水に溶解する。２μｌの重水素化塩酸又はホウ酸ナトリウムを置換されたキトサン溶液に添加して、解析に適したｐＨ範囲に納める。適切なｐＨ範囲は、置換基の性質に依存し、例えばホウ酸ナトリウムにおいて８．５、１２ＭのＨＣｌにおいて３〜４であってもよい。スペクトルは７０℃で記録され、走査の回数は６４〜２５６回、緩和時間は１〜８秒である。取得されたスペクトルはデコンボリューションによって処理され、置換されたキトサンの置換度を計算出来るように関心のあるシグナルの領域の積分値を決定する。

実施例１２〜２４において使用された置換されたキトサンは、上記の（表１５）方法に従い調製及び特定された。キトサンの分子量は、濃度１％（ｖ／ｖ）の酢酸中１％（ｍ／ｍ）の濃度のキトサンの溶液の粘度によって規定される。

表１５−置換されたキトサン及びこれらの置換されたキトサンの前駆体キトサンの特性
＊置換反応中の目標値に基づき推定された置換度；＊＊上記の方法に従いプロトンＮＭＲによって測定された置換度。

続く実施例において、置換されたキトサン製剤は、以下のプロトコルによって調製される。
−置換されたキトサンの粉末を所望の濃度のソルビトール又はマンニトールを含有する溶液に溶解し；
−浸透圧を２８０〜４００にするためにリン酸緩衝剤の母溶液（１００ｍＭ）を添加し；
−氷酢酸を添加してｐＨを７．２〜８．５にする。

以下の全ての実施例は、「オートクレーブ前」と言及しているものを除き、以下の手順に従いオートクレーブで滅菌した。
−適切な容器に溶液を入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブで滅菌する。

表１６は、実施例１２〜２２に記載の置換されたキトサンに基づく製剤の一覧である。
表１６−置換されたキトサンに基づく製剤

実施例１２−キトサンスクシンイミドに基づく製剤の熱ゲル化特性
熱における掃除は、Ｐｅｌｔｉｅｒエレメントを備え、ジオメトリーが２５ｍｍ型、距離０．７ｍｍの平行の鉄プレートである、距離レオメーターＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｈｙｂｒｉｄ ＤＨＲ−２（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）により、温度に依存した（表１７）キトサンスクシンイミドに基づく異なる製剤の弾性（Ｇ´）及び損失（Ｇ´´）係数の時間依存的な変化を追跡するために実施される。温度の上昇は、レオメーター上の試料の場所に設置する間の試料間の差を標準化するために、予め前せん断された。変形、温度上昇及び振動数は、各試験された試料に従い調整される（表１７）。

表１７−異なる温度でのキトサンスクシンイミドに基づく製剤の弾性係数（Ｇ´）及び損失係数（Ｇ´´）。

この実施例から、キトサンスクシンイミドに基づく全ての試験された製剤において、弾性係数Ｇ´は所定の温度から損失係数Ｇ´´よりも大きくなり、これは、製剤の熱ゲル化特性を示すことが理解される。Ｇ´がＧ´´と交差する温度は、製剤の組成及びキトサンスクシンイミドの分子的特性に依存して変化する。

実施例１３−非常に細い針（２９Ｇ及び３０Ｇ）を通しての注射のための低濃度の置換されたキトサンの製剤
置換されたキトサンに基づく製剤の弾性（Ｇ´）及び損失（Ｇ´´）係数は、「コーン−プレート」Ｐｅｌｔｉｅｒジオメトリーの距離５０μｍ及び角０．０４ラジアン、温度３７℃で振動数１０Ｈｚ、変形３％のＡＲＥＳレオメーターを用いて、上記の方法に従い測定される（表１８ａ）。動的粘度は、上記のように、回転するモビールを有する粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ）を用いて測定される（表１８ａ）。２９及び３０ゲージ針を通して製剤を注射するのに要する力は、上記のように測定される（表１８ｂ）。
表１８ａ−流動特性及び粘度
表１８ｂ−注射性（注射に要する力、ニュートン）

良好な弾性及び粘性を有するゲル特性を保持しつつ、例えば皮下、真皮内注射、又は更に皮膚の若返りのために表皮に実施されるマイクロインジェクションに適した、非常に細い針を通して容易に注射出来る製剤が取得されることが見出された。

実施例１４−市販の粘性添加物の流動特性
粘性付与を意図する非架橋（ＶＳ１及びＶＳ２）又は共有結合による架橋（ＶＳ３）ヒアルロン酸に基づく市販品の流動特性が、上記の方法に従い、３７℃で振動モードでレオメーターＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｈｙｂｒｉｄ ＤＨＲ−２（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）によって測定される。交差頻度は、係数Ｇ´及びＧ´´の間で決定され、Ｇ´の値は、歩く頻度に対応する０．６Ｈｚである。静止時の粘度は、上記の方法に従い、流動掃除モードで決定される。
表１９−市販の粘性添加物の流動特性

この実施例から、ヒアルロン酸に基づく粘性添加物の流動挙動は、それらの組成及びヒアルロン酸の特定、特に共有結合により架橋しているか否かの構造に依存することが理解される。

実施例１５−異なるグリセロリン酸塩濃度のキトサンスクシンイミドの製剤
「中」分子量のキトサンスクシンイミド（参照ＣＳＳ２５）に基づく製剤の流動特性は、濃度２％（ｍ／ｍ）で、及び様々な濃度のグリセロリン酸塩（ＧＰ）で、上記の方法に従い、３７℃で、レオメーターＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｈｙｂｒｉｄ ＤＨＲ−２（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）によって測定される。
表２０−２％（ｍ／ｍ）のキトサンスクシンイミドに基づく製剤のＧＰ濃度に対する流動特性

この実施例から、以下のことが見出される。
−置換度２０％かつ分子量「中」型のキトサンスクシンイミドの溶液は、ＧＰを添加せずにゲルを形成し得る；
−ゲルの粘着性は、添加するＧＰの濃度を増大させると増大し得る；
−潤滑性（安静時の粘度）は、ＧＰ比率が増大すると最大になる。

実施例１６−置換度及び濃度の異なるキトサンスクシンイミドに基づく製剤
様々な濃度のキトサンスクシンイミドの溶液が上記のように調製され、異なる置換度（ＤＳ）（参照ＣＳＳ２６、ＣＳＳ２７、ＣＳＳ２８）、同一の分子量（中）のキトサンスクシンイミドを出発材料とし、ＧＰを用いない。製剤の流動特性は、上記の方法に従い、３７℃で、レオメーターＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｈｙｂｒｉｄ ＤＨＲ−２（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）によって測定される（表２１）。
表２１−キトサンスクシンイミドに基づく製剤のＤＳに対する流動特性
＊上記のように推定されたＤＳ

この実施例から、以下のことが見出される：
−ＤＳが２０、２５及び３０％のＣＳＳから出発して調製された全ての製剤においてゲルが取得される；
−粘着性及び静止時の粘度は、同一の分子量（中）において、ＤＳ及びＣＳＳを変化させることにより変化する。

実施例１７−キトサンスクシンイミド及びヒアルロン酸に基づく製剤
２％（ｍ／ｍ）のキトサンスクシンイミド（参照ＣＳＳ２５）の溶液は、上記のように調製される。２％（ｍ／ｍ）のヒアルロン酸（ＨＡ）の溶液は、浸透圧が２８０〜４００ｍｏｓｍ／ｋｇ、ｐＨが７．２〜８．５となるようにリン酸緩衝剤中にＨＡ及びマンニトールを溶解することにより調製される。高分子量のＨＡ（参照Ｈ３４、固有粘度３ｍ^３／ｋｇ、数値は供給者によって提供された）又は低分子量のＨＡ（参照Ｈ２２、固有粘度１．５５ｍ^３／ｋｇ）が使用される。ようえきは、異なる質量比で混合される。それらは蒸気のようにオートクレーブで滅菌される。製剤の流動特性は、上記の方法に従い、３７℃で、レオメーターＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｈｙｂｒｉｄ ＤＨＲ−２（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）によって測定される（表２２）。
表２２−キトサンスクシンイミド及びヒアルロン酸に基づく製剤の流動特性

この結果から、ＣＳＳ及びＨＡの混合物によって形成されるゲルの流動特性は、ＣＳＳとＨＡの間の比率、濃度、及びＨＡの固有粘度によって調整され得ることが理解される。高粘度のＨＡは最高のＧ´及び操作頻度（０．６Ｈｚ）での動的粘度を有するゲルの取得の可能性をもたらす。更に、所定の条件下、Ｇ´とＧ´´の交差が無く、これは、このゲルがせん断頻度に拘らず形成されることを示す。

実施例１８−関節症患者の膝の滑液との親和性
膝の骨関節症に罹患した４名のボランティア成人患者の滑液（ＳＦ）が、人工関節の移植前に採取される（ＳＦ１〜ＳＦ４）。これを、キトサンスクシンイミドに基づく異なる溶液と、又は市販の粘性添加物と、質量比１／１で混合し、混合物の流動特性を、上記の方法に従い、３７℃で、レオメーターＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｈｙｂｒｉｄ ＤＨＲ−２（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）によって測定する（表２３）。
表２３−骨関節症に罹患した４名の患者の膝の滑液、並びにキトサンスクシンイミドの又は市販の粘性添加物の製剤の、体積比５０／５０（ｖ／ｖ）での混合前後の流動特性

この実施例から、以下のことが見出される：
−膝の骨関節症に罹患した患者の滑液は流動特性の低いゲルである；粘性添加物及びキトサンスクシンイミドに基づく製剤はより良好な特性を有する；
−ＨＡに基づく粘性添加物の流動特性はＳＦで希釈すると低下する；
−ＣＳＳに基づく製剤は滑液で希釈後もゲル特性を保持する；
−ＣＳＳに基づく製剤は、架橋した又はしていないＨＡに基づく市販の粘性添加物と異なり、骨関節症に罹患したボランティア成人の滑液と混合することにより、流動特性が強化する。恐らく例えばヒアルロン酸又はアグレカン等の滑液の成分と相互作用が起こっている。

実施例１９−キトサンスクシンイミドの幾つかのバッチから出発したキトサンスクシンイミドに基づく製剤の再現性
様々な濃度のキトサンスクシンイミド溶液が上記のように調製され、１９〜２８％（参照ＣＳＳ２２、ＣＳＳ２４、ＣＳＳ２５、ＣＳＳ２９及びＣＳＳ３０）の類似の置換度、類似の分子量（中）、ＧＰ無しの異なるバッチを出発材料とした。流動特性は、上記の方法に従い、オートクレーブ処理前後に、３７℃で、レオメーターＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｈｙｂｒｉｄ ＤＨＲ−２（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）によって測定する（表２４ａ及び２４ｂ）。
表２４ａ−オートクレーブ前
表２４ｂ−オートクレーブ後

この実施例から、以下のことが見出される：
−オートクレーブ処理で、製剤のゲルの特性、弾性係数及び安静時粘度は保持される；
−それ自体「中」分子量範囲の異なるバッチからのキトサンに由来する異なるＣＳＳの幾つかのバッチから出発して、流動及び注射特性が類似する製剤を再現性をもって調製することが可能である。

実施例２０−キトサンスクシンイミド製剤及び市販の粘性添加物の注射性
スクシンイミドキトサン及び市販の粘性添加物に基づく異なる製剤を異なる種類の関節内投与に適した針を通して注射するのに要する力を、上記の方法に従い室温で測定する（表２５）。異なる種類の針のサイズは、実施例２３に規定している。
表２５−様々なサイズの注射針を通して製剤を注射するのに要する力（ニュートン）
＊ゲル片の存在

この実施例から、キトサンスクシンイミドに基づくゲルの製剤が、生理的温度３７℃で高い流動特性を有しつつ、室温で細い針を通して容易に注射出来ることが理解される。

実施例２１−酸化ストレス条件下インビトロ分解に対する感受性
この実施例で、キトサンスクシンイミド及び市販の粘性添加物に基づく製剤を、Ｍｅｎｄｏｚａ ｅｔ ａｌ． （Ｃａｒｂ Ｒｅｓ ３４２， ９６， ２００７）の文献を適用した手順に従い炎症性環境を模倣するためにインビトロで酸化ストレス下に置く。この手順は、第二銅イオンと過酸化水素の間のフェムトン反応により遊離ヒドロキシルラジカルを発生させること、及びゲルをその存在下２４時間３７℃に置くことからなる。ゲルを回収し、インキュベーションの影響を特定するため、弾性係数Ｇ´及びそれらの動的粘度を測定する。

要するに、ＣＳＳに基づくゲル製剤又はＨＡに基づく市販の粘性添加物８００μｇを試験管内に置く。２００μＭ濃度のＥＤＴＡ溶液１００μｇと濃度１ｍＭの硫酸銅溶液７０μｇを添加する。混合物をホモジナイズし、混合物を３７℃で２４時間インキュベーションする。０．０３Ｍの過酸化水素溶液３０μｇを添加し、この溶液を異なる間隔で採取し、上記の方法に従いレオメーターＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＲ−２ （ＴＡ）を用いて３７℃で流動特性を測定する。

相対弾性係数（Ｇ’_Ｒ）及び相対動的粘度（η_Ｒ）は、それぞれ下記式１及び２に従い計算される。
式１：Ｇ’_Ｒ＝時間ｔでのＧ’／時間０でのＧ’×１００ （表２６ａ）
式２：η_Ｒ＝時間ｔでのη／時間０でのη×１００ （表２６ｂ）
表２６ａ−頻度０．６Ｈｚ（３．９８ｒａｄ／ｓ）でのゲルの相対弾性係数（Ｇ’_Ｒ）対酸化媒体中でのインキュベーション時間
表２６ｂ−ゲルの相対動的粘度（η_Ｒ）対酸化媒体中でのインキュベーション時間

この実施例のＣＳＳに基づくゲル製剤は、架橋ヒアルロン酸（ＶＳ２）又は非架橋ヒアルロン酸（ＶＳ１）に基づく市販の製剤よりも酸化媒体集での分解に顕著に耐性で、それらは、より長い時間、少なくとも２４時間、衝撃吸収性（Ｇ’）及び潤滑力（η）を保持する。

実施例２２−ベータ−グリセロリン酸塩の水溶液の浸透圧
１０ｇのベータ−グリセロリン酸ナトリウムを、浸透水（ｏｓｍｏｓｅｄ ｗａｔｅｒ）１００ｍｌに溶解する。この溶液を完全に溶解するまで撹拌し、水を添加して様々な濃度に希釈する。溶液の浸透圧は、上記のように測定する（表２７）。
表２７−水中のベータ−グリセロリン酸ナトリウム（ＧＰ）溶液の浸透圧

従って、そのような組成物中のグリセロリン酸塩濃度に従い浸透圧が増大する点留意すべきである。従って、グリセロリン酸塩を１０％以上含有する組成物の浸透圧は、本発明で想定される用途において望ましい浸透圧を超える浸透圧範囲を有する。

特に、ＹＵＨＵＡ Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （≪ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌ， Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｂｅｒｌｉｎ， ＤＥ， ６３， ５３１）及びＷＵ Ｊ． ｅｔ ａｌ． （Ａ ｔｈｅｒｍｏ− ａｎｄ ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｑｕａｔｅｒｎｉｚｅｄ ｃｈｉｔｏｓａｎ／ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｍａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ＢＶ， ＮＬ， ３１５， Ｎｏ １−２， ｐｐ． １−１１）の文献は、１０質量％以上のグリセロリン酸塩を含有する組成物を記載している。これらの組成物の浸透圧は、７００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ超であり、５００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇを大幅に超えている。

浸透圧範囲の重要性に関し、製品Ｎｕｆｌｅｘｘａ（登録商標）（Ｓａｖｉｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．；浸透圧２５８−３８１ ｍｏｓｍ／ｋｇ） の健康安全性に関する文献、及びＮｅｇｏｒｏ ｅｔ ａｌ． （Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ ｏｎ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｕｎｄｅｒ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ２００８， ２６， ５３４−５４１）を特に参照できる。浸透圧約４００ｍｏｓｍ／ｋｇは、軟骨細胞、骨細胞及び線維芽細胞等の細胞の増殖に強力な影響をもたらすので、治療的に優れた値である。

実施例２３−注射用針の直径
注射用針のサイズはＩＳＯ９２６２：１９９１及び補正ＩＳＯ９２６２：１９９１／Ａｍｄ．１：２００１（Ｅ）によって定義される。外径は許容値で固定され（最小−最大範囲）る一方、針の内径は、針の種類及び用途に依存して、通常の厚さ（通常の壁）、薄いもの（薄い壁）、特に薄いもの（特に薄い壁）がある、壁面の厚さに依存する。表２８は、市販の針の種類の外径（最小／最大）及び最小内径を反復する。
表２８−ＩＳＯ９２６２：１９９１／Ａｍｄ．１：２００１（Ｅ）標準に従う、異なる厚さの注射用針の範囲及び内径及び外径の許容値
＊参考のため

実施例２４−注射用針の種類の推奨
表２９は、修復、治療又は充填用の異なる市販製品の注射に推奨される針を列挙したものである。例えば関節内経路の様々な市販の粘性添加物製品が有り、真皮内又は皮下経路の真皮を充填するための市販製品が有り、表面真皮内経路の皮膚再生に関する市販製品が有り、又は更に眼科用の眼球内投与製品が有る。これらの種類の針の外径及び内径は、実施例２３に示している。
表２９−注射の部位又は種類及び関連する製品に基づく注射投与に推奨される針の種類
＊Ｓｔａｎｉｓｈ ｅｔ ａｌ． ２００６参照；＊＊例えばＢＤ製「ペンニードル」型Ｍｉｃｒｏ−Ｆｉｎｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ４ｍｍ （３２Ｇ）の針

実施例２５−上記による滅菌試験
この実施例の溶液は、置換度１５％及び「中」分子量のキトサンスクシンイミド（表２のＮｏ．ＣＳＳ１６）１．２％（ｍ／ｍ）、ベータ−グリセロールリン酸ナトリウム３．５％（ｍ／ｍ）、Ｄ−マンニトール０．４％（ｍ／ｍ）及び酢酸ナトリウム三水和物１１ｍｍｏｌ／ｌ（実施例１１）を含有する溶液である。この溶液を、以下の手順で滅菌する。

ハイドロゲル４００ｍｌをＳｃｈｏｔｔボトル中に置き、これを、ＩＳＯ１７６６５標準で推奨される既存の滅菌操作に従い、液体サイクル１２０℃２０分でオートクレーブ（モデルＳｙｓｔｅｃ ＤＸ−２３）にかける。

滅菌後、本発明のハイドロゲルのｐＨ、粘度及び浸透圧は、ヒト又は動物における使用、特に針を通しての注射用組成物としての使用に適している。浸透圧の測定は、上記のように実施される。

実施例２６−ゾル−ゲル転位サイクル
試料は、実施例２５にきさいのように滅菌サイクルに掛けられた。そのように滅菌された幾つかの試料を、４℃の初期温度に置いた。これらの試料は、流動物である：チューブを転倒するとチューブ内で液体が流動するのが視覚的に確認できる。これらの試料を３７℃のオーブンに１時間おいてゲル化サイクルを実施した。ゲルの存在は、チューブを転倒して視覚的に確認され、ゲルは流動しない。

同一の試料を冷却して少なくとも４℃で１時間維持する。試料は流動物である：チューブを転倒するとチューブ内で液体が流動するのが視覚的に確認できる。

従って、試料は数回のゾル−ゲル転位にのみ供されてもよく、故にゾル−ゲル転位の可逆性を有する。

試料に対して３サイクルのゲル化−脱ゲル化が実施された。

実施例２７−滅菌後のゲル化試験
注射性は上記のように測定される。
溶液は３７℃で実際にゲル化が認められる。

実施例２８−微生物汚染試験
本発明の熱ゲル化組成物を医療用一回使用のプラスチックシリンジ内に入れ、これを上記の滅菌手順に従い上記滅菌した。続いて微生物増殖試験を実施した。

前記熱ゲル化組成物を含有する滅菌シリンジを、好気条件３５℃５％ＣＯ２下５％ヒツジ血液を含有するＣｏｌｕｍｂｉａゲロース（ゲロースＣＯＳ）及びゲロース（ゲロースＰＶＸ）上に置き、又はチオグリコレート（ＴＨＩＯ）チューブ中Ｃｏｌｕｍｂｉａゲロース中で３５℃サブカルチャーする。

微生物汚染は検出されない：増殖試験は全て陰性である。

従って、滅菌サイクルは、本発明の、例えばヒト又は動物における注射用の、滅菌熱ゲル化組成物に適している。

Claims (15)

1. Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位、Ｄ−グルコサミン単位、及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位以外の置換されたＤ−グルコサミン単位、及び任意で置換されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位を有する置換されたキトサンを含有する、滅菌熱ゲル化組成物。
2. ゾル−ゲル転位が可逆的である、請求項１に記載の滅菌熱ゲル化組成物。
3. 蒸気で滅菌された、請求項１又は２のいずれか１項に記載の滅菌熱ゲル化組成物。
4. 滅菌後にゲル化されない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の滅菌熱ゲル化組成物。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の滅菌熱ゲル化組成物からなり、又はそれを含有する、滅菌溶液。
6. 熱ゲル化組成物を滅菌する方法であって、少なくとも以下の工程：
   −オートクレーブのチャンバー中にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位、Ｄ−グルコサミン単位、及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位以外の置換されたＤ−グルコサミン単位を有する置換されたキトサンを含有する熱ゲル化組成物を置く工程；
   −当該オートクレーブのチャンバーの温度を滅菌温度まで上げ、滅菌時間の間その温度を維持し、当該温度及び滅菌時間は、当該熱ゲル化組成物を滅菌するのに十分である工程；
   −当該オートクレーブのチャンバーの温度を下げる工程；
   −当該オートクレーブのチャンバーから当該熱ゲル化組成物を取り出す工程；
   を含む、方法。
7. 前記チャンバーの温度が、６０℃超、好ましくは１００℃超、好ましくは１２０℃超で維持される、請求項６に記載の方法。
8. 前記滅菌時間が３分以上、好ましくは１０分以上、好ましくは１５分以上、尚も好ましくは２０分以上である、請求項６又は７のいずれか１項に記載の方法。
9. １つ又は幾つかの蒸気滅菌サイクルを含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の熱ゲル化組成物、又は請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法により取得され得る熱ゲル化組成物を含有し、又はこれからなる、注射用組成物。
11. 注射用医薬組成物、又は注射用若しくは移植用医療デバイスとして使用される、請求項１０に記載の注射用組成物。
12. 皮下、真皮内、眼球内、又は関節内経路を介して前記組成物を注射することを含む治療方法に使用するための、又は修復若しくは充填を要する１つ以上の身体組織を修復又は充填するために使用するための、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記身体組織が、声帯、筋肉、靭帯、腱、軟骨、生殖器、骨、関節、眼球、真皮又はそれらの任意の組み合わせ、より具体的には関節に属する組織から選択される、請求項１２に記載の組成物。
14. 例えば滑液内に注入することにより、又は血液及び軟骨内の移植物と混合した後に注入することにより、関節症の治療のための、又は軟骨の機能不全を修復するための方法に使用するための、請求項１２又は１３のいずれか１項に記載の組成物。
15. 請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の組成物を含有する、又はこれからなる、医療用デバイス、例えば医療用移植物。