JP2017523802A

JP2017523802A - リソソーム蓄積症処置用のアデノ随伴ウイルスベクター

Info

Publication number: JP2017523802A
Application number: JP2017512423A
Authority: JP
Inventors: テュバート，エムファティマボッシュ; メンドーサ，エムヴァージニアアウリゴ; サンチェス，アルベルトリベラ
Original assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB
Current assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB
Priority date: 2014-05-14
Filing date: 2015-05-13
Publication date: 2017-08-24
Anticipated expiration: 2035-05-13
Also published as: ES2823948T3; AU2015261519A2; RU2718248C2; AR100419A1; AU2015261519A1; MY183472A; US20170088859A1; PH12016502248A1; IL248538B; JP6634073B2; AU2015261519B2; SG11201609314XA; CN107002095A; NZ726316A; MX383227B; KR102446169B1; TWI701332B; PT3143146T; BR112016025819B1; EP3143146A1

Abstract

本発明は、新規なアデノ随伴ウイルスベクター、および上記ベクターを含有するリソソーム蓄積症の処置用（特に、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型の処置用）薬学的組成物を提供する。

Description

本発明は、所定のタンパク質の発現に有用なベクター、および遺伝子治療におけるその利用に関する。本発明はまた、ムコ多糖症（ＭＰＳ）の処置（具体的には、ムコ多糖症ＩＩＩ−Ｂ型またはサンフィリッポＢ症候群の処置）に役立つ、ベクターおよび核酸の配列に関する。

リソソームは、５０種類以上の加水分解酵素を含んでいる、動物細胞の細胞質に見られる細胞内小器官である。上記加水分解酵素は、使い古した細胞の構成要素の再利用中、または、ウイルスもしくは細菌の貪食後に、生体分子を破壊する。上記細胞内小器官は、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼおよびスルファターゼを含む、いくつかの種類の加水分解酵素を含んでいる。全ての酵素は、酸性の加水分解酵素である。

リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、１種類以上のリソソーム酵素に影響を及ぼす、遺伝的欠陥によって引き起こされる。これらの遺伝病は、一般的に、リソソーム中に存在する特定の酵素活性における欠陥に起因する。より少ない程度ではあるが、これらの疾患は、リソソームでの生合成に関係しているタンパク質における欠陥が原因であることもある。

ＬＳＤは、個人としては珍しい。しかし群としては、これらの障害は、一般集団において比較的多くみられる。ＬＳＤの総罹患率は、生児出生の約５０００人に１人である（Meikle P, et al., JAMA 1999;281:249-254を参照）。しかし、一般集団の中でもいくつかの集団は、特に高い発生率でＬＳＤに罹患する。例えば、中央ユダヤおよび東ヨーロッパ（アシュケナージ）の個人の子孫において、ゴーシュ病およびテイ＝サックス病の罹患率は、それぞれ、出生児の６００人に１人、および出生児の３９００人に１人である。

ムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳＩＩＩ）（総称してサンフィリッポ症候群として知られている）は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ヘパラン硫酸（ＨＳ）の段階的な分解に関連している酵素の１つの欠陥によって引き起こされ、グリコサミノグリカンヘパラン硫酸の異常な蓄積をもたらす、ＬＳＤである。ＭＰＳＩＩＩは、酵素の欠陥に応じて、４種類のサブタイプに分類される。α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの酵素活性の損失は、サブタイプＩＩＩＢを引き起こす。結果として生じる疾患は、ＣＮＳの小児期発症進行性ニューロパシーとして、臨床的に特徴づけられる。臨床経過は一般的に、３つの段階に分けられる。上記疾患の第一の段階は、出生後最初の数か月に及び無症状期間の後、精神発達の遅れが明らかになる。その後、上記疾患の第二の段階の間、重篤な行動障害および進行性の知能衰退が続く。最後に、重度の認知症の発症と共に、行動障害は緩やかに消失して全運動機能が衰え始め、次第に嚥下障害、歩行の完全な喪失、および錘体路障害という結果に陥る。神経学的症状に加えて、ＭＰＳＩＩＩＢの患者は、非神経学的な変化にも苛まれる。上記変化には、耳、鼻、咽喉および胸部の再発性の感染症、頻繁な下痢および頻繁な便秘、移動性を冒す進行性の関節の退化および骨格の異常、ならびに肝腫脹および脾腫が含まれる（Cleary and Wraith, Arch Dis Child. 1993;69 (3):403-6；Neufeld and Muenzer, “The Mucopolysaccharidoses” in Scriver C, et al., Eds., “The metabolic and molecular basis of inherited disease”, McGraw-Hill Publishing Co., New York, NY, US, 2001, pp. 3421-3452, van de Kamp et al., Clin Genet. 1981;20(2):152-60；Moog et al, Am J Med Genet C Semin Med Genet. 2007;145C(3):293-301を参照）。通常、患者は、２０代の末から３０代の初めにかけて死亡する（Neufeld and Muenzer, supraを参照）。より遅い発症およびより長い生存期間を示す、上記疾患のより緩やかに進行する病型（減衰型の表現型として知られている）が、ＭＰＳＩＩＩＢの患者の一部集合において記載されている（Moog et al., supraおよびValstar et al., Ann Neurol. 2010;68(6):876-87を参照）。

現在のところ、ＭＰＳＩＩＩＢに対する利用可能な処置は存在しない。したがって、上記疾患の制御は対処的であり、患者およびその家族の生活の質を改善することを目的としている。特に重要なことに、これらの症状は、ＣＮＳの変性から生じる。例えば、断続的に上昇している頭蓋内圧は、行動障害の認められている原因であり、ＭＰＳにおいて珍しいことではない（Muenzer et al., Genet Med. 2006;8(8):465-73を参照）。ムコ多糖体の沈着を原因とする髄膜の肥大は、脳脊髄液（ＣＳＦ）圧力の上昇の潜在的な原因かもしれない。したがって、行動の変質が従来の薬物療法では手に負えない場合、圧力を緩和するため、脳脊髄液シャントの挿入が検討される。脳脊髄シャントを挿入したサンフィリッポ患者６名において、神経症状が有意に改善した（Robertson et al., Eur J Pediatr. 1998;157(8):653-5を参照）。一方で、メラトニンの投与は、上記疾患に特徴的な睡眠障害のための、完全に効果的ではないものの、最善の処置であると考えられる（Fraser et al., Arch Dis Child. 2005;90(12):1239-42を参照）。体性異常のための特定の処置もまた存在せず、緩和的治療のみが個別の症状にそれぞれ適用されうる。

ＭＰＳＩＩＩＢに対する新たな治療方法が試験されており、成功の度合いはまちまちである。基質抑制療法（ＳＤＴ）は、ＧＡＧの合成率を減らすことを目的としているため、なんらかの剰余の酵素活性が残る場合であっても、ＧＡＧの過剰な蓄積を妨げるか、または少なくとも蓄積の速度を減速させる。ゲニステイン（大豆のイソフラボン）は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のキナーゼの活性を低下させることにより、ＨＳの産生の阻害剤として働くことが示唆されている（Jakobkiewicz-Banecka et al., J Biomed Sci. 2009;16:26, Piotrowska et al., Eur J Hum Genet. 2006;14(7):846-52を参照）。最近の研究によると、種々のムコ多糖症（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ−Ａ型およびＩＩＩ−Ｂ型）に罹患している患者の繊維芽細胞において、ゲニステインは、ＧＡＧの合成を阻害することが示されている（Piotrowska et al., supraを参照）。ＭＰＳＩＩＩＢ疾患マウスモデルへの、短期間および長期間のゲニステインの経口投与の結果、蓄積の減少、および運動スキル試験におけるよりよい結果が得られた（Malinowska et al., Mol Genet Metab. 2009;98(3):235-42, Malinowska et al., PLoS One. 2010;5(12):e14192を参照）。静脈内投与の場合、ゲニステインは血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができ、ＣＮＳの異常を処置することを可能にすると予想される。この考えを支持するように、ゲニステインが豊富な大豆抽出物を、ＭＰＳＩＩＩＡ患者５名およびＭＰＳＩＩＩＢ患者５名に、１２か月間投与したオープンラベルパイロット研究の結果、体性パラメーターおよび神経パラメーターの両方が、有意に改善された（Piotrowska et al., Current Therapeutic Research. 2008;69(2):166-179を参照）。しかし、その後の研究によると、ゲニステインで１２か月間処置したＭＰＳＩＩＩＡ患者、ＭＰＳＩＩＩＢ患者またはＭＰＳＩＩＩＣ患者の、障害の度合いまたは行動のスコアのいずれにおいても、改善は示されなかった（Delgadillo et al., J Inherit Metab Dis. 2011;34(5):1039-44, 研究番号：NTR #1826（The Netherlands National Trial Registerに登録）および de Ruijter et al., Ann Neurol. 2012;71(1):110-20を参照）。他の分子であるローダミンＢもまた、臨床前試験においてＧＡＧの蓄積を減少させることに効果的であることが証明されており、ゲニステインで観察された効果と同等の効果を有していた（Hendriksz et al., “Guidelines for the investigation and Management of Mucopolysaccharidosis type III”, 2012を参照。www.mpssociety.co.uk.において入手可能）。ローダミンＢは、糖の前駆体形成を阻害すること、および／または糖転移酵素活性を阻害することによって、ＧＡＧ鎖の合成を抑制すると考えられる（Roberts et al., Mol Genet Metab. 2007;92(1-2):115-21を参照）。

正常な細胞は、多量のマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）で標識されたリソソーム酵素を分泌する。その後、上記リソソーム酵素は、細胞膜上のＭ６Ｐの受容体を通じて、他の細胞に取り込まれることができる。この事実により、欠如している酵素の正しい型を注入することによって、可溶性の加水分解酵素の欠陥により引き起こされるＬＳＤを処置する可能性が開かれる。酵素補充療法（ＥＲＴ）は、未だサンフィリッポＢの患者に利用できないが、３月齢のＭＰＳＩＩＩＢマウスに対する組換えα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの静脈内投与により、上記組換え酵素が、いくつかの臓器（主に肝臓）へと分配されたことが示された。脳においては僅かな量の酵素しか検出されなかった。このことは、外部から与えられたタンパク質の脳実質への進入を制限する、ＢＢＢの存在による（Yu et al., Mol Genet Metab. 2000;71(4):573-80およびHendriksz et al, supraを参照）。ＭＰＳＩＩＩＢの患者における神経疾患の処置のために、ＥＲＴ製品に関する開発初期段階のプログラムが存在する。ＨＧＴ−３０００プログラム（Shire）は、ＥＲＴに基づいた組換え酵素の髄内送達であり、現在では臨床前段階にある。ＣＮＳに対するＥＲＴの直接的な送達により、ＭＰＳＩＩＩＢマウスにおける神経症状が減少し、現在ではＭＰＳＩＩＩＡ患者において試験されている（Hemsley K, et al., Genes Brain Behav. 2008;53(2):161-8；Savas P, et al., Mol Genet Metab. 2004;82:273-285；www.clinicaltrials.gov.中のNCT01155778およびCT01299727を参照）。しかし、上記治療が必要とする、永久髄内送達デバイスの埋入は、実質的なリスクおよび欠点を伴っており、上記治療そのものが、患者１人当たり、または１年当たりで、非常に高い経済的コストを有している。

骨髄由来幹細胞（骨髄移植、ＢＭＴ）を用いる造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、他のＭＰＳの患者における、体性異常および神経異常の両方の処置において、効果的であることが証明されている（Peters et al., Blood 1996;87(11):4894-902；Peters and Steward, Bone Marrow Transplant 2003;31(4):229-39およびYamada et al., Bone Marrow Transplant 1998;21(6):629-34を参照）。ドナー由来の骨髄性細胞は、ＢＢＢを通過することができ、脳実質に入ることができ、欠如しているリソソーム酵素を分泌するミクログリア細胞へと分化することができる。その後、上記リソソーム酵素は、周囲の細胞に取り込まれ、脳内のＧＡＧの蓄積を治療した（Krivit et al., Cell Transplant. 1995;4(4):385-92を参照）。しかし、ＢＭＴを施されたサンフィリッポＡ患者またはサンフィリッポＢ患者においては、明白な利点が観察されていない（Hoogerbrugge et al., Lancet 1995;345(8962):1398-402；Vellodi et al., J Inherit Metab Dis. 1992;15(6):911-8；Guengoer and Tuncbilek, Turk J Pediatr. 1995;37(2):157-63；Sivakumur and Wraith, J Inherit Metab Dis. 1999;22(7):849-50およびLange et al., Arq Neuropsiquiatr. 2006;64(1):1-4を参照）。ＢＭＴが上手く行かない主な理由は、初期疾患の急速な進行に比較して、造血細胞の前駆体によるミクログリアの集団の置換ペースが遅いことであろう（Rovelli, Bone Marrow Transplant 2008;41Suppl2:S87-9を参照）。したがって現在のところ、ＢＭＴを用いるＨＳＣＴは、ＭＰＳＩＩＩの患者用の処置の選択肢として検討されていない（Boelens et al., Pediatr Clin North Am. 2010;57(1):123-145を参照）。臍帯血由来幹細胞を用いるＨＳＣＴは、ＭＰＳＩＩＩＢマウスにおいて、認識に関する結果を改善したが、細胞の投与が繰り返して必要であった（Willing et al., Cell Transplantation 2013;epub ahead of printを参照）。最近では、このアプローチは、ＭＰＳＩＩＩＡまたはＭＰＳＩＩＩＢの子供数名に移植するために、使用されている。しかし、ＣＮＳを変質から保護する結果となるかどうかは、未だ不確かである（de Ruijter et al., Curr Pharm Biotechnol. 2011;12(6):923-30を参照）。

ＭＰＳＩＩＩ（特にＭＰＳＩＩＩＢ）のための、現在の治療の選択肢の制限を考えると、代替アプローチが必要とされる。ｉｎｖｉｖｏ遺伝子治療は、ＭＰＳＩＩＩＢおよび他の遺伝病のための、生涯にわたる有利な効果を期待できる一時の治療の可能性を提供する。種々の投与経路と組み合された種々のウイルスベクターの使用に基づき、いくつかの遺伝子治療のアプローチが、ＭＰＳＩＩＩＢ疾患の動物モデルにおいて試験されてきた。

ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子をコードしているレンチウイルスベクターを、若いＭＰＳＩＩＩＢマウスに対して静脈内投与した結果、肝臓、脾臓、肺、および心臓において、導入遺伝子は低いレベルでしか発現しなかった。上記投与により、これらの組織において、ＧＡＧの蓄積は減少したが、ＧＡＧの蓄積は正常化されなかった（Di Natale et al., Biochem J. 2005;388(2):639-46を参照）。レンチウイルスベクターの治療上の潜在能力はまた、静脈内投与を介した、脳実質に対するベクターの直接的な送達によって試験されている（Di Domenico et al., Am J Med Genet A. 2009;149A(6):1209-18を参照）。１箇所の脳の部位に投与されたＭＰＳＩＩＩＢマウスは、処置後６ヶ月までにα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の上昇を示したが、部分的にしかリソソーム蓄積の異常は治療されなかった。

特に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを媒介とする遺伝子の移入が、多くのｉｎｖｉｖｏ遺伝子治療の応用のため最適なアプローチとして、急速に浮上している。上記ベクターの、形質導入の効率の高さ、および病原性がないことが原因である。ＡＡＶベクターは、分裂終了細胞を形質導入することができる。いくつかの臨床前試験および臨床試験によると、種々の疾患のための治療用導入遺伝子の持続的な発現を、効果的に促進するための、ＡＡＶベクターを媒介とする遺伝子の移入の潜在能力が実証された（Bainbridge et al., N Engl J Med. 2008;358(21):2231-9；Hauswirth et al., Hum Gene Ther. 2008;19(10):979-90；Maguire et al., N Engl J Med. 2008;358(21):2240-8；Niemeyer et al., Blood 2009;113(4):797-806；Rivera et al., Blood 2005;105(4):1424-30；Nathawani et al., N Engl J Med. 2011;365(25):2357-65およびBuchlis et al., Blood 2012;119(13):3038-41を参照）。

ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしている血清型２のＡＡＶベクターを、ＭＰＳＩＩＩＢマウスの脳実質中の１箇所に対して送達した場合、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの発現および活性は注入箇所に制限され、部分的にしか疾患の表現型は改善されなかった（Fu et al., Mol Ther. 2002;5(1):42-9；Cressant et al., J Neurosci. 2004;24(45):10229-39を参照）。ＢＢＢを通り抜けるためにマンニトールにより前処理をした後、ＭＰＳＩＩＩＢマウス対して静脈内送達されたＡＡＶ２ベクターによって、生存期間が有意に延長され、行動の動きは改善され、脳のリソソーム異常は減少した。しかし、部分的にしか体性疾患は治療されなかった（McCarty et al., Gene Ther. 2009;16(11):1340-52を参照）。一方で、槽内注入による脳脊髄液（ＣＳＦ）に対するＡＡＶ２ベクターの一回投与により、ＭＰＳＩＩＩＢマウスの脳において、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性が回復し、ＧＡＧが減少した。しかし体性組織においては、検出可能なα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性が観察されなかった（Fu et al., J Gene Med. 2010;12(7):624-33を参照）。ＡＡＶ２の槽内送達および静脈内送達を含む併用療法により、ＣＮＳにおける有意に長期間にわたる治療効果、および部分的な身体の治療が実証されている（Fu et al., Gene Ther. 2007;14(14):1065-77を参照）。

他の研究には、実質内投与後の血清型５のＡＡＶベクターによって示される、神経細胞に対する高い親和性を利用しているものがある。しかし、上記ベクターは、脳実質における分布が狭く、このアプローチは複数の注入を必要とする。骨髄移植と組み合わせられた、ＭＰＳＩＩＩＢマウス新生児の脳の複数箇所に対するＡＡＶ５ベクターの送達により、血清型２のベクターによって得られた効果と同様の、治療効果が示された（Heldermon et al., Mol Ther. 2010;18(5):873-80を参照）。脳のサイズがより大きい動物モデルにおいて、ＭＰＳＩＩＩＢイヌの脳の相異なる４箇所に対するＡＡＶ５ベクターの定位固定投与により、活性型α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが、脳の広範な部位において検出された。しかし、前端領域および後端領域の多くにおいて（特に小脳において）は、酵素活性は依然として低いか、検出できなかった（Ellinwood et al., Mol Ther. 2011;19(2):251-9を参照）。処置したＭＰＳＩＩＩＢイヌにおいて、リソソームの異常は改善されたが、完全には治療されなかった。これは、上記アプローチにより達成された酵素活性のレベルが、ＧＡＧの蓄積に対処するには不充分であったことを示している。このような部分的でしかない効果にもかかわらず、最近では、上記アプローチに基づいた臨床試験が開始されている（ISRCTN registerのISRCTN19853672を参照）。脳が大きくなるほど、実質内投与で臓器全体をカバーすることが難しくなり、ヒトに対する送達には数箇所におけるベクターの投与が必要となる。このため、送達は技術的な課題であり、特定の外科的処置の発展が必要である（Souweidane et al., J Neurosurg Pediatr. 2010;6(2):115-122を参照）。

今までのところ、ＭＰＳＩＩＩＢの処置のために、血清型９のＡＡＶベクターを使用する研究は、１件しか報告されていない。このアプローチは、ＡＡＶ９ベクターが全身投与された場合に、ＣＮＳを形質導入する能力を利用する（Foust et al., Nat Biotechnol. 2009;27(1):59-65およびDuque, et al., Mol Ther. 2009;17(7):1187-1196を参照）。ＭＰＳＩＩＩＢマウスに対するＡＡＶ９−α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼベクターの静脈内送達により、ＣＮＳおよび体性臓器においてリソソーム蓄積異常が治療され、行動の動きが改善され、生存期間が延長される結果となった（Fu et al., Mol Ther. 2011;19(6):1025-33を参照）。しかし、この提案されている一連の処置は、いくつかの欠点を有している。第一に、利用されたＣＭＶプロモーターは、機能しなかったことが報告された（Loeser et al., J Virol. 1998 Jan;72(1):180-90を参照）。第二に、治療効果は、非常に高いベクターの投与量（１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ以上）において達成された。このような高い投与量の使用は、製造上および安全上の観点から、臨床への橋渡しに対する課題であると推測される。

上述したいずれのアプローチも、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を完全には回復していないか、ＣＮＳおよび体性組織における細胞質内の異物を完全には根絶していないか、または、ＭＰＳＩＩＩＢの全ての臨床症状を治療していない。したがって、より優れた効果および安全性を有している、ＭＰＳＩＩＩＢを処置するための新規のアプローチが必要とされている。

本発明は、疾患の処置用の、具体的にはムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳＩＩＩ）の処置用の、特にＭＰＳＩＩＩＢ処置用の、新規な組換えベクターを提供する。

第１の態様では、本発明は、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ；配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列を含んでいるアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）に関する。本発明に係るＡＡＶベクターは、血清型９のＡＡＶ（ＡＡＶ９）のベクターである。上記ベクターは、脳組織および体性組織の全領域における病理的なＧＡＧの蓄積を、全く元の状態に戻すことに非常に効果的であることが判明した。

本発明に係るＡＡＶ９ベクターは、Ｎａｇｌｕをコードしているヌクレオチド配列を含んでいる。上記ヌクレオチド配列は、配列番号２に対して８０％以上の配列同一性を有しており、好ましくは配列番号２に対して８４％以上の配列同一性を有している。

本発明に係るＡＡＶ９ベクターは、Ｎａｇｌｕの発現を調節するために、コードしているヌクレオチド配列に連結されているプロモーターを、さらに含んでいる。適したプロモーターは、ＣＡＧプロモーター（配列番号４）である。

本発明の他の態様は、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）をコードしているヌクレオチド配列を含んでいるプラスミドに関する。具体的には、上記ヌクレオチド配列は、配列番号２に対して８０％以上の配列同一性を有しており、あるいは、好ましくは配列番号２に対して８４％以上の配列同一性を有している。

本発明のさらなる態様は、本発明のＡＡＶ９ベクターまたは本明細書において説明されているプラスミドを、治療上効果的な量含んでいる薬学的組成物に関する。

本発明は、ポリヌクレオチド（特にＮａｇｌｕポリヌクレオチド）を送達するために有用な方法を、さらに提供する。

本発明のまたさらなる態様は、薬剤として使用するための、本発明のＡＡＶ９ベクターまたは本発明において説明されているプラスミドに関する。具体的には、ムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳＩＩＩ）の処置のための使用、特にＭＰＳＩＩＩＢの処置のための使用に関する。

本発明はまた、本発明に係るＡＡＶ９ベクターの、製造方法を提供する。

さらなる態様において、本発明は、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる単離細胞に関する。具体的には、上記ヌクレオチド配列は、配列番号２に対して８０％以上の配列同一性を有しており、あるいは、好ましくは配列番号２に対して８４％以上の配列同一性を有している。

ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているプラスミド（ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕ）の流体力学的送達。２月齢のＭＰＳＩＩＩＢマウスに、５０μｇの上記プラスミド（ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕ）を、流体力学的に注入した。プラスミドを投与してから１週間後に測定された、（Ａ）肝臓および（Ｂ）血清におけるα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）活性を、棒グラフは表している。生理食塩水を注入した野生種マウスのＮＡＧＬＵ活性を１００％とした。値は、一群当たり３、４匹のマウスの平均±標準誤差である。＊＊＊：野生種に対してＰ＜０．００１。ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕ）の、静脈内（ＩＶ）送達。野生種（健康な）マウス、未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウス、および５×１０^１１ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕのＩＶ注入により処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの、（Ａ）肝臓および（Ｂ）血清におけるα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性。（Ｃ）体性臓器におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量化。値は、一群当たり５〜８匹のマウスの平均±標準誤差である。＄＄＄：野生種に対してＰ＜０．００１、＊＊：未処置のＭＰＳＩＩＩＢに対してＰ＜０．０１、＊＊＊：未処置のＭＰＳＩＩＩＢに対してＰ＜０．００１、ｎｄ：未検出。ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕ）の静脈内送達。（Ａ）野生種（健康な）マウス、未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウス、および５×１０^１１ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕのＩＶ注入により処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの、脳の種々の部位（Ｉ〜ＩＶ）におけるα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性。（Ｂ）脳の同じ部位におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量化。値は、一群当たり５〜８匹のマウスの平均±標準誤差である。＊＊＊：未処置のＭＰＳＩＩＩＢに対してＰ＜０．００１、ｎｄ：未検出。最適化ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ）の、静脈内送達。野生種（健康な）マウス、未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウス、および５×１０^１１ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕのＩＶ注入により処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの、（Ａ）肝臓および（Ｂ）血清におけるα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性。（Ｂ）体性臓器におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量化。値は、一群当たり５〜８匹のマウスの平均±標準誤差である。＄＄＄：野生種に対してＰ＜０．００１、＊＊：未処置のＭＰＳＩＩＩＢに対してＰ＜０．０１、＊＊＊：未処置のＭＰＳＩＩＩＢに対してＰ＜０．００１、ｎｄ：未検出。最適化ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ）の静脈内送達。（Ａ）野生種（健康な）マウス、未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウス、および５×１０^１１ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕのＩＶ注入により処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの、脳の種々の部位（Ｉ〜ＩＶ）におけるα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性。（Ｂ）脳の同じ部位におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量化。値は、一群当たり５〜８匹のマウスの平均±標準誤差である。＊＊＊：未処置のＭＰＳＩＩＩＢに対してＰ＜０．００１、ｎｄ：未検出。ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕ）の槽内（ＩＣ）送達。（Ａ）野生種（健康な）マウス、未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウス、および９．３×１０^９ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕの槽内注入により処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの、脳の種々の部位（Ｉ〜ＩＶ）におけるα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性。（Ｂ）脳の同じ部位におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量化。値は、一群当たり５〜８匹のマウスの平均±標準誤差である。＊＊＊：未処置のＭＰＳＩＩＩＢに対してＰ＜０．００１、ｎｄ：未検出。ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕ）の槽内送達。（Ａ）野生種（健康な）マウス、および未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウス、および９．３×１０^９ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕの槽内注入により処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの、肝臓におけるα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性。（Ｂ）体性臓器におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量化。値は、一群当たり５〜８匹のマウスの平均±標準誤差である。＄＄＄：野生種に対してＰ＜０．００１、＊＊：未処置のＭＰＳＩＩＩＢに対してＰ＜０．０１、＊＊＊：未処置のＭＰＳＩＩＩＢに対してＰ＜０．００１、ｎｄ：未検出。最適化ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ）の槽内送達。（Ａ）野生種（健康な）マウス、未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウス、および９．３×１０^９ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕの槽内注入により処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの、脳の種々の部位（Ｉ〜ＩＶ）におけるα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性。（Ｂ）脳の同じ部位におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量化。値は、一群当たり５〜８匹のマウスの平均±標準誤差である。＊＊＊：未処置のＭＰＳＩＩＩＢに対してＰ＜０．００１、ｎｄ：未検出。最適化ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ）の槽内送達。（Ａ）野生種（健康な）マウス、未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウス、および９．３×１０^９ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕの槽内注入により処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの、肝臓におけるα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性。（Ｂ）体性臓器におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量化。値は、一群当たり５〜８匹のマウスの平均±標準誤差である。＄＄＄：野生種に対してＰ＜０．００１、＊＊：未処置のＭＰＳＩＩＩＢに対してＰ＜０．０１、＊＊＊：未処置のＭＰＳＩＩＩＢに対してＰ＜０．００１、ｎｄ：未検出。最適化ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ−バージョン２をコードしているプラスミド（ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ２）の、流体力学的送達。２月齢のＭＰＳＩＩＩＢマウスに、５０μｇの上記プラスミド（ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ２）を、流体力学的に注入した。プラスミドを投与してから１週間後に測定された、（Ａ）肝臓および（Ｂ）血清におけるα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）活性を、棒グラフは表している。生理食塩水を注入した野生種マウスのＮＡＧＬＵ活性を１００％とした。値は、一群当たり３、４匹のマウスの平均±標準誤差である。＊＊＊：野生種に対してＰ＜０．００１。最適化ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ−バージョン３をコードしているプラスミド（ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ３）の流体力学的送達。２月齢のＭＰＳＩＩＩＢマウスに、５０μｇの上記プラスミド（ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ３）を、流体力学的に注入した。プラスミドを投与してから１週間後に測定された、（Ａ）肝臓および（Ｂ）血清におけるα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）活性を、棒グラフは表している。生理食塩水を注入した野生種マウスのＮＡＧＬＵ活性を１００％とした。値は、一群当たり３、４匹のマウスの平均±標準誤差である。＊＊＊：野生種に対してＰ＜０．００１。最適化ネズミα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕ）の槽内送達。ＭＰＳＩＩＩＢマウスの大槽に、３×１０^１０ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕを投与後の、ベクターゲノムの生体内分布。定量化ＰＣＲの後、二倍体のゲノムに含まれているＤＮＡの量と比較することによって、（Ａ）脳および（Ｂ）体性組織におけるベクターゲノムを定量化した。ＮＤ：未検出。最適化ネズミα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕ）の槽内送達。（Ａ）野生種（健康な）マウス、未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウス、および、３．９×１０^１０ｖｇのコントロールベクター（ＡＡＶ９−Ｎｕｌｌ）または３×１０^１０ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕのいずれか一方を大槽内投与されたＭＰＳＩＩＩＢマウスの、脳の種々の部位（Ｉ〜Ｖ）におけるα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性。（Ｂ）脳の同じ部位におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量化。値は、一群当たり４匹のマウスの平均±標準誤差である。＊＊：ＭＰＳＩＩＩＢ−ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０１、＊＊＊：ＭＰＳＩＩＩＢ−ｎｕｌｌに対してＰ＜０．００１、ｎｄ：未検出。最適化ネズミα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕ）の槽内送達。（Ａ）野生種（健康な）マウス、および、３．９×１０^１０ｖｇのコントロールベクター（ＡＡＶ９−Ｎｕｌｌ）または３×１０^１０ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕのいずれか一方を大槽内投与されたＭＰＳＩＩＩＢマウスにおいて、リソソームのマーカーであるＬＩＭＰ−２（リソソーム区画の大きさを示す）を染色した後、脳の種々の部位において得られた信号強度の定量化。値は、一群当たり４匹のマウスの平均±標準誤差である。＊：ＭＰＳＩＩＩＢ−ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０５、＊＊：ＭＰＳＩＩＩＢ−ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０１、＊＊＊：ＭＰＳＩＩＩＢ−ｎｕｌｌに対してＰ＜０．００１。（Ｂ）野生種マウス（左側）、未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウス（中央）および、大槽内にＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕを投与されたＭＰＳＩＩＩＢマウス（右側）の、大脳皮質および小脳の電子顕微鏡分析。１：ニューロン、２：ニューロン周囲グリア細胞、３：プルキンエニューロン。（Ｃ）野生種（ＷＴ）マウス、未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウス（ＭＰＳＩＩＩＢ）、および、３．９×１０^１０ｖｇのコントロールベクター（ＡＡＶ９−Ｎｕｌｌ）または３×１０^１０ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕのいずれか一方を大槽内投与されたＭＰＳＩＩＩＢマウスから得た脳抽出物における、他のリソソーム酵素の活性。ＳＧＳＨ：Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドラーゼ、ＧＵＳＢ：β−グルクロニダーゼ、ＨＥＸＢ：ヘキソサミニダーゼＢ。野生種の酵素活性を１００％とした。値は、一群当たり４匹のマウスの平均±標準誤差である。＊＊＊：ＭＰＳＩＩＩＢ−ｎｕｌｌに対してＰ＜０．００１。最適化ネズミα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕ）の槽内送達。野生種（健康な）マウス、および、３．９×１０^１０ｖｇのコントロールベクター（ＡＡＶ９−Ｎｕｌｌ）または３×１０^１０ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕのいずれか一方を大槽内投与されたＭＰＳＩＩＩＢマウスの、前頭葉、頭頂葉、後頭葉、上丘、視床における、（Ａ）アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰ、および（Ｂ）ミクログリアのマーカーであるＢＳＩ−Ｂ４を免疫染色した後に測定された信号強度を、棒グラフは表している。値は、一群当たり２、３匹のマウスの平均±標準誤差である。＊：ＭＰＳＩＩＩＢ−ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０５、＊＊：ＭＰＳＩＩＩＢ−ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０１、＊＊＊：ＭＰＳＩＩＩＢ−ｎｕｌｌに対してＰ＜０．００１、ｎｄ：未検出。（Ｃ）遺伝子オントロジー（ＧＯ）注釈に基づく、機能上の分類。それぞれの生物学的過程の用語に関連する転写産物の割合を、円グラフは表している。明らかに、ほとんどの用語は、炎症／炎症関連カテゴリーを表している。（Ｄ）ＣＴＥＮ（ソフトウェア）によりミクログリアを代表していると認められた遺伝子群に基づく、全ての実験群の階層的クラスター化。それぞれの縦列は遺伝子を表しており、それぞれの横列は動物を表している。それぞれの遺伝子の発現レベルは、全サンプルにおける当該遺伝子の平均発現量と比較して表されている（下部に示されているグレースケールにて表した）。マトリックスの上部に示されているサンプルの系統図は、全体における転写レベルの類似性を表している。全てのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕで処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスは、明らかに、健康、同齢かつ同腹の野生種マウスのものと近い遺伝子発現プロファイルを有している。最適化ネズミα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕ）の槽内送達。野生種（健康な）マウス、未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウス、および、３．９×１０^１０ｖｇのコントロールベクター（ＡＡＶ９−Ｎｕｌｌ）または３×１０^１０ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕのいずれか一方を大槽内投与されたＭＰＳＩＩＩＢマウスの、（Ａ）肝臓および（Ｂ）血清におけるα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性。（Ｃ）体性臓器におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量化。値は、一群当たり４〜８匹のマウスの平均±標準誤差である。＄：野生種に対してＰ＜０．０５、＊＊：未処置のＭＰＳＩＩＩＢに対してＰ＜０．０１、＊＊＊：未処置のＭＰＳＩＩＩＢに対してＰ＜０．００１、ｎｄ：未検出。（Ｄ）肝臓の電子顕微鏡分析。明るく見える多数の小胞（矢印）が、ｎｕｌｌベクターで処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの肝細胞の細胞質において観察される。これらの小胞は、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍＮａｇｌｕで処置した動物においては、消失している。（Ｅ）（Ａ）および（Ｂ）と同じ動物群から得た肝臓抽出物における、他のリソソーム酵素の活性。ＩＤＳ：イズロン酸−２−スルファターゼ、ＩＤＵＡ：α−Ｌ−イズロニダーゼ、ＳＧＳＨ：Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドラーゼ、ＧＵＳＢ：β−グルクロニダーゼ、ＨＥＸＢ：ヘキソサミニダーゼＢ。野生種の酵素活性を１００％とした。値は、一群当たり４匹のマウスの平均±標準誤差である。＊＊：ＭＰＳＩＩＩＢ−ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０１、＊＊＊：ＭＰＳＩＩＩＢ−ｎｕｌｌに対してＰ＜０．００１。最適化ネズミα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕ）の槽内送達。薬剤未投与の野生種（健康な）マウス、未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウス、および、３．９×１０^１０ｖｇのコントロールベクター（ＡＡＶ９−Ｎｕｌｌ）または３×１０^１０ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕのいずれか一方を大槽内投与されたＭＰＳＩＩＩＢマウスにおける、行動評価。データは運動に対応しており、最初の２分間における探索行動を記録した。上記データは、一群当たり１０〜１５匹の動物の平均±標準誤差を表している。（Ａ）中央区画への待ち時間、（Ｂ）縁辺区画滞在時間、（Ｃ）中央区画への進入、（Ｄ）休息時間、（Ｅ）総移動距離、（Ｆ）越えたラインの総数。＊：ＭＰＳＩＩＩＢ−ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０５、＊＊：ＭＰＳＩＩＩＢ−ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０１。（Ｇ）野生種マウス（ｎ＝２３）、未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウス（ｎ＝１２）、３．９×１０^１０ｖｇのＡＡＶ９−Ｎｕｌｌを注入されたＭＰＳＩＩＩＢマウス（ｎ＝５）、または３×１０^１０ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕを注入されたＭＰＳＩＩＩＢマウス（ｎ＝８）における、カプラン＝マイヤー生存分析。ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕ遺伝子治療による処置により、ＭＰＳＩＩＩＢ動物の生存期間が相当に延長された。ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕ処置ＭＰＳＩＩＩＢマウスと、ＭＰＳＩＩＩＢ−ｎｕｌｌとの間において、Ｐ＝０．０００７。ビーグル犬に対する、最適化イヌα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｃＮａｇｌｕ）の槽内送達。（Ａ）健康なビーグル犬に対するＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｃＮａｇｌｕベクターのＣＳＦ内送達前後における、対応する血清およびＣＳＦサンプル中の抗ＡＡＶ９中性化抗体（Ｎａｂ）力価の追跡。槽内送達より１か月先前に、１×１０^１１ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９−ｎｕｌｌベクターを静脈内送達することにより、イヌ３およびイヌ４を事前に免疫化した。（Ｂ）６．５×１０^１２ｖｇのイヌα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているＡＡＶ９ベクターのＣＳＦ内投与後における、健康なビーグル犬成犬のＣＳＦ中のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の追跡。イヌ１およびイヌ２（白記号）は、投与時点において薬剤未投与であった。一方、イヌ３およびイヌ４（黒記号）は、事前に上記ＡＡＶ９ベクターに対する免疫を有していた。それぞれの時点における、全ての犬のＣＳＦ中の白血球数（ＷＢＣ）が、同じグラフに示されている（破線）。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕの模式図、および（Ｂ）組換えＡＡＶベクターＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕのゲノムの模式図。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕの模式図、および（Ｂ）組換えＡＡＶベクターＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕのゲノムの模式図。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ２の模式図、および（Ｂ）組換えＡＡＶベクターＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ２のゲノムの模式図。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ３の模式図、および（Ｂ）組換えＡＡＶベクターＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ３のゲノムの模式図。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕの模式図、および（Ｂ）組換えＡＡＶベクターＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕのゲノムの模式図。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｃＮａｇｌｕの模式図、および（Ｂ）組換えＡＡＶベクターＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｃＮａｇｌｕのゲノムの模式図。

〔微生物の寄託〕
プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ（配列番号６）は、２０１２年１１月１３日、アクセス番号(access number)ＤＳＭ２６６２６として、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstrasse 7 B, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany）に寄託された。

プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕ（配列番号５）は、２０１４年３月１３日、アクセス番号ＤＳＭ２８５６８として、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstrasse 7 B, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany）に寄託された。

プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ２（配列番号２０）は、２０１５年４月２９日、アクセス番号ＤＳＭ３２０４２として、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstrasse 7 B, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany）に寄託された。

プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ３（配列番号２３）は、２０１５年４月２９日、アクセス番号ＤＳＭ３２０４３として、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstrasse 7 B, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany）に寄託された。

〔定義〕
用語「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの核酸分子（それぞれ、デオキシリボ核酸またはリボ核酸を含んでいる）を指す。上記核酸は、二重鎖配列であっても、一重鎖配列であっても、または二重鎖配列もしくは一重鎖配列の両方の部分を有していてもよい。

用語「％の配列同一性」は、候補配列が最大の「％の配列同一性」を達成するように調整した後において、参照配列におけるヌクレオチドと同一である上記候補配列のヌクレオチドの割合を指す。上記「％の配列同一性」は、本技術分野において定着している任意の方法またはアルゴリズム（ＡＬＩＧＮ、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムなど）によって決定することができる。Altschul S, et al., Nuc Acids Res. 1977;25:3389-3402およびAltschul S, et al., J Mol Biol. 1990;215:403-410を参照。

本明細書において、上記「％の配列同一性」は、上記参照配列および上記候補配列を調整後に同一であるヌクレオチド数を、参照配列の全ヌクレオチド数で除し、その結果を１００倍することにより計算される。

用語「コードする(codify)」または「コードしている(coding)」は、どのようにヌクレオチド配列がポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるかを決定する、遺伝子コードを指す。配列中のヌクレオチドの順序は、ポリペプチドまたはタンパク質におけるアミノ酸の順序を決定する。

用語「タンパク質」は、１本以上のアミノ酸鎖またはポリペプチドから構成される高分子を指す。タンパク質は、システイン残基の３−オキソアラニンへの変換、糖鎖形成、または金属の結合のような翻訳後の修飾を受けうる。タンパク質の糖鎖形成とは、種々の炭化水素（アミノ酸鎖に共有結合されている）の付加である。

用語「効果的な量」は、意図された目的を達成するために充分な物質の量を指す。例えば、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）活性を上昇させるために効果的な量のＡＡＶ９ベクターは、グリコサミノグリカンの蓄積を減少させるために充分な量である。疾患または障害を処置するために「治療上効果的な量」の発現ベクターは、上記疾患または障害の徴候および症状を減少または根絶させるために充分な量の、上記発現ベクターである。所与の物質の効果的な量は、上記物質の性質、投与経路、上記物質を与えられる動物の大きさおよび生物種、ならびに上記物質を与える目的などの要因によって異なる。それぞれの個体の症例における効果的な量は、当業者によって経験的に決定されてよい。

用語「個体」は、哺乳類を指し、好ましくはヒトまたは非ヒト哺乳類を指し、より好ましくはマウス、ラット、その他の齧歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマまたは霊長類を指し、さらに好ましくはヒトを指す。

用語「作動可能に連結されている(operably linked)」は、機能上の関係、および所定の遺伝子に対するプロモーター配列の位置を指す（例えば、コード配列の転写に影響を及ぼすならば、プロモーターまたはエンハンサーは、当該コード配列に対して作動可能に連結されている）。一般的に、作動可能に連結されているプロモーターは、所定の配列に隣接している。しかし、エンハンサーは、所定の配列の発現を調節するために、当該所定の配列に隣接している必要がない。

用語「親和性」は、種々のウイルスが、特定の宿主となる生物種または当該生物種における特定の種類の細胞を、優先的に標的とするように進化した状態を指す。

用語「遺伝子治療」は、遺伝的疾患もしくは状態または獲得的疾患もしくは状態を、処置または予防するための、宿主に対する所定の遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の移入を指す。上記所定の遺伝物質は、ｉｎｖｉｖｏにおける生産が望まれている産物（例えば、ポリペプチドタンパク質、ペプチドまたは機能性ＲＮＡ）をコードしている。上記所定の遺伝物質は、例えば、酵素、ホルモン、受容体または治療上価値のあるポリペプチドをコードしうる。

用語「組換えウイルスベクター」、「ウイルスベクター」、「組換えベクター」または「ベクター」は、自然に産するウイルスから、所定の遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞に移入することができ、結果として当該遺伝物質によりコードされている産物（例えば、ポリペプチドタンパク質、ペプチドまたは機能性ＲＮＡ）を標的細胞において産生する遺伝子工学技術を経て、得られた作用物質を指す。本発明との関連において、「組換えベクター」または「ベクター」は、内部に含まれている遺伝物質に加えて、当該遺伝物質を細胞内へ移入するために用いられるキャプシドタンパク質でもあるとして、理解される。ヌクレオチド配列を介して「組換えベクター」または「ベクター」を指すことによって、対応する配列表（配列番号）にゲノムが記載されている「組換えベクター」または「ベクター」を指すことが意味される。

用語「組換えプラスミド」または「プラスミド」は、小型で、環状で、二重鎖の、自己複製するＤＮＡ分子であって、所定の遺伝物質を細胞に移入することができ、結果として当該遺伝物質によりコードされている産物（例えば、ポリペプチドタンパク質、ペプチドまたは機能性ＲＮＡ）を標的細胞において産生する遺伝子工学技術を経て得られた、ＤＮＡ分子を指す。さらに、用語「組換えプラスミド」または「プラスミド」はまた、小型で、環状で、二重鎖の、自己複製するＤＮＡ分子であって、組換えウイルスゲノムの搬送体としてのウイルスベクターを作製する際に使用される遺伝子工学技術を経て得られた、ＤＮＡ分子も指す。

〔発明の詳細な説明〕
本発明は、疾患の処置用の、具体的にはムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳＩＩＩ）の処置用の、特にＭＰＳＩＩＩＢ処置用の、新規な組換えベクターを提供する。

上記組換えベクターはまた、遺伝物質以外に、種々の機能因子を含んでいてよい。上記機能因子は、転写の調節因子（プロモーターまたはオペレーターのような）、転写因子結合部位またはエンハンサー、および、転写開始または転写終了の調節因子を含んでいる。

本発明に係るベクターは、所定の遺伝子の移入に用いられる、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）である。上記ベクターは、広範な組織における分裂終了細胞に形質導入するにあたって、高い効果を有することが判明した。本発明との関連において、上記ベクターは、ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ｈＮａｇｌｕ）ポリヌクレオチド（配列番号２）、またはコドン最適化ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ｃｏｈＮａｇｌｕ）ポリヌクレオチド（配列番号３）を送達するために用いられる。アデノ随伴ベクターは、parvoviridae科のアデノ随伴ウイルスのゲノムに由来するベクターである。上記アデノ随伴ウイルスのゲノムは、一重鎖のデオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）でできている。上記ベクターは、哺乳類に感染するが、しかし病原性ではない（すなわち、疾患を引き起こさない）。上記ベクターは、分裂細胞または非分裂細胞に感染することができる。上記ベクターの親和性は、血清型に応じて変化する。上記血清型は、ウイルスのキャプシド抗原に応じた、当該ウイルス群の分類である。ウイルスのキャプシドタンパク質によって決定されるアデノ随伴ウイルスの上記血清型は、当該ウイルスの親和性を規定し、特定の種類の細胞への当該ウイルスの進入を可能とする。本発明との関連において、血清型９のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ９）は、１回の投与で脳および末梢臓器へ遺伝物質を送達することに、最大の効果を示している。

本発明者らは、ＡＡＶ９キャプシドおよびα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているヌクレオチド配列と、特定のＣＡＧプロモーターとの一体となった連携により、欠如している酵素の長期間にわたる発現が、脳の全ての部位において可能となることを、驚くべきことに発見した。結果として、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のリソソームへの蓄積が治療される。上記治療は、ＭＰＳＩＩＩ（特にＭＰＳＩＩＩＢ）に特徴的な様式の神経変性により妨げられていたものである。この効果は、上記ベクターの投与箇所からは離れている嗅球においてさえも得られた。さらに、脳脊髄液中に送達される本発明に係るＡＡＶ９ベクターは、体循環に達し、肝臓を形質転換することができた。肝細胞による酵素の産生および分泌の結果、血清中のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性が上昇し、最終的に、多くの体性組織においてリソソームの異常を減少させた。このことは、既存の技法に対する本発明に係るベクターの、明白な長所を意味している。上記既存の技法では、上記疾患の臨床症状が部分的にしか治療されず、通常は脳または体循環のいずれか一方においてしか効果を発揮しないのであって、両方においては効果を発揮しない。

故に本発明は、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列に連結されているＣＡＧプロモーター（配列番号４）を含んでいる、組換えＡＡＶ９ベクターに関する。

具体的には、本発明の組換えＡＡＶ９ベクターは、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列に連結されているＣＡＧプロモーター（配列番号４）を含んでおり、上記ヌクレオチド配列は、配列番号２に対して８０％以上の配列同一性を有している。より好ましくは、本発明の組換えＡＡＶ９ベクターは、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列に連結されているＣＡＧプロモーター（配列番号４）を含んでおり、上記ヌクレオチド配列は、配列番号２に対して８４％以上の配列同一性を有している。具体的には、上記α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号２に対して８４％、８７％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有している。

他の具体的な実施形態において、本発明の組換えＡＡＶ９ベクターは、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列に連結されているＣＡＧプロモーター（配列番号４）を含んでおり、上記ヌクレオチド配列は、配列番号３に対して８５％以上の配列同一性を有している。具体的には、上記α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号３に対して８５％、８７％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有している。

本発明の好ましい実施形態において、上記α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号２である。

本発明のさらに好ましい実施形態において、上記α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号３である。配列番号３に記載されている配列は、配列番号２に対して８４％の配列同一性を有している。

本発明のよりさらに好ましい実施形態において、上記α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号１９である。

本発明のよりさらに好ましい実施形態において、上記α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号２２である。

本発明に係るＡＡＶ９ベクターは、所定の遺伝子の翻訳および転写を調節する、プロモーターを含んでいる。プロモーターは、上記所定の遺伝子に作動可能に連結されている、ヌクレオチド配列である。本発明において用いられるプロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。上記ＣＡＧプロモーターは、サイトメガロウイルス初期エンハンサー要素およびニワトリβ−アクチンプロモーターを含んでいる組み合わせを指す。上記ＣＡＧプロモーターはさらに、β−グロビンのイントロンの一部を含んでいる。上記β−グロビンのイントロン部分は、上記所定の遺伝子に由来するｍＲＮＡに安定性を与える（Alexopoulou A, et al., BMC Cell Biology 2008; 9(2): 1-11を参照）。本発明のＡＡＶ９ベクターに含まれている上記ＣＡＧプロモーターは、配列番号４の配列を有している。さらに言えば、上記ＣＡＧプロモーターは、本技術分野において通常用いられているＣＭＶプロモーターよりも効果的であることが立証された。

本発明のさらに好ましい実施形態において、上記組換えＡＡＶ９ベクターは、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕ（配列番号９）、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ（配列番号１０）、ならびにＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ２（配列番号２１）およびＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ３（配列番号２４）から選択される。好ましくは、上記組換えＡＡＶ９ベクターは、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕ（配列番号９）、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ（配列番号１０）から選択される。より具体的には、本発明の組換えＡＡＶ９ベクターは、血清型９のヒトアデノ随伴ウイルスのウイルスキャプシド、ならびに血清型２のヒトアデノ随伴ウイルスの逆方向反復配列（ＩＴＲ）、上記ＣＡＧプロモーター、上記ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）遺伝子のコード配列（ＣＤＳ）、およびウサギβ−グロビン遺伝子のポリＡを含んでいる改変ゲノム、から構成されている。

本発明はまた、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列を含んでいるプラスミドに関する。具体的には、本発明に係るプラスミドは、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列を含んでおり、上記ヌクレオチド配列は、配列番号２に対して８０％以上の配列同一性を有している。好ましくは、本発明に係るプラスミドは、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列を含んでおり、上記ヌクレオチド配列は、配列番号２に対して８４％以上の配列同一性を有している。具体的には、上記α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号２に対して８４％、８７％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有している。

好ましい実施形態において、本発明に係るプラスミドは、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列を含んでおり、上記ヌクレオチド配列は、配列番号３に対して８５％以上の配列同一性を有している。具体的には、上記α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号３に対して８５％、８７％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有している。

上記プラスミドは、本技術分野において知られている方法を用いるＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションにより、本発明の組換えＡＡＶ９ベクターを産生するために有用である。

本発明の好ましい実施形態において、本発明のプラスミドに含まれているヌクレオチド配列であって、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号２である。

本発明の他の好ましい実施形態において、本発明のプラスミドに含まれているヌクレオチド配列であって、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号３である。

本発明の他の好ましい実施形態において、本発明のプラスミドに含まれているヌクレオチド配列であって、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号１９である。

本発明の他の好ましい実施形態において、本発明のプラスミドに含まれているヌクレオチド配列であって、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号２２である。

より好ましい実施形態において、本発明のプラスミドは、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕ（配列番号５）、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ（配列番号６）、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ２（配列番号２０）およびｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ３（配列番号２３）から選択され、特にｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕ（配列番号５）およびｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ（配列番号６）から選択される。好ましくは、上記プラスミドは、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ（配列番号６）である。

本発明はさらに、本発明に係るアデノ随伴ウイルス組換えベクター（ＡＡＶ９）の製造方法を提供する。製法は、以下の工程を含む。
ｉ）第１のＡＡＶ末端反復と第２のＡＡＶ末端反復との間に挿入されている所定のタンパク質をコードしている配列、当該所定のタンパク質をコードしている配列に対して作動可能に連結されているＣＡＧプロモーターを含んでいる、第１のベクター；血清型９のＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含んでいる、第２のベクター；ならびに、アデノウイルスヘルパー機能遺伝子を含んでいる、第３のベクターを用意する工程、
ｉｉ）工程ｉ）のベクターを、コンピテントセルに共にトランスフェクションする工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）のトランスフェクションされた細胞を培養する工程、および
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の培地から、発現しているベクターを精製する工程。

好ましい実施形態において、上記第１のベクターの上記第１のＡＡＶ末端反復および上記第２のＡＡＶ末端反復は、血清型２のＡＡＶのＩＴＲである。他の好ましい実施形態において、上記第２のベクターの上記ＡＡＶｒｅｐ遺伝子は、血清型２のＡＡＶのものである。他の好ましい実施形態において、上記コンピテントセルは、ＨＥＫ２９３細胞である。

本発明はまた、本発明に係るプラスミドの調製方法を提供する。上記調製方法は、以下の工程を含む。
ｉ）出発材料であるプラスミドから、消化によって（具体的にはＭＩｕＩ／ＥｃｏＲＩを用いて）、所定のタンパク質をコードしている配列を切り取る工程、
ｉｉ）ＡＡＶを骨格とするプラスミドであるｐＡＡＶ−ＣＡＧの２箇所の制限部位の間において、上記所定のタンパク質をコードしている配列をクローニングする工程。この結果、上記所定のタンパク質をコードしている配列を含んでいる、対応するプラスミドを得る。

さらなる態様において、本発明は、本明細書において説明されているＡＡＶ９ベクターを治療上効果的な量含有している薬学的組成物、または本明細書において説明されているプラスミドを治療上効果的な量含有している薬学的組成物を、予期する(contemplates)。

本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体中に、上記組換えＡＡＶ９ベクターを含んでいる。上記組成物はまた、１種類以上の補助物質を含んでいてよい。上記補助物質は、担体、賦形剤、溶剤、希釈剤またはアジュバントのうちから選択されうる。許容可能な担体、許容可能な希釈剤または許容可能なアジュバントは、毒性がなく、好ましくは、投薬に際して不活性かつ採用された濃度において不活性である。上記許容可能な担体、許容可能な希釈剤または許容可能なアジュバントは、緩衝剤（リン酸、クエン酸または他の有機酸など）；酸化防止剤；低分子量のポリペプチド、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー；アミノ酸；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート剤；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；対イオンを形成する塩（ナトリウムなど）；および／または非イオン性界面活性剤（ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体（プルロニックＦ６８（登録商標））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）を包含している。

好ましい実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、非経口投与に適している。非経口投与の例としては、静脈内注入、皮下注入、槽内注入および筋肉内注入がある。好ましくは、本発明に係る薬学的組成物は、静脈内投与または槽内投与に適している。このような非経口投与に適している組成物は、無菌水性溶液または無菌水性分散液、無菌溶液または無菌分散液を必要に応じて調製するための無菌粉末を包含している。本発明に係る薬学的組成物は、都合の良いことに、細菌および菌類の汚染作用から守られている。

ヒトおよび動物向けの一日当たり投与量は、それぞれの生物種または他の要因（年齢、性別、体重または疾病の程度など）に基づく要因に応じて異なっていてよい。

本発明の他の態様は、上記に説明されているＡＡＶ９ベクターまたは上記に説明されているプラスミドの、治療上の使用に関する。上述したように、本発明に係る組換えＡＡＶ９ベクターは、欠如しているＮａｇｌｕ酵素を発現させられる。このようにして、上記組換えＡＡＶ９ベクターは、ＧＡＧのリソソームへの蓄積を治療する。これにより、ムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳＩＩＩ）の、そして特にＭＰＳＩＩＩＢの、全ての臨床症状を治療することができる。この点において、本発明はまた、薬剤として使用するための、上記に説明されている組換えＡＡＶ９ベクターまたは上記に説明されているプラスミドと関係がある。

具体的には、本発明は、体内のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を上昇させるための、上記に説明されている組換えＡＡＶ９ベクターまたは上記に説明されているプラスミドに関する。

さらに好ましい態様において、本発明は、ムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳＩＩＩ）の処置のための、および特にＭＰＳＩＩＩＢの処置のための、上記に説明されている組換えＡＡＶ９ベクターまたは上記に説明されているプラスミドに関する。

より更に好ましい実施形態において、本発明は、ムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳＩＩＩ）の処置、および特にＭＰＳＩＩＩＢの処置に有用な薬剤の作製のための、上記に説明されている組換えＡＡＶ９ベクターまたは上記に説明されているプラスミドの使用に関する。

本発明の他の実施形態は、上記に説明されている組換えＡＡＶ９ベクターの少なくとも１つ、または上記に説明されているプラスミドの少なくとも１つを、それ必要としている被験体に対して投与する工程を含む、ムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳＩＩＩ）の、および特にＭＰＳＩＩＩＢの、処置の方法に導かれる(directed)。

本発明は、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる単離細胞を、さらに提供する。具体的には、本発明に係る細胞は、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列を含んでおり、上記ヌクレオチド配列は、配列番号２に対して８０％以上の配列同一性を有している。好ましくは、配列番号２に対して８４％以上の配列同一性を有している、上記α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列。具体的には、上記α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号２に対して８４％、８７％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有している。さらに具体的な態様において、上記α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号３に対して８５％以上の配列同一性を有しており、好ましくは配列番号３に対して８５％、８７％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有している。

好ましい実施形態において、本発明の細胞は、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしている配列番号２のヌクレオチド配列を含んでいる。

他の好ましい実施形態において、本発明の細胞は、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしている配列番号３のヌクレオチド配列を含んでいる。

他の好ましい実施形態において、本発明の細胞は、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしている配列番号１９のヌクレオチド配列を含んでいる。

他の好ましい実施形態において、本発明の細胞は、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしている配列番号２２のヌクレオチド配列を含んでいる。

以下の実施例は、本発明の特定の実施例の単なる例示であり、決して本発明を制限するように見做すことはできない。

〔一般的な手順〕
［１．組換えＡＡＶベクター］
本明細書において説明されているＡＡＶベクターは、３重のトランスフェクションによって得た。上記ベクターを作製するために必要な材料は、ＨＥＫ２９３細胞（Ｅ１遺伝子を発現している）、アデノウイルス機能を与えるヘルパープラスミド、血清型２のＡＡＶｒｅｐ遺伝子および血清型９（ＡＡＶ９）のｃａｐ遺伝子を与えるプラスミド、そして最後に、ＡＡＶ２ＩＴＲを有する骨格プラスミドおよび所定のコンストラクトである。

ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの非最適化もしくは最適化ＣＤＳ、ネズミα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの非最適化もしくは最適化ＣＤＳ、またはイヌα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの非最適化もしくは最適化ＣＤＳを、ユビキタスハイブリッドＣＡＧプロモーターの制御下で、ＡＡＶ骨格プラスミド中にてクローニングして、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを発現しているＡＡＶベクターを産生した。

３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターを産生した（Matsushita T, et al., Gene Ther. 1998;5:938-945およびWright J, et al., Mol. Ther. 2005;12:171-178を参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ；Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエントにて細胞を培養した。次に、１）血清型２のＡＡＶのウイルスＩＴＲにより両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド（上述）；２）ＡＡＶｒｅｐ２遺伝子およびＡＡＶｃａｐ９遺伝子を有しているプラスミド；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、を共にトランスフェクションした。上述した最適化プロトコルを用いて、２回の塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso E, et al., Gene Ther. 2010;17:503-510を参照）。ベクターをＰＢＳで透析し、濾過し、ｑＰＣＲで定量し、使用まで−８０℃にて保存した。

本発明のベクターは、本技術分野において周知である分子生物学技術によって作製された。

［２．動物］
Ｃ５７Ｂ１／６Ｊのコンジェニック変異体（α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ欠失マウス（ＭＰＳＩＩＩＢ）モデル）は、The Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME, USA. Stock 003827）から購入した（Li et al., Proc Natl Acad Sci. 1999; 96(25):14505-10を参照）。ＭＰＳＩＩＩＢ罹患マウスおよび健康なコントロールマウスは、ヘテロ接合のファウンダーから近親交配により誕生した。テール・クリップサンプルをＰＣＲ分析し、目的の変異を含んでいる配列を増幅して、ゲノムＤＮＡの遺伝子型を決定した。それぞれのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーの配列は、以下の通りであった。フォワードプライマー：５’−ＧＴＣＧＴＣＴＣＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＡＣ−３’（配列番号１３）、リバースプライマー：５’−ＡＣＣＡＣＴＴＣＡＴＴＣＴＧＧＣＣＡＡＴ−３’（配列番号１４）、変異型リバースプライマー：５’−ＣＧＣＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＧ−３’（配列番号１５）。標準食（Harlan, Tekland）で行動制限を設けずにマウスを飼育し、明暗周期を１２時間に保った（午前９時に点灯）。

［３．ｈＮＡＧＬＵをコードしているプラスミドの、マウスへの流体力学的送達］
ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕプラスミド、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ２プラスミドおよびｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ３プラスミドの流体力学的送達のために、２月齢のＭＰＳＩＩＩＢ動物および野生種動物の尾静脈に注入を行った。上記注入は、５秒未満の間に行われ、総投与量は、上記動物の体重の１０％に相当する体積中に５０μｇのプラスミドであった。この技法により、プラスミドにコードされている導入遺伝子を、主として肝臓において発現させた（Liu et al., Gene Ther. 1990;6(7):1258-66を参照）。コントロールとして、マウスの一群に同量の生理食塩水を注入した。いずれのマウスも、プラスミドの流体力学的注入から１週間後に殺処分した。以下の項目で説明する通りに、臓器を摘出した。

［４．ベクターの投与およびサンプルの収集］
マウスへのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕベクターの槽内送達のために、２月齢のＭＰＳＩＩＩＢ動物の大槽に、総投与量３×１０^１０ｖｇを注入した。３．９×１０^１０ｖｇのコードしていないコントロールベクター（ＡＡＶ９−ｎｕｌｌ）を、同種の動物の一群に注入した。５月齢の時点（すなわちベクターの投与から３か月後）で、マウスに麻酔を施し、その後、心臓を経由して１０ｍＬのＰＢＳを潅流させて、組織から血液を完全に除去した。全脳および複数の体性組織（肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、肺、心臓、骨格筋および精巣を含む）を収集し、次の組織学的分析のために、液体窒素中で凍結させ−８０℃にて保存するか、ホルマリン中に浸漬した。

ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕベクターおよびＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕベクターの静脈内送達のために、２月齢のＭＰＳＩＩＩＢ動物の尾静脈に、総投与量５×１０^１１ｖｇを注入した。４月齢の時点（すなわちベクターの投与から２か月後）で、先の段落で説明されている通りに、マウスを殺処分し、臓器を摘出した。

ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕベクターおよびＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕベクターの槽内送達のために、２月齢のＭＰＳＩＩＩＢ動物の大槽内に、総投与量９．３×１０^９ｖｇを注入した。４月齢の時点（すなわちベクターの投与から２か月後）で、先の段落で説明されている通りに、マウスを殺処分し、臓器を摘出した。

イヌに対するＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｃＮａｇｌｕベクターの槽内送達のために、健康なビーグル犬の成犬に、大槽内注入により、総投与量６．５×１０^１２ｖｇを投与した。Ｎａｇｌｕベクターの投与に６週間先だって、動物のうち２頭に、１×１０^１１ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９−ｎｕｌｌベクターを静脈内注入し、ＡＡＶ９に対して事前に免疫化した。当初は毎週、次いで毎月、ＣＳＦおよび血清サンプルを収集し、−８０℃にて保存した。

［５．ベクターゲノムのコピー数の定量］
組織（約１００ｍｇ）を、４００μＬのプロテイナーゼＫ溶液（０．２ｍｇ／ｍＬ）中で、５６℃にて一晩（ＯＮ）消化した。標準的な技法で用いられている抽出により、上清から全ＤＮＡを単離した。ＤＮＡを蒸留水中で再懸濁し、NanoDrop ND-1000（NanoDrop, Wilmington, DE, USA）を用いて定量した。２０ｎｇの全ＤＮＡ中におけるベクターゲノムのコピー数は、定量リアルタイムＰＣＲにより決定した。上記定量リアルタイムＰＣＲでは、ネズミα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ導入遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブ（内因性の遺伝子座を増幅させない）を用いた。フォワードプライマー：５’−GCＣＧＡＧＧＣＣＣＡＧＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号１６）；リバースプライマー：５’−ＴＴＧＧＣＧＴＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧ−３’（配列番号１７）；プローブ：５’−ＡＧＣＡＧＡＡＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡＧＡＴＣＡＣＣＣ−３’（配列番号１８）。標準曲線と比較することにより、最終的な値を決定した。上記標準曲線は、２０ｎｇの形質導入されないゲノムＤＮＡが挿入されているＡＡＶベクター産生に用いられる直線化プラスミドを、一連の希釈率としたものから構成されている。

［６．α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性およびグリコサミノグリカンの定量］
肝臓サンプルおよび脳サンプルは、Ｍｉｌｉ−Ｑ水中で超音波処理した。血清は、未処理で分析した。上述した通りに、４−メチルウンベリフェロン由来の蛍光源基質（Moscerdam Substrates, Oegstgeest, NL）によって、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を決定した（Marsh and Fensom, Clin Genet. 1985;27(3):258-262を参照）。タンパク質の全量に対して脳および肝臓の活性レベルを正規化し、Bradford protein assay（Bio-Rad, Hercules, CA, US）を用いて定量した。血清の活性は、体積に対して正規化した。

グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量のために、組織サンプルを計量し、プロテイナーゼＫで消化した。遠心分離および濾過により、抽出物を清澄化した。Blyscan sulfated glycosaminoglycan kit（Biocolor, Carrickfergus, County Antrim, GB）により、コンドロイチン−４−スルファートを標準として用いて、組織抽出物中のＧＡＧレベルを決定した。ＧＡＧのレベルを、組織の含水重量に対して、正規化した。

［７．他のリソソーム酵素の活性］
４−メチルウンベリフェリル−α−Ｎ−イズロニド（Glycosynth）と共に、３７℃にて１時間インキュベートしたタンパク質１５μｇにおける、ＩＤＵＡ活性を測定した。ＩＤＳ活性のために、タンパク質１５μｇを、まず、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｌ−イズロニド−２−スルファート（Moscerdam Substrates）と共に、３７℃にて４時間インキュベートした。次いで、ウシ精巣のリソソーム酵素（LEBT-M2, Moscerdam Substrates）を含む液溜め中で、３７℃にて２４時間インキュベートした。上述した通りに、ＳＧＳＨ活性を測定した（Haurigot et al., J Clin Invest 2013;123(8):3254-71を参照）。ＧＵＳＢ活性のために、タンパク質１０μｇを、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（Sigma）と共に、３７℃にて１時間インキュベートした。タンパク質０．１μｇを、４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコアミニド(glucoaminide)（Sigma）と共に、３７℃にて１時間インキュベートして、ＨＥＸＥ活性を定量した。ｐＨを上昇させることにより反応を停止させた後、放出された蛍光を、FLx800 fluorimeter（BioTek Instruments）で計測した。全ての酵素活性は、Bradford（Bio-Rad）により定量した総タンパク質含有量に対して正規化した。

［８．組織学的分析］
組織をホルマリン中で１２〜２４時間固定し、パラフィンに包埋し、切片を作製した。体性組織におけるＬＡＭＰ１の免疫組織学的検出のために、クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中で、パラフィン切片を熱誘導エピトープ賦活化した。次いで、上記パラフィン切片を、１：１００に希釈したラット抗ＬＡＭＰ１抗体（1D4B; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, US）と共に、４℃にて一晩インキュベートした。続いて、上記パラフィン片を、１：３００に希釈したビオチン化ウサギ抗ラット抗体（Dako, Glostrup, DK）と共にインキュベートした。脳におけるＬＩＭＰ２の免疫組織学的検出のために、パラフィン切片を、１：１００に希釈したウサギ抗ＬＩＮＰ２抗体（NB400; Novus Biologicals, Littleton, CO, USA）と共に、４℃にて一晩インキュベートした。続いて、上記パラフィン片を、１：３００に希釈したビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体（31820; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA）と共にインキュベートした。脳サンプルにおけるＧＦＡＰの免疫染色のために、パラフィン切片を、１：１０００に希釈したウサギ抗ＧＦＡＰ抗体（Ab6673; Abcam, Cambridge, UK）と共に、４℃にて一晩インキュベートした。続いて、上記パラフィン片を、１：３００に希釈したビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体（31820; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA）と共にインキュベートした。切片を、１：１００に希釈したABC-Peroxidase staining kit（Thermo Scientific, Waltham, MA, US）と共にインキュベートすることにより、ＬＡＭＰ１、ＬＩＭＰ２およびＧＦＡＰの信号を増幅した。そして、上記切片を、色原体として３，３−ジアミノベンジジン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US）を用いて可視化した。光学顕微鏡（Eclipse 90i; Nikon, Tokyo, JP）により、明視野像を得た。

脳サンプルにおけるミクログリア細胞を染色するために、パラフィン切片を、１：１００に希釈したＢｓｉ−Ｂ４レクチン（L5391; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）と共に、４℃にて一晩インキュベートした。色原体として３，３−ジアミノベンジジン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US）を用いて、Ｂｓｉ−Ｂ４の信号を可視化した。光学顕微鏡（Eclipse 90i; Nikon, Tokyo, JP）により、明視野像を得た。

NIS Elements Advanced Research 2.20ソフトウェアを用いて、一匹の動物のそれぞれの脳の部位当たり３〜５枚の画像（元の拡大倍率：２０倍）における、ＬＩＭＰ２、ＧＦＡＰおよびＢｓｉ−Ｂ４信号を定量した（全ての動物に対して同じ信号閾値を設定した）。次いで、ポジティブである面積の割合を計算した。すなわち、上記画像中の全組織の面積に対する、ポジティブ信号を有する面積を、ピクセルで計算した。

［９．透過型電子顕微鏡による分析］
イソフルオラン(isofluorane)（Isofluo, Labs. Esteve, Barcelona, ES）の過剰投与によりマウスを殺処分し、下大動脈を通して、１ｍＬの２．５％グルタルアルデヒドおよび２％パラホルムアルデヒドを潅流させた。肝臓の側葉および大脳皮質の小片（約１ｍｍ^３）から切片を作製し、同じ固定液中で、４℃にて２時間インキュベートした。冷却したカコジル酸緩衝液中で洗浄した後、１％４酸化オスミウム中で試料を後固定し、酢酸ウラニル水溶液中で染色した。次いで、濃度を段階的に高く変えながらエタノールに数回通して脱水し、エポキシ樹脂中に包埋した。樹脂ブロックから作製した極薄片（６００〜８００Å）を、クエン酸鉛を用いて染色し、透過型電子顕微鏡（H-7000; Hitachi, Tokyo, JP）で調査した。

［１０．トランスクリプトーム解析］
マウスの脳の半分（〜２５０ｍｇ）を機械的にホモジナイズし、mirVanaTM(Ambion, Life Technologies)で全てのＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡを合成し、その後、Progenika Biopharma（スペイン）製のGeneChip Mouse Gene 2.1 ST 16 array plate（Affymetrix）中でハイブリダイズした。サンプルの処理、ハイブリダイゼーションおよびスキャンは、Affymetrixにより推奨されている、プロトコルおよび器具に従って実行した。Affymetrix（登録商標）Expression Console TM toolを用いて、ＲＭＡ（Robust Multiarray averaging）法によってデータの正規化を行い、ｌｏｇ２変換および正規化された値を得た。データをフィルタリングして、公知のコード配列に対する分析にフォーカスし、最初に２６６８８の変異遺伝子のリストを得た。続いて、上記リストを再度フィルタリングして、７５％より少ない変異を示す遺伝子を除去した。この処理によって、作業用に６６７２の遺伝子のリストを作成した。多様に発現した遺伝子のために、８０％の確からしさを有するＦＤＲ（False Discovery Rate）の基準として、＜０．１を設定した。クラスター分析のために、データを正規化し、J-Express Proソフトウェア（jexpress.bioinfo.no）を用いて、ヒートマップとして表した。Genecodis Tool 2.0（genecodis2.dacya.ucm.es）を用いて、機能分析を実行した。アレイのデータは、ArrayExpress database(http://www.ebi.ac. uk/arrayexpress/；アクセッションコード: E-MTAB-2984)に提出した。

［１１．行動評価］
オープンフィールド試験を通じて、行動変化を評価した。動物を、明るく照らされた試験室（４１ｃｍ×４１ｃｍ×３０ｃｍ）の左下隅の角に配置した。活動領域の表面を、同心状の３つの正方形へと分割した（中央（１４×１４ｃｍ）、外周（２７×２７ｃｍ）および縁辺（４１×４１ｃｍ））。ビデオ追跡システム（Smart Junior, Panlab）を用いて、最初の２分間における探索行動および一般的な運動を記録した。該日リズムの影響を最小限にするため、試験は常に、一日のうちの同じ時間帯に実施された（午前９時〜午後１時）。

［１２．統計分析］
全ての結果を平均±標準誤差として表した。一元配置分散分析を用いて統計比較を行い、ダネットの事後検定を用いてコントロール群と処置群との間の多重比較を行う。Ｐ＜０．０５の場合、統計的有意であると見なした。生存の分析のためにカプラン＝マイヤー法を用い、比較のためにログランク検定を用いる。

〔実施例１：ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕの構築〕
ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのコード配列（ＣＤＳ）を出発材料（ＮＣＢＩの参照配列: NM_000263）として利用し、本実施例の目的のために化学的に合成した（GeneArt; Life Technologies）。プラスミドｐＭＡ（AmpR）内で、上記ＣＤＳをクローニングした。上記ＣＤＳは、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位によって、５’末端側および３’末端側がそれぞれ挟まれていた。α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのＣＤＳを、ＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩの消化によって切り出した。その後、ＡＡＶを骨格とするプラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ（AmpR）の、ＭｌｕＩの制限部位とＥｃｏＲＩの制限部位との間においてクローニングした。結果として生じたプラスミドを、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕ（アクセッション番号：ＤＳＭ２８５６８）と名付けた（配列番号５および図１９Ａを参照）。

ｐＡＡＶ−ＣＡＧプラスミドは、従前産生されてきた。上記ｐＡＡＶ−ＣＡＧプラスミドには、所定のＣＤＳのクローニングのためのマルチクローニングサイトに加え、ＡＡＶ２ゲノムのＩＴＲ、ＣＡＧプロモーター、およびウサギβ−グロビンのポリＡシグナルを含んでいた。上記ＣＡＧプロモーターは、ＣＭＶの初期／中期エンハンサーおよびニワトリβ−アクチンプロモーターから構成された、ハイブリッドプロモーターである。上記プロモーターは、あらゆる部位において、強力に発現を促進することができる（Sawicki J et al., Exper Cell Res. 1998;244:367-369, Huang J et al., J Gene Med. 2003;5:900-908, Liu Y et al., Exp Mol Med. 2007; 39(2):170-175を参照）。

〔実施例２：ＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕの産生〕
３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕ（配列番号９および図１９Ｂ）を産生した（Matsushita, 1998, supra および Wright, 2005, supraを参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ；Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエントにて細胞を培養した。次に、１）ＡＡＶ２のＩＴＲにより両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド（ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕ）；２）ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ９ｃａｐ遺伝子を有しているプラスミド（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、を共にトランスフェクションした。標準的なプロトコルまたは上述の最適化されたプロトコルのいずれかを用いて、２回の塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso, 2010, supraを参照）。ベクターをＰＢＳで透析し、濾過し、ｑＰＣＲで定量し、使用まで−８０℃にて保存した。

〔実施例３：ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕの構築〕
最適化されているヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのＣＤＳ（ｃｏｈＮａｇｌｕ）を含んでいる発現カセットを設計して得た。配列の最適化（GeneArt（登録商標））を実行して、ヒトにおけるα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼタンパク質の産生効率を最大化した。上記最適化では、短いスプライス部位およびＲＮＡ安定化配列要素（ＲＮＡの安定性を上げるため）の削除、ＲＮＡ安定化配列要素の付加、コドンの最適化およびＧ／Ｃの含有量の適応、他の変化に起因するＲＮＡの安定二次構造の回避を行った。最適化したＣＤＳを、プラスミドｐＭＡ−ＲＱ（AmpR）内でクローニングした。上記ＣＤＳは、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位によって、５’および３’がそれぞれ挟まれていた。

ｐＭＡ−ＲＱ−ｃｏｈＮａｇｌｕプラスミドをＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、最適化α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのＣＤＳを切り出した。続いて、この断片を、上記ｐＡＡＶ−ＣＡＧを骨格とするプラスミドの同じ制限部位の間にてクローニングして、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕプラスミド（アクセッション番号：ＤＳＭ２６６２６）を産生した（配列番号６および図２０Ａを参照）。

〔実施例４：ＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕの生産〕
３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ（配列番号１０および図２０Ｂ）を産生した（Matsushita, 1998, supraおよびWright, 2005, supraを参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ；Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエントにて細胞を培養した。次に、１）ＡＡＶ２のＩＴＲにより両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド（ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ）；２）ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ９ｃａｐ遺伝子を有しているプラスミド（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、を共にトランスフェクションした。標準的なプロトコルまたは上述の最適化されたプロトコルのいずれかを用いて、２回の塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso, 2010, supraを参照）。ベクターをＰＢＳで透析し、濾過し、ｑＰＣＲで定量し、使用まで−８０℃にて保存した。

〔実施例５：ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ２の構築〕
第２の最適化されているヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのＣＤＳ（ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ２）を含んでいる発現カセットを設計して得た。プラスミドｐＪ２０８（AmpR）中にて、最適化ＣＤＳ（ＤＮＡ２．０（登録商標））をクローニングした。上記ＣＤＳは、５’および３’において、それぞれ、ＭｌｕＩの制限部位およびＥｃｏＲＩの制限部位に挟まれていた。

ｐＪ２０８−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ２プラスミドをＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、最適化α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ−バージョン２のＣＤＳを切り出した。続いて、この断片を、上記ｐＡＡＶ−ＣＡＧを骨格とするプラスミドの同じ制限部位の間にてクローニングして、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ２プラスミド（アクセッション番号：ＤＳＭ３２０４２）を産生した（配列番号２０および図２１Ａを参照）。

〔実施例６：ＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ２の産生〕
３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ２（配列番号２１および図２１Ｂ）を産生した（Matsushita, 1998, supraおよびWright, 2005, supraを参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ；Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエントにて細胞を培養した。次に、１）ＡＡＶ２のＩＴＲにより両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド（ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ２）；２）ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ９ｃａｐ遺伝子を有しているプラスミド（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、を共にトランスフェクションした。標準的なプロトコルまたは上述の最適化されたプロトコルのいずれかを用いて、２回の塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso, 2010, supraを参照）。ベクターをＰＢＳで透析し、濾過し、ｑＰＣＲで定量し、使用まで−８０℃にて保存した。

〔実施例７：ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ３の構築〕
第３の最適化されているヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのＣＤＳ（ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ３）を含んでいる発現カセットを設計して得た。プラスミドｐＵＣ５７（AmpR）中にて、最適化ＣＤＳ（GenScript, Inc）をクローニングした。上記ＣＤＳは、５’および３’において、それぞれ、ＭｌｕＩの制限部位およびＥｃｏＲＩの制限部位に挟まれていた。

ｐＵＣ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ３プラスミドをＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、最適化α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ−バージョン３のＣＤＳを切り出した。続いて、この断片を、上記ｐＡＡＶ−ＣＡＧを骨格とするプラスミドの同じ制限部位の間にてクローニングして、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ３プラスミド（アクセッション番号：ＤＳＭ３２０４３）を産生した（配列番号２３および図２２Ａを参照）。

〔実施例８：ＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ３の生産〕
３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ３（配列番号２４および図２２Ｂ）を産生した（Matsushita, 1998, supraおよびWright, 2005, supraを参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ；Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエントにて細胞を培養した。次に、１）ＡＡＶ２のＩＴＲにより両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド（ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ３）；２）ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ９ｃａｐ遺伝子を有しているプラスミド（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、を共にトランスフェクションした。標準的なプロトコルまたは上述の最適化されたプロトコルのいずれかを用いて、２回の塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso, 2010, supraを参照）。ベクターをＰＢＳで透析し、濾過し、ｑＰＣＲで定量し、使用まで−８０℃にて保存した。

〔実施例９：ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕの構築〕
ネズミα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのＣＤＳ（ＮＣＢＩの参照配列:NM_013792）に対し、配列の最適化（GeneArt; Life Technologies）を行った。プラスミドｐＭＡ−ＲＱ（AmpR）中にて、最適化ＣＤＳ（GenScript, Inc）をクローニングした。上記ＣＤＳは、５’および３’において、それぞれ、ＭｌｕＩの制限部位およびＥｃｏＲＩの制限部位に挟まれていた。

ＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩ−最適化ネズミα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのＣＤＳの断片を、上記ｐＭＡ−ＲＱプラスミドから切り出した。続いて、ＡＡＶを骨格とするプラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧの、ＭｌｕＩの制限部位とＥｃｏＲＩの制限部位との間においてクローニングした。結果として生じたプラスミドを、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕと名付けた（配列番号７および図２３Ａを参照）。

〔実施例１０：ＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕの生産〕
３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕ（配列番号１１および図２３Ｂ）を産生した（Matsushita, 1998, supraおよびWright, 2005, supraを参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ；Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエントにて細胞を培養した。次に、１）ＡＡＶ２のＩＴＲにより両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド（ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕ）；２）ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ９ｃａｐ遺伝子を有しているプラスミド（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、を共にトランスフェクションした。標準的なプロトコルまたは上述の最適化されたプロトコルのいずれかを用いて、２回の塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso, 2010, supraを参照）。ベクターをＰＢＳで透析し、濾過し、ｑＰＣＲで定量し、使用まで−８０℃にて保存した。

〔実施例１１：ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｃＮａｇｌｕの構築〕
イヌα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのＣＤＳ（ＮＣＢＩの参照配列:XM_548088.4）に対し、配列の最適化（GeneArt; Life Technologies）を行った。プラスミドｐＭＡ−ＲＱ（AmpR）中にて、最適化ＣＤＳをクローニングした。上記ＣＤＳは、５’および３’において、それぞれ、ＭｌｕＩの制限部位およびＥｃｏＲＩの制限部位に挟まれていた。

ＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩ−最適化イヌα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのＣＤＳの断片を、上記ｐＭＡ−ＲＱプラスミドから切り出した。続いて、ＡＡＶを骨格とするプラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧの、ＭｌｕＩの制限部位とＥｃｏＲＩの制限部位との間においてクローニングした。結果として生じたプラスミドを、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｃＮａｇｌｕと名付けた（配列番号８および図２４Ａを参照）。

〔実施例１２：ＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｃＮａｇｌｕの生産〕
３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｃＮａｇｌｕ（配列番号１２および図２４Ｂ）を産生した（Matsushita, 1998, supraおよびWright, 2005, supraを参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ；Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエントにて細胞を培養した。次に、１）ＡＡＶ２のＩＴＲにより両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド（ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｃＮａｇｌｕ）；２）ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ９ｃａｐ遺伝子を有しているプラスミド（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、を共にトランスフェクションした。標準的なプロトコルまたは上述の最適化されたプロトコルのいずれかを用いて、２回の塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso, 2010, supraを参照）。ベクターをＰＢＳで透析し、濾過し、ｑＰＣＲで定量し、使用まで−８０℃にて保存した。

〔実施例１３：プラスミドｐＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕの流体力学的送達〕
総投与量５０μｇのプラスミドｐＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕ（野生種のヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの発現カセットを含んでいる）を、流体力学的尾静脈（ＨＤＴＶ）注入を介して、２月齢のＭＰＳＩＩＩＢマウスに対して投与した。この技法は、肝臓に送達されたプラスミドの発現を目的とする（Liu et al., Gene Ther. 1990;6(7):1258-66を参照）。

プラスミドの送達から１週間後、処置前のレベルに対するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の著しい上昇が、野生種のヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているプラスミドを投与された全ての動物の、肝臓および血清において記録された（図１Ａおよび図１Ｂを参照）。生理食塩水を注入されたＭＰＳＩＩＩＢ動物では、活性が検出されなかった。処置した動物の肝臓および血清において観察されたα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性のレベルは、それぞれ、野生種の動物の肝臓および血清において測定された活性の平均値（当該平均値を１００％とした）の、１５０％および１７００％に相当した（図１Ａおよび図１Ｂを参照）。

〔実施例１４：ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕの静脈内送達〕
総投与量５×１０^１１ベクターゲノムのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕベクターを、尾静脈注入を介して、２月齢のＭＰＳＩＩＩＢマウスに対して投与した。

ＡＡＶ９ベクターの肝臓に対する高い親和性と合致していることに、投与から２か月後、処置した動物は、肝臓において高いレベルのα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を示した（健康な動物において観察された活性のレベルの７００％）。上記活性は、未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウスの体性組織において観察された病理的なＧＡＧの蓄積を、完全に除去するか、またはかなり減少させた（図２Ａ〜図２Ｃを参照）。加えて、全身性の投与であっても、血清型９のＡＡＶベクターが脳を高い効率で形質導入することができるので、処置した動物は、有意なレベルのα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性（健康なマウスの２０〜３０％）を、分析した脳の全領域において示した（図３Ａを参照）。このα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の部分的な回復は、脳の全部位からＧＡＧの蓄積を除去するに充分であった（図３Ｂを参照）。

〔実施例１５：ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕの静脈内送達〕
総投与量５×１０^１１ベクターゲノムのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕベクターを、尾静脈注入を介して、２月齢のＭＰＳＩＩＩＢマウスに対して投与した。

投与から２か月後、処置した動物は、肝臓における高いレベルのα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性（健康なレベルの６００％）、および、血清における活性レベルの緩やかな上昇（健康なレベルの７％）を示した（図４Ａおよび図４Ｂを参照）。α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの産生により、未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウスの体性組織において観察された病理的なＧＡＧの蓄積は、完全に消失したか、またはかなり減少した（図４Ｃを参照）。加えて、処置した動物は、有意なレベルのα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性（健康なマウスの１８〜２７％）を、分析した脳の全領域において示した（図５Ａを参照）。このα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の部分的な回復は、脳の全部位からＧＡＧの蓄積を除去するに充分であった（図５Ｂを参照）。

〔実施例１６：ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕの槽内送達〕
総投与量９．３×１０^９ベクターゲノムのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕベクターを、２月齢のＭＰＳＩＩＩＢ動物の大槽内に、総容積５μＬで注入した。

ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕベクターのＣＳＦ内投与により、分析した脳の全部位において、高いレベルのα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性がもたらされた（健康なマウスの５０〜１００％）。脳の最前端部において、健康な動物で観察されるレベルにまで活性が達した（図６Ａを参照）。ＧＡＧの過剰な蓄積は、処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの脳において、完全に消失した（図６Ｂを参照)。ＣＳＦへと送達される場合、血清型９のＡＡＶベクターは血流へと漏出し、肝臓を形質導入する（Haurigot et al., J Clin Invest 2013;123(8):3254-71を参照）。上記文献の通り、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性は、処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの肝臓において、健康な動物の３２％のレベルで検出された（図７Ａを参照）。このような、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の上昇は、肝臓、脾臓、心臓、肺、精巣および膀胱における、ＧＡＧの蓄積の治療をもたらし、また腎臓におけるＧＡＧの蓄積は有意に減少した（図７Ｂを参照）。

〔実施例１７：ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕの槽内送達〕
総投与量９．３×１０^９ベクターゲノムのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕベクターを、２月齢のＭＰＳＩＩＩＢ動物の大槽内に、総容積５μＬで注入した。

ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕベクターの槽内投与により、分析した脳の全領域において、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性のレベルがかなり上昇した（健康な値の２２〜４５％に及んだ）（図８Ａを参照）。これに応じて、処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの脳の全領域において、病理的なＧＡＧの蓄積は完全に元の状態に戻った（図８Ｂを参照）。α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性もまた、処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの肝臓において、健康な動物の２５％へと上昇した（図９Ａを参照）。このような、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の上昇は、肝臓、心臓、肺および膀胱における、ＧＡＧの蓄積の治療をもたらし、また脾臓、精巣および腎臓におけるＧＡＧの蓄積は有意に減少した（図９Ｂを参照）。

〔実施例１８：プラスミドｐＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ２の流体力学的送達〕
総投与量５０μｇの、プラスミドｐＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ２（最適化されたバージョン（バージョン２）のヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを含んでいる発現カセットを有している）を、流体力学的尾静脈注入を介して、２月齢のＭＰＳＩＩＩＢマウスに対して投与した。上述した通り、この技法は、肝臓に送達されたプラスミドの発現を目的とする（Liu et al., supraを参照）。

プラスミドの送達から１週間後、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性が、処置前のレベルに対して上昇した。上記上昇は、最適化ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ−バージョン２をコードしている配列を含んでいるプラスミドを流体力学的注入された全ての動物の、肝臓および血清において発生した（図１０Ａおよび図１０Ｂを参照）。生理食塩水を注入されたＭＰＳＩＩＩＢ動物では、活性が検出されなかった。処置した動物において、肝臓および血清のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性のレベルは、それぞれ、野生種の動物において観察された活性の平均値（当該平均値を１００％とした）の、１５０％および１５００％に達した（図１０Ａおよび図１０Ｂを参照）。

〔実施例１９：プラスミドｐＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ３の流体力学的送達〕
総投与量５０μｇの、プラスミドｐＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ３（コドン最適化されたバージョン（バージョン３）のヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ発現カセットを有している）を、流体力学的尾静脈注入を介して、２月齢のＭＰＳＩＩＩＢマウスに対して投与した。上述した通り、この技法は、肝臓に送達されたプラスミドの発現を目的とする（Liu et al., supraを参照）。

プラスミドの送達から１週間後、処置前のレベルに対するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の上昇が、最適化ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ−バージョン３をコードしている配列を含んでいる発現カセットを有するプラスミドを投与された全ての動物の、肝臓および血清において記録された（図１１Ａおよび図１１Ｂを参照）。生理食塩水を注入されたＭＰＳＩＩＩＢ動物では、活性が検出されなかった。処置した動物の肝臓および血清において観察されたα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性のレベルは、それぞれ、野生種の動物の肝臓および血清において決定された活性の平均値（当該平均値を１００％とした）の、１７０％および１１００％に達した（図１１Ａおよび図１１Ｂを参照）。

〔実施例２０：ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕの槽内送達〕
総投与量３×１０^１０ベクターゲノムのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕベクターを、２月齢のＭＰＳＩＩＩＢ動物の大槽内に、総容積１０μＬで注入した。

分析された脳の全部位および脊髄において、ＡＡＶ９ベクターゲノムを検出することができた。末梢組織において、多量の遺伝子コピー数のベクターゲノムを検出することができたのは、肝臓においてのみであった。頭部を流れるリンパ節（下顎のリンパ節）において、少量の遺伝子コピー数のベクターゲノムを検出することができた（図１２Ａ〜Ｂを参照）。

ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕベクターのＣＳＦ内投与により、分析された脳の全部位において、非常に高いレベルのα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性がもたらされた。上記レベルは、全領域において、健康な動物で観察されたレベルよりも、数倍高いレベルに達した（図１３Ａを参照）。ベクター送達から３か月後、本疾患に特徴的なリソソームの異常は、処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの脳において、完全に元の状態に戻った。これは、分析した脳の全部位における、ＧＡＧの蓄積の正常化、およびリソソームマーカーＬＩＭＰ−２＋の信号強度の正常化によって示される（図１３Ｂおよび図１４Ａを参照）。透過型電子顕微鏡による、後頭葉および小脳の超微細構造分析により、リソソームの異常の減少を確認した。上記異常は、コントロールベクターを受容したＭＰＳＩＩＩＢ動物における、拡張し、大きな蓄積小胞で満たされている皮質ニューロン周囲グリア細胞の外観から、非常に明白である。一方で、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕで処置した動物においては、正常な外観であった（図１４Ｂを参照）。ＬＳＤでは、いくつかのリソソーム酵素の活性（遺伝的変異による直接的な罹患を除く）は、二次的に変化し、正常なリソソームの恒常性が攪乱されうる（Sardiello et al., Science. 2009;325:473−477を参照）。未処置またはＮｕｌｌ処置したオスのＭＰＳＩＩＩＢマウス（５月齢）の脳において、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドラーゼ（ＳＧＳＨ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）およびヘキソサミニダーゼＢ（ＨＥＸＢ）の活性は、有意に上昇した（図１４Ｃを参照）。ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕベクターのＣＳＦ内送達から３か月後に観察された、ＧＡＧの蓄積における減少と合致していることに、脳のＳＧＳＨ、ＧＵＳＢおよびＨＥＸＢの活性は、処置した動物において、健康な野生種のレベルに戻った（図１４Ｃを参照）。

リソソームの異常の治療に従って、処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの脳から、全ての炎症の徴候が消失した。アストロサイトーシス（ＧＦＡＰ）およびミクログリオーシス（ＢＳＩ−Ｂ４）を検出するために用いた染色の信号強度は、処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスおよび健康な動物において類似していた。これらの神経炎症マーカーの明白な上方制御が示されている、未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウスにおいて記録された信号とは対照的であった（図１５Ａおよび図１５Ｂを参照）。ＣＮＳの炎症についての、ＣＳＦ内ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕ遺伝子治療の効果をさらに評価するため、野生種の脳、ならびにＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕ処置またはＡＡＶ９−Ｎｕｌｌ処置したＭＰＳＩＩＩＢの脳から単離された全ＲＮＡについて、Affimetrix（登録商標）マイクロアレイプラットフォームを用いて、遺伝子発現プロファイリング試験を実行した。データの処理およびデータのフィルタリングの後、３群の間で、９４の遺伝子が異なって発現していることが判明した。遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント分析を使用して、生物学的過程によって異なって発現している遺伝子を分類したとき、９４のうち６７の遺伝子が、対応するオントロジーと共にアノテーションされた（図１５Ｃを参照）。このうち、大多数が炎症および先天性免疫、または上記過程に関係する細胞に起因しうる機能と関連付けられた（図１５Ｃを参照）。この観察を明らかにするため、セルタイプエンリッチメント（ＣＴＥＮ）分析を用い、転写レベルにおいて観察された変化に対する、種々の種類の細胞の寄与を評価した。このソフトウェアでは、当該ソフトウェアが定義したスコアが２よりも大きければ、特定の種類の細胞のエンリッチメントがあると見なす。データセットのうち最も高いスコアは、ミクログリア細胞が得た（スコア＝６０）。この結果は、神経変性の疾患およびＭＰＳＩＩＩにおける、ミクログリアに起因する重要な役割と一致した（Ohmi et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100:1902-1907, McGeer et al. Alzheimer Dis Assoc Disord. 1998;12 (Suppl. 2):S1-E16, Derecki et al., Nature. 2012;484: 105-109, DiRosario et al., J Neurosci Res. 2009;87:978-990, Archer, et al., J Inherit Metab Dis. 2014;37:1-12を参照）。ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕベクターの、ＣＳＦ内送達の効果が評価されたところで、ＡＡＶ９−Ｎｕｌｌを注入した動物に関する遺伝子発現のプロファイルにおいては、特筆すべき変化が観察された。ベクターの投与から３か月後、処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスにおける大多数の遺伝子は、健康な同腹仔のそれと類似した転写レベルを有していた。ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕ処置の後に、未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウスにおいて異なって発現していた遺伝子のほぼ９０％が、５０％以上の転写レベルに治療され、そのうち６０％は、７５％の転写レベルに治療された。ＣＴＥＮソフトウェアがミクログリアだと見なした遺伝子のセットを個々に分析したとき、同程度またはかなり高い程度に、転写レベルが正常化されていることが観察された（図１５Ｄを参照）。この観察により、ＭＰＳＩＩＩＢにおいて観察された遺伝子発現のプロファイルについて、ミクログリアは大いに原因がある、という考えが支持される。また上記観察は、処置した動物において記録された、ミクログリオーシスの完全な回復に整合性がある。

ＣＦＳに対して投与されたＡＡＶ９ベクターは、末梢に漏出し、肝臓を形質導入する（図９およびHaurigot et al., supraを参照）。したがって、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕで処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの肝臓および血清において、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の上昇が記録された。上記活性は、健康な動物において観察されたレベルの、約８００％のレベルに達した（図１６Ａおよび１６Ｂを参照）。血清における酵素活性のレベルは、処置したマウスの肝臓における活性のレベルとよく関連しており、肝臓が酵素循環の主要な原因であったことを示唆している。種々の臓器におけるＧＡＧの含有量の定量化を通して、体部における治療の効果を評価したとき、肝臓、脾臓、心臓および肺を含む多くの組織（腎臓を例外とする）において、完全な正常化が観察された。すなわち、５０％を超えるＧＡＧの減少が観察された（図１６Ｃを参照）。種々の実験群における肝臓の超微細構造分析によると、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕで処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの肝細胞からは、ＭＰＳＩＩＩＢの疾患に特徴的な蓄積小胞が、完全な消失した（図１６Ｄを参照）。ＣＮＳで観察されたように、リソソーム区画からの蓄積物質の除去により、他のリソソーム酵素の活性が回復した。未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウスまたはＮｕｌｌ処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの肝臓においては、α−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、ＳＧＳＨ、ＧＵＳＢおよびＨＥＸＢの活性が変化した（図１６Ｅを参照）。ＡＡＶ９に媒介されたＮＡＧＬＵ遺伝子の移入後３か月で、全ての上記酵素の活性は、正常なレベルに戻った。このことは、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕを媒介としたＮＡＧＬＵのＣＳＦ遺伝子移入により、末梢の臓器においてもまた、疾患の表現型を逆転させることができるという考えを、さらに支持している（図１６Ｅを参照）。

行動におけるＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕのＣＳＦ内投与の影響を、オープンフィールド試験によって評価した。上記試験は、未知の環境におけるマウスの一般的な運動および探索行動を評価する。未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウスおよびＡＡＶ９−ｎｕｌｌ処置したマウスは、中央区画へ進入するまでの待ち時間、縁辺区画で過ごす時間、中央区画への進入回数、休息時間、総移動距離および越えたラインの総数の観点において、健康なマウスと比較して探索行動が減少した。ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕの槽内投与は、行動の不足を完全に治療した（図１７Ａ〜Ｆを参照）。

さらに、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕでの処置により、ＭＰＳＩＩＩＢマウスの生存期間が有意に延長された。未処置のＭＰＳＩＩＩＢマウスは、全て１５月齢までに死亡した一方、槽内にＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕを与えられた動物の１００％は、１８月齢においても依然として生存している（図１７Ｇを参照）。ＡＡＶ９−ｎｕｌｌのＭＰＳＩＩＩＢのオスにおいては、生存期間の中央値が１３．８か月間であるのに対して、処置したＭＰＳＩＩＩＢのオスは、生存期間の中央値が２１か月間であった（Ｐ＝０．０００７）。健康なオスの生存期間の中央値は、２６．６か月間であった。処置したＭＰＳＩＩＩＢマウスの、行動反応の正常化およびより長い生存期間は、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｍＮａｇｌｕの治療的効果をさらに実証している。

〔実施例２１：イヌに対するＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｃＮａｇｌｕの槽内送達〕
遺伝子治療のアプローチの、臨床的応用へ向けた第一段階には、大型の動物モデルにおける上記遺伝子治療の実現可能性の実証が求められる。これまでに我々は、ビーグル犬（ヒトの脳の大きさに近い脳の大きさを有する動物モデル）に対する脳骨髄液内の投与ついて、ＡＡＶベクターの分布は、同じ経路で同等の投与量のベクターを与えられているマウスにおいて観察されたものと、非常に類似していることを実証した（Haurigot et al., supraを参照）。簡潔に説明すると、２×１０^１３ｖｇのＡＡＶ９ベクター（レポータータンパク質ＧＦＰをコードしている）の投与により、脳、小脳、髄膜、脊髄および後根神経節における細胞の、広範囲の形質導入が実証された。マウスにおいてなされた観察と同様に、ＧＦＰはまた、ビーグル犬の肝臓においても検出された。このとき、平均して３．７％の肝細胞が形質導入された（Haurigot et al., supraを参照）。重要なことに、リソソーム酵素のスルファミダーゼ（当該酵素の欠損は、ＭＰＳＩＩＩＡを引き起こす）をコードしているＡＡＶ９ベクターのＣＳＦ内投与により、処置したイヌのＣＳＦ中の酵素のレベルは、維持された。ＣＳＦはＣＮＳを満たしているので、酵素は、種々のＣＮＳの構造に有効である。実際に、ＣＳＦに対する組換え酵素の定期的な送達は、ＭＰＳＩＩＩＡの臨床研究における、最近の治療戦略である（NCT01155778およびNCT01299727, clinicaltrials.govを参照）。

本発明に係るＡＡＶ９ベクターの潜在的な効果を説明するために、同様のアプローチが用いられてきた。

総投与量６．５×１０^１２ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｃＮａｇｌｕベクターを、４頭のビーグル犬成犬（イヌ１〜４）の大槽に対して投与した。処置により達成されうるα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性のＣＦＳレベルについて、既に存在している免疫性の影響を評価するために、ＣＦＳ送達の６週間前に、１×１０^１１ｖｇ／ｋｇのノンコーディングＡＡＶ９−ｎｕｌｌベクターの体部への投与によって、これらのイヌのうち２頭（イヌ３および４）を免疫化した。ベクターの槽内送達が実行されるまでは、免疫化されていないイヌは、循環およびＣＳＦにおいて、抗ＡＡＶ９中性化抗体（ＮＡｂ）力価が低かった。これは、野生種ウイルスまたは組換えウイルスに曝露されたことのない動物ついて予想されたことである。対照的に、事前に免疫化されたイヌは、血液循環においてＮＡｂ力価が高かったが、ＣＳＦにおいて低いレベルであった。この観察結果は、血液脳関門を挟んだＮＡｂの非対称な分布と矛盾しない（図１８ＡおよびHaurigot et al., supraを参照）。大槽に対するＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｃｏｃＮａｇｌｕベクターの投与により、全４頭のイヌのＣＳＦサンプルにおいて測定された酵素の活性は、有意に増加した。事前に存在している免疫性の存在の有無に関しては、有意差がなかった（図１８Ｂを参照）。酵素活性のレベルは、第２週目と第３週目の間にピークを迎え、その後、安定した状態のレベルに達した。重要なことに、このような、ＣＳＦにおけるα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の上昇は、長期に渡った（４か月超）（図１８Ｂを参照）。

プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ（配列番号６）は、２０１２年１１月１３日、アクセス番号(access number)ＤＳＭ２６６２６として、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstrasse 7 B, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany）に寄託された。

Claims

α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列に結合されているＣＡＧプロモーター（配列番号４）を含んでいる、組換えＡＡＶ９ベクター。
上記α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号２に対して８０％以上の配列同一性を有している、請求項１に記載の組換えＡＡＶ９ベクター。
上記α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号３に対して８５％以上の配列同一性を有している、請求項１に記載のＡＡＶ９ベクター。
上記α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号２の配列である、請求項１または２に記載の組換えＡＡＶ９ベクター。
上記α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号３の配列である、請求項１または３に記載の組換えＡＡＶ９ベクター。
上記α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号１９の配列である、請求項１または２に記載のＡＡＶ９ベクター。
上記α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号２２の配列である、請求項１または２に記載のＡＡＶ９ベクター。
α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列であって、配列番号２に対して８０％以上の配列同一性を有している配列を含んでいる、プラスミド。
上記プラスミドは、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列（配列番号３）を含んでいる、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ（アクセッション番号：ＤＳＭ２６６２６）である、請求項８に記載のプラスミド。
上記プラスミドは、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列（配列番号２）を含んでいる、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＮａｇｌｕ（アクセッション番号：ＤＳＭ２８５６８）である、請求項８に記載のプラスミド。
上記プラスミドは、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列（配列番号１９）を含んでいる、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ２（アクセッション番号：ＤＳＭ３２０４２）である、請求項８に記載のプラスミド。
上記プラスミドは、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列（配列番号２２）を含んでいる、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｃｏｈＮａｇｌｕ−ｖｅｒｓｉｏｎ３（アクセッション番号：ＤＳＭ３２０４３）である、請求項８に記載のプラスミド。
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶ９ベクター、または請求項８〜１２のいずれか１項に記載のプラスミドを、治療上効果的な量含んでいる、薬学的組成物。
静脈内投与用または槽内投与用の、請求項１３に記載の薬学的組成物。
薬剤として使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶ９ベクターまたは請求項８〜１２のいずれか１項に記載のプラスミド。
身体中のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を上昇させるための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶ９ベクターまたは請求項８〜１２のいずれか１項に記載のプラスミド。
ムコ多糖症、好ましくはムコ多糖症ＩＩＩＢ型の処置のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶ９ベクターまたは請求項８〜１２のいずれか１項に記載のプラスミド。
ｉ）第１のＡＡＶ末端反復と第２のＡＡＶ末端反復との間に挿入されている所定のタンパク質をコードしている配列、および当該所定のタンパク質をコードしている配列に対して作動可能に連結されているＣＡＧプロモーターを含んでいる、第１のベクター；血清型９のＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含んでいる、第２のベクター；ならびに、アデノウイルスヘルパー機能遺伝子を含んでいる、第３のベクターを用意する工程、
ｉｉ）工程ｉ）のベクターを、コンピテントセルに共にトランスフェクションする工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）のトランスフェクションされた細胞を培養する工程、および
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の培地から、発現しているベクターを精製する工程
を含む、請求項１に規定されているベクターの、製造方法。
α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１）をコードしているヌクレオチド配列であって、配列番号２に対して８０％以上の配列同一性を有している配列を含んでいる、単離細胞。