JP2017523976A - 化粧品におけるサーファクチンの応用 - Google Patents

Abstract

七つのアミノ酸で環状の構造を形成する天然環型のリポペプチドであり、且つ、皮膚の老化防止をし、防しわであり、化粧品の皮膚透過力を増加し（透過助剤）、発泡剤及び乳化剤等の機能を有する微生物バチルス・サブチリスに由来する生物表面活性剤biosurfactantのサーファクチン（surfactin）である。

Description

本発明は、サーファクチンの応用方法に関し、特に化粧品におけるサーファクチンの応用方法に関する。

1．ヒト皮膚の構造及びその老化因子
皮膚は、人体表面の主な器官であり、厚さは、部位、年齢及び性別によっては異なり、且つ皮膚の主な機能は、人体の第一の障壁であり、人体内部の組織が外在環境因子による損害、例えば、紫外線の照射、温度の変化、湿度の変化、懸濁粒子による損害及びウイルス又は細菌の人体への直截な進入を避けることができるので、皮膚は、外界因子の刺激を容易に受けて老化メカニズムを起動させ損傷された細胞を代謝する。

（1）細胞の老化及び遺伝子の欠け
老化作用は、細胞から徐々に組織と器官に影響を及ぼし、各部分の組織器官の構造と機能を徐々に衰退させる。Leonard Hayflickの1963年の研究において、冷凍貯蓄された人体分離細胞を培養してサブテストを行い、細胞が一定の回数分裂した後に歪みが発生したことを発現し、結果から、人体細胞がその分裂上限回数があり、細胞は約50回分裂した後にその分裂レート及び外観は、いずれも変化して、ランダムな分裂手段を生じて、粒状タイプ、ねじれタイプ等の不正常な細胞外観をもたらしてアポトーシスを起こすことが発現される。この研究によると、生物体の生長周期が受精卵時に決めされ、事前に既に生物体の生命時計を設定して、ヒトとして、細胞が50回分裂することは、約120年間に達することができることが認められる。人体には細胞を複製時に欠かれるセグメントを複製し直すことができるテロメラーゼが無く、複数回の細胞複製、分裂途中で遺伝子が損なわれてしまうので、細胞の周期を制限し、当該制限がGlass Ceilingとも称され、この老化は、不可逆で且つ回避できないことである。

（2）紫外線
皮膚とその他の器官は、時間につれて老化するが、相違点は、皮膚が日常生活において環境因子による刺激を受けることで、人体のその他の組織と器官より皮膚の老化が激しい。多くの環境老化因子では、紫外線（ultraviolet、UV）の照射が最も影響力を有する。紫外線の波長範囲が10〜400nmであり、能量範囲が3eVから124eVであり、波長によって、（1）波長が315〜400nmにあり、地球の大気層を直接透過して地表に照射でき、皮膚の真皮層を透過して、皮膚のダークスポット、老化及びしわをもたらしてしまい、透過力が三種類の波長で最も強い長波紫外線（UV−A）と、（2）波長が280〜315nmにあり、皮膚の腫れ、熱さ、痛さ乃至脱皮又は類似な焼けつきの症状をもたらしてしまい、地球に照射する時に成層圏におけるオゾン層によって吸収され、極少の一部しかオゾン層を介して地表に到達しない中波紫外線（UV−B）と、（3）波長が100〜280nmにあり、能量が最も強くてかなり危険な傷害力を有するが、波長が短くて大気層で吸収されるので、総太陽光の0．1％より少ないのものしか地表に到達しなく、且つ一般的な遮蔽と日焼け止め及びガラス障壁によって効果的に阻止できる短波紫外光（UV−C）という三種類の紫外線階層に分けられる。研究では、UV−Aがのヒト皮膚の繊維芽細胞に対してマトリックスメタロプロテアーゼの産生を誘発し、マトリックスメタロプロテアーゼ家族は皮膚コラーゲン、エラスチン及び細胞間のマトリックス等の物質を分解し、皮膚を老化させ、UV−Aは、細胞内のフリーラジカルの濃度の向上を余儀なくさせ、高すぎる濃度は、細胞を早めに老化乃至アポトーシスさせることがあることが発現される。

（3）フリーラジカル
フリーラジカル（Free radical）理論は、現在科学界において最も承認される老化理論であり、1954年にアメリカリンカーン大学の医学院のDenham Harmam M．D．によって提出されたが重視されなく、20年間後、フリーラジカル理論は徐々に受けられ、現在既に老化理論の主流の一つになっており、1995年にDenham Harmamがノーベル医学賞に指名される。正常な原子は一対になる電子を有するが、フリーラジカルは、一対にならない電子を含む酸素原子物質である。電子が一対にならない状態において極不安定であるので、フリーラジカルは正常な原子の電子を移し、細胞で構成されたマトリックスを変化させ、細胞の死亡になってしまう。

フリーラジカルの重要な由来は、自体の新陳代謝又は合成栄養素の外、老化を引き起こす由来は、環境汚染、紫外線、放射線、喫煙、殺虫剤及び多くの化学薬品であり、特に環境汚染（自動車の排気、工場から排出されるSO₂）は、体内の大量の有害なフリーラジカルを増加する。

フリーラジカル攻撃は、細胞膜損害及びDNA損害に分けることができる。ヒト細胞にとっては、酸素含有フリーラジカルは、スーパーオキシドアニオンO₂−、過酸化水素H₂O₂、水酸基フリーラジカルOH−等を含み、活性酸素分子と呼ばれる。過剰のフリーラジカルは、細胞膜における不飽和脂肪酸を攻撃しやすい。フリーラジカルが細胞膜における不飽和脂肪を攻撃する場合、過酸化脂質（lipid peroxidase）を形成し、血管内壁の低密度リポタンパク質を酸化してプロスタサイクリンシンテターゼ（prostacycline Synthetase）を抑制し、動脈硬化、糖尿病、関節炎、白内障、老化、冠状動脈疾患等を招く。フリーラジカルが細胞核に入り込んでDNAを攻撃すると、遺伝情報を変化させて更に癌を引き起こす。また、フリーラジカルは、老化遺伝子を誘導して老化作用の発生を促進することができ、研究によると、癌、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋ジストロフィー、皮膚ダークスポットの沈積、しわの生成、黄斑、退行心臓病、卒中、潰瘍、リウマチ性関節炎及び多発性硬化等を含む約80％〜90％の老化性、退化性疾患がフリーラジカルに相関することが指摘される。

細胞のフリーラジカルに対する防御メカニズムは、細胞で合成される各種の酸化防止酵素、グルタチオンペルオキシダーゼ（glutathione Peroxidase、GPx）、スーパーオキシドディスムターゼ（superoxide Dismutase、SOD）等の酵素と、グルタチオン（Glutathione、GSH）は、スーパーオキシドアニオン

等の体内に自ら発生する物質を取り除くことができることである。研究報告によると、長生きの動物体内のSODの含有量が高いが、ヒトは現在知られる体内のSOD含有量が最も高い動物であることが指摘される。年寄老化、体質の変化、環境因素等はいずれも、体内の酸化防止酵素を不足にさせて更に老化を招く恐れがある。

（4）発炎反応
発炎反応は、組織が損なわれるか感染される場合に発生する反応である。先ず、肥満細胞（Mast cell）は組織に到達して、内皮細胞に付着して、
（1）アミノ酸の衍生物であり、毛細管（capillary）の透過性を増加させ、局所的血管を拡張させ、血漿（plasma）及び食細胞等の物質を通過させ、痒み及び過敏反応を引き起こすヒスタミン（Histamine）と、
（2）サイトカイン（cytokine）でターゲット細胞を殺し免疫システムを活性化し、リンパ細胞の増殖を加速化させ且つ病原体の増殖を阻止し、食細胞を吸引してくることができる腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor、TNF）と、
（3）毛細管を拡張させ、神経終末を膨張圧迫するとともに痛みを起し、発炎反応が過ぎた後に、死細胞及び体液で構成され通常マクロファージによって消化される（pus）を生じることがあるプロスタグランジン（Prostaglandin）とを放出する。

特定の細胞因子は、COX−1とCOX−2を含む自体のシクロオキシゲナーゼ（cyclooxygenase、COX）を活性化する。COXは、アラキドン酸をPGE 2とPGF 2α等のプロスタグランジンに大量転換する。最近、研究によれば、COX−2については多数の正常な組織に存在が発現されないが、各種の癌病者において検出できることが発現され、腫瘍患者におけるCOX−2の重要性を示した。又、COX−2は、誘導酵素であり、マクロファージ又はその他の細胞を活性化し、炎症組織を充満することを機能とする。

発炎箇所が熱感を発生する主因は、血管拡張剤又はヒスタミンが放出され、血管を拡張させまた血液の流量が増えるからである。ある細胞は、IL−17（Interleukin−1 alpha）の炎性細胞因子、又は旧名インターロイキン（Inflammatory cytokines）等の物質を放出する。特定の白血球ロイコトリエンを活性化してアレルギー誘発物質を阻止するためのものである。前記細胞因子は、細胞の走化性メカニズム及びインターフェロンを起動し宿主細胞が蛋白質の合成を行うことを中止するケモカインを更に含む。生長因子と細胞毒性分子が放出されて組織を治す可能性もある。上記物質が分泌時に周囲の細胞にも影響を及ぼし、細胞間のマトリックスが流失して更に老化する。

上記の四つの老化成因から、皮膚が老化する途中、表皮層の角質細胞及び真皮層の繊維芽細胞の増生が遅くなることによって、皮膚内の真皮層細胞の外のマトリックスの大分子成分及び構造性タンパクが変化し、皮膚の皺を寄せることと、皮膚が薄くなることと、膚色が暗くなることと、皮膚の弾性が低下することと、保湿度がが低下する等の老化現象を招く。紫外線は、皮膚間葉プロテアーゼの生成を誘発し、皮膚コラーゲン及び弾性フィブリン組織を分解し、且つ紫外線は、細胞内のフリーラジカルの濃度の高めをもたらすこともあり、更に皮膚が発炎反応を発生して早めに老化することになってしまう。又、紫外線照射された後に、皮膚は、生活性酸化物質を発生し細胞膜、構造蛋白、核酸等の細胞構造を破壊し、最終に、皮膚細胞の癌化、死亡を招き、皮膚マトリックスを流失させ外表のしわの累積をもたらす。

2．ヒト老化防止蛋白
研究によると、細胞がワインにおける化学的物質であるレスベラトロール（resveratrol）又は熱量制限の刺激を受ける場合、サーチュイン familyを起動してその細胞周期を延長させることが指摘される。Sinclair及びそのMIT Leonard Guarente実験室から、酵母菌の中の特殊なサーチュイン蛋白は、二種類の特定の手段で老化過程に影響を及ぼし、サーチュインは、細胞における遺伝子の活性を調節制御しDNAにおける断裂を補うことに協力できることが発現される。

Philipp Oberdoerffer、Sinclair実験室は、マイクロアレイプラットホームを利用してマウス細胞で酵母菌サーチュイン遺伝子を検知して哺乳類動物のサーチュイン遺伝子配列を捜す。マウス研究結果によれば、脊椎動物には酵母菌におけるサーチュイン遺伝子に類似なものもあることも実証される。Oberdoerfferから、哺乳類動物システムにおけるサーチュインの一つの主な機能は遺伝子発現モードをモータリングすることである。全ての遺伝子は全ての細胞に出るが、特定の時間に、僅かの遺伝子は活性化を必要とし、間違いの遺伝子が活性化されば、細胞の損傷をもたらしてしまってアポトーシスに入るようにする。

サーチュインは、発現が抑制される遺伝子を脱アセチル化し、環境因子による破壊を受けさせることがなく、抑制される遺伝子にオフ状態を維持させ、安定な細胞遺伝子を保持する。サーチュインは、協力してクロマチン（chromatin）を保存して、遺伝子とヒストン（histone）を共通収縮及び被覆して、アイドル状態を保持することができる。DNAが紫外光又はフリーラジカルで損なわれる場合に、サーチュインは、損なわれたところでDNAと協力してメカニズムを修補する。サーチュインの保護機能は、遺伝子が永久性傷害をもたらす前に、保護する効果を図るために、遺伝子と蛋白を被覆住することができる。サーチュインによって保護されないと、ヒストンは、ふわふわとして、保存抑制される遺伝子は、起動され直し、遺伝子が外界によって容易に干渉され損傷される。

マウスが老化する場合に、DNAの損傷レートが増え、このような損傷は遺伝子の発現が管理制御を失うようにして、クロマチンはそのコントロールされずに解放される場合に、サーチュインは、協力して全遺伝子組の制御外れを制御管理する。この制御外れに活性化された多くの遺伝子は、老化表現型と直接に関連する遺伝子である。

研究によると、サーチュインによって制御外れを制御管理されるマウス遺伝子は、老化のマウスに出現しつつあることが発現される。Oberdoerfferは、遺伝子が改造された一双のリンパ腫マウス動物モデルを利用して、マウスに追加のサーチュイン遺伝子コピーを与えたり、マウスにサーチュイン活性化剤（activator）−−スベラトロールを飲食する場合に、マウスの平均寿命が24％〜46％延長されることが発現される。

Leonard Guarenteの研究によれば、新たな薬物の使用によって、時間につれてサーチュインの新たな分配を安定にし、細胞を老化を避けるように保護する新たな手段があることが指摘される。このような特定のメカニズムに基づいて、DNAの損傷は老化を悪化させるが、DNAが損傷されるのそのものからではなく、遺伝子が調節制御に乏しいからのである。Oberdoerffer研究によると、この遺伝子の活性の調節制御過程がエピジェネティクス（Epigenetics、エピジェネティクス）と呼ばれ、DNAにおける実質的な突然変異と異なることが指摘される。この原理の検証によって、サーチュインを刺激することで老化を逆転することが発現される。

3．皮膚透過増強剤（Transdermal Penetration Enhancers、TPE）
新薬の研究は、金と時間がかなりかかるので、投与システムの開発は、益々重視されている。最も見られる投与手段は、経口投与と、皮下組織注射投与と、経皮投与とを含む。経口投与は、最も常用される投与手段であり、薬物が経口投与後、胃腸粘膜によって吸収され血液に入り、局所的又は全身の治療作用を達成する。経口投与の欠点は、薬物が体内で遅くてランダムに吸収されることにより、薬物が治療作用を達成できない。尚、薬物が血液に到達する前にまず肝臓を経ることは、薬物の効果が破壊され、肝臓に負担をもたらす。ある薬物は、腸内では吸収されなかったり刺激性をゆうしたりするので経口できない。経口投与の最大な欠点は、薬物が体内に副作用をもたらして、患者が吐き気、嘔吐等の身体上の不適応がする。もう一つの投与手段は、薬物を皮下に直接注入し、皮下毛細管によって吸収され全身に輸送される皮下組織注射法であり、そのメリットは、薬物が胃液と肝臓からの影響を受けずに、血管に直接に入って身体の各部位を経て、治療目的を達成することができる。皮下組織注射法は、経口法より、投与の速度を大幅に向上させるが、注射投与を長期に頼る病者にとって、注射による痛み負担を長期に受ける。又、別の投与手段は、経皮投与システム（Transdermal Drug Delivery system、TDDS）であり、当該システムでは、薬物が皮膚によって吸収され、投与後、薬物は、予定の時間に、皮膚角質層を透過して毛細管によって浸透吸収された後に、血液に入って循環して働いて、更に全身治療の目的を達成する（Saunders et al．、1999）。

経皮投与治療システムが有するメリットは、生産しやすく、コストが安価であり、恒定のレートで体内に進入でき、血液に安定な濃度を長時間維持でき、投与の頻度を減少し、低毒副作用であり、肝臓の首渡效應、薬物の代謝を低減し、投与の個体差異を減少し、生体の利用率及び小さい剤量で治療の効果を達成できる等のメリットを含む。又、経皮投与は、幼い患者、老人又は投与しにくい患者に適合である。投与しやすく、問題がある時に直ちに除去して、投与を停止することができる。経皮投与が上記のメリットを有するので、このシステムが注目される。現在、経皮投与の開発研究は、既に局所のから全身の、ターゲット器官及び制御放出メカニズムへ発展しており、臨床に適用される（Shin et al．、2005）。

経皮投与システムの最大な障碍は、皮膚の角質層であり、角質層（stratum corneum 、SC）は、皮膚の最上層であり、扁平長型の角質細胞からなり、角質細胞の四周は、層状の脂肪に囲まれ（Norlen、2001）、角質層の最も主要な機能は、外界物質が体内に進入することを阻止し、体内の水分の散失を防止し、皮膚最外層の障壁である（Bouwstra et al．、2003）。1973年に学者Breathnachらは、電子顕微鏡で角質層細胞の隙間に脂肪が充満されることを発現し、角質層の脂肪が皮膚障壁機能において重要な役割を果たすことを認め始める（Breathnach et al．、1973）。研究では、角質層の温度が上がる場合に、角質層の細胞間の脂肪の流動性が増加するにつれて、皮膚の経皮吸収浸透性もことも指摘される（Golden et al．、1987）。角質層における脂質を除去すれば、親水性及び両性薬品の皮膚に対する浸透性を著しく増加することができるが、脂肪親和性0の薬物に対して著しい影響を有しない（Tsai et al．、2001）。

経皮吸収の障碍問題を克服するには、皮膚に瞬間的な穴をもうたらせ、薬物の吸収を促進するように外来の能量を与え、よく見られる処理手段は、超音波（ultrasound）、イオン導入（iontophoresis）、マイクロニードルアレイ（microneedle array）及び熱能量（thermal energy）がある物理方法と、薬物の吸収を増加するように合成生物によって前駆体を転化してまた新陳代謝の禁止剤とともに投与する生物化学方法と、曲がっている双層の脂質からなり、親水端が外へ向き疎水端が内にある双面親水サンドイッチを形成して、同時に脂質双層に嵌めることができる油性物質とリポソームの水相中に被覆できる水性物質のキャリアとすることができるリポソーム（liposome）を用いて薬物を被覆したり皮膚透過増強剤（penetration enhancer）を添加したりする化学方法とを使用することができる。リポソームと細胞作用のメカニズムは、リポソーム膜の組成が細胞膜の組成のうちの一部と相互に交換する膜組成交換（intermembrane transfer）と、リポソームが細胞膜に付着する吸着（adsorption）と、リポソームが細胞膜と融合し、包容物を細胞内膜に送り込む融合（fusion）と、リポソームが細胞によって細胞内取り込まれる細胞内取り込み（phagocytosis、endocytosis）とがある。皮膚透過増強剤（penetration enhancer）とは、薬物が皮膚を透過する速度及び含有量を加速化することができるが、皮膚に厳重な刺激及び傷害をもたらさない物質を指す（Williams and Barry、1991）。皮膚透過増強剤は主に、規則的構造を乱して且つ流動性を向上させるように、角質層の脂質層（intercelluar）に作用するとともに、ケラチン（keratin）に作用し、角細胞構造を緩ませ、角質層における薬物の溶解度を増加し、薬物吸収の目的を達成する（Walker and Smith、1996）。皮膚透過増強剤を添加することは、開発ポテンシャルをかなり有する浸透補助方法である（Saunders et al．、1999）。

界面活性剤は、良好な皮膚透過増強剤であり、生物膜及び皮膚に対して浸透に協力する効果を有し（Lopez et al．、2000）、近年、既に広く薬物透過に適用される（Nokhodchi et al．、2003； Shokri et al．、2001）。2001年にNokhodchiらの研究では、界面活性剤であるアルキル硫酸塩（sodium lauryl sulfate、SLS）、セチルトリメチルアンモニウム臭化物（cetyltrimethylammonium bromide、CTAB）及び塩化ベンザルコニウム（Benzalkonium Chloride）がマウスの皮膚の抗うつ薬Diazepamに対する吸収を促進できることが指摘された（Shokri et al．、2001）。Nokhodchiらのもう一つの抗うつ薬に関する研究では、界面活性剤であるアルキル硫酸塩（sodium lauryl sulfate、SLS）、セチルトリメチルアンモニウム臭化物（cetyltrimethylammonium bromide、CTAB）及び塩化ベンザルコニウム（BenzalkoniumChloride）は、マウスの皮膚の抗うつ薬lorazepamに対する吸収を促進できることが指摘される（Nokhodchi et al．、2003）。サーファクチンは、人工合成の細胞膜、原生生物の細胞膜及び真核生物の細胞膜に対してかなりよい親和力を有する（Maget−Dana and Ptak、1995； Sheppard et al．、1991； Tsukagoshi et al．、1970b）。且つ、サーファクチンは、細胞膜との結合に対して高度選択性を有することは、サーファクチンがコレステロール（cholesterol）及びリン脂質（phospholipid）に対する親和力が高く、細胞膜の構造が、この二つの物質を主とするからである（Hosono and Suzuki、1985）。化学合成の界面活性剤と比較すると、サーファクチンがやさしくて、皮膚に傷害をもたらさない。

一般的に従来の方法は、薬物又は栄養活性物質は、表皮の阻隔層（即ち、角質層）だけまでに浸透し、効果が著しくない（0．3パーセントの効果しかに達成しない）。この問題を解決するために、多くの経皮吸収技術が研究開発されてきて、目的は、養分が皮膚表皮層及び真皮層細胞を透過するように、養分の浸透力を効果的に向上させるので、養分輸送方法は、皮膚保護科技の一つの研究重点になる。

ヒト皮膚の角質層が薄いが、その厚さは、10−25ミクロンであり、最も薄い角質層が上眼瞼にあり、ただ6ミクロンあるが、かなり「強靭」であり、皮膚の最も重要な保護層である。一般的な化粧品の原料は、経皮浸透は主に、汗管経由（sweat duct）と、角質層に対する直接透過（stratum corneum）と、毛嚢経由（hair follicle）と三つのルートである。

化粧品の原料は、黄金を例として、現代黄金美容研究によると、黄金は、解毒し、鎮静し、きれいにして及びしわを消すという機能を有し、使用後、肌に細胞因素を組み換えさせ、生理機能、新陳代謝を促進し、油脂の分泌を平衡して且つ天然水分を保持して、外界に由来する過敏を抵抗できる。化粧品の原料に常用される金ナノ粒子は、大きさがヒト毛穴の200分の一に相当するので、金ナノ粒子含有皮膚保護品を用いて肌に塗布する場合は、金ナノ粒子が真皮層細胞に効果的で瞬間に入り込むことができることが期待される。

金ナノ粒子が真皮層に進入した後、金ナノ粒子は、遺伝子のレベル上、真皮細胞をSOD、メタロチオネイン、EGF等を含むシリーズの活性物質を発生するように促進することを含む真皮細胞の機能を調節できる。SODは、ヒドロキシフリーラジカルを取り除くことができ、メタロチオネインは、又、皮層細胞の紫外線による損傷を抵抗することもできるため、金ナノ粒子は、真皮細胞に対して老化を防止する効果を有する。金ナノ粒子が繊維細胞を刺激し、更に新たな細胞外マトリックス（ECM）を分泌合成し、繊維芽細胞をコラーゲン分泌するように刺激することができることと、纖維細胞を上皮成長因子（EGF）を呈示及び分泌するように刺激することで、ターゲット細胞特異の角化細胞生長因子（KGF）を分化すると同時に、皮膚の緊致度を強化し、皮膚を滑らかにさせて弾力を充満させ、ぴかぴかと輝くこととが示されるその他の研究もある。

4．生物乳化剤（Bioemulsifier）
サーファクチンは、抗細菌ペプチドとすることができるほかに、サーファクチンは、更に生物乳化剤（bioemulsifier）である別の重要な役割を果たす。1999年にDeleuらは、クリーム分離及び凝集作用を抑制するテストにおいて、ituirn Aの効果がサーファクチンより良く、アルカン類の乳化効果のテストにおいて、アルカン類の乳化効果について、サーファクチンがituirn A及びFengycinより遥かに大きく、乳化効果が最も悪いのは化学合成されるアニオン界面活性剤であるラウリル硫酸ナトリウム（Sodium dodecyl sulfate、SDS）であることを発現した。その他の研究では、20mg／lのサーファクチンを添加することは、ディーゼル油の生物分解性を増加することができることが示され、且つ、更にpHは、サーファクチンのディーゼル油に対する乳化効果に影響を与え、pHを7．4に調整する場合、サーファクチンのディーゼル油に対する生物分解性が最も好ましいことが指摘される。

5．発泡剤
一般的な界面活性剤が有する乳化能力の他に、サーファクチンは、発泡力も有する（Razafindralambo et al．、1998）。発泡現象とは、サーファクチンは、氣相及び液相の界面で激しく揺れて界面活性剤に空気を捕まえ、内に空気が含まれる薄膜を形成することを指す（Halling、1981）。Razafindralamboらは、ituirn Aと比較すると、サーファクチンは、優れた発泡効果を有し、両者の間の構造に関係することを推測し、サーファクチンがアニオン界面活性剤に属し、その脂肪酸の炭素鎖が短いが、ituirn Aがノニオン界面活性剤であり、脂肪酸の炭素鎖が長いことも指摘される（Razafindralambo、et al．、1998）。

本発明は、サーファクチン（surfactin）による老化防止（又は防しわ）化粧品組成物の調製方法を提供することを目的とする。当該組成物は、シクロリポペプチド分子であり七つのアミノ酸（L−Aspartic acid、L−leucine、glutamic acid、L−leucine、L−valineと二つのD−leucines）からなる環状ヘプタペプチド（heptapeptide）構造であるサーファクチン及び薬学的に許容される担持体、賦形剤、希釈剤、補助剤等を含む。この環化ヘプタペプチドは、一つのβ−ヒドロキシ脂肪酸に連結され、イソテトラデカン（isoC14）ヒドロキシを主とする（17％〜35％）；当該サーファクチンの脂肪酸末端における脂肪酸の分布は、（1）イソC13が3％より大きく、（2）n−C13が0．65％より大きく、（3）イソC14が17％より大きく、（4）n−C14が41％より少なく、（5）イソC15が11％より少ない。当該脂肪酸末端の脂肪酸の分布は、（1）イソC13が10％より大きく、（2）n−C13が25％より大きく、（3）イソC14が35％より大きく、（4）n−C14が25％より小さく、（5）イソC15が3％より少ないことが好ましく、当該脂肪酸末端の脂肪酸の分布以下列分布は、（1）イソC13が11％であり、（2）n−C13が26％であり、（3）イソC14が37％であり、（4）n−C14が24％であり、（5）イソC15が2％であることが最も好ましく、当該サーファクチンの分子量が1022又は1036Daであり、当該サーファクチンは、その化学異性体を含む。（中華民国特許出願号097137532を参照する。）。

当該老化防止（又は防しわ）化粧品組成物は、更にアルコール類、エステル類、複合多糖体、ナットオイル及びビタミンを含んでもよい。当該アルコール類は、C16−18アルコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、オクタンジオール、グリセリン、へクサデカノール、オクタデシルアルコール、ドコサノール及びプロピレングリコールのうちの少なくとも一つを含む。当該エステル類は、セチルアルコールオリーブ油エステル（OLIVEM 1000）、モノステアリン酸グリセリル（GSM（登録商標））、イソプロピルミリステート（IPM）、イソプロピルパルミテート（IPP）及びトリグリセリドのうちの少なくとも一つを含む。当該複合多糖体は、キサンタンガム、シロキクラゲ多糖体、グルカン、センナ葉種多糖体のうちの少なくとも一つを含む。当該ナットオイルは、アルガン油、ククイナッツオイル、アボカドオイル、小麦胚芽油、オリーブ油のうちの少なくとも一つを含む。当該ビタミンは、ビタミンA、ビタミンB、ビタミンC、ビタミンE、ビタミンF、ビタミンKのうちの少なくとも一つを含む。

当該老化防止（又は防しわ）化粧品組成物は、繊維芽細胞の増殖を促進し、紫外光による老化を防止し、酸化を防止し、サーチュイン1遺伝子の発現を促進し、コラーゲンの増生を促進し且つマトリックスメタロプロテアーゼ九タイプ（Matrix metallopeptidase 9）であるマトリックスメタロプロテアーゼ（Matrix metallopeptidase）を抑制するためのものである。

本発明は、更にサーファクチン（surfactin）による皮膚透過力を増加する組成物の方法を提供する。当該組成物は、シクロリポペプチドであり、βヒドロキシ脂肪酸に連結されるヘプタペプチド配列（L）Glu−（L）Leu−（D）Leu−（L）Val−（L）Asp−（D）Leu−（L）Leuを含むサーファクチン及び薬学的に許容される担持体、賦形剤、希釈剤、補助剤等を含む。当該サーファクチンの脂肪酸末端における脂肪酸の分布は、（1）イソC13が3％より大きく、（2）n−C13が0．65％より大きく、（3）イソC14が17％より大きく、（4）n−C14が41％より少なく、（5）イソC15が11％より少なく、当該脂肪酸末端の脂肪酸の分布は、（1）イソC13が10％より大きく、（2）n−C13が25％より大きく、（3）イソC14が35％より大きく、（4）n−C14が25％より小さく、（5）イソC15が3％より少ないことが好ましく、当該脂肪酸末端の脂肪酸の分布は、（1）イソC13が11％であり、（2）n−C13が26％であり、（3）イソC14が37％であり、（4）n−C14が24％であり、（5）イソC15が2％であることが最も好ましく、当該サーファクチンの分子量が1022又は1036Daであり、当該サーファクチンは、その化学異性体を含む。当該皮膚透過力を増加する組成物は、アルコール類、エステル類、複合多糖体、ナットオイル及びビタミンを含んでもよい。当該アルコール類は、C16−18アルコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、オクタンジオール、グリセリン、へクサデカノール、オクタデシルアルコール、ドコサノール及びプロピレングリコールのうちの少なくとも一つを含む。当該エステル類は、セチルアルコールオリーブ油エステル（OLIVEM 1000）、モノステアリン酸グリセリル（GSM（登録商標））、イソプロピルミリステート（IPM）、イソプロピルパルミテート（IPP）及びトリグリセリドのうちの少なくとも一つを含む。当該複合多糖体は、キサンタンガム、シロキクラゲ多糖体、グルカン、センナ葉種多糖体のうちの少なくとも一つを含む。当該ナットオイルは、アルガン油、ククイナッツオイル、アボカドオイル、小麦胚芽油、オリーブ油のうちの少なくとも一つを含む。当該ビタミンは、ビタミンA、ビタミンB、ビタミンC、ビタミンE、ビタミンF、ビタミンKのうちの少なくとも一つを含む。

当該皮膚透過力を増加する組成物は、コルチコステロイド（dexamethasone）、ヒアルロン酸（hyaluronic acid）、ガンマポリグルタミン酸（Gamma−polyglutamic acid）和金ナノ粒子（gold−nanoparticles）である化粧品の原料を皮膚を透過するように促進するためのものである。

本発明は、更にサーファクチン（surfactin）による乳化剤組成物の調製方法を提供する。当該乳化剤組成物は、シクロリポペプチドであり、βヒドロキシ脂肪酸に連結されるヘプタペプチド配列（L）Glu−（L）Leu−（D）Leu−（L）Val−（L）Asp−（D）Leu−（L）Leuを含むサーファクチン及び薬学的に許容される担持体、賦形剤、希釈剤、補助剤等を含む。当該サーファクチンの脂肪酸末端における脂肪酸の分布は、（1）イソC13が3％より大きく、（2）n−C13が0．65％より大きく、（3）イソC14が17％より大きく、（4）n−C14が41％より少なく、（5）イソC15が11％より少なく、当該脂肪酸末端の脂肪酸の分布は、（1）イソC13が10％より大きく、（2）n−C13が25％より大きく、（3）イソC14が35％より大きく、（4）n−C14が25％より小さく、（5）イソC15が3％より少ないことが好ましく、当該脂肪酸末端の脂肪酸の分布は、（1）イソC13が11％であり、（2）n−C13が26％であり、（3）イソC14が37％であり、（4）n−C14が24％であり、（5）イソC15が2％であることが最も好ましく、当該サーファクチンの分子量が1022又は1036Daである。当該サーファクチンは、その化学異性体を含む。当該乳化剤組成物は、更に脂肪酸グリセリド、脂肪酸ソルビタン、脂肪酸ショ糖エステル、脂肪酸プロピレングリコール、レシチンを含んでもよい。

当該乳化剤組成物は、発泡力を増加し、乳化作用を増加し、なめらかさを増加するためのものであり、当該乳化剤組成物は、シャンプー、洗面乳、ハンドクリンザー及びボディーウオッシュ等である清潔用品の発泡力を増加するためのものであり、当該乳化剤組成物は、ボディーローション、美顔用クリーム、エッセンス、バリアクリーム等である化粧品の乳化力を増加するためのものである。当該乳化剤組成物は、シャンプー、洗面乳、ハンドクリンザー及びボディーウオッシュ等である清潔用品のなめらかさを増加するためのものである。

［図１］異なる濃度のサーファクチンのマウスの胚胎繊維芽細胞（BALB／3T3 clone A31 Mus musculus embryo fibroblast）の長寿遺伝子（サーチュイン1遺伝子）mRNA発現に対する影響であり、マウスの胚胎繊維芽細胞を異なる濃度のサーファクチン（0、25、50、75、100μM）に培養し、培養時間が6、12、24、36、48時間である。
［図２］レスベラトロール（Resveratrol）、ペンタペプチド（Palmitoyl pentapeptide−3）及びサーファクチンの細胞の増殖に対する影響であり、マウスの胚胎繊維芽細胞を異なる濃度のサーファクチン（0、25、50、75、100μM）、レスベラトロール（0、5、10、20、30μM）とペンタペプチド（0、3、5、8、10μM）に培養し、培養時間が48時間である。
［図３］サーファクチンの光老化防止作用であり、異なる濃度のサーファクチンの紫外光照射された後のマウスの胚胎繊維芽細胞の生存率に対する影響であり、細胞が5J／cm2、10J／cm2及び15J／cm2の紫外光で照射された後に、25、50、75、100及び125μM濃度のサーファクチンを添加し、24時間培養した後に、MTT法で細胞の生存率をテストする。
［図４］サーファクチンのマウスの胚胎繊維芽細胞の酸化防止圧力に対する保護効果であり、細胞が100、150、200及び250μM濃度の過酸化水素で処理された後に、更に0、25、50、75及び100μM濃度のサーファクチンを添加し、24時間培養し、その後MTT法で細胞の生存率をテストする。
［図５］サーファクチンとペンタペプチドのマウスの胚胎繊維芽細胞の可溶性コラーゲン定量アッセイによって測量されるコラーゲン含有量（collagen dose）に対する影響であり、マウスの胚胎繊維芽細胞是が異なる濃度のサーファクチン（0、25、50、75、100μM）とペンタペプチド（0、3、5、8、10μM）24時間培養し、PBS：リン酸塩緩衝溶液であり、a、b、ab、c、dは、符号が同じであれば、統計上の差異がないことを表す。
［図６］サーファクチン（SF）とペンタペプチド（PPP−3）のマトリックスメタロプロテアーゼ（Matrix metallopeptidase 9）に対する抑制能力であり、マトリックスメタロプロテアーゼの量は、酵素免疫測定法（ELISA）によって測量され、マウスの胚胎繊維芽細胞は、それぞれ異なる濃度のペンタペプチド（0、3、5、8及び10μM）とサーファクチン（0、25、50、75及び100μM）に培養され、a、b、cは、符号が同じであれば、統計上の差異がないことを表す。
［図７］サーファクチンが皮膚をコルチコステロイドを吸収するように促進するテストであり、実験は、PBS（pH＝7．4）100μl混合イソチオシアン酸（fluorescein isothiocyanate、FITC）標記されるコルチコステロイド（dexamethasone）を、1cm²の無菌脱脂綿に添加して通気性テープでマウスの背部に固定するコントロールと、イソチオシアン酸で標記されるコルチコステロイドに0、0．2、0．5、1、2、5％のサーファクチンを添加して処理する実験群に分けられ、実験結果については、共焦点顕微鏡で観察してその蛍光の明度を検知し、図（A）〜（F）は順に、コルチコステロイドに0、0．2、0．5、1、2、5％サーファクチンを添加することであり、SF：サーファクチンである。
［図８］サーファクチンが皮膚を保湿因子ヒアルロン酸（HA）を吸収するように促進するテストである。実験は、PBS（pH＝7．4）100μl 混合イソチオシアン酸（fluorescein isothiocyanate、FITC）で標記されるヒアルロン酸（hyaluronic acid）を、1cm²無菌脱脂綿に添加し、通気性テープでマウスの背部に固定するコントロールと、イソチオシアン酸で標記されるヒアルロン酸に0、0．2、0．5、1、2、5％のサーファクチンを添加して一時間処理する実験群とに分けられ、実験結果については、共焦点顕微鏡でその蛍光の明度を検知する。図（A）〜（F）は順に、ヒアルロン酸に0、0．2、0．5、1、2、5％のサーファクチンを添加することであり、SF：サーファクチンである。
［図９］サーファクチンが皮膚を保湿因子（γ−GPA）を吸収するように促進するテストであり、実験は、PBS（pH＝7．4）100μl 混合イソチオシアン酸（fluorescein isothiocyanate、FITC）で標記されるヒアルロン酸（hyaluronic acid）を、1cm²無菌脱脂綿に添加し、通気性テープでマウスの背部に固定するコントロールと、イソチオシアン酸で標記されるヒアルロン酸に0、0．2、0．5、1、2、5％のサーファクチンを添加して一時間処理する実験群とに分けられ、実験結果については、共焦点顕微鏡でその蛍光の明度を検知する。図（A）〜（G）は順に、γ−GPAに0、1％、2％、5％、10％、15％、20％のサーファクチンを添加することである。
［図１０］サーファクチンは、金ナノ粒子の皮膚経由吸収を促進する効果を有し、金ナノ粒子の量は、蛍光顕微鏡で測量され、緑の蛍光は、金ナノ粒子の存在を表し、サーファクチンが混合された金ナノ粒子実験群では、マウス（BALB／c）の真皮層に多くの金ナノ粒子が発現され、緑の光点は毛嚢自体蛍光（hair follicles autofluorescence）であり、SCsurface：角質層（Stratum corneum）の表面である。
［図１１］サーファクチンの乳化力分析であり、異なる濃度のサーファクチンをpHが6．4、7．4及び8．4の緩衝溶液に溶解し、2ml取り出して3mlディーゼル油を試験管に添加し、2分間振盪（vortex）し、室温下で24時間静置した後に、その乳化指数（emulsification index、E₂₄）を測量する。
［図１２］サーファクチンの発泡力分析であり、異なる濃度の粗純化サーファクチンをpHが7．4の緩衝溶液に溶解し、2分間振盪（vortex）した後に1時間静置した後に、発泡の高さを測量し、最大発泡密度（foam maximum density、MD）を計算する。
［図１３］サーファクチンの濃度と発泡の高度との間の関係を示す。
［図１４］サーファクチンの濃度と濁度（Turbidity％）との間の関係を示す。
［図１５］ポリマーと界面活性剤複合物（polymer−surfactant complex）に希釈した後に、サーファクチンを含有するシャンプーに沈殿の発生がある。

本発明は、下記の実施例で示範して説明するが、本発明は、下記実施例によって制限されるものではない。以下、各実施例は、シクロリポペプチドであり、且つβヒドロキシ脂肪酸（beta−hydroxy fatty acid）（13〜15個の炭素水素鎖が連結される）に連結されるヘプタペプチド配列（L）Glu−（L）Leu−（D）Leu−（L）Val−（L）Asp−（D）Leu−（L）Leuを含み、当該脂肪酸のイソC14が約37％であるという特徴を有するサーファクチンで実施する。

実施例一 サーファクチンのヒト皮膚及びマウスの胚胎繊維芽細胞に対する老化防止試験
実験材料と方法
1．実験細胞株
ヒト皮膚繊維芽細胞（CCD−966SK）は、BCRC生物資源保存及び研究センターから購入され、−番号：60153である。
2．マウスBALB／3T3胚胎（BALB／3T3Clone A31）は、BCRC生物資源保存及び研究センターより購買され、−番号：60009である。
3．実験動物
国家実験動物センターによって購買される単一な性別のBALB／cByJNarl品系のマウスは、体重が約200〜250グラムで、飼育条件が毎日12時間人工照射し、湿度75％と温度25℃であり、エアコン設備を含む海洋大学生命科学動物室に飼育され、専門人によって気を配って十分な飼料及び飲用水を提供する。
4．老化防止遺伝子の発現量のテスト
（1）ヒト及びマウスの遺伝子cDNA配列のクローニング
本実験は、TRIzol reagent（Invitrogen、USA）によってヒト皮膚繊維芽細胞及びマウスの胚胎繊維芽細胞のTotal RNAを抽出し、RNA電気泳動分析された後、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）によってヒト皮膚繊維芽細胞サーチュイン1、サーチュイン3及びマウスの胚胎繊維芽細胞サーチュイン1遺伝子配列のクローニングを行い、遺伝子銀行（GeneBank）によって既知のサーチュイン遺伝子配列を捜し、GCG programによって相似性が高い配列を捜し、一対のプライマー（Primer）を設計し、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase chain reaction、PCR）を行い、更に小さい一部の反応生成物を取って1．2％のコロイドによって電気泳動分析して、予期の遺伝子セグメントの大きさにふさわしい生成物が出る時に、残られる生成物が低融点寒天コロイドによって電気泳動された後に、所望のコロイドの生成物がコロイドによって上から下に切られ、コロイド抽出して純化された特定の大きさのDNAセグメントを取得し、この純化セグメントは、クローニングキャリアpGEM−T−easy vector（pGEM−T−easy cloning kit、Promega、USA）と接合反応を行い、更にコンピテントセルに転換し、最後に、小量培養された後に、クローニングキャリアを抽出し配列を決め、配列のデータをアメリカ生物情報センター（NCBI）ウェブのBLASTプログラムによって対比する。以上の工程によって正確な部分のヒト皮膚繊維芽細胞サーチュイン1、サーチュイン3及びマウスの胚胎繊維芽細胞サーチュイン1cDNA配列のクローニング株をクローニングした後、後続の実験を行うために、クローニング株を再びコンピテントセルに転換して複製し、高純度のプラスチドを抽出して保存する。

（2）細胞Total RNAの抽出
RNAは、自然環境においてRNaseの分解を容易に受けるので、実験前に用いられる器具を高温で滅菌し、オーブンで乾燥しなければならない。操作中手袋及びマスクをつける。実験しようとする細胞実験群を取り、迅速に800μLのTRIzolTM reagentを培養皿に入れ、洗浄された細胞液を滅菌Tubeに置き、用いられるTRIzolTM reagentの総体積の1／5のクロロホルム（Chloroform）を入れ、激しく30秒揺れ、室温下で15分間静置し、4℃で13200 rpmで15分間遠心し、上清液を新たな1．5mL微量遠心管に抽出する。この時、RNAは、上清液の水層に溶解し、上清液を別のきれいな1．5mL微量遠心管に吸入し、用いられるTRIzolTM reagentの体積の1／2のイソプロパノール（Isopropanol）及び高塩溶液（1．2 M Sodium Chloride及び0．8 M Sodium citrate）を入れ、均一に揺れた後に−20℃で30分間静置し、4℃で13200 rpmで15分間遠心しRNAを沈殿し、上清液をゆっくり除去し、先ず800 μLの100％無水アルコールを入れて揺れて洗浄した後、4℃で13200rpmで10分間遠心した後に、アルコールを100％除去する。上清液をゆっくり吸入除去し、55℃でRNA沈殿物を5分間乾燥する。沈殿物を15 μL DEPC水に溶解する。RNAを溶解するために55℃で10分間に置き、最後に−80℃の冷凍冷蔵庫に貯蓄して待機する。

（3）RNAの濃度と純度の測量
分光光度計でOD260を測量し、RNAの濃度の標準が1 OD260＝40 μg of RNA／mLと計算し、その公式40 μg × dilute factor × A260＝μg／mLである。RNAの純度は、OD260／OD280の比値として準拠にして、比値が1．9〜2．0の間にある純度較高のRNA。

（4）逆転写（Reverse Transcription、RT）
5 μg のTotal RNAを200 μL微量遠心管に取り、DEPC水で総体積を13 μLに調整し、1 μLのoligo（dT）18、10 mM dNTPs、置於冰上。再加入5 × AMV buffer 4 μl 及びAMV1μl（40 units／μL）を入れ、均一に混合し、42℃で60分間反応してcDNAを合成し、又70℃で10分間作用して反応を終止する。

（5）ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase chain reaction、PCR）
RTが作ったcDNA鋳型（Template）を、Taq polymeraseでポリメラーゼ連鎖反応（PolymeraseChain Reaction、PCR）し増大分析する。1 μLのcDNAを取り0．5 μLの10 mM dNTPs、2．5 μl の10×PCRのbuffer、専一性のプライマー（Gene specific primer、GSP）を各0．5 μL及び0．25 μLのTaq polymeraseを入れ、二次滅菌水を二次滅菌し体積を25 μLに調整する。反応管をPCR反応器（DNA thermal cycler；Applied Biosystems2720 ThermalCycler）に入れ、94℃で2分間解離し、94℃で30秒解離し、64℃で30 秒貼り付け、72℃で1分間合成し、解離、貼り付け、合成工程が30個の循環繰り返した後に4℃下に保存する。反応後のPCR生成物5〜15 μLを取り、1．5％の寒天コロイドで電気泳動分析し、臭化エチジウム（EtBr）によって10分間染色した後に、水で約10分間退色し、撮影システムDigital Gel Image Systemに置き影像を取り、UN−SCAN−IT gel−Gel Analysis Software Version 6．1で定量分析する。

（6）ポリメラーゼ連鎖反応（Real−time quantitative PCR）の即時な定量
蛍光染色SYBR green IによってDNAの二つの凹溝に嵌めることができ、ハロゲンランプの励起による蛍光の特性により、その蛍光値の量を検知する。SYBR green Iが二つのDNA上に嵌めされない場合に、蛍光背景の値が非常に低く、SYBR green IがPCR拡大の標的遺伝子セグメント上に嵌め始める場合に、蛍光値の信号は、相対的に高められる。非特異性プライマーの結合、又はGenomicDNAの汚染等の干渉の影響がなければ、PCR反応で合成される標的遺伝子の状態は、DNAの合成が二倍増倍の幾何学的増倍期（Geometric phase）と、反応物が不足であり、遺伝子の合成が非二倍増倍の線形増加期（Linear phase）と、最後反応物が使い尽し、失効であり、反応の終点に到達する高原期（Plateau phase）とに分けられる。従って、標的遺伝子の組織器官における発現量を検知するには、PCR反応の幾何学倍増し倍増期で定量して意義を有する。Real−time quantitative PCRの原理は、異なる濃度の鋳型によって同じPCR 反応条件下で、高濃度の鋳型を含有する反応は、速く幾何的増倍期に到達し、比較的に低濃度の鋳型は、遅く到達し、幾何的増倍期の中点に到達する臨界PCRの循環数目をCT（Thresholdcycle）と定義し、つまり、CT値は、鋳型の濃度の低減によって高まる。異なる濃度の標準品でPCR反応のCT値を同期定量し、ソフトウェアで標準曲線と回帰公式を描画し、内挿法で測定待ち試料に含まれる標的遺伝子の絶対発現量を換算する。同時に、MeltingCurveを得れば、標的遺伝子が拡大循環した後にmelting temperature 40℃〜99℃の連続的蛍光検知し、melting curveの結果を分析することは、プライマーが自行的に互いに補充する現象があるか又はプライマーの専一性を了解することができ、実験定量の正確性を了解することにより正確的に役立つ。
96 well PCR plateを4℃予冷の96 well PCR plate專用の製氷皿上に置き、それぞれ10 μL SYBR green、各4μLのReal−time PCR 專一性プライマー（表一）を入れて、最後に2 μL のRT生成物をPCR 反応の鋳型として入れ、96 well PCR plateの專用膜を貼り付けてから4℃遠心機に置き1500 rpmで遠心3分間し、試料をPCR plateの底部に遠心する。PCR plateをPCRを即時に定量するPCR反応器中（Roche lightcycler 480 Real time PCR）に置き、95℃で熱起動（Hot start）反応が5分間反応し、増幅反応（Amplification）が95℃で30秒解離し、60℃で30秒貼り付け、40個循環し、蛍光値を連続的に検知し、増幅される生成物は同じ解離温度であるかを判断するという反応条件を設定する。反応を完成した後に、反応データをRocheソフトウェアで分析する。実験によって得られたデータは、SPSSソフトウェア、単変量分析（One−way analysis of variance）によって、Duncan’s Multiple Range Testに基づいて各因子間の顕著な差異程度（p＜0．05）を比較し、得られるデータは、平均値±標準偏差（Mean±SD）として示される。

＊は、逆方向プライマーである
表一Real−timePCRの專一性プライマー
表一におけるプライマーの配列表における番号は、以下のとおりである：
Mouse RSP16−F： SEQ ID NO：2；Mouse RSP16−R： SEQ ID NO：3；Mouse SIT1−F： SEQ ID NO：4；Mouse SIT1−R： SEQ ID NO：5；Human−GAPDH−F： SEQ ID NO：6；Human−GAPDH−R： SEQ ID NO：7；Human−SIT1−F： SEQ ID NO：8；Human−SIT1−R： SEQ ID NO：9；Human−SIT3−F： SEQ ID NO：10；Human−SIT3−R： SEQ ID NO：11；T7：SEQ ID NO：12；SP6＊：SEQ ID NO：13；Oligo d（T）＊： SEQ ID NO：14。
結果
サーファクチンはマウスの胚胎繊維芽細胞の長寿遺伝子（サーチュイン1遺伝子）の発現と増殖を促進する
図1から、サーファクチンは、マウスの胚胎繊維芽細胞の長寿遺伝子（サーチュイン1遺伝子）の発現を促進することができ、マウスの胚胎繊維芽細胞に異なる濃度のサーファクチンを与える場合に、異なる濃度のサーファクチンは、サーチュイン1遺伝子の発現について、異なる効果を有し、マウスの胚胎繊維芽細胞にサーファクチンを6時間与えた後、50μM、75μMのサーファクチンは、サーチュイン1遺伝子の発現を促進する効果を有し、マウスの胚胎繊維芽細胞にサーファクチンを12時間与えた後、25μMのサーファクチンは、サーチュイン1遺伝子の発現を促進する効果を有し、マウスの胚胎繊維芽細胞にサーファクチンを36時間与えた後、50μM、100μMのサーファクチンは、サーチュイン1遺伝子の発現を促進する効果を有し、マウスの胚胎繊維芽細胞にサーファクチンを48時間与えた後、50μMのサーファクチンは、サーチュイン1遺伝子の発現を促進する効果を有する。50μMのサーファクチンは、サーチュイン1遺伝子の発現に対する促進については、最も良い効果を有することが知られる。
図2は、レスベラトロール（Resveratrol）、ペンタペプチド（Palmitoyl pentapeptide−3）及びサーファクチンのマウスの胚胎繊維芽細胞の増殖に対する影響であり、図2から、サーファクチンは、マウスの胚胎繊維芽細胞増殖を促進する効果を有し、且つ、最も好ましくは、75μMのサーファクチンが細胞増殖を促進する効果であり、次に好ましくは、50μMのサーファクチンが細胞増殖を促進する効果であることが知られる。又、サーファクチンが細胞増殖を促進する効果は、レスベラトロールとペンタペプチドよりも好ましい。

実施例二 サーファクチンは、光老化防止と酸化防止作用を有する
1． サーファクチンは光老化防止修正保護機能
細胞を皿に分けた後に、4時間培養して培養皿に固定させた後に、UV−A波長の紫外線ランプチューブを光ストレス由来とし、紫外光雑交箱で実験細胞に能量濃度が0J／cm²、10J／cm²及び15J／cm²照射し、照射後に25、50、75、100及び125μM濃度のサーファクチンを添加し、24時間培養し後に、MTT法で細胞の生存率をテストする。
図3から、サーファクチンは、光老化防止修正保護機能を有し、マウスの胚胎繊維芽細胞に10J／cm²の紫外光を照射した後に、25、50、75、100及び125μM濃度のサーファクチンはいずれも細胞の生存率を増加する効果を有し、且つ最も好ましくは、75μM濃度のサーファクチンの効果であり、マウスの胚胎繊維芽細胞に15J／cm²の紫外光を照射した後に、25、50、75及び100μM濃度のサーファクチンはいずれも細胞の生存率を増加する効果を有し、且つ、50μM濃度のサーファクチン効果が最も好ましいことが知られる。
2．サーファクチンは酸化防止修正保護機能を有する
マウスの胚胎繊維芽細胞を皿に分けた後に、4時間培養し培養皿に固定した後に、過酸化水素を酸化ストレス由来とし、細胞が100、150、200及び250μM濃度の過酸化水素で処理された後に、更に25、50、75及び100μM濃度のサーファクチンを添加し、24時間培養し、その後、MTT法で細胞の生存率をテストする。
図4から、サーファクチンは過酸化水素で処理されたマウスの胚胎繊維芽細胞の生存率を増加することができることが知られる。その中では、25、50、75μM濃度のサーファクチンはいずれも良い効果を有するが、75μM濃度のサーファクチンの効果が最も顕著である。

実施例三 サーファクチンのマウスの胚胎繊維芽細胞のコラーゲンを長める効果
1．コラーゲン濃度分析
コラーゲン濃度分析キット（Sircol^TM soluble collagen assay kit）で培養基におけるコラーゲンの総濃度を分析する。分析方法は以下のように簡略する。
分析待ち試料と異なる濃度の標準品0．1mLを1．5mL遠心管に置く。1mL dye reagentを入れて、振盪混合器で35min振盪する。12000rpmで10min遠心し、上清液を除去する。給水紙で遠心管のエッジの残留液をゆっくり除去し、沈殿物を触れてはならない。1mL Alkali reagentの溶解沈殿物を入れ、安定的に色を現れた後に0．2mLを取り出して96ホールプレートに置き、ELISA readerで吸光値570nmを読み取る。
2．サーファクチンはマウスの胚胎繊維芽細胞のコラーゲンを増加する効果を有する
図5から、サーファクチンは、マウスの胚胎繊維芽細胞のコラーゲンの増生を増加することができ、リン酸塩緩衝溶液（Phosphate buffered saline、PBS）を与えて培養するコントロールより、25、50、75及び100μMのサーファクチンは、細胞内のコラーゲンの増加については、いずれも良い効果を有するが、而100μMの効果が最も好ましいことが知られる。ペンタペプチド（Palmitoyl pentapeptide−3、PPP−3）は、細胞内のコラーゲンの含有量を増加することもできるが、その効果がサーファクチンと比べると、サーファクチンのほうが良いそうだ。

実施例四 サーファクチンはマトリックスメタロプロテアーゼ（Matrix metallopeptidase 9）を抑制する効果を有する
1．マトリックスメタロプロテアーゼ（Matrix metallopeptidase 9）の抑制効果の測定
マウスの胚胎繊維芽細胞を培養して皿に分けた後に、商用活性防しわ物質3、5、8及び10μM Palmitoyl pentapeptide−3）を入れることは、25、50、75及び100μMサーファクチンを入れることと比べると、分析方式はAbnova MMP−9（Mouse）ELISA KitとELISA Readerで細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼ九型の濃度分析を行う。
2．サーファクチンはマトリックスメタロプロテアーゼを抑制する効果を有する
図6図から、50、75及び100μMのサーファクチンはマトリックスメタロプロテアーゼを抑制する効果を有し、且つ、50μMのサーファクチンの抑制効果が最も好ましいことが知られる。

実施例五 サーファクチンは化粧品の原料が皮膚を透過するように促進する
1．実験方法
実験前、先ず背部に毛を剃る動作を行う。6−8週のマウスを麻酔剤Zoletilで腹腔内注射し麻酔し、動物を平らに横たわらせた後に、電気カミソリで背部の毛を柔らかに剃り、脱毛クリームで残りの体毛を除去する。動物を温暖ランプ付き籠（cage）に置き、且つ飲水を与える。実験前、以Zoletilでマウスを麻酔する。実験は、PBS（pH＝7．4）100 μl混合イソチオシアン酸（fluorescein isothiocyanate、FITC）で標記されるヒアルロン酸（hyaluronic acid）又はコルチコステロイド（dexamethasone）を、1cm²無菌脱脂綿に添加し通気性テープでマウスの背部に固定するコントロールと、ヒアルロン酸又はコルチコステロイドにそれぞれ0．2、0．5、1、2、5％surfactinを添加し処理する実験群とに分けられる。
一時間処理した後にCO₂窒息法でマウスを犧牲させ、アルコールで皮膚上に残られた薬品を除去し、マウスの背部の皮膚を刈って、Optimum cutting temperature compound（O．C．T）（SAKURA(R)、Japen）で包埋した後に凍結切片する（CM−2000，Leica、Germany）。
2．サーファクチンはコルチコステロイドを皮膚を透過するように促進することができる
図7から、サーファクチンは、コルチコステロイドを皮膚を透過するように促進することができ、蛍光の強度を観察ことによって、各実験群におけるコルチコステロイドの皮膚透過量が分かることができ、蛍光の強度が強ければ強いほど、皮膚を透過するコルチコステロイドの量が多いことを表し、図7における（B）、（C）、（D）、（E）には、コントロール（A）より多い蛍光が見え、つまり、0．2、0．5、1、2％のサーファクチンはコルチコステロイドの皮膚透過量を増加することができることが知られる。
3．サーファクチンは皮膚を保湿因子ヒアルロン酸（HA）を吸収するように促進する
図8から、サーファクチンは皮膚をヒアルロン酸を吸収するように促進することができ、蛍光の強度が強ければ強いほど、皮膚を透過するヒアルロン酸の量が多いことを表し、図8における（A）に見えられる蛍光の強度が最も強いことが表し、つまり、1％のサーファクチンが皮膚を保湿因子ヒアルロン酸を吸収するように促進する効果が最も好ましい。
4．サーファクチンは皮膚を保湿因子ガンマポリグルタミン酸（Gamma−polyglutamic acid、γ−GPA）を吸収するように促進する
図9から、サーファクチンは、皮膚を保湿因子（γ−GPA）を吸収するように促進することができ、蛍光強度が強ければ強いほどものは、皮膚が吸収するガンマポリグルタミン酸の量が多いことを表し、図9における（B）、（C）、（D）、（E）、（F）、（G）はいずれもコントロール（A）より多い蛍光が見えることができ、つまり、1、2、5、10、10、15、20％のサーファクチンはいずれも皮膚がガンマポリグルタミン酸の量を吸収するように増加することができる。
5．サーファクチンは金ナノ粒子（gold−nanoparticles、2nm）が皮膚経由吸収を促進する
金ナノ粒子とサーファクチンで混合してマウスの表皮に塗布した後に、時期を経て、皮膚を取り外して凍結切片し、金ナノ粒子が自行的に発行することができるので、直接に光学顕微鏡で金ナノ粒子が皮膚の表皮層と真皮層の蛍光含有量を観察する。結果から、伝統的なプロセスで乳化された皮膚保護クリームは、その内部構造がミセル状又はミセル状であるから、皮膚が金ナノ粒子を吸収することに不利であり、金ナノ粒子は表皮層のみで発現されることが示される。12．5ppmサーファクチンを添加した後に、金ナノ粒子を皮膚経由吸収する効果を著しく促進することができる（図10）。
以上の研究結果から、本願に係るサーファクチンは、化学合成された界面活性剤を取り換えて、経皮投与システムに広く適用することができる。

実施例六 サーファクチンの乳化力分析
乳化指数が界面活性剤の重要な指標の一つであり、本発明はCooperらに用いられる方法を参考して、界面活性剤のディーゼル油に対する乳化指数を測量する。將異なる濃度の粗純化サーファクチンをpHが6．4、7．4及び8．4の緩衝溶液に溶解し、2mlを抽出し3mlディーゼル油を試験管に添加し、2分間振盪（vortex）し、室温下で24時間静置し、乳化層の高さと溶液総高さの比値を測量し100％に乗じて当該測量待ち液の乳化指数になる。油の乳化能力は、乳化指数（emulsification index、E₂₄）で表され、ただし、E₂₄の公式は、

である。
図11から、サーファクチンはpH＝7．4である場合に、好ましい乳化力を有し、且つ、サーファクチンはpH＝7．4と160μg／ml濃度である場合に、最も好ましい乳化力を有することが知られる。

実施例七 サーファクチンは発泡剤とすることができる
1．発泡力分析
界面活性剤は低発泡性の特性を有し、本発明は、粗純化されるサーファクチンが発泡性を有するかどうかをテストすることである。Razafindralamboらに用いられる方法を参考し、異なる濃度の粗純化サーファクチンをpHが7．4の緩衝溶液に溶解し、二分間振盪（vortex）した後に1時間静置し、その泡の高さを測量する。発泡力は最大の発泡密度（foam maximum density、MD）で表され、総液体の高さを最大発泡高度で割って最大発泡密度を得る。
2．サーファクチンが発泡剤とすることができる
サーファクチンは、多くの生物特性を有し、一般的な界面活性剤が有する発泡及び乳化能力（Razafindralambo et al．、1998）を含む。発泡現象とは、サーファクチンが気相及び液相の界面中に存在し、激しく揺れて界面活性剤に空気を捕えさせ、内に空気が含まれる薄膜を形成する（Halling、1981）。本発明は、Bacillus subtilis THによるサーファクチンが発泡する活性を有するかをテストし、結果から、150 μgより大きいサーファクチンを緩衝液に入れ、MD値が顕著に低下することがなく、最低なMD値が1．23（図12を参照する）であることが示され、脱イオン水に添加されるサーファクチンの濃度が既に臨界ミセル濃度（Critical micelle concentration、CMC）に達成し、サーファクチンがミセル状に形成され、単体のみが残って溶液に作用するからかもしれないと推測される。図13は、サーファクチンの濃度と発泡の高さとの間の関係を示す。Razafindralamboらによって、サーファクチンの最低なMD値が0．10にも達することができ、伊枯草菌素より、サーファクチンが優れた発泡効果を有することが指摘され、両者の間の構造に関係し、サーファクチンがアニオン界面活性剤に属し、且つ、その脂肪酸の炭素鎖が短いが、ituirn Aがノニオン界面活性剤であり、脂肪酸の炭素鎖が長いと推測される（Razafindralambo et al．、1998）。Bacillus subtilis THによるサーファクチンは発泡能力を有し、清潔剤、シャンプー、ハンドクリンザー等の個人保養品に適当に適用できる。

実施例八 サーファクチンが潤滑剤とする
サーファクチンが洗浄時に沖洗時著しいなめらかさ（Flushing will show good sense of smooth）を現わすが、低濃度である場合に、コアセルベート（corecervate）現象が起こることがある。
1． サーファクチンは濁度を低減することができる
（1）シャンプーの相対濃度を0．01−1．0に調整する
相対濃度＝シャンプー原液（g）／（シャンプー原液（g）＋水（g））
（2）（1）溶液420mlにおける透過率（％、温度40℃）を測定し、その濁度（Turbidity）（％）＝100−透過率（％）を簡単に示す
図14から、清潔用品に常用される乳化剤−ラウリルアルコールポリエーテル硫酸エステルナトリウム（sodium laureth sulfate）に比べると、本願のサーファクチンは、シャンプーの濁
度をより低減することができ、つまり、シャンプーのなめらかさを増加する。
2．サーファクチンはコアセルベート（corecervate）現象が起こる。
サーファクチン於沖洗時會発現出色のなめらかさ（sense of smooth）、而在低濃度の情況下、會産生液滴（corecervate）現象。 サーファクチンが洗浄時に著しいなめらかさ（sense of smooth）を現わすが、低濃度である場合に、コアセルベート（corecervate）現象が起こることがある。
図15から、ポリマーと界面活性剤複合物（polymer−surfactant complex）に希釈した後、即ち、コアセルベート（corecervate）現象が発生し、サーファクチンを含むシャンプーは沈殿が発生するので、摩擦感（friction sensitivity）を減少し、なめらかさ（sense of smooth）を増加する。

上記実施例及び図面はただ本発明の好ましい実施例だけであり、これによって本発明の実施の範囲を限定するものではなく、即ち、本発明の特許請求の範囲によって作る均等な変化と修飾であっても、本発明の特許範囲に属すべきである。

Claims (43)

1. サーファクチン（surfactin）と、薬学的に許容される担持体（vehicles）、賦形剤、希釈剤、補助剤等とを含む化粧品組成物を使用者に有効投与量投与することを含む老化防止の治療方法。
2. 前記サーファクチンは、シクロリポペプチドであり、βヒドロキシ脂肪酸に連結されるヘプタペプチド配列（L）Glu−（L）Leu−（D）Leu−（L）Val−（L）Asp−（D）Leu−（L）Leuを含み、前記サーファクチンの脂肪酸末端における脂肪酸の分布は、
   （1）イソC13が3％より大きく、
   （2）n−C13が0．65％より大きく、
   （3）イソC14が17％より大きく、
   （4）n−C14が41％より少なく、
   （5）イソC15が11％より少ないことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
3. 前記サーファクチンの前記脂肪酸末端における脂肪酸の分布は、
   （1）イソC13が10％より大きく、
   （2）n−C13が25％より大きく、
   （3）イソC14が35％より大きく、
   （4）n−C14が25％より小さく、
   （5）イソC15が3％より少ないことを特徴とする、請求項2に記載の方法。
4. 前記サーファクチンの前記脂肪酸末端における脂肪酸の分布は、（1）イソC13が11％であり、（2）n−C13が26％であり、（3）イソC14が37％であり、（4）n−C14が24％であり、（5）イソC15が2％であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
5. 前記サーファクチンの分子量が1022又は1036 Daであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
6. 前記サーファクチンは、その化学異性体を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
7. 前記老化防止化粧品組成物は、更にアルコール類、エステル類、複合多糖体、ナットオイル及びビタミンのうちの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
8. 前記アルコール類は、C16−18アルコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、オクタンジオール、グリセリン、へクサデカノール、オクタデシルアルコール、ドコサノール及びプロピレングリコールのうちの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項7に記載の方法。
9. 前記エステル類は、オリーブ油セチルアルコールエステル（OLIVEM 1000）、モノステアリン酸グリセリル（GSM（登録商標））、イソプロピルミリステート（IPM）、イソプロピルパルミテート（IPP）及びトリグリセリドのうちの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項7に記載の方法。
10. 前記複合多糖体は、キサンタンガム、シロキクラゲ多糖体、グルカン、センナ葉種多糖体のうちの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項7に記載の方法。
11. 前記ナットオイルは、アルガン油、ククイナッツオイル、アボカドオイル、小麦胚芽油、オリーブ油のうちの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項7に記載の方法。
12. 前記ビタミンは、ビタミンA、ビタミンB、ビタミンC、ビタミンE、ビタミンF、ビタミンKのうちの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項7に記載の方法。
13. 前記老化防止化粧品組成物は、繊維芽細胞の増殖、コラーゲンの増生又はサーチュイン1遺伝子の発現を促進するためのものであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
14. 前記老化防止化粧品組成物は、紫外光による老化防止又は酸化防止のためのものであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
15. 前記老化防止化粧品組成物は、マトリックスメタロプロテアーゼ（Matrix metallopeptidase）を抑制するためのものであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
16. 前記マトリックスメタロプロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ9タイプ（Matrix metallopeptidase 9）であることを特徴とする、請求項15に記載の方法。
17. サーファクチン（surfactin）と、薬学的に許容される担持体（vehicles）、賦形剤、希釈剤、補助剤等とを含み、サーファクチンの使用により皮膚透過力を増加させる組成物の調製方法。
18. 前記サーファクチンは、シクロリポペプチドであり、βヒドロキシ脂肪酸に連結されるヘプタペプチド配列（L）Glu−（L）Leu−（D）Leu−（L）Val−（L）Asp−（D）Leu−（L）Leuを含み、前記脂肪酸末端における脂肪酸の分布は、
    （1）イソC13が3％より大きく、
    （2）n−C13が0．65％より大きく、
    （3）イソC14が17％より大きく、
    （4）n−C14が41％より少なく、
    （5）イソC15が11％より少ないことを特徴とする、請求項17に記載の方法。
19. 前記サーファクチンの前記脂肪酸末端における脂肪酸の分布は、
    （1）イソC13が10％より大きく、
    （2）n−C13が25％より大きく、
    （3）イソC14が35％より大きく、
    （4）n−C14が25％より小さく、
    （5）イソC15が3％より少ないことを特徴とする、請求項18に記載の方法。
20. 前記サーファクチンの前記脂肪酸末端における脂肪酸の分布は、（1）イソC13が11％であり、（2）n−C13が26％であり、（3）イソC14が37％であり、（4）n−C14が24％であり、（5）イソC15が2％であることを特徴とする、請求項19に記載の方法。
21. 前記サーファクチンの分子量が1022又は1036Daであることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
22. 前記サーファクチンは、その化学異性体を含むことを特徴とする、請求項17に記載の方法。
23. 前記皮膚透過力を増加する組成物は、更にアルコール類、エステル類、複合多糖体、ナットオイル及びビタミンのうちの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項17に記載の方法。
24. 前記アルコール類は、C16−18アルコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、オクタンジオール、グリセリン、へクサデカノール、オクタデシルアルコール、ドコサノール及びプロピレングリコールのうちの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項23に記載の方法。
25. 前記エステル類は、セチルアルコールオリーブ油エステル（OLIVEM 1000）、モノステアリン酸グリセリル（GSM（登録商標））、イソプロピルミリステート（IPM）、イソプロピルパルミテート（IPP）及びトリグリセリドのうちの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項23に記載の方法。
26. 前記複合多糖体は、キサンタンガム、シロキクラゲ多糖体、グルカン、センナ葉種多糖体のうちの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項23に記載の方法。
27. 前記ナットオイルは、アルガン油、ククイナッツオイル、アボカドオイル、小麦胚芽油、オリーブ油のうちの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項23に記載の方法。
28. 前記ビタミンは、ビタミンA、ビタミンB、ビタミンC、ビタミンE、ビタミンF、ビタミンKのうちの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項23に記載の方法。
29. 前記組成物は、化粧品の原料が皮膚を透過するように促進するためのものであることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
30. 前記化粧品の原料は、コルチコステロイド（dexamethasone）であることを特徴とする、請求項29に記載の方法。
31. 前記化粧品の原料は、ヒアルロン酸（hyaluronic acid）であることを特徴とする、請求項29に記載の方法。
32. 前記化粧品の原料は、ガンマポリグルタミン酸（Gamma−polyglutamic acid）であることを特徴とする、請求項29に記載の方法。
33. 前記化粧品の原料は、金ナノ粒子（gold−nanoparticles）であることを特徴とする、請求項29に記載の方法。
34. サーファクチン（surfactin）と、薬学的に許容される担持体（vehicles）、賦形剤、希釈剤、補助剤等とを含む、サーファクチンを用いる乳化剤組成物の調製方法。
35. 前記サーファクチンは、シクロリポペプチドであり、βヒドロキシ脂肪酸に連結されるヘプタペプチド配列（L）Glu−（L）Leu−（D）Leu−（L）Val−（L）Asp−（D）Leu−（L）Leuを含み、前記サーファクチンの脂肪酸末端における脂肪酸の分布は、
    （1）イソC13が3％より大きく、
    （2）n−C13が0．65％より大きく、
    （3）イソC14が17％より大きく、
    （4）n−C14が41％より少なく、
    （5）イソC15が11％より少ないことを特徴とする、請求項34に記載の方法。
36. 前記サーファクチンの前記脂肪酸末端における脂肪酸の分布は、
    （1）イソC13が10％より大きく、
    （2）n−C13が25％より大きく、
    （3）イソC14が35％より大きく、
    （4）n−C14が25％より小さく、
    （5）イソC15が3％より少ないことを特徴とする、請求項35に記載の方法。
37. 前記サーファクチンの前記脂肪酸末端における脂肪酸の分布は、（1）イソC13が11％であり、（2）n−C13が26％であり、（3）イソC14が37％であり、（4）n−C14が24％であり、（5）イソC15が2％であることを特徴とする、請求項36に記載の方法。
38. 前記サーファクチンの分子量は、1022又は1036Daことを特徴とする、請求項34に記載の方法。
39. 前記サーファクチンは、その化学異性体を含むことを特徴とする、請求項34に記載の方法。
40. 前記乳化剤組成物は、更に脂肪酸グリセリド、脂肪酸ソルビタン、脂肪酸ショ糖エステル、脂肪酸プロピレングリコール、レシチンのうちの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項34に記載の方法。
41. 前記乳化剤組成物は、発泡力を増加するためのものであることを特徴とする、請求項34に記載の方法。
42. 前記乳化剤組成物は、乳化作用を増加するためのものであることを特徴とする、請求項34に記載の方法。
43. 前記乳化剤組成物係は、なめらかさを増加するためのものであることを特徴とする、請求項34に記載の方法。

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