JP2017524714A - 脳腫瘍への選択的デンドリマー送達 - Google Patents

Abstract

脳腫瘍の１つまたは複数の症状を処置または軽減するための少なくとも１つの治療薬剤、予防薬剤、または診断薬剤に共有結合的に連結している、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）ヒドロキシル末端デンドリマーを含む組成物が開発されている。本デンドリマーは、１つまたは複数の、エチレンジアミンコアのポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）ヒドロキシル末端世代４、５、６、７、８、９、または１０の、最も好ましくは世代６の（Ｇ４−１０−ＯＨ）デンドリマーを含む。Ｇ６デンドリマーは、予想外に高い脳内への取込みを提示している。本デンドリマーは、化学治療薬剤、免疫治療薬剤、および緩和薬剤の血液脳関門（「ＢＢＢ」）を通過する選択的送達のための手段を提供する。本デンドリマーはまた、１つまたは複数の作用機序を有する２つの異なるクラスの化合物をデンドリマーに結合させて、同時の送達を提供することができるという利点を有する。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１４年８月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／０３６，６７５号、２０１４年８月１３日に出願された同第６２／０３６，８３９号および２０１５年１０月３日に出願された同第６２／０５９，２４０号（これらは、参考として援用される）への優先権を主張する。

本発明は、概して、脳腫瘍および関連症状を処置するための化学治療薬物、免疫治療薬物、および緩和薬物の脳への送達に関する分野に含まれる。

脳腫瘍は、正しい脳機能を破綻させうる、脳または中心脊椎の組織の異常な成長である。医師は、どこで腫瘍細胞が生じたのか、そしてそれらががん性（悪性）であるか否（良性）かに基づいて、腫瘍について言及する。脳腫瘍の最も侵襲性の低いタイプは、多くの場合、良性の脳腫瘍と呼ばれる。それらは、脳の内部または周囲の細胞から生じ、がん細胞を含有せず、ゆっくりと成長し、そして典型的には、他の組織内への広がりのない明確な境界を有する。悪性の脳腫瘍は、がん細胞を含有し、多くの場合、明確な境界を持たない。それらは、速やかに成長し、周囲の脳組織を侵すことから、生命を脅かすものと考えられている。脳の細胞で開始する腫瘍は、原発性脳腫瘍と呼ばれる。原発性脳腫瘍は、脳の他の部分または脊椎に広がることがあるが、他の器官に広がることは稀である。転移性または二次性の脳腫瘍は、身体の別の部分で始まり、次いで、脳へと広がる。これらの腫瘍は、原発性脳腫瘍よりも一般的であり、それらの始まる場所によって命名される。

脳および中枢神経系の腫瘍は、１２０を超えるタイプがある。脳および脊髄の腫瘍は、各人で異なる。それらは、異なる領域に形成し、異なる細胞のタイプから発達し、異なる処置の選択肢があると思われる。多くの場合、低いグレードの腫瘍（グレードＩおよびＩＩ）、すなわち侵襲性の高くないものは、注意深いモニタリングまたは手術のみで処置される。全ての腫瘍が、走査を繰り返してモニタリングされるが、グレードＩＩの腫瘍は、手術後にさらに入念に、かつ時間をかけて注視されて、再発がないことを確認される。高グレードの腫瘍（グレードＩＩＩおよびＩＶ）、すなわち悪性であり急速に成長しうるものは、除去がさらに難しく、手術より先の追加の処置、例えば放射線照射または化学治療などを必要とする。微視的な腫瘍細胞が、手術後に残る可能性があり、最終的に元通りに成長することになる。全ての処置は、それゆえ、生命をできる限り長く延長し向上させることを意図するものである。

低グレードの脳腫瘍については、手術は、腫瘍の全てを除去することが可能である場合に、特に必要な唯一の処置であると思われる。目に見える腫瘍が手術後に残っている場合には、放射線照射および化学治療が使用されることがある。高グレードの腫瘍については、処置は通常、手術に始まり、その後に放射線照射治療および化学治療が続く。高グレードの腫瘍に用いる追加の処置の選択肢としては、腫瘍細胞を破壊するかまたは腫瘍の成長を遅延させるためのＸ線および他の形態の放射線照射；分裂している細胞を速やかに死滅させるための化学治療；細胞の特異的な構成要素、例えば細胞の成長に必要とされる分子または経路に、それらを標的として使用するように焦点を合わせた標的化治療；および異なる方向でその使用領域にわたる交互になった「波様の」電界を作り出すことによって、がん細胞の示す速やかな細胞分裂を破綻させるための電界を生成する、局所的または領域的に送達される処置、が挙げられる。

首尾良く脳腫瘍を処置することは難題となりうる。身体の血液−脳関門は、正常には脳および脊髄を、血流を通じてこれらの構造に入り込む有害な化学物質から保護する。しかし、この関門はまた、多くのタイプの化学治療を閉め出す。腫瘍が脳または脊髄の繊細な部分に近い場合には、手術が難しいことがある。外科医が元の腫瘍を完全に除去することができた時でさえ、手術中に目にするかまたは除去するには小さすぎる腫瘍の一部が残る場合がある。放射線照射治療は、健康な組織を損傷させることがある。

脳腫瘍およびその処置は、多くの場合に、副作用を引き起こす。腫瘍を遅らせる、停止させる、または排除するための処置に加えて、ケアの重要な部分とは、人の症状と副作用を和らげることである。このアプローチは、緩和ケアまたは支持ケアと呼ばれ、物理的、感情的、および社会的要求のある患者を支持することを含む。疼痛薬物療法は、脳腫瘍の一般的な症状である頭痛に由来する痛みを管理する助けとなる。多くの場合、コルチコステロイドが、脳の腫脹を小さくするために使用され、このことによって、処方箋による疼痛薬物療法を必要とすることなく腫脹由来の痛みを少なくすることができる。抗発作（ａｎｔｉｓｅｉｚｕｒｅ）の薬物療法は、発作を制御する助けとするために使用される。

手術は、脳腫瘍の全てまたは一部を除去するために一般に使用される。時には、腫瘍が外科医の到達することのできない場所に位置するか、または重要な構造の近くにあるために、手術を実施することができない。これらの腫瘍は、手術不能であると呼ばれる。

化学治療の目標は、手術後に残っているがん細胞を破壊し、腫瘍の成長を遅らせ、症状を低減することであり得る。化学治療レジメンは、通常、ある一期間にわたって施される特有の回数のサイクルからなる。患者は、一度に１つの薬物を受けてもよいし、異なる薬物の組合せを同時に受けてもよい。化学治療を施すための一般的な方法としては、飲み込まれる（経口的に）丸剤もしくはカプセルまたは静脈内による（ＩＶ）ものである。薬物によっては、血液−脳関門を通り抜けるのに優れており、これらの薬物は、この能力ゆえに、多くの場合、脳腫瘍に使用される。グリアデル・ウエハー（Ｇｌｉａｄｅｌ ｗａｆｅｒ）は、薬物カルムスチンを与えるための１つの方法であり、この方法は、手術中に腫瘍が除去された領域にウエハーを配置することを含む。神経膠芽腫に罹っている人にとって、最新のケアの標準は、放射線照射治療を毎日の低用量のテモゾロミド（テモダール）と共に行い、続いて、６か月から１年間、毎月のテモゾロミドの投薬を放射線治療後に行うというものである。ロムスチン（ＣｅｅＮＵ）、プロカルバジン（マチュレーン（Ｍａｔｕｌａｎｅ））、およびビンクリスチン（ビンカサール（Ｖｉｎｃａｓａｒ））の３つの薬物の組合せは、放射線照射治療と併せて使用されている。このアプローチは、放射線照射治療の前または直後のどちらかに与えた際に、１ｐ１９ｑの共欠失を伴うグレードＩＩＩの乏突起神経膠腫に罹っている患者の命を延ばす助けとなっている。それはまた、手術で完全に除去することのできなかった低グレードの腫瘍に対し放射線照射治療後に与えた際に、患者の命を延ばすことを示している。化学治療の副作用は、個体と使用された用量とに依存するが、疲労、感染のリスク、吐き気および嘔吐、脱毛、食欲喪失、および下痢を含むことがある。これらの副作用は、通常はひとたび治療が終了すると消える。稀に、ある種の薬物は、多少の難聴の原因となることがある。腎臓の損傷を引き起こすことがあるものもある。患者には、その腎臓を保護するために、ＩＶによって余分の流体を与えることがある。がん薬物の完全な一覧は、ＮＣＩのウェブサイト上で見ることができる。

抗血管新生は、新しい血管を作る過程である血管新生の停止に、焦点が合わせられる。腫瘍は、成長および拡大のために、血管によって送達される栄養分を必要とすることから、抗血管新生治療の目標は、腫瘍を「飢えさせる」ことである。ベバシズマブ（アバスチン）は、事前の処置が機能しなかった際に、多形神経膠芽腫を処置するために使用される抗血管新生治療である。

寛解は、腫瘍を体内に検出することができない時である。寛解は、一時的でも永続的でもあり得る。大半の原発性脳腫瘍については、イメージング試験が、腫瘍の成長が制御されるかまたは目に見える腫瘍の徴候がないことを示すにも関わらず、脳腫瘍が再発するのが一般的である。

神経膠腫では、腫瘍随伴ミクログリア／マクロファージ（ＴＡＭ）は、腫瘍の成長、腫瘍の侵入、血管新生、および免疫系の回避に関与することが示されている。ＴＡＭは、腫瘍微小環境中で再プログラミングに付され、交互になった免疫抑制性の腫瘍形成性Ｍ２表現型につながる（ｄａ Ｆｏｎｓｅｃａ ＡＣ、Ｂａｄｉｅ Ｂ．、Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１３年、２６４１２４頁）。種々のミクログリア／マクロファージ調節分子は、前臨床試験において、ＴＡＭの表現型を切り替え、神経膠腫の進行を低下させ、生存を増加させることを示している（Ｅｌ Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ Ａら、Ｇｌｉａ、２００６年、５４巻、５２６〜３５頁；Ｈｕｓｓａｉｎ ＳＦら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００７年、６７巻、９６３０〜６頁；Ｇａｂｒｕｓｉｅｗｉｃｚ Ｋら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１１年、６巻、ｅ２３９０２頁；Ｍａｒｋｏｖｉｃ ＤＳら、Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ Ｉｍｍｕｎ、２０１１年、２５巻、６２４〜８頁）。免疫調節分子のＴＡＭへの標的送達は、副作用を低減した有効性の向上を提供するものと思われる。

悪性の神経膠腫は、最も一般的で最も侵襲性の高い原発性脳腫瘍であり、処置の進歩にもかかわらず、生存の中央値は、依然として１６．４か月である。有効な治療の開発に際して直面している鍵となる難題は、（ａ）全身に送達される化学治療薬剤が、損なわれた血液脳腫瘍関門（ＢＢＴＢ）を貫通して、固形腫瘍全体にわたる均一な網羅を提供する能力、および（ｂ）特異的な細胞を標的化する能力に関連する。小分子ベースの治療剤は、腫瘍組織内に有効に分布することができるものの、速やかな腫瘍クリアランスと、有害作用につながる可能性があるオフターゲット血管外遊出とによって制限される。最近のナノ技術の進歩によって、選択的な腫瘍蓄積が可能となっている。しかし、多くのナノ粒子のサイズが、血管外遊出および腫瘍貫通を制限し、それゆえ均一な固形腫瘍の網羅を制限する。皮下腫瘍中のナノ粒子の分布プロファイルを増強するため、粒子サイズと表面電荷とを入念に調節することが試みられている。残念ながら、同所性の脳腫瘍の均一な網羅を達成することは、さらに大きな難題であることが証明されている。これは、皮下腫瘍での血液−腫瘍関門（ＢＴＢ）に比べてＢＢＴＢの浸透性が低いこと、脈管間の空間が不均一であること、および脳腫瘍中の間質の圧力が高いことに起因するものと考えられる。いくつかの戦略では、ＢＢＴＢを通じて吸収性の取込みを介したナノ粒子送達が試みられているものの、漏出性のＢＢＴＢ穿孔を通じた受動拡散が、２０ｎｍ未満の分子を用いて示されているにすぎず、ＢＢＴＢを通じた妨げのない拡散は、７ｎｍの分子を用いて達成されており、それゆえほとんどのナノ粒子ベース治療剤の全身投与は制限されている。

ｄａ Ｆｏｎｓｅｃａ ＡＣ、Ｂａｄｉｅ Ｂ．、Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１３年）２６４１２４頁 Ｅｌ Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ Ａら、Ｇｌｉａ（２００６年）５４巻、５２６〜３５頁 Ｈｕｓｓａｉｎ ＳＦら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００７年）６７巻、９６３０〜６頁 Ｇａｂｒｕｓｉｅｗｉｃｚ Ｋら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１１年）６巻、ｅ２３９０２頁

それゆえ、本発明の目的は、脳腫瘍を処置するための薬物を送達するための、改良された方法および試薬を提供することである。

脳腫瘍の１つまたは複数の症状を処置または軽減するための少なくとも１種の治療薬剤、予防薬剤、または診断薬剤と共有結合的に連結または複合体形成している、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）ヒドロキシル末端デンドリマーを含む組成物を開発した。本組成物は、１つまたは複数のエチレンジアミンコアのポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）ヒドロキシル末端の世代４、５、６、７、８、９、または１０（Ｇ４−１０−ＯＨ）のデンドリマーを含有する。Ｇ６デンドリマーは、予想外に高い取込みと脳腫瘍全体への均一な分布とを実証している。本デンドリマーは、化学治療薬剤、免疫治療薬剤、および緩和薬剤の血液脳関門（「ＢＢＢ」）を通じた選択的な送達のための手段をもたらす。本デンドリマーはまた、同じデンドリマーを用いて多種の治療薬剤、予防薬剤、および／または診断薬剤を送達することができるという利点を有する。一実施形態では、本デンドリマーは、２つの異なるクラスの化合物と複合体形成またはコンジュゲートし、同時の送達をもたらす。本デンドリマーは、静脈内注射によって単独で、または放射線照射および／もしくは手術を伴う多面的治療の一部として、投与されてもよい。一実施形態では、本デンドリマーは、増殖性疾患においてＤＤＸ３の活性を抑制または阻害するのに有効な量で、少なくとも１つの放射線増感薬剤に共有結合的に連結している。別の実施形態では、本デンドリマーは、被験体で腫瘍を検出するのに有効な量で、少なくとも１つの検出可能な部分に共有結合的に連結している。別の実施形態では、本デンドリマー組成物は、化学治療薬剤、免疫治療薬剤、抗発作薬剤、腫脹を減少させるためのステロイド、抗生物質、抗血管新生性（ａｎｔｉｏｇｅｎｉｃ）薬剤、および／または診断薬剤など、多種の薬剤を有し、これらは、デンドリマーと複合体形成またはコンジュゲートしている。

本デンドリマー組成物は、好ましくは全身に、最も好ましくは静脈内注射を介して投与される。本組成物は、手術、放射線照射、もしくはその両方の前またはその後直ちに、投与されてもよい。本組成物は、神経膠腫など特異的な型の腫瘍を処置するために、またはミクログリア／マクロファージ（ＴＡＭ）に随伴する腫瘍を標的化することを通じて、設計されてもよい。

実施例は、ヒドロキシル末端ＰＡＭＡＭデンドリマーが、全身投与後に、固有の好ましい薬物動態の特徴を神経膠芽腫腫瘍モデルで提示することを実証している。デンドリマーは、速やかに蓄積して、選択的に腫瘍組織に保持される。これは、少なくとも部分的には、サイズが小型であること、および表面電荷が中性に近く、固形腫瘍全体にわたってデンドリマーが均一に分布するのを可能にすることに起因する。デンドリマーは、細胞外マトリックスを通して均一に分布し、腫瘍全体および腫瘍周囲の領域に行き届く。デンドリマーは、本質的には神経炎症を標的化し、腫瘍随伴ミクログリア／マクロファージ（ＴＡＭ）に蓄積する。デンドリマーの世代を４から６までに増やすことによって、その均一な分布とＴＡＭの標的化に影響を及ぼすことなく、腫瘍でのデンドリマーの蓄積を有意に増加させることができる。世代４および６のヒドロキシル末端ＰＡＭＡＭデンドリマーは、全身投与後、血液脳腫瘍関門を通って漏出し、腫瘍周囲の領域ではなく、選択的に神経膠芽腫に蓄積することができる。しかし，デンドリマーはまた、腫瘍周囲の領域に蓄積し、それによって、神経膠芽腫の遊走先端（ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ｆｒｏｎｔ）に影響を及ぼす。これらのデンドリマーは、本質的に腫瘍随伴ミクログリア／マクロファージを標的化して、これらの細胞に少なくとも４８時間にわたって保持される。血管腔にデンドリマーが残っている対側半球（「健康な」）には、有意なデンドリマーの蓄積はない。

世代４（Ｇ４）のデンドリマーは、循環から速やかにクリアランスされるものの、速やかにかつ選択的に蓄積し、腫瘍組織に保持される。蛍光定量および高分解能蛍光顕微鏡に基づけば、デンドリマーは、最初の８時間にわたって蓄積し、４８時間では依然として腫瘍に保持される。デンドリマーの世代を４から６まで増やすことによって、その均一な分布とＴＡＭの標的化に影響を及ぼすことなく、腫瘍でのデンドリマーの蓄積、ＡＵＣおよび保持を約１００倍、大幅に増やすことができる。

図１Ａ〜１Ｃは、ヒドロキシル末端Ｇ４デンドリマーに、小分子であるＢＬＺ−９４５をコンジュゲートするための合成スキームを示す。

図２Ａおよび２Ｂは、げっ歯類９Ｌ神経膠肉腫モデルの脳（腫瘍、腫瘍周囲領域、および対側半球）でのＤ−Ｃｙ５の薬物動態を図説するグラフである。図１Ａは、全身投与後１５分、１時間、４時間、８時間、２４時間、および４８時間の脳領域でのＤ−Ｃｙ５濃度のグラフである。蓄積は、組織ｇ当たりのＤ−Ｃｙ５のμｇとして表される。図１Ｂは、Ｄ−Ｃｙ５の曲線下面積（「ＡＵＣ」）のグラフである。４８時間でのＡＵＣは、腫瘍と対側半球との間で、デンドリマーの曝露に大きな差を示している。

図３Ａは、脳の定量データの線形カーブフィッティングのグラフである。対側、腫瘍周囲、および腫瘍のＲ^２は、それぞれ０．９８、０．９９および０．９６である。図３Ｂは、脳薬物動態データ、組織（ｔ）／血清（ｔ）（ｍＬ／ｇ）対ＡＵＣ血清ｔ／血清（ｔ）（時間）に基づく、腫瘍、腫瘍周囲の領域、および対側半球での浸透定数（Ｋ_ｉｎ）および分布の初期体積（Ｖ_ｉ）の計算を示す。

図４Ａおよび４Ｂは、Ｉｍａｒｉｓソフトウェアを使用した、９Ｌ神経膠肉腫を接種したげっ歯類の脳のミクログリア細胞の特徴付け（集団および活性化）を図示する。図４Ａは、腫瘍、同側半球および対側半球でのｍｍ^２面積当たりのＩｂａ１＋ミクログリア／マクロファージ集団の画像ベースの細胞カウントのグラフである。図４Ｂは、健康な脳、腫瘍接種脳の対側半球および同側半球、ならびに腫瘍組織でのミクログリア／マクロファージの活性化および貪食活性の指標としての、ミクログリア細胞の体積に対する表面積の比率の画像ベースの測定のグラフである。１＋細胞のＤ−Ｃｙ５とＩｂａ１＋ＴＡＭとの共局在、およびＤ−Ｃｙ５とＤＡＰＩ＋細胞との共局在である。結果を、総ＤＡＰＩ＋細胞集団のパーセントとして表す。ミクログリア取込みと細胞取込みとの間に、統計学的有意性はない。統計^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．００１統計解析は、３〜５枚の異なる切片に基づく。

図５は、投与から２４時間後のＤ−Ｃｙ５の細胞局在性解析のグラフであり、Ｉｂａ−１＋細胞のＤ−Ｃｙ５のＩｂａ１＋ＴＡＭとの共局在、およびＤ−Ｃｙ５のＤＡＰＩ＋細胞との共局在の、画像ベースの測定を使用した。結果を、総ＤＡＰＩ＋細胞集団のパーセントとして表す。ミクログリア取込みと細胞取込みとの間に、統計学的有意性はない。

図６Ａ〜６Ｃは、Ｄ−Ｃｙ５投与の２４時間後の９Ｌ神経膠肉腫のげっ歯類モデルの主要器官（脳、肝臓、肺、脾臓、心臓、および腎臓）、血清および尿中の、Ｄ−Ｃｙ５の蛍光ベースの定量に基づくグラフである。図６Ａは、体内分布を、器官当たりの注射用量：腎臓、尿、および他の器官中のＤ−Ｃｙ５の蓄積、のパーセントで表す。図６Ｂは、脾臓、肝臓、腎臓および血清中のＤ−Ｃｙ５の時間依存的な濃度のグラフである。濃度を、組織ｇ当たりの注射用量のパーセントで表す。図６Ｃは、Ｄ−Ｃｙ５の血漿中薬物動態の蛍光ベースの定量のグラフである。

図７Ａ〜７Ｃは、腫瘍を担持した脳でのＧ６とＧ４デンドリマーとの間の蓄積（デンドリマーμｇ／脳組織ｇ）を時間の関数として比較した（図７Ａ）グラフである。腫瘍／腫瘍周囲のＧ４デンドリマーの蓄積は、注射後８時間頃にピークとなり、徐々に減少し、一方、腫瘍／腫瘍周囲のＧ６デンドリマーの濃度は、継続して増加した。４８時間で、Ｇ６の濃度は、腫瘍中のＧ４デンドリマー濃度のほぼ１００倍であった。そして、Ｇ６デンドリマーを示す曲線下面積（ＡＵＣ）プロット（図７Ｂ）は、４８時間以内に、Ｇ４デンドリマーのほぼ１００倍の脳腫瘍曝露を有する。脳のデンドリマー濃度を血清中のデンドリマー濃度によって正規化した際に、血清に対する脳の比は、脳標的化能力の指標である。Ｇ６デンドリマーは、全ての時点で、Ｇ４デンドリマーよりも高い腫瘍標的化能力を示した（図７Ｃ）。

図８Ａおよび８Ｂは、血清および主要器官：腎臓、肝臓、脾臓中のＧ４およびＧ６デンドリマーの濃度を時間の関数として示すグラフである。図８Ａは、Ｇ６デンドリマーがＧ４デンドリマーよりも高い血清中濃度と、延長された血清中半減期とを示し、これらは、Ｇ６デンドリマーの腫瘍へのより高い蓄積と標的化に寄与することを示す。デンドリマー濃度は、血清ミリリットル当たりの総注射用量の百分率として提示された。図８Ｂは、Ｇ４デンドリマーについて、腎臓が、最も多くのデンドリマー蓄積（２０％〜３０％）を有し、各種時点で肝臓および脾臓中のデンドリマー蓄積（約０．３％）よりも有意に高かったことを示した。Ｇ６デンドリマーについては、サイズの増加によって、腎濾過および腎臓への蓄積が大きく減少した。Ｇ６デンドリマーの腎臓中濃度は、Ｇ４デンドリマー（約１％）の１／１０未満であり、４８時間から開始される腎臓からのクリアランスを示し始めた。Ｇ６デンドリマーの肝臓への蓄積は、Ｇ４デンドリマーと同様であったが、一方で、脾臓は、約５倍高い蓄積を示し、これは単球による取込みが増加したことに起因する可能性がある。

Ｉ．定義
用語「治療薬剤」は、疾患または障害の１つまたは複数の症状を防止または処置するために投与することのできる薬剤を指す。例としては、以下に限定されないが、核酸、核酸類似体、小分子、ペプチド模倣剤（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、タンパク質、ペプチド、炭水化物、もしくは糖、脂質、もしくは界面活性剤、またはそれらの組合せが挙げられる。

用語「処置する」は、疾患、障害、または状態の１つまたは複数の症状を防止または軽減することを指す。疾患または状態を処置することは、このような薬剤が痛みの原因を処置しなくても鎮痛薬剤の投与によって被験体の痛みを処置することなど、根底にある病態生理が影響を受けないとしても、特定の疾患または状態の少なくとも１つの症状を改善することを含む。

「薬学的に許容される」という語句は、健全な医療上の判断の範囲内で、合理的な利益／リスクの比に見合う過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、人間および動物の組織に接触させる際の使用に適した、組成物、ポリマー、および他の材料ならびに／または剤形を指す。「薬学的に許容される担体」という語句は、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクル、例えば液体または固体の充填剤、希釈剤、溶媒、または一器官もしくは身体の一部から別の器官もしくは身体の一部までの任意の対象組成物の運搬もしくは輸送に関与する被包材料を指す。各担体は、対象組成物の他の成分と適合性があり、かつ患者に害にならないという意味で、「許容される」でなければならない。

「治療有効量」という語句は、任意の医学的処置に適用可能な合理的な利益／リスクの比で、いくらかの所望の効果をもたらす治療薬剤の量を指す。有効量は、処置されている疾患もしくは状態、投与されている特定の標的化構築物、被験体のサイズ、または疾患もしくは状態の重症度などの要因に応じて、様々であることがある。当業者は、過度な実験を必要とすることなく、特定の化合物の有効量を経験的に決定してもよい。

ＩＩ．製剤
Ａ．デンドリマー
本明細書に使用されるときの用語「デンドリマー」としては、以下に限定されないが、内部コアと、この起点コアに規則的に付着している繰り返し単位の内部層（または「世代」）と、最も外側の世代に付着している末端基の外部表面とを有する、分子構造物が挙げられる。デンドリマーの例としては、以下に限定されないが、ＰＡＭＡＭ、ポリエステル、ポリリジン、およびＰＰＩが挙げられる。ＰＡＭＡＭデンドリマーは、カルボキシル、アミン、およびヒドロキシル末端を有することができ、任意の世代のデンドリマーとすることができるが、そのようなものとしては、以下に限定されないが、世代１のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代２のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代３のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代４のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代５のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代６のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代７のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代８のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代９のＰＡＭＡＭデンドリマー、または世代１０のＰＡＭＡＭデンドリマーが挙げられる。使用に適したデンドリマーとしては、以下に限定されないが、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリプロピルアミン（ＰＯＰＡＭ）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）、ポリリジン、ポリエステル、イプチセン、脂肪族ポリ（エーテル）、および／または芳香族ポリエーテルのデンドリマーが挙げられる。デンドリマー複合体の各デンドリマーは、他のデンドリマーと同様のまたは異なる化学的性質を有していてもよい（例えば、第１のデンドリマーは、ＰＡＭＡＭデンドリマーを含んでもよく、一方で、第２のデンドリマーは、ＰＯＰＡＭデンドリマーを含んでもよい）。一部の実施形態では、第１または第２のデンドリマーは、追加の薬剤をさらに含んでいてもよい。多重腕のＰＥＧポリマーとしては、スルフヒドリルまたはチオピリジン末端基を保有する少なくとも２つの分枝を有するポリエチレングリコールが挙げられる。しかし、本明細書に開示される実施形態は、このクラスに限定されず、他の末端基、例えばスクシンイミジルまたはマレイミド末端などを保有するＰＥＧポリマーを、使用することができる。分子量１０ｋＤａから８０ｋＤａのＰＥＧポリマーを使用することができる。

デンドリマー複合体は、多種のデンドリマーを含む。例えば、本デンドリマー複合体は、第３のデンドリマーを含むことができる。ここで、第３のデンドリマーは、少なくとも１つの他のデンドリマーと複合体形成している。さらに、第３の薬剤は、第３のデンドリマーと複合体形成することができる。別の実施形態では、第１および第２のデンドリマーは、それぞれ第３のデンドリマーと複合体形成し、ここで、第１および第２のデンドリマーは、ＰＡＭＡＭデンドリマーであり、第３のデンドリマーは、ＰＯＰＡＭデンドリマーである。本発明の趣旨を逸脱することなく、追加のデンドリマーを組み入れることができる。多種のデンドリマーを利用する際には、多種の薬剤も組み入れることができ、互いに複合体形成するデンドリマーの数によって限定されない。

本明細書に使用されるとき、用語「ＰＡＭＡＭデンドリマー」は、ポリ（アミドアミン）デンドリマーを意味し、それは、アミドアミン基本要素を含む異なるコアを含有することがある。それらを作製するための方法は、当業者によって公知であり、概して、中心の起点コアの周りにある樹状のβ−アラニン単位の同心の殻（世代）を生成する、２ステップの反復する反応シークエンスを含む。このＰＡＭＡＭコア殻構造物は、追加される殻（世代）の関数として、線状に直径を成長させる。その間に、表面基が、樹状−分枝形成の数学に従って、各世代で指数関数的に増幅する。それらは、５種の異なるコアタイプと１０個の表面官能基を有する世代Ｇ０〜１０で利用可能である。デンドリマー分枝型ポリマーは、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリエステル、ポリエーテル、ポリリジン、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリペプチドのデンドリマーからなっていてもよい。

一部の実施形態に従って、使用されるＰＡＭＡＭデンドリマーは、世代４のデンドリマーまたはそれを超えるものとすることができ、それらは、その表面官能基に付着したヒドロキシル基を有する。多重腕のＰＥＧポリマーは、スルフヒドリルまたはチオピリジン末端基を保有する２つまたはそれを超える分枝を有する、ポリエチレングリコールを含む。しかし、実施形態は、このクラスに限定されず、スクシンイミジルまたはマレイミド末端など、他の末端基を保有するＰＥＧポリマーを使用することができる。分子量１０ｋＤａから８０ｋＤａのＰＥＧポリマーを使用することができる。

一部の実施形態では、本デンドリマーは、ナノ粒子の形態であり、国際特許公報ＷＯ２００９／０４６４４６に詳細に記載されている。

ＰＡＭＡＭ−ＢＬＺ−９４５の調製
非限定的な例として、以下は、酢酸、２−（２−シクロオクチン−１−イルオキシ）酸、および２−アジド酢酸をリンカーとして使用して、第４世代のヒドロキシル末端ＰＡＭＡＭデンドリマー（ＰＡＭＡＭ−ＯＨ）に、小分子であるＢＬＺ−９４５をコンジュゲートするための合成スキームである。図１Ａ〜１Ｃを参照されたい。

初めに、２−（２−シクロオクチン−１−イルオキシ）酸を使用して、第４世代のヒドロキシル末端ＰＡＭＡＭデンドリマー（ＰＡＭＡＭ−ＯＨ）を、表面上に９つのクリック可能な（ｃｌｉｃｋａｂｌｅ）基を有するクリック可能な二機能性デンドリマー（中間体１）へと官能化する（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅ）（図１Ａ）。ＢＬＺ−９４５を２−アジド酢酸と反応させて、エステル結合を介したアジド官能化中間体を形成する（図１Ｂ）。２−アジドアセチルリンカー上に結果として得られるアジドを、さらに二機能性デンドリマーのクリック可能な基と反応させて、デンドリマー−ＢＬＺ−９４５コンジュゲートを得る（図１Ｃ）。およそ９分子のＢＬＺ−９４５が１分子のデンドリマーにコンジュゲートされたものがある。

上記に記載のスキームは、ＢＬＺ−９４５に限定されない。他の小分子、例えばＷＰ１０６６などのシグナル伝達性転写因子（Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）（ＳＴＡＴ）タンパク質の小分子阻害剤、ならびにミノサイクリンおよびシクロスポリンＡなどの他の小分子を、ＴＡＭ標的化療法のための免疫調節分子として、本デンドリマーにコンジュゲートすることができる。

Ｂ．カップリング剤およびスペーサー
デンドリマー複合体は、デンドリマーまたは多重腕のＰＥＧにコンジュゲートまたは付着している治療的に活性な薬剤または化合物（以降「薬剤」とする）から形成され得る。付加は、薬剤とデンドリマーとの間にジスルフィド架橋を提供する適切なスペーサーを介して起こりうる。本デンドリマー複合体は、体内に見出される還元条件下で、ｉｎ ｖｉｖｏでチオール交換反応によって、薬剤を速やかに放出することが可能である。

本明細書に使用されるときの用語「スペーサー」は、治療的に活性な薬剤をデンドリマーに連結するために使用される組成物を含むことが意図される。スペーサーは、一緒に連結されてポリマーと治療薬剤またはイメージング剤とを架橋する、単一の化学実体かまたは２つもしくはそれを超える化学実体のどちらかとすることができる。スペーサーとしては、スルフヒドリル、チオピリジン、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン、およびカーボネート末端を有する、任意の小さな化学実体、ペプチド、またはポリマーを挙げることができる。

スペーサーは、スルフヒドリル、チオピリジン、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン、およびカーボネート基で終結する化合物のクラスの中から選択することができる。スペーサーは、チオピリジン末端化合物、例えばジチオジピリジン、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエートＬＣ−ＳＰＤＰ、またはスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰを含むことができる。また、スペーサーとしては、ペプチドを挙げることができ、ここで、ペプチドは、線状または環状であり、本質的にはスルフヒドリル基、例えばグルタチオン、ホモシステイン、システイン、およびその誘導体、ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ−ｃｙｓ（ＲＧＤＣ）（配列番号１）、シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ）（ｃ（ＲＧＤｆＣ））（配列番号２）、シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ）（配列番号３）、シクロ（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ｄ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ）（配列番号４）を有する。スペーサーは、メルカプト酸誘導体、例えば３メルカプトプロピオン酸、メルカプト酢酸、４メルカプト酪酸、チオラン−２−オン、６メルカプトヘキサン酸、５メルカプト吉草酸など、および他のメルカプト誘導体、例えば２メルカプトエタノール、および２メルカプトエチルアミンとすることができる。スペーサーは、チオサリチル酸およびその誘導体、（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−アルファ−２−ピリジチオ）トルエン、（３−［２−ピリジチオ（ｐｙｒｉｄｉｔｈｉｏ）］プロピオニルヒドラジドとすることができる。スペーサーは、マレイミド末端を有することができ、ここで、スペーサーは、ポリマーまたは小さな化学実体、例えばビス−マレイミドジエチレングリコールおよびビス−マレイミドトリエチレングリコール、ビス−マレイミドエタン、ビスマレイミドヘキサンを含む。スペーサーは、１，６−ヘキサン−ビス−ビニルスルホンなどのビニルスルホンを含むことができる。スペーサーは、チオグルコースなどのチオグリコシドを含むことができる。スペーサーは、還元タンパク質、例えばウシ血清アルブミンおよびヒト血清アルブミン、ジスルフィド結合を形成することが可能な任意のチオール末端化合物とすることができる。スペーサーとしては、マレイミド、スクシンイミジルおよびチオール末端を有するポリエチレングリコールを挙げることができる。

治療的に活性な薬剤、イメージング剤、および／または標的化部分は、共有結合的に付着しているか、または分子内に分散もしくは被包されているかのどちらかとすることができる。デンドリマーは、好ましくは、カルボキシル、ヒドロキシル、またはアミン末端を有する、世代１０までのＰＡＭＡＭデンドリマーである。ＰＥＧポリマーは、２本またはそれを超える腕および１０ｋＤａから８０ｋＤａの分子量を有する、星型ポリマーである。ＰＥＧポリマーは、スルフヒドリル、チオピリジン、スクシンイミジル、またはマレイミド末端を有する。デンドリマーは、ジスルフィド、エステル、またはアミド結合で終わるスペーサーを介して、標的化部分、イメージング剤、および／または治療薬剤に連結される。

Ｃ．治療薬剤、予防薬剤、および診断薬剤
本明細書に使用されるときの用語「デンドリマー複合体」は、１つまたは複数の治療薬剤、予防薬剤、または診断薬剤とコンジュゲートまたは複合体形成しているデンドリマーを指す。本デンドリマー複合体は、ｉ．ｖ．注射によって投与された際に、正常条件下ではなく病的条件下でのみ血液脳関門（ＢＢＢ）を優先的に横断することができる。好ましくは、薬剤（複数可）は、ＰＡＭＡＭデンドリマーまたは多重腕のＰＥＧに付着またはコンジュゲートしており、それらは、ｉｎ ｖｉｖｏに見出される還元条件下で薬物を細胞内に優先的に放出することが可能である。薬剤に連結された本デンドリマー複合体は、標的化、病的部位での局在化、薬物の放出、およびイメージングの目的を含む、いくつかの機能を実施するために使用することができる。本デンドリマー複合体は、標的化部分を用いるかまたは用いずにタグ付けすることができ、その結果、本デンドリマーと薬剤またはイメージング剤との間のジスルフィド結合が、スペーサーまたはリンカー分子を介して形成される。

代表的な治療薬剤（プロドラッグを含めて）、予防薬剤または診断薬剤は、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、小分子、またはそれらの組合せとすることができる。代表的なオリゴヌクレオチドとしては、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＲＮＡが挙げられる。

用語「化学治療薬剤」は、概して、がん細胞でのＤＮＡ合成または機能に干渉することによって働く、医薬的または治療的に活性な化合物を含む。それらの細胞レベルでの化学的な作用に基づいて、化学治療薬剤は、細胞周期に特異的な薬剤（細胞周期のある種の期の間に有効である）と、細胞周期に非特異的な薬剤（細胞周期の全ての期の間に有効である）とに分類することができる。化学治療薬剤の例としては、アルキル化薬剤、血管新生阻害剤、腫瘍免疫応答の調節剤、アロマターゼ阻害剤、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、抗腫瘍抗生物質、白金化合物、トポイソメラーゼ阻害剤、放射性同位体、放射線増感薬剤、チェックポイント阻害剤、ＰＤ１阻害剤、ＡＰＲＫｉｎａｓｅ阻害剤、植物アルカロイド、糖分解阻害剤、およびそれらのプロドラッグが挙げられる。

脳腫瘍を処置する際に一般に使用される代表的な化学治療剤としては、パクリタキセルなどのタキソール、ＢＣＮＵ、カンプトテシン、ドキシサイクリン、シスプラチン、ならびにそれらの誘導体、類似体およびプロドラッグが挙げられる。

ＰＤ−１阻害剤の例としては、例えば、遺伝学的に操作され、かつヒトＰＤ−１に特異的な完全ヒト型イムノグロブリンＧ４（ＩｇＧ４）モノクローナル抗体である、ＭＤＸ−１１０６、および米国ＦＤＡによって最近承認されたペンブロリズマブが挙げられる。

治療薬剤としては、放射線照射など、異なる治療の効果を増強する薬剤を挙げることができる。本明細書に使用されるとき、用語「放射線照射線量増感剤」は、細胞、細胞の集団または組織に接触した際に、その細胞、細胞の集団、または組織の電離放射線に対する感受性を増加させる、任意の薬剤を意味する。一部の実施形態では、放射線増感剤は、ＤＤＸ３阻害剤、例えば化合物ＲＫ−３３、またはその塩、溶媒化合物、立体異性体、もしくは誘導体である。

治療薬剤としては、脳腫瘍の１つまたは複数の症状を軽減する薬剤が挙げられる。例えば、腫瘍に関連がある腫脹を低減する薬剤が、デンドリマーを介して送達されてもよい。例としては、ステロイドなどの抗炎症薬剤、例えばメチルプレドニゾン、デキサメタゾン、およびフルオシノロンアセトニド、ＣＯＸ−２阻害剤などの非ステロイド系抗炎症薬剤、金化合物抗炎症薬剤、免疫抑制薬剤、サリチル酸系抗炎症薬剤、ラニビズマブ、ミノサイクリン、ならびにラパマイシンが挙げられる。他の抗炎症薬物としては、インドメタシン、アスピリン、アセトアミノフェン、ジクロフェナクナトリウムおよびイブプロフェンなどの非ステロイド系薬物が挙げられる。

ペプチド薬物は、ＴＡＭまたはがん細胞に対して活性な任意の配列とすることができる。例としては、Ｌｙｓ３Ｇｌｙ３Ｓｅｒリンカーを有するペプチド［配列ＹＥＱＤＰＷＧＶＫＷＷＹ（配列番号５）を有するＭ２ｐｅｐ、および配列ＷＥＤＹＱＷＰＶＹＫＧＷ（配列番号６）を有するｓｃＭ２ｐｅｐ］が挙げられ、Ｃ末端のビオチンタグは、Ｅｌｉｍ ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから＞９５％の純度で購入された。ＫＬＡ材料は、以下のように合成し、＞９５％の純度で精製された：Ｍ２ｐｅｐＫＬＡ［ＹＥＱＤＰＷＧＶＫＷＷＹＧＧＧＳ−Ｄ［ＫＬＡＫＬＡＫ］２（配列番号７）］、ｓｃＭ２ｐｅｐＫＬＡ［ＷＥＤＹＱＷＰＶＹＫＧＷＳＧＧＧＳ−Ｄ［ＫＬＡＫＬＡＫ］２（配列番号８）］およびＫＬＡ（Ｄ［ＫＬＡＫＬＡＫ］２（配列番号９）］。

ＴＡＭを標的化する免疫治療薬剤のための例としては、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）受容体阻害剤、例えばＢＬＺ−９４５およびＰＬＸ３３９７、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、例えばＰＤ９８０５９、ＳＴＡＴの小分子阻害剤（例えばＷＰ１０６６）、ミノサイクリン、およびシクロスポリンＡを挙げることができる。

他の例示的な治療薬剤としては、血管拡張剤および抗感染薬剤が挙げられる。抗生物質としては、ベータ−ラクタム類、例えば、ペニシリンおよびアンピシリン、セファロスポリン類、例えば、セフロキシム、セファクロル、セファレキシン、セファドロキシル（ｃｅｐｈｙｄｒｏｘｉｌ）、セフポドキシム（ｃｅｐｆｏｄｏｘｉｍｅ）およびプロキセチル、テトラサイクリン抗生物質類、例えば、ドキシサイクリンおよびミノサイクリン、マクロライド抗生物質類、例えば、アジスロマイシン、エリスロマイシン、ラパマイシンおよびクラリスロマイシン、フルオロキノロン類、例えば、シプロフロキサシン、エンロフロキサシン（ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、オフロキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシンおよびノルフロキサシン、トブラマイシン、コリスチン、またはアズトレオナム、ならびにエリスロマイシン、アジスロマイシン、またはクラリスロマイシンなどの抗炎症活性を有することが公知である抗生物質が挙げられる。抗興奮毒性薬剤として、例えばバルプロ酸、Ｄ−アミノホスホノバレレート、Ｄ−アミノホスホノへプタノエート、バクロフェンなどのグルタメートの形成／放出の阻害剤、およびＮＭＤＡ受容体アンタゴニストなどとしての活性を有する他の化合物もまた、投与することができる。

一部の実施形態では、分子としては、抗体、例えばダクリズマブ、ベバシズマブ［ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）］、ラニビズマブ［ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）］、バシリキシマブ、ラニビズマブ、およびペガプタニブナトリウム、またはＳＮ５０のようなペプチド、およびＮＦのアンタゴニストを挙げることができる。

例示的な診断薬剤としては、常磁性分子、蛍光化合物、磁性分子、ならびに放射性核種、ｘ線イメージング剤、および造影剤が挙げられる。これらはまた、上述のものを用いて標識されているリガンドまたは抗体であってもよいし、または当業者に公知の方法によって検出可能な標識化リガンドもしくは抗体に結合してもよい。

例示的な診断薬剤としては、色素、蛍光色素、近赤外色素、ＳＰＥＣＴイメージング剤、ＰＥＴイメージング剤、および放射性同位体が挙げられる。代表的な色素としては、カルボシアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、ツイカルボシアニン（ｔｈｕｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）およびメロシアニン、ポリメチン、クマリン、ローダミン、キサンテン、フルオレセイン、ホウ素−ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＶｉｖｏＴａｇ−６８０、ＶｉｖｏＴａｇ−Ｓ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ−Ｓ７５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７９０、Ｄｙ６７７、Ｄｙ６７６、Ｄｙ６８２、Ｄｙ７５２、Ｄｙ７８０、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４７、ＨｉＬｙｔｅＦｌｕｏｒ６４７、ＨｉＬｙｔｅＦｌｕｏｒ６８０、ＨｉＬｙｔｅＦｌｕｏｒ７５０、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ８００ＲＳ、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、ＡＤＳ７８０ＷＳ、ＡＤＳ８３０ＷＳ、およびＡＤＳ８３２ＷＳが挙げられる。

代表的なＳＰＥＣＴまたはＰＥＴイメージング剤としては、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、ジアミンジチオール、活性化メルカプトアセチル−グリシル−グリシル−グリシン（ｇｙｌｃｉｎｅ）（ＭＡＧ３）、およびヒドラジノニコチンアミド（ｈｙｄｒａｚｉｄｏｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）（ＨＹＮＩＣ）などのキレート剤が挙げられる。

代表的な同位体としては、Ｔｃ−９４ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｇｄ^３＋、Ｙ−８６、Ｙ−９０、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｃｏ−５５、Ｃｏ−５７、Ｆ−１８、Ｓｃ−４７、Ａｃ−２２５、Ｂｉ−２１３、Ｂｉ−２１２、Ｐｂ−２１２、Ｓｍ−１５３、Ｈｏ−１６６、およびＤｙ−ｉ６６が挙げられる。

標的化部分としては、葉酸、線状または環状のどちらかのＲＧＤペプチド、ＴＡＴペプチド、ＬＨＲＨ、およびＢＨ３が挙げられる。

Ｄ．デバイスおよび製剤
本デンドリマーは、硬膜下、静脈内、羊膜内（ｉｎｔｒａ−ａｍｎｉｏｔｉｃ）、腹腔内、または皮下の経路によって、非経口的に投与することができる。

本明細書で使用される担体または希釈剤は、固形製剤のための固形担体もしくは希釈剤、液体製剤のための液体担体もしくは希釈剤、またはそれらの混合物であってもよい。

液体製剤のために、薬学的に許容される担体は、例えば、水性または非水性の溶液、懸濁物、乳濁液、または油であってもよい。非経口的なビヒクル（皮下、静脈内、動脈内、または組織内注射のための）としては、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンゲル・デキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、ならびに不揮発性油が挙げられる。非水性の溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、例えば、水、アルコール性／水性溶液、シクロデキストリン、乳濁液または懸濁物が挙げられ、食塩水および緩衝化媒体を含む。

本デンドリマーはまた、乳濁液で、例えば油中水で投与することができる。油の例は、石油、動物、植物、または合成由来のもの、例えばピーナツ油、ダイズ油、鉱油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ、ペトロラタム、および鉱物である。非経口的な製剤での使用に適した脂肪酸としては、例えばオレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、適した脂肪酸エステルの例である。

非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、ならびに目的のレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質、ならびに懸濁剤を含むことのできる水性および非水性の滅菌懸濁物、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、ならびに保存剤を含み得る。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充剤、電解質補充剤、例えば、リンゲル・デキストロースをベースにするものなどを挙げることができる。概して、水、食塩水、水性デキストロース、および関連の糖溶液、およびプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが、好適な液体担体であり、特に注射可能な溶液に好適である。

注射可能な組成物に用いるための注射可能な医薬担体は、当業者に周知である［例えばＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｊ．Ｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、フィラデルフィア、ペンシルバニア州、 ＢａｎｋｅｒおよびＣｈａｌｍｅｒｓ編、２３８〜２５０頁（１９８２年）、ならびにＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ、Ｔｒｉｓｓｅｌ、第１５版、６２２〜６３０頁（２００９年）を参照］。

対流強化送達（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）（「ＣＥＤ」）のための製剤は、小分子量の塩（ｓａｌｅｓ）および糖、例えばマンニトールなどの溶液を含む。

ＩＩＩ．処置の方法
Ａ．処置される障害または疾患
１つまたは複数の治療薬剤、予防薬剤、および／または診断薬剤に連結しているデンドリマーを含むデンドリマー複合体組成物は、ミクログリアおよび星状膠細胞を選択的に標的化することができる。有効な血液−脳腫瘍関門（ＢＢＴＢ）貫通および一様な固形腫瘍分布によって、脳腫瘍への治療薬剤の送達が大幅に増強される。ヒドロキシルにより官能化された世代４または６のポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーは、小型のサイズと中性に近い表面電荷とを有し、神経炎症に関連のある細胞に選択的に局在化する。

本明細書に使用されるとき、用語「増殖性疾患」は、がん、ならびに良性および悪性の新形成および過形成などの他の疾患を含む。用語のがんは、ＣＮＳおよび脳のがんを含み、そのようなものとしては、以下に限定されないが、神経膠腫、神経膠芽腫、神経膠肉腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、髄膜腫、髄芽腫、神経節腫、シュワン腫、頭蓋咽頭腫、脊索腫（ｃｏｒｄｏｍａ）および下垂体腫瘍が挙げられる。

腫瘍はまた、脳とは異なる起源のものであってもよい。例えば、腫瘍は、胞巣状横紋筋肉腫、骨がん、乳がん、肛門、肛門管または肛門直腸（ａｎｏｒｅｃｔｕｍ）のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頚部、胆嚢または胸膜のがん、鼻、鼻腔または中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、結腸がん、食道がん、子宮頚がん、消化管カルチノイド、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝がん、肺がん、悪性中皮腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵がん、腹膜、網および腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん（例えば腎細胞癌（ＲＣＣ））、小腸がん、軟組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、および膀胱がんとして生じてもよい。

本デンドリマーは、腫瘍のサイズとタイプ、位置、および他の処置、ならびに送達される薬剤に応じた投薬量で投与される。典型的には、担当医は、種々の要因、例えば年齢、体重、全身の健康状態、食事、性別、投与される化合物、投与経路、および処置されている状態の重症度などを考慮して、各個体被験体を処置するのに用いる組成物の投薬量を決定することになる。概して、投与のタイミングおよび頻度は、所与の処置または診断スケジュールの有効性と、所与の送達系の副作用とのバランスを取るように調整されることになる。例示的な投薬頻度としては、持続注入、単回および多回の投与、例えば毎時、毎日、毎週、毎月、または毎年の投薬などが挙げられる。

投薬レジメンは、脳腫瘍を処置してサイズ、転移、または成長速度を低減するか、または腫脹、痛み、もしくは発作など１つもしくは複数の症状を軽減するのに、充分な任意の量、および任意の長さの時間にわたるものとすることができることが、当業者に理解されよう。医師は、投与する治療の長さおよび量を慣例的に決定する。

Ｂ．補助治療または併用治療
本デンドリマー複合体は、脳腫瘍またはそれに関連する症状を処置することが可能であることが公知である、１つまたは複数の追加的な治療的に活性な薬剤と組み合わせて投与することができる。

例えば、静脈内投与を介してまたは手術中に、本デンドリマーを脳へ投与して、腫瘍の全てまたは一部を除去してもよい。本デンドリマーを使用して、化学治療薬剤、免疫治療薬剤、放射線照射治療を受けている被験体などの補助治療を増強する薬剤を送達してもよく、ここで、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）ヒドロキシル末端デンドリマーは、脳の増殖性疾患のＤＤＸ３の活性を抑制または阻害するのに有効な量で、少なくとも１つの放射線増感薬剤に共有結合的に連結している。

化学治療に加えて、外科的な介入および放射線照射治療もＣＮＳのがんの処置に使用されることが、当業者によって理解されよう。放射線照射治療は、本明細書に使用されるとき、電離放射線を被験体中のがんの位置の近くで被験体に投与することを意味する。一部実施形態では、放射線増感薬剤は、２回またはそれを超える用量で投与され、その後、電離放射線が、被験体中のがんの位置の近くで被験体に投与される。さらなる実施形態では、放射線増感薬剤の投与とそれに続く電離放射線照射とを、２つまたはそれを超えるサイクルで繰り返すことができる。

典型的には、電離放射線の線量は、腫瘍のサイズおよび位置によって様々であるが、線量は、０．１Ｇｙから約３０Ｇｙの範囲に、好ましくは５Ｇｙから約２５Ｇｙの範囲にある。

一部の実施形態では、電離放射線照射は、定位焼灼的放射線治療（ｓｔｅｒｏｔａｃｔｉｃ ａｂｌａｔｉｖｅ ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）（ＳＡＢＲ）または体幹部定位放射線照射治療（ＳＢＲＴ）の形態である。

Ｃ．イメージングおよび診断
本デンドリマーはまた、被験体の増殖性疾患に関連するＴＡＭをイメージングするための方法において有用である。本デンドリマーは、少なくとも１つの検出可能な部分に連結され、被験体のＴＡＭを検出するために有効な量で被験体に静脈内で投与される。

本デンドリマー組成物は、セラノスティクス（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ）の目的で製剤化することができる。言い換えれば、本デンドリマー組成物は、少なくとも１つの生物学的に活性な薬剤および少なくとも１つの検出可能な部分を含む、多種の組成物を含むことができる。場合によっては、その少なくとも１つの生物学的に活性な薬剤および少なくとも１つの検出可能な部分は、同じ分子実体とすることができる。そのため、デンドリマー組成物を使用して、被験体の体内の増殖性疾患または腫瘍を検出し、同時に、生物学的に活性な薬剤を腫瘍またはＴＡＭに送達することができる。

本発明は、以下の非制限的な例を参照することにより、さらに理解されよう。

（実施例１：ラットにおける神経膠腫への蛍光標識デンドリマーの投与）
材料および方法
以下の薬剤を購入した。ヒドロキシル末端エチレンジアミノコアＰＡＭＡＭデンドリマー（特段に指定のない限り、通してデンドリマーと称する）（Ｄｅｎｄｒｉｔｅｃｈ、ミッドランド、ミシガン州）、メタノール（ＨＰＬＣグレード）、ＤＭＦ（ＨＰＬＣグレード）、ステンレス鋼ビーズ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）、およびシアニン５（Ｃｙ５）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）。共焦点顕微鏡用：核対比染色、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ジヒドロクロライド（ＤＡＰＩ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州）；蛍光封入剤（Ｄａｋｏ、サンタクララ、カリフォルニア州）；ウサギ抗Ｉｂａ１（Ｗａｋｏ、大阪、日本）；Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ由来レクチン（ＢＳＩ−Ｂ４）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）；抗ＧＦＡＰ４８８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、カリフォルニア州）；フルオレセインイソチオシアネート−デキストラン（ＦＩＴＣ−デキストラン）、平均分子量７０，０００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）。

デンドリマーＣｙ５（Ｄ−Ｃｙ５）コンジュゲートの合成
Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、１０巻、４５６０頁（２０１３年）の方法に準じて、２つのステップを経てＤ−Ｃｙ５を調製した。簡単に述べれば、アミン基を用いて、ヒドロキシル末端ＰＡＭＡＭデンドリマーを表面修飾して、二機能性デンドリマーを作製した。６−（Ｆｍｏｃ−アミノ）カプロン酸を使用して、Ｆｍｏｃ保護された二機能性デンドリマー中間体を生成し、それをピペリジン／ＤＭＦ混合物中に再溶解することによって最後には脱保護した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドモノエステルを有するＣｙ５色素を、二機能性デンドリマーの表面上のアミン基と反応した。「粗」生成物を、透析によってさらに広範囲に精製した。最終的なＤ−Ｃｙ５コンジュゲートを、^１Ｈ ＮＭＲ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、およびゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して特徴付けた。コンジュゲートを固体粉末として−２０℃で保存し、投与日に、０．９％滅菌ＮａＣｌを用いて１０ｍｇ／ｍＬに再構成した。

腫瘍の接種
各１２５〜１７５ｇの重さの雌のＦｉｓｃｈｅｒ３４４ラット（Ｈａｒｌａｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、インディアナ、インディアナ州）を、標準施設に収容し、食餌および水に自由にアクセスさせた。Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、２０１０年、６６巻、５３０〜７頁；Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、２０１０年、１１３巻、２１０〜７頁に記載されているように、頭蓋内への９Ｌ神経膠肉腫の移植を実施した。簡単に述べれば、９Ｌ神経膠肉腫（脳腫瘍研究センター、ＵＣＳＦ、サンフランシスコ、カリフォルニア州から入手）を、Ｆ３４４の側腹で維持した。腫瘍を担体動物の側腹から外科的に摘出し、１ｍｍ^３片に切断し、頭蓋内移植のために氷上の０．９％滅菌ＮａＣｌ中に置いた。ラットを麻酔して、正中線の頭皮切開を行い、矢状縫合および冠状縫合を特定した。頭蓋穿孔を、矢状縫合から３ｍｍ横方向かつ冠状縫合から５ｍｍ後方に行った。硬膜を切開し、外科用顕微鏡と穏やかな吸引とを使用して、小さな皮質領域を切除した。腫瘍片を切除窩に置き、外科用ステープラーを使用して皮膚を閉じた。全ての動物を、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのポリシーおよびガイドラインに従って処置した。

定量および免疫蛍光のためのＤ−Ｃｙ５投与
尾静脈注射のために、動物を固定し、その尾を加温して血管拡張を誘発した。３ｍｇ／３００μＬのデンドリマー−Ｃｙ５溶液を、動物１頭当たりに投与した。デンドリマーおよびデキストランの分布をイメージングするために、２ｍｇのＤ−Ｃｙ５および２ｍｇのデキストラン−ＦＩＴＣの３００μＬ中０．９％ＮａＣｌ溶液を用いて、３頭の動物を共注射した。

腫瘍脳でのデンドリマーの蓄積の動力学を検討するため、腫瘍を接種した２７頭のラット内に、平均腫瘍サイズが直径６ｍｍになった際に、Ｄ−Ｃｙ５を注射し、次いで、定時点（１５分、１時間、４時間、８時間、２４時間、および４８時間）で動物を屠殺した。磁気共鳴イメージングを使用して、頭蓋内の腫瘍サイズを測定した。心臓穿刺を通じて血液を抜き取り、直ちに遠心分離して血漿を収集した。脳を採取し、蛍光分光分析ベースの定量のためにドライアイス上で急速冷凍するか、または免疫蛍光のために４％ホルマリン溶液中に置いた。

デンドリマーの細胞取込みを検討するため、腫瘍を接種した３頭のラットおよび正常な３頭のラットに、Ｄ−Ｃｙ５注射を実施し、注射から２４時間後に動物を屠殺した。脳を採取し、免疫蛍光研究のために４％ホルマリン中に置いた。

血漿および全身の器官でのデンドリマーの薬物動態および生体内分布を検討するため、尿収集用の代謝ケージに置いた１５頭の腫瘍接種ラットに、Ｄ−Ｃｙ５を注射し、続いて、定時点（１５分、１時間、４時間、８時間、２４時間、および４８時間）で動物を安楽死させた。器官を採取し、蛍光分光分析ベースの定量のためにドライアイス上で急速冷凍するか、または免疫蛍光のために４％ホルマリン中に置いた。

蛍光分光分析
Ｄ−Ｃｙ５コンジュゲートの蛍光ベースの定量は、Ｌｅｓｎｉａｋ、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．、２０１３年１２月２日、１０巻（１２号）：４５６０〜７１頁のプロトコールに準じた。簡単に述べれば、ホモジナイザー（ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＬＴ、Ｇｉａｇｅｎ）を使用して、２ｍＬのＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブ中で、１００〜１５０ｍｇの凍結組織を１ｍＬのメタノール中でホモジナイズし、続いて超音波破砕した。懸濁物を１００ｍｇ／ｍｌに希釈して、１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間、遠心分離した。得られた上清を蛍光分光分析に供した。重要なことに、以前の研究では、Ｄ−Ｃｙ５が血漿中で安定であり、コンジュゲートされたＣｙ５を認めうるほど放出することなく、無傷の組織から回収することができたことが示されていた。

脳組織については、腫瘍の正確な解剖を実施し、腫瘍周囲の領域を、腫瘍の解剖平面から最長１ｍｍまで離れたものと規定した。対側半球では、周囲の白質領域と共に１００ｍｇの尾状核／被殻を解剖して、解析に使用した。血漿および尿の試料については、１００μＬの血漿および尿の試料を９００μＬのリン酸緩衝液（０．１Ｍ）と混合して、蛍光分光分析によって解析した。

Ｄ−Ｃｙ５コンジュゲートおよび組織抽出物から得たものの蛍光スペクトルを、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＲＦ−５３０１分光蛍光光度計（京都、日本）を使用して記録した。Ｄ−Ｃｙ５の較正曲線を各実験後に構築し、この構築では、異なるスリット幅の下で、６４５ｎｍの励起波長を用いて６５０ｎｍから７２０ｎｍまでのスペクトルを記録した後、６６２ｎｍの最大発光波長を使用した。Ｄ−Ｃｙ５の濃度をメタノールまたはリン酸緩衝液（０．１Ｍ）中、１ｎｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬまでの範囲の溶液で測定した。異なる試料セットの観察された蛍光レベルに基づき、スリット幅を選択した。低レベルのＤ−Ｃｙ５を有する生体試料（すなわち脳、肺、心臓）には、励起および発光スリット幅を１０に設定し、高レベルのＤ−Ｃｙ５を有する生体試料（すなわち尿および腎臓）には、励起および発光スリット幅を３に設定した。残りの生体試料には、励起スリット幅５および発光スリット幅１０を使用した。全ての較正曲線が、Ｒ^２約０．９９を伴う直線性を示した。組織の自己蛍光の原因を説明するために、Ｄ−Ｃｙ５を注射しない健康なラットおよび腫瘍を接種したラットの組織により記録された蛍光を、Ｄ−Ｃｙ５を注射した組織の試料により観察された値から差し引いた。

脳でのＤ−Ｃｙ５コンジュゲートの濃度を、組織ｇ当たりのμｇで表した。他の器官でのＤ−Ｃｙ５コンジュゲートの濃度を、組織ｇ当たりの注射用量の百分率（％）で、または器官に対する注射用量の％で表した。尿および血液中のＤ−Ｃｙ５コンジュゲートの濃度を、ｍｌ当たりの注射用量の％、または尿もしくは血漿の総量中の注射用量の％で表した。総血漿濃度を、動物の重さに基づいて計算した（Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ．、１９８５年、２６巻、７２〜６頁）。脳および血漿の定量データを解析して、曲線下面積（ＡＵＣ）と、血清に対する脳の比率とを計算した。

脳腫瘍での浸透定数（Ｋ_ｉｎ）および分布の初期体積（Ｖ_ｉ）を計算した（Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）、２０１３年、９巻、１１１〜２１頁；Ｊ． Ｃｅｒｅｂ． Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．、１９８３年、３巻、８〜３２頁）。血清に対する脳の比率と、血清濃度（血清（ｔ））に対する血清の曲線下面積（ＡＵＣ_（血清）（ｔ））とを、各時点について計算し、以下の式に基づいてＫ_ｉｎおよびＶ_ｉを得るために線形回帰分析を実施した。

脳の３つ全ての領域について、多時点回帰分析（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｉｍｅ−ｐｏｉｎｔ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、それぞれ対側半球、腫瘍周囲、および腫瘍領域に関して０．９８、０．９９、および０．９６に等しいＲ^２を有した、良好な直線性を示した（図３Ａ）。

免疫蛍光
新鮮に採取した組織を、４％ホルマリンで２４時間固定した後、凍結切削の前にスクロース溶液の勾配に供した。次いで、Ｌｅｉｃａ ＣＭ１９０５クライオスタットを使用して、組織を横方向に３０μｍ厚の切片とした。ＤＡＰＩ（核）、ミクログリア／マクロファージに対するウサギ抗Ｉｂａ１抗体、およびヤギ抗−ウサギ５９５二次抗体を用いて、切片を染色した。いくつかの切片は、内皮細胞染色用のイソレクチンで染色した。次いで、共焦点ＬＳＭ７１０顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ；ハートフォードシャー、イギリス）を使用して、５×、２０×、４０×、および６３×の倍率下で切片をイメージングした。腫瘍を接種した脳の各切片については、画像を腫瘍、腫瘍境界、および対側半球について取得した。対照（非腫瘍）脳については、１〜３枚の代表的な画像を取得した。注射されていない対照ラット脳に基づき、バックグラウンドの蛍光を避けるように、設定を最適化した。レーザー出力、ピンホール、ゲイン、オフセット、およびデジタルゲインを、各倍率について別々に選択し、全ての試験を通じて一定に保った。

ソフトウェア
画像処理にはＺｅｎソフトウェアを使用し、明るさおよびコントラストのあらゆる補正を、同じ拡大画像を通じて一定に保った。Ｃｙ５チャネル上では、補正を行わなかった。細胞の計数、共局在、およびミクログリアの体積に対する表面の比率の測定には、Ｉｍａｒｉｓソフトウェアを使用した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ２０１０およびＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ４．０を、薬物動態試験に関連する全ての計算、曲線フィッティング、および図のプロットに使用した。

細胞の計数および共局在
ミクログリア／マクロファージの細胞の計数のため、２０×、１３×１３タイルの走査画像を解析し、領域当たり３〜５枚の切片を解析した。機能「ｓｐｏｔｓ」を使用して、Ｉｂａ１＋ミクログリア／マクロファージを特定した。４．１５μｍの直径の閾値を設定して、ミクログリア細胞よりも小さな物体を排除し、「Ｑｕａｌｉｔｙ」解析に基づく２６．８０１の強度の閾値を設定して、バックグラウンドのシグナルを排除した。

共局在を検討するため、４０×、４×４タイルの走査画像を使用し、領域当たり３〜５枚のスライドを解析した。機能「ｓｐｏｔｓ」を使用して、ＤＡＰＩ＋核、Ｉｂａ１＋ミクログリア／マクロファージ、およびＤ−Ｃｙ５＋細胞を特定した。Ｄ−Ｃｙ５取込みのある細胞については、Ｄ−Ｃｙ５およびＤＡＰＩを有したスポットの共局在を計数し、Ｄ−Ｃｙ５取込みのあるミクログリア細胞については、ＤＡＰＩ、抗Ｉｂａ１およびＤ−Ｃｙ５の共局在を有したスポットを計数した。推定された直径を適用して、細胞よりも小さなサイズのスポットを排除し、「Ｑｕａｌｉｔｙ」解析に基づきシグナルの閾値を適用した。Ｄ−Ｃｙ５シグナルおよび細胞シグナルが、互いに隣り合って１０μｍ以内にあるスポットを計数することによって、機能ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅ ｓｐｏｔｓを使用した。

ミクログリア細胞の体積に対する表面積の比率の解析のために、ミクログリアの形態の３Ｄ表現を、共焦点顕微鏡で４０×の倍率を使用し、３×３タイルの走査を用いて、ｚスタックにてｚ方向に１０μｍ延伸させて取得した。機能「ｓｕｒｆａｃｅｓ」を使用して、個々のＩｂａ１＋ミクログリア／マクロファージを、各細胞の表面および体積について解析した。腫瘍領域、同側（非腫瘍領域）、対側領域、および非腫瘍脳を解析し、およそ１５０個の細胞を各領域に含めた。閾値の設定は、細胞の直径に基づいた（Ｎａｔ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００９年、１２巻、８７２〜８頁）。

統計解析
データの統計解析は、スチューデントのｔ検定および一元配置ＡＮＯＶＡの後、必要に応じてＳＰＳＳ １８．０（ＩＢＭ，Ｉｎｃ．）を用いたＧａｍｅｓ−Ｈｏｗｅｌｌ検定によって行った。差はｐ＜０．０５で統計学的に有意であるとみなした。

結果
全身に送達されたＤ−Ｃｙ５の頭蓋内脳腫瘍での薬物動態
図２Ａおよび２Ｂは、腫瘍を保有するげっ歯類の脳の各種領域、すなわち腫瘍、腫瘍周囲、および対側半球におけるＤ−Ｃｙ５の薬物動態解析を示す。４８時間でのＡＵＣを別途に列挙し、腫瘍と対側半球との間に大きな差があることを示した。蛍光共焦点顕微鏡に基づくと、デンドリマーは、全身投与後１５分もの早さで、５ｍｍの腫瘍全体に速やかに蓄積した。

これに対して、Ｄ−Ｃｙ５の全身投与後、腫瘍を接種したげっ歯類の脳の共焦点顕微鏡画像を使用すると、「健康な」対側半球ではデンドリマーが血管を縁取りし、実質には観察されなかった。画像は、腫瘍内でのＤ−Ｃｙ５の均一な分布および血管腔内でのデンドリマーの制限を示す。全身投与の１５分後、デンドリマーは、頭蓋内腫瘍実質の全体を通じて分散した。この分布は、腫瘍実質の不均一性による影響を受けなかった。この時点で、認めうるほどの細胞取込みはなかった。全身へのデンドリマー投与後４時間で、腫瘍領域での細胞外の分布が減少したが、これは、Ｉｂａ１＋炎症性細胞による取込みの増加に伴うものだった。対側半球は、全ての時点で比較的最小限のＤ−Ｃｙ５蛍光を示した。

脳でのデンドリマーの蓄積の動態を評価するために、最近開発されたＤ−Ｃｙ５用の蛍光ベースの準定量的な方法を使用した。近ＩＲのＣｙ５の波長を使用することで、組織の自己蛍光の問題が克服される。この方法の高い感度（０．１ｎｇ／組織ｇ）によって、特異的な解剖学的位置でのデンドリマーの蓄積を検出することが可能になる。共焦点顕微鏡の結果に従えば、デンドリマーは、腫瘍および腫瘍周囲の領域に速やかに蓄積し、８時間でピーク濃度を生じた。図３Ａを参照されたい。デンドリマーは、最初の全身注射から４８時間後に、腫瘍から約０．０１μｇ／ｇ／時間の速さで、および腫瘍周囲の領域から約０．００７μｇ／ｇ／時間の速さで、徐々に取り除かれ、０．２μｇ／組織ｇの濃度に達した。対側半球では、また、デンドリマーの蓄積が８時間で、腫瘍領域で見出されたものの約１／８の濃度でピークに達した。２４時間では、痕跡量のデンドリマー（０．０３μｇ／ｇ）を対側半球に検出され得、腫瘍では約１４倍高い蓄積が観察された。４８時間では、ＡＵＣが、対側半球に比べて腫瘍領域で１０倍高く、このことは、腫瘍に対するデンドリマーの曝露全体が有意に（ｐ＜０．０５）高かったことを示す。腫瘍および腫瘍周囲の領域でデンドリマーが高くかつ選択的に保持されたことは、デンドリマーの投与の２４時間後に星状膠細胞について染色した低倍率の腫瘍の画像で可視化された。

脈管構造およびＢＢＴＢの破綻の量は、腫瘍コアと、薬物の蓄積に重要な役割を担うことがある腫瘍境界との間で、大きく異なることが実証されている。そのため、腫瘍と腫瘍周囲の領域との間での脈管構造の違いと、したがってそれらの間での灌流を調べるために、血管内皮細胞を染色した。予想通り、腫瘍周囲の領域および腫瘍境界は、腫瘍コアよりも劇的に稠密な脈管構造を示した。しかし、デンドリマーの分布は、腫瘍において一様であるようであった。

腫瘍でのデンドリマーの貫通の動態をさらに理解するために、腫瘍、腫瘍周囲の領域、および対側半球における浸透定数（Ｋ_ｉｎ）および分布の初期体積（Ｖ_ｉ）を計算した。図３Ｂを参照されたい。Ｋ_ｉｎは、血液から脳へのデンドリマーの流入を表し、腫瘍および腫瘍周囲の領域では、対側半球に比べて１０倍高く、このことは、デンドリマーの貫通の増加、および腫瘍組織の浸透性と灌流の増加を示している。Ｖ_ｉは、血漿との急速平衡における脳コンパートメントの体積を示し、腫瘍と腫瘍周囲の領域との間で有意に異なっていたが、このことは、腫瘍コアにおいてさらに大きな体積での急速平衡があることを示す。腫瘍異種移植片では、低酸素の腫瘍コアは、腫瘍境界に比べて血管の浸透性を増加し、神経膠芽腫で特異的に、腫瘍コアと腫瘍周囲の領域との間でＢＢＴＢの形態の明白な差異が示されており、これらは、腫瘍周囲の領域とは対照的に、腫瘍コアで速やかな分布に寄与し得る。

Ｄ−Ｃｙ５の生体内分布：頭蓋内脳腫瘍のイメージングベースの試験
腫瘍および腫瘍周囲の領域でのデンドリマーの分布を検討するために、Ｄ−Ｃｙ５を、デンドリマーのおよそ２倍のサイズを有する直鎖デキストラン−ＦＩＴＣ（７０ｋＤａ、半径約６．５ｎｍ）と共注射した。ＤＡＰＩ陽性の核の密度の増加に基づき、腫瘍を明確に特定した。図４Ａおよび４Ｂを参照されたい。各時点で、腫瘍領域全体を通じて均一に分布されたデンドリマーと、シグナルの著しい減少とが、注射の２４時間後に観察された。図５を参照されたい。それに対し、ＦＩＴＣチャネルでのバックグラウンドシグナルを見るために、レーザー出力およびゲイン設定を増加させた時でさえ、デキストラン−ＦＩＴＣ由来のシグナルは、腫瘍境界の周囲に観察されたにすぎず、腫瘍コアにはなかった。さらに高い倍率の画像では、デンドリマーが速やかに分布し、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を描出することが示され、分布の細網パターンと細胞での緩やかな蓄積とを生じた。一方、デキストランは、細胞外マトリックスにわたって制限された分布を示したが、注射の１５分後に血管腔に高いシグナルが見ることができた。のちの時点で、制限された量のデキストランが組織で保持されたが、これは、おそらくは細胞取込みが低いことに起因する。

腫瘍に関連するミクログリア／マクロファージおよび細胞のデンドリマー取込みの特徴付け
神経膠腫は、ミクログリア／マクロファージの動員および増殖を促進する化学誘引物質および成長因子を生成する。ヒト神経膠芽腫では、細胞の３０％までが、腫瘍に関連するマクロファージである可能性がある。９Ｌ腫瘍モデルの各種の解剖学的位置におけるミクログリアの分布を決定したが、これにより、この腫瘍モデル中のＴＡＭの濃度が、ヒトの神経膠芽腫に見られるものと同等であることが示唆された。ｍｍ^２当たりのミクログリア集団は、対側半球に比べて腫瘍内で９倍高く、対側半球に比べて同側半球の健康な脳組織で２．５倍高かった。

ＴＡＭは、腫瘍微小環境中で再プログラミングされ、交互になった免疫抑制性のＭ２表現型を導く。しかし、多くの研究が、神経膠腫でＴＡＭの貪食活性が持続されることを示唆している。ＴＡＭの貪食活性は、ナノ粒子の取込みに鍵となる役割を果たすことが示唆されている。ミクログリア／マクロファージが休止期から活性化形態へと変化する際に、それらの形態は、分枝状から、貪食活性の増加を表すアメーバ状へと改変される。９Ｌ腫瘍モデルにおけるＴＡＭの形態を評価するために、各種の解剖学的位置における免疫細胞集団（Ｉｂａ１＋）の体積に対する表面積の比率を特徴付けた。体積に対する表面積の比率（Ｓ対Ｖ比）を、ミクログリアの活性化の「尺度」と考える。結果は、腫瘍内および腫瘍の周囲のミクログリア／マクロファージが、対側半球および健康な脳の免疫細胞に比較して、有意に（ｐ＜０．００１）低いＳ対Ｖ比を有したことを示す。腫瘍に関連するミクログリアについての平均Ｓ対Ｖ比は、１よりも低く、これはそれらのアメーバ状態および貪食活性を示す。腫瘍、同側半球および対側半球におけるｍｍ^２面積当たりのＩｂａ１＋ミクログリア／マクロファージ集団の画像ベースの細胞の計数値。健康な脳、腫瘍を接種した脳の対側半球および同側半球、ならびに腫瘍組織におけるミクログリア／マクロファージの活性化および貪食活性の指標としての、ミクログリア細胞の体積に対する表面積の比率の画像ベースの測定。１＋細胞のＤ−Ｃｙ５とＩｂａ１＋ＴＡＭとの共局在、およびＤ−Ｃｙ５とＤＡＰＩ＋細胞との共局在。結果を、総ＤＡＰＩ＋細胞集団のパーセントとして表す。ミクログリア取込みと細胞取込みとの間に、統計学的有意性はなかった。統計^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．００１統計解析は、３〜５枚の異なる切片に基づく。図４Ａおよび４Ｂを参照されたい。

Ｉｂａ１＋ミクログリア／マクロファージ細胞におけるＤ−Ｃｙ５の局在を、次いで計算した。全身投与後２４時間で、デンドリマーは、Ｉｂａ１＋ＴＡＭに局在した。Ｉｂａ１＋ミクログリア／マクロファージを計算すると、総腫瘍細胞集団の３８％を構成していた（図５）。共局在によって、ＴＡＭ集団のおよそ半分が、デンドリマーを取り込んだこと、およびデンドリマー陽性細胞の総集団が、デンドリマー陽性Ｉｂａ１＋ミクログリア／マクロファージの集団とは定量的に差がなかったことが示された。したがって、デンドリマーは、腫瘍に関連するマクロファージによってほぼ排他的に、腫瘍組織内に取り込まれたのに対して、腫瘍領域内の他の細胞は、測定可能なデンドリマーの取込みがなかった。腫瘍境界（ＤＡＰＩ染色に基づき腫瘍端から１ｍｍ）では、デンドリマー陽性のミクログリア／マクロファージが、実質的に低減し、このことは、腫瘍コアと腫瘍境界との間の生物学的な過程の差を反映している。デンドリマーは、同側の非腫瘍領域にも対側半球にも存在しなかった。

投与後２４時間のＤ−Ｃｙ５の細胞局在解析を、Ｉｂａ−１＋細胞のＤ−Ｃｙ５とＩｂａ１＋ＴＡＭとの共局在、およびＤ−Ｃｙ５とＤＡＰＩ＋細胞との共局在の画像ベースの測定を使用して実施した。結果を、総ＤＡＰＩ＋細胞集団のパーセントとして表す。ミクログリア取込みと細胞取込みとの間に、統計学的有意性はない。９Ｌ神経膠肉腫を接種した脳の各種の解剖学的位置の高倍率（４０×）の蛍光共焦点イメージング。

Ｄ−Ｃｙ５の全身生体内分布
２４時間の全身投与後、抽出したＤ−Ｃｙ５の蛍光定量では、デンドリマーの５６％が尿を通じて排出されたのに対し、３２％が腎臓に残ったことが示唆された。これは、これと同じ時点で血清レベルが低いこと（０．６６％、図６Ａ）とよく相関する。２４時間の全身投与後、デンドリマーの２．５％のみが、他の主要器官に蓄積された。これらのデンドリマーの１．５％が肝臓および脾臓に保持され、このことは、細網内皮系（ＲＥＳ）による排除を表す。痕跡量が、脳、肺、および心臓に蓄積した。

より良く動態を理解するために、血清および主要器官のデンドリマー濃度を、時間をわたり測定した（図６Ｂ）。腎臓は、２４時間まで、選択した全ての時点で蓄積の増加を示した。全身投与から４８時間後、腎臓のデンドリマーの量は、減少し始めた。デンドリマーの血清中レベルは、速やかに減少し、全身注射の１５分後に注射用量の４％のみが観察された（図８Ａ）。

図６Ａは、Ｄ−Ｃｙ５投与の２４時間後の９Ｌ神経膠肉腫のげっ歯類モデルの主要器官（脳、肝臓、肺、脾臓、心臓、および腎臓）、血清および尿中の、Ｄ−Ｃｙ５の蛍光ベースの定量を示す。生体内分布を、器官当たりの注射用量のパーセントで表す（挿入されたパネル）：腎臓、尿、および他の器官でのＤ−Ｃｙ５の蓄積。（６Ｂ）脾臓、肝臓、腎臓および血清中のＤ−Ｃｙ５の時間依存的な濃度。濃度を、組織ｇ当たりの注射用量のパーセントで表す。（５７Ｃ）Ｄ−Ｃｙ５の血漿中薬物動態の蛍光ベースの定量。

腎の蓄積および分布
腎系でデンドリマーが高濃度であったため、蓄積部位を評価するために、腎臓での分布の試験を行った。蛍光顕微鏡に基づけば、デンドリマーは腎皮質に蓄積した。デンドリマーは、管周囲の線維芽細胞を染色する抗ＧＦＡＰ抗体と共局在した。糸球体では、デンドリマーの存在が観察されなかった。健康なまたは腫瘍を保有したラットの間で、腎臓を通じたクリアランスについて有意差はなかった。

まとめおよび結論
悪性の神経膠腫は、最も一般的な原発性脳腫瘍であり、他のどの腫瘍よりも多くの年数の寿命を失わせる原因となる。前臨床および臨床試験中にある多数の従来型の小分子の化学治療薬物が、全身投与後のその低い蓄積と、腫瘍からの速やかなクリアランスのために、疾患の自然歴に強力な影響を与えることができない。

４８時間で、脳腫瘍でのデンドリマーの蓄積は、対側半球よりも１１倍高い。この比率は、他の非標的化型のナノ粒子と比べて突出しており、能動的に標的化された磁性ナノ粒子に匹敵する。重要なことに、腫瘍周囲の領域にも高い保持が観察された。神経膠芽腫細胞は、高度に浸潤性であり、無傷の血液脳関門を含む解剖学的な位置に見出すことが可能であった。そのため、腫瘍周囲の領域で高い保持を達成することは、有効な治療ビヒクルの設計のために際立って重要である。短い循環半減期と組み合わせて腫瘍および腫瘍周囲の領域でデンドリマーを選択的に保持することは、オフターゲット効果を制限しつつ化学治療剤の特異的な送達を可能にする。

（実施例２：神経膠芽腫を処置するための治療ビヒクルとしての、世代６のヒドロキシル末端ＰＡＭＡＭデンドリマー）
材料および方法
材料および方法は、世代４および６の両方のヒドロキシル末端ＰＡＭＡＭデンドリマーを利用したことを除いて、実施例１に記載された通りである。

腫瘍脳でのデンドリマーの蓄積の動力学を検討するため、腫瘍を接種したラット内に、平均腫瘍サイズが直径６ｍｍになった際に、デンドリマーを注射し、次いで、各種の時点で動物を屠殺した。

結果
化学治療剤の有効性は、腫瘍での蓄積量に直接的に関連する。世代４から世代６までデンドリマーサイズを増やすことによって、そのζ−電位に有意に影響を与えることなく、その流体力学的径は、約４．３ｎｍから約６．７ｎｍに増えた（表１）。ＰＢＳ中、ｐＨ７．４、室温で動的光散乱法を使用して、流体力学的径（サイズ）および表面電荷（ζ−電位）を測定した。分子量は、供給業者によって提供されたものである。

実施例１は、Ｇ４デンドリマーが、９Ｌ神経膠肉腫を接種したラットへＤ−Ｃｙ５投与の２４時間後に全身投与された際に、選択的にＴＡＭに蓄積することを示す。しかし、サイズの増加によって、Ｇ６デンドリマーは、腎濾過に起因する速やかなクリアランスを回避し、血中でさらに長く循環することが可能となり、このことで、さらに良好な局在と保持とが可能になった。Ｇ６デンドリマーは、Ｇ４デンドリマーよりも高い血清濃度と延長された血清中半減期とを示し、これらは、Ｇ６デンドリマーの腫瘍へのさらに高い蓄積と標的化に寄与した。

図７Ａ〜７Ｃは、腫瘍を保有した脳でのＧ６とＧ４デンドリマーとの間の蓄積（デンドリマーμｇ／脳組織ｇ）を時間の関数として比較した（図７Ａ）グラフである。腫瘍／腫瘍周囲のＧ４デンドリマーの蓄積は、注射後８時間頃にピークとなり、徐々に減少し、一方、腫瘍／腫瘍周囲のＧ６デンドリマーの濃度は、継続して増加した。４８時間で、Ｇ６の濃度は、腫瘍中のＧ４デンドリマー濃度のほぼ１００倍になった。Ｇ６デンドリマーを示す曲線下面積（ＡＵＣ）プロット（図７Ｂ）は、４８時間以内に、Ｇ６デンドリマーのほぼ１００倍の脳腫瘍曝露を有する。

脳のデンドリマー濃度を血清中のデンドリマー濃度によって正規化した際に、血清に対する脳の比率は、脳標的化能力の指標である。Ｇ６デンドリマーは、全ての時点で、Ｇ４デンドリマーよりも高い腫瘍標的化能力を示した（図６Ｃ）。デンドリマー濃度を、血清ミリリットル当たりの総注射用量の百分率として示した。Ｇ４デンドリマーでは、腎臓は、最も多くのデンドリマーの蓄積（２０％〜３０％）を有し、各種時点で肝臓および脾臓でのデンドリマーの蓄積（約０．３％）よりも有意に高かった。Ｇ６デンドリマーでは、サイズの増加によって、腎濾過および腎臓への蓄積が大きく減少した。Ｇ６デンドリマーの腎臓濃度は、Ｇ４デンドリマーの１／１０未満であり（約１％）、４８時間から開始する腎臓からのクリアランスの証拠を示し始めた。Ｇ６デンドリマーの肝臓への蓄積は、Ｇ４デンドリマーと同様であったが、一方で、脾臓は、約５倍高い蓄積を示し、これは単球による取込みが増加したことに起因する可能性がある。この高い血清中濃度は、Ｇ６デンドリマーが血液−脳腫瘍関門を横断して拡散し、Ｇ４デンドリマーに比べて１００倍高い濃度とＡＵＣで腫瘍に蓄積（４８時間で）（図７Ｂ）しながら、より良好に腫瘍を標的化する推進力をもたらす。

高頻度での神経膠芽腫の再発は、侵襲性の高い処置を生き残る個々の細胞から生じる。この理由から、どんな治療ビヒクルでもあらゆる腫瘍細胞に行き届くことを可能にすることが重要である。最近のナノ技術分野の研究は、有効性のための必要条件として、腫瘍組織全体にわたりナノ粒子が効率よく分布されることの重要性を示している。これらの研究の多くは、１０〜５０ｎｍの間のサイズ域を有するナノ粒子が、腫瘍内へ投与された際に、固形腫瘍を通じて一様に分布することができたことを明らかにした。１００ｎｍ未満のサイズを有する大きなナノ粒子であるほど、腫瘍ベッド（ｔｕｍｏｒ ｂｅｄ）全体に均一に分布する可能性が低くなるが、これは、線維性組織には、血管が存在せず、がん細胞巣の間で中に織り混ざって、分子の均一な分布に対する拡散障壁を形成するからである。しかし、ナノ粒子が均一に分布するには、それらが何ら妨害されることなく脈管構造から一様に血管外遊出することも必要とされる。頭蓋腫瘍の穿孔および孔のサイズが皮下腫瘍に比較してさらに小さいことを考慮すると、神経膠芽腫の場合、この要件によって、サイズのカットオフの上限が１０ｎｍにさらに減少する。ＢＢＴＢを通じた妨害のない拡散は、７ｎｍの分子を用いて達成されている。

電荷密度はまた、ナノ粒子の貫通にも影響を与える。ナノ粒子は、静電的に派生した結合部位の障壁効果を防止するために、強力な陽イオン性ではなく、中性または僅かに正の電荷を維持することが重要である。その結果、４．３ｎｍの流体力学的径と中性の表面電荷を有したＧ４のＯＨのＰＡＭＡＭデンドリマーは、１５分で脈管間の空間を通じて速やかに分布し、５ｍｍの腫瘍全体を均一に網羅することができる。世代をＧ６に増加させることは、デンドリマーが脳腫瘍で均一に分布する能力を保持するだけではなく、デンドリマーが腫瘍実質から速やかに取り除かれるのを防止する。

Ｇ４およびＧ６デンドリマーを、腫瘍保有ラット内に、尾静脈を通じて静脈内共注射した。脳を固定化し、軸方向に凍結切削した。図８Ａおよび８Ｂを参照されたい。図８Ａおよび８Ｂは、血清および主要器官：腎臓、肝臓、脾臓中のＧ４およびＧ６デンドリマーの濃度を時間の関数として示すグラフである。図８Ａは、Ｇ６デンドリマーがＧ４デンドリマーよりも高い血清中濃度と、延長された血清中半減期とを示し、これらがＧ６デンドリマーの腫瘍へのさらに高い蓄積と標的化に寄与したことを示す。デンドリマー濃度は、血清ミリリットル当たりの総注射用量の百分率として提示された。Ｇ６デンドリマーの肝臓への蓄積は、Ｇ４デンドリマーと同様であったが、一方で、脾臓は、約５倍高い蓄積を示し、これは単球による取込みが増加したことに起因する可能性がある。

Ｇ４デンドリマーは、Ｇ６デンドリマーよりも早い排出速度を有していた。図８Ｂは、Ｇ４デンドリマーでは、腎臓が、最も多くのデンドリマー蓄積（２０％〜３０％）を有し、各種時点で肝臓および脾臓中のデンドリマーの蓄積（約０．３％）よりも有意に高かったことを示した。Ｇ６デンドリマーでは、サイズの増加によって、腎濾過および腎臓への蓄積が大きく減少した。Ｇ６デンドリマーの腎臓中濃度は、Ｇ４デンドリマー（約１％）の１／１０未満であり、４８時間から開始される腎臓からのクリアランスを示し始めた。Ｇ４デンドリマーでは、血管から腫瘍組織への排出は、ｉ．ｖ．注射後直ちに（約１５分）開始し、続いて８時間後に腫瘍からのクリアランスがあった。注射の２４時間後、Ｇ４デンドリマーは、細胞に保持された。Ｇ６デンドリマーでは、腫瘍組織でのデンドリマーの存在は、投与後直ちには観察されなかった。Ｇ６デンドリマーの濃度は、観察期間全体で徐々に増加した。投与後４８時間で、Ｇ６デンドリマーは、腫瘍および腫瘍周囲の領域で最も高い濃度を示した。腫瘍細胞の遊走先端を含む神経膠芽腫でそれらが均一に分布すること、および腫瘍で少なくとも４８時間にわたってそれらが保持されることから、本デンドリマーは治療剤を効率よく送達する場合に望ましいことが確認された。

全身投与時の腫瘍ベッド中にわたる均一な分布に加えて、デンドリマーはまた、正常神経組織への神経膠腫細胞の脈管周囲および神経周囲侵入が深くかつ活動的に生じている腫瘍周囲の領域に、蓄積することができる。様々な技術が、腫瘍周囲の領域の標的化のために適用されている（例えば、ＧＦＡＰ特異的なモノクローナル抗体を使用してナノ粒子の表面特性を改変すること、および磁界を使用して磁性ナノ粒子の蓄積を誘導すること）。デンドリマーについては、何ら改変または標的化リガンドの追加を行うことなく、腫瘍周囲の領域の曲線下面積（ＡＵＣ）は、腫瘍領域のそれの６０％に達し、このことは、デンドリマーが本質的に腫瘍周囲の領域を標的化する能力を示している。

最後に、デンドリマーは、神経炎症性細胞を標的化し、大部分がかつ排他的にＴＡＭに局在し、一方、非腫瘍領域の休止期の分枝状ミクログリアは、デンドリマーを取り込まない。デンドリマーが細網内皮系で低い蓄積量でＴＡＭに特異的に蓄積すること、および循環から速やかにクリアランスされることは、ＴＡＭを標的化する抗神経膠腫治療の送達について固有の利点をもたらす。

本明細書に記載の方法および材料の改変および変形は、当業者に明らかになるものであり、特許請求の範囲によって包含されることを意図するものである。

世代４（Ｇ４）のデンドリマーは、循環から速やかにクリアランスされるものの、速やかにかつ選択的に蓄積し、腫瘍組織に保持される。蛍光定量および高分解能蛍光顕微鏡に基づけば、デンドリマーは、最初の８時間にわたって蓄積し、４８時間では依然として腫瘍に保持される。デンドリマーの世代を４から６まで増やすことによって、その均一な分布とＴＡＭの標的化に影響を及ぼすことなく、腫瘍でのデンドリマーの蓄積、ＡＵＣおよび保持を約１００倍、大幅に増やすことができる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
被験体の増殖性疾患を処置するための方法であって、少なくとも１つの治療薬剤、予防薬剤、または診断薬剤と共有結合的に連結しているかまたは複合体形成しているポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）ヒドロキシル末端デンドリマーを含む組成物を、前記被験体の前記増殖性疾患の１つもしくは複数の症状を抑制もしくは阻害するか、または前記増殖性疾患をイメージングするのに有効な量で前記被験体に全身投与することを含む、方法。
（項目２）
前記デンドリマーが、少なくとも１つの治療薬剤に共有結合的に連結している、世代４〜１０のポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）ヒドロキシル末端デンドリマーである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＰＡＭＡＭデンドリマーが、世代６のＰＡＭＡＭデンドリマーである、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記デンドリマーが、第１の治療薬剤と、治療薬剤、予防薬剤、および診断薬剤からなる群より選択される第２の薬剤とにコンジュゲートしている、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記デンドリマーが、２つの治療薬剤にコンジュゲートしている、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記デンドリマーが、化学治療薬剤および抗炎症薬剤および／または抗興奮毒性薬剤にコンジュゲートしている、項目５に記載の方法。
（項目７）
デンドリマー複合体が、ミクログリアおよび星状膠細胞に局在し、これらを標的化するための治療的に活性な薬剤を含む、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記増殖性疾患が、前記被験体の脳にある、項目１〜７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
治療薬剤にコンジュゲートしている前記デンドリマーが、増殖性障害を軽減するのに有効な量の単位投薬量にある、項目１〜８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記薬剤が、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、小分子、およびそれらの組合せからなる群より選択される、項目１〜９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記薬剤が、アルキル化薬剤、血管新生阻害剤、腫瘍免疫応答の調節剤、アロマターゼ阻害剤、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、抗腫瘍抗生物質、白金化合物、トポイソメラーゼ阻害剤、放射性同位体、放射線増感薬剤、チェックポイント阻害剤、ＰＤ１阻害剤、ＡＰＲキナーゼ阻害剤、植物アルカロイド、糖分解阻害剤、およびそれらのプロドラッグからなる化学治療薬剤の群より選択される、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記薬剤が、タキソール、例えば、パクリタキセル、ＢＣＮＵ、カンプトテシン、ドキシサイクリン、シスプラチン、ならびにそれらの誘導体、類似体およびプロドラッグからなる化学治療薬剤の群より選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記デンドリマーと複合体形成しているかまたは前記デンドリマーにコンジュゲートしている少なくとも１つの薬剤が、腫瘍の１つまたは複数の症状を軽減し、抗炎症薬剤、抗興奮毒性薬剤、免疫抑制薬剤、抗血管新生薬剤、および抗感染薬剤からなる群より選択される薬剤である、項目１〜１２のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記抗炎症薬剤が、ステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症薬剤、金化合物抗炎症薬剤、免疫抑制薬剤、サリチル酸系抗炎症薬剤、ラニビズマブ、ミノサイクリン、およびラパマイシンからなる群より選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記腫瘍の１つまたは複数の症状を軽減する前記薬剤が、抗興奮毒性薬剤としての活性を有する薬剤であり、バルプロ酸、Ｄ−アミノホスホノバレレート、Ｄ−アミノホスホノヘプタノエート、グルタメート形成／放出の阻害剤、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストからなる群より選択され、投与することもできる、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
常磁性分子、蛍光化合物、磁性分子、放射性核種、ｘ線イメージング剤、造影剤、蛍光色素、近赤外色素、ＳＰＥＣＴイメージング剤、ＰＥＴイメージング剤、および放射性同位体からなる群より選択される診断薬剤を含み、前記組成物を個体に投与して、前記個体の前記増殖性障害に関する情報を診断する、項目１〜１５のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
前記色素が、カルボシアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、ツイカルボシアニンおよびメロシアニン、ポリメチン、クマリン、ローダミン、キサンテン、フルオレセイン、ホウ素−ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＶｉｖｏＴａｇ−６８０、ＶｉｖｏＴａｇ−Ｓ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ−Ｓ７５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７９０、Ｄｙ６７７、Ｄｙ６７６、Ｄｙ６８２、Ｄｙ７５２、Ｄｙ７８０、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４７、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ６４７、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ６８０、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ７５０、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ８００ＲＳ、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、ＡＤＳ７８０ＷＳ、ＡＤＳ８３０ＷＳ、およびＡＤＳ８３２ＷＳからなる群より選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ＳＰＥＣＴイメージング剤または前記ＰＥＴイメージング剤が、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、ジアミンジチオール、活性化メルカプトアセチル−グリシル−グリシル−グリシン（ＭＡＧ３）、およびヒドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）を含むキレート剤である、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記放射性同位体が、Ｔｃ−９４ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｇｄ ^３＋ 、Ｙ−８６、Ｙ−９０、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｃｏ−５５、Ｃｏ−５７、Ｆ−１８、Ｓｃ−４７、Ａｃ−２２５、Ｂｉ−２１３、Ｂｉ−２１２、Ｐｂ−２１２、Ｓｍ−１５３、Ｈｏ−１６６、およびＤｙ−ｉ６６からなる群より選択される、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
前記デンドリマーが、標的化部分と複合体形成しているかまたは標的化部分にコンジュゲートしている、項目１〜１９のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
放射線照射治療を受けている被験体の増殖性疾患を処置するための項目１〜２０のいずれかに記載の方法であって、前記被験体の前記増殖性疾患においてＤＤＸ３の活性を抑制または阻害するのに有効な量で、少なくとも１つの放射線増感薬剤に共有結合的に連結しているデンドリマーを、前記被験体に全身投与することを含む、方法。
（項目２２）
前記放射線増感薬剤を２回またはそれを超える用量で投与し、続いて、電離放射線を前記被験体のがんの位置に近接して前記被験体に投与し、任意選択で、前記放射線増感薬剤、続いて前記電離放射線の投与を２つまたはそれを超えるサイクルにわたり繰り返す、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記電離放射線の線量が、０．１Ｇｙから約３０Ｇｙの範囲に、好ましくは５Ｇｙから約２５Ｇｙの範囲にある、項目２１から２２のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
前記放射線が、定位焼灼的放射線治療（ＳＡＢＲ）または体幹部定位放射線治療（ＳＢＲＴ）である、項目２１から２３のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
前記放射線増感薬剤がＲＸ−３３である、項目２１から２４のいずれかに記載の方法。
（項目２６）
前記増殖性疾患が固形がんである、項目１〜２５のいずれかに記載の方法。
（項目２７）
前記がんが、胞巣状横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管または肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頚部、胆嚢または胸膜のがん、鼻、鼻腔または中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、結腸がん、食道がん、子宮頚がん、消化管カルチノイド、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝がん、肺がん、悪性中皮腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵がん、腹膜、網、および腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん（例えば腎細胞癌（ＲＣＣ））、小腸がん、軟組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、および膀胱がんとして生じる、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記増殖性疾患が、神経膠腫、神経膠芽腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、髄膜腫、髄芽腫、神経節腫、シュワン腫、頭蓋咽頭腫、脊索腫および下垂体腫瘍を含む、中枢神経系の新形成、過形成およびがんからなる群より選択される脳がんである、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記がんが神経膠腫である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
デンドリマー組成物が、リポソーム、粒子、懸濁剤、溶体、または乳濁液を用いて製剤化される、項目１〜２９のいずれかに記載の方法。
（項目３１）
前記組成物が、毎日、毎週、隔週、毎月、および隔月からなる群より選択される期間で、前記被験体に投与される、項目１〜３０のいずれかに記載の方法。
（項目３２）
項目１〜３１のいずれかに記載の方法における使用のための製剤。

Claims (32)

1. 被験体の増殖性疾患を処置するための方法であって、少なくとも１つの治療薬剤、予防薬剤、または診断薬剤と共有結合的に連結しているかまたは複合体形成しているポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）ヒドロキシル末端デンドリマーを含む組成物を、前記被験体の前記増殖性疾患の１つもしくは複数の症状を抑制もしくは阻害するか、または前記増殖性疾患をイメージングするのに有効な量で前記被験体に全身投与することを含む、方法。
2. 前記デンドリマーが、少なくとも１つの治療薬剤に共有結合的に連結している、世代４〜１０のポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）ヒドロキシル末端デンドリマーである、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＰＡＭＡＭデンドリマーが、世代６のＰＡＭＡＭデンドリマーである、請求項１に記載の方法。
4. 前記デンドリマーが、第１の治療薬剤と、治療薬剤、予防薬剤、および診断薬剤からなる群より選択される第２の薬剤とにコンジュゲートしている、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 前記デンドリマーが、２つの治療薬剤にコンジュゲートしている、請求項４に記載の方法。
6. 前記デンドリマーが、化学治療薬剤および抗炎症薬剤および／または抗興奮毒性薬剤にコンジュゲートしている、請求項５に記載の方法。
7. デンドリマー複合体が、ミクログリアおよび星状膠細胞に局在し、これらを標的化するための治療的に活性な薬剤を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
8. 前記増殖性疾患が、前記被験体の脳にある、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 治療薬剤にコンジュゲートしている前記デンドリマーが、増殖性障害を軽減するのに有効な量の単位投薬量にある、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 前記薬剤が、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、小分子、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 前記薬剤が、アルキル化薬剤、血管新生阻害剤、腫瘍免疫応答の調節剤、アロマターゼ阻害剤、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、抗腫瘍抗生物質、白金化合物、トポイソメラーゼ阻害剤、放射性同位体、放射線増感薬剤、チェックポイント阻害剤、ＰＤ１阻害剤、ＡＰＲキナーゼ阻害剤、植物アルカロイド、糖分解阻害剤、およびそれらのプロドラッグからなる化学治療薬剤の群より選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記薬剤が、タキソール、例えば、パクリタキセル、ＢＣＮＵ、カンプトテシン、ドキシサイクリン、シスプラチン、ならびにそれらの誘導体、類似体およびプロドラッグからなる化学治療薬剤の群より選択される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記デンドリマーと複合体形成しているかまたは前記デンドリマーにコンジュゲートしている少なくとも１つの薬剤が、腫瘍の１つまたは複数の症状を軽減し、抗炎症薬剤、抗興奮毒性薬剤、免疫抑制薬剤、抗血管新生薬剤、および抗感染薬剤からなる群より選択される薬剤である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 前記抗炎症薬剤が、ステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症薬剤、金化合物抗炎症薬剤、免疫抑制薬剤、サリチル酸系抗炎症薬剤、ラニビズマブ、ミノサイクリン、およびラパマイシンからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記腫瘍の１つまたは複数の症状を軽減する前記薬剤が、抗興奮毒性薬剤としての活性を有する薬剤であり、バルプロ酸、Ｄ−アミノホスホノバレレート、Ｄ−アミノホスホノヘプタノエート、グルタメート形成／放出の阻害剤、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストからなる群より選択され、投与することもできる、請求項１４に記載の方法。
16. 常磁性分子、蛍光化合物、磁性分子、放射性核種、ｘ線イメージング剤、造影剤、蛍光色素、近赤外色素、ＳＰＥＣＴイメージング剤、ＰＥＴイメージング剤、および放射性同位体からなる群より選択される診断薬剤を含み、前記組成物を個体に投与して、前記個体の前記増殖性障害に関する情報を診断する、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
17. 前記色素が、カルボシアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、ツイカルボシアニンおよびメロシアニン、ポリメチン、クマリン、ローダミン、キサンテン、フルオレセイン、ホウ素−ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＶｉｖｏＴａｇ−６８０、ＶｉｖｏＴａｇ−Ｓ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ−Ｓ７５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７９０、Ｄｙ６７７、Ｄｙ６７６、Ｄｙ６８２、Ｄｙ７５２、Ｄｙ７８０、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４７、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ６４７、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ６８０、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ７５０、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ８００ＲＳ、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、ＡＤＳ７８０ＷＳ、ＡＤＳ８３０ＷＳ、およびＡＤＳ８３２ＷＳからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ＳＰＥＣＴイメージング剤または前記ＰＥＴイメージング剤が、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、ジアミンジチオール、活性化メルカプトアセチル−グリシル−グリシル−グリシン（ＭＡＧ３）、およびヒドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）を含むキレート剤である、請求項１６に記載の方法。
19. 前記放射性同位体が、Ｔｃ−９４ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｇｄ^３＋、Ｙ−８６、Ｙ−９０、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｃｏ−５５、Ｃｏ−５７、Ｆ−１８、Ｓｃ−４７、Ａｃ−２２５、Ｂｉ−２１３、Ｂｉ−２１２、Ｐｂ−２１２、Ｓｍ−１５３、Ｈｏ−１６６、およびＤｙ−ｉ６６からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
20. 前記デンドリマーが、標的化部分と複合体形成しているかまたは標的化部分にコンジュゲートしている、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
21. 放射線照射治療を受けている被験体の増殖性疾患を処置するための請求項１〜２０のいずれかに記載の方法であって、前記被験体の前記増殖性疾患においてＤＤＸ３の活性を抑制または阻害するのに有効な量で、少なくとも１つの放射線増感薬剤に共有結合的に連結しているデンドリマーを、前記被験体に全身投与することを含む、方法。
22. 前記放射線増感薬剤を２回またはそれを超える用量で投与し、続いて、電離放射線を前記被験体のがんの位置に近接して前記被験体に投与し、任意選択で、前記放射線増感薬剤、続いて前記電離放射線の投与を２つまたはそれを超えるサイクルにわたり繰り返す、請求項２１に記載の方法。
23. 前記電離放射線の線量が、０．１Ｇｙから約３０Ｇｙの範囲に、好ましくは５Ｇｙから約２５Ｇｙの範囲にある、請求項２１から２２のいずれかに記載の方法。
24. 前記放射線が、定位焼灼的放射線治療（ＳＡＢＲ）または体幹部定位放射線治療（ＳＢＲＴ）である、請求項２１から２３のいずれかに記載の方法。
25. 前記放射線増感薬剤がＲＸ−３３である、請求項２１から２４のいずれかに記載の方法。
26. 前記増殖性疾患が固形がんである、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
27. 前記がんが、胞巣状横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管または肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頚部、胆嚢または胸膜のがん、鼻、鼻腔または中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、結腸がん、食道がん、子宮頚がん、消化管カルチノイド、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝がん、肺がん、悪性中皮腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵がん、腹膜、網、および腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん（例えば腎細胞癌（ＲＣＣ））、小腸がん、軟組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、および膀胱がんとして生じる、請求項２６に記載の方法。
28. 前記増殖性疾患が、神経膠腫、神経膠芽腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、髄膜腫、髄芽腫、神経節腫、シュワン腫、頭蓋咽頭腫、脊索腫および下垂体腫瘍を含む、中枢神経系の新形成、過形成およびがんからなる群より選択される脳がんである、請求項２６に記載の方法。
29. 前記がんが神経膠腫である、請求項２８に記載の方法。
30. デンドリマー組成物が、リポソーム、粒子、懸濁剤、溶体、または乳濁液を用いて製剤化される、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
31. 前記組成物が、毎日、毎週、隔週、毎月、および隔月からなる群より選択される期間で、前記被験体に投与される、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
32. 請求項１〜３１のいずれかに記載の方法における使用のための製剤。