JP2017525354A - 高親和性ｐｄ−１薬剤とその使用方法 - Google Patents

Abstract

（ｉ）野生型のＰＤ−１タンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含み、および（ｉｉ）野生型タンパク質に対してＰＤ−Ｌ１との親和性が増加した、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドが提供される。ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２との間の生理学的な結合相互作用を阻害する高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを含む治療用量の医薬組成物を投与することにより、哺乳動物中の免疫細胞の活性を調節するための、組成物および方法が提供される。【選択図】なし

Description

＜相互参照＞
本出願は、２０１４年８月８日に出願された米国仮特許出願第６２／０３５，３１６号の利益と、２０１５年４月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／１５０，７８９号の利益を主張するものであり、当該文献は各々、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

テキストファイルとして提供される配列表の参照による組み込み
配列表は、２０１５年８月７日に作成されるとともに１１９ＫＢのサイズを有するテキストファイル「ＳＴＡＮ−１１３６ＷＯ２＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として本明細書とともに提供される。テキストファイルの内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる。

導入部
Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞受容体に提供される抗原特異的なシグナルに依存する。さらなるシグナル、例えば、共刺激（正）および／または共抑制（負）シグナルはこの応答を微調整して、その強さ、性質、および継続時間を決定しやすくする。共刺激相互作用はＴ細胞の活性化と増殖を強化し、その一方で共抑制相互作用は調節を促す。例えば、ＣＤ２８とＣＴＬＡ−４の共受容体は両方ともＢ７−１（ＣＤ８０）とＢ７−２（ＣＤ８６）の分子に結合する。ＣＤ２８は強力な正の共刺激受容体として作用し、ＣＴＬＡ−４は共抑制受容体として作用する。

プログラム死−１（ＰＤ−１）受容体として知られている受容体は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および骨髄性細胞上で発現し、プログラム死リガンド（ＰＤ−Ｌ）に結合する。この受容体−リガンドペアは、主として抑制シグナル（例えば、ＰＤ−１の細胞質尾部の免疫受容体のチロシンベースのスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）へのＳＨＰ−２などのホスファターゼの補充を介して）を提供するように機能する。

ＰＤ−１シグナル伝達は周辺の許容差を引き起こすとともに維持するのに重要な役割を果たす。抗原提示細胞上のＰＤ−１リガンド（ＰＤ−Ｌ）は自己反応性のＴ細胞を阻害するとともに周辺の許容差を引き起こすことが示されているが、実質細胞上のＰＤ−１リガンドは、許容差を維持するためにエフェクターＴ細胞を抑えることによって組織の破壊を防ぐ。ＰＤ−１の抑制性の役割はＰＤ−１欠損マウスの表現型によって強調され、これは遺伝的背景に依存して様々な自己免疫性疾患にかかる。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌの経路は、腫瘍細胞によるおよび様々な病原体による免疫回避の標的として頻繁に利用される。例えば、ＰＤ１：ＰＤ−Ｌ経路は、腫瘍とウイルス（例えば、慢性感染症を引き起こすウイルス）により活用（例えば、活性化過剰）可能であり、これはＰＤ−Ｌタンパク質を発現してＰＤ−１（例えばＴ細胞上で）を刺激することができ、それによって、免疫細胞（例えばＴ細胞）応答を減らし、免疫系による根絶を回避する。

本開示は高親和性ＰＤ１模倣ポリペプチドを提供しており、これは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合することにより、細胞（例えばＴ細胞のような免疫細胞）の表面上のＰＤ−１とのＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断する／減らすことにより、および、ゆえにＰＤ−Ｌ１により刺激されたＰＤ−１活性を遮断する／減らすことにより、ＰＤ−１を模倣する。さらに、ＰＤ−１活性を減少させるために高親和性ＰＤ１模倣ポリペプチドを使用する方法も開示されている。

高親和性ＰＤ−１変異体（模倣）ポリペプチドが提供される。ポリペプチドは、野生型ＰＤ−１タンパク質（例えば、野生型ヒトＰＤ−１タンパク質）の配列変異体であり、野生型ＰＤ−１タンパク質とそのリガンドＰＤ−Ｌ（ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２）の間の相互作用を阻害するインビボとインビトロの方法に対する実用性を有する。高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、野生型のＰＤ−１タンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含み、野生型のＰＤ−１タンパク質に対してＰＤ−Ｌ（ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２）との親和性を増加させ、野生型ＰＤ−１タンパク質の膜貫通ドメインを欠いている。親和性を増加させるアミノ酸変化は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌとの間の接触のアミノ酸位置へ局在化可能であり、および／またはそれが由来するＰＤ−１タンパク質の免疫グロブリンドメイン中に位置付け可能である。

高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、例えば、グリコシル化、ペグ化などによって翻訳後に修飾可能である。高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、融合タンパク質（つまり、追加のアミノ酸配列を含むことができる）、例えば、抗体Ｆｃ配列および／または対象となる抗原への特異的な結合をもたらす抗体の可変領域などを含む融合であり得る。高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、単量体または多量体、つまり二量体、三量体、四量体などであってもよい。

いくつかの実施形態では、方法は、ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２との間の生理学的な結合相互作用を阻害する高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを含む治療用量の医薬組成物を投与することにより、哺乳動物中の免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞など）の活性を調節するために提供される。

本開示はさらに、薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせた高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを有する医薬製剤を含んでいる。こうした製剤は、単位投与量、例えば、個体内の第２の細胞上のＰＤ−Ｌ（ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２）との第１の細胞上のＰＤ−１の相互作用を阻害するのに効果的な投与量として提供されることもある。医薬製剤はさらに、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの凍結乾燥させた調合物またはそれ以外の調合物を含み、それらは使用のために再構成されてもよい。

いくつかの実施形態では、方法は、例えば、免疫系による生きている癌細胞の破壊を標的として、標的細胞への免疫応答を刺激するために提供される。こうした方法では、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞は、内在性のＰＤ−１（例えば第１の細胞上）とＰＤ−Ｌ（例えば、第２の細胞上のＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２）の間の相互作用を阻害するのに有効な投与量の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドと接触させる。この相互作用を阻害することにより、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドのない状態では破壊されない標的細胞の免疫ベースの破壊が可能となる。接触は、例えば、治療目的のためにインビボで、例えば、スクリーニング検査などのためにインビトロで行われてもよい。こうした目的のための高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、多量体または単量体であってもよい。単量体の試薬については、標的細胞へ選択的に結合する抗体と組み合わせて、投与のための特別の用途が見出される。

高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドで処置可能な病気に罹患した個体は、癌を抱える個体、感染症（例えば、慢性感染症、ウィルス感染症など）を抱える個体、免疫疾患（例えば、免疫抑制に関連する疾患）を抱える個体、炎症性障害を抱える個体、および／または他の過剰増殖性の疾患、例えば、硬化症、繊維症などを抱える個体を含む。場合によっては、癌細胞（例えば腫瘍細胞）は、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌとの相互作用を阻害するまたは遮蔽するのに効果的な投与量の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドに、免疫系の細胞を接触させることにより、免疫系の刺激を増加させて、除去の対象となる。場合によっては、標的細胞（例えば癌細胞、腫瘍細胞、感染細胞などのような損傷を受けた細胞）は、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２を発現し、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、標的細胞上のＰＤ−Ｌの、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞など）上のＰＤ−１との相互作用を阻害し、これにより、標的細胞に対する免疫応答を抑える標的細胞の能力を阻害することができる。

患者への有効な量の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの投与は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を防ぎ、これにより、腫瘍細胞および／または感染細胞（例えば慢性的な感染細胞）の除去を増加させる場合がある。場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは１つ以上の腫瘍細胞マーカーに向けられたモノクローナル抗体と組み合わせ可能であり、この併用療法は、単一体としてのいずれかの薬剤の投与と比較して、癌細胞の除去を強化するのに相乗的であり得る。他の実施形態では、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは検知可能な標識を含む。このような標識化した試薬は、インビトロまたはインビボでの画像化のために、例えば腫瘍の画像化において使用可能である。場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ（例えば、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞）の検出のための診断ツールとして使用可能であり、特定の処置レジメンが成功したかどうかを評価するためのコンパニオン診断として使用可能である。

高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドが提供される。場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、野生型のＰＤ−１配列の変異体であるが、ＰＤ−１膜貫通ドメインを欠いており、野生型ＰＤ１−ポリペプチドの対応する配列に対して１つ以上のアミノ酸変化を含み、この１つ以上のアミノ酸変化は、対応する野生型ＰＤ−１ポリペプチドのＰＤ−Ｌ１への親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ１のポリペプチドの親和性を増加させる。場合によっては、ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１に対して１×１０^−７Ｍ以下のＫ_ｄを有する。場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドのＰＤ−Ｌ１との親和性は、野生型ＰＤ−１ポリペプチドの対応する配列に対するアミノ酸変化を有していない上記ＰＤ−１模倣ポリペプチドのＰＤ−Ｌ１との親和性よりも５倍以上大きい。場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、野生型ＰＤ−１ポリペプチドの対応する配列に対するアミノ酸変化を有していない上記ＰＤ−１模倣ポリペプチドのＰＤ−Ｌ２との親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ２に対する親和性が低い。場合によっては、１つ以上のアミノ酸変化はＰＤ−Ｌ１と接触するＰＤ−１のアミノ酸位置に位置する。場合によっては、１つ以上のアミノ酸変化は、Ｖ３９、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｓ４８、Ｎ４９、Ｑ５０、Ｔ５１、Ｄ５２、Ｋ５３、Ａ５６、Ｑ６３、Ｇ６５、Ｑ６６、Ｌ９７、Ｓ１０２、Ｌ１０３、Ａ１０４、Ｐ１０５、Ｋ１０６、およびＡ１０７から選択されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるタンパク質フラグメントに対するアミノ酸位置、または、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置にある。場合によっては、１つ以上のアミノ酸変化は、Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｒ４４、Ｍ４５、Ｓ４８、Ｎ４９、Ｑ５０、Ｔ５１、Ｄ５２、Ｋ５３、Ａ５６、Ｑ６３、Ｇ６５、Ｑ６６、Ｖ７２、Ｈ８２、Ｍ８３、Ｒ９０、Ｙ９６、Ｌ９７、Ａ１００、Ｓ１０２、Ｌ１０３、Ａ１０４、Ｐ１０５、Ｋ１０６、およびＡ１０７から選択されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるタンパク質フラグメントに対するアミノ酸位置、または、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置にある。場合によっては、１つ以上のアミノ酸変化は、５つ以上のアミノ酸変化である。

さらに、以下から選択されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＰＤ−１タンパク質フラグメントに対する１つ以上のアミノ酸変化：（１）Ｖ３９ＨまたはＶ３９Ｒ；（２）Ｌ４０ＶまたはＬ４０Ｉ；（３）Ｎ４１ＩまたはＮ４１Ｖ；（４）Ｙ４３ＦまたはＹ４３Ｈ；（５）Ｒ４４ＹまたはＲ４４Ｌ；（６）Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、またはＭ４５Ｄ；（７）Ｓ４８Ｄ、Ｓ４８Ｌ、Ｓ４８Ｎ、Ｓ４８Ｇ、またはＳ４８Ｖ；（８）Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、またはＮ４９Ｓ；（９）Ｑ５０Ｋ、Ｑ５０Ｅ、またはＱ５０Ｈ；（１０）Ｔ５１Ｖ、Ｔ５１Ｌ、またはＴ５１Ａ；（１１）Ｄ５２Ｆ、Ｄ５２Ｒ、Ｄ５２Ｙ、またはＤ５２Ｖ；（１２）Ｋ５３ＴまたはＫ５３Ｌ；（１３）Ａ５６ＳまたはＡ５６Ｌ；（１４）Ｑ６３Ｔ、Ｑ６３Ｉ、Ｑ６３Ｅ、Ｑ６３Ｌ、またはＱ６３Ｐ；（１５）Ｇ６５Ｎ、Ｇ６５Ｒ、Ｇ６５Ｉ、Ｇ６５Ｌ、Ｇ６５Ｆ、またはＧ６５Ｖ；（１６）Ｑ６６Ｐ；（１７）Ｖ７２Ｉ；（１８）Ｈ８２Ｑ；（１９）Ｍ８３ＬまたはＭ８３Ｆ；（２０）Ｒ９０Ｋ；（２１）Ｙ９６Ｆ；（２２）Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、またはＬ９７Ｉ；（２３）Ａ１００ＩまたはＡ１００Ｖ；（２４）Ｓ１０２ＴまたはＳ１０２Ａ；（２５）Ｌ１０３Ｉ、Ｌ１０３Ｙ、またはＬ１０３Ｆ；（２６）Ａ１０４Ｓ、Ａ１０４Ｈ、またはＡ１０４Ｄ；（２７）Ｐ１０５Ａ；（２８）Ｋ１０６Ｇ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｉ、Ｋ１０６Ｖ、Ｋ１０６Ｒ、またはＫ１０６Ｔ；および、（２９）Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、またはＡ１０７Ｖ；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化、を含む高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドも提供される。

さらに、（ａ）Ｖ３９、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｓ４８、Ｎ４９、Ｑ５０、Ｋ５３、Ａ５６、Ｑ６３、Ｇ６５、Ｑ６６、Ｌ９７、Ｓ１０２、Ｌ１０３、Ａ１０４、Ｋ１０６、およびＡ１０７、または別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置；（ｂ）Ｖ３９、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｓ４８、Ｑ５０、Ｔ５１、Ｄ５２Ｆ、Ｋ５３、Ａ５６、Ｑ６３、Ｇ６５、Ｑ６６、Ｌ９７、Ｓ１０２、Ｌ１０３、Ａ１０４、Ｋ１０６、およびＡ１０７、または別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置；（ｃ）Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｒ４４、Ｍ４５、Ｎ４９、Ｋ５３、Ｍ８３、Ｌ９７、Ａ１００、およびＡ１０７、または別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置；（ｄ）Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｎ４９、Ｋ５３、Ｑ６６Ｐ、Ｍ８３、Ｌ９７、およびＡ１０７、または別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置；（ｅ）Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｎ４９、Ｋ５３、Ｑ６６Ｐ、Ｈ８２、Ｍ８３、Ｌ９７、Ａ１００、およびＡ１０７、または別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置；（ｆ）Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｎ４９、Ｋ５３、Ｍ８３、Ｌ９７、Ａ１００、およびＡ１０７、または別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置；（ｇ）Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｒ４４、Ｍ４５、Ｎ４９、Ｋ５３、Ｌ９７、Ａ１００、およびＡ１０７、または別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置；ならびに、（ｈ）Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｎ４９、Ｋ５３、Ｌ９７、Ａ１００、およびＡ１０７、または別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置、から選択されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるタンパク質フラグメントに対するアミノ酸位置にあるアミノ酸変化を含む、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドも提供される。

さらに、以下から選択されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＰＤ−１タンパク質フラグメントに対する、アミノ酸変化：（ａ）｛Ｖ３９ＨまたはＶ３９Ｒ｝、｛Ｎ４１ＩまたはＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３ＦまたはＹ４３Ｈ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、またはＭ４５Ｄ｝、｛Ｓ４８Ｄ、Ｓ４８Ｌ、Ｓ４８Ｎ、Ｓ４８Ｇ、またはＳ４８Ｖ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、またはＮ４９Ｓ｝、｛Ｑ５０Ｋ、Ｑ５０Ｅ、またはＱ５０Ｈ｝、｛Ｋ５３ＴまたはＫ５３Ｌ｝、｛Ａ５６ＳまたはＡ５６Ｌ｝、｛Ｑ６３Ｔ、Ｑ６３Ｉ、Ｑ６３Ｅ、Ｑ６３Ｌ、またはＱ６３Ｐ｝、｛Ｇ６５Ｎ、Ｇ６５Ｒ、Ｇ６５Ｉ、Ｇ６５Ｌ、Ｇ６５Ｆ、またはＧ６５Ｖ｝、｛Ｑ６６Ｐ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、またはＬ９７Ｉ｝、｛Ｓ１０２ＴまたはＳ１０２Ａ｝、｛Ｌ１０３Ｉ、Ｌ１０３Ｙ、またはＬ１０３Ｆ｝、｛Ａ１０４Ｓ、Ａ１０４Ｈ、またはＡ１０４Ｄ｝、｛Ｋ１０６Ｇ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｉ、Ｋ１０６Ｖ、Ｋ１０６Ｒ、またはＫ１０６Ｔ｝、および、｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、またはＡ１０７Ｖ｝；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；（ｂ）｛Ｖ３９ＨまたはＶ３９Ｒ｝、｛Ｎ４１ＩまたはＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３ＦまたはＹ４３Ｈ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、またはＭ４５Ｄ｝、｛Ｓ４８Ｄ、Ｓ４８Ｌ、Ｓ４８Ｎ、Ｓ４８Ｇ、またはＳ４８Ｖ｝、｛Ｑ５０Ｋ、Ｑ５０Ｅ、またはＱ５０Ｈ｝、｛Ｔ５１Ｖ、Ｔ５１Ｌ、またはＴ５１Ａ｝、｛Ｄ５２Ｆ、Ｄ５２Ｒ、Ｄ５２Ｙ、またはＤ５２Ｖ｝、｛Ｋ５３ＴまたはＫ５３Ｌ｝、｛Ａ５６ＳまたはＡ５６Ｌ｝、｛Ｑ６３Ｔ、Ｑ６３Ｉ、Ｑ６３Ｅ、Ｑ６３Ｌ、またはＱ６３Ｐ｝、｛Ｇ６５Ｎ、Ｇ６５Ｒ、Ｇ６５Ｉ、Ｇ６５Ｌ、Ｇ６５Ｆ、またはＧ６５Ｖ｝、｛Ｑ６６Ｐ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、またはＬ９７Ｉ｝、｛Ｓ１０２ＴまたはＳ１０２Ａ｝、｛Ｌ１０３Ｉ、Ｌ１０３Ｙ、またはＬ１０３Ｆ｝、｛Ａ１０４Ｓ、Ａ１０４Ｈ、またはＡ１０４Ｄ｝、｛Ｋ１０６Ｇ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｉ、Ｋ１０６Ｖ、Ｋ１０６Ｒ、またはＫ１０６Ｔ｝、および｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、またはＡ１０７Ｖ｝；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；（ｃ）｛Ｖ３９ＨまたはＶ３９Ｒ｝、｛Ｌ４０ＶまたはＬ４０Ｉ｝、｛Ｎ４１ＩまたはＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３ＦまたはＹ４３Ｈ｝、｛Ｒ４４ＹまたはＲ４４Ｌ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、またはＭ４５Ｄ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、またはＮ４９Ｓ｝、｛Ｋ５３ＴまたはＫ５３Ｌ｝、｛Ｍ８３ＬまたはＭ８３Ｆ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、またはＬ９７Ｉ｝、｛Ａ１００ＩまたはＡ１００Ｖ｝、および｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、またはＡ１０７Ｖ｝；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；（ｄ）｛Ｖ３９ＨまたはＶ３９Ｒ｝、｛Ｌ４０ＶまたはＬ４０Ｉ｝、｛Ｎ４１ＩまたはＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３ＦまたはＹ４３Ｈ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、またはＭ４５Ｄ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、またはＮ４９Ｓ｝、｛Ｋ５３ＴまたはＫ５３Ｌ｝、｛Ｑ６６Ｐ｝、｛Ｍ８３ＬまたはＭ８３Ｆ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、またはＬ９７Ｉ｝、および｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、またはＡ１０７Ｖ｝；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；
（ｅ）｛Ｖ３９ＨまたはＶ３９Ｒ｝、｛Ｌ４０ＶまたはＬ４０Ｉ｝、｛Ｎ４１ＩまたはＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３ＦまたはＹ４３Ｈ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、またはＭ４５Ｄ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、またはＮ４９Ｓ｝、｛Ｋ５３ＴまたはＫ５３Ｌ｝、｛Ｑ６６Ｐ｝、｛Ｈ８２Ｑ｝、｛Ｍ８３ＬまたはＭ８３Ｆ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、またはＬ９７Ｉ｝、｛Ａ１００ＩまたはＡ１００Ｖ｝、および｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、またはＡ１０７Ｖ｝；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；（ｆ）｛Ｖ３９ＨまたはＶ３９Ｒ｝、｛Ｌ４０ＶまたはＬ４０Ｉ｝、｛Ｎ４１ＩまたはＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３ＦまたはＹ４３Ｈ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、またはＭ４５Ｄ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、またはＮ４９Ｓ｝、｛Ｋ５３ＴまたはＫ５３Ｌ｝、｛Ｍ８３ＬまたはＭ８３Ｆ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、またはＬ９７Ｉ｝、｛Ａ１００ＩまたはＡ１００Ｖ｝、および｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、またはＡ１０７Ｖ｝；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；（ｇ）｛Ｖ３９ＨまたはＶ３９Ｒ｝、｛Ｌ４０ＶまたはＬ４０Ｉ｝、｛Ｎ４１ＩまたはＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３ＦまたはＹ４３Ｈ｝、｛Ｒ４４ＹまたはＲ４４Ｌ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、またはＭ４５Ｄ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、またはＮ４９Ｓ｝、｛Ｋ５３ＴまたはＫ５３Ｌ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、またはＬ９７Ｉ｝、｛Ａ１００ＩまたはＡ１００Ｖ｝、および｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、またはＡ１０７Ｖ｝；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；ならびに、（ｈ）｛Ｖ３９ＨまたはＶ３９Ｒ｝、｛Ｌ４０ＶまたはＬ４０Ｉ｝、｛Ｎ４１ＩまたはＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３ＦまたはＹ４３Ｈ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、またはＭ４５Ｄ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、またはＮ４９Ｓ｝、｛Ｋ５３ＴまたはＫ５３Ｌ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、またはＬ９７Ｉ｝、｛Ａ１００ＩまたはＡ１００Ｖ｝、および｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、またはＡ１０７Ｖ｝；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化、を含む高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドがさらに提供される。

同様に、以下から選択されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＰＤ−１タンパク質フラグメントに対するアミノ酸変化；（ａ）Ｖ３９Ｒ、Ｎ４１Ｖ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｓ４８Ｇ、Ｎ４９Ｙ、Ｑ５０Ｅ、Ｋ５３Ｔ、Ａ５６Ｓ、Ｑ６３Ｔ、Ｇ６５Ｌ、Ｑ６６Ｐ、Ｌ９７Ｖ、Ｓ１０２Ａ、Ｌ１０３Ｆ、Ａ１０４Ｈ、Ｋ１０６Ｖ、およびＡ１０７Ｉ；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；（ｂ）Ｖ３９Ｒ、Ｎ４１Ｖ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｓ４８Ｎ、Ｑ５０Ｈ、Ｔ５１Ａ、Ｄ５２Ｙ、Ｋ５３Ｔ、Ａ５６Ｌ、Ｑ６３Ｌ、Ｇ６５Ｆ、Ｑ６６Ｐ、Ｌ９７Ｉ、Ｓ１０２Ｔ、Ｌ１０３Ｆ、Ａ１０４Ｄ、Ｋ１０６Ｒ、およびＡ１０７Ｉ；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；（ｃ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｖ、Ｎ４１Ｖ、Ｙ４３Ｈ、Ｒ４４Ｙ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｇ、Ｋ５３Ｔ、Ｍ８３Ｌ、Ｌ９７Ｖ、Ａ１００Ｉ、およびＡ１０７Ｉ；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；（ｄ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｖ、Ｎ４１Ｖ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｇ、Ｋ５３Ｔ、Ｑ６６Ｐ、Ｍ８３Ｌ、Ｌ９７Ｖ、およびＡ１０７Ｉ；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；（ｅ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｖ、Ｎ４１Ｖ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｓ、Ｋ５３Ｔ、Ｑ６６Ｐ、Ｈ８２Ｑ、Ｍ８３Ｌ、Ｌ９７Ｖ、Ａ１００Ｖ、およびＡ１０７Ｉ；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；（ｆ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｉ、Ｎ４１Ｉ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｇ、Ｋ５３Ｔ、Ｍ８３Ｌ、Ｌ９７Ｖ、Ａ１００Ｖ、およびＡ１０７Ｉ；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；（ｇ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｖ、Ｎ４１Ｉ、Ｙ４３Ｈ、Ｒ４４Ｌ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｇ、Ｋ５３Ｔ、Ｌ９７Ｖ、Ａ１００Ｖ、およびＡ１０７Ｉ；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；（ｈ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｖ、Ｎ４１Ｉ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｇ、Ｋ５３Ｔ、Ｌ９７Ｖ、Ａ１００Ｖ、およびＡ１０７Ｉ；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；ならびに、（ｉ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｖ、Ｎ４１Ｖ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｇ、Ｋ５３Ｔ、Ｌ９７Ｖ、Ａ１００Ｖ、およびＡ１０７Ｉ；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化、を含む高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドも提供される。

場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、融合パートナーを含む（例えば、融合される）。場合によっては、融合パートナーは、ヒト免疫グロブリンポリペプチド配列のフラグメントである（例えば、フラグメントは（ａ）ＣＨ３ドメイン、および、（ｂ）Ｆｃ領域の一部または全体から選択される）。場合によっては、融合パートナーが以下から選択される：多量体化ドメイン；サイトカイン；弱毒化サイトカイン；４１ＢＢアゴニスト；ＣＤ４０アゴニスト；ＢＴＬＡおよび／またはＣＤ１６０の阻害剤；ならびに、ＴＩＭ３および／またはＣＥＡＣＡＭ１の阻害剤。

場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは多量体である（例えば、二量体）。このような場合、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは融合パートナーを含み（例えば、融合され）、融合パートナーは多量体化（例えば二量化）ドメインを含む。例えば、場合によっては、融合パートナーは、（免疫グロブリンポリペプチド配列（例えば、ヒト免疫グロブリンポリペプチド配列）からの）ＣＨ３ドメインである。

場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＰＤ−１タンパク質フラグメントに対してＲ８７Ｃ、Ｎ９１Ｃ、および／またはＲ１２２Ｃに対応する１つ以上の変異を含んでいる。場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２５と３９−４６のいずれかにで示されるアミノ酸配列を含んでいる。場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、検知可能な標識（例えば、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）の画像化標識）を含んでいる。場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＰＤ−１タンパク質フラグメントに対してＲ８７Ｃ、Ｎ９１Ｃ、および／またはＲ１２２Ｃに対応する１つ以上の変異を含み、さらに、検知可能な標識（例えば陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）の画像化標識）を含んでいる。

さらに、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを含む医薬製剤が提供される。

さらに、核酸も提供される。主題の核酸は、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含んでいる。場合によっては、核酸は、（ｉ）ＴＣＲをコード化するヌクレオチド配列（例えば、ＴＣＲのＴＣＲアルファポリペプチドとＴＣＲベータポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列）；および／または、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコード化するヌクレオチド配列をさらに含む。場合によっては、核酸は、発現ベクター（例えば、直線ベクター、円形ベクター、プラスミド、ウイルスベクターなど）である。

さらに、こうした核酸を含む細胞（例えば、ヒト細胞、霊長類細胞、マウス細胞、哺乳動物細胞）（例えば、免疫細胞、白血球、Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、記憶／エフェクターＴ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞、マクロファージ、単球、ＮＫ細胞、幹細胞、造血幹細胞、多分化能性幹細胞、多能性幹細胞、組織特異的幹細胞など）も提供される。場合によっては、細胞は免疫細胞である。場合によっては、細胞は幹または前駆細胞である。場合によっては、細胞は造血幹細胞である。場合によっては、細胞は、Ｔ細胞（例えば、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞）である。

さらに、画像化の方法も提供される。場合によっては、方法は、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドに、ＰＤ−Ｌ１（例えば、インビトロ、インビボ、エクスビボで）を発現する細胞を接触させる工程を含んでいる。場合によっては、上記接触させる工程は、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを個体へ投与する工程を含む。場合によっては、方法は、個体の癌を診断および／または予測する方法である。したがって、場合によっては、画像化は個体の癌を診断および／または予測するために使用される。

さらに、第１の細胞上のＰＤ−１の第２の細胞上のＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２との相互作用を阻害する方法も提供される。場合によっては、方法は、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドに第２の細胞を接触させる工程を含んでいる。場合によっては、第２の細胞は癌細胞または慢性的に感染した細胞である。場合によっては、接触させる工程はインビトロである。場合によっては、接触させる工程は、エクスビボ（例えば、１つ以上の細胞は、１つ以上の細胞が導入される個体に対して自家性であり得る）である。場合によっては、接触させる工程はインビボである。場合によっては、方法は、第２の細胞を、以下から選択される薬剤に接触させる工程を含む：免疫刺激剤、慢性感染症を治療する薬剤、細胞毒性薬、化学療法剤、細胞特異的な抗体、腫瘍細胞マーカーに選択的な抗体、および操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞。場合によっては、方法が第２の細胞を腫瘍特異抗体と接触させる工程を含んでいる。

さらに、癌を抱えるか、慢性感染症を抱えるか、または免疫抑制に関連する免疫学的疾患を抱える個体を処置する方法が提供される。例えば、方法は、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを（例えば、第１の細胞上のＰＤ−１の第２の細胞上のＰＤ−Ｌ１との結合を減少させるのに有効な量で）個体に投与する工程を含み得る。場合によっては、投与する工程は、ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸を第３の細胞へ導入する工程を含んでいる。場合によっては、第３の細胞がインビボである。場合によっては、ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸は、インビトロまたはエクスビボで第３の細胞に導入され、第３の細胞はその後、個体に導入される。場合によっては、第３の細胞は免疫細胞である。場合によっては、免疫細胞は操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞である。場合によっては、操作されたＴＣＲはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。場合によっては、個体は進行性腫瘍を有している。場合によっては、方法は、以下から選択される薬剤を個体に投与する工程を含む：免疫刺激剤、慢性感染症を処置する薬剤、細胞毒性薬、化学療法剤、細胞に特異的な抗体、腫瘍細胞マーカーに選択的な抗体、および操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞。

本発明は、添付の図面と共に精読すると以下の詳細な記載から最も良く理解される。一般的な手法に従って、図面の様々な特徴は同一縮尺ではないことを強調しておく。これに反して、明瞭化のために様々な特徴の寸法が任意に拡大縮小される。図には以下の特徴が含まれている。
Ｔ細胞の活性化を阻害するためにＴ細胞の表面上のＰＤ−１に特異的に結合し、それによって腫瘍細胞が免疫系による破壊を逃れることができるようにする、腫瘍細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１を例証する概略図である。 癌細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、それによって、Ｔ細胞活性化を阻害する癌細胞の能力を低下させ、免疫応答を逃れる癌細胞の能力を低下させる、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを例証する概略図である。 ＰＤ−１（上方右）とＰＤ−Ｌ１（下方左）との相互作用の構造的な表現。ＰＤ−Ｌ１との接触部位にあるＰＤ−１の残基は、球体として表わされる。 ＰＤ−１模倣ポリペプチド（野生型アミノ酸残基を含む）は、酵母にディスプレイされた第一世代ライブラリー（世代１）を生成するためにＰＤ−Ｌ１と接触する残基で突然変異を誘発された。その後、ビオチン化ヒトＰＤ−Ｌ１（１００ｎＭ）を使用して、結合に基づく選択が行われた。集束位置に集中した第二世代ライブラリー（世代２）は、（１ｎＭのビオチン化ヒトＰＤ−Ｌ１を用いて）ＰＤ−Ｌ１に対してさらに大きな親和性を有するＰＤ−１模倣ポリペプチドをスクリーニングするために作成された。 表は、操作された変異体（主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド）の配列を反映している。「Ｇ１」変異体は世代１からのものであり、「Ｇ２」変異体は世代２からのものである（図２Ａ−図２Ｂを参照）。それぞれの番号を付けた行は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＰＤ−１ポリペプチドに対して各々の示された残基のアミノ酸位置を示している（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリペプチドは、野生型ＰＤ−１配列を含むが、膜貫通ドメインを欠くＰＤ−１模倣ポリペプチドであり、野生型ＰＤ−１の最初の２５のアミノ酸を欠いている）。野生型のアミノ酸残基との相違は、各々の変異体について結果として生じた変異の一文字のコードで示されている。ＰＤ−Ｌ１に対する測定された表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の親和性は（測定時に）右に示される。ＨＡＣ：高親和性コンセンサス。 ２つの代表的な表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のプロットが示される。天然のＰＤ−１模倣ポリペプチド（野生型ヒトＰＤ−１配列を持つ）の解離半減期は、１秒未満であった。対照的に、高親和性コンセンサスＰＤ−１変異体ＨＡＣ−Ｉ（主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド）の解離半減期は、４２．４分であった。 主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１に強力かつ特異的に拮抗した。酵母ディスプレイ：（図５Ａ）ヒトＰＤ−Ｌ１、（図５Ｂ）ヒトＰＤ−Ｌ２、または（図５Ｃ）マウスＰＤ−Ｌ１を、標識化した天然のＰＤ−１模倣ポリペプチドストレプトアビジン四量体で染色した（野生型ヒトＰＤ−１配列を有し、Ａｌｅｘａ６４７に共役した対照ＰＤ−１模倣ポリペプチド）を模倣する。標識化した天然のＰＤ−１模倣ポリペプチドのＰＤ−Ｌ１との結合を、標識化されていない高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの可変濃度（Ｘ軸上で示される濃度）と競わせた。（図５Ａ）標識化されていない天然のＰＤ−１模倣ポリペプチド（野生型のヒトＰＤ−１配列を有する）は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用に拮抗した。高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド（ＨＡＣ−Ｖ ＰＤ−１、Ｇ２ ４−１、およびＧ２ ４−２）は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用に強力に拮抗した。 主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１に強力かつ特異的に拮抗した。酵母ディスプレイ：（図５Ａ）ヒトＰＤ−Ｌ１、（図５Ｂ）ヒトＰＤ−Ｌ２、または（図５Ｃ）マウスＰＤ−Ｌ１を、標識化した天然のＰＤ−１模倣ポリペプチドストレプトアビジン四量体で染色した（野生型ヒトＰＤ−１配列を有し、Ａｌｅｘａ６４７に共役した対照ＰＤ−１模倣ポリペプチド）を模倣する。標識化した天然のＰＤ−１模倣ポリペプチドのＰＤ−Ｌ１との結合を、標識化されていない高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの可変濃度（Ｘ軸上で示される濃度）と競わせた。（図５Ｂ）高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ２の相互作用の任意の拮抗作用を実証せず、一方で、天然のＰＤ−１模倣ポリペプチドはＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ２の相互作用に拮抗した。 主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１に強力かつ特異的に拮抗した。酵母ディスプレイ：（図５Ａ）ヒトＰＤ−Ｌ１、（図５Ｂ）ヒトＰＤ−Ｌ２、または（図５Ｃ）マウスＰＤ−Ｌ１を、標識化した天然のＰＤ−１模倣ポリペプチドストレプトアビジン四量体で染色した（野生型ヒトＰＤ−１配列を有し、Ａｌｅｘａ６４７に共役した対照ＰＤ−１模倣ポリペプチド）を模倣する。標識化した天然のＰＤ−１模倣ポリペプチドのＰＤ−Ｌ１との結合を、標識化されていない高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの可変濃度（Ｘ軸上で示される濃度）と競わせた。（図５Ｃ）主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドはさらに、マウスＰＤ−Ｌ１との結合のために競合することができた。 高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ヒト癌細胞上のＰＤ−Ｌ１に拮抗する。（図６Ａ）ヒトメラノーマ細胞株ＳＫＭＥＬ２８上でのＰＤ−Ｌ１の発現。ＰＤ−Ｌ１発現は、２４時間２０００Ｕ／ｍＬのヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を用いる刺激によってＳＫＭＥＬ２８細胞上で誘発された。ＰＤ−Ｌ１染色は、誘導条件（プラスＩＦＮγ）対非誘導条件（マイナスＩＦＮγ）下でフローサイトメトリーによって評価された。 高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ヒト癌細胞上のＰＤ−Ｌ１に拮抗する。（図６Ｂ）ＩＦＮγで刺激されたＳＫＭＥＬ２８細胞は、可変濃度（Ｘ軸上で示される濃度）の標識化されていない高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドとともに、標識化された天然のＰＤ−１模倣ポリペプチドストレプトアビジン四量体（野生型のヒトＰＤ−１配列を有し、Ａｌｅｘａ６４７に共役した対照ＰＤ−１模倣ポリペプチド）で染色された。標識化されていない天然のＰＤ−１模倣ポリペプチド（野生型ヒトＰＤ−１配列を有する）は、ＳＫＭＥＬ２８細胞に対する標識化した天然のＰＤ−１模倣ポリペプチドの結合を防ぐ効果はなかった（ＩＣ５０＝８．２μＭ）。対照的に、ＨＡＣ−Ｖ（高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド）は、標識化した天然のＰＤ−１模倣ポリペプチドの結合を強力に阻害した（２１０ｐＭのＩＣ５０）。ＨＡＣ−ＭＢＨ（ＨＡＣ−Ｖ、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインに融合した、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド）は、さらに増強された効力（５５ｐＭのＩＣ５０）で、標識化した天然のＰＤ−１模倣ポリペプチドの結合を阻害した。 酵母表面ディスプレイによる高親和性のＰＤ−１の定向進化。（図７Ａ）ｍＰＤ−１：ｈＰＤ−Ｌ１複合体（ＰＤＢ ＩＤ ３ＢＩＫ）のｈＰＤ−１（ＰＤＢ ＩＤ ３ＲＲＱ）との構造的な位置合わせによって構築されたｈＰＤ−Ｌ１とのｈＰＤ−１複合体のモデル。ＰＤ−１の無作為化された残基は、ＰＤ−Ｌ１接触残基については「青い球体」として、コア残基については「赤い球体」として描かれている。 酵母表面ディスプレイによる高親和性のＰＤ−１の定向進化。（図７Ｂ）各選択回で酵母ｈＰＤ−Ｌ１染色を評価するヒストグラムの重ね合わせ。第一世代の選択（左のパネル）については、全ての回は１００ｎＭでビオチン化されたｈＰＤ−Ｌ１で染色された。第二世代選択（右のパネル）については、酵母は、１ｎＭのビオチン化されたｈＰＤ−Ｌ１で染色された。 酵母表面ディスプレイによる高親和性のＰＤ−１の定向進化。（図７Ｃ）選択されたＰＤ−１変異体に関する配列とｈＰＤ−Ｌ１親和性の要約。各々の突然変異した位置と野生型のＰＤ−１における対応する残基の位置が表の一番上に示される。イタリック体のフォントは、無作為化されていない部位で生じた変異を示す。３９、４１、４３、４５、４９、５３、１０７で示される残基は、ＨＡＣコンセンサス配列（「接触コンセンサス部位」）に集中したＰＤ−Ｌ１接触位置であるが、４０と１００で示される残基は、集束するコア位置（「コアコンセンサス部位」）である。ｈＰＤ−Ｌ１に対するいくつかの配列の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定された（示されるように、一番右の行）。 ＨＡＣ−ＰＤ−１は、ヒトとネズミのＰＤ−Ｌ２ではなくＰＤ−Ｌ１に結合するとともに拮抗する。（図８Ａ）固定されたｈＰＤ−Ｌ１に対する野生型のＰＤ−１（左）とＨＡＣ−Ｖ ＰＤ−１（右）の結合の代表的な表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ）。 ＨＡＣ−ＰＤ−１は、ヒトとネズミのＰＤ−Ｌ２ではなくＰＤ−Ｌ１に結合するとともに拮抗する。（図８Ｂ）ヒトＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞（左）、マウスＢ１６−Ｆ１０細胞、またはｈＰＤ−Ｌ２をディスプレイする酵母上での野生型のｈＰＤ−１、ＨＡＣ−Ｖ ＰＤ−１、またはＨＡＣ「ミクロボディ」（ＨＡＣｍｂ）の競合結合アッセイ。１００ｎＭのｈＰＤ−１／ストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７四量体を、プローブリガンドとして使用した。エラーバーは平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）を表す。 ＨＡＣ−ＰＤ−１は腫瘍浸透を強化し、周辺のＴ細胞を枯渇させない。（図９Ａ）抗−ｈＰＤ−Ｌ１−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（カラーで提示された際は緑）とＨＡＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５９４（カラーで提示される際には赤）の腹膜腔内注射後４時間の、ＰＤ−Ｌ１（上）が欠乏しているか、またはｈＰＤ−Ｌ１（下）トランスジェニックの区分されたＣＴ２６腫瘍の代表的な蛍光顕微鏡法画像。核（カラーで提示された際には青）はＤＡＰＩで標識化された。スケールバーは５００μｍを表す。 ＨＡＣ−ＰＤ−１は腫瘍浸透を強化し、周辺のＴ細胞を枯渇させない。（図９Ｂ）相対的なＨＡＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５９４染色対抗−ｈＰＤ−Ｌ１−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８染色を示す、図９Ａからの解離した腫瘍の代表的なフローサイトメトリー。パーセンテージは個々の正の象限中で与えられる。 ＨＡＣ−ＰＤ−１は腫瘍浸透を強化し、周辺のＴ細胞を枯渇させない。（図９Ｃ）４ＰＤ−Ｌ１欠乏腫瘍と４ｈＰＤ−Ｌ１トランスジェニック腫瘍からのフローサイトメトリー研究の要約。ｎ．ｓは重要ではない（ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）。＊＊＊、ｐ＜０．０００１、双方向ＡＮＯＶＡ．エラーバーは平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）を表す。 ＨＡＣ−ＰＤ−１は腫瘍浸透を強化し、周辺のＴ細胞を枯渇させない。（図９Ｄ）ＣＴ２６腫瘍を移植されたマウスに対するビヒクル（ＰＢＳ）、抗−ｍＰＤ−Ｌ１、またはＨＡＣｍｂの３日間の投与後の、周辺のＣＤ８＋Ｔ細胞（最も左のパネル）、周辺のＣＤ４＋Ｔ細胞（左から２番目のパネル）、リンパ節ＣＤ８＋Ｔ細胞（右から二番目のパネル）、およびリンパ節ＣＤ４＋Ｔ細胞（最も右のパネル）の比存在度。ｎｓは重要ではなく（ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．００１、一方向ＡＮＯＶＡ． 大小のＣＴ２６同系腫瘍モデル中のＨＡＣｍｂと抗−ＰＤ−Ｌ１抗体の抗腫瘍有効性。（図１０Ａ）小さな腫瘍実験の実験計画法を例証する概略図。腫瘍の移植後７日目にすべてのコホートで処置を始めた。一日量のビヒクル（ＰＢＳ）、２５０μｇの抗−ＰＤ−Ｌ１（クローン１０Ｆ．９Ｇ２）、または２５０μｇのＨＡＣｍｂを１４日間、マウスに注入した。 大小のＣＴ２６同系腫瘍モデル中のＨＡＣｍｂと抗−ＰＤ−Ｌ１抗体の抗腫瘍有効性。（図１０Ｂ）処置期間にわたって個々の腫瘍について（左側の３つのパネル）、または集計データ（最も右のパネル）として表示されたものから倍率変化（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ）として計算された、移植された腫瘍の相対成長率。エラーバーは平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）を表す。ｎ．ｓは重要ではない（ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）。＊＊＊、ｐ＜０．０００１． 大小のＣＴ２６同系腫瘍モデル中のＨＡＣｍｂと抗−ＰＤ−Ｌ１抗体の抗腫瘍有効性。（図１０Ｃ）大きな腫瘍実験の実験計画法を例証する概略図。マウスにＣＴ２６腫瘍を移植して、毎日モニタリングした。個々の腫瘍が１５０ｍｍ３を超えると、マウスを処置コホートに無作為化した。腫瘍を毎日測定し、ビヒクル（ＰＢＳ）、２５０μｇの抗−ＰＤ−Ｌ１（クローン１０Ｆ．９Ｇ２）、または２５０μｇのＨＡＣｍｂを用いる処置を１４日間、毎日受けさせた。抗ＣＴＬＡ４（クローン９Ｄ９）は２５０μｇの１回量として投与された。 大小のＣＴ２６同系腫瘍モデル中のＨＡＣｍｂと抗−ＰＤ−Ｌ１抗体の抗腫瘍有効性。（図１０Ｄ）１４日間の処置の期間にわたって平均的な腫瘍の増殖に関する集計データ。エラーバーは平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）を表す。左右のパネルのＰＢＳで処置された腫瘍の増殖（黒）と抗−ＣＴＬＡ４で処置された腫瘍の増殖（紫）は同一である；明確にするために、これらを２回表す。ｎ．ｓは重要ではない（ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）。＊＊＊、ｐ＜０．００１、二方向ＡＮＯＶＡ．処置後１４日目の完全な統計分析が表４に示される。 ６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣによるｈＰＤ−Ｌ１のＭｉｃｒｏＰＥＴ画像化。（図１１Ａ）皮下のｈＰＤ−Ｌ１（＋）またはｈＰＤ−Ｌ１（−）ＣＴ２６腫瘍を有するＮＳＧマウスにおける６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣ（２３０μＣｉ／２５μｇ／２００μｌ）の注入後１時間のＰＥＴ−ＣＴ画像。阻害はＰＥＴトレーサーの２時間前に５００μｇ／２００μｌの標識化されていないＨＡＣ−ＰＤ１を用いて行われた。Ｔ−腫瘍、Ｌ−肝臓、Ｋ−腎臓、Ｂ−膀胱、ＳＧ−唾液腺。 ６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣによるｈＰＤ−Ｌ１のＭｉｃｒｏＰＥＴ画像化。（図１１Ｂ）組織１グラム当たりの注入投与量のパーセントとして示される（％ＩＤ／ｇ）、関心領域（ＲＯＩ）分析による注入後１時間の腫瘍摂取の定量化。＊、ｐ＜０．０５． 「第一世代」ＰＤ−１ライブラリの設計。（図１２Ａ）ｈＰＤ−１の無作為化された位置の表が表の中で与えられ、各部位で起こり得る潜在的なアミノ酸と対応する縮重コドンが示されている。 「第一世代」ＰＤ−１ライブラリの設計。（図１２Ｂ）「第一世代」ライブラリの構造的な描写；ｈＰＤ−１は空間充填型球体として示されるような無作為化された側鎖を含んで緑（カラーで提示されるとき）である。 「第二世代」ＰＤ−１ライブラリの設計。（図１３Ａ）ｈＰＤ−１の無作為化された位置の表が表の中で与えられ、各部位で起こり得る潜在的なアミノ酸と対応する縮重コドンが示されている。 「第二世代」ＰＤ−１ライブラリの設計。（図１３Ｂ）「第二世代」ライブラリの構造的な描写；ｈＰＤ−１は空間充填型球体として示されるような無作為化された側鎖を含んで緑（カラーで提示されるとき）である。 個々のＨＡＣ ＰＤ−１単量体と抗−ＰＤ−Ｌ１抗体と比較した、ＨＡＣ「ミクロボディ」（ＨＡＣｍｂ）設計の概略図。ＨＡＣｍｂは、ジスルフィド含有ヒンジ配列によって結合したヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインに融合したＨＡＣ−Ｖである。 ｈＰＤ−Ｌ１発現細胞のインビトロおよびインビボでの染色。（図１５Ａ）染色されていない、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４で標識化されたＨＡＣ単量体で染色された、または、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で標識化された抗−ＰＤ−Ｌ１抗体（クローン２９Ｅ．２Ａ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色された、ＣＴ２６−Ｔｇ（ｈＰＤ−Ｌ１）−Δ（ｍＰＤＬ１）のＦＡＣＳプロット。 ｈＰＤ−Ｌ１発現細胞のインビトロおよびインビボでの染色。（図１５Ｂ）図９Ａで描かれるのと同じ腫瘍であるが、腫瘍の周囲よりもむしろ腫瘍の中心から得られる組織切片。画像は、抗−ｈＰＤ−Ｌ１−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（カラーで提示されるときは緑）とＨＡＣ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４（カラーで提示されるときは赤）の腹膜腔内注入４時間後に切開された腫瘍のものである。核（カラーで提示された際には青）はＤＡＰＩで標識化された。スケールバーは５００μｍを表す。 ＣＴ２６を移植されたマウスにおける主要な末梢血Ｔ細胞でのＰＤ−Ｌ１の発現。皮下にＣＴ２６腫瘍を移植後１４日のＢａｌｂ／ｃホストの末梢血中のＰＤ−Ｌ１の陽性のＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示すドットプロット。 ＤＯＴＡ−ＨＡＣ ＰＥＴトレーサーの検証。（図１７Ａ）ヒトＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞での野生型のｈＰＤ−１、ＨＡＣ−Ｖ、またはＤＯＴＡ−ＨＡＣの競合結合アッセイ。１００ｎＭのｈＰＤ−１／ストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７四量体をプローブリガンドとして使用した。エラーバーは平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）を表す。 ＤＯＴＡ−ＨＡＣ ＰＥＴトレーサーの検証。（図１７Ｂ）抗−ｈＰＤ−Ｌ１放射性トレーサーの免疫反応性。トレーサーの追加前に過剰なＨＡＣ−Ｎ９１Ｃで阻害したｈＰＤ−Ｌ１（＋）、ｈＰＤ−Ｌ１（−）、およびｈＰＤ−Ｌ１（＋）細胞を、結合特異性に関して試験した。５ｎＭの６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣはｈＰＤ−Ｌ１（＋）細胞（８０．５％±１．９％）に用意に結合するが、対照ｈＰＤ−Ｌ１（−）細胞は最小限の免疫反応性（８．３％±０．５％）しか示さなかった。ＨＡＣ−Ｎ９１Ｃの１μＭ（８．９％±０．１％）までの追加によって、結合はｈＰＤ−Ｌ１（＋）細胞中で阻害された。ｎ．ｓは重要ではない（ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、双方向のＡＮＯＶＡ． ６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣ ＭｉｃｒｏＰＥＴ画像化ダイナミクス。（図１８Ａ）腫瘍の取り込みは２４時間にわたって関心領域（ＲＯＩ）の分散によって計算された。 ６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣ ＭｉｃｒｏＰＥＴ画像化ダイナミクス。（図１８Ｂ）ＲＯＩ分析によって評価されるｈＰＤ−Ｌ１（＋）と（−）腫瘍を抱えるマウスにおける腎臓出の取り込み。 ６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣ ＭｉｃｒｏＰＥＴ画像化ダイナミクス。（図１８Ｃ）二重の皮下のｈＰＤ−Ｌ１（＋）（波線）とｈＰＤ−Ｌ１（−）（実線）のＣＴ２６腫瘍を抱えるＮＳＧマウスにおける６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣ（２３０μＣｉ／２５μｇ／２００μｌ）の注入後２４時間のＰＥＴＣＴ画像。 ６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣ ＭｉｃｒｏＰＥＴ画像化ダイナミクス。（図１８Ｄ）関心領域（ＲＯＩ）によって計算された腫瘍の取り込み。 ６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣ ＭｉｃｒｏＰＥＴ画像化ダイナミクス。（図１８Ｅ）２４時間の腎クリアランス。組織１グラム当たりの注入投与量の割合として与えられる取り込み値（％ＩＤ／ｇ）。 ６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣの２４時間の体内分布。（図１９Ａ）ミクロＰＥＴ／ＣＴ画像化の完了後、マウスを安楽死させ、体内分布のために解剖した。示された器官と組織中の取り込みは、組織１グラム当たりの注入された投与量の割合として与えられる（％ＩＤ／ｇ）。 ６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣの２４時間の体内分布。（図１９Ｂ）血液および筋肉と比較されたｈＰＤ−Ｌ１（＋）腫瘍放射性トレーサーの取り込みの相対量。 （ｉ）（抗原に結合する）異種のＴＣＲ（例えば、ＴＣＲアルファとＴＣＲベータのポリペプチドをコード化する）、または、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と同様に、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化するウイルスベクター構築物の例の概略図。図２０Ａは図２０Ｂ−２０Ｅ向けの説明文を提供する。 （ｉ）（抗原に結合する）異種のＴＣＲ（例えば、ＴＣＲアルファとＴＣＲベータのポリペプチドをコード化する）、または、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と同様に、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化するウイルスベクター構築物の例の概略図。図２０Ａは図２０Ｂ−２０Ｅ向けの説明文を提供する。 （ｉ）（抗原に結合する）異種のＴＣＲ（例えば、ＴＣＲアルファとＴＣＲベータのポリペプチドをコード化する）、または、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と同様に、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化するウイルスベクター構築物の例の概略図。図２０Ａは図２０Ｂ−２０Ｅ向けの説明文を提供する。 （ｉ）（抗原に結合する）異種のＴＣＲ（例えば、ＴＣＲアルファとＴＣＲベータのポリペプチドをコード化する）、または、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と同様に、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化するウイルスベクター構築物の例の概略図。図２０Ａは図２０Ｂ−２０Ｅ向けの説明文を提供する。 （ｉ）（抗原に結合する）異種のＴＣＲ（例えば、ＴＣＲアルファとＴＣＲベータのポリペプチドをコード化する）、または、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と同様に、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化するウイルスベクター構築物の例の概略図。図２０Ａは図２０Ｂ−２０Ｅ向けの説明文を提供する。 主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸（ＤＮＡベクター）の例の概略図。 主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸（ＤＮＡベクター）の例の概略図。 主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸（ＤＮＡベクター）の例の概略図。 主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸（ＤＮＡベクター）の例の概略図。

高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドとその使用方法が提供される。高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、野生型ＰＤ−１タンパク質（例えば、野生型ヒトＰＤ−１タンパク質）の配列変異体であり、野生型ＰＤ−１タンパク質とそのリガンドＰＤ−Ｌ（ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２）の間の相互作用を阻害するインビボおよびインビトロの方法に対して実用性がある。高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、野生型のＰＤ−１タンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含み、野生型のＰＤ−１タンパク質に対してＰＤ−Ｌ（ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２）との親和性が強く、野生型ＰＤ−１タンパク質の膜貫通ドメインを欠いている。親和性を増加させるアミノ酸変化は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌとの間の接触のアミノ酸位置へ局在化可能であり、および／またはそれが由来するＰＤ−１タンパク質の免疫グロブリンドメイン中に位置付け可能である。

本方法と組成物を記載する前に、本発明が記載される特定の方法または組成物に限定されず、当然のことながら変化することがあるということが理解されよう。さらに、本明細書で使用される用語は特定の実施形態だけを記載することを目的としており、本発明の範囲が添付の請求項によってのみ制限されるため、限定的であることを意図していないことも理解されよう。

様々な値の範囲が提供されている場合、特段の定めのない限り、その範囲の上限と下限の間の、下限の単位の小数第２位までの各々の介在する値が特に開示される。任意の記載された範囲の任意の記載された値または介在する値とその記載された範囲の任意の他の記載されたまたは介在する値との間のそれぞれの小さな範囲は本発明内に包含される。こうした小さな範囲の上下限は、範囲に独立して含まれることもあれば、排除されることもあり、その小さな範囲にいずれか、両方が含まれるか、またはいずれも含まれない場合、それぞれの範囲は、記載された範囲中の任意の具体的に除外された制限を受けて、本発明に包含される。記載された範囲が１つまたは両方の限界を含む場合、これらの含まれる限界の一方または両方を除外する範囲は本発明にも含まれる。

別段の定めのない限り、本明細書に記載される技術的かつ科学的な用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法や材料と類似するまたは同等の任意の方法や材料を本発明の実施または試験の際に使用することができるが、可能性のあるおよび好ましい方法や材料がここで記載されている。本明細書で言及されるすべての出版物は、出版物の引用の際に関連付けられる方法および／または材料を開示および記載するために参照により本明細書に組み込まれる。本開示は矛盾がある程度まで、組み込まれた出版物の任意の開示に取って代わることが理解されよう。

本開示を精読した当業者に明らかとなるように、本明細書で記載および例証された個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他の複数の実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るまたは該特徴と組み合わせ得る別の構成要素と特徴を有している。記載されたどの方法も、記載された事象の順に、または、論理上可能な他の順に実行することができる。

本明細書および添付の請求項で使用されるように、単数形（「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」）は、文脈で特段の定めのない限り複数形を含むことを理解されたい。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のそうした細胞を含んでおり、「ペプチド」への言及は、１つ以上のペプチドおよびその等価物（例えば、当業者に知られているポリペプチドなど）への言及を含んでいる。

本明細書で議論された出版物は、本出願の出願日よりも前に開示するためだけに提供される。本発明が先行発明によるこうした公開に先行するという資格がないという承認として解釈されるものは本明細書には何もない。
さらに、提供される公開日は、独立して確認される必要があることがある実際の公開日とは異なり得る。

（定義）
以下の記載では、当該分野で従来使用される多くの用語が用いられている。

明細書と請求項についての明瞭かつ一貫した理解とこうした用語に与えられる範囲を提供するために、以下の定義が与えられる。ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１との間の相互作用の「阻害剤」、「遮断薬」、および「隠蔽剤」との用語は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合を防ぐ分子を指す。開発のために、結合は、実験条件下で、例えば、結合パートナーとして単離したタンパク質を用いて、結合パートナーとしてタンパク質の一部を用いて、結合パートナーとしてタンパク質またはタンパク質の一部の酵母ディスプレイを用いるなどして行われてもよい。

生理学的に関連する目的のために、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合は、通常２つの細胞間の事象であり、ここで各細胞は結合パートナーの１つを発現する。場合によっては、ＰＤ−１は、免疫細胞（例えばＴ細胞）の表面上で発現し、ＰＤ−Ｌ１は、免疫系による破壊の標的となり得る細胞（例えば、腫瘍細胞、慢性感染症のような感染を抱える細胞など）上で発現される。阻害剤は、受容体またはリガンドの結合あるいはシグナル伝達について、インビトロおよびインビボの分析を使用して特定され得る。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は本明細書では交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。こうした用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学薬品模倣物であるアミノ酸ポリマーや、天然のアミノ酸ポリマーと非天然のアミノ酸ポリマーにも当てはまる。

用語「アミノ酸」は、天然および合成のアミノ酸やアミノ酸アナログ、および天然のアミノ酸に類似したやり方で機能するアミノ酸模倣薬を指す。天然のアミノ酸は、遺伝コードによってコード化されたものや後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタマート、Ｏ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログは、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合する、天然のアミノ酸と同じ基本的な化学構造（すなわち、アルファ炭素）を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチルメチオニンスルホニウムを指す。こうしたアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然のアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣薬とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なるが天然のアミノ酸に似た方法で機能する構造を有する化学化合物を指す。

用語「レシピエント」、「個体」、「被験体」、「宿主」、および「患者」は本明細書では交換可能に使用され、診断、処置、または治療が望まれる任意の哺乳動物の被検体、特にヒトを指す。処置目的の「哺乳動物」とは、ヒト、飼育動物や家畜、および動物園の動物、競技用動物、またはペット用動物を含む、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの哺乳動物として分類される任意の動物を指す。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。

用語「癌」、「新生物」、および「腫瘍」は本明細書では交換可能に使用され、細胞増殖に対する重大な制御不能を特徴とする常軌を逸した成長表現型を呈するような自律的に制御されない成長を示す細胞を指す。本出願における検出、分析、または処置の対象となる細胞は、前癌性（例えば、良性）、悪性、前転移性、転移性、および非転移性の細胞を含んでいる。事実上すべての組織の癌が知られている。成句「癌負荷（ｃａｎｃｅｒ ｂｕｒｄｅｎ）」とは、被験体の癌細胞または癌量の量を指す。したがって、癌負荷を減らすことは被験体の癌細胞の数または癌量を減らすことを指す。本明細書で使用されるような用語「癌細胞」は、癌細胞か、癌細胞に由来する（例えば癌細胞のクローン）あらゆる細胞を指す。細胞腫、肉腫、膠芽腫、黒色腫、リンパ腫、骨髄腫などの固形腫瘍や、白血病などの循環癌を含む、多くのタイプの癌が当業者に知られている。

本明細書で使用されるように、「癌」は、限定されないが、固形腫瘍癌（例えば、肺、前立腺、乳房、膀胱、結腸、卵巣、膵臓、腎臓、肝臓の癌、神経膠芽腫、髄芽細胞腫、平滑筋肉腫、頭部と頸部の扁平上皮癌、黒色腫、神経内分泌癌など）や液体の癌（例えば、血液の癌）；細胞腫；軟組織腫瘍；肉腫；奇形腫；黒色腫；白血病；リンパ腫；および、微小残存病変を含む脳癌と、原発性腫瘍と転移性腫瘍の両方を含む、任意の形態の癌を含んでいる。任意の癌も主題の方法と組成物によって処置されるのに適切な癌である。場合によっては、癌細胞はＰＤ−Ｌ１を発現する。場合によっては、癌細胞はＰＤ−Ｌ１を発現しない（例えば、こうした場合、処置されている個体の免疫系の細胞はＰＤ−Ｌ１を発現する）。

細胞腫は上皮組織で生じる悪性腫瘍である。上皮細胞は身体の外表面を覆い、内部空洞を覆い、腺性組織の内層を形成する。細胞腫の例としては、限定されないが、腺癌（腺（分泌）細胞中で始まる癌）、例えば、乳房、膵臓、肺、前立腺、および結腸の癌は腺癌であり得る；副腎皮質癌；肝細胞癌；腎細胞癌；卵巣癌；上皮内癌；腺管癌；乳癌；基底細胞癌；扁平上皮癌；移行上皮癌；結腸癌；上咽頭癌；多胞性嚢胞性腎癌；燕麦細胞癌；大細胞肺癌；小細胞肺癌；非小細胞肺癌；などが挙げられる。細胞腫は、前立腺、膵臓、結腸、脳（通常、第２転移として）、肺、乳房、皮膚などで見られる。

軟組織腫瘍は、結合組織に由来するまれな腫瘍の非常に多様な群である。軟組織腫瘍の例としては、限定されないが、胞状軟部肉種；血管腫様線維性組織球腫；軟骨粘液線維腫；骨格の軟骨肉腫；骨格外の粘液性軟骨肉腫；明細胞肉腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；隆起性皮膚線維肉腫；子宮内膜間質腫瘍；ユーイング肉腫；線維腫症（デスモイド）；乳児性の繊維肉腫；消化管間質腫瘍；骨巨細胞腫；腱滑膜巨細胞腫（ｔｅｎｏｓｙｎｏｖｉａｌ ｇｉａｎｔ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ）；炎症性筋線維芽細胞性腫瘍；子宮平滑筋腫；平滑筋肉腫；脂肪肉腫；典型的な脂肪腫；紡錘細胞または多形性脂肪腫；異型脂肪腫；軟骨様脂肪腫；十分に分化した脂肪肉腫；粘液性脂肪肉腫／円形細胞脂肪肉腫；多形態脂肪肉腫；粘液性悪性線維性組織球腫；高悪性度悪性線維性組織球腫；粘液線維肉腫；悪性末梢神経鞘腫；中皮腫；神経芽腫；骨軟骨腫；骨肉腫；原始神経外胚葉性腫瘍；胞巣状横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；良性または悪性のシュワン腫；滑膜肉腫；Ｅｖａｎ腫瘍；結節性筋膜炎；デスモイドタイプ線維腫症；単発性線維性腫瘍；隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）；血管肉腫；類上皮性血管内皮腫；腱滑膜巨細胞腫（ＴＧＣＴ）；色素性絨毛結節性滑膜炎（ＰＶＮＳ）；繊維性異形成症；粘液線維肉腫；線維肉腫；滑膜肉腫；悪性末梢神経鞘腫；神経線維腫；および、軟組織の多形腺腫；ならびに、繊維芽細胞、筋線維芽細胞、組織球、血管細胞／内皮細胞および髄鞘細胞に由来する腫瘍形成が挙げられる。

肉腫は、例えば、軟骨、脂肪、筋肉、血管、繊維組織、または他の接続組織あるいは支持組織を含む、身体の骨または軟組織中の間葉系起原の細胞中で生じるまれなタイプの癌である。様々なタイプの肉腫は、癌が生じる場所に基づく。例えば、骨肉腫は骨に形成され、脂肪肉腫は脂肪に形成され、横紋筋肉腫は筋肉に形成される。肉腫の例としては、限定されないが、アスキン腫瘍；葡萄状肉腫；軟骨肉腫；ユーイング肉腫；悪性血管内皮腫；悪性シュワン腫；骨肉腫；および、軟組織肉腫（例えば、胞状軟部肉腫；血管肉腫；嚢腫肉腫 葉状の隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）；類腱腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；類上皮肉腫；骨格外の軟骨肉腫；骨格外の骨肉腫；繊維肉腫；消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）；血管外皮胞腫；血管内皮腫（より一般には「血管肉腫」と呼ばれる）；カポジ肉腫；平滑筋肉腫；脂肪肉腫；リンパ管肉腫；悪性末梢神経鞘腫（ＭＰＮＳＴ）；神経繊維肉腫；滑膜肉腫；未分化の多形性肉腫などが挙げられる。

奇形腫は、例えば、毛、筋肉、および骨を含む、複数の種類の組織（例えば、３つの胚葉：内胚葉、中胚葉、および外胚葉のいずれかおよび／またはすべてに由来する組織を含み得る）を含み得る一種の胚細胞性腫瘍である。奇形腫は、女性の卵巣、男性のこう丸、および子どもの尾骨で最も頻繁に生じる。

黒色腫は、メラニン細胞（色素メラニンを作る細胞）中で始まる癌の形態である。黒色腫は黒子で発生することもあるが（皮膚黒色腫）、さらに、目または腸などの他の色素性組織で生じることもあり得る。

白血病は、骨髄などの造血組織で発生する癌であり、大量の異常な血球を生成して血流に入らせる。例えば、白血病は、血流中で正常に成熟する骨髄由来細胞で発生し得る。白血病の名前は、この疾患がどれだけ速く発症して進行するのか（例えば、急性対慢性）ということと、影響を受ける白血球のタイプ（例えば、骨髄性対リンパ性）に由来している。骨髄性白血病は骨髄性または骨髄芽球性白血病とも呼ばれる。リンパ性白血病はリンパ芽球またはリンパ性白血病とも呼ばれる。リンパ性白血病細胞はリンパ節に集まることがあり、リンパ節は腫大し得る。白血病の例としては、限定されないが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）が挙げられる。

リンパ腫は免疫系の細胞中で発生する癌である。例えば、リンパ腫は、リンパ系で正常に成熟する骨髄由来細胞中で生じ得る。２つの基本的な種類のリンパ腫がある。１つは、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）であり、これは、リード−スターンバーグ細胞と呼ばれる一種の細胞の存在により特徴づけられる。現在、認識されているタイプのＨＬが６つある。ホジキンリンパ腫の例としては、限定されないが、結節硬化型古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、混合細胞型ＣＨＬ、リンパ球枯渇ＣＨＬ、リンパ球豊富型ＣＨＬ、および結節性リンパ球優位型ＨＬが挙げられる。

別のカテゴリーのリンパ腫は非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）であり、これは免疫細胞の癌の多くの多様な群を含んでいる。非ホジキンリンパ腫は、さらに低悪性度の（成長の遅い）コースがある癌、および攻撃的な（急成長している）コースがあるものに分けることができる。現在、６１の認識されたタイプのＮＨＬがある。非ホジキンリンパ腫の例としては、限定されないが、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ腫、芽細胞性ＮＫ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、バーキット様リンパ腫（非切れ込み型小細胞リンパ腫）、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、悪性皮膚Ｔ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、腸疾患型Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、肝脾ガンマ・デルタＴ細胞リンパ腫、Ｔ細胞白血病、リンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、鼻のＴ細胞リンパ腫、小児リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、形質転換リンパ腫、処置関連Ｔ細胞リンパ腫、およびワルデンストレームマクログロブリン血症が挙げられる。

脳腫瘍は、脳組織の任意の癌を含む。脳腫瘍の例としては、限定されないが、神経膠腫（例えば、神経膠芽腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫など）、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原始神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫）などが挙げられる。

癌の「病状」は、患者の幸福を危険にさらす現象をすべて含んでいる。これは、限定されないが、異常なまたは制御不能な細胞成長、転移、隣接細胞の正常な機能に対する干渉、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌物の放出、炎症反応または免疫応答の抑制または悪化、腫瘍形成、前悪性腫瘍、悪性腫瘍、リンパ節などの周囲または遠位の組織または器官の浸潤が挙げられる。

本明細書で使用されるように、「癌再発」や「腫瘍再発」という用語とその文法的な変異体は、癌の診断後の腫瘍細胞または癌細胞のさらなる成長を指す。とりわけ、さらなる癌細胞の成長が癌組織で生じる再発が起こることもある。同様に、腫瘍の細胞が局所的または離れた組織および器官に広まる「腫瘍拡散」が起こり、したがって、腫瘍拡散は腫瘍転移を包含する。腫瘍の増殖が局所的に拡散して正常な器官の機能の圧縮、破壊、または阻止によって関与組織の機能を危険にさらす「腫瘍浸潤」が生じる。

本明細書で使用されるように、用語「転移」とは、元々の癌腫瘍の器官に直接つながっていない器官または身体部分の癌腫瘍の成長を指す。転移は、元々の癌の腫瘍の器官に直接つながれていない器官または身体部分における検出不可能な量の癌細胞の存在である微小癌組織の転移を含むことが理解されよう。転移は、元々の腫瘍部位から癌細胞が離れることや癌細胞が身体の他の部分に遊走および／または浸潤することといったプロセスの複数の工程として定義可能である。

患者に対する「サンプル」との用語は、血液や生体起源の他の液体サンプル、生検材料または組織培養物またはそれに由来する細胞およびその後代などの個体組織サンプルを包含する。この定義は、試薬による処置、洗浄、または、癌細胞などの特定の細胞集団向けの濃縮などによって、調達後に任意の方法で操作されたサンプルを含んでいる。この定義は、特定のタイプの分子について濃縮されたサンプル、例えば、核酸、ポリペプチドなども含んでいる。用語「生体サンプル」は臨床のサンプルを包含し、同様に、外科的切除によって得られた組織、生検によって得られた組織、培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、組織サンプル、器官、骨髄、血液、血漿、血清なども含む。「生体サンプル」は、患者の癌細胞から得られたサンプル、例えば、患者の癌細胞（例えば、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを含む細胞溶解物または他の細胞抽出液）から得られるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを含むサンプル）；ならびに、患者からの癌細胞を含むサンプルを含む。患者からの癌細胞を含む生体サンプルはさらに非癌細胞を含み得る。

乳癌、前立腺癌または他のタイプの癌の分子の亜型の同定のような分子か病的な状態、疾患または症状の同定を参照するために、用語「診断」が使用される。

用語「予後」とは、癌の再発、癌の転移拡散、および薬剤耐性を含む疾患進行（例えば、癌に起因し得る死または進行）の可能性の予測を指すために使用される。用語「予測」は、観察、経験、または科学的推論に基づいて予告または評価する行為を指すために使用される。一例において、医師は、患者が、癌を再発させることなく原発腫瘍の外科的切除および／または一定期間の化学療法の後に生き残る可能性を予測することもある。

「特異的結合」、「特異的に結合する」などの用語は、溶液または反応混合物（例えば、抗体は、特に他の入手可能なポリペプチドに比べて特別のポリペプチドまたはエピトープに結合する）中の他の分子または実体と比較して、分子への非共有的または共有的な優先結合を指す。いくつかの実施形態では、１つの分子が別の分子に特異的に結合する親和性は、１０^−５Ｍ以下（例えば、１０^−６Ｍ以下、１０^−７Ｍ以下、１０^−８Ｍ以下、１０^−９Ｍ以下、１０^−１０Ｍ以下、１０^−１１Ｍ以下、１０^−１２Ｍ以下、１０^−１３Ｍ以下、１０^−１４Ｍ以下、１０^−１５Ｍ以下、または１０^−１６Ｍ以下）のＫ_ｄ（解離定数）を特徴とする。「親和性」とは結合の強度を指し、結合親和性の増加はより低いＫ_ｄと相関する。

本明細書で使用されるような用語「特異的結合メンバー」は、特異的結合ペアのメンバーを指す（つまり２つの分子、通常は、２つの異なる分子で、分子の１つ、例えば、第１の特異的結合メンバーが非共有結合手段を介して別の分子、例えば、第２の特異的結合メンバーと特異的に結合する）。

「同時投与」、「同時投与する」および、「〜と併用して」との用語は、特定の時間制限なく、同時の、並行した、または連続した２つ以上の治療薬の投与を含む。１つの実施形態では、薬剤は、同時に細胞または被験体の身体に存在するか、あるいは同時に生物学的効果または治療的効果を働かせる。１つの実施形態では、治療薬は同じ組成物または単位剤形である。他の実施形態では、治療薬は別々の組成物または単位剤形である。ある実施形態では、第１の薬剤は、第２の治療薬の投与前（例えば、数分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週、２週、３週、４週、５週、６週、８週、または１２週前）、第２の治療薬の投与と同時に、あるいは、第２の治療薬の投与後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週、２週、３週、４週、５週、６週、８週、または１２週後）に投与可能である。

例えば、癌治療薬、感染症を処置する治療薬、または腫瘍を対象とする抗体の、本開示の医薬組成物との「併用投与」とは、薬／抗体と本開示の組成物の両方が治療効果を持つような時間に高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを用いる投与を意味する。このような併用投与は、本開示の化合物の投与に対して、薬／抗体の投与と並行して（つまり、同時に）、投与前、または投与後を含み得る。当業者は、特別の医薬品および本開示の組成物の投与の適切なタイミング、順番、および量を決定するのには苦労しないだろう。

いくつかの実施形態では、処置は、本開示の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの、別の薬剤（例えば、免疫刺激剤、慢性感染症を処置する薬剤、細胞毒性薬など）との組み合わせを投与することにより行われる。典型的な１つのクラスの細胞毒性薬は化学療法剤である。典型的な化学療法剤としては、限定されないが、アルデスロイキン、アルトレタミン、アミホスチン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クラドリビン、シサプリド、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロナビノール、デュオカルマイシン、エトポシド、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、グラニセトロン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、インターフェロンα、イリノテカン、ランソプラゾール、レバミソール、ロイコボリン、メゲストロール、メスナ、メトトレザト、メトクロプラミド、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オメプラゾール、オンダンセトロン、パクリタキセル（タキソール（商標））、ピロカルピン、プロクロルペラジン、リツキシマブ、サポリン（ｓａｐｒｏｉｎ）、タモキシフェン、タキソール、塩酸トポテカン、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、および酒石酸ビノレルビンが挙げられる。

他の併用療法は、細胞特異的な抗体、例えば、腫瘍細胞マーカー、放射線、外科手術、および／またはホルモン欠乏に選択的な抗体を用いる投与を含んでいる（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９６： １５０７４−９， １９９９）。血管新生抑制剤は本開示の方法と組み合わせることもできる。現在、多くの抗体が癌の処置のための臨床で使用されており、それ以外のものは臨床開発の変動ステージである。例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置のための多くの抗原と対応するモノクローナル抗体がある。１つの標的抗原はＣＤ２０である。リツキシマブはＣＤ２０抗原を対象とするキメラ非抱合型モノクローナル抗体である。ＣＤ２０はＢ細胞の活性化、増殖、および分化において重要な機能的役割を有する。ＣＤ５２抗原は、慢性リンパ球性白血病の処置に用いられる、モノクローナル抗体であるアレムツズマブによって標的とされる。ＣＤ２２は多くの抗体によって標的とされ、最近では化学療法抵抗性の毛様細胞性白血病中の毒素と組み合わせて有効性が実証されている。ＣＤ２０を標的とする新しい２つのモノクローナル抗体（トシツモマブとイブリツモマブ）が、食品医薬品局（ＦＤＡ）に提出されている。これらの抗体は放射性同位元素と共役する。アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）は慢性リンパ球性白血病の処置で使用され、ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）は急性骨髄性白血病の処置で使用され、イブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ）は非ホジキンリンパ腫の処置で使用され、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）は結腸癌の処置で使用される。

固形腫瘍で使用されてきた本開示の方法で有用なヒト化およびキメラ変異体を含むモノクローナル抗体は、限定されないが、エドレコロマブとトラスツズマブ（ハーセプチン）を含んでいる。エドレコロマブは、結腸癌と直腸癌で見られる１７−１Ａ抗原を標的とし、これらの兆候についてヨーロッパでの使用が承認されている。トラスツズマブはＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原を標的とする。この抗原は乳癌の２５％から３５％で見られる。セツキシマブ（アービタックス）も本開示の方法での使用を対象としている。抗体はＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）に結合し、結腸癌と頭部と頸部（ＳＣＣＨＮ）の扁平上皮癌を含む固形腫瘍の処置で使用されている。

場合によっては、そのようなものとして、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＤ１１７、Ｃ−Ｍｅｔ、ＰＴＨＲ２、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３）など）を除く抗原に特異的に結合する薬剤（例えば抗体）と同時投与される。癌細胞マーカーに特異的に結合するＣＤＲを含む抗体（したがって、併用療法（主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドと同時投与される）で使用することができる）の例としては、限定されないが、セツキシマブ（ＥＧＦＲに結合する）、パニツムマブ（ＥＧＦＲに結合する）、リツキシマブ（ＣＤ２０に結合する）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２に結合する）、ペルツズマブ（ＨＥＲ２に結合する）、アレムツズマブ（ＣＤ５２に結合する）、およびブレンツキシマブベドチン（ＣＤ３０に結合する）が挙げられる。

場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とともにＴ細胞に同時投与される（こうした細胞は本明細書で「ＴＣＲ操作されたＴ細胞」とも呼ばれる）。ＴＣＲ操作されたＴ細胞の非限定的な適切な例は次のとおりである：（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含んでいるＴ細胞；および、（ｉｉ）癌抗原などの抗原に結合する異種起源のＴＣＲを含んでいるＴ細胞（ＴＣＲ操作されたＴ細胞は、核酸の導入について以下で詳細に記載されている）。

主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、任意の便利な免疫調節剤（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗−ＰＤ−１抗体、ＣＤ４０アゴニスト、４−１ＢＢモジュレーター（例えば４１ＢＢアゴニスト）など）とともに同時投与可能である。場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＢＴＬＡおよび／またはＣＤ１６０の阻害剤とともに同時投与される。場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＴＩＭ３および／またはＣＥＡＣＡＭ１の阻害剤とともに同時投与される。

本明細書で使用されるように、成句「無病生存率」とは、患者の寿命に対する癌の影響に関して、診断後のこうした腫瘍の再発および／または拡散の欠如と患者の運命を指す。成句「全生存」とは、患者の死因が癌の直接的な影響によるものではない可能性の如何にかかわらず、診断後の患者の運命を指す。成句「無病生存率の可能性」、「再発リスク」、およびその変形は、癌の診断後の患者の腫瘍の再発または拡散の可能性を指し、その確率は本開示のプロセスによって決定される。

本明細書で使用されるように、用語は「相互に関連する」または「〜に相互に関連する」および類似する用語は、２つの事象例の間の統計的な関連性を指し、事象は数、データセットなどを含む。例えば、事象が数を含む場合、正の相関（本明細書では「直接相関」とも呼ばれる）とは１つが増えると他も増えることを意味する。負の相関（本明細書では「逆相関」とも呼ばれる）は、１つが増えると他は減少することを意味する。

「単位剤形」は、処置される特定の個体に対する単位投与量として適切な物理的に別の単位を指す。各単位は、要求された薬学担体に関連して所望の治療効果を生むように計算された所定量の活性化合物を含むことができる。単位剤形に関する明細書は、（ａ）活性化合物の特有の特性と達成される特定の治療効果、および（ｂ）こうした活性化合物を調剤する技術に固有の限定によって決定可能である。

「薬学的に許容可能な賦形剤」とは、一般に安全で、無毒で、望ましい医薬組成物を調製するのに役立つ賦形剤を意味し、動物への使用とヒトの製薬用途にも許容可能な賦形剤を含んでいる。こうした賦形剤は固体、液体、半固体、または、エアロゾル組成物の場合にはガス状であり得る。

用語「薬学的に許容可能な」、「生理学的に容認できる」、および、その文法的な変形は、組成物、担体、希釈剤、および試薬を指すように交換可能に使用され、この材料が組成物の投与を禁止する程度の望ましくない生理的効果をもたらすことなくヒトへ投与することが可能であることを表す。

「治療上有効な量」は、疾患を処置するために被験体に投与される際に、その疾患の処置をもたらすのに十分な量を意味する。

本明細書で使用されるような用語「標的細胞」は、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの投与後に免疫系による破壊の標的にされる細胞を指す。場合によっては、標的細胞はＰＤ−Ｌタンパク質（例えばＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２）を発現する。主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、標的細胞の表面上で発現されたＰＤ−Ｌタンパク質に結合することによって標的細胞へ結合することができる。したがって、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドが、ＰＤ−Ｌ１発現細胞とＰＤ−１発現細胞ｔとの間の相互作用を阻害することによって、ＰＤ−１発現細胞中でのＰＤ−１シグナル伝達の減少を促すことから、用語「標的細胞」はＰＤ−Ｌ１−発現細胞を指すことができる。

しかしながら、標的細胞はＰＤ−Ｌ１を発現する必要はない。場合によっては、標的細胞（例えば、感染細胞、癌細胞など）はＰＤ−Ｌ１を発現しない。いくつかのこうした場合には、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの投与により、免疫系が刺激され、それにより、標的細胞が破壊されることになる。

場合によっては、標的細胞は「損傷を受けた」細胞（例えば、「損傷を受けた」個体からの細胞）であり、用語「損傷を受けた」は、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドで処置することができる症状、病気、または疾患を抱える被験体を指すために本明細書では使用されている。「病気に罹患した」個体は、癌を抱えていることもあれば、感染症（例えば慢性感染症）を抱えていることもあれば、免疫障害（例えば、免疫抑制に関連する障害）を抱えていることもあれば、炎症性障害を抱えていることもあれば、および／または他の過剰増殖性の疾患、例えば、硬化症、繊維症などを抱えていることもある。「損傷を受けた細胞」は、症状、病気、または疾患を引き起こす細胞であり得る。非限定的な例として、病気に罹患した患者の損傷を受けた細胞は、ＰＤ−Ｌ１発現癌細胞、感染細胞、炎症細胞などであり得る。場合によっては、病気または疾患を主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドで治療することができるという１つの指標は、関与する細胞（つまり、損傷を受けた細胞（例えば、癌細胞、感染細胞、炎症細胞、免疫細胞など）がＰＤ−Ｌ１を発現するということである。場合によっては、損傷を受けた細胞（例えば癌細胞）はＰＤ−Ｌ１を発現しないが、その病気（例えば癌）は主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを使用して依然として治療することが可能である。

用語「処置」、「処置すること」、「処置する」などは、望ましい薬理学的および／または生理学的効果を達成することを一般に指すために本明細書で使用される。この効果は、病気またはその症状を完全にまたは部分的に予防する点では予防的であり得、および／または、病気および／またはその病気に起因する副作用の部分的または完全な安定化または治癒の観点からは治療的なこともある。用語「処置」は、哺乳動物、とりわけヒトの疾患の任意の処置も包含し、以下を含む：（ａ）疾患または症状に陥りやすいがまだそれに罹患していると診断されていない被験体で疾患および／または症状が生じることを防ぐこと；（ｂ）疾患および／または症状を阻害すること、つまり、それらの発症を妨げること、または（ｃ）病徴を軽減すること、つまり、疾患および／または症状の退行をもたらすこと。処置を必要としている人は、すでに病気に罹患した人（例えば、癌を抱える人、感染症を抱える人、免疫不全を抱える人など）や、予防が望ましい人（例えば、癌に対する罹患率が高い人、感染症の可能性が高い人、癌に罹る疑いのある人、感染症を抱える疑いのある人など）を含む。

治療的処置とは被験体が投与前に病気に罹患した場合の治療であり、予防療法とは被験体が投与前に病気に罹患していない場合の治療である。いくつかの実施形態では、被験体は、処置の前に病気に罹患するか、病気に罹患している疑いのある可能性が高い。いくつかの実施形態では、被験体は、病気に罹患する可能性が高くなる疑いがある。

本明細書で使用されるとき、「標識」という言葉は、主題のＰＤ−１模倣ポリペプチドに直接または間接的に共役する検知可能な化合物または組成物を指す。標識それ自体は単独で検知可能なこともあり（例えば、放射性同位元素標識または蛍光性標識）、あるいは、酵素の標識の場合には、検知可能な基質化合物または組成物の化学変換を触媒することがある。

「固相」によって、本開示の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドが付着することができる非水性のマトリックスを意味する。本明細書で包含される固相の例としては、ガラス（例えば、制御されたポアガラス）、多糖（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、およびシリコーンから部分的にまたは完全に形成されたものが挙げられる。ある実施形態では、文脈によっては、固相はアッセイプレートのウェルを含むことがあり、それ以外のものでは、精製カラム（例えば親和性クロマトグラフィーカラム）である。この用語はさらに離散粒子の不連続な固相を含んでいる。

用語「抗体」は最も広範な意味で使用され、望ましい生物活性を示す限り、モノクローナル抗体（完全長のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを特異的に包含する。「抗体」（Ａｂｓ）と「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は同じ構造的な特性を有する糖タンパク質である。抗体が特異性抗原に対する結合特異性を示す一方で、免疫グロブリンは抗原特異性を欠いた抗体と他の抗体様分子の両方を含んでいる。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系により低いレベルで、および骨髄腫により高いレベルで生成される。

「抗体フラグメント」およびそのすべての文法的な変異体は、本明細書で使用されるように、無処置の抗体の抗原結合部位または可変領域を含む無処置の抗体の一部として定義され、一部とは無処置の抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（つまり、抗体アイソタイプに依存してＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含まない。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；任意の抗体フラグメント、それはポリペプチドである、一次構造を持っていること、切れ目がないアミノ酸残基（引用された、本明細書で「一本鎖の抗体フラグメント」または「一本鎖・ポリペプチド」として）の１つの中断されない配列からなること、限定（１）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（２）１つの軽鎖可変ドメイン、または関連する重鎖部分のない軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含むそのフラグメントのみを含んでいる一本鎖ポリペプチド、（３）１つの重鎖可変領域、または関連する軽鎖部分のない重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含むそのフラグメントのみを含んでいる一本鎖ポリペプチド、および、（４）ヒト以外の種からの単一のＩｇドメインまたは他の特異的な単一ドメイン結合モジュールを含むナノボディ；および、抗体フラグメントから形成された多特異性構造または多価構造が挙げられる。１つ以上の重鎖を含む抗体フラグメントでは、重鎖は、無処置の抗体の非Ｆｃ領域で見られる任意の定常ドメイン配列（例えば、ＩｇＧアイソタイプ中のＣＨ１）を含むことができ、および／または、無処置の抗体で見られる任意のヒンジ領域配列を含むことができ、および／または、重鎖のヒンジ領域配列または定常ドメイン配列に融合または位置するロイシンジッパー配列を含むことができる。

「天然の抗体と免疫グロブリン」は通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。軽鎖はそれぞれ１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド結合の数は様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。重鎖と軽鎖はそれぞれ規則的に距離をおいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は一方の端部に可変ドメイン（ＶＨ）とその後の多くの定常ドメインを有する。各軽鎖は一方の端部に可変ドメイン（ＶＬ）を、もう一方の端部に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと位置合わせされ、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと位置合わせされる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変ドメイン間のインタフェースを形成すると考えられている（Ｃｌｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８６：６５１ （１９８５）； Ｎｏｖｏｔｎｙ ａｎｄ Ｈａｂｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８２：４５９２ （１９８５））。

用語「可変」とは、可変ドメインの特定の部分が抗体中で大きく異なり、その特定の抗原について各々の特定の抗体の結合と特異性で使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。それは、軽鎖と重鎖の両方の可変ドメイン中の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖と軽鎖の可変ドメインは各々、ｂ−シート構造を接続する、場合によってはｂ−シート構造の一部を形成するループを形成する３つのＣＤＲにより接続された、ｂ−シート構造を採用している４つのＦＲ領域を含む。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって極めて接近して一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１）を参照）。定常ドメインは抗体を抗原に結合することに直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。

抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合性フラグメントと、その名前が容易に結晶させる能力を反映している残基「Ｆｃ」フラグメントを生成する。ペプシン処置により、２つの抗原結合部位を有するとともに依然として抗原を架橋結合することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントが生成される。

「Ｆｖ」は、完全抗原認識部位と完全抗原結合部位を含む最小限の抗体フラグメントである。２つの鎖Ｆｖ種では、この領域は、緊密な非共有結合性会合中の１つの重鎖と１つの軽鎖の可変ドメインからなる。単一の鎖のＦｖ種（ｓｃＦｖ）では、１つの重鎖と１つの軽鎖の可変ドメインは、軽鎖と重鎖が２つの鎖Ｆｖ種においてそれに類似した「二量体」構造で会合することができるように、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合することが可能である。ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するために、それぞれの可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用するのはこの構造内である。まとめて、６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、全結合部位よりも親和性は低いが、１つの可変ドメインでも（または、抗原に特異的なわずか３つのＣＤＲしか含まないＦｖの半分）、抗原を認識して結合する能力を有している。ｓｃＦｖの調査については、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９−３１５ （１９９４）を参照されたい。

Ｆａｂフラグメントはさらに、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少数の残基を加えることでＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’に関する本明細書での命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、その間にヒンジ・システインを有するＦａｖ’フラグメントのペアとして生成された。抗体フラグメントの他の化学的結合も知られている。

５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２に分けることが可能である。様々なクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、ａ、ｄ、ｅ、ｇ、およびｍと呼ばれる。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造と三次元構造は周知である。免疫のエフェクターの機能、半減期、または血清安定性を増減させるものを含む免疫グロブリンサブクラスの操作された変異体もこの用語により包含される。

それとは逆に別段の定めのない限り、本明細書に記載および主張される用語「抱合体」は、１つ以上の抗体フラグメントの１つ以上のポリマー分子との共有結合により形成された異種起源の分子として定義され、異種起源の分子は水に溶解可能であり、つまり、血液などの生理液に溶解可能であり、異種起源の分子は任意の構造化した凝集体を含まない。対象となる抱合体はＰＥＧである。前述の定義の文脈において、用語「構造化した凝集体」とは、（１）異種起源の分子がミセルでも他のエマルジョン構造でもなく、脂質二重層、小胞、またはリポソームに固定されないように、スフェロイドまたはスフェロイド殻構造を有する水溶液中の分子の任意の凝集体、および、（２）水相と接触すると異種起源の分子を溶液へ放出しない、クロマトグラフィー・ビーズ・マトリックスなどの固体または不溶化形態の分子の任意の凝集体を指す。これに応じて、本明細書で定義されるような用語「抱合体」は、固体の水和時に前述の異種起源の分子を水溶液へ放出することができる、沈殿物、沈降物、生体分解性マトリックスまたは他の固体の前述の異種起源の分子を包含する。

本開示で使用されるように、用語「エピトープ」は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原決定基を意味する。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または砂糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面のグループからなり、通常、比電荷特性と同様に特異的な３次元の構造的な特性を有している。

（組成物）
高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドとそのアナログが提供され、これは一般的に高親和性ＰＤ−１試薬と呼ばれることがある。高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは野生型ヒトＰＤ−１タンパク質の変異体である。いくつかの実施形態では、本開示は高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを提供し、ポリペプチドはＰＤ−１膜貫通ドメインを欠いており（および、溶解可能な高親和性ＰＤ−１でありえる）、野生型のＰＤ−１配列に対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含み、アミノ酸変化は、（例えば、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍またはそれ以上、オフレート（ｏｆｆ ｒａｔｅ）を低下させることによって）ＰＤ−Ｌ１への結合に対するＰＤ−１模倣ポリペプチドの親和性を増加させる。主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドがＰＤ−１膜貫通ドメインを欠いているとき、膜貫通ドメイン（例えばＰＤ−１膜貫通ドメイン）からのいくつかのアミノ酸は依然として存在することがある（例えば、タンパク質が所望の機能を保持する限り、膜貫通ドメインからのいくつかのアミノ酸は保持されることがある）を理解されたい。場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは溶解可能である。場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドはＰＤ−１膜貫通ドメインを欠いているが、異種起源の膜貫通ドメインを含む（つまり、膜貫通ドメインはＰＤ−１以外のタンパク質を形成する）。場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは膜貫通ドメインを含み（例えば、異種起源の膜貫通ドメイン、ＰＤ−１膜貫通ドメインなど）、外部ドメイン部分と膜貫通ドメインとの間に開裂可能なリンカーを含んでいる。

（ポリペプチド）
本明細書で使用されるような「ＰＤ−１模倣ポリペプチド」は、認識しうる親和性でＰＤ−Ｌ（例えばＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２）に結合するのに十分であるが、膜貫通ドメインを欠いている（例えば、野生型ＰＤ−１タンパク質の天然に存在する膜貫通ドメインを欠いている）、ＰＤ−１タンパク質の一部を有するポリペプチドを指す。したがって、天然に存在するＰＤ−１ポリペプチドとは異なり、主題のＰＤ−１模倣ポリペプチドは、膜貫通ドメインによって細胞膜に永久には結合されない。いくつかの実施形態では、主題のＰＤ−１模倣ポリペプチドは溶解可能である。細胞の原形質膜に通常結合されるタンパク質の細胞外ドメインは、当該技術分野ではしばしば外部ドメインと呼ばれる。したがって、ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−１の外部ドメインである（またはそれに由来する）とみなされることがあるか、あるいは、ＰＤ−１ポリペプチドの外部ドメインの少なくとも一部（またはそれに由来する一部）を含むとみなされ得る。

野生型ＰＤ−１タンパク質は膜貫通ドメインを有しており、細胞表面上で発現し、細胞表面上で表現するそのＰＤ−Ｌリガンド（ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２）に特異的に結合する。したがって、第１の細胞の表面上で発現される野生型ＰＤ−１は、第２の細胞の表面上で発現されるＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２に特異的に結合する。ＰＤ−１模倣ポリペプチドが対応する（例えば、ＰＤ−１模倣ポリペプチドの由来する元である）ＰＤ−１タンパク質は、任意のＰＤ−１タンパク質（例えば野生型ＰＤ−１タンパク質）であり得る。例として、ＰＤ−１タンパク質は、任意の種、例えば、哺乳動物のＰＤ−１タンパク質、げっ歯動物のＰＤ−１タンパク質、霊長類のＰＤ−１タンパク質、ラットのＰＤ−１タンパク質、マウスのＰＤ−１タンパク質、ブタのＰＤ−１タンパク質、ウシのＰＤ−１タンパク質、ヒツジのＰＤ−１タンパク質、ウサギのＰＤ−１タンパク質、イヌのＰＤ−１タンパク質、ヒトＰＤ−１タンパク質などからのタンパク質を含む。様々な野生型ＰＤ−１ポリペプチド配列（例えば、イヌ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、げっ歯動物、マウス、ラット、ネコ、霊長類、サル、類人猿、チンパンジーなど）の配列は容易に見つけることが可能であり、当業者は容易に入手可能である。例えば、ヒトＰＤ−１タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示される）は次のとおりである：

野生型ヒトＰＤ−１
（「プログラム細胞死１」、ＰＤＣＤ１、ＣＤ２７９、ＰＤ１、ＳＬＥＢ２、ｈＰＤ−１、ｈＰＤ−ｌおよびｈＳＬＥ１としても知られている）

ＰＤ−Ｌタンパク質はＰＤ−１への膜結合型リガンドである。当該技術分野でＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２と呼ばれる２つのヒトＰＤ−Ｌタンパク質がある。例として、ＰＤ−Ｌタンパク質は、任意の種、例えば、哺乳動物のＰＤ−Ｌタンパク質、げっ歯動物のＰＤ−Ｌタンパク質、霊長類のＰＤ−Ｌタンパク質、ラットのＰＤ−Ｌタンパク質、マウスのＰＤ−Ｌタンパク質、ブタのＰＤ−Ｌタンパク質、ウシのＰＤ−Ｌタンパク質、ヒツジのＰＤ−Ｌタンパク質、ウサギのＰＤ−Ｌタンパク質、イヌのＰＤ−Ｌタンパク質、ヒトのＰＤ−Ｌタンパク質などからのタンパク質を含んでいる。様々な野生型ＰＤ−Ｌポリペプチド配列（例えば、イヌ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、げっ歯動物、マウス、ラット、ネコ、霊長類、サル、類人猿、チンパンジーなど）の配列は容易に見つけることが可能であり、当業者は容易に入手可能である。例えば、ヒトのＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２のタンパク質（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６−３８として示される）は次のとおりである：

野生型ヒトＰＤ−Ｌ１
（「プログラム細胞死１リガンド１」、ＰＤＣＤ１ＬＧ１、ＣＤ２７４、Ｂ７−Ｈ、Ｂ７Ｈ１、ＰＤＬ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤＣＤ１Ｌ１としても知られている）

野生型ヒトＰＤ−Ｌ２
（「プログラム細胞死１リガンド２」、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＣＤ２７３、Ｂ７ＤＣ、Ｂｔｄｃ、ＰＤＬ２、ＰＤＣＤ１Ｌ２、ｂＡ５７４Ｆ１１．２としても知られている）

野生型ＰＤ−１の膜貫通ドメインは容易に識別可能である。例示的な例として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される野生型ヒトＰＤ−１タンパク質上で３つの様々なドメイン予測プログラムが実行され、以下の重複するアミノ酸領域が膜貫通ドメインを定義すると判定された：１６８−１９１、１６７−１８９および１６９−１９１。したがって、膜貫通ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される野生型ヒトＰＤ−１タンパク質のアミノ酸１６７−１９１（例えば、１６８−１９１、１６７−１８９、および／または１６９−１９１）に存在する。ゆえに、場合によっては、ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される野生型ヒトＰＤ−１タンパク質のアミノ酸１６７−１９１、１６８−１９１、１６７−１８９、および／または１６９−１９１を欠いているか、あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質の対応する領域を欠いている。様々な追加の野生型ＰＤ−１ポリペプチド配列（例えば、イヌ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、げっ歯動物、マウス、ラット、ネコ、霊長類、サル、類人猿、チンパンジーなど）の配列は容易に見つけることが可能であり、当業者は容易に入手可能である。

適切なＰＤ−１模倣ポリペプチドはＰＤ−Ｌ（例えば、標的細胞上、例えば癌細胞上のＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２）に特異的に結合し、それによってＰＤ−ＬとＰＤ−１（例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞上のＰＤ−１）との間の相互作用を低下させる（例えば、阻害する、防ぐなど）。ゆえに、主題のＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ（例えば、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２）の操作されたデコイ受容体であると考えることができる。ＰＤ−ＬとＰＤ−１の間の相互作用を低下させることによって、主題のＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ／ＰＤ−１相互作用によって生成される免疫抑制シグナルを減少させることができ、したがって、（例えば、Ｔ細胞活性化を増加させることにより）免疫応答を増加させることができる。

適切なＰＤ−１模倣ポリペプチドは、認識しうる親和性、例えば、高親和性でＰＤ−Ｌ１に結合するのに十分なＰＤ−１の部分であって、シグナル配列と膜貫通ドメインの間に通常位置する部分、または結合活性を保持するそのフラグメントを含む。ゆえに、主題のＰＤ−１模倣ポリペプチドは、免疫グロブリンドメイン、または認識しうる親和性でＰＤ−Ｌ１と結合するのに十分な（以下に記載されるような）その一部を含むことができる。主題のＰＤ−１模倣ポリペプチド（例えば、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド）は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と２７−３４で示される配列（または、他のＰＤ−１タンパク質、例えば、他の哺乳動物のＰＤ−１タンパク質の対応する配列）のいずれかの隣接するアミノ酸を含む、免疫グロブリンドメイン以外の野生型ＰＤ−１タンパク質の一部を含むことができる。

場合によっては、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２に結合するのに十分なＰＤ−１の部分は、当業者により容易に識別可能な野生型ＰＤ−１ポリペプチドの免疫グロブリンドメインのすべてまたは一部を含んでいる。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される野生型のヒトＰＤ−１配列の走査は、アミノ酸３５−１４６からの領域が免疫グロブリンドメインを含むことを明らかにする（表１）。ＰＤ−１模倣ポリペプチド（例えば、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド）は、ＰＤ−１の免疫グロブリンドメインのすべてまたは一部を含むことがあり、免疫グロブリンドメインのＰＤ−１外部からの１つ以上のアミノ酸をさらに含むことがあり、限定なしに免疫グロブリンＦｃ領域配列を含む、ＰＤ−１以外のアミノ酸配列を含むことがある。

場合によっては、ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、野生型ＰＤ−１ポリペプチドに対して（例えば、野生型ＰＤ−１ポリペプチドの対応領域に対して）（例えば、哺乳動物の野生型ＰＤ−１ポリペプチド；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に明記されるヒト野生型ＰＤ−１タンパク質など）、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、又は１００％の配列同一性）を有しているアミノ酸配列を含む。

場合によっては、ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、野生型ＰＤ−１ポリペプチドの免疫グロブリンドメイン（例えば、免疫グロブリンＶ−セットドメイン又は免疫グロブリンＶ型ドメイン（ＩＧｖドメイン）；免疫グロブリン様フォールド；免疫グロブリン可変ドメイン；免疫グロブリン様ドメインなど）に対して８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、又は１００％の配列同一性）を有しているアミノ酸配列を含む。様々な付加的な野生型ＰＤ−１ポリペプチド配列に関する配列（例えば、イヌ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、げっ歯類、マウス、ラット、ネコ、霊長類、サル、類人猿、チンパンジーなど）は、容易に見出すことができ、且つ当業者に容易に利用可能となる。

場合によっては、ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に明記されるヒトＰＤ−１アミノ酸配列の免疫グロブリンドメイン含有領域；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質（例えば、別の哺乳動物の野生型ＰＤ−１タンパク質）の対応領域に対して８５％の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、又は１００％の配列同一性）を有しているアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に明記される野生型ヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸３５−１４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、３８−１２８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、３９−１４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）、３９−１４６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、４９−１２５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、４２−１３６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、３９−１２５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、３５−１４６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、１−１６６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、及び／又は２６−１４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質（例えば、別の哺乳動物の野生型ＰＤ−１タンパク質）の対応領域に対して、８５％の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、又は１００％の配列同一性）を有しているアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に明記される野生型ヒトＰＤ−１タンパク質配列（アミノ酸配列）のアミノ酸３５−１４５、３８−１２８、３９−１４５、３９−１４６、４９−１２５、４２−１３６、３９−１２５、３５−１４６、１−１６６、及び／又は２６−１４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質（例えば、別の哺乳動物の野生型ＰＤ−１タンパク質）の対応領域を含む。

場合によっては、ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記される天然のＰＤ−１模倣ポリペプチドのアミノ酸配列（即ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記されるＰＤ−１タンパク質フラグメント）；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質（例えば、別の哺乳動物の野生型ＰＤ−１タンパク質）の対応領域に対して８５％の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、又は１００％の配列同一性）を有しているアミノ酸配列を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記されるポリペプチドは、野生型ヒトＰＤ−１タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のタンパク質フラグメント（アミノ酸２６−１４７）である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記されるアミノ酸配列は、野生型ヒトＰＤ−１ポリペプチドの免疫グロブリンドメインを含む。場合によっては、ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記されるアミノ酸配列（即ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に明記されるヒトＰＤ−１タンパク質配列のアミノ酸２６−１４７）（即ち、場合によっては、ＰＤ−１模倣ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記されるＰＤ−１タンパク質フラグメントを含む）；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質、例えば、別の哺乳動物の野生型ＰＤ−１タンパク質の対応領域を含む。

場合によっては、ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２−２５の何れかに明記されるアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、又は１００％の配列同一性）（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２−２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４−２５などの何れかに対し８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、又は１００％の配列同一性）を有しているアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２−２５（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２−２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４−２５など）の何れかに明記されるアミノ酸配列を含む。

野生型ＰＤ−１タンパク質の対応領域に対して変異がないＰＤ−１模倣ポリペプチド（即ち、ＰＤ−１模倣ポリペプチドが野生型タンパク質のフラグメントである場合）は、本明細書では「天然のＰＤ−１模倣ポリペプチド」と称される。天然のＰＤ−１模倣ポリペプチドは、様々な例、例えば、ＰＤ−１模倣ポリペプチドが「高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド」であるかどうかを判定する幾つかの場合において、対照として使用され得る。

高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド。「高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド」は、野生型ＰＤ−１タンパク質に対して（例えば、野生型ＰＤ−１タンパク質の対応領域に対して、野生型ＰＤ−１タンパク質の細胞外ドメインに対して、野生型ＰＤ−１タンパク質の免疫グロブリンドメインに対して、天然のＰＤ−１模倣ポリペプチドに対して、など）、アミノ酸の変異（例えば、アミノ酸の変化）があるＰＤ−１模倣ポリペプチド（上記に定義されるようなものであり、故に野生型ＰＤ−１タンパク質の膜貫通ドメインを欠いている）であり、ここで、アミノ酸変異は、ＰＤ−Ｌ１に関する高親和性のＰＤ−１模倣ポリペプチドの親和性が、ＰＤ−Ｌ１に関するＰＤ−１模倣タンパク質（及び／又は、対応する天然のＰＤ−１模倣ポリペプチド）の親和性よりも大きくなるように、ＰＤ−Ｌ１に関するＰＤ−１模倣ポリペプチドの親和性を増加させる。例えば、アミノ酸変異は、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、又はそれ以上、オフレートを減らすことにより、親和性を増加することができる。

本開示によれば、アミノ酸変異（即ち、変化）は、当該技術分野で既知の又は後に発見される、任意の自然発生又は人為的なアミノ酸修飾を含む。幾つかの実施形態において、アミノ酸変化は、例えば１以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入などを含む。幾つかの実施形態において、アミノ酸変化は、既存のアミノ酸を別のアミノ酸に置き換えることを含む。関連する実施形態において、アミノ酸変化は、１以上の既存のアミノ酸を非天然アミノ酸に置き換える、又は１以上の非天然アミノ酸を挿入することを含む。アミノ酸変化は、野生型配列に対して１以上（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上など）のアミノ酸残基において行われ得る。１以上のアミノ酸変化は、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドに様々な特性を付与することができ、例えば、安定性、結合活性、及び／又は特異性などに影響を及ぼす。

場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、野生型ＰＤ−１ポリペプチド（例えば、哺乳動物の野生型ＰＤ−１ポリペプチド；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に明記されるヒト野生型ＰＤ−１タンパク質）に対して（例えば、野生型ＰＤ−１ポリペプチドの対応領域に対して）、アミノ酸変化（例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、又は２０のアミノ酸変化）を含む。

場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、野生型ＰＤ−１ポリペプチドの免疫グロブリンドメイン（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に明記される野生型ヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸３５−１４５、３８−１２８、３９−１４５、３９−１４６、４９−１２５、４２−１３６、３９−１２５、３５−１４６、１−１６６、及び／又は２６−１４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質、例えば別の哺乳動物の野生型ＰＤ−１タンパク質の対応領域）に対して、アミノ酸変化（例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、又は２０のアミノ酸変化）を含む。場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、野生型ＰＤ−１ポリペプチドの細胞外ドメインに対して、アミノ酸変化（例えば１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、又は２０のアミノ酸変化）を含む。

場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、（上記に定義されるように、ヒトの「天然のＰＤ−１模倣ポリペプチド」である）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記されるアミノ酸配列；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質、例えば別の哺乳動物の野生型ＰＤ−１タンパク質の対応領域に対して、アミノ酸変化（例えば１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、又は２０のアミノ酸変化）を含む。場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２−２５の何れかに明記されるアミノ酸配列に対して（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３−２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２−２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３−２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２４−２５などの何れかに明記されるアミノ酸配列に対して）、アミノ酸変化（例えば１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、又は２０のアミノ酸変化）を含む。

場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、野生型ＰＤ−１ポリペプチド（例えば、野生型ＰＤ−１ポリペプチドの対応領域）（例えば、哺乳動物の野生型ＰＤ−１ポリペプチド；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に明記されるヒト野生型ＰＤ−１タンパク質など）に対して、アミノ酸変化（例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、又は２０のアミノ酸変化）を含み、且つ、野生型ＰＤ−１ポリペプチド（例えば、野生型ＰＤ−１ポリペプチドの対応領域）（例えば、哺乳動物の野生型ＰＤ−１ポリペプチド；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に明記されるヒト野生型ＰＤ−１タンパク質など）に対して８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、又は１００％の配列同一性）を有しているアミノ酸配列を含む。

場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、野生型ＰＤ−１ポリペプチドの免疫グロブリンドメイン；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質（例えば、別の哺乳動物の野生型ＰＤ−１タンパク質）の対応領域に対して、アミノ酸変化（例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、又は２０のアミノ酸変化）を含み、且つ、野生型ＰＤ−１ポリペプチドの免疫グロブリンドメイン（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に明記される野生型ヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸３５−１４５、３８−１２８、３９−１４５、３９−１４６、４９−１２５、４２−１３６、３９−１２５、又は３５−１４６）；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質（例えば、別の哺乳動物の野生型ＰＤ−１タンパク質）の対応領域に対して８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、又は１００％の配列同一性）を有しているアミノ酸配列を含む。

場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に明記される野生型ヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸３５−１４５、３８−１２８、３９−１４５、３９−１４６、４９−１２５、４２−１３６、３９−１２５、３５−１４６、１−１６６、及び／又は２６−１４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質（例えば、別の哺乳動物の野生型ＰＤ−１タンパク質）の対応領域に対して、アミノ酸変化（例えば１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、又は２０のアミノ酸変化）を含み、且つ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に明記される野生型ヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸３５−１４５、３８−１２８、３９−１４５、３９−１４６、４９−１２５、４２−１３６、３９−１２５、３５−１４６、１−１６６、及び／又は２６−１４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質（例えば、別の哺乳動物の野生型ＰＤ−１タンパク質）の対応領域に対して８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、又は１００％の配列同一性）を有しているアミノ酸配列を含む。

場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記されるアミノ酸配列；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質（例えば、別の哺乳動物の野生型ＰＤ−１タンパク質）の対応領域に対して、アミノ酸変化（例えば１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、又は２０のアミノ酸変化）を含み、且つ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記されるアミノ酸配列；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質（例えば、別の哺乳動物の野生型ＰＤ−１タンパク質）の対応領域に対して８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、又は１００％の配列同一性）を有しているアミノ酸配列を含む。

場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２−２５の何れかに明記されるアミノ酸配列に対して（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３−２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２−２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３−２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２４−２５などの何れかに対して）、アミノ酸変化（例えば１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、又は２０のアミノ酸変化）を含み、且つ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２−２５の何れかに明記されるアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、又は１００％の配列同一性）（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３−２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２−２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３−２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２４−２５などの何れかに対して８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、又は１００％の配列同一性）を有しているアミノ酸配列を含む。

場合によっては、本開示の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１に接触するＰＤ−１のアミノ酸位置に位置する、１以上（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１４以上、１５以上））のアミノ酸を含む。例えば、場合によっては、１以上（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１４以上、１５以上）のアミノ酸変化は、Ｖ３９、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｓ４８、Ｎ４９、Ｑ５０、Ｔ５１、Ｄ５２、Ｋ５３、Ａ５６、Ｑ６３、Ｇ６５、Ｑ６６、Ｌ９７、Ｓ１０２、Ｌ１０３、Ａ１０４、Ｐ１０５、Ｋ１０６、及びＡ１０７から選択される、（ヒト野生型ＰＤ−１タンパク質のタンパク質フラグメントである）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記される（ヒト野生型ＰＤ−１の）タンパク質フラグメントに対して、アミノ酸位置に；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応アミノ酸位置に位置付けられる。例えば、図３を参照されたい。

場合によっては、本開示の抗親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、１以上（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１４以上、１５以上）のアミノ酸変化は、Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｒ４４、Ｍ４５、Ｓ４８、Ｎ４９、Ｑ５０、Ｔ５１、Ｄ５２、Ｋ５３、Ａ５６、Ｑ６３、Ｇ６５、Ｑ６６、Ｖ７２、Ｈ８２、Ｍ８３、Ｒ９０、Ｙ９６、Ｌ９７、Ａ１００、Ｓ１０２、Ｌ１０３、Ａ１０４、Ｐ１０５、Ｋ１０６、及びＡ１０７から選択される、（ヒト野生型ＰＤ−１タンパク質のタンパク質フラグメントである）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記される（ヒト野生型ＰＤ−１の）タンパク質フラグメントに対して、アミノ酸位置に；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応アミノ酸位置に位置付けられる。例えば、図３を参照されたい。

場合によっては、本開示の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、（ヒト野生型ＰＤ−１タンパク質のタンパク質フラグメントである）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記される（ヒト野生型ＰＤ−１の）タンパク質フラグメントに対して、アミノ酸位置に、又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応アミノ酸位置に位置付けられるアミノ酸変化を含み、アミノ酸位置は、以下から選択される：（ａ）Ｖ３９、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｓ４８、Ｎ４９、Ｑ５０、Ｋ５３、Ａ５６、Ｑ６３、Ｇ６５、Ｑ６６、Ｌ９７、Ｓ１０２、Ｌ１０３、Ａ１０４、Ｋ１０６、及びＡ１０７、又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応アミノ酸位置；（ｂ）Ｖ３９、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｓ４８、Ｑ５０、Ｔ５１、Ｄ５２Ｆ、Ｋ５３、Ａ５６、Ｑ６３、Ｇ６５、Ｑ６６、Ｌ９７、Ｓ１０２、Ｌ１０３、Ａ１０４、Ｋ１０６、及びＡ１０７、又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応アミノ酸位置；（ｃ）Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｒ４４、Ｍ４５、Ｎ４９、Ｋ５３、Ｍ８３、Ｌ９７、Ａ１００、及びＡ１０７、又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応アミノ酸位置；（ｄ）Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｎ４９、Ｋ５３、Ｑ６６Ｐ、Ｍ８３、Ｌ９７、及びＡ１０７、又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応アミノ酸位置；（ｅ）Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｎ４９、Ｋ５３、Ｑ６６Ｐ、Ｈ８２、Ｍ８３、Ｌ９７、Ａ１００、及びＡ１０７、又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応アミノ酸位置；（ｆ）Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｎ４９、Ｋ５３、Ｍ８３、Ｌ９７、Ａ１００、及びＡ１０７、又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応アミノ酸位置；（ｇ）Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｒ４４、Ｍ４５、Ｎ４９、Ｋ５３、Ｌ９７、Ａ１００、及びＡ１０７、又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応アミノ酸位置；及び（ｈ）Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｎ４９、Ｋ５３、Ｌ９７、Ａ１００、及びＡ１０７。例えば、図３を参照されたい。

場合によっては、本開示の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、（ヒト野生型ＰＤ−１タンパク質のタンパク質フラグメントである）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記される（ヒト野生型ＰＤ−１の）タンパク質フラグメントに対して、１以上（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１４以上、１５以上）のアミノ酸変化を含み、アミノ酸変化は以下から選択される：（１）Ｖ３９Ｈ又はＶ３９Ｒ；（２）Ｌ４０Ｖ又はＬ４０Ｉ；（３）Ｎ４１Ｉ又はＮ４１Ｖ；（４）Ｙ４３Ｆ又はＹ４３Ｈ；（５）Ｒ４４Ｙ又はＲ４４Ｌ；（６）Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、又はＭ４５Ｄ；（７）Ｓ４８Ｄ、Ｓ４８Ｌ、Ｓ４８Ｎ、Ｓ４８Ｇ、又はＳ４８Ｖ；（８）Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、又はＮ４９Ｓ；（９）Ｑ５０Ｋ、Ｑ５０Ｅ、又はＱ５０Ｈ；（１０）Ｔ５１Ｖ、Ｔ５１Ｌ、又はＴ５１Ａ；（１１）Ｄ５２Ｆ、Ｄ５２Ｒ、Ｄ５２Ｙ、又はＤ５２Ｖ；（１２）Ｋ５３Ｔ又はＫ５３Ｌ；（１３）Ａ５６Ｓ又はＡ５６Ｌ；（１４）Ｑ６３Ｔ、Ｑ６３Ｉ、Ｑ６３Ｅ、Ｑ６３Ｌ、又はＱ６３Ｐ；（１５）Ｇ６５Ｎ、Ｇ６５Ｒ、Ｇ６５Ｉ、Ｇ６５Ｌ、Ｇ６５Ｆ、又はＧ６５Ｖ；（１６）Ｑ６６Ｐ；（１７）Ｖ７２Ｉ；（１８）Ｈ８２Ｑ；（１９）Ｍ８３Ｌ又はＭ８３Ｆ；（２０）Ｒ９０Ｋ；（２１）Ｙ９６Ｆ；（２２）Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、又はＬ９７Ｉ；（２３）Ａ１００Ｉ又はＡ１００Ｖ；（２４）Ｓ１０２Ｔ又はＳ１０２Ａ；（２５）Ｌ１０３Ｉ、Ｌ１０３Ｙ、又はＬ１０３Ｆ；（２６）Ａ１０４Ｓ、Ａ１０４Ｈ、又はＡ１０４Ｄ；（２７）Ｐ１０５Ａ；（２８）Ｋ１０６Ｇ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｉ、Ｋ１０６Ｖ、Ｋ１０６Ｒ、又はＫ１０６Ｔ；及び（２９）Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、又はＡ１０７Ｖ；又は、前記高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に関連のある対応位置にて同じアミノ酸を結果としてもたらす変化を含む。例えば、図３を参照されたい。

場合によっては、本開示の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、（ヒト野生型ＰＤ−１タンパク質のタンパク質フラグメントである）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記される（ヒト野生型ＰＤ−１の）タンパク質フラグメントに対して、アミノ酸変化を含み、アミノ酸変化は、以下から選択される。
（ａ）｛Ｖ３９Ｈ又はＶ３９Ｒ｝、｛Ｎ４１Ｉ又はＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３Ｆ又はＹ４３Ｈ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、又はＭ４５Ｄ｝、｛Ｓ４８Ｄ、Ｓ４８Ｌ、Ｓ４８Ｎ、Ｓ４８Ｇ、又はＳ４８Ｖ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、又はＮ４９Ｓ｝、｛Ｑ５０Ｋ、Ｑ５０Ｅ、又はＱ５０Ｈ｝、｛Ｋ５３Ｔ又はＫ５３Ｌ｝、｛Ａ５６Ｓ又はＡ５６Ｌ｝、｛Ｑ６３Ｔ、Ｑ６３Ｉ、Ｑ６３Ｅ、Ｑ６３Ｌ、又はＱ６３Ｐ｝、｛Ｇ６５Ｎ、Ｇ６５Ｒ、Ｇ６５Ｉ、Ｇ６５Ｌ、Ｇ６５Ｆ、又はＧ６５Ｖ｝、｛Ｑ６６Ｐ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、又はＬ９７Ｉ｝、｛Ｓ１０２Ｔ又はＳ１０２Ａ｝、｛Ｌ１０３Ｉ、Ｌ１０３Ｙ、又はＬ１０３Ｆ｝、｛Ａ１０４Ｓ、Ａ１０４Ｈ、又はＡ１０４Ｄ｝、｛Ｋ１０６Ｇ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｉ、Ｋ１０６Ｖ、Ｋ１０６Ｒ、又はＫ１０６Ｔ｝、及び｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、又はＡ１０７Ｖ｝；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸を結果としてもたらす変化；
（ｂ）｛Ｖ３９Ｈ又はＶ３９Ｒ｝、｛Ｎ４１Ｉ又はＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３Ｆ又はＹ４３Ｈ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、又はＭ４５Ｄ｝、｛Ｓ４８Ｄ、Ｓ４８Ｌ、Ｓ４８Ｎ、Ｓ４８Ｇ、又はＳ４８Ｖ｝、｛Ｑ５０Ｋ、Ｑ５０Ｅ、又はＱ５０Ｈ｝、｛Ｔ５１Ｖ、Ｔ５１Ｌ、又はＴ５１Ａ｝、｛Ｄ５２Ｆ、Ｄ５２Ｒ、Ｄ５２Ｙ、又はＤ５２Ｖ｝、｛Ｋ５３Ｔ又はＫ５３Ｌ｝、｛Ａ５６Ｓ又はＡ５６Ｌ｝、｛Ｑ６３Ｔ、Ｑ６３Ｉ、Ｑ６３Ｅ、Ｑ６３Ｌ、又はＱ６３Ｐ｝、｛Ｇ６５Ｎ、Ｇ６５Ｒ、Ｇ６５Ｉ、Ｇ６５Ｌ、Ｇ６５Ｆ、又はＧ６５Ｖ｝、｛Ｑ６６Ｐ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、又はＬ９７Ｉ｝、｛Ｓ１０２Ｔ又はＳ１０２Ａ｝、｛Ｌ１０３Ｉ、Ｌ１０３Ｙ、又はＬ１０３Ｆ｝、｛Ａ１０４Ｓ、Ａ１０４Ｈ、又はＡ１０４Ｄ｝、｛Ｋ１０６Ｇ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｉ、Ｋ１０６Ｖ、Ｋ１０６Ｒ、又はＫ１０６Ｔ｝、及び｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、又はＡ１０７Ｖ｝；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸を結果としてもたらす変化；
（ｃ）｛Ｖ３９Ｈ又はＶ３９Ｒ｝、｛Ｌ４０Ｖ又はＬ４０Ｉ｝、｛Ｎ４１Ｉ又はＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３Ｆ又はＹ４３Ｈ｝、｛Ｒ４４Ｙ又はＲ４４Ｌ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、又はＭ４５Ｄ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、又はＮ４９Ｓ｝、｛Ｋ５３Ｔ又はＫ５３Ｌ｝、｛Ｍ８３Ｌ又はＭ８３Ｆ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、又はＬ９７Ｉ｝、｛Ａ１００Ｉ又はＡ１００Ｖ｝、及び｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、又はＡ１０７Ｖ｝；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸を結果としてもたらす変化；
（ｄ）｛Ｖ３９Ｈ又はＶ３９Ｒ｝、｛Ｌ４０Ｖ又はＬ４０Ｉ｝、｛Ｎ４１Ｉ又はＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３Ｆ又はＹ４３Ｈ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、又はＭ４５Ｄ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、又はＮ４９Ｓ｝、｛Ｋ５３Ｔ又はＫ５３Ｌ｝、｛Ｑ６６Ｐ｝、｛Ｍ８３Ｌ又はＭ８３Ｆ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、又はＬ９７Ｉ｝、及び｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、又はＡ１０７Ｖ｝；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸を結果としてもたらす変化；
（ｅ）｛Ｖ３９Ｈ又はＶ３９Ｒ｝、｛Ｌ４０Ｖ又はＬ４０Ｉ｝、｛Ｎ４１Ｉ又はＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３Ｆ又はＹ４３Ｈ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、又はＭ４５Ｄ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、又はＮ４９Ｓ｝、｛Ｋ５３Ｔ又はＫ５３Ｌ｝、｛Ｑ６６Ｐ｝、｛Ｈ８２Ｑ｝、｛Ｍ８３Ｌ又はＭ８３Ｆ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、又はＬ９７Ｉ｝、｛Ａ１００Ｉ又はＡ１００Ｖ｝、及び｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、又はＡ１０７Ｖ｝；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸を結果としてもたらす変化；
（ｆ）｛Ｖ３９Ｈ又はＶ３９Ｒ｝、｛Ｌ４０Ｖ又はＬ４０Ｉ｝、｛Ｎ４１Ｉ又はＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３Ｆ又はＹ４３Ｈ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、又はＭ４５Ｄ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、又はＮ４９Ｓ｝、｛Ｋ５３Ｔ又はＫ５３Ｌ｝、｛Ｍ８３Ｌ又はＭ８３Ｆ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、又はＬ９７Ｉ｝、｛Ａ１００Ｉ又はＡ１００Ｖ｝、及び｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、又はＡ１０７Ｖ｝；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸を結果としてもたらす変化；
（ｇ）｛Ｖ３９Ｈ又はＶ３９Ｒ｝、｛Ｌ４０Ｖ又はＬ４０Ｉ｝、｛Ｎ４１Ｉ又はＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３Ｆ又はＹ４３Ｈ｝、｛Ｒ４４Ｙ又はＲ４４Ｌ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、又はＭ４５Ｄ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、又はＮ４９Ｓ｝、｛Ｋ５３Ｔ又はＫ５３Ｌ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、又はＬ９７Ｉ｝、｛Ａ１００Ｉ又はＡ１００Ｖ｝、及び｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、又はＡ１０７Ｖ｝；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸を結果としてもたらす変化；及び
（ｈ）｛Ｖ３９Ｈ又はＶ３９Ｒ｝、｛Ｌ４０Ｖ又はＬ４０Ｉ｝、｛Ｎ４１Ｉ又はＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３Ｆ又はＹ４３Ｈ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、又はＭ４５Ｄ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、又はＮ４９Ｓ｝、｛Ｋ５３Ｔ又はＫ５３Ｌ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、又はＬ９７Ｉ｝、｛Ａ１００Ｉ又はＡ１００Ｖ｝、及び｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、又はＡ１０７Ｖ｝；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸を結果としてもたらす変化。例えば、図３を参照されたい。

場合によっては、本開示の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、（ヒト野生型ＰＤ−１タンパク質のタンパク質フラグメントである）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記される（ヒト野生型ＰＤ−１の）タンパク質フラグメントに対して、アミノ酸変化を含み、アミノ酸変化は、以下から選択される。
（ａ）Ｖ３９Ｒ、Ｎ４１Ｖ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｓ４８Ｇ、Ｎ４９Ｙ、Ｑ５０Ｅ、Ｋ５３Ｔ、Ａ５６Ｓ、Ｑ６３Ｔ、Ｇ６５Ｌ、Ｑ６６Ｐ、Ｌ９７Ｖ、Ｓ１０２Ａ、Ｌ１０３Ｆ、Ａ１０４Ｈ、Ｋ１０６Ｖ、及びＡ１０７Ｉ；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸を結果としてもたらす変化；
（ｂ）Ｖ３９Ｒ、Ｎ４１Ｖ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｓ４８Ｎ、Ｑ５０Ｈ、Ｔ５１Ａ、Ｄ５２Ｙ、Ｋ５３Ｔ、Ａ５６Ｌ、Ｑ６３Ｌ、Ｇ６５Ｆ、Ｑ６６Ｐ、Ｌ９７Ｉ、Ｓ１０２Ｔ、Ｌ１０３Ｆ、Ａ１０４Ｄ、Ｋ１０６Ｒ、及びＡ１０７Ｉ；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸を結果としてもたらす変化；
（ｃ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｖ、Ｎ４１Ｖ、Ｙ４３Ｈ、Ｒ４４Ｙ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｇ、Ｋ５３Ｔ、Ｍ８３Ｌ、Ｌ９７Ｖ、Ａ１００Ｉ、及びＡ１０７Ｉ；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸を結果としてもたらす変化；
（ｄ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｖ、Ｎ４１Ｖ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｇ、Ｋ５３Ｔ、Ｑ６６Ｐ、Ｍ８３Ｌ、Ｌ９７Ｖ、及びＡ１０７Ｉ；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸を結果としてもたらす変化；
（ｅ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｖ、Ｎ４１Ｖ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｓ、Ｋ５３Ｔ、Ｑ６６Ｐ、Ｈ８２Ｑ、Ｍ８３Ｌ、Ｌ９７Ｖ、Ａ１００Ｖ、及びＡ１０７Ｉ；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸を結果としてもたらす変化；
（ｆ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｉ、Ｎ４１Ｉ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｇ、Ｋ５３Ｔ、Ｍ８３Ｌ、Ｌ９７Ｖ、Ａ１００Ｖ、及びＡ１０７Ｉ；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸を結果としてもたらす変化；
（ｇ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｖ、Ｎ４１Ｉ、Ｙ４３Ｈ、Ｒ４４Ｌ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｇ、Ｋ５３Ｔ、Ｌ９７Ｖ、Ａ１００Ｖ、及びＡ１０７Ｉ；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸を結果としてもたらす変化；
（ｈ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｖ、Ｎ４１Ｉ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｇ、Ｋ５３Ｔ、Ｌ９７Ｖ、Ａ１００Ｖ、及びＡ１０７Ｉ；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸を結果としてもたらす変化；及び
（ｉ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｖ、Ｎ４１Ｖ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｇ、Ｋ５３Ｔ、Ｌ９７Ｖ、Ａ１００Ｖ、及びＡ１０７Ｉ；又は別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸を結果としてもたらす変化。例えば、図３を参照されたい。

＜親和性＞
主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、野生型ＰＤ−１タンパク質のＰＤ−Ｌ１に関する親和性と比較して、及び／又は、野生型ＰＤ−１ポリペプチド（例えば、上記に定義されるような天然のＰＤ−１模倣ポリペプチド）の対応配列に対してアミノ酸変化が無いＰＤ−１模倣ポリペプチドのＰＤ−Ｌ１に関する親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ１に関する増大した親和性を有している。

幾つかの実施形態において、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１に関する１×１０^−７Ｍ以下（例えば、１０^−８Ｍ以下、１０^−９Ｍ以下、１０^−１０Ｍ以下、１０^−１１Ｍ以下、１０^−１２Ｍ以下、１０^−１３Ｍ以下、１０^−１４Ｍ以下、１０^−１５Ｍ以下、又は１０^−１６Ｍ以下）のＫ_ｄを有している。場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、１ｆＭから１μＭの範囲（例えば、１ｆＭから８００ｎＭ、１０ｆＭから５００ｎＭ、１００ｆＭから１００ｎＭ、５００ｆＭから５０ｎＭ、８００ｆＭから５０ｎＭ、１ｐＭから５０ｎＭ、１０ｐＭから５０ｎＭ、５０ｐＭから５０ｎＭ、１００ｐＭから５０ｎＭ、５００ｆＭから１００ｎＭ、８００ｆＭから１００ｎＭ、１ｐＭから１００ｎＭ、１０ｐＭから１００ｎＭ、５０ｐＭから１００ｎＭ、又は１００ｐＭから１００ｎＭ）で、ＰＤ−Ｌ１に関する親和性を有している。場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、１μＭ以上（例えば、８００ｎＭ以上、５００ｎＭ以上、２００ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、５０ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１ｎＭ以上、９００ｐＭ以上、７５０ｐＭ以上、５００ｐＭ以上、２００ｐＭ以上、１００ｐＭ以上、１０ｐＭ以上、１ｐＭ以上など）の親和性でＰＤ−Ｌ１に結合する（ここで、親和性は値を減少させるにつれて増加する）。

幾つかの実施形態において、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、野生型ＰＤ−１タンパク質のＰＤ−Ｌ１に関する親和性よりも２倍以上大きい（例えば、５倍以上、１０倍以上、１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上倍、５０００倍以上、１０^４倍以上、１０^５倍以上、１０^６倍以上、１０^７倍以上倍、１０^８倍以上など）；及び／又は、野生型ＰＤ−１ポリペプチド（例えば、上述に定められるような天然のＰＤ−１模倣ポリペプチド）の対応配列に対してアミノ酸変化が無いＰＤ−１模倣ポリペプチドのＰＤ−Ｌ１に関する親和性よりも２倍以上大きい（例えば、５倍以上、１０倍以上、１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上、５０００倍以上、１０^４倍以上、１０^５倍以上、１０^６倍以上、１０^７倍以上、１０^８倍以上など）、ＰＤ−Ｌ１に関する親和性を有している。

幾つかの実施形態において、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、野生型ＰＤ−１タンパク質のＰＤ−Ｌ１に関する解離半減期よりも２倍以上大きい（例えば、５倍以上、１０倍以上、１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上倍、５０００倍以上、１０^４倍以上、１０^５倍以上、１０^６倍以上、１０^７倍以上、１０^８倍以上など）；及び／又は、野生型ＰＤ−１ポリペプチド（例えば、上述に定められるような天然のＰＤ−１模倣ポリペプチド）の対応配列に対してアミノ酸変化が無いＰＤ−１模倣ポリペプチドのＰＤ−Ｌ１に関する解離半減期よりも２倍以上大きい（例えば、５倍以上、１０倍以上、１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上、５０００倍以上、１０^４倍以上、１０^５倍以上、１０^６倍以上、１０^７倍以上、１０^８倍以上など）、ＰＤ−Ｌ１に関する解離半減期を有している。例えば、場合によっては、（上記に定義されるような）天然のＰＤ−１模倣ポリペプチドは、１秒未満のＰＤ−Ｌ１に関する解離半減期を有しており、一方で主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、５秒以上（例えば、３０秒以上、１分以上、５分以上、１０分以上、２０分以上、３０分以上、４０分以上など）の解離半減期を有し得る。例えば、被験体の抗親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドのアミノ酸変異は、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、又はそれ以上オフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を減らすことにより、親和性を増加することができる。

場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、野生型ＰＤ−１ポリペプチドに対してアミノ酸変化を有していない、対応するＰＤ−１模倣ポリペプチドのＰＤ−Ｌ２に関する親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ２に関する減少した親和性を有している（例えば、上記に定義されるように、対応する天然のＰＤ−１のＰＤ−Ｌ２に関する親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ２に関する減少した親和性）。

場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ２に関するものよりも大きな、ＰＤ−Ｌ１に関する親和性を有している。例えば、場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ２ではなくＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する。場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１に関する高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの親和性を特徴化するＫ_ｄよりも２倍以上大きな（例えば、５倍以上、１０倍以上、１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上、５０００倍以上、１０^４倍以上、１０^５倍以上、１０^６倍以上、１０^７倍以上、１０^８倍以上、など）Ｋ_ｄ（解離定数）を特徴とする、ＰＤ−Ｌ２に関する親和性を有している。言いかえれば、場合によっては、ＰＤ−Ｌ１に関する主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの親和性は、ＰＤ−Ｌ２に関する高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの親和性よりも２倍以上大きい（例えば、５倍以上、１０倍以上、１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上、５０００倍以上、１０^４倍以上、１０^５倍以上、１０^６倍以上、１０^７倍以上、１０^８倍以上、など）場合がある。

ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２に結合する親和性は、例えば、アッセイプレート上で覆われる；微生物細胞表面上で表示される；溶液中に存在するＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２に、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドが結合する能力により、判定され得る。ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２に対する、本開示の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの結合活性は、ビーズ、基質、細胞などに、リガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２）或いは高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを固定することにより、分析され得る。適切な緩衝液中に薬剤が加えられ、結合パートナーは与えられた温度で一定の期間にわたりインキュベートされる。洗浄により結合されない物質を取り除いた後、結合したタンパク質を、例えば、ＳＤＳ、高ｐＨを持つ緩衝液で放出し、分析することができる。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のプロット（即ち、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドがＰＤ−Ｌ１に結合する能力を試験したＳＰＲ実験に起因する）を表す図４を参照する。結合はまた、例えば、標識化されていない高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドが、ＰＤ−Ｌ１に結合するために標識化されたＰＤ−１ポリペプチド（例えば、上記に定義されるような標識化された天然のＰＤ−１模倣ポリペプチド）と競合する能力を測定することにより、判定され得る（例えば、図５Ａ−５Ｃと図６Ａ−６Ｂを参照）。従って、相対的な結合は、候補となる標識化されていない高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを用いた結果を、標識化されていない天然のＰＤ−１模倣ポリペプチド（上記に定義されるように、野生型ＰＤ−１の対応配列に対してアミノ酸変化がないＰＤ−１模倣ポリペプチド）と比較することにより、評価され得る。

主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを生成するのに任意の都合の良い方法が、使用され得る。限定しない一例として、変異したＰＤ−１模倣ポリペプチドの集合を生成するために、変異誘発が実行され得る（更に大きな親和性を持つポリペプチドを生成するために、天然のＰＤ−１模倣ポリペプチドで始まり、又は高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドで始まる）。変異誘発は、特定のアミノ酸にて変化をもたらすために標的化され、又は無作為化され得る。その後、変異したＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌタンパク質（例えば、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２）を結合する自身の能力についてスクリーニングされ得る。例えば、ＰＤ−Ｌタンパク質（又はＰＤ−Ｌタンパク質の変異体、例えば膜貫通ドメインを欠くバージョン）は、（例えば、放射性同位体、蛍光部分などの直接の標識；又は抗原、親和性タグ、ビオチンなどの間接の標識により）標識化され、その後、候補となる高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドに接触させるために使用され得る（例えば、ここで、候補となる高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、固体表面に付けられ、又は細胞（例えば酵母菌）の膜の上に表示され得る）。使用されるＰＤ−Ｌの濃度を変えることにより、候補の中から（即ち、変異したＰＤ−１模倣ポリペプチドの集合の中から）高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを識別することができる。主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをどのように識別することができるかについての限定しない例については、図２Ａ−２Ｂを参照。

幾つかの実施形態において、本開示の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、融合タンパク質（例えば、第２ポリペプチド（融合パートナー）とフレーム中で融合される）である。幾つかの実施形態において、第２のポリペプチドは、例えば、融合タンパク質が循環から急速に取り除かれないように、融合タンパク質の大きさを増大することができる。組織透過性（即ち、組織に浸透する能力）が、その比較的小さな大きさにより（例えば、抗体（例えば抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ抗体）などのはるかに大きなタンパク質と比較して）、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを使用するという明確な利点であり得るので、場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、第２のポリペプチドに融合されず、或いは、（特定の方法及び／又は所望の結果のコンテキストに依存する）受け入れがたいレベルに高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの組織浸透を制限しないのに十分に小さな第２のポリペプチドに融合される。故に、場合によっては、第２のポリペプチド（即ち、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドが融合されるポリペプチド）は、２００以下のアミノ酸（例えば、１９０以下のアミノ酸、１８０以下のアミノ酸、１７０以下のアミノ酸、１６０以下のアミノ酸、１５０以下のアミノ酸、１４０以下のアミノ酸、１３０以下のアミノ酸、１２０以下のアミノ酸、１１０以下のアミノ酸、１００以下のアミノ酸、９０以下のアミノ酸、８０以下のアミノ酸、７０以下のアミノ酸、６０以下のアミノ酸、５０以下のアミノ酸、４０以下のアミノ酸、又は３０以下のアミノ酸）である。場合によっては、融合タンパク質は、２００ｋＤ以下、１５０ｋＤ以下、１００ｋＤ以下、９０ｋＤ以下、８０ｋＤ以下、７０ｋＤ以下、６０ｋＤ以下、５０ｋＤ以下、４０ｋＤ以下、又は３０ｋＤ以下の平均分子量を有している。

幾つかの実施形態において、第２のポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域）（例えば、抗体Ｆｃ配列、ＣＨ３ドメインなど）の一部又は全体である。他の実施形態において、第２のポリペプチドは、例えば大きさの増加、多量体化ドメイン、及び／又はＩｇ分子との付加的な結合又は相互作用をもたらす、Ｆｃと実質的に同様の任意の適切なポリペプチドである。このような融合タンパク質は、精製、多量体化を促進し、インビボでの半減期の増加を示すことができる。ジスルフィド連結多重体構造を持つ融合タンパク質はまた、モノマーの高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド以外の分子の結合及び中和においてより効果的となり得る。

異種のポリペプチドに融合された場合、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドに対応する部分は、「高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド部分」と称され得る。高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド（例えば、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド部分）は、膜貫通ドメインへのＮ末端である野生型タンパク質の部分（例えば、ヒトＰＤ−１タンパク質に関する１６５−１７０のアミノ酸）の総長までの、長さ７０以上のアミノ酸（例えば、７５以上のアミノ酸、８０以上のアミノ酸、８５以上のアミノ酸、９０以上のアミノ酸、９５以上のアミノ酸、１００以上のアミノ酸、１０５以上のアミノ酸、１１０以上のアミノ酸、１１５以上のアミノ酸、１２０以上のアミノ酸、１２５以上のアミノ酸、又は１３０以上のアミノ酸）であり、異種のポリペプチド、例えば免疫グロブリンＦｃ）に融合され得る。場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド（例えば、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド部分）は、７０から１７０のアミノ酸の範囲での長さ（例えば、７０から１６６のアミノ酸、７５から１７０のアミノ酸、８０から１７０のアミノ酸など）を有している。

幾つかの実施形態において、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、キメラタンパク質を形成するために免疫グロブリン配列に融合されるか、そうでなければ結合される。免疫グロブリン配列は免疫グロブリン不変ドメインであり得る。そのようなキメラにおける免疫グロブリン部分は、任意の種（通常はヒト）から得られる場合があり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の亜型、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭを含む。免疫グロブリン部分は、１以上のドメイン、例えばＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３などを含み得る。

適切な免疫グロブリン不変ドメイン配列に連結された配列から構築されたキメラは、当該技術分野で既知である。そのような融合において、コード化されたキメラのポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖の定常領域の、少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３のドメインを保持し得る。融合はまた、不変ドメインのＦｃ部分のＣ末端、又は、直に重鎖のＣＨ１或いは軽鎖の対応領域へのＮ末端に対して行われる。融合が行われる正確な部位は重大ではなく；特定の部位は周知であり、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド：免疫グロブリンキメラの生物活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択され得る。幾つかの実施形態において、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド：免疫グロブリンキメラは、モノマー、又はヘテロ多量体或いはホモ多量体、及び場合によっては二量体又は四量体として組み立てられる。

免疫グロブリン軽鎖の存在は必要ではないが、免疫グロブリン軽鎖は、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド：免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に関連付けられ、或いは該ポリペプチドに直接融合されることで、含まれる場合がある。重鎖及び軽鎖両方の定常領域を提供するために単鎖の構築物が使用され得る。

他の融合タンパク質構築物において、第２のポリペプチドは、融合ポリペプチドの精製を促進するペプチドなどの、マーカー配列である。例えば、マーカーアミノ酸配列は、ｐＱＥベクトル（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， ９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， Ｃａｌｉｆ．， ９１３１１）において提供されるタグなどのヘキサ−ヒスチジンペプチドであり得、とりわけそれらの多くは市販で入手可能である。Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ８２１−８２４， １９８９に記載されるように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製をもたらす。精製に有用な別のペプチドタグ、「ＨＡ」タグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに相当する。Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３７： ７６７， １９８４。ポリペプチドの取り扱いを促進するペプチド部分の付加は、当該技術分野で良く知られた慣習的な技術である。

場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、多価性（例えば４価）である。

高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、単量体、又は多量体、即ち二量体、三量体、四量体などであり得る。例えば、１以上のＰＤ−Ｌ１（及び／又はＰＤ−Ｌ２）結合ドメインは、共有結合により連結され、或いは、非共有結合により、例えば、融合タンパク質として；ジスルフィド結合として；アビジン、ストレプトアビジンなどへのビオチン結合を介して連結され得る。そのような単量体又は多量体の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、免疫応答を刺激するための（例えば、全身的免疫応答を刺激、及び／又はＰＤ−Ｌ１を発現する細胞、例えば癌細胞に向けられた反応を刺激する）単一の薬剤として；又は、他の結合剤（例えばモノクローナル抗体）と組み合わせて、有用となる。

例えば、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、融合パートナーが、多量体化ドメイン（即ち、多量体化を促進するドメイン、例えば二量体化を促進するドメイン）を提供する、融合パートナーを有し得る。例えば、融合パートナーは、任意の都合の良いタンパク質間相互作用ドメイン（例えば、ロイシンジッパーモチーフ、ｓｙｎｚｉｐポリペプチド（ポリペプチドの対）、ＣＨ３ドメインなど）であり得る。

本開示の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは修飾され得、例えば、様々な目的のために多様な他のオリゴペプチド又はタンパク質に結合され得る。例えば、プレニル化、アセチル化、アミド化、カルボキシル化、グリコシル化、ペグ化（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖の共有結合）などにより翻訳後に修飾される。そのような修飾はまた、グリコシル化の修飾、例えば、その合成及び処理の間に、又は更なる処理工程においてポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することにより、例えば、酵素をグリコシル化又は脱グリコシル化する哺乳動物などの、グリコシル化に影響する酵素にポリペプチドを晒すことにより行われるものを含み得る。幾つかの実施形態において、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、１以上のリン酸化したアミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、又はホスホトレオニンを有している。

幾つかの他の実施形態において、本開示の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、タンパク質分解に対する耐性を改善し且つ溶解特性を最適化するように、又は治療剤としてより適切なものにするように更に修飾された、試薬を含む。例えば、本開示の変異体は、自然発生のＬ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸又は非自然発生の合成アミノ酸を含むアナログを更に含む。Ｄ−アミノ酸はアミノ酸残基の幾つか又は全てに置換され得る。

様々な障害及び疾患の処置としての使用に加えて、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、例えば、（例えば、マクロファージ、樹状細胞、好中球、顆粒球、抗原提示細胞、Ｔ細胞などの多くの免疫細胞を刺激、又はその阻害を減少させることにより）（例えば、特定の結合剤、例えば抗体に、場合によっては本明細書で定められるような腫瘍細胞特異抗体に組み合わされる時に）免疫機能を増大させるためのアジュバントとして有用である。

高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドはまた、例えば、検知可能な標識に接合された時に、様々な目的のために、例えば診断薬として使用され得る、造影剤として有用である。例えば、場合によっては、主題の方法は、個体における癌（例えば、検知可能なＰＤ−Ｌ１の存在、レベル、及び／又は位置が診断的（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）及び／又は予後徴候であり得る癌）を診断又は予後判定する方法である。

本開示の幾つかの実施形態において、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、１以上の撮像部分、即ち検知可能な標識に結合又は接合される。本明細書で使用されるように、「細胞傷害性部分」は、細胞に近い又は細胞により吸収される場合、細胞増殖を阻害する又は細胞死を促進する部分を指す。この点における適切な細胞傷害性部分は、放射性同位体（放射性核種）、分化誘導物質及び小さな化学毒性薬物などの化学毒性薬剤、毒素タンパク質、及びそれらの誘導体を含む。

本明細書で利用されるように、「撮像部分」、又は検知可能な標識は、可視化技術、例えばＸ線撮影法、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、直接又は間接的な目視検査において、腫瘍と周囲の健全な組織との間の対比を増大させるために利用され得る部分を指す。故に、適切な撮像部分は、Ｘ線撮影部分、例えば、重金属及び放射線放射部分、陽電子放出部分、磁気共鳴対比部分、光学的に視認できる部分（例えば、蛍光性又は可視スペクトルの色素、視認できる粒子など）を含む。治療部分であるものと、撮像部分であるものとの間には幾つかの重なりが生じることが、当業者に認識される。

通常、治療剤又は造影剤は、患者にとっての薬物動態学的な安定性及び全体的な毒性の低減の必要性を適切に考慮して、任意の適切な技術により高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド部分に共役され得る。薬剤とＰＤ−Ｌ１との間の直接的な反応は、各々が他方に反応することが可能な官能基を持つ場合に可能である。例えば、アミノ基又はスルフヒドリル基などの求核基は、無水物又は酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基、又は優れた脱離基（例えばハロゲン化物）を含有するアルキル基に反応することが可能な場合もある。代替的に、適切な化学リンカー基が使用され得る。リンカー基は、結合能に対する干渉を回避するためにスペーサーとして機能することができる。

様々な二官能性試薬又は多官能性試薬、ホモ官能性及びヘテロ官能性の両方（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌ．のカタログに記載されるものなど）は、リンカー基として利用され得ることが、当業者に明らかとなる。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、又は酸化炭水化物残基を介して達成され得る。そのような方法を説明する多くの言及が存在する。代替的に、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ストレプトアビジン／ビオチン、又はアビジン／ビオチンなどの非共有結合の対を使用することにより、細胞傷害性部分又は撮像部分に連結される。これら実施形態において、対の一方のメンバーは、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドに共有結合され、結合対の他方のメンバーは、細胞傷害性部分又は撮像部分に共有結合される。１より多くの細胞傷害性部分及び／又は撮像部分を結合することが望ましい場合もある。高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをポリ誘導する（ｐｏｌｙ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｉｎｇ）ことにより、様々な戦略が一斉に実践されてもよく、抗体は、様々な可視化技術のために造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）として有用なものとして作られ、又は治療抗体は、可視化技術による追跡のために標識化され得る。

担体は、共有結合を直接又はリンカー基を介して含み、且つ非共有結合の集まりを含む、様々な方法における薬剤を有し得る。適切な共有結合担体は、アルブミン、ペプチド、及び、アミノデキストランなどの多糖類などのタンパク質を含み、その各々が、部分の結合のための複数の部位を有している。担体はまた、非共有結合などの非共有結合の集まりにより、又はカプセル化により、薬剤を有し得る。

放射性核種薬剤に特異的な担体及びリンカーは、放射性ハロゲン化小分子及びキレート化化合物を含む。放射性核種キレート薬は、金属、又は金属酸化物、放射性核種の結合ためにドナー原子として窒素原子と硫黄原子を含有するものを含むキレート化化合物から、形成され得る。

本開示において撮像部分として使用されるＸ線写真部分は、金、イリジウム、テクネチウム、バリウム、タリウム、ヨウ素、及びそれらの同位体などの比較的大きな原子を持つ、化合物及びキレート薬を含む。場合によっては、ヨウ素又はヨウ素同位体などの、あまり有毒でないＸ線写真の撮像部分が、本開示の組成物と方法において利用され得る。そのような部分は、許容可能な化学リンカー又はキレート化担体を介して、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドに共役され得る。本開示で使用される陽電子放出部分は^１８Ｆを含み、これは、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドとのフッ素化反応により容易に共役され得る。ＰＥＴ放射体の例は、^６４Ｃｕ、^６８Ｇａ、^８９Ｚｒ、及び^１８Ｆを含む。

ＰＥＴ撮像は、タンパク質に陽電子放射体を結合することを含み得る。ＰＥＴ放射体の例は、^６４Ｃｕ、^６８Ｇａ、^８９Ｚｒ、及び^１８Ｆを含む。このような薬剤は、例えば、キレート化基（例えば、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、デフェロキサミン（ＤＦＯ））を介して、任意の都合の良い方法を使用してタンパク質に結合され得る。そのようなキレート化剤は、任意の都合の良い方法を使用して、例えば、遊離システイン残基（例えば、システインＲ８７Ｃ、Ｎ９１Ｃ、及び／又はＲ１２２Ｃなどにおいて改変された遊離システイン残基）でのマレイミド化学により（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記されるＰＤ−１タンパク質フラグメントに対してＲ８７Ｃ、とＮ９１Ｃ、及び／又はＲ１２２Ｃに対応する変異）、共有結合的に及び部位特異的にタンパク質に結合され得る。

本開示において撮像部分として使用される単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）部分。ＳＰＥＣＴは、放射トレーサー物質の使用及びγ線の検出において、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）と同様である。しかし、ＰＥＴとは対照的に、ＳＰＥＣＴに使用されるトレーサーは、直接測定されるγ線を放出する一方で、ＰＥＴトレーサーは、数ミリメートル先に、電子と共に消滅する（ａｎｎｉｈｉｌａｔｅ）陽電子を放出し、反対方向に２つのガンマ光子を放出する。

磁気共鳴対比部分は、クロミウム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、プラセオジミウム（ＩＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、及びイッテルビウム（ＩＩＩ）のイオンのキレート薬を含み得る。それらの非常に強い磁気モーメントにより、ガドリニウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）、及び鉄（ＩＩＩ）のイオンも、対比部分と考慮される。

撮像部分として使用される光学的に視認可能な部分は、蛍光色素、又は可視スペクトル色素、視認可能な粒子、及び他の視認可能な標識化部分を含む。フルオレセイン、クマリン、ローダミン、ｂｏｄｉｐｙ Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、及びシアニン色素などの蛍光色素は、視覚的に検査される部位に十分な励起エネルギーを提供することができる場合に有用である。内視鏡検査法の可視化手順は、そのような標識の使用に更に適合し得る。許容可能な色素は、毒性ではない、ＦＤＡに承認された食用色素及び着色料を含むが、内政のために承認された薬学的に許容可能な色素が好ましい。

特定の患者に与えられる撮像用の結合体組成物の有効な量は、様々な要因に依存し得、その幾つかは患者ごとに異なる。有能な臨床医は、例えば腫瘍の可視化を促進するのに有効な量を判定することができる。投与量は、腫瘍、投与経路、治療の性質、治療、治療に対する腫瘍の感度などに依存する。当該技術分野における技術を用いて、有能な臨床医は、慣例的な臨床試験の間にわたり、特定の治療用又は撮像用組成物の投与量を最適化することができる。

典型的な用量は、被験体の体重１キログラムにつき０．００１から１００ミリグラムの結合体であり得る。患者の体重１キログラムにつき０．１から１０ｍｇの範囲の比較的大量の用量が、比較的無毒な撮像部分を持つ撮像用結合体に使用され得る。利用される量は、撮像法の感度、及び撮像部分の相対的な毒性に依存する。

本開示の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、当該技術分野で既知又は後に発見される任意の適切な手段により生成することができ、例えば、真核生物又は原核細胞から生成され、インビトロで合成されるなどである。タンパク質は、原核細胞により生成される場合、変性（例えば熱変性、ＤＴＴ減少など）により更に処理され、及び当該技術分野で既知の方法を用いて更に再変性され得る。

場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記されるＰＤ−１タンパク質フラグメントに対して、Ｒ８７Ｃ、Ｎ９１Ｃ、及び／又はＲ１２２Ｃに対応する１以上の変異を含む。場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３−２５及び３９−４６の何れかに明記されるアミノ酸配列を含む。上述のように、場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、検知可能な標識（例えば、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）撮像標識）を含む。場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記されるＰＤ−１タンパク質フラグメントに対して、Ｒ８７Ｃ、Ｎ９１Ｃ、及び／又はＲ１２２Ｃに対応する１以上の変異を含み、検知可能な標識（例えば、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）撮像標識）も含む。場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に明記されるＰＤ−１タンパク質フラグメントに対して、Ｒ８７Ｃ、Ｎ９１Ｃ、及び／又はＲ１２２Ｃに対応する１以上の変異を含む主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド）は、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）撮像（例えば、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、及び１８ＦなどのＰＥＴ放射体）、ＳＰＥＣＴ（例えばγ線放射体）、及び／又は蛍光撮像（例えば、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、ｂｏｄｉｐｙ Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、シアニン色素などの蛍光色素）のための撮像部分を含む。

ポリペプチドは、当該技術分野で既知の従来の方法を使用して、無細胞翻訳系又はインビトロでの合成により調製され得る。様々な商用の合成装置が利用可能であり、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， Ｂｅｃｋｍａｎの自動合成装置などがある。合成装置の使用により、自然発生のアミノ酸は、非天然のアミノ酸と置換され得る。特定の配列及び調製の方法は、利便性、経済性、必要とされる純度などにより決定される。

ポリペプチドはまた、組み換え合成の従来の方法に従い分離且つ精製され得る。溶解物は発現宿主から調製され得、該溶解物は、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、親和性クロマトグラフィー、又は他の精製法を用いて精製される。大部分に関して、使用される組成物は、少なくとも２０重量％の所望の生成物、より一般的には約７５重量％、好ましくは約９５重量％の生成物を含み、及び治療目的のために、生成物の調製及びその精製の方法に関連する汚染物質に関して、通常は少なくとも約９９．５重量％の生成物を含む。通常、パーセンテージは総タンパク量に基づく。

当業者に周知の方法は、コード配列、及び適切な転写／翻訳調節シグナルを含有する発現ベクターを構築するために使用され得る。このような方法は、例えば、インビトロでの組み換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボでの組み換え又は遺伝子組み換えを含む。代替的に、対象のポリペプチドをコード化することができるＲＮＡが化学的に合成されてもよい。当業者は、本開示のポリペプチドの何れかに関する適切なコード配列をもたらすために、周知のコドン利用表と合成方法を容易に利用することができる。核酸は実質的な純度で分離され且つ獲得され得る。通常、ＤＮＡ又はＲＮＡの何れかとしての核酸は、通常は少なくとも約５０％、大抵は少なくとも約９０％の純度である他の自然発生の核酸配列が実質的に無い状態で得られ、及び、前記核酸は典型的に「組み換え型」であり、例えば、自然発生の染色体上に通常は関連しない１以上のヌクレオチドによりフランクされる（ｆｌａｎｋｅｄ）。本開示の核酸は、直線分子として、又は環状分子内で提供され得、及び、自律複製分子（ベクター）内、又は複製配列の無い分子内で提供され得る。核酸の発現は、それ自体により、又は当該技術分野で既知の他の調節配列により調節され得る。本開示の核酸は、当該技術分野で利用可能な様々な技術を使用して、適切な宿主細胞に導入され得る。

本開示によると、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、治療上の使用、例えばヒトの処置に適している医薬組成物（医薬製剤）において提供され得る。幾つかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、本開示の１以上の治療実態、又はその薬学的に許容可能な塩、エステル、或いは溶媒和物を含む。幾つかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、別の治療剤、例えば別の抗腫瘍剤と組み合わせた、本開示の１以上の治療実体を含む。

本開示の治療実体は、活性な治療剤及び他の薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物（医薬製剤）として頻繁に投与される。好ましい形態は、投与と治療用途の意図した様式に依存する。組成物はまた、所望の製剤に依存して、薬学的に許容可能な、非毒性の担体又は希釈剤を含み得、これらは、動物又はヒトの投与のための医薬組成物を処方するために共通して使用されるビヒクルとして定められる。希釈剤は、組み合わせの生物活性に影響しないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理的なリン酸緩衝生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、及びハンクス溶液である。加えて、医薬組成物又は製剤はまた、他の担体、アジュバント、又は非毒性の、非治療用の、非免疫原性の安定剤などを含み得る。

また幾つかの他の実施形態において、本開示の医薬組成物はまた、タンパク質、キトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びコポリマー（ラテックス官能化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、アガロース、セルロースなど）などの多糖類、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び脂質凝集物（油の液滴又はリポソームなど）などの、大きくてゆっくりと代謝される巨大分子を含み得る。

幾つかの実施形態において、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、多特異性（例えば二重特異性）である。用語「多特異性」又は「二重特異性」は通常、第１の抗原に特異的な（例えば、第１の抗原の可変領域に由来する）少なくとも１つの領域、及び、第２の抗原に特異的な（例えば、第２の抗原の可変領域に由来する）少なくとも第２の領域を持つことにより、２以上の異なる抗原を認識する抗体を指すように、当該技術分野で使用される（このような抗体は、二官能性抗体又は多官能性抗体としても知られる）。二重特異性抗体は、２つの標的抗原に特異的に結合し、故に多特異性抗体の一種である。多特異性抗体は、組換ＤＮＡ方法により生成され得、又は、限定されないが任意の都合の良い方法により化学的に生成された抗体を含み得る。二重特異性抗体は、全ての抗体、抗体の結合体、又は２つの異なる抗原を認識することができる抗体のポリマー形態を含む。二重特異性抗体は、それらの二価の特徴を保持するように減少且つ改良された抗体、及び、各抗原に関する様々な抗原識別部を持つことができるように化学的に結合された抗体を含む。

幾つかの実施形態において、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは多特異性（例えば二重特異性）である。例えば、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは多特異性（例えば二重特異性）であり得、それにより、ポリペプチドの第１の領域は、（ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する）主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド配列、及び別の標的（例えば抗原、受容体、リガンドなど）に特異的に結合する第２の領域（融合パートナー）（例えば、抗体由来の配列、例えば、抗体のＣＤＲを含む抗体の結合領域；特定の結合ポリペプチド；リガンドの結合部分；受容体の結合部分など）に相当する。例えば、場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１以外の標的配列に特異的に結合する、第２のポリペプチド（融合パートナー）に融合される。場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１以外の標的に特異的に結合する、第２のポリペプチド（融合パートナー）に融合される（故に、そのような多重結合の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは二重特異性であり、それ故２つの異なる標的／部分を結合することになる）。

場合によっては、被験体の多重結合の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、その標的に結合する融合パートナーの結果としてシグナル伝達を変更する。例えば、場合によっては、融合パートナーは、融合パートナーとして、リガンド、又はリガンドの結合領域（例えば、サイトカイン、弱化されたサイトカインなど）を含み、多重結合の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、リガンドがその標的（例えば受容体）に結合する場合にシグナル伝達を変更する。同様に、場合によっては、融合パートナーは、融合パートナーとして、受容体または受容体の結合領域を含める。また、受容体がその標的（例えばリガンド）に結合する場合、多重結合の高親和性のＰＤ−１の模倣のポリペプチドはシグナル伝達を変える。

適切な融合パートナーの例は、限定されないが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＤ１１７、Ｃ−Ｍｅｔ、ＰＴＨＲ２、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３）などの癌細胞マーカーに対する抗体からの結合配列を含む。癌細胞マーカーへの特異的結合をもたらすＣＤＲを持つ抗体の例は、限定されないが、ＣＥＴＵＸＩＭＡＢ（ＥＧＦＲに結合）、ＰＡＮＩＴＵＭＵＭＡＢ（ＥＧＦＲに結合）、ＲＩＴＵＸＩＭＡＢ（ＣＤ２０に結合）、ＴＲＡＳＴＵＺＵＭＡＢ（ＨＥＲ２に結合）、ＰＥＲＴＵＺＵＭＡＢ（ＨＥＲ２に結合）、ＡＬＥＭＴＵＺＵＭＡＢ（ＣＤ５２に結合）、ＢＲＥＮＴＵＸＩＭＡＢ（ＣＤ３０に結合）などを含む。

適切な融合パートナーの例は、サイトカイン；弱化されたサイトカイン；４１ＢＢ−アゴニスト；ＣＤ４０−アゴニスト；ＢＴＬＡ及び／又はＣＤ１６０の阻害剤；及びＴＩＭ３及び／又はＣＥＡＣＡＭ１の阻害剤を含む。例えば、場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、多特異性の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドであり、以下から選択された１以上の融合パートナーに融合される：サイトカイン；弱化されたサイトカイン；４１ＢＢ−アゴニスト；ＣＤ４０−アゴニスト；ＢＴＬＡ及び／又はＣＤ１６０の阻害剤；及びＴＩＭ３及び／又はＣＥＡＣＡＭ１の阻害剤。例えば、多特異性の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、そのリガンド／受容体のために減少した親和性（対応する野生型サイトカインに対して減少される）を有している、修飾されたサイトカインである融合パートナーに融合され得る。そのような修飾されたサイトカインは、本明細書では「弱化されたサイトカイン」と称される。弱化されたサイトカインの一例は（可能な融合パートナーの一例）、ＩＬ−２受容体サブユニット（例えば、ＣＤ２５への結合を減少させるＦ４２Ａ、及びＣＤ１２２への結合を減少させるＤ２０Ｔ）（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９を参照）のうち２つに関して親和性を減少させる変異を持つ、ＩＬ−２タンパク質である。

場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、多特異性の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドであり、４１ＢＢ−アゴニスト（例えば、４１ＢＢＬ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０を参照））である融合パートナーを有している。場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、多特異性の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドであり、ＣＤ４０−アゴニスト（例えば、ＣＤ４０Ｌ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１を参照））である融合パートナーを有している。場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、多特異性の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドであり、ＢＴＬＡ及び／又はＣＤ１６０の阻害剤（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２を参照）である融合パートナーを有している。場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、多特異性の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドであり、ＴＩＭ３及び／又はＣＥＡＣＡＭ１（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３を参照）である融合パートナーを有している。

幾つかの実施形態において、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドと融合パートナーは、リンカー（例えばリンカーポリペプチド）により分離される。リンカーポリペプチドは、様々なアミノ酸配列の何れかを有し得る。タンパク質は、柔軟な性質を持ち得るリンカーポリペプチド（例えば柔軟なリンカーポリペプチド）により結合され得るが、他の化学結合は除外されない。適切なリンカーは、長さが約６のアミノ酸と約４０のアミノ酸との間、又は長さが約６のアミノ酸と約２５のアミノ酸との間で、ポリペプチドを含む。このようなリンカーは、タンパク質を結合するために合成的なリンカーコード化オリゴヌクレオチドを使用することにより生成され得る。ある程度の柔軟性を持つペプチドリンカーが使用され得る。結合ペプチドは事実上、任意のアミノ酸配列を有しており、場合によっては、リンカーは、通常柔軟なペプチドを結果としてもたらす配列を有することを念頭に置く。グリシン及びアラニンなどの小さなアミノ酸の使用は、柔軟なペプチドの作成に役立つ。このような配列の作成は、当業者には慣例的なものである。様々な異なるリンカーが市販で入手可能で、使用に適していると考慮される。

リンカーポリペプチドの例は、グリシンポリマー（Ｇ）_ｎ及びグリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）_ｎ、ＧＳＧＧＳ_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）、ＧＧＳＧＧＳ_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）、及びＧＧＧＳ_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）を含み、ここで、ｎは少なくとも１つの整数であり（例えばｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０より上の整数である））、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマーを含む。例示的なリンカーは、ＧＧＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）、ＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）、ＧＳＧＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）、ＧＳＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）、ＧＧＧＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）、ＧＳＳＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）などを含むがこれらに限定されないアミノ酸配列を含み得る。当業者は、上述の任意の要素に共役されるペプチドの設計は、全体的又は部分的に柔軟なリンカーを含み得、それにより、リンカーは、あまり柔軟でない構造を付与する１以上の部分と同様に、柔軟なリンカーも含み得ることを、認識する。

核酸。本開示はまた、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する分離された核酸、核酸を含むベクター及び宿主細胞、及び高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの生成のための組み換え技術を提供する。

高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの組み換え産生のために、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸は、更なるクローン化（ＤＮＡの増幅）、又は発現のために複製可能なベクターに挿入され得る。主題の高親和性ＰＤ−１模倣のポリペプチドをコード化するＤＮＡは、従来の手順を使用して容易に分離且つ配列され得る。多くのベクターが利用可能である。ベクターの構成要素は一般的に、限定されないが、以下のものの１以上を含む：シグナル配列、複製起点、１以上の標識遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列。

本開示の主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、直接的だけでなく、異種又は同種のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組み換えにより精製され得、これは、シグナル配列、又は、成熟したタンパク質或いはポリペプチドのＮ末端にて特異的な開裂部位を有する他のポリペプチド、免疫グロブリン定常領域配列などを含み得る。選択される異種のシグナル配列は、宿主細胞によって認識され且つ加工される（即ち、シグナルペプチターゼによって開裂される）ものが好ましい場合もある。天然の抗体シグナル配列を認識せず且つ加工しない原核生物の宿主細胞について、シグナル配列は、選択された原核生物のシグナル配列により置換される。

「単離された」核酸分子は、単離前に、通常関係している少なくとも１つの汚染核酸分子から同定且つ分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、自然に見出すことが可能な形態又は設定以外にも存在する。それ故、単離された核酸分子は、自然細胞に存在するため、核酸分子と区別される。

被験体の核酸をクローン化又は発現するのに適切な宿主細胞の例は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞を含むが、これらに限定される必要はない。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）によって変形されるサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児腎臓株（懸濁培養における増殖のためにサブクローン化される２９３又は２９３の細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６ （１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４， Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎培養細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２， ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８３：４４−６８ （１．９８２））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。宿主細胞は、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの生成のために上述の発現ベクター又はクローン化ベクターにより変形され、及び、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコード化する遺伝子の増幅に適切なものとして修飾された、従来の栄養培地中で培養される。

核酸の導入。場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドが、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸（例えば、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）；又はＤＮＡ（例えば組み換え発現ベクター、直線ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、プラスミド、ウイルスベクターなど））として、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを提供することにより、個体に投与される。本開示は、そのような方法、及び該方法のための核酸も提供する。

例えば、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡは細胞に導入することができ、該細胞は後に翻訳されたタンパク質を分泌する（ｓｅｃｒｅｔ）ことができる。別の例として、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化するＤＮＡ（例えば、組み換え発現ベクター、直線ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、プラスミド、ウイルスベクターなど）は、細胞に導入することができ、該細胞は後にコード化されたタンパク質を生成且つ分泌することができる。それ故、場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸は、シグナル配列（例えば、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を持つフレームの上流、及びその中にある）をコード化するヌクレオチド配列を含む。当業者に容易に認識されるように、本明細書で引用されるようなシグナル配列は、真核細胞のシグナル認識粒子により認識され得る、新生タンパク質のアミノ末端に、又はその付近にあるアミノ酸配列であり、結果として、細胞の分泌経路へのタンパク質の輸送をもたらし、故に細胞からのタンパク質の分泌を促進する（例えば、シグナル配列はタンパク質から開裂され得る）。任意の都合の良いシグナル配列が使用され得る。

場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸は、細胞（例えば、インビボ、エキソビボ、インビトロ）に導入され、該細胞は後にコード化されたタンパク質を生成且つ分泌することができる。場合によっては、細胞はインビトロである。場合によっては、細胞はエキソビボである。場合によっては、細胞はインビボである。例えば、場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸は、インビボである細胞に導入される（例えば、場合によっては、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸は、個体に核酸を投与することによりインビボの細胞に導入される）。場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸は、細胞（例えば、エキソビボ、インビトロ）に導入され、該細胞は後に個体に導入される。場合によっては、細胞は、個体に対して自家製である（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）（例えば、細胞は個体から単離され、又は個体から単離された細胞の後代である）。

場合によっては（例えば、上述のシナリオ、例えばインビトロ、エキソビボ、インビボの何れかにおいて）、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸が導入される細胞は、免疫細胞（例えば、白血球、Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、メモリー／エフェクターＴ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞、マクロファージ、単球、ＮＫ細胞など）である。場合によっては（例えば、上述のシナリオ、例えばインビトロ、エキソビボ、インビボの何れかにおいて）、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸が導入される細胞は、幹細胞（例えば、造血幹細胞、多能性幹細胞、複能性幹細胞、組織制限幹細胞（ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）など）である。場合によっては（例えば、上述のシナリオ、例えばインビトロ、エキソビボ、インビボの何れかにおいて）、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸が導入される細胞は、免疫細胞（例えば、白血球、Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、メモリー／エフェクターＴ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞、マクロファージ、単球、ＮＫ細胞など）、又は幹細胞（例えば、造血幹細胞、多能性幹細胞、多能性幹細胞、組織制限幹細胞など）である。

場合によっては（例えば、上述のシナリオ、例えばインビトロ、エキソビボ、インビボの何れかにおいて）、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸が導入される細胞は、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を持つＴ細胞である（そのような細胞はまた、本明細書では「ＴＣＲ−操作したＴ細胞」と称される）。本明細書で使用されるように、用語「ＴＣＲ−操作したＴ細胞」は、Ｔ細胞に対して異種であるＴ細胞受容体を有する任意のＴ細胞を指す。適切な例は、限定されないが（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＴ細胞（そのような細胞はまた、本明細書では「ＣＡＲ−Ｔ細胞」又は「操作したＣＡＲ−Ｔ細胞」と称される）；及び（ｉｉ）癌抗原などの抗原（例えば、ＭＡＲＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３など）に結合する異種のＴＣＲを含むＴ細胞（例えば、そのような細胞は、癌抗原などの抗原（例えば、ＭＡＲＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３など）に結合するＴＣＲなどの、異種のＴＣＲのＴｃＲ−アルファ及びＴｃＲ−ベータポリペプチドをコード化する核酸を含み得る）を含む。

場合によっては、適切なＴＣＲ−操作したＴ細胞は、癌マーカー（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＤ１１７、Ｃ−Ｍｅｔ、ＰＴＨＲ２、及び／又はＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３））に結合する、操作したＴＣＲ（例えば、抗原、ＣＡＲなどに結合する、異種のＴＣＲ）を有し得る。場合によっては、適切なＴＣＲ−操作したＴ細胞は、ＰＤ−Ｌ１（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体由来のＣＡＲ）及びＰＤ−１（例えば、抗ＰＤ−１抗体由来のＣＡＲ）から選択された標的抗原に結合する、操作したＴＣＲ（例えば、抗原、ＣＡＲなどに結合する、異種のＴＣＲ）を有し得る。場合によっては、適切なＴＣＲ−操作したＴ細胞は、ＰＤ−Ｌ１（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体由来のＣＡＲ）に結合する、操作したＴＣＲ（例えば、抗原、ＣＡＲなどに結合する、異種のＴＣＲ）を有し得る。場合によっては、適切なＴＣＲ−操作したＴ細胞は、ＰＤ−１（例えば、抗ＰＤ−１抗体由来のＣＡＲ）に結合する、操作したＴＣＲ（例えば、抗原、ＣＡＲなどに結合する、異種のＴＣＲ）を有し得る。場合によっては、適切なＴＣＲ−操作したＴ細胞は、ＣＤ１９（例えば、１Ｄ３ ＣＡＲ）に結合する、操作したＴＣＲ（例えば、抗原、ＣＡＲなどに結合する、異種のＴＣＲ）を有し得る。

場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコード化するヌクレオチド配列も含む。幾つかのそのような場合において、核酸は、ＴＣＲのＴＣＲアルファポリペプチド及びＴＣＲベータポリペプチドの両方をコード化するヌクレオチド配列を含む。場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸は、異種のＴＣＲ（癌抗原などの抗原（例えばＭＡＲＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３など）に結合するＴＣＲなど）のＴｃＲアルファポリペプチド及びＴｃＲベータポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列も含み、ＣＡＲ（例えば、第一世代ＣＡＲ、第二世代ＣＡＲ、第三世代ＣＡＲなど）をコード化する。主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する配列だけでなく、異種のＴＣＲのＴｃＲアルファポリペプチドとＴｃＲベータポリペプチドをコード化する配列、及びＣＡＲをコード化する配列を含む、様々な構成成分は、モジュラーである。故に、様々な配列は各々、同じ又は異なるプロモーターに操作自在に結合され得る。同じプロモーターに操作自在に結合されるそのような構成成分は、別個のポリペプチドとしてタンパク質が最終的に存在するのを可能にする配列（例えば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド配列など）により、分離され得る。様々な可能な配置の例は、限定されないが、図２０Ａ−２０Ｅ及び図２１Ａ−２１Ｄに記載されるものを含む。故に、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸の例は、限定されないが、図２０Ａ−２０Ｅ及び図２１Ａ−２１Ｄに記載されるものを含む。

「ベクター」又は「発現ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルス、又はコスミドなどのレプリコンであり、これに対して別のＤＮＡセグメント（即ち、「挿入物」）が結合され得、それにより細胞中の結合されたセグメントの複製が引き起こされる。

「発現カセット」は、プロモーターに操作自在に結合されたＤＮＡコード配列を含む。「操作自在に結合された」は並置を表わし、ここで、そのように記載された構成成分は、意図された方法でそれらを機能させるのを可能にする関連性にある。例えば、プロモーターは、その転写又は発現に影響する場合に、コード配列に操作自在に結合される。

用語「組み換え発現ベクター」又は「ＤＮＡ構築物」又は「発現ベクター」、及び当該技術分野で同様の用語は、ベクター及び少なくとも１つの挿入物を含むＤＮＡ分子を指すものとして、本明細書で互換的に使用される。組み換え発現ベクターは、挿入物を発現及び／又は伝播させるために、又は、他の組み換え型ヌクレオチド配列の構築のために生成され得る。挿入物（例えば、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列）は、プロモーター配列に操作自在に結合される又は結合されない場合があり、ＤＮＡ調節配列に操作自在に結合される又はされない場合がある。故に、場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、プロモーター（例えば、所望の細胞型（例えば真核細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、ヒト細胞、免疫細胞、白血球、Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、メモリー／エフェクターＴ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞、マクロファージ、単球、ＮＫ細胞、幹細胞、造血幹細胞、多能性幹細胞、複能性幹細胞、組織制限幹細胞など）において操作自在なもの）に操作自在に結合される。

プロモーターは、構成的に活性なプロモーター（即ち、構成的に活性／「ＯＮ」の状態にあるプロモーター）、誘導プロモーター（即ち、活性／「ＯＮ」又は不活性／「ＯＦＦ」という状態が、外部刺激（例えば、特定の温度、化合物、又はタンパク質の存在）により制御される、プロモーター）、空間的に制限されたプロモーター（即ち、転写調節要素、エンハンサーなど）（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）、一時的に制限されたプロモーター（即ち、プロモーターは、胚発生の特定の段階中、又は生物学的プロセス（例えば、マウスの毛嚢循環）の特定の段階中に、「ＯＮ」の状態又は「ＯＦＦ」の状態にある）であり得る。

適切なプロモーターは、ウイルス由来であり、それ故ウイルスのプロモーターと称され得、又は、原核生物或いは真核生物を含む任意の生体に由来し得る。適切なプロモーターは、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）による発現を促進するために使用され得る。例示的なプロモーターは、限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ即時型早期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０， ４９７ − ５００ （２００２））、増強されたＵ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００３ Ｓｅｐ １；３１（１７））、ヒトＨ１プロモータ（Ｈ１）などを含む。

誘導プロモーターの例は、限定されないが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）−調節プロモーター、ラクトース誘導プロモーター、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーターなどを含む。それ故、誘導プロモーターは、以下を含むがこれらに限定されない分子により調節され得る：ドキシサイクリン；ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ；エストロゲン受容体；エストロゲン受容体融合物など。

幾つかの実施形態において、プロモーターは、空間的に制限されたプロモーター（即ち、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーターなど）であり、それにより、多細胞の生体において、プロモーターは特異的細胞の亜群において活性（即ち、「ＯＮ」）である。立体的に制限されたプロモーターは、エンハンサー、転写調節要素、対照配列などとも称され得る。任意の都合の良い、空間的に制限されたプロモーターが使用され、適切なプロモーター（例えば、脳特異的プロモーター、神経細胞の亜群における発現を促進するプロモーター、生殖系列における発現を促進するプロモーター、肺における発現を促進するプロモーター、筋肉における発現を促進するプロモーター、膵臓の島細胞における発現を促進するプロモーターなど）の選択は、生体に依存する。例えば、様々な空間的に制限されたプロモーターは、植物、ハエ、蠕虫類、哺乳動物、マウスなどで知られている。故に、空間的に制限されたプロモーターは、生体に依存して、多様な異なる組織と細胞型における被験体の部位特異的な修飾ポリペプチドをコード化する核酸の発現を調節するために使用され得る。幾つかの空間的に制限されたプロモーターはまた、一時的に制限され、それにより、プロモーターは、胚発生の特定の段階中、又は生物学的プロセス（例えばマウスの毛嚢循環）の特定の段階中に、「ＯＮ」状態又は「ＯＦＦ」状態にある。

例示目的のために、空間的に制限されたプロモーターの例は、限定されないが、ニューロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、平滑筋特異的プロモーター、光受容体特異的プロモーターなどを含む。ニューロン特異的な空間的に制限されたプロモーターは、限定されないが、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、ＥＭＢＬ ＨＳＥＮＯ２，Ｘ５１９５６を参照）；芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモーター；神経フィラメントプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＮＦＬ，Ｌ０４１４７を参照）；シナプシンプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＳＹＮＩＢ，Ｍ５５３０１を参照）；ｔｈｙ−１プロモーター（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｃｅｌｌ ５１：７−１９；及びＬｌｅｗｅｌｌｙｎ， ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １６（１０）：１１６１−１１６６を参照）；セロトニン受容体プロモーター（例えばＧｅｎＢａｎｋ Ｓ６２２８３を参照）；チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（ＴＨ）（例えば、Ｏｈ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６：４３７； Ｓａｓａｏｋａ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｍｏｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １６：２７４； Ｂｏｕｎｄｙ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １８：９９８９；及びＫａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎｅｕｒｏｎ ６：５８３−５９４を参照）；ＧｎＲＨプロモーター（例えば、Ｒａｄｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：３４０２−３４０６を参照）；Ｌ７プロモーター（例えば、Ｏｂｅｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：２２３−２２６を参照）；ＤＮＭＴプロモーター（例えば、Ｂａｒｔｇｅ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：３６４８−３６５２を参照）；エンケファリンプロモーター（例えば、Ｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＥＭＢＯ Ｊ． １７：３７９３−３８０５を参照）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター；Ｃａ２＋−カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ−アルファ（ＣａｍＫＩＩα）プロモーター（例えば、Ｍａｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１３２５０；及びＣａｓａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｇｅｎｅｓｉｓ ３１：３７を参照）；ＣＭＶエンハンサー／血小板由来増殖因子−βプロモーター（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：５２−６０を参照）など。

脂肪細胞特異的な空間的に制限されたプロモーターは、限定されないが、ａＰ２遺伝子プロモーター／エンハンサー、例えば、ヒトａＰ２遺伝子の−５．４ｋｂから＋２１ｂｐまでの領域（例えば、Ｔｏｚｚｏ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １３８：１６０４； Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：９５９０；及びＰａｖｊａｎｉ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １１：７９７を参照）；グルコース輸送体−４プロモーター（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １００：１４７２５を参照）；脂肪酸トランスロカーゼ（ＦＡＴ／ＣＤ３６）プロモーター（例えば、Ｋｕｒｉｋｉ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ２５：１４７６；及びＳａｔｏ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７：１５７０３を参照）；ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）プロモーター（Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：２０６０３）；レプチンプロモーター（例えば、Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １３９：１０１３；及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２６２：１８７を参照）；アディポネクチンプロモーター（例えば、Ｋｉｔａ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ３３１：４８４；及びＣｈａｋｒａｂａｒｔｉ （２０１０） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １５１：２４０８を参照）；アジプシンプロモーター（例えば、Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：７４９０を参照）；レジスチンプロモーター（例えば、Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｍｏｌｅｃ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １７：１５２２を参照）など。

心筋細胞特異的な空間的に制限されたプロモーターは、限定されないが、以下の遺伝子：ミオシン軽鎖−２、α−ミオシン重鎖、ＡＥ３、心筋トロポニンＣ、心臓アクチンなどに由来する対照配列を含む。Ｆｒａｎｚ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． ３５：５６０−５６６； Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７５２：４９２−５０５； Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ７６：５８４−５９１； Ｐａｒｍａｃｅｋ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １４：１８７０−１８８５； Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２２：６０８−６１７；及びＳａｒｔｏｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：４０４７−４０５１。

平滑筋特異的な空間的に制限されたプロモーターは、限定されないが、ＳＭ２２αプロモーター（例えば、Ａｋｙｕｒｅｋ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ６：９８３；及び米国特許第７，１６９，８７４号を参照）；ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎプロモーター（例えば、ＷＯ２００１／０１８０４８を参照）；α−平滑筋アクチンプロモーターなどを含む。例えば、２つのＣＡｒＧ要素が中にある、ＳＭ２２αプロモーターの０．４ｋｂの領域は、血管平滑筋細胞特異的発現を媒介すると示されてきた（例えば、Ｋｉｍ， ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １７， ２２６６−２２７８； Ｌｉ， ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３２， ８４９−８５９；及びＭｏｅｓｓｌｅｒ， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２， ２４１５−２４２５を参照）。

光受容体特異的な空間的に制限されたプロモーターは、限定されないが、ロドプシンプロモーター；ロドプシンキナーゼプロモーター（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ４４：４０７６）；ベータホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ． ９：１０１５）；色素性網膜炎遺伝子プロモーター（上述のＮｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ． （２００７））；光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（上述のＮｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ． （２００７））；ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ５５：２２５）などを含む。

本明細書で互換的に使用される用語「ＤＮＡ調節配列」、「制御要素」、及び「調節要素」は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）、タンパク質分解シグナルなどの、転写制御配列と翻訳制御配列を指し、これらは、非コード配列（例えば、ＤＮＡ標的ＲＮＡ）又はコード配列（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド、又はＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド）の転写をもたらす及び／又は調節し、及び／又は、コード化されたポリペプチドの翻訳を調節する。

適切な発現ベクターは、限定されないが、ウイルスベクター（例えば、牛痘ウイルスをベースとするウイルスベクター；を含む。ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９， １９９４； Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４， １９９９； Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ， ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４， １９９５； Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７， １９９９； ＷＯ ９４／１２６４９， ＷＯ ９３／０３７６９； ＷＯ ９３／１９１９１； ＷＯ ９４／２８９３８； ＷＯ ９５／１１９８４、及びＷＯ ９５／００６５５を参照）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６， １９９８， Ｆｌａｎｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１， １９９７； Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３， １９９７； Ｊｏｍａｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３ ６９０， １９９７， Ｒｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８， １９９９； Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４， １９９６； Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｉｎ ＷＯ ９３／０９２３９， Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒ． （１９８９） ６３：３８２２ ３８２８； Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ． （１９８８） １６６：１５４ １６５；及びＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ （１９９３） ９０：１０６１３ １０６１７を参照）；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３， １９９７； Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２ ７８１６， １９９９を参照）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、及び、ニワトリ肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、脊髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳癌ウイルスなどのレトロウイルス由来のベクター）などを含む。

多数の適切な発現ベクターは、当業者に既知であり、その多くが市販で入手可能である。以下のベクターは一例として提供される；真核生物の宿主細胞：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、任意の他のベクターが、宿主細胞に適合する限り使用されてもよい。

利用された宿主／ベクターの系に依存して、構築プロモーター及び誘導プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含む、多くの適切な転写制御要素と翻訳制御要素の何れかは、発現ベクターに使用され得る（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １５３：５１６−５４４を参照）。

また、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、上述のようなもの）を含む細胞も、本開示に提供される。そのような細胞は、任意の生体に由来する細胞であり得る（例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻細胞、真菌細胞（例えば酵母菌）、動物細胞、無脊髄動物（例えばショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）由来の細胞、哺乳動物由来の細胞、げっ歯類由来の細胞、ヒト由来の細胞など）。

＜使用方法＞
癌を処置、低減、及び／又は予防し；感染症（例えば慢性感染症）を処置、低減、及び／又は予防し；及び／又は免疫疾患或いは障害（例えば、炎症性疾患、免疫抑制に関連した疾病など）（例えば、多発性硬化症、関節炎など）を処置、低減、及び／又は予防する方法が、提供される。例えば、場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、免疫刺激剤（例えば、免疫強化のために使用される）として使用され得る。

場合によっては、主題の方法は、個体の癌細胞の数の減少を結果としてもたらす。場合によっては、主題の方法は腫瘍の大きさの減少を結果としてもたらす。場合によっては、主題の方法は腫瘍の大きさの減少を結果としてもたらす。場合によっては、主題の方法は、第２の細胞上のＰＤ−Ｌ１に対する第１の細胞上のＰＤ−１の結合を減少させる。

場合によっては、主題の方法は、個体を診断又は予後判定する方法である（例えば、個体の癌を診断及び／又は予後判定する）。例えば、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、造影剤として有用であり、例えば、ＰＥＴ標識及び／又は蛍光標識（例えば、本開示に別記されるようなもの）などの検知可能な標識に共役される場合に、それは診断／予後の試薬などの様々な目的のために使用され得る。例えば、場合によっては、主題の方法は、個体における癌（例えば、検知可能なＰＤ−Ｌ１の存在、レベル、及び／又は位置が診断的（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）及び／又は予後徴候であり得る癌）を診断又は予後判定する方法である。

治療剤（例えば、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド）によるＰＤ−１媒介性細胞シグナル伝達の阻害は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など）を活性化し、それ故、癌細胞増殖及び／又はウイルス感染を阻害するといった免疫細胞の機能を増強し、及びヒトの疾患を処置するために免疫監視機構と免疫記憶機能を回復することができる。主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドにより処置することができる、症状、病気、及び／又は疾患は、限定されないが、癌（癌腫、軟組織腫瘍、肉腫、奇形腫、黒色腫、白血病、リンパ腫、脳腫瘍、固形腫瘍、中皮腫（ＭＳＴＯ）などを含むがこれらに限定されない癌の任意の形態）；感染症（例えば、慢性感染症）；及び／又は、免疫疾患又は障害（例えば、炎症性疾患）（例えば、多発性硬化症、関節炎など）を含む。例えば、場合によっては、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、免疫刺激剤（例えば、免疫強化のために使用される）として使用され得る。（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２シグナル伝達により誘導された、免疫抑制シグナルにより引き起こされる）免疫抑制に関与する任意の疾患、障害、又は病気（ａｉｌｍｅｎｔ）は、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを使用して処置され得る。

任意の癌は、主題の方法と組成物により処置されるのに適切な癌である。場合によっては、癌の癌細胞は、ＰＤ−Ｌ１を発現する（即ち、ＰＤ−Ｌ１発現に陽性である）。場合によっては、癌の癌細胞はＰＤ−Ｌ１を発現しないが、しかし、そのような癌は、（例えば、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドによる免疫強化により）主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドで今なお処置され得る。

本明細書で使用されるように、「癌」は、限定されないが、固形腫瘍癌（例えば、肺、前立腺、乳房、膀胱、結腸、卵巣、膵臓、腎臓、肝臓の癌、神経膠芽腫、髄芽細胞腫、平滑筋肉腫、頭部と頸部の扁平上皮癌、黒色腫、神経内分泌癌など）や液体の癌（例えば、血液の癌）；細胞腫；軟組織腫瘍；肉腫；奇形腫；黒色腫；白血病；リンパ腫；および、微小残存病変を含む脳癌と、原発性腫瘍と転移性腫瘍の両方を含む、任意の形態の癌を含んでいる。任意の癌も主題の方法と組成物によって処置されるのに適切な癌である。場合によっては、癌細胞はＰＤ−Ｌ１を発現する。場合によっては、癌細胞はＰＤ−Ｌ１を発現しない（例えば、こうした場合、処置されている個体の免疫系の細胞はＰＤ−Ｌ１を発現する）。

細胞腫は上皮組織で生じる悪性腫瘍である。上皮細胞は身体の外表面を覆い、内部空洞を覆い、腺性組織の内層を形成する。細胞腫の例としては、限定されないが、腺癌（腺（分泌）細胞中で始まる癌）、例えば、乳房、膵臓、肺、前立腺、および結腸の癌は腺癌であり得る；副腎皮質癌；肝細胞癌；腎細胞癌；卵巣癌；上皮内癌；腺管癌；乳癌；基底細胞癌；扁平上皮癌；移行上皮癌；結腸癌；上咽頭癌；多胞性嚢胞性腎癌；燕麦細胞癌；大細胞肺癌；小細胞肺癌；非小細胞肺癌；などが挙げられる。細胞腫は、前立腺、膵臓、結腸、脳（通常、第２転移として）、肺、乳房、皮膚などで見られる。

軟組織腫瘍は、結合組織に由来するまれな腫瘍の非常に多様な群である。軟組織腫瘍の例としては、限定されないが、胞状軟部肉種；血管腫様線維性組織球腫；軟骨粘液線維腫；骨格の軟骨肉腫；骨格外の粘液性軟骨肉腫；明細胞肉腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；隆起性皮膚線維肉腫；子宮内膜間質腫瘍；ユーイング肉腫；線維腫症（デスモイド）；乳児性の繊維肉腫；消化管間質腫瘍；骨巨細胞腫；腱滑膜巨細胞腫；炎症性筋線維芽細胞性腫瘍；子宮平滑筋腫；平滑筋肉腫；脂肪肉腫；典型的な脂肪腫；紡錘細胞または多形性脂肪腫；異型脂肪腫；軟骨様脂肪腫；十分に分化した脂肪肉腫；粘液性脂肪肉腫／円形細胞脂肪肉腫；多形態脂肪肉腫；粘液性悪性線維性組織球腫；高悪性度悪性線維性組織球腫；粘液線維肉腫；悪性末梢神経鞘腫；中皮腫；神経芽腫；骨軟骨腫；骨肉腫；原始神経外胚葉性腫瘍；胞巣状横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；良性または悪性のシュワン腫；滑膜肉腫；Ｅｖａｎ腫瘍；結節性筋膜炎；デスモイドタイプ線維腫症；単発性線維性腫瘍；隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）；血管肉腫；類上皮性血管内皮腫；腱滑膜巨細胞腫（ＴＧＣＴ）；色素性絨毛結節性滑膜炎（ＰＶＮＳ）；繊維性異形成症；粘液線維肉腫；線維肉腫；滑膜肉腫；悪性末梢神経鞘腫；神経線維腫；および、軟組織の多形腺腫；ならびに、繊維芽細胞、筋線維芽細胞、組織球、血管細胞／内皮細胞および髄鞘細胞に由来する腫瘍形成が挙げられる。

肉腫は、間充織起原の細胞、例えば骨または身体の軟組織、において生じる珍しい型の癌である。軟組織には軟骨、脂肪、筋肉、血管、線維組織または他の接続組織や支持組織を含む。異なる型の肉腫は、どこで癌を形成するかに基づく。例えば、骨肉腫は骨で形成され、脂肪肉腫は脂肪で形成され、そして横紋筋肉腫は筋肉で形成される。肉腫の例は、限定されないが次のものを含む：アスキン腫瘍；ブドウ状肉腫；軟骨肉腫；ユーイング肉腫；悪性血管内皮腫；悪性シュワン腫；骨肉腫；および軟部組織肉腫（例えば胞状軟部肉種；血管肉腫；葉状嚢胞性肉腫；隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）；硬性線維腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；類上皮肉腫；骨外性軟骨肉腫；骨外性骨肉腫；線維肉腫；胃腸間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）；血管周囲細胞腫；血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）（より一般に血管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）と呼ばれる）；カポジ肉腫；平滑筋肉腫；脂肪肉腫；リンパ管肉腫；悪性末梢神経鞘腫（ＭＰＮＳＴ）；神経線維肉腫；滑膜肉腫；未分多形肉腫など）。

奇形腫は、いくつかの異なる種類の組織（例えば、３つの胚葉：内胚葉、中胚葉および外胚葉の由来のいずれかの及び／又はすべての組織を含み得る）を含むであろう一種の胚細胞腫瘍である。奇形腫は、例えば、毛、筋肉および骨を含む。奇形腫は、女性における卵巣、男性における精巣および、子供における尾骨において最も頻繁に生じる。

黒色腫は、メラノサイト（色素メラニンを作る細胞）において発生する癌の形態である。それはホクロ（皮膚メラノーマ）において発生するかもしれないが、目または腸のような他の着色された組織でも発生し得る。

白血病は、骨髄のような造血組織で始まる癌であり、また多くの異常な血液細胞を生成し血流に流し込む原因になる。例えば白血病は、血流において通常成熟する骨髄由来細胞を起源とすることができる。白血病は、疾患がどれくらいの速さで発達し進行するか（例えば、急性対慢性）、影響を受ける白血球の種類（例えば、脊髄性対リンパ性）に基づき名づけられる。骨髄性白血病は、また骨髄性白血病もしくは骨髄芽球性白血病とも呼ばれる。リンパ性白血病は、リンパ芽球性白血病もしくはリンパ性白血病とも呼ばれる。リンパ性白血病細胞はリンパ節に集まり肥大し得る。白血病の例は、限定されないが次のものを含む：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）。

リンパ腫は、免疫系の細胞において発生する癌である。例えばリンパ腫は、リンパ系において通常成熟する骨髄由来細胞を起源とすることができる。リンパ腫瘍には２つの基本的分類がある。１つはホジキンリンパ腫（ＨＬ）であり、これはリード−ステルンベルグ細胞と呼ばれる一種の細胞の存在により特徴づけられる。現在、６つの認知されたＨＬの種類がある。ホジキンリンパ腫の例は、次のものを含む：結節性硬化症の古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、混合細胞型ＣＨＬ、リンパ球減少性ＣＨＬ、リンパ球豊富型ＣＨＬおよび結節性リンパ球優位型ＨＬ。

他の分類のリンパ腫は非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）であり、これは免疫系細胞の癌の大きく多様な群を含む。非ホジキンリンパ腫は、さらに遅発性の（ゆっくり成長する）経過がある癌と、侵攻性の（早く成長する）経過があるものに分けることができる。現在、６１の認知されたＮＨＬの種類がある。非ホジキンリンパ腫の例は、限定されないが次のものを含む：エイズ関連リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ腫、芽球性ＮＫ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、バーキット様リンパ腫（小型非切れ込み核細胞性リンパ腫）、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫、悪性皮膚Ｔ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、腸疾患型Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、肝脾のガンマ・デルタＴ細胞リンパ腫、Ｔ細胞白血病、リンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、鼻部Ｔ細胞性リンパ腫、小児リンパ腫、末梢Ｔ細胞性リンパ腫、中枢神経原発リンパ腫、トランスフォームしたリンパ腫、治療に関連したＴ細胞リンパ腫およびワルデンストローム・マクログロブリン血症。

脳腫瘍は、脳組織のいずれかの癌を含む。脳腫瘍の例は、限定されないが次のものを含む：神経膠腫（例えばグリア芽腫、星状細胞腫、希突起神経膠腫、脳室上衣細胞腫など）、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原始神経外胚葉性腫瘍（髄芽細胞腫）、等。

本明細書で使用されている用語の「感染症」は、感染病原体（例えば、被験体は細胞内病原体感染症、例えば、慢性細胞内病原体感染症を有する）により感染した生物体（すなわち被験体）の少なくとも１個の細胞におけるあらゆる状態を指す。本明細書で使用されている用語の「感染病原体」は、感染した生物体の少なくとも１個の細胞においてＰＤ−Ｌ（ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２）発現（例えば増大したＰＤ−Ｌ発現）を誘導する外来の生物学的存在（すなわち病原体）を指す。例えば感染病原体は、限定されないが細菌、ウイルス、原生動物、及び真菌を含む。細胞内病原体は、特に興味深い。感染症は感染病原体により引き起こされた障害である。幾つかの感染病原体は、ある条件の下では認識し得る症状や疾患を引き起こさないが、変化した条件の下では症状または疾患の原因となる可能性がある。主題となる方法は、慢性的な病原体感染の処置において使用され得る。例えば、該病原体感染は、限定されないが以下を含む。ウイルス感染（例えばレトロウイルス、レンチウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヒトパピローマウイルス、等）；細胞内の細菌感染（例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ等）；また細胞内の原生動物病原体（例えばＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐ.、 Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐ．、 Ｇｉａｒｄｉａ ｓｐ．、 Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．、 Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐ．等）。

主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを使用し処置し得る感染症は、限定されないが以下を含む。：ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、Ｇｉａｒｄｉａ、Ｍａｌａｒｉａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ；ウイルス肝炎（Ａ、Ｂ及びＣ）、ヘルペスウイルス（例えばＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−２、またＣＭＶ、エプスタイン−バーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、デング熱ウイルス、乳頭腫ウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスによる病原性の感染症、細菌クラミジア、リケッチア性細菌、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、ｐｎｅｕｍｏｎｏｃｏｃｃｉ、ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉとｃｏｎｏｃｏｃｃｉ、ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、ｐｒｏｔｅｕｓ、ｓｅｒｒａｔｉａ、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ｂａｃｉｌｌｉ、ジフテリア、ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ｂａｃｉｌｌｉ、コレラ、テタヌス、ボツリスム、炭疽、ペスト、レプトスピラ症、及びライム病細菌による病原性の感染症、菌類Ｃａｎｄｉｄａ（ａｌｂｉｃａｎｓ、ｋｒｕｓｅｉ、ｇｌａｂｒａｔａ、ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、など）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、ｎｉｇｅｒ、など）、Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ属（ｍｕｃｏｒ、ａｂｓｉｄｉａ、ｒｈｉｚｏｐｈｕｓ）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ及びＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍによる病原性の感染症、そしてＥｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａｆｏｗｌｅｒｉ、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｓｐ．、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉ、及び／又はＮｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓなど寄生生物による病原性の感染症。

いくつかの実施形態において、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ（例えばＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２）により誘導された阻害シグナルを遮断することができ、その結果として、免疫細胞の活性化を可能にする。したがって、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、免疫細胞、特に細胞表面上でＰＤ−１を発現する免疫細胞によるサイトカイン及び／又はケモカイン生成を促進及び／又は刺激することができる。例えば、免疫細胞と相互に作用する免疫複合体（すなわち抗原−抗体複合体）の存在は、免疫細胞を活性化し、また免疫細胞によるサイトカイン生成を誘導する。しかし、この活性化（刺激）は、第２の細胞の表面上のＰＤ−Ｌによって阻害され得る。主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、免疫細胞の免疫応答を変えるために使用され得る、またその結果として免疫疾患または障害（例えば免疫抑制に関連した障害）を処置または予防するのに有用かもしれない。言いかえれば、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは免疫系をシミュレート薬剤として免疫強化（免疫系の刺激）のために使用され得る。

上記の方法は、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドと薬物（例えば化学療法薬、腫瘍特異抗体、抗炎症薬、感染症を処置する薬物、免疫刺激剤すなわち免疫増強剤、免疫系を刺激する薬剤など）の組み合わせを限定することなく、治療上有効な量または有効投与量を投与する工程を含み、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを、処置を必要とする固体に投与する工程を含む。

例えば癌の処置のための本開示の治療用薬剤の有効量は、投与の方法、標的部位、患者の生理学的な状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬、処置は予防的か治療的かどうかを含む様々な要因に依存して異なる。一般的に患者はヒトであるが、ヒト以外の哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマなどのコンパニオン・アニマル、ウサギ、マウス、ラットなどの実験用哺乳動物なども処置され得る。処置投与量は安全性と効果を最適化するように滴定され得る。

いくつかの実施形態において治療上の投与量は、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、およびより一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇで範囲であり得る。例えば、投与量は、体重あたり１ｍｇ／ｋｇまたは体重あたり１０ｍｇ／ｋｇ、あるいは１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内になり得る。典型的な処置レジメは、２週ごとに１度、あるいは月に１度、あるいは３〜６か月に１度の投与を含む。本開示の治療用薬剤は、一般的に複数回投与される。１度の投与の間隔は、週１度、月１度、あるいは年１度であり得る。また間隔は、患者の治療用薬剤の血中濃度を測定することによって示されるように不規則になり得る。代替的に、本開示の治療用薬剤は持続放出製剤として投与され得る。その場合には、それほど頻繁な投与は必要ない。投与量と頻度は、患者のポリペプチドの半減期に依存し異なる。

予防的な利用において、比較的少ない投与量は、長期にわたって比較的頻繁ではない間隔で投与され得る。残りの生涯にわたって処置を受け続ける患者もいる。他の治療利用において、疾患の進行が縮小するか終結するまで、および好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的多い投与量は、時に必要とされる。その後、本特許では予防的な治療法が施され得る。

さらに他の実施形態において、本開示の方法は、上記の議論された状態、病気及び／又は疾患（例えばリンパ腫、白血病、癌腫、黒色腫、グリア芽腫、肉腫、骨髄腫、等を含む癌の腫瘍成長、腫瘍転移または腫瘍浸潤）のいずれかの処置、減少または予防する工程を含む。予防的な利用のために、生化学的な、組織学的な、及び／又は行動学的な疾患の症状、疾患の発達の間に提示される合併症と中間の病理学的な表現型を含む、疾患のリスクを除去または軽減するか、重症度を和らげるか、または疾患の発症を遅らせるために十分な量を、疾患を患い易いか、さもなければ疾患の他のリスクがある患者に、医薬品組成物または薬物は投与される。

主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、インビトロとインビボで疾患治療の経過を監視するのに使用され得る。例えば、ＰＤ−Ｌ（ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２）を発現する細胞、特に慢性感染細胞及び／又はＰＤ−Ｌ１を発現する癌細胞の数の増減を測定することによって、疾患の改善を目的とした特定の治療レジメが効果的かどうかを決定することができる。前記目的のために、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは検出可能に標識化され得る。

主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、液相中で利用されるか、又は固体相担体として利用され得る結合アッセイにおいてインビトロで使用され得る。さらに、これらの免疫アッセイのポリペプチドは、様々な方法で検出可能に標識化される。高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを利用できるアッセイの型の例は、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ、組織化学、直接的または間接的な形式どちらかの競合的または非競合的免疫アッセイなどのフローサイトメトリーである。高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを使用するＰＤ−Ｌの検知は、生理学的サンプルに関する組織学的アッセイを含む、順、逆のどちらか、または同時の様式で実行されるアッセイとして行われ得る。

主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、様々な担体に結合し、ＰＤ−Ｌ（ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２）を発現する細胞の存在を検出するために使用され得る。周知の担体の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然と修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトを含む。担体の性質は、本開示の目的のために可溶性または不溶性であり得る。当業者は、結合タンパク質のために他の適切な担体として認識するだろう、または日常の実験などを使用して確認することができるだろう。

当業者に知られた様々な異なる標識と標識化の方法がある。本開示で使用され得る標識のタイプの例は、限定されないが、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド金属、ナノ粒子、化学発光化合物およびバイオ発光化合物を含む。当業者は、本開示のポリペプチドに結合する他の適切な標識として認識するだろう、または日常の実験など使用して確認することができるだろう。更に、本開示のポリペプチドへのこれら標識の結合は、当業者が通常有する技術的範囲と使用して行われ得る。

体液と組織においてＰＤ−Ｌがある時、ＰＤ−Ｌは、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドにより検出されるかもしれない。検出可能な量のＰＤ−Ｌを含んでいる任意のサンプルは使用され得る。サンプルは、尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清などのような液体、または組織、便、生検などのような半固形物、または代替的に組織診に一般的に使用されるような固体の組織であり得る。

結果的により高い好感度をもたらすであろう他の標識技術は、低分子量ハプテンにポリペプチドを結合することから成る。その後、これらのハプテンは、第２の反応によって明確に検出することができる。例えば、アビジンと反応するビオチン、または特異的な抗ハプテン抗体と反応するジニトロフェノール、ピリドキサール、またはフルオレセインのようなハプテンを使用することは一般的である。

高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの画像化接合体は、一連の１回を超える投与として被験体に投与され得る。画像化接合組成物は、可視化技術の前の適切な時間に投与されるだろう。例えば、直接の目視検査前の１時間以内の投与は、適切であり得るか、あるいはＰＥＴまたはＭＲＩスキャンの前１２時間以内の投与が適切かもしれない。しかし、注意するべきことがある。それは、画像化化合物は患者の系から結局は除去されるであろうため、投与と可視化の間にあまり多くの時間を空けることはできない。

処置のための（例えば癌、慢性感染症、免疫抑制、炎症、等の処置のための）組成物は、非経口、局所的、静脈内、腫瘍内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、もしくは筋肉内への手段により投与され得る。典型的な投与経路は静脈内かまたは腫瘍内である、しかし他の経路も等しく有効になり得る。

組成物は、溶液または懸濁液のいずれかの注入可能なものとして調製され得る；注入前の液体ビヒクル中の溶液もしくは懸濁液に適切な固体形態も、また調製され得る。上に議論されるように、またその調剤は、リポソームまたはアジュバント効果を高めるためのポリラクチド、ポリグリコール酸あるいはコポリマーのようなミクロ粒子状物質の中で乳化されるかカプセル化されることもあり得る。Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：
１５２７， １９９０ ａｎｄ Ｈａｎｅｓ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８：９７−１１９， １９９７．。本開示の薬剤は、有効成分の持続放出または拍動性放出を可能にするような方式で調剤され得るデポ注射またはインプラントの調製の形で投与され得る。医薬組成物は、無菌、実質的に等張なものとして、そしてアメリカ食品薬品局のすべての医薬品適正製造基準（ＧＭＰ）の規則に完全に従って、一般的に調剤され得る。

本明細書に記載されている高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの毒性は、細胞培養または実験動物における標準の製薬手順により、例えばＬＤ_５０（個体群の５０％に対して致死的な量）またはＬＤ_１００（個体群の１００％に対して致死的な量）によって決定され得る。有毒と治療効果の間の用量比は、治療指数である。細胞培養アッセイと動物研究から得たデータは、ヒトで使用に毒性のない投与量範囲を処方するために使用され得る。本明細書に記述されたタンパク質の投与量は、好ましくは毒性がほとんどない又は全くない有効量を含む血中濃度の範囲内にある。投与量は、利用される剤形及び利用される投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。正確な製剤、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医者によって選択され得る。

本開示の範囲内においては、本開示の組成物（例えば高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドとその製剤）と使用説明書を含むキットがある。キットは、少なくとも１つの付加的な試薬、例えば化学療法薬、抗腫瘍抗体、抗感染症薬物、例えば抗ウイルス薬、をさらに含み得る。キットは、典型的にキットの内容物の意図した使用を示すラベルを含む。用語ラベルは、そのキット上、そうでなければキットと共に提供される、任意の記述または記録される材料を含む。

配列リストに対するカギ

野生型ヒトＰＤ−１タンパク質
（ＰＤＣＤ１、ＣＤ２７９、ＰＤ１、ＳＬＥＢ２、ｈＰＤ−１、ｈＰＤ−ｌおよびｈＳＬＥ１としても知られている）
（太字：膜貫通ドメイン、アミノ酸１６８−１９１；下線：アミノ酸２６−１４７）

野生型ヒトＰＤ−１ポリペプチドのフラグメント（Ｒ８７、Ｎ９１およびＲ１２２は下線が引かれている）
（主題のＰＤ−１模倣ポリペプチドの例； 「野生型フラグメントのＰＤ−１の模のポリペプチド」）

ＨＡＣ−Ｉ ＰＤ−１（位置４１でのイソロイシンを備えた高親和性コンセンサス）

ＨＡＣ−Ｖ ＰＤ−１（位置４１でのバリンを備えた高親和性コンセンサス）

Ｇ２ ４−１（世代２、クローン４−１）

Ｇ２ ４−２

Ｇ２ ４−３

Ｇ２ ４−５

Ｇ２ ４−１２

Ｇ１ ４−１２

Ｇ１ ４−２

Ｇ１ ４−５

Ｇ１ ４−１

Ｇ１ ４−４

Ｇ１ ４−１０

Ｇ２ ４−１０

Ｇ２ ４−１４

Ｇ２ ４−４

Ｇ２ ４−２２

Ｇ２ ４−６

Ｇ２ ４−７

Ｇ２ ４−１８

Ｇ２ ４−２３

多量体化された高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド（例えば改善された薬物動態のための）
（すなわち多量体化ドメインへの融合）
ＨＡＣ−Ｖ「ミクロボディ」
（ヒンジ領域を含むヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインに融合されたＨＡＣ−Ｖ ＰＤ−１）

ＨＡＣ−Ｖ Ｆｃ融合
（ヒトＩｇＧ Ｆｃに融合したＨＡＣ−Ｖ ＰＤ−１；ここでは（他のＦｃ領域と比較した）低下したエフェクター機能のためのヒトＩｇＧ４及びｆａｂアーム交換を防ぐためのＳ２２８Ｐ変異；ＰＤ−１変異体とＦｃの間のＡＡＡリンカーが含まれる）

「弱毒化された」サイトカインへの融合：
例：ＨＡＣ−ＩＬ２（Ｆ４２ａ／Ｄ２０Ｔ）

４１ＢＢ―アゴニストへの融合
例：ＨＡＣ−４１ＢＢＬ

ＣＤ４０−アゴニストへの融合
例：ＨＡＣ−ＣＤ４０Ｌ

ＢＴＬＡ及び／又はＣＤ１６０の阻害剤への融合
例：ＨＡＣ−ＢＴＬＡデコイ：

ＴＩＭ３及び／又はＣＥＡＣＡＭ１の阻害剤への融合：
例：ＨＡＣ−ＴＩＭ３デコイ：

システイン変異体（例えばＰＥＴ標識化のための）
ＨＡＣ−Ｖ Ｎ９１Ｃ

ＨＡＣ−Ｖ Ｒ８７Ｃ

ＨＡＣ−Ｖ Ｒ１２２Ｃ

ここで完全に充分に本発明は、様々な変化と修正は本発明の精神または範囲から逸脱することなくなされる得ることが、当業者にとって明白になるでしょう。

＜実験＞
以下の実施例は、本発明の作成及び使用の方法の完全な開示と記載を当業者に提供するように掲載されるものであり、本発明者が本発明と見なすものの範囲を限定するようには意図されておらず、以下の実験が、実行される全ての実験または唯一の実験であることを表わすようには意図されていない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関する正確さを確かなものとする努力がなされているが、実験的な誤差及び偏差もいくらか含まれるはずである。他に示されない限り、部分（ｐａｒｔｓ）は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ）であるか又はそれに近いものである。

本明細書で引用される全ての公報および特許出願は、個々の公報または特許出願が引用によって組み込まれるよう具体的且つ個別に示されたものであるかのように、引用によって本明細書に組み込まれる。

本発明は、本発明の実施のための好ましい様式を含むために、本発明者によって発見または提案された特定の実施形態に関して記載されている。本開示に照らして、多数の修正および変更が、本発明の意図した範囲から逸脱することなく例証される特定の実施形態においてなされ得ることが当業者によって認識される。例えば、コドン縮重が原因で、タンパク質配列に影響を与えることなく、元々の（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ）ＤＮＡ配列において変更がなされ得る。さらに、生物学的な機能等価性の考慮が原因で、種類または量の点で生物学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造において変更がなされ得る。すべてのそのような修正は、本明細書に添付の請求項の範囲内に含まれるように意図される。

＜実施例１＞
以下の実施例は、ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を有効に拮抗する高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの生成を実証している。高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−１抗体およびＰＤ−Ｌ１抗体としての同じ指標のための治療薬（例えば、現在臨床試験中であるもの）として使用され得る。

図１Ａは、Ｔ細胞の表面上のＰＤ−１に特異的に結合して、Ｔ細胞の活性化を阻害し、それにより、腫瘍細胞が免疫系によって破壊を回避することを可能にする、腫瘍細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１を例証する概略図である。図１Ｂは、癌細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、それにより、Ｔ細胞活性化を阻害する癌細胞が能力を低下させ、続いて、免疫応答を回避する癌細胞の能力を低下させる、主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを例証する概略図を示す。

図２Ａは、ＰＤ−１（右上）とＰＤ−Ｌ１（左下）との相互作用の構造表現を示す。ＰＤ−Ｌ１との接触部位に位置するＰＤ−１の残基は、球体として表わされる。（野生型アミノ酸残基）を含むＰＤ−１模倣ポリペプチドを、酵母細胞の表面上にディスプレイされた変異したポリペプチドの第一世代ライブラリ（世代１）を生成するためにＰＤ−Ｌ１と接触する残基で変異誘発した。その後、結合に基づく選択を、１００ｎのビオチン化したヒトＰＤ−Ｌ１を使用して実行した。ＰＤ−Ｌ１に対してさらに大きな親和性を有するＰＤ−１模倣ポリペプチドに対してスクリーニングするために、変異したポリペプチドの第二世代ライブラリ（世代２）を生成し、変異誘発を収束位置に集中させる。世代２ライブラリをスクリーニングするために、１ｎＭのビオチン化したヒトＰＤ−Ｌ１を使用した。スクリーニングからの結果に関して図２Ｂを参照する。

図３の表は、生成された操作した変異体（主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド）の配列を反映している。「Ｇ１」変異体は世代１ライブラリからのものであり、「Ｇ２」変異体は世代２ライブラリからのものである（図２Ａ−２Ｂを参照）。各番号を付けた行は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２として明記される天然ＰＤ−１模倣ポリペプチドに相対的な各々の示された残基に対するアミノ酸位置を表わす（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリペプチドは、野生型ＰＤ−１配列を含むが、膜貫通ドメインを欠き、野生型ＰＤ−１の第１の２５のアミノ酸を欠く、ＰＤ−１模倣ポリペプチドである）。回収された各ＰＤ−１模倣ポリペプチドのために、野生型アミノ酸残基との相違が、各変異体に対して結果として生じる変異のための一文字コードで示される。ＰＤ−Ｌ１に対する測定された表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の親和性が、（測定されるときに）右で示される。回収された配列に基づいて、コンセンサスアミノ酸変異を含む、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドが生成され、「ＨＡＣ」（高親和性コンセンサス）と呼ばれている。

図４は、実行された（ＰＤ−Ｌ１への結合のための）結合実験からの２つの代表的な表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）プロットを示す。（野生型ヒトＰＤ−１配列を有する）天然ＰＤ−１模倣ポリペプチドのための解離半減期は、１秒未満であった。対照的に、高親和性コンセンサスＰＤ−１変異体ＨＡＣ−Ｉ（主題の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド）のための解離半減期は、４２．４分であり、したがって、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドが、天然ＰＤ−１模倣ポリペプチドよりもＰＤ−Ｌ１へのはるかに高い親和性を有して結合されたことが実証されている。

その後、天然ＰＤ−１模倣ポリペプチドと比較した、生成された高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの幾つかの結合特性をさらに試験するための実験を行った。図５Ａ−５Ｃは、生成した高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドが、ＰＤ−Ｌ１に強力且つ特異的に結合したことを示す。酵母ディスプレイ：（図５Ａ）ヒトＰＤ−Ｌ１、（図５Ｂ）ヒトＰＤ−Ｌ２、または（図５Ｃ）マウスＰＤ−Ｌ１を、標識化した天然ＰＤ−１模倣ポリペプチドのストレプトアビジン四量体（野生型ヒトＰＤ−１配列を有し、Ａｌｅｘａ６４７に結合された対照ＰＤ−１模倣ポリペプチド）を用いて染色した。ＰＤ−Ｌ１への標識化した天然ＰＤ−１模倣ポリペプチドの結合を、標識化していない高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの可変濃度（Ｘ軸上で示される濃度）と競合させた。

（野生型ヒトＰＤ−１配列を有する）標識化していない天然ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を拮抗した。高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド（ＨＡＣ−Ｖ ＰＤ−１、Ｇ２ ４−１およびＧ２ ４−２）は、天然ＰＤ−１模倣ポリペプチドよりもはるかに低い濃度でＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の相互作用を強力に拮抗し、それ故、それらが実際に高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドであることが実証されている（図１Ａ）。高親和性ＰＤ１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ２の相互作用の拮抗作用を実証しなかったが、天然ＰＤ１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ２の相互作用を拮抗した。したがって、これら特定の高親和性ＰＤ１模倣ポリペプチドは、天然ＰＤ１模倣ポリペプチドのＰＤ−Ｌ１に対する親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ１に対する親和性を増大させたが、天然ＰＤ１模倣ポリペプチドのＰＤ−Ｌ２に対する親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ２に対する親和性を減少させた（図１Ｂ）。生成された高親和性ＰＤ１模倣ポリペプチドは、マウスＰＤ−Ｌ１（図５Ｃ）への結合を競合することができた。

その後、ヒト癌細胞に対してＰＤ−Ｌ１を拮抗する生成された高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドの能力を試験した。図６Ａは、２４時間の２０００Ｕ／ｍＬのヒトインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）での刺激による誘導後にヒト黒色腫細胞株ＳＫＭＥＬ２８上で、ＰＤ−Ｌ１が発現されたことを実証している（ＰＤ−Ｌ１染色を、誘導（プラスＩＦＮγ）条件対非誘導（マイナスＩＦＮγ）条件下でフローサイトメトリーによって評価した）。ＩＦＮγ刺激したＳＫＭＥＬ２８細胞を、標識化していない高親和性のＰＤ−１模倣ポリペプチドの可変濃度（Ｘ軸上で示される濃度）で、標識化した天然ＰＤ−１模倣ポリペプチドのストレプトアビジン四量体（野生型ヒトＰＤ−１配列を有し、Ａｌｅｘａ６４７に結合された対照ＰＤ−１模倣ポリペプチド）を用いて染色した（図６Ｂ）。（野生型ヒトＰＤ−１配列を有する）標識化していない天然ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＳＫＭＥＬ２８細胞への標識化した天然ＰＤ−１模倣ポリペプチドの結合を防ぐこと（防ぐために高濃度を必要とする）に有効ではなかった（ＩＣ_５０＝８．２μＭ）。対照的に、ＨＡＣ−Ｖ（高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド）は、標識化した天然ＰＤ−１模倣ポリペプチドの結合を強力に阻害した（２１０ｐＭのＩＣ_５０）。ＨＡＣ−ＭＢＨ（ヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインへと融合した、ＨＡＣ−Ｖ、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド）は、さらに増強された効能で標識化した天然ＰＤ−１模倣ポリペプチドの結合を阻害した（５５ｐＭのＩＣ_５０）。

＜実施例２：最適化された免疫療法とｉｍｍｕｎｏＰＥＴ画像化のための高親和性ＰＤ−１変異体の操作（幾つかのデータは実施例１と共有される）＞
免疫チェックポイントＰＤ−１を介するシグナル伝達は、抗腫瘍免疫応答を低下させることによる腫瘍進行を可能にする。ＰＤ−１とモノクローナル抗体を有するそのリガンドＰＤ−Ｌ１との間のシグナル伝達軸の治療的阻害は、癌の処置における著しい臨床的効果を示した。しかし、抗体は、乏しい組織／腫瘍浸透度および免疫細胞を枯渇させる有害なＦｃエフェクター機能を含む、このセッティングにおけるその効能を縮小しかねない固有の制限がある。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１に向けられた免疫療法が、より小さな、非抗体治療薬で改善され得るかを判定するために、酵母表面ディスプレイによる定向進化を本明細書で使用し、ＰＤ−１細胞外ドメインをＰＤ−Ｌ１の高親和性（１００ｐＭ）競合的アンタゴニストとして操作した。抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体とは対照的に、高親和性ＰＤ−１は、末梢エフェクターＴ細胞の枯渇を誘導することなく優れた腫瘍浸透を実証した。これらの利点と一致して、同系ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて、高親和性ＰＤ−１は、小さな腫瘍（〜５０ｍｍ^３）および大きな腫瘍（＞１５０ｍｍ^３）の両方を処置するのに有効であったが、一方で抗ＰＤ−Ｌ１抗体の活性は、大きな腫瘍に対して完全に抑止された。さらに、高親和性ＰＤ−１を、放射標識し、ＰＥＴ画像化トレーサーとして適用して、生きたマウスにおいてＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍とＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍を効率的に区別し、侵襲的生検および組織学的分析の代案方法を提供する。これらの結果は、増強された癌免疫療法および免疫診断に対する、小さな、非抗体治療薬の好ましい薬理を強調している。

＜結果＞
ＰＤ−Ｌ１を拮抗する高親和性ＰＤ−１変異体の定向進化。ＰＤ−Ｌ１（８．２μＭのＫ_Ｄ）^１８に対するその適度の親和性を考慮すると、野生型ＰＤ−１細胞外ドメインは、治療上の観点でＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１の相互作用を競争的に拮抗するには不十分な候補である。それ故、ＰＤ−Ｌ１に対するＰＤ−１の親和性を、酵母表面ディスプレイでの定向進化を使用して増強させた。操作戦略は、２ライブラリの（ｔｗｏ−ｌｉｂｒａｒｙ）アプローチを利用した。親和性の大きな増加を与える変異「ホットスポット」を特定するために、第１ライブラリを使用し、第２ライブラリは、第１ライブラリに由来する良性変異の最適な組み合わせを判定する働きをした。

最初の「第一世代」ライブラリを設計するために、ネズミＰＤ−１（ｍＰＤ−１）とヒトＰＤ−Ｌ１（ｈＰＤ−Ｌ１）^１９との間の複合体の結晶構造を使用して、無作為化に関するＰＤ−Ｌ１との接触界面でヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１）における２２の対応する残基を特定した（図７Ａ；図１２Ａ−１２Ｂ）。このライブラリは、酵母の表面上にディスプレイされ、組み換え型の、ビオチン化したｈＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインを選択試薬として使用して、４ラウンドの選択を実行した（図７Ｂ、「世代１」）。表面プラズモン共鳴によって測定されるように、残りのクローンの生物物理学的特徴づけは、ｈＰＤ−Ｌ１に対する親和性の４００乃至５００倍の増加を示した（図７Ｃ）。しかし、クローンは乏しい生化学的挙動を示し、発現量の減少および凝集傾向があった。変異体の配列の検査（図７Ｃ）は、１クローン当たり１６の変異の平均を示し、無作為化された位置のいくつかが、変異の小さなセット（例えばＶ３９、Ｎ４１）に収束し、一方で、他の位置は、完全に相違した（例えば、Ｓ４８、Ｄ５２）か、または逆に、元の野生型残基（例えば、Ｐ１０５、Ｅ１１１）を厳密に優先した（ａ ｓｔｒｉｃｔ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）ようであった。結果は、１０^８の酵母形質転換体とともにサンプリングされたライブラリの非常に大きな理論的多様性（およそ１０^２０）を考慮して予期されるように、「第一世代」変異体が、良性変異、非機能性のパッセンジャー変異、および有害突然変異の混合物を含む傾向にあることを示唆した。

したがって、「第二世代」ライブラリが不必要且つ有害な置換を排除するように作成されたが、増強された親和性を与える変異の組み合わせを同時に最適化していた（図１３Ａ−１３Ｂ）。ライブラリを、野生型から離れて収束するように見え、ＰＤ−１細胞外ドメイン内の「コア」位置で変更を導入したこれらの位置上に集中させた（図７Ａ）。５ラウンドの選択を通して、ＰＤ−Ｌ１に強く結合した変異体を得た（図７Ｂ、「世代２」）。野生型ｈＰＤ−１と比較して、選択された変異体は、１５，０００−４０，０００倍増強された親和性を有するｈＰＤ−Ｌ１と結合し、８つの接触残基および２つのコア残基を含む１０のアミノ酸置換基のコンセンサス配列上への収束への強い傾向を示した（図７Ｃ）。位置４１でのイソロイシンまたはバリン（それぞれ、名付けられたＨＡＣ−ＩおよびＨＡＣ−Ｖと呼ばれる）のみが異なる、この「高親和性コンセンサス」（ＨＡＣ）ＰＤ−１の２つのバージョンが生成され、親和性または生化学的挙動による区別がつかないことが分かった。ＨＡＣ−ＰＤ−１変異体の両方が、容易に発現され得、単量体であり、およそ１００ｐＭのＫ_Ｄ値を有してｈＰＤ−Ｌ１と結合した（図７Ｃ）。他の高親和性変異体と同様に、親和性のこの増加は、野生型のｈＰＤ−１：ｈＰＤ−Ｌ１の相互作用の１秒未満と比較して、オフレートの劇的な低下によって大きく促進され、およそ４０分の解離半減期がもたらされる（図８Ａ）。

癌細胞上でＰＤ−Ｌ１を拮抗する操作されたＰＤ−１変異体が能力を評価するために、競合結合実験をヒトおよびネズミの黒色腫細胞株上で実行した。ヒトＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞上で、ＨＡＣ−Ｖは、野生型ＰＤ−１（ＩＣ_５０＝８．２μＭ）と比較したときに、４０，０００倍の効能の増強となる、２１０ｐＭのＩＣ_５０を有する野生型ＰＤ−１四量体の結合をブロックした（図８Ｂ）。ヒトＰＤ−Ｌ１を使用して選択を実行したが、ＨＡＣ−Ｖもまた、野生型ｈＰＤ−１（ＩＣ_５０＝２．６μＭ）と比較して、ネズミＢ１６−Ｆ１０細胞（ＩＣ_５０＝６９ｎＭ）上のＰＤ−Ｌ１の増強された遮断を示し、それにもかかわらず、ヒト細胞上のそのブロッキングに比べて効能が低下した（図８Ｂ）。インビボの研究のための、ｍＰＤ−Ｌ１をより効率的に拮抗することができるＨＡＣ−ＰＤ−１変異体を生成するために、ＨＡＣ−Ｖの配列をヒトＩｇＧ１の二量体ＣＨ３ドメインに融合し、ＨＡＣ「ミクロボディ」を作り出した（ＨＡＣｍｂ；図１４）。その二量体構造によって与えられた結合活性の増加によって、ＨＡＣｍｂは、ＳＫＭＥＬ２８およびＢ１６−Ｆ１０の細胞上の、それぞれ、ｈＰＤ−Ｌ１（ＩＣ_５０＝５５ｐＭ）およびｍＰＤ−Ｌ１（ＩＣ_５０＝１．２ｎＭ）の両方を強力にブロックした（図８Ｂ）。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２の第２リガンドのためのＨＡＣ−ＰＤ−１の交差反応性も特徴づけた。ｈＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインをディスプレイする酵母に関する競合結合実験において、ＨＡＣ−ＰＤ−１は、野生型ＰＤ−１（ＩＣ_５０＝２．５μＭ 図８Ｂ）と比較して、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ２の相互作用を測定可能に阻害しなかった。まとめると、これらの結果は、ＨＡＣ−ＰＤ−１がＰＤ−Ｌ１を強力に且つ特異的に拮抗することができることを示した（およびそれ故、更なる操作のためのモジュラー足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）としても有用であり得る）。

腫瘍浸透およびＴ細胞枯渇試験。インビボでのＨＡＣ−ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１結合および腫瘍浸透度を評価するために、ゲノム編集技術を使用して、ｍＰＤ−Ｌ１発現に対して決定的に陰性であったか、またはｍＰＤ−Ｌ１に対して陰性であったがｈＰＤ−Ｌ１発現に対して構成的に陽性であった、マウス結腸癌株ＣＴ２６の亜系統を生成した。これらのＰＤ−Ｌ１陽性および陰性の細胞株は、蛍光標識した抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体または蛍光標識したＨＡＣ−ＰＤ−１タンパク質のいずれかでのインビボの染色によって容易に区別され得る（図１５Ａ）。これらの操作した株を使用して、マウスにＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍およびｈＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍を両側的に移植した。腫瘍が直径およそ１ｃｍまで成長すると、蛍光標識した抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体と蛍光標識したＨＡＣ−ＰＤ−１の混合物を、 腹腔内注入によって全身に送達した。４時間後、対になった腫瘍を切開し、各薬剤による結合の程度を、蛍光顕微鏡法とＦＡＣＳ分析の両方を使用して評価した。

すべてのＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍において、組織学的分析は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはＨＡＣ−ＰＤ−１のいずれかによる検出可能な結合を明らかにせず、両方の薬剤の特異性を確証した（図９Ａ）。対照的に、ｈＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍における抗体とＨＡＣ−ＰＤ−１両方の結合が明確に観察されたが、著しく異なる分布であった。抗体関連の蛍光シグナルは、血管に近接している腫瘍および細胞の末梢領域に限定されたが、ＨＡＣ−ＰＤ−１染色は広範囲であり、腫瘍内深くの領域まで及んだ（図９Ａおよび図１５Ｂ）。これらの定性的観察は、非酵素的な解離に続く対になったＰＤ−Ｌ１陽性および陰性の腫瘍のＦＡＣＳ分析に支持された。抗体もＨＡＣ−ＰＤ−１も、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍の細胞と認識できるほどには相互作用しなかった（図９Ｂ）。しかし、ｈＰＤ−Ｌ１発現する腫瘍において、多くの細胞がＨＡＣ−ＰＤ−１染色に対して陽性であり、相当な個体数が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびＨＡＣ−ＰＤ−１結合の両方に対して陽性であった（図９Ｂ）。対照的に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体染色のみに対して陽性であった細胞は、あったとしてもごく少数であった（図９Ｂ）。複数の実験にわたるこのシグナルの定量化は、ＨＡＣ−ＰＤ−１結合（ｐ＜１×１０^−４）の著しい利点を明らかにし、抗ＰＤ−Ｌ１抗体よりもＨＡＣ−ＰＤ−１によって平均で２倍を超える数の細胞が結合された（図９Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ＨＡＣ−ＰＤ−１が腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１と結合することができた（さもなければ、抗体結合にアクセスできなかった）ことを例証している。

そのより小さなサイズに加えて、ＨＡＣ−ＰＤ−１はＦｃドメインを欠いており、それ故、抗体とは対照的に、それが循環するＴ細胞数の免疫媒介性の枯渇に寄与しないであろうことが説かれた。この仮説を試験するために、野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに、同系結腸癌株ＣＴ２６に由来する腫瘍を移植し、移植の１４日後から、（ｍＰＤ−Ｌ１へのその増強された結合のためにこの場合は使用される）ＰＢＳ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、またはＨＡＣｍｂの毎日の処置を施した。処置の開始の７２時間後に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を注入されたマウスは、循環する末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞の１５％の減少（ｐ＝０．０１１）を示した（図９Ｄ）。ＰＤ−Ｌ１発現はＣＤ４＋およびＣＤ８＋の細胞の大多数上で検出可能であった（図１６）が、枯渇効果はＣＤ８＋Ｔ細胞に特有であり、ＣＤ４＋区画（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）を残した（図９Ｄ）。抗体とは対照的に、ＨＡＣｍｂタンパク質による毎日の処置は、循環するＴ細胞レベル（図９Ｄ）に対する検出可能な効果がなかったが、リンパ節Ｔ細胞に対するその効果はわずかにより複雑であった。血液中でのように、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による処置は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の著しい枯渇につながった（図９Ｅ、〜２０％、ｐ＜１×１０^−４）。しかしながら、効果がなかった血液中とは異なり、ＨＡＣｍｂによる処置は、リンパ節におけるＣＤ８＋Ｔ細胞レベルのわずかな減少につながったが、抗ＰＤ−Ｌ１抗体よりも著しく少ない程度であった（図９Ｅ、〜１０％、ｐ＝０．０２２）。
この観察は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１に向けられた薬剤が、Ｆｃ媒介性の枯渇の他に腫瘍へのＴ細胞移動のシミュレーションも含むＴ細胞動態に対する多面的効果を有し得ることを示唆している。

同系腫瘍モデルにおけるＨＡＣ−ＰＤ−１の治療効果。ＨＡＣ−ＰＤ−１薬剤がヒトおよびマウスのＰＤ−Ｌ１両方を効果的に拮抗したことを考慮して、この遮断が、延長線上で（ｂｙ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の抗腫瘍効果を再生することができるかを試験した。野生型の、ＨＡＣ−ＰＤ−１のインビボ効果の最初の試験として、抗ＰＤ−Ｌ１抗体に応答すると前に示された同系ＣＴ２６腫瘍を免疫応答性Ｂａｌｂ／ｃマウスに移植した。移植後７日目に、腫瘍が平均でおよそ５０ｍｍ^３の大きさに達したときに、マウスを処置コホートに無作為化し、ＰＢＳ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、またはＨＡＣｍｂによる毎日の注入を開始した（図１０Ａ）。予想通り、ＰＢＳ処置したマウスの腫瘍は急速に成長した（図１０Ｂ）。しかしながら、１４日目までに、抗ＰＤ−Ｌ１またはＨＡＣｍｂのいずれかによる処置は、対照に比べて腫瘍成長を著しく遅らせた（図１０Ｂ、それぞれ、ｐ＝２×１０^−４およびｐ＜ｐ＜１×１０^−４）。これらの２つの薬剤は、小腫瘍研究のほぼ同一の効果を示し、２つの治療群間に腫瘍成長の統計的差はなかった（図１０Ｂ、ｐ＝０．９９）。これらのインビボでの治療結果から、比較的小さな腫瘍のセッティングにおいて、ＨＡＣｍｂが、十分に検証された抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体での処置と区別がつかないほど効果的であることが結論付けられる。

初期実験の設計でのように、ネズミ癌モデルの多くの報告は、強い治療効果を実証するために、まさに早期の腫瘍の処置に依存する。しかしながら、ＨＡＣ−ＰＤ−１の優れた組織浸透度と、循環するＴ細胞の逆効果の枯渇を誘導することなくＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１の相互作用をブロックするその能力を考慮すると、抗体との比較におけるその利点が、より大きく、より問題のある腫瘍を処置しようとするときに最も明白であるかもしれないことが仮定された。この目的のために、実験を開始し、ここで、Ｂａｌｂ／ｃマウスにＣＴ２６細胞を移植し、その腫瘍容積を毎日モニタリングした；個々の腫瘍が１５０ｍｍ^３の最小容積に達したとき、または前の実験の平均の開始時の大きさのおよそ３倍に達したときのみに、宿主マウスをコホートに無作為化し、処置を開始した。実験のプロトコルのこの単純な変更は、これらの薬剤の効力比較に対して甚大な効果があった。抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびＨＡＣｍｂは、非常に小さなＣＴ２６腫瘍の処置において等価であった（図１０Ｂ）が、より大きな腫瘍の場合には、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を毎日注入しても、ＰＢＳ処置に対する測定可能な効果が示されなかった（図１０Ｄ、左、ｐ＝０．４６４）。全く対照的に、ＨＡＣｍｂは、ＰＢＳ処置したマウス（図１０Ｄ、右、ｐ＜１×１０^−４）または抗体処置したマウス（図１０Ｄ、左、ｐ＜１×１０^−４）のいずれと比較しても、研究の期間にわたって大きな腫瘍における腫瘍成長を著しく減少させた。

次に、単独療法としてのＨＡＣｍｂの優れた効果が、組み合わせのセッティング（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体との）においても発揮されるかどうかを試験した。抗ＣＴＬＡ４抗体治療は、単独で、この大きな腫瘍モデルにおいて有効であり、ＰＢＳ処置に比べて腫瘍の成長を遅らせた（図１０Ｄ、左および右、ｐ＜１×１０^−４）；しかし、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と抗ＣＴＬＡ４抗体との併用治療は、抗ＣＴＬＡ４単独以上の付加的な利点をもたらさなかった（図１０Ｄ、左、ｐ＝０．７５６）。対照的に、ＨＡＣｍｂ（図１０Ｄ、ｐ＝０．０１２）、または抗ＣＴＬＡ４単独で（図１０Ｄ、ｐ＝０．００６）と比較して、抗ＣＴＬＡ４とＨＡＣｍｂの組み合わせで処置したマウスは、著しくより小さな腫瘍を有していたため、ＨＡＣｍｂは抗ＣＴＬＡ４治療を向上させた。

要約すると、これらのインビボ研究は、ＨＡＣ−ＰＤ−１が同系マウス腫瘍を処置するのに有効であることを実証している。重要なことに、結果は、腫瘍サイズの増大が抗ＰＤ−Ｌ１抗体の効能に偏った影響を与え（ｄｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｅｌｙ ａｆｆｅｃｔ）（実際には、腫瘍が一定のサイズ閾値を超えると効果がなくなる）、一方で、ＨＡＣ−ＰＤ−１タンパク質が、困難且つより臨床的に現実的な腫瘍モデルにおいて効果的なままであることを例証している。したがって、この観察は、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１遮断の最大の治療効果を十分には得ていないこと、および最適化された治療剤により更なる改善が可能であることを示唆している。

^６４Ｃｕ放射標識したＨＡＣ−ＰＤ−１を用いる陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）によるＰＤ−Ｌ１発現のインビボ検出。腫瘍ＰＤ−Ｌ１発現は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に向けられた免疫療法に対する応答を予測する潜在的なバイオマーカーとして示唆されてきた。現在、腫瘍上のＰＤ−Ｌ１発現は、最も一般的には、生検を介して評価され、免疫組織化学的染色が後続する。しかし、生検手順の関連する危険性と禁忌（ｃｏｎｔｒａｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）に加えて、結果として生じる組織解析は、腫瘍内のＰＤ−Ｌ１の不均一な空間的発現パターンによって複雑化される。「ＩｍｍｕｎｏＰＥＴ」は、組織を切除する必要性なしに腫瘍全体にわたってＰＤ−Ｌ１の発現を同時に測定する、非侵襲的手段を提供することができる。ＰＤ−Ｌ１に対するその高親和性および特異性に加えて、その増強された組織透過性のおかげで、放射標識したＨＡＣ−ＰＤ１は、腫瘍ＰＤ−Ｌ１発現を評価する有効なＰＥＴプローブとして機能し得る。

ＨＡＣ−ＰＤ−１足場に基づいてＰＥＴトレーサーを発達させるために、変異した変異体、ＨＡＣ−Ｎ９１Ｃを、チオール反応性の二官能性キレートＤＯＴＡ−マレイミド^２０と結合させた。ＤＯＴＡ−ＨＡＣの見かけのｈＰＤ−Ｌ１親和性がその親配列ＨＡＣ−Ｖより弱かったが、ＤＯＴＡ−ＨＡＣは、それにもかかわらず、ＷＴ ＰＤ−１より１，２００倍より強力にｈＰＤ−Ｌ１を拮抗した（図１７Ａ）。続く^６４Ｃｕでの放射標識は、ｈＰＤ−Ｌ１特異的な放射性タンパク質（ｒａｄｉｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ）^６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣをもたらし、これは、１μｇ当たり８−１０μＣｉの比放射能および９８％を超える放射化学的純度を有していた（図１７Ｂ）。このＰＥＴトレーサーを使用して、生きたマウスにおける全身のｈＰＤ−Ｌ１発現を視覚化した。

^６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣは、注入の１時間後に強い腫瘍／筋肉のシグナル（６倍の増強、ｐ＜０．０５）を示し（図１１Ａ、図１８Ａ）、腎臓では高い取り込みがあり、これは、血液からの遊離薬物の急速な腎クリアランスと、肝臓で発現したタンパク質による銅特異的結合と一致した、肝臓中の高いシグナルを示している（図１８Ｂ、図１８Ｅ）。ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍（図１１Ａ、図１８Ｃ）内、または５００μｇの冷たいＨＡＣ−ＰＤ１の前の注入によってブロックされたｈＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍（図１１Ａ−１１Ｂ）におけるシグナルの欠如は、ＰＤ−Ｌ１結合に対する^６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣ−ＰＤ１の高度の特異性を示した。追加のスキャンを、２、４および２４時間（図１８Ａ、図１８Ｄ）で得て、２４時間で生体内分布を評価した（図１９Ａ−１９Ｂ）。注入の１時間後に最大の腫瘍取り込みが観察されたが、強いシグナルが少なくとも２４時間ｈＰＤ−Ｌ１（＋）腫瘍内で持続した。要するに、^６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣの急速且つ特異的なｈＰＤ−Ｌ１（＋）腫瘍取り込みは、臨床的画像適用のための試薬としてその使用を促進する。

＜考察＞
癌免疫療法は、その顕著な治療可能性がまさに十分に実現され始めている治療パラダイムである。ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１軸を標的とする抗体での成功が癌患者において達成されているが、本明細書で提供されるデータは、操作されたＰＤ−１デコイ受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｃｏｙ）、ＨＡＣ−ＰＤ−１を使用して、追加の効能が達成され得ることを示している。このタンパク質は、乏しい腫瘍浸透およびエフェクターＴ細胞の望まれない枯渇の抗体固有の制限を共有していない。したがって、それは、より大きい且つより確立された腫瘍に対して、抗ＰＤ−Ｌ１抗体よりも増強された抗腫瘍活性を発揮する。それ故、これらの結果は、患者のための小さなタンパク質生物製剤の可能性および免疫系の調節におけるそれらの広範囲の適用を強調している。

腫瘍への増強された送達に加えて、ＨＡＣ−ＰＤ−１のような小さなタンパク質のモジュラー性質によって、他の免疫治療薬との容易な組み合わせが可能となる。これは、黒色腫患者^２１におけるチェックポイント遮断とニボルマブ（抗ＰＤ−１）およびイピリムマブ（抗ＣＴＬＡ４）との組み合わせの効能に照らして、並びにＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１およびＴＩＭ−３^２２、ＬＡＧ−３^２３、ＧＩＴＲ^２４、ＯＸ−４０^２５、および４−１ＢＢ^２６などの追加の免疫調節経路を標的とする抗体間の相乗効果を実証した多数の前臨床試験において、重要な考察である。ＨＡＣ−ＰＤ−１の場合には、相乗的な免疫調節経路を標的とする多特異性の薬剤は、他の操作されたデコイ受容体または単一ドメイン抗体を含む、複数の小さなタンパク質モジュールを単に融合させることによって容易に産生され得る。この設計は、同じ細胞上の異なる免疫チェックポイントリガンド及び／又は受容体の同時発現を利用して、増強された結合力、それ故、効能を組み合わさった薬剤に提供する。さらに、多特異性の治療は、別々に投与された薬物の数を減少させることによって処置レジメンを単純化し、延長線上で、それらの別々の製造および開発に関連するコストを下げる。

抗ＰＤ−１抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体などの免疫調節薬は、幾つかの他の癌治療に比べて一般に十分に耐性があるが、自己免疫性肝炎、肺炎、および大腸炎^８，９を含む、軽度の下痢から生命を脅かす免疫関連の有害事象までの範囲に及ぶ毒性を有する。患者における不必要な毒性を回避する（さもなければ免疫療法から恩恵を得ない）ために、どの患者が処置に反応するかを特定するためのバイオマーカーおよび方法が緊急に必要とされている。免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）による腫瘍ＰＤ−Ｌ１発現は、ここまでのところ、抗ＰＤ−１／抗ＰＤ−Ｌ１応答^２７の部分的ではあるが不完全な予測因子（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）を証明してきた。しかし、ＩＨＣは、腫瘍ＰＤ−Ｌ１発現の非感受性の手段（ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅ）であり得、この方法がＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍を陰性として誤って特徴づけ得ることが考えられる。ここで提示される研究は、免疫組織化学的検査に代わる代案方法として腫瘍ＰＤ−Ｌ１発現のＨＡＣ−ＰＤ−１ ｉｍｍｕｎｏＰＥＴ画像化が使用され得ることを実証している。この非侵襲性のアプローチによって、ＰＤ−Ｌ１発現状態の原発腫瘍とは異なり得る、腫瘍全体および関連する転移の同時の撮像が可能となる。さらに、異なる時点（例えば、処置の前後）での同じ腫瘍の繰り返しの撮像にＰＥＴ画像化が使用され得、それによって、従来の生検／ＩＨＣのアプローチで達成するのが困難であるか又は不可能であろう豊富なセットの診断情報がもたらされる。

＜方法＞
マウス。スタンフォード大学のＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅからの承認に従って、動物研究を行った。同系腫瘍移植および処置に応じたＴ細胞レベルの評価のために使用される、６−８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから直接得た。腫瘍浸透度のインビボでの評価およびＰＥＴ研究のために使用される、Ｎｏｄ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ．ｓｃｉｄ．ＩＬ２ｒｇ．ｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスを、室内の種畜から得た。

細胞株。ヒト黒色腫細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ネズミ黒色腫細胞株Ｂ１６．Ｆ１０、およびネズミ結腸癌細胞株ＣＴ２６を、ＡＴＣＣから得た。すべての細胞株を、３７℃で、加湿した、５％ ＣＯ_２インキュベーターにおいて維持した。ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補足したＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ）中で継代培養した。Ｂ１６．Ｆ１０細胞を、１０％のＦＢＳおよび５５μＭの２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を補足したＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で継代培養した。ＣＴ２６細胞を、１０％のＦＢＳを補足したＲＰＭＩ中で成長させた。ＣＴ２６細胞とＣａｓ９発現するレンチウイルスとの同時の形質導入、およびｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ^２８でのツールを使用して設計された、２つのｍＰＤ−Ｌ１を標的とするｓｇＲＮＡ［それぞれ、配列 ＧＧＣＴＣＣＡＡＡＧＧＡＣＴＴＧＴＡＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）およびＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＣＧＴＴＣＴＡＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）］の混合物をコード化するレンチウイルスのプールによって、ＣＴ２６の遺伝子変異体を作成した。感染の６日後に、細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのマウスＩＦＮγによる処置を介して高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現するように誘導し、感染の７日後に、細胞を採取し、ＡＰＣ標識した１０Ｆ．９Ｇ２抗体で染色した。陰性群を、選別し、培養し、細胞数の回収の数日後に、これらの細胞は、２ラウンドの追加の連続する選別を受けた。この安定した陰性群を、ＣＴ２６−Δ（ｍＰＤ−Ｌ１）として定義した。ヒトＰＤ−Ｌ１発現するネズミ癌株を生成するために、ｈＰＤ−Ｌ１の構成的な、ＥＦ１Ａで促進された発現をコード化するレンチウイルスを、ＣＴ２６−Δ（ｍＰＤ−Ｌ１）細胞を感染させるように生成し、使用した。これらの細胞を採取し、ＰＥ−抗ＰＤ−Ｌ１（クローンＭＩＨ１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、純度ごとに選別した。この選別を合計３回繰り返して、操作された亜系統ＣＴ２６−Ｔｇ（ｈＰＤ−Ｌ１）−Δ（ｍＰＤ−Ｌ１）を生成した。

タンパク質の発現および精製。ｈＰＤ−１ ＩｇＶドメイン（残基２６−１４７）、ｈＰＤ−Ｌ１ ＩｇＶおよびＩｇＣのドメイン（残基１９−２３９）、高親和性ＰＤ−１変異体、およびＨＡＣｍｂを、ＩＤＴによってｇＢｌｏｃｋｓとして集め、バキュロウイルスを使用してＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）細胞からの分泌物のためのカルボキシ末端８×ヒスチジン標識を有するｐＡｃＧＰ６７ａへとインフレームでクローン化した。Ｎ９１Ｃ変異を、ＰＣＲ媒介性の部位特異的変異誘発を使用してＨＡＣ−Ｖへと導入した。分泌タンパク質を、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）クロマトグラフィーによって調整培地から精製し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）へと脱塩した。マウスにおける機能的研究またはインビボ研究のために使用されるタンパク質をさらに、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４を用いてカラム洗浄液（ｃｏｌｕｍｎ ｗａｓｈｅｓ）にさらし、内毒素を除去した。カルボキシ末端のビオチンアクセプターペプチド配列（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８））の付加およびＢｉｒＡリガーゼでの酵素ビオチン化によって、ビオチン化したタンパク質を得た。

アミン反応性プローブおよびシステイン反応性プローブでのタンパク質標識化。ＨＡＣ−Ｖ Ｎ９１Ｃを、上に記載されるように発現させ、精製し、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の適用によって、１ｍＭの終末濃度まで還元した。その後、還元したタンパク質を、２０倍モル過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５９４ Ｃ５マレイミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７ Ｃ２マレイミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、またはマレイミド−モノ−アミド−ＤＯＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ）と組み合わせ、１時間室温でインキュベートし、その後さらに１２時間、４℃でインキュベートした。ＶｉｖａＳｐｉｎのタンパク質濃縮装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）を使用して、反応混合物をＰＢＳへと脱塩することによって、過剰の遊離プローブを除去した。ＤＯＴＡ−ＨＡＣに関して、反応タンパク質を、Ｈｅｐｅｓ緩衝食塩水（ＨＢＳ；１０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に交換し、〜５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。１抗体当たりの結合されたキレート剤の数（ｃ／ａ）を、未反応のＨＡＣ−Ｎ９１ＣおよびＨＡＣ−ＤＯＴＡの比較によって、マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて推測した。

低内毒素／アジドを含まない抗ｈＰＤ−Ｌ１（クローン２９Ｅ．２Ａ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を、室温で２時間、８倍モル過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ ＮＨＳエステルで標識化した（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。遊離色素を、２０ｍＭの終末濃度までＴＲＩＳ ｐＨ８．０を加えることによってクエンチし、標識抗体をＶｉｖａＳｐｉｎのタンパク質濃縮装置で脱塩した。

酵母ディスプレイおよび定向進化。ｈＰＤ−１のＩｇＶドメイン（残基２６−１４７）、ｈＰＤ−Ｌ１のＩｇＶおよびＩｇＣのドメイン（残基１９−１３２）、およびｈＰＤ−Ｌ２（残基２０−１２３）を、前に記載したようにｐＹＡＬベクターを使用して、Ａｇａ２に対するＮ末端融合としてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＥＢＹ１００の表面上にディスプレイした。

第一世代ｈＰＤ−１ライブラリの構築および選択：ｈＰＤ−Ｌ１に複合体化されたｈＰＤ−１の結晶構造がまだ報告されていないため、２２の有望な接触残基を、ｈＰＤ−Ｌ１に結合されたｍＰＤ−１の構造（ＰＤＢ ＩＤ ３ＳＢＷ）によって推測した。表２にリストされるプライマーを用いるアセンブリＰＣＲを使用して、図１２Ａ−１２Ｂに記載されるように、これらの残基を無作為化するライブラリを生成した。ライブラリは、理論的に多様なおよそ９．５×１０^１９の特有のタンパク質配列を有した。ＰＣＲ産物を、ｐＹＡＬベクターに対する相同性を含んでいるプライマーを用いてさらに増幅し、直線化したｐＹＡＬと一緒にＥＢＹ１００酵母へと同時に電気穿孔した。結果として生じるライブラリは、０．９×１０^８の形質転換体を含んでいた。

形質転換酵母を回収し、３０℃で液状のＳＤＣＡＡ培地中で膨張させ、液状のＳＧＣＡＡ培地への１：１０の希釈により誘導し、２４時間２０℃で培養した。各ラウンドで適切な数の誘導された酵母を使用して、各工程でのライブラリの予期される多様性の少なくとも１０倍の適用範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）、および１０^８以上の細胞を確かなものとした。すべての選択工程を、ＭＡＣＳ緩衝液（０．５％のウシ血清アルブミンおよび２ｍＭのＥＤＴＡを有するＰＢＳ）を使用して４℃で実行した。各ラウンド前に、ストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７（室内で生成された）に対するプレクリアリング（ｐｒｅ−ｃｌｅａｒｉｎｇ）を、抗Ｃｙ５／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）およびＬＤ ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて実行した。ラウンド１−３に関して、４℃で１時間、誘導した酵母を１μＭのビオチン化したｈＰＤ−Ｌ１で標識化すること、およびその後のストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７での二次染色、および抗Ｃｙ５／ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７ミクロビーズおよびＬＳ ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）での磁気選別によって、正の選択を実行した。ラウンド４に関して、１０ｎＭのビオチン化したｈＰＤ−Ｌ１での染色およびストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７での二次標識化によって、正の選択を実行した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８結合した抗ｃＭｙｃ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）での染色によって、ディスプレイレベルを判定し、ディスプレイを標準化した（ｄｉｓｐｌａｙ−ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）ｈＰＤ−Ｌ１結合剤の上位１％を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａのセルソーターを用いる蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を使用して分離した。選択の各ラウンド後に、回収した酵母を、一晩３０℃でＳＤＣＡＡ培地中で膨張させ、その後、２４時間ＳＧＣＡＡ培地中への１：１０の希釈によって２０℃で誘導した。

第二世代ｈＰＤ−１ライブラリの構築および選択：第二世代ライブラリを、野生型残基から離れた収束を実証した第１ライブラリからの１０の接触位置に加えて、７つの追加のコア位置を無作為化するように設計した。図１３で例証される設計は、理論的に多様なおよそ９．１×１０^９の特有のタンパク質配列を有した。第一世代ライブラリと同様に、第二世代ライブラリを、表３にリストされるプライマーを用いてアセンブリＰＣＲによって構築し、ＥＢＹ１００酵母へとｐＹＡＬと同時に電気穿孔した。結果として生じるライブラリは、１．２×１０^８の形質転換体をもたらした。第二世代ライブラリを、若干の修正を除いて第一世代ライブラリと同様に選択した。ラウンド１−３を、上に記載されるように、１μＭのビオチン化したｈＰＤ−Ｌ１での染色および磁気ビーズ選択によって実行した。ラウンド４および５に関して、低下したオフレートを有する変異体を選択するために、動的選択（ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を実行した。簡潔には、酵母を、４℃で１時間１０ｎＭのビオチン化したｈＰＤ−Ｌ１で染色した。ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄後、酵母を、撹拌しながら室温で６時間１μＭのビオチン化していないｈＰＤ−Ｌ１でインキュベートした。競合後の酵母を、その後、ストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８結合した抗ｃＭｙｃで染色し、ディスプレイを標準化した結合剤の上位１％を、ＦＡＣＳ分類によって分離した。

表面プラズモン共鳴。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００を使用して、２５℃で実験を行った。ビオチン化したＰＤ−Ｌ１を、Ｂｉａｃｏｒｅのストレプトアビジン（ＳＡ）センサチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定して、およそ１００ＲＵのＲｍａｘを得た。無関係なビオチン化したタンパク質（ヒトＣＤ４７のＩｇＳＦドメイン）を、一致するＲＵ値を有する基準面上に固定して、非特異的結合に関して制御した。図８Ａに示されるように、ＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）中のＰＤ−１変異体の連続希釈によって測定を行った（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。ＰＤ−Ｌ１表面を、５０％のｖ／ｖエチレングリコール、１００ｍＭのグリシン ｐＨ９．５の３回の６０秒の注入によって再生した。データをすべて、１：１のＬａｎｇｍｕｉｒの結合モデルを備えるＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００の評価ソフトウェア・バージョン２．０を用いて分析した。

ＰＤ−１細胞競合結合アッセイ。
ビオチン化したＷＴ ＰＤ−１をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７結合したストレプトアビジンで４：１のモル比でインキュベートすることによって、ＷＴ ＰＤ−１四量体を形成した。ＰＤ−Ｌ１発現を、２０００Ｕ／ｍＬのヒトＩＦＮγによる一晩のシミュレーションによってＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞上で誘導した。その後、１００ｎＭのＷＴ ＰＤ−１四量体を、滴定濃度（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）のＷＴ ＰＤ−１単量体、ＨＡＣ−Ｖ、またはＨＡＣｍｂと組み合わせ、１００，０００の誘導されたＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞に同時に加えた。細胞を、６０分間氷上で試薬混合物でインキュベートし、その後、洗浄して、非結合の四量体を除去した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７の蛍光強度を、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６のフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、フローサイトメトリーによって定量化した。

インビボでの腫瘍浸透の研究。
各注入に対して７５％のＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および２５％の中密度のマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の５０μＬの懸濁液中で、６−８週齢の雌のＮｏｄ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ．ｓｃｉｄ．ＩＬ２ｒｇ．ｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに、遺伝子組換えの結腸癌株ＣＴ２６−Δ（ｍＰＤ−Ｌ１）の１×１０^６細胞を左肩へと、およびＣＴ２６−Ｔｇ（ｈＰＤ−Ｌ１）−Δ（ｍＰＤ−Ｌ１）の１×１０^６細胞を右肩へと皮下に注入した。１４日後、腫瘍が直径およそ１ｃｍまで成長したときに、マウスに、１００μｇのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８結合した抗ＰＤ−Ｌ１抗体（クローン２９Ｅ．２Ａ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と１００μｇのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５９４結合したＨＡＣ ＰＤ−１単量体の混合物を腹腔内に注入した。４時間後、マウスを安楽死させ、それらの腫瘍を切開した。冷たいＰＢＳで洗浄して過剰の血液を除去するいくらかのラウンド後に、各腫瘍をおよそ半分に切断した。半分を、振動させながら４℃で一晩ＰＢＳ中の１％のＰＦＡの溶液中でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｏ．Ｃ．Ｔ．）（Ｓａｋｕｒａ）に埋め込んだ。これらの組織の７ミクロンの凍結切片を、切断し、３０分間解凍し、４分間４℃でアセトン中で洗浄し、１０分間空気乾燥し、ＰＢＳで洗浄し（３回、各５分）、およびＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を取り付ける前に、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識化した。
スライドを、１０×または２０×の倍率でＥｃｌｉｐｓｅ ｅ８００の蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）上で視覚化した。蛍光チャネルの虚色、チャネル合流（ｃｈａｎｎｅｌ ｍｅｒｇｅ）、および明るさを含む、基本写真処理と、コントラスト調節を、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ）を使用して実行した。ＦＡＣＳ分析のために、各腫瘍の残り半分を、西洋かみそりで細かく刻み、刻んだ組織を、１００μＭのメッシュセルストレーナー（ｍｅｓｈ ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）を介してプレスし、ＰＢＳで洗い流し、最終的に液体懸濁液中にある間に４０μＭのセルストレーナーに通した。すべての処理工程の全体にわたって、サンプルをできる限り４℃近くに維持した。最終的に、結果として生じる単一細胞の懸濁液を、１％のＰＦＡ溶液中に固定させ、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ ＦＡＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上の抗体およびＨＡＣ由来の蛍光シグナルに対して分析した。

Ｔ細胞枯渇の研究。
６−８週齢の野生型雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、その下方背側上で剪毛し、７５％のＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および２５％の中密度のマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の５０μＬの懸濁液中で、マウスに結腸癌株ＣＴ２６の１×１０^６細胞を皮下に注入した。目視検査によって７日以内の腫瘍の移植に失敗したと分かったマウスを、更なる研究から除外した。可視の、触知可能な腫瘍を有するマウスを、ｒａｎｄｏｍ．ｏｒｇでのツールを使用して、１群当たり１０匹のマウスの処置群に無作為化した。マウスを、各々が２．５ｍｇ／ｍＬの濃度に調節された、１００μｌのＰＢＳ、２５０μｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体（クローン１０Ｆ．９Ｇ２、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）、または２５０μｇの精製したＨＡＣｍｂタンパク質の１日１回の腹腔内注入によって３日間処置した。３日間の処置後、末梢血およびリンパ節を、各マウスから集め、抗体の以下のパネルで染色した（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ ＣＤ４５（クローン３０−Ｆ１１）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５−５ ＣＤ８（クローン５３−６．７）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００ Ｎｋ１．１（クローンＰＫ１３６）、ＡＰＣ−Ｃｙ７ Ｂ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２）、ＰＥ−Ｄａｚｚｌｅ ＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０）、ＰＥ−Ｃｙ５ Ｆ４／８０（クローンＢＭ８）、ＰＥ−Ｃｙ７ ＣＤ４（ＧＫ１．５）、およびＡＰＣ ＰＤ−Ｌ１（クローン１０Ｆ．９Ｇ２）。ＤＡＰＩを生存率染色として使用した。サンプルを、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ ＦＡＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した。

ＣＴ２６腫瘍モデル。
６−８週齢の野生型雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、その下方背側上で剪毛し、７５％のＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および２５％の中密度のマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の５０μＬの懸濁液中で、マウスに結腸癌株ＣＴ２６の１×１０^６細胞を皮下に注入した。目視検査によって７日以内の腫瘍の移植に失敗したと分かったマウスを、更なる研究から除外した。小さな腫瘍の処置研究に関して、マウスを、ｒａｎｄｏｍ．ｏｒｇでのリスト無作為ツール（ｌｉｓｔ ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ ｔｏｏｌｓ）を使用してコホートへと無作為化し、すべてのマウスに対して移植の７日後から処置を開始した。これらの小さな腫瘍の研究において、デジタルキャリパー測定値（ｄｉｇｉｔａｌ ｃａｌｉｐｅｒ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）を３日ごとに得て、１０日目に測定値に正規化されるように、値を倍率変化としてグラフ表示した。大きな腫瘍の研究に関して、上に記載されるようにマウスに移植を行い、８日目から腫瘍を毎日測定した。すべての場合において移植のおよそ１０−１４日後に、マウスを処置コホートに個々に分類し、腫瘍が１５０ｍｍ^３の閾値に達したときにだけ処置を開始した。デジタルキャリパー測定値を、処置の期間の間、大きな腫瘍の実験においてすべてのマウスに対して毎日得た。測定値のランダムな日毎の変動を減少させるために、この実験においてグラフ表示した腫瘍容積は、当日、前日、および翌日の測定値を含むスライディングウィンドウ内で評価されるような平均である。大きな腫瘍の研究からの値を、絶対的な腫瘍容積（ｍｍ^３）としてグラフ表示した。両方の実験において、マウスに、各々が２．５ｍｇ／ｍＬの濃度に調節された、１００μｌのＰＢＳ、２５０μｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体（クローン１０Ｆ．９Ｇ２、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）、または２５０μｇの精製したＨＡＣｍｂタンパク質を、１４日間毎日腹腔内に注入した。腫瘍を２つの半径ｘおよびｙを有する楕円体として近似し、ここでｘは腫瘍の最大の測定可能な寸法であり、ｙはｘに直接に（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ）垂直な寸法である：容積（４／３）^＊（ｔｔ）^＊（ｘ／２）^＊（ｙ／２）^２。

ＤＯＴＡ−ＨＡＣの^６４Ｃｕ標識化。ＤＯＴＡ−ＨＡＣを、^６４ＣｕＣｌ_２（ウィスコンシン大学マディソン校）で放射標識した：０．１ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）、２００μｌ中の５００μｇのＤＯＴＡ−ＨＡＣを、１時間３７℃で中和した^６４ＣｕＣｌ_２溶液の〜３７０ＭＢｑ（〜１０ｍＣｉ）で反応させた。インキュベーション後、５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ｐＨ７．０を１５分間室温で加え、反応混合物中でキレート化されていない^６４ＣｕＣｌ_２を除去した（ｓｃａｖｅｎｇｅ）。^６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣの精製を、１．０ｍＬ／分の流速でＳＥＣ ３０００ ＨＰＬＣを使用して実行した（０．１Ｍのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０）。放射化学的純度を放射性ＨＰＬＣによって評価した。最終用量の放射性コンジュゲート（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を、０．２μｍのフィルターに通して無菌バイアルへと移した。

放射性トレーサーの細胞結合アッセイ
インビトロでの細胞結合アッセイを、ｈＰＤＬ１（＋）細胞、ＨＡＣ−Ｖで予めブロックされたｈＰＤＬ１（＋）細胞、および対照ｈＰＤＬ１（−）細胞を使用して実行し、免疫反応性を評価した。０．１ｍＬ中の２．５×１０^５細胞を、３等分し、ＰＢＳＡ（１％のウシ血清アルブミンを補足したＰＢＳ）で洗浄した。各チューブを、４５分間０．１ｍＬ、５ｎｍｏｌ／Ｌの^６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣ（５−６ＭＢｑ／ｎｍｏｌ）でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を１％のＰＢＳＡで３回洗浄した。各細胞ペレットにおける活性を、ガンマカウンター（１４７０ ＷＩＺＡＲＤ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｇａｍｍａ Ｃｏｕｎｔｅｒ； Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して定量化した。

小動物のＭｉｃｒｏ−ＰＥＴ画像化。皮下のｈＰＤＬ１陽性（ｎ＝４）またはｈＰＤＬ１陰性（ｎ＝４）のＣＴ２６腫瘍を有するＮＳＧマウスに、^６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＨＡＣ（〜２３０μＣｉ／２５μｇのタンパク質／２００μｌのＰＢＳ）を静脈内に注入した。１つの群は、ＰＥＴ放射性トレーサーの注入の２時間前に、遮断量（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｄｏｓｅ）（ｎ＝２）の５００μｇ／２００μｌの冷たいＨＡＣを受けた。マウスに麻酔をかけ、マウスを、注入の１、２、４、および２４時間後の時点で、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｉｎｖｅｏｎの小動物多様式ＰＥＴ／ＣＴシステム（Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ； Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で画像化した。ＣＴの原画像を、コーンビームのマイクロＸ線源（５０μｍの焦点サイズ）および２，０４８×３，０７２ピクセルのＸ線検出器を用いて、８０ｋＶｐ／５００μＡ、回転のハーフスキャン２２０°、ベッド（ｂｅｄ）位置当たり１２０の投影で、第２のベッド位置において取得した。ＣＴデータセットを、Ｓｈｅｐｐ−Ｌｏｇａｎのフィルターおよびコーンビームのフィルター補正逆投影を使用して復元した。ＣＴスキャンからの減衰補正に基づいて、静的ＰＥＴ画像を、３．４ｎｓのデフォルト一致のタイミングウィンドウおよび３５０−６５０ｋｅＶのエネルギーウィンドウを用いて取得した。３分（１、２時間）、５分（４時間）、および１０分（２４時間）のＰＥＴスキャン取得時間の長さを、注入後の時間に基づいて選択した。ＰＥＴデータセットを、二次元のサブセット化による期待値最大化法（ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｏｒｄｅｒｅｄ−ｓｕｂｓｅｔ ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ）（ＯＳＥＭ ２Ｄ）アルゴリズム^２９を使用して復元した。
画像分析を、Ｉｎｖｅｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｗｏｒｋｓｐａｃｅ （ＩＲＷ）を利用して実行した。各ｍｉｃｒｏＰＥＴスキャンのために、三次元の関心領域（ＲＯＩ）を、減衰補正した全身画像上で、肝臓、ひ臓、腎臓、および腫瘍に引いた。関心領域（ＲＯＩ；ｎＣｉ／ｃｃ）中の平均ピクセル値を注入量の合計で割ることによって、各器官中の組織のグラム当たりのパーセント注入量（％ＩＤ／ｇ）を得た。部分的な容積補正は実行しなかった。統計分析を双方向ＡＮＯＶＡ（ＧｒａｐｈＰａｄ）によって実行した。

生体内分布の研究。注入の２４時間の時点でのマイクロ−ＰＥＴ／ＣＴ画像化の完了後に、生体内分布のために、マウスを安楽死させ、切開した。血液および器官（心臓、肺、肝臓、ひ臓、膵臓、胃、小腸、大腸、腎臓、筋肉、骨、骨髄、皮膚、脳、腫瘍、および尾部）を収集し、計量した。ガンマカウンター測定値からの各器官に対するＣＰＭ値を、組織のグラム当たりのパーセント注入量に変換した。データを注入時間に減衰補正した。

＜表＞

Claims (42)

1. 高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドであって、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは野生型のＰＤ−１配列の変異体であり、
   （ａ）ＰＤ−１膜貫通ドメインを欠いており、および、
   （ｂ）野生型ＰＤ−１ポリペプチドの対応する配列に対して１つ以上のアミノ酸変化を含み、１つ以上のアミノ酸変化は、対応する野生型ＰＤ−１ポリペプチドのＰＤ−Ｌ１との親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ１へのポリペプチドの親和性を増加させる、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド。
2. 高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１に対して１ｘ１０^−７Ｍ以下のＫ_ｄを有する、請求項１に記載の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド。
3. 高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドのＰＤ−Ｌ１との親和性は、野生型ＰＤ−１ポリペプチドの対応する配列に対するアミノ酸変化を有していない前記ＰＤ−１模倣ポリペプチドのＰＤ−Ｌ１との親和性よりも５倍以上大きい、請求項１または２に記載の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド。
4. 高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、野生型ＰＤ−１ポリペプチドの対応する配列に対するアミノ酸変化を有していない前記ＰＤ−１模倣ポリペプチドのＰＤ−Ｌ２との親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ２との親和性が低い、請求項１乃至３のいずれかに記載の高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチド。
5. １つ以上のアミノ酸変化はＰＤ−Ｌ１と接触するＰＤ−１のアミノ酸位置に位置する、請求項１乃至４のいずれかに記載の高親和性ＰＤ−１ポリペプチド。
6. １つ以上のアミノ酸変化は、Ｖ３９、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｓ４８、Ｎ４９、Ｑ５０、Ｔ５１、Ｄ５２、Ｋ５３、Ａ５６、Ｑ６３、Ｇ６５、Ｑ６６、Ｌ９７、Ｓ１０２、Ｌ１０３、Ａ１０４、Ｐ１０５、Ｋ１０６、およびＡ１０７から選択されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＰＤ−１タンパク質フラグメントに対するアミノ酸位置、または、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置にある、請求項５に記載の高親和性ＰＤ−１ポリペプチド。
7. １つ以上のアミノ酸変化は、Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｒ４４、Ｍ４５、Ｓ４８、Ｎ４９、Ｑ５０、Ｔ５１、Ｄ５２、Ｋ５３、Ａ５６、Ｑ６３、Ｇ６５、Ｑ６６、Ｖ７２、Ｈ８２、Ｍ８３、Ｒ９０、Ｙ９６、Ｌ９７、Ａ１００、Ｓ１０２、Ｌ１０３、Ａ１０４、Ｐ１０５、Ｋ１０６、およびＡ１０７から選択されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＰＤ−１タンパク質フラグメントに対するアミノ酸位置、または、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置にある、請求項１乃至４のいずれかに記載の高親和性ＰＤ−１ポリペプチド。
8. １つ以上のアミノ酸変化は、５つ以上のアミノ酸変化である、請求項１乃至７のいずれかに記載の高親和性ＰＤ−１ポリペプチド。
9. （１）Ｖ３９ＨまたはＶ３９Ｒ；（２）Ｌ４０ＶまたはＬ４０Ｉ；（３）Ｎ４１ＩまたはＮ４１Ｖ；（４）Ｙ４３ＦまたはＹ４３Ｈ；（５）Ｒ４４ＹまたはＲ４４Ｌ；（６）Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、またはＭ４５Ｄ；（７）Ｓ４８Ｄ、Ｓ４８Ｌ、Ｓ４８Ｎ、Ｓ４８Ｇ、またはＳ４８Ｖ；（８）Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、またはＮ４９Ｓ；（９）Ｑ５０Ｋ、Ｑ５０Ｅ、またはＱ５０Ｈ；（１０）Ｔ５１Ｖ、Ｔ５１Ｌ、またはＴ５１Ａ；（１１）Ｄ５２Ｆ、Ｄ５２Ｒ、Ｄ５２Ｙ、またはＤ５２Ｖ；（１２）Ｋ５３ＴまたはＫ５３Ｌ；（１３）Ａ５６ＳまたはＡ５６Ｌ；（１４）Ｑ６３Ｔ、Ｑ６３Ｉ、Ｑ６３Ｅ、Ｑ６３Ｌ、またはＱ６３Ｐ；（１５）Ｇ６５Ｎ、Ｇ６５Ｒ、Ｇ６５Ｉ、Ｇ６５Ｌ、Ｇ６５Ｆ、またはＧ６５Ｖ；（１６）Ｑ６６Ｐ；（１７）Ｖ７２Ｉ；（１８）Ｈ８２Ｑ；（１９）Ｍ８３ＬまたはＭ８３Ｆ；（２０）Ｒ９０Ｋ；（２１）Ｙ９６Ｆ；（２２）Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、またはＬ９７Ｉ；（２３）Ａ１００ＩまたはＡ１００Ｖ；（２４）Ｓ１０２ＴまたはＳ１０２Ａ；（２５）Ｌ１０３Ｉ、Ｌ１０３Ｙ、またはＬ１０３Ｆ；（２６）Ａ１０４Ｓ、Ａ１０４Ｈ、またはＡ１０４Ｄ；（２７）Ｐ１０５Ａ；（２８）Ｋ１０６Ｇ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｉ、Ｋ１０６Ｖ、Ｋ１０６Ｒ、またはＫ１０６Ｔ；および、（２９）Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、またはＡ１０７Ｖから選択されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＰＤ−１タンパク質フラグメントに対する１つ以上のアミノ酸変化、あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化、を含む、請求項１乃至４のいずれかに記載の高親和性ＰＤ−１ポリペプチド。
10. （ａ）Ｖ３９、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｓ４８、Ｎ４９、Ｑ５０、Ｋ５３、Ａ５６、Ｑ６３、Ｇ６５、Ｑ６６、Ｌ９７、Ｓ１０２、Ｌ１０３、Ａ１０４、Ｋ１０６、およびＡ１０７、または別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置；
    （ｂ）Ｖ３９、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｓ４８、Ｑ５０、Ｔ５１、Ｄ５２Ｆ、Ｋ５３、Ａ５６、Ｑ６３、Ｇ６５、Ｑ６６、Ｌ９７、Ｓ１０２、Ｌ１０３、Ａ１０４、Ｋ１０６、およびＡ１０７、または別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置；
    （ｃ）Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｒ４４、Ｍ４５、Ｎ４９、Ｋ５３、Ｍ８３、Ｌ９７、Ａ１００、およびＡ１０７、または別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置；
    （ｄ）Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｎ４９、Ｋ５３、Ｑ６６Ｐ、Ｍ８３、Ｌ９７、およびＡ１０７、または別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置；
    （ｅ）Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｎ４９、Ｋ５３、Ｑ６６Ｐ、Ｈ８２、Ｍ８３、Ｌ９７、Ａ１００、およびＡ１０７、または別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置；
    （ｆ）Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｎ４９、Ｋ５３、Ｍ８３、Ｌ９７、Ａ１００、およびＡ１０７、または別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置；
    （ｇ）Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｒ４４、Ｍ４５、Ｎ４９、Ｋ５３、Ｌ９７、Ａ１００、およびＡ１０７、または別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置；ならびに、
    （ｈ）Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｍ４５、Ｎ４９、Ｋ５３、Ｌ９７、Ａ１００、およびＡ１０７、または別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対する対応するアミノ酸位置、から選択されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＰＤ−１タンパク質フラグメントに対する、アミノ酸位置にあるアミノ酸変化を含む、請求項１乃至４のいずれかに記載の高親和性ＰＤ−１ポリペプチド。
11. （ａ）｛Ｖ３９ＨまたはＶ３９Ｒ｝、｛Ｎ４１ＩまたはＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３ＦまたはＹ４３Ｈ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、またはＭ４５Ｄ｝、｛Ｓ４８Ｄ、Ｓ４８Ｌ、Ｓ４８Ｎ、Ｓ４８Ｇ、またはＳ４８Ｖ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、またはＮ４９Ｓ｝、｛Ｑ５０Ｋ、Ｑ５０Ｅ、またはＱ５０Ｈ｝、｛Ｋ５３ＴまたはＫ５３Ｌ｝、｛Ａ５６ＳまたはＡ５６Ｌ｝、｛Ｑ６３Ｔ、Ｑ６３Ｉ、Ｑ６３Ｅ、Ｑ６３Ｌ、またはＱ６３Ｐ｝、｛Ｇ６５Ｎ、Ｇ６５Ｒ、Ｇ６５Ｉ、Ｇ６５Ｌ、Ｇ６５Ｆ、またはＧ６５Ｖ｝、｛Ｑ６６Ｐ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、またはＬ９７Ｉ｝、｛Ｓ１０２ＴまたはＳ１０２Ａ｝、｛Ｌ１０３Ｉ、Ｌ１０３Ｙ、またはＬ１０３Ｆ｝、｛Ａ１０４Ｓ、Ａ１０４Ｈ、またはＡ１０４Ｄ｝、｛Ｋ１０６Ｇ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｉ、Ｋ１０６Ｖ、Ｋ１０６Ｒ、またはＫ１０６Ｔ｝、および、｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、またはＡ１０７Ｖ｝；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；
    （ｂ）｛Ｖ３９ＨまたはＶ３９Ｒ｝、｛Ｎ４１ＩまたはＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３ＦまたはＹ４３Ｈ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、またはＭ４５Ｄ｝、｛Ｓ４８Ｄ、Ｓ４８Ｌ、Ｓ４８Ｎ、Ｓ４８Ｇ、またはＳ４８Ｖ｝、｛Ｑ５０Ｋ、Ｑ５０Ｅ、またはＱ５０Ｈ｝、｛Ｔ５１Ｖ、Ｔ５１Ｌ、またはＴ５１Ａ｝、｛Ｄ５２Ｆ、Ｄ５２Ｒ、Ｄ５２Ｙ、またはＤ５２Ｖ｝、｛Ｋ５３ＴまたはＫ５３Ｌ｝、｛Ａ５６ＳまたはＡ５６Ｌ｝、｛Ｑ６３Ｔ、Ｑ６３Ｉ、Ｑ６３Ｅ、Ｑ６３Ｌ、またはＱ６３Ｐ｝、｛Ｇ６５Ｎ、Ｇ６５Ｒ、Ｇ６５Ｉ、Ｇ６５Ｌ、Ｇ６５Ｆ、またはＧ６５Ｖ｝、｛Ｑ６６Ｐ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、またはＬ９７Ｉ｝、｛Ｓ１０２ＴまたはＳ１０２Ａ｝、｛Ｌ１０３Ｉ、Ｌ１０３Ｙ、またはＬ１０３Ｆ｝、｛Ａ１０４Ｓ、Ａ１０４Ｈ、またはＡ１０４Ｄ｝、｛Ｋ１０６Ｇ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｉ、Ｋ１０６Ｖ、Ｋ１０６Ｒ、またはＫ１０６Ｔ｝、および｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、またはＡ１０７Ｖ｝；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；
    （ｃ）｛Ｖ３９ＨまたはＶ３９Ｒ｝、｛Ｌ４０ＶまたはＬ４０Ｉ｝、｛Ｎ４１ＩまたはＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３ＦまたはＹ４３Ｈ｝、｛Ｒ４４ＹまたはＲ４４Ｌ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、またはＭ４５Ｄ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、またはＮ４９Ｓ｝、｛Ｋ５３ＴまたはＫ５３Ｌ｝、｛Ｍ８３ＬまたはＭ８３Ｆ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、またはＬ９７Ｉ｝、｛Ａ１００ＩまたはＡ１００Ｖ｝、および｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、またはＡ１０７Ｖ｝；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；
    （ｄ）｛Ｖ３９ＨまたはＶ３９Ｒ｝、｛Ｌ４０ＶまたはＬ４０Ｉ｝、｛Ｎ４１ＩまたはＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３ＦまたはＹ４３Ｈ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、またはＭ４５Ｄ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、またはＮ４９Ｓ｝、｛Ｋ５３ＴまたはＫ５３Ｌ｝、｛Ｑ６６Ｐ｝、｛Ｍ８３ＬまたはＭ８３Ｆ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、またはＬ９７Ｉ｝、および｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、またはＡ１０７Ｖ｝；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；
    （ｅ）｛Ｖ３９ＨまたはＶ３９Ｒ｝、｛Ｌ４０ＶまたはＬ４０Ｉ｝、｛Ｎ４１ＩまたはＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３ＦまたはＹ４３Ｈ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、またはＭ４５Ｄ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、またはＮ４９Ｓ｝、｛Ｋ５３ＴまたはＫ５３Ｌ｝、｛Ｑ６６Ｐ｝、｛Ｈ８２Ｑ｝、｛Ｍ８３ＬまたはＭ８３Ｆ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、またはＬ９７Ｉ｝、｛Ａ１００ＩまたはＡ１００Ｖ｝、および｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、またはＡ１０７Ｖ｝；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；
    （ｆ）｛Ｖ３９ＨまたはＶ３９Ｒ｝、｛Ｌ４０ＶまたはＬ４０Ｉ｝、｛Ｎ４１ＩまたはＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３ＦまたはＹ４３Ｈ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、またはＭ４５Ｄ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、またはＮ４９Ｓ｝、｛Ｋ５３ＴまたはＫ５３Ｌ｝、｛Ｍ８３ＬまたはＭ８３Ｆ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、またはＬ９７Ｉ｝、｛Ａ１００ＩまたはＡ１００Ｖ｝、および｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、またはＡ１０７Ｖ｝；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；
    （ｇ）｛Ｖ３９ＨまたはＶ３９Ｒ｝、｛Ｌ４０ＶまたはＬ４０Ｉ｝、｛Ｎ４１ＩまたはＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３ＦまたはＹ４３Ｈ｝、｛Ｒ４４ＹまたはＲ４４Ｌ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、またはＭ４５Ｄ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、またはＮ４９Ｓ｝、｛Ｋ５３ＴまたはＫ５３Ｌ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、またはＬ９７Ｉ｝、｛Ａ１００ＩまたはＡ１００Ｖ｝、および｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、またはＡ１０７Ｖ｝；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；ならびに、
    （ｈ）｛Ｖ３９ＨまたはＶ３９Ｒ｝、｛Ｌ４０ＶまたはＬ４０Ｉ｝、｛Ｎ４１ＩまたはＮ４１Ｖ｝、｛Ｙ４３ＦまたはＹ４３Ｈ｝、｛Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ、またはＭ４５Ｄ｝、｛Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ、またはＮ４９Ｓ｝、｛Ｋ５３ＴまたはＫ５３Ｌ｝、｛Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ、またはＬ９７Ｉ｝、｛Ａ１００ＩまたはＡ１００Ｖ｝、および｛Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ、またはＡ１０７Ｖ｝、あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化、
    から選択されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＰＤ−１タンパク質フラグメントに対する、アミノ酸変化、を含む、請求項１乃至４のいずれかに記載の高親和性ＰＤ−１ポリペプチド。
12. （ａ）Ｖ３９Ｒ、Ｎ４１Ｖ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｓ４８Ｇ、Ｎ４９Ｙ、Ｑ５０Ｅ、Ｋ５３Ｔ、Ａ５６Ｓ、Ｑ６３Ｔ、Ｇ６５Ｌ、Ｑ６６Ｐ、Ｌ９７Ｖ、Ｓ１０２Ａ、Ｌ１０３Ｆ、Ａ１０４Ｈ、Ｋ１０６Ｖ、およびＡ１０７Ｉ；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；
    （ｂ）Ｖ３９Ｒ、Ｎ４１Ｖ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｓ４８Ｎ、Ｑ５０Ｈ、Ｔ５１Ａ、Ｄ５２Ｙ、Ｋ５３Ｔ、Ａ５６Ｌ、Ｑ６３Ｌ、Ｇ６５Ｆ、Ｑ６６Ｐ、Ｌ９７Ｉ、Ｓ１０２Ｔ、Ｌ１０３Ｆ、Ａ１０４Ｄ、Ｋ１０６Ｒ、およびＡ１０７Ｉ；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；
    （ｃ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｖ、Ｎ４１Ｖ、Ｙ４３Ｈ、Ｒ４４Ｙ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｇ、Ｋ５３Ｔ、Ｍ８３Ｌ、Ｌ９７Ｖ、Ａ１００Ｉ、およびＡ１０７Ｉ；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；
    （ｄ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｖ、Ｎ４１Ｖ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｇ、Ｋ５３Ｔ、Ｑ６６Ｐ、Ｍ８３Ｌ、Ｌ９７Ｖ、およびＡ１０７Ｉ；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；
    （ｅ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｖ、Ｎ４１Ｖ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｓ、Ｋ５３Ｔ、Ｑ６６Ｐ、Ｈ８２Ｑ、Ｍ８３Ｌ、Ｌ９７Ｖ、Ａ１００Ｖ、およびＡ１０７Ｉ；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；
    （ｆ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｉ、Ｎ４１Ｉ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｇ、Ｋ５３Ｔ、Ｍ８３Ｌ、Ｌ９７Ｖ、Ａ１００Ｖ、およびＡ１０７Ｉ；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；
    （ｇ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｖ、Ｎ４１Ｉ、Ｙ４３Ｈ、Ｒ４４Ｌ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｇ、Ｋ５３Ｔ、Ｌ９７Ｖ、Ａ１００Ｖ、およびＡ１０７Ｉ；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；
    （ｈ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｖ、Ｎ４１Ｉ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｇ、Ｋ５３Ｔ、Ｌ９７Ｖ、Ａ１００Ｖ、およびＡ１０７Ｉ；あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化；ならびに、
    （ｉ）Ｖ３９Ｈ、Ｌ４０Ｖ、Ｎ４１Ｖ、Ｙ４３Ｈ、Ｍ４５Ｅ、Ｎ４９Ｇ、Ｋ５３Ｔ、Ｌ９７Ｖ、Ａ１００Ｖ、およびＡ１０７Ｉ、あるいは、別の野生型ＰＤ−１タンパク質に対して対応する位置で同じアミノ酸をもたらす変化、
    から選択されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＰＤ−１タンパク質フラグメントに対するアミノ酸変化、を含む、請求項１乃至４のいずれかに記載の高親和性ＰＤ−１ポリペプチド。
13. 高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、融合パートナーを含む、請求項１乃至１２のいずれかに記載の高親和性ＰＤ−１ポリペプチド。
14. 融合パートナーは、ヒト免疫グロブリンポリペプチド配列のフラグメントである、請求項１３に記載の高親和性ＰＤ−１ポリペプチド。
15. フラグメントは（ａ）ＣＨ３ドメイン、および、（ｂ）Ｆｃ領域の一部または全体から選択される、請求項１４に記載の高親和性ＰＤ−１ポリペプチド。
16. 融合パートナーは、多量体化ドメイン；サイトカイン；弱毒化サイトカイン；４１ＢＢアゴニスト；ＣＤ４０アゴニスト；ＢＴＬＡおよび／またはＣＤ１６０の阻害剤；ならびに、ＴＩＭ３および／またはＣＥＡＣＡＭ１の阻害剤から選択される、請求項１３に記載の高親和性ＰＤ−１ポリペプチド。
17. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＰＤ−１タンパク質フラグメントに対してＲ８７Ｃ、Ｎ９１Ｃ、および／またはＲ１２２Ｃに対応する１つ以上の変異を含む、請求項１乃至１６のいずれかに記載の高親和性ＰＤ−１ポリペプチド。
18. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２５と３９−４６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の高親和性ＰＤ−１ポリペプチド。
19. 高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドは、検知可能な標識をさらに含む、請求項１乃至１８のいずれかに記載の高親和性ＰＤ−１ポリペプチド。
20. 検知可能な標識は、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）画像化標識である、請求項１９に記載の高親和性ＰＤ−１ポリペプチド。
21. 請求項１乃至２０のいずれか１つの高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを含む医薬製剤。
22. 請求項１乃至１９のいずれか１つの高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸。
23. （ｉ）
    （ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファポリペプチドと、
    （ｂ）ＴＣＲのＴＣＲベータポリペプチド
    をコード化するヌクレオチド配列、または、
    （ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコード化するヌクレオチド配列、
    をさらに含む、請求項２２に記載の核酸。
24. 核酸は発現ベクターである、請求項２２または２３に記載の核酸。
25. 請求項２２乃至２４のいずれかの核酸を含む細胞。
26. 請求項１９または２０で示される高親和性ＰＤ−１ポリペプチドに、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞を接触させる工程を含む、画像化の方法。
27. 接触させる工程は、高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを個体へ投与する工程を含む、請求項２６に記載の画像化の方法。
28. 画像化は個体の癌を診断および／または予測するために使用される、請求項２７に記載の画像化の方法。
29. 第１の細胞上のＰＤ−１と、第２の細胞上のＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２との相互作用を阻害する方法であって、
    請求項１−２０のいずれかの高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドに第２の細胞を接触させる工程を含む、方法。
30. 第２の細胞は癌細胞または慢性的に感染した細胞である、請求項２９に記載の方法。
31. 接触させる工程はインビトロである、請求項２９または３０に記載の方法。
32. 接触させる工程はインビボである、請求項２９または３０に記載の方法。
33. 免疫刺激剤、慢性感染症を治療する薬剤、細胞毒性薬、化学療法剤、細胞特異的な抗体、腫瘍細胞マーカーに選択的な抗体、および操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞から選択される薬剤に、第２の細胞を接触させる工程を含む、請求項２９乃至３２のいずれかに記載の方法。
34. 癌を抱えるか、慢性感染症を抱えるか、または免疫抑制に関連する免疫学的疾患を抱える個体を処置する方法であって、
    第１の細胞上のＰＤ−１と第２の細胞上のＰＤ−Ｌ１との結合を減少させるのに有効な量の請求項１乃至２０のいずれかの高親和性ＰＤ−１模倣ポリペプチドを、個体に投与する工程を含む、方法。
35. 投与する工程は、ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸を、第３の細胞へ導入する工程を含む、請求項３４に記載の方法。
36. 第３の細胞がインビボである、請求項３５に記載の方法。
37. ＰＤ−１模倣ポリペプチドをコード化する核酸は、インビトロまたはエクスビボで第３の細胞に導入され、第３の細胞はその後、個体に導入される、請求項３５に記載の方法。
38. 第３の細胞は免疫細胞である、請求項３５乃至３７のいずれかに記載の方法。
39. 免疫細胞は操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞である、請求項３８に記載の方法。
40. 操作されたＴＣＲはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項３９に記載の方法。
41. 個体は進行性腫瘍を有する、請求項３４乃至４０のいずれかに記載の方法。
42. 免疫刺激剤、慢性感染症を処置する薬剤、細胞毒性薬、化学療法剤、細胞に特異的な抗体、腫瘍細胞マーカーに選択的な抗体、および操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞から選択される薬剤を、個体に投与する工程をさらに含む、請求項３４乃至４１のいずれかに記載の方法。