JP2017527572A - 造血幹細胞医療において有用な方法および化合物 - Google Patents

Abstract

本発明は、長期多系統血液再構成能力を有する幹細胞の特異的マーカー、ならびに造血幹細胞薬、特に再生療法および骨髄移植を考慮した細胞組成物を調製するためのそれらの使用に関する。さらに、本発明は、血球レベルの低下および感染症の関連リスクの予防および／または治療において有用な方法および組成物に関する。

Description

本発明は一般に、造血幹細胞医療、特に再生療法および骨髄移植の分野に関する。特に、本発明は、損傷ヒト組織の再生、幹細胞／前駆細胞のエクスビボ増殖、および血液疾患または免疫系疾患の治療において有用な方法および組成物に関する。

生涯にわたる血液生産は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の静止期と、自己複製と、分化との間の精密に調整されたバランスに依拠する。幹細胞がこれらの異なる運命をどのように選択するかを制御するメカニズムは未知である。

造血系は、生物の全生涯において１日に２００億個の赤血球を生成する能力を有する。この信じられないほど長期の細胞産生は、ＨＳＣによって調整されるが、ＨＳＣは同時に、生涯を通じてその機能を維持しなければならない。血液系の維持は、骨髄（ＢＭ）の低酸素領域（低酸素ニッチ）に存在するＨＳＣのプールによって保証される。これらの珍しい細胞は、生涯にわたって自己複製および多分化能性前駆細胞（ＭＰＰ）へのコミットメントが可能である。

機能性ＨＳＣプールの保存は、静止ＨＳＣのプールを維持することによって達成される（これは、細胞ストレスおよび損傷を回避するために細胞が採用する戦略である）（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ，１３５（６），１１８−２９）。細胞代謝は、このプロセスにおいて重要な役割を果たし、ＨＳＣ機能のマスター調節因子であることが最近明らかになった（Ｔａｂｕｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１２（１），４９−６１）。細胞代謝の調節が静止の維持において重要である場合、それはまた、ＨＳＣの運命決定を指示する（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１８（９），１３５０−８）。

ＢＭの移植は、血液学的悪性腫瘍、例えば白血病ならびに、限定されないが、癌（例えば、白血病、リンパ腫）、血液障害（例えば、遺伝性貧血、先天性代謝異常、再生不良性貧血、ベータサラセミア、ブラックファン・ダイアモンド症候群、グロボイド細胞白質萎縮症、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、ハンター症候群、ハーラー症候群、レッシュ・ニャン症候群、大理石骨病、免疫系の救援化学療法（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒｐｙ ｒｅｓｃｕｅ）、および他の疾患（例えば、自己免疫疾患、糖尿病、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス）を含む血液および免疫系の他の疾患のための、命を救う可能性のある治療法である。

移植後の患者の転帰を改善するために、血液回復期間を短縮することによって、重度の感染症および出血のリスクを減少させることが重要である。何十年もの間、ＨＳＣは、血液学的および免疫疾患の治療における使用が成功していたが、その数が限られているので、ＨＳＣに基づく治療のより信頼性の高い広範な応用が妨げられている。実際、造血幹細胞が、臨床応用のために圧倒的に最も広範に使用されている幹細胞であるならば、ＨＳＣ療法は依然として非常に危険な手法であり、血液学的悪性腫瘍に適用した場合には、主に遅延性の好中球減少とそれに続くＢＭ除去により、５０％近くの死亡を伴う。

さらに、培地中においては、長期自己複製およびインビボ再生能力が急速に失われるので、「エクスビボ」において機能性ＨＳＣを増殖させる無数の試みが失敗している。ＳＴ−ＨＳＣとも称される短期ＨＳＣ（ＬＫＳ ＣＤ１５０＋ＣＤ３４＋）およびＭＰＰとも称される多分化能性前駆細胞（ＬＫＳ ＣＤ１５０−ＣＤ３４＋）へのＬＴ−ＨＳＣとも称される長期ＨＳＣ（典型的には、マーカーＬｉｎ−ｃＫｉｔ＋Ｓｃａ−１＋（ＬＫＳ ＣＤ１５０＋ＣＤ３４−）によって定義される）の進行は、細胞表面マーカーのレパートリーのごくわずかな変化によって反映され、表面マーカーのレパートリーは、インビボ機能を正確に予測するものではない。臨床研究により、エクスビボにおいて増殖させたＨＳＣのみが、造血に一時的に貢献することが示された。実際、増殖させたＨＳＣは迅速に生着したが、おそらくは自己複製能力の喪失により、長期的な多系統生着に寄与しなかった。自己複製長期ＨＳＣと、それらの最初期機能不全子孫（ｅａｒｌｉｅｓｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ ｐｒｏｇｅｎｙ）とを区別するための信頼性のある表現型マーカーおよび遺伝子マーカーの欠如は、自己複製の分子機構の解明を困難する。

血液悪性腫瘍などの疾患の治療として現在使用されているヒト自己および同種骨髄移植においては、多数の患者が、家系内および世界登録簿のいずれにおいても組織適合性ドナーを見つけられないので、移植のための他のＨＳＣ供給源、例えば臍帯血に頼らねばならない。残念なことに、臍帯血（ＣＢ）が含有するＨＳＣの絶対数は、動員された末梢血ＣＤ３４＋細胞（ＭＰＢＣ）またはＢＭよりもはるかに少ないので、ＣＢは、成人患者における治療用途にあまり好ましくない。造血幹細胞および前駆細胞の数を増加させる能力は、理論的には、ＭＰＢＣもしくは骨髄の提供に必要な量を減少させるか、または異なる臍帯から造血幹細胞をプールする必要性（複数の臍帯血ユニットを使用する二重移植）（これは、ヒト抗原白血球（ＨＬＡ）マッチングにおけるストリンジェンシーの増加を必要とする）を避ける。

しかしながら、ヒト骨髄増殖培養物は、細胞産生を約６〜８週間中断して、限定的な造血能を示し、少数の造血前駆細胞および成熟血球を産生することが示されているが、外因性成長因子を使用してインビトロ増殖を進めようとする多大な努力にもかかわらず、多能性細胞の数の増加の成功は限定的であった。加えて、現在のところ、ＢＭおよびＨＢＳから単離された長期再増殖（ＬＴ）−ＨＳＣを確実に増殖させることは非常に困難であるので、新たなＬＴ−ＨＳＣ供給に対する必要性が深刻化している。

５０年以上の臨床経験および１００万回の移植によれば、造血幹細胞（ＨＳＣ）移植は、これまでに最も広範に利用された最初の幹細胞療法であった。その成功は、自己複製して前駆細胞（次にこれが、１日当たり１０^１１個の膨大な成熟血球の産生を担う）の安定供給をもたらすＨＳＣの能力にある。それにもかかわらず、同種ＨＳＣ移植およびすべての他の強力な破壊的化学療法（ａｂｌａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）レジメンの成功は依然として、ＨＳＣ刺激因子Ｇ−ＣＳＦによる標準的な支援がある場合においても、主に全白血球枯渇とそれに続く骨髄（ＢＭ）除去に関連する感染性合併症により、２５％近くの手術関連死を伴う。

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）前駆体は、高い循環レベルのコレステロールおよび血中脂質のための治療として、ニコチン酸（ＮＡ）の形態で臨床において既に使用されている（Ｋａｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｌａｎｃｅｔ，３６３（９４２４），１８９２−４；Ｃａｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｃｅｌｌ．Ｍｅｔａｂ．，１５（６），８３８−４７）。しかしながら、造血系に対するＮＡＤレベルの効果は、広範に研究されていない。

それにより、一方においては、ＨＳＣ長期多系統血液再構成能力を有する幹細胞と、長期自己複製能力を喪失した細胞とを正確に区別するための技術、および他方においては、移植直後の期間に血液生産を刺激してＨＳＣ移植関連死を減少させるための戦略の開発により、ＨＳＣ療法の可能性は大幅に高まるであろう。

したがって、特に癌治療において血液系の再生を高めるために、臨床ＨＳＣ増殖およびＨＳＣ運命のインビボ治療操作のために有用な戦略の開発に対するいくつかの必要性が存在するので、特に、患者の重度の血球減少期間を短縮するための新規戦略は大きな臨床的影響を与え、多数の造血器悪性腫瘍に対する唯一の治癒的治療である強力な化学療法およびＨＳＣ移植を、脆弱なまたは高齢の患者に適用することを容易にするであろう。

本発明は、低いミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）が、各造血幹または初期前駆細胞集団内において、新鮮単離ＨＳＣおよびインビトロ培養ＨＳＣの長期多系統血液再構成能力の強力なマーカーとなるという予想外の知見に基づく。ホメオスタシス条件下または活性化条件下（周期の数が増加する）のいずれかにおける静止および周期ＨＳＣは、同等の（ΔΨｍ）プロファイルを有する。したがって、ΔΨｍは、それらの細胞周期の状態にかかわらず、機能性ＨＳＣのマーカーである。さらに、本発明は、低いΔΨｍを保持する娘細胞が幹細胞性を維持するのに対して、ＡＴＰ産生を支援するためにミトコンドリアを利用するものは分化し、顕著に、電子伝達鎖を化学的に脱共役してミトコンドリア内のＡＴＰ合成を破壊すると、ＨＳＣ細胞における低いミトコンドリア膜電位を強制的に維持しながら、迅速な分化を通常誘導する培養条件下においても、前記細胞は自己複製を行うように指示されるという予想外の知見に基づくものである。

本発明は、ミトコンドリア電位を低下させる薬剤、例えばミトコンドリア内のＡＴＰ生成から電子伝達を脱共役する薬剤、またはニコチンアミドリボシド（ＮＲ）などの薬剤の使用が、低いΔΨｍを有する分裂ＨＳＣ細胞の割合を高めながら、エクスビボにおいてＨＳＣを維持しまたは増殖させ、飼料を介して投与した場合には、マウス骨髄中の造血前駆細胞区画を増殖させ、移植後の生存および血液回復を改善することができるという他の予想外の知見に基づく。従前の研究においては、ニコチンの投与は、マウスにおける血小板レベルを増加させなかったことが示されたことからすると（Ｋｏｎｉｅｃｚｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ，ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ＆ｄｉｓｅａｓｅｓ，５０，１７１―６）、これらの知見はさらに意外なものである。

本発明の第一の態様は、エクスビボ造血幹細胞増殖のための方法を提供する。

本発明の第二の態様は、長期多系統血液再構成能力を有する機能性幹細胞における造血幹細胞調製物を濃縮するための方法を提供する。

本発明の第三の態様は、造血幹細胞集団の幹細胞性をエクスビボにおいて維持しおよび／または増殖させる方法を提供する。

本発明の第四の態様は、長期多系統血液再構成能力を有する機能性幹細胞を選択するためのキットを提供する。

本発明の第五の態様は、造血幹細胞のためのキットまたは細胞増殖培養培地であって、少なくとも１つのミトコンドリア膜電位低下剤を含むキットまたは細胞増殖培養培地を提供する。

本発明の第六の態様は、対照血球レベルと比較した血球レベルの低下、例えば、造血幹細胞移植後の被験体、または固形腫瘍のための破壊的化学療法を受けているか、もしくは重度の免疫学的障害を患っている被験体において見られる、例えば重度の好中球減少症および／または重度の血小板減少症の予防および／または治療において使用するためのミトコンドリア膜電位低下剤を提供する。

本発明の第七の態様は、対照血球レベルと比較した血球レベルの低下の予防および／または治療のための医薬またはフードサプリメントを調製するためのミトコンドリア膜電位低下剤の使用を提供する。

本発明の第八の態様は、ミトコンドリア膜電位低下剤と、血球レベルの低下の予防および／または治療において有用な薬剤、例えばＧ−ＣＳＦ類似体（すなわち、フィルグラスチム）またはＴＰＯ受容体類似体（すなわち、Ｎ−ＰＬＡＴＥ）とを含む組成物を提供する。

本発明の第九の態様は、被験体における対照血球レベルと比較した血球レベルの低下を予防および／または治療する方法であって、経口経路、注射によって、またはフードサプリメントとして、有効量のミトコンドリア膜電位低下剤を被験体に投与することを含む方法を提供する。このようなミトコンドリア膜電位低下剤治療は、現在の標準治療、すなわち、好中球減少症の場合にはＧ−ＣＳＦ類似体（すなわち、フィルグラスチム）および自己免疫性血小板減少症の場合にはＴＰＯ受容体類似体（すなわち、Ｎ−ＰＬＡＴＥ）と組み合わされ得る。

本発明の第十の態様は、標準血液プロファイルの回復を促進するための、および／または造血細胞欠失患者における感染症のリスクを予防もしくは軽減するための方法であって、有効量のミトコンドリア膜電位低下剤を注射またはフードサプリメントとして被験体に投与することを含む方法を提供する。

本発明のさらなる態様は、対照血球レベルと比較した血球レベルの低下の予防および／または治療において使用するためのフードサプリメントであって、少なくとも１つのミトコンドリア膜電位低下剤を含むフードサプリメントを提供する。

実施例１において記載されているようにＴＭＲＭ蛍光によって測定した、表現型によって定義された造血幹細胞および前駆細胞集団の異なるミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）を示す。Ａ１およびＡ２：ＴＭＲＭによって標識した（ΔΨｍ）に基づく、ＣＰ、ＬＫＳ、ＳＴ−ＨＳＣおよびＬＴ−ＨＳＣのフローサイトメトリー分析。各集団は、差示的なΔΨｍレベルを特徴とし、最も原始的な集団から最もコミットしている集団に段階的に増加している。Ｂ：生ＴＭＲＭ標識幹細胞／前駆細胞の共焦点画像分析は、コミットメントレベルの増加に伴う、正規化した蛍光強度によって表されるΔΨｍの増加を裏付けている（ｎ＝７）。各細胞集団について、３つの代表的な例が示されている。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１および＊Ｐ＜０．０５。 実施例１において記載されている競合移植アッセイにおいて試験したように、再増殖単位（ＲＵ）によって測定した生着能力（多系統再構成能力）が、低いΔΨｍを有するＨＳＣサブ集団に専ら限定されることを示す。Ａ：骨髄中のすべての多分化能性幹細胞および前駆細胞を含有するＬＫＳ集団、長期幹細胞性は、ＴＭＲＭ^低細胞（ＬＫＳ：ＴＭＲＭ^低）に限定される）（各条件について、ｎ＝８）。Ｂ：表現型によって定義されたＳＴ−ＨＳＣ区画において、幹細胞性は、ＴＭＲＭ^低細胞（ＳＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^低）に限定される（各条件について、ｎ＝９）。Ｃ：表現型によって定義されたＬＴ−ＨＳＣ区画において、幹細胞性は、ＴＭＲＭ^低細胞（ＬＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^低）に限定される（各条件について、ｎ＝９）。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１および＊Ｐ＜０．０５。 実施例３Ａにおいて試験したように、低いΔΨｍが、キメラ化の割合によって測定した培地中の自己複製ＨＳＣの特徴であることを示す。Ａ：５日間のインビトロ増殖後の培地増殖ＨＳＣ子孫のＴＭＲＭ^低細胞およびＴＭＲＭ^高細胞画分のキメラ化の割合。Ｂ：ＴＭＲＭ^高細胞と比較した、第一世代の娘細胞（すなわち、１回分裂）のＴＭＲＭ^低画分のキメラ化の割合。ＴＭＲＭ^低画分の非常に高い長期多系統血液再構成効率を裏付けており、全血液（Ｂ１）ならびにリンパ系（Ｂ２）および骨髄系（Ｂ２）について、培地中の自己複製ＨＳＣの分裂および分化ＨＳＣの分裂の証拠を提供している（各条件について、ｎ＝１０）；Ｃ：ＴＭＲＭ^低注射一次レシピエントマウス由来のＢＭの二次移植は、全血液（Ｃ１）、リンパ系（Ｃ２）および骨髄系（Ｃ２）のキメラ化の割合によって示されるように、８週間の時点において長期再構成を示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１および＊Ｐ＜０．０５。 図３ＡＢ参照。 実施例３において記載されている電子伝達鎖脱共役剤（ＦＣＣＰ）の存在下または非存在下における短期および長期コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイにおいて測定したように、ミトコンドリア代謝の調節がＨＳＣ運命を変化させることを示す。Ａ：コロニーの総数、ならびに全骨髄細胞に対する、最もコミットしている前駆細胞由来の（マクロファージコロニー、Ｍ、顆粒球／マクロファージコロニー、ＧＭ）（それぞれ左および中央のパネル）および最も原始的な前駆細胞由来の（右のパネル）コロニーの割合；Ｂ：表現型ＬＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^低細胞に対する、最もコミットしている前駆細胞由来の（ｍｋ、Ｇ、ＭおよびＧＭ）（左および中央のパネル）および最も原始的な前駆細胞由来の（右のパネル）コロニーの数および割合Ｃ：全細胞（左）、リンパ系細胞（中央のパネルおよび骨髄細胞（右パネル））における、ＦＣＣＰの存在下において培養した細胞におけるキメラ化の割合として測定した多系統再構成のレベル。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１および＊Ｐ＜０．０５。（ＣＦＵ−）Ｇ：コロニー形成単位−顆粒球；（ＣＦＵ−）Ｍ：コロニー形成単位−マクロファージ；（ＣＦＵ−）ＧＭ：コロニー形成単位−顆粒球、マクロファージ；（ＣＦＵ−）ＧＥＭＭ：コロニー形成単位−顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球）；Ｍｋ／ＢＦＵ−Ｅ：巨核球／バースト形成単位−赤血球。 実施例４Ａにおいて記載されているように、骨髄分析による、異なる様々な細胞区画に対するマウスにおけるＮＲ治療の効果を示す。Ａ：治療１週間後（１）、治療４週間後（４）のすべての造血前駆細胞区画（ＬＴ−ＨＳＣ、ＳＴ−ＨＳＣ、ＭＰＰ、ＣＰおよびＭＥＰ）においてＦＡＣＳによる細胞数によって測定した、ＮＲ治療（右）および対照（左）マウスのＢＭ分析（ｎ＝５、統計ｔスチューデント）；Ｂ：対照群（左）と比較した、移植状況における１カ月ＮＲ治療マウス（右）由来のＢＭのコンジェニックＣＤ４５．１キメラ化の割合によって測定した、１２週間の長期生着。ＮＲ治療によるＨＳＣの減少は示されていない；Ｃ：１週間治療群（１）および４週間治療群（４）における、ＢＭ由来マウスからのＣＦＵアッセイにおけるコロニーの数（ｎ＝５、統計ｔスチューデント）。 図５Ａ参照。 図５Ａ参照。 実施例５において記載されているように、骨髄分析による、異なる細胞区画に対するマウスにおけるニコチン酸（ＮＡ）１週間治療の効果を示す。Ａ１〜Ａ３：造血区画のＦＡＣＳ分析は、ＮＡ治療による幹細胞および前駆細胞集団の増加を示している。Ｂ１〜Ｂ２：細胞周期分析は、治療条件と未治療条件との間のいかなる有意差も示していない。 実施例５において記載されているように、対照（点）と比較した、限定（Ａ）および非限定（Ｂ）用量移植マウス（四角）におけるＮＲ治療の効果を示す。Ａ１：移植プロトコール；Ａ２：時間（移植後の日数）に対する生存の割合（ｎ＝１０）。Ｂ：時間（移植後の日数）に対する血球数；Ｂ１：血小板（灰色は血小板減少症の領域）およびＢ２：好中球（灰色は好中球減少症の領域）（ｎ＝１０、統計ｔスチューデント）。 実施例７において記載されているように、ＮＲによるＨＳＣのインビトロ治療の効果を示す。Ａ：ＮＲ治療および対照（ＣＴＲＬ）条件における、ミトコンドリアに関する（ＴＭＲＭによる）ＪＣ１染色ＨＳＣの共焦点イメージング（ｎ＝３、統計ｔスチューデント）；Ｂ：すなわち、低いミトコンドリア活性（「ＴＭＲＭ低」）および高いミトコンドリア活性（「ＴＭＲＭ高」）を有するＨＳＣ集団の分析（ｎ＝３、統計ｔスチューデント）；Ｃ：ＮＲ治療後および対照条件下において経時的顕微鏡検査による追跡によって決定した、同調分裂細胞の割合（ｎ＝３、統計ｔスチューデント）。右のパネルに示されているように、６時間の時間枠内（３時間のΔｔ）において両方の娘細胞が分裂する場合、分裂が同調性であるとみなした。 実施例８において記載されているように、マウスにおけるＮＡまたはアシピモックス治療と比較したＮＲ治療の効果を示す。Ａ：フローサイトメトリー分析；Ｂ：ＣＦＵ分析；Ｃ：血液キメラ化の割合によって測定した、ＮＲ／アシピモックス治療ドナー由来の骨髄を移植したレシピエントマウスにおける血液再構成の分析；Ｄ：細胞数体積によって測定した、ＮＲ／アシピモックスによって治療した移植レシピエントマウスにおける血液再構成の分析。 図９ＡＢ参照。 実施例８において記載されているように、マウスの生存および血液回復を示す。Ａ：ヒトＣＤ３４＋細胞を新生マウスに肝内注射することによって、ＮＳＧヒト化マウスを生産した；Ｂ：ｃｔｒｌまたはＮＲ食を与えたヒト化マウスにおいて評価した、ヒトリンパ球産生、ｎ＝５。スチューデントｔ検定、＊Ｐ＜０．０５ ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞を移植し、次いでｃｔｒｌまたはＮＲ食を７日間与えて作製したヒト化マウスにおけるヒト単球（ＣＤ１４＋ＣＤ１６−）産生に対するＮＲ補充の効果を示す。ＦＡＣＳ分析によってヒト単球を定量し、０日目に対する増加倍率として測定した。ｎ＝５。 実施例９において記載されているように、細胞数によって測定した、ＮＡ（Ｃ〜Ｄ）と比較したＮＲ補充（Ａ〜Ｂ）の効果を示す。

血球レベルの低下を発症するリスクを有する被験体としては、貧血または骨髄異形成症候群を患っている患者、化学療法、骨髄移植または放射線療法を受けている者、ならびにこれらに限定されるものではないが、免疫血小板減少性紫斑病、純赤血球形成不全および自己免疫好中球減少症を含む自己免疫性血球減少症を患っている者が挙げられる。

移植後合併症を発症するリスクを有する被験体としては、一次またはインビトロ操作ＭＰＢＣ、ＢＭまたはＵＣからの自己または同種造血幹細胞または前駆細胞移植を受けた造血細胞欠失被験体が挙げられる。

本明細書において使用される造血幹細胞（ＨＳＣ）サンプルという用語は、前記細胞の供給源（例えば、臍帯血、骨髄、末梢血または胎児組織、例えば胎盤組織、胎児肝臓または造血性内皮）から単離された造血幹細胞、または造血組織もしくは他の中胚葉もしくは中胚葉再プログラム化起源由来の多分化能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）もしくは部分的再プログラム化細胞を含む任意のエクスビボサンプルを含む。

本明細書において使用される「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、本明細書において使用される場合、自己複製能力と、より成熟な血球（顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網状赤血球、赤血球）、栓球（例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板）、単球（例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞）、リンパ球（一般的なリンパ系前駆細胞、プレＢ、プロＢ、成熟Ｂ、プレＴ、プロＢ、成熟ＴおよびＮＫＴリンパ球ならびにＮＫ細胞）を含む）への分化能力とを有する成熟血球を指す。造血幹細胞は、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞（例えば、リンパ球性幹細胞）、および／または特定の造血系にコミットしている幹細胞を含み得ることも当技術分野において公知である。特定の造血系にコミットしている幹細胞は、Ｔ細胞系、Ｂ細胞系、樹状細胞系、ランゲルハンス細胞系、赤血球、巨核球、骨髄および／またはマクロファージ細胞系のものであり得る。ＨＳＣはまた、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）および短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）を指す。ＬＴ−ＨＳＣおよびＳＴ−ＨＳＣは、例えば本明細書において記載されまたは当業者に公知のそれらの細胞表面マーカー発現に基づいて区別される。

本明細書において使用される「ＨＳＣ含有サンプル」という用語は、ＬＴ−ＨＳＣの精製調製物または非精製造血サンプル（例えば、全臍帯血または全ＭＰＢＣアフェレーシス産物または全骨髄サンプル）を指す。ＬＴ−ＨＳＣの精製調製物は、関連哺乳動物種に特異的な表現型によって定義された造血幹細胞および前駆細胞集団の表面マーカーの使用によって調製され得る。例えば、ヒトＬＴ−ＨＳＣは、ＣＤ３４＋表面マーカーを使用することによって精製され得る。

本発明の細胞増殖方法の有効性は、ＨＳＣサンプル調製物中の自己複製細胞の量（これは、表面免疫染色（すなわち、ＣＤ３４、ＣＤ３８、Ｔｈｙ、ＣＤ１３３、ｃ−ｋｉｔ、系統マーカー）を介してフローサイトメトリーによって表現型的に、またはインビボ移植アッセイの状況においてコロニー形成単位（ＣＦＵ）およびキメラ化の割合の測定を介して機能的に測定され得る）の測定によって測定され得る。

本明細書において使用される「増殖」という用語は、幹細胞に適用される場合、母幹細胞と同一の２つの娘幹細胞をもたらす幹細胞分裂を指す。このように、幹細胞の数は、細胞分裂後に増加している。幹細胞生物学において、少なくとも体細胞または成体幹細胞については、幹細胞の異なる運命に関する制約がないので容易である幹細胞の増殖（「母細胞」として公知の細胞が成長および分裂して「娘細胞」を産生する細胞集団の成長）と比較して、幹細胞の増殖は非常に達成困難であることは注目に値する。

本明細書において使用される「細胞増殖培養培地」は、幹細胞の増殖に適切な任意の標準的な細胞幹細胞培養培地、例えば以下の実施例において記載されているか、またはＢｏｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９，１３４５−８において記載されている培養培地を指す。

一つの実施形態によれば、細胞増殖培養培地は、サイトカインおよび成長因子の標準的なカクテルを含む。サイトカインおよび成長因子のカクテルは、間質フィーダーまたは間葉細胞の支援にかかわらず使用され得、限定されないが、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＦＧＦ−１、ＩＧＦ１、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、オンコスタチン−Ｍ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、アンギオポイエチンおよびアンジオポエチン様ファミリー（Ａｎｇｌ５を含む）、プロスタグランジンおよびエイコサノイド（ＰＧＥ２を含む）、アリール炭化水素（ＡｈＲ）受容体阻害剤、例えばＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ１（ＳＲ１）およびＬＧＣ００６（Ｂｏｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ、前掲）を含み得る。

本明細書において使用される「ミトコンドリア膜電位低下剤」という用語は、例えば、ミトコンドリア電位感受性色素（例えば、ＴＭＲＭまたはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ染色）によって、または海馬アッセイを介した細胞内呼吸速度の直接測定によって測定した場合に、ミトコンドリア膜電位の低下を誘導することができる薬剤である。それらの薬剤は、ミトコンドリア内のＡＴＰ生成から電子伝達を脱共役する薬剤を含む。ミトコンドリア内のＡＴＰ生成から電子伝達を脱共役する薬剤の例としては、２，４ジ−ニトロフェノール（ＤＮＰ）、カルボニルシアニド４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラジン（ＣＣＣＰ）、２−フルオロフェニル）｛６−［（２−フルオロフェニル）アミノ］（１，２，５−オキサジアゾロ［３，４−ｅ］ピラジン−５−イル）｝アミン（ＢＡＭ−１５）および４，５，６，７−テトラクロロ−２−トリフルオロメチルベンズイミダゾール（ＴＴＦＢ）から選択される薬剤が挙げられる。ミトコンドリア内のＡＴＰ生成から電子伝達を脱共役することができる任意のさらなる薬剤の同定は、市販のＡＴＰ決定キットを介して当業者に公知の標準的な方法によって同定され得る。さらなるミトコンドリア膜電位低下剤としては、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）、ナイアシン、Ｎ−ホルミルキヌレニン、キノリン酸、ニコチンアミドリボシドキナーゼ（ＮＲＫ）アクチベーター、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）またはトリプトファンなどの薬剤が挙げられる。

さらに、ＨＳＣ区画における膜電位を低下させる薬剤の能力は、例えば本願に記載されている当業者に公知の方法によって、例えば、実施例７および９に示されているように、例えばＴＭＲＭによって染色されたインビトロ培養または新鮮単離ＨＳＣのフローサイトメトリーによってアッセイされ得る。

本明細書において使用される「造血細胞欠失被験体」という用語は、重度の好中球減少症および／または重度の血小板減少症および／または重度の貧血を示す被験体、例えば限定されないが、移植後の被験体、または固形腫瘍のための破壊的化学療法を受けている被験体、毒性、薬物誘発性または感染性造血不全（すなわち、ベンゼン誘導体、クロラムフェニコール、Ｂ１９パルボウイルスなど）を患っている患者、および骨髄異形成症候群、重度の免疫学的障害または先天性血液学的障害（中枢起源（すなわち、ファンコニ貧血）または末梢起源（すなわち、Ｇ６ＰＤＨ欠損症）にかかわらず）を患っている患者を意味する。

本明細書において使用される「治療」および「治療する」は、一般に、所望の薬理学的および生理学的効果を得ることを意味する。この効果は、疾患、その症候もしくは症状を予防もしくは部分的に予防する点において予防的であり得、および／または疾患、症状、症候もしくは疾患に起因する有害効果の部分的もしくは完全な治癒点において治療的であり得る。本明細書において使用される「治療」という用語は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）例えば、家族歴、過体重状態または年齢に基づき疾患の素因を有し得るがそれを有するとまだ診断されていない被験体における疾患の発症の予防；（ｂ）疾患の阻害、すなわち、その発症の阻止；または疾患の緩和、すなわち、疾患および／またはその症候または症状の退行の誘発、例えば損傷の改善または修復を含む。

特に、造血機能の欠如に関連する疾患または障害の治療は、標準血液プロファイルの回復を促進すること、および／または造血細胞欠失患者における感染症のリスクを予防もしくは軽減することを含む。

本明細書において使用される「被験体」という用語は、哺乳動物を指す。例えば、本発明によって企図される哺乳動物としては、ヒト、霊長類、家畜、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、実験用齧歯類が挙げられる。

本発明の治療または方法の「有効性」という用語は、本発明の使用または方法に対する疾患または症状の経過の変化に基づいて測定され得る。例えば、本発明の治療または方法の有効性は、造血細胞欠失プロファイルの低下、例えば、正常血球数の回復、または正常細胞数への血球数の改善、例えば、好中球減少症の終了および終了到達時間（ヒトにおいては、好中球＞０．５Ｇ／ｌ）ならびに／または重度の血小板減少症の終了および終了到達時間（ヒトにおいては、血小板数＞５０〜１００Ｇ／ｌ）（これは、全末梢血球数によって測定され得る）の測定によって測定され得る。

さらに、本発明の治療または方法の有効性は、造血細胞欠失プロファイルの改善によって、例えば、標準血球数（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｅｌｌ ｂｌｏｏｄ ｃｏｕｎｔｓ）（白血球分化、赤血球および血小板数）および末梢血または骨髄中のＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞の測定、ならびにＢＭスメアまたは生検における細胞性の研究によって測定され得る。

本発明の造血幹細胞増殖方法
本発明の実施形態によれば、エクスビボで造血幹細胞を増殖するための方法であって、
ａ）細胞増殖培養培地中にあるＨＳＣ含有サンプルを用意する工程と、
ｂ）前記ＨＳＣサンプルから、低いミトコンドリア膜電位を特徴とするＨＳＣ画分を、単離ＨＳＣプールに単離する工程と、
ｃ）工程ａ）で用意したＨＳＣサンプル、または工程ｂ）で単離したＨＳＣプールを、少なくとも１つのミトコンドリア膜電位低下剤またはそれらの混合物と接触させる工程と
を含んでなることを特徴とする方法が提供される。

さらなる実施形態によれば、本発明のエクスビボ造血幹細胞増殖のための方法であって、ＨＳＣサンプルが、骨髄サンプルおよび／または骨髄細胞調製物である方法が提供される。

さらなる実施形態によれば、本発明のエクスビボ造血幹細胞増殖のための方法であって、ＨＳＣサンプルが、ＵＣＢサンプルまたはＵＣＢ細胞調製物である方法が提供される。

さらなる実施形態によれば、本発明のエクスビボ造血幹細胞増殖のための方法であって、低いミトコンドリア膜電位を有するＨＳＣ画分を、ＪＣ１、ＴＭＲＭおよびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＤｅｅｐＲｅｄから選択される蛍光色素を使用することによって単離する方法が提供される。

さらなる実施形態によれば、本発明のエクスビボ造血幹細胞増殖のための方法であって、前記少なくとも１つのミトコンドリア膜電位低下剤が、ミトコンドリア内のＡＴＰ生成から電子伝達を脱共役する薬剤である方法が提供される。

別のさらなる実施形態によれば、本発明のエクスビボ造血幹細胞増殖のための方法であって、前記少なくとも１つのミトコンドリア膜電位低下剤が、以下の群：２，４ジ−ニトロフェノール（ＤＮＰ）、カルボニルシアニド４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラジン（ＣＣＣＰ）、２−フルオロフェニル）｛６−［（２−フルオロフェニル）アミノ］（１，２，５−オキサジアゾロ［３，４−ｅ］ピラジン−５−イル）｝アミン（ＢＡＭ−１５）および４，５，６，７−テトラクロロ−２−トリフルオロメチルベンズイミダゾール（ＴＴＦＢ）から選択されるものである方法が提供される。

別のさらなる実施形態によれば、本発明のエクスビボ造血幹細胞増殖のための方法であって、前記少なくとも１つのミトコンドリア膜電位低下剤が、カルボニルシアニド４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾンである方法が提供される。

さらなる実施形態によれば、本発明のエクスビボ造血幹細胞増殖のための方法であって、前記少なくとも１つのミトコンドリア膜電位低下剤が、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）、ナイアシン、Ｎ−ホルミルキヌレニン、キノリン酸、ニコチンアミドリボシドキナーゼ（ＮＲＫ）アクチベーター、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）またはトリプトファンから選択される薬剤である方法が提供される。

別のさらなる実施形態によれば、本発明のエクスビボ造血幹細胞増殖のための方法であって、前記少なくとも１つのミトコンドリア膜電位低下剤が、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）である方法が提供される。

さらなる実施形態によれば、本発明のエクスビボ造血幹細胞増殖のための方法であって、工程ｂ）またはｃ）の後に得られた細胞調製物が、長期多系統血液再構成能力を有する機能性幹細胞が富化されたものである方法が提供される。

さらなる実施形態によれば、本発明のエクスビボ造血幹細胞増殖のための方法であって、工程ｃ）の後に得られた細胞調製物の幹細胞性（例えば、ヒトＨＳＣの自己複製能力は、ＣＤ３４＋細胞を定量することによって、および移植アッセイによって評価される）が、ミトコンドリア膜電位低下剤の非存在下におけるＨＳＣサンプルと比較して、サンプル採取後に長時間維持され、および／または増加している方法が提供される。

さらなる実施形態によれば、ＨＳＣまたは短期前駆細胞（後者のものは、凍結に対して非常に感受性である）のいずれかを凍結保護するための方法が提供される。

脱共役剤は、１〜５０μＭの濃度において使用されるであろう。

別の実施形態によれば、少なくとも１つのミトコンドリア膜電位低下剤を含む細胞増殖培養培地が提供される。

別の実施形態によれば、少なくとも１つのミトコンドリア膜電位低下剤を含む細胞増殖培養培地であって、場合により間質フィーダーまたは間葉細胞の支援により幹細胞増殖において有用なサイトカインおよび成長因子のカクテル、例えばＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＦＧＦ−１、ＩＧＦ１、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、オンコスタチン−Ｍ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、アンギオポイエチンおよびアンジオポエチン様ファミリー（Ａｎｇｌ５を含む）、プロスタグランジンおよびエイコサノイド（ＰＧＥ２を含む）、アリール炭化水素受容体阻害剤、例えばＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ１（ＳＲ１）およびＬＧＣ００６をさらに含む細胞増殖培養培地が提供される。

本発明の別の実施形態によれば、長期多系統血液再構成能力を有する機能性幹細胞を選択するためのキットであって、ｉ）表現型によって定義された造血幹細胞および前駆細胞の表面マーカーまたはそれらのマーカーのいくつかの組み合わせの少なくとも１つの検出剤、ならびにｉｉ）造血幹細胞および前駆細胞における低いミトコンドリア膜電位を検出するための少なくとも１つの薬剤、例えばＪＣ１、ＴＭＲＭまたはＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）色素（ベンゾオキサゾリウム、２−［３−［５，６−ジクロロ−１，３−ビス［［４−（クロロメチル）フェニル］メチル］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イリデン］−１−プロペニル］−３−メチル−，クロリド／２０１８６０−１７−５）を含むキットが提供される。

本発明のさらなる実施形態によれば、本発明のキットであって、表現型によって定義された造血幹細胞および前駆細胞の前記少なくとも１つの検出剤が、マウス造血前駆細胞（ＨＳＣを含む）の場合にはｃ−Ｋｉｔ、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ−１、ＣＤ１５０、ＣＤ３４およびＣＤ４８、またはヒトＨＳＣおよび造血前駆細胞の場合にはＬｉｎ−、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ９０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１０およびＩＬ３Ｒａから選択される前記表面マーカーに対する１つ以上の選択的抗体であるキットが提供される。

本発明のさらなる実施形態によれば、造血幹細胞のためのキットまたは細胞増殖培養培地であって、ミトコンドリア内のＡＴＰ生成から電子伝達を脱共役する薬剤、およびニコチンアミドリボシド（ＮＲ）、ナイアシン、Ｎ−ホルミルキヌレニン、キノリン酸、ニコチンアミドリボシドキナーゼ（ＮＲＫ）アクチベーター、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）またはトリプトファンから選択される薬剤から選択される少なくとも１つのミトコンドリア膜電位低下剤を含むキットまたは細胞増殖培養培地が提供される。

さらなる実施形態によれば、造血幹細胞のためのキットまたは細胞増殖培養培地であって、ミトコンドリア内のＡＴＰ生成から電子伝達を脱共役する少なくとも１つの薬剤をさらに含むキットまたは細胞増殖培養培地が提供される。

さらなる実施形態によれば、造血幹細胞のためのキットまたは細胞増殖培養培地であって、ミトコンドリア内のＡＴＰ生成から電子伝達を脱共役する前記少なくとも１つの薬剤が、以下の群：２，４ジ−ニトロフェノール（ＤＮＰ）、カルボニルシアニド４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラジン（ＣＣＣＰ）、２−フルオロフェニル）｛６−［（２−フルオロフェニル）アミノ］（１，２，５−オキサジアゾロ［３，４−ｅ］ピラジン−５−イル）｝アミン（ＢＡＭ−１５）および４，５，６，７−テトラクロロ−２−トリフルオロメチルベンズイミダゾール（ＴＴＦＢ）から選択されるキットまたは細胞増殖培養培地が提供される。

別の態様によれば、本発明は、ＨＳＣサンプル中の細胞の幹細胞性の維持および／または増加のための候補を同定するための方法であって、
（ａ）ＨＳＣサンプルを、試験すべき候補物質と接触させる工程、
（ｂ）前記ＨＳＣサンプルから、低いミトコンドリア膜電位を特徴とするＨＳＣ画分を、単離ＨＳＣプールに単離する工程、
（ｃ）前記試験すべき物質が、工程ａ）における前記ＨＳＣサンプル、もしくは工程ｂ）において単離した単離ＨＳＣプール中の前記細胞のミトコンドリア膜電位を低下させ、および／または工程ａ）における前記ＨＳＣサンプル、もしくは工程ｂ）において単離した単離ＨＳＣプール中の低いミトコンドリア膜電位を有する細胞を増加させるかを測定する工程；そして
（ｄ）前記物質を同定する工程
を含む方法を提供する。

さらなる態様によれば、本発明は、ＨＳＣサンプル中の細胞の幹細胞性の維持および／または増加のための候補を同定するための方法であって、前記細胞におけるミトコンドリア膜電位を、工程ｃ）において、ＪＣ１またはＴＭＲＭなどの蛍光色素を使用することによって測定する方法を提供する。

本発明の細胞増殖方法、または本発明の方法によってもしくは本発明の調製キットを使用することによって得られた幹細胞調製物は、例えばＢｏｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ、前掲に記載されている公知の造血幹細胞増殖方法において、および例えばＢｏｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０、前掲に記載されている公知の方法の移植プロトコールにおける使用のためにさらに使用され得る。

本発明の細胞増殖方法によって得られた細胞の集団は、臨床造血幹細胞移植のために、またはそれを必要とする被験体における造血機能の増強のために製剤化され得る。

本発明による使用
一つの実施形態によれば、本発明は、特に造血幹細胞移植後の被験体、または固形腫瘍のための破壊的化学療法を受けているか、もしくは重度の免疫学的障害を患っている被験体における、例えば造血機能の低下または欠如に起因する血球レベルの低下に関連する疾患または障害、例えば重度の好中球減少症、貧血および／または血小板減少症の予防および／または治療において使用するためのミトコンドリア膜電位低下剤を提供する。

別の実施形態によれば、本発明は、特に造血幹細胞移植後の被験体、または固形腫瘍のための破壊的化学療法を受けているか、もしくは重度の免疫学的障害を患っている被験体における、例えば造血機能の低下または欠如に起因する血球レベルの低下に関連する疾患または障害、例えば重度の好中球減少症および／または血小板減少症の予防または治療のための医薬またはフードサプリメントを調製するためのミトコンドリア膜電位低下剤の使用を提供する。

一つの実施形態によれば、本発明は、被験体における対照血球レベルと比較した血球レベルの低下を予防および／または治療する方法であって、注射によって、またはフードサプリメントとして有効量のミトコンドリア膜電位低下剤を被験体に投与することを含む方法を提供する。

一つの実施形態によれば、本発明は、標準血液プロファイルの回復を促進するための、および／または造血細胞欠失患者における感染症のリスクを軽減するための方法であって、注射によって、またはフードサプリメントとして有効量の膜電位低下剤を被験体に投与することを含む方法を提供する。

別の実施形態によれば、本発明の膜電位低下剤は、公知の技術および本明細書において記載される技術によって測定され得る低いミトコンドリア電位を有する細胞の割合を増加させることができる。

さらなる実施形態によれば、膜電位低下剤は、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）、ナイアシン、Ｎ−ホルミルキヌレニン、キノリン酸、ニコチンアミドリボシドキナーゼ（ＮＲＫ）アクチベーター、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）およびトリプトファンから選択される。

さらなる実施形態によれば、膜電位低下剤は、ニコチンアミドリボシドである。

さらなる実施形態によれば、膜電位低下剤は、好中球および血小板の回復の増加を介した、好中球減少症および／または血小板減少症の迅速な終了による血液回復の誘導において有用である。

本発明の細胞増殖方法、または本発明の方法によってもしくは本発明の調製キットを使用することによって得られた幹細胞調製物、または本発明の治療方法はまた、化学療法に対する補充療法の形成において利益を提供するか、または造血細胞の変化に関する他の疾患状態の治療において支援を提供し、長期幹細胞培養物のさらなる適用を提供し得る。

本発明による組成物
本発明は、造血機能の欠如に関連する疾患または障害、例えば重度の好中球減少症および／または血小板減少症の予防および／または治療において使用するために有用なミトコンドリア膜電位低下剤を提供する。

膜電位低下剤またはその製剤は、本明細書において記載される任意の形態の１つ以上の本発明の薬剤を含有し得る医薬製剤またはフードサプリメントとして投与され得る。本発明の組成物は、通常使用されるアジュバント、担体、希釈剤または賦形剤と共に、医薬組成物およびその単位投与量の形態に収納され得、このような形態において、固体、例えば錠剤もしくは充填カプセルとして、または液体、例えば溶液、懸濁液、エマルジョン、エリキシル剤、もしくはこれらを充填したカプセル（すべて経口用途用）として、または注射もしくは連続点滴による非経口（皮下を含む）用途の場合には滅菌注射液の形態において用いられ得る。注入可能な組成物は、典型的には、注射可能な滅菌生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水または当技術分野において公知の他の注射用担体をベースとするものである。このような医薬組成物およびその単位剤形は、さらなる活性化合物または成分の有無にかかわらず、通常の割合の要素を含み得、このような単位剤形は、用いるべき目的の１日投与量範囲に相応する任意の適切な有効量の有効成分を含み得る。

本発明の組成物は、限定されないが、水性または油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップおよびエリキシル剤を含む液体製剤であり得る。組成物はまた、使用前に水または他の適切なビヒクルによって再構成するための乾燥製品として製剤化され得る。このような液体調製物は、限定されないが、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクルおよび保存剤を含む添加剤を含有し得る。懸濁化剤としては、限定されないが、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルおよび水素化食用脂肪が挙げられる。乳化剤としては、限定されないが、レシチン、モノオレイン酸ソルビタンおよびアカシアが挙げられる。保存剤としては、限定されないが、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピルおよびソルビン酸が挙げられる。分散剤または湿潤剤としては、限定されないが、ポリ（エチレングリコール）、グリセロール、ウシ血清アルブミン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓｐａｎ（登録商標）が挙げられる。

本発明の組成物はまた、埋め込みによってまたは筋肉内注射によって投与され得るデポー調製物として製剤化され得る。

本発明の固体組成物は、通常の方法によって製剤化された錠剤またはロゼンジの形態であり得る。例えば、経口投与のための錠剤およびカプセルは、限定されないが、結合剤、充填剤、滑沢剤、崩壊剤および湿潤剤を含む通常の賦形剤を含有し得る。結合剤としては、限定されないが、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、デンプンの粘液およびポリビニルピロリドンが挙げられる。充填剤としては、限定されないが、ラクトース、糖、微結晶性セルロース、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウムおよびソルビトールが挙げられる。潤滑剤としては、限定されないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコールおよびシリカが挙げられる。崩壊剤としては、限定されないが、ジャガイモデンプンおよびグリコール酸ナトリウムデンプンが挙げられる。湿潤剤としては、限定されないが、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。錠剤は、当技術分野において周知の方法にしたがってコーティングされ得る。

本発明の化合物はまた、徐放性によって、または徐放性薬物送達系から投与され得る。

移植後または化学療法後の患者の場合、化学療法後の粘液炎がすべての経口摂取を妨げることが多く、一部の患者は非経口栄養を必要とさえするので、非経口投与が好ましいであろう。特定の実施形態によれば、本発明の組成物は、静脈内用途のためのものである。

特定の実施形態によれば、本発明の組成物は、フードサプリメントとして被験体に投与され得る。

一つの態様によれば、フードサプリメント製剤は、約１０〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の膜電位低下剤の投与量比で経口摂取され得る。

別の態様によれば、該ミトコンドリア膜電位低下剤が、４ジ−ニトロフェノール、カルボニルシアニド４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン、カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラジン、２−フルオロフェニル）｛６−［（２−フルオロフェニル）アミノ］（１，２，５−オキサジアゾロ［３，４−ｅ］ピラジン−５−イル）｝アミンおよび４，５，６，７−テトラクロロ−２−トリフルオロメチルベンズイミダゾールまたはそれらの混合物から選択される請求項１５に記載の細胞増殖培養培地が提供される。

別の態様によれば、少なくとも１つのミトコンドリア膜電位低下剤を含むフードサプリメントが提供される。

長期多系統血液再構成能力を有する機能性幹細胞における造血幹細胞調製物を濃縮するための方法

別の特定の態様において、本発明の組成物は、反復投与による送達に適合される。

特定の実施形態によれば、本発明の組成物は、獣医学的組成物である。

さらなる材料および製剤加工技術などは、Ｐａｒｔ ５ ｏｆ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ“Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（これは、参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている。

投与経路
ミトコンドリア膜電位低下剤またはその製剤は、経口、非経口、静脈内、直腸またはそれらの組み合わせを含む任意の様式によって投与され得る。非経口投与としては、限定されないが、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下および筋肉内が挙げられる。本発明の組成物はまた、組成物の徐放および緩徐制御静脈内注入を可能にするインプラントの形態によって投与され得る。

特定の態様によれば、ミトコンドリア膜電位低下剤またはその製剤は、経口投与される。

特定の態様によれば、ミトコンドリア膜電位低下剤またはその製剤は、フードサプリメントとして投与される。

特定の態様によれば、ミトコンドリア膜電位低下剤またはその製剤は、注射用製剤として投与される。

単回または複数回投与として個体に投与される投与量は、薬物動態学的特性、患者の状態および特性（性別、年齢、体重、健康、サイズ）、症候の程度、併用療法、治療の頻度および所望の効果を含む様々な因子に応じて変動するであろう。

組み合わせ
本発明を説明したが、以下の実施例は、限定的なものではなく例示として示されるものである。

本発明によれば、ミトコンドリア膜電位低下剤またはその製剤（その医薬製剤を含む）は単独で投与され得るか、または造血機能の欠如に関連する疾患もしくは障害を予防もしくは治療するために有用な、または血液回復を促進するために、および／または造血細胞欠失患者における感染症のリスクを予防もしくは軽減するために有用な助剤（例えば、多剤レジメン）と組み合わせて投与され得る。

本発明は、本発明の化合物または本発明のその製剤の投与を包含し、それは、造血機能の欠如に関連する疾患もしくは障害を予防もしくは治療するために有用な、または血液回復を促進するために、および／または造血細胞欠失患者における感染症のリスクを予防もしくは軽減するために有用な他の治療レジメンまたは助剤の前に、これらと同時に、またはこれらと連続して被験体に投与される。

前記助剤と同時に投与される本発明の化合物またはその製剤は、同じまたは異なる組成物において、同じまたは異なる投与経路によって投与され得る。

一つの実施形態によれば、造血機能の欠如に関連する疾患もしくは障害を予防もしくは治療するために有用な、または血液回復を促進するために、および／または造血細胞欠失患者における感染症のリスクを予防もしくは軽減するために有用な少なくとも１つの助剤、例えば、好中球減少症の治療のために使用されるＧ−ＣＳＦ類似体（すなわち、フィルグラスチム）、または自己免疫性血小板減少症の治療のために使用されるＴＰＯ受容体類似体（すなわち、Ｎ−ＰＬＡＴＥ、Ｒｅｖｏｌａｄｅ）と組み合わせてミトコンドリア膜電位低下剤を含む医薬製剤が提供される。

一つの実施形態によれば、ＨＳＣ破壊的化学療法レジメン（例えば、Ｇ−ＣＳＦ類似体（すなわち、フィルグラスチム、ペグフィルグラスチム））または抗菌／抗真菌予防レジメン（すなわち、スタビシリン、シプロフロキサシン、バクトリム、ポサコナゾール、ボラコーナゾールまたはフルコナゾール）において有用な少なくとも１つの助剤と組み合わせてミトコンドリア膜電位低下剤を含む医薬製剤が提供される。

患者
一つの実施形態において、本発明の患者は、造血機能の低下もしくは欠如に起因する血球レベルの低下に関連する疾患もしくは障害を患っている被験体、または対照血球レベルと比較した血球レベルの低下を発症するリスクを有する患者である。

別の実施形態において、本発明の患者は、造血細胞欠失被験体である。

さらなる実施形態において、血球レベルの低下は、例えば限定されないが、先天性骨髄不全症候群、特発性血小板減少症、再生不良性貧血および骨髄異形成症候群を含む造血系の原発性または自己免疫障害に続発する。

一つの実施形態において、本発明の患者は、重度の好中球減少症および／または血小板減少症を患っているか、または重度の免疫学的障害を患っている被験体である。

特定の実施形態において、本発明の被験体は、造血幹細胞移植後の被験体である。

特定の実施形態において、本発明の被験体は、血液学的および免疫学的障害および癌を患っている。

一つの実施形態において、本発明の患者は、自己免疫性血球減少症、特に難治性特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）を患っている被験体である。

特定の実施形態において、本発明の被験体は、新生物のための破壊的化学療法を受けている被験体である。

特定の実施形態において、本発明の被験体は、血液学的癌を患っている。

さらなる特定の実施形態において、本発明の被験体は、白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性症候群およびリンパ腫から選択される血液学的癌を患っている。

別のさらなる特定の実施形態において、本発明の患者は、薬理学的副作用として血球レベルの低下を有する被験体である。

別のさらなる特定の実施形態において、本発明の被験体は、限定的な骨髄予備能を有する被験体、例えば、高齢の被験体、または化学療法などの免疫枯渇治療に以前に曝露された被験体である。

別のさらなる特定の実施形態において、本発明の被験体は、血球レベルの低下を有するか、または対照血球レベルと比較した血球レベルの低下を発症するリスクを有する。それらの被験体としては、血液癌（例えば、白血病、リンパ腫）、血液障害（例えば、遺伝性貧血、先天性代謝異常、再生不良性貧血、ベータサラセミア、ブラックファン・ダイアモンド症候群、グロボイド細胞白質萎縮症、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、ハンター症候群、ハーラー症候群、レッシュ・ニャン症候群、大理石骨病）を患っている被験体、免疫系および他の疾患（例えば、自己免疫疾患、糖尿病、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス）の救援化学療法を受けている被験体が挙げられる。さらに、本発明の被験体としては、重度の好中球減少症および／または重度の血小板減少症および／または重度の貧血を示す被験体、例えば限定されないが、移植後の被験体、または固形腫瘍のための破壊的化学療法を受けている被験体、毒性、薬物誘発性または感染性造血不全（すなわち、ベンゼン誘導体、クロラムフェニコール、Ｂ１９パルボウイルスなど）を患っている患者、および骨髄異形成症候群、重度の免疫学的障害または先天性血液学的障害（中枢起源（すなわち、ファンコニ貧血）または末梢起源（すなわち、Ｇ６ＰＤＨ欠損症）にかかわらず）を患っている患者が挙げられる。

本明細書において引用される参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、本明細書において記載される特定の実施形態および図面（これらは、本発明の個々の態様の単なる例示を意図する）によって範囲を限定されず、機能的に等価な方法および構成要素は、本発明の範囲内である。本発明を例示する実施例は、決して本発明の範囲を限定するものではない。

Ｓｃａ１（幹細胞抗原１）、ＳＣＦ（幹細胞因子）、ＴＰＯ（トロンボポエチン）、ＦＧＦ−１（線維芽細胞成長因子１）、ＩＧＦＢＰ２（インスリン成長因子結合タンパク質２）。

実施例１：長期再構成能力を有するＨＳＣサブ集団のミトコンドリア膜電位シグネチャーの同定
テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）蛍光によって示されるミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）を使用して、以下のようにインビトロおよびインビボにおいてＨＳＣおよびＭＰＰの代謝状態を追跡した。

表現型によって定義されたＨＳＣおよび前駆細胞は、インビトロにおいて異なるΔΨｍを示す
表現型によって定義された造血幹細胞および前駆細胞集団について最も一般的に使用されている表面マーカーの組み合わせ（コミットしている前駆細胞、ＣＰ：ｃ−Ｋｉｔ＋；ＬＫＳ：Ｌｉｎ−ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋（すなわち、骨髄中のすべての多分化能性幹細胞および前駆細胞を含む集団）；短期ＨＳＣ：ＬＫＳ ＣＤ１５０＋ＣＤ３４＋（ＳＴ−ＨＳＣ）；長期ＨＳＣ：ＬＫＳ ＣＤ１５０＋ＣＤ３４−（ＬＴ−ＨＳＣ））によって、以下において定義される対応する抗体を使用することによって、ＨＳＣおよびそれらの密接に関連する子孫を分離した。細胞におけるＯＸＰＨＯＳのレベルと相関するミトコンドリア分極（Ｆｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ １４，２６４−２７１）を報告するために、以下において定義されるプロトコールにしたがって、ＴＭＲＭ（活性ミトコンドリアによって容易に隔離される細胞透過性色素）によって標識したそれらの表現型的な細胞について、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡法によって、ΔΨｍレベルを分析した。

フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）
Ｃ５７Ｂｌ／６ＪおよびＣ５７Ｂｌ／６Ｊ Ｌｙ５．１の破砕大腿骨および脛骨から、骨髄（ＢＭ）細胞を単離した。新鮮単離骨髄（ＢＭ）において、造血幹細胞および前駆細胞のフローサイトメトリー分析を実施した。細胞懸濁液を７０μｍ細胞ろ過器に通してろ過し、ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｅＢｉｏｓｃｅｎｃｅｓ）と共にインキュベートすることによって、赤血球細胞を除去した。Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、系統陽性細胞を除去した。幹細胞および前駆細胞に対する特異的抗体のパネルを用いて細胞懸濁液を染色し、ＢＤ ＬＳＲＩＩおよびＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩによってそれぞれ分析またはＦＡＣＳ選別した。

ミトコンドリア活性の分析
新鮮単離ＢＭ細胞を、２００ｎＭ ＴＭＲＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に３７℃において１時間インキュベートし、次いで、異なる造血幹細胞／前駆細胞区画に対する以下の特異的抗体を用いて染色した：ｃＫｉｔ（２Ｂ８）、Ｓｃａ１（Ｄ７）、ＣＤ１５０（ＴＣ−１５−１２Ｆ１２．２）、ＣＤ３４（ＲＡＭ３４）、ＣＤ４５．２（１０４）、ＣＤ４５．１（Ａ２０）、Ｇｒ１（ＲＢ６−８Ｃ５）、Ｆ４／８０（ＢＭ８）、ＣＤ１９（６Ｄ５）、ＣＤ３（１７Ａ２）、ＣＤ１６／ＣＤ３２（２．４Ｇ２）に対するラットｍＡｂ（これらは、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＢＤ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）から購入した）。ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、Ｌｙ−６Ｇ、Ｌｙ−６ＣおよびＴＥＲ−１１９に対するビオチン化ｍＡｂの混合物をｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＢＤ）として使用した。標識細胞をＦＡＣＳ選別し、またはフローサイトメトリーによって分析した。

共焦点イメージングの場合、ＬＴ−ＨＳＣ、ＳＴ−ＨＳＣ、ＭＰＰおよびコミットしている前駆細胞を選別し、付着性ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）コーティングガラススライド上に６時間置いた。次いで、２０ｎＭ ＴＭＲＭまたはＪＣ１（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を培地に追加し、Ｌｅｉｃａ ＳＰ５共焦点顕微鏡によって生存細胞の画像を取得した。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染色の場合、細胞を２００ｎＭ、３７℃において１時間インキュベートした。ＵＶレーザー（励起３５０ｎｍ、放出：４６０ｎｍ）を用いてフローサイトメトリーによって、ＮＡＤＨ自己蛍光を測定した。

フローサイトメトリー（図１Ａ）および顕微鏡法のリードアウト（図１Ｂ）によって示されているように、各集団は、異なるレベルのＴＭＲＭ強度を示し、最も原始的な集団から最もコミットしている集団に段階的に増加している：ΔΨｍは、ＬＴ−ＨＳＣ集団において最低であり（図１Ａ）、共焦点顕微鏡法によってわずかに検出可能になった（図１Ｂ）。

これらのデータは、最も原始的な静止ＨＳＣ集団において、ミトコンドリア代謝が限定的であり、ＲＯＳ産生によってもたらされる細胞損傷から、これらの珍しい長命の細胞を保護するための戦略である可能性が最も高いことを裏付けている。全く対照的に、非常に増殖性の造血前駆細胞は、ミトコンドリア代謝を増加させることによって、それらの高まるエネルギー要求を満たしている。

低いΔΨｍは、インビボにおいて長期血液再構成能力を有するＨＳＣサブ集団のみの特徴である
インビボ多系統血液再構成アッセイを使用して、表現型によって定義されたＬＫＳ（骨髄中のすべての多分化能性幹細胞および前駆細胞を含有する集団）、ＳＴ−およびＬＴ−ＨＳＣにおいて、長期幹細胞機能を報告可能なΔΨｍレベルの程度を試験した。

この目的のために、ＦＡＣＳによってＬＫＳサブ集団を単離し、低い（ＬＫＳ：ＴＭＲＭ^低）および高い（ＬＫＳ：ＴＭＲＭ^高）ΔΨｍレベルによって分けた。ＬＫＳ：ＴＭＲＭ^低のリードアウトの範囲は、約３０％低い集団であり、ＬＫＳ：ＴＭＲＭ^高のリードアウトの範囲は、約３０％高い集団である。致死的な放射線を照射したマウスへのこれら２つの表現型の移植を、以下において記載されているように、ダブルコンジェニック対立遺伝子系を使用して実施した。

移植
８５０ＲＡＤの致死的な放射線をＣ５７Ｂｌ／６ Ｌｙ５．２マウスに照射し、Ｃ５７Ｂｌ／６ Ｌｙ５．１マウス由来のドナー細胞、およびＣ５７Ｂｌ／６ Ｌｙ５．１／５．２マウス由来の競合細胞を移植した。ＬＫＳ移植において、１０００個のＬＫＳ（ＴＭＲＭ^低またはＴＭＲＭ^高）ドナー細胞を、２５０＊１０^３個の全ＢＭ競合細胞と一緒にレシピエントマウスに移植した。ＬＫＳ ＣＤ１５０＋ＣＤ３４−（「ＬＴ−ＨＳＣ」）およびＬＫＳ ＣＤ１５０＋ＣＤ３４＋（「ＳＴ−ＨＳＣ」）移植において、８０個のＬＴ−ＨＳＣ（ＴＭＲＭ^低またはＴＭＲＭ^高）または８０個のＳＴ−ＨＳＣ（ＴＭＲＭ^低またはＴＭＲＭ^高）を、２５０＊１０^３個の全ＢＭ競合細胞と一緒にレシピエントマウスに移植した。

４週間、８週間および１６週間の時点において、末梢血を採取して、ドナー由来細胞の再増殖単位（ＲＵ）およびそれらの分化状態を、フローサイトメトリー分析によって決定した。１ＲＵは、１００，０００個の競合骨髄細胞において見られる再増殖能力と同等である。

インビトロ培養ＬＴ−ＨＳＣの移植において、５日間培養した２００個のＬＴ−ＨＳＣの子孫を、それらのＴＭＲＭシグナル（ＴＭＲＭ^低またはＴＭＲＭ^高）に基づいてＦＡＣＳ選別し、２＊１０^６個のヘルパー細胞と一緒に移植した。ヘルパー細胞は、Ｓｃａ１およびＣＤ１５０陽性細胞が欠失しているＣ５７Ｂｌ／６ Ｌｙ５．１／５．２マウスのＢＭに由来するものであった（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。４週間、８週間および１６週間の時点において、末梢血を採取して、キメラ化の割合を決定した。造血のキメラ化は、幹細胞移植（ＳＣＴ）後の宿主におけるドナーおよびレシピエント細胞の数の尺度であり、これを末梢血細胞分析によって測定した。

ＣＦＳＥ−ＴＭＲＭ移植において、ＬＴ−ＨＳＣを、以下において記載されているように選別し、ＣＦＳＥについて染色した。２日間の培養期間の終了時において、１回の分裂を行った細胞子孫を、ＴＭＲＭによって染色し、ＴＭＲＭ^低およびＴＭＲＭ^高シグナルに基づいて再選別した。いずれかの１００個の細胞集団を、２＊１０^６個のヘルパー細胞と一緒に、各レシピエントマウスに注射した。４週間、８週間および１６週間の時点において、末梢血を採取して、キメラ化の割合を決定した。

二次移植：８５０ＲＡＤの致死的な放射線を二次レシピエントＣ５７Ｂｌ／６ Ｌｙ５．２マウスに照射し、一次レシピエント由来の３００万個の骨髄細胞を移植した。４週間および８週間の時点において、末梢血を採取して、キメラ化のレベルを決定した。

長期多系統血液再構成分析により、ＬＫＳ内において、低いΔΨｍを有する細胞（すなわち、ＬＫＳ：ＴＭＲＭ^低）のみが長期多系統再構成を示すことが示された（図２Ａ）。したがって、既存の表面マーカーレパートリーへの代謝マーカー（低いΔΨｍ）の追加は、主にＭＰＰを含有する不明確な集団（ＬＫＳ）から、長期再構成能力を有する細胞を精製することを可能にする。

同じ選別戦略を使用して、ＳＴ−ＨＳＣ、ＳＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^低およびＳＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^高を、それらの血液系再構成能力について比較したところ（図２Ｂ）、驚くべきことに、ＳＴ−ＨＳＣ集団内において、短期多系統再構成能力は、ほとんどＴＭＲＭ^低画分においてのみ限定されていた（図２Ｂ）。また、表現型によって定義されたＬＴ−ＨＳＣを、機能的に非常に異なる２つの集団に分けることができ、低いミトコンドリアの活性を有する集団（ＬＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^低、集団の約５５％に相当する）のみが長期多系統再構成能力を有していたのに対して、ＬＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^高細胞は、長期多系統再構成能力を全く有していなかった（図２Ｃ）。重要なことに、ヨウ化プロピジウム染色により、分析した４つの集団間において、生存率に関するいかなる差異も示されなかったので、生着の欠如が差示的な細胞死によって引き起こされた可能性は除外される。

これらのインビボデータは、表現型によって定義されたＨＳＣにおける顕著な機能的不均一性を明らかにしている。活性化ミトコンドリアを有するＬＴ−ＨＳＣ（すなわち、ＬＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^高）が、短期の場合においても血液を再構成しないという観察結果（図２Ｃ）は、これらの細胞が「真の」ＬＴ−ＨＳＣに階層的に関係しない可能性があることを示唆している。代わりに、それらは、同じ免疫表現において実施された最近のインビボ単一細胞多系統再構成アッセイによって示されているように（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｅｌｌ １５４，１１１２−１１２６）、長期系統制限前駆細胞を生じさせるＨＳＣに相当する可能性がある。ＬＴ−ＨＳＣ区画内のＨＳＣ ＴＭＲＭ^高細胞およびＴＭＲＭ^高細胞が異なるレベルのこのような系統偏向細胞型を含有するかを試験するために、巨核球の機能的マーカーとしてＣＤ４１を使用して、２つの表現型をさらに分けた。以前の研究により、ＨＳＣ区画におけるＣＤ４１発現細胞は、強い骨髄偏向（Ｇｅｋａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｂｌｏｏｄ １２１，４４６３−４４７２）およびごく短期または中期の再増殖活性（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３、前掲）を有することが示されている。今回の実験において、細胞の大部分がＣＤ４１陽性であるＬＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^高細胞と全く対照的に、ＬＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^低細胞は、ＣＤ４１陰性の細胞の約７０％を含む。

したがって、観察された機能的不均一性は、ＣＤ４１＋巨核球前駆細胞（これは、機能性ＬＴ−ＨＳＣと比較して異なるΔΨｍレベルを有する可能性がある）の存在によって少なくとも部分的に説明することができる。

トランスクリプトーム分析は、幹細胞性の喪失をミトコンドリア経路の誘導と関連付ける
次に、新たに同定した４つのＨＳＣ表現型を研究して、以下において記載されているように、それらの中において差示的に発現している遺伝子および経路を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅ １．０ ＳＴ ａｒｒａｙｓを使用して同定した。遺伝子オントロジー分析により、最も調節された遺伝子は、細胞周期およびミトコンドリア経路に対応することが示された。両経路は、ＬＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^低およびＳＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^高細胞間において全く反対方向に差示的にレギュレートされている。これらの経路は、ほとんどの幹様集団においてダウンレギュレートされている一方、それらは、最も非原始的なＨＳＣ区画において増加している。２つの中間集団（ＬＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^高およびＳＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^低）は、細胞周期およびミトコンドリア活性遺伝子について、ほぼ同等のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーション活性を示している。特に、すべての他の集団と全く対照的に、インビボにおいて長期多系統再構成能力を有する集団に対応するＬＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^低細胞は、クエン酸（またはトリカルボン酸、ＴＣＡ）の非常に低い発現レベルを特徴とする。ミトコンドリアのＴＣＡサイクルは、ＯＸＰＨＯＳに密接に関連する。したがって、これらのデータは、ほとんどの自己複製ＨＳＣが、おそらくはＲＯＳによってもたらされる細胞損傷からそれらを保護するために、ＴＣＡサイクルを弱める機構を有することを示唆している。

骨髄中の静止および周期ＨＳＣは、同様のΔΨｍプロファイルを有する
上記において示されている低いΔΨｍとインビボ機能との間の相関関係によれば（図２）、生来の骨髄において、静止および周期ＬＴ−ＨＳＣは、同様のレベルのミトコンドリア活性を有する可能性がある（すなわち、嫌気的解糖は、細胞周期の状態とは無関係の幹細胞性の特徴であろう）。

この仮説を検証するために、以下において記載されているように、Ｋｉ６７およびヘキスト染色を使用して、低いおよび高いΔΨｍに分けた新鮮単離ＨＳＣにおいて、細胞周期分析を実施した。細胞周期染色は、ＴＭＲＭに基づくアッセイと相性が悪い細胞固定を伴うので、ΔΨｍのマーカーとしてＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄを使用し（Ｓｉｍｓｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ７，３８０−３９０）、ＴＭＲＭと比較可能な方法によって幹細胞および前駆細胞におけるΔΨｍを標識するために、これをコントロールした。ホメオスタシス条件下において、静止状態（細胞の約７０％に相当する）および周期ＨＳＣは、区別不可能なΔΨｍプロファイルを有する。

インビボにおいて静止を直接終了させるために、細胞単離の４８時間前および２４時間前に行ったＩＦＮ−αの皮下注射によるマウスのインターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）処理（Ｅｓｓｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｎａｔｕｒｅ ４５８，９０４−９０８）を使用して活性化したＨＳＣにおいて、同様の分析を実施した。対照マウスと比較して、ＩＦＮ−α処理は、以前のデータ（Ｅｓｓｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００９、前掲）と一致して、周期（Ｋｉ６７^＋）ＨＳＣの数の約３０〜５０％の有意な増加をもたらした。しかしながら、ホメオスタシス条件下と同様に、静止および周期ＨＳＣのΔΨｍレベルに有意差はなかった。

これらのデータは、インビボにおいて、低いΔΨｍが静止ＬＴ−ＨＳＣの状態のユニークな特徴ではないが、それらの細胞周期の状態とは無関係の機能性ＨＳＣの指標であると思われることを示している。

細胞周期染色
製造業者の説明書に従ってＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ ｐｌｕｓ ｋｉｔ（ＢＤ）を使用して、選別したＨＳＣを固定および透過処理した。次いで、固定細胞を、ＦＩＴＣ Ｋｉ６７（ＢＤ）によって４℃において一晩染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって１０分間染色した。

ＨＳＣのインビボ活性化
静止を直接終了させるために、公開されているプロトコール（Ｅｓｓｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００９、前掲）にしたがって、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）処理によって、ＨＳＣを活性化した。簡潔に言えば、骨髄抽出の４８時間前および２４時間前に、１０，０００ＵのＩＦＮ−α（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにおいて皮下注射を行った。等量のビヒクル（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ）を対照マウスに注射した。

実施例２：インビトロにおけるＨＳＣの自己複製分裂の特徴としての低いミトコンドリア膜電位
低いΔΨｍが幹細胞性の機能的識別因子であることが立証され（図２Ｂ、Ｃ）、インビボにおける静止および周期ＬＴ−ＨＳＣのΔΨｍレベルが同程度であることが明らかになったので、ΔΨｍレベルが、不均一なバルク培養物中の自己複製ＨＳＣと分化ＨＳＣとを識別するかを研究した（図３）。ＨＳＣをインビトロにおいて培養する場合、表面マーカーの複合的な発現は、放射線照射したマウスに再移植した場合にはそれらのインビボ機能を予測することができない（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｌｏｏｄ １０５，４３１４−４３２０）。実際、現在のところ、ＬＴ−ＨＳＣとそれらの最初期子孫（これは、限定的な多系統血液再構成能力を既に有する）との区別を可能にする戦略はない。

ＴＭＲＭに基づくリードアウトを使用して、自己複製の分裂と分化の分裂とを区別することができるかを試験するために、ＣＤ４５．１ドナーマウス由来の２００個のＬＴ−ＨＳＣを、表面マーカー発現（Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ｃＫｉｔ＋、ＣＤ１５０＋およびＣＤ３４−）に基づいて単離し、Ｈｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６，１６２８−１６３５において記載されているように、自己複製因子アンジオポエチン様タンパク質、インスリン様成長因子結合タンパク質２、幹細胞因子、線維芽細胞成長因子１およびトロンボポエチンのカクテルを含有する無血清培地中において、以下において記載されているようにインビトロにおいて増殖させた（図３Ａ）。５日間の細胞増殖後に、ＴＭＲＭ^低およびＴＭＲＭ^高表現型に基づいて、細胞を再選別し、上記において記載されているように、致死的な放射線を照射したＣＤ４５．２レシピエントマウスに移植した。上記実施例１において示されているように、低いＴＭＲＭ蛍光を使用して機能性ＨＳＣを直接単離した結果（ｐｒｅｓｕｌｔｓ）と一致して、低いＴＭＲＭシグナルはまた、培養ＨＳＣの長期血液再構成能力の予測指標であった（図３Ｂ）。培養ＨＳＣを移植した４カ月後におけるＦＡＣＳ分析による末梢血キメラ化の分析により、ＴＭＲＭ^低細胞は、高いＴＭＲＭシグナルを有していた細胞（ＴＭＲＭ^高細胞）と比較して有意に高い長期多系統血液再構成レベルを誘導することが示された。これにより、骨髄由来の新鮮単離ＨＳＣと同じ代謝的特徴に基づいて、培養物中の自己複製ＨＳＣを検出することができることが示唆された（図２）。

しかしながら、培養ＨＳＣのごく一部は、長時間の培養後においても、依然として静止状態であることによって、それらの幹細胞能力を維持することができることが公知であるので（例えば、Ｌｕｔｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）１，５９−６９）、図３Ｂにおいて見られるＴＭＲＭ^低細胞からの再構成は、非分裂ＨＳＣによるものである可能性がある。この可能性を排除し、これらのバルク培養物中の自己複製細胞を明確に同定して、母ＨＳＣが行った細胞分裂の正確な数を追跡するために、以下において記載されているように、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（これは、細胞分裂ごとに希釈される生存細胞透過性色素であり、ＣＦＳＥ強度は各分裂によって約５０％減少する）によって、ＬＴ−ＨＳＣを均一に標識した。これらの手段によって、増殖培養の２日後に正確に１回の分裂を受けた培養ＨＳＣ娘細胞をＦＡＣＳによって選別し、それらをＴＭＲＭ^低およびＴＭＲＭ^高サブ集団にさらに分けた。各集団の１００個の細胞を、致死的な放射線を照射したマウスに移植し、その後、長期多系統再構成を最大１６週間分析した。長期多系統再構成はやはり、ＴＭＲＭ^低サブ集団に限定されていた（図３Ｃ）。また、二次移植により、ＴＭＲＭ^低画分の長期生着が示された（図３Ｃ）。最も重要なことに、これらのデータは、低いΔΨｍが、インビボにおいて静止ＬＴ−ＨＳＣの特徴であるだけではなく、自己複製細胞分裂を受けた活性化幹細胞の特徴でもあることを示している。本発明者らの知る限り、これは、インビトロにおけるＨＳＣの自己複製分裂に関する最初のリードアウトであり、一般に使用されている細胞表面レパートリーは、実証されているように、このような細胞を同定することができない。

ＨＳＣ培養
Ｕ−ボトム９６ウェルプレート中、「増殖」条件下において、ＨＳＣを５日間培養した。１０μｇ／ｍｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、２ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ３リガンド（Ｒ＆Ｄ）、２０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５００ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦＢＰ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１００ｎｇ／ｍｌ ＡｎｇＬ−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ（Ｓｉｇｍａ）中において、培養物を維持した。培養期間の終了時に、細胞をＴＭＲＭによって染色し、フローサイトメトリーによって分析または選別した。分化を誘導するために、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した基礎培地（１００ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦおよび２ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ３リガンドを含有するＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ）中において、ＨＳＣを培養した。

ＣＦＳＥ染色
選別した新鮮ＬＴ−ＨＳＣを、１：４００ ＣＦＳＥストック溶液（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；ＣＦＳＥ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ）と共に３７℃において２０分間インキュベートした。細胞をペレット化し、１０％ＦＢＳを含有する１ｍｌのＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ（Ｓｉｇｍａ）に３７℃において２０分間再懸濁した。その後、細胞を、１ｍｌのＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ（Ｓｉｇｍａ）によって２回洗浄し、培養液に入れた。

実施例３：分化条件下におけるＨＳＣ自己複製の保存
細胞のミトコンドリア活性レベルの調節を介したＨＳＣ運命の調節を調査した。具体的には、ＨＳＣを非常に増殖性のＭＰＰに迅速に分化させるであろう培養条件を選択し、幹細胞性の維持に対するΔΨｍ確立阻止の効果を調査した。その目的のために、ミトコンドリア内膜を透過処理し、その電位を破壊するトリフルオロカルボニルシアニドフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）を、ＡＴＰ生成からの電子伝達の脱共役剤として使用した。実際、フローサイトメトリー分析により、ＦＣＣＰによるΔΨｍの破壊は、培養ＨＳＣにおけるＮＡＤＨレベルの低下をもたらしたことが示された。

最初の一連の実験において、定量的クローン分化アッセイ（上記において記載されている短期および長期コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイ）を使用して、ミトコンドリア脱共役が、造血幹細胞および前駆細胞のコロニー形成挙動および効率にどの程度影響を与え得るかを試験した（図４Ａ〜Ｃ）。ＦＣＣＰの存在下、分化条件下において２日間培養した１５０００個の全骨髄細胞は、コロニーの総数の顕著な減少だけではなく、最も原始的な前駆細胞のみに由来するクローン性多系統コロニー（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ：コロニー形成単位−顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球）の割合の増加を示した（図４Ａ、右のパネル）。対照的に、よりコミットしている前駆細胞（例えば、マクロファージコロニー、Ｍ、顆粒球／マクロファージコロニー、ＧＭ）に由来するコロニーの総数およびコロニーの割合は顕著に減少したが（図４Ａ、それぞれ左および中央のパネル）、これは、ＦＣＣＰが、分化よりも自己複製を強制することによってコロニー形成を遅延させる可能性があることを示唆している。同様に、ＦＣＣＰの存在下または非存在下、分化条件下において、１００個のＬＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^低細胞を最初に２日間培養したところ（図４Ｂ）、ＦＣＣＰと共に培養した場合、よりコミットしている前駆細胞（Ｍｋ、Ｇ、ＭおよびＧＭ）に由来するコロニーの頻度の顕著な減少（図４Ｂ、左および中央のパネル）と、それと同時に、最も原始的な細胞に由来するコロニー（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の増加（図４Ｂ、右のパネル）が観察された。これらの実験により、分化誘導中のミトコンドリア脱共役は、ＨＳＣ運命を迅速なコミットメントから自己複製にスキューすることが強く示唆された。各実験条件（＋／−ＦＣＣＰ）の写真は、ミトコンドリア脱共役の場合、目視可能な巨大ＧＥＭＭコロニー（白色）を示している。

これらの結果をさらに裏付けるために、長期血液再構成アッセイを行って、ＦＣＣＰの存在下または非存在下、上記において記載されている分化条件（ＳＣＦ、Ｆｌｔ３、ＩＬ−３およびＩＬ−６）下において、ＬＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^低細胞を５日間培養し、すべての子孫を、以下において記載されているように、２＊１０^６個のヘルパー細胞と一緒に、致死的な放射線を照射したマウスに移植した。驚くべきことに、ＦＣＣＰ曝露細胞は、レシピエントマウスにおいて、劇的に高いレベルの長期多系統血液再構成を示した（図４Ｃ）。重要なことに、ＣＦＳＥによってＨＳＣを標識し、それらの分裂経過を追跡したところ、培養物中のすべての細胞が迅速に数回分裂するので、この効果が、ＦＣＣＰ投与による静止誘導によるものであるとは考えられない。したがって、ＯＸＰＨＯＳを遮断することによって、通常は迅速に分化するであろうＨＳＣを、自己複製分裂を受けるように強制することができる。上記インビボデータと一致して、これらのデータは、ＨＳＣの自己複製分裂がＯＸＰＨＯＳを必要とせず、したがって、ミトコンドリア非依存性プロセスを介して細胞によって実行され得ることを示している。

要するに、これらのデータは、表現型によって定義された各造血幹細胞および前駆細胞区画が、非常に異なるΔΨｍレベルを有することを示している。インビボ多系統血液再構成アッセイは、各集団内において、機能的な短期および長期自己複製活性が、より低いΔΨｍを有するサブ集団に正確に限定されていることを示している。興味深いことに、細胞周期によって分けたＨＳＣのΔΨｍレベルの比較は、ホメオスタシス中および急性ストレス下において、静止および周期ＨＳＣが、それらのΔΨｍレベルに基づいて同様の代謝プロファイルを有することを示している。これは、ＨＳＣの異なる代謝プログラムがそれらの静止状態に限定されず、むしろそれらの運命選択の指標であることを示している。実際、インビトロにおける不均一なＨＳＣ増殖培養において、分裂追跡アッセイは、活性化ミトコンドリアを有する分化細胞と全く対照的に、自己複製ＨＳＣを、それらの低いΔΨｍによって認識することができることを示している。驚くべきことに、電子伝達鎖の化学的脱共役は、通常は迅速な分化を誘導する培養条件下においても、ＨＳＣの自己複製を実施する。

したがって、低いミトコンドリア膜電位ΔΨｍは、ＨＳＣの強力な機能的マーカーであることが示されただけではなく、ＨＳＣ培養および治療のための手段を提供するためにこのパラメータに働き掛けることによって幹細胞運命を操作することができることが本明細書において明らかになった。

非脱共役剤ＦＣＣＰに曝露した培養ＨＳＣの移植
５μＭ ＦＣＣＰの存在下または非存在下、分化誘導条件下において、１００個のＬＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^低細胞を５日間培養した。子孫細胞を、２＊１０^６個のヘルパー細胞と一緒に、致死的な放射線を照射したレシピエントマウスに移植した。上記において記載されているように、４週間、８週間および１２週間および１６週間の時点において、末梢血を採取して、キメラ化のレベルを決定した。

ＨＳＣ培養
いくつかの実験において、５μＭまたは１０μＭカルボニルシアニド４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）（Ｓｉｇｍａ）を培地に追加した。粉末を濃度１０ｍＭにおいてエタノールに溶解することによって、ＦＣＣＰストック溶液を調製した。

これらのデータはすべて、ミトコンドリア代謝に基づいて、造血幹細胞運命を予測および指令する新規アプローチを裏付けている。実際、それらは、ＨＳＣおよびそれらの子孫を精製するために一般的に使用される公知の表面マーカーパネルが、異なる幹細胞能力を有する非常に不均一な細胞集団を単離することを示しており、これは、幹細胞運命の機構を研究する際に、およびこれらの珍しい細胞の臨床的拡大の戦略を改善する際に問題である。

ミトコンドリア活性に基づくリードアウト（すなわち、ミトコンドリア膜電位ΔΨｍ）を既存の表面マーカーレパートリーに追加することによって、これらのデータは、機能性幹細胞における幹細胞プールを濃縮すること、および多系統再構成を欠く細胞集団（ＬＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^高）を検出することが可能であることを示している。

したがって、ΔΨｍは、ＨＳＣの長期多系統血液再構成の強力な予測マーカーとして機能し、さらに、生きている自己複製ＨＳＣの特徴である。また、ＦＣＣＰなどの脱共役剤を用いた処理によるミトコンドリア活性の調節は、分化条件下において、ＨＳＣ運命をインビトロにおいて再指令することができる。これらの結果は、ＨＳＣ運命決定におけるミトコンドリア代謝の中心的役割の証拠を提供し、ミトコンドリア代謝を介したエクスビボ増殖およびＨＳＣ運命の治療操作のための新規手段を示唆している。

実施例４：マウス骨髄中の造血前駆細胞区画の増殖に対するミトコンドリア膜電位低下剤の効果
ミトコンドリア膜電位を低下させることができる薬剤（ＮＲ）による短期（１週間）および長期（４週間）治療を、以下において記載されているように、マウスにおいて、骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞プールサイズについて試験した。

ＢＭサンプルのフローサイトメトリー分析により、短期および長期治療の両方において、造血前駆細胞区画の増殖が示された（図５Ａ）。治療１週間後においては、すべての造血前駆細胞区画において、細胞充実性の増加が観察されるのに対して、治療４週間後においては、短期区画（ＳＴ−ＨＳＣ）のみが増殖している。驚くべきことに、前駆細胞の増殖は、ＨＳＣプールの減少を伴わなかった（図５Ａ、Ｂ）。これは、ＮＲの効果が造血前駆細胞に限定されていたこと、または全体的な幹細胞数を変化させないより高レベルの非対称性自己複製分裂を促進することによって、ＨＳＣ運命が影響を受けたことを示している可能性がある。

以前に記載されているように（Ｖａｎｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ，２１１（８）：１５３５−４３）、１カ月間ＮＲ治療したマウス由来のＢＭは、骨髄移植アッセイによって評価した場合に生着の利点を示さないが、これは、ＮＲが幹細胞区画に直接影響を与えないことを示している。したがって、ＮＲ治療がＬＴ−ＨＳＣ集団（これは、短期ＨＳＣおよびそれらの子孫を増加させる場合に問題となることが多い）を枯渇させることは予想されない。

製造業者の説明書（Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ（商標），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）にしたがって、コロニー形成機能アッセイ（「ＣＦＵ」と称される）を実施し、特に短期治療マウスのＢＭにおいて、造血前駆細胞区画の増殖を確認した（図５Ｃ）。コロニーの増加は、Ｍｋ系統において最も顕著であった。

実施例５：マウス骨髄中の造血前駆細胞区画の増殖に対するミトコンドリア膜電位低下剤（ニコチン酸（ＮＡ））の効果
ＮＡ（Ａ、Ｂ）（これはＮＲの前駆体であるが、実際には、ＨＳＣにおけるミトコンドリア膜電位を有意に低下させることができない薬剤である（実施例９を参照のこと））による短期（１週間）治療を、上記において記載されているように、マウスにおいて試験して、骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞プールサイズの変化を測定した。ＢＭサンプルのフローサイトメトリー分析により、前駆細胞および幹細胞区画のいかなる有意な変化も示されなかった（図６Ａ１〜Ａ３）。また、細胞周期分析により、治療および未治療条件間においていかなる有意差も示されなかったが（図６Ｂ１〜Ｂ２）、これは、ＮＡの効果がＮＲと比較して差示的であることを裏付けている。

さらに、同じ条件下において、ニコチンアミド（ＮＡＭ）を与えたマウスの骨髄は、造血前駆細胞区画の有意な増殖を示さなかった。

実施例６：移植後のマウス（用量制限移植マウス）の生存および血液回復に対するミトコンドリア膜電位の低下の効果
分化した造血細胞の前駆区画への依存性を考慮して、移植マウスの血液回復および生存の改善における本発明のミトコンドリア膜電位低下剤（特に、ＮＲ）の効果を評価した。プロトコールのタイムラインは、図７Ａ１に示されている。移植後１３日目において末梢血の計数を開始し、３日または４日ごとにそれを反復した。

驚くべきことに、ＮＲ治療マウス（四角形）の８０％は生存するのに対して、すべての未治療マウス（点）は１カ月以内に死亡した（図７Ａ１）。さらに、ＮＲ治療マウスは、好中球および血小板がより迅速に回復した（図７Ｂ１および７Ｂ２）。

好中球は、患者の感染症に対する最初の障壁を構成し、移植後の患者が病院から退院することを可能にする最も重要な決定因子であるので、好中球減少症の終了は、ポジティブな患者転帰の重要な因子である。ＮＲによって治療したマウスは、平均して対照の１週間前に、好中球減少症を終了した（好中球＞０．５Ｇ／ｌ）（図７Ｂ２）。加えて、重度の血小板減少症（血小板数＞１００Ｇ／ｌ）からの回復は、ＮＲ治療マウスにおいては、対照マウスと比べて平均して１０日間早く起こる（図７Ｂ１）。

したがって、ＮＲ治療は、移植状況において、生存および血液回復を改善する。

実施例７：インビトロにおけるＨＳＣのミトコンドリア活性および分裂同調性に対するニコチンアミドリボシドの効果
ＪＣ１（Ｍａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ，９（１０），２００８−１７）およびＴＭＲＭ色素（Ｖａｎｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５、準備中；Ｎａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ，４６８，６５３−６５８）を使用してミトコンドリア活性を測定することによって、ＨＳＣのミトコンドリア活性に対するＮＲの効果を評価した。ＮＲに曝露したＨＳＣは、ミトコンドリア活性が大きく低下している（図８Ａ）。

また、分裂ＨＳＣにおいて、ＮＲは、低いミトコンドリア活性を有する細胞の割合を高めたが（図８Ｂ１〜Ｂ２）、これは、自己複製活性の増加を示している。さらに、以前に記載されているように（Ｖａｎｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２、前掲）、単一細胞レベルにおいて、細胞増殖動態に対するＮＲの効果を決定した。ＮＲに曝露したＨＳＣは、増殖動態の大きな変化を有しないが、それらは、非同調分裂の有意な増加を示す（図８Ｃ）。

これらの結果は、ＮＲがＨＳＣ運命を非対称分裂に向かわせた可能性を示唆している。

総合すると、これらの結果は、食品を介した本発明のミトコンドリア膜電位低下剤による治療（例えば、ＮＲ治療）が、骨髄中の造血前駆細胞プールの増殖をもたらし、用量制限細胞移植スキームにおいて試験した場合、生存の劇的な改善をもたらすことを示している。重要なことに、ＨＳＣプールサイズは、ＮＲ投与によって影響を受なかったが、これは、このような治療における幹細胞枯渇のリスクが最小限であることを示唆している。

したがって、これらのデータは、本発明のミトコンドリア膜電位低下剤（例えば、ＮＲ）による治療が、血液回復を高めるために、および移植患者、または固形腫瘍もしくは重度の免疫学的障害のための破壊的化学療法を受けている者のＨＳＣプールを維持するために有用であろうことを裏付けている。

マウス
Ｃ５７Ｂｌ／６ＪおよびＣ５７Ｂｌ／６Ｊ Ｌｙ５．１をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入し、マイクロアイソレーターケージにおいて維持した。滅菌されている飼料、水および寝具をマウスに継続的に提供した。ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）（ＳｔｒａｓｂｏｕｒｇのＮｏｖａｌｉｘがトリフラート塩としてカスタム合成したもの）を、マウス０．４ｇ／Ｋｇの飼料によって与え、マウスをそれぞれ１週間および４週間治療した。

生存および血液回復
８５０ＲＡＤの致死的な放射線をＣ５７Ｂｌ／６ Ｌｙ５．２マウスに照射し、Ｃ５７Ｂｌ／６ Ｌｙ５．１マウス由来の全ＢＭドナー細胞（７０＊１０^３個および１５０＊１０^３個）を移植した。マウスを毎日追跡して、それらの一般健康状態を評価した。図２Ａのプロトコールタイムラインに示されているように、移植１３日後から開始して３日ごとに、白血球および赤血球の回復について、末梢血を分析した。脱共役剤ＦＣＣＰに曝露して培養したＨＳＣの移植において、１００個のＬＴ−ＨＳＣ：ＴＭＲＭ^低細胞を、５μＭ ＦＣＣＰの存在下または非存在下、分化誘導条件下において５日間培養した。細胞子孫を、２＊１０^６個のヘルパー細胞と一緒に、致死的な放射線を照射したレシピエントマウスに移植した。４週間、８週間および１２週間の時点において、末梢血を採取して、キメラ化のレベルを決定した。

単一細胞周期動態の分析
単一細胞レベルにおいてＨＳＣの挙動を追跡するために、マイクロウェルアレイによってコーティングした９６ウェルプレートに細胞を直接選別した。プレーティング時に単一細胞を含有するマイクロウェルを、経時的顕微鏡法によって追跡した。温度およびＣＯ_２制御のインキュベーターチャンバー室を備えるＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して、増殖動態を評価した。ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｖｉｓｉｔｒｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の画像分析ソフトウェアを使用して、画像を、５日間にわたって３時間ごとに自動的に取得した。

ヒドロゲルマイクロウェルアレイの生産
記載されているように（Ｋｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２５（１５）：８７７４−９；Ｌｕｔｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ），１（１）：５９−６９）、９６ウェルプレートの個々のウェル内において、ヒドロゲルマイクロウェルアレイを直接キャスティングした。簡潔に言えば、チオールおよびビニルスルホン基によって末端を官能化したマルチアームポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の化学量論的平衡水溶液を混合し、ＰＤＭＳマイクロスタンプに対して成形した。架橋の完了後、スタンプを除去し、ヒドロゲルマイクロウェルアレイを４℃において一晩水和させ、次いで、紫外線によって滅菌した。

統計
スチューデントｔ検定、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニの多重比較検定およびマンホイットニー検定によって、データを統計的に分析した。

実施例８：ＨＳＣ回復におけるニコチンアミドリボシドの効果の比較
図９に示されているように、および以下において記載されているように、ＮＲの効果を、ニコチン酸（ＮＡ）およびアシピモックス（臨床的に承認されたニコチン酸誘導体）のものと比較した。

ＨＩＳ（ヒト免疫系マウス）の作製：
マウス系統ＮＯＤ Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（００５５５７）（これは、ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪバックグラウンド（多くの先天免疫欠損を付与する）、重症複合免疫不全突然変異（ＳＣＩＤ）およびＩＬ２受容体ガンマ鎖欠損（これは、サイトカインシグナル伝達を無効化する）の特徴を併せ持つ突然変異体マウスに対応する）であるＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、交配させ、治療し、室内の無菌条件下において維持した。１Ｇｙを新生ＮＳＧマウスに照射し、６時間後に、１０ｅ６個のヒトＣＤ３４ ＨＳＣ（動員血液由来の精製ＣＤ３４＋、Ｃｅｌｌｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ＧｍｂＨ，Ｔｒｏｉｓｄｏｒｆ，ＤＥ）を肝内（ＩＨ）注射した。１２週間後に、ヒト再構成のレベル（ヒトＣＤ４５＋細胞の％）を、尾静脈血液サンプルのＦＡＣＳ染色によって分析した。再構成のレベルに基づいて、マウスを、マウス各５匹の２つの比較可能なコホートに再分類した。翌日から、上記において示されているように、ＮＡまたはアシピモックスによって治療した群（ｎ＝マウス１０〜１２匹／群）と比較して、ＮＲを補充した低脂肪食を一方のコホートに与え、対照食を他方のコホートに与えた。７日後に、尾静脈血をＥＤＴＡチューブに採取し、マウスを屠殺した。Ｃ５７ＢＬ６について記載されているように、骨髄細胞を採取し、血液および骨髄細胞の両方を染色し、記載されているように、ヒト系統特異的抗体のパネルについて分析した。

ＮＲによって治療したマウスは、増殖したＳＴ−ＨＳＣ区画を有するのに対して、ＮＲと対照的に、ニコチン酸（ＮＡ）によって１週間治療したマウスは、フローサイトメトリー分析によって示されているように、最も原始的な造血幹細胞の数の有意差を示さない（図９Ａ）。コロニー形成アッセイ（ＣＦＵ）による機能分析は、ＮＲによって治療したマウス由来のＢＭは、増殖した前駆細胞集団を有するのに対して、ＮＡによって治療したマウス由来のＢＭは、総および骨髄コロニー間の有意差を示さず、巨核球（ＭｋＥ）コロニーの減少さえ示さないことを示すことによって（図９Ｂ）、これを非常に明確に裏付けている（図９Ｂ）。

ＮＲ治療マウス由来のＢＭを移植したマウスは、より高いＳＴ−ＨＳＣ活性を示すのに対して、アシピモックスによって治療したマウスは、対照（ｃｔｒｌ）群と比較して短期ＨＳＣ活性の有意差を示さない（図９Ｃ）。ＮＲを与えたマウスは、対照よりも迅速な好中球減少症および血小板減少症の終了を示すのに対して、驚くべきことに、アシピモックスによって治療した移植後マウスの血液回復は、特により遅い血小板および顆粒球の回復を示しており（図９Ｄ）、したがって、ＮＲによって治療したマウスによって観察されたものとは反対の効果を示している。

ＨＳＣ回復におけるＮＲの効果からヒト組織について推定することができるかも試験した。マウスのデータと一致して、ＮＲを補充した食餌を１週間与えたヒト化マウス（図１０Ａ）は、リンパ球産生の有意な増加（図１０Ｂ）および単球産生の増加傾向（図１１）によって反映されているように、ヒト造血が増加している。残念なことに、ヒト顆粒球産生は、ヒト化マウスにおいて測定不可能である。

実施例９：ＨＳＣ区画における薬剤の膜電位低下能力の試験
ＨＳＣ区画における薬剤の膜電位低下能力を、異なる方法によってアッセイした。

インビトロアッセイ
ＨＳＣミトコンドリア活性に対する薬剤の効果を、上記実施例７において記載されているように、ミトコンドリア活性を測定することによって評価した。

このアッセイにおいて、ＮＲは、図８Ｂに示されているように、対照条件と比較して、低いミトコンドリア活性を維持するＨＳＣ娘の割合を実質的に２倍（例えば、約５％〜約１０％の増加）にすることができ、反対に、高いミトコンドリア活性を有する細胞の割合を半分に減少させる。

インビボアッセイ
インビボにおいてミトコンドリア活性を測定することによって、ＨＳＣミトコンドリア活性に対する薬剤の効果を評価した：化合物を与えたマウス由来の新鮮単離ＨＳＣをＴＭＲＭによって染色し、フローサイトメトリーによって分析した。

図１２に示されているように、ＮＡＲは、低いミトコンドリア活性を有する短期ＨＳＣの数を非常に有意に押し上げることができたのに対して（図１２Ａ〜Ｂ）、ＮＡは押し上げることができなかった（図１２Ｃ〜Ｄ）。

同じ条件下において、ＮＡＭ治療もまた、ＨＳＣにおけるミトコンドリア膜電位を有意に低下させることができず、したがってこれは、ＨＳＣにおける薬剤（例えば、ＮＲ）のミトコンドリア膜電位低下能力が、おそらくは非対称分裂からのＬＴ−ＨＳＣレベルにおける代謝運命の再プログラミングから生じるＬＴ−ＨＳＣプールの維持能力およびＳＴ−ＨＳＣプールの増殖誘導能力に関連することを裏付けている。

要するに、これらの結果は、ＨＳＣ区画（ＬＴおよびＳＴ−ＨＳＣ区画の両方）における膜電位を有意に低下させることができる薬剤（例えば、ＮＲ）が、特に経口補給を介して、移植後の重度の好中球減少症および血小板減少症の時間を有意に短縮するだけではなく、マウスおよびヒト細胞の両方においてリンパ球再構成を増強することによって、ＨＳＣ枯渇を伴わずに機能性前駆細胞の増殖を誘導し、それにより、生存を劇的に改善し、マウスＨＳＣ移植後の血液回復を促進することができるという主張を裏付けている。これらの結果は、巨核球形成の非常に効率的な増強に基づく難治性特発性血小板減少性紫斑病の治療のために、破壊的化学療法（ＨＳＣ移植を含む）後の骨髄形成不全症において、または自己免疫性血球減少症との関連において、インビボ三系統造血刺激を媒介するこれらの薬剤（特に、ＮＲ）の臨床応用可能性を解明する。

さらに、ＮＲ補充が、他の組織におけるその効果とは反対に、ミトコンドリア活性を最終的に減少させるという事実は驚くべきものである。

Claims (26)

1. 対照血球レベルと比較した血球レベルの低下の予防および／または治療に用いられる、ミトコンドリア膜電位低下剤。
2. 該血球レベルの低下が、重度の好中球減少症および／または重度の血小板減少症である、請求項１に記載の用途のためのミトコンドリア膜電位低下剤。
3. 経口投与される、請求項１または２に記載の用途のためのミトコンドリア膜電位低下剤。
4. 非経口投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の用途のためのミトコンドリア膜電位低下剤。
5. ニコチンアミドリボシド、ナイアシン、Ｎ−ホルミルキヌレニン、キノリン酸、ニコチンアミドリボシドキナーゼアクチベーター、ニコチンアミドモノヌクレオチドおよびトリプトファンから選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の用途のためのミトコンドリア膜電位低下剤。
6. ニコチンアミドリボシドである、請求項１から５のいずれか一項に記載の用途のためのミトコンドリア膜電位低下剤。
7. エクスビボで造血幹細胞を増殖するための方法であって、
   ａ）細胞増殖培養培地中にあるＨＳＣサンプルを用意する工程と、
   ｂ）前記ＨＳＣサンプルから、低いミトコンドリア膜電位を特徴とするＨＳＣ画分を、単離ＨＳＣプールに単離する工程と、
   ｃ）工程ａ）で用意したＨＳＣサンプル、または前記ｂ）で単離したＨＳＣプールを、ミトコンドリア膜電位低下剤と接触させる工程と
   を含んでなる、方法。
8. 工程ｃ）において得られたＨＳＣサンプルが、長期多系統血液再構成能力を有する機能性幹細胞が富化されてなるものである、請求項７に記載の方法。
9. 前記ＨＳＣサンプルが骨髄サンプルおよび／または骨髄細胞調製物である、請求項７または８に記載の方法。
10. 前記ミトコンドリア膜電位低下剤が、以下の群：２，４ジ−ニトロフェノール、カルボニルシアニド４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン、カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラジン、２−フルオロフェニル）｛６−［（２−フルオロフェニル）アミノ］（１，２，５−オキサジアゾロ［３，４−ｅ］ピラジン−５−イル）｝アミンおよび４，５，６，７−テトラクロロ−２−トリフルオロメチルベンズイミダゾールから選択される、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記ミトコンドリア膜電位低下剤が、カルボニルシアニド４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾンである、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記ミトコンドリア膜電位低下剤が、ニコチンアミドリボシド、ナイアシン、Ｎ−ホルミルキヌレニン、キノリン酸、ニコチンアミドリボシドキナーゼアクチベーター、ニコチンアミドモノヌクレオチドおよびトリプトファンから選択される、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
13. 長期多系統血液再構成能力を有する機能性幹細胞を選択するためのキットであって、ｉ）表現型によって定義された造血幹細胞および前駆細胞の表面マーカーまたはそれらマーカーの組み合わせについての少なくとも１つの検出剤、およびｉｉ）造血幹細胞および前駆細胞における低いミトコンドリア膜電位を検出するための少なくとも２つの薬剤、例えばＪＣ１またはＴＭＲＭ色素とを含んでなる、キット。
14. 表現型によって定義された造血幹細胞および前駆細胞の前記少なくとも１つの検出剤が、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ−１、ＣＤ１５０、ＣＤ４８およびＣＤ３４から選択される前記表面マーカーに対する１つ以上の選択的抗体である、請求項１３に記載のキット。
15. 造血幹細胞調製物のための細胞増殖培養培地であって、少なくとも１つのミトコンドリア膜電位低下剤またはその混合物を含んでなる、細胞増殖培養培地。
16. 前記ミトコンドリア膜電位低下剤が、４ジ−ニトロフェノール、カルボニルシアニド４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン、カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラジン、２−フルオロフェニル）｛６−［（２−フルオロフェニル）アミノ］（１，２，５−オキサジアゾロ［３，４−ｅ］ピラジン−５−イル）｝アミンおよび４，５，６，７−テトラクロロ−２−トリフルオロメチルベンズイミダゾールまたはそれらの混合物から選択される、請求項１５に記載の細胞増殖培養培地。
17. 少なくとも１つのミトコンドリア膜電位低下剤を含んでなる、対照血球レベルと比較した血球レベルの低下の予防および／または治療に用いられるフードサプリメント。
18. 前記ミトコンドリア膜電位低下剤が、ニコチンアミドリボシドである、請求項１７に記載のフードサプリメント。
19. 少なくとも１つのミトコンドリア膜と、薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤とを含んでなる医薬組成物であって、さらに、造血機能の欠如に関連する疾患または障害を予防または治療するために有用な、または血液回復を促進するために、および／または造血細胞欠失患者における感染症のリスクを予防もしくは軽減するために有用な助剤を含んでなる、医薬組成物。
20. 前記ミトコンドリア膜電位低下剤が、ニコチンアミドリボシドである、請求項１９に記載の医薬組成物。
21. 前記助剤が、Ｇ−ＣＳＦ類似体およびＴＰＯ受容体類似体またはそれらの混合物から選択される、請求項１９または２０に記載の医薬組成物。
22. 被験体における対照血球レベルと比較した血球レベルの低下を予防および／または治療する方法であって、ミトコンドリア膜電位低下剤を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、方法。
23. 前記血球レベルの低下が、重度の好中球減少症および／または重度の血小板減少症である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記被験体が、造血幹細胞移植後の被験体、または固形腫瘍のための破壊的化学療法を受けているかまたは重度の免疫学的障害を患っている被験体である、請求項２２または２３に記載の方法。
25. 標準血液プロファイルの回復を促進するための、および／または造血細胞欠失患者における感染症のリスクを予防もしくは軽減するための方法であって、有効量のミトコンドリア膜電位低下剤を被験体に投与することを含んでなる、方法。
26. 注射によって、または医薬製剤の経口経路によって、またはフードサプリメントとして、前記ミトコンドリア膜電位低下剤を投与する、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の方法。

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