KR20170045355A - 조혈모 세포 의학에서 유용한 방법 및 화합물 - Google Patents

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니꼴라 바니니
마티아스 루토프
요한 오웨릭스
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에꼴 뽈리떼끄닉 뻬데랄 드 로잔느 (으뻬에프엘)
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Abstract

본 발명은 장기 다중-계통 혈액 재구성 능력을 갖는 줄기 세포에 대한 특이적 마커 및 조혈모 세포 약물 및 특히 재생 치료 및 골수 이식 측면에서 세포 조성물의 제제를 위한 이들의 용도에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 감소된 혈액 세포 준위 및 관련된 감염 위험성의 예방 및/또는 치료에 유용한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

조혈모 세포 의학에서 유용한 방법 및 화합물{METHODS AND COMPOUNDS USEFUL IN HEMATOPOIETIC STEM CELL MEDICINE}
본 발명은 일반적으로 조혈모 세포 의학 분야에 관한 것으로, 특히 재생 치료 및 골수 이식에 관한 것이다. 특히 본 발명은 손상된 인간 조직, 줄기세포/전구세포의 엑소 비보 전파 및 혈액 또는 면역계 질병의 치료에 유용한 방법 및 조성물에 관한 것이다
일생 혈액 생성은 조혈모 세포(HSC) 침묵(quiescence), 자기 재생 및 분화 사이에서 세밀하게 조직화된 균형을 필요로 한다. 줄기 세포들이 이들 이질적인 운명들을 어떻게 선택하는가를 제어하는 메커니즘은 알려져 있지 않다. 상기 조혈계(hematopoietic system)는 유기체의 전체 삶 동안 하루 당 2조 적혈구를 생산하는 능력을 갖는다. 이 믿을 수 없는 장기간 세포 생성은 HSCs에 의해 조직화되며, HSCs는 동시에 삶 전체에 걸쳐 이들 기능을 유지해야만 한다. 혈액계의 유지는 골수(BM)의 저 산소 영역(hypoxic niche)에 존재하는 HSCs 풀에 의해 확보된다. 이들 진귀한 세포들이 일생 자기 재생 및 다능성 전구체(multipotent progenitor, MPP)에 전념할 수 있다.
기능적 HSC 풀(pool)의 보존은 침묵 HSCs의 풀, 즉 세포성 스트레스 및 손상을 피하기 위하여 세포에 의해 채택된 전략을 유지하는 것으로 완성된다(Wilson et al., 2008, 세포, 135(6), 118-29). 세포성 신진 대사는 이 과정에서 중추적 역할을 하며, 최근 HSC 기능의 핵심 조절자로서 나타났다(Tabuko et al., 2013, Cell Stem Cell, 12(1), 49-61). 세포성 신진 대사의 조절이 침묵 유지에서 치명적이라면, 이것은 또한 HSC 운명 결정을 지휘한다 (Ito et al., 2012, Nat. Med ., 18 (9), 1350-8).
BM의 이식은, 혈액성 악성 종양(haematological malignancies), 예를 들어 백혈병 및 혈액계 및 면역계의 다른 질병으로서, 이에 한정되지는 않지만, 암 (e.g., 백혈병, 림프종), 혈액 질환 (e.g., 유전성 빈혈, 선천성 대사장애증, 재생불량성 빈혈, 베타 지중해 빈혈(beta-thalassemia), 블랙판 다이아몬드 증후군(Blackfan-Diamond syndrome), 공세포백색질장애(globoid cell leukodystrophy), 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell anemia), 중증 합병성 면역결핍증(severe combined immunodeficiency), X 연관 림프증식성 증후군(X-linked lymphoproliferative syndrome), 비스코트 올드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 헌터 증후군, 헐러 증후군(Hurler's syndrome), 레쉬 니한 증후군(Lesch Nyhan syndrome), 골석화증(osteopetrosis)), 면역계의 화학요법 구조, 및 다른 질병(e.g., 자가면역 질환, 당뇨병, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스)을 포함하는 질병에 대한 잠재적으로 생명구조 치료법이다.
이식 후 환자들의 결과를 개선하기 위하여, 혈액 회복 기간을 줄이는 것으로 심각한 감염 위험 및 피 흘리는 위험을 줄이는 게 중요하다. 많은 세월동안, HSCs는 혈액성 및 면역성 질환의 치료를 위해 성공적으로 사용되어 왔으나, 그러나 이들의 제한된 수는 HSC-기반 치료법을 보다 신뢰성 있고 보다 넓은 분야에 적용시키는 것을 방해한다. 사실상, 만약 조혈모 세포가 임상적 분야에서 가장 광범위하게 사용된 줄기 세포들이지만, HSC 치료법은, 혈액성 악성 종양에 적용될 때 50% 가까이 연관된 사망률을 갖는, 여전히 매우 위험한 절차이며, 이는 대부분 BM 제거에 이어지는 백혈구 감소증의 지연으로 인한 것이다.
게다가, '엑소 비보'로 기능적 HSCs를 전파하기 위한 셀 수 없는 시도들은, 장기간 자기 재생 및 인비보 재생 능력이 배양액 내에서 빠르게 사라지기 때문에 실패했다. 장기(long-term) HSCs, 또한 소위 LT-HSCs(전형적으로 마커 Lin- cKit+ Sca-1+ (LKS CD150+ CD34-)에 의해 정의됨)가, 단기(short-term) HSCs, 또한 소위 ST-HSCs (LKS CD150+CD34+) 및 다능 전구체, 또한 소위 MPPs (LKS CD150- CD34+)로 진행하는 것은, 세포 표면 마커의 레퍼토리에서 단지 작은 차이만이 보여진 반면에, 표면 마커 레퍼토리는 확실하게 인비보 기능을 예측하지 않는다. 임상적 연구는, 엑소-비보에서 팽창된 HSCs가 단지 조혈작용에 일시적 기여를 한다는 것을 나타냈다. 사실상, 팽창된 HSCs는 빠르게 생착(engraft)은 하나, 잠재적으로 자기 재생 능력의 손실에 의해, 장기 다계열 생착에 기여하지는 않는다. 자기 재생, 장기 HSCs을, 이들의 초기의 기능적으로 약화된 조상과 구별하게 하는 믿을만한 표현형 또는 유전형 마커의 결핍은, 자기 재생의 분자 메커니즘을 설명하기 어렵게 한다.
혈액 악성종양과 같은 질환의 치료로서 현재 사용된, 사람 자가 조직 및 동종 골수 이식에서, 수 많은 환자들은 가족 또는 세계 등록기관 어디에서도 조직 적합성 공여자를 발견하지 못하고, 따라서 제대혈과 같은 이식을 위한 HSCs의 다른 공급원으로 돌아가야만 한다. 불행하게도, 제대혈(CB)는 동원된 말초 혈액 CD34+ 세포 (MPBCs) 또는 BM보다 매우 낮은 절대 수(absolute number)의 HSCs를 포함하므로, 성인 환자의 치료 용도로는 CB가 덜 바람직하게 된다. 조혈 줄기 세포 및 전구 세포의 수를 증가시키는 능력은, 이론적으로 MPBC 또는 골수 공여당 필요한 함량을 줄이거나, 또는 인간 항원 백혈구(HLA) 매칭의 어려움을 증가시키는 다른 탯줄로부터 조혈모 세포를 집단화(pooling)(다중 제대혈 유니트를 사용하여 이중 이식)할 필요가 없다.
그러나, 인간 골수 팽창 배양은, 제한된 조혈 포텐셜을 제시하는 것으로 나타났으며, 이는 약 6 내지 8주에 세포 제조 중단을 하는 줄어든 수의 조혈 전구 세포 및 성숙한 혈액 세포를 만들며, 외인성 성장 인자를 사용하여 인비트로 팽창을 진행하고자 하는 많은 노력에도 불구하고, 만능 세포의 수가 단지 제한적으로만 얻어졌다. 게다가, BM- 및 CB-HSCs로부터 분리된 장기 재증식(LT)-HSCs를 확실하게 증가시키는 것이 현재 매우 어려우며, LT-HSCs을 새롭게 공급할 필요성을 더 높인다.
50년 이상 임상 경험 및 수백만 이식에 걸쳐, 조혈모 세포 (HSC) 이식은 현재까지 제1의 그리고 가장 광범위하게 사용된 줄기 세포 치료법이었다. 이러한 성공은, 전구 세포를 꾸준히 재생하고 생산하는 HSCs의 능력에 있으며, 이는 다시 하루 당 놀라운 1011 성숙한 혈액 세포의 제조를 담당한다. 그럼에도 불구하고, 동종이계 HSC 이식 및 모든 다른 집중적인 탈역 화학요법 치료(intensive ablative chemotherapy regimes)의 성공은, 25%에 가까운 절차-관련한 사망률에 의해 여전히 어두운 부분이 있으며, 이는 HSC-자극 인자 G-CSF를 갖는 표준 지지체에도 불구하고, 대부분 총 백혈구 감소에 이어지는 골수(BM) 소모와 관련된 감염성 합병증에 의한 것이다.
니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD+) 전구체는, 높은 순환 준위의 콜레스테롤 및 혈액 지방의 치료로서 니코틴산(NA)의 형태로 이미 임상적으로 사용되어 왔다 (Karpe et al., 2004, Lancet, 363(9424), 1892-4; Canto et al., 2012, 세포. Metab., 15(6), 838-47). 그러나, 조혈계에 대한 NAD 준위의 효과는 집중적으로 연구되어 있지 않았다.
HSC 치료법 포텐셜은, 한편으로는 장기 자기 재생 능력을 잃어버린 세포들로부터 HSC 장기 다계열 혈액 재구성 포텐셜을 갖는 줄기 세포를 정확하게 구별하는 기술과, 다른 한편으로는 HSC 이식과 관련된 사망율 감소 및 심각한 감염을 피하기 위하여 즉각적인 이식후 기간 동안 혈액 제조를 자극하는 귀한 전략의 개발과 함께 상당히 증가될 것으로 유추된다.
그러므로, 혈액계의 재생 증가를 위하여, 특히 암 치료에서 혈액 계 재생을 증가시키기 위하여, 임상적 HSC 팽창 및 HSC 운명의 인비보 치료적 조작에 유용한 전략을 발전시킬 필요가 있으며, 특히 환자들에서 심각한 혈구 감소 기간을 줄이는 새로운 전략은 따라서 매우 큰 임상적 영향을 가지며, 집중적 화학요법 및 HSC 이식의 응용을 용이하게 하며, 보다 약하거나 또는 보다 나이든 환자들에게 수 많은 조혈 악성 종양에 대한 치료적 요법을 용이하게 할 것이다.
본 발명의 요약
본 발명은, 낮은 미토콘드리아 막 전위 (ΔΨm)가, 각 조혈 줄기 또는 초기 전구 세포 집단 내에서 신선하게 분리되었을 뿐만 아니라 인비트로-배양된 HSCs에 대한 장기 다계열 혈액 재구성 능력에 대한 강력한 마커라는 예상하지 못한 발명에 관한 것이다. 침묵 및 사이클링(cycling) HSCs는, 항상성 조건 또는 사이클링의 수가 증가되는 활성화된 조건하에서, 비교할만한 (ΔΨm) 프로파일을 갖는다. ΔΨm는 그러므로 이들의 세포 사이클 상태와 무관하게 기능적 HSCs의 마커이다. 게다가, 본 발명은, 낮은 ΔΨm을 유지하는 딸 세포가 줄기세포성(stemness)을 유지하는 반면에, ATP 제조를 지지하기 위하여 미토콘드리아를 사로잡는 것들은 분화되었다는 것과, HSC 세포 내에서 낮은 미토콘드리아 막 전위를 강제로 유지시키면서, 미토콘드리아 내에서 ATP 합성을 방해하기 위하여 전자 전달 사슬을 화학적으로 해제하는 것은 놀랍게도, 빠른 분화를 정상적으로 유도하는 배양 조건하에서 조차, 이들 세포들이 자기 재생하도록 지시한다라는 예상하지 못한 발견을 기초로 한 것이다.
본 발명은, 미토콘드리아 내 ATP 생성으로부터 전자 전달을 해제시키는 약제와 같은 미토콘드리아 전위를 줄이는 약제, 또는 니코틴아미드 리보시드(NR)와 같은 약제의 사용이, 엑소 비보에서 HSCs를 유지하거나 팽창시킬 수 있고, 식품을 통해 투여될 때, 마우스 골수 내 조혈 전구 세포 분획을 팽창시키고, 이식 후 생존 및 혈액 회복을 개선시키면서, 낮은 ΔΨm을 갖는 HSCs 세포들을 구분하는 비율을 높인다는 다른 예상하지 못한 발견에 관한 것이다. 이들 발견은, 초기 연구들은 니코틴아미드의 투여가 마우스 내 혈소판 준위를 증가시키지 않는다는 것을 보여주고 있었기 때문에 매우 놀라운 것이다(Konieczna et al., 2013, Blood cells, molecules & diseases, 50,　171-6).
본 발명의 제1 양상은 엑소-비보에서 조혈모 세포 팽창에 대한 방법을 제공한다.
본 발명의 제2 양상은 장기 다계열 재구성 능력을 갖는 기능적 줄기 세포 내에 조혈모 세포 제조를 풍부하게 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제3 양상은 조혈모 세포 집단의 줄기세포성을 엑소-비보에서 유지 및/또는 팽창시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 제4 양상은 장기 다계열 혈액 재구성 능력을 갖는 기능적 줄기 세포를 선택하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 제5 양상은 적어도 하나의 미토콘드리아 막 전위 감소제를 포함하는 조혈모 세포를 위한 키트 또는 세포 팽창 배양 배지를 제공한다.
본 발명의 제6 양상은, 대조군 혈액 세포 준위에 비하여 감소된 혈액 세포 준위, 예를 들어 심각한 백혈구 감소증 및/또는 심각한 혈소판 감소증, 예를 들어 조혈모 세포 이식후 대상 또는 고형 종양에 대해 탈격의 화학 요법을 받거나 또는 심각한 면역계 질환으로 고통받는 대상에서 발견된 것과 같은 줄어든 혈액 세포 준위의 예방 및/또는 치료에서 사용되는 미토콘드리아 막 전위 감소제를 제공한다.
본 발명의 제7 양상은 대조군 혈액 세포 준위에 비하여 감소된 혈액 세포 준위의 예방 및/또는 치료를 위한 약제 또는 식품 보조제의 제조를 위한 미토콘드리아 막 전위 감소제의 용도를 제공한다.
본 발명의 제8 양상은, 예를 들어 G-CSF 유사체(즉, 필그라스팀) 또는 TPO 수용체 유사체(즉, N-PLATE)와 같은 감소된 혈액 세포 준위의 예방 및/또는 치료에 유용한 약제 및 미토콘드리아 막 전위 감소제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 제9 양상은, 대상에서 대조군 혈액 세포 준위에 비하여 감소된 혈액 세포 준위의 예방 및/또는 치료의 방법을 제공하며, 상기 방법은 효과적인 함량의 미토콘드리아 막 전위 감소제를 경구 투여, 주사 또는 식품 보조제로서 대상에 투여하는 단계를 포함한다. 그러한 미토콘드리아 막 전위 감소제 치료는 현재 표준 치료법, 즉 백혈구 감소증에 대한 G-CSF 유사체 (i.e. 필그라스팀) 및 자가 면역 혈소판 감소증에 대한 TPO 수용체 유사체(i.e. N-PLATE)와 병용될 수 있다.
본 발명의 제10 양상은, 표준 혈액 프로파일 회복을 촉진 및/또는 조혈 세포-제거된 환자에서의 감염 위험을 예방 또는 완화시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 효과적 함량의 미토콘드리아 막 전위 감소제를 주사 또는 식품 보조제로서 대상에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가 양상은 적어도 하나의 미토콘드리아 막 전위 감소제를 포함하는 대조군 혈액 세포 준위에 비하여 줄어든 혈액 세포 준위의 예방 및 /또는 치료에서 사용하기 위한 식품 보조제를 제공한다.
도 1은 실시예 1에 설명된 것처럼 TMRM 형광에 의해 측정된 것으로서 표현형으로 규정된 조혈 줄기 및 전구체 세포 집단에 대한 별개의 미토콘드리아 막 전위(ΔΨm)을 나타낸다. A1 및 A2: TMRM으로 표지된 (ΔΨm)을 기초로 한 CPs, LKS, ST-HSC 및 LT-HSC의 유동 세포 계수 분석. 각 집단은 가장 원시적 집단으로부터 가장 열성적인 집단으로 단계적으로 증가되는 미분 ΔΨm 준위로 표시된다; B: 살아있는 TMRM-표지된 줄기/전구체 세포의 콘포칼 영상 분석(confocal image analysis)은, 투입 준위(n=7)를 증가시키면서 정상화된 형광 강도에 의해 대표되는 것으로서 ΔΨ이 증가하는 것을 확인한다. 3개 대표적인 실시예는 각 세포 집단에 대해 나타낸다. ***P < 0.001, **P < 0.01 및 *P < 0.05.
도 2는, 생착 능력(다계열 재구성 능력)은, 실시예 1에 설명된 것처럼, 경쟁적 이식 분석에서 시험된 것으로서 재증식 단위(RU)로 측정된 것으로서, 낮은 ΔΨm을 갖는 HSC 부차집단으로 배타적으로 제한된다는 것을 나타낸다. A: 골수 내 모든 다능성 줄기 세포 및 전구체 세포를 포함하는 LKS 집단, 장기 줄기세포성은 TMRM낮은 세포들 (LKS:TMRM낮은) (각 조건에 대해 n=8)로 제한된다. B: 표현형으로 규정된 ST-HSC 구획에서, 줄기세포성은 TMRM낮은 세포 (ST-HSC:TMRM낮은) (각 조건에 대해 n=9)로 제한된다. C: 표현형으로 규정된 LT-HSC 구획에서, 줄기세포성은 TMRM낮은 세포 (LT-HSC:TMRM낮은) (각 조건에 대해 n=9)으로 제한된다. ***P < 0.001, **P < 0.01 및 *P < 0.05.
도 3는, 낮은 ΔΨm은 실시예 3에서 시험된 것처럼 키메리즘의 퍼센트로 측정된 배양 내에서 자기재생 HSCs를 표지한다는 것을 나타낸다. A: 인비트로에서 팽창 5일 후 배양-팽창된 HSC 자손의 TMRM낮은 세포 및 TMRM높은 세포 분획의 키페리즘의 퍼센트. B: TMRM높은 세포에 비교된 딸 세포의 첫번째 세대(즉, 한번 분할)의 TMRM낮은 분획의 키메리즘의 퍼센트로서, TMRM낮은 분획에 대한 매우 높은 장기 다계열 혈액 재구성 효율을 뒷받침하고, 총 혈액(B1)뿐만 아니라 림프성(B2) 및 마이엘로이드 계통(B2)에 대하여 배양에서 자기 재생 대 분화 HSC 분할(n=10, 각 조건에 대해)에 대한 증거를 제공하며; C: TMRM낮은 주사된 원시적 수용 마우스로부터 유래된 BM의 이차 이식은, 총 혈액(C1), 림프구 (C2) 및 마이엘로이드 계통(C2)에 대해 이들의 키메리즘의 퍼센트로 나타낸 것처럼 8주에서의 장기 재구성을 나타낸다.
***P < 0.001, **P < 0.01 및 *P < 0.05.
도 4 는 미토콘드리아 신진 대사의 조절은, 실시예 3에서 설명된 것처럼, 전자 전달 사슬 공역 해제제(FCCP)의 존재 또는 부재 하에서 단기- 및 장기- 콜로니 형성 단위(Colony forming unit, CFU) 분석에서 측정된 것처럼, HSC 운명을 변경한다는 것을 나타낸다. A: 가장 활성화된 전구체 세포(대식세포 콜로니, M, 과립구/대식세포 콜로니, GM) (왼쪽 및 중간 패널, 각각)로부터 유래되고, 총 골수 세포 상에서 가장 원시적 전구체 세포(오른쪽 패널)로부터 유래된 콜로니의 총수 및 콜로니의 퍼센트; B: 가장 활성화된 전구체 세포(왼쪽 및 중간 패널)로부터 유래되고, 표현형 LT-HSC:TMRM낮은 세포 상의 가장 원시적 전구체 세포(오른쪽 패널)로부터 유래된 콜로니의 수 및 퍼센트. C: 총 세포(왼쪽), 림프구 세포 (중간 패널 및 골수성 세포 (오른쪽 패널))에서 FCCP의 존재하에서 배양된 세포 내 키메리즘의 퍼센트로 측정된 다계통 재구성의 준위. ***P < 0.001, **P < 0.01 및 *P < 0.05. (CFU-)G: 콜로니 형성 단위-과립구; (CFU-)M: 콜로니 형성 단위-대식세포; (CFU-)GM: 콜로니 형성 단위-과립구, 대식세포; (CFU-)GEMM: 콜로니 형성 단위-과립구, 적혈구, 대식세포, 거핵세포); Mk/BFU-E: 거핵세포/대집락 형성 단위(Burst forming unit)-적혈구.
도 5 는, 실시예 4에 설명된 것처럼 다른 다양한 세포 구획에서 골수 분석에 의해 마우스 내 NR 치료의 효과를 나타낸다. A: 치료 1주일 후(1), 치료 4주 후(4), 모든 조혈 전구체 세포 구획(LT-HSC, ST-HSC, MPP, CP 및 MEP)에서 FACS에 의해 세포 계수로 측정된 NR-처리된(오른쪽) 및 대조군(왼쪽) 마우스의 BM 분석을 나타낸다. (n=5, 통계 t=스튜던트); B: NR 처리시 HSCs의 축소를 나타내지 않는 대조군(왼쪽)에 비교하여 이식 측면에서 1 개월 NR-처리된 마우스(오른쪽)으로부터 유래된 BM의 유사 유전자형 CD45.1 퍼센트 키메리즘에 의해 측정된 것으로서 장기 12-주 생착; C: 1주 처리 후 집단(1) 및 4주 처리된 집단(4)의 BM-유래된 마우스로부터 CFU 분석에서 콜로니 수(n=5, 통계 t=스튜던트).
도 6 는 실시예 5에 설명된 것처럼 다른 세포 구획 상에서 골수 분석에 의해 마우스에서 니코틴산(NA) 1-주 처리의 효과를 나타낸다. A1-A3: 조혈 구획의 FACS 분석은 NA 치료시 줄기 세포 및 전구체 세포 집단의 증가를 나타낸다. B1-B2: 세포 사이클 분석은 처리된 조건 및 비처리된 조건 사이에서 임의 커다란 차이를 나타내지 않는다.
도 7 는 실시예 5에서 설명된 것처럼, 대조군(점)에 비하여 제한된(A) 및 비제한적(B) 복용량-이식된 마우스(사각형)에서 NR 치료의 효과를 나타낸다. A1: 이식 프로토콜; A2: 생존 대 시간(이식 후 날짜들)(n=10); B: 혈액 세포 계수 대 시간(이식 후 날짜들); B1: 혈소판(혈소판 감소증 지대, 회색) 및 B2: 호중구 (백혈구 감소증 지대, 회색) (n=10, 통계 t-스튜던트).
도 8 은 실시예 7에 설명된 것처럼 NR로 HSCs를 인비트로 치료한 효과를 나타낸다. A: NR-처리 및 대조(CTRL) 조건에서 미토콘드리아에 대한 JC1 염색된 HSCs(TMRM으로)의 콘포칼 영상(n=3, 통계 t-스튜던트); B: NR-처리 후 및 대조군 조건 하에서 HSCs 집단, 즉 낮은 미토콘드리아 활성('TMRM 낮음') 및 높은 미토콘드리아 활성('TMRM 높음')을 갖는 HSCs 집단의 분석(n=3, 통계 t=스튜던트); C: NR-처리 후 및 대조군 조건하에서(n=3, 통계 t-스튜던트), 연속현미촬영장치(time-lapse microscopy) 추가조사에 의해 동시에 결정된 세포 분할의 퍼센트. 오른쪽 패널에 나타난 것처럼, 2개 딸 세포가 6시간의 시간 프레임(3시간의 Δ t) 내에서 분할할 때 분할은 동시에 일어나는 것으로 생각되었다.
도 9 는 실시예 8에 설명된 것처럼 마우스 내 NA 또는 아시피목스(acipimox) 처리에 비교된 NR 처리의 효과를 나타낸다. A: 유동 세포계수 분석; B: CFU 분석; C: NR/아시피목스 처리된 공여자로부터 유래된 골수로 이식되고 혈액 키메리즘의 퍼센트로 측정된 수용체 마우스의 혈액 재구성의 분석; D: NR/아시피목스로 처리되고 세포/부피의 수로 측정된 이식된 수용체 마우스 내의 혈액 재구성의 분석.
도 10은 실시예 8에 설명된 마우스 내 생존 및 혈액 회복을 나타낸다. A: NSG 인간화 마우스는 새로 태어난 마우스 내에 인간 CD34+ 세포를 간 내에 주입하여 제조되었다; B: ctrl 또는 NR 식이요법으로 먹이 준 인간화 마우스 내에서 평가된 인간 림프구 제조, n=5. 스튜던트의 테스트 *P<0.05
도 11 은 인간 CD34+ 조혈모 세포 및 전구체 세포의 이식을 통해 제조되고, 이후 ctrl 또는 7일에 걸쳐 NR 식이요법으로 먹이 공급된, 인간화 마우스 내의 인간 단핵구 (CD14+ CD16-) 제조에서 NR 보충의 효과를 나타낸다. 인간 단핵구는 FACS 분석에 의해 정량화되고 0 일자, n=5에 대하여 배수 증가로서 측정되었다.
도 12 는 실시예 9에 설명된 것처럼 세포의 수에 의해 측정된 것으로서, NA(C-D)에 비하여 NR 보충(A-B)의 효과를 나타낸다.
혈액 세포 준위의 감소가 진행될 위험이 있는 대상은 빈혈 또는 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome)으로 고통받는 환자들, 화학 요법, 골수 이식 또는 방사선 조사 치료를 받는 환자들, 및 이에 한정되지는 않지만, 특발성 혈소판 감소성 자반증(immune throbocytopenic purpura), 진성 적혈구계 무형성증(pure red cell aplasia) 및 자가 면역 백혈구 감소증을 포함하는 자가 면역 혈구 감소증으로 고통받는 환자들을 포함한다.
이식 후 합병증 진행의 위험에 있는 대상은, 원시적 또는 인비트에서 조작된 MPBCs, BM 또는 UC로부터 자가 조직 또는 동종이계 조혈 줄기 또는 전구체 세포 이식편을 받은 조혈세포 제거된 대상을 포함한다.
여기 사용된 용어 조혈모 세포 (HSC) 샘플은, 상기 세포 (e.g., 제대혈, 골수, 말초 혈액, 또는 태아성 조직, 예를 들어 태반 조직, 태아 간 또는 헤모제닉 내피세포) 또는 다능성 성인 전구 세포 (MAPCs), 또는 조혈 조직 또는 다른 중배엽 또는 중배엽-재프로그램화된 기원으로부터 부분적으로 재프로그램화된 세포의 공급원으로부터 분리된 조혈모 세포를 포함하는 임의의 엑소-비보 샘플을 포함한다.
여기 사용된 용어 "조혈모 세포" 또는 "HSC"는, 과립구 (e.g., 전골수구, 호중구, 호산구, 호염구), 적혈구 (e.g., 망상 적혈구, 적혈구), 혈전구(thrombocyte) (e.g., 거대핵모세포(megakaryoblast), 혈소판 제조 거핵세포, 혈소판), 단핵구 (e.g., 단핵구, 대식세포, 수지상 세포) 및 림프구 (공통의 림프구 전구 세포, pre-B, pro-B, 성숙 B, pre-T, pro-B, 성숙 T 및 NKT 림프구 및 NK 세포)을 포함하는, 보다 성숙한 혈액 세포로 자기 재생 및 분화하는 능력을 갖는 미성숙한 혈액 세포를 의미한다. 조혈모 세포가 전능성(pluripotent) 줄기세포, 다능성(multipotent) 줄기세포(e.g., a 림프구 줄기 세포), 및/또는 특이적 조혈 계통에 전념하는 줄기 세포를 포함할 수 있다는 것이 당해 기술분야에 또한 알려져 있다. 특이적 조혈 계통에 전념하는 줄기 세포는, T 세포 계통, B 세포 계통, 수지상 세포 계통, 랑게르한스(Langerhans) 세포 계통, 적혈구, 거핵구, 골수의 및/또는 대식세포 세포 계통의 것일 수 있다. HSCs는 또한 장기 HSC (L T-HSC) 및 단기 HSC (ST-HSC)를 의미한다. LT-HSC 및 ST-HSC는, 예를 들어 여기 설명된 것 또는 통상의 기술자에게 알려진 것과 같이 이들의 세포 표면 마커 발현을 기초로, 분화된다.
여기 사용된 용어 "HSC 함유 샘플"은 LT-HSCs 또는 정제되지 않은 조혈 샘플(예를 들어 총 제대혈 또는 총 MPBC 분리반출법 생성물 또는 총 골수 샘플)의 정제된 제제를 의미한다. LT-HSCs의 정제된 제제는, 관련 포유류 종에 특이적인 표현형적으로 규정된 조혈 줄기 및 전구 세포 집단에 대한 표면 마커를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 인간 LT-HSCs는 CD34+ 표면 마커를 사용하여 정제될 수 있다. 본 발명에 따른 세포 팽창의 방법의 효능은, 표면 면역염색 (i.e. CD34, CD38, Thy, CD133, c-kit, 계통 마커)을 통한 유동 세포계수에 의해 표현형적으로 측정될 수 있는 HSC 샘플 제제에서 자기 재생 세포의 함량의 측정을 통해, 또는 인비보 이식 분석 측면에서 퍼센트 키메리즘 및 콜로니 형성 단위 (CFU)를 통해 기능적으로측정될 수 있다.
줄기 세포에 적용된 여기 사용된 용어 "팽창(expansion)"은 모 줄기 세포와 동일한 2개 딸 줄기 세포를 유도하는 줄기 세포 분할을 의미한다. 이와 같이, 줄기 세포의 수는 세포 분할 후 증가되었다. 적어도 신체 줄기 세포(somatic stem cell) 또는 성인 줄기 세포에 대한 줄기 세포 생물학에서, 줄기 세포의 팽창은, 줄기 세포의 다른 운명("모 세포"로서 알려진 세포가 성장하여 2개 "딸 세포"로 분할하는, 세포 집단의 성장)에 대해 제한이 없어 용이한 줄기 세포 증식에 비하여 얻기 매우 어렵다는 것이 주목할 가치가 있다.
여기 사용된 것으로서, 용어 "세포 팽창 배양 배지"는, 예를 들어 다음 실시예 또는 Boitano et al., 2010, Science 329, 1345-8에 설명된 배양 배지에 처럼 줄기 세포 팽창에 적당한 임의의 표준 세포 줄기 세포 배양 배지를 의미한다.
실시예에 따라, 세포 팽창 배양 배지는 시토카인 및 성장 인자의 표준 칵테일을 포함한다. 시토카인 및 성장 인자의 칵테일은, 지지 기질 피더(supporting stromal feeder)와 함께 또는 없이 사용될 수 있거나, 또는 간엽 세포는, 이에 제한되지 않지만, 다음을 포함할 수 있다: SCF, TPO, Flt3-L, FGF-1, IGF1, IGFBP2, IL-3, IL-6, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, EPO, 온코스타틴-M, EGF, PDGF-AB, 앙기오포이에틴(angiopoietin) 및 Angl5을 포함하는 앙기오포이에틴-유사 패밀리, 프로스타글라딘 및 에이코사노이드를 포함하는 PGE2, 아릴 하이드로카본 (AhR) 수용체 저해제, 예를 들어 줄기Regenin1 (SR1) 및 LGC006 ( Boitano et al., 2010, Science, supra).
여기 사용된 것처럼, 용어 "미토콘드리아 막 전위 감소제(mitochondrial membrane potential reducing agent)" 는 미토콘드리아 막 전위, 예를 들어 TMRM 또는 MitoTracker Deep Red staining와 같은 미토콘드리아-전위 민감성 다이스(dies), 또는 헤마 분석을 통해 세포 내 호흡율의 직접적 측정에 의해 측정된 것으로 미토콘드리아 막 전위의 환원을 유도할 수 있는 약제이다. 이들 약제는, 미토콘드리아 내 ATP 생성으로부터 전자 전달을 해제하는 약제를 포함한다. 미토콘드리아 내 ATP 생성으로부터 전자 전달을 해제하는 약제의 예는, 2,4 디-니트로페놀 (DNP), 카보닐 시아나이드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존 (FCCP), 카보닐 시아나이드 m-클로로 페닐 히드라진 (CCCP), 2-플루오로페닐){6-[(2-플루오로페닐)아미노](1,2,5-옥사디아졸로[3,4-e]피라진-5-일)}아민 (BAM-15) 및 4,5,6,7-테트라클로로-2-트리플루오로메틸벤즈이미다졸 (TTFB)로부터 선택된 약제를 포함한다. 미토콘드리아 내 ATP 생성으로부터 전자 전달을 해제할 수 있는 임의의 추가 약제의 확인은, 상업적 ATP 결정 키트를 통해 통상의 기술자에게 알려진 표준 방법에 의해 확인될 수 있다. 게다가, 미토콘드리아 막 전위 감소제은, 니코틴아미드 리보시드 (NR), 니아신, N-포르밀키누레닌, 퀴놀린산, 니코틴아미드 리보시드 키나아제 (NRK) 활성화제, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 (NMN), 또는 트립토판과 같은 약제를 포함한다.
게다가, HSC 구획 내 막 전위를 환원시키는 약제의 능력은, 본 출원에 설명된 것처럼, 통상의 기술자에게 알려진 방법, 예를 들어 인비트로-배양된 또는 실시예 7 및 9에 나태낸 것처럼, TMRM으로 염색된, 신선하게 분리된 HSCs 의 유동 세포계수에 의해 평가될 수 있다.
여기 설명된, 용어 "조혈 세포 제거된 대상(hematopoietic cell depleted subject)"은 심각한 백혈구 감소증 및/또는 심각한 혈소판 감소증 및/또는 심각한 빈혈, 예를 들어 이에 한정되지 않지만, 이식 후 대상 또는 고형 종양에 대한 탈격 화학 요법을 받는 대상, 독성, 약물-유도성 또는 감염성 조혈 부전증(i.e. 벤젠-유도체, 클로란페미콜, B19 파르보바이러스, etc.)뿐만 아니라 골수이형성 증후군으로 고통받는 환자, 심각한 면역계 질환, 또는 충주(즉 Fanconi 빈혈) 또는 말초성 기원(i.e. G6PDH 결핍성)의 선천성 혈액학적 장애로 고통받는 환자들을 나타내는 대상을 의미한다.
여기 사용된 "치료" 및 "치료하다" 및 이와 유사한 것들은 일반적으로 원하는 약물학적 및 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 이 효과는 질병, 증후 또는 상태를 예방 또는 부분적으로 예방하는 측면에서 예방적일 수 있으며, 및/또는 질병, 상태, 증후 또는 질병으로 인한 부작용의 부분적 또는 완전한 치료 측면에서 치료적일 수 있다. 여기 사용된 용어 "치료"는 포유류, 특히 인간의 질병의 치료를 포함하며 다음을 포함한다: (a) 예를 들어 가족력, 과체중 상태 또는 연령을 근거로 아직 진단되지는 않았지만 질병이 예정될 수 있는 대상에서 발생하는 질병을 방지; (b) 질병을 저해, 즉 이의 진행을 잡거나; 또는 질병을 완화, 즉 질병 및/또는 증후 및 상태의 퇴행 야기, 예를 들어 손상의 개선 또는 치료.
특히, 조혈 기능(haemopoietic function)의 부재와 관련된 질병 또는 질환의치료는, 표준 혈액 프로파일 회복을 촉진시키거나 및/또는 조혈 세포-제거된 환자에서 감염 위험을 예방, 또는 완화하는 것을 포함한다.
여기 사용된 용어 "대상"은 포유류를 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 의해 고려된 포유류는 인간, 영장류, 가축 동물, 예를 들어, 개, 고양이, 소, 양, 돼지, 말, 실험 설치류, 및 이와 유사한 것을 포함한다.
본 발명에 따른 치료 또는 방법의 용어 "효능"은, 본 발명에 따른 용도 또는 방법에 반응하여 질병 또는 상태 과정에서의 변화를 기초로 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 치료 또는 방법의 효능은, 백혈구 감소증의 탈출(호중구 > 0.5 G/l, 인간에서) 및 이 탈출에 도달하기 위한 시간 및/또는 완전한 말초 세포 혈액 계수에 의해 측정될 수 있는 심각한 혈소판 감소증의 탈출(혈소판 계수 > 50-100 G/l, 인간에서) 및 이의 탈출에 도달하는 시간과 같이, 정상 세포 계수를 향한 정상 혈액 세포 계수의 회복 또는 혈액 세포 계수의 개선과 같은 조혈 세포 제거 프로파일의 감소를 측정하는 것을 통해 측정될 수 있다.
게다가, 본 발명에 따른 치료 또는 방법의 효능은, 표준 세포 혈액 계수(백혈구 분화, 적혈구 및 혈소판 계수) 뿐만 아니라 말초 혈액 또는 골수 내 CD34+ HSCs 세포의 측정을 통해 조혈 세포 제거 프로파일의 개선을 통해서뿐만 아니라 BM 도말(smear) 또는 생검(biopsy) 내 세포질의 연구를 통해 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 조혈모 세포 팽창 방법
본 발명의 일 실시예에 따라, 다음 단계를 포함하는 엑소 비보에서 조혈모 세포 팽창을 위한 방법을 제공한다:
a) 세포 팽창 배양 배지에 HSC-함유 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 HSC 샘플로부터, 낮은 미토콘드리아 막 전위에 의해 특징된 HSC 분획물을 분리된 HSC 풀로 분리하는 단계;
c) a)하에서 제공된 HSC 샘플 또는 b) 하에서 분리된 HSC 풀을 적어도 하나의 미토콘드리아 막 전위 감소제 또는 이들의 혼합물과 접촉시키는 단계.
추가 실시예에 따라, HSC 샘플이 골수 샘플 및/또는 골수 세포 제제인 본 발명에 따라 엑소비보에서 조혈모 세포 팽창을 위한 방법을 제공한다.
추가 실시예에 따라, HSC 샘플이 UCB 샘플 또는 UCB 세포 제제인 본 발명에 따른 엑소비보에서 조혈모 세포 팽창의 방법을 제공한다.
추가 실시예에 따라, 낮은 미토콘드리아 막 전위를 갖는 HSC 분획물이 JC1, TMRM 및 MitoTracker DeepRed로부터 선택된 형광 염료를 사용하여 분리되는, 본 발명에 따른 엑소비보에서 조혈모 세포 팽창을 위한 방법을 제공한다.
추가 실시예에 따라, 상기 적어도 하나의 미토콘드리아 막 전위 감소제가 상기미토콘드리아 내 ATP 생성으로부터 전자 전달을 해제하는 약제인 본 발명에 따른 엑소비보에서 조혈모 세포 팽창의 방법을 제공한다.
또 다른 추가 실시예에 따라, 상기 적어도 하나의 미토콘드리아 막 전위 감소제는 다음 군으로부터 선택된 본 발명에 따른 엑소비보에서 조혈모 세포 팽창의 방법을 제공한다: 2,4 디-니트로페놀 (DNP), 카보닐 시아나이드 4-(트리플루오로메톡시) 페닐히드라존 (FCCP), 카보닐 시아나이드 m-클로로 페닐 히드라진 (CCCP), 2-플루오로페닐){6-[(2-플루오로페닐)아미노](1,2,5-옥사디아졸로[3,4-e] 피라진-5-일)}아민 (BAM-15) 및 4,5,6,7-테트라클로로-2-트리플루오로메틸 벤즈이미다졸 (TTFB).
또 다른 추가 실시예에 따라, 상기 적어도 하나의 미토콘드리아 막 전위 감소제가 카보닐 시아나이드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존인 본 발명에 따른 엑소비보에서 조혈모 세포 팽창의 방법을 제공한다.
추가 실시예에 따라, 상기 적어도 하나의 미토콘드리아 막 전위 감소제가 리보시드 (NR), 니아신, N-포르밀키누레닌, 퀴놀린산, 니코틴아미드 리보시드 키나아제 (NRK) 활성화제, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 (NMN) 또는 트립토판으로부터 선택된 약제인, 본 발명에 따른 엑소비보 조혈모 세포 팽창의 방법을 제공한다.
또 다른 추가 실시예에 따라, 상기 적어도 하나의 미토콘드리아 막 전위 감소제가 니코틴아미드 리보시드(NR)인, 본 발명에 따른 엑소비보에서 조혈모 세포 팽창의 방법을 제공한다.
추가 실시예에 따라, 단계 b) 또는 c) 후에 얻어진 세포 제제가 장기 다중-계통 혈액 재구성 능력을 갖는 기능적 줄기 세포가 풍부한, 엑소비보에서 조혈모 세포 팽창의 방법을 제공한다.
추가 실시예에 따라, 단계 c)후에 얻어진 세포 제제의 줄기세포성(e.g. 인간 HSCs의 자기 재생 능력이 CD34+ 세포의 정량화 및 이식 분석에 의해 평가된다)은, 미토콘드리아 막 전위 감소제의 부재시에 HSC 샘플에 비하여 샘플을 취득한 후 보다 오랜시간 유지 및/또는 증가되는, 엑소비보에서 조혈모 세포 팽창의 방법을 제공한다.
추가 실시예에 따라, HSCs 또는 단기 전구 세포를 동결보호하는 방법을 제공하며, 후자는 냉동에 매우 민감하다.
탈공역제(uncoupling agent)는 1-50νM의 농도에서 사용될 것이다.
또 다른 실시예에 따라, 적어도 하나의 미토콘드리아 막 전위 감소제를 포함하는 세포 팽창 배양 배지를 제공한다.
또 다른 실시예에 따라, 적어도 하나의 미토콘드리아 막 전위 감소제, 및 추가로 줄기 세포 팽창에 유용한 시토카인 및 성장인자의 칵테일과 함께 선택적으로 지지 기질 피더 또는 간엽 세포, 예를 들어 SCF, TPO, Flt3-L, FGF-1, IGF1, IGFBP2, IL-3, IL-6, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, EPO, 온코스타틴-M, EGF, PDGF-AB, 앙기오포이에틴 및 앙기오포이에틴-유사 패밀리를 포함하는 Angl5, 프로스타글라딘 및 에이코사노이드를 포함하는 PGE2, 아릴 하이드로카본 수용체 저해제, 예를 들어 줄기Regenin1 (SR1) 및 LGC006를 더 포함하는 세포 팽창 배양 배지를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따라, 장기 다중-계통 혈액 재구성 능력을 갖는 기능적 줄기 세포를 선택하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 i) 표현형적으로 규정된 조혈 줄기 및 전구 세포용 표면 마커 또는 이들 마커들 서너개의 조합을 위한 적어도 하나의 검출 약제 및 ii) 조혈 줄기 및 전구 세포 내 낮은 미토콘드리아 막 전위를 검출하기 위한 적어도 하나의 약제, 예를 들어 JC1, TMRM 또는 Mitotracker® dye (벤족사졸리움, 2-[3-[5,6-디클로로-1,3-bis[[4-(클로로메틸)페닐]메틸]-1,3-디히드로-2H-벤즈이미다졸-2-일리덴]-1-프로페닐]-3-메틸-, 클로라이드/ 201860-17-5)를 포함한다.
본 발명의 추가 실시예에 따라, 본 발명에 따른 키트가 제공되며, 여기서 표현형으로 규정된 조혈 줄기 및 전구 세포를 위한 적어도 하나의 검출 약제는, 상기 표면 마커에 관련된 하나 이상의 선택적 항체이며, 상기 표면 마커는 HSCs를 포함하는 마우스 조혈 전구 세포에 대해 c-Kit, Lin-, Sca-1, CD150, CD34 및 CD48, 또는 인간 HSCs 및 조혈 전구 세포에 대해 Lin-, CD34, CD38, CD90, CD45RA, CD10 및 IL3Ra 로부터 선택된다.
본 발명의 추가 실시예에 따라, 조혈모 세포를 위한 키트 또는 세포 팽창 배양 배지를 제공하며, 이는 미토콘드리아 내 ATP 생성으로부터 전자 전달을 탈공역하는 약제 및 니코틴아미드 리보시드 (NR), 니아신, N-포르밀키누레닌, 퀴놀린산, 니코틴아미드 리보시드 키나아제 (NRK) 활성화제, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 (NMN) 또는 트립토판으로부터 선택된 약제로부터 선택된 적어도 하나의 미토콘드리아 막 전위 감소제를 포함한다.
추가 실시예에 따라, 미토콘드리아 내 ATP 생성으로부터 적어도 하나의 전자 전달 탈공역제를 더 포함하는 조혈모 세포를 위한 세포 팽창 배양 배지 또는 키트를 제공한다.
추가 실시예에 따라, 본 발명에 따른 조혈모 세포를 위한 키트 또는 세포 팽창 배양 배지를 제공하며, 여기서 상기 미토콘드리아 내 ATP 생성으로부터 적어도 하나의 전자 전달 탈공역제가 다음 군으로부터 선택된다: 2,4 디-니트로페놀 (DNP), 카보닐 시아나이드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존 (FCCP), 카보닐 시아나이드 m-클로로 페닐 히드라진 (CCCP), 2-플루오로페닐){6-[(2-플루오로페닐)아미노](1,2,5-옥사디아졸로[3,4-e] 피라진-5-일)}아민 (BAM-15) 및 4,5,6,7-테트라클로로-2-트리플루오로메틸 벤즈이미다졸 (TTFB).
추가 양상에 따라, 본 발명은 다음을 포함하는, HSC 샘플 내 세포의 줄기 세포성의 유지 및/또는 증가를 위한 후보자를 확인하기 위한 방법을 제공한다:
(a) HSC 샘플을 시험하고자 하는 후보 물질과 접촉시키는 단계;
(b) 상기 HSC 샘플로부터, 낮은 미토콘드리아 막 전위에 의해 특징된 HSC 분획을 분리된 HSC 풀로 분리하는 단계;
(c) 시험되는 물질이, 단계 a) 하에서 상기 HSC 샘플 또는 단계 b)하에서 분리된 HSC 풀 내 상기 세포의 미토콘드리아 막 전위를 낮추는지 여부 및/또는 상기 단계 a)하에서 상기 HSC 샘플 또는 단계 b) 하에서 분리된 HSC 풀 내에서 낮은 미토콘드리아 막 전위를 갖는 세포의 집단을 증가시키는 지 여부를 측정하는 단계; 및
(d) 상기 물질을 확인하는 단계.
추가 양상에 따라, 본 발명은 HSC 샘플 내 세포의 줄기세포성의 유지 및/또는 증가를 위한 후보자를 확인하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 세포 내 미토콘드리아 막 전위는 형광 염료, 예를 들어 JC1 또는 TMRM을 사용하여 단계 c)하에서 측정된 된다.
본 발명에 따른 세포 팽창의 방법 또는 본 발명에 따른 방법 또는 본 발명의 제제의 키트를 사용하여 얻어진 줄기 세포 제제는 Boitano et al., 2010, supra 에 설명된 것처럼 조혈모 세포 팽창을 위한 공지된 방법, 및 Boitano et al., 2010, supra.에 설명된 것처럼 공지된 방법에 따른 이식 프로토콜에서의 사용을 위한 방법에서 더 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 세포 팽창의 방법으로 얻어진 세포 집단은, 임상적 조혈 줄기 세포 이식, 또는 이러한 것이 필요한 대상에서 조혈 기능의 증가를 위하여 제형화될 수 있다.
본 발명에 따른 용도
일 실시예에 따라, 본 발명은 감소된 혈액 세포 준위, 예를 들어 조혈 기능이 감소되거나 조혈기능 부재, 예를 들어 심각한 백혈구 감소증, 빈혈 및/또는 혈소판 감소증, 특히 이식후 대상의 조혈모 세포 또는 고형 종양에 대한 탈격 화학 요법을 받는 대상 또는 심각한 면역 질환으로 고통받는 대상의 결과로서 감소된 혈액 세포 준위와 관련된 질병 또는 질환의 예방 및/또는 치료에서 사용되는 미토콘드리아 막 전위 감소제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따라, 감소된 혈액 세포 준위, 예를 들어 심각한 백혈구 감소증 및/또는 혈소판 감소증, 특히 조혈모 세포 이식후 대상에서 또는 고형 종양을 위한 탈격 화학요법을 받거나 또는 심각한 면역 질환으로 고통받는 환자에서 혈액 세포 준위 감소와 관련된 질병 또는 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제 또는 식품 보조제의 제조를 위한 미토콘드리아 막 전위 감소제의 용도를 제공한다.
실시예에 따라, 본 발명은, 대상에서 대조군 혈액 세포 준위에 비하여 감소된 혈액 세포 준위를 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 주사 또는 식품 보조제로서 대상에 효과적인 함량의 미토콘드리아 막 전위 감소제를 투여하는 단계를 포함한다.
실시예에 따라, 본 발명은 표준 혈액 프로파일 회복을 촉진하거나, 또는 조혈 세포 제거된 환자에서 감염 위험을 줄이는 방법을 제공하며, 상기 방법은 효과적인 함량의 막 전위 감소제를 주사 또는 식품 보조제로서 대상에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에 따라, 본 발명에 따른 막 전위 감소제는 여기 공지 기술 및 여기 설명된 기술에 의해 측정될 수 있는 낮은 미토콘드리아 전위를 갖는 세포의 비율을 증가시킬 수 있다.
추가 실시예에 따라, 상기 막 전위 감소제는 니코틴아미드 리보시드 (NR), 니아신, N-포르밀키누레닌, 퀴놀린산, 니코틴아미드 리보시드 키나아제 (NRK) 활성화제, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 (NMN) 및 트립토판으로부터 선택된다.
추가 실시예에 따라, 상기 막 전위 감소제는 니코틴아미드 리보시드이다.
추가 실시예에 따라, 상기 막 전위 감소제는 증가된 호중구 및 혈소판 회복을 통해 백혈구 감소증 및/또는 혈소판 감소증의 보다 빠른 탈출에 의해 혈액 회복을 유도하는데 유용하다.
본 발명에 따른 세포 팽창의 방법 또는 본 발명에 따른 방법 또는 본 발명의 제조 키트를 사용하여 얻어진 줄기세포 제제 또는 본 발명에 따른 치료 방법은, 화학 요법에 보충 치료를 하는데 유리한 점을 제공하거나 또는 조혈 세포의 변형과 관련되는 다른 질병 상태의 치료를 보조하고, 장기 줄기 세포 배양에 대한 추가적인 응용을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물
본 발명은 심각한 백혈구 감소증 및/또는 혈소판 감소증과 같은 조혈 기능 부재와 관련된 질병 또는 질환의 예방 및/또는 치료에 사용되는데 유용한 미토콘드리아 막 전위 감소제를 제공한다.
막 전위 감소제 또는 이들의 제형은 약제학적 제형 또는 식품 보조제로서 투여될 수 있으며, 이는 여기 설명된 임의 형태로 본 발명에 따른 하나 이상의 약제를 포함할 수 있다. 본 발명에 다른 조성물은, 종래 사용된 아주반트, 담체, 희석제 또는 부형제와 함께, 약제학적 조성물 및 이들의 단위 복용형태로 놓여질 수 있고, 그러한 형태는 모든 경구형 용도, 또는 주사 또는 연속적인 주입에 의한 비경구(경피를 포함) 용도를 위한 멸균 주사가능한 용도를 위하여, 고체, 예를 들어 정제 또는 충진된 캡슐, 또는 액체 예를 들어 용액, 현탁액, 에멀젼, 엘르시르, 또는 동일한 것으로 채워진 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 주사가능한 조성물은 전형적으로 주사가능한 멸균 염류 또는 인산염-완충된 염류 또는 당해 기술분야에 알려진 다른 주사가능한 담체를 기초로 한다. 그러한 약제학적 조성물 및 이들의 단위 복용 형태는 추가적인 활성 화합물 또는 프린서플(principle)와 함께 또는 이것들 없이 종래 비율로 성분을 포함할 수 있고, 그러한 복용 형태는, 사용되는 의도한 매일 복용량 범위와 비례하는 임의의 적당한 효과적인 함량의 활성 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 이에 한정되지 않지만, 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽 및 엘르시르를 포함하는 액체 제형일 수 있다. 조성물은 사용 전에 물 또는 다른 적당한 비이클과 함께 재구성용 건식 제품으로 제형화될 수 있다. 그러한 액상 제제는 이에 한정되지 않지만 현탁화제, 에멀젼화제, 비수성 비이클 및 방부제를 포함하는 첨가제들을 포함할 수 있다. 현탁화제는, 이에 한정되지는 않지만, 소르비톨 시럽, 메틸 셀룰로오스, 글루코오스/설탕 시럽, 젤라틴, 히드록시에틸 셀룰로오스, 카복시메틸 셀룰로오스, 알루미늄 스테아레이트 겔, 및 수소화된 식용 지방을 포함한다. 에멀화제는, 이에 한정되지 않지만, 레시틴, 소르비탄 모노올리에이트, 및 아카시아를 포함한다. 방부제는, 이에 한정되지 않지만, 메틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트 및 소르브산을 포함한다. 분산제 또는 습윤제는, 이에 한정되지 않지만 폴리(에틸렌글리콜), 글리세롤, 소혈청 알부민, Tween®, Span®을 포함한다.
본 발명의 조성물은 또한 데폿(depot) 제제로서 제형화될 수 있으며, 이는 이식 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 고형 조성물은 종래 방법으로 제형화된 정제 또는 로젠즈(lozenge)의 형태일 수 있다. 예를 들어, 경구 투여용 정제 및 캡슐은 이에 제한되지 않지만, 결합제, 필러, 윤활제, 붕해제 및 습윤제를 포함하는 종래 부형제를 포함할 수 있다. 결합제는, 이에 한정되지 않지만, 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨, 트래거캔스, 전분의 점액 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 필러는, 이에 한정되지 않지만, 락토오스, 설탕, 미정질 셀룰로오스, 옥수수 전분, 칼슘 포스페이트, 및 소르비톨을 포함한다. 윤활제는, 이에 한정되지 않지만, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 및 실리카를 포함한다. 붕해제는, 이에 한정되지 않지만, 감자 전분 및 소듐 전분 글리콜레이트를 포함한다. 습윤제는, 이에 한정되지 않지만, 소듐 라우릴 설페이트를 포함한다. 정제는 당해 기술분야에 잘 알려진 방법에 따라 코팅될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 지효성 방출 형태로 또는 지효성 방출 약물 송달 시스템으로부터 투여될 수 있다.
이식 후 또는 화학요법 후 환자들을 위하여, 비경구 투여가 바람직할 것이며, 화학요법 후 막염은 때때로 모든 경구 섭취를 손상시키고, 일부 환자들은 비경구적 영양공급조차 필요하다. 특정 실시예에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 정맥주사용이다.
특정 실시예에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 식품 보조제로서 대상에 투여될 수도 있다.
일 양상에 따라, 식품 보조 제형은 약 10 내지 50mg/kg/일의 범위의 막 전위 감소제의 복용율로 경구적으로 투여될 수 있다.
또 다른 양상에 따라, 청구항 15에 따른 세포 팽창 배양 배지를 제공하며, 여기서 상기 미토콘드리아 막 전위 감소제는 4 디-니트로페놀, 카보닐 시아나이드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존, 카보닐 시아나이드 m-클로로 페닐 히드라진, 2-플루오로페닐){6-[(2-플루오로페닐)아미노](1,2,5-옥사디아졸로[3,4-e]피라진-5-일)}아민 및 4,5,6,7-테트라클로로-2-트리플루오로메틸 벤즈이미다졸 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다.
또 다른 양상에 따라, 적어도 하나의 미토콘드리아 막 전위 감소제를 포함하는 식품 보조제를 제공한다.
장기 다중-계통 혈액 재구성 능력을 갖는 기능적 줄기 세포 내에 조혈모 세포 제제를 풍부하게 하는 방법을 제공한다.
또 다른 특정 양상에서, 본 발명에 따른 조성물은 반복된 투여에 의한 송달에 적합화된다.
특정 실시예에 따라, 본 발명의 조성물은 수의과 조성물이다.
물질뿐만 아니라 제형 가공 기술 및 이와 유사한 것들은 Part 5 of Remington's "The Science 및 Practice of Pharmacy", 22 nd Edition, 2012, University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins에 설정되어 있고, 이는 참조로서 여기서 통합되어 있다.
투여의 모드
미토콘드리아 막 전위 감소제 또는 이들의 제형은, 경구로, 비경구로, 정맥으로, 직장으로, 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 방법으로 투여될 수 있다. 비경구 투여는, 이에 한정되지 않지만, 정맥으로, 동맥으로, 복강 내로, 피하로 및 근육 내를 포함한다. 본 발명의 조성물은, 또한 이식의 형태로 투여될 수 있고, 이는 조성물의 느린 방출뿐만 아니라 느리게 제어된 i.v. 주입을 가능하게 한다. 특정 양상에 따라, 미토콘드리아 막 전위 감소제 또는 이들의 제형은 경구적으로 투여된다.
특정 양상에 따라, 미토콘드리아 막 전위 감소제 또는 이들의 제형은 식품 보조제로서 투여된다.
특정 양상에 따라, 미토콘드리아 막 전위 감소제 또는 이들의 제형은 주사가능한 제형으로 투여된다.
개인에게 단일 또는 다중 복용으로 투여된 복용량은, 약동학적 성질, 환자 상태 및 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 크기), 증후의 정도, 동시 치료, 치료의 빈도 및 이들의 효과를 포함하는 다양한 인자들에 따라 변화할 것이다.
병행 요법(Combination)
설명된 본 발명, 다음 실시예들은 설명의 방법으로 제한없이 제시된 것이다.
본 발명에 따라, 미토콘드리아 막 전위 감소제 또는 이들의 약제학적 조성물을 포함하는 이들의 제형은, 단독으로, 또는 조혈 기능의 부재와 관련된 질병 또는 질환의 예방 또는 치료, 또는 혈액 회복을 촉진하거나 및/또는 조혈 세포-제거된 환자들 내에서 감염 위험을 방지 또는 완화시키는데 유용한 공동 약제(예를 들어 다중 약제 식이요법)와 병행하여 투여될 수 있다.
본 발명은, 본 발명에 따른 본 발명의 화합물 또는 이들의 제형의 투여를 포함하며, 여기서 이것은 대상에 투여되는데, 조혈 기능의 부재와 관련된 질병 또는 질환의 예방 또는 치료에 유용하거나, 또는 조혈 세포-제거된 환자에서 혈액 회복의 촉진 및/또는 감염 위험성을 방지 또는 완화시키는데 유용한 다른 치료 요법 또는 공동 약제 투여 전, 동시에 또는 연속해서 투여된다.
공동 약제와 동시에 투여되는 본 발명에 따른 본 발명의 화합물 또는 이들의 제형은, 동일 또는 다른 조성물 내에 그리고 동일 또는 다른 투여 루트에 의해 투여될 수 있다.
일 실시예에 따라, 미토콘드리아 막 전위 감소제를 포함하는 약제학적 제형을 제공하며, 이는 조혈 기능의 부재와 관련된 질병 또는 질환의 예방 또는 치료하기 위하여 유용하고, 또는 조혈 세포-제거된 환자 내 혈액 회복을 촉진 및/또는 감염 위험을 제거하거나 또는 완화시키는데 유용한 공동 약제, 예를 들어 백혈구 감소증의 치료에 사용되는 G-CSF 유사체 (i.e. 필그라스팀) 또는 자가 면역 혈소판 감소증의 치료에 사용된 TPO 수용체 유사체 (i.e. N-PLATE, Revolade)와 병행된다.
일 실시예에 따라, 미토콘드리아 막 전위 감소제를 포함하는 약제학적 제형을 제공하며, 이는 HSC 탈격의 화학요법에 유용한 적어도 하나의 공동 약제, 예를 들어 G-CSF 유사체 (i.e. 필그라스팀, 페그필그라스팀) 또는 항균성/항진균성 예방 (i.e. 스타비실린(Stabicilline), 시프로플록사신(ciprofloxacine), 박트림(Bactrim), 포사코나졸(posaconazole), 보라코나졸(voraconazole) 또는 플루코나졸(fluconazole))과 함께 병용된다.
환자
일 실시예에서, 본 발명에 따른 환자는, 조혈 기능의 축소 또는 부재의 결과 감소된 혈액 세포 준위와 관련된 질병 또는 질환으로 고통받는 환자 또는 대조군 혈액 세포 준위와 비교하여, 감소된 혈액 세포 준위를 발전시킬 위험이 있는 환자들이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 환자는 조혈 세포 제거된 대상이다.
추가 실시예에서, 감소된 혈액 세포 준위는, 조혈계, 예를 들어 이에 한정되지는 않지만, 선천성 골수 부전증 증후군, 특발성 혈소판 감소증, 재생불량성 빈혈 및 골수이형성 증후군을 포함하는 조혈계의 원시적 또는 자가 면역 질환에 부차적이이다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 환자는, 심각한 백혈구 감소증 및/또는 혈소판 감소증으로 고통받거나, 또는 심각한 면역학적 질환으로 고통받는 대상들이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 대상은 조혈모 이식후 대상이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 대상은 혈액학적 및 면역학적 질병 및 암으로 고통받는다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 환자는 자가면역 혈구 감소증, 특히 난치의 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP)으로 고통받는 대상이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 대상은 신생 세포를 위하여 탈격의 화학 요법을 받는 대상이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 대상은 혈액암으로 고통받는다.
추가 특정 실시예에서, 본 발명에 따른 대상은 백혈병, 골수이형성 증후군, 골수증식 증후군 및 림프종으로부터 선택된 혈액암으로 고통받는다.
또 다른 추가 특정 실시예에서, 본 발명에 따른 환자는, 약물학적 부작용으로서 감소된 혈액 세포 준위를 갖는 대상들이다.
또 다른 추가 특정 실시예에서, 본 발명에 따른 대상은 나이 많은 대상 또는 화학요법과 같은 면역 제거 치료에 사전에 노출된 대상과 같은 제한된 골수 저장량을 갖는 대상들이다.
또 다른 추가 특정 실시예에서, 본 발명에 따른 대상은, 감소된 혈액 세포 준위를 갖거나 대조군 혈액 세포 준위에 비교된 줄어든 혈액 세포 준위를 발전시킬 위험이 있다. 이들 대상은, 혈액암 (e.g., 백혈병, 림프종), 혈액 질환(e.g., 유전성 빈혈, 선천성 대사장애증, 재생불량성 빈혈, 베타 지중해 빈혈, 블랙판 다이아몬드 증후군, 공세포백색질장애, 겸상 적혈구 빈혈증, 중증 합병성 면역결핍증, X 연관 림프증식성 증후군, 비스코트 올드리치 증후군, 헌터 증후군, 헐러 증후군 레쉬 니한 증후군, 골석화증)으로 고통받는 대상, 면역계의 화학 요법 구조를 받는 대상들 및 다른 질병들(e.g., 자가면역 질환, 당뇨병, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스)로 고통받는 대상들이다. 게다가, 본 발명에 따른 대상은, 심각한 백혈구 감소증 및/또는 심각한 혈소판 감소증 및/또는 심각한 빈혈을 나타내는 환자, 예를 들어, 이에 한정되지 않지만, 이식 후 환자 또는 고형 종양에 대한 탈격의 화학 요법을 받는 대상, 독성, 약물-유도되거나 또는 감염성 조혈 부전증(i.e. bencene-유도체, 클로란페미콜, B19 파르보바이러스, etc.) 으로 고통받는 환자뿐만 아니라 골수이형성 증후군, 심각한 면역 질환, 또는 중추(i.e. Fanconi 빈혈) 또는 말초 기원(i.e. G6PDH 결핍증)으로부터 어느 것이든 선천성 혈액학적 장애로 고통받는 환자를 포함한다.
여기 인용된 참조 문헌들은 전체로 참조로서 여기 통합된다. 본 발명은 여기 설명된 구체적 실시예 및 도면에 의해 범위가 제한되지 않으며, 본 발명의 개별 양상의 단일 설명으로 의도되며, 기능적으로 등가 방법 및 성분들은 본 발명의 범위 내이다. 본 발명을 설명하는 실시예들은 임의의 방법으로 본 발명의 범위를 제한하고자 의도되는 것은 아니다.
실시예
Sca1 (줄기 세포 항원 1), SCF (줄기 세포 인자), TPO (트롬보포이에틴), FGF -1 (섬유아세포 성장인자 1), IGFBP2 (인슐린 성장인자 결합 단백질 2).
실시예 1: 장기 재구성 능력을 갖는 HSC 하부-집단의 미토콘드리아 막 전위 특징의 확인
테트라메틸로다민 메틸에스테르(TMRM) 형광에 의해 지적된 것처럼, 미토콘드리아 막 전위 (ΔΨm)가 사용되어 다음과 같이 인비트로 및 인비보에서 HSC 및 MPP의 신진 대사 상태를 추척한다:
표현형으로 규정된 HSC 및 전구 세포는 인비트로에서 별개의 ΔΨm를 나타낸다
HSCs 및 이들의 밀접하게 관련된 자손은, 표현형으로 규정된 조혈 줄기 및 전구 세포 집단에 대한 표면 마커들에 대해 가장 공통적으로 사용된 병용방법들에 의해 분리되었다(사용된 전구 세포, CPs: c-Kit+; LKS: Lin- c-Kit+ Sca-1+ (i.e. 골수 내 모든 다능성 줄기 세포 및 전구 세포를 포함하는 집단); 단기 HSCs: LKS CD150+ CD34+ (ST-HSC); 장기 HSCs: LKS CD150+ CD34- (LT-HSC)), 이하 규정된 대응하는 항체를 사용함. ΔΨm 준위는, 세포 내 OXPHOS의 준위와 관련있는 미토콘드리아 분극을 보고하기 위하여(Folmes et al., 2011, Cell Metab 14, 264-271), 활성 미토콘드리아에 의해 용이하게 격리된 세포-투과성 염료, TMRM으로 표현형으로 세포 표지된 것들에 대해 유동 세포 계수(flow cytometry) 및 콘포칼 현미경(confocal microscopy)으로 분석되었고, 이하 규정된 프로토콜을 따른다.
유동 세포계수 및 형광 활성화된 세포 분류 ( FACS )
골수 (BM) 세포는, 부서진 골 및 뼈의 C57Bl/6J 및 C57Bl/6J Ly5.1으로부터 분리되었다. 조혈 줄기 세포 및 전구 세포의 유동 세포계수 분석은, 신선하게 분리된 골수(BM)에서 수행되었다. 세포 현탁액은 70 ㎛ 세포 여과기를 통해 여과되었고, 적혈구 세포는 적혈구 세포 용해 완충제(eBioscences)로 배양되어 제거되었다. 계통-양성 세포가 자성적 계통 소모 키트(Miltenyi Biotech)로 제거되었다. 세포 현탁액은 줄기 세포 및 전구 세포에 특이적 항체의 패널로 착색되었고, BD LSRII 및 BD FACS Aria II에서 각각 분석되거나 또는 FACS-분류되었다.
미토콘드리아 활성의 분석
신선하게 분리된 BM 세포는 1시간 동안 37℃에서 200 nM TMRM (Invitrogen)으로 배양되었고, 이후 다른 조혈 줄기/전구 세포 구획에 대해 다음 특이적 항체로 착색되었다: Biolegend, eBiosciences 및 BD (Becton, Dickinson and Company)으로부터 구매된 cKit (2B8), Sca1 (D7), CD150 (TC-15-12F12.2), CD34 (RAM34), CD45.2 (104), CD45.1 (A20), Gr1 (RB6-8C5), F4/80 (BM8), CD19 (6D5), CD3 (17A2), CD16/CD32 (2.4G2)에 대한 랫트 mAbs. CD3, CD11b, CD45R/B220, Ly-6G, Ly-6C 및 TER-119에 대한 바이오티닐화된 mAbs의 혼합물이 계통 칵테일(BD)로 사용되었다. 표지된 세포는 FACS-분류되거나 또는 유동 세포계수로 분석되었다.
콘포칼 영상화를 위하여, LT-HSC, ST-HSC, MPPs 및 전념한 전구 세포가 분류되었고, 6 시간 동안 밀착된 폴리-L-리신(PLL)-코팅된 유리 슬라이드에 놓여졌다. 20 nM TMRM 또는 JC1 (Cayman Chemical)는 이후 배지에 추가되었고, 살아 있는 세포 영상들은 Leica SP5 콘포칼 현미경에서 얻어졌다. MitoTracker® Deep Red (Invitrogen) 착색을 위하여, 세포들은 37℃에서 1시간 동안 200nM로 배양되었다. NADH 자동 형광은 UV 레이저(ex: 350 nm, em: 460 nm)를 사용하여 유동 세포 계수로 측정되었다.
각 집단은 개별 준위의 TMRM 강도를 나타내었고, 이는 유동 세포계수(도 1 A) 및 현미경-기초 판독(도 1B)에 의해 나타난 것처럼 가장 원시적 집단으로부터 가장 헌신적 집단으로 단계적으로 증가한다: ΔΨm는 LT-HSCs에서 가장 낮았고(도 1A), 콘포칼 현미경 관찰법으로는 거의 검출되지 않게 되었다 (도 1 B).
이들 데이터는, 미토콘드리아 신진대사는, 아마도 ROS 제조에 의해 가해진 세포성 손상으로부터 이들 희귀하고 오래 살아남은 세포를 보호하는 전략으로서, 가장 원시적인 침묵 HSC 내로 제한된다는 것을 뒷받침한다. 매우 대조적으로, 매우 증식적인 조혈 전구 세포는 미토콘드리아 신진대사를 증가시키는 것에 의해 이들의 증가하는 에너지 요구를 만족시킨다.
낮은 ΔΨm 은 배타적으로 인비보에서 장기 혈액 재구성 능력을 갖는 HSC 하부집단을 표시한다.
인비보에서 다중-계통 혈액 재구성 분석을 사용하여, 표현형으로 규정된 LKS (골수 내 모든 다능성 줄기 세포 및 전구 세포를 포함하는 집단), ST- 및 LT-HSCs에서 시험되었고, 이 정도까지 ΔΨm 준위는 장기 줄기 세포 기능을 보고할 수 있다.
이 목적에 대하여, LKS 하부 집단은 FACS로 분류되었으며, 낮은(LKS:TMRM낮 은) 및 높은 (LKS:TMRM높은) ΔΨm 준위로 분리되었다. LKS:TMRM낮은에 대한 판독 범위는 ~ 30% 낮은 집단이고, LKS:TMRM높은에 대한 판독 범위는 ~ 30% 높은 집단이다. 이들 2개 표현형을 치명적으로 방사선 조사된 마우스로 이식한 것은 이하 설명된 것처럼 이중 유사유전자형 대립형질 시스템을 사용하여 수행되었다.
이식
C57Bl/6 Ly5.2 마우스는 850RAD에서 치명적으로 방사선 조사되었고, C57Bl/6 Ly5.1 마우스로부터 유래된 공여자 세포 및 C57Bl/6 Ly5.1/5.2 마우스로부터 유래된 경쟁자 세포로 이식되었다. LKS 이식을 위하여, 1000 LKS (TMRM낮은 또는 TMRM높 은) 공여자 세포는, 수용체 마우스 내에 250*103 총 BM 경쟁자 세포와 함께 이식되었다. LKS CD150+CD34- ('LT-HSC') 및 LKS CD150+ CD34+ ('ST-HSC') 이식에 대하여, 80 LT-HSC (TMRM낮은 또는 TMRM높은) 또는 80 ST-HSC (TMRM낮은 또는 TMRM높은)은 수용체 마우스 내 250*103 총 BM 경쟁자 세포와 함께 이식되었다.
말초 혈액은 4, 8 및 16 주에서 수집되어 유동 세포계수 분석으로 공여자-유래 세포의 재증식 단위(repopulating unit, RU) 및 이들의 분화 상태를 결정한다. 1 RU는 100,000 경쟁자 골수 세포 내에 발견된 재증식 능력에 등가이다.
인비트로-배양된 LT-HSCs의 이식을 위하여, 5일 동안 배양된 200 LT-HSCs의 자손들은 이들의 TMRM 신호(TMRM낮은 또는 TMRM높은)를 기초로 FACS-분류되었고 2*106 헬퍼 세포와 함께 이식되었다. 헬퍼 세포는 Sca1 및 CD150 양성(positive) 세포 (Miltenyi Biotech)에 대해 제거되었던 C57Bl/6 Ly5.1/5.2 마우스의 BM으로부터 유래되었다. 말초 혈액은, 4, 8 및 16 주에서 수집되어 키메리즘의 퍼센트를 결정하였다. 조혈 키메리즘은 줄기 세포 이식(SCT)을 뒤따르는 숙주 내 공여자 및 수혜자 세포의 수를 측정한 것이고 말초 혈액 세포 분석에 의해 측정되었다.
CFSE-TMRM 이식을 위하여, LT-HSCs는 분류되었고 이하 설명된 것처럼 CFSE에 대해 착색되었다. 2-일 배양 기간의 끝에, 한번 분할한 세포 자손은 TMRM으로 착색되고, TMRM낮은 및 TMRM높은 신호를 기초로 재분류되었다. 각 수혜자 마우스는 2*106 헬퍼 세포와 함께 각 집단의 100 세포를 주입하였다. 말초 혈액은 4, 8 및 16 주에서 수집되고 키메리즘의 퍼센트를 결정하였다.
이차적 이식: 이차적 수혜자 C57Bl/6 Ly5.2 마우스는 850RAD에서 치명적으로 방사선 조사되었고, 원시적 수혜자의 3백만 골수 세포로 이식되었다. 말초 혈액은 4 및 8주에서 수집되어 키메리즘의 준위를 결정하였다.
장기 다중-계통 혈액 재구성 분석은, LKS 내에서, 단지 낮은 ΔΨm (i.e. LKS:TMRM낮은)를 갖는 세포가 장기 다중-계통 재구성을 나타내는 것으로 보였다(도 2A). 그러므로, 기존 표면 마커 레퍼토리에 신진대사 마커(낮은 ΔΨm)를 첨가하는 것으로, 주로 MMPs를 포함하는 좋지 못하게 규정된 집단(LKS)으로부터 장기 재구성 능력을 갖는 세포를 정제할 수 있게 한다.
동일한 분류 전략을 사용하여, ST-HSCs, ST-HSC:TMRM낮은 및 ST-HSC:TMRM높은 은, 혈액 시스템(도 2B)를 재구성하는 이들의 능력에 대해 비교되었고, 놀랍게도, ST-HSC 집단 내에서, 단기 다중 계통 재구성 능력은, TMRM낮은 분획물 내에서 거의 배타적으로 제한되었다(도 2B). 게다가, 표현형으로 규정된 LT-HSCs는 2개의 기능적으로 매우 분명한 집단들로 분리될 수 있고, 낮은 미토콘드리아 활성(LT-HSC:TMRM낮은, 집단의 ~55%에 대응함)을 갖는 집단만이 장기 다중-계통 재구성할 수 있는, 반면에 LT-HSC:TMRM높은 세포는 그렇게 하기에 완전히 실패하였다 (도 2C). 중요하게, 프로피디움 요오다이드 착색은 분석된 4개 집단들 사이에서 생존 가능성에 임의의 차이를 나타내지 않으며, 생착의 결핍이 분화적 세포 사멸에 의해 야기되었다는 가능성을 배제하였다.
이들 인비보 데이터는 표현형으로 규정된 HSCs 에서 놀라운 기능적 이질성을 밝힌다. 활성화된 미토콘드리아(i.e. LT-HSC:TMRM높은)을 갖는 LT-HSCs는, 단기에서 조차 혈액 재구성을 하지 않는다는 관찰(도 2C)은, 이들 세포가 '진정한(true)' LT-HSCs에 계급적으로 관련되지 않을 수 있다는 것을 암시한다. 이들은 대신에, 동일한 면역 표현형에서 수행된 최근 인비보 단일-세포 다중-계통 재구성 분석에 의해 나타낸 것처럼, 장기 계통-제한된 전구 세포가 생기게 하는 HSCs를 대표한다 (Yamamoto et al., 2013, 세포 154, 1112-1126). LT-HSC 구획 내에서 HSC TMRM높은 세포 대 TMRM높은 세포가 다른 준위의 그러한 계통-바이어스된 세포 타입을 포함하고 있는지 여부를 시험하기 위하여, CD41이 거핵세포용 기능적 마커로 사용되어 2개 표현형을 더 분리하였다. 이전 연구는, HSC 구획 내 CD41-발현 세포는 강한 골수 바이어스(Gekas et al., 2013, 혈액 121, 4463-4472) 및 단지 단기- 또는 중기 재증식 활성(Yamamoto et al., 2013, supra) 을 갖는다는 것을 보여줬다. 본 실험에서, LT-HSC:TMRM낮은 세포는, 다수의 세포가 CD41 양성인 LT-HSC:TMRM높은 세포와 매우 대조적으로, CD41에 대해 음성적인 세포를 약 70% 포함한다.
그러므로, 관찰된 기능적 이질성은, 기능적 LT-HSCs에 비교된 다른 ΔΨm 준위를 가질 수 있는 CD41+ 거핵세포 전구 세포의 존재로 적어도 부분적으로 설명될 수 있다.
전사체 분석은 줄기 세포성의 손실과 미토콘드리아 경로의 유도를 연결한다.
다음으로, 4개의 새롭게 확인된 HSC 표현형을 연구하여, 이하 설명된 것처럼, Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST 분석을 사용하여 이들 중에서 다르게 발현된 경로 및 유전자를 확인하였다. 유전자 존재론 분석(gene ontology analysis)은, 가장 조절된 유전자들이 세포 사이클 및 미토콘드리아 경로에 대응한다는 것을 나타내었다. 두 가지 경로들은 LT-HSC:TMRM낮은 및 ST-HSC:TMRM높은 세포 사이에서 매우 반대되는 방향으로 다르게 조절된다. 이들 경로는 가장 줄기 세포-유사 집단 내에서 하향 조절되는 동안, 이들은 최소 원시적 HSC 구획이 증가한다. 이들 2개의 중간체 집단(LT-HSC:TMRM높은 및 ST-HSC:TMRM낮은)은, 세포 사이클링 및 미토콘드리아 활성 유전자의 상향- 및 하향 조절에서 대략적인 등가 활성을 나타낸다. 특히 인비트에서 장기 다계열 재구성할 수 있는 집단에 대응하는 LT-HSC:TMRM낮은 세포는, 모든 다른 집단과 매우 대조적으로, 시트르산(또는 트리카복시산, TCA) 사이클 유전자의 매우 낮은 발현 준위에 의해 특징된다. 미토콘드리아 내에서 TCA 사이클은 OXPHOS에 매우 밀접하게 연결되어 있다. 그러므로, 이들 데이터는, 대부분 자기 재생 HSCs가, 아마도 ROS에 의해 부여된 세포성 손상으로부터 이들을 보호하기 위하여 TCA 사이클을 완화시키는 메커니즘을 갖추고 있다는 것을 암시한다.
골수 내 정지 및 순환 HSCs는 유사한 ΔΨm 프로파일을 갖는다
낮은 ΔΨm 및 상기 도 2에 나타난 인비보 기능 사이의 관계를 기초로, 타고난 골수, 침묵 및 사이클링 LT-HSC는, 유사한 준위의 미토콘드리아 활성을 가질 수 있으며, 즉 혐기성 해당 반응(anaerobic glycolysis)은 세포 사이클 상태와 무관한 줄기세포성의 특징일 것이다.
이 가설을 입증하기 위하여, 세포 사이클 상 분석이, 낮은 및 높은 ΔΨm으로 나누어진 새롭게 분리된 HSCs 상에 하기 설명된 것처럼 Ki67 및 Hoechst 착색을 사용하여 수행되었다. 세포 사이클 염색은 TMRM-계 분석과 양립할 수 없는 세포 고정과 관련이 있기 때문에, MitoTracker® Deep Red가 ΔΨm를 위한 마커(Simsek et al., 2010, Cell Stem Cell 7, 380- 390)로 사용되었고, 이 마커는 TMRM에 비교할만한 방법으로 줄기 세포 및 전구 세포에서 ΔΨm를 표지하기 위하여 제어되었다. 항상성 조건하에서, ca. 70%의 세포에 대응하는 침묵 상태 및 사이클링 HSCs는 구별할 수 없는 ΔΨm 프로파일을 갖는다.
세포 분리 전에 48 및 24 시간 수행된 IFN-α의 피하 주사를 통해, 마우스를 인터페론-알파(IFN-α) 처리( Essers et al., 2009, Nature 458, 904- 908)하여, 인비보에서 직접적으로 휴지기를 탈출하도록 활성화된 HSCs에서 유사한 분석을 행하였다. 대조군 마우스에 비하여, IFN-α 처리는 이전 데이터와 유사하게 ca. 30 내지 50%의 사이클링(Ki67+) HSCs의 수가 크게 증가된 결과를 가져왔다(Essers et al., 2009, supra). 그러나, 단지 항상성 조건하에서와 같이 침묵 및 사이클링 HSCs의 ΔΨm 준위는 크게 다르지 않았다.
이들 데이터들은, 인비보에서, 낮은 ΔΨm은 침묵 LT-HSC 상태의 독특한 특징은 아니나, 이들의 세포 사이클 상태와 무관한 기능적 HSCs를 나타내는 것처럼 보인다는 것을 나타낸다.
세포 사이클 염색
분류된 HSCs는 고정되었고, 제조자의 지침서에 따라 Cytofix/Cytoperm plus kit (BD)를 사용하여 투과되었다. 고정된 세포는 이후 4℃에서 FITC Ki67 (BD)으로 밤새 그리고 Hoechst33342 (Invitrogen)으로 10분간 염색되었다.
HSC의 인비보 활성화
HSC는 공개된 프로토콜(Essers et al., 2009, supra)을 따라 인터페론-알파(IFN-α) 처리에 의해 활성화되어 휴지기를 탈출하였다. 간단하게, C57Bl/6J 마우스 내로 한 피하 주사는, 골수 추출 전에 48 및 24 시간 10,000U의 IFN-α (R&D 시스템)으로 수행되었다. 대조군 마우스는 등가 부피의 비이클(PBS+0.1%BSA)로 주사되었다.
실시예 2: 인비트로에서 HSCs의 자기 재생 분할의 특징으로서 낮은 미토콘드리아 막 전위
줄기세포성 (도 2B,C)의 기능적 판별기로서 낮은 ΔΨm를 확립하였고, 인비보에서 침묵 및 사이클링 LT-HSCs의 비교할만한 ΔΨm 준위를 밝혔으며, ΔΨm 준위가 이종 벌크 배양액 내에서 HSCs를 분화시키는 것과 자기 재생을 구별할 것인지 여부를 연구하였다(도 3). HSCs가 인비트로에서 배양될 때, 표면 마커의 병행적 발현은, 방사선 조사된 마우스 내로 재이식될 때 이들의 인비보 기능을 예측하는데 실패한다(Zhang et al., 2005, 혈액 105, 4314-4320). 실제로, 제한된 다중-계통 혈액 재구성 능력을 이미 갖고 있는, 이들 최초 자손과 LT-HSC를 구별할 수 있게 하는 전략은 현재 없다.
TMRM-기초된 판독이 분화 분열로부터 떨어진 자기 재생을 말하기 위해 사용될 수 있는지 여부를 시험하기 위하여, CD45.1 공여자 마우스의 200 LT-HSCs가 표면 마커 발현(Lin-, Sca1+, cKit+, CD150+ 및 CD34-)을 기초로 분리되었고, 이하 설명된 것처럼, 자기 재생 인자, 앙기오포이에틴-유사 단백질, 인슐린-윳 성장인자 결합 단백질 2, 줄기 세포 인자, 섬유아세포 성장인자 1 및 트롬보포이에틴(Huynh et al., 2008, 줄기 세포 26, 1628-1635 (도 3A)에 설명되어져 있음)의 칵테일을 포함하는 무혈청 배지 내에서 인비트로 팽창되었다. 세포 팽창 5일 후, 세포는 TMRM낮은 및 TMRM높은 표현형을 기초로 FACS에 의해 재분류되었고, 상술된 것처럼 치명적으로 방사선 조사된 CD45.2 수혜자 마우스로 이식되었다. 상기 실시예 1에 제시된 것처럼 인비보에서 기능적 HSC를 직접적으로 분리하기 위하여 낮은 TMRM 형광을 사용한 결과와 일치하여, 낮은 TMRM 신호는 또한 배양된 HSCs의 장기 혈액 재구성 능력을 예측하였다 (도 3B). 배양된 HSCs를 이식한 후 4개월에, FACS 분석에 의해 말초 혈액 키메리즘의 분석은, TMRM 낮은 세포가, 높은 TMRM 신호 (TMRM높은 세포)를 갖는 세포에 비하여 매우 높은 장기 다중-계통 혈액 재구성 준위를 유도한다는 것을 나타냈다. 이것은, 배양액의 자기 재생 HSCs가 골수로부터 신선하게 분리된 HSCs과 동일한 대사적 특징을 기초로 검출될 수 있다는 것을 암시한다(도 2).
그러나, 배양된 HSCs의 작은 분획물은 배양액 내에서 오랜 시간 후에조차 침묵을 유지하는 것으로 이들의 줄기 세포 포텐셜을 유지할 수 있는 것으로 알려져 있기 때문에(e.g. Lutolf et la., 2009, Integr Biol ( Camb ) 1, 59-69), 도 3B에 보여진 TMRM낮은 세포로부터의 재구성은 분할하지 않는 HSCs의 결과이다. 모 HSC가 받게 되는 세포 분할의 정확한 수를 추적하기 위하여, 이들 벌크 배양액에서 자기 재생 세포의 가능성을 배제하고 자기 재생 세포를 명백하게 확인하기 위하여, LT-HSCs는 이하 설명된 것처럼 카복시 플루오레신 숙시니미딜 에스테르(CFSE)로 균일하게 표지되었고, 이는 CFSE 강도가 각 분할에 따라 ~50% 감소되도록 모든 세포 분할액으로 희석된 살아있는 세포-투과성 염료이다. 이들 방법에 의하여, 팽창 배양액에서 2일 후 정확하게 한번 분할한 배양된 HSC 딸 세포는, FACS-분류되었고, 추가로 TMRM낮은 및 TMRM높은 하부-집단으로 분리되었다. 각 집단의 수백 개의 세포가 치명적으로 방사선 조사된 마우스 내로 이식되었고, 장기 다계열 재구성이 16주 이후까지 분석되었다. 장기 다계열 재구성은 다시 TMRM낮은 하부 집단으로 제한되었다(도 3C). 게다가, 이차적 이식은, TMRM낮은 분획물의 장기 생착을 나타내었다(도 3C). 가장 중요하게, 이들 데이터는 낮은 ΔΨm 은 단지 인비보에서 침묵 LT-HSC의 특징일뿐만 아니라, 자기 재생 세포 분할을 겪는 활성화된 줄기 세포의 특징이라는 것을 나타낸다. 우리 지식에 의하면, 이것은, 공통적으로 사용된 세포 표면 레퍼토리가 그러한 세포를 확인하는데 실패한 곳인 인비트로에서 HSCs의 자기 재생 분할을 1차적으로 판독한 것이다.
HSC 배양액
HSCs는 5일 동안 U-바닥 96-웰 플레이트 내에서 '팽창' 조건하에서 배양되었다. 배양액은, 10 ㎍/ml Heparin (Sigma), 100 ng/ml SCF (R&D Systems), 2 ng/ml Flt3 리간드(R&D), 20ng/ml TPO (R&D Systems), 10ng/ml FGF-1 (Invitrogen), 500 ng/ml IGFBP2 (R&D Systems), 100 ng/ml AngL-3 (R&D Systems)으로 공급된 Stemline II(Sigma) 내에서 유지되었다. 배양 주기 말기에, 세포는 TMRM으로 염색되었고 유동 세포계수로 분석 또는 분류되었다. 분화를 유도하기 위하여, HSCs는 20 ng/ml IL-3 (R&D Systems) 및 100 ng/ml IL-6 (R&D Systems)이 보충된 기초 배지(100 ng/ml SCF 및 2 ng/ml Flt3 리간드를 포함하는 Stemline II) 내에서 배양되었다.
CFSE 염색
새롭게 분류된 LT-HSCs는 37℃에서 20분 동안 1:400 CFSE 저장 용액 (Cayman chemicals; CFSE cell division assay kit)으로 배양되었다. 세포를 펠렛화하고, 37℃에서 20분 동안 10% FBS를 포함하는 Stemline II (Sigma) 1ml 내에 재현탁시켰다. 이후, 세포를 Stemline II(Sigma) 1ml로 2번 세척하고 배양액에 넣었다.
실시예 3: 분화 조건하에서 HSC 자기 재생의 보존
HSC 운명 조절을 통해 세포의 미토콘드리아 활성 준위가 조사되었다. 구체적으로, 높게 증식적 MMPs로 빠르게 HSCs를 분화할 배양 조건이 선택되고, 줄기 세포성을 유지하는 데 있어서 ΔΨm의 확립을 차단하는 효과가 조사되었다. 이 목적을 위하여, 내부 미토콘드리아막을 투과가능하게 하고 이의 포텐셜을 방해하는 트리플루오로카보닐시아나이드 페닐히드라존 (FCCP)이 ATP 생성으로부터 전자 전달을 해제하는 탈공역제로서 사용되었다. 사실상, 유동 세포계수 분석은, FCCP에 의한 ΔΨm의 붕괴로 인하여 배양된 HSCs 내 NADH 준위가 감소되는 결과가 되는 것을 나타내었다.
첫 번째 시리즈 실험에서, 양적 클론 분화 분석(상술된 것과 같은 단기- 및 장기 콜로니 형성 단위(CFU) 분석)이 사용되어 미토콘드리아 해제가 조혈 줄기 및 전구 세포의 콜로니 형성 행동 및 효율에 어느 정도 영향을 미칠 수 있는지를 테스트하였다 (도 4A-C). FCCP의 존재하에서, 2일 동안 다른 조건하에서 배양된 15,000 전체 골수 세포는, 콜로니 총 수가 놀랍게도 감소하였을 뿐만 아니라, 가장 원시적 전구 세포에서만 발생하는 클론형성 다중-계통 콜로니(CFU-GEMMs: 콜로니 형성 단위-과립구, 적혈구, 대식세포, 거핵세포)의 퍼센트가 증가하는 것을 나타내었다(도 4A, 오른쪽 패널). 대조적으로, 콜로니의 총 수 및 보다 헌신적인 전구 세포(e.g. 대식세포 콜로니, M, 과립구/대식세포 콜로니, GM)로부터 유래된 콜로니 퍼센트가 놀랍게도 감소되었으며(도 4A, 왼쪽 및 중간 패널, 각각), 이는 FCCP가 분화 동안 자기 재생을 강제하여 콜로니 형성을 느리게 만들 수 있다는 것을 암시한다. 유사하게, 100 LT-HSC:TMRM낮은 세포는 FCCP의 존재 또는 부존재시 분화 조건하에서 2일 동안 일차적으로 배양되었으며(도 4B), 보다 헌신적 전구 세포(Mk, G, M 및 GM) (도 4B, 왼쪽 및 중간 패널)로부터 유래된 콜로니의 빈도가 놀랍게 감소하는 것과 FCCP (도 4B, 오른쪽 패널)로 배양될 때 가장 원시적 세포(CFU-GEMM)로부터 유래된 것들이 수반되어 증가하는 것이 관찰되었다. 이들 실험들은, 분화-유도 동안 미토콘드리아 해제가, 자기 재생으로 향하여 HSC 운명을 왜곡시킨다는 것을 강하게 암시하였다. 각 실험 조건(+/- FCCP)의 사진은, 미토콘드리아 해제의 경우에 눈으로 볼 수 있는 커다란 GEMM 콜로니(백색)를 나타낸다.
이들 결과들을 더 확증하기 위하여, LT-HSC:TMRM낮은가 FCCP의 존재 또는 부존재시 상술한 것처럼 분화 조건(SCF, Flt3, IL-3 및 IL-6) 하에서 5일 동안 배양되고, 이하 설명된 것처럼 2*106 헬퍼 세포와 함께 치명적으로 방사선 조사된 마우스 내로 모든 자손들을 이식한 장기 혈액 재구성 분석이 수행되었다. 놀랍게도, FCCP-노출된 세포는 수혜자 마우스 내에서 장기 다계열 혈액 재구성이 드라마틱하게 보다 높은 준위로 나타났다(도 4C). 중요하게, CFSE로 HSCs를 표지하고 이들의 분할 역사를 추척하는 것으로, 이 효과가 FCCP 투여시 침묵 유도에 의한 것임을 밝힐 수 있었으며, 이는 배양액 내 모든 세포가 서너번 빠르게 분할하기 때문이다. 그러므로, OXPHOS를 차단하는 것에 의해, 정상적으로 빠르게 분화할 HSCs는 강제적으로 자기 재생 분할하게 된다. 상기 인비보 데이터와 유사하게, 이들 데이터는 HSCs의 자기 재생 분할이 OXPHOS를 요구하지 않고 따라서 미토콘드리아-독립 과정을 통해 세포에 의해 실행될 수 있다는 것을 나타낸다.
이들 데이터 모두는, 각각의 표현형으로 정의된 조혈 줄기 및 전구 세포 구획이 매우 분명한 ΔΨm 준위를 갖는다는 것을 나타낸다. 인비보 다중-계통 혈액 재구성 분석은, 각 집단 내에서, 기능적 단기 및 장기 자기 재생 활성이 보다 낮은 ΔΨm을 갖는 하부 집단으로 정확하게 제한된다는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, 이들 세포 사이클 상에 의해 분리된 HSCs의 ΔΨm 준위들의 비교는,, 항상성 동안 및 급성 스트레스하에서, 침묵 및 사이클링 HSC가 이들의 ΔΨm 준위들을 기초로 하는 유사한 신진 대사 프로파일을 갖는다는 것을 나타낸다. 이는, HSCs의 별개의 신진 대사 프로그램은 이들의 침묵 상태로 제한되는 것이 아니라, 오히려 이들 운명 선택의 지침이라는 것을 나타낸다. 실제로, 인비트로에서, 이종 HSC 팽창 배양액에서, 분할 추적 분석은, 자기 재생 HSCs는 이들의 낮은 ΔΨm으로 인식될 수 있고, 이는 활성화된 미토콘드리아를 갖는 분화된 세포와 뚜렷하게 대조적이다는 것을 나타낸다. 놀랍게도, 전자 전달 사슬의 화학적 해제는, 정상적으로 빠른 분화를 유도하는 배양 조건하에서조차 강제적으로 HSC 자기 재생을 하게 한다.
그러므로, 낮은 미토콘드리아 막 전위 ΔΨm는 HSCs의 강력한 기능적 마커라는 것을 보여줬을뿐만 아니라, 줄기 세포 운명은 HSC 배양 및 치료법에 대한 길을 제공하는 파라미터에 작용하는 것에 의해 조작될 수 있다는 것이 밝혀진다.
공역방지제(uncoupler) FCCP에 노출된 배양된 HSC의 이식
100 LT-HSC:TMRM낮은 세포는 5 μM FCCP의 존재 또는 부존재에서 분화-유도 조건하에서 5일 동안 배양되었다. 세포 후손은 2*106 헬퍼 세포와 함께 치명적으로 방사선 조사된 수혜자 마우스 내로 이식되었다. 말초 혈액은 4, 8 및 12 및 16 주에 수집되어 상술된 키메리즘의 준위를 결정하였다.
HSC 배양액
일부 실험에서, 5 또는 10 μM 카보닐 시아나이드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존 (FCCP) (Sigma)를 상기 배지에 첨가하였다. FCCP 저장 용액은 10mM 농도로 에탄올 내에 분말을 용해시키는 것으로 제조되었다.
이들 데이터 모두는, 미토콘드리아 신진 대사를 기초로 조혈모 세포 운명을 예측 및 지시하는 새로운 연구를 뒷받침한다. 사실상, HSCs 및 이들의 자손들을 정제하는데 공통적으로 사용된 알려진 표면 마커 패널은, 줄기 세포 운명의 메커니즘을 연구하고 이들 희귀한 세포의 임상적 팽창에 대한 전략을 개선하는데 문제가 있는 다른 줄기 세포 포텐셜을 갖는 이종 세포 집단을 높게 분리한다는 것을 나타낸다.
미토콘드리아 활성-기초된 판독, 즉 미토콘드리아 막 전위 ΔΨm을 기존 표면 마커 레퍼토리에 추가하는 것에 의해, 이들 데이터는, 기능적 줄기 세포 내에 줄기 세포 풀을 풍부하게 하고, 다중 계통 재구성이 결핍된 세포 집단(LT-HSC:TMRM높은)을 검출하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다.
그러므로, ΔΨm 는 HSC 장기 다계열 혈액 재구성을 위한 강력하고 유망한 마커로서 작용하고 또한 살아있는, 자기 재생 HSCs를 표시한다. 게다가, 탈공역제, 예를 들어 FCCP로 처리하여 미토콘드리아 활성을 조절하는 것은 분화 조건하에서 인비트로에서 HSCs 운명을 지시할 수 있다. 이들 결과들은, HSC 운명 결정화에서 미토콘드리아 신진 대사의 중추적 역할에 대한 증거를 제공하며, 엑소비보 팽창에 대한 새로운 길 및 미토콘드리아 신진 대사를 통한 HSC 운명의 치료적 조작에 대한 새로운 길을 제안한다.
실시예 4: 마우스 골수 내 조혈 전구 세포 구획의 팽창에서 미토콘드리아 막 전위 감소제의 효과
미토콘드리아 막 전위, NR을 축소시킬 수 있는 약제로 단기(1 주) 및 장기 (4 주) 처리한 것은, 골수 내 조혈 줄기 및 전구 세포 풀 크기 별로 이하 설명된 마우스 내에서 시험되었다.
BM 샘플의 유동 세포계수 분석은 단기- 및 장기 처리 모두에서 조혈 전구 세포 구획의 팽창을 나타내었다(도 5A). 증가된 세포질이 처치 1 주일 후 모든 조혈 전구 세포 구획 내에서 관찰된 반면에, 처치 4주 후에는 단지 단기 구획(ST-HSC)만 팽창된다. 놀랍게도, 전구 세포 팽창은, HSC 풀의 감소가 수반되지는 않았다(도 5A, B). 이것은 NR의 효과가 조혈 전구 세포에 제한되었다는 것, 또는 HSC 운명이 전체 줄기 세포 수를 변경하지 않을 비대칭적 자기 재생 분할의 준위를 보다 높게 촉진시키는 것으로 영향을 받았다는 것을 나타낼 수 있었다.
1-개월 NR-처리된 마우스로부터 유래된 BM은 이전에 설명된 이식 분석(Vannini et al., 2012, Cell Cycle, 211(8):1535- 43)으로 평가된 생착 장점을 나타내지 않으며, 이는 NR이 줄기 세포 구획에 직접적으로 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다. 그러므로, NR-처리는 LT-HSC 집단을 제거시키는 것으로 기대되지 않으며, 이는 때때로 단기 HSCs 및 이들의 자손을 증가시킬 때 가끔 문제가 된다.
콜로니 형성 기능적 분석('CFUs'라 함)는 제조자의 지침서(MethocultTM, 줄기 세포 기술)에 따라 수행되었고, 조혈 전구 세포 구획의 팽창은, 특히 단기 처리된 마우스의 BM 내에서 확인되었다(도 5C). 이 콜로니 증가는 Mk 계통에서 가장 놀라웠다.
실시예 5: 마우스 골수 내 조혈 전구 세포 구획의 팽창에서 미토콘드리아 막 전위 감소제, 니코틴산(NA)의 효과
NR의 전구체이지만 실제로 HSCs 내에 미토콘드리아 막 전위를 크게 줄일 수는 없는 NA(A, B)로 단기(1주) 처리(실시예 9 참조)는, 골수 내 조혈 줄기 및 전구 세포 풀 사이즈에서의 변화를 측정하기 위하여 상기와 같이 마우스 내에서 시험되었다. BM 샘플의 유동 세포계수 분석은 전구 세포 및 줄기 세포 구획에서 어떠한 큰 변화도 나타내지 않았다(도 6A1-A3). 게다가, 세포 사이클 분석은 처리 및 비처리 조건 사이에서 큰 차이를 나타내지 않았고(도 6B-B2), 이는 NR에 비하여 NA의 차별적 효과를 확인하는 것이다.
게다가, 동일한 조건하에서, 니코틴아미드(NAM)을 먹이 공급한 마우스의 골수는 조혈 전구 세포 구획에서 큰 팽창을 나타내지 않았다.
실시예 6: 이식 후 마우스(투여량 제한 이식된 마우스) 내 생존 및 혈액 회복에 대한 미토콘드리아 막 전위 감소의 효과
전구 세포 구획에 대해 분화된 조혈 세포에 종속성을 부여하여, 이식된 마우스의 혈액 회복 및 생존을 개선하는 데 있어서, 본 발명에 따른 미토콘드리아 막 전위 감소제, 특히 NR의 효과가 평가되었다. 프로토콜의 타임 라인이 도 7A1에 보여진다. 말초 혈액 계수는 이식 후 13일에 시작하였고, 3일 또는 4일마다 반복하였다.
놀랍게도 NR-처리된 마우스(사각형) 80%가 생존한 반면에 처리되지 않은 마우스(점선) 모두는 한 달 내에 죽었다(도 7A1). 게다가, NR-처리된 마우스는 보다 빠른 호중구 및 혈소판 회복을 갖는다(도 7B1 및 7B2).
백혈구 감소증의 탈출은 양성 환자 결과에 대한 주요 인자이며, 이는 호중구가 환자 내 감염에 대해 1차적인 장벽을 구성하기 때문에 이식 후 환자가 병원에서 퇴원하게 하는 가장 중요한 결정인자이다. NR 처리된 마우스는 평균적으로 대조군보다 1주일 전에 백혈구 감소증에서 탈출하였다(호중구 > 0.5 G/l). 추가적으로, 심각한 혈소판 감소증(혈소판 계수 > 100 G/l)으로부터 회복은 평균적으로 대조군 마우스에 비하여 NR-처리된 마우스에서 10일 앞선다(도 7B1).
그러므로, NR 처리는 이식의 관점에서 생존 및 혈액 회복을 개선한다.
실시예 7: 인비트로에서 HSCs의 미토콘드리아 활성 및 분할 동기성에서 대한 니코틴아미드 리보시드의 효과
HSC 미토콘드리아 활성에 대한 NR의 효과는 JC1(Mantel et al., 2010, Cell Cycle, 9(10), 2008-17) 및 TMRM 염료( Vannini et al., 2015, in preparation; Nakada et al., 2010, Nature, 468, 653- 658)를 사용하여 미토콘드리아 활성을 측정하는 것으로 평가되었다. NR에 노출된 HSCs는 미토콘드리아 활성이 크게 감소한다(도 8A).
분할하는 HSCs에 있어서 또한, NR은 낮은 미토콘드리아 활성을 갖는 세포의 비율을 높혔으며(도 8B1-B2), 이는 자기 재생 활성의 증가를 나타낸다. 게다가, 단일 세포 준위에서, 세포 증식 동력학에 대한 NR의 효과는 이전에 설명된 것처럼 결정되었다 (Vannini et al., 2012, supra). NR에 대해 노출된 HSCs는 이들의 증식 동력학에서 큰 변화를 갖지 않지만, 이들은 비동기식 분할에서 큰 증가를 나타낸다 (도 8C).
이들 결과들은 NR이 비대칭적 분할쪽으로 HSC 운명을 밀어넣는 가능성을 암시한다.
이들 결과들은 함께 본 발명에 따른 미토콘드리아 막 전위 감소제, 예를 들어 NR을 음식을 통해 처리한 것은 골수 내 조혈 전구 세포 풀의 팽창을 유도한다는 것을 나타내며, 세포 용량 제한 이식 계획으로 시험될 때, 생존이 드라마틱하게 개선되는 결과를 가져온다. 중요하게, HSC 풀 사이즈는 NR 투여에 의해 영향을 받지 않으며, 이는 그러한 처리에서 줄기 세포 제거 위험이 최소화된다는 것을 암시한다.
그러므로, 이들 데이터는, 본 발명에 따른 미토콘드리아 막 전위 감소제, 예를 들어 NR로 처리한 것은, 이식된 환자 또는 고형 종양 또는 심각한 면역 질환을 위해 탈격의 화학 요법을 받는 사람들의 혈액 회복을 증진시키고 HSCs 풀을 유지시키는데 유용할 것이라는 것을 암시한다.
마우스
C57Bl/6J 및 C57Bl/6J Ly5.1를 Charles River Laboratories International에서 구입하였고, 마이크로-아이솔레이터 케이즈 내에서 유지하였다. 마우스에 멸균 음식, 물 및 잠자리를 계속 제공하였다. 니코틴아미드 리보시드 (NR) (Strasbourg 내 Novalix에 의해 트리플레이트 염으로서 관습적 합성됨)은 0.4 g/Kg 마우스의 용량으로 음식 내로 공급되었고, 마우스는 1 및 4주 각각 처리되었다.
생존 및 혈액 회복
C57Bl/6 Ly5.2 마우스는 850RAD로 치명적으로 방사선 조사되었고, C57Bl/6 Ly5.1 마우스 (70*103 및 150*103)으로부터 유래된 총 BM 공여자 세포로 이식되었다. 마우스는 매일 이들의 일반 건강 상태가 평가되었다. 말초 혈액은 도 2A의 프로토콜 타임 라인에 보여진 것처럼 이식 후 13일에 시작하여 3일마다 백혈구 및 적혈구 회복에 대해 분석되었다. 해제자 FCCP에 노출된 배양된 HSC의 이식을 위하여, 5 μM FCCP 의 존재 또는 부존재시 분화-유도 조건하에서 5일 동안 100 LT-HSC:TMRM낮은세포가 배양되었다. 세포 자손들은 2*106 헬퍼 세포와 함께 치명적으로 방사선 조사된 수혜자 마우스 내에 이식되었다. 말초 혈액은 4, 8 및 12 주에 수집되어 키메리즘의 준위를 결정하였다.
단일 세포 순환 동력항의 분석
단일 세포 준위에서 HSCs의 행동을 추적하기 위하여, 마이크로웰 어레이로 코팅된 96-웰 플레이트 내로 직접적으로 세포들을 분류하였다. 플레이팅시에 단일 세포를 포함하는 마이크로웰은 타입-랩스 현미경 관찰법으로 추척되었다. 증식 동력학은, 인큐베이터 챔버가 장착된 Zeiss Axio Observer 현미경, 온도 및 CO2 대조군을 사용하여 평가되었다. 영상은 MetaMorph (Visitron, Germany)의 영상화 분석 소프트웨어를 사용하여 5일 동안 매 3시간마다 자동적으로 얻어졌다.
히드로겔 마이크로웰 어레이 제조
히드로겔 마이크로웰 어레이는 공지(Kobel et al., 2009, Langmuir , 25(15):8774-9; Lutolf et al., 2009, Integr Biol ( Camb ), 1(1):59- 69)된 것처럼 96-웰 플레이트의 각 웰 내에 직접적으로 캐스트되었다. 간단하게, 티올 및 비닐 술폰기로 말단-기능화된, 다중-팔 폴리(에틸렌글리콜)(PEG)의 화학 양론적으로 밸런스된 수용액을 혼합하고 PDMS 마이크로스탬프에 대하여 몰드되었다. 가교화가 완료될 때, 스탬프가 제거되고 히드로겔 마이크로웰 어레이는 4℃에서 밤새 수화되었고, UV 광으로 멸균되었다.
통계
데이터는 스튜던트의 t 시험으로 통계적으로 분석되었고, 원웨이 ANOVA, Bonferroni's 다중 비교 시험(multiple comparison test) 및 Mann Whitney 시험이 이어졌다.
실시예 8: HSC 회복에서 니코틴아미드리보시드의 비교된 효과
NR 효과는 도 9 에 도시되고 이하 설명된 것처럼 니코틴산(NA) 및 임상 승인된 니코틴산 유도적 아시피목스의 것들과 비교되었다.
HIS (인간 면역계 마우스)의 생성:
돌연변이 마우스에 대응하는 마우스 변형체 NOD Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (005557)인 NOD scid gamma (NSG) 마우스는, The Jackson Laboratory에서 구입되었고, 내부의 무병원 조건하에서 사육, 처리 및 유지되었고, 상기 돌연변이 마우스는 NOD/ShiLtJ 배경 (수 많은 선천성 면역성이 결핍됨), 심각한 조합된 면역 결핍성 돌연변이(SCID) 및 시토카인 신호전달을 할 수 없게 하는 IL2 수용체 감마 사슬 결핍성의 특징들을 결합한 것이다. 새로 태어난 NSG 마우스는 1Gy로 방사선 조사되고 6 시간 후 10e6 인간 CD34 HSCs (이동성 혈액으로부터 정제된 CD34+, Cellsystemss Biotechnologie GmbH, Troisdorf, DE)이 간 내로 주사되었다. 인간 재구성의 준위(인간 CD45+ 세포의 %)는 꼬리 혈관 혈액 샘플을 FACS 착색하여 12주 후 분석되었다. 마우스는 재구성 준위를 기초로 5 마우스 각각의 2개 비교할만한 코호트 내로 재집단화되었다. 다음날부터 하나의 코호트는, 상기 나타낸 것처럼 NA 또는 아시피목스 (n=10-12 마우스/group)로 처리된 집단에 비하여 NR로 공급된 저지방 음식이 주어졌고, 다른 코호트는 대조군 섭식이 주어졌다. 몇 일 후, 꼬리 혈관 혈액은 EDTA 튜브 내에 수집되었고 마우스가 희생되었다. 골수 세포가 C57BL6 마우스에 대해 설명된 것처럼 수집되었고, 혈액 및 골수 세포 모두 착색되고 설명된 것처럼 인간계통 특이적 항체의 패널에 대해 분석되었다.
NR로 처리된 마우스는 팽창된 ST-HSC 구획을 갖는 반면에, NR과 대조적으로, 니코틴산(NA)를 가지고 1 주일 동안 처리된 마우스는 유동 세포계수 분석(도 9A)에 보여진 것처럼, 가장 원시적 조혈모 세포의 수에 큰 차이를 나타내지 않는다. 콜로니-형성 분석(CFUs)에 의한 기능적 분석은, NR로 처리된 마우스로부터 유래된 BM이 팽창된 전구 세포 집단을 갖는 반면에 NA로 처리된 마우스로부터 유래된 BM은 총 수 및 골수 콜로니에서 큰 차이를 나타내지 않고 거핵세포 (MkE) 콜로니의 감소조차 나타내지 않는다(도 9B).
NR-처리된 마우스로부터 유래된 BM으로 이식된 마우스는 보다 높은 ST-HSC 활성을 나타내는 반면에, 이시피목스로 처리된 마우스는 대조군(ctrl) 집단에 비하여 단기 HSC 활성에 큰 차이가 없다(도 9C). NR로 먹이 공급된 마우스는 대조군보다 백혈구 감소증 및 혈소판 감소증을 보다 빠르게 탈출하는 반면에, 놀랍게도, 이시피목스로 처리된 이식 후 마우스의 혈액 회복은, 보다 느린 혈소판 및 과립구 회복조차 나타내며, 따라서 NR로 처리된 마우스에 의해 관찰된 것보다 반대적 효과를 나타낸다.
HSC 회복 내 NR의 효과가 인간 조직에 추론될 수 있는지 여부가 또한 시험되었다. 쥐과 데이터와 부합하는, 1 주일 동안 NR-보충된 섭식으로 먹이 공급된 인간화 마우스(도 10A)는, 림프구 생성의 큰 증가(도 10B) 및 증가된 단핵구 생성 경향(도 11)에 의해 반영된 것처럼 인간 조혈작용이 증가한다. 인간 과립구 생성은 불행하게도 인간화 마우스에서 측정될 수 없다.
실시예 9: HSC 구획 내 막 전위를 감소시키는 시약 능력의 시험
HSC 구획 내 막 전위를 감소시키는 약제의 능력은 다른 방법으로 평가되어 왔다.
인비트로 분석
HSC 미토콘드리아 활성에 대한 약제의 효과는 상기 실시예 7에 설명된 것과 같은 미토콘드리아 활성을 측정하는 것으로 평가되었다.
이 분석에서, 대조군 조건에 비하여 NR은 낮은 미토콘드리아 활성을 유지하는 HSC 딸들의 퍼센트를 필연적으로 두 배(예를 들어 약 5% 내지 약 10% 증가)로 할 수 있고, 역으로 도 8B에 도시된 것처럼 높은 미토콘드리아 활성을 갖는 세포의 퍼센트가 반으로 줄어들게 할 수 있다.
인비트로 분석
HSC 미토콘드리아 활성에 대한 약제의 효과는 인비보에서 미토콘드리아 활성을 측정하는 것에 의해 평가되어 왔다: 상기 화합물로 먹이 공급된 마우스로부터 새롭게 분리된 HSC는 TMRM으로 염색되고 유동 세포계수에 의해 분석되었다.
도 12에 도시된 것처럼, NAR은 낮은 미토콘드리아 활성을 갖는 단기 HSCs의 수를 매우 크게 요구할 수 있는(도 12 A-B) 반면에, NA는 그렇지 않다(도 12C-D).
동일한 조건하에서, NAM 처리는 또한 HSCs에서 미토콘드리아 막 전위를 크게 줄일 수 없었고, 그러므로 이는 NR과 같은, HSCs 내 미토콘드리아 막 전위를 줄이는 약제의 능력은, LT-HSC 풀을 유지하고, 비대칭적 분할로부터 유사하게, LT-HSCs의 준위에서 신진 대사 운명 재프로그래밍으로부터 ST-HSC 풀 줄기화의 팽창을 유도하는 이들의 능력에 대해 관련이 있다는 것을 암시한다.
이들 결과들 모두, NR과 같은 HSC 구획(LT- 및 ST-HSC 구획들 내 모두) 내 막 전위를 크게 줄일 수 있는 약제들이, 특히 경구 보충을 통해, HSC 소모없이 기능적 전구 세포들의 팽창을 유도할 수 있으며, 이에 따라서 이식 후 심각한 백혈구 감소증 및 혈소판 감소증의 시간을 크게 줄이는 것으로 쥐과 HS 이식 후 생존을 크게 개선하고 혈액 회복을 가속화할 뿐만 아니라, 쥐과 및 인간 세포 모두에서 림프구 재구성을 증가시킬 수 있다. 이들 결과들은, HSC 이식을 포함하는 탈격의 화학 요법 후 골수 무형성증, 또는 자가 면역 혈구 감소증의 맥락에서, 인비보에서 3-계통 조혈 자극을 중재하는 이들 약제들은, 특히 NR의 잠재적 임상 응용, 특히 난치의 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP)의 치료가 거대핵세포형성(megakaryopoiesis)을 놀랍게도 효율적으로 증가시킨다는 잠재적 임상적 응용분야를 밝힌다.
게다가, NR-보충은 다른 조직 내에서 이 효과와 대조적으로 궁극적으로 미토콘드리아 활성을 줄인다는 사실이 놀랍다.

Claims (26)

  1. 대조군 혈액 세포 준위에 비하여 감소된 혈액 세포 준위의 예방 및/또는 치료에 사용되는 미토콘드리아 막 전위 감소제(mitochondrial membrane potential reducing agent).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 감소된 혈액 세포 준위가 심각한 백혈구 감소증 및/또는 심각한 혈소판 감소증인 미토콘드리아 막 전위 감소제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 막 전위 감소제가 경구로 투여되는 미토콘드리아 막 전위 감소제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 막 전위 감소제가 비경구로 투여되는 미토콘드리아 막 전위 감소제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제는 니코틴아미드 리보시드, 니아신, N-포르밀키누레닌, 퀴놀린산, 니코틴아미드 리보시드 키나아제 활성화제, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 및 트립토판으로부터 선택되는 미토콘드리아 막 전위 감소제.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제가 니코틴아미드 리보시드인 미토콘드리아 막 전위 감소제.
  7. 다음 단계를 포함하는 엑소-비보에서 조혈모 세포 팽창 방법:
    a) 세포 팽창 배양 배지 내에 HSC 샘플을 제공하는 단계;
    b) 상기 HSC 샘플로부터, 낮은 미토콘드리아 막 전위에 의해 특징된 HSC 분획물을 분리된 HSC 풀(pool)로 분리하는 단계;
    c) a) 하에서 제공된 HSC 샘플 또는 b) 하에서 분리된 HSC 풀을 미토콘드리아 막 전위 감소제와 접촉시키는 단계.
  8. 제7항에 있어서,
    단계 c) 하에서 얻어진 HSC 샘플이 장기 다중-계통 혈액 재구성 능력을 갖는 기능적 줄기 세포 내에 풍부해지는, 엑소-비보에서 조혈모 세포 팽창 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 HSC 샘플은 골수 샘플 및/또는 골수 세포 제제인 엑소-비보에서 조혈모 세포 팽창 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 막 전위 감소제가, 다음 그룹으로부터 선택되는 엑소-비보에서 조혈모 세포 팽창 방법: 2,4 디-니트로페놀, 카보닐 시아나이드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존, 카보닐 시아나이드 m-클로로 페닐 히드라진, 2-플루오로페닐){6-[(2-플루오로페닐)아미노](1,2,5-옥사디아졸로[3,4-e]피라진-5-일)}아민 및 4,5,6,7-테트라클로로-2-트리플루오로메틸벤즈이미다졸.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 막 전위 감소제가 카보닐 시아나이드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존인 엑소-비보에서 조혈모 세포 팽창 방법.
  12. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에서,
    상기 미토콘드리아 막 전위 감소제가 니코틴아미드 리보시드, 니아신, N-포르밀키누레닌, 퀴놀린산, 니코틴아미드 리보시드 키나아제 활성화제, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 및 트립토판로부터 선택된 엑소-비보에서 조혈모 세포 팽창 방법.
  13. 장기 다중-계통 혈액 재구성 능력을 갖는 기능적 줄기 세포를 선택하는 키트에 있어서, 상기 키트는 i) 표현형으로 정의된 조혈 줄기 및 전구 세포용 표면 마커 또는 이들 마커들의 서너 개의 조합을 검출하는 적어도 하나의 검출 약제 및 ii) 조혈 줄기 및 전구 세포 내 낮은 미토콘드리아 막 전위를 검출하기 위한 적어도 2개의 약제, 예를 들어 IC1 또는 TMRM 염료를 포함하는, 키트.
  14. 제13항에 있어서,
    표현형으로 규정된 조혈 줄기 및 전구 세포에 대한 적어도 하나의 상기 검출 약제는 c-Kit, Lin-, Sca-1, CD150, CD48 및 CD34으로부터 선택된 상기 표면 마커에 관련한 하나 이상의 선택적 항체인, 키트.
  15. 적어도 하나의 미토콘드리아 막 전위 감소제 또는 이들의 혼합물을 포함하는 조혈모 세포 제제용 세포 팽창 배양 배지.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 막 전위 감소제가, 4 디-니트로페놀, 카보닐 시아나이드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존, 카보닐 시아나이드 m-클로로 페닐 히드라진, 2-플루오로페닐){6-[(2-플루오로페닐)아미노](1,2,5-옥사디아졸로[3,4-e]피라진-5-일)}아민 및 4,5,6,7-테트라클로로-2-트리플루오로메틸벤즈이미다졸 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 세포 팽창 배양 배지.
  17. 적어도 하나의 미토콘드리아 막 전위 감소제를 포함하는, 대조군 혈액 세포 준위에 비하여 감소된 혈액 세포 준위의 예방 및/또는 치료에 사용되는 식품 보조제.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 막 전위 감소제가 니코틴아미드 리보시드인 식품 보조제.
  19. 적어도 하나의 미토콘드리아 막 감소제 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형체를 포함하고, 조혈 기능 부재와 관련된 질병 또는 질환의 예방 또는 치료에 유용한 공동 약제, 또는 혈액 회복을 증진 및/또는 조혈 세포-제거된 환자에서 감염 위험성을 예방, 또는 완화시키는데 유용한 공동 약제를 더 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 막 전위 감소제가 니코틴아미드 리보시드인 약제학적 조성물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    상기 공동 약제가 G-CSF 유사체 및 TPO 수용체 유사체 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  22. 대상에서 대조군 혈액 세포 준위에 비하여 감소된 혈액 세포 준위의 예방 및/또는 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법이 치료가 필요한 대상에 미토콘드리아 막 전위 감소제를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 감소된 혈액 세포 준위가 심각한 백혈구 감소증 및/또는 심각한 혈소판 감소증인, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서,
    상기 대상이 조혈모 이식 후 대상, 또는 고형 종양을 위한 탈격의 화학 요법을 받거나 심각한 면역 질환으로 고통받는 대상인, 방법.
  25. 환자 내 표준 혈액 프로파일 회복을 촉진 및/또는 예방하거나, 또는 조혈 세포-제거된 환자에서 감염 위험성을 완화시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 대상에서 효과적인 함량의 미토콘드리아 막 전위 감소제를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미토콘드리아 막 전위 감소제는 주사로 또는 약제학적 제형의 경구 루트로 또는 식품 보조제로서 투연되는, 방법.
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