JP2017529062A5

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Publication number: JP2017529062A5
Application number: JP2017502621A
Authority: JP
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2018-08-16
Anticipated expiration: 2035-07-10

Description

上記目的は、請求項１に係る方法、請求項１９に係るダイナミック自己集合型ケミカルライブラリ、及び請求項２６に係るライブラリの用途によって達成される。

図３は、反応式によって、高親和性リガンド対がレセプタとの錯体としてどのように「蓄積されていく（accumulate）」かを説明するものである。図１から図２を参照して既に説明した分子に加え、リガンド対は、リガンドと共有結合された一本鎖ＤＮＡを補完する一本鎖ＤＮＡ１０，１１をさらに有する（それ以外は、分子も符号も図１と同一である）。当該追加の一本鎖ＤＮＡ１０，１１は、例えば適切なプライマ及びＰＣＲ反応を介して生成される。下向き矢印１２は、（例えば、該追加の一本鎖ＤＮＡ１０，１１が相互に化学共有結合するように促すリガーゼ酵素を追加することで実現する）連結反応を示す。この例において有利な点は、連結されたＤＮＡフラグメントが、塩基配列を介して特定のリガンド対用にコード化される結果、ＤＮＡ配列により当該リガンド対を容易に特定できることにある。

Claims

２個のリガンドと１個のレセプタとからなる高親和性錯体の特定方法であって、
ａ）ケミカルライブラリのリガンドと、溶液中の少なくとも１個のレセプタとからなる多数の異なる錯体を相互作用させるステップであって、前記ライブラリの該リガンドが前記リガンドと化学共有結合する長さ１０ベース以上の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを有し、前記リガンドの第１部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの１０ベース以上が前記リガンドの第２部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完すると共に、前記リガンドを、前記ＤＮＡ又はＲＮＡのハイブリッド化を介してリガンド錯体を形成するために複合化し、
ｂ）前記溶液を所定時間培養し、リガンド錯体と前記レセプタとからなる錯体を生成するステップと、
ｃ）遊離リガンドを形成するために前記リガンド錯体を分離するステップと、
ｄ）更なるリガンド錯体を形成するために前記遊離リガンドを再ハイブリッド化するステップと、
ｅ）前記溶液を所定時間培養し、前記更なるリガンド錯体と前記レセプタとからなる更なる錯体を生成するステップと、
ｆ）リガンド錯体とレセプタとからなる、結果物たる前記錯体を特定するステップと、を備え、
前記培養が、前記リガンドの第１部位と前記リガンドの第２の部位が前記溶液内でハイブリッド化されてリガンド錯体を形成する温度で実行されることを特徴とする、
又は、
ｉ）ケミカルライブラリのリガンドと、溶液中の少なくとも１個のレセプタとからなる多数の異なる錯体の相互作用させるステップであって、前記ライブラリの該リガンドが前記リガンドと化学共有結合する長さ２ベース以上の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを有し、前記リガンドの第１部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースのみが前記リガンドの第２部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完すると共に、前記リガンドが、前記ＤＮＡ又はＲＮＡのハイブリッド化を介してリガンド錯体を形成するために複合化され、
ｉｉ）前記溶液を所定時間培養し、リガンド錯体と前記レセプタとからなる錯体を生成するステップと、
ｉｉｉ）リガンド錯体とレセプタとからなる、結果物たる前記錯体を特定するステップと、を備え、
前記溶液は、前記リガンドの第１部位と前記リガンドの第２部位との間において、リガンド錯体を形成するハイブリッド化と遊離リガンドを形成する分離化との平衡を達成できる温度で培養されることを特徴とする。
前記リガンドの第１部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの１０ベース以上が前記リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを補完する場合、前記溶液の温度を３５℃から９５℃、好ましくは５０℃から９５℃、より好ましくは７０℃から９５℃、具体的には８０℃から９５℃に上昇させることによって前記リガンド錯体を分離させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記リガンドの第１部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの１０ベース以上が前記リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを補完する場合、前記リガンド錯体の分離化を、前記レセプタから所定距離だけ、好ましくは前記分離化を誘起する状況によって前記レセプタの機能を損なうことのないように、離して配置した前記溶液の一部で実行することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
前記リガンドの第１部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの１０ベース以上が前記リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを補完する場合、前記溶液の温度を１℃から３０℃、好ましくは５℃から２８℃、より好ましくは１０℃から２５℃、具体的には１５℃から２０℃に低下させることによって前記遊離リガンドを再ハイブリッド化させることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
前記リガンドの第１部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの１０ベース以上が前記リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを補完する場合、前記ｃ）からｅ）のステップを、少なくとも１回又は２回、好ましくは少なくとも３回又は４回、より好ましくは少なくとも５回又は６回、具体的には少なくとも７回又は８回、繰り返すことを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
前記リガンドの第１部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの１０ベース以上が前記リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを補完する場合、前記リガンドの第１部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの少なくとも２０ベース、好ましくは４０ベースより好ましくは少なくとも１００ベース、具体的には少なくとも２００ベースが、前記リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを補完することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
前記リガンドの第１部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースのみが前記リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを補完する場合、前記リガンドの第１部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの３から９ベースのみ、好ましくは４から８ベースのみ、より好ましくは５から７ベースのみが前記リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを補完することを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
前記リガンドの前記第１部位における前記ＤＮＡ又はＲＮＡの長さ及び／又は前記リガンドの前記第２部位における前記ＤＮＡ又はＲＮＡの長さが、少なくとも２０ベース、好ましくは少なくとも４０ベース、より好ましくは少なくとも１００ベース、具体的には少なくとも２００ベースであることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
前記リガンドの前記第１部位がＬ個の異なるリガンドを有し、前記リガンドの前記第２部位がＭ個の異なるリガンドを有し、よってＬ・Ｍ個の異なるリガンド錯体が形成されることを特徴とする請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
前記溶液が、少なくとも前記ｂ）、ｅ）、及びｉｉ）のステップにおいて、１℃から５０℃、好ましくは５℃から３７℃、より好ましくは１０℃から２５℃、具体的には１５℃から２０℃で培養されることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
前記溶液が、少なくとも前記ｂ）、ｅ）、及びｉｉ）のステップにおいて、０．１から４８時間、好ましくは０．２から２４時間、より好ましくは０．５から１２時間、具体的には１から６時間、培養されることを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
前記レセプタが、好ましくはガラス、セラミック、バイオポリマ、セファロース、合成ポリマ、及びハイドロゲルからなる一群から選択される基板上に固定されることを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
前記レセプタが、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、セル、及び／又は、分子量２００ｋＤａ以下、好ましくは１００ｋＤａ以下、より好ましくは１０ｋＤａ以下、具体的には３ｋＤａ以下の有機分子を含む、又はこれらからなることを特徴とする請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
前記リガンドが、タンパク質、ペプチド、リピド、炭水化物、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、及びｓｓＲＮＡからなる一群から選択された分子と、アプタマーと、分子量２００ｋＤａ以下、好ましくは１００ｋＤａ以下、より好ましくは１０ｋＤａ以下、具体的には３ｋＤａ以下の有機分子と、を含む、又はこれらからなることを特徴とする請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
リガンド錯体と前記レセプタとからなる前記錯体が、質量分光、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィ、クロマトグラフィ、赤外線分光、及びＤＮＡ配列、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡバーコードのＤＮＡ配列、からなる一群から選択される分析手法によって特定されることを特徴とする請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
前記リガンドの前記第１部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ及び／又は前記リガンドの前記第２部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡが、前記化学共有結合されたリガンドをコード化する塩基配列を備え、
前記塩基配列を、好ましくは、少なくとも部分的にハイブリッド化して、更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの相補的塩基配列を形成することを特徴とする請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
前記ライブラリのリガンドの前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡが、更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの相補的塩基配列を形成するために部分的にハイブリッド化され、
前記リガンドの第１部位における前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースが、前記リガンドの第２部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完すると共に、前記相補的ベースと連結し、
前記方法においてＹ型を形成し、
リガーゼを添加して、前記リガンドの前記第１部位における前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、前記リガンドの前記第２部位における前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡとを化学共有結合することを特徴とする請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
前記リガンドの第１部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡが、
ｉ）５´端末に前記リガンドを有しているとき、該５´端末において、前記リガンドの第２部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完すると共に、前記リガンドの第２部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完する前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースが、前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの３´端末に配置される、又は
ｉｉ）３´端末に前記リガンドを有しているとき、該３´端末において、前記リガンドの第２位部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースと補完するベースを有すると共に、前記リガンドの第２部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完する前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースが、前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの５´端末に配置される、
ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
ベース長さ２ベース以上の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと化学共有結合したリガンドを備えるケミカルライブラリであって、
前記リガンドの第１部位における前記一本鎖ＤＮＡのうちの２から１０ベースのみが前記リガンドの第２部位における前記一本鎖ＤＮＡのベースを補完することを特徴とする。
前記リガンドの第１部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの３から９ベースのみ、好ましくは５から９ベースのみ、より好ましくは６から８ベースのみが前記リガンドの第２部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを補完することを特徴とする請求項１９に記載のライブラリ。
前記リガンドの前記第１部位における前記ＤＮＡの長さ及び／又は前記リガンドの前記第２部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの長さが、少なくとも２０ベース、好ましくは少なくとも４０ベース、より好ましくは少なくとも１００ベース、具体的には少なくとも２００ベースであることを特徴とする請求項１９又は２０に記載のライブラリ。
前記リガンドの前記第１部位がＬ個の異なるリガンドを有すると共に、前記リガンドの前記第２部位がＭ個の異なるリガンドを有し、よって前記ライブラリがＬ・Ｍ個の異なるリガンド錯体を有することを特徴とする請求項１９から２１のいずれか１項に記載のライブラリ。
前記リガンドが、タンパク質、ペプチド、リピド、炭水化物、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、及びｓｓＲＮＡからなる一群から選択された分子と、アプタマーと、分子量２００ｋＤａ以下、好ましくは１００ｋＤａ以下、より好ましくは１０ｋＤａ以下、具体的には３ｋＤａ以下の有機分子と、を含む、又はこれらからなることを特徴とする請求項１９から２２のいずれか１項に記載のライブラリ。
前記ライブラリのリガンドの前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡが、更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの相補的塩基配列を形成するためにそれぞれ部分的にハイブリッド化され、
前記リガンドの第１部位における第１の更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースが、前記リガンドの第２部位における前記第２の一本鎖ＤＮＡのベースを補完することを特徴とする請求項１９から２３のいずれか１項に記載のライブラリ。
前記リガンドの第１部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡが、
ｉ）５´端末に前記リガンドを有しているとき、該５´端末において、前記リガンドの第２部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完すると共に、前記リガンドの第２部位における前記第２の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完する前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースが、前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの３´端末に配置される、又は
ｉｉ）３´端末に前記リガンドを有しているとき、該３´端末において、前記リガンドの第２位部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースと補完するベースを有すると共に、前記リガンドの第２部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完する前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースが、前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの５´端末に配置される、
ことを特徴とする請求項２４に記載のライブラリ。
高親和性三元リガンド‐レセプタ錯体の選択的で高感度な特定のための、請求項１９から２５のいずれか１項に記載のライブラリの用途。