JP2017529355A

JP2017529355A - 競合的ｈｉｖ侵入阻害を媒介するｃｄ４に対するモノクローナル抗体によるｈｉｖ感染の処置および機能的治癒

Info

Publication number: JP2017529355A
Application number: JP2017514874A
Authority: JP
Inventors: イワン、チャン
Original assignee: United Biomedical Inc
Current assignee: United Biomedical Inc
Priority date: 2014-09-16
Filing date: 2014-11-11
Publication date: 2017-10-05
Anticipated expiration: 2034-11-11
Also published as: US11180555B2; TWI695720B; AU2014406462A1; WO2016043788A1; MX2017003546A; JP2020097569A; RU2762315C2; AU2021203071B2; EP3194442A1; RU2017112967A; KR20170054478A; CN107074944B; TW201611845A; CA2961464A1; AU2021203071A1; US20170369576A1; SG11201702056YA; JP6716544B2; BR112017005134A2; RU2017112967A3

Abstract

本開示は、ＨＩＶ感染の予防、処置および／または機能的治癒のための組成物および方法に関する。本開示の一面として、ＨＩＶ感染の予防、処置および機能的治癒のためのＣＤ４に対するモノクローナル抗体、その組成物およびそのような組成物の使用方法に関する。

Description

本願は、2014年９月１６日に出願された米国仮出願第62/051,200号の利益を主張するＰＣＴ国際出願であり、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、ＨＩＶ感染の処置及び機能的治癒のための、競合的ＨＩＶ侵入阻害を媒介するＣＤ４に対するモノクローナル抗体、その組成物及びそのような組成物の使用方法に関する。

後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされるヒト免疫系の疾患である（http://en.wikipedia.org/wiki/HIV/AIDS）。遺伝子研究によると、ＨＩＶは、１９世紀後期または２０世紀初期にアフリカ中西部で始まったことがわかる。ＡＩＤＳは１９８１年に米国疾病管理予防センター（U.S. Centres for Disease Control andPrevention）によって最初に認められ、その原因であるＨＩＶは１９８０年代初期に特定された。この流行病の開始から７０００万人を超える人々がＨＩＶに感染し、３５００万人の人々がＡＩＤＳで死亡している。世界的には、２０１１年の終わりに３４００万人の人々がＨＩＶを抱えて生きていた（http://www.who.int/gho/hiv/en/）。

ＨＩＶ感染は免疫系の有効性を次第に減少させ、個体を日和見感染症や腫瘍に罹患しやすい状態にする。ＨＩＶは、粘膜又は血流が血液、精液、膣液、前精液（pre seminal fluid）および母乳などのＨＩＶを含む体液と直接接触することにより感染する。この感染は、肛門、膣内もしくは口腔性交、輸血、汚染された皮下注射針、妊娠、出産、授乳時の母親と乳児とのやり取り（exchange）または上記体液のうちの１つへの他の曝露により生じ得る。

３０年間、科学者らは休止Ｔ細胞ではなく「ウイルス産生」ＣＤ４Ｔ細胞によってＡＩＤＳが引き起こされると考えていた。しかし、ＡＩＤＳを発症している患者の体内で幅広い範囲のＴ細胞が壊滅されていることを説明するのに、これらの「ウイルス産生」感染細胞は十分でなかった。Greeneおよび彼の同僚は、静止（休止）リンパＣＤ４Ｔ細胞の９５％が不稔ウイルス感染によって引き起こされるピロトーシスにより死滅すると報告した（Doitsh, G.ら、2014）。これらの細胞は細胞質内ウイルスＤＮＡを有するがウイルス複製単位になるＴ細胞とは異なり、これらの「ＨＩＶに感染した」休止Ｔ細胞は、炎症誘発性サイトカインの放出を伴う高炎症型のプログラム細胞死（ピロトーシス）により自滅する。細胞タンパク質であるインターフェロンγ誘導性タンパク質１６（ＩＦＩ１６）はウイルスＤＮＡを認識し、ピロトーシスを媒介するカスパーゼ−１酵素の活性化を含むＴ細胞における一連の応答を引き起こし、細胞膨張、細胞膜の透過および細胞質内容物の漏出を生じさせる。休止Ｔ細胞はウイルスの死滅を無駄に試みて自滅する。このプロセスは最終的に、ＡＩＤＳへの疾患の進行を早めるＨＩＶの病理発生に繋がる。

ＡＩＤＳの発症を遅らせるＨＩＶ感染症の現在の処置は、ウイルス複製を防止するための高活性抗レトロウイルス療法、即ちＨＡＡＲＴからなる。現在の最適なＨＡＡＲＴの選択肢は、少なくとも２つのクラスの抗レトロウイルス剤に属する少なくとも３種類の薬剤からなる組み合わせ（即ち「カクテル」）（ｃＡＲＴ）で構成されている。典型的なレジメンは、２種類のヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＡＲＴＩまたはＮＲＴＩ）＋プロテアーゼ阻害剤または非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）のどちらか一方からなる。

先進国において、医師は、ＨＡＡＲＴ処置の開始をいつ勧めるかを決定する際に、ウイルス量、ＣＤ４Ｔ細胞数、ＣＤ４陽性細胞の減少速度および患者の迅速性（readiness）を評価する。慣例上、処置は、ＣＤ４Ｔ細胞数が１マイクロリットルの血液当たり２００〜２５０細胞に減少した際に無症状の患者に勧められてきた。しかし、より早期に（３５０細胞／マイクロリットルのＣＤ４レベルの時点で）処置を開始することで、ＡＩＤＳおよび死亡のリスクを著しく減少させることができる。

処置を行わない場合、ＨＩＶ感染後の正味の生存期間中央値は、ＨＩＶサブタイプに応じて９〜１１年と推定されており、ＡＩＤＳと診断された後の生存期間中央値は６〜１９ヶ月の範囲である。ＨＡＡＲＴ処置が広く利用可能な地域では、この疾患の死亡率は８０％低下し、次いで、これにより新たに診断されたＨＩＶ感染者の平均余命は約２０年まで上昇する。

ＨＡＡＲＴの標準的な目標としては、患者の生活の質の向上、合併症の減少、及び検出限界未満へのＨＩＶウイルス血症の減少が挙げられる。

しかし、ＨＡＡＲＴ処置にはいくつかの問題がある。第一に、この処置は、ＨＩＶ感染患者を治癒することはなく、処置が一旦停止されると大部分が「ＨＡＡＲＴ耐性」のＨＩＶ血中濃度が再び高くなるのを防止することもない。第二に、ＨＡＡＲＴは倦怠感、疲労、下痢、頭痛、悪心および嘔吐などの不快な副作用を有し得る。ＨＩＶ感染患者は長期間にわたって、神経認知障害、骨粗鬆症、神経障害、癌、腎症および心血管疾患を経験することがある。より新しい抗レトロウイルス剤は昔のものよりも副作用が少ないが、生涯使用すればなお被害をもたらす可能性はある。非遵守により、ＨＩＶのリバウンド、薬剤耐性および疾患の進行が生じ得る。第三に、最大５０％超の患者では、薬剤不耐性、以前の効果のない抗レトロウイルス療法およびＨＩＶの薬剤耐性株による感染により、ＨＡＡＲＴは最適にはほど遠い結果をもたらす。

研究者らは、ＨＩＶ感染を治癒する方法、又は抗レトロウイルス剤なしに長期間または永久的な寛解を少なくとも達成する方法の研究をさらに行っている。

表１に示すように、ＨＩＶ感染のための２つの治癒的戦略、即ち完全（sterilizing）（即ち根絶）治癒および機能的治癒について現在研究されている。完全治癒法は、ＨＩＶ感染細胞を全て排除し、ＨＩＶを体から完全に一掃することを目標とし、ウイルス量を血液１ミリリットル当たり１コピー未満まで減少させる方法として定められている。機能的治癒は、抗レトロウイルス療法の非存在下での低いウイルス量などの寛解状態およびＨＩＶの長期間の制御を目標とし、永久的または長期間にわたってウイルス量を血液１ミリリットル当たり５０コピー未満まで減少させる方法として定められている。

「完全治癒」の現在の唯一の例は、急性骨髄性白血病に罹患して突然変異型または他の型のＣＣＲ５遺伝子を有するドナーから骨髄移植を受けた、ＨＩＶ感染を有する「ベルリン患者（The Berlin Patient）」というニックネームの男性の症例研究から得られたものである。処置なしで４５ヶ月後に、医師は彼の系中にＨＩＶを検出することができなかった。それにも関わらず、ＣＣＲ５突然変異体のドナーによる骨髄移植を用いる戦略は、その毒性および処置の複雑さを考慮するとＨＩＶの現実的な治癒ではない。「機能的治癒」の自然な例の１つは、長期非進行者（エリートコントローラー）（elite controller）において認めることができる。長期非進行者はその免疫系が抗レトロウイルス剤なしにウイルスを自然に制御することができるＨＩＶに感染した個体である。これらの個体は、安定なＣＤ４細胞（白血球）数、低いか又は検出不能なウイルス量、およびそれらの細胞中の著しく少量の「潜伏ＨＩＶ」の維持に成功している。

治癒を妨げる主な障害の１つは、抗レトロウイルス剤での処置中に長い寿命を有する記憶細胞などの免疫系細胞中に潜伏している「潜伏ＨＩＶリザーバー（reservoir）」が存在するということである。なぜなら、そのような処置は複製を阻止することにより活性なウイルス感染に対して作用することはできるが潜伏ＨＩＶに対しては作用しないからである。但し、そのような抗レトロウイルス剤処置を停止すれば、潜伏ＨＩＶを活性化させ、ＨＩＶ感染プロセスを再開させることができる。

これらの「問題となる」潜伏ＨＩＶリザーバーを標的にする現在の戦略としては、ＨＡＡＲＴ処置の存在下でウイルス発現の活性化により潜伏リザーバーを枯渇させ、それにより感染細胞を全滅させ、非感染細胞のみを残すことが挙げられる。活性化剤のグループの１つは、表２に示すヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤である。現在、ＨＤＡＣ阻害剤は、気分安定薬、抗てんかん薬および抗癌処置薬として使用されている。癌遺伝子の悪性度および／または再活性化のリスクを高めるＨＤＡＣ阻害剤の長期間の影響は依然として主な懸念事項である。この戦略は、併用抗レトロウイルス療法（ｃＡＲＴ）により活性なウイルス複製が完全に阻害される場合には実行可能である。これまでのところ、これらの努力により長期間のウイルス抑制または機能的治癒は得られていない。

ＨＩＶ感染を有する人々における潜伏ＨＩＶリザーバーのサイズの制限または減少のための２つの計画は、（１）新しいＡＲＴ剤を患者のレジメンに追加することによる強化処置、および（２）感染後すぐにＡＲＴを開始することによる早期処置を含む。いくつかの研究の結果から、ＨＩＶ感染の後期の慢性段階ではなく初期の急性段階の間にｃＡＲＴを開始したとき、ＨＩＶ感染細胞数が著しく減少することが分かった。

要約すると、強力かつ安全な薬剤は、（１）無細胞および細胞間伝播モードの両方においてＨＩＶ侵入を阻止し、それらの寿命の長い記憶Ｔ細胞を含む活性化もしくは休止ＣＤ４Ｔ細胞におけるＨＩＶ感染を著しく減少させることができ、（２）特に、ＨＩＶ感染した休止ＣＤ４Ｔ細胞を再活性化させてＨＩＶを放出させ、それにより潜在的に感染した細胞においてアポトーシスを引き起こすことができ、かつ／または（３）そのような活性化によりＡＩＤＳに繋がる正常なＣＤ４陽性Ｔ細胞のピロトーシスおよび大量の枯渇を引き起こし得る場合には、抗原／サイトカイン刺激時のＨＩＶ感染した休止ＣＤ４Ｔ細胞の活性化／炎症を阻害することができる限り、単独またはｃＡＲＴへの補助剤としてＨＩＶ処置で使用するのに非常に望ましいものとなる。その後のｃＡＲＴの非存在下での長期間または永久的な寛解に繋がるＨＩＶ感染の機能的または完全治癒に向けた協力は、世界的な公衆衛生課題の上位にあり、世界中で積極的に探究されており、これが入手可能になれば、ＨＩＶ感染処置に革新を引き起こすものとなる。

参考文献
1. Briant, L., Reynes, J., Coudronniere, N., et al. “HIV Reactivation in resting peripheral blood mononuclear cells of infected Adults upon in vitro CD4 cross-linking by ligands of the CDR2-loop in extracellular domain 1.” J. AIDS. 1999. 21:9-19.
2. Briant, L., Coudronniere, N., Robert-Hebmann, V., et al. “Binding of HIV virions or gp120-anti-gp120 immune complexes to HIV-1 infected quiescent peripheral blood mononuclear cells reveals latent infection.” J. Immunol., 1996. 156:3994-4004.
3. Burkly, L.C., Olson, D., Shapiro, R., et al. “Inhibition of HIV infection by a novel CD4 domain 2-specific monoclonal antibody. Dissecting the basis for its inhibitory effect on HIV-induced cell fusion.” J. Immunol. 1992; 149: 1779-87.
4. Carr, F.J., Carter, G., Hamilton, A.A. & Adair, F.S. “Reducing immunogenicity of proteins - by modifying the amino acid sequence of the protein to eliminate potential epitopes for T-cells of a given species.” PCT Publication WO 1998-052976.
5. Chiba, Y., “Leu3A Binding Peptides.” US Patent 5,171,838 (1992).
6. Doitsh, G. Galloway, K., Geng, X., et al. “Cell Death by pyroptosis derives CD4 T-cell depletion in HIV infection.” Nature. 2014. 505:509-514.
7. Global Health Observatory (GHO) HIV/AIDS. http://www.who.int/gho/hiv/en/
8. HIV-Wikepedia, The free encyclopedia. http://en.wikipedia.org/wiki/HIV/AIDS
9. Jacobson, J.M. Kuritzkes, D.R., Godofsky, E., et al. “Safety, Pharmacokinetics, and Antiretroviral Activity of Multiple Doses of Ibalizumab (formerly TNX-355), an Anti-CD4 Monoclonal Antibody, in Human Immunodeficiency Virus Type-1-Infected Adults.” Antimicrob. Agents Chemother. 2009. 53:450457.
10. Jameson, B.D., Rao, P.E., Kong, L.L. et al. Location and chemical synthesis of a binding site for HIV-1 on the CD4 protein. Science. 1988, 240, 1335-1339.
11. Jones, T.D., et al. “Deimmunization of Monoclonal Antibodies.” Methods Mol. Bio. 2009. 525:405-423.
12. Kuritzkes, D.R., Jacobson, J.L., Powderly, W.G., et al. “Antiretroviral activity of the anti-CD4 monoclonal antibody TNX-355 in patients infected with HIV type I.” J. Infect. Dis. 2004. 189:286-291.
13. Lynn, S. and Wang, C.Y. “Designed deimmunized monoclonal antibodies for protection against HIV exposure and treatment of HIV infection.” US Patent No. 7,501,494 (Issued March 10, 2009).
14. Pace, C.S., Fordyce, M.W., Franco, D. ,et al. “Anti-CD4 Monoclonal Antibody ibalizumab Exhibits Breadth and Potency Against HIV-1, with Natural Resistance Medicated by the loss of a V5 Glycan in Envelope.” J.AIDS. 2013. 62:1-9.
15. Pace G, Fordyce M, Franco D. “Anti-CD4 monoclonal antibody ibalizumab exhibits exceptional breadth and potency against HIV, which adopts a unique pathway to resistance.” Abstract 585, 18th CROI 2011, Boston.
16. Sawyer, L.S.W., Wrin, M.T., Crawford-Miksza, L., et al. “Neutralization sensitivity of human immunodeficiency virus type 1 is determined in part by the cell in which the virus is propagated.” J. Virol. 1994, 68(3), 1342-1349.
17. Sigal, A., Kim, J.T., Balazs, A.B., et al. “Cell-to-Cell spread of HIV permits ongoing replication despite antiretroviral therapy.” Nature. 2011. 477:95-98.
18. Than, S., Oyaizu, N., Tetali, S., et al. “Upregulation of human immunodeficiency virus (HIV) replication by CD4 cross-linking on peripheral blood mononuclear cells of HIV-infected adults.” J. Virol. 1997: 71(8):6230-6232.
19. Toma, T., Weinheimer, S.P., Stawiski, E., et al. “Loss of Asparagine-linked glycosylation sites in variable region 5 of human immunodeficiency virus type 1 envelope is associated with resistance to CD4 antibody ibalizumab.” J. Virol. 2011. 85:3872-3880
20. Wang, C.Y. “Antibodies against a host cell antigen complex for pre and post exposure protection from infection by HIV.” US Patent No. 5,912,176, 1999.
21. Wang, C.Y., Sawyer, L.S.W., Murthy, K.K., et al. “Postexposure immunoprophylaxis of primary isolates by an antibody to HIV receptor complex.” Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1999, 96, 10367-10372.

本開示の一面として、ＨＩＶ感染の予防、処置および／または機能的治癒のためのＣＤ４に対する抗体、その組成物およびそのような組成物の使用方法に関する。特定の態様において、本抗体は、ＣＤ４のドメイン１のＣＤＲ２領域に特異的に結合する。本開示の抗体は、無細胞系および細胞間系の両方においてそのＣＤ４のドメイン１への結合によって強力な競合的ＨＩＶ侵入阻害を発揮する。本開示の抗体は、ピロトーシスの病理発生サイクル（pathogenic cycle）に関与する抗原誘導性Ｔ細胞増殖およびＣＤ４陽性Ｔ細胞のサイトカイン産生（ＩＬ２およびＩＦＮ−γ）も阻害する。本開示の抗体は、休止ＣＤ４陽性Ｔ細胞を再活性化する能力も有する。この性質は、休止Ｔ細胞におけるＨＩＶの潜伏リザーバーを再活性化させて、これらの細胞を抗レトロウイルス剤によって処置しやすくするのに特に有用である。そのようなＣＤ４に対する高親和性抗体は、ＨＩＶの放出のために休止ＨＩＶ感染細胞を活性化することができる。ＨＩＶ感染した休止ＣＤ４＋Ｔ細胞の再活性化により、ＨＩＶ感染した患者において本発明の抗体をＨＡＡＲＴと共に組み込んだ併用処置が可能になり、機能的治癒が生じる。

本開示は、ＨＩＶ感染の処置、予防および機能的治癒のための方法に関する。特定の態様において、本製剤はＣＤ４に対する抗体を含む。本開示は、ＨＩＶ感染の処置、予防および機能的治癒のための方法に用いることができる抗ウイルス剤も含む。

特定の態様において、本発明は、単剤療法として１週間に１回または２週間に１回のスケジュールにおいて約１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量で投与したとき、血清抗体レベルが１０μｇ／ｍＬよりも高い限り、そのような処置によりウイルス量のリバウンドなしに処置される対象においてウイルス量を検出不能なレベルまで減少させることができる、上記結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、処置未経験ＨＩＶ患者に１週間に１回または２週間に１回のスケジュールにおいて約１０ｍｇ／ｋｇ以上で投与したとき、患者の機能的治癒を生じさせる、ＨＡＡＲＴへの補助療法における重要な成分として上記結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

競合的対非競合的ＨＩＶ侵入阻害機序。図１ａは、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０及び阻害剤（例えば、抗体薬剤）が共通の標的表面分子の同じ部分（即ち、ＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２）に結合するために競合する競合的ＨＩＶ侵入阻害モデルにおいて得られる理論上の結果を示すグラフである。このモデルでは、阻害剤の濃度が特定の閾値に達したとき、ＨＩＶ結合／侵入の１００％阻害を達成することができる。それと比較して、図１ｂは、ＨＩＶ及び阻害剤が同じ標的分子上の異なる部位（例えば、ＴＭＢ−３５５ではＣＤ４のドメイン２）に結合する非競合的ＨＩＶ侵入阻害モデルにおいて得られる理論上の結果を示すグラフである。この非競合的阻害モデルでは、ＨＩＶ結合／侵入を阻害剤により減少させることができるが、阻害剤の濃度に関わらず完全な阻害は達成されていない。本抗体薬剤に対するＨＩＶの耐性は、薬剤濃度に関わらず％阻害において「平坦域」として反映されている。ＴＭＢ−３５５を用いた、１１種類の分岐群を網羅する１１８種類の多様なＨＩＶ−１Ｅｎｖ偽ウイルス株のパネルのＨＩＶ−１侵入阻害結果（Pace, G.ら、2011）。各ウイルスについて、黒色の線は最大１０μｇ／ｍＬのＴＭＢ−３５５濃度で処置した場合の最大阻害率（ＭＰＩ）（左のＹ軸）を示し、灰色の線は対応するＩＣ_５０（右のＹ軸）を示す。ＴＭＢ−３５５は５０％以上の阻害でウイルス株の９２％を中和し、９５％以上の阻害でウイルス株の３１％のみを中和した。ｍＡｂＢ４を用いて１０年間にわたって収集した８５０種を超えるＥｎｖ偽型ＨＩＶウイルスのパネルのＨＩＶ−１侵入阻害。ｍＡｂＢ４は、８５０種類全てのＥｎｖ偽型ウイルスにおいてほぼ１００％の最大阻害率（ＭＰＩ）と共に、一方が０．０１〜１μｇ／ｍＬで他方が約１０μｇ／ｍＬの２種類の濃度の周りに集中しているＩＣ_５０により、ＨＩＶ侵入阻害において広域性（breadth）および効力の両方を与える。ＵＢ−４２１に用いられる、ｍＡｂｄＢ４Ｃ７抗体のＦｖ領域の重鎖の全アミノ酸配列（配列番号７）。その親マウスＢ４抗体に由来する、対応するＣＤＲ１、２および３領域を表す配列には下線が引かれている（表４、配列番号１〜３）。可変および定常領域はそれぞれ薄い灰色および濃い灰色で網かけされている（それぞれ配列番号１１および１２）。そのＦｖ領域位置には珍しいＮ−グリコシル化部位として機能する重鎖のａａ１０１にあるアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）は、Ｂ４抗体結合に不可欠である。置換されたヒトＩｇＧ_１Ｆｃ領域配列では、そのアミノ酸をＨｉｓ（Ｈ）で置換すること、即ちＮ２９８Ｈにより、ａａ２９８にあるアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）のＮ−グリコシル化部位が除去されている。この突然変異により、抗体Ｂ４の存在下でのＩｇＧ媒介性補体依存性細胞傷害（ＣｄＣ）およびＣＤ４陽性Ｔ細胞枯渇がなくなることが分かっている。ＵＢ−４２１に用いられる、ｄＢ４Ｃ７抗体のＦｖ領域の軽鎖の全アミノ酸配列（配列番号８）。その親マウスＢ４抗体に由来する、対応するＣＤＲ１、２および３領域を表す配列には下線が引かれている（表４、配列番号４〜６）。可変および定常領域はそれぞれ薄い灰色および濃い灰色で網かけされている（それぞれ配列番号１３および１４）。重鎖のＦｃ領域位置ａａ２５３、ａａ２５５およびａａ２５７における、それぞれＭｅｔ（Ｍ）からＴｙｒ（Ｙ）、即ちＭ２５３Ｙ、Ｓｅｒ（Ｓ）からＴｈｒ（Ｔ）、即ちＳ２５５Ｔ、およびＴｈｒ（Ｔ）からＧｌｕ（Ｅ）、即ちＴ２５７Ｅへのアミノ酸置換により、より長い半減期を有する、さらに改良されたヒト化抗体の重鎖の全アミノ酸配列（配列番号９）。図４および図６に記載されている可変アミノ酸を包含するヒト化抗体ｍＡｂｄＢ４の重鎖の全アミノ酸配列（配列番号１０）。本抗体を細胞の上に３回通した後のＨＰＢ−ＡＬＬ細胞の表面ＣＤ４に対するｍＡｂＢ４の結合親和性（抗体濃度）および結合能（遊離抗体および結合抗体）を示すグラフ。ＥＬＩＳＡプレートに被覆された可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）およびｐ２７０４ａペプチドの捕捉混合物に対するｍＡｂＢ４（−−−）およびｍＡｂｄＢ４（―――）の結合親和性を比較するグラフ。Ｂ４−ビオチンおよびｄＢ４Ｃ７−Ａｌｅｘａそれぞれの上記捕捉混合物への結合を競合的に阻害するためにｍＡｂＢ４およびｍＡｂｄＢ４を用いて結合親和性を決定した。ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞のＣＤ４に対するｍＡｂＢ４（−−−）およびｍＡｂｄＢ４（―――）の結合親和性を比較するグラフ。Ｂ４−ビオチンおよびｄＢ４Ｃ７−ＡｌｅｘａそれぞれのＨＰＢ−ＡＬＬ細胞の表面ＣＤ４への結合を競合的に阻害するためにｍＡｂＢ４およびｍＡｂｄＢ４を用いるＦＡＣＳにより結合親和性を決定した。ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞のＣＤ４に対するｍＡｂｄＢ４（−−−）およびｇｐ１２０ＭＮ（―――）の結合親和性を比較するグラフ。ｄＢ４Ｃ７−ＡｌｅｘａのＨＰＢ−ＡＬＬ細胞の表面ＣＤ４への結合を競合的に阻害するためにｍＡｂｄＢ４およびｇｐ１２０ＭＮを用いるＦＡＣＳにより結合親和性を決定した。ｍＡｂｄＢ４Ｃ７のＰＢＭＣＣＤ４＋Ｔ細胞への結合の温度依存性（ＭＦＩ）を示すグラフ。ｍＡｂｄＢ４濃度の関数として６人の感染していない個体の血液試料からの占有されていないＣＤ４受容体（―――）およびｍＡｂｄＢ４で占有／結合されたＣＤ４受容体（−−−）の平均割合（±ＳＤ）を示すグラフ。占有されていない受容体をｄＢ４Ｃ７−Ａｌｅｘａの血液ＣＤ４＋Ｔ細胞の表面の遊離結合部位への結合により検出し、ｍＡｂｄＢ４で占有された受容体をヤギ抗ｈｕＩｇＧ−ＦＩＴＣにより検出した。現在の抗レトロウイルス療法（ｃＡＲＴ）剤テノホビル（Tenofovir）のＨＩＶの無細胞および細胞間伝播に対する効果を示す棒グラフ（Sigal, A.ら、2011）。Ｙ軸は、テノホビルの存在または非存在下で異なる感染源から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの伝播指数を表す（Sigal, A.ら、2011）。図の説明文に示されている以下の刺激：無刺激（レーン１）、ＰＨＡ（レーン２）、非活性化ＨＩＶ（ｉＨＩＶ）溶解物（レーン３）、ＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域に対するモノクローナル抗体（レーン４）、ＣＤ４ドメインのＣＤＲ３領域に対するモノクローナル抗体（レーン５）、ＣＤ４ドメイン１／２に対するモノクローナル抗体（レーン６）、可溶性ＣＤ４の存在下におけるｉＨＩＶ（レーン７）、可溶性ＣＤ４の存在下におけるＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域に対するモノクローナル抗体（レーン８）、可溶性ＣＤ４の存在下におけるＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ３領域に対するモノクローナル抗体（レーン９）、および可溶性ＣＤ４の存在下におけるＣＤ４ドメイン１／２に対するモノクローナル抗体（レーン１０）によって誘導された休止ＰＢＭＣにおけるウイルスの再活性化を示す棒グラフ（ＨＩＶ−１ｐ２４ｇａｇ産生によって測定）（出典：Briant, L.ら、1999）。ＥＬＩＳＡで測定した、抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体によるビオチン化Ｂ４のｒｓＣＤ４への結合の競合的阻害を示すグラフ。ｍＡｂｄＢ４および抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体のＰＢＭＣの表面ＣＤ４への抗体滴定を示すグラフ。この抗体滴定は、抗体濃度（単位：μｇ／ｍＬ）に対するＣＤ４結合率（％）として測定した。図１８ａ〜図１８ｃ。処置未経験ＨＩＶ陽性およびＨＩＶ陰性対象におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させることによるサイトカインＩＬ２およびＩＦＮ−γのスーパー抗原ＳＥＢ誘導性産生に対するｍＡｂｄＢ４および抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体阻害の分析。ＨＩＶ陰性（図１８ａ）およびＨＩＶ陽性（図１８ｂ）対象について、ＣＤ４＋Ｔ細胞のスーパー抗原誘導性増殖によるＩＬ２産生に対するｍＡｂｄＢ４および抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体阻害が示されている。ＨＩＶ陰性対象および年齢適合ＨＩＶ陽性対象（図１８ｃ）について、ＣＤ８＋Ｔ細胞のスーパー抗原誘導性増殖によるＩＬ２産生に対するｍＡｂｄＢ４および抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体阻害も示されている。図１８ｄ〜図１８ｇ。ＨＩＶ陰性（図１８ｄ）およびＨＩＶ陽性（図１８ｅ）対象について、ＣＤ４＋Ｔ細胞のスーパー抗原誘導性増殖によるＩＦＮ−γ産生に対するｍＡｂｄＢ４および抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体阻害が示されている。ＨＩＶ陰性（図１９ｆ）およびＨＩＶ陽性（図１９ｇ）対象について、ＣＤ８＋Ｔ細胞のスーパー抗原誘導性増殖によるＩＦＮ−γ産生に対するｍＡｂｄＢ４および抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体阻害も示されている。図１９ａ〜図１９ｃ。感染後の時間の経過に伴ってＰＢＭＣ中のＨＩＶ−１ＲＮＡコピー／ｍＬによって測定した場合の、ＨＩＶ−１初代分離株ＤＨ１２（ＨＩＶ−１_ＤＨ１２）への曝露前（図１９ａ）および曝露後（図１９ｂ）のｍＡｂＢ４投与によるチンパンジーのＨＩＶ感染からの保護を示すグラフ。抗体投与なしでＨＩＶ−１_ＤＨ１２に曝露した対照動物の結果を示すグラフ（図１９ｃ）も示されている。下向きの矢印はＨＩＶ−１_ＤＨ１２抗原投与の投与前または投与から１時間後のいずれかにｍＡｂＢ４を投与した研究の開始を示す。図２０ａおよび図２０ｂ。時間の経過に伴ってＨＩＶ−１ＲＮＡコピー／ｍＬにより測定した場合の、未処置およびｍＡｂＢ４で処置したＨＩＶ−１感染チンパンジーのＨＩＶウイルス量を示すグラフ。図２０ａは、ｍＡｂＢ４の３回の注入を受けたチンパンジーＸ３５６（黒丸）における血漿ウイルス血症の持続期間を、前の研究でｍＡｂＢ４の単回投与を以前に受けた未処置の対照チンパンジーＸ０８４（白丸）と比較している。図２０ｂは、ｍＡｂＢ４の３回の注入を受けたチンパンジーＸ３５６（黒丸）における血漿ウイルス血症の持続期間を、以前にｍＡｂＢ４の投与を受けなかった未処置の対照チンパンジーＸ２５９（白丸）と比較している。図２１。ｍＡｂｄＢ４のヒト（−−−）およびヒヒ（―――）ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対する結合親和性を比較するグラフ。図２２ａおよび図２２ｂ。用量増加（１、５、１０および２５ｍｇ／ｋｇ）第Ｉ相臨床研究における抗体薬剤ＵＢ−４２１（ｍＡｂｄＢ４Ｃ７）の単回投与を受けた患者に関する、研究日数に対するＨＩＶ−１ＲＮＡにおける平均Ｌｏｇ_１０の変化を示すグラフ。図２２ａは研究の過程にわたって各用量によって示されるウイルス減少を示すグラフである。図２２ｂは各用量の平均および最大の個々の最下点を示すグラフである。図２３ａ。ＵＢ−４２１（ｍＡｂｄＢ４Ｃ７）の有効性の理論上の比較およびＴＭＢ−３５５（ＴＮＸ−３５５として以前から知られている、Kuritzkes, D. R.ら、２００４、図１）について以前に報告された有効性データを示すグラフ。図２３ａは５ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１および３ｍｇ／ｋｇのＴＭＢ−３５５の単回投与後に観察されたウイルス量の減少を比較するグラフである。図２３ｂ。ＵＢ−４２１（ｍＡｂｄＢ４Ｃ７）の有効性の理論上の比較およびＴＭＢ−３５５（ＴＮＸ−３５５として以前から知られている、Kuritzkes, D. R.ら、２００４、図１）について以前に報告された有効性データを示すグラフ。図２３ｂは、１０ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１またはＴＭＢ−３５５の単回投与後に観察されたウイルス量の減少を比較するグラフである。図２３ｃ。ＵＢ−４２１（ｍＡｂｄＢ４Ｃ７）の有効性の理論上の比較およびＴＭＢ−３５５（ＴＮＸ−３５５として以前から知られている、Kuritzkes, D. R.ら、２００４、図１）について以前に報告された有効性データを示すグラフ。図２３ｃは、２５ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１またはＴＭＢ−３５５の単回投与後に観察されたウイルス量の減少を比較するグラフである。図２４ａ。８週間の処置期間にわたってＵＢ−４２１（ｍＡｂｄＢ４Ｃ７）の投与を１０ｍｇ／ｋｇで１週間に１回（図２４ａ）または２５ｍｇ／ｋｇで２週間に１回（図２４ｂ）受けた対象における平均ＰＢＭＣＣＤ４Ｔ細胞数／ｍｍ^３を示すグラフ。ＣＤ４のドメイン２に対するビオチン化抗体によってＵＢ−４２１処置患者において安定なＣＤ４Ｔ細胞数が検出された。図２４ｂ。８週間の処置期間にわたってＵＢ−４２１（ｍＡｂｄＢ４Ｃ７）の投与を１０ｍｇ／ｋｇで１週間に１回（図２４ａ）または２５ｍｇ／ｋｇで２週間に１回（図２４ｂ）受けた対象における平均ＰＢＭＣＣＤ４Ｔ細胞数／ｍｍ^３を示すグラフ。ＣＤ４のドメイン２に対するビオチン化抗体によってＵＢ−４２１処置患者において安定なＣＤ４Ｔ細胞数が検出された。図２５ａ。第ＩＩａ相臨床試験の過程で、ウイルス量の減少によって測定したＵＢ−４２１処置の臨床的有効性（上側のパネル）および血清中濃度（μｇ／ｍＬ）によって測定したＵＢ−４２１の薬物動態（下側のパネル）を示すグラフ。以下の代表的な患者：ＵＢ−４２１の投与を１０ｍｇ／ｋｇで１週間に１回受けた患者１−１−０１（図２５ａ）、ＵＢ−４２１の投与を１０ｍｇ／ｋｇで１週間に１回受けた患者１−１−０２（図２５ｂ）、ＵＢ−４２１の投与を２５ｍｇ／ｋｇで２週間に１回受けた患者１−２−０３（図２５ｃ）およびＵＢ−４２１の投与を２５ｍｇ／ｋｇで２週間に１回受けた患者１−２−０６（図２５ｄ）の関連データが提供されている。細胞の完全被覆を示すＰＢＭＣＣＤ４＋細胞上へのＵＢ−４２１結合の持続期間は灰色で網かけされている。図２５ｂ。第ＩＩａ相臨床試験の過程で、ウイルス量の減少によって測定したＵＢ−４２１処置の臨床的有効性（上側のパネル）および血清中濃度（μｇ／ｍＬ）によって測定したＵＢ−４２１の薬物動態（下側のパネル）を示すグラフ。以下の代表的な患者：ＵＢ−４２１の投与を１０ｍｇ／ｋｇで１週間に１回受けた患者１−１−０１（図２５ａ）、ＵＢ−４２１の投与を１０ｍｇ／ｋｇで１週間に１回受けた患者１−１−０２（図２５ｂ）、ＵＢ−４２１の投与を２５ｍｇ／ｋｇで２週間に１回受けた患者１−２−０３（図２５ｃ）およびＵＢ−４２１の投与を２５ｍｇ／ｋｇで２週間に１回受けた患者１−２−０６（図２５ｄ）の関連データが提供されている。細胞の完全被覆を示すＰＢＭＣＣＤ４＋細胞上へのＵＢ−４２１結合の持続期間は灰色で網かけされている。図２５ｃ。第ＩＩａ相臨床試験の過程で、ウイルス量の減少によって測定したＵＢ−４２１処置の臨床的有効性（上側のパネル）および血清中濃度（μｇ／ｍＬ）によって測定したＵＢ−４２１の薬物動態（下側のパネル）を示すグラフ。以下の代表的な患者：ＵＢ−４２１の投与を１０ｍｇ／ｋｇで１週間に１回受けた患者１−１−０１（図２５ａ）、ＵＢ−４２１の投与を１０ｍｇ／ｋｇで１週間に１回受けた患者１−１−０２（図２５ｂ）、ＵＢ−４２１の投与を２５ｍｇ／ｋｇで２週間に１回受けた患者１−２−０３（図２５ｃ）およびＵＢ−４２１の投与を２５ｍｇ／ｋｇで２週間に１回受けた患者１−２−０６（図２５ｄ）の関連データが提供されている。細胞の完全被覆を示すＰＢＭＣＣＤ４＋細胞上へのＵＢ−４２１結合の持続期間は灰色で網かけされている。図２５ｄ。第ＩＩａ相臨床試験の過程で、ウイルス量の減少によって測定したＵＢ−４２１処置の臨床的有効性（上側のパネル）および血清中濃度（μｇ／ｍＬ）によって測定したＵＢ−４２１の薬物動態（下側のパネル）を示すグラフ。以下の代表的な患者：ＵＢ−４２１の投与を１０ｍｇ／ｋｇで１週間に１回受けた患者１−１−０１（図２５ａ）、ＵＢ−４２１の投与を１０ｍｇ／ｋｇで１週間に１回受けた患者１−１−０２（図２５ｂ）、ＵＢ−４２１の投与を２５ｍｇ／ｋｇで２週間に１回受けた患者１−２−０３（図２５ｃ）およびＵＢ−４２１の投与を２５ｍｇ／ｋｇで２週間に１回受けた患者１−２−０６（図２５ｄ）の関連データが提供されている。細胞の完全被覆を示すＰＢＭＣＣＤ４＋細胞上へのＵＢ−４２１結合の持続期間は灰色で網かけされている。図２６ａ。他の研究者ら（Jacobson, J. L.ら、2009；Toma, J.ら、2011およびPace, C. S.ら、2013）によって行われたＴＭＢ−３５５（イバリズマブ、かつてのＴＮＸ−３５５）に関する同様の研究で観察されたウイルス量の減少に対して、ＵＢ−４２１を用いた第ＩＩａ相臨床試験で観察されたウイルス量の減少の理論上の比較を示すグラフ。図２６ａは１０ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１で処置した対象において観察されたウイルス量の変化を要約したものであり、図２６ｂは同じ投与量レベルのＴＭＢ−３５５で処置した対象において観察されたウイルス量の変化を要約したものである。図２６ｂ。他の研究者ら（Jacobson, J. L.ら、2009；Toma, J.ら、2011およびPace, C. S.ら、2013）によって行われたＴＭＢ−３５５（イバリズマブ、かつてのＴＮＸ−３５５）に関する同様の研究で観察されたウイルス量の減少に対して、ＵＢ−４２１を用いた第ＩＩａ相臨床試験で観察されたウイルス量の減少の理論上の比較を示すグラフ。図２６ａは１０ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１で処置した対象において観察されたウイルス量の変化を要約したものであり、図２６ｂは同じ投与量レベルのＴＭＢ−３５５で処置した対象において観察されたウイルス量の変化を要約したものである。図２７。処置未経験ＨＩＶ患者およびＨＡＡＲＴ処置で安定したＨＩＶ患者において、ＨＡＡＲＴ療法の代わりとしてＵＢ−４２１単剤療法を用いたＨＩＶ患者集団における処置法を示す概略図。図２８。処置未経験ＨＩＶ患者、ＨＡＡＲＴ処置で安定したＨＩＶ患者およびＨＡＡＲＴ処置に失敗したＨＩＶ患者において、ＨＩＶ感染の機能的治癒のためにＵＢ−４２１をＨＡＡＲＴ療法と併用したＨＩＶ患者集団における処置法を示す概略図。

本開示は、ＨＩＶ感染の予防、処置および／または機能的治癒のための組成物および方法に関する。本開示の一面として、ＣＤ４に対する抗体、その製剤、ならびにＨＩＶ感染の予防、処置および／または機能的治癒のためにそのような製剤を用いる方法に関する。

本明細書で使用されている節の見出しは単に構成のためのものであり、記載されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。本願に引用されている全ての参考文献または参考文献の一部は、あらゆる目的のためにその内容全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

ＣＤ４
ＣＤ４（分化抗原群４）は、Ｔヘルパー細胞、単球、マクロファージおよび樹状細胞などの免疫細胞の表面に存在する糖タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０１７３０．１）である（http://en.wikipedia.org/wiki/CD4）。ＣＤ４は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、細胞の細胞外表面に露出される４種類の免疫グロブリンドメイン（Ｄ１〜Ｄ４）を有する。ＣＤ４ドメインのＤ１およびＤ３は免疫グロブリン可変（ＩｇＶ）ドメインに似ており、Ｄ２およびＤ４は免疫グロブリン定常（ＩｇＣ）ドメインに似ている。ＣＤ４は、そのＤ１ドメインを使用してＭＨＣクラスＩＩ分子のβ２ドメインと相互作用する。したがって、それらの表面でＣＤ４分子を発現しているＴ細胞は、ＭＨＣＩＩによって提示される抗原に特異的である。ＣＤ４の短い細胞質尾部／細胞内末端（intracellular tail）は、それをｌｃｋ分子と相互作用させることができる特殊なアミノ酸配列を含む。

ＣＤ４の第一の細胞外ドメインは、免疫グロブリン鎖と類似する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）において免疫グロブリンと相同性を共有している。ＣＤ４分子の細胞外領域のドメイン１およびドメイン２はどちらもＭＨＣクラスＩＩ分子の結合部位に寄与することが分かったが、ドメイン１のみがＨＩＶ結合および合胞体形成に関与することが分かった。特に、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０との結合部位はドメイン１のＣＤＲ２様ループに局在化されていることが分かった。

ＨＩＶ−１は、ＣＤ４を使用して宿主Ｔ細胞に入り込み、ｇｐ１２０として知られているそのウイルスエンベロープタンパク質を介してこれを達成する。ＣＤ４への結合によりｇｐ１２０の立体構造における変化が生じ、ＨＩＶ−１は、宿主細胞上に発現されているケモカイン受容体ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４に結合することができる。別のウイルスタンパク質（ｇｐ４１）における構造的変化後に、ＨＩＶは、ウイルスの外膜を細胞膜と融合させることができる融合ペプチドを宿主細胞の中に挿入する。ＨＩＶ感染によりＣＤ４を発現しているＴ細胞の数の漸減が生じる。

抗体
本開示の一面として、ＨＩＶ感染の予防、処置および／または機能的治癒のためのＣＤ４に対する抗体、その組成物およびそのような組成物の使用方法に関する。

本開示の抗体は、インタクトな（intact）ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、キメラ抗体、脱免疫化（deimmunized）抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、霊長類化抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、合成抗体および組換え抗体ならびに所望の活性または機能を有する抗体断片を含むインタクトな抗体分子を広く包含する。

本開示の抗体は、ＣＤ４のドメイン１を認識する。ある態様において、該抗体は、ＣＤ４のドメイン１のＣＤＲ２領域に特異的に結合する。

本開示の抗体は、あらゆる標準的な方法によって産生させことができる。いくつかの態様において、本開示の抗体は、動物（例えば、マウス、イヌ、モルモット、ブタ、ヤギ、ウマなど）を組換えＣＤ４タンパク質、組換えＣＤ４タンパク質の断片またはその表面においてＣＤ４を発現している細胞で免疫化することにより産生される。または、該抗体は、化学合成することができる。

ある態様において、抗体は、動物をＣＤ４のドメイン１のアミノ酸配列を含むペプチドで免疫化することにより産生される。例えば、動物をＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域のアミノ酸配列を含むペプチドまたはペプチドの組み合わせで免疫化することによりポリクローナル抗体を産生させることができる。いくつかの態様において、該ペプチドは、ＨＩＶがＣＤ４のこの部分に結合するという理由から、ＨＩＶ受容体複合体（「ＨＩＶＲＣ」）としても知られているＣＤ４のａａ３９−６６を含む。具体的な態様において、ＨＩＶＲＣペプチドは、ジスルフィド結合により環状になる。

いくつかの態様において、ポリクローナル抗体は、動物を環状ＨＩＶＲＣペプチドで免疫化することにより産生される。本明細書で用いられる「抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体」という用語は、ＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域のａａ３９−６６を含む環状ペプチドに対する免疫血清を指す。

他の態様において、抗体は、動物をＣＤ４陽性細胞で免疫化することにより産生される。例えば、ある態様において、ＢＡＬＢ／ｃマウスをインタクトな感染していないＣＤ４＋ヒトＨＰＢ−ＡＬＬ細胞、即ちＴ細胞性急性リンパ芽球性白血病細胞株で免疫化することにより該抗体を産生させた。この抗体は、Wangによる米国特許第5,912,176号並びに第6,090,388号及び1999年のWangらによる雑誌論文にさらに詳細に記載されており、それらの内容全体が参照により組み込まれる。

他の態様において、抗体は、配列表に含まれる配列の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を含む。本開示は、配列表に含まれるアミノ酸配列を含む抗体の相同体および機能的類似体を包含する。

本開示の抗体の機能的類似体は、元の抗体と実質的に同じ機能特性（結合認識、結合親和性など）を保持する配列変異体および相同体を含む。例えば、機能的類似体または相同体である抗体変異体は、アミノ酸位置における保存的置換、全電荷（overall charge）における変化、別の部分への共有結合または小さい付加、挿入、欠失または保存的置換および／またはそれらのあらゆる組み合わせを有していてもよい。したがって、抗体の変異抗体の機能的類似体および相同体は、ＣＤ４を認識して結合し、対象におけるＨＩＶを処置するのに用いることができる。

一態様において、抗体の機能的類似体または相同体は一般に、配列表に開示されているアミノ酸配列を含む抗体と少なくとも約５０％の配列同一性を有する。この態様の変形において、抗体の機能的類似体または相同体は、配列表に開示されているアミノ酸配列を含む抗体と少なくとも約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９９％の同一性を有する。

保存的置換は、１つのアミノ酸残基が同様の化学的特性を有する別のアミノ酸残基で置換された場合の置換である。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられ；極性中性アミノ酸として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ；正電荷を有する（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられ；負電荷を有する（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。

別の態様において、抗体の機能的類似体を、Ｎ末端、Ｃ末端へのアミノ酸付加または欠失、および／または配列の中央への挿入によって修飾することができる。本発明の各種態様において、付加または欠失はペプチドのＮ末端またはＣ末端への付加または欠失である。付加または欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸残基の付加または欠失である。そのような付加または欠失は、抗体の一般的な機能特性を変化させない配列表に含まれている配列中に存在しないアミノ酸配列を構成してもよい。

ある態様において、本開示の抗体は、化学物質でタグ付けまたは標識化されている。例えば、抗体を、ビオチン、スペーサーアーム、プローブ（例えば、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＴＲＩＴＣ、ＤｙＬｉｇｈｔＦｌｕｏｒｓ、Ａｌｅｘａ、ＧＦＰ、Ｒ−フィコエリトリン、量子ドットなど）、酵素複合体およびそれらの組み合わせで標識化することができる。具体的な態様において、本抗体はビオチンまたは蛍光プローブで標識化されている。

具体的な態様において、脱免疫化として知られているプロセスにより抗体を修飾することができる。本明細書で使用される「脱免疫化」という用語は一般に、動物の体内で免疫応答を引き起こすことなく動物に投与することができるように抗体の一部を修飾するためのプロセスを指す。具体的には、脱免疫化は、抗体が投与される特定の動物において免疫原性になる抗体のアミノ酸配列の一部（例えば、Ｔ細胞エピトープ）の位置を突き止めて除去するためのプロセスを含む。このプロセスは免疫学的および分子生物学的技術の併用により達成することができる。このプロセスについては以前に記載されている（例えば、Jones, T. D.ら、2009）。抗体の脱免疫化の場合、一般に、抗体の結合親和性を著しく減少させることなくＴ細胞エピトープを除去するための突然変異を導入することができる。

本明細書で使用される「ヒト化」という用語は、ヒトに投与されるとき、抗体の免疫原性を除去するようにそのタンパク質配列が修飾（脱免疫化）された非ヒト生物種によって最初に産生された抗体を指す。ある態様において、本開示の抗体は、その定常領域をヒト定常領域で置換すること、および／または哺乳類細胞においてこれらの抗体をコードする遺伝子を発現させることにより、ヒトへの使用のために脱免疫化されている。

ある態様において、本開示の抗体は、表４に示す、抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有する。

本明細書で用いられる「ｍＡｂＢ４」または「Ｂ４」または「マウスＢ４」という用語は、配列番号１〜６の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２、３領域のアミノ酸配列をそれぞれ有するマウスモノクローナル抗体を指す（表４）。このマウスモノクローナル抗体は、ＣＤ４を認識することが分かっており、ＨＩＶ侵入を阻害することができる。この抗体の構造および機能特性については以下の実施例でさらに詳細に考察する。

本明細書で用いられる「ｍＡｂｄＢ４」または「ｄＢ４」という用語は、ｍＡｂＢ４に由来するヒト脱免疫化抗体を指す。ヒト脱免疫化ｍＡｂｄＢ４は、配列番号１〜６の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２、３領域のアミノ酸配列をそれぞれ有する（表４）。いくつかの態様において、ｍＡｂｄＢ４の軽鎖は、図５に示す配列番号８のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、ｍＡｂｄＢ４の重鎖は、図４に示す配列番号７のアミノ酸配列を有する。変形態様において、ｍＡｂｄＢ４の重鎖は、図６に示す配列番号９のアミノ酸配列を有する。当該分野で知られている任意の適当な方法により、ｍＡｂＢ４を脱免疫化することができる。一態様において、米国特許第7,501,494号および第7,872,110号（これらの開示内容全体が参照により組み込まれる）に記載されている方法に従って、ヒトへの使用のためにｍＡｂＢ４を脱免疫化する。特定の態様において、ｍＡｂＢ４のマウス抗体の定常領域（Ｃ_ＨおよびＣκ）を除去してヒトＩｇＧ_１の定常領域で置換することにより、ヒト脱免疫化ｍＡｂｄＢ４が産生される。ｍＡｂｄＢ４はあらゆる好適な細胞性クローンによって産生されるｄＢ４を包含する。具体的な態様において、クローン７によってｍＡｂｄＢ４を産生させる。

本明細書で用いられる「ｍＡｂｄＢ４Ｃ７」または「ｄＢ４Ｃ７」という用語は、米国特許第7,501,494号および第7,872,110号（これらの開示内容全体が参照により組み込まれる）以前に記載された組換え遺伝子Ｂ４ＤＩＶＨｖ１／ＶＫ１ＣＨＯ＃７を含むクローン７によって発現されたｍＡｂｄＢ４を指す。Ｃ７クローンは、多量のｍＡｂｄＢ４抗体を産生することが分かっている。特に、ｍＡｂＢ４Ｃ７は、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖（図５）および配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖（図４）を含むヒト脱免疫化抗体である。さらに、ｍＡｂｄＢ４Ｃ７中の２９８位のＡｓｎ（Ｎ）残基は、Ｈｉｓ（Ｈ）で置換され、Ｎ−グリコシル化部位が除去され、このようにして抗体Ｂ４の存在下でのＩｇＧ媒介性補体依存性細胞傷害（ＣｄＣ）をなくしてＣＤ４陽性Ｔ細胞の枯渇を防止する。

本明細書で用いられる「ＵＢ−４２１」という用語は、ヒト対象に投与するのに適した形態で使用されるｍＡｂｄＢ４Ｃ７を指す。

本開示の抗体を、その興味深くかつ独特な機能特性によって説明することもできる。

例えば、本開示の抗体は、そのＣＤ４のドメイン１への結合により、強力な競合的ＨＩＶ侵入阻害を発揮する。特に、本開示の抗体は、試験した全てのＥｎｖ偽型ウイルスにおいてほぼ１００％の最大阻害率（ＭＰＩ）を有すると共に、一方が０．０１〜１μｇ／ｍＬで他方が約１０μｇ／ｍＬの２種類の濃度の周りに集中しているＩＣ_５０を有する。本開示の抗体の結合活性は、ＨＩＶｇｐ１２０エンベロープタンパク質によって示されるＣＤ４結合親和性よりも約２ｌｏｇ高い（即ち、１００倍より密な結合）。さらに、本開示の抗体の平均Ｋｄは、５．６×１０^−１１Ｍ（範囲：３．１〜８．１×１０^−１１Ｍ）と推定され、Ｂｍａｘは、１細胞当たり１．２×１０^６Ａｂ（範囲：０．９３〜１．４×１０^６）と推定された。

本開示の抗体の競合的阻害特性は、無細胞系および細胞間系の両方において示された。本開示の抗体は、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質ｇｐ１２０ＭＮよりも少なくとも５０倍高い親和性でＣＤ４受容体に結合する。また、本開示の抗体は、Ｌｅｕ３ａなどの他の市販されている抗体と比較してより大きな親和性および特異性によりＣＤ４に結合する。

本開示の抗体は、ピロトーシスの病理発生サイクルに関与する、抗原誘導性Ｔ細胞増殖およびＣＤ４陽性Ｔ細胞のサイトカイン産生（ＩＬ２およびＩＦＮ−γ）を阻害することもできる。そのようなＣＤ４に対する高親和性モノクローナル抗体は、スーパー抗原ＳＥＢ（ブドウ球菌性エンテロトキシンＢ、ＳＥＢ）などの抗原誘導性ＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化およびサイトカイン（例えば、ＩＬ２およびＩＦＮ−γ）産生を阻害する。不稔ＨＩＶ感染を有する静止ＣＤ４＋Ｔ細胞においてサイトカイン産生を生じさせるそのような抗原誘導性活性化は、これらの静止ＣＤ４＋Ｔ細胞および近くの正常な休止ＣＤ４陽性細胞のピロトーシスを引き起こし、その結果、ＣＤ４＋Ｔ細胞の大量の枯渇が生じ、このようにしてＡＩＤＳが生じる。

本開示の抗体は、休止ＣＤ４陽性Ｔ細胞を再活性化する能力も有する。この特性は、休止Ｔ細胞におけるＨＩＶの潜伏リザーバーを再活性化させて、これらの細胞を抗レトロウイルス剤によって処置しやすくするのに特に有用である。そのようなＣＤ４に対する高親和性抗体は、ＨＩＶの放出のために休止ＨＩＶ感染細胞を活性化することができる。ＨＩＶ感染した休止ＣＤ４＋Ｔ細胞の再活性化により、ＨＩＶ感染した患者において本発明の抗体をＨＡＡＲＴと共に組み込んだ併用処置が可能になり、機能的治癒が生じる。

本開示の抗体のさらなる構造および機能特性は、以下の実施例に提供されている。

製剤
本開示は、ＨＩＶ感染の予防、処置および／または機能的治癒のために使用することができる医薬製剤にも関する。ある態様において、本製剤はＣＤ４に対する抗体を含む。具体的な態様において、本開示は、ＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域内またはその近傍の部位に向けられるＣＤ４に対する高親和性モノクローナル抗体を有する医薬組成物に関する。そのような抗体の結合活性（ＥＣ_５０）は、ＨＩＶｇｐ１２０エンベロープタンパク質によって示されるＣＤ４結合親和性（ｇｐ１２０のＥＣ_５０＝９７ｎＭ）よりも約２ｌｏｇ高い（即ち１００倍より密な結合）。

本開示の抗体タンパク質の医薬製剤は、抗体タンパク質を薬学上許容可能な担体と任意に混合することにより、調製することができる。薬学上許容可能な担体として、溶媒、分散媒、等張剤などが挙げられる。該担体は、液体、半固体、例えばペースト、または固体の担体であってもよい。担体の例として、水、生理食塩水または他の緩衝液（リン酸、クエン酸緩衝液など）、油、アルコール、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンなど）、炭水化物（グルコース、スクロース、トレハロース、マンノース、マンニトール、ソルビトールまたはデキストリンなどの単糖類、二糖類および他の炭水化物など）、ゲル、脂質、リポソーム、樹脂、多孔性マトリックス、結合剤、充填剤、被覆剤、安定化剤、防腐剤、アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤、またはそれらの組み合わせが挙げられる。

製剤は、２種類以上の活性化合物を含むことができる。例えば、製剤は、ＨＩＶ感染を予防または処置するための１種以上の抗体および／または１種以上のさらなる有利な化合物を含むことができる。該有効成分を任意の好都合かつ実用的な方法、例えば、混合、溶解、懸濁、乳化、カプセル化、吸収などにより担体と組み合わせることができ、注射、経口摂取、注入などに適した錠剤、カプセル、粉末（凍結乾燥した粉末を含む）、シロップ、懸濁液などの製剤に調製することができる。徐放性調製物も調製することができる。

ある態様において、医薬製剤は、ヒトへの使用のためにｍＡｂｄＢ４Ｃ７を含む。ｍＡｂｄＢ４Ｃ７を含む医薬製剤は、限定されるものではないが、ｐＨ６．０〜７．０のクエン酸、リン酸、Ｔｒｉｓ、ＢＩＳ−Ｔｒｉｓなどの適当な緩衝液で調製することができ、糖類（５０ｍＭ〜５００ｍＭスクロース、トレハロース、マンニトールまたはそれらの混合物）、界面活性剤（例えば、０．０２５％〜０．５％Ｔｗｅｅｎ２０またはＴｗｅｅｎ８０）および／または他の試薬などの賦形剤も含むことができる。具体的な態様において、製剤は、２０ｍＭグリシン中にｍＡｂｄＢ４Ｃ７と、ｐＨ６．５のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（ポリソルベート２０）とを含む。別の具体的な態様において、皮下注射などの特定の用途で使用するために、１０ｍＭヒスチジンを含むｍＡｂｄＢ４の高濃度製剤も調製した。

製剤は、各種量の抗体を含むように調製することができる。一般に、対象への投与のための製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの抗体を含む。ある態様において、製剤は、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ；約１．０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ；約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ；または約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬの抗体を含むことができる。具体的な態様において、製剤は、約１．０ｍｇ／ｍＬ、約５．０ｍｇ／ｍＬ、約１０．０ｍｇ／ｍＬ、または約２５．０ｍｇ／ｍＬの抗体を含む。

具体的な態様において、本発明は、ＨＩＶ感染を有する患者における免疫療法として、競合的ＨＩＶ侵入阻害及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示す、上記結合特性を有するＣＤ４のドメイン１のＣＤＲ２領域を標的とするモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、処置される対象において、１０μｇ／ｍＬよりも高い血清抗体レベルでウイルス量を検出不能なレベルまで減少させることができる単剤療法剤として機能する、上記結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、処置される対象において１０μｇ／ｍＬよりも高い血清抗体レベルでウイルス量を検出不能なレベルまで減少させ、かつ１２週間の処置期間中に安定なＣＤ４Ｔ細胞数を維持することができる単剤療法剤として機能する、上記結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

ある態様において、本発明は、単剤療法として１週間に１回または２週間に１回のスケジュールにおいて約１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量で投与したとき、そのような処置により１２週間の処置期間中に処置される対象において、ウイルス量を検出不能なレベルまで減少させることができる、上記結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

さらに別の好ましい態様において、本発明は、処置未経験ＨＩＶ患者に１週間に１回または２週間に１回のスケジュールにおいて約１０ｍｇ／ｋｇ以上で投与したとき、患者の機能的治癒を生じさせる、ＨＡＡＲＴへの補助療法における重要な成分として上記結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

さらに別の好ましい態様において、本発明は、ＨＡＡＲＴ下で安定したウイルス量を有する患者に１週間に１回または２週間に１回のスケジュールにおいて約１０ｍｇ／ｋｇ以上で投与したとき、患者の機能的治癒を生じさせる、ＨＡＡＲＴへの補助療法における重要な成分として上記結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

抗ウイルス剤
本開示は、ＨＩＶ感染の処置、予防および機能的治癒のための方法で用いることができる抗ウイルス剤も含む。

抗ウイルス剤として、哺乳類におけるＨＩＶの形成および／または複製を阻害するのに有効なあらゆる薬剤（化合物または生物製剤）が挙げられる。抗ウイルス剤の例として、侵入／融合阻害剤（例えば、マラビロク（maraviroc）、エンフビルチド（enfuvirtide））；ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）およびヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮｔＲＴＩ）（例えば、ジドブジン（zidovudine）、アバカビル（abacavir）、ラミブジン（lamivudine）、エムトリシタビン（emtricitabine）およびテノホビル（tenofovir））；非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）（例えば、ネビラピン（nevirapine）、エファビレンツ（efavirenz）、エトラビリン（etravirine）、およびリルピビリン（rilpivirine））；インテグラーゼ核鎖転移阻害剤（nuclear strand transfer inhibitor）またはＩＮＳＴＩとしても知られているインテグラーゼ阻害剤（例えば、ラルテグラビル（raltegravir）、ドルテグラビル（dolutegravir））；プロテアーゼ阻害剤（例えば、サキナビル（saquinavir）、メシル酸サキナビル（saquinavir mesylate）、ホスアンプレナビル（fosamprenavir）、チプラナビル（tipranavir）、ロピナビル（lopinavir）、インジナビル（indinavir）、ネルフィナビル（nelfinavir）、アンプレナビル（amprenavir）、リトナビル（ritonavir）、ダルナビル（darunavir）、アタザナビル（atazanavir）、ベビリマット（bevirimat）、ビベコン（vivecon））；ウイルス成熟阻害剤；ＨＩＶ遺伝子の発現を標的とする薬剤；ＨＩＶ複製に関与する重要な宿主細胞遺伝子および遺伝子産物を標的とする薬剤；及び他の抗ＨＩＶ剤；ｉＲＮＡ剤；アンチセンスＲＮＡ、ｉＲＮＡ発現ベクター剤（vectors expressing iRNA agent）またはアンチセンスＲＮＡ；ＰＮＡおよび抗ウイルス抗体；及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

抗ウイルス剤は、個々に使用することも併用することもできる。抗ウイルス剤の併用は、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）、併用抗レトロウイルス療法（ｃＡＲＴ）または高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）として知られている。抗レトロウイルス（ＡＲＶ）剤は、その薬剤が阻害するレトロウイルス生活環の段階によって大きく分類される。典型的な組み合わせは、「ベース」としての１種類のＮＮＲＴＩ、ＰＩまたはＩＮＳＴＩと共に「バックボーン」として２種類のＮＲＴＩを含む。ある態様において、コンビビル（Combivir）、トリジビル（Trizivir）、カレトラ（Kaletra）、エプジコム（Epzicom）、ツルバダ（Truvada）、アロリプラ（Atripla）、コムプレラ（Complera）、スタリビルド（Stribild）、トリーメク（Triumeq）などの抗ウイルス剤の組み合わせが用いられる。

処置、予防および機能的治癒方法
本開示は、ＨＩＶ感染の処置、予防および機能的治癒のための方法にも関する。ある態様において、製剤はＣＤ４に対する抗体を含む。

さらなる面において、対象におけるＨＩＶ感染の処置、予防、および／または機能的治癒ならびにＨＩＶ感染の予防のために、薬学上許容可能な担体と混合して任意に提供される本明細書に開示されている抗体を用いることができる。

ＨＩＶ感染の「処置」という用語は、その発症を遅らせるか、その進行を減速させるか、ウイルス量を減少させるか、および／またはＨＩＶ感染によって引き起こされる症状を改善させるためのＨＩＶ感染の有効な阻害を指す。処置は、ＨＩＶへの曝露前および曝露後の両方を含む。

ＨＩＶ感染の「予防」という用語は、ＨＩＶ感染の発症を遅らせること、および／またはＨＩＶ感染の発生率または可能性を減少または皆無にすることを意味する。ＨＩＶ伝播の「予防」という用語は、ＨＩＶがある個体から別の個体に（例えば、妊娠、陣痛または出産または授乳中にＨＩＶ陽性の女性からその子供に）伝播する発生率または可能性を減少または皆無にすることを意味する。

「対象」という用語は、ヒト、アカゲザル、ヒヒおよびチンパンジー対象などのあらゆる霊長類対象を指す。

ＨＩＶ感染を処置および／または予防するために、治療量の本明細書に開示されている抗体をそれを必要としている対象に投与する。

「治療上有効量」という用語は、ＨＩＶ感染を処置および／または予防するためにＨＩＶ感染の阻害をもたらすのに必要な投与量を意味する。抗体の投与量は、疾患状態、対象の体重および状態などの他の臨床的因子、対象の療法への応答、製剤の種類および投与経路によって決まる。治療上有効かつ有害でない正確な投与量は、当業者によって決定することができる。

一般に、成人のヒトへの投与のための抗体の好適な用量は、対象の体重の約３〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、使用される典型的な初回範囲は、対象の体重の約５〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲である。好適な投与量として、患者の体重の約５．０ｍｇ／ｋｇ、約１０．０ｍｇ／ｋｇ、または約２５．０ｍｇ／ｋｇも挙げられる。

本発明のヒトモノクローナル抗体を含む治療用組成物は、例えば単位用量の注射により、従来通りに静脈内投与される。本発明の治療用組成物の単位用量とは一般に、各単位が所要の希釈液、即ち担体または溶媒と共に所望の処置効果を生じさせるように計算された所定量の活性物質を含有する対象に適した単位投与量として物理的に分離した単位をさらに指す。

組成物は、該投与剤形（dosage formulation）に適合可能な方法、および治療上有効量で投与される。投与される量は、処置される対象、有効成分を利用する対象の系の容量、および所望の治療効果の程度によって決まる。投与するのに必要な有効成分の正確な量は、実務者の判断によって決まり、各個体に特有である。但し、全身投与に適した投与量範囲は、本明細書に開示されており、投与経路によって決まる。投与に適したレジメンも可変的であるが、初回投与、次いでその後の注射または他の投与による１時間以上の間隔での反復投与が典型的である。または、血中濃度をインビボ療法のために指定された範囲に維持するのに十分な連続的な静脈内注入が想定される。

対象におけるＨＩＶ感染の処置、予防、および／または機能的治癒のための方法は、抗体を含む製剤を有効量で対象に投与する工程を含む。ある態様において、製剤は、単回投与で対象に与えられる。他の態様において、製剤は、複数回投与で対象に与えられる。製剤が複数回投与で対象に与えられる場合、本製剤を１日１回、１週間に１回、２週間に１回（隔週）または１ヶ月に１回投与することができる。具体的な態様において、処置スケジュールが１週間に１回である場合、製剤は、対象の体重の約５．０ｍｇ／ｋｇの投与量で対象に投与される。別の態様において、処置スケジュールが２週間に１回である場合、製剤は、対象の体重の約２５．０ｍｇ／ｋｇの投与量で対象に投与される。

ある態様において、モノクローナル抗体を含む製剤は、高い安全性因子を示し、計８週間にわたって５ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇを１週間に１回の頻度で対象に繰り返し投与したとき、十分に忍容性があった。具体的な態様において、ＨＩＶ感染後数時間以内にモノクローナル抗体を５ｍｇ／ｋｇで対象に投与してＨＩＶ感染の完全治癒を得ることができる。他の態様において、ＨＩＶ感染後数日以内にモノクローナル抗体を５ｍｇ／ｋｇで対象に投与してＨＩＶ感染の機能的治癒を得ることができる。

ある態様において、本発明は、ウイルス量を減少させるための免疫療法としてＩＶまたはＳＣ経路によりＨＩＶ患者に投与することができる、上記結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。具体的な態様において、本発明は、ＨＩＶ感染を有する患者における免疫療法として競合的ＨＩＶ侵入阻害ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示す、上記結合特性を有するＣＤ４のドメイン１のＣＤＲ２領域を標的とするモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

他のある態様において、本発明は、１週間に１回または２週間に１回のスケジュールにおいて約１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量でウイルス量を減少させるための免疫療法としてＩＶまたはＳＣ経路によりＨＩＶ患者に投与することができる、上記結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、処置される対象において１０μｇ／ｍＬよりも高い血清抗体レベルでウイルス量を検出不能なレベルまで減少させることができる単剤療法剤として機能する、上記結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、単剤療法として１週間に１回または２週間に１回のスケジュールにおいて約１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量で投与したとき、そのような処置により１２週間の処置期間中に処置される対象においてウイルス量を検出不能なレベルまで減少させることができる、上記結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、単剤療法として１週間に１回または２週間に１回のスケジュールにおいて約１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量で投与したとき、血清抗体レベルが１０μｇ／ｍＬよりも高い限りそのような処置によりウイルス量のリバウンドなしに処置される対象においてウイルス量を検出不能なレベルまで減少させることができる、上記結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、ＨＡＡＲＴ下で安定したウイルス量を有する患者に１週間に１回または２週間に１回のスケジュールにおいて約１０ｍｇ／ｋｇ以上で投与したとき、患者の機能的治癒を生じさせる、ＨＡＡＲＴへの補助療法における重要な成分として上記結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、ＨＡＡＲＴ処置に失敗した患者にＨＡＡＲＴへの補助療法において１週間に１回または２週間に１回のスケジュールにおいて約１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量でＩＶまたはＳＣ経路のいずれかにより投与することができ、それによりさらなるウイルスの減少を生じさせる、上記結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、ＨＡＡＲＴ下で安定した検出不能なウイルス量を経験している患者のために１〜４またはそれ以上のサイクルにわたって各処置サイクルを２〜４ヶ月間の抗ＣＤ４抗体処置で開始し、休薬期間（treatment holiday）を設け、次いでＨＡＡＲＴ処置を行い、それにより機能的治癒を生じさせる、ＨＡＡＲＴ代替療法における重要な成分としてＩＶまたはＳＣ経路のいずれかにより投与することができる上記結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、処置未経験ＨＩＶ患者のために１〜４またはそれ以上のサイクルにわたって各処置サイクルを２〜４ヶ月間の抗ＣＤ４抗体処置で開始し、次いで２〜４ヶ月間のＨＡＡＲＴ処置を行い、それにより機能的治癒を生じさせる、ＨＡＡＲＴ代替療法における重要な成分としてＩＶまたはＳＣ経路のいずれかにより投与することができる上記結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、ＨＡＡＲＴ下で安定した検出不能なウイルス量を経験している患者のために１〜４またはそれ以上のサイクルにわたって各処置サイクルを１週間に１回または２週間に１回のスケジュールにおいて約５ｍｇ／ｋｇ以上の用量の２〜４ヶ月間の抗ＣＤ４抗体処置で開始し、休薬期間を設け、次いでＨＡＡＲＴ処置を行い、それにより機能的治癒を生じさせる、ＨＡＡＲＴ代替療法における重要な成分としてＩＶまたはＳＣ経路のいずれかにより投与することができる上記結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、処置未経験ＨＩＶ患者のために１〜４またはそれ以上のサイクルにわたって各処置サイクルを１週間に１回または２週間に１回のスケジュールにおいて約５ｍｇ／ｋｇ以上の用量の２〜４ヶ月間の抗ＣＤ４抗体処置で開始し、次いで２〜４ヶ月間のＨＡＡＲＴ処置を行い、それにより機能的治癒を生じさせる、ＨＡＡＲＴ代替療法における重要な成分としてＩＶまたはＳＣ経路のいずれかにより投与することができる上記結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、処置未経験ＨＩＶ患者に集中的ＨＡＡＲＴ処置モードにおける補助療法として、１〜４またはそれ以上のサイクルにわたってサイクルごとに２〜４ヶ月間の処置期間で開始し、かつ１〜２ヶ月間の休薬期間を設ける断続モードで、ＨＡＡＲＴへの補助療法における重要な成分としてＩＶまたはＳＣ経路のいずれかにより投与することができ、それにより患者の機能的治癒を生じさせる、上記結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、処置未経験ＨＩＶ患者に集中的ＨＡＡＲＴ処置モードにおける補助療法として、１〜４またはそれ以上のサイクルにわたってサイクルごとに１週間に１回または２週間に１回のスケジュールにおいて約５ｍｇ／ｋｇ以上の用量の２〜４ヶ月間の処置期間で開始し、かつ１〜２ヶ月間の休薬期間を設ける断続モードで、ＨＡＡＲＴへの補助療法における重要な成分としてＩＶまたはＳＣ経路のいずれかにより投与することができ、それにより患者の機能的治癒を生じさせる、上記結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、ＨＡＡＲＴ下で安定した検出不能なウイルス量を経験している患者に集中的ＨＡＡＲＴ処置モードにおける補助療法として、１〜４またはそれ以上のサイクルにわたってサイクルごとに１週間に１回または２週間に１回のスケジュールにおいて約５ｍｇ／ｋｇ以上の用量の２〜４ヶ月間の処置期間で開始し、かつ１〜２ヶ月間の休薬期間を設ける断続モードで、ＨＡＡＲＴへの補助療法における重要な成分としてＩＶまたはＳＣ経路のいずれかにより投与することができ、それにより患者の機能的治癒を生じさせる、上記結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、ウイルス量を減少させるための免疫療法としてＩＶまたはＳＣ経路によりＨＩＶ患者に投与することができる、上記結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、ウイルス量を減少させるための免疫療法として１週間に１回または２週間に１回のスケジュールにおいて約５ｍｇ／ｋｇ以上の用量でＩＶまたはＳＣ経路によりＨＩＶ患者に投与することができる、上記結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。

具体的な態様
本開示は以下の具体的な態様を包含する。

（１）ＨＩＶ感染に曝露された対象の処置方法であって、ａ）配列番号１のマウス抗体Ｂ４の重鎖のＣＤＲ１、配列番号２のマウス抗体Ｂ４の重鎖のＣＤＲ２、配列番号３のマウス抗体Ｂ４の重鎖のＣＤＲ３、配列番号４のマウス抗体Ｂ４の軽鎖のＣＤＲ１、配列番号５のマウス抗体Ｂ４の軽鎖のＣＤＲ２、および配列番号６のマウス抗体Ｂ４の軽鎖のＣＤＲ３を有する、ＣＤ４に対するモノクローナル抗体を薬理学上有効量で投与する工程；ｂ）工程（ａ）後に、対象の血液１ミリリットル当たりのＨＩＶＲＮＡレベルを評価する工程；を有する、上記方法。

（２）前記抗体の重鎖配列が配列番号７を有する、（１）の方法。
（３）前記抗体の重鎖配列が配列番号９を有する、（１）の方法。
（４）前記抗体の軽鎖配列が配列番号８を有する、（１）の方法。
（５）前記抗体の重鎖配列が配列番号７を有し、かつ前記抗体の軽鎖配列が配列番号８を有する、（１）の方法。
（６）前記抗体の重鎖配列が配列番号９を有し、かつ前記抗体の軽鎖配列が配列番号８を有する、（１）の方法。

（７）ＨＩＶ感染への曝露後２４時間以内に投与工程（ａ）を行う、（１）の方法。
（８）ＨＩＶ感染への曝露後４８日以内に投与工程（ａ）を行う、（１）の方法。
（９）１２週間の期間中に１週間に１回または２週間に１回のスケジュールにおいて約１０μｇ／ｍｌ以上の血清レベルで前記モノクローナル抗体を薬理学上有効量で投与する、（１）の方法。
（１０）１ミリリットル当たりのＨＩＶＲＮＡレベル値が１コピー／ｍｌ未満をウイルスの根絶とみなす、（１）の方法。
（１１）１ミリリットル当たりのＨＩＶＲＮＡレベル値が１〜５０コピー／ｍｌ未満をウイルスの機能的治癒とみなす、（１）の方法。

（１２）ＨＩＶを有する患者の処置方法であって、ａ）配列番号１のマウス抗体Ｂ４の重鎖のＣＤＲ１、配列番号２のマウス抗体Ｂ４の重鎖のＣＤＲ２、配列番号３のマウス抗体Ｂ４の重鎖のＣＤＲ３、配列番号４のマウス抗体Ｂ４の軽鎖のＣＤＲ１、配列番号５のマウス抗体Ｂ４の軽鎖のＣＤＲ２、および配列番号６のマウス抗体Ｂ４の軽鎖のＣＤＲ３：を有する、ＣＤ４に対するモノクローナル抗体を有する組成物を薬理学上有効量；及び高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）剤を投与する工程；及びｂ）工程（ａ）後に、対象の血液１ミリリットル当たりのＨＩＶＲＮＡレベルを評価する工程；を有する上記方法。

（１３）前記抗体の重鎖配列が配列番号７を有する、（１２）の方法。
（１４）前記抗体の重鎖配列が配列番号９を有する、（１２）の方法。
（１５）前記抗体の軽鎖配列が配列番号８を有する、（１２）の方法。
（１６）前記抗体の重鎖配列が配列番号７を有し、かつ前記抗体の軽鎖配列が配列番号８を有する、（１２）の方法。
（１７）前記抗体の重鎖配列が配列番号９を有し、かつ前記抗体の軽鎖配列が配列番号８を有する、（１２）の方法。

（１８）１週間に１回または２週間に１回の頻度により１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量で薬理学上有効量の前記抗体を投与する、（１２）の方法。
（１９）ＨＡＡＲＴ処置モードにおける補助療法として断続モードで前記抗体を投与する、（１２）の方法。
（２０）１サイクル当たりＨＡＡＲＴ処置モードにおける補助療法としての約２〜４ヶ月の期間、次いでＨＡＡＲＴ処置モードにおける１〜２ヶ月間の休抗体薬期間で前記抗体を投与する、（１９）の方法。
（２１）１〜４サイクルにわたって中間モードを継続する、（２０）の方法。

（２２）ＨＩＶを有する患者の処置方法であって、ａ）患者におけるＨＩＶウイルス発現および潜在的に感染した細胞のアポトーシスを活性化させることによりＨＩＶ感染患者における潜伏ＨＩＶリザーバーを減少させる工程；及びｂ）薬理学上有効量のＨＡＡＲＴ剤を患者に投与する工程；を有する、上記方法。

（２３）患者におけるＨＩＶウイルス発現および潜在的に感染した細胞のアポトーシスの前記活性化を、配列番号１のマウス抗体Ｂ４の重鎖のＣＤＲ１、配列番号２のマウス抗体Ｂ４の重鎖のＣＤＲ２、配列番号３のマウス抗体Ｂ４の重鎖のＣＤＲ３、配列番号４のマウス抗体Ｂ４の軽鎖のＣＤＲ１、配列番号５のマウス抗体Ｂ４の軽鎖のＣＤＲ２、および配列番号６のマウス抗体Ｂ４の軽鎖のＣＤＲ３：を有する、ＣＤ４に対するモノクローナル抗体を薬理学上有効量で患者に投与することにより行う、（２２）の方法。

（２４）患者におけるＨＩＶウイルス発現および潜在的に感染した細胞のアポトーシスの前記活性化を、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤を患者に投与することにより行う、（２２）の方法。

（２５）ＨＩＶ感染に曝露された対象の処置方法であって、ａ）ＣＤ４のＣＤＲ２様ドメイン領域に対して高い親和性を有するモノクローナル抗体を薬理学上有効量で投与する工程；及びｂ）工程（ａ）後に、対象の血液１ミリリットル当たりのＨＩＶＲＮＡレベルを評価する工程；を有する、上記方法。

（２６）前記抗体の重鎖配列が配列番号７を有する、（２５）の方法。
（２７）前記抗体の重鎖配列が配列番号９を有する、（２５）の方法。
（２８）前記抗体の軽鎖配列が配列番号８を有する、（２５）の方法。
（２９）前記抗体の重鎖配列が配列番号７を有し、かつ前記抗体の軽鎖配列が配列番号８を有する、（２５）の方法。
（３０）前記抗体の重鎖配列が配列番号９を有し、かつ前記抗体の軽鎖配列が配列番号８を有する、（２５）の方法。

（３１）ＨＩＶ感染への曝露後２４時間以内に投与工程（ａ）を行う、（２５）の方法。
（３２）ＨＩＶ感染への曝露後４８日以内に投与工程（ａ）を行う、（２５）の方法。

（３３）１２週間の期間中に１週間に１回または２週間に１回のスケジュールにおいて約１０μｇ／ｍｌ以上の血清レベルで前記モノクローナル抗体を薬理学上有効量で投与する、（２５）に記載の方法。
（３４）１ミリリットル当たりのＨＩＶＲＮＡレベル値が１コピー／ｍｌ未満をウイルスの根絶とみなす、（２５）の方法。
（３５）１ミリリットル当たりのＨＩＶＲＮＡレベル値が１〜５０コピー／ｍｌ未満をウイルスの機能的治癒とみなす、（２５）の方法。

追加の具体的な態様
（１）ＣＤ４のドメイン１に対する抗体を薬理学上有効量で対象に投与する工程；を有する、ＨＩＶに曝露された対象の処置方法。
（２）前記抗体がＣＤ４のドメイン１のＣＤＲ２領域に特異的に結合する、（１）記載の方法。
（３）前記抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそれらの組み合わせである、（２）に記載の方法。
（４）前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である、（２）に記載の方法。

（５）前記ヒト化モノクローナル抗体が、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２、および配列番号３のＣＤＲ３を有する重鎖アミノ酸配列；及び配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、および配列番号６のＣＤＲ３を有する軽鎖アミノ酸配列；を有する、（４）に記載の方法。
（６）前記ヒト化モノクローナル抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖；及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖；を有する、（４）に記載の方法。
（７）前記ヒト化モノクローナル抗体が、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖；及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖；を有する、（４）に記載の方法。
（８）前記重鎖が配列番号７のアミノ酸配列を有する、（７）に記載の方法。

（９）前記ヒト化抗体を、ＨＩＶへの曝露前に対象に投与する、（８）に記載の方法。
（１０）前記ヒト化抗体を、ＨＩＶへの曝露後に対象に投与する、（８）に記載の方法。
（１１）前記ヒト化抗体を、ＨＩＶへの曝露後４８時間以内に投与する、（１０）に記載の方法。
（１２）前記ヒト化抗体を少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で対象に投与する、（８）に記載の方法。

（１３）前記ヒト化抗体を対象に複数回投与する、（１２）に記載の方法。
（１４）前記ヒト化抗体を１週間に１回または２週間に１回の間隔で対象に投与する、（１３）に記載の方法。
（１５）抗ウイルス剤を対象に投与する工程をさらに含む、（１３）に記載の方法。
（１６）前記抗ウイルス剤が高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）剤である、（１５）に記載の方法。

（１７）前記ＨＡＡＲＴ剤が、プロテアーゼ阻害剤または非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤と組み合わせたヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤を有する、（１６）に記載の方法。
（１８）前記ヒト化抗体をＨＡＡＲＴ剤と同時に投与する、（１６）に記載の方法。
（１９）前記ヒト化抗体およびＨＡＡＲＴ剤をあるサイクルに亘って対象に投与する、（１６）に記載の方法であって、前記サイクルが（ｉ）前記ヒト化抗体を４ヶ月の期間にわたって１週間に１回または２週間に１回の間隔で対象に投与し、その後の２ヶ月間を休薬期間とする工程；及び（ｉｉ）（ｉ）における６ヶ月の期間にＨＡＡＲＴ剤を対象に連続的に投与する工程；を有する、上記方法。
（２０）対象を２サイクルに亘って処置する、（１８）に記載の方法。

（２１）処置レジメンを対象に投与する工程を有する、ＨＩＶ感染を有する対象の処置方法であって、該処置レジメンが、（ａ）ＣＤ４のドメイン１に対する抗体を薬理学上有効量；及び（ｂ）高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）剤を有する、上記方法。
（２２）前記抗体がＣＤ４のドメイン１のＣＤＲ２領域に特異的に結合する、（２１）に記載の方法。
（２３）前記抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそれらの組み合わせである、（２２）に記載の方法。
（２４）前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である、（２２）に記載の方法。
（２５）前記ヒト化モノクローナル抗体が、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２、および配列番号３のＣＤＲ３：を有する重鎖アミノ酸配列；及び配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、および配列番号６のＣＤＲ３：を有する軽鎖アミノ酸配列；を有する、（２４）に記載の方法。

（２６）前記ヒト化モノクローナル抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖；及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖；を有する、（２４）に記載の方法。
（２７）前記ヒト化モノクローナル抗体が、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖；及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖；を有する、（２４）に記載の方法。
（２８）前記ヒト化抗体を少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で対象に投与する、（２７）に記載の方法。
（２９）前記処置レジメンをあるサイクルに亘って対象に投与する、（２１）に記載の方法であって、前記サイクルが、（ｉ）前記ヒト化抗体を４ヶ月の期間にわたって１週間に１回または２週間に１回の間隔で対象に投与し、その後の２ヶ月間を休薬期間とする工程；及び（ｉｉ）（ｉ）における６ヶ月の期間にＨＡＡＲＴ剤を対象に連続的に投与する工程；を有する、上記方法。
（３０）対象を２サイクルで処置する、（１８）に記載の方法。

さらなる具体的な態様
（１）ＣＤ４のドメイン１に対する抗体を薬理学上有効量で有する、ＨＩＶに曝露された対象を処置するための組成物。
（２）前記抗体がＣＤ４のドメイン１のＣＤＲ２領域に特異的に結合する、（１）に記載の組成物。
（３）前記抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又はそれらの組み合わせである、（２）に記載の組成物。
（４）前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である、（２）に記載の組成物。

（５）前記ヒト化モノクローナル抗体が、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２、および配列番号３のＣＤＲ３：を有する重鎖アミノ酸配列；及び配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、および配列番号６のＣＤＲ３：を有する軽鎖アミノ酸配列；を有する、（４）に記載の組成物。

（６）前記ヒト化モノクローナル抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖；及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖；を有する、（４）に記載の組成物。
（７）前記ヒト化モノクローナル抗体が、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖；及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖；を有する、（４）に記載の組成物。
（８）前記重鎖が配列番号７のアミノ酸配列を有する、（７）に記載の組成物。
（９）前記ヒト化抗体を、ＨＩＶへの曝露前に対象に投与する、（８）に記載の組成物。
（１０）前記ヒト化抗体を、ＨＩＶへの曝露後に対象に投与する、（８）に記載の組成物。
（１１）前記ヒト化抗体を、ＨＩＶへの曝露後４８時間以内に投与する、（１０）に記載の組成物。

（１２）前記ヒト化抗体を少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で対象に投与する、（８）に記載の組成物。
（１３）前記ヒト化抗体を対象に複数回投与する、（１２）に記載の組成物。
（１４）前記ヒト化抗体を１週間に１回または２週間に１回の間隔で対象に投与する、（１３）に記載の組成物。
（１５）抗ウイルス剤で対象を処置する（か又は抗ウイルス剤を対象に投与する）、（１３）に記載の組成物。
（１６）前記抗ウイルス剤が高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）剤である、（１５）に記載の組成物。

（１７）ＨＡＡＲＴ剤が、プロテアーゼ阻害剤または非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤と組み合わせたヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤を有する、（１６）に記載の組成物。
（１８）前記ヒト化抗体をＨＡＡＲＴ剤と同時に投与する、（１６）に記載の組成物。
（１９）前記ヒト化抗体およびＨＡＡＲＴ剤をあるサイクルに亘って対象に投与する、（１６）に記載の組成物であって、前記サイクルが、（ｉ）前記ヒト化抗体を４ヶ月の期間にわたって１週間に１回または２週間に１回の間隔で対象に投与し、その後の２ヶ月間を休薬期間とする工程；及び（ｉｉ）（ｉ）における６ヶ月の期間にＨＡＡＲＴ剤を対象に連続的に投与する工程；を有する、上記組成物。
（２０）対象を２サイクルに亘って処置する、（１８）に記載の組成物。

（２１）（ａ）ＣＤ４のドメイン１に対する抗体を薬理学上有効量；及び（ｂ）高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）剤；を有する、ＨＩＶ感染を有する対象を処置するための組成物。
（２２）前記抗体がＣＤ４のドメイン１のＣＤＲ２領域に特異的に結合する、（２１）に記載の組成物。

（２３）前記抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそれらの組み合わせである、（２２）に記載の組成物。
（２４）前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である、（２２）に記載の組成物。
（２５）前記ヒト化モノクローナル抗体が、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２、および配列番号３のＣＤＲ３：を有する重鎖アミノ酸配列；及び配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、および配列番号６のＣＤＲ３：を有する軽鎖アミノ酸配列；を有する、（２４）に記載の組成物。

（２６）前記ヒト化モノクローナル抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖；及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖；を有する、（２４）に記載の組成物。
（２７）前記ヒト化モノクローナル抗体が、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖；及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖；を有する、（２４）に記載の組成物。
（２８）前記ヒト化抗体を少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で対象に投与する、（２７）に記載の組成物。

（２９）前記処置レジメンをあるサイクルに亘って対象に投与する、（２１）に記載の組成物であって、前記サイクルが、（ｉ）前記ヒト化抗体を４ヶ月の期間にわたって１週間に１回または２週間に１回の間隔で対象に投与し、その後の２ヶ月間を休薬期間とする工程；及び（ｉｉ）（ｉ）における６ヶ月の期間にＨＡＡＲＴ剤を対象に連続的に投与する工程；を有する、上記組成物。
（３０）対象を２サイクルで処置する、（１８）に記載の組成物。

特記しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。「１つ（種）の（a）」「１つ（種）の（an）」および「その（前記）（the）」という単数の用語は、その文脈が明らかに別の意を示していない限り複数の指示対象を含む。同様に、「または」という用語は、その文脈が明らかに別の意を示していない限り「および」を含むものとする。故に、「ＡまたはＢを有する」は、「ＡまたはＢ」あるいは「ＡおよびＢ」を含むことを意味する。さらに、ポリペプチドについて与えられる全てのアミノ酸のサイズおよび全ての分子量（molecular weight）または分子量の値（molecular mass value）はおおよそであり、説明のために提供されているものと理解すべきである。本明細書に記載されているものと同様または等価の方法および材料を本開示の方法の実施または試験で使用することができるが、好適な方法および材料について以下に説明する。本明細書で言及されている全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献の内容全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書を優先する。さらに、材料、方法および実施例は単に例示であり、限定的なものではない。

図および関連する実施例の以下の例示的な説明は、本明細書、特に実施例に頻繁に使用されている特定の用語の理解を容易にするために提供されている。これらの説明は便宜上提供されており、本発明を限定するものではない。

実施例１
ｍＡｂＢ４の免疫学的および機能的特性
モノクローナル抗体Ｂ４（ｍＡｂＢ４）は、Ｔ細胞の表面（ＣＤ４）にあるＨＩＶ受容体複合体部位を認識するモノクローナル抗体である。ｍＡｂＢ４は、ＣＤ４のＨＩＶ共受容体との相互作用に影響を与えて妨害することができる。ｍＡｂＢ４は、初代ＨＩＶ−１分離株を優先的に中和した。

以下の情報は、２つの米国特許（Wangによる米国特許第5,912,176号および第6,090,388号）ならびにWangらによる１９９９年の雑誌論文（その開示内容全体が参照により組み込まれる）から引用されたデータを含むマウスｍＡｂＢ４の発見および予備特性評価研究を要約したものである。

１．ＨＰＢ−ＡＬＬ免疫により得られるマウスモノクローナル抗体
ＢＡＬＢ／ｃマウスをインタクトな未感染ＣＤ４＋ヒトＨＰＢ−ＡＬＬ細胞（Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病細胞株）で免疫化して、ｍＡｂＢ４を得た。
細胞表面にあるＣＤ４に対する特異性を有し、かつＨＩＶ−１の初代分離株に対する広域な中和活性を有する、ｍＡｂＢ４によって代表される新規なクラスの抗ＣＤ４抗体を得た。

２．ｍＡｂＢ４認識部位の特性評価
ｍＡｂＢ４は、組換え可溶性ＣＤ４（ｒｓＣＤ４）と比較して、細胞の表面にある膜結合型ＣＤ４を優先的に認識することが分かっている。

ＨＩＶの曝露前に膜結合型ＣＤ４に結合しているｍＡｂＢ４は、その後のｇｐ１２０およびウイルス全体のＣＤ４への結合を阻止することが分かっている。但し、該抗体への曝露前にｇｐ１２０に結合した膜結合型ＣＤ４は、なおｍＡｂＢ４に結合することができる。したがって、ｍＡｂＢ４はｇｐ１２０の膜結合型ＣＤ４への結合に影響を与えることができるが、ｇｐ１２０はｍＡｂＢ４のＣＤ４への結合に影響を与えない。

ｍＡｂＢ４の認識部位は、ＣＤ４ドメイン１を認識するｍＡｂＬｅｕ３ａおよびＯＫＴ４Ａモノクローナル抗体などの他のよく研究されている抗ＣＤ４モノクローナル抗体（Chiba,Y. 1992；Jameson, B.D.ら、1988）およびＣＤ４ドメイン２を認識するｍＡｂ５Ａ８モノクローナル抗体（Burklyら、1992）のものとは異なる。

３．ｍＡｂＢ４のインビトロ中和活性
マウスｍＡｂＢ４は、一般的な定義では中和抗体ではない。その代わり、ｍＡｂＢ４は、ウイルスに結合するのではなく、むしろ宿主細胞受容体を被覆することによりウイルス侵入を阻害する。ｍＡｂＢ４のＨＩＶ感染に対する効果は、当該分野で知られているウイルス中和アッセイ（例えば、ＭＴ−２マイクロプラーク中和アッセイ（ＭＴ−２ Microplaque Neutralization Assay）（Sawyerら、1994））により容易に観察することができる。マウスｍＡｂＢ４の中和活性は、本発明者らの共同研究者であるCarl Hanson博士（カリフォルニア保健サービス省（California Department of Health Services））によって評価され、John Mascola博士（ヘンリー・ジャクソン財団（Henry Jackson Foundation）、ＷＲＡＩＲ）、David Montefiori博士（デューク大学）およびMalcolm Martin博士（アメリカ国立アレルギー・感染症研究所（ＮＩＡＩＤ））の研究所でも独立して評価された。１９９５年から２０１０年に広範囲に特性評価された以下のＨＩＶ中和特徴はｍＡｂＢ４に関連している。

１．ＰＢＭＣで増殖させた初代分離株は、Ｔ細胞株適応（T cell line-adapted）分離株ＨＩＶ−１_ＩＩＩＢおよびＨＩＶ−１_ＭＮよりもｍＡｂＢ４による中和に対して感度が高かった。
２．ｍＡｂＢ４は、ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４（二重指向性）およびＣＣＲ５共受容体利用の初代分離株による感染を中和する。
３．ｍＡｂＢ４は、ＣＸＣＲ４共受容体利用のＴ細胞株適応ＨＩＶ−１分離株に対して低い活性を有する。

４．ｍＡｂＢ４は、ＨＩＶ−１サブタイプＡ〜Ｇを表す様々な合胞体誘導性（ＳＩ：Syncytial Inducing）および非合胞体誘導性（ＮＳＩ：Non-Syncytial Inducing）初代分離株を９０％終点および３ｌｏｇの感染力まで中和する。
５．ｍＡｂＢ４は、二重指向性（dual co-receptor）ＨＩＶ−１エンベロープを有するＨＩＶ−２、ＳＩＶおよびＳＨＩＶを中和する。

６．扁桃組織培養（histoculture）システムでは、ｍＡｂＢ４は、ＨＩＶ−１初代分離株ＶＬ１３５（ＨＩＶ−１_{ＶＬ１３５}）の感染力を２ｌｏｇ減少させる。１２．５μｇ／ｍＬ程の少ないｍＡｂＢ４が、活性なヒト補体の存在下で（これは多くの抗ウイルス抗体が抗体依存性感染増強（antibody-dependent enhancement）を示す条件である）、１００ＴＩＤ_５０（５０％扁桃組織感染用量（tonsil infectious dose））超の単細胞向性（monocytotropic）分離株ＪＲ−ＣＳＦを完全に中和する。

７．ｍＡｂＢ４は、感染後４８時間までｎ添加した場合、ＨＩＶ−１_{ＶＬ１３５}に対し中和活性を発揮し、その後、７２時間までに添加した場合、著しい抗ウイルス効果を示した。
ａ．これは、細胞またはウイルスと共にプレインキュベートしたか否かに関わらず等しく有効である。
ｂ．これは、侵入後機序（post-entry mechanism）ではなく感染病巣が新しい細胞に広がるのを阻止することにより作用する。
ｃ．これらのアッセイでは、ｍＡｂＢ４は細胞傷害に寄与しなかった。

実施例２
ＨＩＶ−１中和および耐性アッセイ
１９９８年から２０１１年の間、Carl Hanson博士の研究所及びMonogram Biosciences社において、各種分岐群の複数のＨＩＶ分離株について以下のウイルス中和および耐性アッセイを行った。これらのアッセイの詳細な説明について以下に記載する。

１．ＨＩＶ−１中和アッセイ
当該研究のそれぞれに示されているように血液または抗体試料を採取した。ＭＴ−２マイクロプラークアッセイまたはマイトジェン（ＰＨＡ）刺激ＰＢＭＣアッセイのいずれかを用いて、血清または抗体試料をＨＩＶ−１分離株の複数分岐群（multi-clade）パネル上で評価した。

１．１．ＭＴ−２マイクロプラークアッセイ
ＭＴ−２マイクロプラークアッセイはＨＩＶの合胞体誘導性（syncytium-inducing）分離株に限定した。このアッセイを９６ウェルプレート内で行い、ここではマイクロプラーク上の合胞体の蛍光染色により、１ウェル当たり最大２５個の小さいプラークを数えることができた。このアッセイでは、感染したＭＴ−２細胞は、遠心分離中にゲル化する溶解したアガロースを介した遠心分離により単層を形成した。このアッセイは高感度であり、広いダイナミックレンジを有することが分かった。このアッセイは多数の標本を処理する際に比類なく効率的であることも分かった。多数の反復ウェル（replicate well）によって可能となるコンピュータ化統計分析を用いることにより、他の形式を用いたとき、達成が難しかった程度の品質管理および標準化が提供されることが分かった。

１．２．ＰＢＭＣアッセイ
ＰＢＭＣアッセイは、９６ウェルマイクロタイタープレートにおける感染細胞の増殖後の抗原捕捉ＥＬＩＳＡによりＰＢＭＣにおけるｐ２４抗原の発現を定量化する、標準的な抗原減少（antigen-reduction）アッセイである。このアッセイの利点は、全てのＨＩＶ株および分離株へのその適用性にある。

１．３．ウイルス株
エクスビボおよびインビボ中和研究のためのＨＩＶ−１株は、表３、表５および表６ならびに図１ａ、図１ｂ、図３、図２２および図２３に列挙されている。サブタイプＡ〜ＧおよびＨの初代ＨＩＶ−１ウイルスは、（ａ）カリフォルニア保健サービス省のサンフランシスコ男性健康研究（San Francisco Men’s Health Study）のウイルスおよびリケッチア症研究室（ＶＲＤＬ：Viral and Rickettsial Disease Laboratory）に参加した同性愛者の男性から単離されたもの、（ｂ）ＨＩＶの分離および特性評価のための世界保健機関ネットワーク（World Health Organization Network for HIV Isolation and Characterization）から取得したもの、（ｃ）米軍ＨＩＶ研究プログラム（U.S. Military HIV Research Program）によって提供されたもの、および（ｄ）アメリカ国立アレルギー・感染症研究所のＡＩＤＳ研究および標準試薬プログラム（AIDS Research and Reference Reagent Program）から贈呈されたものである。ＤＨ−１２（チンパンジー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において継代された患者分離株）も、アメリカ国立アレルギー・感染症研究所のＡＩＤＳ研究および標準試薬プログラムによって提供された。

１．４．Ｂ４またはｄＢ４中和活性
Ｂ４またはｄＢ４中和活性は、抗体を含有しない対照と比較したとき、ウイルスにおける指示された減少率（５０〜９５％）が得られる抗体濃度として定めた。５０％および９０％終点の抗体濃度を抗体希釈間の補間により導出した。

２．ＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅＨＩＶ侵入アッセイ
薬剤耐性の測定のためのＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅＨＩＶ侵入アッセイを、Monogram Biosciences社（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）で行った。
ベクタープールから産生された組換えウイルスを使用して、各種濃度の薬剤または抗体（例えば、Ｂ４またはｄＢ４）の存在下で細胞を感染させた。試験ベクターのウイルス複製を５０％（ＩＣ_５０）又は９０％（ＩＣ_９０）阻害するのに必要な薬剤の量を測定した。
２．１．ＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅＨＩＶアッセイで使用される組換えウイルスの産生
ＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅＨＩＶアッセイで使用される組換えウイルスを、ＨＩＶ感染の横断的研究でスクリーニングしてＨＩＶ血清陽性と判定された患者から採取した試料から産生した。偶発的なＨＩＶ感染を有する個体では、ＨＩＶウイルス量およびＣＤ４細胞数を含む臨床検査評価のために臨床および血漿試料を採取した。最初に血清陰性であったが約１年の経過観察後に血清陽性となった個体では、ウェスタンブロット確認を含む２種類の酵素免疫測定法によりＨＩＶ感染を確認した。

表３に示すように、抗体陽転時にサブタイプＡ、ＢＦ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＥＡ、Ｆ、ＧまたはＪ（複数のハイブリダイゼーションアッセイを用いる以前のＨＩＶサブタイプ化に基づく）を有していた参加者の試料を組換えウイルスの構築のために採取した。ＨＩＶのｅｎｖおよびｐｏｌ領域を試験試料から増幅し、増幅したＤＮＡを試験ベクターにクローン化した。ＧｅｎｅＳｅｑＨＩＶでは、ベクタープールを配列決定してＨＩＶ遺伝子型を決定した。ＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅＨＩＶアッセイでは、ベクタープールから産生した組換えウイルスを使用して各種濃度の薬剤の存在下で細胞を感染させた。

実施例３
Monogram Biosciences社のＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅアッセイによる全ての分岐群のＨＩＶ分離株に対するｍＡｂＢ４の中和活性
ｍＡｂＢ４がＢ分岐群の全てのＨＩＶウイルスを中和することが十分に立証されている。１つの研究において、分岐群Ａ（ｎ＝８）、ＢＦ（ｎ＝１）、Ｃ（ｎ＝１８）、Ｄ（ｎ＋１８）、Ｅ（ｎ＝４）、ＥＡ（ｎ＝１０）、Ｆ（ｎ＝８）、Ｇ（ｎ＋４）、Ｊ（Ｎ＝２）由来の計７３種類の代表的なＢ分岐群以外のＨＩＶ分離株＋３種類の対照ウイルス９２ＨＴ５９４、ＪＲＣＳＦ、ＪＲＦＬを組換えウイルスに調製し、ｍＡｂＢ４に対するそれらの感度についてＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅＨＩＶアッセイで試験した（表３）。全ての組換えウイルスはｍＡｂＢ４に対して非常に感度が高く、平均ＩＣ_５０＝０．０１８μｇ／ｍＬおよびＩＣ_９０＝０．０６２μｇ／ｍＬという前例がない程に低いＩＣ_５０およびＩＣ_９０濃度を有することが分かった。これらのＨＩＶ分離株の多くが多剤耐性患者に由来しており、ｍＡｂＢ４またはそのヒト対応物が既にＨＩＶ薬剤耐性である患者を処置するのに非常に効率的であるという明らかな兆候を発見したことは注目すべきことであった。

実施例４
モノクローナル抗体Ｂ４は競合的ＨＩＶ侵入阻害を媒介する：処置時のＨＩＶ耐性突然変異の防止を予測する予期せぬ特徴
競合的阻害研究により、ＣＤ４上の同じ受容体結合部位に対してＨＩＶエンベロープタンパク質と競合し、それによりＨＩＶの細胞への侵入を阻害する阻害剤（例えば、侵入阻害抗体）の能力および有効性を評価することができる。理論上の研究では、ｍＡｂＢ４は、ＣＤ４への結合のためにＨＩＶエンベロープタンパク質（ｇｐ１２０）と競合する。図１ａはこの研究の予測される結果を示しており、この図の各線は異なるウイルス分離株を表している。具体的には、この理論上の研究から期待される結果は、異なるウイルス分離株がｍＡｂＢ４に対して異なる感度（ＩＣ_５０）を有するが、ｍＡｂＢ４が十分な濃度で存在する限り全てのウイルス分離株の侵入が１００％阻害されることを実証している。

比較として、非競合的阻害研究により、ＨＩＶエンベロープタンパク質のＣＤ４に結合する能力を阻害または減少させ、それによりＨＩＶの細胞への侵入を阻害する阻害剤（例えば、ＣＤ４の異なる部分に結合する共受容体拮抗薬または抗体）の能力および有効性を評価することができる。理論上の研究では、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｇｐ１２０）がＣＤ４に結合するのを阻害する非競合的阻害剤（例えば、ＴＭＢ−３５５）の能力を分析する。図１ｂは、この研究の予測される結果を示し、この図の各線は異なるウイルス分離株を表している。具体的には、この理論上の研究から期待される結果は、異なるウイルス分離株はＴＭＢ−３５５に対して異なる感度（ＩＣ_５０）を有し、ＴＭＢ−３５５の存在量に関わらず、ウイルス分離株の少なくとも一部が細胞に侵入することを実証している。この理論上の研究によれば、ＩＣ_５０に関わらずＨＩＶ耐性は最大阻害率における「平坦域」として観察されることが期待される。

ＴＭＢ−３５５（かつてのＴＮＸ−３５５、イバリズマブともいう）は、アカゲザルおよびヒトＣＤ４の細胞外ドメイン２に結合してＨＩＶのＣＤ４＋細胞への結合後侵入（post-binding entry）を防止するように設計されたヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である（例えば、Burkly, LCら、1992およびKurizkes, DRら、2004）。ＣＤ４上のＴＭＢ−３５５抗体結合部位はＨＩＶ−１エンベロープｇｐ１２０の結合に必要な部位とは異なり、主要組織適合遺伝子複合体タンパク質との相互作用に必要な部位とは異なる。したがって、ＴＭＢ−３５５は非競合的ＨＩＶ侵入阻害を媒介する。

ＴＭＢ−３５５は、幾種かのＨＩＶ−１ウイルスに対して強力な中和活性を有することが分かっているが、その阻害活性はＨＩＶ株の広いパネルを評価した際に一貫していない。図２は、各棒線が１種類のウイルス分離株を表す１１８種類のＥｎｖ偽型ＨＩＶウイルスのパネルに対するＴＭＢ−３５５のＭＰＩが１００％〜１５％（左のＹ軸）の範囲であり、それに伴いＩＣ_５０が０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬ（右のＹ軸）に増加することを示している（Song, R.ら、2013）。分析した全ての分岐群のうち、分岐群ＡおよびＥのウイルスは、ＡおよびＥ分岐群以外のウイルスよりもＴＭＢ−３５５に対して著しく感度が高かった。さらに、ウイルス量の減少のためにＴＭＢ−３５５処置を受けている患者からのｇｐ１２０のＶ５領域において同定された突然変異によりウイルス耐性突然変異株が発見された（Toma, J.ら、2011；Pace, C. S.ら、2013）。ＴＭＢ−３５５（イバリズマブ）によって実証された非競合的阻害作用は、１００％未満の阻害を有する分離株ではウイルス複製が生じるため、この抗体処置期間中に耐性ＨＩＶ突然変異株が発生する可能性が高くなることを示唆している。

対照的に、８５０種超のＥｎｖ偽型ＨＩＶウイルスのパネルから１０年間にわたって収集されたデータは、ｍＡｂＢ４がＨＩＶ侵入阻害において予期せぬ広域性および効力を与えることを示している（図３）。このデータ収集から、ｍＡｂＢ４がほぼ１００％のＭＰＩを有すると共に、一方が０．０１〜１μｇ／ｍＬで他方が約１０μｇ／ｍＬの２種類の濃度の周りにＩＣ_５０が集中していることが分かる。ｍＡｂＢ４のＨＩＶ侵入阻害プロファイルは、ＩＣ_５０に関わらずＨＩＶウイルスのそれぞれのＭＰＩが約１００％であるという競合的阻害機序の典型的な特性を有する。ｍＡｂＢ４の著しく強力な競合的ＨＩＶ侵入阻害特性を考慮すると、ｍＡｂＢ４による処置期間中にウイルス耐性突然変異株が発生する可能性は低い。ｍＡｂＢ４によって発揮されるそのような強い（tight）競合的阻害は、これまで試験した他のどのＨＩＶ阻害剤でも観察されたことはなかった。

この実施例から得られたＭＰＩおよびＩＣ_５０データは、実施例３で考察した多剤耐性患者に由来するＨＩＶ分離株の多くがｍＡｂＢ４に対して非常に感度が高かったということを示すデータと合わせて、ｍＡｂＢ４またはそのヒト対応物がＨＡＡＲＴ処置で失敗している薬剤耐性ＨＩＶ患者を処置するのに非常に効率的であることを示唆していた。ｍＡｂＢ４によって媒介される中和モードは、ｍＡｂＢ４または同様のＦｖ領域を有するそのヒト対応類似体による処置を受けているＨＩＶ患者において薬剤耐性ウイルス突然変異株の発生を防止するという独特なＨＩＶ剤を提供する。

実施例５
モノクローナル抗体Ｂ４のヒト化
マウス抗体として、ｍＡｂＢ４は、ヒトにおいて免疫原性である。マウス抗体のヒト化は、脱免疫化法として現在知られているプロセスにより達成することができる（Jones, T. D.ら、2009）。ｍＡｂＢ４の脱免疫化については、以下に要約されているとおり、Lynn., S.およびWang, C. Y．による米国特許第7,501,494号に詳細に説明されている（その両開示内容全体が参照により組み込まれる）。

最初に、Ｆｖ部分を保持したまま、マウス抗体Ｂ４の定常領域（Ｃ_ＨおよびＣκ）を完全に除去してヒトＩｇＧ_１の定常領域（それぞれ配列番号１２および１４）で置換し、それによりキメラＢ４抗体を産生させる。次に、ヒトへの使用のために、潜在的に免疫原性のマウスのＴおよびＢ細胞エピトープの位置を突き止めて除去することにより、マウスｍＡｂＢ４のＦｖ断片の脱免疫化を達成した。ｍＡｂＢ４の可変領域からそのようなエピトープの位置を突き止めた後に、Ｔ細胞エピトープの除去を達成した。３次元「ペプチドスレッディング（peptide threading）」法により、可変領域のアミノ酸配列をＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフの存在について分析した。抗体認識を妨げない表面残基の「ベニヤリング（veneering）」により、Ｂ細胞エピトープの可変領域からの除去を達成した。脱免疫化ヒト化型のｍＡｂＢ４をｍＡｂｄＢ４と表す。

Lynn., S.およびWang, C. Y．による米国特許第7,501,494号は、ＩｇＧ_１が、標的抗原の除去を生じさせる補体結合および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能にとって重要な二分岐の複合型のＮ−結合型糖鎖をＣＨ２内に含むと述べている。ｍＡｂＢ４はＣＤ４受容体複合体に標的化されるため、補体結合に寄与するＩｇＧ_１のエフェクター機能によりＣＤ４＋細胞の破壊およびＣＤ４＋細胞機能の免疫抑制を引き起こすことができる。したがって、ＩｇＧ_１のＦｃ領域におけるＮ−グリコシル化部位の除去により、ＩｇＧ_１がヒトＦｃＲ１に結合する能力、補体を活性化させる能力またはＣ１ｑに結合する能力を消失させて、それによりＩｇＧ_１媒介性補体依存性細胞傷害（ＣｄＣ）をなくす。１つのアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）をＨｉｓ（Ｈ）で置換する（即ちＮ２９８Ｈ）ことにより、ＩｇＧ_１のＦｃ領域内のＮ−グリコシル化部位の除去を達成した。

本明細書で述べるアミノ酸の番号付け／位置は、本明細書の一部である配列表に含まれている配列に基づいている。なお、上記のａａ２９８におけるグリコシル化部位は、ＩｇＧ_１のＥＵ番号付けシステム（European numbering system）に従って番号付けされた天然のＩｇＧ_１分子のａａ２９７に存在するグリコシル化部位に対応している。したがって、本出願におけるａａ２９８は、米国特許第7,501,494号に記載されているａａ２９７におけるグリコシル化部位に対応する。

Ｆｖドメインの脱免疫化ｍＡｂｄＢ４の重鎖（図４）および軽鎖（図５）のＣＤＲ１、２および３領域はそれぞれ、配列番号１〜６のアミノ酸配列を含む（表４）。ｍＡｂｄＢ４の重鎖および軽鎖の全長配列は、図４および図５にそれぞれ配列番号７および８として示されている。

本抗体の重鎖内の特定のアミノ酸が突然変異したとき、ｍＡｂｄＢ４の半減期が改善（延長）されることが分かった。具体的には、ａａ２５３（Ｍｅｔ）、ａａ２５５（Ｓｅｒ）およびａａ２５７（Ｔｈｒ）位の重鎖Ｆｃアミノ酸をそれぞれＴｙｒ、ＴｈｒおよびＧｌｕで置換したとき、ヒト化抗体の半減期が改善された。ヒト化ｍＡｂｄＢ４抗体の改良された重鎖の全長配列が配列番号９として図６に示されている。したがって、改良されたヒト化抗体ｍＡｂｄＢ４は、配列番号８の配列を有する軽鎖および配列番号９の配列を有する重鎖を含む。

マウスｍＡｂＢ４およびヒト化ｍＡｂｄＢ４の配列および構造の独特な特徴は、Ｆｖの重鎖内のアミノ酸位置１０１における糖結合残基Ａｓｎ（Ａｓｎ１０１）の存在である。この糖結合部位はそのＦｖ領域位置には珍しく、予期せずにＦｖドメイン内に隠れており、完全抗体分子の変性による糖の酵素的切断のためにのみ露出させることができる。Ｆｖ領域におけるこの糖の存在は最初、本抗体の特性評価を複雑にした。しかし、糖鎖または結合部位に対する修飾により本抗体のＣＤ４に対する結合親和性が破壊された。したがって、Ｆｖ領域におけるこの珍しいＮ−グリコシル化部位は本抗体のＣＤ４への結合には不可欠である。
図７は、図４および図６について上記で考察したグリコシル化、置換および突然変異部位を強調するｍＡｂｄＢ４の全長重鎖アミノ酸配列を示す。

実施例６
ＭＴ−２マイクロプラーク、ＰＢＭＣ中和アッセイおよびＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅ侵入アッセイによるｍＡｂｄＢ４とその親ｍＡｂＢ４との生物学的同等性の実証
脱免疫化／ヒト化Ｆｃ非グリコシル化（Fc-aglycosylated）ｍＡｂｄＢ４とその親マウスｍＡｂＢ４との生物学的同等性を評価して、霊長類動物およびヒトにおけるさらなる毒性／安全性および有効性の研究のためにそのヒト化型を利用できることを保証するために、広範囲な比較研究を行った。これらの比較研究の結果を以下に要約する。

１．分岐群Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥならびに分岐群ＣおよびＥ由来の代表的なＨＩＶ分離株をそれぞれ用いて、ＭＴ−２マイクロプラークおよびマイトジェン刺激ＰＢＭＣアッセイの両方において非常に高感度のＨＩＶ−１中和アッセイを行った。脱免疫化法によってマウスｍＡｂＢ４をｍＡｂｄＢ４抗体にヒト化した後にＨＩＶ中和活性の喪失は認められなかった。同等の結果がＭＴ−２マイクロプラーク（表５）およびＰＢＭＣ系アッセイ（表６）において示されている。

２．したがって、測定した全ての分岐群の全てのＨＩＶ分離株のＩＣ_５０およびＩＣ_９０は互いに２倍以内であるため、マウスｍＡｂＢ４とｍＡｂｄＢ４との間に生物学的同等性が実証された。

３．ＪＲＣＳＦ（Ｒ５）、ＨＸＢ２（Ｘ４）、９２ＴＨ５９４（Ｒ５／Ｘ４）、初代分離株＃５（Ｒ５）、初代分離株＃６（Ｒ５）および初代分離株＃７（Ｒ５）を含む様々な指向性の選択されたＨＩＶ分離株と共に、二重指向性受容体（ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５またはＸ４／Ｒ５）を発現する細胞株Ｕ８７に対して、ｍＡｂＢ４、ｍＡｂｄＢ４ならびに２種類の他の周知のＨＩＶ−ｅｎｖ標的モノクローナル中和抗体２Ｆ５および２Ｇ１２によるＨＩＶ侵入阻害を評価した。この研究では、ＨＩＶ侵入阻害を、何百種類ものＨＩＶ株のうちのいずれか１つ由来のエンベロープ糖タンパク質を有する偽型ウイルスおよびルシフェラーゼを用いて、Monogram Biosciences社が評価した。ＨＩＶのｔａｔの制御下でルシフェラーゼを発現するように操作されたＵ８７−ＣＤ４＋／ＣＣＲ５＋／ＣＸＣＲ４＋細胞において発生する生物発光を定量化することにより、抗体による中和を測定する。この研究の結果が表７に示されており、以下を実証している：
ａ．マウスｍＡｂＢ４（ＭｕＢ４、行４）は、２種類の最も強力な抗ＨＩＶＥｎｖ抗体２Ｆ５（行１）および２Ｇ１２（行２）と比較したとき、ＨＩＶ侵入阻害において非常により強力である。異なるＨＩＶ分離株の対応するＩＣ_５０はそれぞれ、０．０４：４および０．８、０．４：０．０７および０．５、０．０５：３および１．３、０．０５：５０および２０、０．０５：２および３、０．０３：＞１００および２である。
ｂ．マウスｍＡｂＢ４（ＭｕＢ４、行４）およびｍＡｂｄＢ４（行３）は、様々な種類の指向性の同じ代表的なＨＩＶ分離株で試験したとき、驚くべきことにそれらのＩＣ_５０において等しい。

したがって、重鎖及び軽鎖の両方で同じＣＤＲを共有しているマウスｍＡｂＢ４及び脱免疫化ｍＡｂｄＢ４は、生物学的に同等であり、この２種の抗体の機能特性は、各種インビトロ及びインビボ研究において互いを代表していることが十分に立証されている。

実施例７
（Ａ）ｄＢ４およびｍＡｂＢ４のＨＰＢ−ＡＬＬ細胞への結合活性；（Ｂ）ｄＢ４のＰＢＭＣＣＤ４陽性細胞への結合活性；（Ｃ）ｄＢ４の組換えＣＤ４への結合活性、ならびに（Ｄ）ｄＢ４およびｇｐ１２０のＨＰＢ−ＡＬＬ細胞への結合活性についての特性評価

１．背景
先の実施例に示されているｍＡｂｄＢ４およびその親マウスｍＡｂＢ４の中和アッセイによって実証されているように、抗原結合の定性的側面および機能特性は知られているが、ＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるｍＡｂＢ４およびｍＡｂｄＢ４の定量的細胞結合プロファイルは過去に調査されたことはない。

マウスｍＡｂＢ４およびそのヒト化Ｆｃ非グリコシル化ＩｇＧ_１モノクローナル抗体ｍＡｂｄＢ４の両方を、正常なヒト血液ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔ細胞性白血病ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞に対する細胞結合プロファイルについて試験した。実施例１で考察したようにマウスをＨＰＢ−ＡＬＬ細胞で免疫化することによりｍＡｂＢ４を選択したため、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を使用した。ＦＡＣＳ分析により一般的な細胞結合を評価し、その結果を平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づくＥＣ_５０またはＩＣ_５０値として報告した。本抗体の一般的な細胞結合の評価に加えて、天然のｄＢ４ＩｇＧ_１分子のＨＰＢ−ＡＬＬ細胞に対する絶対結合親和性（Ｋｄ）および最大結合能（Ｂｍａｘ）も調査した。

２．材料
２．１．培養培地および試薬
ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を培養するためのＲＰＭＩ−１６４０培地およびウシ胎児血清は、Gibco社製であった（それぞれのカタログ番号：１１８７５−０９３および１００９１−１４８）。ウシ血清アルブミンはApplicChem社製であった（カタログ番号：Ａ−０８５０）。細胞と試験抗体とのインキュベーションはＮｕｎｃ社製Ｖ底９６ウェルプレート（カタログ番号：２４９６６２）上で行った。試料の調製のための微量希釈管（１．２ｍＬ）はBertec社製であった（カタログ番号：１７１０−００）。細胞固定は２％ホルムアルデヒドで行い、試料を０．０５％ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、洗浄緩衝液は０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）であった。

マウスｍＡｂＢ４およびヒト化ｍＡｂｄＢ４の結合をそれぞれ、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Sigma社、カタログ番号：Ｆ８２６４）およびヤギＦ（ａｂ’）_２抗ヒトＩｇＧＦｃγ−ＦＩＴＣ（Jackson ImmunoResearch社、カタログ番号：１０９−０９６−０９８）により追跡した。ｄＢ４−Ａｌｅｘａ４８８複合体（本明細書全体を通して省略して「ｄＢ４−Ａｌｅｘａ」と示す）は、United Biomedical社（「ＵＢＩ」）の社内で調製した（ＵＢＩロット番号：０１０２１４３）。Ｂ４−ビオチン複合体はＵＢＩ製であった（ロット番号：０５１８０７）。ヒツジ抗ｈＩｇＧ−ＨＲＰはThe Binding Site社製であり（カタログ番号：ＡＰ００４）、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰはSigma Aldrich社製であり（カタログ番号：Ｅ２８８６）、可溶性ｒＣＤ４はR&D system社製であった（カタログ番号：５１４−ＣＤ−０５０）。ペプチドｐ２７０４ａＨＩＶエンベロープはＵＢＩ社製であり、組換えｇｐ１２０ＭＮはImmunoDiagnostics社製であった（カタログ番号：１０２１−２）。結合の追跡のための血液ＣＤ４^＋Ｔ細胞のゲーティングは、抗ＣＤ４（Ｄ２）−ＦＩＴＣ抗体（Ancell社、カタログ番号：１４８−０２０）を用いて行った。参照標準としてＬｉｎｅａｒＦｌｏｗ（商標）緑色フローサイトメトリー強度較正キット（Green Flow Cytometry Intensity Calibration Kits）（Molecular Probe社）に含まれている蛍光ビーズを使用して、標識された細胞の相対蛍光を定量化した。使用した他の蛍光検出材料は、ＦＩＴＣ−ＣｈｒｏｍＰｕｒｅヤギＩｇＧのＦ（ａｂ’）_２断片（Jackson ImmunoResearch社、カタログ番号：００５−０９０−００６）、ＣＤ３ＰＥ（ＡＳＲ）ＢＤ（Biosciences社、カタログ番号：３４０６６２）、ＣＤ４５ＰｅｒＣＰ（ＡＳＲ）ＢＤ（Biosciences社、カタログ番号：３４０６６５）であった。

２．２．ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞および末梢血ＣＤ４ ^＋Ｔ細胞
ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞株（ヒト胸腺の急性リンパ性白血病細胞株）をＤＳＭＺＡＣＣ社から得た。ＰＢＭＣＣＤ４^＋Ｔ細胞（健康なドナーからＥＤＴＡヴァキュテーナーに新たに採取した血液）は、ＮＨ_４Ｃｌを含む低張溶液（８．３ｇ／Ｌ塩化アンモニウム、０．８４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムおよび２９．４ｍｇ／ＬＥＤＴＡの混合物、ｐＨ７．４）で赤血球を溶解した後の末梢血白血球（ＰＢＬ）に由来していた。

２．３．マウスｍＡｂＢ４およびヒト化ｍＡｂｄＢ４
免疫原としてＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を用いるハイブリドーマ操作により、マウスのモノクローナルＢ４ＩｇＧ_１（ＵＢＩロット番号：１２０１９７）を得た。Ｂ４由来ヒト化ｄＢ４ＩｇＧ_１（ＵＢＩＡｓｉａ社基準ロット）は、Ｎ２９８ＨでＦｃを非グリコシル化したものである（実施例５）。

２．４．ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳでの検出
９６ウェルマイクロプレートはNalge Nunc International社製であり、光学読み取りのために平底のもの（カタログ番号：４４２４０４）を使用し、細胞のインキュベーションのためにＶ底のもの（カタログ番号：２４９５７０）を使用した。光学濃度をＶｅｒｓａＭａｘマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社）で読み取った。ＢＤＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒスキャナー（DB Biosciences社）で蛍光染色を検出し、得られたデータを関連するＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアにより取得した。ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳからの結合データを、定量的分析のためにＳｉｇｍａＰｌｏｔ１１ソフトウェアにインポートした。

３．方法
３．１．ｄＢ４のＨＰＢ−ＡＬＬ細胞への結合
３．１．１．平衡時間研究。Ｖ底マイクロプレート上で、１ウェル当たり０．１ｍＬ中に一定分量の２×１０^５細胞を添加し、遠心分離し、液体を捨てた。最長１８０分の様々な持続時間で、細胞を最大１００ｎｇ／ｍＬの各種濃度で一定分量の１００μＬのｄＢ７と共に氷上でインキュベートした。指示された時間で、遊離した未結合の抗体薬剤の決定のために上澄みを回収した。添加した薬剤濃度の合計から遊離画分を減算して結合画分を計算した。

結合溶液中の遊離ｄＢ４濃度をＥＬＩＳＡで定量化した。簡単に言うと、このアッセイでは、Ｎｕｎｃ社製Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロプレート上に被覆したヒツジ抗ｈＩｇＬ（０．５μｇ／ｍＬ）と検出タンパク質（detector protein）としてのヒツジ抗ｈｕＩｇＧ−ＨＲＰ（１／１０００希釈）との混合物を使用した。０．１４〜１８．５ｎｇ／ｍＬの範囲の較正標準に基づき未知の試料中の濃度を測定した。

３．１．２．ｄＢ４との直接結合研究。Ｖ底マイクロプレート上で、１ウェル当たり０．１ｍＬ中に一定分量の２×１０^５細胞を添加し、遠心分離し、液体を捨てた。細胞を２０００ｎｇ／ｍＬまでの各種濃度の少量のｄＢ４１００μＬと共に氷上で１時間インキュベートした。インキュベーション後にｄＢ４を除去し、新しい一定分量のｄＢ４を最初のインキュベーションのために使用した同じ濃度で細胞に添加し、細胞を氷上でもう１時間インキュベートした。この工程をもう１回繰り返した。３回のインキュベーション（継代）を経た細胞を調べた。３回目のインキュベーション後に、細胞を１回洗浄し、３００ｇで５分間遠心分離し、ヤギＦ（ａｂ）_２抗ｈｕＩｇＧＦｃ−ＦＩＴＣ（２５０ｎｇ／ｍＬ）１００μＬにより氷上で３０分間染色した。細胞を１回洗浄し、遠心分離後に液体を捨てた。各ウェルに一定分量の結合緩衝液２００μＬを添加し、フローサイトメトリー分析のために微量希釈管に移した。１試料当たり５，０００細胞の投入に基づく結合強度（平均蛍光強度、ＭＦＩ）をＦＡＣＳで読み取った。

３．１．３．ｄＢ４の結合親和性（Ｋｄ）研究。エッペンドルフ管において、３．１〜２０００ｎｇ／ｍＬ（０．５ｍＬ）のｄＢ４抗体を４×１０^５細胞のＨＰＢ−ＡＬＬ細胞（０．５ｍＬ）に添加し、穏やかに振盪しながら氷上で１時間インキュベートした。飽和結合の時点で絶対結合親和性を決定し、ここでは、溶液中の遊離ｄＢ４濃度（［Ｆ］）をＥＬＩＳＡで定量化し、上記平衡研究の箇所で説明したように結合画分（［Ｂ］）を計算した。得られた飽和遊離濃度：結合濃度プロファイルを、方程式：［Ｂ］＝Ｂｍａｘ・｛［Ｆ］／（［Ｆ］＋Ｋｄ）｝（式中、［Ｂ］および［Ｆ］はそれぞれ結合濃度および遊離濃度を表す）に基づくカーブフィッティングによりＳｉｇｍａＰｌｏｔで分析した。

３．１．４．ｄＢ４およびＢ４のＢ４−ビオチンとの競合。ｓＣＤ４（０．５μｇ／ｍＬ）およびｐ２７０４ａペプチド（２．０μｇ／ｍＬ）の混合物で被覆した平底マイクロプレート上で、一定分量の０．１ｍＬのｄＢ４またはＢ４を０．７８〜１００μｇ／ｍＬでＢ４−ビオチン（１０μｇ／ｍＬ）の存在下で添加し、室温で１時間インキュベートした。捕捉混合物への競合結合後に、結合したＢ４−ビオチンをＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰで検出し、ＥＬＩＳＡリーダーで測定した。

３．１．５．ｄＢ４およびＢ４のｄＢ４−Ａｌｅｘａとの競合。Ｖ底マイクロプレート上で、１ウェル当たり０．１ｍＬ中に一定分量の２×１０^５細胞を添加し、遠心分離し、液体を捨てた。細胞をｄＢ４−Ａｌｅｘａ（２５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で一定分量の１００μＬのｄＢ４またはＢ４（最大２０００ｎｇ／ｍＬ）と共に氷上で１時間インキュベートした。細胞を１回洗浄し、遠心分離後に液体を捨てた。各ウェルに、一定分量の２００μＬの結合緩衝液を添加し、フローサイトメトリー分析のために微量希釈管に移した。１試料当たり５，０００細胞の投入に基づく結合強度（平均蛍光強度、ＭＦＩ）をＦＡＣＳで読み取った。

３．１．６．ｄＢ４Ｃ７およびｇｐ１２０ＭＮのｄＢ４Ｃ７−Ａｌｅｘａとの競合。Ｖ底マイクロプレート上で、１ウェル当たり０．１ｍＬ中に一定分量の２×１０^５細胞を添加し、遠心分離し、液体を捨てた。細胞をｄＢ４−Ａｌｅｘａ（２５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で一定分量の１００μＬのｄＢ４Ｃ７またはｇｐ１２０ＭＮ（最大２００ｎＭ、約３０μｇ／ｍＬ）と共に氷上で１時間インキュベートした。細胞を１回洗浄し、遠心分離後に液体を捨てた。各ウェルに、一定分量の２００μＬの結合緩衝液を添加し、フローサイトメトリー分析のために微量希釈管に移した。１試料当たり５，０００細胞の投入に基づく結合強度（平均蛍光強度、ＭＦＩ）をＦＡＣＳで読み取った。

３．２．ｄＢ４の血液ＣＤ４＋Ｔリンパ球への結合
３．２．１．ｄＢ４の温度依存性結合の研究。ＩＶ投与後にｄＢ４（ＵＢ−４２１）がＣＤ４^＋Ｔ細胞上のＣＤ４受容体に結合する（ＣＤ４受容体を被覆または占有する）生理学的環境を模倣するために、研究室職員から新たに採取した一定分量のＥＤＴＡ−血液を、希釈緩衝液中に最大１００μｇ／ｍＬの濃度の等体積のｄＢ４と共に３７℃でインキュベートした。比較のために、別の試料セットを氷上で同時にインキュベートした。１時間のインキュベーション後に、試料を２０倍の体積のＲＢＣ溶解緩衝液により室温で１０分間溶解して末梢血白血球（ＰＢＬ）画分を得た。

ＰＢＬ画分を遠心分離し、洗浄し、次いで１．０％ＢＳＡおよびアジ化ナトリウムを含む等体積のＰＢＳ緩衝液（例えば、希釈緩衝液０．１ｍＬを含む血液０．１ｍＬ）で再構成した。ＰＢＬ試料を氷上で、ヤギＦ（ａｂ）_２抗ｈＩｇＧＦｃ−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ３−ＰＥおよび抗ＣＤ４５ｐｅｒＣＰの混合物０．１ｍＬにより３０分間染色した。洗浄後、試料を２％ホルムアルデヒドで固定し、１０，０００細胞の投入に基づくＦＡＣＳ分析に供した。Ｔリンパ球集団を抗ＣＤ３−ＰＥを用いてゲーティングした。

３．２．２．直接結合。３人の男性および３人の女性の対象においてｄＢ４の血液ＣＤ４＋Ｔ細胞への直接結合を定め、ここでは、対象らの新たに採取したＥＤＴＡ−血液をｄＢ４と共に３７℃で１時間インキュベートした。ｍＡｂｄＢ４はＣＤ４＋Ｔ細胞に結合し、０．２〜２００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲で見かけ上の飽和に達したのが分かった。Ｔリンパ球集団を抗ＣＤ３−ＰＥを用いてゲーティングした。この実験手順は温度依存性結合研究の箇所において上述の手順と同じであり、ここでは細胞をヤギＦ（ａｂ）_２抗ｈＩｇＧＦｃγ−ＦＩＴＣにより染色してｄＢ４結合を追跡した。

３．２．３．遊離結合部位。上記確定的な直接結合研究と同時に、ｄＢ４結合よりも後で遊離結合部位のレベル（完全な受容体占有前）を個々の３人の男性および３人の女性対象のそれぞれについて同時期に調査した。この実験手順は、２５０ｎｇ／ｍＬの固定量のｄＢ４−Ａｌｅｘａを使用して占有されていない遊離結合部位のレベルを明らかにしたこと以外は、直接結合について上で説明した手順と同じであった。

３．２．４．較正ビーズ。直接結合および遊離結合部位を同時に調査するために、２種類のMolecular Probe社製ＬｉｎｅａｒＦｌｏｗ（商標）キット（カタログ番号：Ｌ１４８２１およびＬ１４８２３）の組み合わせを用いて、６種類の異なる時期のそれぞれについて対数（ＭＦＩ）：対数（ビーズ％）の標準曲線を作成した。このキットの組み合わせにより、フローサイトメトリー実験で使用するための広範な較正範囲の高い／低い強度標準が得られる。参照標準としてこれらの蛍光ビーズを使用して、ヤギＦ（ａｂ）_２抗ｈＩｇＧＦｃＲ−ＦＩＴＣまたはｄＢ４−Ａｌｅｘａで標識した細胞について相対蛍光を定量化した。

４．結果および考察
４．１．ＣＤ４陽性ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞におけるｄＢ４の結合プロファイルおよびその絶対結合親和性（Ｋｄ）の決定
４．１．１．ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞に対する結合活性の平衡。リガンド−受容体結合反応に関する完全な特性評価の前に、各種濃度のリガンドについて平衡に達する時間の長さ、即ち結合速度（on-rate）が解離速度（off-rate）と等しくなる平坦域状態を定めた。濃度が低くなるにつれて平衡に達するのに要する時間が長くなることは一般的に知られている。

氷上でインキュベートしたＣＤ４陽性ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞におけるｄＢ４−ＣＤ４相互作用の場合、結合率（％）値において平坦域に達するのに、２．０ｎｇ／ｍＬの濃度で約６０分、５０ｎｇ／ｍＬの濃度で約１５分を要した。１００ｎｇ／ｍＬ（０．１μｇ／ｍＬ）以上のレベルにおけるｄＢ４濃度では、ほぼ即時の平坦域が観察された。

これらの結果は、広範囲の濃度（例えば、２．０ｎｇ／ｍＬ以上の濃度）ではｄＢ４結合反応を１時間行うことができることを示している。リガンド−受容体複合体の潜在的なエンドサイトーシスを回避するために、低温および／または０．０５％アジド下でこの結合研究を行った。室温または３７℃でのインキュベーションにより、より早く反応平坦域に到達させることができる。この上記計画した条件下で、３種類の異なる細胞継代を有するＨＰＢ−ＡＬＬ細胞をｄＢ４と共に氷上で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡによる遊離薬剤濃度の決定のために上澄みを回収し、全体からの減算により結合画分を得た。図８に示す結合曲線を用いて、絶対結合親和性および最大結合能を計算した。

４．１．２．ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞への直接結合。３種類の異なる時期（細胞継代）において、２×１０^５個のＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を最大約２０００ｎｇ／ｍＬのｄＢ４と共に氷上で１時間インキュベートすると、本抗体は４つのパラメータのロジット関数により特徴づけられる飽和結合プロファイルを示した（ここでは、結合の程度をヤギＦ（ａｂ）_２抗ｈｕＩｇＧＦｃ−ＦＩＴＣにより検出して平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表した）。結合は、２００ｎｇ／ｍＬ（０．２μｇ／ｍＬ）以上で飽和に近づいた。継代間にほとんどばらつきはなく（ｎ＝３）、平均結合ＥＣ_５０を４２．２ｎｇ／ｍＬと推定した（表８）。また、継代間の比較のために絶対ＭＦＩ値をＭＦＩ率（％）に正規化した。このようにして標準偏差を最小にし、ＥＣ_５０値を本質的に同じままにし、両方の平均曲線の全体的な平均結合ＥＣ_５０値を４２．９ｎｇ／ｍＬと推定した（表８）。

４．１．３．ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞における結合親和性（Ｋｄ）および最大結合能（Ｂｍａｘ）。インキュベーション（氷上で１時間）後の上澄みの回収により、遊離（未結合）ｄＢ４濃度［Ｆ］のＥＬＩＳＡによる決定および、ひいては添加した（総）濃度からの減算による結合濃度［Ｂ］が可能となった。表９に示す遊離薬剤：結合薬剤のプロファイルを用いて、ｄＢ４の絶対結合親和性の推定を行った。平均Ｋｄを５．６×１０^−１１Ｍ（範囲：３．１〜８．１×１０^−１１Ｍ）と推定し、Ｂｍａｘを１細胞当たり１．２×１０^６Ａｂ（範囲：０．９３〜１．４×１０^６）と推定した。これらの結果は、ｄＢ４が例外的に高い親和性でＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上のＣＤ４受容体に結合し、かつＨＰＢ−ＡＬＬ細胞が、最大で１細胞当たりのｄＢ４に対する百万超の結合部位により高い密度を有することを示した（表９）。ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上のＣＤ４受容体密度は、１細胞当たり約３．２〜６．１×１０^４個の結合部位であった血液ＣＤ４＋Ｔリンパ球の密度よりも少なくとも２０倍高かった。

４．２．ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞への結合におけるｄＢ４およびＢ４の比較
マウスＢ４抗体をｄＢ４に脱免疫化する方法によるヒト化が結合親和性を変化させるか否かという問題を、競合設計を用いる２種類の技術的評価方法（technical account）で徹底的に調査した。

第一に、ｍＡｂＢ４およびｍＡｂｄＢ４の結合親和性を、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）およびｐ２７０４ａペプチドの捕捉混合物で被覆したＥＬＩＳＡプレートで調べた。ｐ２７０４ａペプチドは、ＨＩＶ−１がＣＤ４細胞に侵入するために結合するＣＣＲ５上のエピトープ配列を含むため、ＣＤ４−ＣＣＲ５受容体複合体を模倣する。ＥＬＩＳＡにより分析したとき、各種濃度のｍＡｂＢ４またはｍＡｂｄＢ４の存在下で、Ｂ４−ビオチンの被覆されたｓＣＤ４／ｐ２７０４ａ混合物への結合は阻害された。ｍＡｂＢ４またはｍＡｂｄＢ４抗体が同時に存在し、かつ捕捉タンパク質混合物への結合のためにＢ４−ビオチンと競合しているとき、Ｂ４−ビオチンの結合は、Ｂ４およびｄＢ４によってそれぞれ５５３９ｎｇ／ｍＬおよび８１９１ｎｇ／ｍＬのＩＣ_５０値で阻害された（図９）。Ｂ４：ｄＢ４のＩＣ_５０比は０．６８であり、これは、ヒト化ｄＢ４がマウスＢ４抗体と比較的同程度の結合親和性を有することを示している。

第二に、Ｂ４またはｄＢ４抗体が同時に存在し、かつ細胞のＣＤ４受容体への結合のためにｄＢ４−Ａｌｅｘａと競合している場合の相対的結合親和性もＣＤ４陽性ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を用いて調べた。ＦＡＣＳで分析すると、ｄＢ４−Ａｌｅｘａの結合は、Ｂ４およびｄＢ４によりそれぞれ１３５および１９７ｎｇ／ｍＬのＩＣ_５０値で阻害された（図１０）。Ｂ４：ｄＢ４のＩＣ_５０比は０．６９であり、これはＥＬＩＳＡ模範（paradigm）によって実証されたものと実質的に同じあり、これも、ヒト化ｄＢ４がマウスＢ４抗体と比較的同程度の親和性でＣＤ４受容体に結合することを示している。

親抗体Ｂ４およびそのヒト化抗体ｄＢ４Ｃ７（ＵＢ−４２１）を用いたこの比較的競合結合阻害研究により、一連の濃度（１００〜１０４ｎｇ／ｍＬ）にわたる抗体濃度に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）で測定したＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＨＰＢ−ＡＬＬ）に対する抗体結合プロファイルが得られた。この研究により、ＭＴ２およびＰＢＭＣアッセイシステムの両方における両抗体のそれぞれの中和活性が同等の中和抗体活性を有するという表５および表６に示されているデータがさらに立証された。

これらの比較研究で得られた結果から、脱免疫化技術によるヒト化が、その親マウス抗体Ｂ４と比較したとき、ｄＢ４Ｃ７（ＵＢ−４２１）のＣＤ４受容体に対する結合親和性を著しく減少させなかったことが示唆される。

４．３．ｍＡｂｄＢ４のＣＤ４に対する結合特性
ｍＡｂｄＢ４のＣＤ４に対する結合特性を評価した。
４．３．１．ｍＡｂｄＢ４の可溶性ＣＤ４対細胞結合ＣＤ４への結合。上記で考察したように、ｄＢ４は、ＥＬＩＳＡで評価したとき、８１９１ｎｇ／ｍＬのＩＣ_５０でＢ４−ビオチンのｓＣＤ４／ｐ２７０４ａへの結合を阻害し（図９）、ＦＡＣＳで調べたとき、ｄＢ４は、１９７ｎｇ／ｍＬのＩＣ_５０でｄＢ４−ＡｌｅｘａのＨＰＢ−ＡＬＬ細胞への結合を阻害した（図１０）。これらのデータから、興味深いことに、ｄＢ４が可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）と比較してＣＤ４陽性Ｔ細胞に対して非常に高い結合親和性を有することが実証されている。具体的には、２つの研究のＩＣ_５０値を比較することにより、ｄＢ４の結合親和性がｓＣＤ４と比較してＣＤ４陽性Ｔ細胞に対して４０倍高いことが分かった。

４．３．２．ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞への結合におけるｄＢ４およびｇｐ１２０ＭＮの比較。ｄＢ４およびＨＩＶｇｐ１２０ＭＮのＣＤ４陽性Ｔ細胞に結合したＣＤ４に対する結合親和性を比較するために競合研究を行った。具体的には、ｄＢ４−ＡｌｅｘａがＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上のＣＤ４に結合するのを阻害するｄＢ４およびｇｐ１２０ＭＮの能力を比較した（図１１）。最初の研究では、ｄＢ４は１．８ｎＭのＩＣ_５０で、ｄＢ４−ＡｌｅｘａがＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上のＣＤ４に結合するのを阻害した。比較研究では、ｇｐ１２０ＭＮは９７．２ｎＭのＩＣ_５０で、ｄＢ４−ＡｌｅｘａがＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上のＣＤ４に結合するのを阻害した。これらの結果により、ｄＢ４がｇｐ１２０ＭＮと比較してＨＰＢ−ＡＬＬＴ細胞上のＣＤ４に対する実質的により高い結合親和性を有することが分かった。具体的には、２つの研究のＩＣ_５０値を比較することにより、ｄＢ４のＣＤ４に対する結合親和性がｇｐ１２０ＭＮの結合親和性よりも少なくとも５０倍高いことが分かった。

４．３．３．ｄＢ４およびｇｐ１２０ＭＮのＣＤ４に対する結合親和性の比較。上記で考察したように、ｍＡｂｄＢ４は、約５．６×１０^−１１Ｍの結合親和性（Ｋｄ）でＣＤ４に結合する（表９）。以前に他の研究者によって、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０が約５×１０^−９Ｍの高い結合親和性（Ｋｄ）でＣＤ４分子のドメイン１の周りに結合することが結晶学的研究により発見されている（Myszka, D. G.ら、“Energetics of the HIV gp120-CD4 binding reaction”Proc Natl Acad Sci USA.Aug 1, 2000; 97(16): 9026-9031）。したがって、ｄＢ４およびｇｐ１２０のＫｄ値を比較することにより、ｄＢ４のＣＤ４に対する結合親和性がｇｐ１２０の結合親和性よりも約１００倍高いことが分かる。この結果は、ｄＢ４がＩＣ_５０値の比較に基づきｇｐ１２０ＭＮよりも少なくとも５０倍強くＨＰＢ−ＡＬＬ細胞に結合するという上記発見に一致している。

全体的なインビトロ結果は、ｄＢ４が、ＨＩＶウイルス侵入を防止または遮断することによりＨＩＶ−１感染を阻止または減少させる能力を有することを示唆している。

４．４．ｄＢ４（ＵＢ−４２１）の血液ＣＤ４＋Ｔ細胞への温度依存性結合
正常な体温（３７℃）におけるヒトの血液中でのＣＤ４＋Ｔ細胞へのｄＢ４の結合を調べて、ｄＢ４をヒト対象への処置薬として有効に投与することができるか否かを決定した。ヒトの体の生理学的環境を模倣するために、ｄＢ４Ｃ７（ＵＢ−４２１）を新たに採取した血液と共に３７℃で１時間インキュベートし、ＲＢＣ溶解手順によって末梢血白血球（ＰＢＬ）試料を得た。氷上（４℃）でのインキュベーションも同時に行った。次いで、ＰＢＬ画分をヤギＦ（ａｂ）_２抗ｈｕＩｇＧ−ＦＩＴＣで染色して、ｄＢ４のＣＤ４ゲーティングされるＴ細胞上のＣＤ４受容体への直接結合を可視化した。

４℃でインキュベートした場合と比較して、マウス抗ＣＤ４（Ｄ２）−ＦＩＴＣのＭＦＩにおいて変化が観察されなかったため（データは示さない）、細胞のｄＢ４との３７℃で１時間のインキュベーションによりリガンド−受容体のエンドサイトーシスは引き起こされないように見えた。５０〜１０００ｎｇ／ｍＬのＣＤ４＋Ｔ細胞のゲーティングのためのマウス抗ＣＤ４（Ｄ２）−ＦＩＴＣおよび最大２００ｎｇ／ｍＬの濃度のｄＢ４（ＣＤ４受容体のＤ１ドメインを標的にする）は、結合のために競合しなかった。

１人の女性の個体の血液試料において示されているように（図１２）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をｄＢ４と共に２種類の異なる温度３７℃または４℃で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳでのｄＢ４結合の観察のために、ゲーティングされるＣＤ４＋Ｔ細胞を染色した。図１２は、それぞれ４．８ｎｇ／ｍＬおよび２３．０ｎｇ／ｍＬのＩＣ_５０値に基づき、ｄＢ４が４℃よりも３７℃において５倍高い親和性でＣＤ４受容体に結合したことを示している。期待されたとおり、ｄＢ４は両温度条件下で同じ最大結合ＭＦＩに達した。ＭＦＩ値は、特にこれらの値を正規化してＭＦＩ率（％）として表した場合の受容体の占有の程度を反映している。

４．４．１．ｄＢ４の血液ＣＤ４＋Ｔ細胞への直接結合。正常な体温（３７℃）におけるヒトの血液中でのｄＢ４のＣＤ４＋Ｔ細胞への結合プロファイルも調べた。６人のヒトの成人（３人の男性と３人の女性）から新たに採取した血液を用いて、ｄＢ４の血液ＣＤ４＋細胞への直接結合活性を６種類の異なる時期に評価した（表１０）。１時間のインキュベーション後に、末梢血白血球を単離し、ヤギＦ（ａｂ）_２抗ｈｕＩｇＧＦｃ−ＦＩＴＣで染色し、ＣＤ４ゲーティングされるＴ細胞に結合したｄＢ４をＦＡＣＳで分析した。蛍光読取りのために試料を基準ビーズで較正した。結合（ＥＣ_５０）値は２．６ｎｇ／ｍＬ〜５．７ｎｇ／ｍＬであり、平均ＥＣ_５０は４．１ｎｇ／ｍＬであることが分かった。また、最大ＭＦＩ（％）値は６８％〜９３％の範囲であり、その平均は７７．８％であった（表１０）。これらの結果は、結合親和性および受容体密度のそれぞれにおける重要性の低い対象間のばらつきを反映している。

４．４．２．ｍＡｂｄＢ４による受容体占有後の遊離ＣＤ４結合部位。４℃でのｄＢ４の血液ＣＤ４＋細胞への直接結合（ヤギ抗ｈＩｇＧにより検出）と共に、ＣＤ４＋細胞上の占有されていない遊離ＣＤ４結合部位をｄＢ４−Ａｌｅｘａにより評価した。

ｄＢ４の非存在下では、ｄＢ４−Ａｌｅｘａ複合体は単独で、約２５０ｎｇ／ｍＬにおいて約１００％のその最大結合に近づくことができた（図１３）。５００ｎｇ／ｍＬよりも高い濃度では、ｄＢ４−Ａｌｅｘａ複合体は、結合されたｄＢ４の約１０％以上を追い払うことができた（データは示さない）。具体的には、飽和に近づくレベルの２５０ｎｇ／ｍＬにおいて受容体がｄＢ４によって占有された場合、ｄＢ４−Ａｌｅｘａ（２５０ｎｇ／ｍＬ）のＣＤ４受容体への結合は完全に阻止された。

ｄＢ４の存在の減少に伴う受容体占有における低下は、ｄＢ４−Ａｌｅｘａの結合の増加と同時であることが観察された。受容体占有の程度は、遊離結合部位のレベルと対称的に同時に変化し、約４．０ｎｇ／ｍＬ（図１３）で交差する両曲線は、それらの結合ＥＣ_５０値と一致している（表１０）。

したがって、全体的な結果は、２５０ｎｇ／ｍＬでのｄＢ４−Ａｌｅｘａのインビトロでの使用は、ＭＦＩおよびＭＦＩ率（％）と共に、ｄＢ４Ｃ７（ＵＢ−４２１）をヒト対象に投与した後にインビボで受容体占有を調べるための適当な模範になり得ることを示唆している。

５．結論
１．ｍＡｂｄＢ４は異常に高い活性によりＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上のＣＤ４受容体と反応し、５０ｎｇ／ｍＬよりも高い濃度では氷上で即座に平衡に達した。その絶対結合親和性（Ｋｄ）を５．６×１０^−１１Ｍと推定し、最大で１．２×１０^６個のｄＢ４分子（Ｂｍａｘ）が、正常な血液ＣＤ４＋Ｔ細胞の密度よりも少なくとも２０倍高い受容体密度を有する単一のＨＰＢ−ＡＬＬ細胞に結合することができた。
２．マウスＢ４のｍＡｂｄＢ４へのヒト化は、ｄＢ４のＣＤ４受容体に対する結合親和性を著しく変化させない。分子に基づくＥＬＩＳＡ（ｓＣＤ４およびＣＣＲ５エピトープ含有ペプチドｐ２７０４ａで被覆）ならびにＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を用いる細胞に基づくＦＡＣＳを使用する結合阻害設計により、Ｂ４：ｄＢ４のＩＣ_５０比が両研究において約０．７であることが観察されたため、両抗体はトレーサーであるＢ４−ビオチンまたはｄＢ４−Ａｌｅｘａの結合を同等に阻止する。
３．ｄＢ４抗体は、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質ｇｐ１２０ＭＮの親和性よりも少なくとも５０倍高い親和性でＣＤ４受容体に結合する。具体的には、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を用いる結合阻害研究により、ｄＢ４およびｇｐ１２０ＭＮがそれぞれ１．８および９７．２ｎＭのＩＣ_５０値でトレーサーであるｄＢ４−Ａｌｅｘａの結合を阻害することが実証された。この結果は以前に報告された組換えｇｐ１２０よりも約１００倍高いｄＢ４の高い結合親和性（Ｋｄ）とも一致する。
４．ｍＡｂｄＢ４はＨＰＢ−ＡＬＬ細胞に対する同様の結合親和性で血液ＣＤ４＋Ｔ細胞に結合する。低温条件（４℃）下では、ｄＢ４は約２３．０ｎｇ／ｍＬのＥＣ_５０を有し、正常な体温（３７℃）下では、結合ＥＣ_５０値が４．８ｎｇ／ｍＬと推定されるため、ｄＢ４は約５倍より高い親和性で血液ＣＤ４＋Ｔ細胞に結合する。
５．６人のヒト対象から採取した血液試料の研究により、ｄＢ４濃度とＣＤ４受容体占有との間に直接的（反比例の）相関があることが確認された。図１３に示す対向する曲線は約４．０ｎｇ／ｍＬで交差し、これはＣＤ４に対するｄＢ４の平均ＥＣ_５０結合値と一致する。これらの全体的な結果は、ｄＢ４−Ａｌｅｘａ（２５０ｎｇ／ｍＬ）のインビトロでの使用は、蛍光ビーズで較正されたＭＦＩ率（％）の測定値と共に、ｄＢ４Ｃ７（ＵＢ−４２１）をヒト対象に投与した後のインビボでの受容体占有の調査にとって適当な模範になり得ることを示唆している。

実施例８
抗体Ｂ４はＨＩＶの無細胞および細胞間伝播の両方を有効に阻害する
ＨＩＶ粒子は古典的に、無細胞伝播により体内中に広がり、そこでＨＩＶウイルスは血流および局所環境の中に拡散して細胞を感染させる。このウイルスは、密接な細胞間接触を必要とする機序により、感染細胞から非感染細胞に直接移動する能力も有する。感染細胞が非感染細胞との安定な接触点を形成したとき、そのような伝播が生じ、ＨＩＶ粒子を非感染細胞に直接伝播させる。細胞間伝播は、無細胞伝播と比較して、より効率的かつより速く、血流の中への拡散を必要としない。

無細胞ウイルスから生じる感染は、抗レトロウイルス剤テノホビルの存在下で大きく減少するが、細胞間伝播を伴う感染は共培養アッセイにおいてこの薬剤に対して非常に感度が低いことを、Sigal, A.ら、2011は報告した（図１４）。この感度の低さは、薬剤の存在下で複数回の感染が終結するのを防止するのに十分であった。この著者らは、確率的感染モデルを用いて臨床的薬剤濃度の存在下で細胞間伝播による複製を調査し、突然変異株の大きな蓄積がなく複製が断続的であることを見出した。細胞間伝播がインビボで同じ特性を有する場合、これは免疫系に対して悪影響を有し、危険因子を有する個体における療法の失敗に繋がり、かつ潜在的にウイルスの存続に寄与する可能性があり、故に、ＨＩＶ感染の治癒に対する障壁となり得る。

したがって、処置におけるその潜在的な効果の評価のために、ｍＡｂＢ４およびｍＡｂｄＢ４関連抗体がＨＩＶの細胞間伝播を阻害する能力および効力を評価することが重要である。

１．ＨＩＶの細胞間伝播の抗体媒介性阻害を測定するためのアッセイ
１．１．材料および方法
１．１．１．細胞およびウイルス。表面ＣＤ４の発現が低いという理由から、レポーター遺伝子ルシフェラーゼがＨＩＶ−１ゲノム内に組み込まれたＪｕｒｋａｔ−ｉｎＧＬｕｃクローン（ＮＩＨＡＩＤＳ研究および試薬プログラム（NIH AIDS Research and Reagents Program））をドナー細胞として選択して、標的初代ＣＤ４＋Ｔ細胞との共培養実験においてドナー間感染を最小限に抑えた。感染細胞においてレポーター遺伝子ルシフェラーゼを発現させてウイルス感染のマーカーとして使用することができる。感染細胞においてウイルスによって発現されたこれらのレポーターを測定して、ＨＩＶ−１感染を定量化することができる。初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞を標的細胞として使用した。分岐群ＤのウイルスＵＧ２６６およびＵＧ０４６をこの研究で使用した。

１．１．２．ウイルス細胞間伝播アッセイ。このアッセイでは、指示されたＨＩＶ−１株と混合する前にドナーを連続希釈した抗体Ｂ４と共にプレインキュベートし、細胞の約１０〜７５％がＧａｇ^＋になった数日後に使用した。次いで、ドナーおよびＣＤ４陽性ＰＢＭＣ標的細胞を１：２の比で、９６ウェルプレート内で２００μＬ中に１．５×１０^６細胞／ｍｌの最終濃度で混合した。４８時間後、細胞内Ｇａｇについて細胞を染色し、フローサイトメトリーで分析した。培養物の上澄み中に蓄積したＧＬｕｃを、ＢｉｏＬｕｘガウシアルシフェラーゼアッセイキット（New England Biolabs社）およびBerthold Technologies社製ルミノメーターを用いて検出した。

１．１．３．ＩＣ_５０およびＩＣ_９０の計算。データをＳ字状の用量反応曲線（可変勾配）に当てはめて用量反応阻害曲線を描いた。阻害率を（未処置標的細胞におけるシグナルの割合−抗体処置細胞におけるシグナルの割合）／（未処置標的細胞におけるシグナルの割合）×１００として定めた。それに応じて、ＩＣ_５０およびＩＣ_９０を計算した。

２．結果および考察
表１１は、抗体Ｂ４が厳しい９０％侵入阻害基準によって測定したとき、ＨＩＶ（分岐群Ｃのウイルス株ＵＧ２６６およびＵＧ０４６）の細胞間および無細胞伝播を等しく阻害できたことを示している。具体的には、ＵＧ２６６およびＵＧ０４６ウイルス株の融合阻害力価が細胞間伝播アッセイにおいて１：１４０および１：２４５であることが分かり、これは、無細胞伝播中和アッセイにおける１：１３６および１：２３４のそれぞれの中和力価に匹敵していた。５０％侵入阻害基準によって測定したとき、対応する無細胞伝播と比較した細胞間伝播について、この２種類の株のより高い融合阻害力価が観察された。

これらの結果から、抗体Ｂ４が、ＨＩＶＥｎｖタンパク質を標的にする全ての他の中和モノクローナル抗体およびこれまで測定された他のＡＲＴ剤と比較したとき、ＨＩＶの細胞間および無細胞伝播の両方を阻害するその能力において珍しい性質を有することが実証される。これらの結果から、ｍＡｂＢ４およびｍＡｂｄＢ４関連抗体は、個体におけるＨＩＶウイルスの無細胞および細胞間伝播を防止するための他にはない能力を有することが示唆される。

実施例９
抗体ＵＢ−４２１（ｄＢ４Ｃ７またはｄＢ４）はＨＩＶ感染した個体におけるウイルス複製を増強させるための休止ＰＢＭＣの再活性化を媒介する
１．背景
ＨＩＶ−１は、休止末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を感染させるが、その後の細胞活性化まで不活性なままである。静止ＰＢＭＣ内に隠れた潜伏ＨＩＶ−１を模倣する、休止Ｔ細胞の非増殖性（nonproductive）感染を可能にする細胞培養条件およびプロトコルを用いるインビトロモデルを使用して、これらの休止ＰＢＭＣに対する熱不活性化（heat-inactivated）ＨＩＶ−１（ｉＨＩＶ−１）またはｇｐｌ２０−抗ｇｐｌ２０免疫複合体の刺激効果を調査した（Briant, L.ら、1996）。

ＣＤ４と熱不活性化ＨＩＶ−１（ｉＨＩＶ−１）またはｇｐｌ２０−抗ｇｐｌ２０免疫複合体のエンベロープ糖タンパク質とが結合することにより、架橋によりＮＦ−ｋＢ（即ち核転座）およびＡＰ−１の活性化を制御するシグナル伝達経路が刺激され、次いでＣＤ４の細胞外ドメイン１（Ｄ１）および細胞質内ドメインならびに幾種かのキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｒａｆ−１、ＭＥＫおよびＥＲＫ）に関与して細胞周期進行が誘導され、活性化マーカーＣＤ２５の細胞表面発現が促進され、かつプロウイルスの組込みが刺激され、かつ細胞にウイルスの産生を委ねるのに十分であることが実証された。

Thanらの別個の科学的発見（Thanら、1997）により、抗ＣＤ４モノクローナル抗体によるｇｐ１２０結合部位におけるＣＤ４分子の架橋が、ＨＩＶ感染した患者から潜在的に感染したＰＢＭＣを誘導してウイルス複製を促進させることがさらに確認された。この研究で使用した抗ＣＤ４ｍＡｂは、ＣＤ４のＤ１のＣＤＲ２ループに結合するＬｅｕ３ａであった。具体的には、Ｌｅｕ３ａは、ＣＤ４のドメイン１にａａ４７−６４を有するペプチドによって代表される直線状エピトープに対する抗体である（Chiba,Y. 1992）。

さらに、休止ＰＢＭＣにおけるウイルスの再活性化は、ＣＤ４のドメイン１（Ｄｌ）のＣＤＲ２ループに対するモノクローナル抗体によって特異的に誘導され、Ｄ１のＣＤＲ３またはその近傍のＤ１／Ｄ２接合領域などの他のエピトープに対する抗体によって誘導されないことが分かった（Briant, L.ら、1999）（図１５、レーン４をレーン５および６と比較）。そのようなウイルスの再活性化は、ＣＤＲ２ループリガンドを可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）で予め吸収することにより防止することができる（図１５、レーン４をレーン８と比較）。

したがって、ドメイン１領域の周りにＣＤ４との高い結合親和性を有する抗体ｄＢ４Ｃ７（ＵＢ−４２１）が、ＨＩＶ感染した個体におけるウイルス複製の増強のための休止ＰＢＭＣの再活性化を媒介することができるか否かを評価することが重要であった。

２．ＣＤ４のＤ１の周りのＢ４／ｄＢ４立体構造結合部位の改善
２．１．逆順では生じないｍＡｂＢ４によるＬｅｕ３ａのチンパンジーＣＤ４陽性ＰＢＭＣへの結合の競合的連続結合阻害
２匹の対象（Ｘ２８２およびＸ３０１）から単離したチンパンジーＰＢＭＣ細胞ならびにｍＡｂＢ４（ＦＩＴＣで標識）およびＬｅｕ３ａ（ＰＥで標識）をこの研究で使用した。ＰＢＭＣを連続的にそれぞれの抗体で染色し、細胞蛍光（cytofluorography）で分析した。この実験から得られたデータは表１２に報告されており、以下に説明する。

単標識の対照試料において、Ｌｅｕ３ａで染色された細胞のみがＬｅｕ３ａ−ＰＥ結合について試験で陽性反応を示し、ｍＡｂＢ４で染色された細胞のみがＢ４−ＦＩＴＣ結合について試験で陽性反応を示した。具体的には、感染されていないチンパンジー試料（Ｘ２８２およびＸ３０１）中のＣＤ４＋細胞（Ｌｅｕ３ａで検出）はそれぞれ２５．５％および４４．０％であり、ｍＡｂＢ４で検出した割合と同様であった（２６．１％および４５．５％）。

Ｌｅｕ３ａを先に結合させ、その後にｍＡｂＢ４に曝露すると、Ｌｅｕ３ａまたはＢ４のみで染色された単標識の対照細胞と同様の二重染色された（Ｌｅｕ３ａ＋／Ｂ４＋）ＰＢＭＣ細胞数（即ち、Ｘ２８２およびＸ３０１についてそれぞれ２４．５％および４６．７％）が得られた。

対照的に、ｍＡｂＢ４を先に結合させ、その後にＬｅｕ３ａに曝露すると、ｍＡｂＢ４のみで染色されたＰＢＭＣが得られ、単一または二重染色手順のいずれにおいてもＬｅｕ３ａ陽性染色は認められなかった。

まとめると、これらの結果からＬｅｕ３ａ−ＰＥに対する抗体Ｂ４−ＦＩＴＣによる一方向の阻害が実証される。つまり、Ｌｅｕ３ａを先に結合させてもＢ４結合は阻止されないが、Ｂ４結合を先に結合させることによりＬｅｕ３ａ結合は阻止される。これらのデータは、ｍＡｂＢ４は抗体Ｌｅｕ３ａによって認識されるＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域を覆う立体構造エピトープを認識し、かつｍＡｂＢ４は抗体Ｌｅｕ３ａと比較してより高い親和性でＣＤ４のこの領域に結合するという結論を支持している。

２．２．ＨＩＶＲＣペプチド（ａａ３９−６６）に対する免疫血清によるＢ４のｒｓＣＤ４への結合のＥＬＩＳＡによる競合的阻害
ＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域に対する免疫血清を用いる競合的阻害研究により、ｍＡｂＢ４の全長組換え可溶性ＣＤ４（ｒｓＣＤ４）に対する結合親和性を評価した。

２．２．１．抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体。モルモットをＣＤ４のａａ３９−６６を含む環状ペプチドで免疫化して、ＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域に対するポリクローナル抗体を調製した。この環状ペプチドをこの研究ではＨＩＶ受容体複合体ペプチド（ＨＩＶＲＣペプチド）と呼ぶが、「Wangら、2002」において以前はペプチドｐ２２４０ｃと記載されていた。

具体的には、４〜６週齢のＤｕｎｃａｎＨａｒｔｌｅｙモルモットを、０週目に完全フロイントアジュバント、３週および６週目に不完全フロイントアジュバントと混合した１回の用量当たり０．５ｍｌ中に１００μｇのＨＩＶＲＣペプチドで筋肉内免疫化し、次いでその後に不完全フロイントで毎月追加免疫化した後の指定された時点で、ＨＩＶＲＣペプチドに対するモルモット血清を得た。
得られたポリクローナル抗体を「抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体」と称す。

２．２．２．抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体によるＢ４のｒｓＣＤ４への結合の競合的阻害。１ウェル当たり０．１ｍＬで０．０８μｇ／ｍＬの全長ｒｓＣＤ４で被覆した９６ウェルマイクロタイタープレートを用いて、競合的阻害実験を行った。これらのウェルを、ビオチン化Ｂ４抗体による結合およびその後のトレーサーとしてのアビジン−ＨＲＰ複合体による結合前に、１：３０で希釈したＨＩＶＲＣペプチド（ＣＤ４のａａ３９−６６）に対する免疫原で免疫化した後０、３、６、９、１２、１４、１６および１９週目に回収したモルモット血清と共にインキュベートした。同じ期間を通して回収した未免疫モルモットからの陰性対照血清（ＲＣアイソタイプ）も試験した。

図１６は、ビオチン化Ｂ４のｒｓＣＤ４への結合が、初回免疫後６週目に得られた抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体により著しく阻害され、初回免疫後９週目までにほぼ完全な阻害に達していることを示している。

この競合結合阻害研究により、ｍＡｂＢ４の結合部位がＣＤ４のドメイン１のＣＤＲ２ループの周りにあるが、ｍＡｂＢ４によるこのペプチドへの直接結合は、ｍＡｂＢ４が膜結合型ＣＤ４の立体構造の輪郭に優先的に結合するため、重要ではないことがさらに実証された。

２．３．ｍＡｂｄＢ４の架橋によるＨＩＶ感染した個体におけるウイルス産生の増強のための休止ＣＤ４陽性Ｔ細胞の再活性化
細胞をｍＡｂｄＢ４で処置し、かつＴＮＦ−α産生、ウイルス量および細胞増殖を監視することにより、ｍＡｂｄＢ４が休止ＣＤ４＋細胞を活性化する能力を評価した。
この研究では、プレートをヤギ抗ヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch社）２００μＬと共に３７℃で１時間インキュベートすることにより、８ウェル培養プレートをヒトＩｇＧで被覆した。被覆プレートは、この研究でさらに使用するまで４℃の冷蔵庫に保存した。

ＨＩＶ患者のＰＢＭＣを、標準的な作業方法に従って１．５時間解凍した。後述するように、ＰＢＭＣをｍＡｂｄＢ４（実験用）、ＰＭＡ＋ＰＨＡ（陽性対照）又は培地のみ（陰性対照）のいずれかで処置することにより、休止ＣＤ４＋細胞の活性化を評価した。

２．３．１．ｍＡｂｄＢ４処置。細胞を濃度３μｇ／１０^６細胞／ｍＬのｍＡｂｄＢ４を用いて４℃で１時間処置して、細胞上でＣＤ４の架橋を開始させた。次いで、ｍＡｂｄＢ４で処置した細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ培地及び１０％ＦＢＳを含む被覆した４８ウェル培養プレート上で７日間培養した。未被覆ウェルも陰性対照として使用した。一定分量の培養物の上澄みを後日の評価のために、０日目、２日目及び７日目に凍結させた。４℃で３０分間処置した後に細胞から上澄みを除去して、０日目の時点のｍＡｂｄＢ４試料を得た。

２．３．２．ＰＭＡ＋ＰＨＡ処置。休止ＣＤ４＋細胞を再活性化させるための陽性対照としての０．１μＭフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）＋１５μｇ／ｍＬ酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）（Sigma社）（ＰＭＡ＋ＰＨＡ）を用いて、ＲＰＭＩ培地および１０％ＦＢＳを含む被覆した４８ウェル培養プレート上で細胞を７日間処置した。未被覆ウェルも陰性対照として使用した。一定分量の培養物の上澄みを後日の評価のために、０日目、２日目および７日目に凍結させた。４℃で３０分間処置した後に細胞から上澄みを除去して０日目時点のＰＭＡ＋ＰＨＡ試料を得た。

２．３．３．培地のみ。陰性対照として、細胞をＲＰＭＩ培地および１０％ＦＢＳ（培地のみ）を含む被覆した４８ウェル培養プレート上で７日間インキュベートした。未被覆ウェルもさらなる陰性対照として使用した。一定分量の培養物の上澄みを後日の評価のために、０日目、２日目および７日目に凍結させた。培地における４℃で３０分間のインキュベーション後に細胞から上澄みを除去して、０日目時点の培地のみの試料を得た。

２．３．４．ＣＤ４＋再活性化の分析。ＴＮＦ−α産生、ウイルス量および細胞増殖を評価することにより、ＣＤ４＋細胞の再活性化を測定した。この研究の結果は表１３に要約されている。
全ての試料の一定分量を標準的な方法を用いて、（１）定量的ＥＬＩＳＡによるＴＮＦ−αの濃度、（２）ＲＴＰＣＲによるＨＩＶウイルス量、（３）細胞数、および（４）トリパンブルーによる生存度についてアッセイした。

具体的には、当該データは、ＨＩＶ患者から得たｍＡｂｄＢ４で被覆されたＰＢＭＣ細胞の架橋により、培地のみの陰性対照（検出不能）およびＰＭＡ＋ＰＨＡで刺激された細胞と比較したとき、ＴＮＦ−αの適度な産生が引き起こされた（ｍＡｂｄＢ４で被覆された細胞よりも約３〜５倍高い）ことを示している。

また、ｍＡｂｄＢ４試料は培地のみの陰性対照と同様の速度で増殖した一方；ＰＭＡ＋ＰＨＡ刺激細胞は、ｍＡｂｄＢ４で架橋された細胞と比較して一段と増殖した（細胞数は７日目にｍＡｂｄＢ４培養物よりもＰＭＡ＋ＰＨＡ培養物において５倍高かった）。

しかし、ＨＩＶウイルス量は、培地対照およびＰＭＡ＋ＰＨＡ刺激細胞と比較して、ｍＡｂｄＢ４で架橋された細胞において著しく増加した。具体的には、ｍＡｂｄＢ４で架橋された細胞は、培地のみの陰性対照と比較したとき、２日目および７日目にそれぞれ１５１％および２２０％のウイルス量の増加を示した一方；ＰＭＡ＋ＰＨＡ培養物は、細胞増殖における５倍の増加にも関わらず、最適以下のウイルス量産生を示した（２日目および７日目にそれぞれ５５％および７８％）。

３．結論
１．マウスｍＡｂＢ４は、抗体Ｌｅｕ３ａによって認識される部位に近いＣＤ４上の立体構造部位（ＣＤＲ２領域内のａａ４７−６４）を認識することが分かった。ｍＡｂｄＢ４は、実施例７で報告されている比較研究によれば、ｍＡｂＢ４について本明細書に記載されている同じ認識特性を有することが期待される。
２．マウスｍＡｂＢ４の全長ｒｓＣＤ４への結合は、ＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域のａａ３９−６６を含む環状ペプチド（ＨＩＶＲＣペプチド）に対するポリクローナル抗体により阻害された。これらの結果から、ｍＡｂＢ４はＣＤ４のＤ１のＣＤＲ２ループに対応するＣＤ４のａａ３９−６６を認識することが示唆される。ｍＡｂｄＢ４は、実施例７で報告されている比較研究によれば、ｍＡｂＢ４について本明細書に記載されている同じ認識特性を有することが期待される。
３．ｍＡｂｄＢ４によるＣＤ４の架橋は、ＨＩＶ感染したＰＢＭＣＣＤ４＋Ｔ細胞においてウイルス産生を活性化することが分かった。具体的には、表１３に示すようにｍＡｂｄＢ４は、ＴＮＦ−α産生の誘導を引き起こし、細胞増殖を誘導することなくＨＩＶ産生を増強させた。
４．この実施例で得られた結果によれば、ｍＡｂｄＢ４（ＵＢ−４２１を含む）は、ＨＩＶ感染した個体におけるウイルス産生の増強のための休止ＰＢＭＣの再活性化を媒介することができる。

実施例１０
ｍＡｂｄＢ４Ｃ７および抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体はＣＤ４陽性Ｔ細胞による抗原誘導性Ｔ細胞増殖およびサイトカイン（ＩＬ２およびＩＦＮ−γ）産生を阻害し、このようにしてピロトーシスのＨＩＶ病理発生サイクルを破壊する
１．背景
最近の報告により、ＨＩＶが活性化された許容状態のＣＤ４＋Ｔ細胞を感染させた場合、カスパーゼ−３依存性アポトーシスを介して細胞死が静かに生じることが分かっている（Doitsh, G.ら、2014）。逆に、Ｒ５またはＸ４指向性ＨＩＶのいずれかがリンパ系組織からの非許容状態の静止ＣＤ４＋Ｔ細胞を不稔感染させたとき、これらの細胞は、カスパーゼ−１依存性ピロトーシス（高炎症型のプログラム細胞死）により死滅する。インターフェロン誘導因子１６（ＩＦＩ１６）は、不完全なＨＩＶ逆転写物を認識し、次いでカスパーゼ−１の活性化を開始する宿主ＤＮＡセンサーとして同定されている（Monroe, K. M.ら、2013）。扁桃腺、リンパ節および脾臓を含む大部分のヒトリンパ系組織では、活性化された許容状態の細胞のサブセットは、総ＣＤ４Ｔ細胞の５％以下を表し、非許容状態の静止細胞は、ＨＩＶが遭遇する標的の９５％以上を表す。したがって、カスパーゼ−３媒介性アポトーシスでなくカスパーゼ−１媒介性ピロトーシスが、これらのリンパ系組織のＨＩＶ感染後のＣＤ４Ｔ細胞死の促進に主に関与していると思われる。これらの発見は、Ｒ５指向性ＨＩＶに感染した対象の新しいリンパ節の分析によってさらに支持されており、この分析では、カスパーゼ−１およびＩＬ−１βは、休止ＣＤ４Ｔ細胞が多く存在する傍皮質領域において検出され、カスパーゼ−３活性は、生産的に感染された細胞が存在する解剖学的に異なる胚中心において検出される。

ピロトーシスは大抵の場合、細胞内複製適所（niche）を除去し、かつ炎症誘発性サイトカインおよび内因性危険シグナルの放出によって宿主の防御反応を高めることにより、各種細菌感染の急速な排除を促進する。しかし、ＨＩＶ感染などの病原性の慢性炎症では、ピロトーシスは防御反応にはならず、一次感染の排除には至らない。実際に、ピロトーシスは、悪性の病理発生サイクルを生じさせると思われ、ここでは、瀕死のＣＤ４Ｔ細胞が炎症性シグナルを放出し、これにより、より多くの細胞を、感染したリンパ系組織内に引き寄せて死滅させ、より多くの炎症を生じさせる。これらの事象は、疾患の進行および組織傷害に拍車をかける慢性の炎症状態を確立する。慢性炎症は、メモリＣＤ４Ｔ細胞の恒常的増殖を刺激する潜伏ＨＩＶリザーバーの維持も促進することがある。

ＣＤ４Ｔ細胞の枯渇および慢性炎症の発生は、疾患の進行を早めるＨＩＶの病理発生における特徴的なプロセスであり、ピロトーシスはこれらの２つの疾患促進プロセス間に予期せぬ繋がりを与える。

上記情報から、ＨＩＶ感染中にリンパ系組織において生じるピロトーシスが、ＣＤ４＋細胞の抗原刺激によって引き起こされるＣＤ４＋細胞増殖および／または炎症性サイトカイン産生を抑制する機序によって軽減または減少し得ることが示唆される。

２．実験
ｍＡｂｄＢ４がＨＩＶ感染した個体における慢性炎症の発生を阻害することにより、ピロトーシスによって引き起こされる病理発生サイクルを破壊することができるか否かを測定するための研究を行った。抗原刺激によって引き起こされるサイトカイン産生の阻害は、不稔ＨＩＶ感染を既に有する休止Ｔ細胞の多くによるピロトーシスを軽減するのを助け、このようにして、サイトカイン産生によるＣＤ４陽性Ｔ細胞枯渇におけるＨＩＶの病理発生を破壊する。

ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を用いるインビトロモデルを使用して、正常な個体およびＨＩＶ感染した個体においてｍＡｂｄＢ４Ｃ７（ＵＢ−４２１）がＰＢＭＣＴ細胞増殖を阻害する能力を評価した。ＳＥＢは、特定のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を有する全てのＴ細胞を刺激する能力を有し、かつ大量のサイトカイン産生を誘導するスーパー抗原である。

Huyen Cao博士およびMohamed Elrefaei博士と協力して、正常なヒトのドナー（ｎ＝３）およびＨＩＶに感染したドナー（ｎ＝６、ＡＲＴ未経験、ＣＤ４＋の数が２００超、ウイルス量が１０，０００超）の機能分析を行って、ＣＤ４のＤ１のＣＤＲ２領域に対するｍＡｂｄＢ４Ｃ７（ＵＢ−４２１）または抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体（実施例９で説明）が細胞増殖およびサイトカイン（ＩＬ２およびＩＦＮ−γ）産生を阻害することができるか否かを評価した。

２．１．研究対象および試料
ＨＩＶ陽性のＡＲＴ処置未経験志願者（ｎ＝６）を、ＲＥＡＣＨコホート（cohort）（サンフランシスコ）から採用した。３人の年齢適合ＨＩＶ血清陰性対照志願者もこの研究に含めた。ＰＢＭＣを分離し、アッセイの時間まで液体窒素中に凍結保存した。

２．２．飽和濃度のｍＡｂｄＢ４Ｃ７または精製した抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体を使用した
最初にＣＤ４＋Ｔリンパ球を、間接的免疫蛍光研究においてｍＡｂｄＢ４Ｃ７ＩｇＧまたは抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体ＩｇＧ、次いでＡｌｅｘａ−ヤギ抗ＨｕＩｇＧまたはＡｌｅｘａ−ヤギ抗モルモットＩｇＧでそれぞれ染色した。得られた染色細胞を検出される陽性細胞の割合についてフローサイトメトリーで分析した。ｍＡｂｄＢ４Ｃ７および抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体はどちらも、２倍希釈した５０μｇ／ｍＬ〜０．００２５μｇ／ｍＬで滴定した。ｍＡｂｄＢ４および抗ＨＩＶＲＣ抗体の抗体滴定は、抗体濃度（μｇ／ｍＬ）に対するＣＤ４結合率（％）として決定した。ＨＩＶ感染した個体および正常な個体に対して行われるＴ細胞機能アッセイでの使用前に、これらの滴定を評価した。

図１７から、機能的研究で使用されるそれぞれの試薬の飽和濃度がｍＡｂｄＢ４（ｄＢ４Ｃ７）では１μｇ／ｍＬ、抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体では２５μｇ／ｍＬであることが判明したことがわかる。

２．３．ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖
細胞分裂時のＣＦＤＡ−ＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル）染色の喪失を追跡するＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）蛍光アッセイにより、細胞増殖を分析した。^３Ｈ−チミジン（増殖）アッセイの代わりとしてＣＦＳＥを使用した。

ＰＢＭＣを飽和濃度のｍＡｂｄＢ４Ｃ７または精製した抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体と共にインキュベートして、細胞の表面上のＣＤ４受容体を被覆した。また、細胞をそれぞれ陰性および陽性対照として２５μｇ／ｍＬの抗ＨＩＶＲＣアイソタイプおよびＰＨＡ（１０μｇ／ｍｌ、Sigma Aldrich社）と共にインキュベートした。

ＰＢＭＣをＰＢＳ中でＣＦＤＡ−ＳＥ（Molecular Probes社、オレゴン州ユージーン）で標識し、次いで、１００％ＦＣＳ（Sigma Aldrich社、ミズーリ州セントルイス）で失活させた。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄した後、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０（Sigma Aldrich社）に再懸濁した。
次いで、細胞を５％ＣＯ_２中３７℃で５日間ＳＥＢＡｇ（１μｇ／ｍＬ）の存在下で培養し、表面マーカーの発現について分析した。

ＣＤ３＋（Ａｍｃｙａｎ）でゲーティングされるＣＤ４＋（ＰＥ、Ｄ２）、ＣＤ８＋（Ｐｅｒｃｐ−ＣＹ５．５）細胞集団の分析のためにフローサイトメトリーを行い、これらをそれぞれ、増殖細胞の割合としてのＣＦＳＥ陽性細胞率（％）についてさらに測定した。ＬＳＲＩＩ（BD Biosciences社、カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いて、１試料当たり四万（４０，０００）のリンパ球を取得し、ＦＬＯＷＪＯソフトウェア（TreeStar社、カリフォルニア州サンカルロス）により分析を行った。結果を分裂ＣＤ４（またはＣＤ８）Ｔ細胞の割合として測定した。全ての研究参加者はＰＨＡ刺激後に著しい増殖を示した。ＳＥＢＡｇ刺激のないＣＤ４Ｔ細胞の増殖（陰性対照）は＜０．５％であった。

２．４．サイトカインの測定のための細胞内染色アッセイ（ＩＬ２およびＩＦＮ−γ産生）
ＰＢＭＣ（０．５×１０^６細胞）を５％ＣＯ_２中３７℃でＳＥＢＡｇ（１μｇ／ｍＬ）と共に２時間インキュベートした。細胞を、０．１％ＦＣＳを含むＰＢＳ（洗浄緩衝液）で洗浄し、細胞を溶解溶液（lysing solution）（BD Biosciences社）に室温で１０分間再懸濁することにより固定した。細胞を洗浄緩衝液で１回洗浄し、次いで、透過用溶液２（permeabilizing solution 2）（BD Biosciences社）０．５ｍＬに再懸濁させて透過処理し、室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄緩衝液で洗浄し、抗ＩＬ−２ＡＰＣ、抗ＩＦＮ−γ（ＰＥＣＹ７）および抗ＣＤ３（Ａｍｃｙａｎ）、抗ＣＤ４（ＰＥ、Ｄ２）または抗ＣＤ８（Ｐｅｒｃｐ−ＣＹ５．５）（BD Pharmingen社）で染色した。ＬＳＲＩＩ（BD Biosciences社）を用いて、１試料当たり４万（４０，０００）のリンパ球を取得し、ＦＬＯＷＪＯソフトウェア（TreeStar社）で分析を行った。Ａｇ刺激なしのサイトカイン産生ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞の割合は０．０５％未満であった（陰性対照）。結果をＩＦＮ−γまたはＩＬ２を発現するＣＤ４＋（またはＣＤ８＋）Ｔ細胞の割合として表した。

２．５．統計分析
対応のあるｔ検定を用いて統計分析および比較を行った。

３．結果
このＳＥＢＡｇ誘導性Ｔ細胞増殖研究から得られた結果から、ｍＡｂｄＢ４Ｃ７（１μｇ／ｍＬ）および抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体（２５μｇ／ｍＬ）はどちらも、飽和条件下でＨＩＶＡＲＴ処置未経験患者および年齢適合正常個体の両方においてＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を減少させるがＣＤ８＋Ｔ細胞増殖は減少させないことが明らかとなった（データは示さない）。

ｍＡｂｄＢ４（１μｇ／ｍＬ）および精製した抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体（２５μｇ／ｍＬ）はどちらも、それらのそれぞれの飽和ＰＢＭＣ表面ＣＤ４結合濃度で、ＨＩＶ陰性（図１８ａ）およびＨＩＶ陽性（図１８ｂ）の個体において、スーパー抗原ＳＥＢ誘導性増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ２産生を抑制した。そのような抑制は同じＨＩＶ陽性および陰性の個体のＣＤ８＋Ｔ細胞（図１８ｃ）では認められなかった。

ｍＡｂｄＢ４（１μｇ／ｍＬ）および精製した抗ＨＩＶＲＣ抗体（２５μｇ／ｍＬ）はどちらも、それらのそれぞれの飽和濃度で、ＨＩＶ陰性（図１８ｄ）およびＨＩＶ陽性（図１８ｅ）の個体においてスーパー抗原ＳＥＢ誘導性増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生も抑制した。そのような抑制は同じＨＩＶ陰性（図１８ｆ）および陽性（図１８ｇ）の個体のＣＤ８＋Ｔ細胞では認められなかった。

４．結論
どちらもＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域を標的とするｍＡｂｄＢ４Ｃ７（ＵＢ−４２１）抗体および抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞によるスーパー抗原ＳＥＢ誘導性Ｔ細胞増殖およびサイトカイン（ＩＬ２およびＩＦＮ−γ）産生を抑制するが、ＣＤ８陽性Ｔ細胞によるＴ細胞増殖およびサイトカイン（ＩＬ２およびＩＦＮ−γ）産生を抑制しないことが分かった。ｄＢ４Ｃ７および抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体がＣＤ４＋Ｔ細胞増殖および関連するサイトカイン（ＩＬ２およびＩＦＮ−γ）産生を抑制することができたという発見は、本抗体が、ピロトーシスのＨＩＶ病理発生サイクルを破壊する可能性を有する他のＣＤ４陽性細胞に関連するサイトカイン産生に対して同様の抑制効果を発揮し得ることを示唆している。

この実施例および上記実施例において観察されたＣＤ４陽性Ｔ細胞増殖および付随するサイトカイン（ＩＬ２およびＩＦＮ−γ）産生に対する抑制効果は、ＣＤＲ２領域を標的とする本明細書に記載されている抗体がＣＤ４細胞に対して、（１）それらの潜伏状態からＨＩＶの放出を引き起こすためのＨＩＶ感染した休止ＣＤ４陽性Ｔ細胞の再活性化（実施例９で考察）、（２）休止ＣＤ４＋Ｔ細胞の再活性化により放出された新しいウイルスから感染していないＣＤ４陽性Ｔ細胞へのＨＩＶ侵入の競合的阻害および防止（実施例４および６）、ならびに（３）（スーパー）抗原刺激時のＣＤ４陽性Ｔ細胞によるＴ細胞増殖およびサイトカイン産生の阻害（本実施例）を含む同時的拮抗作用を与え得るという点で、非常に重要である。

ＨＩＶ結合および免疫応答を開始する正にその部位（即ち、ＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域）を標的とするｍＡｂｄＢ４および抗ＨＩＶＲＣポリクローナル抗体の独特な生物学的特徴により、ＨＩＶ感染の機能的治癒のために必要な特性、即ち（１）侵入阻害によるＨＩＶ感染を妨げ、（２）休止Ｔ細胞におけるウイルス産生を再活性化し、かつ（３）サイトカイン産生を直接変化させるための能力が得られる。

実施例１１
分岐群ＢのＨＩＶ初代分離株ＨＩＶ−１_ＤＨ１２を抗原投与したチンパンジーにおけるｍＡｂＢ４によるＨＩＶ感染の曝露前および曝露後の予防および処置
ＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域を標的とするＢ４に関連する高親和性抗体について独特なインビトロ特性の多くを実証してきたが、最もヒトに似ている動物モデルにおいてＨＩＶ感染の予防および／または処置におけるＢ４抗体の有効性を試験することが重要であった。ヒトのウイルス、細菌および寄生虫感染をモデル化するために１００年以上もの間チンパンジーが使用されてきた。分岐群ＢのＨＩＶ初代分離株ＨＩＶ−１_ＤＨ１２を用いてチンパンジーにおいて慎重に計画された抗原投与モデルを用いて、抗原投与研究を開始してｍＡｂＢ４が曝露前および曝露後モードの両方においてＨＩＶ−１感染に対して受動免疫を与える可能性を評価した。具体的には、ｍＡｂＢ４を、（１）曝露された対象を感染から保護するための殺菌免疫および（２）感染の確立から数日後に抗体が投与されたとき、曝露された対象に対して処置を与えるその能力について評価した。

１．チンパンジーにおけるｍＡｂＢ４によるＨＩＶ感染の曝露前および曝露後の予防。
抗原投与（ＨＩＶ−１への曝露）前および後モードの両方においてｍＡｂＢ４がＨＩＶ−１感染に対して受動免疫を与える可能性を評価した。

１．１．方法
１．１．１．研究で用いた動物。この研究では計４匹のチンパンジーを用いた。曝露前処置動物（Ｘ０８４）として１匹のチンパンジーを用い、曝露後処置動物（Ｘ３５６およびＸ３５７）として２匹のチンパンジーを用い、対照（Ｘ２５９）として１匹のチンパンジーを用いた。

１．１．２．ＨＩＶ−１_ＤＨ１２株による感染に対する動物の感受性。ＨＩＶ−１_ＤＨ１２株による感染に対する動物の感受性を、処置および感染前のそれらのＰＢＭＣのインビトロ感染により決定した。全ての培養物がウイルスへの曝露から３日以内に感染した。

１．１．３．ｍＡｂＢ４抗体。注入用のｍＡｂＢ４を高純度抗体薬剤として５ｍｇ／ｍＬで調製した。
１．１．４．抗原投与前の予防／処置。ＨＩＶ−１_ＤＨ１２抗原投与の１時間前に、チンパンジーＸ０８４に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂＢ４を静脈内注入した。
１．１．５．抗原投与後の予防／処置。ＨＩＶ−１_ＤＨ１２抗原投与から１時間後に、チンパンジーＸ３５６およびＸ３５７に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂＢ４を静脈内注入した。

１．１．６．対照動物。チンパンジーＸ２５９にｍＡｂＢ４抗体を注入せずにＨＩＶ−１_ＤＨ１２を抗原投与した。
１．１．７．ＨＩＶ−１_ＤＨ１２による抗原投与。４匹のチンパンジーに、サウスウェスト生物医学研究財団（Southwest Foundation for Biomedical Research）において、チンパンジーのＰＢＭＣで以前に調製および滴定したウイルス株から採取した１００ＴＣＩＤ_５０のＨＩＶ−１_ＤＨ１２を静脈内に抗原投与した。

１．１．８．ＨＩＶ−１_ＤＨ１２ウイルスの検出。ｇａｇ配列のＤＮＡＰＣＲ増幅、共培養、ｐ２４捕捉ＥＬＩＳＡおよび免疫ブロットを用いて、血漿ウイルス血症の検出、細胞関連ウイルス量およびＨＩＶに対する免疫応答によりチンパンジーにおける感染の確立を監視した。全てのチンパンジーから５０週間の研究中に採取した全ての血液試料においてＨＩＶ感染を示す血清ウイルス血症をＨＩＶ−１ＲＮＡコピー／ｍＬとして測定した。ウイルスの単離およびＤＮＡＰＣＲアッセイによりチンパンジーのＰＢＭＣにおいてＨＩＶ−１_ＤＨ１２ウイルスを検出して、ｇａｇに対応するプロウイルスＤＮＡを検出した。ｐ２４抗原捕捉ＥＬＩＳＡ（Coulter社）によりウイルス産生を評価した。ＩＬ−２培地において３日齢のＰＨＡ刺激した芽細胞からの２×１０^６細胞との共培養のために、チンパンジーのＰＢＭＣおよびリンパ節細胞の１×１０^６〜１×１０^２細胞の連続希釈物を調製した。ｐ２４の産生を生じた最も高い希釈を有するウェルを終点とみなした。

１．１．９．動物収容。米国学術研究会議（National Research Council）のガイドラインに準拠し、かつ動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）の認可の下で、チンパンジーをサウスウェスト生物医学研究財団で管理した。

１．２．結果
ＨＩＶ−１_ＤＨ１２の抗原投与を受けているチンパンジーにｍＡｂＢ４による殺菌免疫を与えた。抗原投与後３２週間の経過観察の間に、ＨＩＶ−１抗原投与前にｍＡｂＢ４抗体を注入した動物（Ｘ０８４）（図１９ａ）またはＨＩＶ−１処置から１時間後にｍＡｂＢ４抗体を注入した２匹の動物（Ｘ３５６およびＸ３５７）（図１９ｂ）において、感染のマーカーを検出することはできなかった。

対照的に、抗原投与後１週目に開始する対照動物（Ｘ２５９）（図１９ｃ）のＰＢＭＣおよび抗原投与後２週目までの血漿から、ウイルスが容易に単離された。４週目および２０週目に生検したＸ２５９のリンパ節細胞からもウイルスが単離された。１×１０^４〜１×１０^６の範囲の細胞数を含む希釈溶液内のＰＢＭＣおよびリンパ節区画中で感染細胞が検出された。動物Ｘ２５９において４週目までに抗体陽転が生じた。

循環中に認められた遊離した未結合のｍＡｂＢ４の存在は、抗体で処置したチンパンジーＸ０８４、Ｘ３５６およびＸ３５７において急速に減少した。処置したチンパンジーのＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットを抗原投与後２０週間にわたって監視したが、ＣＤ４＋枯渇の証拠は認められなかった。３２週を通して、マイトジェン（ＰＨＡ、ヤマゴボウマイトジェンおよびコンカナバリンＡ）に対するチンパンジーのＰＢＭＣの増殖応答の抑制は認められなかった。

この研究の結果は、ｍＡｂＢ４がＨＩＶ感染に対して予防または完全治癒を与えることができることを示しており、これは抗原投与日から１年後でさえも血清ウイルス血症および他のパラメータの広範囲な経過観察によって実証されている。

１．３．結論
チンパンジーの治験では、悪性の初代分離株によるＨＩＶ感染は、曝露前または曝露後すぐの期間のいずれかにおいて、ｍＡｂＢ４の投与により阻止された。移入された免疫は殺菌的であり、一過性のウイルス血症、ウイルス血症の減少または遅発性ウイルス血症の証拠は全く認められなかった。末梢血およびリンパ系組織中のＣＤ４＋細胞上で隔離することによるｍＡｂＢ４抗体の血漿からの急速なクリアランスにも関わらず、完全な保護は明白であった。
この慎重に行われた実験は、ｍＡｂＢ４または関連抗体を５ｍｇ／ｋｇ用いる処置プロトコルにより、（ｉ）ＨＩＶに遭遇して数時間以内の患者または（ｉｉ）血清陽性の母親の下に生まれた出産後すぐの乳児が完全治癒に至ることをさらに示唆した。

１．４．ｍＡｂＢ４による曝露後予防のための適用
米国公衆衛生局ガイドラインは、ＨＩＶへの不慮の曝露後に医療従事者に対して抗レトロウイルス剤を用いる曝露後予防を推奨している。しかし、米国公衆衛生局ガイドラインは、曝露後予防のために現在入手可能な薬剤の毒性に関して危惧を表明している。

この研究で得られた結果は、ｍＡｂＢ４を現在の曝露後処置の代わりとして使用するかそれと併用することができる曝露後予防処置として使用する可能性を実証している。ｍＡｂＢ４の低い毒性および有効性は、本抗体が抗レトロウイルス剤よりも広く活性である可能性を実証している。

これらの結果は、ｍＡｂＢ４をＨＩＶの母親から子供への垂直感染の予防のために使用できることをさらに示唆している。周産期感染または垂直感染とも呼ばれるＨＩＶの母子感染（ＭＴＣＴ）は、ＨＩＶが妊娠、陣痛および／または出産または授乳中にＨＩＶ＋女性からその乳児に広がった際に生じる。ウイルスの処置を受けていないＨＩＶ＋女性の妊娠、陣痛および出産中のＭＴＣＴの確率は約２５％である。子供を母乳で育てている未処置のＨＩＶ＋女性におけるＭＴＣＴの確率はさらに１２％上がる。世界的に２００１年には、１８０万人の女性がＨＩＶに感染し、約８００，０００人の子供たちもＨＩＶに感染し、彼らの大部分はＭＴＣＴを介して感染した。世界的にＨＩＶと新たに診断された人々の大部分は１５〜２４歳の間である。ＭＴＣＴ予防で非常に重要なことは、性的に活発になる前の若い人々、特に少女および若い女性のＨＩＶ予防および既に感染した人々の処置であることは間違いない。ＭＴＣＴに関するさらなる情報は、http://caps.ucsf.edu/archives/factsheets/mother-to-child-transmission-mtct#sthash.DTRyms46.dpufで見つけることができる。ｍＡｂＢ４により得られた結果は、ＨＩＶ＋女性の生まれたばかりの子供に５ｍｇ／ｋｇ以上のｍＡｂｄＢ４の単回投与を与えることで、ＭＴＣＴを陣痛および出産段階で予防できることを示唆している。

２．チンパンジーにおけるｍＡｂＢ４によるＨＩＶ感染の処置
２．１．方法
２．１．１．研究で使用した動物。前の予防研究で使用し、かつ５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂＢ４の単回投与を受けてＨＩＶ−１_ＤＨ１２感染から保護されているチンパンジーＸ０８４、Ｘ３５６およびＸ３５７を、この抗原投与研究において処置モードで再利用した。

２．１．２．ＨＩＶ−１_ＤＨ１２株による感染に対する動物の感受性。抗体処置およびＨＩＶ抗原投与前に、ＨＩＶ−１_ＤＨ１２による感染に対する感受性を決定するために、動物からＰＢＭＣを調製した。全てのインビトロ培養物はウイルスの接種から３日以内で感染した。

２．１．３．ｍＡｂＢ４抗体。注入用のｍＡｂＢ４を５ｍｇ／ｍＬの高純度抗体薬剤として調製した。
２．１．４．ＨＩＶ−１_ＤＨ１２による抗原投与。全ての動物（Ｘ０８４、Ｘ３５６およびＸ３５７）に、サウスウェスト生物医学研究財団においてチンパンジーのＰＢＭＣで以前に調製および滴定したウイルス株から採取した１００ＴＣＩＤ_５０のＨＩＶ−１_ＤＨ１２を静脈内に抗原投与した。

２．１．５．抗原投与後の処置。チンパンジーＸ０８４は抗原投与後の処置を全く受けなかった。ＨＩＶ感染の処置のために抗原投与した動物においてＨＩＶウイルス血症が最も高かった抗原投与後１４日目に、チンパンジーＸ３５７にｍＡｂＢ４を５ｍｇ／ｋｇ注入した。抗原投与後１４日、１８日および２２日目に、チンパンジーＸ３５６にｍＡｂＢ４を５ｍｇ／ｋｇ注入した。

２．２．結果の要約
この受動免疫療法研究をマウスｍＡｂＢ４の５ｍｇ／ｋｇの注入により行い、急性期ＨＩＶ感染を有するチンパンジーにおけるｍＡｂＢ４の処置効果を決定した。３匹のチンパンジー（Ｘ０８４、Ｘ３５６およびＸ３５７）にＨＩＶ−１_ＤＨ１２を静脈内（ｉ．ｖ．）接種し、ウイルス検出（図示せず）および定量的ＲＴ−ＰＣＲに基づき感染の確立を確認した。

全てのチンパンジー（Ｘ０８４、Ｘ３５６およびＸ３５７）において曝露後７日目までに、ＨＩＶ−１_ＤＨ１２から（ベースラインを超える）ＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲにより検出された。ウイルスの単離およびＨＩＶ−１_ＤＨ１２組込みの検出のためのＤＮＡ−ＰＣＲにより、３匹全ての動物のＰＢＭＣおよびリンパ節細胞中に１４日で細胞結合ウイルスが検出された。

感染後１４日目に、感染したチンパンジーのうちの２匹（Ｘ３５６およびＸ３５７）にｍＡｂＢ４（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）を注入した。感染後１８日および２２日目に、１匹の動物（Ｘ３５６）に２回のさらなる用量の本抗体（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）を投与した。最初の１２週間は１週間に１回、次いで感染後４０週目まで１ヶ月に１回の間隔で、ＲＴ−ＰＣＲアッセイによりウイルス量を監視した。チンパンジーＸ３５６およびＸ３５７にｍＡｂＢ４を注入した日である感染後１４日目までに、ウイルスＲＮＡは既に急上昇期にあった。次いで、抗体を投与したこの２匹のチンパンジー（図２０ａ、黒丸）は、未処置のチンパンジー（Ｘ０８４）（図２０ａ、白丸）と比較して、２０日目までの１〜２ｌｏｇのそれらのウイルス量の急速かつ著しい減少および４週間から１週間への一次ウイルス血症期間の持続期間の著しい減少を経験した。

図２０ａおよび図２０ｂは、未処置の対照チンパンジーＸ０８４（この研究から未処置であり、以前にｍＡｂＢ４の単回曝露前投与を受けた）および未処置の対照Ｘ２５９（前の研究から未処置であり、ｍＡｂＢ４の投与を受けなかった）における血漿ウイルス血症の持続期間を、ｍＡｂＢ４の３回の注入を受けたチンパンジーＸ３５６と比較している。チンパンジーＸ０８４（図２０ａ、白丸）およびＸ２５９（図２０ｂ、白丸）をどんな介入もなしにＨＩＶ−１_ＤＨ１２で抗原投与し、ウイルス抗原投与から早くも３日目に血清ＨＩＶ−１ＲＮＡコピーとして検出されるウイルス血症が現れ始めた。血清ＨＩＶ−１ウイルス血症の持続期間は約４２日間続き、これはＨＩＶ−１_ＤＨ１２感染に特徴的である。チンパンジーＸ３５６（図２０ａおよび図２０ｂ、黒丸）はｍＡｂＢ４の３回の投与を受け、そのＨＩＶ−１ウイルス血症は急勾配で減少し、その後２１日目またはその前後に検出不能なレベルに達した。Ｘ３５６とＸ０８４およびＸ２５９とのウイルス量データの比較は、ＨＩＶ−１_ＤＨ１２感染の特徴的なウイルス血症持続期間からの２１日の減少を示している。

上述のように、この研究から未処置の対照チンパンジーＸ０８４は前の研究でｍＡｂＢ４の単回曝露前投与を受け、前の研究から未処置の対照チンパンジーＸ２５９はｍＡｂＢ４の投与を全く受けなかった。興味深いことに、Ｘ０８４について得られたデータ（図２０ａ、白丸）とＸ２５９（図２０ｂ、白丸）との比較は、Ｘ０８４がＸ２５９と比較して研究期間にわたって全体的により低いウイルス量を有していたことを示している。したがって、この研究における未処置の動物（Ｘ０８４）のウイルス量はｍＡｂＢ４で処置した動物（Ｘ２５６）よりも著しく高かったが、Ｘ０８４におけるｍＡｂＢ４への前の曝露は、特にＨＩＶ感染の急性期の間に全体的なウイルス量を著しく減少させるように見える（Ｘ０８４をＸ２５９と比較）。まとめると、これらの結果から、ＨＩＶ曝露前のｍＡｂＢ４のあらゆる投与が感染の急性期の間にウイルス量の強度を減少させることができ、これにより、感染後の個体から個体へのウイルスの伝播をさらに減少させることができることが示唆される。

細胞表面染色も行い、ｍＡｂＢ４が、１４日目にｍＡｂＢ４の単回投与を与えた動物（Ｘ３５７）において少なくとも７日間ＣＤ４＋細胞に結合したままであり、本抗体の複数回投与を与えた動物（Ｘ３５６）において少なくとも１４日間持続することを見出した。対照的に、ＨＩＶ−１_ＤＨ１２分離株に対する中和活性により測定したとき、注入後３日間のみ両動物において循環中に遊離したｍＡｂＢ４が検出された。チンパンジー予防研究と同様に、これはＣＤ４＋細胞への結合により循環から除去されたｍＡｂＢ４と一致している。

ＦＡＣＳ分析では、ＣＤ４／Ｂ４エピトープのインビトロ免疫染色により４０週間を通して全ての試料中に著しい枯渇なしにＣＤ４＋細胞が検出された。注入したｍＡｂＢ４の免疫染色を最初の２１日間ＰＢＭＣ上で行った。抗体処置の前後でのＰＢＭＣ試料のマイトジェン誘導性増殖応答（ＣｏｎＡ、ＰＷＭまたはＰＨＡを用いる）は可変的であり、ｍＡｂＢ４の注入によって影響されているようには見えなかった。これらの観察から、ｍＡｂＢ４はウイルス感染を弱めることができ、かつ過度の免疫毒性の証拠もなくウイルス量およびウイルス血症期間の両方を減少させることができることが示唆される。

実施例１２
ヒヒにおけるＵＢ−４２１製剤、前臨床的薬理学／毒性研究およびヒト組織における交差反応性
導入
先の実施例で考察した細胞培養およびチンパンジー研究から得られたデータにより、ヒトへの使用のためにｍＡｂｄＢ４を含有する医薬製剤のさらなる開発を正当化するのに十分な科学的利点が実証された。ｍＡｂｄＢ４Ｃ７を含有する医薬製剤（ＵＢ−４２１）を調製し、臨床用途のために製造したロットに対して一般的な安全性試験を行った。

薬剤候補ＵＢ−４２１に関する薬力学、薬物動態、毒性および安全性情報を得るために、パネルの前臨床的安全性研究も行った。

無症状のＨＩＶ−１感染したヒト対象におけるＵＢ−４２１の用量依存的安全性、忍容性および免疫毒性を評価するための第Ｉ相臨床試験の設計を容易にするために、ヒヒ（ヒヒ属種）において単回および複数回投与ならびに用量依存性（低用量および高用量）研究を行った。図２１に示すように、ヒヒにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞はヒトと同様のｍＡｂｄＢ４Ｃ７に対する結合親和性を有するため（即ち、ヒトおよびヒヒにおいてそれぞれＥＣ_５０＝０．３３μｇ／ｍＬおよび０．２９μｇ／ｍＬ）、前臨床的薬理学的／毒性研究における動物モデルとしてヒヒを使用した。ヒテキサス州サンアントニオにあるサウスウェスト生物医学研究財団のウイルス学および免疫学部門においてKrishna Murthy博士と共同して、ヒヒにおける非ヒト霊長類の薬理学的／毒性研究を開始および実施した。

さらに、ＵＢ−４２１があらゆる予期せぬ反応性および意図した標的とは異なるヒト組織に向かう細胞傷害の可能な位置を有するか否かを評価するために、交差反応性研究を行った。
以下でさらに詳細に考察するように、これらの前臨床的研究から得られたデータにより、ヒト臨床試験における新治験薬としてのＵＢ−４２１のさらなる開発を正当化するのに十分な科学的利点が実証されている。

１．医薬製剤
ヒトへの使用のためにｍＡｂｄＢ４Ｃ７を含有する医薬製剤を調製した。一般に、ｍＡｂｄＢ４Ｃ７を含有する医薬製剤は、限定されるものではないが、ｐＨ６．０〜７．０のクエン酸、リン酸、Ｔｒｉｓ、ＢＩＳ−Ｔｒｉｓなどの適当な緩衝液で調製することができ、糖類（５０ｍＭ〜５００ｍＭのスクロース、トレハロース、マンニトールまたはそれらの混合物）、界面活性剤（例えば、０．０２５％〜０．５％のＴｗｅｅｎ２０またはＴｗｅｅｎ８０）および／または他の試薬などの賦形剤も含有することができる。

ＵＢ−４２１は、ｐＨ６．５のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に１０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂｄＢ４Ｃ７、２０ｍＭグリシンおよび０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（ポリソルベート２０）を含有する医薬組成物の呼称である。
皮下注射などの特定の用途で使用するために、ヒスチジン１０ｍＭを含むｍＡｂｄＢ４の高濃度製剤も調製した。
製造後に、製造した製剤がヒトおよび動物対象に投与するのに安全であることを保証するために、一般的な安全性および毒性研究を行った。

２．一般的な安全性研究
２．１．ＵＢ−４２１の製造ロットおよび安全基準
ＵＢ−４２１製剤の２回の大規模生産（Ｐ／ＮＺ８０７、ロット番号：２２５７１１および２２５７５８）を臨床試験で使用するために準備し、一般的な安全性について評価した。
７日間の試験期間中に、（１）試験期間を通して全ての動物が生存し、（２）見かけ上の毒性の兆候が観察されず、かつ（３）医薬組成物を投与した時から試験期間の終了までの間に動物に大きな体重減少が認められなかったという基準を満たしたとき、ＵＢ−４２１の大規模バッチ（ロット）を臨床用途のために安全かつ許容可能なものとみなした。

２．２．試験動物
マウス：（アルビノ、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＮａｒｌ系（学名：Mus musculus）、特定病原体不在、雄（国立動物研究所（ＮＬＡＣ：National Animal Research Laboratory）、台湾））（研究番号：ＢＩＯ−００３．９０）。モルモット：（アルビノ、Ｈａｒｔｌｅｙ系（学名：Cavia porcellus）、特定病原体不在、雄（国立台湾大学病院（ＮＴＵＨ）、動物センター、台湾））（研究番号：ＢＩＯ−００３．９１）。

２．３．方法
２匹のマウスおよび２匹のモルモットにＵＢ−４２１の各ロットを腹膜内経路で注射した。対照マウスおよびモルモットに生理食塩液（「Ｓ．Ｔ．」、ロット番号：１ＯＣ０２０６）を腹膜内経路で注射した。各マウスに０．５ｍＬの全量を投与し、各モルモットに５．０ｍＬの全量を投与した。投与前（０日目）および終了前（７日目）に動物の体重を記録した。各動物を健康状態および毒性の臨床的兆候について毎日観察した。

２．４．分析および結論
一般的な安全性研究の結果から、分析した基準について以下の満足な結果が得られた。
（１）試験期間中に一般的な安全性試験のために使用した全ての動物が生存していた。
（２）ＵＢ−４２１で処置した動物において見かけ上の毒性の兆候は観察されなかった。
（３）試験期間中にどの動物にも体重の減少は認められなかった。
上記から判断して、これらのロットを予期せぬ許容し難い外部混入物について陰性であるとみなした。

これらの発見により、ＵＢ−４２１の大規模製造ロット（ロット番号：２２５７１１および２２５７５８）は予期せぬ許容し難い外部混入物について陰性であることを確認した。したがって、これらの２種類のロットをヒトの臨床試験において使用するのに安全かつ許容可能なものとみなした。

３．研究Ａ：ヒヒにおけるＵＢ−４２１の単回投与毒性研究
３．１．方法
研究Ａは、表１４ａに示すように、４２日間にわたる低用量（５ｍｇ／ｋｇ体重）または高用量（２５ｍｇ／ｋｇ体重）のいずれかのＵＢ−４２１の単回投与の薬力学、薬物動態および安全性を評価した。この研究では、ＵＢ−４２１を５ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇ体重で３０分かけて静脈内注入により投与した。０、０．５、１、２、４、８、１２、２４時間後および２、３、５、７、１０、１４、２１、２８、３５、４２日目に薬物動態（ＰＫ）分析のために血液試料を採取した。

以下のマーカー：ＣＤ４ドメイン１（抗ＣＤ４＋Ｄ１）およびＣＤ４ドメイン２（抗ＣＤ４＋Ｄ２）を用いてＣＤ４^＋Ｔリンパ球の存在を監視するために、フローサイトメトリー分析により血液試料を分析した。モノクローナル抗体ＵＢ４２１およびＣＤ４ドメイン１および２に対する抗体による競合的ＣＤ４結合のためのマーカーおよびトレーサーの両方としてＡｌｅｘａ−ｄＢ４を使用した。ＣＤ４ドメイン１および２に対するモノクローナル抗体のためのトレーサーとしてＡｌｅｘａ−ヤギ抗ｈｕＩｇＧを使用した。さらに、ＰＢＭＣ調製物中の総Ｔ細胞数（ＣＤ３）および単球（ＣＤ１４）を監視するために、ＣＤ３およびＣＤ１４に対する抗体を使用した。

３．２．結果の要約
薬力学、薬物動態および安全性研究において、ＵＢ−４２１をヒトにおける第Ｉ相臨床試験に進めるべきではないということを示唆する一貫した否定的な観察は認められなかった。評価した全てのパラメータについて、対照および実験動物の両方において平均を著しく超えるか満たない値（「正常範囲外」）が認められるあらゆるデータ点が観察された。
低用量（５ｍｇ／ｋｇ）および高用量（２５ｍｇ／ｋｇ）のＵＢ−４２１の単回投与で処置したヒヒから得られた血液試料を評価することにより、ＵＢ−４２１の初期薬物動態（ＰＫ）特性を評価した。

この研究の結果から、ＵＢ−４２１を用いた処置により、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ節生検試料の細胞懸濁液のいずれかから単離されたＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ１４＋ＣＤ４＋単球の検出において劇的な減少が生じることが分かった。これらの細胞における減少は、動物におけるＣＤ４＋細胞の枯渇によるものではなく、ＵＢ−４２１によるＣＤ４＋細胞の「被覆」によるものではないかと疑った。抗ＣＤ４＋Ｄ２マーカーに対する抗体によって検出されるＣＤ４＋Ｔリンパ球の割合において変化がなかったことを見出した際に、この疑いが確信へと変わった。注入後のそのようなＵＢ−４２１によるＣＤ４＋細胞上の「被覆」の持続期間は、低用量を投与した動物では少なくとも３日間、高用量を投与した動物では少なくとも７日間であった。ＵＢ−４２１が動物の血漿中でもはや検出されなくなったとき、ＣＤ４＋細胞上の「被覆」は減少し、ＣＤ４＋細胞（抗ＣＤ４＋Ｄ１によって検出）は、抗ＣＤ４＋Ｄ２によって検出される割合と同じ割合に戻った。

要約すると、この研究から、ＵＢ−４２１は安全であり、低用量のＵＢ−４２１を投与したとき、少なくとも３日間、高用量のＵＢ−４２１を投与したとき、少なくとも７日間ＣＤ４陽性細胞を完全に被覆できることが分かった。先の実施例で考察した結果によれば、ＣＤ４＋細胞が完全に被覆された場合、ＨＩＶは細胞への侵入から完全に排除され、これによりウイルス量の減少が生じることが期待される。

４．研究Ｂ：ヒヒにおける複数回投与毒性研究
４．１．方法
研究Ｂは、表１４ｂに示すように、５６日間（８週間）にわたる低用量（５ｍｇ／ｋｇ体重）または高用量（２５ｍｇ／ｋｇ体重）のいずれかのＵＢ−４２１の反復投与の薬力学、薬物動態および毒性を評価した。この研究では、処置期は、１週間に１回の間隔で与えられる計８回のＵＢ−４２１の投与（１週間に１回の投与）で構成されていた。８週間の処置期の終了時に、処置した動物の半分を剖検して評価した（表１４ｂ、第一部）。残りの動物を１２週間の回復期を通して追跡調査し、回復期は観察ならびに血液およびリンパ節試料の採取のために動物を維持した（表１４ｂ、第二部）。処置期中の０^＊、１、３、７^＊、１４、２１、２８、３５^＊、４２、４９、５６^＊日目および回復期中の６３^＊、７０、７７、９１、１０５^＊、１３３日目に、分析のために動物から血液試料（およびリンパ節生検^＊）を採取した。試験系として成体の雄（Ｍ）および雌（Ｍ）のヒヒ（ｎ＝２０、年齢：７〜１８年齢）を使用した。

４．２．結果の要約
前臨床的研究の広範なパネルから、低用量（５ｍｇ／ｋｇ）および高用量（２５ｍｇ／ｋｇ）のＵＢ−４２１の複数回投与について薬物動態、薬力学、毒性および安全性情報を得た。
まとめると、研究Ｂの第一部および第二部から得られたデータは、ＵＢ−４２１薬剤候補が新治験薬としてのさらなる開発のために科学的利点を有することを示した。薬力学、薬物動態および安全性研究において、ＵＢ−４２１をヒトにおける第Ｉ相臨床試験に進めるべきではないということを示唆する一貫した否定的な観察は認められなかった。対照および実験動物の両方において、評価した全てのパラメータについて平均を著しく超えるか満たない値（「正常範囲外」）が認められるあらゆるデータ点が観察された。

４．２．１．血液および生検分析。低用量および高用量のＵＢ−４２１の複数回投与で処置した動物から得られた試料に対して広範なパネルの試験を行った。これらの試験の結果は表１５および表１７に要約されており、以下でさらに考察する。

ＵＢ−４２１は、ＵＢＩＥＬＩＳＡ試験（実施例７で考察）およびＭＴ−２アッセイ（実施例２で考察）の両方を用いて、低用量（５ｍｇ／ｋｇ）のＵＢ−４２１を投与した動物では少なくとも３日間、高用量（２５ｍｇ／ｋｇ）のＵＢ−４２１を投与した動物では少なくとも７日間、血漿中で検出可能であった。最後の注入後少なくとも１４日間は、何匹かの高用量動物の血漿中で過剰なＵＢ−４２１が検出された。

ＵＢ−４２１を投与した１６匹の動物のいずれにおいてもＵＢ−４２１に対するヒヒ抗体は認められず、この薬剤候補は処置した動物において免疫原性ではないことが分かった。

０日および２８日目に、全てのヒヒをＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ワクチン（Merck社）で免疫化した。４匹の対照（１Ｂ）動物のうちの４匹、低用量（２Ｂ）のＵＢ−４２１を投与した８匹のヒヒのうちの６匹、および高用量（３Ｂ）のＵＢ−４２１を投与した８匹のヒヒのうちの３匹において、５６日目に検出可能なレベルのヒヒ抗ＨＢｓＡｇ抗体が観察された。これらの結果から、ＣＤ４^＋細胞のＵＢ−４２１「被覆」により、抗原に対して免疫予防している何匹かの動物において低応答性が引き起こし得ることが示唆される。但し、これらの動物はＵＢ−４２１処置の休止およびＨＢＶワクチンによるさらなる免疫後に抗ＨＢｓＡｇ抗体を産生することができたため、そのような低応答効果は可逆的であることが分かった。

４．２．２．観察および剖検の結果。この研究で処置したヒヒの肉眼的および顕微鏡分析を、表１６及び表１７に要約する。
概して、この研究（第一部および第二部）で評価したヒヒの全てから採取した組織は、低用量または高用量レベルのいずれかのＵＢ−４２１の投与に起因し得る、いかなる独特または一貫した病理学的変化も示さなかった。

注入前の登録時および最後の注入から１週間後の処置期の終了時に再度、全ての３Ｂ群（高用量）動物（ｎ＝８）に対して検眼鏡（眼）検査を行った。これらの動物からの眼に関する報告書は、処置期の終了時に行った全ての試験について両眼が正常範囲内のままであることを示した。

各用量の投与の前、間および後に、全ての動物（ｎ＝２０）から心電図（ＥＣＧ）記録を得た。調査した全ての動物の心電図報告書により、認められたＥＣＧ変化は正常な日差変動範囲内であると結論づけた。

４．２．３．ＩＮＤ認可毒性試験の結果
ＨＢＶワクチン接種に対する免疫応答の低下以外、免疫毒性試験の結果においてＵＢ−４２１処置群（２Ｂおよび３Ｂ）と対照群（１Ｂ）との間に著しい差は認められなかった。臨床検査の結果、即ち検眼鏡検査（眼）に関する報告書、ＥＣＧ記録及び組織病理学検査の結果は、ＵＢ−４２１が、最大２５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで１週間に１回の８回の注入を受けた後の成体のヒヒにおいて安全であり、かつ十分に忍容性がある、即ち、標的細胞を枯渇させることなく有効に被覆した処置であるという結論を支持するものであった。

５．ヒト組織における交差反応性研究
先の実施例で考察したとおり、ｍＡｂｄＢ４Ｃ７（ＵＢ−４２１薬剤候補における主成分）などのｍＡｂｄＢ４抗体は、Ｔ細胞上のＣＤ４、特に膜結合型ＣＤ４に対して高い結合親和性を示した。その後の前臨床研究では、３０種類のヒト臓器の多くの組織を用いてｍＡｂｄＢ４Ｃ７が他の細胞型に結合するか否かを評価した。この研究の目的は、ｍＡｂｄＢ４Ｃ７があらゆる予期せぬ反応性および意図した標的とは異なるヒト組織に向かう細胞傷害の可能な位置を有するか否かを評価することであった。

５．１．方法
３０種類の臓器（各臓器は３人の正常なヒト個体ドナーから採取したもの（US BioMax社製の組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）スライド、メリーランド州ロックヴィル）である）の全部で９０種類の組織コアを含むＦＤＡ規格凍結組織アレイを用いて、免疫組織化学研究を行った。表１８に記載するように、個々のヒト標本のさらなるクリオスタット切片もヒト組織パネルに含めた。特異性および望ましくない自己反応性の評価のために、ビオチン化ｍＡｂｄＢ４Ｃ７および対照試薬（ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ）を用いて、ヒト組織パネルを免疫反応性についてスクリーニングした。

５．２．結果
成体の正常組織切片について観察された染色パターンを、PhenoPath Laboratories（ワシントン州シアトル）において有資格の臨床病理医によって反応性について見直されてスコア化した。胸腺および扁桃腺（およびリンパ節）内のＴ細胞依存性領域において強い陽性の表面膜染色が観察され、脾臓において弱い陽性の反応性が認められた。ときにはリンパ球またはマクロファージに一致する単核細胞を、複数の組織において期待されるパターンで陽性に染色した。肝臓における局所的な弱いクッパー細胞染色も認められた。いくつかの組織における内因性ビオチンの弱い染色以外、試験した全ての他の成人のヒト組織は陰性であった。扁桃腺切片の標識されていないｍＡｂｄＢ４Ｃ７抗体とのプレインキュベーションにより特異的な染色パターンが阻止された。予期せぬ交差反応性は観察されなかった。
これらの結果から、ｍＡｂｄＢ４Ｃ７（ＵＢ−４２１中の主成分）は、意図した標的とは異なるヒト組織に向かう細胞傷害を潜在的に生じさせ得る予期せぬ交差反応性を有しないことが確認された。

実施例１３
無症状のＨＩＶ−１感染した成人におけるＵＢ−４２１の安全性および薬物動態を評価するための第Ｉ相非盲検単回投与用量依存性研究
１．目的
第一の目的は、無症状のヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）に感染した対象における漸増用量のＵＢ−４２１の単回静脈内注入の安全性および忍容性を評価することにあり、第二の目的は、無症状のＨＩＶ−１感染した対象における漸増用量のＵＢ−４２１の単回静脈内注入の薬物動態を測定することにあった（臨床試験識別番号：ＮＣＴ０１１４０１２６）。

２．方法論
非盲検、単回投与、用量依存性（漸増）、２施設、非比較。
３．対象の数
計２０人の対象（各コホートに５人の対象）が登録された。

４．組み入れのための診断および主要な基準
この研究に参加するために、対象は以下の基準を全て満たさなければならなかった。
１．ＨＩＶ−１血清陽性；
２．年齢２０歳以上；
３．プロトコル２０１０年３月９日（Ｍａｒ−０９−２０１０）版では、スクリーニング来院（来院１、Ｖ１）時に、病歴、身体検査、心電図（ＥＣＧ）および凝固試験の結果に基づき研究者によって無症状と判定され、かつ臨床化学および血液検査が正常範囲±１０％内でなければならない；
４．プロトコル２０１０年７月１日（Ｊｕｌ−０１−２０１０）版では、病歴、身体検査、ＥＣＧおよび研究室評価に基づき研究者によって無症状と判定され、スクリーニング来院（来院１、Ｖ１）前の２４週間以内に急性または症候性のウイルス肝炎に罹患しておらず、かつＡＩＤＳ指標疾患歴を有していない；
５．プロトコル２０１０年３月９日（Ｍａｒ−０９−２０１０）版では、スクリーニング来院（来院１、Ｖ１）時に得られたＣＤ４＋Ｔ細胞数が３５０細胞／ｍｍ^３超であり、かつＨＩＶ−１ウイルス量が５，０００コピー／ｍＬ超である；
６．プロトコル２０１０年７月１日（Ｊｕｌ−０１−２０１０）版では、スクリーニング来院前の４週間以内またはスクリーニング来院（来院１、Ｖ１）時に得られたＣＤ４＋Ｔ細胞数が３５０細胞／ｍｍ^３超であり、かつＨＩＶ−１ウイルス量が５，０００コピー／ｍＬ超である；
７．処置未経験、即ち過去または現在も抗レトロウイルス療法を受けていない対象；
８．女性については授乳中でない；
９．出産の可能性のある女性についてはスクリーニング来院時の妊娠検査結果が陰性でなければならない；
１０．研究期間中に避妊具（女性または男性用コンドーム）の使用に同意しなければならない；かつ
１１．全ての研究手順を受ける前にインフォームドコンセントにサインしなければならない。

５．治験薬および介入方法
ＵＢ−４２１（ｄＢ４Ｃ７ｍＡｂ）は、１０ｍｇ／ｍＬ（１０ｍＬのバイアル中に１００ｍｇ）の濃度で提供された。
与えられるＵＢ−４２１の投与量に基づいて、対象をそれぞれ５人の対象を含む４つのコホートに分けた。登録された対象は、それぞれ０日目（来院２、Ｖ２）に、以下の用量レベル：１ｍｇ／ｋｇ体重（コホート１）、５ｍｇ／ｋｇ体重（コホート２）、１０ｍｇ／ｋｇ体重（コホート３）または２５ｍｇ／ｋｇ体重（コホート４）のうちの１つのＵＢ−４２１の単回静脈内注入を受けた。指定された用量および対象の体重に基づき、ＵＢ−４２１の適切な体積を計算した。コホート内の各個々の対象に同等の注入体積の薬剤が注入されるように各個々の用量の体積を無菌の生理食塩水を用いて調節した。次いでその用量のＵＢ−４２１を注入ポンプで送達した。

６．処置の持続期間
スクリーニング、処置および経過観察の時間枠：６２〜９０日間。注入から研究の終了までの時間枠：６０日間。
７．評価基準
７．１．主要安全性評価項目
１．身体検査（ＰＥ）
２．バイタルサイン
３．臨床化学および血液検査
４．有害事象（ＡＥ）／深刻な有害事象（ＳＡＥ）の発生率
５．心電図（ＥＣＧ）。

７．２．副次的安全性評価項目
１．０日目（注入前）、投与後１４日目、２８日目および６０日目に行った、抗ＵＢ−４２１抗体の血清中濃度（ＵＢ−４２１の免疫原性）。
２．スクリーニング来院（Ｖ１）時に評価したかスクリーニング来院前の４週間以内に得られたスクリーニング前データに基づく初回ＣＤ４＋Ｔ細胞数。
３．投与後６０日目に評価した経過観察ＣＤ４＋Ｔ細胞数。

８．有効性評価項目
有効性評価項目をベースラインからのＨＩＶ−１ウイルス量の変化として評価した。ベースラインＨＩＶ−１ウイルス量は、スクリーニング来院Ｖ１時に評価したウイルス量として定めた。

９．薬物動態（ＰＫ）
ＵＢ−４２１について以下の薬物動態（ＰＫ）パラメータを評価した。
１．Ｃ_ｍａｘ：投与後に観察された最高血清中薬物濃度。
２．Ｔ_ｍａｘ：Ｃ_ｍａｘ到達時間。
３．λ_ｚ：消失（最終）速度定数。
４．ｔ_１／２：消失（最終）半減期。
５．ＡＵＣ_{（０→last）}：０時間から最後に試料をアッセイした時間までの血清中薬物濃度時間曲線下面積。
６．ＡＵＣ_{（０→∞）}：０時間から無限時間までの血清中薬物濃度時間曲線下面積。
７．ＣＬ：薬物の体外への血清クリアランス。
８．Ｖ_β：クリアランス期の分布容積。
９．Ｖ_ｓｓ：定常状態時の分布容積。
１０．ＭＲＴ_{（０→∞）}：無限時間まで外挿した平均滞留時間（ＭＲＴ_{（０→ｔ）}）。

１０．統計学的方法
１０．１．主要安全性評価項目
１．身体検査：施設、日数、コホートおよび全体ごとの記述統計を用いて身体的異常を要約した。ベースラインから最終来院までの遷移表も作成した。
２．バイタルサイン：バイタルサインを各来院ごとの記述統計を用いて要約した。ベースライン値からの変化も施設、日数、コホートおよび全体ごとに示した。
３．臨床化学および血液検査：臨床化学および血液検査の結果を適用可能な来院時に記述統計を用いて要約した。研究者の専門家判断および各研究場所における正常範囲基準に基づき、試験結果を４つのカテゴリー、即ち、正常、臨床的意義のない（ＮＣＳ）異常、臨床的意義のある（ＣＳ）異常、および典型的な臨床的意義のある（ＣＳＴ）異常のうちの１つに分類した。ベースラインから最終来院までの臨床検査結果の異常における変化も遷移表に示した。
４．有害事象（ＡＥ）の発生率：処置前ＡＥ、処置により発現したＡＥ（ＴＥＡＥ）および薬剤関連ＡＥを頻度分布として要約した。各報告されたＡＥを１つの国際医薬用語集（ＭｅｄＤＲＡ）コードおよび１つの体組織クラスに関連づけた。重症度評価のために国立アレルギー・感染症研究所のＡＩＤＳ処置研究部（ＤＡＩＤＳ：Division of AIDS Treatment Research Program）ＡＥ評価表ｖ１．０を利用した。
５．ＥＣＧ：適用可能な来院時に得られたＥＣＧ記録データを記述統計により要約した。

１０．２．副次的安全性評価項目
１．抗ＵＢ−４２１抗体の血清中濃度：抗体濃度を適用可能な来院ごとに要約した。
２．ＣＤ４＋Ｔ細胞数：細胞数および細胞率を適用可能な来院ごとに分布統計学を用いて要約した。ＣＤ４＋Ｔ細胞数および細胞率の両方におけるベースラインから最終来院までの変化も要約した。

１０．３．有効性評価項目
１．ＨＩＶ−１ウイルス量：ＨＩＶ−１ウイルス量を各来院時に記述統計を用いて要約した。ベースライン値からの変化＝（処置後来院時の値−ベースライン来院時の値）も、施設、日数、処置コホートおよび全体ごとに示す。

１０．４．薬物動態評価
薬物動態パラメータを各来院時に記述統計を用いて要約した。
プロトコルおよび統計解析計画書（ＳＡＰ）に従って、安全性評価項目を包括解析（ＩＴＴ：intent-to-treat）集団について分析し、有効性の分析はＩＴＴおよび有効集団（efficacy population）の両方に対して行う。ＰＫ評価に関しては、ＴＶＧＨの対象のみがＰＫデータ分析のために採取された利用可能な試料を有していたため、これらの対象をＰＫ集団と定めた。ＰＫの評価はＴＶＧＨの対象に対してのみ行った。

１１．結論の要約
１１．１．有効性、薬物動態および安全性の結果
１１．１．１．有効性の結果。図２２ａに示すように、この研究全体の各種時点におけるＨＩＶ−１ウイルス量における変化を測定することにより、ＵＢ−４２１の有効性を評価した。有効性の分析は、平均ＨＩＶ−１ウイルス量における顕著な正味変化がＵＢ−４２１注入後にコホート２（５ｍｇ／ｋｇ）、コホート３（１０ｍｇ／ｋｇ）およびコホート４（２５ｍｇ／ｋｇ）の対象で認められ、コホート１（１ｍｇ／ｋｇ）の対象では認められなかったことを示している。

抗体薬剤ＵＢ−４２１（ｍＡｂｄＢ４Ｃ７）の有効性は、単回投与後の最大２．２５ｌｏｇ_１０のウイルス量の減少（１０ｍｇ／ｋｇ群）により実証されている（図２２ｂ）。各コホートのＨＩＶ−１ウイルス量における最大の平均減少は以下に要約され、かつ図２２ｂに示されている。
コホート１（１ｍｇ／ｋｇ）：６日目に０．２９ｌｏｇ_１０コピー／ｍＬ（Ｖ５）
コホート２（５ｍｇ／ｋｇ）：６日目に０．９７ｌｏｇ_１０コピー／ｍＬ（Ｖ５）
コホート３（１０ｍｇ／ｋｇ）：１０日目に１．５８ｌｏｇ_１０コピー／ｍＬ（Ｖ６）
コホート４（２５ｍｇ／ｋｇ）：１４日目に１．６３ｌｏｇ_１０コピー／ｍＬ（Ｖ７）

ＨＩＶ−１抑制の持続期間は用量レベルと相関しており、より高用量のコホートにおける対象は、より低用量のコホートにおける対象と比較してＨＩＶ−１ウイルス量の減少のより長い持続期間を示した（図２２ａ）。最高用量のＵＢ−４２１を注入した対象（コホート４、２５ｍｇ／ｋｇ）のＨＩＶ−１ウイルス量抑制の持続期間は、最長の時間である約２８日間維持された。

要約すると、ＵＢ−４２１抗体は、５、１０および２５ｍｇ／ｋｇ用量レベルにおいて用量依存的関係で強力な抗ウイルス効果を有することが分かった。即ち、より高い割合の患者が、同程度の投与量のＴＭＢ−３５５と比較して、ＵＢ−４２１処置により血清ＨＩＶ−１ＲＮＡレベルにおいて１ｌｏｇ_１０超の減少を達成した。

図２３ａ〜図２３ｃに示すように、ＵＢ−４２１を用いる本研究からの有効性データの理論上の比較を、ＴＭＢ−３５５（ＴＮＸ−３５５として以前から知られている；Kuritzkes, D. R.ら、2004、図１）について以前に報告された有効性データに対して行った。この比較によれば、ＵＢ−４２１は、評価した対象の１００％において１０ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇの単回投与を与えるとウイルス量において１０倍の減少を達成したが、ＴＭＢ−３５５は、同じ投与量を用いた対象の８３％のみでウイルス量において１０倍の減少しか達成することができなかった。

１１．１．２．薬物動態の結果。上記列挙した薬物動態（ＰＫ）パラメータを、本研究で使用したＵＢ−４２１の各用量（１、５、１０および２５ｍｇ／ｋｇ）について評価した。表１９は、各コホート中の３人の対象からの評価したいくつかのＰＫパラメータ（Ｃ_ｍａｘ、ＡＵＣ_{（０→∞）}Ｔ_１／２およびＭＲＴ）の結果を要約したものである。この結果は、各ＰＫパラメータのデータ値と投与されたＵＢ−４２１の投与量との間に相関を示した。つまり、１ｍｇ／ｋｇから２５ｍｇ／ｋｇへのＵＢ−４２１の用量の増加は、評価したＰＫパラメータにおける増加に一致している。具体的には、Ｃ_ｍａｘは２８．６μｇ／ｍＬから４６２．５μｇ／ｍＬに増加し、ＡＵＣ_{（０→∞）}は２０１μｇ−ｈｒ／ｍＬから５１３６７μｇ−ｈｒ／ｍＬに増加し、Ｔ_１／２は１４．４時間から８５．４時間に増加し、ＭＲＴ_{（０→∞）}は２１．６時間から９７．４時間に増加した。

１１．１．３．安全性の結果。ＵＢ−４２１の安全性特徴を、身体検査、バイタルサイン、臨床化学および血液検査、ＡＥ／ＳＡＥの発生率ならびにＥＣＧによって評価した。さらなる安全性評価を与えるために、ＣＤ４＋Ｔ細胞数および抗ＵＢ−４２１抗体濃度も測定した。

重症度評価によるＴＥＡＥの全体的な発生率は、計３０回の事象について６５．０％（２０人の対象中１３人）であった。３人の対象が、重症度評価を有する６種類の処置関連ＡＥ、即ち対象Ｂ−００１−００１（１ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１を投与）における段階１（軽度）の「掻痒」および「せつ」、対象Ａ−０１５−００９（１０ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１を投与）において段階１（軽度）の「リンパ球数の増加」、「好中球数の減少」および「血小板数の減少」、ならびに対象Ｂ−０１５−００８（２５ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１を投与）における段階２（中程度）の「麻疹様発疹（rash morbilliform）」を有していると報告された。対象Ｂ−０１５−００８における麻疹様発疹の出来事は、疑わしい予期せぬ重篤な有害事象（ＳＵＳＡＲ：Suspected Unexpected Serious Adverse Reaction）であり、この対象は５日間の処置後に病院から退院させられた。１人の対象はＵＢ−４２１に関連しない別のＳＡＥ、即ち対象Ａ−０１２−００５（５ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１を投与）における痔瘻および痔核を有していると報告されたが、バイタルサインまたはＥＣＧ結果において処置関連異常は認められなかった。この処置では投与は１回のみであったため、処置の中断や用量の変更は行われなかった。

抗ＵＢ−４２１抗体は、１４日目（Ｖ７）に３人の対象（各コホート２、３および４から１人）において０．４μｇ／ｍＬのアッセイ検出限界をちょうど僅かに超えたレベルで検出された。６０日目（研究の終了）までのその後のどの来院時にも抗ＵＢ−４２１抗体は検出されなかった。関連するＡＥまたは他の身体的異常は、抗ＵＢ−４２１抗体の出現に付随していなかった。
また、ＣＤ４＋Ｔ細胞数および細胞率は、６０日間の処置期間中および処置のない経過観察期間中にも比較的安定であった。
要約すると、ＵＢ−４２１は、静脈内（ＩＶ）注入により１〜２５ｍｇ／ｋｇの用量範囲で単回用量を投与した場合、ＨＩＶ−１感染した成人に対して安全であり、かつ十分忍容性があった。

１２．結論
１〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量でＵＢ−４２１の単回静脈内注入を行うこの第Ｉ相研究では、ＵＢ−４２１がＨＩＶ−１感染した成人に対して安全であり、かつ十分に忍容性があることが実証された。ＡＥの大部分は軽度であり、研究薬剤とは無関係であった。コホート４（２５ｍｇ／ｋｇの用量）において麻疹様発疹のＳＵＳＡＲの発生が１度だけ起こったが、この発生が本研究薬剤と関係があるか否かは明らかでなかった。１４日目（Ｖ７）のみに０．４μｇ／ｍＬのアッセイ検出限界を僅かにのみ超える抗体レベルを有する３人の対象においてＵＢ−４２１に対する一過性の免疫反応が検出されたが、この抗体の出現は臨床的重要性が低いことを示唆している。本研究薬剤の薬物動態プロファイルに関して、主要なパラメータの傾向は用量レベルと相関していた。さらに、ＨＩＶ−１ウイルス量抑制の程度および持続期間は、著しくかつ明白に５、１０および２５ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１用量レベルと関連していたが、１ｍｇ／ｋｇ用量のコホートでは同じように明らかではなかった。

この治験から得られた安全性および有効性の結果の両方を考慮すると、無症状のＨＩＶ−１感染した成人の処置におけるさらなる開発のために少なくとも５ｍｇ／ｋｇの用量レベルのＵＢ−４２１が当然必要となる。

実施例１４
無症状のＨＩＶ−１感染した成人におけるＵＢ−４２１の安全性および有効性を調査するための第ＩＩａ相非盲検複数回投与用量依存性試験
１．研究目的
１．無症状のＨＩＶ−１感染した対象においてＵＢ−４２１の２種類の用量レジメンの複数回投与の安全性および忍容性を評価すること。
２．これらの対象においてＵＢ−４２１の２種類の用量レジメンの複数回投与の抗ウイルス活性の証拠を得ること。
３．最適なＵＢ−４２１の用法および用量レジメンを決定するために抗ウイルス活性および安全性プロファイルを評価すること。
（臨床試験識別番号：ＮＣＴ０１６６８０４３）

２．研究設計
これはＵＢ−４２１の反復静脈内投与による非盲検研究であった。ＨＩＶ−１に対して血清陽性であり、かつ無症状の対象を適格性についてスクリーニングした。２９人の登録された対象は、８週間の処置期間中に２種類の用量レベルの一方、即ち１０ｍｇ／ｋｇを１週間に１回（コホート１）または２５ｍｇ／ｋｇを２週間に１回（コホート２）の本研究薬剤（ＵＢ−４２１）の複数回の静脈内注入を受けた。対象を登録順に基づき研究場所および順番ごとに、この２つの研究コホートのうちの一方に割り当てた。対象を８週間の処置期間後にさらに８週間追跡調査した。この研究は１６週目に終了した。

３．組み入れ基準
対象は第ＩＩａ相試験に適格となるために、以下の基準を満たさなければならなかった。
１．無症状、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）未経験、ＨＩＶ−１血清陽性
２．ＣＤ４＋Ｔ細胞数が３５０細胞／ｍｍ^３を超えている
３．ＨＩＶ−１ウイルス量が５，０００コピー／ｍＬを超えている
４．即時の処置を必要とする活動性感染がない（ＨＩＶ−１を除く）
５．免疫調節剤または全身化学療法を使用していない
６．高活性抗レトロウイルス処置（ＨＡＡＲＴ）を必要としていない

この研究の完了後に、対象らは外来診察室において定期的監視スケジュール（抗レトロウイルス剤なし）に従ったか、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの診断および処置のための現在のガイドラインに従って、研究責任者によって必要とみなされたとき、標準処置の抗レトロウイルス療法（例えばＨＡＡＲＴ）を受けた。ＵＢ−４２１による第Ｉ相試験に登録され、かつ第ＩＩａ相試験の組み入れ基準を満たした個体は、この研究に参加することを認められた。

４．治験薬
ＵＢ−４２１（ｄＢ４Ｃ７ｍＡｂ）は１０ｍｇ／ｍＬの濃度（１０ｍＬのバイアル中１００ｍｇ）で提供された。
各登録された対象は、８週間にわたって以下の投与量レベル：１０ｍｇ／ｋｇを１週間に１回（コホート１）または２５ｍｇ／ｋｇを２週間に１回（コホート２）のうちの一方でＵＢ−４２１の複数回の静脈内注入を受けた。ＵＢ−４２１の適切な体積は、指定された用量および対象の体重に基づいていた。コホート内の各個々の対象に同等の注入体積の薬剤が注入されるように、各個々の用量の体積を無菌の生理食塩水を用いて調節した。注入の全量は、１０ｍｇ／ｋｇ用量のコホートでは約１００ｍＬ、２５ｍｇ／ｋｇ用量のコホートでは約２００ｍＬであった。各投与の注入時間は約１〜２時間であった。

５．評価基準
５．１．主要安全性および有効性評価項目
ＵＢ−４２１の以下の安全性および忍容性パラメータを１６週目（研究の終了）まで評価した。
１．身体検査（ＰＥ）
２．バイタルサイン
３．臨床化学および血液検査
４．有害事象（ＡＥ）／深刻な有害事象（ＳＡＥ）の発生率
研究期間中（Ｖ２からＶ１２まで）、ＵＢ−４２１の以下の有効性パラメータを各研究コホートについて評価した。
１．個々の最大ウイルス量減少
２．平均的な最大ウイルス量減少

５．２．副次的ウイルス学的評価項目
この研究期間（Ｖ２からＶ１２まで）中に、以下のウイルス学的反応を評価した。
１．各研究コホート内およびその間のサブグループごとに個々の最大ウイルス量減少および平均的な最大ウイルス量減少
２．５０コピー／ｍＬ未満のウイルス量を有する対象の割合
３．２００コピー／ｍＬ未満のウイルス量を有する対象の割合
４．０．５ｌｏｇ_１０コピー／ｍＬ超のウイルス量減少を有する対象の割合
５．１ｌｏｇ_１０コピー／ｍＬ超のウイルス量減少を有する対象の割合
６．コホート１およびコホート２のそれぞれについて、最後に完了した研究薬剤投与後７日目および１４日目までにウイルスリバウンドを有する対象の割合（ウイルス量における最下点からの０．５ｌｏｇ_１０超の増加）
７．抗ＵＢ−４２１抗体の血清中濃度（ＵＢ−４２１の免疫原性）
８．ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞数における変化
９．ＵＢ−４２１の薬物動態パラメータ（Ｃ_ｍａｘ、ＡＵＣ_{（０→∞）}およびＡＵＣ_{（０→last）}）

６．解析集団
包括解析（ＩＴＴ）集団：本研究薬剤の少なくとも１回の投与を受けた２９人の対象。コホート１およびコホート２のＩＴＴ集団はそれぞれ１４人の対象および１５人の対象であった。
パープロトコル（ＰＰ）集団：有効なベースラインおよび少なくとも１回の有効な処置後有効性測定値（ＨＩＶ−１ウイルス量の試験）を有し、かつ主要なプロトコル違反のない本研究薬剤の全ての投与を受けた１８人の対象。コホート１およびコホート２のＰＰ集団はそれぞれ７人の対象および１１人の対象であった。

安全性および免疫原性集団：包括解析集団に含まれる２９人の対象。
薬物動態集団：安全性および免疫原性集団内のサブセット集団に基づいていた。
安全性および免疫原性集団に対してベースラインデータおよび安全性評価項目を分析し、ＩＴＴおよびＰＰ集団の両方に対して有効性の分析を行った。薬物動態集団に対して薬物動態分析を行った。

７．研究期間の持続期間
スクリーニング期間：＜４週間
処置期間：８週間
経過観察期間：処置期間の終了後８週間
来院０は、最初のスクリーニングを表し、研究中の各来院は１週間の期間を表す。追跡調査期間は一般に１週間に１回の間隔で行った。

８．結果の要約
８．１．調査対象母集団
台湾の２箇所の研究場所において計３３人の無症状のＨＩＶ感染した成人をスクリーニングした。これらの対象のうち、２９人の対象がスクリーニング基準に合格し、この治験のために選択された。２９人全ての適格な対象は男性であった。

８．２．安全性および忍容性の結果
２９人全ての対象がこの研究中に少なくとも１回のＡＥを経験し、全部で１２８回のＡＥが生じた。そのうち、１１４回（２９人全ての対象において８９．０６％）は処置により発現した有害事象（ＴＥＡＥ）であり、１４回は（５人の対象において１０．９４％）処置前ＡＥであった。２９人の対象において深刻な有害事象（ＳＡＥ）は観察されなかった。全ての処置前ＡＥはＵＢ−４２１とは無関係であり、これらの事象はいずれもＳＡＥとはみなされなかった。報告されたＴＥＡＥの大部分（７８．９５％）は軽度であり、１７．５４％は中程度であり、３．５１％（１人の対象）は深刻であった。

最も頻繁に観察された（１０％超）ＴＥＡＥは発疹および蕁麻疹であった。有害事象以外には、血液（２２人の対象において１５４回の事象）および生化学（６人の対象において３２回の事象）臨床検査結果における異常が２２人の対象において観察された。但し、それらの変化の大部分は微小であり、臨床的な意義はなかった。この研究期間中の身体検査結果およびバイタルサインは大部分が正常であったか臨床的な意義を有しなかった。
この研究期間中にＵＢ−４２１は十分に忍容性があり、臨床試験プロトコルによって指定される８週間の処置期間の全体的な処置忍容性は７３．８４％であった。

８．３．薬力学
８．３．１．ＣＤ４^＋ＴおよびＣＤ８^＋Ｔ細胞の数。８週間の処置期間および８週間の経過観察期間後に、平均ＣＤ４^＋Ｔ細胞数はベースラインから５５．１０±１１７．９７細胞／ｍｍ^３で僅かに減少し、平均ＣＤ８^＋Ｔ細胞数はベースラインから１９３．３１±４５９．３４細胞／ｍｍ^３で増加した。コホート１の対象の代表的なＣＤ４^＋Ｔ細胞数および平均ＣＤ４Ｔ細胞数を表２２ａおよび図２４ａに示す。コホート２の対象の代表的なＣＤ４^＋Ｔ細胞数および平均ＣＤ４Ｔ細胞数を表２２ｂおよび図２４ｂに示す。

８．３．２．ＵＢ−４２１によるＣＤ４受容体の被覆。蛍光結合のＵＢ−４２１を用いるフローサイトメトリーでＣＤ４受容体被覆の程度を検出した。４人の代表的な対象（コホート１から２人およびコホート２から２人）から得られた結果を、図２５ａ〜図２５ｂ及び図２５ｃ〜図２５ｄにそれぞれ示す。このアッセイの感度は０．１５μｇ／ｍＬである。１０ｍｇ／ｋｇを１週間に１回または２５ｍｇ／ｋｇを２週間に１回で反復投与した際のＵＢ−４２１の臨床的有効性は、１０μｇ／ｍＬ超（単剤療法として使用した場合のＵＢ−４２１の血清レベル）の存在下で検出不能なレベルへのウイルスの減少を示した。ＰＢＭＣＣＤ４＋細胞が完全に被覆されている（即ち、ｄＢ４Ｃ７−Ａｌｅｘａ結合率が０に近づく）限り、ウイルスリバウンドは存在しない。

両投与量レベルのＵＢ−４２１を２〜３回投与した後に、ＰＢＭＣ上のＣＤ４受容体のＵＢ−４２１による完全被覆が達成された。さらに、処置期間全体を通してＵＢ−４２１によるＣＤ４＋Ｔ細胞の完全被覆は維持された（図２５ａ〜図２５ｄ、上側のパネル）。対象の大部分において、蛍光性ｄＢ４Ｃ７ｍＡｂ（ｄＢ４Ｃ７−Ａｌｅｘａ）の結合により測定されるように、ＵＢ−４２１のＣＤ４受容体への結合は減少し、最後のＵＢ−４２１注入後３週間以内にベースライン値に戻った。

この研究中に、対象の血清中に存在するＵＢ−４２１の濃度を評価して、完全なＣＤ４被覆およびＨＩＶ−１ウイルス抑制を達成するのに十分なＵＢ−４２１の血清中濃度を測定した。得られたデータによれば、ＵＢ−４２１の血清中濃度が１０μｇ／ｍＬ超で維持される限り、ＵＢ−４２１によるＣＤ４＋Ｔ細胞の一定の完全被覆およびＨＩＶ−１ウイルス抑制が達成された（図２５ａ〜図２５ｄ、下側のパネル）。

８．４．薬物動態
コホート１で観察された平均ＡＵＣは、１７３００±１００００μｇ×ｈｒ／ｍＬ（来院１〜２）から２３９００±１０７００μｇ×ｈｒ／ｍＬ（来院８〜９）に増加し、次いで来院１１〜１２の際にベースラインに戻った。コホート１で観察された平均ＡＵＣ_{（０→last）}は１７１０００±７０３００μｇ×ｈｒ／ｍＬであった。
コホート２で観察された平均ＡＵＣは５６５００±１９５００μｇ×ｈｒ／ｍＬ（来院１〜３）から６１１００±２０７００μｇ×ｈｒ／ｍＬ（来院７〜９）に増加し、次いで来院１１〜１２の際にベースラインに戻った。コホート２で観察された平均ＡＵＣ_{（０→last）}は、２３９０００±７３９００μｇ×ｈｒ／ｍＬであった。

これらのデータは、ＡＵＣ_{（０→last）}によって評価した場合の平均血清中薬物濃度が、１０ｍｇ／ｋｇで１週間に１回ＵＢ−４２１注入を受けた対象（コホート１、１７１０００±７０３００μｇ×ｈｒ／ｍＬ）よりも２５ｍｇ／ｋｇで２週間に１回ＵＢ−４２１注入を受けた対象（コホート２、２３９０００±７３９００μｇ×ｈｒ／ｍＬ）において高いことを実証している。

８．５．有効性の結果
２９人のＨＩＶ−１感染した対象をこの研究に採用し、少なくとも１回の投与のＵＢ−４２１を与えた（ＩＴＴ集団）。採用された２９人の対象のうち、計１８人の対象が８週間の処置期間を完了し、本研究薬剤の全ての投与を受けた（ＰＰ集団）。この研究中に、登録された無症状のＨＩＶ−１感染した対象の個々および平均的な最大ウイルス量減少を評価することにより、ＵＢ−４２１の複数回投与の有効性を評価し、コホート１および２のＩＴＴおよびＰＰ集団の結果を表２０に要約する。

ＩＴＴまたはＰＰ集団のいずれかにおいて平均的な最大ウイルス量減少は２種類の投与量レベル間で著しく異ならないことが分かった。具体的には、ＩＴＴ集団におけるウイルス量は、コホート１では２．２７±０．６０ｌｏｇ_１０コピー／ｍＬ、コホート２では２．４５±０．４６ｌｏｇ_１０コピー／ｍＬ減少した。ＰＰ集団におけるウイルス量は、コホート１では２．７３±０．３４ｌｏｇ_１０コピー／ｍＬ、コホート２では２．４７±０．４５ｌｏｇ_１０コピー／ｍＬ減少した。

この処置期間中、全て（ｎ＝２９、１００．００％）の研究対象において、０．５ｌｏｇ_１０コピー／ｍＬ以上のウイルス量の減少が観察され、全て（ｎ＝２９、１００．００％）の研究対象において、１ｌｏｇ_１０コピー／ｍＬ以上のウイルス量の減少も観察された。

この処置期間中に得られたデータのさらなる評価から以下のことが明らかとなった。
コホート１において、ＩＴＴの８／１４人（５７．１４％）の対象およびＰＰの５／７人（７１．４３％）の対象が２００コピー／ｍＬ以下のウイルス量を有し、さらに、ＩＴＴの３／１４人（２１．４３％）の対象およびＰＰの３／７人（４２．８６％）の対象が、５０コピー／ｍＬ未満のウイルス量を有していた。

コホート２において、ＩＴＴの１０／１５人（６６．６７％）の対象およびＰＰの７／１１人（６３．６４％）の対象が２００コピー／ｍＬ以下のウイルス量を有し、ＩＴＴの３／１５人（２０．００％）の対象およびＰＰの２／１１人（１８．１８％）の対象が５０コピー／ｍＬ未満のウイルス量を有していた。

コホート１および２の対象に関する代表的なウイルス量減少データを、表２１ａ〜表２１ｃ及び図２５ａ〜図２５ｄ（上側のパネル）に示す。各コホート内、コホート間または各コホート内の亜集団の間で、ウイルス量減少を有する対象の割合において統計的に著しい差はなかった。さらに８週間の処置期間中、ウイルス量は、コホート１および２のそれぞれの対象の４３％および１８％において、現在のアッセイ検出限界（２０コピー／ｍＬ）未満のレベルまで減少した。全ての対象において、ウイルス量の減少は持続し、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＵＢ−４２１により完全に被覆された。ウイルス量は経過観察期間の終了までに両コホートにおいてベースラインレベルまで戻った。さらに、この処置期間中に研究対象のいずれにおいてもウイルスリバウンドは観察されなかった。この処置期間を通して、両コホートの患者から定量化可能な抗ＵＢ４２１抗体は検出されなかった（表２１ａ〜表２１ｃ）。

８．６．ＵＢ−４２１とＴＭＢ−３５５との比較
ＵＢ−４２１についてこの研究で得られた結果を、他の研究者によって行われたＴＭＢ−３５５（イバリズマブ、かつてのＴＮＸ−３５５）に関する同様の研究（Jacobson, J. L.ら、2009；Toma, J.ら、2011およびPace, C. S.ら、2013）で得られた結果に対して評価した。図２６ａは、ＣＤ４＋細胞の完全被覆を有するＵＢ−４２１の存在下で、ウイルス量のリバウンドなしに最大３Ｌｏｇ_１０超の優れたウイルス量の減少を示す。対照的に、ＴＭＢ−３５５で処置を受けている患者は、ＣＤ４＋細胞の完全被覆の存在下であっても、処置からたった１週間後に耐性ウイルス突然変異株の発生を示すウイルスリバウンドに直面した（図２６ｂ）。

これらの２種類の処置レジメンの比較により、図に示すように、ＨＩＶ感染対象のＵＢ−４２１による処置はＴＭＢ−３５５処置よりも確かな利点を有することが実証されている。具体的には、ＵＢ−４２１は、処置期間全体を通し、かつさらには経過観察期間に入って１週間または２週間の間に、３ｌｏｇ_１０超の最大ウイルス量減少でＨＩＶウイルス量の連続的な減少を与える。対照的に、ＴＭＢ−３５５は初回投与により一時的なウイルス量の減少および約１ｌｏｇ_１０の最大ウイルス量減少のみを与える。

また、ＴＭＢ−３５５を用いた先行研究により、血清ＴＭＢ−３５５の存在およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の完全被覆にも関わらず、処置に入って１週間後にＨＩＶウイルスリバウンドが生じることが分かった（Jacobson, J. L.ら、2009）。この結果は、ＴＭＢ−３５５（イバリズマブ）によって媒介される非競合的侵入阻害機序により、本抗体処置期間中に耐性ＨＩＶ突然変異株が発生する可能性が高まるという上記実施例４における先の予測と一致している。実際に、ウイルス耐性突然変異株は、ウイルス量の減少のためにＴＭＢ−３５５処置を受けている患者のｇｐ１２０のＶ５領域において同定された突然変異により発見された（Toma, J.ら、2011；Pace, C. S.ら、2013）。

９．結論
無症状のＨＩＶ−１感染した対象におけるＵＢ−４２１による８週間の処置は、十分に忍容性があることが分かった。さらに、両コホート１および２の個々の対象の代表的なＣＤ４＋Ｔ細胞数（表２２ａおよび表２２ｂ）ならびに平均ＣＤ４Ｔ細胞数（図２４ａおよび図２４ｂ）はそれぞれ、監視した２ヶ月の期間を通して安定なままであった。

さらに重要なことに、ＵＢ−４２１による処置では、全ての対象において著しいウイルス量の減少が生じた（処置した対象の１００％が１ｌｏｇ_１０コピー／ｍＬ以上の最大減少で応答した。両レジメン、即ち１０ｍｇ／ｋｇを１週間に１回（コホート１）および２５ｍｇ／ｋｇを２週間に１回（コホート２）の注入はウイルス量の減少における同様の有効性を示した。ＩＴＴ集団における平均最大ウイルス減少は、コホート１では２．２７±０．６０ｌｏｇ_１０コピー／ｍＬ、コホート２では２．４５±０．４６ｌｏｇ_１０コピー／ｍＬに達した）。ＵＢ−４２１により観察されたウイルス減少の有効性は、これまで試験したどの他の小分子抗ＨＩＶ剤よりも優れている。

ＵＢ−４２１のこの慎重に実施された複数回投与第ＩＩａ相試験の臨床試験結果により、この処置期間中にウイルスリバウンドなしに、高い忍容性、安全性および単剤療法としてのウイルス量の減少における前例がない程の有効性が実証された。この研究で得られた結果は予期しないものであり、ＣＤ４のドメイン１に結合する抗ＣＤ４モノクローナル抗体が主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ媒介性免疫機能による干渉により免疫抑制性であり、かつそのような療法はＨＩＶ疾患の処置には適していないという当該分野で長年抱かれていた疑いに矛盾するものである（Jacobson, J. L.ら、2009）。これらの結果は、ＵＢ−４２１を直交するＨＡＡＲＴおよび／またはＨＤＡＣｉなどの他のＨＩＶリザーバー活性化剤と併用するさらなるＨＩＶ療法によりＨＩＶ感染の機能的治癒を達成することができることもさらに示唆している。

実施例１５
ＨＩＶ−１感染した成人における抗レトロウイルス療法の代替法としてのＵＢ−４２１単剤療法を用いる処置法
図２７は、抗レトロウイルス療法の代替法としてのＵＢ−４２１単剤療法を用いる各種ＨＩＶ患者集団のための処置法を示す。詳細な目的およびプロトコルについて以下に説明する。

１．適用される患者集団
安定な高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）によりウイルス抑制を有するＨＩＶ−１血清陽性対象は、そのような処置に適格である。
適格患者は、最初の４ヶ月間はＩＶまたはＳＣ経路のいずれかにより投与されるＵＢ−４２１を受け、次いでＨＡＡＲＴ処置の別のサイクルを受ける。ＵＢ−４２１およびＨＡＡＲＴ処置の両方を中止した際にウイルスリバウンドがもはや観察されず、それによりＨＩＶ感染の機能的治癒が生じるまで、「ＨＡＡＲＴ−ＵＢ−４２１」交互処置サイクルを何回か繰り返すことができる。

より具体的には、これらの対象は、本研究薬剤（ＵＢ−４２１）の複数回の静脈内注入を２種類の用量レベル、即ち１０ｍｇ／ｋｇを１週間に１回または２５ｍｇ／ｋｇを２週間に１回のうちの一方をそれぞれ８週間および１６週間の処置期間にわたって受ける。ＨＡＡＲＴレジメンは最初のＵＢ−４２１注入の前日に中止される。ＵＢ−４２１の投与前に、注入反応を予防するために研究責任者によって判断されるステロイドおよび抗ヒスタミン剤などの予防薬（前投薬）を対象に与える。最後の予定されたＵＢ−４２１投与を完了した後、全ての対象は同日に、元の処置または他の適当なウイルス感受性抗レトロウイルス療法を再開する。ＨＡＡＲＴレジメンの使用は研究責任者によって判断される。全ての患者のウイルス量およびＣＤ４細胞数は、この処置期間中および処置期間の終了後６ヶ月間監視される。

２．組み入れ基準
以下の基準を全て満たしたとき、対象をこの処置法に組み入れることができる。
１．ＨＩＶ−１血清陽性；
２．年齢２０歳以上；
３．少なくとも２種類のヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）＋非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、インテグラーゼ阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤として定められたＨＡＡＲＴ処置を少なくとも２年間受けたことがあり、この処置が進行中であり、かつ本研究への参加前の１年以内に薬剤を変更していない；
４．スクリーニング来院前の１年以内に、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が５００細胞／ｍｍ^３以上またはＣＤ４割合が２８％以上という２種類の測定値を有する；
５．スクリーニング来院前の４週間以内またはスクリーニング来院時に得られたＣＤ４＋Ｔ細胞数が５００細胞／ｍｍ^３以上である；
６．ＨＩＶ−１血漿ＲＮＡがスクリーニング来院前の少なくとも１年間は検出不能なままであり、１年につき少なくとも２回のウイルス量測定を行い、このウイルス量もスクリーニング来院前の４週間以内またはスクリーニング来院時に検出不能なままである（但し、スクリーニング来院の４週間より前の検出可能なＨＩＶ血漿ＲＮＡの１回の発現は参加を除外するものではない）。

３．除外基準
対象は以下の理由のいずれかによりこの処置法から除外される。
１．即時の処置を必要とするあらゆる活動性感染（ＨＩＶを除く）；
２．ＨＩＶ感染の米国疾病管理予防センター（ＣＤＣ）の分類体系によるカテゴリーＢおよびカテゴリーＣの条件に該当するあらゆる以前に診断されたか活動性のＡＩＤＳ指標疾患；
３．体重が８０ｋｇ超；
４．スクリーニング前の１２週間以内のあらゆる立証されたＣＤ４＋Ｔ細胞数が２５０細胞／ｍｍ^３未満またはＣＤ４＋Ｔ細胞率が１４％以下；
５．ＵＢ−４２１の第Ｉ相または第ＩＩａ相試験のいずれかに以前に登録されたか抗ＵＢ−４２１抗体の存在のあらゆる履歴；
６．研究薬剤ＵＢ−４２１の初回投与前１２週間以内のモノクローナル抗体に対するあらゆる以前の曝露；
７．研究者の見解においてスクリーニング、病歴および／または身体検査から対象を本研究への参加から除外すべきと判断される精神医学上および行動上の問題を含む、あらゆる重大な疾患（ＨＩＶ−１感染以外）または臨床的に有意な所見；
８．本研究薬剤の初回投与前８週間以内のあらゆるワクチン接種；
９．本研究薬剤の初回投与前１２週間以内のあらゆる免疫調節療法（インターフェロンを含む）、全身化学療法；
１０．余命１２ヶ月未満；
１１．本研究薬剤の初回投与前１２週間以内のあらゆる違法な静脈内薬物；
１２．ウイルス学的処置不成功によるＨＡＡＲＴレジメンの２回以上の変更およびホジキンリンパ腫またはカポジ肉腫の既往歴；
１３．研究者の見解において投薬および来院スケジュールならびにプロトコル評価に従う対象の能力を妨げるあらゆる現在のアルコールまたは違法薬物の使用。

４．製剤
ＵＢ−４２１（ｄＢ４Ｃ７ｍＡｂ）製剤は１０ｍｇ／ｍＬの濃度（１０ｍＬのバイアル中１００ｍｇ）で提供される。対象は、静脈内注入による１０ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１を１週間に１回の８週間の投与または２５ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１を２週間に１回の８週間の投与のいずれかを受ける。
ＵＢ−４２１の適切な体積は、指定された用量および対象の体重に基づく。コホート内の各個々の対象に同等の注入体積の薬剤が注入されるように、各個々の用量の体積を無菌の生理食塩水を用いて調節した。注入の全量は１０ｍｇ／ｋｇ用量のコホートでは約１００ｍＬ、２５ｍｇ／ｋｇ用量のコホートでは２００ｍＬであった。各投与の注入時間は約１〜２時間であった。

実施例１６
ＨＩＶ感染の機能的治癒のためにＵＢ−４２１をＨＡＡＲＴと併用する処置法
図２８は、ＨＩＶ感染の機能的治癒のために抗体ＵＢ−４２１をＨＡＡＲＴと併用する各種ＨＩＶ患者集団のための処置法を示す。適用される患者集団：（１）処置未経験ＨＩＶ患者、（２）ＨＡＡＲＴ処置で安定したＨＩＶ患者、および（３）ＨＡＡＲＴ処置に失敗したＨＩＶ患者。

より具体的には、感染した対象におけるＨＩＶの機能的治癒のための臨床的プロトコルは、２回の完全なサイクル（１年）の間に１回の処置サイクル（６ヶ月）として最初の４ヶ月間のＩＶまたはＳＣ経路のいずれかによるＵＢ−４２１の投与およびその後の２ヶ月の休薬期間により達成することができる。これらの同じ対象は、ＵＢ−４２１処置の２回の完全なサイクルの間にＨＡＡＲＴ処置も開始および継続する。２回の完全なサイクルの終了時に、ＨＡＡＲＴおよびＵＢ−４２１の両方を中止し、もし存在すればウイルスリバウンドが生じる時間を評価する（アームＡ）。同じ１２ヶ月の期間を通してＨＡＡＲＴのみで処置した対象を含む対照群もＨＡＡＲＴ処置を中止する前に評価し、もし存在すればウイルスリバウンドが生じる時間を評価する（アームＢ）。

２サイクルのＵＢ−４２１およびＨＡＡＲＴの同時処置および処置期間後の６ヶ月の計１８ヶ月間に、全ての患者のウイルス量およびＣＤ４細胞数を監視する。
アームＡ：１０ｍｇ／ｋｇを１週間に１回または２５ｍｇ／ｋｇを２週間に１回のＵＢ−４２１投与を併用するＨＡＡＲＴ処置。アームＢ：ＨＡＡＲＴ処置のみ。

２．機能的治癒におけるＵＢ−４２１処置の設計（表２３）
ＨＡＡＲＴ剤を超えるＵＢ−４２１の潜在的な利点
１．ＵＢ−４２１はＨＩＶ−１ウイルスの細胞間伝播を阻止する
２．ＵＢ−４２１はＣＤ４のＣＤＲ２様ループを架橋して細胞を活性化させ、このようにしてＨＩＶ−１を潜伏状態から誘導および放出する

３．目標
１．ＨＩＶの無細胞および細胞間伝播の両方を阻止することにより、ＵＢ−４２１をＨＡＡＲＴと併用してＨＩＶ感染した対象に有効な処置および保護を与えること
２．ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶの機能的治癒を与えること

４．適用される患者集団
（１）ＨＡＡＲＴ処置で安定したＨＩＶ患者、（２）ＨＡＡＲＴ処置未経験ＨＩＶ患者、および（３）ＨＡＡＲＴ処置に失敗したＨＩＶ患者。

５．ＵＢ−４２１製剤
ＵＢ−４２１（ｄＢ４Ｃ７ｍＡｂ）製剤は、濃度１０ｍｇ／ｍＬ（１０ｍＬのバイアル中に１００ｍｇ）で提供される。対象は、静脈内注入により１０ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１を１週間に１回の８週間の投与または２５ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１を２週間に１回の８週間の投与のいずれかを受ける。

ＵＢ−４２１の適切な体積は、指定された用量および対象の体重に基づく。コホート内の各個々の対象に同等の注入体積の薬剤が注入されるように、各個々の用量の体積を無菌の生理食塩水を用いて調節した。注入の全量は、１０ｍｇ／ｋｇ用量のコホートでは約１００ｍＬ、２５ｍｇ／ｋｇ用量のコホートでは約２００ｍＬであった。各投与の注入時間は約１〜２時間であった。

６．割り当てられた介入
以下の介入が割り当てられる。
６．１．アームＡ：ＵＢ−４２１とＨＡＡＲＴとの併用療法
１年間続く２回の完全なサイクルの間、対象を適当なＨＡＡＲＴ療法で連続的に処置し、かつＵＢ−４２１でも処置する。ＵＢ−４２１処置の各サイクルは、４ヶ月間にわたる１０ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１の毎週の投与または２５ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１の隔週での投与およびその後のＵＢ−４２１処置のない２ヶ月間を含む。

１年間の処置期間の完了後、ＨＡＡＲＴおよびＵＢ−４２１の両療法を中止する。さらなる観察研究を行い、ＨＡＡＲＴおよびＵＢ−４２１の非存在下でウイルスリバウンドが全く認められないことによりＨＩＶ感染の機能的治癒を確信する。

６．１．アームＢ：ＨＡＡＲＴ処置のみ
対照群として、別個のセットの対象を同じ期間中にＵＢ−４２１で処置せずに適当なＨＡＡＲＴ療法で連続的に処置する。
１年間の処置期間の完了後、ＨＡＡＲＴ療法を中止し、対象をウイルスリバウンドについて監視する。

Claims

ＣＤ４のドメイン１に対する抗体を薬理学上有効量で対象に投与する工程を含む、ＨＩＶに曝露された対象の処置方法。
前記抗体がＣＤ４のドメイン１のＣＤＲ２領域に特異的に結合する請求項１記載の方法。
前記抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又はそれらの組み合わせである請求項２記載の方法。
前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である請求項２記載の方法。
前記ヒト化モノクローナル抗体が、
配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２、及び配列番号３のＣＤＲ３を有する重鎖アミノ酸配列；及び
配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、及び配列番号６のＣＤＲ３を有する軽鎖アミノ酸配列；
を有する請求項４記載の方法。
前記ヒト化モノクローナル抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖；及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖；を有する請求項４記載の方法。
前記ヒト化モノクローナル抗体が、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖；及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖；を有する請求項４記載の方法。
前記重鎖が配列番号７のアミノ酸配列を有する請求項７記載の方法。
ＨＩＶへの曝露前に前記ヒト化抗体を前記対象に投与する請求項８記載の方法。
ＨＩＶへの曝露後に前記ヒト化抗体を前記対象に投与する請求項８記載の方法。
ＨＩＶへの曝露後４８時間以内に前記ヒト化抗体を投与する請求項１０記載の方法。
前記ヒト化抗体を少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で前記対象に投与する請求項８記載の方法。
前記ヒト化抗体を前記対象に複数回投与する請求項１２記載の方法。
前記ヒト化抗体を１週間に１回または２週間に１回の間隔で前記対象に投与する請求項１３記載の方法。
抗ウイルス剤を前記対象に投与する工程をさらに有する請求項１３記載の方法。
前記抗ウイルス剤が高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）剤である請求項１５記載の方法。
前記ＨＡＡＲＴ剤が、プロテアーゼ阻害剤又は非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤と組み合わせたヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤を有する請求項１６記載の方法。
前記ヒト化抗体を前記ＨＡＡＲＴ剤と同時に投与する請求項１６記載の方法。
前記ヒト化抗体およびＨＡＡＲＴ剤を前記対象にあるサイクルに亘って投与する請求項１６記載の方法であって、前記サイクルが
ｉ）前記ヒト化抗体を４ヶ月の期間にわたって１週間に１回または２週間に１回の間隔で前記対象に投与し、その後の２ヶ月間を休薬期間とする工程；及び
ｉｉ）ｉ）における６ヶ月の期間にＨＡＡＲＴ剤を前記対象に連続的に投与する工程；
を有する、上記方法。
前記対象を２サイクルに亘って処置する請求項１８記載の方法。
ＨＩＶ感染を有する対象の処置方法であって、
ａ）ＣＤ４のドメイン１に対する抗体を薬理学上有効量；及び
ｂ）高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）剤；
を有する処置レジメンを前記対象に投与する工程を有する、上記方法。
前記抗体がＣＤ４のドメイン１のＣＤＲ２領域に特異的に結合する請求項２１記載の方法。
前記抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又はそれらの組み合わせである請求項２２記載の方法。
前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である請求項２２記載の方法。
前記ヒト化モノクローナル抗体が、
配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２、及び配列番号３のＣＤＲ３を有する重鎖アミノ酸配列；及び
配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、及び配列番号６のＣＤＲ３を有する軽鎖アミノ酸配列；
を有する請求項２４記載の方法。
前記ヒト化モノクローナル抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖；及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖；を有する請求項２４記載の方法。
前記ヒト化モノクローナル抗体が、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖；及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖；を有する請求項２４記載の方法。
前記ヒト化抗体を少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で前記対象に投与する請求項２７記載の方法。
前記処置レジメンをあるサイクルに亘って前記対象に投与する請求項２１記載の方法であって、前記サイクルが
ｉ）前記ヒト化抗体を４ヶ月の期間にわたって１週間に１回または２週間に１回の間隔で前記対象に投与し、その後の２ヶ月間を休薬期間とする工程；及び
ｉｉ）ｉ）における６ヶ月の期間にＨＡＡＲＴ剤を前記対象に連続的に投与する工程；
を有する、上記方法。
前記対象を２サイクルで処置する請求項１８記載の方法。