KR20170054478A - 경쟁적 ｈｉｖ 진입 억제를 매개하는 ｃｄ４에 대한 모노클로날 항체에 의한 hiv 감염의 치료 및 기능적 치유 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 HIV 감염의 예방, 치료, 및/또는 기능적 치유를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 CD4에 대해 지정된 모노클로날 항체, 그의 조성물, 및 이러한 조성물을 채용한 HIV 감염의 예방, 치료, 및 기능적 치유를 위한 방법에 관한 것이다.

Description

경쟁적 ＨＩＶ 진입 억제를 매개하는 ＣＤ４에 대한 모노클로날 항체에 의한 HIV 감염의 치료 및 기능적 치유 {TREATMENT AND FUNCTIONAL CURE OF HIV INFECTION BY MONOCLONAL ANTIBODIES TO CD4 MEDIATING COMPETITIVE HIV ENTRY INHIBITION}
본 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 2014년 9월 16일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/051,200의 우선권을 주장하는 PCT 국제 출원이다.
본 발명은 경쟁적 HIV 진입 억제를 매개하는 CD4에 대해 지정된 모노클로날 항체, 그의 조성물, 및 이러한 조성물을 이용한 HIV 감염의 치료 및 기능적 치유를 위한 방법에 관한 것이다.
후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS)은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)에 의해 유발되는 인간 면역계의 질환이다 (http://en.wikipedia.org/wiki/HIV/AIDS). 유전적 연구는 HIV가 19세기 후반 또는 20세기 초반 동안 서-중앙 아프리카에서 기원하였음을 나타낸다. AIDS는 1981년에 미국 질병 통제 예방 센터에 의해 처음 인식되었으며, 그의 원인인 HIV는 1980년대 초반에 확인되었다. 유행의 시작 이래로, 7000만 명이 넘는 사람들이 HIV로 감염되었으며, 3500만 명이 AIDS로 사망하였다. 전세계적으로, 2011년 말에 34.0 백만 명이 HIV를 갖고 살고 있었다 (http://www.who.int/gho/hiv/en/).
HIV 감염은 면역계의 유효성을 점진적으로 감소시키며, 개체를 기회 감염 및 종양에 감수성으로 있게 만든다. HIV는 점막 또는 혈류와, HIV를 함유하는 체액, 예컨대 혈액, 정액, 질액, 전정액, 및 모유의 직접 접촉을 통해 전파된다. 이 전파는 항문, 질 또는 구강 성교, 수혈, 오염된 피하 주사침, 임신, 출산, 모유수유 동안 어머니와 아기 사이의 교환, 또는 상기 체액 중 하나에의 기타 노출을 포함할 수 있다.
30년 동안, 과학자들은 AIDS가 휴지 T-세포라기보다는 "바이러스-생성" CD4 T-세포에 의해 야기된다고 생각해 왔다. 그러나, AIDS가 발달한 환자에서 일소되는 T-세포의 거대한 자취를 설명하기에는 이들 "바이러스 생성" 감염된 세포가 충분하지 않았다. 그린 (Greene) 및 그의 동료들은 정지 (휴지) 림프성 CD4 T-세포의 95 퍼센트가 불발성 바이러스 감염에 의해 촉발되는 피롭토시스에 의해 사멸함을 보고하였다 (Doitsh, G. et al. 2014). 이들 세포는 세포액 바이러스 DNA를 갖지만, 바이러스-복제 단위가 되는 T-세포와는 달리, 이들 "HIV-감염된" 휴지 T-세포는 염증유발 시토카인의 방출을 포함하는 프로그래밍된 세포 사멸 (피롭토시스)의 고도 염증성 형태에 의해 자기-파괴된다. 세포성 단백질인 인터페론-감마-유도성 단백질 16 (IFI16)은 바이러스 DNA를 인식하며, 피롭토시스를 매개하고 세포 팽창, 원형질막 투과화, 및 누출성 세포질 내용물을 유발하는 카스파제-1 효소 활성화를 비롯한 T-세포에서의 일련의 반응을 촉발시킨다. 휴지 T-세포는 바이러스를 살해하기 위한 공허한 시도로 자기-파괴된다. 이 공정은 궁극적으로 AIDS로의 질환 진행을 추진시키는 HIV 발병기전을 초래한다.
AIDS의 개시를 지연시키는 HIV 감염을 위한 현재 치료는 바이러스 복제를 방지하기 위한 고도 활성 항레트로바이러스 요법, 또는 HAART로 이루어진다. 현재 최적 HAART 선택안은 적어도 2가지 부류의 항레트로바이러스제 (cART)에 속하는 적어도 3종의 약물로 이루어진 조합물 (또는 "칵테일")로 이루어진다. 전형적인 처방은 2가지 뉴클레오시드 유사체 역전사효소 억제제 (NARTI 또는 NRTI) 더하기 프로테아제 억제제 또는 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제 (NNRTI) 중 어느 하나로 이루어진다.
선진국에서, 의사들은 HAART 치료의 개시를 권고할 시기를 결정하는 동안 바이러스 로드, CD4 T-세포 카운트, CD4-양성 세포 감소의 급속성 및 환자 준비성을 평가한다. 전통적으로, 무증상 환자에 대해 CD4 T-세포 카운트가 혈액의 마이크로리터 당 200 내지 250 세포에 해당하는 경우 치료가 권고되었다. 그러나, 치료를 보다 일찍 (350 세포/마이크로리터의 CD4 수준에서) 시작하는 것은 AIDS 및 사망의 위험을 유의하게 감소시킬 수 있다.
치료 없이, HIV로의 감염 후의 순 중앙값 생존 시간은 HIV 하위유형에 따라 9 내지 11년으로 추정되며; AIDS의 진단 후의 중앙값 생존율은 6 내지 19개월 범위이다. HAART 치료가 폭넓게 이용가능한 지역에서, 이 질환의 사망률은 80％ 감소되며, 이는 결국 새롭게 진단된 HIV-감염된 사람에 대한 기대 여명을 약 20년으로 상승시킨다.
HAART의 표준 목표는 환자의 삶의 질의 개선, 합병증의 감소, 및 검출 한계 미만의 HIV 바이러스혈증의 감소를 포함한다.
그러나, HAART 치료에는 몇몇 쟁점이 있다. 첫째로, 이는 HIV 감염의 환자를 치유하지 않으며, 이는 일단 치료가 중단되면 대부분 "HAART 내성" HIV의 높은 혈액 수준의 복귀를 방지하지도 않는다. 둘째로, HAART는 권태감, 피로, 설사, 두통, 구역 및 구토를 비롯한 불쾌한 부작용을 가질 수 있다. 장기간에 걸쳐, HIV-감염된 환자는 신경인지 장애, 골다공증, 신경병증, 암, 신장병증, 및 심혈관 질환을 경험할 수 있다. 보다 새로운 항레트로바이러스 약물은 보다 오래된 것들보다 더 적은 부작용을 갖지만, 일생 사용은 여전히 해를 끼칠 수 있다. 불-순응은 HIV 반동, 약물 내성, 및 질환 진행을 의미할 수 있다. 셋째로, 50％ 초과까지의 환자에 대해, HAART는 투약 불내성, 사전 무효 항레트로바이러스 요법 및 HIV의 약물-내성 균주로의 감염으로 인해, 최적에 훨씬 못 미치는 결과를 달성한다.
연구자들은 점점 더 HIV 감염을 치유하는 방법을 조사하고 있거나, 적어도 항-레트로바이러스 없이 장기간 또는 영구적 완화를 달성한다.
2가지 치유적 전략, 즉, 표 1에 나타낸 바와 같은 멸균 (즉, 박멸) 및 기능적 치유는 현재 HIV 감염에 대해 조사되고 있다. 멸균 치유 방법은 모든 HIV-감염된 세포를 제거하여, HIV를 신체로부터 완전히 제거하는 것을 목표로 하며, 바이러스 로드를 혈액의 밀리리터 당 1 카피 미만으로 감소시키는 것으로서 정의된다. 기능적 치유는 항레트로바이러스 요법의 부재 하에서 낮은 바이러스 로드를 비롯한, HIV의 완화 상태 및 장기간 제어, 및 영구적으로 또는 연장된 기간 동안 바이러스 로드를 혈액의 밀리리터 당 50 카피 미만으로 감소시키는 것에 목표를 둔다.
"멸균 치유"의 유일한 현재 예는 HIV 감염을 갖는 "베를린 환자"라는 별명의, 급성 골수성 백혈병을 가지며, CCR5 유전자의 돌연변이되거나 교대 형태를 갖는 공여자로부터 골수 이식편을 받은 남성의 사례 연구로부터이다. 치료 없이 45개월 후, 의사들은 그의 계에서 HIV를 검출할 수 없었다. 그럼에도 불구하고, CCR5 돌연변이체 공여자로의 골수 이식을 사용하는 전략은 독성 및 치료의 복잡성을 고려하면 HIV에 대한 현실적인 치유가 아니다. "기능적 치유"의 한 자연적 예는 엘리트 컨트롤러에서 발견될 수 있다. 엘리트 컨트롤러는 그의 면역계가 항레트로바이러스 약물 없이 바이러스를 자연적으로 제어할 수 있는 HIV로 감염된 개체이다. 이들 개체는 안정한 CD4 (백혈구) 세포 카운트, 낮거나 비검출가능한 바이러스 로드 및 그의 세포 중에 유의하게 더 작은 양의 "잠복성 HIV"를 성공적으로 유지한다.
치유에 대한 한 가지 주요한 장애물은 항-레트로바이러스 약물 치료 동안 긴 수명을 갖는 면역계 세포, 예컨대 기억 세포에 휴면하고 있는 "잠복성 HIV 병원소"가 있어서, 복제를 차단함으로써 활성 바이러스 감염에 대해서는 치료가 작동할 수 있지만, 잠복성 HIV에 대해서는 그렇지 않다는 사실이다. 그러나, 이러한 항-레트로바이러스 약물 치료가 중단되는 경우, 잠복성 HIV는 활성화되어, HIV 감염 과정을 재개시킬 수 있다.
이들 "문제성" 잠복성 HIV 병원소를 표적화하는 현재 전략은 단지 비감염된 세포만을 남겨 두고 감염된 세포의 살해 제거를 초래하는 HAART 치료의 존재 하에서 바이러스 발현의 활성화를 통해 잠복성 병원소를 고갈시키는 노력을 포함한다. 활성화제의 한 군은 표 2에 예시된 바와 같은 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제이다. 현재, HDAC 억제제는 기분 안정화제, 항-간질 약물 및 항암 치료로서 사용된다. 악성종양의 위험 및/또는 종양유전자의 재활성화의 향상에 대한 HDAC 억제제의 장기간 영향은 주요 관심사로 남아 있다. 이 전략은 활성 바이러스 복제가 조합 항레트로바이러스 요법 (cART)으로 완전히 억제된다면 실행가능하다. 지금까지, 이들 노력은 장기간 바이러스 억제 또는 기능적 치유를 산출하지 않았다.
HIV 감염을 갖는 사람에서 잠복성 HIV 병원소의 크기를 제한하거나 감소시키기 위한 2가지 계획은 (1) 새로운 ART 약물을 사람의 처방에 첨가하는 것에 의한 증강 치료 및 (2) 감염 직후 ART를 시작하는 것에 의한 초기 치료를 포함한다. 몇몇 연구로부터의 결과는 cART가 HIV 감염의 만성 후기 단계라기 보다는 초기 급성 단계 동안 개시되는 경우 HIV-감염된 세포의 수가 유의하게 감소함을 보여주었다.
요약하면, 강력하고 안전한 제제는 이들이 (1) 세포-유리 및 세포-대-세포 전파 방식 둘 다로 HIV 진입을 차단하여, 오래 사는 그러한 기억 T 세포를 비롯한 활성화된 또는 휴지 CD4 T-세포에서 HIV 감염의 유의한 감소를 초래하고/거나; (2) HIV를 방출하는 HIV 감염된 휴지 CD4 T-세포를 특이적으로 재활성화시켜 잠복성으로 감염된 세포에서 아폽토시스를 초래하고/거나; (3) 항원/시토카인 자극 시 HIV 감염된 휴지 CD4 T-세포 활성화/염증을 억제 (이 때, 이러한 활성화는 피롭토시스 및 정상 CD4 양성 T-세포의 대량 고갈을 유발하여 AIDS를 초래할 수 있음)할 수 있다면, 단독으로 또는 cART에 대한 보조제로서 HIV 치료에 사용하기에 매우 바람직할 것이다. 후속 cART의 부재 하에서 장기간 또는 영구적 완화를 초래하는 HIV 감염에 대한 기능적 또는 멸균 치유를 향한 합심된 노력은 중요한 전세계적 공중 보건 안건이고, 범세계적으로 활발히 탐구되고 있으며, 이용가능한 경우, HIV 감염의 치료를 혁신시킬 것이다.
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발명의 간단한 요약
본 개시내용은 HIV 감염의 예방, 치료, 및/또는 기능적 치유를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 CD4에 대해 지정된 모노클로날 항체, 그의 조성물, 및 이러한 조성물을 채용한 HIV 감염의 예방, 치료, 및 기능적 치유를 위한 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 한 측면은 CD4에 대해 지정된 항체, 그의 조성물, 및 이러한 조성물을 채용한 HIV 감염의 예방, 치료, 및/또는 기능적 치유를 위한 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 항체는 CD4의 도메인 1 중의 CDR2 영역에 특이적으로 결합한다. 개시된 항체는 세포-유리 및 세포-대-세포 계 둘 다에서 CD4의 도메인 1에의 그의 결합을 통해 강력한 경쟁적 HIV 진입 억제를 발휘한다. 개시된 항체는 또한 피롭토시스의 병원성 주기에 연루되는 CD4 양성 T 세포의 항원 유도된 T 세포 증식 및 시토카인 생성 (IL2 및 IFN-감마)을 억제한다. 개시된 항체는 또한 휴지 CD4 양성 T 세포를 재활성화시키는 능력을 갖는다. 이 특성은 휴지 T 세포 중의 HIV의 잠복성 병원소를 재활성화시켜 이들 세포를 항레트로바이러스제로의 치료에 감수성이도록 만드는 데 특히 유용하다. 이러한 CD4에 대한 고친화도 항체는 HIV의 방출을 위해 휴지 HIV 감염된 세포를 활성화시킬 수 있다. HIV 감염된 휴지 CD4+ T 세포의 재활성화는 HIV 감염된 환자에서 본 발명의 항체를 HAART와 함께 혼입하여 기능적 치유를 초래하는 조합적 치료를 가능하게 한다.
본 개시내용은 HIV 감염의 치료, 예방, 및 기능적 치유를 위한 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 제제는 CD4에 대해 지정된 항체를 함유한다. 본 개시내용은 또한 HIV 감염의 치료, 예방, 및 기능적 치유를 위한 방법에 사용될 수 있는 항바이러스제를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 단독요법으로서 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상의 용량으로 주어질 경우, 혈청 항체 수준이 10 μg/mL 초과인 한, 이러한 치료가 바이러스 로드 반동 없이 치료되는 대상체에서 바이러스 로드를 비-검출가능한 수준으로 저하시킬 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상으로 치료 나이브 HIV 환자에게 주어질 경우 환자의 기능적 치유를 초래할 HAART와의 보조 요법에서의 핵심 성분으로서 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
도 1. 경쟁적 대 비-경쟁적 HIV 진입 억제 메커니즘. 도 1a는 경쟁적 HIV 진입 억제 모델에서 얻어진 이론적 결과를 나타내는 그래프이며, 여기서, HIV는 단백질 gp120을 외피화하고, 억제제 (예를 들어, 항체 약물)는 공통 표적 표면 분자 (즉, CD4 도메인 1의 CDR2)의 동일한 부분 상에서 결합에 대해 경쟁한다. 이 모델에서, HIV 결합/진입의 100％ 억제는 억제제의 농도가 특정 역치에 도달할 경우 달성될 수 있다. 그와 비교하여, 도 1b는 비-경쟁적 HIV 진입 억제 모델에서 얻어진 이론적 결과를 나타내는 그래프이며, 여기서, HIV 및 억제제는 동일한 표적 분자 (예를 들어 TMB-355에 대해 CD4의 도메인 2) 상의 상이한 부위에 결합한다. 이 비-경쟁적 억제 모델에서, HIV 결합/진입은 억제제에 의해 감소될 수 있지만, 억제제의 농도와 무관하게 완전한 억제는 달성되지 않는다. 항체 약물에 대한 HIV의 내성은 약물 농도와 무관하게 ％ 억제에서 "플라토"로서 반영된다.
도 2. TMB-355를 사용한 11개의 계통군을 커버하는 118종의 다양한 HIV-1 Env 슈도바이러스 균주의 패널로부터의 HIV-1 진입 억제 결과 (Pace, G., et al., 2011). 각각의 바이러스에 대해, 흑색 선은 10 μg/mL 이하의 TMB-355 농도에서 처리된 경우 최대 퍼센트 억제 (MPI)를 지시하고 (좌측 Y 축); 회색 선은 상응하는 IC50을 지시한다 (우측 Y 축). TMB-355는 바이러스 균주의 92％를 ≥ 50％ 억제로 중화시키고, 단지 바이러스 균주의 31％를 ≥ 95％ 억제로 중화시킨다.
도 3. mAb B4를 사용하여 10년 기간에 걸쳐 수집된 850종 초과의 Env 위형 HIV 바이러스에 대한 패널로부터의 HIV-1 진입 억제. mAb B4는 2가지 농도 주위에 무리지어 있는, 즉, 하나는 0.01 내지 1 μg/mL 및 두번째 것은 10 μg/mL 주위에 IC50으로, 모든 850종의 Env 위형 바이러스에서의 거의 100％ 최대 퍼센트 억제 (MPI)를 갖는 HIV 진입 억제의 폭 및 효능 둘 다를 제공한다.
도 4. UB-421에서 사용된, mAb dB4C7 항체의 Fv 영역의 중쇄에 대한 전체 아미노산 서열 (서열식별번호 (SEQ ID NO): 7). 그의 모 뮤린 B4 항체로부터 유래된 상응하는 CDR1, 2 및 3 영역을 나타내는 서열은 밑줄쳐 있다 (표 4, 서열식별번호: 1 내지 3). 가변 및 불변 영역은 각각 밝은 회색 및 짙은 회색 색깔로 음영화되어 있다 (각각 서열식별번호: 11 및 12). 중쇄의 aa101에서의 아미노산 잔기 Asn (N)은 그의 Fv 영역 위치에 대해 통상적이지 않은 N-글리코실화 부위로서 기능하며, 이는 B4 항체 결합에 중요하다. 치환된 인간 IgG1 Fc 영역 서열에 대해, aa298에서의 아미노산 잔기 Asn (N)에서의 N-글리코실화 부위는 아미노산을 His (H)로 치환함으로써 (즉, 즉 N298H) 제거되었다. 이 돌연변이는 IgG 매개된 보체 의존성 세포독성 (CdC) 및 항체 B4의 존재 하에서의 CD4 양성 T 세포의 고갈을 제거하는 것으로 밝혀졌다.
도 5. UB-421에서 사용된 dB4C7 항체의 Fv 영역의 경쇄에 대한 전체 아미노산 서열 (서열식별번호: 8). 그의 모 뮤린 B4 항체로부터 유래된 상응하는 CDR1, 2 및 3 영역을 나타내는 서열은 밑줄쳐 있다 (표 4, 서열식별번호: 4 내지 6). 가변 및 불변 영역은 각각 밝은 회색 및 짙은 회색 색깔로 음영화되어 있다 (각각 서열식별번호: 13 및 14).
도 6. 각각 Met (M)로부터 Tyr (Y)로의, 즉 M253Y, Ser (S)로부터 Thr (T)로의, 즉 S255T, 및 Thr (T)로부터 Glu (E)로의, 즉 T257E 아미노산 치환으로 인한, 중쇄 위치 aa253, aa255 및 aa257의 Fc 영역에서의 보다 긴 반감기를 갖는 추가로 개량된 인간화 항체의 중쇄에 대한 전체 아미노산 서열 (서열식별번호: 9).
도 7. 도 4 및 6에서 논의된 가변 아미노산을 포괄하는 인간화 항체 mAb dB4의 중쇄에 대한 전체 아미노산 서열 (서열식별번호: 10).
도 8. 세포에 대해 항체의 3 계대 후 HPB-ALL 세포 상의 표면 CD4에 대한 mAb B4의 결합 친화도 (항체 농도) 및 결합능 (유리 및 결합된 항체)을 나타내는 그래프.
도 9. ELISA 플레이트 상에 코팅된 가용성 CD4 (sCD4) 및 p2704a 펩티드의 포획 혼합물에 대한 mAb B4 (---) 및 mAb dB4 (－)의 결합 친화도를 비교하는 그래프. 결합 친화도는 포획 혼합물에의 각각 B4-비오틴 및 dB4C7-알렉사 (Alexa)의 결합을 경쟁적으로 억제하는 mAb B4 및 mAb dB4를 사용하여 측정하였다.
도 10. HPB-ALL 세포 상의 CD4에 대한 mAb B4 (---) 및 mAb dB4 (－)의 결합 친화도를 비교하는 그래프. 결합 친화도는 FACS에 의해 HPB-ALL 세포 상의 표면 CD4에의 각각 B4-비오틴 및 dB4C7-알렉사의 결합을 경쟁적으로 억제하는 mAb B4 및 mAb dB4를 사용하여 측정하였다.
도 11. HPB-ALL 세포 상의 CD4에 대한 mAb dB4 (---) 및 gp120MN (－)의 결합 친화도를 비교하는 그래프. 결합 친화도는 FACS에 의해 HPB-ALL 세포 상의 표면 CD4에의 dB4C7-알렉사의 결합을 경쟁적으로 억제하는 mAb dB4 및 gp120MN을 사용하여 측정하였다.
도 12. PBMC CD4+ T 세포에의 mAb dB4C7의 온도-의존성 결합 (MFI)을 나타내는 그래프.
도 13. 6명의 비-감염된 개체의 혈액 샘플로부터의 비점유된 CD4 수용체 (－) 및 mAb dB4로 점유된/결합된 CD4 수용체 (---)의 평균 백분율 (±SD)을 나타내며 mAb dB4 농도의 함수로서의 그래프. 비점유된 수용체는 혈액 CD4+ T 세포의 표면 상의 유리 결합 부위에의 dB4C7-알렉사의 결합에 의해 검출된 반면, mAb dB4 점유된 수용체는 염소 항-huIgG-FITC에 의해 검출되었다.
도 14. HIV의 세포-유리 및 세포-대-세포 전파에 대한 현재 항레트로바이러스 요법 (cART) 약물 테노포비르의 효과를 나타내는 막대 그래프 (Sigal, A., et al., 2011). Y-축은 테노포비르의 존재 또는 부재 하에서의 상이한 감염원으로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터의 전파 지수를 나타낸다 (Sigal, A., et al., 2011).
도 15. 하기 자극에 의해 유도된 휴지 PBMC에서의 바이러스 재활성화 (HIV-1 p24 gag 생성에 의해 측정된 바와 같음)를 나타내는 막대 그래프: 비자극됨 (레인 1), PHA (레인 2), 불활성화된 HIV (iHIV) 용해물 (레인 3), CD4 도메인 1의 CDR2 영역에 지정된 모노클로날 항체 (레인 4), CD4 도메인의 CDR3 영역에 지정된 모노클로날 항체 (레인 5), CD4 도메인 1/2에 지정된 모노클로날 항체 (레인 6), 가용성 CD4의 존재 하에서의 iHIV (레인 7), 가용성 CD4의 존재 하에서의 CD4 도메인 1의 CDR2 영역에 지정된 모노클로날 항체 (레인 8), 가용성 CD4의 존재 하에서의 CD4 도메인 1의 CDR3 영역에 지정된 모노클로날 항체 (레인 9), 및 가용성 CD4의 존재 하에서의 CD4 도메인 1/2에 지정된 모노클로날 항체 (레인 10), 도면 설명에 나타낸 바와 같음 (문헌 [Briant L., et al., 1999]으로부터 조정됨).
도 16. ELISA에 의해 측정된 바와 같은 항-HIV RC 폴리클로날 항체에 의한 rsCD4에의 비오티닐화된-B4 결합의 경쟁적 억제를 나타내는 그래프.
도 17. PBMC 상의 표면 CD4에 대한 mAb dB4 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체의 항체 적정을 나타내는 그래프. 항체 적정은 ％ CD4 결합 대 항체 농도 (μg/mL)로서 측정하였다.
도 18a 내지 18g. 치료 나이브 HIV 양성 및 HIV 음성 대상체에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 증식시킴으로써 시토카인 IL2 및 IFN-γ의 초항원 SEB 유도된 생성의 mAb dB4 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체 억제의 분석. HIV 음성 (도 18a) 및 HIV 양성 (도 18b) 대상체에 대한 초항원 유도된 증식성 CD4+ T 세포에 의한 IL2 생성의 mAb dB4 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체 억제가 나타나 있다. HIV 음성 대상체 및 동일-연령 HIV 양성 대상체 (도 18c)에 대한 초항원 유도된 증식성 CD8+ T 세포에 의한 IL2 생성의 mAb dB4 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체 억제가 또한 나타나 있다. HIV 음성 (도 18d) 및 HIV 양성 (도 18e) 대상체에 대한 초항원 유도된 증식성 CD4+ T 세포에 의한 IFN-γ 생산의 mAb dB4 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체 억제가 나타나 있다. HIV 음성 (도 19f) 및 HIV 양성 (도 19g) 대상체에 대한 초항원 유도된 증식성 CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ 생산의 mAb dB4 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체 억제가 또한 나타나 있다.
도 19a 내지 19c. 감염후 시간 경과에 따른 PBMC 중의 HIV-1 RNA 카피/mL에 의해 측정된 바와 같은, HIV-1 1차 단리체 DH12 (HIV-1DH12)에의 mAb B4 노출전 (도 19a) 및 노출후 (도 19b)의 투여에 의한 HIV 감염으로부터의 침팬지의 보호를 나타내는 그래프. 항체 투여 없이 HIV-1DH12에 노출된 대조군 동물의 결과를 나타내는 그래프 (도 19c)가 또한 나타나 있다. 아래쪽 화살표는 mAb B4가 HIV-1DH12 챌린지 전 또는 1시간 후 중 어느 하나로 투여된 연구의 시작을 표시한다.
도 20a 및 20b. 시간 경과에 따른 HIV-1 RNA 카피/mL에 의해 측정된 바와 같은, 비처리된 및 mAb B4 처리된 HIV-1 감염된 침팬지의 HIV 바이러스 로드를 나타내는 그래프. 도 20a는 mAb B4의 3회 주입을 받는 침팬지 X356 (채워진 원)에서의 혈장 바이러스혈증의 지속기간을 사전 연구에서 mAb B4의 단일 용량을 이전에 받은 비처리된 대조군 침팬지 X084 (빈 원)와 비교한다. 도 20b는 mAb B4의 3회 주입을 받는 침팬지 X356 (채워진 원)에서의 혈장 바이러스혈증의 지속기간을 mAb B4의 이전 용량을 받지 않은 비처리된 대조군 침팬지 X259 (빈 원)와 비교한다.
도 21. 인간 (---) 및 개코원숭이 (－) CD4 양성 T 세포에 대한 mAb dB4의 결합 친화도를 비교하는 그래프.
도 22a 및 22b. 용량 상승 (1, 5, 10, 및 25 mg/kg) I상 임상 연구에서 항체 약물 UB-421 (mAb dB4C7)의 단일 투여를 받는 환자에 대한 HIV-1 RNA의 평균 Log10 변화 대 연구 일을 나타내는 그래프. 도 22a는 연구의 과정에 걸쳐 각각의 용량에 의해 나타난 바이러스 감소를 나타내는 그래프이다. 도 22b는 각각의 용량에 대한 평균 및 최대 개별적 최하점을 나타내는 그래프이다.
도 23a 내지 23c. UB-421 (mAb dB4C7)의 효능 및 TMB-355 (이전에 TNX-355로 공지됨; Kuritzkes, D.R., et al., 2004, 도 1)에 대해 이전에 보고된 효능 데이터의 이론적 비교를 나타내는 그래프. 도 23a는 5 mg/kg의 UB-421 및 3 mg/kg의 TMB-355의 단일 투여 후 관찰된 바이러스 로드 감소를 비교하는 그래프이다. 도 23b는 10 mg/kg의 UB-421 또는 TMB-355의 단일 투여 후 관찰된 바이러스 로드 감소를 비교하는 그래프이다. 도 23c는 25 mg/kg의 UB-421 또는 TMB-355의 단일 투여 후 관찰된 바이러스 로드 감소를 비교하는 그래프이다.
도 24a 및 24b. 8-주 치료 기간에 걸쳐 UB-421 (mAb dB4C7)의 10 mg/kg 매주 (도 24a) 또는 25 mg/kg 격주 (도 24b) 투여를 받는 대상체에서의 평균 PBMC CD4 T 세포 카운트/mm3을 나타내는 그래프이다. UB-421 치료된 환자에서 CD4의 도메인 2에 대해 지정된 비오티닐화된 항체에 의해 안정한 CD4 T 세포 카운트가 검출되었다.
도 25a 내지 25d. IIa상 임상 시험의 과정에 걸친, 바이러스 로드 감소에 의해 측정된 바와 같은 UB-421 치료의 임상적 효능 (상부 패널), 및 μg/mL 혈청 농도에 의해 측정된 바와 같은 UB-421의 약동학 (하부 패널)을 나타내는 그래프. 하기 대표적 환자에 대한 관련 데이터가 제공된다: UB-421의 10 mg/kg 매주 투여를 받는 환자 1-1-01 (도 25a); UB-421의 10 mg/kg 매주 투여를 받는 환자 1-1-02 (도 25b); UB-421의 25 mg/kg 격주 투여를 받는 환자 1-2-03 (도 25c); 및 UB-421의 25 mg/kg 격주 투여를 받는 환자 1-2-06 (도 25d). 세포의 완전한 코팅을 지시하는 PBMC CD4+ 세포 상의 UB-421 결합의 지속기간은 회색으로 음영화되어 있다.
도 26a 및 26b. 다른 이들 (Jacobson, J.L., et al., 2009; Toma, J., et al., 2011; 및 Pace, C.S., et al., 2013)에 의해 수행된 TMB-355 (이발리주맙, 예전에 TNX-355)에 대한 유사한 연구에서 관찰된 바이러스 로드 감소에 대한, UB-421을 사용한 IIa상 임상 시험에서 관찰된 바이러스 로드 감소의 이론적 비교를 나타내는 그래프. 도 26a는 10 mg/kg 및 25 mg/kg의 UB-421로 치료된 대상체에서 관찰된 바이러스 로드 변화를 요약하는 반면, 도 26b는 TMB-355의 동일한 투여량 수준으로 치료된 대상체에서 관찰된 바이러스 로드 변화를 요약한다.
도 27. 치료 나이브 HIV 환자 및 HAART 치료 안정화된 HIV 환자에서 HAART 요법에 대한 대체로서 UB-421 단독요법을 채용한 HIV 환자 집단에서의 치료 양식을 나타내는 개략도.
도 28. 치료 나이브 HIV 환자; HAART 치료 안정화된 HIV 환자; 및 HAART 치료에 실패한 HIV 환자에서 HIV 감염의 기능적 치유를 위한 HAART 요법과 조합으로 UB-421을 채용한 HIV 환자 집단에서의 치료 양식을 나타내는 개략도.
본 개시내용은 HIV 감염의 예방, 치료, 및/또는 기능적 치유를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 CD4에 대해 지정된 항체, 그의 제제, 및 이러한 제제를 채용한 HIV 감염의 예방, 치료, 및/또는 기능적 치유를 위한 방법에 관한 것이다.
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CD4
CD4 (분화 4의 클러스터)는 면역 세포, 예컨대 T 조력자 세포, 단핵구, 대식세포, 및 수지상 세포의 표면 상에서 발견되는 당단백질 (UniProtKB/Swiss-Prot: P01730.1)이다 (http://en.wikipedia.org/wiki/CD4). CD4는 이뮤노글로불린 상과의 구성원이며, 세포의 세포외 표면 상에 노출된 4개의 이뮤노글로불린 도메인 (D1 내지 D4)을 갖는다. CD4 도메인 D1 및 D3은 이뮤노글로불린 가변 (IgV) 도메인을 닮은 반면; D2 및 D4는 이뮤노글로불린 불변 (IgC) 도메인을 닮았다. CD4는 그의 D1 도메인을 사용하여 MHC 부류 II 분자의 β2-도메인과 상호작용한다. 따라서, 그의 표면 상에 CD4 분자를 발현하는 T 세포는 MHC II에 의해 제시되는 항원에 대해 특이적이다. CD4의 짧은 세포질/세포내 꼬리는 그것이 lck 분자와 상호작용하는 것을 허용하는 아미노산의 특수한 서열을 함유한다.
CD4의 제1 세포외 도메인은 이뮤노글로불린 쇄의 그것과 유사한 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에서 이뮤노글로불린과 상동성을 공유한다. CD4 분자의 세포외 영역의 도메인 1 및 도메인 2 둘 다는 부류 II MHC 분자에 대한 결합 부위에 기여하는 것으로 밝혀졌지만; 그러나, 도메인 1 단독은 HIV 결합 및 합포체 형성과 관련되는 것으로 밝혀졌다. 특히, HIV 외피 당단백질 gp120에 대한 결합 부위는 도메인 1의 CDR2-유사 루프에 국재화되는 것으로 밝혀졌다.
HIV-1은 CD4를 사용하여 숙주 T-세포 내로의 진입을 달성하며, gp120으로 공지된 그의 바이러스 외피 단백질을 통해 이를 달성한다. CD4에의 결합은 gp120의 입체형태의 이동을 창출하여 HIV-1이 숙주 세포 상에 발현된 케모카인 수용체 CCR5 또는 CXCR4에 결합하는 것을 허용한다. 또다른 바이러스 단백질 (gp41)의 구조적 변화 후, HIV는 융합 펩티드를 숙주 세포 내로 삽입하고, 이는 바이러스의 외막이 세포막과 융합되는 것을 허용한다. HIV 감염은 CD4를 발현하는 T 세포의 수의 점진적 감소를 초래한다.
항체
본 개시내용의 한 측면은 CD4에 대해 지정된 항체, 그의 조성물, 및 이러한 조성물을 채용한 HIV 감염의 예방, 치료, 및/또는 기능적 치유를 위한 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 항체는 무손상 항체 분자를 폭넓게 포괄하며, 이는 바람직한 활성 또는 기능을 갖는 무손상 폴리클로날, 모노클로날, 단일특이적, 다중특이적, 키메라, 탈면역화, 인간화, 인간, 영장류화, 단일-쇄, 단일-도메인, 합성 및 재조합 항체, 및 항체 단편을 포함한다.
본 개시내용의 항체는 CD4의 도메인 1을 인식한다. 특정 실시양태에서, 항체는 CD4의 도메인 1 중의 CDR2 영역에 특이적으로 결합한다.
본 개시내용의 항체는 임의의 표준 방법에 의해 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 항체는 동물 (예를 들어, 마우스, 개, 기니아 피그, 돼지, 염소, 말 등)을 재조합 CD4 단백질, 재조합 CD4 단백질의 단편, 또는 표면 상에 CD4를 발현하는 세포로 면역화함으로써 생산된다. 대안적으로, 항체는 화학적으로 합성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체는 동물을 CD4의 도메인 1의 아미노산 서열을 함유하는 펩티드로 면역화함으로써 생산된다. 예를 들어, 폴리클로날 항체는 동물을 CD4 도메인 1의 CDR2 영역의 아미노산 서열을 함유하는 펩티드 또는 펩티드의 조합으로 면역화함으로써 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 CD4의 aa39-66을 함유하며, 이는 HIV가 CD4의 이 부분에 결합하기 때문에, HIV 수용체 복합체 ("HIV RC")로도 공지되어 있다. 구체적 실시양태에서, HIV RC 펩티드는 디술피드 결합을 통해 시클릭화된다.
일부 실시양태에서, 폴리클로날 항체는 동물을 시클릭 HIV RC 펩티드로 면역화함으로써 생산된다. 본원에 사용된 용어 "항-HIV RC 폴리클로날 항체"는 CD4 도메인 1의 CDR2 영역의 aa39-66을 함유하는 시클릭 펩티드에 대해 지정된 면역 혈청을 지칭한다.
다른 실시양태에서, 항체는 동물을 CD4 양성 세포로 면역화함으로써 생산된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 항체는 BALB/c 마우스를 T-급성 림프모구성 백혈병 세포주인 무손상, 비감염된 CD4+ 인간 HPB-ALL 세포로 면역화함으로써 생성되었다. 이 항체는 왕 (Wang)에 의한 미국 특허 제5,912,176호 및 제6,090,388호 및 [Wang et al., 1999]에 의한 저널 논문에 더 상세하게 논의되어 있으며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
다른 실시양태에서, 항체는 서열 목록에 함유된 것들의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 함유한다. 본 개시내용은 서열 목록에 함유된 아미노산 서열을 함유하는 항체의 상동체 및 기능적 유사체를 포괄한다.
개시된 항체의 기능적 유사체는 원래 항체와 실질적으로 동일한 기능적 특징 (결합 인식, 결합 친화도 등)을 보유하는 서열 변이체 및 상동체를 포함한다. 예를 들어, 기능적 유사체 또는 상동체인 항체 변이체는 아미노산 위치에서의 보존적 치환; 전체 전하의 변화; 또다른 모이어티에의 공유 부착; 또는 작은 부가, 삽입, 결실 또는 보존적 치환 및/또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다다. 따라서, 항체의 기능적 유사체 및 상동체인 변이체 항체는 CD4를 인식하고 그에 결합할 수 있으며, 대상체에서의 HIV를 치료하는 데 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 항체의 기능적 유사체 또는 상동체는 일반적으로 서열 목록에 개시된 아미노산 서열을 함유하는 항체와 적어도 약 50％ 서열 동일성을 갖는다. 이 실시양태의 변형에서, 항체의 기능적 유사체 또는 상동체는 서열 목록에 개시된 아미노산 서열을 함유하는 항체와 적어도 약 50％, 약 75％, 약 80％, 약 85％, 약 90％, 약 95％, 또는 약 99％ 동일성을 갖는다.
보존적 치환은 한 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성을 갖는 또다른 아미노산 잔기로 치환되는 경우이다. 예를 들어, 비극성 (소수성) 아미노산으로는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 들 수 있고; 극성 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 들 수 있고; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 들 수 있고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산을 들 수 있다.
또다른 실시양태에서, 항체의 기능적 유사체는 N-말단, C-말단에의 아미노산 부가 또는 결실에 의해, 및/또는 서열의 중간 내로의 삽입에 의해 변형될 수 있다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 부가 또는 결실은 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 대한 것이다. 부가 또는 결실은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산 잔기의 것일 수 있다. 이러한 부가 또는 결실은 항체의 일반적인 기능적 특성을 변경시키지 않는 서열 목록에 함유된 서열에 존재하지 않는 아미노산 서열을 구성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 화학물질로 태깅되거나 표지된다. 예를 들어, 항체는 비오틴, 스페이서 아암, 프로브 (예를 들어, FITC, PE, TRITC, 딜라이트 플루오르 (DyLight Fluor), 알렉사, GFP, R-피코에리트린 (Phycoerythrin), 양자 점 등), 효소 접합체, 및 이들의 조합으로 표지될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 항체는 비오틴 또는 형광 프로브로 표지된다.
구체적 실시양태에서, 항체는 탈면역화로 공지된 공정을 통해 변형될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "탈면역화"는 일반적으로 항체의 부분을 변형하여, 그것이 동물 내에서 면역 반응을 촉발시키지 않고 동물에게 투여될 수 있도록 하는 공정을 지칭한다. 구체적으로, 탈면역화는 항체가 투여되고 있는 특정 동물에서 면역원성일 것인 항체의 아미노산 서열의 부분 (예를 들어, T-세포 에피토프)을 위치화하고 제거하는 공정을 포함한다. 이 공정은 면역 및 분자 생물학 기술의 조합 사용을 통해 달성될 수 있다. 이 공정은 이전에 기재되었다 (예를 들어, 문헌 [Jones, T.D., et al. 2009]). 항체의 탈면역화의 경우, T-세포 에피토프를 제거하는 돌연변이는 일반적으로 항체의 결합 친화도를 유의하게 감소시키지 않고 도입될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "인간화"는 그것이 인간에게 투여되는 경우 항체의 면역원성을 제거하는 방식으로, 그의 단백질 서열이 변형된 (탈면역화된) 비-인간 종에 의해 원래 생산된 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 개시된 항체는 불변 영역을 인간 불변 영역으로 대체함으로써 및/또는 포유동물 세포에서 이들 항체를 코딩하는 유전자의 발현에 의해 인간 용도를 위해 탈면역화된다.
특정 실시양태에서, 개시된 항체는 표 4에 나타낸 것들의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "mAb B4" 또는 "B4" 또는 "뮤린 B4"는 각각 서열식별번호: 1 내지 6의 중쇄 및 경쇄에 대한 CDR1, 2, 3 영역의 아미노산 서열 (표 4)을 갖는 뮤린 모노클로날 항체를 지칭한다. 이 뮤린 모노클로날 항체는 CD4를 인식하는 것으로 나타났으며, HIV 진입을 억제할 수 있다. 이 항체의 구조적 및 기능적 특징은 이어지는 실시예에서 더 상세하게 논의된다.
본원에 사용된 용어 "mAb dB4" 또는 "dB4"는 mAb B4로부터 유래된 인간 탈면역화 항체를 지칭한다. 인간 탈면역화 mAb dB4는 각각 서열식별번호: 1 내지 6의 중쇄 및 경쇄에 대한 CDR1, 2, 3 영역의 아미노산 서열을 갖는다 (표 4). 일부 실시양태에서, mAb dB4의 경쇄는 도 5에 나타낸 바와 같은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, mAb dB4의 중쇄는 도 4에 나타낸 바와 같은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는다. 변형 실시양태에서, mAb dB4의 중쇄는 도 6에 나타낸 바와 같은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 갖는다. mAb B4는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 탈면역화될 수 있다. 한 실시양태에서, mAb B4는 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제7,501,494호 및 제7,872,110호에 기재된 방법에 따라 인간 용도를 위해 탈면역화된다. 특정 실시양태에서, 인간 탈면역화 mAb dB4는 mAb B4의 뮤린 항체의 불변 영역 (CH 및 Cκ)을 제거하고, 인간 IgG1의 불변 영역으로 대체함으로써 생산된다. mAb dB4는 임의의 적합한 세포 클론에 의해 생산된 dB4를 포괄한다. 구체적 실시양태에서, mAb dB4는 클론 7에 의해 생산된다.
본원에 사용된 용어 "mAb dB4C7" 또는 "dB4C7"은 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제7,501,494호 및 제7,872,110호에 이전에 기재된 재조합 유전자 B4DIVHv1/VK1CHO#7을 함유하는 클론 7에 의해 발현된 mAb dB4를 지칭한다. C7 클론은 고품질의 mAb dB4 항체를 생산하는 것으로 나타났다. 특히, mAb B4C7은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 (도 5) 및 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 (도 4)를 갖는 인간 탈면역화 항체이다. 또한, mAb dB4C7에서 위치 298에서의 Asn (N) 잔기는 N-글리코실화 부위를 제거하기 위해 His (H)로 치환되었으며, 따라서 IgG 매개된 보체 의존성 세포독성 (CdC)을 제거하여 항체 B4의 존재 하에서의 CD4 양성 T 세포의 고갈을 방지한다.
본원에 사용된 용어 "UB-421"은 인간 대상체에게 투여되는 데 적합한 형태로 사용되는 mAb dB4C7을 지칭한다.
본 개시내용의 항체는 또한 그의 흥미롭고 독특한 기능적 특징에 의해 기재될 수 있다.
예를 들어, 개시된 항체는 CD4의 도메인 1에의 그의 결합을 통해 강력한 경쟁적 HIV 진입 억제를 발휘한다. 특히, 개시된 항체는 2가지 농도 주위에 무리지어 있는; 하나는 0.01 내지 1 μg/mL 및 두번째 것은 10 μg/mL 주위에 IC50으로, 시험된 모든 Env 위형 바이러스에서 거의 100％ 최대 퍼센트 억제 (MPI)를 갖는다. 개시된 항체의 결합 활성은 HIV gp120 외피 단백질에 의해 나타난 CD4 결합 친화도보다 약 2 log 더 높다 (즉 100X 더 긴밀한 결합). 또한, 개시된 항체의 평균 Kd는 5.6 x 10-11 M (범위: 3.1 내지 8.1 x 10-11 M)인 것으로 추정되었으며, Bmax는 세포 당 1.2 x 106 Ab (범위: 0.93 내지 1.4 x 106)인 것으로 추정되었다.
개시된 항체의 경쟁적 억제 특성은 세포-유리 및 세포-대-세포 계 둘 다에서 나타났다. 개시된 항체는 HIV-1 외피 단백질 gp120 MN에 대한 것보다 적어도 50배 더 높은 친화도로 CD4 수용체에 결합한다. 또한, 개시된 항체는 다른 시판되는 항체, 예컨대 Leu3a에 비해 더 큰 친화도 및 특이성으로 CD4에 결합한다.
개시된 항체는 또한 피롭토시스의 병원성 주기에 연루되는 CD4 양성 T 세포의 항원 유도된 T 세포 증식 및 시토카인 생산 (IL2 및 IFN-감마)을 억제할 수 있다. CD4에 대한 이러한 고친화도 모노클로날 항체는 항원, 예컨대 초항원 SEB (스타필로코쿠스 내독소 B, SEB) 유도된 CD4 양성 T 세포 활성화 및 시토카인 (예를 들어 IL2 및 IFN-γ) 생산을 억제한다. 불발성 HIV 감염을 갖는 정지 CD4+ T 세포에서 시토카인 생산을 초래하는 이러한 항원 유도된 활성화는 이들 정지 CD4+ T 세포 및 인근의 정상 휴지 CD4 양성 세포의 피롭토시스를 초래하여, CD4 + T 세포의 뒤이은 대량 고갈, 따라서 AIDS를 초래할 것이다.
개시된 항체는 또한 휴지 CD4 양성 T 세포를 재활성화시키는 능력을 갖는다. 이 특성은 휴지 T 세포에서 HIV의 잠복성 병원소를 재활성화시켜 이들 세포를 항레트로바이러스제로의 치료에 감수성이도록 만드는 데 특히 유용하다. CD4에 대한 이러한 고친화도 항체는 HIV의 방출을 위한 휴지 HIV 감염된 세포를 활성화시킬 수 있다. HIV 감염된 휴지 CD4+ T 세포의 재활성화는 본 발명의 항체를 HIV 감염된 환자에서의 HAART와 함께 혼입시켜 기능적 치유를 초래하는 조합적 치료를 허용한다.
개시된 항체의 추가적인 구조적 및 기능적 특징은 하기 실시예에서 제공된다.
제제
본 개시내용은 또한 HIV 감염의 예방, 치료, 및/또는 기능적 치유에 사용될 수 있는 제약 제제에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 제제는 CD4에 대해 지정된 항체를 함유한다. 구체적 실시양태에서, 본 개시내용은 CD4 도메인 1의 CDR2 영역 내의 또는 인근의 부위로 지정된 CD4에 대한 고친화도 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 이러한 항체의 결합 활성 (EC50)은 HIV gp120 외피 단백질에 의해 나타난 CD4 결합 친화도 (gp120에 대한 EC50=97 nM)보다 약 2 log 더 높다 (즉 100X 더 긴밀한 결합).
개시된 항체 단백질의 제약 제제는 항체 단백질을 임의적 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 제약학적으로 허용되는 담체는 용매, 분산 매질, 등장화제 등을 포함한다. 담체는 액체, 반-고체, 예를 들어 페이스트, 또는 고체 담체일 수 있다. 담체의 예로는 물, 염수 용액 또는 다른 완충제 (예컨대 인산염, 시트르산염 완충제), 오일, 알콜, 단백질 (예컨대 혈청 알부민, 젤라틴), 탄수화물 (예컨대 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 만노스, 만니톨, 소르비톨 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물), 겔, 지질, 리포좀, 수지, 다공성 매트릭스, 결합제, 충전제, 코팅, 안정화제, 보존제, 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제, 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 염 형성 반대-이온, 예컨대 소듐; 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈 (TWEEN)™, 플루로닉스 (PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 또는 이들의 조합을 들 수 있다.
제제는 1종 초과의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 제제는 1종 이상의 항체 및/또는 HIV 감염의 예방 및 치료를 위한 1종 이상의 추가의 유익한 화합물을 함유할 수 있다. 활성 성분은 임의의 편리하고 실용적인 방식으로, 예를 들어, 혼합, 용액화, 현탁, 유화, 캡슐화, 흡수 등에 의해 담체와 배합될 수 있으며, 정제, 캡슐, 분말 (동결건조된 분말 포함), 시럽, 주사, 섭취, 주입에 적합한 현탁액 등으로 제제화될 수 있다. 서방형 제제는 또한 제조될 수 있다.
특정 실시양태에서, 제약 제제는 인간 용도를 위한 mAb dB4C7을 함유한다. mAb dB4C7을 함유하는 제약 제제는 pH 6.0 내지 7.0의 시트르산염, 인산염, 트리스 (Tris), BIS-트리스 등을 비롯한 그러나 이에 제한되지 않는 적절한 완충제에서 제조될 수 있으며, 또한 부형제, 예컨대 당 (50 mM 내지 500 mM의 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 또는 이들의 혼합물), 계면활성제 (예를 들어, 0.025％ 내지 0.5％의 트윈 20 또는 트윈 80), 및/또는 다른 시약을 함유할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 제제는 20 mM 글리신 중 mAb dB4C7, 및 pH 6.5의 인산염 완충 염수 (PBS) 중 0.05％ (v/v) 트윈 (폴리소르베이트 20)을 함유한다. 또다른 구체적 실시양태에서, 10 mM 히스티딘을 포함한 피하 주사제를 비롯한 mAb dB4의 고농도 제제가 또한 특정 적용에 사용하기 위해 제조되었다.
제제는 다양한 양의 항체를 함유하도록 제조될 수 있다. 일반적으로, 대상체에게 투여하기 위한 제제는 약 0.1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL를 함유한다. 특정 실시양태에서, 제제는 약 0.5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL; 약 1.0 mg/mL 내지 약 50 mg/mL; 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL; 또는 약 10 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체를 함유할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 제제는 약 1.0 mg/mL, 약 5.0 mg/mL, 약 10.0 mg/mL, 또는 약 25.0 mg/mL의 항체를 함유한다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 HIV 감염을 갖는 환자에서의 면역요법으로서, 경쟁적 HIV 진입 억제 뿐만 아니라 CD4+ T 세포의 활성화를 나타내는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 CD4의 도메인 1의 CDR2 영역을 표적화하는 인간, 인간화 또는 키메라 모노클로날 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 10 μg/mL 초과의 혈청 항체 수준에서 치료되는 대상체에서 바이러스 로드를 비-검출가능한 수준으로 저하시킬 수 있는 단독요법으로서 기능하는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 10 μg/mL 초과의 혈청 항체 수준에서 치료되는 대상체에서 바이러스 로드를 비-검출가능한 수준으로 저하시킬 수 있고, 12-주 치료 기간 동안 안정한 CD4 T 세포 카운트를 유지한 단독요법으로서 기능하는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 단독요법으로서 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상의 용량으로 주어질 경우, 이러한 치료가 12-주 치료 기간 동안 치료되는 대상체에서 바이러스 로드를 비-검출가능한 수준으로 저하시킬 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
더 또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상으로 치료 나이브 HIV 환자에게 주어질 경우 환자의 기능적 치유를 초래할, HAART와의 보조 요법에서의 핵심 성분으로서 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
더 또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상으로 HAART 하의 안정화된 바이러스 로드를 갖는 환자에게 주어질 경우 환자의 기능적 치유를 초래할, HAART와의 보조 요법에서의 핵심 성분으로서 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
항바이러스제
본 개시내용은 또한 HIV 감염의 치료, 예방, 및 기능적 치유를 위한 방법에 사용될 수 있는 항바이러스제를 포함한다.
항바이러스제는 포유동물에서 HIV의 형성 및/또는 복제를 억제하는 데 유효한 임의의 제제 (화합물 또는 생물제제)를 포함한다. 항바이러스제의 예로는 진입/융합 억제제 (예를 들어, 마라비록, 엔푸비르티드); 뉴클레오시드 역전사효소 억제제 (NRTI) 및 뉴클레오티드 역전사효소 억제제 (NtRTI) (예를 들어, 지도부딘, 아바카비르, 라미부딘, 엠트리시타빈, 및 테노포비르); 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제 (NNRTI) (예를 들어, 네비라핀, 에파비렌즈, 에트라비린, 및 릴피비린); 인테그라제 핵 가닥 전달 억제제 또는 INSTI로도 공지된 인테그라제 억제제 (예를 들어, 랄테그라비르, 돌루테그라비르); 프로테아제 억제제 (예를 들어, 사퀴나비르, 사퀴나비르 메실레이트, 포삼프레나비르, 티프라나비르, 로피나비르, 인디나비르, 넬피나비르, 암프레나비르, 리토나비르, 다루나비르, 아타자나비르, 베비리마트, 비베콘); 바이러스 성숙 억제제; HIV 유전자의 발현을 표적화하는 제제; 핵심 숙주 세포 유전자 및 HIV 복제에 관여하는 유전자 생성물을 표적화하는 제제; 및 다른 항-HIV 제제; iRNA 제제; 안티센스 RNA; iRNA 제제 또는 안티센스 RNA를 발현하는 벡터; PNA 및 항바이러스 항체; 및 이들의 조합을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
항바이러스제는 개별적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 조합으로의 항바이러스제의 사용은 항-레트로바이러스 요법 (ART), 조합 항-레트로바이러스 요법 (cART) 또는 고도 활성 항-레트로바이러스 요법 (HAART)으로 공지되어 있다. 항-레트로바이러스 (ARV) 약물은 약물이 억제하는 레트로바이러스 생활-주기의 단계에 의해 폭넓게 분류된다. 전형적인 조합은 "기본"으로서 1 NNRTI, PI 또는 INSTI와 함께 "골격"으로서 2 NRTI를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항바이러스제의 조합, 예컨대 콤비비르 (Combivir), 트리지비르 (Trizivir), 칼레트라 (Kaletra), 엡지콤 (Epzicom), 트루바다 (Truvada), 아트리플라 (Atripla), 콤플레라 (Complera), 스트리빌드 (Stribild), 트리우메크 (Triumeq)가 사용된다.
치료, 예방, 및 기능적 치유의 방법
본 개시내용은 또한 HIV 감염의 치료, 예방, 및 기능적 치유를 위한 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 제제는 CD4에 대해 지정된 항체를 함유한다.
추가의 측면에서, 임의로 제약학적으로 허용되는 담체 중에 제공되는 본원에 개시된 항체는 대상체에서 HIV 감염의 치료, 예방, 및/또는 기능적 치유, 뿐만 아니라 HIV 전파의 예방을 위해 채용될 수 있다.
용어 HIV 감염의 "치료"는 HIV 감염에 의해 유발된 개시를 지연시키고/거나, 진행을 감속시키고/거나, 바이러스 로드를 감소시키고/거나, 증상을 개선시키도록 HIV 감염의 유효한 억제를 제공한다. 치료는 HIV에의 노출 전 및 후 둘 다를 포함한다.
용어 HIV 감염의 "예방"은 HIV 감염의 개시가 지연되는 것, 및/또는 HIV 감염의 발생 또는 가능성이 감소되거나 제거되는 것을 의미한다. 용어 HIV 전파의 "예방"은 한 개체로부터 또다른 개체로 (예를 들어, 임신, 출산 또는 분만, 또는 모유수유 동안 HIV-양성 여성으로부터 어린이에게로) HIV가 전달되는 것의 발생 또는 가능성이 감소되거나 제거되는 것을 의미한다.
용어 "대상체"는 인간, 리저스원숭이, 개코원숭이, 및 침팬지 대상체를 비롯한 임의의 영장류 대상체를 지칭한다.
HIV 감염을 치료하고/거나 예방하기 위해, 본원에 개시된 항체의 치료량이 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
용어 "치료학적 유효량"은 HIV 감염을 치료하고/거나 예방하도록 HIV 감염의 억제를 수행하는 데 요구되는 투여량을 의미한다. 항체의 투여량은 질환 상태 및 다른 임상적 인자, 예컨대 대상체의 체중 및 상태, 요법에 대한 대상체의 반응, 제제의 유형 및 투여 경로에 의존한다. 치료학적으로 유효하고 비-유해한 정확한 투여량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.
일반적으로, 성인 인간에의 투여를 위한 항체의 적합한 용량은 약 3 내지 50 mg/kg의 대상체의 체중의 범위이며, 사용되는 전형적인 초기 범위는 약 5 내지 25 mg/kg의 대상체의 체중의 범위이다. 적합한 투여량은 또한 약 5.0 mg/kg, 약 10.0 mg/kg, 또는 약 25.0 mg/kg의 환자의 체중을 포함한다.
이 발명의 인간 모노클로날 항체를 함유하는 치료 조성물은 통상적으로 정맥내로, 예를 들어 단위 용량의 주사에 의해서로서 투여된다. 단위 용량은 일반적으로 본 발명의 치료 조성물을 지칭하며, 이는 추가로 대상체에 대한 단일의 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하고, 각각의 단위는 요구되는 희석제; 즉, 담체, 또는 비히클과 함께 바람직한 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 물질의 미리 결정된 양을 함유한다.
조성물은 투여량 제제와 혼화성인 방식으로, 및 치료학적 유효량으로 투여된다. 투여되는 양은 치료되는 대상체, 활성 성분을 이용하는 대상체의 계의 능력, 요망되는 치료 효과의 정도에 의존한다. 투여되도록 요구되는 활성 성분의 정확한 양은 의사의 판단에 의존하며, 각각의 개체에 고유하다. 그러나, 전신적 적용을 위한 적합한 투여량 범위는 본원에 개시되며, 투여 경로에 의존한다. 투여를 위한 적합한 처방은 또한 가변적이지만, 초기 투여 후 1시간 이상의 간격으로 후속 주사 또는 다른 투여에 의한 반복된 용량이 전형적이다. 대안적으로, 생체내 요법에 대해 특정된 범위로 혈중 농도를 유지하는 데 충분한 연속적 정맥내 주입이 고려된다.
대상체에서 HIV 감염의 치료, 예방, 및/또는 기능적 치유를 위한 방법은 항체를 함유하는 제제의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제제는 단일 투여로 대상체에게 제공된다. 다른 실시양태에서, 제제는 다중 투여로 대상체에게 제공된다. 제제가 다중 투여로 제공되는 경우, 제제는 1일 당 1회, 주 1회, 격주 (2주마다), 또는 월 1회 투여될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 치료 일정이 주 1회인 경우, 제제는 약 5.0 mg/kg의 대상체의 체중의 투여량으로 대상체에게 투여된다. 또다른 실시양태에서, 치료 일정이 격주인 경우, 제제는 약 25.0 mg/kg의 대상체의 체중의 투여량으로 대상체에게 투여된다.
특정 실시양태에서, 모노클로날 항체를 함유하는 제제는 높은 안전성 인자를 나타내며, 대상체에게 매주 기초로 총 8주 동안 5 mg/kg 또는 25 mg/kg으로 반복적으로 주어질 경우 내약성이 양호하였다. 구체적 실시양태에서, 모노클로날 항체는 HIV 감염의 멸균 치유를 제공하기 위해 HIV 감염의 수 시간 내에 5 mg/kg으로 대상체에게 주어질 수 있다. 다른 실시양태에서, 모노클로날 항체는 HIV 감염의 기능적 치유를 제공하기 위해 HIV 감염의 수 일 내에 5 mg/kg으로 대상체에게 주어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 바이러스 로드의 감소를 위한 면역요법으로서 IV 또는 SC 경로를 통해 HIV 환자에게 투여될 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 구체적 실시양태에서, 본 발명은 HIV 감염을 갖는 환자에서의 면역요법으로서, 경쟁적 HIV 진입 억제 뿐만 아니라 CD4+ T 세포의 활성화를 나타내는 상기 기재된 결합 특징을 갖는, CD4의 도메인 1의 CDR2 영역을 표적화하는 인간, 인간화 또는 키메라 모노클로날 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
다른 특정 실시양태에서, 본 발명은 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상의 용량으로 바이러스 로드의 감소를 위한 면역요법으로서 IV 또는 SC 경로를 통해 HIV 환자에게 투여될 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 10 μg/mL 초과의 혈청 항체 수준에서 치료되는 대상체에서 바이러스 로드를 비-검출가능한 수준으로 저하시킬 수 있는 단독요법으로서 기능하는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 10 μg/mL 초과의 혈청 항체 수준에서 치료되는 대상체에서 바이러스 로드를 비-검출가능한 수준으로 저하시킬 수 있고, 12-주 치료 기간 동안 안정한 CD4 T 세포 카운트를 유지한 단독요법으로서 기능하는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 단독요법으로서 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상의 용량으로 주어질 경우, 이러한 치료가 12-주 치료 기간 동안 치료되는 대상체에서 바이러스 로드를 비-검출가능한 수준으로 저하시킬 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 단독요법으로서 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상의 용량으로 주어질 경우, 이러한 치료가 혈청 항체 수준이 10 μg/mL 초과인 한 바이러스 로드 반동 없이 치료되는 대상체에서 바이러스 로드를 비-검출가능한 수준으로 저하시킬 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상으로 치료 나이브 HIV 환자에게 주어질 경우 환자의 기능적 치유를 초래할, HAART와의 보조 요법에서 핵심 성분으로서 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상으로 HAART 하의 안정화된 바이러스 로드를 갖는 환자에게 주어질 경우 환자의 기능적 치유를 초래할, HAART와의 보조 요법에서 핵심 성분으로서 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 IV 또는 SC 경로 중 어느 하나로, 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상의 용량으로 HAART에 대한 보조 요법에서 HAART 치료에 실패한 환자에게 투여되어 추가의 바이러스 감소를 초래할 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 IV 또는 SC 경로 중 어느 하나로, HAART 대체 요법에서 핵심 성분으로서 투여됨으로써, 각각의 치료 주기가 HAART 하의 안정화된 비검출가능한 바이러스 로드를 경험하는 환자에 대해 치료 휴일로서 2 내지 4개월 동안 항-CD4 항체 치료로 시작한 후, 1 내지 4 이상의 주기에 걸쳐 HAART 치료가 이어져, 기능적 치유를 초래할 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 IV 또는 SC 경로 중 어느 하나로, HAART 대체 요법에서 핵심 성분으로서 투여됨으로써, 각각의 치료 주기가 치료 나이브 HIV 환자에 대해 2 내지 4개월 동안 항-CD4 항체 치료로 시작한 후, 1 내지 4 이상의 주기에 걸친 2 내지 4개월의 HAART 치료가 이어져, 기능적 치유를 초래할 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 IV 또는 SC 경로 중 어느 하나로, HAART 대체 요법에서 핵심 성분으로서 투여됨으로써, 각각의 치료 주기가 HAART 하의 안정화된 비검출가능한 바이러스 로드를 경험하는 환자에 대해 치료 휴일로서 2 내지 4개월 동안 항-CD4 항체 치료로 시작한 후, 매주 또는 격주 일정으로 약 5 mg/kg 이상의 용량으로 1 내지 4 이상의 주기에 걸쳐 HAART 치료가 이어져, 기능적 치유를 초래할 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 IV 또는 SC 경로 중 어느 하나로, HAART 대체 요법에서 핵심 성분으로서 투여됨으로써, 각각의 치료 주기가 치료 나이브 HIV 환자에 대해 2 내지 4개월 동안 항-CD4 항체 치료로 시작한 후, 매주 또는 격주 일정으로 약 5 mg/kg 이상의 용량으로 1 내지 4 이상의 주기에 걸쳐 2 내지 4개월의 HAART 치료가 이어져, 기능적 치유를 초래할 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상으로 치료 나이브 HIV 환자에게 주어질 경우 환자의 기능적 치유를 초래할, HAART와의 보조 요법에서 핵심 성분으로서 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상으로 HAART 하의 안정화된 바이러스 로드를 갖는 환자에게 주어질 경우 환자의 기능적 치유를 초래할, HAART와의 보조 요법에서 핵심 성분으로서 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 IV 또는 SC 경로 중 어느 하나로, 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상의 용량으로 HAART에 대한 보조 요법에서 HAART 치료에 실패한 환자에게 투여되어, 추가의 바이러스 감소를 초래할 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 IV 또는 SC 경로 중 어느 하나로, HAART와의 보조 요법에서 핵심 성분으로서, 1 내지 4 이상의 주기에 걸쳐 주기 당 2 내지 4개월 동안의 치료 기간 및 1 내지 2개월 동안의 치료 휴일로 시작하는 간헐적 방식으로, 치료 나이브 HIV 환자에게 집중 HAART 치료 방식에서 보조 요법으로서 투여되어, 환자의 기능적 치유를 초래할 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 IV 또는 SC 경로 중 어느 하나로, HAART와의 보조 요법에서 핵심 성분으로서, 1 내지 4 이상의 주기에 걸쳐 주기 당 2 내지 4개월 동안의 치료 기간 및 1 내지 2개월 동안의 치료 휴일로 시작하는 간헐적 방식으로, 매주 또는 격주 일정으로 약 5 mg/kg 이상의 용량으로, 치료 나이브 HIV 환자에게 집중 HAART 치료 방식에서 보조 요법으로서 투여되어, 환자의 기능적 치유를 초래할 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 IV 또는 SC 경로 중 어느 하나로, HAART와의 보조 요법에서 핵심 성분으로서, 1 내지 4 이상의 주기에 걸쳐 주기 당 2 내지 4개월 동안의 치료 기간 및 1 내지 2개월 동안의 치료 휴일로 시작하는 간헐적 방식으로, 매주 또는 격주 일정으로 약 5 mg/kg 이상의 용량으로, HAART 하의 안정화된 비검출가능한 바이러스 로드를 경험하는 환자에게 집중 HAART 치료 방식에서 보조 요법으로서 투여되어, 환자의 기능적 치유를 초래할 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 바이러스 로드의 감소를 위한 면역요법으로서 IV 또는 SC 경로를 통해 HIV 환자에게 투여될 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 매주 또는 격주 일정으로 약 5 mg/kg 이상의 용량으로 바이러스 로드의 감소를 위한 면역요법으로서 IV 또는 SC 경로를 통해 HIV 환자에게 투여될 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
구체적 실시양태
본 개시내용은 하기 구체적 실시양태를 포괄한다:
(1) a) 서열식별번호: 1의 뮤린 항체 B4의 중쇄의 CDR1, 서열식별번호: 2의 뮤린 항체 B4의 중쇄의 CDR2, 서열식별번호: 3의 뮤린 항체 B4의 중쇄의 CDR3, 서열식별번호: 4의 뮤린 항체 B4의 경쇄의 CDR1, 서열식별번호: 5의 뮤린 항체 B4의 경쇄의 CDR2, 및 서열식별번호: 6의 뮤린 항체 B4의 경쇄의 CDR3을 포함하는 CD4에 대한 모노클로날 항체의 약리학적 유효량을 투여하고; b) 단계 (a) 후에 대상체의 혈액의 밀리리터 당 HIV RNA 수준을 평가하는 것을 포함하는, HIV 감염에 노출된 대상체의 치료 방법.
(2) 항체의 중쇄 서열이 서열식별번호: 7을 포함하는 것인 (1)의 방법.
(3) 항체의 중쇄 서열이 서열식별번호: 9를 포함하는 것인 (1)의 방법.
(4) 항체의 경쇄 서열이 서열식별번호: 8을 포함하는 것인 (1)의 방법.
(5) 항체의 중쇄 서열이 서열식별번호: 7을 포함하고, 항체의 경쇄 서열이 서열식별번호: 8을 포함하는 것인 (1)의 방법.
(6) 항체의 중쇄 서열이 서열식별번호: 9를 포함하고, 항체의 경쇄 서열이 서열식별번호: 8을 포함하는 것인 (1)의 방법.
(7) 투여 단계 (a)가 HIV 감염에의 노출의 24시간 내에 수행되는 것인 (1)의 방법.
(8) 투여 단계 (a)가 HIV 감염에의 노출의 48일 내에 수행되는 것인 (1)의 방법.
(9) 모노클로날 항체의 약리학적 유효량이 12-주 기간 동안 매주 또는 격주 일정으로 약 10 μg/ml 이상의 혈청 수준으로 투여되는 것인 (1)의 방법.
(10) 1 카피/ml 미만의 밀리리터 당 HIV RNA 수준 값이 바이러스의 박멸로 간주되는 것인 (1)의 방법.
(11) 1 내지 50 카피/ml 미만의 밀리리터 당 HIV RNA 수준 값이 바이러스의 기능적 치유로 간주되는 것인 (1)의 방법.
(12) a) 서열식별번호: 1의 뮤린 항체 B4의 중쇄의 CDR1, 서열식별번호: 2의 뮤린 항체 B4의 중쇄의 CDR2, 서열식별번호: 3의 뮤린 항체 B4의 중쇄의 CDR3, 서열식별번호: 4의 뮤린 항체 B4의 경쇄의 CDR1, 서열식별번호: 5의 뮤린 항체 B4의 경쇄의 CDR2, 및 서열식별번호: 6의 뮤린 항체 B4의 경쇄의 CDR3을 포함하는 CD4에 대한 모노클로날 항체를 포함하는 조성물; 및 고도 활성 항레트로바이러스 요법 (HAART)의 약리학적 유효량을 투여하고; b) 단계 (a) 후에 대상체의 혈액의 밀리리터 당 HIV RNA 수준을 평가하는 것을 포함하는, HIV를 갖는 환자의 치료 방법.
(13) 항체의 중쇄 서열이 서열식별번호: 7을 포함하는 것인 (12)의 방법.
(14) 항체의 중쇄 서열이 서열식별번호: 9를 포함하는 것인 (12)의 방법.
(15) 항체의 경쇄 서열이 서열식별번호: 8을 포함하는 것인 (12)의 방법.
(16) 항체의 중쇄 서열이 서열식별번호: 7을 포함하고, 항체의 경쇄 서열이 서열식별번호: 8을 포함하는 것인 (12)의 방법.
(17) 항체의 중쇄 서열이 서열식별번호: 9를 포함하고, 항체의 경쇄 서열이 서열식별번호: 8을 포함하는 것인 (12)의 방법.
(18) 항체의 약리학적 유효량이 매주 또는 격주 기초로 10 mg/kg 이상의 용량으로 투여되는 것인 (12)의 방법.
(19) 항체가 HAART 치료 방식에서 보조 요법으로서 간헐적 방식으로 투여되는 것인 (12)의 방법.
(20) 항체가 주기 당 HAART 치료 방식에서 보조 요법으로서 약 2 내지 4개월의 기간 동안 투여된 후, HAART 치료 방식에서 1 내지 2개월 동안의 항체 치료 휴일이 이어지는 것인 (19)의 방법.
(21) 중간 방식이 1 내지 4 주기에 걸쳐 계속되는 것인 (20)의 방법.
(22) a) 환자에서 HIV 바이러스 발현 및 잠복성으로 감염된 세포의 아폽토시스를 활성화시킴으로써 HIV로 감염된 환자에서 잠복성 HIV 병원소를 감소시키고; b) HAART의 약리학적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, HIV를 갖는 환자의 치료 방법.
(23) 환자에서 HIV 바이러스 발현 및 잠복성으로 감염된 세포의 아폽토시스를 활성화시키는 것이 서열식별번호: 1의 뮤린 항체 B4의 중쇄의 CDR1, 서열식별번호: 2의 뮤린 항체 B4의 중쇄의 CDR2, 서열식별번호: 3의 뮤린 항체 B4의 중쇄의 CDR3, 서열식별번호: 4의 뮤린 항체 B4의 경쇄의 CDR1, 서열식별번호: 5의 뮤린 항체 B4의 경쇄의 CDR2, 및 서열식별번호: 6의 뮤린 항체 B4의 경쇄의 CDR3을 포함하는 CD4에 대한 모노클로날 항체의 약리학적 유효량을 환자에게 투여함으로써 수행되는 것인 (22)의 방법.
(24) 환자에서 HIV 바이러스 발현 잠복성으로 감염된 세포의 및 아폽토시스를 활성화시키는 것이 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제를 환자에게 투여함으로써 수행되는 것인 (22)의 방법.
(25) a) CD4의 CDR2-유사 도메인 영역에 대해 높은 친화도를 갖는 모노클로날 항체의 약리학적 유효량을 투여하고; b) 단계 (a) 후에 대상체의 혈액의 밀리리터 당 HIV RNA 수준을 평가하는 것을 포함하는, HIV 감염에 노출된 대상체의 치료 방법.
(26) 항체의 중쇄 서열이 서열식별번호: 7을 포함하는 것인 (25)의 방법.
(27) 항체의 중쇄 서열이 서열식별번호: 9를 포함하는 것인 (25)의 방법.
(28) 항체의 경쇄 서열이 서열식별번호: 8을 포함하는 것인 (25)의 방법.
(29) 항체의 중쇄 서열이 서열식별번호: 7을 포함하고, 항체의 경쇄 서열이 서열식별번호: 8을 포함하는 것인 (25)의 방법.
(30) 항체의 중쇄 서열이 서열식별번호: 9를 포함하고, 항체의 경쇄 서열이 서열식별번호: 8을 포함하는 것인 (25)의 방법.
(31) 투여 단계 (a)가 HIV 감염에의 노출의 24시간 내에 수행되는 것인 (25)의 방법.
(32) 투여 단계 (a)가 HIV 감염에의 노출의 48일 내에 수행되는 것인 (25)의 방법.
(33) 모노클로날 항체의 약리학적 유효량이 12-주 기간 동안 매주 또는 격주 일정으로 약 10 μg/ml 이상의 혈청 수준으로 투여되는 것인 (25)의 방법.
(34) 1 카피/ml 미만의 밀리리터 당 HIV RNA 수준 값이 바이러스의 박멸로 간주되는 것인 (25)의 방법.
(35) 1 내지 50 카피/ml 미만의 밀리리터 당 HIV RNA 수준 값이 바이러스의 기능적 치유로 간주되는 것인 (25)의 방법.
추가의 구체적 실시양태
(1) CD4의 도메인 1에 대해 지정된 항체의 약리학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, HIV에 노출된 대상체의 치료 방법.
(2) 항체가 CD4의 도메인 1 중의 CDR2 영역에 특이적으로 결합하는 것인 (1)에 따른 방법.
(3) 항체가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 또는 이들의 조합물인 (2)에 따른 방법.
(4) 항체가 인간화 모노클로날 항체인 (2)에 따른 방법.
(5) 인간화 모노클로날 항체가 서열식별번호: 1의 CDR1, 서열식별번호: 2의 CDR2, 및 서열식별번호: 3의 CDR3을 포함하는 중쇄 아미노산 서열; 및 서열식별번호: 4의 CDR1, 서열식별번호: 5의 CDR2, 및 서열식별번호: 6의 CDR3을 포함하는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인 (4)에 따른 방법.
(6) 인간화 모노클로날 항체가 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 (4)에 따른 방법.
(7) 인간화 모노클로날 항체가 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 (4)에 따른 방법.
(8) 중쇄가 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인 (7)에 따른 방법.
(9) 인간화 항체가 HIV에의 노출 전에 대상체에게 투여되는 것인 (8)에 따른 방법.
(10) 인간화 항체가 HIV에의 노출 후에 대상체에게 투여되는 것인 (8)에 따른 방법.
(11) 인간화 항체가 HIV에의 노출 후 48시간 내에 투여되는 것인 (10)에 따른 방법.
(12) 인간화 항체가 적어도 약 5 mg/kg 체중의 투여량으로 대상체에게 투여되는 것인 (8)에 따른 방법.
(13) 인간화 항체가 다수회 대상체에게 투여되는 것인 (12)에 따른 방법.
(14) 인간화 항체가 매주 또는 격주 간격으로 대상체에게 투여되는 것인 (13)에 따른 방법.
(15) 항바이러스제를 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 (13)에 따른 방법.
(16) 항바이러스제가 고도 활성 항레트로바이러스 요법 (HAART)인 (15)에 따른 방법.
(17) HAART가 뉴클레오시드 유사체 역전사효소 억제제를 프로테아제 억제제 또는 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제와 조합으로 포함하는 것인 (16)에 따른 방법.
(18) 인간화 항체가 HAART와 공동으로 투여되는 것인 (16)에 따른 방법.
(19) 인간화 항체 및 HAART가 주기의 과정에 걸쳐 대상체에게 투여되고, 여기서 주기는 i) 인간화 항체를 대상체에게 4개월의 기간 동안 매주 또는 격주 간격으로 투여한 후, 2개월 치료 휴일이 이어지고; ii) HAART를 대상체에게 (i)에서의 6-개월 기간 동안 연속적으로 투여하는 것을 포함하는 것인 (16)에 따른 방법.
(20) 대상체가 2 주기의 과정에 걸쳐 치료되는 것인 (18)에 따른 방법.
(21) a) CD4의 도메인 1에 대해 지정된 항체의 약리학적 유효량; 및 b) 고도 활성 항레트로바이러스 요법 (HAART)을 포함하는 치료 처방을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, HIV 감염을 갖는 대상체의 치료 방법.
(22) 항체가 CD4의 도메인 1 중의 CDR2 영역에 특이적으로 결합하는 것인 (21)에 따른 방법.
(23) 항체가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 또는 이들의 조합물인 (22)에 따른 방법.
(24) 항체가 인간화 모노클로날 항체인 (22)에 따른 방법.
(25) 인간화 모노클로날 항체가 서열식별번호: 1의 CDR1, 서열식별번호: 2의 CDR2, 및 서열식별번호: 3의 CDR3을 포함하는 중쇄 아미노산 서열; 및 서열식별번호: 4의 CDR1, 서열식별번호: 5의 CDR2, 및 서열식별번호: 6의 CDR3을 포함하는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인 (24)에 따른 방법.
(26) 인간화 모노클로날 항체가 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 (24)에 따른 방법.
(27) 인간화 모노클로날 항체가 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 (24)에 따른 방법.
(28) 인간화 항체가 적어도 약 5 mg/kg 체중의 투여량으로 대상체에게 투여되는 것인 (27)에 따른 방법.
(29) 치료 처방이 주기의 과정에 걸쳐 대상체에게 투여되고, 여기서 주기는 i) 인간화 항체를 대상체에게 4개월의 기간 동안 매주 또는 격주 간격으로 투여한 후, 2개월 치료 휴일이 이어지고; ii) HAART를 대상체에게 (i)에서의 6-개월 기간 동안 연속적으로 투여하는 것을 포함하는 것인 (21)에 따른 방법.
(30) 대상체가 2 주기로 치료되는 것인 (18)에 따른 방법.
추가의 구체적 실시양태
(1) CD4의 도메인 1에 대해 지정된 항체의 약리학적 유효량을 포함하는, HIV에 노출된 대상체의 치료용 조성물.
(2) 항체가 CD4의 도메인 1 중의 CDR2 영역에 특이적으로 결합하는 것인 (1)에 따른 조성물.
(3) 항체가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 또는 이들의 조합물인 (2)에 따른 조성물.
(4) 항체가 인간화 모노클로날 항체인 (2)에 따른 조성물.
(5) 인간화 모노클로날 항체가 서열식별번호: 1의 CDR1, 서열식별번호: 2의 CDR2, 및 서열식별번호: 3의 CDR3을 포함하는 중쇄 아미노산 서열; 및 서열식별번호: 4의 CDR1, 서열식별번호: 5의 CDR2, 및 서열식별번호: 6의 CDR3을 포함하는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인 (4)에 따른 조성물.
(6) 인간화 모노클로날 항체가 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 (4)에 따른 조성물.
(7) 인간화 모노클로날 항체가 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 (4)에 따른 조성물.
(8) 중쇄가 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인 (7)에 따른 조성물.
(9) 인간화 항체가 HIV에의 노출 전에 대상체에게 투여되는 것인 (8)에 따른 조성물.
(10) 인간화 항체가 HIV에의 노출 후에 대상체에게 투여되는 것인 (8)에 따른 조성물.
(11) 인간화 항체가 HIV에의 노출 후 48시간 내에 투여되는 것인 (10)에 따른 조성물.
(12) 인간화 항체가 적어도 약 5 mg/kg 체중의 투여량으로 대상체에게 투여되는 것인 (8)에 따른 조성물.
(13) 인간화 항체가 다수회 대상체에게 투여되는 것인 (12)에 따른 조성물.
(14) 인간화 항체가 매주 또는 격주 간격으로 대상체에게 투여되는 것인 (13)에 따른 조성물.
(15) 대상체가 항바이러스제로 치료되는 (또는 투여되는) 것인 (13)에 따른 조성물.
(16) 항바이러스제가 고도 활성 항레트로바이러스 요법 (HAART)인 (15)에 따른 조성물.
(17) HAART가 뉴클레오시드 유사체 역전사효소 억제제를 프로테아제 억제제 또는 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제와 조합으로 포함하는 것인 (16)에 따른 조성물.
(18) 인간화 항체가 HAART와 공동으로 투여되는 것인 (16)에 따른 조성물.
(19) 인간화 항체 및 HAART가 주기의 과정에 걸쳐 대상체에게 투여되고, 여기서 주기는 i) 인간화 항체를 대상체에게 4개월의 기간 동안 매주 또는 격주 간격으로 투여한 후, 2개월 치료 휴일이 이어지고; ii) HAART를 대상체에게 (i)에서의 6-개월 기간 동안 연속적으로 투여하는 것을 포함하는 것인 (16)에 따른 조성물.
(20) 대상체가 2 주기의 과정에 걸쳐 치료되는 것인 (18)에 따른 조성물.
(21) a) CD4의 도메인 1에 대해 지정된 항체의 약리학적 유효량; 및 b) 고도 활성 항레트로바이러스 요법 (HAART)을 포함하는, HIV 감염을 갖는 대상체의 치료용 조성물.
(22) 항체가 CD4의 도메인 1 중의 CDR2 영역에 특이적으로 결합하는 것인 (21)에 따른 조성물.
(23) 항체가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 또는 이들의 조합물인 (22)에 따른 조성물.
(24) 항체가 인간화 모노클로날 항체인 (22)에 따른 조성물.
(25) 인간화 모노클로날 항체가 서열식별번호: 1의 CDR1, 서열식별번호: 2의 CDR2, 및 서열식별번호: 3의 CDR3을 포함하는 중쇄 아미노산 서열; 및 서열식별번호: 4의 CDR1, 서열식별번호: 5의 CDR2, 및 서열식별번호: 6의 CDR3을 포함하는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인 (24)에 따른 조성물.
(26) 인간화 모노클로날 항체가 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 (24)에 따른 조성물.
(27) 인간화 모노클로날 항체가 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 (24)에 따른 조성물.
(28) 인간화 항체가 적어도 약 5 mg/kg 체중의 투여량으로 대상체에게 투여되는 것인 (27)에 따른 조성물.
(29) 치료 처방이 주기의 과정에 걸쳐 대상체에게 투여되고, 여기서 주기는 i) 인간화 항체를 대상체에게 4개월의 기간 동안 매주 또는 격주 간격으로 투여한 후, 2개월 치료 휴일이 이어지고; ii) HAART를 대상체에게 (i)에서의 6-개월 기간 동안 연속적으로 투여하는 것을 포함하는 것인 (21)에 따른 조성물.
(30) 대상체가 2 주기로 치료되는 것인 (18)에 따른 조성물.
달리 설명되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 이 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 단수 형태 ("a", "an", 및 "the")는 맥락이 명백하게 달리 지시하지 않는다면 복수 언급대상을 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은 맥락이 명백하게 달리 지시하지 않는다면 "및"을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, "A 또는 B를 포함하는"은 A, 또는 B, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 또한, 폴리펩티드에 대해 주어진 모든 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 대략적이며, 설명을 위해 제공되는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가의 방법 및 물질이 개시된 방법의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 설명된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 용어의 설명을 비롯한 본 명세서가 지배할 것이다. 또한, 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한인 것으로 의도되지 않는다.
도면 및 관련된 실시예의 하기 예시적 설명은 본원에, 특히 실시예에서 빈번히 사용된 특정 용어의 이해를 용이하게 하기 위해 제공된다. 설명은 편의상 주어지며, 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
MAB B4의 면역학적 및 기능적 특성
모노클로날 항체 B4 (mAb B4)는 T 세포 표면 상의 복합체 HIV 수용체 부위 (CD4)를 인식하는 모노클로날 항체이다. mAb B4는 HIV 공-수용체와의 CD4의 상호작용에 영향을 주며, 이를 방해할 수 있다. mAb B4는 1차 HIV-1 단리체를 선호적으로 중화시킨다.
하기 정보는 그 전문이 참조로 포함되는 2건의 미국 특허 (왕에 의한 미국 특허 제5,912,176호 및 제6,090,388호) 및 [Wang et al., 1999]에 의한 저널 논문으로부터 발췌된 데이터를 비롯한 뮤린 mAb B4의 발견 및 예비적 특징화 연구를 요약한다.
1. HPB -ALL 면역화로부터 유래된 뮤린 모노클로날 항체
mAb B4는 BALB/c 마우스를 T-급성 림프모구성 백혈병 세포주인 무손상, 비감염된 CD4+ 인간 HPB-ALL 세포로 면역화함으로써 얻었다.
세포 표면 상의 CD4에 대한 특이성을 가지며, HIV-1의 1차 단리체에 대해 폭넓은 중화 활성을 갖는, mAb B4로 나타내어지는 신규 부류의 항-CD4 항체를 얻었다.
2. mAb B4 인식 부위의 특징화
mAb B4는 재조합 가용성 CD4 (rsCD4)에 비해 세포의 표면 상의 막-결합된 CD4를 선호적으로 인식하는 것으로 밝혀졌다.
HIV의 노출 전에 막-결합된 CD4에 결합하는 mAb B4는 CD4에의 gp120 및 전체 바이러스의 후속 부착을 차단하는 것으로 나타났다. 그러나, 항체에의 노출 전에 gp120에 결합된 막-결합된 CD4는 여전히 mAb B4에 결합할 수 있다. 따라서, mAb B4는 막-결합된 CD4에의 gp120의 결합에 영향을 미칠 수 있지만, gp120은 CD4에의 mAb B4의 결합에 영향을 미치지 않는다.
mAb B4의 인식 부위는 CD4 도메인 1을 인식하는 mAb Leu3a 및 OKT4A (Chiba, Y. 1992; Jameson, B.D., et al., 1988) 및 CD4 도메인 2를 인식하는 mAb 5A8 (Burkly, et al., 1992)을 비롯한 다른 널리 연구된 항-CD4 모노클로날 항체의 그것과는 차별적이다.
3. mAb B4의 시험관내 중화 활성
뮤린 mAb B4는 통상적인 정의에 의하면 중화 항체가 아니다. 대신, mAb B4는 바이러스에 부착함으로써라기 보다는 숙주 세포 수용체를 코팅함으로써 바이러스 진입을 억제한다. HIV 감염에 대한 mAb B4의 효과는 관련 기술분야에서 사용되는 바이러스 중화 검정 (예를 들어, MT-2 마이크로플라크 중화 검정 (MT-2 Microplaque Neutralization Assay) (Sawyer et al., 1994))에 의해 용이하게 관찰될 수 있다. 뮤린 mAb B4의 중화 활성은 본 발명자들의 공동연구자인 칼 한슨 (Carl Hanson) 박사 (캘리포니아 보건당국)에 의해 평가되었으며, 또한 존 마스콜라 (John Mascola) 박사 (헨리 잭슨 파운데이션 (Henry Jackson Foundation), WRAIR), 데이비드 몬테피오리 (David Montefiori) (듀크 유니버시티 (Duke University)) 및 말콤 마틴 (Malcolm Martin) 박사 (NIAID)의 실험실에서 독립적으로 평가되었다. 1995년에서 2010까지 광범위하게 특징화된 하기 HIV 중화 특색은 mAb B4와 연관된다:
1. PBMC-성장된 1차 단리체는 T 세포주-적합화된 단리체 HIV-1IIIB 및 HIV-1MN보다 mAb B4에 의한 중화에 더 민감성이다.
2. mAb B4는 공-수용체 사용 CCR5/CXCR4 (이중) 및 CCR5의 1차 단리체에 의한 감염을 중화시킨다.
3. mAb B4는 CXCR4 공-수용체 사용의 T 세포주-적합화된 HIV-1 단리체에 대해 낮은 활성을 갖는다.
4. mAb B4는 HIV-1 하위유형 A 내지 G를 나타내는 다양한 범위의 합포체 유도 (Syncytial Inducing) (SI) 및 비-합포체 유도 (Non-Syncytial Inducing) (NSI) 1차 단리체를 90％ 종점 및 3 로그 이하의 감염력으로 중화시킨다.
5. mAb B4는 이중 공-수용체 HIV-1 외피를 갖는 HIV-2, SIV, 및 SHIV를 중화시킨다.
6. 편도 조직배양 시스템에서, mAb B4는 HIV-1 1차 단리체 VL135 (HIV-1VL135)의 감염력을 2 로그 감소시킨다. 12.5 μg/mL만큼 작은 mAb B4는 많은 항-바이러스 항체가 항체-의존성 증강을 나타내는 상태인 활성 인간 보체의 존재 하에서 100 TID50 (50％ 편도 감염 용량) 초과의 단일세포친화성 단리체 JR-CSF를 중화시킨다.
7. mAb B4는 감염후 48시간 이하에 첨가될 경우 HIV-1VL135에 대한 중화 활성을 발휘하며, 72시간 이하 후에 첨가될 경우 유의한 항-바이러스 효과를 갖는다.
a. 이는 세포로든 바이러스로든 예비-인큐베이션되면 동등하게 유효하다.
b. 이는 진입후 메커니즘에 의해서라기 보다는 감염의 초점이 새로운 세포로 확산되는 것을 차단함으로써 작용한다.
c. 이들 검정에서, mAb B4는 세포독성에 기여하지 않았다.
실시예 2
HIV-1 중화 및 내성 검정
하기 바이러스 중화 및 내성 검정은 1998년 내지 2011년의 기간 동안 칼 한슨 박사의 실험실 및 모노그램 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 (Monogram Biosciences, Inc.)에서 다양한 계통군의 다중 HIV 단리체에 대해 수행되었다. 검정의 상세한 설명을 하기에 기재한다.
1. HIV -1 중화 검정.
혈액 또는 항체 샘플을 각각의 연구에 지시된 바와 같이 수집하였다. 혈청 또는 항체 샘플을 HIV-1 단리체의 다중-계통군 패널에 대해 MT-2 마이크로플라크 검정 또는 미토겐 (PHA)-자극된 PBMC 검정 중 어느 하나를 사용하여 평가하였다.
1.1. MT -2 마이크로플라크 검정
MT-2 마이크로플라크 검정은 HIV의 합포체-유도 단리체에 제한되었다. 검정을 96-웰 플레이트에서 수행하였으며, 여기서, 웰 당 25개 이하의 작은 플라크는 마이크로플라크 상의 합포체의 형광 형광 염색에 의해 나열될 수 있었다. 이 검정에서, 감염된 MT-2 세포는 원심분리 동안 겔화되는 용융된 아가로스를 통한 원심분리에 의해 단층으로 형성되었다. 검정은 민감성인 것으로 밝혀졌으며, 많은 차수 규모에 걸쳐 확대되는 동적 범위를 갖는다. 검정은 또한 다수의 시료를 프로세싱하는 데 특별하게 유효한 것으로 밝혀졌다. 다수의 복제물 웰에 의해 가능하게 된 컴퓨터화된 통계적 분석의 사용은 다른 형식을 사용하여 달성되기 곤란하였던 품질 제어 및 표준화의 정도를 제공하는 것으로 밝혀졌다.
1.2 PBMC 검정
PBMC 검정은 PBMC에서의 p24 항원의 발현을 96-웰 미세역가 플레이트에서의 감염된 세포의 성장 후 항원-포획 ELISA에 의해 정량화하는 표준 항원-감소 검정이다. 이 검정의 이점은 모든 HIV 균주 및 단리체에의 그의 적용가능성이다.
1.3 바이러스 스톡 .
생체외 및 생체내 연구에서 중화를 위한 HIV-1 스톡은 표 3, 5, 및 6 뿐만 아니라 도 1a, 1b, 3, 22 및 23에 열거되어 있다. 하위유형 A 내지 G 및 H로부터의 1차 HIV-1 바이러스는 (a) 캘리포니아 보건당국, 바이러스 및 리케차 질환 실험실, VRDL의 샌 프란시스코 남성의 보건 연구에 참여한 동성애자 남성으로부터 단리되고; (b) HIV 단리 및 특징화를 위한 세계 보건 기구 네트워크로부터 얻어지고, (c) 미국 국방부 HIV 연구 프로그램에 의해 공급되고, (d) 국립 알레르기 및 감염성 질환 연구소 AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램으로부터 기증품으로서였다. 침팬지 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 계대된 환자 단리체인 DH-12는 또한 국립 알레르기 및 감염성 질환 연구소 AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램에 의해 공급되었다.
1.4. B4 또는 dB4 중화 활성
B4 또는 dB4 중화 활성은 항체를 함유하지 않는 대조군과 비교할 경우 지시된 백분율의 바이러스의 감소 (50 내지 95％)를 제공한 항체 농도로서 정의되었다. 50％ 및 90％ 종점에 대한 항체 농도는 항체 희석액 사이의 내삽에 의해 유도되었다.
2. 페노센스 ( PhenoSense ) HIV 진입 검정
약물 내성의 측정을 위한 페노센스 HIV 진입 검정을 모노그램 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코)에서 수행하였다.
벡터 풀로부터 생성된 재조합 바이러스를 사용하여 세포를 다양한 농도의 약물 또는 항체 (예를 들어 B4 또는 dB4)의 존재 하에서 감염시켰다. 시험 벡터의 바이러스 복제를 50％ (IC50) 또는 90％ (IC90) 억제하는 데 필요한 약물의 양을 측정하였다.
2.1 페노센스 HIV 검정에 사용된 재조합 바이러스의 생성
페노센스 HIV 검정에 사용된 재조합 바이러스를 HIV 감염의 종적 연구에서 스크리닝되고 HIV 혈청양성으로 확인된 환자로부터 수집된 샘플로부터 생성하였다. 우연한 HIV 감염을 갖는 개체에 대해, 임상 및 혈장 샘플을 HIV 바이러스 로드 및 CD4 세포 카운트를 비롯한 실험실 평가를 위해 수집하였다. 초기에 혈청음성이었지만, 대략 1년의 후속조치 후에 혈청양성이 된 개체에 대해, HIV 감염을 웨스턴 블롯 확인으로 2가지 효소 면역검정에 의해 확인하였다.
혈청전환 시에 하위유형 A, BF, C, D, E, EA, F, G, 또는 J를 가졌던 (다중 혼성화 검정을 사용한 이전의 HIV 하위유형화에 기초하여) 참가자로부터의 샘플을 표 3에 나타낸 바와 같이 재조합 바이러스의 구축을 위해 수집하였다. HIV env, pol 영역을 시험 샘플로부터 증폭시키고, 증폭된 DNA를 시험 벡터 내로 클로닝하였다. 진세크 (GeneSeq) HIV에서, 벡터 풀을 시퀀싱하여 HIV 유전자형을 결정하였다. 페노센스 HIV 검정에서, 벡터 풀로부터 생성된 재조합 바이러스를 사용하여 세포를 다양한 농도의 약물의 존재 하에서 감염시켰다.
실시예 3
모든 계통군의 HIV 단리체에 대한 모노그램 바이오사이언스 페노센스 검정에 의한 MAB B4의 중화 활성
mAb B4는 B 계통군의 모든 HIV 바이러스를 중화시키는 것으로 널리 문서화되었다. 한 연구에서, 계통군 A (n=8), BF (n=1), C (n=18), D (n+18), E (n=4), EA (n=10), F (n=8), G (n+4), J (N=2)로부터의 총 73개의 대표적 비-B 계통군 HIV 단리체, 더하기 3개의 대조군 바이러스 92HT594, JRCSF, JRFL을 재조합 바이러스 내로 제조하고, 페노센스 HIV 검정에서 mAb B4에 대한 그의 민감도에 대해 시험하였다 (표 3). 모든 재조합 바이러스는 평균 IC50=0.018 μg/mL 및 IC90=0.062 μg/mL를 갖는 전례없는 낮은 IC50 및 IC90 농도로 mAb B4에 대해 매우 민감성인 것으로 밝혀졌다. 많은 이들 HIV 단리체는 다중-약물 내성 환자로부터 유래되었음을 밝혀낸 것은 주목할 가치가 있었으며, 이는 mAb B4 또는 그의 인간 대응물은 이미 HIV 약물 내성인 환자를 치료하는 데 매우 유효할 것임을 명백하게 지시한다.
실시예 4
모노클로날 항체 B4는 경쟁적 HIV 진입 억제를 매개한다: 치료 시 HIV 내성 돌연변이체의 예방을 예측하는 예상치 않은 특색
경쟁적 억제 연구는 CD4 상의 동일한 수용체 결합 부위에 대해 HIV 외피 단백질과 경쟁함으로써, 세포 내로의 HIV의 진입을 억제하는 억제제 (예를 들어, 진입 억제제 항체)의 능력 및 효능을 평가할 수 있다. 이론적 연구에서, mAb B4는 CD4의 결합에 대해 HIV 외피 단백질 (gp120)과 경쟁한다. 도 1a는 이 연구의 예측된 결과를 나타내며, 여기서, 각각의 선은 상이한 바이러스 단리체를 나타낸다. 구체적으로, 이 이론적 연구로부터 예상된 결과는, 상이한 바이러스 단리체는 mAb B4에 대해 상이한 민감도 (IC50)를 가질 것이지만, 모든 바이러스 단리체의 진입은 mAb B4가 충분한 농도로 존재하는 한 100％ 억제될 것임을 입증한다.
그에 비해, 비경쟁적 억제 연구는 CD4에 결합하는 HIV 외피 단백질의 능력을 억제하거나 감소시킴으로써, 세포 내로의 HIV의 진입을 억제하는 억제제 (예를 들어, CD4의 상이한 부분에 결합하는 공-수용체 길항제 또는 항체)의 능력 및 효능을 평가할 수 있다. 이론적 연구에서, HIV 외피 단백질 (gp120)이 CD4에 결합하는 것을 억제하는 비경쟁적 억제제 (예를 들어, TMB-355)의 능력이 분석된다. 도 1b는 이 연구의 예측된 결과를 나타내며, 여기서, 각각의 선은 상이한 바이러스 단리체를 나타낸다. 구체적으로, 이 이론적 연구로부터 예상된 결과는 상이한 바이러스 단리체는 TMB-355에 대해 상이한 민감도 (IC50)를 가질 것이며, 바이러스 단리체의 적어도 일부 부분은 존재하는 TMB-355의 양과 무관하게 세포로 진입할 것임을 입증한다. 이 이론적 연구에 기초하여, HIV 내성은 IC50과 무관하게 최대 퍼센트 억제에서 "플라토"로서 관찰될 것임이 예상될 것이다.
TMB-355 (예전에 TNX-355, 이발리주맙으로도 지칭됨)는 리저스원숭이 및 인간 CD4의 세포외 도메인 2에 결합하여 CD4+ 세포 내로의 HIV의 결합후 진입을 방지하도록 설계된 인간화 IgG4 모노클로날 항체이다 (예를 들어, 문헌 [Burkly, LC, et al., 1992]; 및 [Kurizkes, DR, et al., 2004]). CD4 상의 TMB-355 항체 결합 부위는 HIV-1 외피 gp120의 결합에 요구되는 부위와는 별개이며, 주조직적합성 복합체 단백질과의 상호작용에 필요한 부위와 별개이다. 따라서, TMB-355는 비-경쟁적 HIV 진입 억제를 매개한다.
TMB-355는 일부 HIV-1 바이러스에 대해 강한 중화 활성을 갖는 것으로 나타났지만, 그의 억제 활성은 HIV 균주의 폭넓은 패널을 평가하는 경우 불일치한다. 도 2는 TMB-355의 MPI가 118개의 Env 위형 HIV 바이러스의 패널에 대해 (각각의 막대는 1개의 바이러스 단리체를 나타냄), 0.01 μg/mL 내지 10 μg/mL의 증가하는 IC50과 커플링하여 (우측 Y 축), 100％ 내지 15％ (좌측 Y 축)의 범위임을 나타낸다 (Song, R., et al., 2013). 분석된 모든 계통군 중에서, 계통군 A 및 E 바이러스는 비-계통군 A 및 E 바이러스보다 TMB-355에 대해 유의하게 더 감수성이었다. 또한, 바이러스 내성 돌연변이체는 바이러스 로드 감소를 위한 TMB-355 치료를 받는 환자로부터의 gp120의 V5 영역에서 확인된 돌연변이와 함께 발견되었다 (Toma, J., et al., 2011; Pace, C.S., et al., 2013). TMB-355 (이발리주맙)에 의해 입증된 비-경쟁적 억제 효과는, 바이러스 복제가 100％ 억제 미만을 갖는 단리체에 대해 일어날 것이기 때문에, 항체 치료 기간 동안 내성 HIV 돌연변이체의 발달에 대한 높은 가능성이 있을 것임을 시사한다.
대조적으로, 850개 초과의 Env 위형 HIV 바이러스의 패널로부터 10년 기간에 걸쳐 수집된 데이터는 mAb B4가 HIV 진입 억제에서 예상치 않은 폭 및 효능을 제공함을 나타낸다 (도 3). 이 데이터의 수집으로부터, mAb B4는 2가지 농도 주위에 무리지어 있는, 즉, 하나는 0.01 내지 1 μg/mL, 및 다른 하나는 10 μg/mL 주위에 IC50으로 거의 100％ MPI를 가짐을 볼 수 있다. mAb B4에 대한 HIV 진입 억제 프로파일은 IC50과 무관하게 약 100％에서 각각의 HIV 바이러스에 대한 MPI를 갖는 경쟁적 억제 메커니즘의 전형적인 특징을 갖는다. mAb B4의 현저하게 강한 경쟁적 HIV 진입 억제 특징의 관점에서, 바이러스 내성 돌연변이체는 mAb B4 치료 기간 동안 발달할 가능성이 적다. mAb B4에 의해 발휘되는 바와 같은 이러한 긴밀한 경쟁적 억제는 지금까지 시험된 임의의 다른 HIV 억제제로는 결코 관찰되지 않았다.
이 실시예로부터의 MPI 및 IC50 데이터는 다중-약물 내성 환자로부터 유래된 많은 HIV 단리체가 실시예 3에서 논의된 mAb B4에 대해 매우 민감성이었음을 나타내는 데이터와 조합되어, mAb B4 또는 그의 인간 대응물이 HAART 치료에 실패하고 있는 약물 내성 HIV 환자의 치료에 매우 유효할 것임을 시사하였다. mAb B4에 의해 매개되는 중화의 방식은 유사한 Fv 영역을 운반하는 mAb B4 또는 그의 인간 대응물 유사체로의 치료를 받는 HIV 환자에서 약물 내성 바이러스 돌연변이체의 생성을 방지할 독특한 HIV 약물을 제공한다.
실시예 5
모노클로날 항체 B4의 인간화
뮤린 항체로서, mAb B4는 인간에서 면역원성이다. 뮤린 항체의 인간화는 현재 탈면역화 기술로 공지되어 있는 공정을 통해 달성될 수 있다 (Jones, T.D., et al. 2009). mAb B4의 탈면역화는 하기에 요약된 바와 같은 린., 에스. (Lynn., S.) 및 왕, 시.와이. (Wang, C.Y.)에 의한 미국 특허 제7,501,494호 (이들 둘 다는 그 전문의 참조로 포함됨)에 상세하게 기재되어 있다.
먼저, 뮤린 항체 B4의 불변 영역 (CH 및 Cκ)을 전체적으로 제거하고, 인간 IgG1의 불변 영역 (각각 서열식별번호: 12 및 14)으로 대체한 반면, Fv 부분은 유지함으로써, 키메라 B4 항체를 제조하였다. 다음으로, 인간 용도를 위한 뮤린 mAb B4의 Fv 단편의 탈면역화를 잠재적으로 면역원성 뮤린 T 및 B-세포 에피토프의 확인 및 제거에 의해 달성하였다. T 세포 에피토프의 제거는 mAb B4의 가변 영역으로부터 이러한 에피토프의 확인 후 달성되었다. 가변 영역의 아미노산 서열을 3-차원 "펩티드 트레딩 (peptide threading)" 방법에 의해 MHC 부류 II-결합 모티프의 존재에 대해 분석하였다. 가변 영역으로부터의 B 세포 에피토프의 제거는 항체 인식을 방해하지 않는 표면 잔기의 '베니어링 (veneering)'에 의해 달성되었다. mAb B4의 탈면역화, 인간화 형태를 mAb dB4로 지칭한다.
린., 에스. 및 왕, 시.와이.에 의한 미국 특허 제7,501,494호는 IgG1이 이펙터 기능, 예컨대 표적 항원의 제거를 초래하는 보체 고정 및 항원-의존성-세포성-세포독성 (ADCC)에 중요하고, CH2 내의 비안테나리 복합체 N-연결된 탄수화물을 함유함을 논의하였다. mAb B4는 CD4 수용체 복합체에 표적화되기 때문에, 이는 보체에 결합하는 것을 담당하는 IgG1의 이펙터 기능을 통해 CD4+ 세포의 파괴 및 CD4+ 세포 기능의 면역억제를 유발할 수 있다. 따라서, IgG1의 Fc 영역에서 N-글리코실화 부위를 제거하는 것은 인간 FcR1에 결합하거나, 보체를 활성화시키거나, C1 q에 결합하는 IgG1의 능력을 폐지함으로써, IgG1 매개된 보체 의존성 세포독성 (CdC)을 제거한다. IgG1의 Fc 영역에서의 N-글리코실화 부위의 제거는 1개의 아미노산 잔기 Asn (N)를 His (H)로 치환함으로써 (즉, N298H) 달성되었다.
이 설명에서 논의된 아미노산 넘버링/위치는 이 명세서의 일부인 서열 목록에 함유된 서열에 기초한다. 상기 논의된 aa298에서의 글리코실화 부위는 천연 IgG1 분자의 aa297에서 발견되는 글리코실화 부위에 상응하며, 이는 IgG1에 대한 유럽 넘버링 체계에 따라 넘버링됨을 유념한다. 따라서, 이 출원에서 aa298은 미국 특허 제7,501,494호에서 논의된 aa297에서의 글리코실화 부위에 상응한다.
Fv 도메인의 탈면역화 mAb dB4 중쇄 (도 4) 및 경쇄 (도 5)의 CDR1, 2, 및 3 영역은 각각 서열식별번호: 1 내지 6의 아미노산 서열을 함유한다 (표 4). mAb dB4의 중쇄 및 경쇄에 대한 전장 서열을 도 4 및 5에 각각 서열식별번호: 7 및 8로서 나타낸다.
mAb dB4의 반감기는 항체의 중쇄 중의 특정 아미노산이 돌연변이된 경우 개량되는 (연장되는) 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 인간화 항체의 반감기는 위치 aa253(Met), aa255(Ser), 및 aa257(Thr)에서의 중쇄 Fc 아미노산이 각각 Tyr, Thr 및 Glu로 치환된 경우 개량되었다. 인간화 mAb dB4 항체의 개량된 중쇄에 대한 전장 서열을 도 6에 서열식별번호: 9로서 나타낸다. 따라서, 개량된 인간화 항체 mAb dB4는 서열식별번호: 8의 서열을 갖는 경쇄 및 서열식별번호: 9의 서열을 갖는 중쇄를 함유한다.
뮤린 mAb B4 및 인간화 mAb dB4의 서열 및 구조의 독특한 특색은 Fv의 중쇄에서, 아미노산 위치 101에서의 당 결합 잔기 Asn (Asn101)의 존재이다. 이 당 결합 부위는 그의 Fv 영역 위치에 대해 비통상적이며, Fv 도메인 내부에 예상치 않게 숨겨져 있고, 단지 전체 항체 분자의 변성에 의한 당의 효소적 절단을 위해 노출될 수 있다. Fv 영역에서의 이 당의 존재는 초기에는 항체의 특징화를 복잡하게 하였다. 그러나, 당 쇄 또는 결합 부위에 대한 변형은 CD4에 대한 항체의 결합 친화도를 파괴하였다. 따라서, Fv 영역에서의 이 비통상적인 N-글리코실화 부위는 CD4에의 항체 결합에 중요하다.
도 7은 mAb dB4의 전장 중쇄 아미노산 서열을 예시하며, 도 4 및 6에 대해 상기 논의된 글리코실화, 치환, 및 돌연변이 부위를 강조하고 있다.
실시예 6
MT-2 마이크로플라크, PBMC 중화 검정 및 페노센스 진입 검정에 의한 MAB DB4와 그의 모 MAB B4 사이의 생물학적 등가성의 입증
인간화 형태가 영장류 동물 및 인간에서 추가의 독성/안전성 및 효능 연구를 위해 이용될 수 있음을 보장하기 위해, 탈면역화/인간화 Fc-비글리코실화된 mAb dB4 및 모 뮤린 mAb B4의 생물학적 등가성을 평가하기 위한 광범위한 비교 연구가 수행되었다. 이들 비교 연구로부터의 결과를 하기에 요약한다.
1. 고도 민감성 HIV-1 중화 검정을 MT-2 마이크로플라크 및 미토겐-자극된 PBMC 검정 둘 다에서 각각 계통군 A, B, C, D 및 E 및 계통군 C 및 E로부터의 대표적 HIV 단리체로 수행하였다. 탈면역화 기술에 의한 뮤린 mAb B4의 mAb dB4 항체로의 인간화 후에 HIV 중화 활성의 소실이 없었다. 필적하는 결과를 MT-2 마이크로플라크 (표 5) 및 PBMC-기재 검정 (표 6)에 나타낸다.
2. 따라서, 측정된 모든 계통군으로부터의 모든 HIV 단리체에 대한 IC50 및 IC90이 서로의 2배 내에 있기 때문에, 뮤린 mAb B4와 mAb dB4 사이에 생물학적 등가성이 입증된다.
3. mAb B4, mAb dB4, 뿐만 아니라 2가지 다른 널리 공지된 HIV-env 지정된 모노클로날 중화 항체, 2F5 및 2G12에 의한 HIV 진입 억제를 JRCSF (R5), HXB2 (X4), 92TH594 (R5/X4), 1차 단리체 #5 (R5), 1차 단리체 #6 (R5), 및 1차 단리체 #7 (R5)을 비롯한 다양한 향성의 선택된 HIV 단리체로 세포주 U87을 발현하는 이중-수용체 (CXCR4 및 CCR5 또는 X4/R5)에 대해 평가하였다. 이 연구에서, HIV 진입의 억제를 모노그램 바이오사이언시즈에 의해 수백 개의 HIV 균주 중 어느 하나로부터의 외피 당단백질 및 루시페라제를 운반한 위형 바이러스를 사용하여 평가하였다. 항체에 의한 중화는 HIV tat의 대조군 하에서 루시페라제를 발현하도록 조작된 U87-CD4+/CCR5+/CXCR4+ 세포에서 생산된 생물발광을 정량함으로써 측정된다. 이 연구로부터의 결과를 표 7에 나타내며, 이는
a. 뮤린 mAb B4 (MuB4; 제4열)가, 2가지 가장 강력한 항-HIV Env 항체 2F5 (제1열) 및 2G12 (제2열)와 비교할 경우, HIV 진입 억제에서 훨씬 더 강력함. 상이한 HIV 단리체에 대한 상응하는 IC50은 각각 0.04 대 4 및 0.8; 0.4 대 0.07 및 0.5; 0.05 대 3 및 1.3; 0.05 대 50 및 20; 0.05 대 2 및 3; 0.03 대 >100 및 2임;
b. 뮤린 mAb B4 (MuB4; 제4열) 및 mAb dB4 (제3열)는 다양한 유형의 향성의 동일한 대표적 HIV 단리체로 시험한 경우 놀랍게도 그의 IC50에서 등가임
을 입증한다.
따라서, 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대해 동일한 CDR을 공유하는 뮤린 mAb B4 및 탈면역화 mAb dB4는 생물학적 등가성이며, 2가지 항체의 기능적 특성은 다양한 시험관내 및 생체내 연구에서 서로의 대표임이 널리 문서화되어 있다.
실시예 7
(a) HPB -ALL 세포에 대한 DB4 및 MAB B4 결합 활성; (b) PBMC CD4 양성 세포에 대한 DB4 결합 활성; (c) 재조합 CD4에 대한 DB4 결합 활성, 및 (d) HPB -ALL 세포에 대한 DB4 및 GP120 결합 활성의 특징화
1. 배경
중화 검정에 의해 입증된 바와 같이, 이전 실시예에 나타난 바와 같은 mAb dB4 및 그의 모 뮤린 mAb B4에 대한 항원 결합 및 기능적 특성의 정성적 측면은 공지되어 있지만, CD4+ T 림프구에서의 mAb B4 및 mAb dB4의 정량적 세포 결합 프로파일은 이전에 조사되지 않았다.
뮤린 mAb B4 및 그의 인간화, Fc-비글리코실화된 IgG1 모노클로날 항체 mAb dB4 둘 다를 정상 인간 혈액 CD4+ T 림프구에 대해 및 또한 CD4+ T-백혈병 HPB-ALL 세포에 대해 세포 결합 프로파일에 대해 시험하였다. mAb B4는 실시예 1에서 논의된 바와 같이 HPB-ALL 세포로의 마우스의 면역화를 통해 선택되었기 때문에, HPB-ALL 세포를 사용하였다. 일반적 세포 결합을 FACS 분석에 의해 평가하고, 결과를 평균 형광 강도 (MFI)에 기초한 EC50 또는 IC50 값으로서 보고하였다. 항체의 일반적 세포 결합을 평가하는 것 외에, HPB-ALL 세포에 대한 천연 dB4 IgG1 분자의 절대 결합 친화도 (Kd) 및 결합능 (Bmax)을 또한 연구하였다.
2. 물질
2.1 배양 배지 및 시약.
HPB-ALL 세포를 배양하기 위한 RPMI-1640 배지 및 소 태아 혈청은 지브코 (Gibco) 제품이었다 (각각 Cat. 11875-093 및 10091-148). 소 혈청 알부민은 어플릭켐 (ApplicChem) 제품이었다 (Cat. A-0850). 시험 항체와 함께 세포의 인큐베이션은 눈크 (NUNC) V-바닥 96-웰 플레이트 (Cat. 249662) 상에서 수행하였다. 샘플 제조용 미세희석 튜브 (1.2 mL)는 베르텍 (Bertec) 제품이었다 (Cat. 1710-00). 세포 고정은 2％ 포름알데히드로 수행하였고; 샘플은 0.05％ BSA 및 0.05％ 아지드화나트륨을 함유하는 PBS (pH 7.4)를 갖는 희석액이었으며; 세척 완충제는 0.05％ 아지드화나트륨을 갖는 PBS (pH 7.4)였다.
뮤린 mAb B4 및 인간화 mAb dB4의 결합을 각각 염소 항-마우스 IgG-FITC (시그마 (Sigma), Cat. F8264) 및 염소 F(ab')2 항-인간 IgG Fcγ-FITC (잭슨 이뮤노리서치 (Jackson ImmunoResearch), Cat. 109-096-098)에 의해 추적하였다. dB4-알렉사 488 접합체 (본문 전반에 걸쳐 약칭 "dB4-알렉사"로 나타냄)는 유나이티드 바이오메디칼, 인코포레이티드 (United Biomedical, Inc.) ("UBI")에서 내부 제조하였다 (UBI Lot. 0102143). B4-비오틴 접합체는 UBI 제품이었다 (Lot 051807). 양 항-hIgG-HRP는 더 바인딩 사이트 (The Binding Site) 제품이고 (Cat. AP004); 엑스트라비딘 (Extravidin)-HRP는 시그마 알드리치 (Sigma Aldrich) 제품이고 (Cat. E2886); 가용성 rCD4는 알앤디 시스템 (R & D System) 제품이었다 (Cat. 514-CD-050). 펩티드 p2704a HIV 외피는 UBI 제품이고, 재조합 gp120 MN은 이뮤노다이아그노스틱스 (ImmunoDiagnostics) 제품이었다 (Cat. 1021-2). 결합의 추적에 대해 게이팅된 혈액 CD4+ T 세포는 항-CD4(D2)-FITC 항체 (안셀 (Ancell), Cat. 148-020)로 수행하였다. 리니어플로우 (LinearFlow)™ 녹색 형광 유동 세포측정법 강도 보정 키트 (Green Flow Cytometry Intensity Calibration Kit)로부터의 형광 비드를 참조 표준으로서 사용하여, 표지된 세포의 상대 형광을 정량화하였다. 다른 형광 검출제를 사용하였다: FITC-크롬퓨어 (FITC-ChromPure) 염소 IgG, F(ab')2 단편 (잭슨 이뮤노리서치, Cat. 005-090-006); CD3 PE (ASR) (비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences), Cat. 340662); CD45 PerCP (ASR) (비디 바이오사이언시즈, Cat. 340665).
2.2 HPB -ALL 세포 및 말초 혈액 CD4 + T 세포.
인간 흉선 급성 림프구성 백혈병 세포주인 HPB-ALL 세포주는 DSMZ ACC로부터 얻었다. PBMC CD4+ T 세포 (건강한 공여자로부터 EDTA-진공채혈기 내로 신선하게 채혈된 혈액)는 NH4Cl-함유 저장성 용액 (pH 7.4의 8.3 g/L 염화암모늄, 0.84 g/L 중탄산나트륨, 및 29.4 mg/L EDTA의 혼합물)으로의 적혈구의 용해 후의 말초 혈액 백혈구 (PBL)로부터 유래되었다.
2.3 뮤린 mAb B4 및 인간화 dB4 mAb .
뮤린 모노클로날 B4 IgG1 (UBI Lot 120197)은 면역원으로서 HPB-ALL 세포를 사용한 하이브리도마 작업을 통해 얻었다. B4-유래된 인간화 dB4 IgG1 (UBI 아시아 참조 로트 (Asia Reference Lot))은 N298H에 의해 Fc-비글리코실화시켰다 (실시예 5).
2.4 ELISA & FACS 상의 검출.
96-웰 마이크로플레이트는 날지 눈크 인터내셔널 (Nalge NUNC International) 제품이며, 광학 판독용으로는 평평-바닥 (Cat. 442404)이고, 세포 인큐베이션용으로는 V-바닥 (Cat. 249570)이다. 광학 밀도는 베르사맥스 (VersaMax) 마이크로플레이트 판독기 (몰리큘라 디바이시즈 (Molecular Devices)) 상에서 판독하였다. 형광 염색제는 비디 팍스칼리버 (BD FACSCalibur) 스캐너 (비디 바이오사이언시즈)에 의해 검출하였으며; 생성된 데이터는 부속된 셀 퀘스트 (Cell Quest) 소프트웨어에 의해 획득하였다. ELISA 및 FACS로부터의 결합 데이터는 정량적 분석을 위해 시그마플롯 (SigmaPlot) 11 소프트웨어로 불러왔다.
3. 방법
3.1 HPB -ALL 세포에의 dB4의 결합
3.1. 1 평형 시간 연구. V-바닥 마이크로플레이트 상에서, 웰 당 0.1 mL 중 2 x 105 세포의 분취액을 첨가하고, 원심분리하고, 액체를 버렸다. 180분 이하의 다양한 시간 지속기간 동안, 세포를 얼음 상에서 100 ng/mL 이하의 다양한 농도의 100 μL의 dB7의 분취액과 함께 인큐베이션하였다. 지시된 시간에, 상청액을 유리, 비결합된 항체 약물의 측정을 위해 수집하였다. 결합된 분율을 첨가된 총 약물 농도로부터 유리 분율을 뺌으로써 계산하였다.
결합 용액 중의 유리 dB4 농도를 ELISA에 의해 정량하였다. 간략하게, 검정은 눈크 맥시소르프 (NUNC Maxisorp) 마이크로플레이트 상에 코팅된 양 항-hIgL (0.5 μg/mL), 및 검출제 단백질로서 양 항-huIgG-HRP (1/1000 희석)의 혼합물의 사용을 포함하였다. 미지의 샘플 중의 농도를 보정 표준에 기초하여 0.14 내지 18.5 ng/mL의 범위에서 측정하였다.
3.1. 2 dB4로의 직접 결합 연구. V-바닥 마이크로플레이트 상에서, 웰 당 0.1 mL 중 2 x 105 세포의 분취액을 첨가하고, 원심분리하고, 액체를 버렸다. 세포를 얼음 상에서 1시간 동안 2000 ng/mL 이하의 다양한 농도의 100 μL의 dB4의 분취액과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, dB4를 제거하고, dB4의 신선한 분취액을 초기 인큐베이션에 사용된 동일한 농도의 세포에 첨가하고, 세포를 얼음 상에서 추가의 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 단계를 1회 더 반복하였다. 3회의 인큐베이션 (계대)으로부터의 세포를 조사하였다. 세번째 인큐베이션 후, 세포를 1회 세척하고, 300 g에서 5분 동안 원심분리하고, 얼음 상에서 30분 동안 100 μL의 염소 F(ab)2 항-huIgG Fc-FITC (250 ng/mL)로 염색하였다. 세포를 1회 세척하고, 원심분리 후 액체를 버렸다. 각각의 웰에, 200 μL의 결합 완충제의 분취액을 첨가하고, 유동 세포측정 분석을 위해 미세희석 튜브에 옮겼다. 샘플 당 5,000 세포의 유입에 기초한 결합 강도 (평균 형광 강도, MFI)를 FACS 상에서 판독하였다.
3.1. 3 dB4의 결합 친화도 ( Kd ) 연구. 에펜도르프 (Eppendorf) 튜브에서, 3.1 내지 2000 ng/mL (0.5 mL)의 dB4 항체를 4 x 105 세포 (0.5 mL)의 HPB-ALL 세포에 첨가하고, 얼음 상에서 부드러운 진탕 하에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 절대 결합 친화도를 포화 결합에서 측정하였으며, 여기서, 용액 중의 유리 dB4 농도 ([F])를 ELISA에 의해 정량하고, 결합된 분율 ([B])을 상기 평형 연구에 기재된 바와 같이 계산하였다. 생성된 포화 유리-대-결합된 농도 프로파일을 시그마플롯 상에서 방정식 [B] = Bmax · {[F]/([F] + Kd)} (상기 식에서, 각각의 [B] 및 [F]는 결합된 및 유리 농도를 나타냄)에 기초하여 곡선-피팅함으로써 분석하였다.
3.1. 4 dB4 및 B4의 B4-비오틴과의 경쟁. sCD4 (0.5 μg/mL) 및 p2704a 펩티드 (2.0 μg/mL)의 혼합물로 코팅된 평평-바닥 마이크로플레이트 상에서, B4-비오틴 (10 μg/mL)의 존재 하에서의 0.78 내지 100 μg/mL의 0.1 mL dB4 또는 B4의 분취액을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 포획 혼합물에의 경쟁적 결합 후, 결합된 B4-비오틴을 엑스트라비딘-HRP로 검출하고, ELISA 판독기 상에서 측정하였다.
3.1. 5 dB4 및 B4의 dB4 - 알렉사와의 경쟁. V-바닥 마이크로플레이트 상에서, 웰 당 0.1 mL 중 2 x 105 세포의 분취액을 첨가하고, 원심분리하고, 액체를 버렸다. 세포를 얼음 상에서 1시간 동안 100 μL의 dB4 또는 B4의 분취액 (2000 ng/mL 이하)과 함께 dB4-알렉사 (250 ng/mL)의 존재 하에서 인큐베이션하였다. 세포를 1회 세척하고, 원심분리 후 액체를 버렸다. 각각의 웰에, 200 μL의 결합 완충제의 분취액을 첨가하고, 유동 세포측정 분석을 위해 미세희석 튜브로 옮겼다. 샘플 당 5,000 세포의 유입에 기초한 결합 강도 (평균 형광 강도, MFI)를 FACS 상에서 판독하였다.
3.1. 6 dB4C7 및 gp120 MN의 dB4C7 - 알렉사와의 경쟁. V-바닥 마이크로플레이트 상에서, 웰 당 0.1 mL 중 2 x 105 세포의 분취액을 첨가하고, 원심분리하고, 액체를 버렸다. 세포를 얼음 상에서 1시간 동안 100 μL의 dB4C7 또는 gp120 MN의 분취액 (200 nM, 약 30 μg/mL 이하)과 함께 dB4-알렉사 (250 ng/mL)의 존재 하에서 인큐베이션하였다. 세포를 1회 세척하고, 원심분리 후 액체를 버렸다. 각각의 웰에, 200 μL의 결합 완충제의 분취액을 첨가하고, 유동 세포측정 분석을 위해 미세희석 튜브로 옮겼다. 샘플 당 5,000 세포의 유입에 기초한 결합 강도 (평균 형광 강도, MFI)를 FACS 상에서 판독하였다.
3.2 혈액 CD4+ T 림프구에의 dB4의 결합
3.2. 1 dB4의 온도-의존성 결합 연구. IV 투여 후의 dB4 (UB-421)가 CD4+ T 세포 상의 CD4 수용체에 결합할 (코팅하거나 점유할) 생리학적 환경을 모방하기 위해, 실험실 직원으로부터의 신선하게 채혈된 EDTA-혈액의 분취액을 37℃에서 동등한 부피의 dB4와 함께 희석 완충제에서 100 μg/mL 이하의 농도에서 인큐베이션하였다. 비교를 위해, 또다른 샘플 세트를 얼음 상에서 병행하여 인큐베이션하였다. 1시간 동안 인큐베이션 후, 샘플을 20배 부피의 RBC 용해 완충제로 10분 동안 실온에서 용해시켜 말초 혈액 백혈구 (PBL)의 분획을 얻었다.
PBL 분획을 원심분리하고, 세척한 후, 1.0％ BSA 및 아지드화나트륨을 함유하는 동등한 부피의 PBS 완충제로 재구성하였다 (예를 들어, 0.1 mL 혈액을 0.1 mL 희석 완충제로). PBL 샘플을 얼음 상에서 30분 동안 염소 F(ab)2 항-hIgG Fc-FITC, 항-CD3-PE, 및 항-CD45 perCP의 0.1 mL 혼합물로 염색하였다. 세척 후, 샘플을 2％ 포름알데히드로 고정하고, 10,000 세포의 유입에 기초하여 FACS 분석에 적용하였다. T 림프구 집단을 항-CD3-PE로 게이팅하였다.
3.2. 2 직접 결합. 혈액 CD4+ T 세포에의 dB4의 직접 결합을 3명의 남성 및 3명의 여성 대상체에서 정의하였으며, 여기서, 이들의 신선하게 채혈된 EDTA-혈액을 dB4와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. mAb dB4는 CD4+ T 세포에 결합하였으며, 0.2 내지 200 ng/mL의 농도 범위에서 명백한 포화에 도달하는 것으로 밝혀졌다. T 림프구 집단을 항-CD3-PE로 게이팅하였다. 실험 절차는 세포를 염소 F(ab)2 항-hIgG Fcγ-FITC로 염색하여 dB4 결합을 추적한 온도-의존성 결합 연구에서 상기 기재된 것과 동일하였다.
3.2. 3 유리 결합 부위. 상기 정의적 직접 결합 연구와 병행하여, dB4 결합 뒤에 남겨진 (완전한 수용체 점유 전) 유리 결합 부위의 수준을 개별적인 3명의 남성 및 3명의 여성 대상체의 각각에 대해 동일한 경우에 대해 조사하였다. 실험 절차는, 250 ng/mL의 고정된 양의 dB4-알렉사를 사용하여 비점유된, 유리 결합 부위의 수준을 밝힌 점을 제외하고는, 직접 결합에 대해 상기 기재된 것과 동일하였다.
3.2. 4 보정 비드. 직접 결합 및 유리 결합 부위에 대한 동시 조사를 위해, log(MFI)-대-log(비드％) 표준 곡선을 6가지 상이한 경우의 각각에 대해 2가지 몰리큘라 프로브 (Molecular Probe)의 리니어플로우™ 키트 (Cat. L14821 및 L14823)의 조합물을 사용하여 생성하였다. 키트 조합물은 유동 세포측정법 실험에 사용하기 위한 고 및 저 강도 표준의 넓은 보정된 범위를 제공한다. 참조 표준으로서, 이들 형광 비드를 사용하여 염소 F(ab)2 항-hIgG FcR-FITC 또는 dB4-알렉사에 의해 표지된 세포에 대한 상대 형광을 정량하였다.
4. 결과 및 논의
4.1 dB4의 결합 프로파일 및 CD4-양성 HPB -ALL 세포에서의 그의 절대 결합 친화도 (Kd)의 측정.
4.1. 1 HPB -ALL 세포에 대한 결합 활성의 평형. 리간드-수용체 결합 반응에 대한 완전한 특징화 전에, 다양한 농도의 리간드에 대해 평형에 도달하는 시간 길이, 즉, 온-레이트가 오프-레이트와 동등한 플라토 상태를 정의하였다. 일반적으로 농도가 보다 낮을 수록, 평형에 도달하는 시간이 보다 길 것으로 공지되어 있다.
얼음 상에서 인큐베이션된 CD4-양성 HPB-ALL 세포에서의 dB4-CD4 상호작용의 경우, ％ 결합된 값으로 플라토에 도달하는 데 2.0 ng/mL 농도에 대해서는 대략 60분이 걸리고, 50 ng/mL 농도에 대해서는 대략 15분이 걸렸다. 100 ng/mL (0.1 μg/mL) 및 그보다 높은 수준의 dB4 농도에 대해서는 거의 순간 플라토가 관찰되었다.
이들 결과는 dB4 결합 반응이 넓은 범위의 농도 (예를 들어, 농도 ≥ 2.0 ng/mL)에 대해 1시간 동안 수행될 수 있음을 지시한다. 리간드-수용체 복합체의 잠재적 세포내이입을 회피하기 위해, 결합 연구를 차가운 곳에서 및/또는 0.05％ 아지드 하에서 수행하였다. 실온 또는 37℃에서의 인큐베이션은 반응 플라토가 보다 빨리 도달되게 할 수 있다. 이 상기 연구된 조건 하에서, 3개의 상이한 세포 계대를 갖는 HPB-ALL 세포를 얼음 상에서 1시간 동안 dB4와 함께 인큐베이션하였다. 상청액을 ELISA에 의한 유리 약물 농도의 측정을 위해 수집하고, 전체로부터 뺌으로써 결합된 분율을 얻었다. 절대 결합 친화도 및 결합능을 도 8에 나타낸 결합 곡선으로 계산하였다.
4.1. 2 HPB -ALL 세포에의 직접 결합. 3가지 상이한 경우 (세포 계대)에 대해, 2 x 105 HPB-ALL 세포를 1시간 동안 얼음 상에서 약 2000 ng/mL 이하의 dB4로 인큐베이션하였으며, 항체는 4-파라미터 로지트 함수에 의해 특징화된 포화 결합 프로파일을 나타내었고, 여기서, 결합의 정도는 염소 F(ab)2 항-huIgG Fc-FITC에 의해 검출하고, 평균 형광 강도 (MFI)로서 표현하였다. 결합은 200 ng/mL (0.2 μg/mL) 및 그 위에서 포화에 접근하였다. 평균 결합 EC50은 42.2 ng/mL인 것으로 추정되었으며 (표 8), 계대간 변이는 거의 없었다 (n = 3). 절대 MFI 값을 또한 계대간 비교의 목적으로 ％ MFI로 정규화하였다. 표준 편차는 따라서 최소화되었고, EC50 값은 본질적으로 동일하게 남아 있었으며; 둘 다의 평균 곡선에 대한 전체 평균 결합 EC50 값은 42.9 ng/mL인 것으로 추정되었다 (표 8).
4.1. 3 HPB -ALL 세포에서의 결합 친화도 ( Kd ) 및 결합능 ( Bmax). 인큐베이션후 상청액의 수집 (얼음 상에서 1시간 동안)은 ELISA에 의한 유리 (비결합된) dB4 농도 [F] 및 따라서 첨가된 (총) 농도로부터 빼는 것을 통한 결합된 농도 [B]의 측정을 허용하였다. dB4에 대한 절대 결합 친화도의 추정은 표 9에 나타낸 바와 같은 유리 약물-대-결합된 약물 프로파일을 사용하여 수행하였다. 평균 Kd는 5.6 x 10-11 M (범위: 3.1 내지 8.1 x 10-11 M)인 것으로 추정되었으며, Bmax는 세포 당 1.2 x 106 Ab (범위: 0.93 내지 1.4 x 106)인 것으로 추정되었다. 이들 결과는 dB4가 이례적으로 높은 친화도로 HPB-ALL 세포 상의 CD4 수용체에 결합하였으며, HPB-ALL 세포는 최대량에서 세포 당 dB4에 대한 100만개 초과의 결합 부위로, 높은 밀도를 가짐을 지시하였다 (표 9). HPB-ALL 세포 상의 CD4 수용체 밀도는 세포 당 약 3.2 내지 6.1 x 104 결합 부위인 혈액 CD4+ T 림프구의 그것보다 적어도 20배 더 높았다.
4.2 HPB -ALL 세포에의 결합에 있어서 dB4 및 B4의 비교.
뮤린 B4 항체의 dB4로의 탈면역화의 방법에 의한 인간화가 결합 친화도를 변경시켰는지 여부의 질문을 경쟁 설계를 사용한 2가지 기술적 고려에 대해 철저히 조사하였다.
첫째로, mAb B4 및 mAb dB4의 결합 친화도를 가용성 CD4 (sCD4) 및 p2704a 펩티드의 포획 혼합물로 코팅된 ELISA 플레이트 상에서 조사하였다. p2704a 펩티드는, 이것이 HIV-1이 부착하여 CD4 세포에 진입하는 CCR5 상의 에피토프 서열을 함유하기 때문에, CD4-CCR5 수용체 복합체를 모방한다. 코팅된 sCD4/p2704a 혼합물에의 B4-비오틴의 결합은 ELISA에 의해 분석한 경우 다양한 농도의 mAb B4 또는 mAb dB4의 존재 하에서 억제되었다. mAb B4 또는 mAb dB4 항체가 공존하며, 포획 단백질 혼합물에의 결합에 대해 B4-비오틴과 경쟁하고 있었던 경우, B4-비오틴의 결합은 B4 및 dB4에 의해 각각 5539 ng/mL 및 8191 ng/mL의 IC50 값을 갖고 억제되었다 (도 9). B4 대 dB4의 IC50 비는 0.68이었으며, 이는 인간화 dB4가 뮤린 B4 항체에 상대적으로 필적하는 결합 친화도를 가짐을 지시한다.
둘째로, 상대 결합 친화도를 또한 B4 또는 dB4 항체가 공존하며, 세포 CD4 수용체에의 결합에 대해 dB4-알렉사와 경쟁하고 있었던 경우, CD4-양성 HPB-ALL 세포를 사용하여 조사하였다. FACS에 의해 분석했을 때, dB4-알렉사의 결합은 B4 및 dB4에 의해 각각 135 및 197 ng/mL의 IC50 값을 갖고 억제되었다 (도 10). B4 대 dB4의 IC50 비는 ELISA 패러다임에 의해 입증된 것과 실질적으로 동일한 0.69였으며, 이는 다시금 인간화 dB4가 뮤린 B4 항체에 상대적으로 필적하는 친화도로 CD4 수용체에 결합함을 지시한다.
모 항체 B4 및 그의 인간화 항체 dB4C7 (UB-421)을 사용한 이 비교 경쟁적 결합 억제 연구는 평균 형광 강도 (MFI) 대 항체 일련의 농도 (100 내지 104 ng/mL)에 걸친 항체 농도에 의해 측정된 바와 같은 CD4 양성 T 세포 (HPB-ALL)에 대한 항체 결합 프로파일을 제공하였다. 이 연구는 MT2 및 PBMC 검정 시스템 둘 다에서 둘 다의 항체의 각각의 중화 활성이 필적하는 중화 항체 활성을 갖는다는 표 5 및 6에 제시된 데이터를 추가로 입증하였다.
이들 비교 연구에서 얻어진 결과는 탈면역화 기술에 의한 인간화가 그의 모 뮤린 항체 B4와 비교할 경우 CD4 수용체에 대한 dB4C7 (UB-421)의 결합 친화도를 유의하게 감소시키지 않았음을 시사한다.
4.3. CD4에 대한 mAb dB4의 결합 특징.
CD4에 대한 mAb dB4의 결합 특징을 평가하였다.
4.3. 1. 가용성 CD4 대 세포- 결합된 CD4에의 mAb dB4의 결합. 상기 논의된 바와 같이, dB4는 ELISA에 의해 평가된 바로 8191 ng/mL의 IC50을 갖고 sCD4/p2704a에의 B4-비오틴의 결합을 억제하였으며 (도 9), dB4는 FACS에 의해 조사된 바로 197 ng/mL의 IC50을 갖고 HPB-ALL 세포에의 dB4-알렉사의 결합을 억제하였다 (도 10). 이들 데이터는 흥미롭게도 dB4가 가용성 CD4 (sCD4)에 비해 훨씬 더 높은 CD4-양성 T 세포에 대한 결합 친화도를 가졌음을 입증한다. 구체적으로, 2가지 연구의 IC50 값의 비교는 dB4의 결합 친화도가 sCD4에 비해 CD4-양성 T 세포에 대해 40배 초과 더 높았음을 나타내었다.
4.3. 2. HPB -ALL 세포의 결합에 있어서의 dB4 및 gp120 MN의 비교. CD4-양성 T 세포에 결합된 CD4에 대한 dB4 및 HIV gp120 MN의 결합 친화도를 비교하기 위한 경쟁 연구를 수행하였다. 구체적으로, dB4-알렉사가 HPB-ALL 세포 상의 CD4에 결합하는 것을 억제하는 dB4 및 gp120 MN의 능력을 비교하였다 (도 11). 첫번째 연구에서, dB4는 1.8 nM의 IC50을 갖고 HPB-ALL 세포 상의 CD4에의 dB4-알렉사의 결합을 억제하였다. 비교 연구에서, gp120 MN은 97.2 nM의 IC50을 갖고 HPB-ALL 세포 상의 CD4에의 dB4-알렉사의 결합을 억제하였다. 이들 결과에 따르면, dB4는 gp120 MN에 비해 실질적으로 더 높은 HPB-ALL T 세포 상의 CD4에 대한 결합 친화도를 갖는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 2가지 연구의 IC50 값의 비교는 CD4에 대한 dB4의 결합 친화도가 gp120 MN의 그것보다 적어도 50배 더 높음을 나타내었다.
4.3. 3. CD4에 대한 dB4 및 gp120 MN 결합 친화도의 비교. 상기 논의된 바와 같이, mAb dB4는 약 5.6 x 10-11 M의 결합 친화도 (Kd)로 CD4에 결합한다 (표 9). 이전에 다른 이들에 의해, 결정학 연구를 통해, HIV-1 gp120은 대략 5 x 10-9 M의 높은 결합 친화도 (Kd)로 CD4 분자의 도메인 1 주위에 결합하는 것으로 밝혀졌다 (Myszka, D.G., et al., "Energetics of the HIV gp120-CD4 binding reaction" Proc Natl Acad Sci U S A. Aug 1, 2000; 97(16): 9026-9031). 따라서, dB4 및 gp120의 Kd 값의 비교는 CD4에 대한 dB4의 결합 친화도가 gp120의 결합 친화도보다 대략 100배 더 높음을 나타낸다. 이 결과는 dB4가 IC50 값의 비교에 기초하여 gp120 MN보다 적어도 50배 더 강하게 HPB-ALL 세포에 결합한다는 상기 발견과 일치한다.
상기 논의된 전반적인 시험관내 결과는 dB4가 HIV 바이러스 진입을 방지하거나 정지시킴으로써 HIV-1 감염의 차단 또는 감소에 능숙할 것임을 입증하였다.
4.4. 혈액 CD4+ T 세포에의 dB4 ( UB - 421)의 온도-의존성 결합.
정상 체온 (37℃)의 인간 혈액 중의 CD4+ T 세포에의 dB4의 결합을 조사하여 dB4가 인간 대상체에게 치료제로서 유효하게 투여될 수 있는 지를 측정하였다. 인간 신체의 생리학적 환경을 모방하기 위해, dB4C7 (UB-421)을 신선하게 채혈된 혈액과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 말초 혈액 백혈구 (PBL) 샘플을 RBC 용해 절차에 의해 얻었다. 얼음 상에서 (4℃) 인큐베이션을 또한 병행하여 수행하였다. 그 후, PBL 분획을 염소 F(ab)2 항-huIgG-FITC로 염색하여 CD4-게이팅된 T 세포 상의 CD4 수용체에의 dB4의 직접 결합을 가시화하였다.
37℃에서 1시간 동안 dB4와 함께 세포 인큐베이션은, 4℃에서의 인큐베이션에 비해, 마우스 항-CD4(D2)-FITC의 MFI의 변화가 관찰되지 않았기 때문에, 리간드-수용체의 세포내이입을 유발하는 것으로 보이지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 50 내지 1000 ng/mL의 CD4+ T 세포 및 200 ng/mL 이하의 농도의 dB4 (CD4 수용체의 D1 도메인을 표적화함)의 게이팅을 위한 마우스 항-CD4(D2)-FITC는 결합에 대해 경쟁하지 않았다.
1명의 여성 개체로부터의 혈액 샘플에서 나타난 바와 같이 (도 12), 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 dB4와 함께 2가지 상이한 온도, 37℃ 또는 4℃에서, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 게이팅된 CD4+ T 세포를 FACS 상에서의 dB4 결합의 관찰을 위해 염색하였다. 도 12는 각각 4.8 ng/mL 및 23.0 ng/mL의 IC50 값에 기초하여, dB4가 4℃에서보다 37℃에서 5배 더 높은 친화도로 CD4 수용체에 결합하였음을 나타낸다. 예상된 바와 같이, dB4는 둘 다의 온도 조건 하에서 동일한 최대 결합 MFI에 도달하였다. MFI 값은, 특히 이들 값을 정규화하고, ％ MFI로서 표현하는 경우, 수용체 점유의 정도를 반영한다.
4.4. 1 혈액 CD4+ T 세포에의 dB4의 직접 결합. 정상 체온 (37℃)에서 인간 혈액 중의 CD4+ T 세포에 대한 dB4의 결합 프로파일을 또한 조사하였다. 혈액 CD4+ 세포에 대한 dB4의 직접 결합 활성을 6명의 인간 성인 (3명의 남성 및 3명의 여성)으로부터의 신선하게 채혈된 혈액을 사용하여 6개의 상이한 경우에 대해 평가하였다 (표 10). 1시간 인큐베이션 후, 말초 혈액 백혈구를 단리하고, 염소 F(ab)2 항-huIgG Fc-FITC로 염색하고, CD4-게이팅된 T 세포에 결합된 dB4를 FACS에 의해 분석하였다. 샘플을 형광 판독을 위해 참조 비드로 보정하였다. 결합 (EC50) 값은 2.6 ng/mL 내지 5.7 ng/mL인 것으로 밝혀졌으며, 평균 EC50은 4.1 ng/mL이었다. 또한, 최대 ％ MFI 값은 68％ 내지 93％ 범위였으며, 평균은 77.8％였다 (표 10). 이들 결과는 각각 결합 친화도 및 수용체 밀도에 있어서 작은 유의성의 대상체간 변이를 반영한다.
4.4. 2 mAb dB4에 의한 수용체 점유 후의 유리 CD4 결합 부위.
4℃의 혈액 CD4+ 세포에의 dB4의 직접 결합 (염소 항-hIgG에 의해 검출된 바와 같음)과 함께, CD4+ 세포 상의 비점유된, 유리 CD4 결합 부위를 dB4-알렉사에 의해 평가하였다.
dB4의 부재 하에서, dB4-알렉사 접합체 단독은 약 250 ng/mL에서 그의 최대 결합의 약 100％에 접근할 수 있었다 (도 13). 500 ng/mL 초과의 농도에서, dB4-알렉사 접합체는 결합된 dB4의 대략 10％ 이상을 축출할 수 있었다 (데이터는 나타내지 않음). 구체적으로, 수용체가 250 ng/mL의 포화-접근 수준에서 dB4에 의해 점유된 경우, CD4 수용체에의 dB4-알렉사의 결합 (250 ng/mL에서)은 완전히 차단되었다.
dB4의 감소하는 존재를 갖는 수용체 점유의 강하는 dB4-알렉사의 결합의 상승과 평행하는 것으로 관찰되었다. 수용체 점유의 정도는 유리 결합 부위의 수준과 대칭적 방식으로 동시발생하였으며, 대략 4.0 ng/mL에서 교차된 둘 다의 곡선 (도 13)은 그의 결합 EC50 값과 일치한다 (표 10).
따라서, 전반적 결과는 MFI 및 ％MFI와 함께 250 ng/mL에서의 dB4-알렉사의 시험관내 사용은 dB4C7 (UB-421)이 인간 대상체에게 투여된 후에 생체내 수용체 점유를 조사하기 위한 적절한 패러다임일 수 있음을 시사한다.
5. 결론
1. mAb dB4는 비범하게 높은 활성으로 HPB-ALL 세포 상의 CD4 수용체와 반응하여, 얼음 상에서 50 ng/mL 초과의 농도에서 순간 평형에 도달한다. 절대 결합 친화도 (Kd)는 5.6 x 10-11 M인 것으로 추정되었고, 최대로 1.2 x 106 dB4 분자 (Bmax)가 정상 혈액 CD4+ T 세포의 그것보다 적어도 20배 더 높은 수용체 밀도를 갖는 단일 HPB-ALL 세포에 결합할 수 있었다.
2. 뮤린 B4의 dB4 mAb로의 인간화는 CD4 수용체에 대한 dB4 결합 친화도를 유의하게 변경시키지 않는다. 분자-기재 ELISA (sCD4 및 CCR5 에피토프-함유 펩티드 p2704a로 코팅됨) 뿐만 아니라 HPB-ALL 세포를 사용한 세포-기재 FACS를 사용한 결합 억제 설계에 의해, 둘 다의 항체는, B4-대-dB4의 IC50 비가 둘 다의 연구에서 대략 0.7인 것으로 관찰되었기 때문에, B4-비오틴 또는 dB4-알렉사인 추적제의 결합을 필적하게 차단한다.
3. dB4 항체는 HIV-1 외피 단백질 gp120 MN에 대한 그것보다 적어도 50배 더 높은 친화도로 CD4 수용체에 결합한다. 구체적으로, HPB-ALL 세포를 사용한 결합 억제 연구는 dB4 및 gp120 MN이 각각 IC50 값 1.8 및 97.2 nM을 갖고 추적제 dB4-알렉사의 결합을 억제함을 입증하였다. 이 결과는 또한 재조합 gp120에 대해 이전에 보고된 것보다 약 100배 더 높은 dB4의 높은 결합 친화도 (Kd)와 일치한다.
4. mAb dB4는 HPB-ALL 세포에 대한 유사한 결합 친화도로 혈액 CD4+ T 세포에 결합한다. 냉조건 (4℃) 하에서, dB4는 대략 23.0 ng/mL의 EC50을 가지며, 정상 체온 (37℃) 하에서 dB4는, 결합 EC50 값이 4.8 ng/mL에 있는 것으로 추정되었기 때문에, 약 5배 더 높은 친화도로 혈액 CD4+ T 세포에 결합한다.
5. 6명의 인간 대상체로부터 취해진 혈액 샘플로부터의 연구는 dB4 농도와 CD4 수용체 점유 사이에 직접 (반비례) 상관관계가 있음을 확인시켜 주었다. 도 13에 나타낸 대향 곡선은 대략 4.0 ng/mL에서 교차하며, 이는 CD4에 대한 dB4의 평균 EC50 결합 값과 상응한다. 이들 전반적 결과는 형광 비드-보정된 ％MFI의 측정과 함께 dB4-알렉사 (250 ng/mL에서)의 시험관내 사용이, dB4C7 (UB-421)이 인간 대상체에게 투여된 후에 생체내 수용체 점유에 대한 조사를 위한 적절한 패러다임일 수 있음을 시사한다.
실시예 8
항체 B4는 HIV의 세포-유리 및 세포-대-세포 전파 둘 다를 유효하게 억제한다
HIV 입자는 고전적으로 세포-유리 전파에 의해 신체 전반에 확산되며, 여기서, 바이러스는 혈류 및 국소 환경에서 확산되어 세포를 감염시킨다. 바이러스는 또한 친밀한 세포-대-세포 접촉을 요구하는 메커니즘에 의해 감염된 세포로부터 비감염된 세포로 직접적으로 전달되는 능력을 갖는다. 이러한 확산은 감염된 세포가 비감염된 세포와의 안정한 접촉점을 형성하고, HIV 입자를 비감염된 세포로 직접적으로 전파할 경우 일어난다. 세포-대-세포 확산은 세포-유리 확산에 비해 더 유효하고, 더 빠르며, 혈류에서의 확산을 요구하지 않는다.
문헌 [Sigal, A., et al., 2011]은 세포-유리 바이러스로부터 기원한 감염이 항레트로바이러스 약물 테노포비르의 존재 하에서 강하게 감소하는 반면, 세포-대-세포 확산에 관여하는 감염은 공동-배양 검정에서 약물에 대해 현저하게 덜 민감성임을 보고하였다 (도 14). 민감도의 감소는 감염의 다중 라운드가 약물의 존재 하에서 종결되지 못하게 하는 데 충분하였다. 저자들은 추계적 감염 모델을 사용하여 임상적 약물 농도의 존재 하에서 세포-대-세포 확산으로부터의 복제를 조사하였으며, 복제가 돌연변이의 실질적 축적 없이 간헐적이었음을 밝혀내었다. 세포-대-세포 확산이 생체내에서 동일한 특성을 갖는 경우, 이는 면역계에 대해 유해 결과를 가져, 위험 인자를 갖는 개체에서 요법 실패를 초래하며, 잠재적으로 바이러스 내성에 기여하고, 따라서, HIV 감염의 치유에 대한 장벽이 될 수 있다.
따라서, 치료에 있어서 그의 잠재적 효과의 평가를 위해 HIV의 세포-대-세포 전파를 억제하는 mAb B4 및 mAb dB4 관련된 항체의 능력 및 효능을 평가하는 것은 중요하다.
1. HIV의 세포-대-세포 전파의 항체 매개된 억제를 측정하기 위한 검정
1.1 물질 및 방법
1.1. 1 세포 및 바이러스. HIV-1 게놈 내로 조작된 리포터 유전자 루시페라 제를 갖는 주르카트 (Jurkat)-inGLuc 클론 (NIH AIDS 연구 및 시약 프로그램 (NIH AIDS Research and Reagents Program))을, 표면 CD4의 낮은 발현으로 인해, 표적 1차 CD4+ T 세포를 사용한 공동-배양 실험에서 공여자-대-공여자 감염을 최소화하기 위한 공여자 세포로서 선택하였다. 리포터 유전자 루시페라제는 감염된 세포에서 발현되며, 바이러스 감염에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 감염된 세포에서의 이들 바이러스적으로 발현된 리포터를 측정하여 HIV-1 감염을 정량화할 수 있다. 1차 CD4+ T 세포를 표적 세포로서 사용하였다. 계통군 D의 바이러스 UG266 및 UG046을 연구에 사용하였다.
1.1. 2 바이러스 세포-대-세포 전파 검정. 이 검정에서, 공여자를 계열 희석액 중에서 항체 B4와 함께 예비인큐베이션한 후, 지시된 HIV-1 균주와 혼합하고, 수 일 후에 사용하였으며, 이 때 세포의 약 10 내지 75％가 Gag+였다. 그 후, 공여자 및 CD4 양성 PBMC 표적 세포를 1:2 비율로 96-웰 플레이트에서 200 μl 중 1.5 × 106 세포/ml의 최종 농도에서 혼합하였다. 48시간 후, 세포를 세포내 Gag에 대해 염색하고, 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 배양 상청액에 축적된 GLuc를 바이오룩스 가우시아 루시페라제 검정 키트 (BioLux Gaussia Luciferase Assay Kit) (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs)) 및 버톨드 테크놀로지즈 (Berthold Technologies) 광도계를 사용하여 검출하였다.
1.1. 3 IC 50 및 IC 90 의 계산. 데이터를 S자형 용량-반응 곡선 (가변 기울기)으로 피팅함으로써 용량-반응 억제 곡선을 도출하였다. 억제의 백분율은 (비처리된 표적 세포에서의 퍼센트 신호 ― 항체-처리된 세포에서의 퍼센트 신호)/(비처리된 표적 세포에서의 퍼센트 신호 ) × 100으로서 정의되었다. IC50 및 IC90을 그에 따라 계산하였다.
2. 결과 및 논의
표 11은 항체 B4가 엄격한 90％ 진입 억제 기준에 의해 측정한 경우 HIV (계통군 C의 바이러스 균주 UG266 및 UG046)의 세포-대-세포 및 세포-유리 전파를 등가적으로 억제할 수 있었음을 나타낸다. 구체적으로, 융합 억제 역가는 세포-대-세포 전파 검정에서 UG266 및 UG046 바이러스 균주에 대해 1:140 및 1:245인 것으로 밝혀졌으며, 이는 각각 세포-유리 전파 중화 검정에서 1:136 및 1:234의 중화 역가에 필적하였다. 50％ 진입 억제 기준에 의해 측정한 경우 상응하는 세포-유리 전파에 비해 세포-대-세포 전파에 대해 2가지 균주에 대한 보다 높은 융합 억제 역가가 관찰되었다.
이들 결과는 항체 B4가 HIV Env 단백질을 표적화하는 모든 다른 중화 모노클로날 항체 및 지금까지 측정된 다른 ART-약물과 비교할 경우 HIV의 세포-대-세포 및 세포-유리 전파 둘 다를 억제하는 그의 능력에 있어서 비범한 특성을 가짐을 입증한다. 이들 결과는 mAb B4 및 mAb dB4 관련된 항체가 개체에서 HIV 바이러스의 세포-유리 및 세포-대-세포 확산을 방지하는 데 특출하게 적격임을 시사한다.
실시예 9
항체 UB -421 ( DB4C7 또는 DB4)은 HIV 감염된 개체에서 향상된 바이러스 복제를 위한 휴지 PBMC의 재활성화를 매개한다
1. 배경
HIV-1은 휴지 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 감염시키지만, 후속 세포 활성화까지 불활성으로 남아 있다. 정지 PBMC에 잠복한 잠복성 HIV-1을 모방하는 휴지 T 세포의 비증식적 감염을 허용하는 세포 배양 조건 및 프로토콜을 사용한 시험관내 모델을 사용하여 이들 휴지 PBMC에 대한 열-불활성화된 HIV-1 (iHIV-1) 또는 gpl20-항-gpl20 면역 복합체의 자극 효과를 조사하였다 (Briant, L., et al., 1996).
열-불활성화된 HIV-1 (iHIV-1) 또는 gpl20-항-gpl20 면역 복합체의 외피 당단백질과의 CD4 맞물림은 가교를 통해, NF-κB (즉, 핵 전위) 및 AP-1의 활성화를 제어하는 신호 전달 경로를 자극하고, 결국 CD4 및 몇몇 키나제 (Lck, Raf-1, MEK 및 ERK)의 세포외 도메인 1 (D1) 및 세포질내 도메인이 세포 주기 진행을 유도하고, 활성화 마커 CD25의 세포-표면 발현을 촉진시키며, 프로바이러스 통합을 자극하고 세포가 바이러스를 생산하게 하는 것에 관여하는 데 충분한 것으로 입증되었다.
탄 (Than) 등에 의한 별개의 과학적 발견 (Than, et al., 1997)은 항-CD4 모노클로날 항체에 의한 gp120 결합 부위에서의 CD4 분자의 가교가 HIV 감염된 환자로부터 잠복성으로 감염된 PBMC를 유도하여 바이러스 복제를 촉진시킴을 추가로 확인하였다. 이 연구에 사용된 항-CD4 mAb는 CD4의 D1의 CDR2-루프에 결합하는 Leu3a였다. 구체적으로, Leu3a는 CD4의 도메인 1 내에 aa47-64를 갖는 펩티드로 나타내어진 선형 에피토프로 지정된다 (Chiba, Y. 1992).
또한, 휴지 PBMC에서의 바이러스 재활성화는 CD4의 도메인 1 (D1) 중의 CDR2-루프에 대해 지정된 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 유도되며, 다른 에피토프, 예컨대 D1 중의 CDR3 또는 인근의 D1/D2 연접 영역에 대해 지정된 항체에 의해서는 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다 (Briant, L., et al., 1999) (도 15, 레인 4를 레인 5 및 6와 비교). 이러한 바이러스 재활성화는 가용성 CD4 (sCD4)로의 CDR2-루프 리간드의 사전 흡수에 의해 방지될 수 있다 (도 15, 레인 4 및 레인 8을 비교).
따라서, 도메인 1 영역 주위의 CD4와의 높은 결합 친화도를 갖는 항체 dB4C7 (UB-421)이 HIV 감염된 개체에서 향상된 바이러스 복제를 위한 휴지 PBMC의 재활성화를 매개할 수 있는지 여부를 평가하는 것이 중요하였다.
2. CD4의 D1 주위의 B4/ dB4 입체형태적 결합 부위의 정밀화
2.1 mAb B4에 의한 침팬지 CD4 양성 PBMC에의 Leu3a 결합의 경쟁적 순차적 결합 억제 (그러나 역순은 아님)
2가지 대상체 (X282 및 X301)로부터 단리된 침팬지 PBMC 세포 뿐만 아니라 mAb B4 (FITC에 의해 표지됨) 및 Leu3a (PE에 의해 표지됨)를 이 연구에 사용하였다. PBMC를 각각의 항체로 순차적으로 염색하고, 세포형광촬영법에 의해 분석하였다. 이 실험으로부터 얻어진 데이터를 표 12에 보고하며, 하기에 논의한다.
단일 표지 대조군 샘플에서, Leu3a만으로 염색된 세포는 Leu3a-PE 결합에 대해 양성으로 시험되었고; mAb B4만으로 염색된 세포는 B4-FITC 결합에 대해 양성으로 시험되었다. 구체적으로, 비-감염된 침팬지 샘플 (X282 및 X301)에서 CD4+ 세포 (Leu3a에 의해 검출된 바와 같음)는 각각 25.5％ 및 44.0％였으며, 이는 mAb B4에 의해 검출된 것들 (26.1％ 및 45.5％)과 유사하였다.
Leu3a의 사전 결합 후 이어진 mAb B4에의 노출은 Leu3a 또는 B4 단독으로 염색된 단일 표지 대조군 세포와 유사한 이중 염색된 (Leu3a+/B4+) PBMC 세포 카운트를 초래하였다 (즉, X282 및 X301에 대해 각각 24.5％ 및 46.7％).
대조적으로, mAb B4의 사전 결합, 그 후 이어진 Leu3a에의 노출은 단일 또는 이중 염색 절차 중 어느 하나에서 Leu3a 양성 염색 없이 단지 mAb B4 염색된 PBMC를 초래하였다.
집합적으로, 이들 결과는 Leu3a-PE에 대한 항체 B4-FITC에 의한 한 방향 억제를 입증한다. 즉, B4 결합은 사전 Leu3a 결합에 의해 차단되지 않지만; 그러나, Leu3a 결합은 사전 B4 결합에 의해 차단된다. 이들 데이터는 mAb B4가 항체 Leu3a에 의해 인식되는 CD4 도메인 1의 CDR2 영역을 커버하는 입체형태적 에피토프를 인식하며, mAb B4가 항체 Leu3a에 비해 더 높은 친화도로 CD4의 이 영역에 결합한다는 결론을 뒷받침한다.
2.2 ELISA에 의한 HIV RC 펩티드 ( aa39 - 66)에 대해 지정된 면역 혈청에 의한 rsCD4에의 B4 결합의 경쟁적 억제
전장 재조합 가용성 CD4 (rsCD4)에 대한 mAb B4의 결합 친화도를 CD4 도메인 1의 CDR2 영역에 대해 지정된 면역 혈청을 사용한 경쟁적 억제 연구를 통해 평가하였다.
2.2. 1 항 -HIV RC 폴리클로날 항체. CD4 도메인 1의 CDR2 영역에 대한 폴리클로날 항체를, 기니아 피그를 CD4의 aa39-66을 포함하는 시클릭 펩티드로 면역화함으로써 제조하였다. 이 시클릭 펩티드는 이 연구에서 HIV 수용체 복합체 펩티드 (HIV RC 펩티드)로 지칭되며, 이전에 문헌 [Wang, et al., 2002]에서 펩티드 p2240c로서 기재되었다.
구체적으로, HIV RC 펩티드에 대해 지정된 기니아 피그 혈청을, 4 내지 6주령 던컨 하틀리 (Duncan Hartley) 기니아 피그를 제0주에서 완전 프로인트 아주번트 (Complete Freunds Adjuvant) 및 3 및 6주에서 불완전 프로인트 (Incomplete Freunds) 중에서 용량 당 0.5 ml 중 100 μg으로 근육내 면역화하고, 그 후 불완전 프로인트 중에서 매월 부스팅한 후에, 특정된 시점에서 얻었다.
얻어진 폴리클로날 항체는 "항-HIV RC 폴리클로날 항체"로 지칭된다.
2.2. 2 항 -HIV RC 폴리클로날 항체에 의한 rsCD4에의 B4 결합의 경쟁적 억 제. 전장 rsCD4로 웰 당 0.1 mL 중 0.08 μg/mL로 코팅된 96 웰 미세역가 플레이트를 사용하여 경쟁적 억제 실험을 수행하였다. 웰을 1:30 희석액에서의 HIV RC 펩티드 (CD4의 aa39-66)에 대해 지정된 면역원으로 면역화 후, 비오티닐화된 B4-항체에 의한 결합, 그 후 이어진 추적제로서의 접합된 아비딘-HRP과의 결합 후 0, 3, 6, 9, 12, 14, 16, 및 19주로부터 수집된 기니아 피그 혈청과 함께 인큐베이션하였다. 동일한 기간 전반에 걸쳐 수집된 비면역화된 기니아 피그로부터의 음성 대조군 혈청 (RC 이소형)을 또한 시험하였다.
도 16은 rsCD4에의 비오티닐화된-B4 결합이 초기 면역화 후 6주에서 얻어진 항-HIV RC 폴리클로날 항체에 의해 유의하게 억제되어, 초기 면역화 후 9주까지 거의 완전한 억제에 도달하였음을 나타낸다.
이 경쟁적 결합 억제 연구는 mAb B4의 결합 부위가 CD4의 도메인 1의 CDR2 루프 주위에 있지만, mAb B4에 의한 이 펩티드에의 직접 결합은 막-결합된 CD4의 입체형태적 윤곽에의 mAb B4의 선호적 결합으로 인해 유의하지 않았음을 추가로 입증하였다.
2.3 mAb dB4의 가교 시 HIV 감염된 개체에서의 향상된 바이러스 생산을 위한 휴지 CD4 양성 T 세포의 재활성화
휴지 CD4+ 세포를 활성화시키는 mAb dB4의 능력을, 세포를 mAb dB4로 처리하고, TNF-α 생산, 바이러스 로드, 및 세포 증식을 모니터링함으로써 평가하였다.
이 연구에서, 8-웰 배양 플레이트를, 플레이트를 200 μL의 염소 항-인간 IgG (잭슨 이뮤노리서치)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 인간 IgG로 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 4℃ 냉장고에서 이 연구에 추가로 사용할 때까지 유지하였다.
HIV 환자로부터의 PBMC를 1.5시간 동안 표준 관행에 따라 해동하였다. 휴지 CD4+ 세포의 활성화를, 하기 설명된 바와 같이 PBMC를 mAb dB4 (실험적), PMA+PHA (양성 대조군), 또는 배지 단독 (음성 대조군) 중 어느 하나로 처리함으로써 평가하였다.
2.3. 1 MAb dB4 처리. 세포를 3 μg/106 세포/mL의 농도의 mAb dB4로 4℃에서 1시간 동안 처리하여 세포 상의 CD4의 가교를 개시하였다. 그 후, mAb dB4로 처리된 세포를 세척하고, 코팅된 48-웰 배양 플레이트 상에서 7일 동안 RPMI 배지 및 10％ FBS와 함께 배양하였다. 비코팅된 웰을 또한 음성 대조군으로서 사용하였다. 배양 상청액의 분취액을 차후 평가를 위해 제0일, 제2일 및 제7일에 동결시켰다. mAb dB4 샘플에 대한 제0일 시점을, 4℃에서 30분의 처리 후에 세포로부터 상청액을 제거함으로써 얻었다.
2.3. 2 PMA + PHA 처리. 휴지 CD4+ 세포를 재활성화시키기 위한 양성 대조군으로서, 세포를 0.1 μM 피토헤마글루티닌 (PHA) 더하기 15 μg/mL 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA) (시그마) (PMA+PHA)로, 코팅된 48-웰 배양 플레이트 상에서 7일 동안 RPMI 배지 및 10％ FBS와 함께 처리하였다. 비코팅된 웰을 또한 음성 대조군으로서 사용하였다. 배양 상청액의 분취액을 차후 평가를 위해 제0일, 제2일 및 제7일에 동결시켰다. PMA+PHA 샘플에 대한 제0일 시점을, 4℃에서 30분의 처리 후에 세포로부터 상청액을 제거함으로써 얻었다.
2.3. 3 배지 단독. 음성 대조군으로서, 세포를 코팅된 48-웰 배양 플레이트 상에서 7일 동안 RPMI 배지 및 10％ FBS (배지 단독)와 함께 인큐베이션하였다. 비코팅된 웰을 또한 음성 대조군으로서 사용하였다. 배양 상청액의 분취액을 차후 평가를 위해 제0일, 제2일 및 제7일에 동결시켰다. 배지 단독 샘플에 대한 제0일 시점을, 4℃에서 배지 중에서 30분의 인큐베이션 후에 세포로부터 상청액을 제거함으로써 얻었다.
2.3. 4 CD4 + 재활성화의 분석. CD4+ 세포의 재활성화를, TNF-α 생산, 바이러스 로드, 및 세포 증식을 평가함으로써 측정하였다. 이 연구로부터의 결과를 표 13에 요약한다.
모든 샘플로부터의 분취액을 표준 방법을 사용하여 (1) 정량적 ELISA에 의해 TNF-α의 농도; (2) RT PCR에 의해 HIV 바이러스 로드; (3) 세포 카운트; 및 (4) 트리판 블루에 의해 생존력에 대해 검정하였다.
구체적으로, 데이터는 HIV 환자로부터의 mAb dB4 코팅된 PBMC 세포의 가교가 배지 단독 음성 대조군 (비-검출가능함) 및 PMA+PHA로 자극된 세포 (mAb dB4 코팅된 세포보다 약 3 내지 5배 더 높음)와 비교할 경우, TNF-α의 중등도 생산을 촉발시켰음을 나타낸다.
또한, mAb dB4 샘플은 배지 단독 음성 대조군과 유사한 속도로 증식한 반면; PMA+PHA 자극된 세포는 mAb dB4와 가교된 세포에 비해 훨씬 더 큰 정도로 증식하였다 (세포 카운트는 제7일에 mAb dB4 배양물보다 PMA+PHA 배양물에서 5배 더 높았음).
그러나, HIV 바이러스 로드는 배지 대조군 및 PMA+PHA 자극된 세포에 비해 mAb dB4와 가교된 세포에서 유의하게 향상되었다. 구체적으로, mAb dB4와 가교된 세포는 제2일 및 제7일에서의 배지 단독 음성 대조군과 비교할 경우 각각 바이러스 로드의 151％ 및 220％ 증가를 나타낸 반면; PMA+PHA 배양물은 세포 증식의 5배 증가에도 불구하고, 차선의 바이러스 로드 생산 (제2일 및 제7일에서 각각 55％ 및 78％)을 나타내었다.
3. 결론
1. 뮤린 mAb B4는 항체 Leu3a에 의해 인식되는 부위 (CDR2 영역 중의 aa47-64)에 가까운 CD4 상의 입체형태적 부위를 인식하는 것으로 밝혀졌다. mAb dB4는 실시예 7에서 보고된 비교 연구에 기초하여 mAb B4에 대해 본원에 기재된 것과 동일한 인식 특성을 가질 것으로 예상된다.
2. 전장 rsCD4에의 뮤린 mAb B4 결합은 CD4 도메인 1의 CDR2 영역의 aa39-66을 함유하는 시클릭 펩티드 (HIV RC 펩티드)에 대해 지정된 폴리클로날 항체에 의해 억제되었다. 이들 결과는 mAb B4가 CD4의 D1의 CDR2 루프에 상응하는 CD4의 aa39-66을 인식함을 시사한다. mAb dB4는 실시예 7에서 보고된 비교 연구에 기초하여 mAb B4에 대해 본원에 기재된 것과 동일한 인식 특성을 가질 것으로 예상된다.
3. mAb dB4와 가교되는 CD4는 HIV 감염된 PBMC CD4+ T 세포에서 바이러스 생산을 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, mAb dB4는 표 13에 나타낸 바와 같이, 세포 증식의 유도 없이 TNF-α 생산 및 향상된 HIV 생산의 유도를 초래한다.
4. 이 실시예에서 얻어진 결과에 기초하면, mAb dB4 (UB-421 포함)는 HIV 감염된 개체에서 향상된 바이러스 생산을 위한 휴지 PBMC의 재활성화를 매개할 수 있다.
실시예 10
MAB DB4C7 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체는 CD4 양성 T 세포에 의한 항원 유도된 T 세포 증식 및 시토카인 (IL2 및 IFN -γ) 생산을 억제하며, 따라서 피롭토시스의 HIV 병원성 주기를 브레이킹한다
1. 배경
최근의 보고는 HIV가 허용적, 활성화된 CD4+ T 세포를 감염시키는 경우, 세포 사멸이 카스파제-3-의존성 아폽토시스를 통해 침묵적으로 일어남을 보여주었다 (Doitsh, G., et al., 2014). 반대로, R5 또는 X4-트로픽 HIV 중 어느 하나가 림프성 조직으로부터의 비-허용적, 정지 CD4+ T 세포를 불발적으로 감염시키는 경우, 이들 세포는 프로그래밍된 세포 사멸의 극심하게 염증성 형태인 카스파제-1-의존성 피롭토시스에 의해 사멸한다. 인터페론 유도 인자 16 (IFI16)은 불완전 HIV 역전사체를 인식하고, 결국 카스파제-1의 활성화를 개시하는 숙주 DNA 센서로서 확인되었다 (Monroe, K.M., et al., 2013). 편도, 림프절 및 비장을 비롯한 대부분의 인간 림프성 조직에서, 세포의 활성화되고 허용적 하위집합은 총 CD4 T-세포의 5％ 이하를 나타내는 반면, 비-허용적 정지 세포는 HIV에 의해 마주친 표적의 95％ 이상을 나타낸다. 따라서, 카스파제-3-매개된 아폽토시스가 아니라 카스파제-1-매개된 피롭토시스는 이들 림프성 조직의 HIV 감염 후 CD4 T-세포 사멸의 유도를 우세하게 담당하는 것으로 보인다. 이들 발견은 R5-트로픽 HIV로 감염된 대상체로부터의 신선한 림프절의 분석에 의해 추가로 뒷받침되며, 여기서, 카스파제-1 및 IL-1β는 휴지 CD4 T 세포에 풍부한 부피질 구역에서 검출된 반면, 카스파제-3 활성은 증식적으로 감염된 세포가 발견되는 해부학적으로 별개의 배중심에서 검출된다.
피롭토시스는 가장 가능성있게는, 세포내 복제 니치를 제거하고, 염증유발 시토카인의 방출 및 내인성 위험 신호를 통해 숙주의 방어 반응을 향상시킴으로써 다양한 박테리아 감염의 급속한 청소를 촉진시킨다. 그러나, 병원성 만성 염증에서, 예컨대 HIV 감염에서, 피롭토시스는 보호적 반응이며, 1차 감염의 청소를 초래하지 않는다. 사실, 피롭토시스는 악성 병원성 주기를 생성하는 것으로 보이며, 여기서, 사멸하는 CD4 T 세포는 보다 많은 세포를 감염된 림프성 조직 내로 유인하여 사멸시키고 보다 많은 염증을 생성하는 염증 신호를 방출한다. 이들 사건은 질환 진행 및 조직 손상을 부추기는 염증의 만성 상태를 확립한다. 만성 염증은 또한 기억 CD4 T 세포의 항상성 증식을 자극하는 잠복성 HIV 병원소의 유지를 촉진시킬 수 있다.
CD4 T 세포의 고갈 및 만성 염증의 발달은 질환 진행을 추진시키는 HIV 발병기전에서 특징적인 공정이며, 피롭토시스는 이들 2가지 질환-촉진 공정 사이의 예상치 않은 관련을 제공한다.
상기 정보는 HIV 감염 동안 림프성 조직에서 일어나는 피롭토시스가 CD4+ 세포의 항원 자극에 의해 촉발되는 CD4+ 세포 증식 및/또는 염증성 시토카인 생산을 억제하는 메커니즘에 의해 경감되거나 감소될 수 있음을 시사한다.
2. 실험
mAb dB4가 HIV 감염된 개체에서 만성 염증의 발달을 억제함으로써 피롭토시스에 의해 유발된 병원성 주기를 브레이킹할 수 있는 지를 측정하기 위한 연구를 수행하였다. 항원 자극에 의해 촉발된 시토카인 생산의 억제는 이미 불발성 HIV 감염을 갖는 많은 휴지 T 세포에 의한 피롭토시스의 부하를 완화하며, 따라서 시토카인 생산으로 인한 CD4 양성 T 세포 고갈에서 HIV 병리학을 브레이킹하는 데 조력할 것이다.
스타필로코쿠스 내독소 B (SEB)를 채용한 시험관내 모델을 사용하여 정상 및 HIV 감염된 개체 둘 다에서 PBMC T 세포 증식을 억제하는 mAb dB4C7 (UB-421)의 능력을 평가하였다. SEB는 특정 T 세포 항원 수용체 (TCR)를 보유하는 모든 T 세포를 자극하는 능력을 가지며, 대량 시토카인 생산을 유도하는 초항원이다.
후옌 카오 (Huyen Cao) 및 모하메드 엘레패리 (Mohamed Elrefaei) 박사와의 공동연구를 통해, 정상 인간 공여자 (n=3) 및 HIV-감염된 공여자 (n=6, ART 나이브, CD4+ 카운트 > 200, 바이러스 로드 > 10,000)의 기능적 분석을 수행하여, mAb dB4C7 (UB-421) 또는 CD4의 D1의 CDR2 영역에 대해 지정된 항-HIV RC 폴리클로날 항체 (실시예 9에 기재됨)가 세포 증식 및 시토카인 (IL2 및 IFN-γ) 생산을 억제할 수 있는 지를 평가하였다.
2.1 연구 대상 및 샘플.
HIV-양성 ART 치료 나이브 자원자 (n=6)를 REACH 코호트 (샌 프란시스코)로부터 모집하였다. 3명의 동일-연령, HIV-혈청음성 대조군 자원자가 또한 연구에 포함되었다. PBMC를 분리하고, 검정 시간까지 액체 질소에서 저온보존하였다.
2.2 포화 농도의 mAb dB4C7 또는 정제된 항-HIV RC 폴리클로날 항체를 사용하였다.
CD4+ T 림프구를 먼저 간접 면역형광 연구에서 각각 mAb dB4C7 IgG 또는 항-HIV RC 폴리클로날 항체 IgG, 그 후 알렉사-염소 항-HuIgG 또는 알렉사-염소 항-기니아 피그 IgG로 염색하였다. 생성된 염색된 세포를 유동 세포측정법에 의해 검출된 양성 세포 퍼센트에 대해 분석하였다. mAb dB4C7 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체 둘 다는 2배 희석에서 50 μg/mL 내지 0.0025 μg/mL에서 역가화되었다. mAb dB4 및 항-HIV RC 항체에 대한 항체 적정은 ％ CD4 결합 대 항체 농도 (μg/mL)로서 측정되었다. 이들 적정은 HIV 감염된 개체 및 정상 개체에 대해 수행된 T 세포 기능적 검정에 사용하기 전에 평가되었다.
도 17은 기능적 연구에 사용된 각각의 시약에 대한 포화 농도가 mAb dB4 (dB4C7)에 대해서는 1 μg/mL이고, 항-HIV RC 폴리클로날 항체에 대해서는 25 μg/mL인 것으로 밝혀졌음을 나타낸다.
2.3 CD4 + 또는 CD8+ T 세포의 증식.
세포 증식을 CFSE (카르복시-플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (carboxy-fluorescein succinimidyl ester)) 형광 검정에 의해 분석하였으며, 이는 세포 분열 시 CFDA-SE (카르복시-플루오레세인 디아세테이트, 숙신이미딜 에스테르 (carboxy-fluorescein diacetate, succinimidyl ester)) 염색의 소실을 따른다. CFSE는 3H-티미딘 (증식) 검정을 위한 대용물로서 사용되었다.
PBMC를 포화 농도의 mAb dB4C7 또는 정제된 항-HIV RC 폴리클로날 항체와 함께 인큐베이션하여 세포의 표면 상의 CD4 수용체를 코팅하였다. 세포를 또한 각각 음성 및 양성 대조군으로서 25 μg/mL의 항-HIV RC 이소형 및 PHA (10 μg/ml; 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich))와 함께 인큐베이션하였다.
PBMC를 PBS 중 CFDA-SE (몰리큘라 프로브, 미국 오레곤주 유진)로 표지한 후, 100％ FCS (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스)로 켄칭하였다. 그 후, 세포를 PBS로 세척한 후 10％ FCS를 갖는 RPMI 1640 (시그마-알드리치)에 재현탁시켰다.
그 후, 세포를 SEB Ag (1 μg/mL)의 존재 하에서 37℃에서 5％ CO2 중에서 5일 동안 배양하고, 표면 마커의 발현에 대해 분석하였다.
CD3+ (암시안 (Amcyan)) 게이팅된 CD4+ (PE, D2), CD8+ (PercpCY5.5) 세포 집단의 분석을 위해 유동 세포측정법을 수행하고, 이들을 각각 증식하는 세포의 ％로서 ％ CFSE 양성 세포에 대해 추가로 측정하였다. LSR II (비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 사용하여 샘플 당 4만 (40,000)개의 림프구를 획득하고, FLOWJO 소프트웨어 (트리스타 (TreeStar), 미국 캘리포니아주 샌 칼로스)에 의해 분석을 수행하였다. 결과를 분열하는 CD4 (또는 CD8) T 세포의 ％로서 측정하였다. 모든 연구 참가자는 PHA 자극 후 유의한 증식이 입증되었다. SEB Ag 자극이 없는 CD4T 세포 (음성대조군)의 증식은 0.5％ 미만이었다.
2.4 시토카인 (IL2 및 IFN -γ) 생산의 측정을 위한 세포내 염색 검정.
PBMC (0.5 x 106 세포)를 37℃에서 5％ CO2 중에서 SEB Ag (1 μg/mL)와 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 0.1％ FCS를 함유하는 PBS (세척 완충제)로 세척하고, 세포를 실온에서 10분 동안 용해 용액 (비디 바이오사이언시즈)에 재현탁시킴으로써 고정하였다. 세포를 세척 완충제로 1회 세척한 후, 0.5 mL의 투과화 용액 2 (비디 바이오사이언시즈)에 재현탁시킴으로써 투과화하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세척 완충제로 세척하고, 항-IL-2 APC, 항-IFN-γ (PE CY7), 및 항-CD3 (암시안), 항-CD4 (PE, D2) 또는 항-CD8 (Percp CY5.5) (비디 파밍겐 (BD Pharmingen))으로 염색하였다. LSR II (비디 바이오사이언시즈)를 사용하여 샘플 당 4만 (40,000)개의 림프구를 획득하고, FLOWJO 소프트웨어 (트리스타)에 의해 분석을 수행하였다. Ag 자극 없는 시토카인-생산 CD4 또는 CD8 T 세포의 백분율은 0.05％ 미만이었다 (음성 대조군). 결과를 IFN-γ 또는 IL2를 발현하는 CD4+ (또는 CD8+) T 세포의 ％로서 표현하였다.
2.5 통계적 분석.
통계적 분석 및 비교를 대응표본 t 검정으로 수행하였다.
3. 결과
이 SEB Ag 유도된 T 세포 증식 연구로부터 얻어진 결과는 mAb dB4C7 (1 μg/mL) 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체 (25 μg/mL) 둘 다가, 포화 상태 하에서, CD4+ T 세포 증식을 감소시켰지만, 둘 다의 HIV ART 치료 나이브 환자에서 및 동일-연령 정상 개체에서 CD8+ T 세포 증식은 그렇지 않았음을 밝혀내었다 (데이터는 나타내지 않음).
mAb dB4 (1 μg/mL) 및 정제된 항-HIV RC 폴리클로날 항체 (25 μg/mL) 둘 다는, 그들의 각각의 포화 PBMC 표면 CD4 결합 농도에서, HIV 음성 (도 18a) 및 HIV 양성 (도 18b) 개체에서 초항원 SEB 유도된 증식성 CD4+ T 세포에 의한 IL2 생산을 억제하였다. 이러한 억제는 동일한 HIV 양성 및 음성 개체로부터의 CD8+ T 세포에서는 발견되지 않았다 (도 18c).
mAb dB4 (1 μg/mL) 및 정제된 항-HIV RC 항체 (25 μg/mL) 둘 다는, 그들의 각각의 포화 농도에서, 또한 HIV 음성 (도 18d) 및 HIV 양성 (도 18e) 개체에서 초항원 SEB 유도된 증식성 CD4+ T 세포에 의한 IFN-감마 생성을 억제하였다. 이러한 억제는 동일한 HIV 음성 (도 18f) 및 양성 (도 18g) 개체로부터의 CD8+ T 세포에서는 발견되지 않았다.
4. 결론
둘 다 CD4 도메인 1의 CDR2 영역을 표적화하는 항체 mAb dB4C7 (UB-421) 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체는 CD4 양성 T 세포에 의한 초항원 SEB 유도된 T 세포 증식 및 시토카인 (IL2 및 IFN-γ) 생산을 억제하지만, CD8 양성 T 세포에 의한 T 세포 증식 및 시토카인 (IL2 및 IFN-γ) 생산은 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다. dB4C7 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체가 CD4+ T 세포 증식 및 연관된 시토카인 (IL2 및 IFN-γ) 생산을 억제할 수 있다는 발견은 항체가 피롭토시스의 HIV 병원성 주기를 브레이킹할 잠재성을 갖는 다른 CD4 양성 세포 관련된 시토카인 생산에 대한 유사한 억제 효과를 발휘할 수 있음을 시사한다.
이 실시예 및 선행 실시예에서 관찰된 CD4 양성 T 세포 증식 및 연관된 시토카인 (IL2 및 IFN-γ) 생산에 대한 억제 효과는 본원에 기재된 CDR2 영역 표적화 항체가 (1) 그의 잠복성 상태로부터 HIV의 방출을 촉발시키는 휴지 HIV 감염된 CD4 양성 T 세포의 재활성화 (실시예 9에서 논의된 바와 같음); (2) 휴지 CD4+ T 세포의 재활성화에 의해 방출된 새로운 바이러스로부터의 비감염된 CD4 양성 T 세포 내로의 HIV 진입의 경쟁적 억제 및 방지 (실시예 4 및 6); 및 (3) (초)항원 자극 시 CD4 양성 T 세포에 의한 T 세포 증식 및 시토카인 생산의 억제 (이 실시예)를 비롯한, CD4 세포에 대한 동시 대향 효과를 발휘할 수 있다는 점에서 매우 중요하다.
HIV 결합 및 면역 반응의 억제의 바로 그 부위 (즉, CD4 도메인 1의 CDR2 영역)를 표적화하는 mAb dB4 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체의 독특한 생물학적 특색은 HIV 감염의 기능적 치유에 요구되는 특성, 즉, (1) 진입 억제를 통해 HIV 감염을 방지하고; (2) 휴지 T 세포에서 바이러스 생산을 재활성화시키고, (3) 시토카인 생산을 직접적으로 변경시키는 능력을 제공한다.
실시예 11
계통군 B의 HIV 1차 단리체 HIV- 1 DH12 로 챌린지된 침팬지에서의 MAB B4에 의한 HIV 감염의 노출전 및 노출후 예방 뿐만 아니라 치료
CD4 도메인 1의 CDR2 영역을 표적화하는 B4 관련된 고친화도 항체에 대한 많은 독특한 시험관내 특성이 입증되었으므로, 인간을 닮은 동물 모델에서 HIV 감염의 예방 및/또는 치료에 있어서의 B4 항체의 효능을 시험하는 것이 중요하였다. 침팬지는 100년 넘게 동안 인간 바이러스, 박테리아, 및 기생충 감염을 모델화하는 데 사용되었다. 계통군 B의 HIV 1차 단리체 HIV-1DH12를 사용한 침팬지에서의 주의깊게 연구된 챌린지 모델로, 노출전 및 노출후 방식 둘 다로 HIV-1 감염에 대한 수동 면역을 제공하는 mAb B4의 잠재성을 평가하는 챌린지 연구를 개시하였다. 구체적으로, mAb B4를 (1) 감염에 대해 노출된 대상체를 보호하기 위한 멸균 면역 및 (2) 항체가 감염의 확립 수 일 후에 주어진 경우 노출된 대상체에게 치료를 제공하는 그의 능력에 대해 평가하였다.
1. 침팬지에서의 mAb B4에 의한 HIV 감염의 노출전 및 노출후 예방.
챌린지 (HIV-1에의 노출) 전 및 후 방식 둘 다에서 HIV-1 감염에 대한 수동 면역을 제공하는 mAb B4의 잠재성을 평가하였다.
1.1 방법 .
1.1. 1 연구에 사용된 동물. 총 네 (4)마리의 침팬지를 이 연구에 사용하였다. 1마리의 침팬지는 노출전 치료 동물 (X084)로서 사용하였고, 2마리의 침팬지는 노출후 치료 동물 (X356 및 X357)로서 사용하였으며, 1마리의 침팬지는 대조군 (X259)으로서 사용하였다.
1.1. 2 HIV - 1 DH12 스톡으로의 감염에 대한 동물의 감수성. HIV-1DH12 스톡으로의 감염에 대한 동물의 감수성을 치료 및 감염 전에 그의 PBMC의 시험관내 감염에 의해 측정하였다. 모든 배양물은 바이러스에의 노출 3일 내에 감염되었다.
1.1. 3 mAb B4 항체. 주입용 mAb B4를 5 mg/mL의 고도 정제된 항체 제제로서 제조하였다.
1.1. 4 챌린지전 예방/ 치료. 침팬지 X084를 HIV-1DH12 챌린지 1시간 전에 5 mg/kg mAb B4로 정맥내로 주입하였다.
1.1. 5 챌린지후 예방/ 치료. 침팬지 X356 및 X357를 HIV-1DH12 챌린지 1시간 후에 5 mg/kg의 mAb B4로 정맥내로 주입하였다.
1.1. 6 대조군 동물. 침팬지 X259를 mAb B4 항체로 주입하지 않고 HIV-1DH12로 챌린지하였다.
1.1. 7 HIV - 1 DH12 로의 챌린지. 네 (4)마리의 침팬지를 사우스웨스트 파운데이션 포 바이오메디칼 리서치 (Southwest Foundation for Biomedical Research)에서의 침팬지 PBMC에서 이전에 제조되고 역가화된 바이러스 스톡으로부터 취해진 100 TCID50의 HIV-1DH12로 정맥내로 챌린지하였다.
1.1. 8 HIV - 1 DH12 바이러스의 검출. 침팬지에서의 감염의 확립을, gag 서열의 DNA PCR 증폭, 공동-배양, p24 포획 ELISA, 및 이뮤노블롯을 사용함으로써 혈장 바이러스혈증, 세포-회합된 바이러스 로드, 및 HIV에 대한 면역 반응의 검출에 의해 모니터링하였다. HIV 감염의 지표인 혈청 바이러스혈증을 연구의 50-주 기간 동안 모든 침팬지로부터 수집된 모든 혈액 샘플에서 HIV-1 RNA 카피/mL에 의해 측정하였다. HIV-1DH12 바이러스를 바이러스 단리에 의해 및 DNA PCR 검정에 의해 침팬지 PBMC에서 검출하여 gag에 상응하는 프로바이러스 DNA를 검출하였다. 바이러스 생산을 p24 항원 포획 ELISA (코울터 (Coulter))에 의해 평가하였다. 침팬지 PBMC 및 림프절 세포의 1 × 106 내지 1 × 102 세포의 계열 희석액을 제조하여 IL-2 배지 중에서 3일령 PHA-자극된 모세포로부터의 2 × 106 세포와 공동-배양하였다. p24의 생산을 초래한 최고 희석의 웰을 종점으로서 취하였다.
1.1. 9 동물 하우징. 침팬지를 사우스웨스트 파운데이션 포 바이오메디칼 리서치에서 국립 연구 회의 (National Research Council) 지침 및 기관 IACUC의 승인에 따라 유지하였다.
1.2. 결과
멸균 면역을 mAb B4에 의해 HIV-1DH12 챌린지를 받는 침팬지에게 제공하였다. HIV-1 챌린지 전에 mAb B4 항체로 주입된 동물 (X084) (도 19a)에서, 또는 HIV-1 처리 1시간 후에 mAb B4 항체로 주입된 2마리의 동물 (X356 및 X357) (도 19b)에서, 챌린지후 후속조치의 32주 동안 감염의 마커는 검출될 수 없었다.
대조적으로, 바이러스는 챌린지후 제1주에서 시작한 대조군 동물 (X259) (도 19c)로부터의 PBMC로부터 및 챌린지후 제2주에 의해 혈장으로부터 용이하게 단리되었다. 바이러스는 또한 제4주 및 제20주에 생검된 X259의 림프절 세포로부터 단리되었다. PBMC 및 림프절 구획 중의 감염된 세포는 1 × 104 내지 1 × 106 범위인 세포 수를 함유하는 희석액에서 검출되었다. 혈청전환은 동물 X259에서 제4주에 의해 일어났다.
순환에서 발견된 유리, 비결합된 mAb B4의 존재는 항체로 처리된 침팬지 X084, X356 및 X357에서 급속하게 감소하였다. 처리된 침팬지로부터의 CD4+ 및 CD8+ 하위집합을 챌린지후 20주에 걸쳐 모니터링하였으며, CD4+ 고갈의 증거는 없었다. 제32주를 통해 미토겐 (PHA, 포크위드 (Pokeweed) 미토겐, 및 콘카나발린 (Concanavalin) A)에 대한 침팬지 PBMC의 증식 반응의 억제는 없었다.
이 연구로부터의 결과는 mAb B4가 HIV 감염에 대한 예방 또는 멸균 치유를 제공할 수 있음을 지시하며, 이는 챌린지 일로부터 심지어 1년의 혈청 바이러스혈증 및 다른 파라미터의 광범위한 후속조치에 의해 문서화되었다.
1.3. 결론
침팬지 시험에서, 독성 1차 단리체에 의한 HIV 감염은 노출 전, 또는 노출 후 짧은 간격 내에 mAb B4의 투여에 의해 중단되었다. 전달된 면역은 일시적, 감소된, 또는 지연된 바이러스혈증의 증거를 갖지 않는 멸균이었다. 혈장으로부터의 mAb B4 항체의 급속한 청소에도 불구하고, 말초 혈액 및 림프 조직에서 CD4+ 세포 상에 격리됨으로써, 완전한 보호는 명백하였다.
이 주의깊게 실행된 실험은 (i) HIV를 마주친 것으로부터 수 시간 내의 환자 또는 (ii) 분만 시 혈청양성 어머니에게 태어난 아기에 대해 5 mg/kg의 mAb B4 또는 관련된 항체를 사용하여 멸균 치유에 도달하는 치료 프로토콜을 추가로 시사하였다.
1.4 mAb B4에 의한 노출후 예방을 위한 적용.
미국 공중 보건국 지침은 HIV에의 우연한 노출 후의 의료계 종사자를 위해 항레트로바이러스 약물을 사용한 노출후 예방을 권고하였다. 그러나, 미국 공중 보건국 지침은 노출후 예방을 위해 현재 이용가능한 약물의 독성에 관한 의구심을 표명한다.
이 연구에서 얻어진 결과는 현재 노출후 치료 대신, 또는 그와 함께 사용될 수 있는 노출후 예방적 치료로서 mAb B4를 사용하는 것의 잠재성을 입증한다. mAb B4의 낮은 독성 및 효능은 항레트로바이러스 약물보다 더 폭넓게 활성인 항체의 잠재성을 입증한다.
이들 결과는 mAb B4가 어머니-대-어린이로부터의 HIV의 수직 전파의 예방에 사용될 수 있음을 추가로 시사한다. 주산기 또는 수직 전파로도 지칭되는 HIV의 어머니-대-어린이 전파 (MTCT)는 HIV가 임신, 출산, 및/또는 분만 또는 모유수유 동안 HIV+ 여성으로부터 그녀의 아기로의 확산이다. MTCT의 가능성은 바이러스에 대한 치료를 받지 않는 HIV+ 여성에 대해 임신, 출산, 및 분만 동안 약 25％이다. 그의 영아에게 모유수유하는 비치료된 HIV+ 여성에서 MTCT의 추가의 12％ 가능성이 있다. 2001년에 전세계적으로 1.8 백만명의 여성이 HIV로 감염되었고, 대략 800,000명의 어린이가 또한 HIV에 감염되었으며, 그들 중 대다수는 MTCT를 통해서였다. 전세계적으로 HIV로 새롭게 진단된 사람들의 대부분은 15 내지 24세이다. MTCT 예방의 매우 중요한 요소는 젊은 사람들, 특히 성관계를 갖기 전의 소녀 및 젊은 여성에 대한 HIV 예방, 및 이미 감염된 사람들에 대한 치료임이 틀림없다. MTCT에 관련된 추가의 정보는 http://caps.ucsf.edu/archives/factsheets/mother-to-child-transmission-mtct#sthash.DTRyms46.dpuf에서 발견될 수 있다. mAb B4로 얻어진 결과는 MTCT가 HIV+ 여성의 신생아에게 5 mg/kg 이상의 mAb dB4의 단일 투여를 제공함으로써 출산 및 분만 단계 동안 예방될 수 있었음을 시사한다.
2. 침팬지에서의 mAb B4에 의한 HIV 감염의 치료.
2.1 방법 .
2.1. 1 연구에 사용된 동물. 이전 예방 연구에 사용되고, 5 mg/kg의 mAb B4의 단일 투여를 받을 때 HIV-1DH12 감염으로부터 보호된 침팬지 X084, X356, 및 X357을 치료 방식으로의 이 챌린지 연구에 재사용하였다.
2.1. 2 HIV - 1 DH12 스톡으로의 감염에 대한 동물의 감수성. 항체 처리 및 HIV 챌린지 전에, HIV-1DH12로의 감염에 대한 감수성을 측정하기 위해 PBMC를 동물로부터 제조하였다. 모든 시험관내 배양물은 바이러스로의 접종 3일 내에 감염되었다.
2.1. 3 mAb B4 항체. 주입용 mAb B4를 5 mg/mL의 고도 정제된 항체 제제로서 제조하였다.
2.1. 4 HIV - 1 DH12 로의 챌린지. 모든 동물 (X084, X356, 및 X357)을 사우스웨스트 파운데이션 포 바이오메디칼 리서치에서의 침팬지 PBMC에서 이전에 제조되고 역가화된 바이러스 스톡으로부터 취해진 100 TCID50의 HIV-1DH12로 정맥내로 챌린지하였다.
2.1. 5 챌린지후 치료. 침팬지 X084는 임의의 챌린지후 치료를 갖지 않았다. 침팬지 X357은 챌린지후 제14일에 5 mg/kg의 mAb B4로 주입하였으며, 이 때 HIV 바이러스혈증은 HIV 감염의 치료를 위해 챌린지된 동물에서 가장 높았다. 침팬지 X356은 챌린지후 제14일, 제18일, 및 제22일에 5 mg/kg의 mAb B4로 주입하였다.
2.2 결과의 요약
이 수동 면역요법 연구는 급성 단계 HIV 감염을 갖는 침팬지에서의 mAb B4의 치료 효능을 측정하기 위해 뮤린 mAb B4의 5 mg/kg 주입으로 수행되었다. 3마리의 침팬지 (X084, X356, 및 X357)를 HIV-1DH12로 정맥내로 (i.v.) 접종하고, 감염의 확립을 바이러스 검출 (나타내지 않음) 및 정량적 RT-PCR에 기초하여 확인하였다.
HIV-1DH12로부터의 RNA를 모든 침팬지 (X084, X356, 및 X357)에서 노출후 7일에 의해 RT-PCR에 의해 검출하였다 (기준선 초과). 세포-회합된 바이러스를 14일에 모든 3마리의 동물로부터의 PBMC 및 림프절 세포에서, 바이러스 단리에 의해 및 HIV-1DH12 통합의 검출을 위한 DNA-PCR에 의해 검출하였다.
감염후 제14일에, 2마리의 감염된 침팬지 (X356 및 X357)를 mAb B4 (5 mg/kg, i.v.)로 주입하였다. 감염후 제18일 및 제22일에, 1마리의 동물 (X356)은 항체의 2회의 추가의 용량 (5 mg/kg, i.v.)을 받았다. 바이러스 로드를 RT-PCR 검정에 의해 매주 간격으로 첫번째 12주 동안, 그 후 감염후 40주까지 매월 모니터링하였다. 침팬지 X356 및 X357를 mAb B4로 주입한 날인 감염후 제14일에 의해, 바이러스 RNA는 이미 급속하게 상승하는 단계에 있었다. 그 후, 항체를 받는 2마리의 침팬지는, 비처리된 침팬지 (X084) (도 20a, 빈 원)에 비해, 제20일에 의해 1 내지 2 로그의 그들의 바이러스 로드의 급속하고 유의한 감소, 및 4주로부터 1주로의 1차 바이러스혈증 기간의 지속기간의 현저한 감소 (도 20a, 채워진 원)를 경험하였다.
도 20a 및 20b는 비처리된 대조군 침팬지 X084 (이 연구로부터, 이전에 mAb B4의 단일 노출전 용량을 받았음) 및 비처리된 대조군 X259 (이전 연구로부터, mAb B4의 용량을 받지 않았음)에서의 혈장 바이러스혈증의 지속기간을 mAb B4의 3회 주입을 받는 침팬지 X356과 비교하였다. 침팬지 X084 (도 20a, 빈 원) 및 X259 (도 20b, 빈 원)는 임의의 개입 없이 HIV-1DH12에 의해 챌린지되었으며, 바이러스 챌린지 후의 혈청 HIV-1 RNA 카피로서 검출된 바이러스혈증이 제3일만큼 빨리 나타나기 시작하였다. HIV-1DH12 감염에 대해 특징적인 혈청 HIV-1 바이러스혈증의 지속기간은 약 42일 지속되었다. 침팬지 X356 (도 20a 및 20b, 채워진 원)은 mAb B4의 3회 투여를 받았으며, HIV-1 바이러스혈증은 그 후 가파르게 강하하여 제21일 경에 비-검출가능한 수준에 도달하였다. X356과 X084 및 X259 사이의 바이러스 로드 데이터의 비교는 HIV-1DH12 감염의 특징적 바이러스혈증 지속기간으로부터 21일의 감소를 나타낸다.
상기 언급된 바와 같이, 이 연구로부터의 비처리된 대조군 침팬지 X084는 사전 연구에서 mAb B4의 단일 노출전 투여를 받은 반면; 이전 연구로부터의 비처리된 대조군 침팬지 X259는 mAb B4의 임의의 투여를 받지 않았다. 흥미롭게도, X084 (도 20a, 빈 원)와 X259 (도 20b, 빈 원)에 대해 얻어진 데이터의 비교는 X084가 X259에 비해 연구 기간에 걸쳐 전반적인 보다 낮은 바이러스 로드를 가졌음을 나타낸다. 따라서, 이 연구에서 비처리된 동물 (X084)의 바이러스 로드는 mAb B4 처리된 동물 (X256)보다 유의하게 더 높았지만, X084에서 mAb B4에의 사전 노출은 특히 HIV 감염의 급성 단계 동안 전반적 바이러스 로드를 유의하게 감소시키는 것으로 보인다 (X084와 X259를 비교). 집합적으로, 이들 결과는 HIV 노출 전의 mAb B4의 임의의 투여가 감염의 급성 단계 동안 바이러스 로드의 강도를 감소시킬 수 있으며, 이는 감염후 개체로부터 개체로의 바이러스의 전파를 추가로 감소시킬 수 있음을 시사한다.
세포 표면 염색을 또한 수행하였으며, mAb B4는 제14일에 mAb B4의 단일 용량이 주어진 동물 (X357)에서 적어도 7일 동안 CD4+ 세포에 결합된 채 남아 있으며, 항체의 다중 용량이 주어진 동물 (X356)에서는 적어도 14일 동안 지속되었음이 밝혀졌다. 대조적으로, 유리 mAb B4는 HIV-1DH12 단리체에 대한 중화 활성에 의해 측정된 바로, 주입후 단지 3일 동안 둘 다의 동물에서 순환에서 검출되었다. 침팬지 예방 연구에서와 같이, 이는 mAb B4가 CD4+ 세포에 결합함으로써 순환으로부터 제거되었음과 일치한다.
FACS 분석은 CD4/B4 에피토프에 대한 시험관내 면역염색에 의해 40주를 통해 모든 샘플에서 CD4+ 세포를 주목할만한 고갈 없이 검출하였다. 주입된 mAb B4의 면역염색을 최초 21일 동안 PBMC에 대해 수행하였다. 항체 처리 전후의 PBMC 샘플의 미토겐-유도된 증식 반응 (Con A, PWM, 또는 PHA를 사용함)은 가변적이었으며, mAb B4로의 주입에 의해 영향을 받은 것으로 보이지 않았다. 이들 관찰은 mAb B4가 바이러스 감염을 전복시키고, 지나친 면역독성의 증거를 갖지 않고 바이러스 로드 및 바이러스혈증 기간 둘 다를 감소시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 12
개코원숭이에서의 UB -421 제제, 전-임상 약리학/독성 연구 및 인간 조직에서의 교차-반응성
도입
이전 실시예에서 논의된 세포 배양 및 침팬지 연구로부터 얻어진 데이터는 인간 용도를 위한 mAb dB4를 함유하는 제약 제제의 추가의 개발을 정당화하는 충분한 과학적 장점을 입증하였다. mAb dB4C7 (UB-421)을 함유하는 제약 제제를 제조하고, 일반적 안전성 시험을 임상 용도를 위해 제조된 로트에 대해 수행하였다.
약물 후보 UB-421에 대한 약역학, 약동학, 독성, 및 안전성 정보를 얻기 위한 전-임상 안전성 연구의 패널을 또한 수행하였다.
무증상 HIV-1 감염된 인간 대상체에서 UB-421의 용량-의존성 안전성, 내약성 및 면역독성을 평가하기 위한 I상 임상 시험의 설계를 용이하게 하기 위해, 단일- 및 다중-투여 뿐만 아니라 용량-의존성 (저- 및 고-용량) 연구를 개코원숭이 (파피 오 (Papio) 종)에서 수행하였다. 도 21에 나타낸 바와 같이 (즉, 인간 및 개코원숭이에 대해 각각 EC50= 0.33 μg/mL 및 0.29 μg/mL), 개코원숭이에서의 CD4+ T 세포가 인간과 유사한 mAb dB4C7에 대한 결합 친화도를 갖기 때문에, 개코원숭이를 전-임상 약리학/독성 연구에서 동물 모델로서 사용하였다. 개코원숭이에서의 비-인간 영장류 약리학 및 독성 연구를 미국 텍사스주 샌 안토니오에 소재하는 사우스웨스트 파운데이션 포 바이오메디칼 리서치 바이러스학 및 면역학 부의 크리시나 머티 (Krishna Murthy) 박사와의 공동연구에서 개시 및 수행하였다.
또한, UB-421가 임의의 비의도적 반응성 및 의도된 표적과는 별개의 인간 조직을 향한 세포독성의 잠재적 위치를 갖는지 여부를 평가하기 위한 교차-반응성 연구를 수행하였다.
하기에 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 이들 전-임상 연구로부터 얻어진 데이터는 인간 임상 시험에서 조사적 새로운 약물로서 UB-421의 추가의 개발을 정당화하는 충분한 과학적 장점을 입증한다.
1. 제약 제제
mAb dB4C7을 함유하는 제약 제제를 인간 용도를 위해 제조하였다. 일반적으로, mAb dB4C7을 함유하는 제약 제제는 6.0 내지 7.0의 pH의 시트르산염, 인산염, 트리스, BIS-트리스 등을 비롯한 그러나 이에 제한되지 않는 적절한 완충제 중에서 제조될 수 있으며, 또한 부형제, 예컨대 당 (50 mM 내지 500 mM의 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 또는 이들의 혼합물), 계면활성제 (예를 들어, 0.025％ 내지 0.5％의 트윈 20 또는 트윈 80), 및/또는 다른 시약을 함유할 수 있다.
UB-421은 pH 6.5의 인산염 완충 염수 (PBS) 중 10 mg/mL mAb dB4C7, 20 mM 글리신, 및 0.05％ (v/v) 트윈 (폴리소르베이트 20)을 함유하는 제약 조성물에 대한 명칭이다.
mAb dB4의 고농도 제제를 또한 피하 주사를 비롯한 특정 적용에 사용하기 위해 제조하였으며, 이는 10 mM 히스티딘을 포함하였다.
생성 후, 제조된 약물 생성물이 인간 및 동물 대상체에게 투여하기에 안전함을 보장하기 위한 일반적 안전성 및 독성 연구를 수행하였다.
2. 일반적 안전성 연구
2.1 UB -421 생성 로트 및 안전성 기준
UB-421 약물 생성물 (P/N Z807, 로트 번호 225711 및 225758)의 2가지 대규모 생성을 임상 시험에 사용하기 위해 제조하고, 일반적인 안전성에 대해 평가하였다.
UB-421의 대규모 배치 (로트)는 하기 기준이 7-일 시험 기간 동안 충족된 경우 안전하며 임상적 사용에 허용되는 것으로 간주되었다: (1) 모든 동물이 시험 기간까지 생존하였음; (2) 독성의 명백한 징후가 관찰되지 않았음; 및 (3) 어떠한 동물도 제약 조성물이 투여된 시간과 시험 기간의 종료까지의 사이에 인식가능한 체중 감소를 갖지 않았음.
2.2 시험 동물
마우스: (알비노 (Albino), BALB/cByJNarl 균주 (무스 무스쿨루스 (Mus musculus)), 특이적 병원체 무함유, 수컷 (내셔널 애니멀 리서치 래버러토리 (National Animal Research Laboratory) (NLAC), 타이완)). (연구 번호 BIO-003.90)
기니아 피그: (알비노, 하틀리 균주 (카비아 포르셀루스 (Cavia porcellus)), 특이적 병원체 무함유, 수컷 (내셔널 타이완 유니버시티 호스피탈 (National Taiwan University Hospital) (NTUH), 애니멀 센터 (Animal Center), 타이완)). (연구 번호 BIO-003.91)
2.3 방법
두 (2)마리의 마우스 및 두 (2)마리의 기니아 피그를 복강내 경로에 의해 UB-421의 각각의 로트에 대해 주사하였다. 대조군 마우스 및 기니아 피그를 복강내 경로에 의해 등장성 염화나트륨 용액 ("S.T.", 로트 번호 1OC0206)으로 주사하였다. 각각의 마우스는 0.5 mL 총 부피를 받았으며, 각각의 기니아 피그는 5.0 mL 총 부피를 받았다. 동물의 체중을 투약 전 (제0일) 및 종료 전 (제7일)에 기록하였다. 각각의 동물을 매일 일반적 건강 및 독성의 임상적 징후에 대해 관찰하였다.
2.4 분석 및 결론
일반적 안전성 연구로부터의 결과는 분석된 기준에 대해 하기 만족스러운 결과를 산출하였다:
(1) 일반적 안전성 시험에 사용된 모든 동물은 시험 기간 동안 생존하였다.
(2) 어떠한 독성의 명백한 징후도 UB-421-처리된 동물에서 관찰되지 않았다.
(3) 어떠한 동물도 시험 기간 동안 체중이 감소하지 않았다.
상기의 관점에서, 로트는 예상치 않은, 비허용되는 이질적인 오염물에 대해 음성으로 간주되었다.
이들 발견은 UB-421의 대규모 생산 로트 (로트 번호 225711 및 225758)가 예상치 않거나 비허용되는 이질적인 오염물에 대해 음성이었음을 확인시켜 주었다. 따라서, 이들 2가지 로트는 안전하며 인간 임상 시험에 사용되는 데 허용되는 것으로 간주되었다.
3. 연구 A: 개코원숭이에서의 UB -421의 단일 투여 독성 연구
3.1 방법
연구 A는 표 14a에 나타낸 바와 같이, 42-일 기간에 걸친 UB-421의 저-용량 (5 mg/kg 체중) 또는 고-용량 (25 mg/kg 체중) 중 어느 하나의 단일 투여의 약역학, 약동학 및 안전성을 평가하였다. 이 연구에서, UB-421을 30분에 걸쳐 5 mg/kg 또는 25 mg/kg 체중 중 어느 하나로 정맥내 주입에 의해 투여하였다. 혈액 샘플을 약동학 (PK) 분석을 위해 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24시간에서, 및 2, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42일에서 수집하였다.
하기 마커: CD4 도메인 1 (항-CD4+D1), 및 CD4 도메인 2 (항-CD4+D2)를 사용하여 혈액 샘플을 유동 세포측정법 분석에 의해 분석하여 CD4+ T 림프구의 존재를 모니터링하였다. 알렉사-dB4는 모노클로날 항체 UB421 및 CD4 도메인 1 및 2에 대해 지정된 것들에 의한 경쟁적 CD4 결합에 대한 마커 및 추적제 둘 다로서 사용되었다. 알렉사-염소 CD4 도메인 1 및 2에 대해 지정된 항-huIgG는 모노클로날 항체에 대한 추적제로서 사용되었다. 또한, CD3 및 CD14에 대해 지정된 항체는 PBMC 제제에서 총 T 세포 카운트 (CD3) 및 단핵구 (CD14)를 모니터링하는 데 사용되었다.
3.2 결과의 요약
UB-421이 인간에서의 I상 임상 시험을 진행하지 않아야 함을 시사하는 일치하는 부정적 관찰은 약역학, 약동학 및 안전성 연구에서 발견되지 않았다. 평가된 모든 파라미터에 대해, 유의하게 평균 초과 또는 미만 ("정상 범위 밖")인 것으로 밝혀진 임의의 데이터 점은 대조군 및 실험 동물 둘 다에서 관찰되었다.
UB-421의 초기 약동학 (PK) 특성을, 저용량 (5 mg/kg) 및 고용량 (25 mg/kg) UB-421의 단일 투여로 처리된 개코원숭이로부터 얻어진 혈액 샘플을 평가함으로써 평가하였다.
이 연구로부터의 결과는 UB-421로의 처리가 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 림프절 생검 샘플의 세포 현탁액 중 어느 하나로부터 단리된 CD3+CD4+ T 림프구 및 CD14+CD4+ 단핵구의 검출의 극적인 감소를 초래하였음을 나타내었다. 이들 세포의 감소는 CD4+ 세포의 UB-421로의 "코팅"으로 인한 것이며, 동물에서 CD4+ 세포의 고갈로 인한 것은 아닌 것으로 의심되었다. 이 의심은 항-CD4+ D2 마커에 대한 항체에 의해 검출된 CD4+ T-림프구의 백분율의 변화가 없었음이 밝혀졌을 때 확인되었다. 주입 후의 CD4+ 세포 상의 UB-421에 의한 이러한 "코팅"의 지속기간은 저용량을 받는 동물에서는 적어도 3일, 및 고용량을 받는 동물에서는 적어도 7일이었다. UB-421이 동물의 혈장에서 더 이상 검출되지 않았을 경우, CD4+ 세포 상의 "코팅"은 감소하였으며, CD4+세포 (항-CD4+D1에 의해 검출된 바와 같음)는 항-CD4+D2에 의해 검출된 것과 동일한 백분율로 복귀하였다.
요약하면, 이 연구는 UB-421가 안전한 것이며, 저용량 UB-421이 투여된 경우는 적어도 3일 동안, 및 고용량 UB-421이 투여된 경우는 적어도 7일 동안 CD4 양성 세포를 완전히 코팅할 수 있었음을 밝혀내었다. 이전 실시예에서 논의된 결과에 기초하면, CD4+ 세포가 완전히 코팅되는 경우, HIV는 세포 내로 진입하는 것으로부터 완전히 배제될 것으로 예상되며, 이는 바이러스 로드의 감소를 산출할 것이다.
4. 연구 B: 개코원숭이에서의 다중 투여 독성 연구
4.1 방법
연구 B는 표 14b에 나타낸 바와 같이, 56-일 (8주) 기간에 걸친 UB-421의 저-용량 (5 mg/kg 체중) 또는 고-용량 (25 mg/kg 체중) 중 어느 하나의 반복 투여의 약역학, 약동학 및 독성학을 평가하였다. 이 연구에서, 치료 단계는 매주 간격으로 주어진 UB-421의 총 8회 투여 (주 당 1회 투여)로 이루어졌다. 8-주 치료 단계의 종료 시에, 치료된 동물의 1/2을 부검하고, 평가하였다 (표 14b, 파트 1). 나머지 동물은 12-주 회복 단계까지 지켜보았으며, 여기서, 동물을 관찰을 위해 및 혈액 및 림프절 샘플을 수집하기 위해 유지하였다 (표 14b, 파트 2). 혈액 샘플 (및 림프절 생검*)을 치료 단계 동안 0*, 1, 3, 7*, 14, 21, 28, 35*, 42, 49, 56*일에, 및 회복 단계 동안 63*, 70, 77, 91, 105*, 133일에 분석을 위해 동물로부터 수집하였다. 성체 수컷 (M) 및 암컷 (M) 개코원숭이 (n = 20; 연령: 7 내지 18세)를 시험 시스템으로서 사용하였다.
4.2 결과의 요약
저용량 (5 mg/kg) 및 고용량 (25 mg/kg) UB-421의 다중 투여에 대한 약동학, 약역학, 독성, 및 안전성 정보를 전-임상 연구의 광범위한 패널로부터 얻었다.
집합적으로, 연구 B의 파트 1 및 파트 2로부터 얻어진 데이터는 UB-421 약물 후보가 조사적 새로운 약물로서의 추가의 개발을 위한 과학적 장점을 가졌음을 지시하였다. UB-421이 인간에서의 I상 임상 시험으로 진행하지 않아야 함을 시사하는 일치하는 부정적 관찰은 약역학, 약동학 및 안전성 연구에서 발견되지 않았다. 평가된 모든 파라미터에 대해, 유의하게 평균 초과 또는 미만 ("정상 범위 밖")인 것으로 밝혀진 임의의 데이터 점은 대조군 및 실험 동물 둘 다에서 관찰되었다.
4.2. 1 혈액 및 생검 분석. 시험의 광범위한 패널을 저용량 및 고용량 UB-421의 다중 투여로 처리된 동물로부터 얻어진 샘플에 대해 수행하였다. 이들 시험으로부터의 결과를 표 15 및 17에 요약하며, 하기에 추가로 논의한다.
UB-421은 UBI ELISA 시험 (실시예 7에서 논의된 바와 같음) 및 MT-2 검정 (실시예 2에서 논의된 바와 같음) 둘 다를 사용하여, 저용량 (5 mg/kg) UB-421을 받는 동물에서는 적어도 3일 동안, 및 고용량 (25 mg/kg) UB-421을 받는 동물에서는 적어도 7일 동안 혈장에서 검출가능하였다. 최후 주입 후 적어도 14일 동안 일부 고용량 동물의 혈장에서 과량의 UB-421이 검출되었다.
UB-421에 대해 지정된 개코원숭이 항체는 UB-421을 받는 16마리의 동물 중 어느 것에서도 발견되지 않았으며, 이는 약물 후보가 처리된 동물에서 면역원성이 아니었음을 확인시켜 주었다.
모든 개코원숭이를 제0일 및 제28일에 B형 간염 바이러스 (HBV) 백신 (머크 (Merck))로 면역화하였다. 검출가능한 수준의 개코원숭이 항-HBsAg 항체가 제56일에서 4마리의 대조군 (1B) 동물 중 4마리, 저용량 (2B) UB-421을 받는 8마리의 개코원숭이 중 6마리, 및 고용량 (3B) UB-421를 받는 8마리의 개코원숭이 중 3마리에서 발견되었다. 이들 결과는 CD4+ 세포의 UB-421 "코팅"은 일부 동물에서 저-반응성을 유발하여 항원에 대한 면역화를 방지할 수 있음을 시사한다. 그러나, 이러한 저-반응성 효과는, 이들 동물이 UB-421 치료의 중단 및 HBV 백신으로의 추가의 면역화 후에 항-HBsAg 항체를 발달시킬 수 있었기 때문에, 가역적인 것으로 밝혀졌다.
4.2. 2 관찰 및 부검 결과. 이 연구에서 처리된 개코원숭이의 육안 및 현미경적 분석을 표 16 및 17에 요약한다.
일반적으로, 이 연구 (파트 1 및 2)에서 평가된 모든 개코원숭이로부터 취해진 조직은 저 또는 고용량 수준 중 어느 하나의 UB-421의 투여에 기여할 수 있는 임의의 독특하거나 일치하는 병리학적 변화를 나타내지 않았다.
검안경 (눈) 검사를 주입 전 등록 시에, 및 최후 주입 1주 후에 치료 단계의 종료 시에 다시 모든 군 3B (고용량) 동물 (n = 8)에 대해 수행하였다. 이들 동물로부터의 안과 보고서 (Ophthalmic Reports)는 양쪽 눈이 치료 단계의 종료 시에 수행된 모든 시험에 대해 정상 한계 내에 남아 있었음을 지시하였다.
심전도 (ECG) 기록을 각각의 용량의 투여 전, 동안, 및 완결 후에 모든 동물 (n = 20)로부터 얻었다. 연구된 모든 동물로부터의 심전도 보고서 (Electrocardiogram Reports)는 확인된 ECG 변화는 정상적인 하루하루 변동 내에 있다고 결론내렸다.
4.2. 3 IND - 가능화 독성학 결과
HBV 백신화에 대한 감소된 면역 반응을 제외하고는, UB-421 처리군 (2B 및 3B)과 대조군 (1B) 사이의 면역독성 결과에 유의한 차이는 없었다. 임상 실험실 시험 결과, 안과 (눈) 보고서, ECG 기록, 및 조직병리학 결과는 UB-421이 안전하며, 25 mg/kg 이하의 용량 수준에서 8회 매주 주입, 즉, 표적 세포를 그들을 고갈시키지 않고 유효하게 코팅한 처리를 받은 후에 성체 개코원숭이에서 내약성이 양호하였다는 결론을 뒷받침하였다.
5. 인간 조직에서의 교차 반응성 연구
이전 실시예에서 논의된 바와 같이, mAb dB4C7 (UB-421 약물 후보에서의 주요 성분)을 비롯한 mAb dB4 항체는 CD4, 및 특히, T 세포 상의 막-결합된 CD4에 대한 높은 결합 친화도를 입증한다. 30종의 인간 기관으로부터의 조직의 어레이를 사용한 하기 전-임상 연구는 mAb dB4C7이 다른 세포 유형에 결합하는지 여부를 평가하였다. 이 연구의 목적은 mAb dB4C7이 임의의 비의도적 반응성 및 의도된 표적과는 별개의 인간 조직을 향한 세포독성의 잠재적 위치를 갖는지 여부를 평가하는 것이었다.
5.1 방법
3명의 정상 인간 개별적 공여자로부터 각각의 기관을 취하여, 30종의 기관의 90개의 총 조직 코어를 함유하는 FDA 표준 동결된 조직 어레이 (미국 바이오맥스 티슈 마이크로 어레이 (US BioMax Tissue Micro Array) (TMA) 슬라이드, 미국 메릴랜드주 로크빌)를 사용한 면역조직화학 연구를 수행하였다. 개별적 인간 시료의 추가의 저온장치 섹션은 또한 표 18에 기재된 바와 같이 인간 조직 패널에 포함되었다. 인간 조직의 패널을 비오티닐화된 mAb dB4C7 및 대조군 시약 (비오티닐화된 염소 항-토끼 IgG)을 사용하여 면역반응성에 대해 스크리닝하여 특이성 및 바람직하지 않은 자가반응성의 평가하였다.
5.2 결과
성인 정상 조직 섹션 상에서 관찰된 염색 패턴을 검토하고, 페노패쓰 래버러토리즈 (PhenoPath Laboratories) (미국 워싱턴주 시애틀)의 공인 임상 병리학자에 의해 반응성에 대해 점수화하였다. 강한 양성 표면 막 염색이 흉선, 및 편도 (및 림프절) 중의 T-세포 의존성 영역에서 관찰되었으며, 약한 양성 반응성이 비장에서 주목되었다. 가끔의 단핵 세포는, 림프구 또는 대식세포와 일치하게, 예상된 패턴으로 다중 조직에서 양성으로 염색되었다. 간에서의 초점성 약한 쿠퍼 (Kupffer) 세포 염색이 또한 주목되었다. 일부 조직에서의 내인성 비오틴의 약한 염색을 제외하고는, 시험된 모든 다른 성인 인간 조직은 음성이었다. 비표지된 mAb dB4C7 항체와 함께의 편도 섹션의 예비-인큐베이션은 특이적 염색 패턴을 차단하였다. 예상치 않은 교차-반응성은 관찰되지 않았다.
이들 결과는 mAb dB4C7 (UB-421에서의 주요 성분)이 의도된 표적과는 별개의 인간 조직을 향한 세포독성을 잠재적으로 초래할 수 있는 임의의 비의도적 교차-반응성을 갖지 않음을 확인시켜 주었다.
실시예 13
무증상 HIV-1 감염된 성인에서의 UB -421의 안전성 및 약동학을 평가하기 위한 I상 , 개방-표지, 단일-투여, 용량-의존성 연구
1. 목적
1차 목적은 무증상 인간 면역결핍 바이러스-1 (HIV-1) 감염된 대상체에서 상승하는 용량의 UB-421의 단일 정맥내 주입의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이었으며, 2차 목적은 무증상 HIV-1 감염된 대상체에서 상승하는 용량의 UB-421의 단일 정맥내 주입의 약동학을 측정하는 것이었다. (임상 시험 식별자 (Clinical Trial Identifier): NCT01140126).
2. 방법론
개방-표지, 단일-투여, 용량-의존성 (상승), 2-기관, 비-비교.
3. 대상체의 수
총 20명의 대상체 (각각의 코호트에서 5명의 대상체)를 등록하였다.
4. 진단 및 포함을 위한 주요 기준
대상체는 이 연구에 참가하기 위해 하기 기준 모두를 충족시킬 것이 요구되었다.
1. HIV-1 혈청양성;
2. 20세 이상;
3. 프로토콜 버전 Mar-09-2010에 대해: 병력, 신체 검사, 심전도 (ECG)에 기초하여 조사자에 의해 측정된 바로 무증상, 및 스크리닝 방문 (방문 1, V1)에서 응고 시험 및 임상 화학 및 혈액학 시험의 결과가 정상 범위 ±10％ 내였어야 함;
4. 프로토콜 버전 Jul-01-2010에 대해: 스크리닝 방문 (방문 1, V1) 전 24주 내에 급성 또는 증상적 바이러스성 간염 및 AIDS-정의 질병의 내력을 갖지 않는 환자로서 정의된 무증상, 이는 병력, 신체 검사, ECG 및 실험실 평가에 기초하여 조사자에 의해 측정됨;
5. 프로토콜 버전 Mar-09-2010에 대해: 스크리닝 방문 (방문 1, V1)에서 얻어진, CD4+ T 세포 카운트 > 350 세포/mm3 및 HIV-1 바이러스 로드 > 5,000 카피/mL;
6. 프로토콜 버전 Jul-01-2010에 대해: 스크리닝 방문전 4주 내에 또는 스크리닝 방문 (방문 1, V1)에서 얻어진, CD4+ T 세포 카운트 > 350 세포/mm3 및 HIV-1 바이러스 로드 > 5,000 카피/mL;
7. 치료-나이브, 즉, 사전 또는 현재 항레트로바이러스 요법을 받지 않는 대상체;
8. 여성에 대해 모유수유하지 않음;
9. 대상체는 가임 잠재성의 여성에 대해 스크리닝 방문에서 음성 혈청 임신 검사 결과를 가져야 함;
10. 대상체는 연구 기간 동안 출생 제어 장벽 (여성 또는 남성 콘돔)을 사용하는 데 동의해야 함; 및
11. 대상체는 임의의 연구 절차를 겪기 전에 고지 동의서에 서명해야 함.
5. 조사적 생성물(들) 및 개입 방법
UB-421 (dB4C7 mAb)을 10 mg/mL (10 mL 바이알 중 100 mg)의 농도로 공급하였다.
받은 UB-421의 투여량에 기초하여 대상체를 각각 5명의 대상체를 함유하는 네 (4)개의 코호트로 분리하였다. 각각의 등록된 대상체는 하기 용량 수준 중 하나의 UB-421의 단일 정맥내 주입을 받았다: 제0일 (방문 2, V2)에서 1 mg/kg 체중 (코호트 1), 5 mg/kg 체중 (코호트 2), 10 mg/kg 체중 (코호트 3) 또는 25 mg/kg 체중 (코호트 4). UB-421의 적절한 부피를 특정된 용량 및 대상체의 체중에 기초하여 계산하였다. 코호트 내의 각각의 개별적 대상체가 약물의 등가의 주입 부피로 주입되도록 각각의 개별적 용량의 부피를 멸균 염수를 사용하여 조정하였다. 그 후, UB-421의 용량을 주입 펌프로 전달하였다.
6. 치료의 지속기간:
스크리닝, 치료, 및 후속조치로부터의 기간: 62 내지 90일. 주입부터 연구의 종료까지의 기간: 60일.
7. 평가를 위한 기준:
7.1 1차 안전성 종점:
1. 신체 검사 (PE)
2. 활력 징후
3. 임상 화학 및 혈액학 시험
4. 유해 사례 (AE)/심각한 유해 사례 (SAE)의 발생
5. 심전도 (ECG)
7.2 2차 안전성 종점:
1. 항-UB-421 항체의 혈청 농도 (UB-421의 면역원성)를 제0일 (주입전), 투약 후 제14일, 제28일, 및 제60일에 수행하였다.
2. 초기 CD4+ T 세포 카운트는 스크리닝 방문 (V1)에서 평가하거나, 스크리닝 방문 전 4주 내에 얻어진 스크리닝전 데이터에 기초하였다.
3. 후속조치 CD4+ T 세포 카운트를 투약 후 제60일에 평가하였다.
8. 효능 종점:
효능 종점은 기준선으로부터의 HIV-1 바이러스 로드의 변화로서 평가하였다. 기준선 HIV-1 바이러스 로드는 스크리닝 방문 V1에서 평가된 바이러스 로드로서 정의되었다.
9. 약동학 (PK)
하기 약동학 (PK) 파라미터를 UB-421에 대해 평가하였다:
1. Cmax: 투약 후에 관찰된 최대 혈청 약물 농도.
2. Tmax: Cmax가 도달되는 시간.
3. λz: 제거 (종료) 속도 상수.
4. t1/2: 제거 (종료) 반감기.
5. AUC(0→last): 제0시부터 검정된 최후 샘플의 시간까지의 혈청 약물 농도-시간 곡선 하 면적.
6. AUC(0→∞): 제0시부터 무한대까지의 혈청 약물 농도-시간 곡선 하 면적.
7. CL: 신체로부터의 약물의 혈청 청소율.
8. Vβ: 제거 단계에서의 분포의 부피.
9. Vss: 지속-상태에서의 분포의 부피.
10. MRT(0→∞): 무한대로 외삽된 평균 체류 시간 (MRT(0→t)).
10. 통계적 방법:
10. 1 1차 안전성 종점
1. 신체 검사: 신체 이상을 기술 통계학을 사용하여 센터, 일, 코호트, 및 전반적에 의해 요약하였다. 기준선으로부터 최종 방문까지의 전이 표를 또한 제시하였다.
2. 활력 징후: 활력 징후를 기술 통계학을 사용하여 각각의 방문에 의해 요약하였다. 기준선 값으로부터의 변화를 또한 센터, 일, 코호트 및 전반적에 의해 요약하였다.
3. 임상 화학 및 혈액학 시험: 임상 화학 및 혈액학 시험의 결과를 적용되는 방문에서 기술 통계학을 사용하여 요약하였다. 조사자의 전문적 판단 및 각각의 연구 사이트에서의 정상 범위 표준에 기초하여, 시험 결과를 4가지 범주 중 하나로 분류하였다: 정상, 임상적 유의성이 없는 (NCS) 이상, 임상적 유의성 (CS)을 갖는 이상, 및 전형적으로 임상적 유의성 (CST)을 갖는 이상. 기준선으로부터 최종 방문까지의 실험실 시험 결과의 이상의 변화를 또한 전이 표에 나타내었다.
4. 유해 사례 (AE)의 발생: 치료전 AE, 치료-응급성 AE (TEAE), 및 약물-관련된 AE를 빈도 분포에 요약하였다. 각각의 보고된 AE는 규제 업무를 위한 의학 사전 (Medical Dictionary for Regulatory Affairs) (MedDRA) 코드 하나 및 신체 시스템 부류 하나에 연관되었다. 국립 알레르기 및 감염성 질환 연구소 AIDS 부 (DAIDS) AE 등급화 표 v1.0을 중증도 등급화에 이용하였다.
5. ECG: 적용되는 방문에서 얻어진 ECG 기록 데이터를 기술 통계학에 의해 요약하였다.
10. 2 2차 안전성 종점
1. 항-UB-421 항체의 혈청 농도: 항체 농도를 적용되는 방문에 의해 요약하였다.
2. CD4+ T 세포 카운트: 세포 카운트 및 세포 백분율을 분포 통계학을 사용하여 적용되는 방문에 대해 요약하였다. CD4+ T 세포 카운트 및 백분율 둘 다의 기준선으로부터 최종 방문까지의 변화를 또한 요약하였다.
10. 3 효능 종점
1. HIV-1 바이러스 로드: HIV-1 바이러스 로드를 기술 통계학을 사용하여 각각의 방문에서 요약하였다. 기준선 값으로부터의 변화 = (치료 방문 후에서의 값 ― 기준선 방문에서의 값)을 또한 센터, 일, 치료 코호트 및 전반적에 의해 제시하였다.
10. 4 약동학 평가
약동학 파라미터를 기술 통계학을 사용하여 각각의 방문에서 요약하였다.
프로토콜 및 통계적 분석 계획 (SAP)에 따라, 안전성 종점은 처리 의향 (ITT) 집단에 대해 분석한 반면, 효능 분석은 ITT 및 효능 집단 둘 다에 대해 수행될 것이다. PK 평가에 대해, 단지 TVGH에서의 대상체만이 이용가능한 PK 데이터 분석에 대해 수집된 샘플을 가졌기 때문에, 이들 대상체를 PK 집단으로서 정의하였다. PK의 평가는 단지 TVGH 대상체에 대해서만 수행하였다.
11. 결론의 요약
11. 1 효능 , 약동학 및 안전성 결과
11. 1.1 효능 결과. UB-421의 효능을, 도 22a에 나타낸 바와 같이 연구 전반에 걸쳐 다양한 시점에서 HIV-1 바이러스 로드의 변화를 측정함으로써 평가하였다. 효능 분석은 평균 HIV-1 바이러스 로드의 현저한 순 변화가 UB-421 주입 후 코호트 2 (5 mg/kg), 코호트 3 (10 mg/kg), 및 코호트4 (25 mg/kg)로부터의 대상체에서 발견되었지만, 코호트 1 (1 mg/kg)의 대상체에서는 그렇지 않았음을 나타낸다.
항체 약물 UB-421 (mAb dB4C7)의 효능은 단일 투여 후 2.25 log10 이하의 바이러스 로드 감소 (10 mg/kg 군으로부터)에 의해 입증된다 (도 22b). 각각의 코호트에 대한 HIV-1 바이러스 로드의 최대 평균 감소를 하기에 요약하며, 도 22b에 나타낸다:
코호트 1 (1 mg/kg): 제6일 (V5)에 0.29 log10 카피/mL
코호트 2 (5 mg/kg): 제6일 (V5)에 0.97 log10 카피/mL
코호트 3 (10 mg/kg): 제10일 (V6)에 1.58 log10 카피/mL
코호트 4 (25 mg/kg): 제14일 (V7)에 1.63 log10 카피/mL
HIV-1 억제의 지속기간은 용량 수준과 상관되었으며, 여기서, 보다 높은 용량 코호트에서의 대상체는 보다 낮은 용량 코호트에서의 대상체에 비해 HIV-1 바이러스 로드 감소의 보다 긴 지속기간을 나타내었다 (도 22a). UB-421의 최고 용량으로 주입된 대상체 (코호트 4, 25 mg/kg)에 대한 HIV-1 바이러스 로드 억제의 지속기간은 최장 시간, 즉, 약 28일 동안 유지되었다.
요약하면, UB-421 항체는 5, 10 및 25 mg/kg 용량 수준에서 용량-의존성 관계로 강한 항-바이러스 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 즉, 보다 높은 ％의 환자는 필적하는 투약 하의 TMB-355에 비해 UB-421 치료로 혈청 HIV-1 RNA 수준의 1 Log10 초과 감소를 달성하였다.
UB-421을 사용한 이 연구로부터의 효능 데이터의 이론적 비교를 도 23a 내지 23c에 나타낸 바와 같이, TMB-355 (이전에 TNX-355로 공지됨; Kuritzkes, D.R., et al., 2004, 도 1)에 대해 이전에 보고된 효능 데이터에 대해 평가하였다. 이 비교에 기초하면, UB-421은 평가된 대상체의 100％에서 10 mg/kg 또는 25 mg/kg의 단일 투여를 받을 때 바이러스 로드의 10배 감소를 달성한 반면; TMB-355는 단지 동일한 투여량을 사용하여 대상체의 단지 83％에서만 바이러스 로드의 10배 감소를 달성할 수 있었다.
11. 1.2 약동학 결과. 상기 열거된 약동학 (PK) 파라미터를 이 연구에 사용된 UB-421의 각각의 용량 (1, 5, 10, 및 25 mg/kg)에 대해 평가하였다. 표 19는 각각의 코호트에서의 3명의 대상체로부터 평가된 몇몇 PK 파라미터 (Cmax, AUC(0→∞), T1/2, 및 MRT)의 결과를 요약한다. 결과는 각각의 PK 파라미터에 대한 데이터 값과 투여된 UB-421의 투여량 사이의 상관관계를 나타내었다. 즉, UB-421의 용량을 1 mg/kg으로부터 25 mg/kg으로 증가시키는 것은 평가된 PK 파라미터의 증가에 상응하였다. 구체적으로, Cmax는 28.6 μg/mL로부터 462.5 μg/mL로 증가하였고; AUC(0→∞)는 201 μg-시간/mL로부터 51367 μg-시간/mL로 증가하였고; T1/ 2은 14.4시간으로부터 85.4시간으로 증가하였고; MRT(0→∞)는 21.6시간으로부터 97.4시간으로 증가하였다.
11. 1.3 안전성 결과. UB-421의 안전성 특색을 신체 검사, 활력 징후, 임상 화학 및 혈액학 시험, AE/SAE의 발생, 및 ECG에 의해 평가하였다. CD4+ T 세포 카운트 및 항-UB-421 항체 농도를 또한 측정하여 추가의 안전성 평가를 제공하였다.
중증도 등급화로의 TEAE의 전체적 발생은 총 30 사건에 대해 65.0％ (20명의 대상체 중 13명)였다. 3명의 대상체는 중증도 등급화로 6건의 치료-관련된 AE를 갖는 것으로 보고되었다: 대상체 B-001-001 (1 mg/kg의 UB-421로 투약됨)에서 등급 1 (경도) "가려움" 및 "종기"; 대상체 A-015-009 (10 mg/kg의 UB-421로 투약됨)에서 등급 1 (경도) "림프구 카운트 증가", "호중구 카운트 감소" 및 "혈소판 카운트 감소"; 및 대상체 B-015-008 (25 mg/kg의 UB-421로 투약됨)에서 등급 2 (중등도) "홍역상 발진". 대상체 B-015-008에서 홍역상 발진의 사건은 의심되는 예상치 않은 심각한 유해 반응 (Suspected Unexpected Serious Adverse Reaction) (SUSAR)이었으며; 대상체는 5일의 치료 후에 병원으로부터 퇴원하였다. 1명의 대상체는 대상체 A-012-005 (5 mg/kg의 UB-421로 투약됨)에서 치루 및 치질의 UB-421과 관련되지 않은 또다른 SAE를 갖는 것으로 보고되었으며; 활력 징후 또는 ECG 결과에서 치료-관련된 이상은 발견되지 않았다. 치료에는 단지 하나의 용량만이 있었으며; 따라서, 치료 중단 또는 용량이 변화는 일어나지 않았다.
항-UB-421 항체는 3명의 대상체 (각각의 코호트 2, 3, 및 4로부터 1명씩)에서 제14일 (V7)에 0.4 μg/mL의 검정 검출 한계 단지 약간 위의 수준에서 검출되었다. 항-UB-421 항체는 제60일 (연구의 종료)까지 임의의 후속 방문에서 검출되지 않았다. 관련 AE 또는 다른 신체 이상은 항-UB-421 항체의 출현과 연관되지 않았다.
또한, CD4+ T 세포 카운트 및 세포 백분율은 60-일 치료 기간 및 또한 무-치료 후속조치 기간 동안 상대적으로 안정하였다.
요약하면, UB-421은 단일 용량이 정맥내 (IV) 주입을 통해 1 내지 25 mg/kg 용량 범위로 투여된 경우, HIV-1 감염된 성인에 대해 안전하며, 내약성이 양호하였다.
12. 결론
이 I상 연구는, 1 내지 25 mg/kg 범위의 투여량의 UB-421의 단일 정맥내 주입으로, UB-421이 HIV-1 감염된 성인에 대해 안전하며, 내약성이 양호하였음을 입증하였다. 대부분의 AE는 경도이고, 연구 약물와 비관련되었다. 홍역상 피부 발진의 SUSAR의 단지 1건의 발생만이 코호트 4 (25 mg/kg 용량)에서 일어났지만, 이 사건이 연구 약물과 관련되었는지 여부는 명백하지 않았다. UB-421에 대한 일시적 면역 반응은 단지 제14일 (V7)에 3명의 대상체에서 0.4 μg/mL의 검정 검출 한계 단지 약간 위의 수준으로 검출되었으며, 이는 항체의 출현이 사소한 임상적 유의성의 것이었음을 시사한다. 연구 약물의 약동학 프로파일에 관하여, 주요 파라미터의 경향성은 용량 수준과 상관되었다. 더욱이, HIV-1 바이러스 로드 억제의 정도 및 지속기간은 5, 10, 및 25 mg/kg의 UB-421 용량 수준과 유의하고 양성으로 연관되었지만, 1 mg/kg 용량 코호트에서는 자명한 것으로서가 아니었다.
이 시험으로부터 얻어진 안전성 및 효능 결과 둘 다를 고려하면, 적어도 5 mg/kg의 용량 수준의 UB-421은 무증상 HIV-1 감염된 성인의 치료에 있어서 추가로 개발될 것이 정당화되었다.
실시예 14
무증상 HIV-1 감염된 성인에서의 UB -421의 안전성 및 효능을 조사하기 위한 IIa상 , 개방-표지, 다중-투여, 용량-의존성 시험
1. 연구 목적:
1. 무증상 HIV-1 감염된 대상체에서의 UB-421의 2가지 용량 처방의 다중 투여의 안전성 및 내약성을 평가하기 위해.
2. 이들 대상체에서의 UB-421의 2가지 용량 처방의 다중 투여의 항바이러스 활성의 증거를 얻기 위해.
3. 최적 UB-421 투여 및 용량 처방을 결정하기 위한 항바이러스 활성 및 안전성 프로파일을 평가하기 위해.
(임상 시험 식별자: NCT01668043).
2. 연구 설계
이는 UB-421의 반복된 정맥내 투여를 사용한 개방-표지 연구였다. HIV-1에 대해 혈청양성 및 무증상인 대상체를 적격성에 대해 스크리닝하였다. 스물 아홉 (29)명의 등록된 대상체는 8-주 치료 기간 동안 2가지 용량 수준, 즉, 10 mg/kg 매주 (코호트 1) 또는 25 mg/kg 격주 (코호트 2) 중 하나의 연구 약물 (UB-421)의 다중 정맥내 주입을 받았다. 대상체를 사이트에 의해 및 등록 순차에 기초한 차례에 의해 2개의 연구 코호트 중 하나로 할당하였다. 대상체를 8-주 치료 기간 후 추가의 8-주 기간 동안 지켜보았다. 연구는 제16주에 종료하였다.
3. 포함을 위한 기준
대상체는 IIa상 시험에 적격성이 되기 위해 하기 기준을 충족시킬 것이 요구되었다:
1. 무증상, 항레트로바이러스 요법 (ART)-나이브, HIV-1 혈청양성
2. CD4+ T 세포 카운트 > 350 세포/mm3
3. HIV-1 바이러스 로드 > 5,000 카피/mL
4. 즉각 요법을 요구하는 활성 감염이 없음 (HIV-1 제외)
5. 면역조정 약물 또는 전신적 화학요법의 사용 없음
6. 고도 활성 항레트로바이러스 치료 (HAART)에 대한 필요 없음.
이 연구의 완결 후, 대상체는 외래환자 클리닉에서 통상적인 모니터링 일정 (항레트로바이러스제를 갖지 않음)을 따르거나, HIV/AIDS의 진단 및 치료를 위한 현재 지침에 따라 주요 조사자에 의해 필요한 것으로 간주되는 경우 치료 표준 항레트로바이러스 요법 (예를 들어 HAART)을 받았다. UB-421으로의 I상 시험에서 등록되고, IIa상 시험의 참가 기준을 충족시킨 환자는 이 연구에 합류하도록 허용되었다.
4. 조사적 생성물(들)
UB-421 (dB4C7 mAb)을 10 mg/mL (10 mL 바이알 중 100 mg)의 농도에서 공급하였다.
각각의 등록된 대상체는 8주 동안 하기 투여량: 10 mg/kg 매주 (코호트 1) 또는 25 mg/kg 격주 (코호트 2) 중 하나의 UB-421의 다중 정맥내 주입을 받았다. UB-421의 적절한 부피는 특정된 용량 및 대상체의 체중에 기초하였다. 코호트 내의 각각의 개별적 대상체가 약물의 등가의 주입 부피를 받도록 각각의 개별적 용량의 부피를 멸균 염수를 사용하여 조정하였다. 총 주입 부피는 대략, 10 mg/kg 용량 코호트에 대해 100 mL 및 25 mg/kg 용량 코호트에 대해 200 mL이었다. 각각의 투여에 대한 주입 시간은 대략 1 내지 2시간이었다.
5. 평가를 위한 기준:
5.1 1차 안전성 및 효능 종점:
UB-421의 하기 안전성 및 내약성 파라미터를 제16주 (연구의 종료)까지 평가하였다:
1. 신체 검사 (PE)
2. 활력 징후
3. 임상 화학 및 혈액학 시험
4. 유해 사례 (AE)/심각한 유해 사례 (SAE)의 발생
UB-421의 하기 효능 파라미터를 연구 기간 (V2 내지 V12) 동안 각각의 연구 코호트에 대해 평가하였다:
1. 개별적 최대 바이러스 로드 감소
2. 평균 최대 바이러스 로드 감소
5.2 2차 바이러스학적 종점
하기 바이러스학적 반응을 연구 기간 (V2 내지 V12) 동안 평가하였다:
1. 각각의 연구 코호트 내의 및 간의 하위군에 의한 개별적 최대 바이러스 로드 감소 및 평균 최대 바이러스 로드 감소.
2. 바이러스 로드 < 50 카피/mL를 갖는 대상체의 비율;
3. 바이러스 로드 < 200 카피/mL를 갖는 대상체의 비율;
4. 바이러스 로드 감소 > 0.5 log10 카피/mL를 갖는 대상체의 비율;
5. 바이러스 로드 감소 > 1 log10 카피/mL를 갖는 대상체의 비율;
6. 코호트 1에 대해 및 코호트 2에 대해 각각 최후 완결된 연구 약물 투여 후 7일 및 14일까지의 바이러스 반동 (최하점으로부터 바이러스 로드의 0.5 log10 초과 증가)을 갖는 대상체의 비율;
7. 항-UB-421 항체의 혈청 농도 (UB-421의 면역원성);
8. CD4+ 및 CD8+ T 세포 카운트의 변화;
9. UB-421의 약동학 파라미터 (Cmax, AUC(0→∞) 및 AUC(0→last)).
6. 분석 집단:
처리 의향 (ITT) 집단: 연구 약물의 적어도 1회 투여를 받은 29명의 대상체. 코호트 1 및 코호트 2에 대한 ITT 집단은 각각 14명의 대상체 및 15명의 대상체였다.
프로토콜 순응 (PP) 집단: 유효한 기준선 및 적어도 1회의 유효한 치료후 효능 측정 (HIV-1 바이러스 로드 시험)을 갖고, 주요 프로토콜 위반이 없는 연구 약물의 모든 투여를 받은 18명의 대상체. 코호트 1 및 코호트 2에 대한 PP 집단은 각각 7명의 대상체 및 11명의 대상체였다.
안전성 및 면역원성 집단: 처리 의향 집단에 포함된 29명의 대상체.
약동학 집단: 안전성 및 면역원성 집단 내의 하위집합 집단에 기초하였음.
기준선 데이터 및 안전성 종점을 안전성 및 면역원성 집단에 대해 분석한 반면, 효능 분석은 ITT 및 PP 집단 둘 다에 대해 수행하였다. 약동학 분석은 약동학 집단에 대해 수행하였다.
7. 연구 기간의 지속기간
스크리닝 기간: < 4주
치료 기간: 8주
후속조치 기간: 치료 기간의 종료 후 8주
방문 0은 초기 스크리닝을 나타내었고, 연구 동안의 각각의 방문은 1주 기간을 나타낸다. 후속조치 기간은 일반적으로 매주 간격으로 수행되었다.
8. 결과의 요약 :
8.1 연구 집단.
총 33명의 무증상 HIV 감염된 성인을 타이완에 있는 2개의 연구 사이트에서 스크리닝하였다. 그들 중에서, 29명의 대상체는 스크리닝 기준을 통과하였으며, 시험을 위해 선택되었다. 모든 29명의 적격성 대상체는 남성이었다.
8.2 안전성 및 내약성 결과:
모든 29명의 대상체는 연구 동안 적어도 1건의 AE, 합계 128건의 AE를 경험하였다. 이들 중에서, 114건 (모든 29명의 대상체에서 89.06％)은 치료-응급성 유해 사례 (TEAE)였으며, 14건 (5명의 대상체에서 10.94％)은 치료전 AE였다. 29명의 대상체에서는 심각한 유해 사례 (SAE)가 관찰되지 않았다. 모든 치료전 AE는 UB-421과 비관련되었으며, 이들 사례 중 어느 것도 SAE로 간주되지 않았다. 대부분 (78.95％)의 TEAE는 경도로 보고되었으며, 17.54％는 중등도이고, 3.51％ (1명의 대상체에서)는 중증이었다.
가장 빈번히 관찰된 (>10％) TEAE는 피부 발진 및 두드러기였다. 기타 유해 사례인 혈액학의 이상 (22명의 대상체에서 154건의 사례) 및 생화학 (6명의 대상체에서 32건의 사례) 실험실 시험 결과가 22명의 대상체에서 관찰되었다. 그러나, 대부분의 변화는 사소하였으며, 임상적으로 유의하지 않았다. 신체 검사 결과 및 활력 징후는 연구 기간 동안 대부분 정상이거나 비-임상적으로 유의하였다.
UB-421은 연구 기간 동안 내약성이 양호하였고 임상 시험 프로토콜에 의해 특정된 바로 전체적 치료 내약성이 8-주 치료 기간 동안 73.84％이었다.
8.3 약역학
8.3. 1 CD4 + T 및 CD8 + T 세포 카운트. 8-주 치료 기간 및 8-주 후속조치 기간 후에, 평균 CD4+ T 세포 카운트는 기준선으로부터 55.10 ± 117.97 세포/mm3만큼 약간 감소한 반면, 평균 CD8+ T 세포 카운트는 기준선으로부터 193.31 ± 459.34 세포/mm3만큼 증가하였다. 코호트 1에서의 대상체에 대한 대표적인 CD4+ T 세포 카운트 및 평균 CD4 T 세포 카운트를 표 22a 및 도 24a에 나타낸다. 코호트 2에서의 대상체에 대한 대표적인 CD4+ T 세포 카운트 및 평균 CD4 T 세포 카운트를 표 22b 및 도 24b에 나타낸다.
8.3. 2 UB -421로의 CD4 수용체의 코팅. CD4 수용체 코팅의 정도를 유동 세포측정법에 의해 형광-접합된 UB-421로 검출하였다. 4명의 대표적인 대상체, 즉, 코호트 1로부터 2명 및 코호트 2로부터 2명으로부터 얻어진 결과를 각각 도 25a 내지 25b 및 도 25c 내지 25d에 나타낸다. 검정의 민감도는 0.15 μg/mL이다. 10 mg/kg 매주 또는 25 mg/kg 격주의 반복된 투약 시 UB-421의 임상적 효능은 단독요법으로서 사용된 경우 10 μg/mL 초과의 UB-421 혈청 수준의 존재 하에서 비-검출가능한 수준으로 저하된 바이러스 감소를 밝혀내었다. PBMC CD4+ 세포가 완전히 코팅되는 (즉 ％ dB4C7-알렉사 결합이 0에 접근하는) 한, 바이러스 반동은 없다.
UB-421로의 PBMC 상의 CD4 수용체의 완전한 코팅은 둘 다의 투여량 수준의 UB-421의 2 내지 3회 투여 후에 달성되었다. 또한, UB-421로의 CD4+ T 세포의 완전한 코팅은 전체 치료 기간 전반에 걸쳐 유지되었다 (도 25a 내지 25d, 상부 패널). 대부분의 대상체에서, 형광 dB4C7 mAb (dB4C7-알렉사)의 결합에 의해 측정된 바로, CD4 수용체에의 UB-421 결합은 감소하였으며, 최후 UB-421 주입의 3주 내에 기준선 값으로 복귀하였다.
연구 동안 대상체의 혈청에 존재하는 UB-421의 농도를 평가하여 완전한 CD4 코팅 및 HIV-1 바이러스 억제를 달성하는 데 충분한 UB-421의 혈청 농도를 측정하였다. 얻어진 데이터에 기초하면, UB-421의 혈청 농도가 10 μg/mL 초과로 유지된 한, UB-421에 의한 CD4+ T 세포의 일정한 완전한 코팅 및 HIV-1 바이러스 억제가 달성되었다 (도 25a 내지 25d, 하부 패널).
8.4 약동학 :
코호트 1에서 관찰된 평균 AUC는 17300 ± 10000 μg x hr/mL (방문 1 내지 2)로부터 23900 ± 10700 μg x hr/mL (방문 8 내지 9)로 증가한 후, 방문 11 내지 12에서 기준선으로 복귀하였다. 코호트 1에서 관찰된 평균 AUC(0→last)는 171000 ± 70300 μg x hr/mL이었다.
코호트 2에서 관찰된 평균 AUC는 56500 ± 19500 μg x hr/mL (방문 1 내지 3)로부터 61100 ± 20700 μg x hr/mL (방문 7 내지 9)로 증가한 후, 방문 11 내지 12에서 기준선으로 복귀하였다. 코호트 2에서 관찰된 평균 AUC(0→last)은 239000 ± 73900 μg x hr/mL이었다.
이들 데이터는 AUC(0→last)에 의해 평가된 바로 평균 혈청 약물 농도가 10 mg/kg 매주 UB-421 주입을 받은 대상체 (코호트 1, 171000 ± 70300 μg x hr/mL)에 비해 25 mg/kg 격주 UB-421 주입이 투여된 대상체 (코호트 2, 239000 ± 73900 μg x hr/mL) 중에서 더 높았음을 입증한다.
8.5 효능 결과:
스물 아홉 (29)명의 HIV-1 감염된 대상체가 이 연구에서 모집되었으며, UB-421의 적어도 1회의 용량을 받았다 (ITT 집단). 모집된 스물 아홉 (29)명의 대상체 중, 총 열 여덟 (18)명의 대상체가 8-주 치료 기간을 완결하여 모두 연구 약물의 투여를 받았다 (PP 집단). UB-421의 다중-투여의 효능을, 연구 동안 등록된 무증상 HIV-1 감염된 대상체의 개별적 및 평균 최대 바이러스 로드 감소를 평가함으로써 평가하였으며, 코호트 1 및 2에 대한 ITT 및 PP 집단에 대한 결과를 표 20에 요약한다.
평균 최대 바이러스 로드 감소는 ITT에서도 PP 집단에서도 2가지 투여량 수준 사이에 유의하게 상이하지 않은 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 바이러스 로드는 ITT 집단에서 코호트 1에서 2.27 ± 0.60 log10 카피/mL 및 코호트 2에서 2.45 ± 0.46 log10 카피/mL만큼 감소되었다. PP 집단에서, 바이러스 로드는 코호트 1에서 2.73 ± 0.34 log10 카피/mL 및 코호트 2에서 2.47 ± 0.45 log10 카피/mL만큼 감소되었다.
치료 기간 동안, 0.5 log10 카피/mL 이상의 바이러스 로드 감소가 모든 (n=29, 100.00％) 연구 대상체에서 관찰되었으며; 1 log10 카피/mL 이상의 바이러스 로드 감소가 또한 모든 (n=29, 100.00％) 연구 대상체에서 관찰되었다.
치료 기간 동안 얻어진 데이터의 추가의 평가는 하기를 밝혀내었다:
코호트 1에서, ITT에서 대상체의 8/14 (57.14％) 및 PP에서 대상체의 5/7 (71.43％)은 바이러스 로드 ≤ 200 카피/mL를 가졌으며; 더욱이, ITT에서 대상체의 3/14 (21.43％) 및 PP에서 대상체의 3/7 (42.86％)은 바이러스 로드 < 50 카피/mL를 가졌다.
코호트 2에서, ITT에서 대상체의 10/15 (66.67％) 및 PP에서 대상체의 7/11 (63.64％)은 바이러스 로드 ≤ 200 카피/mL를 가졌으며; ITT에서 대상체의 3/15 (20.00％) 및 PP에서 대상체의 2/11 (18.18％)는 바이러스 로드 < 50 카피/mL를 가졌다.
코호트 1 및 2에서의 대상체로부터의 대표적인 바이러스 로드 감소 데이터를 표 21a 내지 21c 및 도 25a 내지 25d (상부 패널)에 나타낸다. 각각의 코호트 내, 코호트 간, 또는 각각의 코호트 내의 하위-집단 간에 바이러스 로드 감소를 갖는 대상체의 비율의 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 게다가, 바이러스 로드는 8-주 치료 기간 동안 코호트 1 및 2에서 각각 대상체의 43％ 및 18％에서 현재 검정 검출 한계 (20 카피/mL) 미만의 수준으로 감소되었다. 모든 대상체에서, 바이러스 로드 감소는 CD4+ T 세포가 UB-421에 의해 완전히 코팅되는 동안 지속되었다. 바이러스 로드는 후속조치 기간의 종료에 의해 둘 다의 코호트에서 기준선 수준으로 복귀하였다. 또한, 바이러스 반동은 치료 기간 동안 임의의 연구 대상체에서 관찰되지 않았다. 정량가능한 항-UB421 항체는 치료 기간 전반에 걸쳐 둘 다의 코호트에서의 환자로부터 검출되지 않았다 (표 21a 내지 21c).
8.6 UB -421과 TMB -355의 비교:
UB-421에 대해 이 연구에서 얻어진 결과를 다른 이들 (Jacobson, J.L., et al., 2009; Toma, J., et al., 2011; 및 Pace, C.S., et al., 2013)에 의해 수행된 TMB-355 (이발리주맙, 예전에 TNX-355)에 대한 유사한 연구에서 얻어진 결과에 대해 평가하였다. 도 26a는 CD4+ 세포의 완전한 코팅을 갖는 UB-421의 존재 하에서 바이러스 로드 반동을 갖지 않고 3 Log10 초과까지의 우월한 바이러스 로드 감소를 나타낸다. 대조적으로, TMB-355로의 치료를 받는 환자는 심지어 CD4+ 세포의 완전한 코팅의 존재 하에서도 치료로부터 단지 1주 후에 바이러스 반동을 마주쳤으며, 이는 내성 바이러스 돌연변이체의 발달을 지시한다 (도 26b).
이들 2가지 치료 처방의 비교는, 도면에 예시된 바와 같이, UB-421을 사용한 HIV 감염된 대상체의 치료가 TMB-355 치료에 비해 뚜렷한 이점을 가짐을 입증한다. 구체적으로, UB-421은 치료 기간 전반에 걸쳐 및 심지어 후속조치 기간 내로 1 또는 2주에도 3 log10 초과의 최대 바이러스 로드 감소를 갖고 HIV 바이러스 로드의 계속적인 감소를 제공한다. 대조적으로, TMB-355는 제1 투여로 단지 일시적인 바이러스 로드 감소 및 대략 1 log10의 최대 바이러스 로드 감소를 제공하였다.
또한, TMB-355를 사용한 사전 연구는 혈청 TMB-355 및 CD4 양성 T 세포의 완전한 코팅의 존재에도 불구하고, 치료 내로 1주 후에 HIV 바이러스 반동이 일어났음을 밝혀내었다 (Jacobson, J.L., et al., 2009). 이 결과는 TMB-355 (이발리주맙)에 의해 매개된 바와 같은 비-경쟁적 진입 억제 메커니즘이 항체 치료 기간 동안 내성 HIV 돌연변이체의 발달에 대한 높은 가능성을 제공할 것이라는 상기 실시예 4에서의 초기 예측과 일치한다. 사실, 바이러스 내성 돌연변이체는 바이러스 로드 감소를 위한 TMB-355 치료를 받는 환자로부터 gp120의 V5 영역에서 확인된 돌연변이 (Toma, J., et al., 2011; Pace, C.S., et al., 2013)와 함께 발견되었다.
9. 결론
무증상 HIV-1 감염된 대상체에서의 UB-421로의 8-주 치료는 내약성이 양호하였다. 또한, 코호트 1 및 2 둘 다로부터의 개별적 대상체에 대한 대표적 CD4+ T 세포 카운트 (표 22a 및 22b) 및 평균 CD4 T 세포 카운트 (도 24a 및 24b)는 각각 모니터링된 2-개월 기간 전반에 걸쳐 안정하게 남아 있었다.
보다 중요하게는, UB-421로의 치료는 모든 대상체에서 유의한 바이러스 로드 감소를 초래하였다 (치료된 대상체의 100％가 1 log10 카피/mL 이상의 최대 감소를 갖고 반응하였다. 둘 다의 처방, 즉, 10 mg/kg 매주 (코호트 1) 및 25 mg/kg 격주 (코호트 2) 주입은 바이러스 로드 감소에서 유사한 효능을 나타내었다. ITT 집단에서의 평균 최대 바이러스 감소는 코호트 1에서 2.27 ± 0.60 log10 카피/mL 및 코호트 2에서 2.45 ± 0.46 log10 카피/mL에 도달하였다). UB-421로의 관찰된 바이러스 감소 효능은 지금까지 시험된 임의의 다른 소분자 항 HIV 약물보다 우월하다.
이 주의깊게 실시된 UB-421의 다중-용량 IIa상 시험으로부터의 임상 시험 결과는 치료 기간 동안 바이러스 반동 없이 단독요법으로서 높은 내약성, 안전성, 및 바이러스 로드 감소의 전례없는 효능을 입증하였다. 이 연구에서 얻어진 결과는 예상치 않은 것이며, CD4의 도메인 1에 결합하는 항-CD4 모노클로날 항체가 주조직적합성 복합체 부류 II-매개된 면역 기능의 방해 때문에 면역억제성일 것이며, 이러한 요법은 HIV 질환의 치료에 부적합할 것 (Jacobson, J.L., et al., 2009)이라는 관련 기술분야에서 오랫동안 지속된 의심을 반박한다. 이들 결과는 직교의 HAART 및/또는 다른 HIV 병원소 활성화 제제, 예컨대 HDACi와 조합으로 UB-421을 사용한 HIV 요법의 추가의 양식이 HIV 감염에 대한 기능적 치유를 달성할 수 있었음을 추가로 시사한다.
실시예 15
HIV-1 감염된 성인에서 항레트로바이러스 요법에 대한 대용으로서 UB -421 단독요법을 채용한 치료 양식
도 27은 항레트로바이러스에 대한 대용으로서 UB-421 단독요법을 채용한 다양한 HIV 환자 집단에 대한 치료 양식을 예시한다. 상세한 목적 및 프로토콜을 하기에 설명한다.
1. 적용된 환자 집단
안정한 고도 활성 항레트로바이러스 요법 (HAART)에 의해 바이러스 억제를 갖는 HIV-1에 대해 혈청양성인 대상체는 이러한 치료에 적격일 것이다.
적격성 환자는 IV 또는 SC 경로 중 어느 하나를 통해 4개월의 초기 기간 동안 투여된 UB-421을 받고, 그 후 HAART 치료의 또다른 주기가 이어질 것이다. "HAART-UB-421" 교대 치료 주기는 바이러스 반동이 UB-421 및 HAART 요법 둘 다의 철회 시더이상 관찰되지 않을 때까지 수 회 반복될 수 있으며, 그에 의해 HIV 감염에 대한 기능적 치유가 초래된다.
보다 구체적으로, 이들 대상체는 2가지 용량 수준, 즉, 10 mg/kg 매주 또는 25 mg/kg 격주 중 어느 하나의 연구 약물 (UB-421)의 다중 정맥내 주입을, 각각 8-주 및 16-주 치료 기간 동안 받을 것이다. HAART 처방은 제1 UB-421 주입 전날에 철회될 것이다. UB-421 투여 전에, 대상체는 주입 반응을 예방하기 위해, 주요 조사자에 의해 판단된 바와 같이 스테로이드 및 항-히스타민 약물을 비롯한 예방적 투약 (예비-투약)이 주어질 것이다. 최후 일정화된 UB-421 투여를 완결한 후, 모든 대상체는 동일한 날에 그의 원래 또는 다른 적절한 바이러스-민감성 항레트로바이러스 요법을 재시작할 것이다. HAART 처방의 사용은 주요 조사자에 의해 판단될 것이다. 모든 환자로부터의 바이러스 로드 및 CD4 세포 카운트는 치료 기간 및 치료 기간 종료 후 6개월 동안 모니터링될 것이다.
2. 포함 기준
대상체는 하기 기준 모두를 충족시킬 경우 이 치료 양식에 포함될 수 있다:
1. HIV-1 혈청양성;
2. 20세 이상;
3. 적어도 2년 동안, 적어도 2종의 뉴클레오시드/뉴클레오티드 역전사효소 억제제 (NRTI) 더하기 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제 (NNRTI), 인테그라제 억제제, 또는 프로테아제 억제제로서 정의된 HAART 치료를 받았음; 치료는 계속 진행중이며, 연구의 진입 전 1년 내에 약물의 변화가 없음;
4. 스크리닝 방문 전 1년 내에 CD4+ T 세포 카운트 ≥ 500 세포/mm3 또는 CD4 백분율 ≥ 28％의 2가지 측정을 가짐;
5. 스크리닝 방문 전 4주 내 또는 스크리닝 방문에서 얻어진 CD4+ T 세포 카운트 ≥ 500 세포/mm3을 가짐;
6. HIV-1 혈장 RNA가 1년 당 적어도 2회의 바이러스 로드 측정치로, 스크리닝 방문 전 적어도 1년 동안 비검출가능하게 남아 있다. 바이러스 로드는 또한 스크리닝 방문 전 4주 내에 또는 스크리닝 방문에서 비검출가능하며; 스크리닝 방문 전 4주 전에 검출가능한 HIV 혈장 RNA의 단일 에피소드는 참가를 배제하지 않을 것이다.
3. 배제 기준
대상체는 하기 이유 중 임의의 것으로 인해 치료 양식으로부터 배제될 것이다:
1. 즉각 요법을 요구하는 임의의 활성 감염 (HIV 제외);
2. 미국 질환 통제 예방 센터 (CDC) HIV 감염에 대한 분류 체계에 따른 카테고리 B 및 카테고리 C 상태에 따른 임의의 이전에 진단된 또는 활성 AIDS-정의 질병;
3. 체중 > 80 kg;
4. 스크리닝 전 12주 내에 임의의 문서화된 CD4+ T 세포 카운트 < 250 세포/mm3 또는 CD4+ T 세포 백분율 ≤ 14％;
5. UB-421의 I상 또는 IIa상 시험 중 어느 하나에서 이전에 등록되거나, 항-UB-421 항체의 존재의 임의의 내력;
6. 연구 약물 UB-421의 최초 용량 전 12주 내에 모노클로날 항체에의 임의의 이전 노출;
7. 임의의 유의한 질환 (HIV-1 감염 이외) 또는 조사자의 의견으로, 대상체가 이 연구에 참가하지 못하게 할, 스크리닝, 병력 및/또는 신체 검사로부터 측정된 정신적 및 행동적 문제를 비롯한 임상적으로 유의한 발견;
8. 연구 약물의 최초 용량 전 8주 내에 임의의 백신화;
9. 연구 약물의 최초 용량 전 12주 내에 임의의 면역조정 요법 (인터페론 포함), 전신적 화학요법;
10. 12개월 미만의 기대 여명;
11. 연구 약물의 최초 용량 전 12주 내에 임의의 불법 정맥내 약물;
12. 바이러스학적 실패, 및 사전 비-호지킨 림프종 또는 카포시 육종 때문에 1회 초과의 HAART 처방의 변화;
13. 조사자의 의견으로, 투약 및 방문 일정 및 프로토콜 평가에 순응하는 대상체의 능력을 방해할 임의의 현재 알콜 또는 불법 약물 사용.
4. 약물 생성물
약물 생성물 UB-421 (dB4C7 mAb)은 10 mg/mL (10 mL 바이알 중 100 mg)의 농도에서 공급될 것이다. 대상체는 10 mg/kg UB-421의 8회의 매주 용량 또는 25 mg/kg UB-421의 8회의 격주 용량을 정맥내 주입에 의해 받을 것이다.
UB-421의 적절한 부피는 특정된 용량 및 대상체의 체중에 기초할 것이다. 코호트 내의 각각의 개별적 대상체가 약물의 등가의 주입 부피로 주입되도록 각각의 개별적 용량의 부피는 멸균 염수를 사용하여 조정하였다. 총 주입 부피는 10 mg/kg 용량 코호트에 대해 대략 100 mL 및 25 mg/kg 용량 코호트에 대해 200 mL이었다. 각각의 투여에 대한 주입 시간은 대략 1 내지 2시간이었다.
실시예 16
HIV 감염의 기능적 치유를 위한 HAART와 조합으로 UB -421을 채용한 치료 양식
도 28은 HIV 감염의 기능적 치유를 위한 HAART와 조합으로 항체 UB-421을 채용한 다양한 HIV 환자 집단에 대한 치료 양식을 예시한다. 적용된 환자 집단: (1) 치료 나이브 HIV 환자; (2) HAART 치료 안정화된 HIV 환자; 및 (3) HAART 치료에 실패한 HIV 환자.
보다 구체적으로, 감염된 대상체에서의 HIV의 기능적 치유를 위한 임상적 프로토콜은 UB-421을 IV 또는 SC 경로 중 어느 하나를 통해 4개월의 초기 기간 동안 투여한 후, 2 완전 주기 (1년) 동안 1 치료 주기 (6개월)로서 2개월의 치료 휴일이 이어짐으로써 달성될 수 있다. 이들 동일한 대상체는 또한 UB-421 치료의 2 완전 주기 동안 HAART 치료를 시작하고 계속할 것이다. 2 완전 주기의 종료 시에, HAART 및 UB-421 둘 다를 철회하여 (부문 A), 존재하는 경우 바이러스 반동이 일어나는 시간의 양을 평가할 것이다. HAART 치료가 철회되기 전에 동일한 12개월 기간까지 HAART 단독으로 치료된 대상체를 함유하는 대조군을 또한 평가하여, 존재하는 경우 바이러스 반동이 일어나는 시간을 평가할 것이다 (부문 B).
모든 환자로부터의 바이러스 로드 및 CD4 세포 카운트를 공동의 UB-421 및 HAART 치료의 2 주기 및 총 18개월 동안의 치료 기간 후 6개월 동안 모니터링할 것이다.
부문 A: 10 mg/kg 매주 또는 25 mg/kg 격주의 UB-421 투여와 조합으로 HAART 치료. 부문 B: HAART 치료 단독.
2. 기능적 치유에서의 UB -421 치료의 설계 (표 23)
HAART 약물에 비해 UB-421의 잠재적 이점:
1. UB-421은 HIV-1 바이러스의 세포-대-세포 전파를 차단한다.
2. UB-421은 CD4의 CDR2-유사 루프를 가교하고, 세포를 활성화시키며, 따라서, 잠복으로부터 HIV-1을 유도하고 방출한다.
3. 목표 :
1. HAART와 조합으로 UB-421을 사용하여, HIV의 세포-유리 및 세포-대-세포 전파 둘 다를 차단함으로써, HIV 감염된 대상체에게 유효한 치료 및 보호를 제공하기 위해.
2. HIV-감염된 대상체에서 HIV에 대한 기능적 치유를 제공하기 위해.
4. 적용된 환자 집단:
(1) HAART 치료 안정화된 HIV 환자; (2) HAART 치료 나이브 HIV 환자, 및 (3) HAART 치료에 실패한 HIV 환자.
5. 약물 생성물 UB -421
약물 생성물 UB-421 (dB4C7 mAb)은 10 mg/mL (10 mL 바이알 중 100 mg)의 농도에서 공급될 것이다. 대상체는 10 mg/kg UB-421의 8회의 매주 용량 또는 25 mg/kg UB-421의 8회의 격주 용량 중 어느 하나를 정맥내 주입에 의해 받을 것이다.
UB-421의 적절한 부피는 특정된 용량 및 대상체의 체중에 기초할 것이다. 코호트 내의 각각의 개별적 대상체가 약물의 등가의 주입 부피로 주입되도록 각각의 개별적 용량의 부피를 멸균 염수를 사용하여 조정하였다. 총 주입 부피는 10 mg/kg 용량 코호트에 대해 대략 100 mL 및 25 mg/kg 용량 코호트에 대해 200 mL이었다. 각각의 투여에 대한 주입 시간은 대략 1 내지 2시간이었다.
6. 할당된 개입:
하기 개입이 할당될 것이다:
6.1 부문 A - UB -421 및 HAART 치료의 조합
대상체를 적절한 HAART 요법으로 연속적으로 치료하고, 또한 UB-421로 1년 지속하는 2회 완전 주기 동안 치료할 것이다. UB-421 치료의 각각의 주기는 매주 10 mg/kg UB-421의 투여 또는 4개월의 기간에 걸쳐 2주마다 25 mg/kg UB-421의 투여, 그 후 이어진 UB-421 치료가 없는 2개월을 포함할 것이다.
1년 치료 기간의 완결 후, HAART 및 UB-421 요법 둘 다는 철회될 것이다. 추가의 관찰적 연구를 수행하여, HAART 및 UB-421의 부재 하에서 임의의 바이러스 반동을 보지 못함으로써 HIV 감염의 기능적 치유를 확인할 것이다.
6.1 부문 B - HAART 치료 단독
대조군으로서, 별개의 세트의 대상체를 동일한 기간 동안 UB-421로 치료하지 않고 적절한 HAART 요법으로 연속적으로 치료할 것이다.
1년 치료 기간의 완결 후, HAART 요법을 철회할 것이며, 대상체를 바이러스 반동에 대해 모니터링할 것이다.
<표 1>
HIV 치료에서 비충족된 의학적 요구: 기능적 치유 및 박멸
Figure pct00001
<표 2>
현재 개발 중인 HIV 감염된 휴지 T 세포의 재활성화를 위한 HDAC 억제제의 목록
Figure pct00002
Figure pct00003
<표 3>
모노클로날 항체 B4의 HIV 진입 억제 활성
(모노그램 바이오사이언스 페노센스 ™ 검정)
Figure pct00004
<표 4>
뮤린 항체 B4의 중쇄 및 경쇄 서열로부터의 상응하는 CDR 1, 2, 3 서열
Figure pct00005
<표 5>
모 B4에 대한 비교 (MT-2 마이크로플라크 검정)에서의 탈면역화 B4 ( dB4C7 )의 중화 활성
Figure pct00006
<표 6>
모 B4에 대한 비교 ( PBMC 검정)에서의 탈면역화 B4 ( dB4C7 )의 중화 활성
Figure pct00007
<표 7>
바이러스 복제의 중화에서 IC50 (μg/mL)에 의해 측정된 모노클로날 항체 B4 또는 dB4에 의한 세포-유리 시스템에서의 CD4 양성 PBMC 세포 내로의 진입으로부터의 HIV 단리체 (R5, X4 또는 R5/X4)의 억제. HIV gp120에 대해 지정된 폭넓은 중화 모노클로날 항체 2F5 및 2G12가 비교를 위해 포함된다.
Figure pct00008
<표 8>
HPB -ALL 세포에 대한 dB4C7의 결합 활성 (EC 50 )
Figure pct00009
<표 9>
HPB -ALL 세포에 대한 dB4C7의 절대 결합 친화도 ( Kd ) 및 결합능 ( Bmax )
Figure pct00010
<표 10>
(1) 염소 항- huIgG - FITC 및 (2) 혈액 CD4+ T 세포에의 dB4C7 - 알렉사 결합에 의해 검출된 dB4C7의 결합 활성 (EC 50 )
Figure pct00011
<표 11>
모노클로날 항체 B4는 HIV의 세포-유리 및 세포-대-세포 전파 둘 다를 차단한다
Figure pct00012
<표 12>
FACS 분석에 의한 순차적 염색 - 퍼센트 양성 PBMC
Figure pct00013
<표 13>
PBMC 배양물 중의 TNF -α 수준 및 HIV-1 바이러스 로드
Figure pct00014
ND: 비-검출가능함
<표 14a>
연구 A: 개코원숭이에서의 단일 투여 전-임상 연구
Figure pct00015
<표 14b>
연구 B: 개코원숭이에서의 다중 투여 전-임상 연구
Figure pct00016
1 8주 동안 매주 투여됨
2 투여량: mg (UB-421) / kg (체중)
<표 15>
개코원숭이에서의 혈액 및 생검 결과
Figure pct00017
<표 16>
개코원숭이에서의 관찰 및 부검 결과
Figure pct00018
<표 17>
UB -421의 전-임상 요약: 개코원숭이에서의 IND - 가능화 독성학 연구
Figure pct00019
<표 18>
비오티닐화된 mAb dB4C7을 사용한 교차-반응성 분석을 위해 평가된 조직
Figure pct00020
1 강한 양성 표면 막 염색이 관찰됨
2 비표지된 mAb dB4C7과 함께 예비-인큐베이션은 염색을 차단함
3 약한 양성 반응성이 관찰됨
4 가끔의 양성 염색이 관찰됨
5 초점성 약한 쿠퍼 세포 염색
<표 19>
I상 시험에서의 단일-용량 UB -421에 대한 PK 파라미터
Figure pct00021
1 결과는 3명의 대상체로부터의 평균임
<표 20>
IIa상 시험에서의 UB -421의 다중 투여 후의 바이러스 로드 감소
Figure pct00022
ITT: 처리 의향 집단
PP: 프로토콜 순응 집단
VL: 바이러스 로드
<표 21a>
비검출가능한 수준으로 저하된 바이러스 감소를 나타내는 IIa상 임상적 효능 데이터: 환자 1-1-01 ( 코호트 1: 10 mg /kg 매주)
Figure pct00023
NQ: 정량가능하지 않음
사선: 평가되지 않음
<표 21b>
비검출가능한 수준으로 저하된 바이러스 감소를 나타내는 IIa상 임상적 효능 데이터: 환자 1-1-02 ( 코호트 1: 10 mg /kg 매주)
Figure pct00024
NQ: 정량가능하지 않음
사선: 평가되지 않음
<표 21c>
비검출가능한 수준으로 저하된 바이러스 감소를 나타내는 IIa상 임상적 효능 데이터: 1-2-03 ( 코호트 2: 25 mg /kg 격주)
Figure pct00025
NQ: 정량가능하지 않음
사선: 평가되지 않음
<표 22a>
코호트 1 ( 10 mg /kg 매주)로부터의 UB -421 치료된 환자의 평균 CD4 T 세포 카운트
Figure pct00026
<표 22b>
코호트 2 ( 25 mg /kg 매주)로부터의 UB -421 치료된 환자의 평균 CD4 T 세포 카운트
Figure pct00027
<표 23>
기능적 치유에서의 UB -421 치료의 설계
Figure pct00028
SEQUENCE LISTING <110> United Biomedical, Inc. Wang, Chang-Yi <120> TREATMENT AND FUNCTIONAL CURE OF HIV INFECTION BY MONOCLONAL ANTIBODIES TO CD4 MEDIATING COMPETITIVE HIV ENTRY INHIBITION <130> 1004263.213WO (2034WO) <140> PCT/US2014/065048 <141> 2014-11-11 <150> US 62/051,200 <151> 2014-09-16 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine Antibody <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(5) <223> CDR1 of heavy chain of murine antibody B4 <400> 1 Asp Tyr Val Ile His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine Antibody <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(17) <223> CDR2 of heavy chain of murine antibody B4 <400> 2 Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Asn Ala Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine Antibody <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(9) <223> CDR3 of heavy chain of murie antibody B4 <400> 3 Arg Gly Asn Gly Thr Gly Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Lys Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Asn Ala Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Asn Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 8 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(218) <223> Light Chain of deimmuized human antibody B4 [UB421] with identical CDRs1, 2 and 3 derived from the corresponding CDRs1, 2,and 3 from the light chain sequence of the parental murine B4 antibody <400> 8 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asn Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr 85 90 95 Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 9 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(448) <223> Heavy Chain of the deimmunized human antibody B4 [UB421] with M253Y/S255T/T257E substitutions <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Lys Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Asn Ala Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Asn Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg 245 250 255 Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 10 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <220> <221> SITE <222> (253)..(253) <223> M or Y <220> <221> SITE <222> (255)..(255) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (257)..(257) <223> T or E <220> <221> SITE <222> (298)..(298) <223> N or H <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Lys Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Asn Ala Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Asn Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Xaa Ile Xaa Arg 245 250 255 Xaa Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 11 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Lys Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Asn Ala Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Asn Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <220> <221> SITE <222> (135)..(135) <223> M or Y <220> <221> SITE <222> (137)..(137) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (139)..(139) <223> T or E <220> <221> SITE <222> (180)..(180) <223> N or H <400> 12 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Xaa Ile Xaa Arg Xaa Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 13 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <400> 13 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asn Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr 85 90 95 Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <400> 14 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (30)

  1. HIV에 노출된 대상체에게 CD4의 도메인 1에 대해 지정된 항체의 약리학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, HIV에 노출된 대상체의 치료 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항체가 CD4의 도메인 1 중의 CDR2 영역에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 또는 이들의 조합물인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 항체가 인간화 모노클로날 항체인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 인간화 모노클로날 항체가
    서열식별번호 (SEQ ID NO): 1의 CDR1,
    서열식별번호: 2의 CDR2, 및
    서열식별번호: 3의 CDR3을 포함하는 중쇄 아미노산 서열; 및
    서열식별번호: 4의 CDR1,
    서열식별번호: 5의 CDR2, 및
    서열식별번호: 6의 CDR3을 포함하는 경쇄 아미노산 서열
    을 포함하는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 인간화 모노클로날 항체가
    서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 것인 방법.
  7. 제4항에 있어서, 인간화 모노클로날 항체가
    서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 중쇄가 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 인간화 항체가 HIV에의 노출 전에 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 인간화 항체가 HIV에의 노출 후에 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 인간화 항체가 HIV에의 노출 후 48시간 내에 투여되는 것인 방법.
  12. 제8항에 있어서, 인간화 항체가 적어도 약 5 mg/kg 체중의 투여량으로 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 인간화 항체가 다수회 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 인간화 항체가 매주 또는 격주 간격으로 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 항바이러스제를 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 항바이러스제가 고도 활성 항레트로바이러스 요법 (HAART)인 방법.
  17. 제16항에 있어서, HAART가 뉴클레오시드 유사체 역전사효소 억제제를 프로테아제 억제제 또는 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제와 조합으로 포함하는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 인간화 항체가 HAART와 공동으로 투여되는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 인간화 항체 및 HAART가 주기의 과정에 걸쳐 대상체에게 투여되고, 여기서 주기는
    i) 인간화 항체를 대상체에게 4개월의 기간 동안 매주 또는 격주 간격으로 투여한 후, 2개월 치료 휴일이 이어지고;
    ii) HAART를 대상체에게 (i)에서의 6-개월 기간 동안 연속적으로 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 대상체가 2 주기의 과정에 걸쳐 치료되는 것인 방법.
  21. HIV 감염을 갖는 대상체에게
    a) CD4의 도메인 1에 대해 지정된 항체의 약리학적 유효량; 및
    b) 고도 활성 항레트로바이러스 요법 (HAART)
    을 포함하는 치료 처방을 투여하는 것을 포함하는, HIV 감염을 갖는 대상체의 치료 방법.
  22. 제21항에 있어서, 항체가 CD4의 도메인 1 중의 CDR2 영역에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 또는 이들의 조합물인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 항체가 인간화 모노클로날 항체인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 인간화 모노클로날 항체가
    서열식별번호: 1의 CDR1,
    서열식별번호: 2의 CDR2, 및
    서열식별번호: 3의 CDR3을 포함하는 중쇄 아미노산 서열; 및
    서열식별번호: 4의 CDR1,
    서열식별번호: 5의 CDR2, 및
    서열식별번호: 6의 CDR3을 포함하는 경쇄 아미노산 서열
    을 포함하는 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 인간화 모노클로날 항체가
    서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 것인 방법.
  27. 제24항에 있어서, 인간화 모노클로날 항체가
    서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 인간화 항체가 적어도 약 5 mg/kg 체중의 투여량으로 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  29. 제21항에 있어서, 치료 처방이 주기의 과정에 걸쳐 대상체에게 투여되고, 여기서 주기는
    i) 인간화 항체를 대상체에게 4개월의 기간 동안 매주 또는 격주 간격으로 투여한 후, 2개월 치료 휴일이 이어지고;
    ii) HAART를 대상체에게 (i)에서의 6-개월 기간 동안 연속적으로 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  30. 제18항에 있어서, 대상체가 2 주기로 치료되는 것인 방법.
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