JP2017532037A - ヒト化抗ｏｘ４０抗体及びその使用 - Google Patents

ヒト化抗ｏｘ４０抗体及びその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、ヒト化抗ＯＸ４０抗体を提供する。また、かかる抗体の作製方法、及び例えば癌の治療など、使用方法も提供される。【選択図】図１

Description

ＯＸ４０（ＣＤ１３４；ＴＮＦＲＳＦ４）は、主に活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に見られる腫瘍壊死因子レセプターである（Ｃｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２２９：１７３−９１）。ＯＸ４０は１つの既知の内因性リガンド、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ；ＣＤ１５２；ＴＮＦＳＦ４）を有し、ＯＸ４０リガンドは三量体形態で存在し、これがＯＸ４０をクラスター化すると、Ｔ細胞内に強力な細胞シグナル伝達イベントが生じ得る（同上）。活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上のＯＸ４０を介したシグナル伝達により、サイトカイン産生、グランザイム及びパーフォリン放出、並びにエフェクター及びメモリーＴ細胞プールの拡大が増強される（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．３７：５２４−３２）。加えて、Ｔｒｅｇ細胞上のＯＸ４０シグナル伝達は、Ｔｒｅｇの拡大を阻害し、Ｔｒｅｇの誘導を終了させ、及びＴｒｅｇ抑制機能を遮断する（Ｖｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９１：３６４１−５０；Ｖｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｌｏｏｄ．１１０：２５０１−１０）。
免疫組織化学研究及び初期のフローサイトメトリー解析により、ＯＸ４０は、幅広い種類のヒト癌に浸潤するＴ細胞上に発現することが明らかになった（Ｂａｒｕａｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ２１７：６６８−６７５；Ｃｕｒｔｉ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７３：７１８９−９８；Ｌａｄａｎｙｉ ｅｔ ａｌ，２００４，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５２１−３０；Ｐｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ，２００２，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１８３：５１２−８；Ｒａｍｓｔａｄ ｅｔ ａｌ，２０００，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１７９：４００−６；Ｓａｒｆｆ ｅｔ ａｌ，２００８，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１９５：６２１−５；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ６２５；Ｖｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１７４：２５８−６５）。理論によって拘束されることを望むものではないが、腫瘍浸潤リンパ球上のＯＸ４０発現は幾つかのヒト癌における長期生存に相関することから、ＯＸ４０シグナルが抗腫瘍免疫応答の確立において役割を果たし得ることが示唆される（Ｌａｄａｎｙｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５２１−３０；Ｐｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１８３：５１２−８）。
種々の非臨床マウス腫瘍モデルでは、抗体及びＯＸ４０リガンド融合タンパク質を含め、ＯＸ４０のアゴニストの使用が成功を収めており、有望な結果が得られている（Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：５５１４−２１；Ｎｄｈｌｏｖｕ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２９９１−９；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２１６０−９）。ＯＸ４０を介してＴ細胞を共刺激すると、抗腫瘍活性が促進され（これは場合によっては耐久性があった）、続く腫瘍チャレンジに対して持続的な保護が提供された（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２１６０−９）。ＯＸ４０アゴニストの腫瘍成長阻害には、Ｔｒｅｇ細胞阻害及びエフェクターＴ細胞の共刺激が必須であることが示された（Ｐｉｃｏｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０５：８２５−３９）。ワクチン、化学療法、放射線療法、及び免疫療法との併用によってＯＸ４０アゴニスト療法の抗腫瘍効果を増強しようと、多くの戦略及び技術が調査されている（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．３７：５２４−３２；Ｍｅｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９：９９７−１００８）。
Ｃｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２２９：１７３−９１ Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．３７：５２４−３２ Ｖｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９１：３６４１−５０ Ｖｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｌｏｏｄ．１１０：２５０１−１０ Ｂａｒｕａｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ２１７：６６８−６７５ Ｃｕｒｔｉ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７３：７１８９−９８ Ｌａｄａｎｙｉ ｅｔ ａｌ，２００４，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５２１−３０ Ｐｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ，２００２，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１８３：５１２−８ Ｒａｍｓｔａｄ ｅｔ ａｌ，２０００，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１７９：４００−６ Ｓａｒｆｆ ｅｔ ａｌ，２００８，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１９５：６２１−５；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ６２５ Ｖｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１７４：２５８−６５ Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：５５１４−２１ Ｎｄｈｌｏｖｕ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２９９１−９ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２１６０−９ Ｐｉｃｏｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０５：８２５−３９ Ｍｅｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９：９９７−１００８
本開示は、ＯＸ４０、例えばヒトＯＸ４０に結合する抗体を提供する。特定の態様において、提供される抗体はヒト化抗体である。例えば、本開示は、ヒト化重鎖可変領域（ＶＨ）とヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここでＶＨは、式：
ＨＦＷ１−ＨＣＤＲ１−ＨＦＷ２−ＨＣＤＲ２−ＨＦＷ３−ＨＣＤＲ３−ＨＦＷ４
［式中、ＨＦＷ１は配列番号６又は配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は配列番号８であり、ＨＦＷ２は配列番号９（ＷＩＲＸ３９ＨＰＧＫＧＬＥＸ４７Ｘ４８Ｇ；式中、Ｘ３９はＱ又はＫであり、Ｘ４７はＷ又はＹであり、及びＸ４８はＩ又はＭである）であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号１４、配列番号１５又は配列番号１６であり、ＨＦＷ３は配列番号１７（ＲＩＴＩＮＸ７１ＤＴＳＫＮＱＸ７８ＳＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＸ９１ＣＡＲ；式中、Ｘ７１はＰ又はＲであり、Ｘ７８はＦ又はＹであり、及びＸ９１はＹ又はＦである）であり、ＨＣＤＲ３は、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７であり、及びＨＦＷ４は配列番号２８である］を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬはアミノ酸配列、配列番号２９又は配列番号３２を含み；及び抗体又はその断片はヒトＯＸ４０に特異的に結合することができる。特定の態様において、ＨＦＷ２のアミノ酸配列は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１であり、特定の態様において、ＨＦＷ３のアミノ酸配列は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４である。
特定の態様において、提供される抗体又はその断片のＶＨは、アミノ酸配列、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、又は配列番号６７を含む。特定の態様において、提供される抗体又はその断片のＶＬはアミノ酸配列、配列番号２９を含み、ＶＨはアミノ酸配列、配列番号５９を含む。
特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、ＶＬのＣ末端に融合した軽鎖定常領域又はその断片、例えばヒトκ定常領域又はヒトλ定常領域を更に含む。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、ＶＨのＣ末端に融合した重鎖定常領域又はその断片、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域、ヒトＩｇＧ４Ｐ定常領域、ヒトＩｇＧ１ＴＭ定常領域又はマウスＩｇＧ１定常領域を更に含む。特定の態様において、重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１定常領域である。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、重鎖アミノ酸配列、配列番号７１と軽鎖アミノ酸配列、配列番号３０とを含む。本開示によって提供されるとおりの抗体の抗原結合断片は、例えば、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、ｄｓＦｖ断片、ｓｃＦｖ断片、又はｓｃ（Ｆｖ）２断片、又はこれらの任意の組み合わせであり得る。
特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、ヒト、カニクイザル、又はアカゲザルＯＸ４０に特異的に結合することができ、例えば、ヒト、カニクイザル、アカゲザル、又はこれらの任意の組み合わせ由来のジャーカット細胞、初代活性化ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現するとおりのＯＸ４０に特異的に結合することができる。特定の態様において、提供される抗体又はその断片はマウス又はラットＯＸ４０に結合しない。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は関連ＴＮＦＲＳＦタンパク質と交差反応しない。
特定の態様において、提供される抗体又はその断片は初代活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現するヒトＯＸ４０に対し、フローサイトメトリーによって計測するとき約２５０ｐＭ〜約３７０ｐＭ、例えば約３１２ｐＭの結合親和性を有し得る。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、フローサイトメトリーによって計測するとき、初代活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対する２０％レセプター占有率（ＥＣ２０）を約６３〜約９３ｐＭで、初代活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対する５０％レセプター占有率（ＥＣ５０）を約２５０〜約３７０ｐＭで、及び初代活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対する９０％レセプター占有率（ＥＣ９０）を約２２９０〜約３３３０ｐＭで実現することができる。例えば、特定の態様において、ＥＣ２０は約７８ｐＭであり、ＥＣ５０は約３１２ｐＭであり、及びＥＣ９０は約２８１０ｐＭである。
特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、ＯＸ４０過剰発現ジャーカット細胞上に発現するヒトＯＸ４０に対し、フローサイトメトリーによって計測するとき約２５０ｐＭ〜約６００ｐＭ、例えば約４２４ｐＭの結合親和性を有し得る。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、フローサイトメトリーによって計測するとき、ＯＸ４０過剰発現ジャーカット細胞に対するＥＣ２０を約６０〜約１５０ｐＭで、ＯＸ４０過剰発現ジャーカット細胞に対するＥＣ５０を約２５０〜約６００ｐＭで、及びＯＸ４０過剰発現ジャーカット細胞に対するＥＣ９０を約２２６０〜約４３８０ｐＭで実現することができる。例えば、特定の態様において、ＥＣ２０は約１０６ｐＭであり、ＥＣ５０は約４２４ｐＭであり、及びＥＣ９０は約３８２０ｐＭである。
特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、初代活性化カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現するカニクイザルＯＸ４０に対し、フローサイトメトリーによって計測するとき約３４０ｐＭ〜約８２０ｐＭ、例えば約５８０ｐＭの結合親和性を有し得る。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、初代活性化アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現するアカゲザルＯＸ４０に対し、フローサイトメトリーによって計測するとき約１３０ｐＭ〜約６００ｐＭ、例えば約３７０ｐＭの結合親和性を有し得る。
特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、プレートベースのアッセイで活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の用量依存的増殖及び初代活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞における用量依存的サイトカイン放出を誘導し得る。例えば、特定の態様において、全てフローサイトメトリーによって計測するとき２０％最大増殖応答（ＥＣ２０）は初代活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞において約１４ｐＭ〜約２８ｐＭの抗体濃度で実現することができ、５０％最大増殖応答（ＥＣ５０）は初代活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞において約０．３ｐＭ〜約１３０ｐＭの抗体濃度で実現することができ、及び９０％最大増殖応答（ＥＣ９０）は初代活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞において約５０ｐＭ〜約９０ｐＭの抗体濃度で実現することができる。特定の態様において、ＥＣ２０は約２１ｐＭであり、ＥＣ５０は約２８ｐＭであり、及びＥＣ９０は約７２ｐＭである。初代活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞における放出サイトカインは、限定なしに、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ ｐ７０、ＩＬ−１β、又はこれらの任意の組み合わせ、例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、又はこれらの任意の組み合わせのうちの１つ、２つ、３つ又はそれ以上であり得る。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、初代活性化カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞及び初代活性化アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４＋Ｔ細胞増殖及びサイトカイン放出を実現することができる。
特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、ＦｃγＲ発現細胞の存在下でＯＸ４０発現Ｔ細胞のＮＦκＢ経路を活性化させることができる。例えば、ＯＸ４０発現Ｔ細胞は、ＮＦκＢシグナル伝達経路の刺激に応答してルシフェラーゼを産生するＯＸ４０過剰発現ジャーカットＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター細胞であり得る。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、ＯＸ４０発現細胞に対する補体依存性又は抗体依存性細胞傷害を惹起することができる。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、ヒトＣ１ｑに結合して、ＯＸ４０発現細胞に対するＮＫ媒介性抗体依存性細胞傷害を惹起することができる。
特定の態様において、癌治療を必要としている対象に、提供される抗体又はその断片の有効用量を投与すると、対象の腫瘍成長を阻害することができる。例えば、腫瘍成長阻害はＴ細胞の存在下で実現し得る。特定の態様において、腫瘍成長は、アイソタイプ対応対照抗体又はその断片の投与と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％阻害される。
本開示は、上記に記載したとおりの抗体又はその断片と担体とを含む組成物を更に提供する。
本開示は、提供される抗体又はその断片をコードするか、或いは提供される抗体又はその断片のポリペプチドサブユニットをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを更に提供する。特定の態様において、提供されるポリヌクレオチドは、配列番号６０の核酸、配列番号３１の核酸、配列番号７２の核酸、又はこれらの任意の組み合わせを含む。本開示は、提供されるポリヌクレオチドを含むベクター、及び提供されるポリヌクレオチド又は提供されるベクターを含む宿主細胞を更に提供する。別の態様において、本開示は、抗体又はその断片の作製方法を提供し、この方法は、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が発現する条件下で、提供される宿主細胞を培養するステップと、抗体又はその断片を回収するステップとを含む。
更なる態様において、本開示は、活性化Ｔ細胞の生存又は増殖を促進する方法を提供し、この方法は、提供される抗体又はその断片を活性化Ｔ細胞と接触させるステップを含み、ここで抗体又はその断片は、Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる。
更なる態様において、本開示は、活性化Ｔ細胞からのサイトカイン放出を誘導する方法を提供し、この方法は、提供される抗体又はその断片を活性化Ｔ細胞と接触させるステップを含み、ここで抗体又はその断片は、Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる。特定の態様において、放出されるサイトカインは、限定なしに、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ ｐ７０、ＩＬ−１β、又はこれらの任意の組み合わせ、例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、又はこれらの任意の組み合わせのうちの１つ、２つ、３つ又はそれ以上であり得る。特定の態様において、活性化Ｔ細胞は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はこれらの組み合わせである。特定の態様において、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞、カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞、アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞、又はこれらの組み合わせである。
更なる態様において、本開示は、Ｔ細胞活性化を促進する方法を提供し、この方法は、提供される抗体又はその断片をＴ細胞と接触させるステップを含み、ここで抗体又はその断片は、Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる。特定の態様において、Ｔ細胞活性化は、ＮＦκＢシグナル伝達経路の刺激によって計測することができる。特定の態様において、Ｔ細胞は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はこれらの組み合わせである。特定の態様において、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞、カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞、アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞、又はこれらの組み合わせである。特定の態様において、接触させるステップは、対象に抗体又はその断片の有効量を投与するステップを含む。
更なる態様において、本開示は、対象の癌を治療する方法を提供し、この方法は、治療を必要としている対象に、提供される抗体若しくはその断片、又は提供される組成物の有効量を投与するステップを含む。特定の態様において、癌は固形腫瘍である。特定の態様において、抗体若しくはその断片又は組成物の投与は、腫瘍成長を阻害することができるか、腫瘍縮小を促進することができるか、又は両方である。特定の態様において、腫瘍成長阻害はＴ細胞の存在下で実現する。
更なる態様において、本開示は、対象の免疫応答を増強する方法を提供し、この方法は、それを必要としている対象に、提供される抗体若しくはその断片、又は提供される組成物の治療有効量を投与するステップを含む。
本開示によって提供される治療方法において、治療される対象はヒト対象であり得る。
特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、配列番号９１のアミノ酸１０８〜１４６の範囲内にあるヒトＯＸ４０のエピトープに結合することができる。特定の態様において、エピトープは、少なくとも、配列番号９１のアミノ酸ロイシン１１６（Ｌ１１６）及びアラニン１２６（Ａ１２６）を含む。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、Ｑ１１３Ｌ突然変異及びＶ１２４Ａ突然変異を除いて配列番号９２のアミノ酸配列を有するマウスＯＸ４０変異体に結合することができる。
本開示は、１００アミノ酸以下からなる単離ペプチドを更に提供し、このペプチドには、提供される抗体又はその断片が特異的に結合し得る。特定の態様において、ペプチドは配列番号９１のアミノ酸１１６〜１２６を含む。特定の態様において、ペプチドは、Ｌ１１６及びＡ１２６を除く任意の位置における１、２、３、４、５、又は６個の単一アミノ酸置換、欠失、又は挿入を除いて配列番号９１のアミノ酸１０８〜１４６を含む。
ヒト化９Ｂ１２ ＶＨ領域の突然変異：クローンニックネームの数字は、Ｋａｂａｔ付番によるＶＨ中のアミノ酸の位置を表す。Ｍａｂ１、２、５及び８は、ヒト化ＶＬと対のＶＨキメラ変異体である。Ｍａｂ１０〜１７は、マウス復帰突然変異を有するヒト化ＶＨ変異体である。Ｍａｂ１８〜２７は、潜在的な配列易障害性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉａｂｉｌｉｔｉｅｓ）が除去されるように操作した変異体である。Ｍａｂ２４及びｍＡｂ２７の可変領域を種々の重鎖定常領域にグラフトし、得られたアイソタイプ変異体について、それぞれｍＡｂ２８〜３０及びｍＡｂ３１〜３２、ｍＡｂ３７と命名した。 初代活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の表面上に発現するＯＸ４０に対するＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２の結合。初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上のＯＸ４０ｍＡｂ２４に結合するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識二次抗ヒト抗体（図２Ａ〜図２Ｂ）のＭＦＩ＝平均蛍光強度。 初代活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の表面上に発現するＯＸ４０に対するＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２の結合。初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上の９Ｂ１２に結合するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗マウス二次抗体（図２Ｃ〜図２Ｄ）のＭＦＩ＝平均蛍光強度。 ジャーカットＴ細胞上に発現するヒトＯＸ４０に対するＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２の結合。ジャーカットＴ細胞上のＯＸ４０ｍＡｂ２４に結合するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識二次抗ヒト抗体（図３Ａ〜図３Ｃ）のＭＦＩ＝平均蛍光強度。 ジャーカットＴ細胞上に発現するヒトＯＸ４０に対するＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２の結合。ジャーカットＴ細胞上の９Ｂ１２に結合するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗マウス二次抗体（図３Ｄ〜図３Ｆ）のＭＦＩ＝平均蛍光強度。 ＴＮＦＲＳＦ発現ＨＥＫ２９３細胞及びＯＸ４０発現ジャーカットＴ細胞に対するＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合。（図４Ａ）ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＮＦＲＳＦメンバー（ヒストグラムの左に示されるとおり）の一過性発現、及びＴＮＦＲＳＦ特異的ｍＡｂ又はＯＸ４０ｍＡｂ２４（ヒストグラムの上に示されるとおり）に対する結合。灰色のヒストグラム、ＴＮＦＲＳＦ特異的ｍＡｂに対する蛍光色素コンジュゲートアイソタイプ対照抗体結合、又はＯＸ４０ｍＡｂ２４に対するヤギ抗ヒトＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７二次抗体結合対照；白色のヒストグラム、ＴＮＦＲＳＦ特異的ｍＡｂ結合又はＯＸ４０ｍＡｂ２４結合。 ＴＮＦＲＳＦ発現ＨＥＫ２９３細胞及びＯＸ４０発現ジャーカットＴ細胞に対するＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合。（図４Ａ）ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＮＦＲＳＦメンバー（ヒストグラムの左に示されるとおり）の一過性発現、及びＴＮＦＲＳＦ特異的ｍＡｂ又はＯＸ４０ｍＡｂ２４（ヒストグラムの上に示されるとおり）に対する結合。灰色のヒストグラム、ＴＮＦＲＳＦ特異的ｍＡｂに対する蛍光色素コンジュゲートアイソタイプ対照抗体結合、又はＯＸ４０ｍＡｂ２４に対するヤギ抗ヒトＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７二次抗体結合対照；白色のヒストグラム、ＴＮＦＲＳＦ特異的ｍＡｂ結合又はＯＸ４０ｍＡｂ２４結合。（図４Ｂ）：陽性対照としてのＯＸ４０発現ジャーカットに対するＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合。灰色のヒストグラム、ヤギ抗ヒトＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７二次抗体結合対照；白色のヒストグラム、ＯＸ４０ｍＡｂ２４結合。 ＥＬＩＳＡによる組換えヒトＴＮＦＲＳＦメンバーに対するＯＸ４０ｍＡｂ２４（ＯＸ４０ｍＡｂ２９）（相補性決定領域）ＣＤＲ及び９Ｂ１２の結合。ＯＸ４０ｍＡｂ２９（図５Ａ）及び９Ｂ１２（図５Ｂ）によるＯＸ４０の特異的結合を実証するＥＬＩＳＡアッセイの結果。ＯＸ４０ｍＡｂ２９はＯＸ４０ｍＡｂ２４のＣＤＲを含む。ＯＸ４０の抗体結合を他のヒトＴＮＦＲＳＦタンパク質の結合と比較した。 ＯＸ４０ｍＡｂ２４プレート結合生物活性アッセイの概略図。Ｑ＝ＯＸ４０ｍＡｂ２４；￥＝抗ヒトＣＤ３抗体クローンＯＫＴ３。 ＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２に応答したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞増殖。（図７Ａ）サブマイトジェニックなＴＣＲ刺激（抗ＣＤ３）と組み合わせたプレート固定化ＯＸ４０ｍＡｂ２４によって媒介される独立した４ドナーのＣＤ４Ｔ細胞増殖。データ点は、各応答のダイナミックレンジの可視化を増強するため、グラフ化前にローデータ曲線の下方漸近値に対して正規化した。（図７Ｂ）ＯＸ４０ｍＡｂ２４＋サブマイトジェニックなＴＣＲ刺激（抗ＣＤ３）によって駆動される増殖、及びＲ３４７ヒトＩｇＧ１対照ｍＡｂ、同時のＴＣＲシグナル伝達の存在下又は非存在下での可溶性ＯＸ４０ｍＡｂ２４、ＯＸ４０ｍＡｂ２４のない抗ＣＤ３ ｍＡｂ単独、及び抗ＣＤ３ ｍＡｂの非存在下でのプレート固定化ＯＸ４０ｍＡｂ２４によって媒介される増殖の相対的欠如を実証するドナー６５１の代表的なローデータ。（図７Ｃ）サブマイトジェニックなＴＣＲ刺激と組み合わせたプレート固定化９Ｂ１２によって媒介される独立した４ドナーのＣＤ４Ｔ細胞増殖。記号、平均値；エラーバー、平均値の標準偏差；全て抗ＣＤ３と組み合わせたＯＸ４０ｍＡｂ２４、Ｒ３４７ヒトＩｇＧ１対照ｍＡｂ、及び９Ｂ１２についてｎ＝３テクニカルレプリケート；可溶性ＯＸ４０ｍＡｂ２４、及びＯＸ４０ｍＡｂ２４の非存在下でのＣＤ３、抗ＣＤ３のないプレート結合ＯＸ４０ｍＡｂ２４、及び抗ＣＤ３のない可溶性ＯＸ４０ｍＡｂ２４についてｎ＝２テクニカルレプリケート。 ＯＸ４０ｍＡｂ２４に応答したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞サイトカイン放出。（図８Ａ）ＩＦＮγ、（図８Ｂ）ＴＮＦα及び（図８Ｃ）ＩＬ−１０を含めた、ドナー６５１についての代表的なＯＸ４０ｍＡｂ２４誘導ヒトＣＤ４Ｔ細胞サイトカイン放出。記号、平均値；エラーバー、平均値の標準偏差；両方ともに抗ＣＤ３と組み合わせたＯＸ４０ｍＡｂ２４及びＲ３４７ヒトＩｇＧ１対照ｍＡｂについてｎ＝３テクニカルレプリケート；可溶性ＯＸ４０ｍＡｂ２４、抗ＣＤ３のない可溶性ＯＸ４０ｍＡｂ２４、及びＯＸ４０ｍＡｂ２４の非存在下での抗ＣＤ３についてｎ＝２テクニカルレプリケート。 ＯＸ４０ｍＡｂ２４に応答したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞サイトカイン放出。（図８Ｄ）ＩＬ−１３、及び（図８Ｅ）ＩＬ−５を含めた、ドナー６５１についての代表的なＯＸ４０ｍＡｂ２４誘導ヒトＣＤ４Ｔ細胞サイトカイン放出。記号、平均値；エラーバー、平均値の標準偏差；両方ともに抗ＣＤ３と組み合わせたＯＸ４０ｍＡｂ２４及びＲ３４７ヒトＩｇＧ１対照ｍＡｂについてｎ＝３テクニカルレプリケート；可溶性ＯＸ４０ｍＡｂ２４、抗ＣＤ３のない可溶性ＯＸ４０ｍＡｂ２４、及びＯＸ４０ｍＡｂ２４の非存在下での抗ＣＤ３についてｎ＝２テクニカルレプリケート。 ９Ｂ１２に応答したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞サイトカイン放出。（図９Ａ）ＩＦＮγ、（図９Ｂ）ＴＮＦα及び（図９Ｃ）ＩＬ−１０を含めた、ドナー６５１についての代表的な９Ｂ１２誘導ヒトＣＤ４Ｔ細胞サイトカイン放出。記号、平均値；エラーバー、平均値の標準偏差；両方ともに抗ＣＤ３と組み合わせた９Ｂ１２及びマウスＩｇＧ１対照ｍＡｂについてｎ＝３テクニカルレプリケート；可溶性９Ｂ１２、抗ＣＤ３のない可溶性９Ｂ１２、及び９Ｂ１２の非存在下での抗ＣＤ３についてｎ＝２テクニカルレプリケート。 ９Ｂ１２に応答したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞サイトカイン放出。（図９Ｄ）ＩＬ−１３、及び（図９Ｅ）ＩＬ−５を含めた、ドナー６５１についての代表的な９Ｂ１２誘導ヒトＣＤ４Ｔ細胞サイトカイン放出。記号、平均値；エラーバー、平均値の標準偏差；両方ともに抗ＣＤ３と組み合わせた９Ｂ１２及びマウスＩｇＧ１対照ｍＡｂについてｎ＝３テクニカルレプリケート；可溶性９Ｂ１２、抗ＣＤ３のない可溶性９Ｂ１２、及び９Ｂ１２の非存在下での抗ＣＤ３についてｎ＝２テクニカルレプリケート。 ＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２生物活性の計測に用いられる細胞システムを示す概略図である。ＦｃγＲ発現細胞によるＯＸ４０ｍＡｂ２４架橋結合がＯＸ４０発現ジャーカットＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター細胞株の細胞表面上のＯＸ４０のクラスター化及び活性化を媒介するとＮＦκＢ媒介性のルシフェラーゼ産生が生じ、これをＯＸ４０活性化の代用として計測することができる。ＦｃγＲ＝断片結晶化可能γレセプター；ＮＦκＢ＝核内因子κＢ。 ＦｃγＲによる架橋結合を有する及び有しないＯＸ４０発現ジャーカットＮＦκＢレポーター細胞におけるＯＸ４０ｍＡｂ２４の生物活性。２細胞バイオアッセイにおけるジャーカットＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター細胞株の細胞表面上に発現するヒトＯＸ４０を介したＯＸ４０ｍＡｂ２４誘導シグナル伝達の濃度依存的活性（ＲＬＵ単位）。（図１１Ａ）ＣＤ３２Ａ発現ＨＥＫ２９３細胞、及びＨＥＫ２９３親細胞（ＨＥＫ）による、又は（図１１Ｂ）ＣＤ３２Ｂ発現ＨＥＫ２９３細胞、（図１１Ｃ）Ｒａｊｉ Ｂ細胞、又は（図１１Ｄ）原発肺腫瘍から単離したＣＤ４５＋細胞の存在下でのＯＸ４０ｍＡｂ２４の架橋結合後のレポーター活性。データは、表５−２に掲載する他の結果を代表するものである。ｍＡｂ＝モノクローナル抗体、ＲＬＵ＝相対発光単位。 ２細胞生物活性アッセイにおける種々の細胞型によるＦｃγＲ架橋結合を使用したＯＸ４０発現ジャーカットＮＦκＢレポーター細胞における９Ｂ１２の生物活性。２細胞バイオアッセイにおけるジャーカットＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター細胞株の細胞表面上に発現するヒトＯＸ４０を介した９Ｂ１２誘導シグナル伝達の濃度依存的活性（ＲＬＵ単位）。（図１２Ａ）ＣＤ３２Ａ発現ＨＥＫ２９３細胞、又は（図１２Ｂ）ＣＤ３２Ｂ発現ＨＥＫ２９３細胞による９Ｂ１２の架橋結合後のレポーター活性。データは、表５−３に掲載する他の結果を代表するものである。ｍＡｂ＝モノクローナル抗体；ＲＬＵ＝相対発光単位。 ２細胞生物活性アッセイにおける種々の細胞型によるＦｃγＲ架橋結合を使用したＯＸ４０発現ジャーカットＮＦκＢレポーター細胞における９Ｂ１２の生物活性。２細胞バイオアッセイにおけるジャーカットＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター細胞株の細胞表面上に発現するヒトＯＸ４０を介した９Ｂ１２誘導シグナル伝達の濃度依存的活性（ＲＬＵ単位）。（図１２Ｃ）Ｒａｊｉ Ｂ細胞、又は（図１２Ｄ）原発肺腫瘍から単離したＣＤ４５＋細胞による９Ｂ１２の架橋結合後のレポーター活性。データは、表５−３に掲載する他の結果を代表するものである。ｍＡｂ＝モノクローナル抗体；ＲＬＵ＝相対発光単位。 ＯＸ４０ｍＡｂ２４のナチュラルキラー細胞媒介性抗体依存性細胞傷害、実験１。（図１３Ａ）１０μ／ｍＬの９Ｂ１２、ＯＸ４０ｍＡｂ２４、又はＩｇＧ１三重突然変異体（ｍＡｂ２９）若しくはヒトＩｇＧ４Ｐ（ｍＡｂ２８）バージョンのＯＸ４０ｍＡｂ２４を使用した同種（左）又は自己（右）ＮＫ及びＣＤ４＋Ｔ細胞ドナー対由来のヒトＮＫ細胞によるＯＸ４０発現活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の特異的死滅。（図１３Ｂ）リツキシマブの存在下における、しかしＲ３４７ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の存在下においてはない、ドナー３５０及び３５１由来のＮＫ細胞によるＴｏｌｅｄｏ Ｂ細胞の溶解。テクニカルレプリケートはトリプリケートで行った。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。ＡＤＣＣ＝抗体薬物依存性細胞傷害；ｍＡｂ＝モノクローナル抗体；ＮＫ＝ナチュラルキラー。 ＯＸ４０ｍＡｂ２４のナチュラルキラー細胞媒介性抗体依存性細胞傷害、実験２。（図１４Ａ）１０μ／ｍＬの対照Ｒ３４７ヒトＩｇＧ１、９Ｂ１２、ＯＸ４０ｍＡｂ２４、ヒトＩｇＧ４Ｐ（ｍＡｂ２８）又はＩｇＧ１三重突然変異体（ｍＡｂ２９）バージョンのＯＸ４０ｍＡｂ２４を使用した同種（左）又は自己（右）ＮＫ及びＣＤ４Ｔ細胞ドナー対由来のヒトＮＫ細胞によるＯＸ４０発現活性化ＣＤ４Ｔ細胞の特異的死滅。（図１４Ｂ）リツキシマブの存在下における、しかしＲ３４７ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の存在下においてはない、ドナー５５８及び５８９由来のＮＫ細胞によるＴｏｌｅｄｏ Ｂ細胞の溶解。テクニカルレプリケートはトリプリケートで行った。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。ＡＤＣＣ＝抗体薬物依存性細胞傷害；ｍＡｂ＝モノクローナル抗体；ＮＫ＝ナチュラルキラー。 ＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２のナチュラルキラー細胞媒介性抗体依存性細胞傷害の評価、実験３。（図１５Ａ〜図１５Ｂ）指示されるとおりの２人の別個のドナー由来の初代ヒトＮＫ細胞を使用した、ＯＸ４０ｍＡｂ２４によって媒介されるが９Ｂ１２によっては媒介されないＯＸ４０発現ヒトＣＤ４Ｔ細胞の特異的死滅。（図１５Ｃ〜図１５Ｄ）リツキシマブの存在下における、しかしＲ３４７ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の存在下においてはない、ドナー３６３及び５０４由来のＮＫ細胞によるＴｏｌｅｄｏ Ｂ細胞の溶解。テクニカルレプリケートはデュプリケートで行った。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。ＡＤＣＣ＝抗体薬物依存性細胞傷害；ｍＡｂ＝モノクローナル抗体；ＮＫ＝ナチュラルキラー。 ＯＸ４０ｍＡｂ２４のナチュラルキラー細胞媒介性抗体依存性細胞傷害の評価、実験４。（図１６Ａ〜図１６Ｂ）指示されるとおりの２人の別個のドナー由来の初代ヒトＮＫ細胞を使用した、ＯＸ４０ｍＡｂ２４によって媒介されるＯＸ４０発現ヒトＣＤ４Ｔ細胞の特異的死滅。（図１６Ｃ〜図１６Ｄ）リツキシマブの存在下における、しかしＲ３４７ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体においてはない、ドナー４６４及び５３２由来のＮＫ細胞によるＴｏｌｅｄｏ Ｂ細胞の溶解。テクニカルレプリケートはデュプリケートで行った。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。ＡＤＣＣ＝抗体薬物依存性細胞傷害；ｍＡｂ＝モノクローナル抗体；ＮＫ＝ナチュラルキラー。 ＯＸ４０ｍＡｂ２４のナチュラルキラー細胞媒介性抗体依存性細胞傷害の評価、実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｎｅｎｔ）５。指示されるとおりのドナー６０１（パネルＡ）及び６０２（パネルＢ）由来の初代ヒトＮＫ細胞を使用した、ＯＸ４０ｍＡｂ２４によって媒介されるＯＸ４０発現ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の特異的死滅。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。ＡＤＣＣ＝抗体薬物依存性細胞傷害；ｍＡｂ＝モノクローナル抗体；ＮＫ＝ナチュラルキラー。 精製ヒトＣ１ｑタンパク質に対するＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２結合の評価。指示濃度の精製ヒトＣ１ｑタンパク質をバイオセンサーチップに注入した。ブランクは、ＰＢＳ／０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０媒体単独の注入を表す。パネルＡ：精製ヒトＣ１ｑに対するＯＸ４０ｍＡｂ２４結合。パネルＢ：精製ヒトＣ１ｑに対する９Ｂ１２結合。 カニクイザル／アカゲザルＯＸ４０発現ジャーカットＮＦκＢ−ルシフェラーゼクローンＢ２及びＬＣＬ８６６４アカゲザルＢ細胞生物活性アッセイにおけるＯＸ４０ｍＡｂ２４活性。アカゲザルＢ細胞株ＬＣＬ８６６４と組み合わせたカニクイザル／アカゲザルＯＸ４０発現ジャーカットＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター細胞株におけるＯＸ４０ｍＡｂ２４によるＮＦκＢ活性の濃度依存的誘導（ＲＬＵ単位）。データは２つの独立したアッセイについて示し、各データ点につき４レプリケートである。エラーバーは平均値の標準誤差を表し、目盛が原因で見えない。ＲＬＵ＝相対発光単位。 カニクイザル／アカゲザルＯＸ４０発現ジャーカットＮＦκＢ−ルシフェラーゼクローンＢ２及びＬＣＬ８６６４アカゲザルＢ細胞生物活性アッセイにおける９Ｂ１２活性。アカゲザルＢ細胞株ＬＣＬ８６６４と組み合わせたカニクイザル／アカゲザルＯＸ４０発現ジャーカットＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター細胞株における９Ｂ１２によるＮＦκＢ活性の濃度依存的誘導（ＲＬＵ単位）。データは２つの独立したアッセイについて示し、各データ点につき４レプリケートである。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。ＲＬＵ＝相対発光単位。 カニクイザル／アカゲザルＯＸ４０発現ジャーカットＮＦκＢ−ルシフェラーゼクローンＢ２及びＦｃγレセプター発現アカゲザル免疫細胞生物活性アッセイにおけるＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２活性。Ｆｃγレセプター発現アカゲザル免疫細胞と組み合わせたカニクイザル／アカゲザルＯＸ４０発現ジャーカットＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター細胞株におけるＯＸ４０ｍＡｂ２４（パネルＡ）及び９Ｂ１２（パネルＢ）によるＮＦκＢ活性の濃度依存的誘導（ＲＬＵ単位）。データ点につき２レプリケート。ＲＬＵ＝相対発光単位。 ＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２は初代アカゲザルＣＤ４Ｔ細胞の増殖を引き起こす。初代活性化アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＯＸ４０ｍＡｂ２４（図２２Ａ〜図２２Ｂ）誘導性細胞分裂。トリプリケートウェルでの２つの独立したアッセイのデータを示す。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。 ＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２は初代アカゲザルＣＤ４Ｔ細胞の増殖を引き起こす。初代活性化アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞における９Ｂ１２（図２２Ｃ〜図２２Ｄ）誘導性細胞分裂。トリプリケートウェルでの２つの独立したアッセイのデータを示す。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。 マウス異種移植モデルにおいてＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２がＡ３７５細胞の成長に及ぼす効果−実験１。１日目に、Ｅ：Ｔ比１：６でアロ反応性ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞株と混合したＡ３７５細胞を各群６匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＳＣ移植した。３、５、７、１０及び１２日目にＯＸ４０ｍＡｂ２４（図２３Ａ）及び９Ｂ１２（図２３Ｂ）及びアイソタイプ対照（図２３Ａ〜図２３Ｂ）をＩＰ投与した。腫瘍容積の平均値を示す。それぞれ２５及び１８日目にＯＸ４０ｍＡｂ２４処置動物（図２３Ａ）又は９Ｂ１２処置動物（図２３Ｂ）とアイソタイプ対照処置動物との比較を行い、マン・ホイットニー順位和検定による統計的有意性について群間差を分析した。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。＊：ＴＧＩ＞６８％、Ｐ≦０．０５ 対アイソタイプ対照群。Ｅ：Ｔ＝エフェクター対標的比；ＩＰ 腹腔内；ＮＯＤ／ＳＣＩＤ＝非肥満糖尿病／重症複合免疫不全；ＳＣ＝皮下；ＴＧＩ＝腫瘍成長阻害。 マウス異種移植モデルにおいてＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２がＡ３７５細胞の成長に及ぼす効果−実験２。１日目に、Ｅ：Ｔ比１：６でアロ反応性ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞株と混合したＡ３７５細胞を各群６匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＳＣ移植した。３、５、７、１０及び１２日目にＯＸ４０ｍＡｂ２４（図２４Ａ）及び９Ｂ１２（図２４Ｂ）及びアイソタイプ対照（図２４Ａ−２４Ｂ）をＩＰ投与した。腫瘍容積の平均値を示す。１８日目にＯＸ４０ｍＡｂ２４処置動物（図１２Ａ）又は９Ｂ１２処置動物（図１２Ｂ）とアイソタイプ対照処置動物との比較を行い、マン・ホイットニー順位和検定による統計的有意性について群間差を分析した。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。＃：ＴＧＩ≧７５％、Ｐ≦０．０００４ 対アイソタイプ対照群。＊：ＴＧＩ＝５３％、Ｐ≦０．０５ 対アイソタイプ対照群。Ｅ：Ｔ＝エフェクター対標的比；ＩＰ＝腹腔内；ＮＯＤ／ＳＣＩＤ＝非肥満糖尿病／重症複合免疫不全；ＳＣ＝皮下；ＴＧＩ＝腫瘍成長阻害。 マウス異種移植モデルにおいてＯＸ４０ｍＡｂ２４がＡ３７５細胞の成長に及ぼす効果−実験３。１日目に、Ｅ：Ｔ比１：６でアロ反応性ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞株と混合したＡ３７５細胞を各群６匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＳＣ移植した。３、６、８、１０及び１３日目にＯＸ４０ｍＡｂ２４をＩＰ投与した。腫瘍容積の平均値を示す。２８日目にＯＸ４０ｍＡｂ２４処置動物とアイソタイプ対照処置動物との比較を行い、マン・ホイットニー順位和検定による統計的有意性について群間差を分析した。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。＊：ＴＧＩ＝７５％、Ｐ≦０．０５ 対アイソタイプ対照群；Ｅ：Ｔ＝エフェクター対標的比；ＩＰ＝腹腔内；ＮＯＤ／ＳＣＩＤ＝非肥満糖尿病／重症複合免疫不全；ＳＣ＝皮下；ＴＧＩ＝腫瘍成長阻害。 マウス同系モデルにおいてＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａがＣＴ２６細胞株の成長に及ぼす効果。１日目に各群１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６細胞をＳＣ接種した。９及び１２日目（（図２６Ａ）の矢印）に対照（陰性対照）及び被験物質（ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ）をＩＰ投与した。腫瘍容積の平均値（図２６Ａ）及び個々の値（図２６Ｂ）を示す。ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ処置動物と陰性対照処置動物との比較を行い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを使用して一元配置ＡＮＯＶＡによる統計的有意性について群間差を分析した。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。＊：ＴＧＩ＞５０％、Ｐ≦０．０００１ 対２１日目のアイソタイプ対照群。ＩＰ＝腹腔内；ＳＣ＝皮下；ＴＧＩ＝腫瘍成長阻害。 マウス同系モデルにおいてＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａがＣＴ２６細胞株の成長に及ぼす効果。１日目に各群１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６細胞をＳＣ接種した。１３及び１６日目（（図２７Ａ）の矢印）に被験物質（ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ）をＩＰ投与した。腫瘍容積の平均値（図２７Ａ）及び個々の値（図２７Ｂ）を示す。ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ処置動物と未処置対照動物との比較を行い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを使用して一元配置ＡＮＯＶＡによる統計的有意性について群間差を分析した。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。＊：ＴＧＩ＞５０％、Ｐ≦０．０００１ 対２４日目の未処置対照群。ＩＰ＝腹腔内；ＳＣ＝皮下；ＴＧＩ＝腫瘍成長阻害。 マウス同系モデルにおいてＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａがＭＣＡ２０５細胞株に及ぼす効果。１日目に各群１４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスにＭＣＡ２０５細胞をＳＣ接種した。１１及び１４日目に対照物質（アイソタイプ対照）及び被験物質（ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ）をＩＰ投与した。腫瘍容積の平均値（図２８Ａ）及び個々の値（図２８Ｂ）を示す。ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ処置動物とアイソタイプ対照処置動物との比較を行い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを使用して一元配置ＡＮＯＶＡによる統計的有意性について群間差を分析した。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。＊：ＴＧＩ＞５０％、Ｐ≦０．０００１ 対２７日目のアイソタイプ対照群。ＩＰ＝腹腔内；ＳＣ＝皮下；ＴＧＩ＝腫瘍成長阻害。 マウス同系モデルにおいてＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａが４Ｔ１細胞株の成長に及ぼす効果。１日目に各群１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに４Ｔ１細胞をＳ接種した。１３、１６、２０、及び２３日目に対照物質（アイソタイプ対照）及び被験物質（ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ）をＩＰ投与した。腫瘍容積の平均値（図２９Ａ）及び個々の値（図２９Ｂ）を示す。ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ処置動物とアイソタイプ対照処置動物との比較を行い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを使用して一元配置ＡＮＯＶＡによる統計的有意性について群間差を分析した。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。ＩＰ＝腹腔内；ＳＣ＝皮下；ＴＧＩ＝腫瘍成長阻害。 ヒト及びマウスＯＸ４０分子の細胞外ドメインのアミノ酸アラインメント。ヒトＯＸ４０（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３３１８．１）はマウスＯＸ４０（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０３５７８９．１）と６０％の配列同一性を共有する。アラインメントはＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法を用いて実施した。ＯＸ４０の細胞外ドメインを詳細に示す。ＣＲＤ３ドメインにおいてヒトとマウスとの間で異なるアミノ酸を矢印で示す。２つの必須エピトープ残基Ｌ１１６及びＡ１２６を枠で囲む。ＣＲＤ＝システインリッチドメイン。 キメラヒト／マウスＯＸ４０変異体の命名及び概略図。マウスＯＸ４０（白抜き）の様々なドメイン又は残基をヒト（塗り潰し）に（ＫＯ）、又はヒトＯＸ４０アミノ酸のそれをマウスＯＸ４０に（ＫＩ）スワップイン又はスワップアウトすることにより、キメラヒト／マウスＯＸ４０変異体を構築した。個々のアミノ酸又は組み合わせの突然変異を赤色（ＫＯ）及び緑色（ＫＩ）の矢印で示す。ＣＲＤ＝システインリッチドメイン；ＫＩ＝ノックイン；ＫＯ＝ノックアウト；ＴＭ＝膜貫通ドメイン。 キメラヒト／マウスＯＸ４０変異体に対するＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合のＦＡＣＳ分析。ＯＸ４０ｍＡｂ２４及びその親マウスｍＡｂ、９Ｂ１２を使用したＦＡＣＳ分析による結合特性決定のため、２９３Ｆ細胞を使用して全ての変異体を一過性に発現させた。抗ヒト及びマウスＯＸ４０ポリクローナル抗体を使用して発現レベルをモニタした。（Ａ）ドメインスワップキメラ変異体を使用すると、ＣＲＤ３ドメインがエピトープ含有ドメインと同定された。ＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２は、マウスＣＲＤ３ドメインをコードするＫＯ変異体（ＫＯ＿ＣＲＤ３及びＫＯ＿ＣＲＤ３＋４）と結合せず、ヒトＣＲＤ３ドメインをコードするＫＩ変異体（ＫＩ＿ＣＲＤ３）を認識する。 図３２Ａ−１の続きである。 キメラヒト／マウスＯＸ４０変異体に対するＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合のＦＡＣＳ分析。ＯＸ４０ｍＡｂ２４及びその親マウスｍＡｂ、９Ｂ１２を使用したＦＡＣＳ分析による結合特性決定のため、２９３Ｆ細胞を使用して全ての変異体を一過性に発現させた。抗ヒト及びマウスＯＸ４０ポリクローナル抗体を使用して発現レベルをモニタした。（Ｂ）加えて、個々の又は組み合わせのアミノ酸を突然変異させることにより、ＣＲＤ３ドメインにおいてヒトとマウスとの間で異なる必須エピトープ残基がＣＲＤ３ドメインのＬ１１６及びＡ１２６と決定された（図１１−１）。ヒト残基Ｌ１１６及びＡ１２６をマウス対応物によって置き換えると（ＫＯ＿Ｌ１１６＋Ａ１２６）、ＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２の結合性は消失した。 図３２Ｂ−１の続きである。 図３２Ｂ−２の続きである。 キメラヒト／マウスＯＸ４０変異体に対するＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合のＦＡＣＳ分析。ＯＸ４０ｍＡｂ２４及びその親マウスｍＡｂ、９Ｂ１２を使用したＦＡＣＳ分析による結合特性決定のため、２９３Ｆ細胞を使用して全ての変異体を一過性に発現させた。抗ヒト及びマウスＯＸ４０ポリクローナル抗体を使用して発現レベルをモニタした。（Ｃ）ＫＩ／機能獲得型変異体は、これらの２つの必須残基の重要性を裏付ける。Ｌ１１６、Ａ１２６、又は組み合わせをマウスＯＸ４０にグラフトすると、ＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２の結合性がもたらされた。 図３２Ｃ−１の続きである。 ナイーブマウスにＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａを投与した後の末梢血及び脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＫｉ６７及びＩＣＯＳの発現レベル。１日目に各群７匹のナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに対照物質（生理食塩水及びＮＩＰ２２８ ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照）及び被験物質（ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ）を指示用量レベルで腹腔内接種した。指示日に血液（パネルＡ及びＣ）を採取し、１０日目に５群から脾臓を摘出した。ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＫｉ６７（パネルＡ及びＢ）及びＩＣＯＳ（パネルＣ及びＤ）の発現レベルをフローサイトメトリーによって計測した。各群について、Ｋｉ６７（パネルＡ）及びＩＣＯＳ（パネルＣ）を発現する血中のＣＤ４細胞の割合の平均値を示す。個々の群の各動物について、Ｋｉ６７（パネルＢ）及びＩＣＯＳ（パネルＤ）を発現する脾臓中のＣＤ４細胞の割合をプロットした。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。＊：パネルＡ及びＣにおいてＰ≦０．０５を示す；パネルＢ及びＤでは有意性のある各群についてＰ値を掲載する。 ナイーブマウスにＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａを投与した後の末梢血及び脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＫｉ６７及びＩＣＯＳ発現の相関。指示用量レベルの対照物質（生理食塩水及びＮＩＰ２２８ ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照）及び被験物質（ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ）による処置から１０日後の図１２−１に示す個々の動物の末梢血（パネルＡ）及び脾臓（パネルＢ）から単離されたＫｉ６７及びＩＣＯＳ陽性ＣＤ４Ｔ細胞の割合の間の比較を行った。個々のマウスについて計測値をプロットした。得られた一群のデータセットに対し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを使用して線形回帰分析を実施し、このデータの最良適合線を決定した。決定係数（ｒ２）及び傾きがゼロでない有意性（Ｐ値）を各グラフについて提供する。 ナイーブマウスにＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａを投与した後の末梢血及び脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＫｉ６７及びＩＣＯＳの発現レベル。１日目に各群７匹のナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに対照物質（生理食塩水及びＮＩＰ２２８ ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照）及び被験物質（ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ）を指示用量レベルで腹腔内接種した。指示日に血液（パネルＡ及びＣ）を採取し、１０日目に５群から脾臓を摘出した。ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＫｉ６７（パネルＡ及びＢ）及びＩＣＯＳ（パネルＣ及びＤ）の発現レベルをフローサイトメトリーによって計測した。各群について、Ｋｉ６７（パネルＡ）及びＩＣＯＳ（パネルＣ）を発現する血中のＣＤ８細胞の割合の平均値を示す。個々の群の各動物について、Ｋｉ６７（パネルＢ）及びＩＣＯＳ（パネルＤ）を発現する脾臓中のＣＤ８細胞の割合をプロットした。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。＊：パネルＡ及びＣにおいてＰ≦０．０５を示す；パネルＢ及びＤでは有意性のある各群についてＰ値を掲載する。 ナイーブマウスにＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａを投与した後の末梢血及び脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＫｉ６７及びＩＣＯＳ発現の相関。指示用量レベルの対照物質（生理食塩水及びＮＩＰ２２８ ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照）及び被験物質（ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ）による処置から１０日後の図１２−１に示す個々の動物の末梢血（パネルＡ）及び脾臓（パネルＢ）から単離したＫｉ６７及びＩＣＯＳ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の間の比較を行った。個々のマウスについて計測値をプロットした。得られた一群のデータセットに対し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを使用して線形回帰分析を実施し、このデータの最良適合線を決定した。決定係数（ｒ２）及び傾きがゼロでない有意性（Ｐ値）を各グラフについて提供する。 阻害性（Ｆｃｇｒ２ｂ−／−）又は活性化（Ｆｃｅｒ１ｇ−／−）Ｆｃγレセプターが欠損した同系マウスモデルにおけるマウスＯＸ８６ ＩｇＧ２ａがＣＴ２６細胞株の成長に及ぼす効果。１日目に、阻害性ＦｃγレセプターＩＩｂ（Ｆｃｇｒ２ｂ−／−；パネルＡ及びＢ）又は活性化Ｆｃγレセプター（Ｆｃｅｒ１ｇ−／−；パネルＣ及びＤ）が欠損するように遺伝子操作された８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群にＣＴ２６細胞をＳＣ接種した。４及び７日目に対照物質（生理食塩水／未処置及びＯＸ８６ ｍＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａ突然変異体／アイソタイプ対照）及び被験物質（ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ）をＩＰ投与した。平均（パネルＡ及びＣ）及び個々の（パネルＢ及びＤ）腫瘍容積を示す。ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ処置動物と未処置とアイソタイプ対照処置動物との比較を行い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを使用して一元配置ＡＮＯＶＡによる統計的有意性について群間差を分析した。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。ＳＣ＝皮下；ＩＰ＝腹腔内；ＴＧＩ＝腫瘍成長阻害 阻害性（Ｆｃｇｒ２ｂ−／−）又は活性化（Ｆｃｅｒ１ｇ−／−）Ｆｃγレセプターが欠損した同系マウスモデルにおいてマウスＯＸ８６ ＩｇＧ２ａがＭＣＡ２０５細胞株の成長に及ぼす効果。１日目に、阻害性ＦｃγレセプターＩＩｂ（Ｆｃｇｒ２ｂ−／−；パネルＡ及びＢ）又は活性化Ｆｃγレセプター（Ｆｃｅｒ１ｇ−／−；パネルＣ及びＤ）が欠損するように遺伝的に突然変異させた８匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群にＭＣＡ２０５細胞をＳＣ接種した。４及び７日目に対照物質（生理食塩水／未処置及びＯＸ８６ ｍＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａ突然変異体／アイソタイプ対照）及び被験物質（ｍＯＸ４０Ｌ ＦＰ）をＩＰ投与した。平均（パネルＡ及びＣ）及び個々の（パネルＢ及びＤ）腫瘍容積を示す。ｍＯＸ４０Ｌ ＦＰ処置動物と未処置及びアイソタイプ対照処置動物との比較を行い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを使用して一元配置ＡＮＯＶＡによる統計的有意性について群間差を分析した。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。＊：ＴＧＩ≧９５％、Ｐ≦０．０２３ 対試験２０日目の未処置及びアイソタイプ対照群。ＳＣ＝皮下；ＩＰ＝腹腔内；ＴＧＩ＝腫瘍成長阻害 阻害性（Ｆｃｇｒ２ｂ−／−）又は活性化（Ｆｃｅｒ１ｇ−／−）Ｆｃγレセプターが欠損したマウスにＯＸ８６マウスＩｇＧ２ａを投与した後の末梢血、脾臓及びＣＴ２６腫瘍から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＫｉ６７の発現レベル。１日目に、阻害性ＦｃγレセプターＩＩｂ（Ｆｃｇｒ２ｂ−／−；パネルＡ）又は活性化Ｆｃγレセプター（Ｆｃｅｒ１ｇ−／−；パネルＢ）が欠損するように遺伝子操作された４匹のＢａｌｂ／ｃマウスの群にＣＴ２６細胞をＳＣ接種した；この試験は図１２−５に提供する試験と独立しているが、それと同様に行われた。４及び７日目に対照物質（生理食塩水／未処置及びＯＸ８６ ｍＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａ突然変異体／アイソタイプ対照）及び被験物質（ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ）をＩＰ投与した。パネルＡについては１４日目に、及びパネルＢについては１３日目に、血液、脾臓及び腫瘍を採取した。ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＫｉ６７の発現レベルをフローサイトメトリーによって計測した。記号は、個々のマウスの各組織からのＫｉ６７陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を表す；水平のバーは各群の平均値を表す。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを使用して一元配置ＡＮＯＶＡによる統計的有意性について群間差を分析し、計算Ｐ値と共に水平のバーで示した。ＳＣ＝皮下；ＩＰ＝腹腔内 阻害性（Ｆｃｇｒ２ｂ−／−）又は活性化（Ｆｃｅｒ１ｇ−／−）Ｆｃγレセプターが欠損したマウスにＯＸ８６マウスＩｇＧ２ａを投与した後の末梢血、脾臓及びＣＴ２６腫瘍から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＫｉ６７の発現レベル。１日目に、阻害性ＦｃγレセプターＩＩｂ（Ｆｃｇｒ２ｂ−／−；パネルＡ）又は活性化Ｆｃγレセプター（Ｆｃｅｒ１ｇ−／−；パネルＢ）が欠損するように遺伝子操作された４匹のＢａｌｂ／ｃマウスの群にＣＴ２６細胞をＳＣ接種した；この試験は図１２−５に提供する試験と独立しているが、それと同様に行われた。４及び７日目に対照物質（生理食塩水／未処置及びＯＸ８６ ｍＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａ突然変異体／アイソタイプ対照）及び被験物質（ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ）をＩＰ投与した。パネルＡについては１４日目に、及びパネルＢについては１３日目に、血液、脾臓及び腫瘍を採取した。ＣＤ８＋Ｔ細胞のＫｉ６７の発現レベルをフローサイトメトリーによって計測した。記号は、個々のマウスの各組織からのＫｉ６７陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を表す；水平のバーは平均値を表す。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを使用して一元配置ＡＮＯＶＡによる統計的有意性について群間差を分析し、計算Ｐ値と共に水平のバーで示した。ＳＣ＝皮下；ＩＰ＝腹腔内 阻害性（Ｆｃｇｒ２ｂ−／−）又は活性化（Ｆｃｅｒ１ｇ−／−）Ｆｃγレセプターが欠損したマウスにＯＸ８６マウスＩｇＧ２ａを投与した後の流入領域リンパ節、脾臓及びＭＣＡ２０５腫瘍から単離されたＣＤ４Ｔ細胞におけるＫｉ６７の発現レベル。１日目に、阻害性ＦｃγレセプターＩＩｂ（Ｆｃｇｒ２ｂ−／−；パネルＡ）又は活性化Ｆｃγレセプター（Ｆｃｅｒ１ｇ−／−；パネルＢ）が欠損するように遺伝子操作された４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群にＭＣＡ２０５細胞をＳＣ接種した；試験は独立しているが、図１２−６に提供する試験と同様に行う。４及び７日目に対照物質（生理食塩水／未処置及びＯＸ８６ ｍＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａ突然変異体／アイソタイプ対照）及び被験物質（ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ）をＩＰ投与した。パネルＢについて、２０日目に流入領域リンパ節、脾臓及び腫瘍を摘出した。ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＫｉ６７の発現レベルをフローサイトメトリーによって計測した。記号は、個々のマウスの各組織からのＫｉ６７陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を表す；水平のバーは平均値を表す。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを使用して一元配置ＡＮＯＶＡによる統計的有意性について群間差を分析し、計算Ｐ値と共に水平のバーで示した。ＳＣ＝皮下；ＩＰ＝腹腔内 阻害性（Ｆｃｇｒ２ｂ−／−）又は活性化（Ｆｃｅｒ１ｇ−／−）Ｆｃγレセプターが欠損したマウスにＯＸ８６マウスＩｇＧ２ａを投与した後の流入領域リンパ節、脾臓及びＭＣＡ２０５腫瘍から単離されたＣＤ８Ｔ細胞におけるＫｉ６７の発現レベル。１日目に、阻害性ＦｃγレセプターＩＩｂ（Ｆｃｇｒ２ｂ−／−；パネルＡ）又は活性化Ｆｃγレセプター（Ｆｃｅｒ１ｇ−／−；パネルＢ）が欠損するように遺伝子操作された４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群にＭＣＡ２０５細胞をＳＣ接種した；この試験は図１２−６に提供される試験と独立しているが、それと同様に行われた。４及び７日目に対照物質（生理食塩水及びｍＯＸ４０Ｌ ＦＰ Ｄ２６５Ａ突然変異体対照）及び被験物質（ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ）をＩＰ投与した。２０日目に流入領域リンパ節、脾臓及び腫瘍を摘出した。ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＫｉ６７の発現レベルをフローサイトメトリーによって計測した。記号は、個々のマウスの各組織からのＫｉ６７陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を表す；水平のバーは平均値を表す。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを使用して一元配置ＡＮＯＶＡによる統計的有意性について群間差を分析し、計算Ｐ値と共に水平のバーで示した。ＳＣ＝皮下；ＩＰ＝腹腔内 ＯＸ４０ｍＡｂ２４による調節性Ｔ細胞の減少。パネルＡ：ＫＬＨ免疫化及びＮＩＰ２２８ ｈｕＩｇＧ１対照（ｈｕＩｇＧ１）又はＯＸ４０ｍＡｂ２４による処置の直前にヒト免疫細胞を移植したマウスの末梢血において計測したヒトＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇ細胞の割合。ｍＡｂ無しは、免疫化がなく、且つｍＡｂ処置がないことを意味する。パネルＢ：免疫化及びｍＡｂによる処置後の同じ群内のマウスの末梢血中におけるヒトＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ Ｔｒｅｇ細胞の割合。統計学的ｐ値は一元配置ＡＮＯＶＡによる。Ｈｕ＝ヒト；ｍＡｂ＝モノクローナル抗体；Ｔｒｅｇ＝調節性Ｔ細胞 ＯＸ４０ｍＡｂ２４処置後の調節性Ｔ細胞と比べたエフェクター及びメモリーＣＤ４Ｔ細胞の拡大。全ＣＤ４＋（パネルＡ）；ＣＤ４＋エフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）（パネルＢ）；ＣＤ４＋エフェクターメモリー細胞（Ｔｅｍ）（パネルＣ）；及びＣＤ４＋セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）（パネルＤ）について、ＫＬＨ免疫化と、続く指示されるとおりのＮＩＰ２２８ ｈｕＩｇＧ１ ｍＡｂ（ｈｕＩｇＧ１）又はＯＸ４０ｍＡｂ２４による処置前（左）又は処置後（右）のいずれかの、ヒト免疫細胞を移植したマウスの末梢血中におけるヒトＴｒｅｇ細胞に対するヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の比。ｍＡｂ無しは、免疫化がないとともにｍＡｂ処置もないことを意味する。統計学的ｐ値は一元配置ＡＮＯＶＡによる。Ｈｕ＝ヒト；ｍＡｂ＝モノクローナル抗体；Ｔｃｍ＝セントラルメモリーＴ細胞；Ｔｅｆｆ＝エフェクターＴ細胞；Ｔｅｍ＝エフェクターメモリーＴ細胞 ＯＸ４０ｍＡｂ２４で処置したマウスにおける調節性Ｔ細胞に対するＣＤ８＋エフェクターの比の増加。ＫＬＨ免疫化と、続く指示されるとおりのＮＩＰ２２８ ｈｕＩｇＧ１ ｍＡｂ（ｈｕＩｇＧ１）又はＯＸ４０ｍＡｂ２４による処置前（左）又は処置後（右）のいずれかの、ヒト免疫細胞を移植したマウスの末梢血中におけるヒトＴｒｅｇ細胞に対するヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の比。ｍＡｂ無しは、免疫化がないとともにｍＡｂ処置もないことを意味する。全ての群を比較する一元配置ＡＮＯＶＡによる統計学的ｐ値を示す。Ｈｕ＝ヒト；ｍＡｂ＝モノクローナル抗体；Ｔｅｆｆ＝エフェクターＴ細胞；Ｔｒｅｇ＝調節性Ｔ細胞 ＯＸ４０ｍＡｂ２４で処置したマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５（ＩＬ−２レセプター）レベルの増加。（Ａ）全ＣＤ８＋、（Ｂ）ＣＤ８＋エフェクター（Ｔｅｆｆ）、（Ｃ）ＣＤ８＋エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）Ｔ細胞について、処置無し（ｍＡｂ無し）、又はＫＬＨ免疫化と、続く指示されるとおりのＮＩＰ２２８ ｈｕＩｇＧ１ ｍＡｂ（ｈｕＩｇＧ１）又はＯＸ４０ＭＡＢ２４による処置後（左）又は処置前（右）のいずれかの、ヒト免疫細胞を移植したマウスの末梢血中におけるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞中のヒトＣＤ２５（ＩＬ−２レセプター）陽性細胞の割合。ｍＡｂ無しは、免疫化がないとともにｍＡｂ処置もないことを意味する。統計学的ｐ値は一元配置ＡＮＯＶＡによる。Ｈｕ＝ヒト；ｍＡｂ＝モノクローナル抗体；Ｔｅｆｆ＝エフェクターＴ細胞；Ｔｅｍ＝エフェクターメモリーＴ細胞。
抗原によるプライミング中、又はその直後には、Ｔ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞上のＯＸ４０レセプターが会合することにより、抗原に対するＴ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞の応答が増加する。本開示の文脈では、用語「会合」は、ＯＸ４０レセプターとの結合及びそれによって媒介される少なくとも１つの活性の刺激を指す。例えば、抗原特異的Ｔ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞上のＯＸ４０レセプターの会合により、単独での抗原に対する応答と比較したときＴ細胞増殖が増加し、サイトカイン産生が増加し得る。抗原に対する応答の上昇は、ＯＸ４０レセプター会合がない場合と比べて実質的に長い期間維持され得る。このように、ＯＸ４０レセプターを介した刺激は、抗原、例えば腫瘍抗原のＴ細胞認識をブーストすることによって抗原特異的免疫応答を増強する。
ＯＸ４０アゴニストは、抗原によるＴ細胞のプライミング中、又はその直後に対象に投与されるとき、ヒト対象などの対象の抗原特異的免疫応答を増強し得る。ＯＸ４０アゴニストには、ＯＸ４０リガンド（「ＯＸ４０Ｌ」）、例えば可溶性ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質及び抗ＯＸ４０抗体又はその断片が含まれる。具体的な例は、ＯＸ４０に特異的に結合して、それによりシグナル伝達を惹起するヒト化抗体である。本開示により、一群のヒト化抗ＯＸ４０モノクローナル抗体が提供される。また、かかる抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸も記載される。本開示はまた、ヒト化抗ＯＸ４０モノクローナル抗体を使用して対象の抗原特異的免疫応答を増強する方法も提供する。
定義
用語「一つの（ａ）」又は「一つの（ａｎ）」実体とは、当該の実体の１つ以上を指し；例えば、「一つの結合分子（ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、１つ以上の結合分子を表すものと理解されることに留意すべきである。従って、用語「一つの（ａ）」（又は「一つの（ａｎ）」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書では同義的に用いられ得る。
更に、「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、２つの指定される特徴又は構成要素の各々の、他方を伴う又は伴わない具体的な開示であると解釈されるべきである。従って、用語「及び／又は」は、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」などの語句で用いられるとき、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、用語「及び／又は」は、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの語句で用いられるとき、以下の実施形態：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）の各々を包含することが意図される。
特に定義されない限り、本明細書で使用される科学技術用語は、本開示が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓが、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞、及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で認められている形式で示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。特に指示されない限り、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に記載する。本明細書に提供される見出しは、本明細書を全体として参照することによって有され得る様々な態様又は本開示の態様の限定ではない。従って、このすぐ下に定義する用語は、本明細書を全体として参照することによって更に十全に定義される。
本明細書で使用されるとき、用語「天然に存在しない」物質、組成物、実体、及び／又は物質、組成物、若しくは実体の任意の組み合わせ、又はその任意の文法上の変形は、裁判官又は行政若しくは司法機関によって「天然に存在する」と判断又は解釈されるか、又はいかなる時でもそのように判断又は解釈されるであろう形態の物質、組成物、実体、及び／又は物質、組成物、若しくは実体の任意の組み合わせを明示的に除外するが、但しそれらを除外するのみである条件付きの用語である。
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、単数形「ポリペプチド」並びに複数形「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線状に連結されている単量体（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は２つ以上のアミノ酸の任意の１つ又は複数の鎖を指し、特定の長さの産物を指すものではない。従って、２つ以上のアミノ酸の１つ又は複数の鎖を指すために用いられるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は任意の他の用語が「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、用語「ポリペプチド」はこれらの用語のいずれかの代わりに、又はそれと同義的に用いることができる。用語「ポリペプチド」はまた、限定なしに、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、及び既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾を含め、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図される。ポリペプチドは生物学的供給源から得られてもよく、又は組換え技術によって作製されてもよいが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されなくてもよい。ポリペプチドは、化学合成によることを含め、任意の方法で作成することができる。
本明細書に開示されるとおりのポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、又は２，０００以上のアミノ酸サイズのものであり得る。ポリペプチドは定義付けられた三次元構造を有し得るが、必ずしもかかる構造を有しなくてもよい。定義付けられた三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれたと称され、定義付けられた三次元構造を有さず、むしろ多数の異なるコンホメーションをとることのできるポリペプチドは、折り畳まれていないと称される。本明細書で使用されるとき、用語の糖タンパク質は、アミノ酸、例えばセリン又はアスパラギンの酸素含有又は窒素含有側鎖を介してタンパク質に結合している少なくとも１つの炭水化物部分にカップリングしたタンパク質を指す。
「単離」ポリペプチド又はその断片、変異体、若しくは誘導体とは、その自然環境にないポリペプチドが意図される。特別な精製レベルは要求されない。例えば、単離ポリペプチドは、その天然又は自然環境から取り出され得る。宿主細胞において発現した組換え産生ポリペプチド及びタンパク質は、任意の好適な技術によって分離され、分画され、又は部分的若しくは実質的に精製されている天然又は組換えポリペプチドと同じく、本明細書に開示されるとおり単離されていると見なされる。
本明細書で使用されるとき、用語「天然に存在しない」ポリペプチド、又はその任意の文法上の変形は、裁判官又は行政若しくは司法機関によって「天然に存在する」と判断又は解釈されるか、又はいかなる時でもそのように判断又は解釈されるであろう形態のポリペプチドを明示的に除外するが、但しそれらを除外するのみである条件付きの用語である。
本明細書に開示される他のポリペプチドは、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、又は変異体、及びこれらの任意の組み合わせである。用語「断片」、「変異体」、「誘導体」及び「類似体」は、本明細書に開示されるとき、対応する天然抗体又はポリペプチドの特性、例えば抗原との特異的結合性の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片には、本明細書の他の部分で考察される具体的な抗体断片に加えて、例えば、タンパク質分解性断片、並びに欠失断片が含まれる。例えばポリペプチドの変異体には、上記に記載したとおりの断片が含まれ、また、アミノ酸置換、欠失、又は挿入によって改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。特定の態様において、変異体は天然に存在しないものであってもよい。天然に存在しない変異体は、当該技術分野において公知の突然変異誘発技術を用いて作製することができる。変異ポリペプチドは、保存的又は非保存的アミノ酸置換、欠失又は付加を含み得る。誘導体は、元のポリペプチドに見られない追加的な特徴を呈するように改変されているポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。変異ポリペプチドまた、本明細書では「ポリペプチド類似体」とも称される。本明細書で使用されるとき、ポリペプチドの「誘導体」はまた、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上のアミノ酸を有する対象ポリペプチドも指し得る。また、「誘導体」としては、２０個の標準的なアミノ酸の１つ以上の誘導体を含有するペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンに代えることができ；５−ヒドロキシリジンをリジンに代えることができ；３−メチルヒスチジンをヒスチジンに代えることができ；ホモセリンをセリンに代えることができ；及びオルニチンをリジンに代えることができる。
「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸が、同様の側鎖を有する別のアミノ酸に置き換えられているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸のファミリーは当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。例えば、フェニルアラニンとチロシンの置換は保存的置換である。特定の実施形態では、アミノ酸配列を含有するポリペプチド又は抗体の、その結合分子が結合する抗原との結合性が、本開示のポリペプチド及び抗体の配列中の保存的置換によって無効になることはない。抗原結合性が消失しないヌクレオチド及びアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１ １８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；及びＢｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：．４１２−４１７（１９９７）を参照のこと）。
用語「ポリヌクレオチド」は、単数形の核酸並びに複数形の核酸を包含することが意図され、単離核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のリン酸ジエステル結合又は非従来的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸」又は「核酸配列」は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つ以上の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
「単離」核酸又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から分離されている任意の形態の核酸又はポリヌクレオチドが意図される。例えば、ゲル精製ポリヌクレオチド、又はベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドであれば、「単離されている」と見なされる。また、クローニング用の制限部位を有するように操作されているポリヌクレオチドセグメント、例えばＰＣＲ産物も、「単離されている」と見なされる。単離ポリヌクレオチドの更なる例としては、異種宿主細胞に維持される組換えポリヌクレオチド、又は緩衝液若しくは生理食塩水などの非天然溶液中の（部分的に若しくは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離ＲＮＡ分子には、ポリヌクレオチドのインビボ又はインビトロＲＮＡ転写物が含まれ、ここで転写物は自然中に見出されるものではない。単離ポリヌクレオチド又は核酸には、合成的に作製されたかかる分子が更に含まれる。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターなどの調節エレメントであってもよく、又はそれを含んでもよい。
本明細書で使用されるとき、「天然に存在しない」ポリヌクレオチド、又はその任意の文法上の変形は、裁判官又は行政若しくは司法機関によって「天然に存在する」と判断又は解釈されるか、又はいかなる時でもそのように判断又は解釈されるであろう形態のポリヌクレオチドを明示的に除外するが、但しそれらを除外するのみである条件付きの定義である。
本明細書で使用されるとき、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないものの、コード領域の一部であると見なすことができ、しかし任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が単一のポリヌクレオチドコンストラクト内、例えば単一のベクター上、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト内、例えば別個の（異なる）ベクター上に存在し得る。更に、任意のベクターが単一のコード領域を含有してもよく、又は２つ以上のコード領域を含んでもよく、例えば、単一のベクターが免疫グロブリン重鎖可変領域と免疫グロブリン軽鎖可変領域とを別個にコードすることができる。加えて、ベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、別のコード領域と融合した又は融合していない異種コード領域を含むことができる。異種コード領域としては、限定なしに、分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインなどの特別なエレメント又はモチーフをコードするものが挙げられる。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは通常、１つ以上のコード領域と作動可能に結合したプロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントを含み得る。遺伝子産物の発現が１つ又は複数の調節配列の影響下又は制御下に置かれるようにして遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が１つ以上の調節配列と結合しているときが、作動可能な結合である。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域及びそれと結合したプロモーターなど）は、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写がプロモーター機能の誘導によってもたらされる場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現調節配列の能力に干渉しないか、又はＤＮＡ鋳型が転写される能力に干渉しない場合、「作動可能に結合している」。従って、プロモーター領域は、そのプロモーターが当該核酸の転写を生じさせる能力を有したならば、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に結合していると言える。プロモーターは、所定の細胞においてＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーターの他に、他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くためポリヌクレオチドと結合され得る。
種々の転写制御領域が当業者に公知である。それらとしては、限定なしに、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定はされないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（イントロンＡと併せた前初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、及びレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルスなど）が挙げられる。他の転写制御領域としては、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ−グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来するもの、並びに真核細胞における遺伝子発現を制御する能力を有する他の配列が挙げられる。更なる好適な転写制御領域としては、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロン類又はインターロイキン類によって誘導可能なプロモーター）が挙げられる。
同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に公知である。それらとしては、限定はされないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、及びピコルナウイルスに由来するエレメント（特に配列内リボソーム進入部位、即ちＩＲＥＳ、別名ＣＩＴＥ配列）が挙げられる。
他の実施形態において、ポリヌクレオチドはＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、又はリボソームＲＮＡの形態のＲＮＡであり得る。
ポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本明細書に開示されるとおりのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を導く分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と結合することができる。シグナル仮説によれば、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは、粗面小胞体を通じた成長タンパク質鎖の運び出しが始まると、成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有することができ、それが完成した又は「完全長」ポリペプチドから切断されて分泌形態又は「成熟」形態のポリペプチドが産生されることを認識している。特定の実施形態では、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド、又は作動可能に結合したポリペプチドの分泌を導く能力を保持している当該配列の機能性誘導体が用いられる。或いは、異種哺乳類シグナルペプチド、又はその機能性誘導体が用いられてもよい。例えば、野生型リーダー配列をヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列に置換することができる。
本明細書には、ある種の結合分子、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体が開示される。具体的にフルサイズの抗体と言及しない限り、用語「結合分子」は、フルサイズの抗体並びにかかる抗体の抗原結合サブユニット、断片、変異体、類似体、又は誘導体、例えば、改変抗体分子、又は抗体分子と同じように抗原と結合するが異なる足場を使用する断片を包含する。
本明細書で使用されるとき、用語「結合分子」は、その広義の意味において、レセプター、例えばエピトープ又は抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。本明細書に更に記載するとおり、結合分子は、本明細書に記載される１つ以上の「抗原結合ドメイン」を含み得る。結合分子の非限定的な例は、抗体又は抗原特異的結合を保持しているその断片である。
本明細書で使用されるとき、用語「結合ドメイン」、「レセプター結合ドメイン」、又は「抗原結合ドメイン」は、エピトープに特異的に結合するために必要且つ十分な結合分子の一領域を指す。例えば、「Ｆｖ」、例えば２つの別個のポリペプチドサブユニットとしての、或いは単鎖としての、抗体の可変重鎖及び可変軽鎖は、「結合ドメイン」と見なされる。他の結合ドメインとしては、限定なしに、ラクダ科動物種に由来する抗体の可変重鎖（ＶＨＨ）、又は異種フレームワーク、例えば異なる生殖細胞系列若しくは種、又は異なる足場、例えばフィブロネクチン足場において発現する６つの免疫グロブリン相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。本明細書に記載されるとおりの「結合分子」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個又はそれ以上の「抗原結合ドメイン」を含み得る。
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書では同義的に用いられ得る。抗体（又は本明細書に開示されるとおりのその断片、変異体、又は誘導体）は、少なくとも重鎖の可変ドメイン（ラクダ科動物種について）又は少なくとも重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的十分に理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）を参照のこと。特に指定しない限り、用語「抗体」は、抗体の小型の抗原結合断片からフルサイズの抗体、例えば２つの完全な重鎖と２つの完全な軽鎖とを含むＩｇＧ抗体、４つの完全な重鎖と４つの完全な軽鎖とを含み、且つ任意選択でＪ鎖及び／又は分泌成分を含むＩｇＡ抗体、又は１０若しくは１２個の完全な重鎖と１０若しくは１２個の完全な軽鎖とを含み、且つ任意選択でＪ鎖を含むＩｇＭ抗体にまで及ぶ任意のものを包含する。
以下で更に詳細に考察するとおり、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に区別され得る様々な幅広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、それらの間に幾つかのサブクラスが含まれる（例えば、γ１〜γ４又はα１〜α２））ことを理解するであろう。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ ＩｇＧ、又はＩｇＥと決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等は十分に特徴付けられており、機能上の特殊化を付与することが知られている。これらのクラス及びアイソタイプの各々の修飾バージョンは、本開示に鑑みて当業者が容易に識別し得るものであり、従って本開示の範囲内にある。
軽鎖はカッパ又はラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパ又はラムダ軽鎖のいずれかと結合し得る。一般に、ハイブリドーマ、Ｂ細胞又は遺伝子操作宿主細胞のいずれかによって免疫グロブリンを作成したとき、軽鎖と重鎖とは互いに共有結合的に結合しており、且つ２つの重鎖の「テイル」部分が互いに共有結合性のジスルフィド連結又は非共有結合性の連結によって結合している。重鎖では、アミノ酸配列がＹ構造の分岐の先端にあるＮ末端から各鎖の最末端にあるＣ末端まで延在する。ある種の抗体、例えばＩｇＧ抗体の基本構造は、本明細書では「Ｈ２Ｌ２」構造とも称される、ジスルフィド結合を介して共有結合的につながることによって「Ｙ」構造を形成する２つの重鎖サブユニットと２つの軽鎖サブユニットとを含む。
軽鎖及び重鎖は、いずれも構造的及び機能的相同領域に分けられる。機能的には、用語「定常」及び「可変」が用いられる。この点で、可変軽（ＶＬ）鎖部分及び可変重（ＶＨ）鎖部分の両方の可変ドメインによって抗原認識及び特異性が決まることが理解されるであろう。逆に、軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動度、Ｆｃレセプター結合、補体結合などの生物学的特性を付与する。慣習上、定常領域ドメインの付番は、抗体の抗原結合部位又はアミノ末端から遠位になる程増える。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分には定常領域があり；実際にはＣＨ３（又はＩｇＭの場合ＣＨ４）及びＣＬドメインが、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。
上記に指摘したとおり、結合ドメイン、例えば抗体可変領域によって、結合分子が抗原上のレセプター、又はエピトープを選択的に認識し、それに特異的に結合することが可能となる。即ち、結合分子、例えば抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わせになって、三次元抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の各々にある３つのＣＤＲによって規定される。ある種の抗体は、より大型の構造を形成する。例えば、ＩｇＡは、全てがジスルフィド結合を介して共有結合的につながった２つのＨ２Ｌ２単位とＪ鎖と分泌成分とを含む分子を形成することができ、ＩｇＭは、ジスルフィド結合を介して共有結合的につながった５個又は６個のＨ２Ｌ２単位と任意選択でＪ鎖とを含む五量体又は六量体分子を形成することができる。
抗体抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境中でその三次元配置をとるとき特異的な位置取りで結合ドメインを形成するアミノ酸の短い非連続配列である。「フレームワーク」領域又は「ＦＷ」領域と称される結合ドメイン中の残りのアミノ酸は、分子間のばらつきがより小さい。フレームワーク領域は概してβシートコンホメーションをとり、ＣＤＲは、そのβシート構造をつなぎ合わせ、且つ場合によってはその一部を形成するループを形成する。従って、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用によってＣＤＲが正しい配向で置かれるようにするための足場を形成する働きをする。配置されたＣＤＲによって形成される結合ドメインが、免疫反応性抗原上のエピトープと相補的な表面を規定する。この相補的な表面が、抗体とそのコグネイトエピトープとの非共有結合性の結合を促進する。当業者は所与の重鎖又は軽鎖可変領域について、それらが種々の方法で定義されていることに伴い、それぞれＣＤＲ及びフレームワーク領域を構成するアミノ酸を容易に同定することができる（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，米国保健社会福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ），（１９８３）；及びＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）（これらは全体として参照により本明細書に援用される）を参照）。
当該技術分野において使用される及び／又は認められている用語に２つ以上の定義がある場合、本明細書で使用されるときのその用語の定義は、反する旨が明記されない限り、かかる意味の全てを含むことが意図される。具体的な例は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非連続抗原結合部位を記載するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。これらの特定の領域は、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，米国保健社会福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）（これらは参照により本明細書に援用される）によって記載されている。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義は、互いに比較したときアミノ酸の重複又はサブセットを含む。それにも関わらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを参照するためのいずれの定義（又は当業者に公知の他の定義）の適用も、特に指示されない限り、本明細書において定義及び使用されるとおりの用語の範囲内であることが意図される。比較として、上記に引用した文献の各々によって定義されるとおりのＣＤＲを包含する適切なアミノ酸を以下の表１に記載する。特定のＣＤＲを包含する正確なアミノ酸番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて異なることになる。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を所与として、どのアミノ酸が特定のＣＤＲを含むかをルーチンで決定することができる。
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Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能な抗体重鎖及び軽鎖、例えば抗体可変ドメイン配列の付番方式も定義した。当業者は、配列それ自体を越えたいかなる実験データにも頼ることなく、この「Ｋａｂａｔ付番」方式を任意の可変ドメイン配列に一義的に割り当てることができる。本明細書で使用されるとき、「Ｋａｂａｔ付番」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，米国保健社会福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）によって示される付番方式を指す。しかしながら、Ｋａｂａｔ付番方式の使用が明示的に注記されない限り、本開示の全てのアミノ酸配列について連続番号が用いられる。
結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体としては、限定はされないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ又はＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって産生される断片が挙げられる。ＳｃＦｖ分子は当該技術分野において公知であり、例えば米国特許第５，８９２，０１９号明細書に記載されている。本開示に包含される免疫グロブリン又は抗体分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの免疫グロブリン分子であってもよい。
「特異的に結合する」とは、概して、結合分子、例えば、抗体又はその断片、変異体、若しくは誘導体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、及び結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間の何らかの相補性を伴うものであることを意味する。この定義によれば、結合分子は、それがランダムな無関係のエピトープに結合する場合と比べてより容易にその抗原結合ドメインを介して当該のエピトープに結合するとき、エピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、本明細書では、ある種の結合分子がある種のエピトープに結合する相対的親和性を評価するために用いられる。例えば、結合分子「Ａ」は、結合分子「Ｂ」と比べて所与のエピトープに対してより高い特異性を有すると見なすことができ、又は結合分子「Ａ」は、それが関連エピトープ「Ｄ」に対して有する特異性と比べてより高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言うことができる。
本明細書に開示される結合分子、例えば、抗体又はその断片、変異体、若しくは誘導体は、例えば、５×１０−２ｓｅｃ−１、１０−２ｓｅｃ−１、５×１０−３ｓｅｃ−１、１０−３ｓｅｃ−１、５×１０−４ｓｅｃ−１、１０−４ｓｅｃ−１、５×１０−５ｓｅｃ−１、又は１０−５ｓｅｃ−１ ５×１０−６ｓｅｃ−１、１０−６ｓｅｃ−１、５×１０−７ｓｅｃ−１又は１０−７ｓｅｃ−１以下のｏｆｆ速度（ｋ（ｏｆｆ））で標的抗原に結合すると言うことができる。
本明細書に開示される結合分子、例えば、抗体又は抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体は、例えば、１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１、又は５×１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１又は１０７Ｍ−１ｓｅｃ−１以上のｏｎ速度（ｋ（ｏｎ））で標的抗原に結合すると言うことができる。
結合分子、例えば、その抗体又は断片、変異体、若しくは誘導体は、それが所与のエピトープに対する参照抗体又は抗原結合断片の結合を何らかの度合いで遮断する程度に当該エピトープに優先的に結合する場合、そのエピトープに対する参照抗体又は抗原結合断片の結合を競合的に阻害すると言われる。競合的阻害は、当該技術分野において公知の任意の方法、例えば競合ＥＬＩＳＡアッセイによって決定することができる。結合分子は、所与のエピトープに対する参照抗体又は抗原結合断片の結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、又は少なくとも５０％競合的に阻害すると言うことができる。
本明細書で使用されるとき、用語「親和性」は、例えば免疫グロブリン分子の１つ以上の結合ドメインとの個々のエピトープの結合強度の尺度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）の２７〜２８頁を参照のこと。本明細書で使用されるとき、用語「アビディティ」は、結合ドメインの集団と抗原との間の複合体の全体的な安定性を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの２９〜３４頁を参照のこと。アビディティは、特定のエピトープに対する集団中の個々の結合ドメインの親和性と、また免疫グロブリン及び抗原の結合価との両方に関係する。例えば、二価モノクローナル抗体と、ポリマーなど、高度に反復性のあるエピトープ構造を有する抗原との間の相互作用は、高アビディティの一つであり得る。二価モノクローナル抗体と細胞表面上に高密度で存在するレセプターとの間の相互作用もまた、高アビディティであり得る。
本明細書に開示されるとおりの結合分子又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体はまた、その交差反応性の観点からも記載又は特定することができる。本明細書で使用されるとき、用語「交差反応性」は、ある抗原に特異的な結合分子、例えば、抗体又はその断片、変異体、若しくは誘導体が第２の抗原と反応する能力；２つの異なる抗原性物質の間の関連性の尺度を指す。従って、結合分子は、それがその形成を誘導したもの以外のエピトープに結合する場合、交差反応する。交差反応性エピトープは、概して、誘導エピトープと同じ相補的構造特徴の多くを備え、場合によっては、実に元のエピトープよりも良好に適合し得る。
結合分子、例えば、抗体又はその断片、変異体、若しくは誘導体はまた、抗原へのそれらの結合親和性によっても記述又は特定が可能である。例えば、結合分子は、例えば、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数又はＫＤで抗原に結合可能である。
一本鎖抗体又は他の結合ドメインを含む抗体断片は、単独で、又は次のもの、すなわち、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、若しくはＣＨ４ドメイン、Ｊ鎖、又は分泌成分の１つ以上との組合せで、存在可能である。また、可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、若しくはＣＨ４ドメイン、Ｊ鎖、又は分泌成分の１つ以上と、の任意の組合せを含み得る抗原結合断片も含まれる。結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片は、トリや哺乳動物をはじめとする任意の動物起源であり得る。抗体は、ヒト、ネズミ、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、又はニワトリの抗体であり得る。別の実施形態では、可変領域は、軟骨魚（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）起源（例えばサメ由来）であり得る。本明細書で用いられる場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、また、ヒト免疫グロブリンライブラリーから又は１種以上のヒト免疫グロブリンが導入されたトランスジェニック動物から単離された抗体を含み、このトランスジェニック動物の中には、以下に及び例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号明細書に記載されるように、内因性免疫グロブリンを発現可能なものもあればそうでないものもある。
本明細書で用いられる場合、「重鎖サブユニット」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。結合分子、例えば、重鎖サブユニットを含む抗体は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上側、中間、及び／若しくは下側のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、又はそれらの変異体若しくは断片の少なくとも１つを含む。例えば、結合分子、例えば、抗体又はその断片、変異体、若しくは誘導体は、ＶＨドメインのほかに、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ１ドメインとヒンジとＣＨ２ドメイン、ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメイン、ＣＨ１ドメインとヒンジとＣＨ３ドメイン、又はＣＨ１ドメインとヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含み得る。ある特定の態様では、結合分子、例えば、抗体又はその断片、変異体、若しくは誘導体は、ＶＨドメインのほかに、ＣＨ３ドメインとＣＨ４ドメイン、又はＣＨ３ドメインとＣＨ４ドメインとＪ鎖を含み得る。さらに、本開示で使用するための結合分子は、ある特定の定常領域部分、例えば、ＣＨ２ドメインの全部又は一部が欠如し得る。これらのドメイン（例えば、重鎖サブユニット）を元の免疫グロブリン分子とアミノ酸配列が異なるように修飾可能であることは、当業者であれば理解されよう。
結合分子例えば抗体又はその断片の重鎖サブユニットは、異なる免疫グロブリン分子に由来するドメインを含み得る。例えば、ポリペプチドの重鎖サブユニットは、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインとＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域とを含み得る。別の例では、重鎖サブユニットは、一部がＩｇＧ１分子及び一部がＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖サブユニットは、一部がＩｇＧ１分子及び一部がＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含み得る。
本明細書で用いられる場合、「軽鎖サブユニット」という用語は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。軽鎖サブユニットは、ＶＬ又はＣＬ（例えばＣκ若しくはＣλ）ドメインの少なくとも１つを含む。
結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体は、認識されるか又は特異的に結合される抗原のエピトープ又は部分により記述又は特定が可能である。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的抗原の部分は、「エピトープ」又は「抗原決定基」である。標的抗原は、単一のエピトープ又は少なくとも２つのエピトープを含み得るとともに、抗原のサイズ、コンフォメーション、及びタイプに依存していずれかの数のエピトープを含み得る。
前述したように、種々の免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び三次元配置は周知である。本明細書で用いられる場合、「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の第１（最もアミノ末端側）の定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに近接し、且つ典型的な免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端側にある。
本明細書で用いられる場合、「ＣＨ２ドメイン」という用語は、例えば、従来の付番方式を用いてＩｇＧ抗体の約アミノ酸２４４〜アミノ酸３６０（Ｋａｂａｔ付番系ではアミノ酸２４４〜３６０及びＥＵ付番系ではアミノ酸２３１〜３４０、前掲文献のＫａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）に延在する重鎖分子の部分を含む。ＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端まで延在し且つ約１０８アミノ酸を含む。ある特定の免疫グロブリンクラス例えばＩｇＭは、ＣＨ４領域をさらに含む。
明細書で用いられる場合、「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は、約２５アミノ酸を含み可撓性であるので、２つのＮ末端抗原結合領域の独立した運動を可能にする。
本明細書で用いられる場合、「ジスルフィド結合」という用語は、２個の硫黄原子間に形成された共有結合を含む。アミノ酸のシステインは、第２のチオール基とジスルフィド結合又は架橋を形成可能なチオール基を含む。ある特定のＩｇＧ分子では、ジスルフィド結合によりＣＨ１領域とＣＬ領域とが結合され、且つＫａｂａｔ付番系を用いて２３９及び２４２に対応する位置（ＥＵ付番系では２２６又は２２９の位置）で２つのジスルフィド結合により２つの重鎖が結合される。本明細書に提供されたある特定の態様では、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、２つのヒンジ領域間にジスルフィド結合形成が確保されるようにヒンジ領域で突然変異が可能であり、とくに位置２２８（ＥＵ付番による）でセリンからプロリンへの突然変異が可能である。Ｓ２２８Ｐ突然変異を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、本明細書では「ＩｇＧ４Ｐ Ｆｃドメイン」という。
本明細書で用いられる場合、「Ｆｃ−ＴＭ領域」とは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスによる付番でＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３３１Ｓのアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のことであり、エフェクター（ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ）機能の低減若しくは破壊、Ｆｃレセプターへの結合の低減若しくは破壊、及び／又は毒性の低減若しくは破壊を呈する。例えば、米国特許出願公開第２０１１／００５９０７８号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
本明細書で用いられる場合、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性の領域又は部位が第１の種から得られるか又はそれに由来し且つ定常領域（無傷であり得るか、一部であり得るか、又は修飾され得る）が第２の種から得られる抗体を意味する。いくつかの実施形態では、標的結合の領域又は部位は、非ヒト源（例えば、マウス又は霊長動物）に由来するであろう。また、定常領域はヒト由来である。
「多重特異的抗体」又は「二重特異的抗体」という用語は、単一抗体分子内に２つ以上の異なるエピトープに対する結合ドメインを有する抗体を意味する。他の結合分子は、カノニカル抗体構造のほかに２つの結合特異性をもたせて構築可能である。二重特異的抗体又は多重特異的抗体によるエピトープ結合は、同時であり得るか又は逐次的であり得る。トリオーマ及びハイブリッドハイブリドーマは、二重特異的抗体を分泌可能な細胞系の２つの例である。二重特異的抗体は、組換え手段によっても構築可能である。（Ｓｔｒｏｅｈｌｅｉｎ ａｎｄ Ｈｅｉｓｓ，Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ．６：１３８７−９４（２０１０）；Ｍａｂｒｙ ａｎｄ Ｓｎａｖｅｌｙ，ＩＤｒｕｇｓ．１３：５４３−９（２０１０））。二重特異的抗体はダイアボディーでもあり得る。
本明細書で用いられる場合、「工学操作抗体」という用語は、ＣＤＲ領域又はフレームワーク領域のいずれかで１アミノ酸以上の少なくとも部分的な置換えにより重鎖及び軽鎖の一方又は両方の可変ドメインが改変された抗体を意味する。ある特定の態様では、既知の特異性の抗体の全ＣＤＲを異種抗体のフレームワーク領域にグラフト可能である。代替ＣＤＲは、フレームワーク領域の由来源の抗体と同一のクラス又はさらにはサブクラスの抗体に由来し得るが、ＣＤＲは、異なるクラスの抗体、例えば、異なる種の抗体にも由来し得る。既知の特異性の非ヒト抗体の１つ以上の「ドナー」ＣＤＲをヒト重鎖又は軽鎖のフレームワーク領域にグラフトした工学操作抗体は、本明細書では「ヒト化抗体」という。ある特定の態様では、すべてのＣＤＲがドナーの可変領域の完全ＣＤＲで置き換えられるとは限らないが、それでも依然としてドナーの抗原結合能をレシピエントの可変ドメインに導入可能である。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６１号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書、及び同第６，１８０，３７０号明細書に示される説明を考慮すれば、ルーチンの実験を行うことにより又は試行錯誤の試験により工学操作又はヒト化された機能性抗体を得ることは、十分に当業者の能力の範囲内であろう。
本明細書で用いられる場合、「工学操作」という用語は、合成手段（例えば、組換え技術、ｉｎ ｖｉｔｒｏペプチド合成、ペプチドの酵素的結合若しくは化学的結合、又はこれらの技術のいくつかの組合せ）による核酸分子又はポリペプチド分子の操作を含む。
本明細書で用いられる場合、「結合された」、「融合された」、若しくは「融合」という用語又は他の文法的等価表現は、同義的に用いることが可能である。これらの用語は、化学的コンジュゲーション又は組換え手段を含めてどんな手段を用いるにせよ、さらに２つの要素又は成分を連結一体化することを意味する。「インフレーム融合」とは、元のＯＲＦの翻訳リーディングフレームを維持するように２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を連結して連続したより長いＯＲＦを形成することを意味する。従って、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによりコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含有する単一のタンパク質である（それらのセグメントは天然では通常そのように連結されていない）。リーディングフレームは、このように融合セグメント全体を通じて連続した状態で作製されるが、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列により物理的又は空間的に分離可能である。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、インフレームで融合可能であるが、「融合」ＣＤＲが連続したポリペプチドの一部として共翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域又は追加のＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドにより分離可能である。
ポリペプチドとの関連では、「線状配列」又は「配列」とは、ポリペプチド中におけるアミノ末端からカルボキシル末端方向のアミノ酸の順序のことであり、この場合、配列中で互いに近接するアミノ酸は、ポリペプチドの一次構造中で隣接している。ポリペプチドの別の部分の「アミノ末端側」又は「Ｎ末端側」のポリペプチドの部分は、逐次ポリペプチド鎖中でより前にくる部分である。同様に、ポリペプチドの別の部分の「カルボキシ末端側」又は「Ｃ末端側」のポリペプチドの部分は、逐次ポリペプチド鎖中でより後にくる部分である。例えば、典型的な抗体では、可変ドメインは定常領域の「Ｎ末端側」であり、且つ定常領域は可変ドメインの「Ｃ末端側」である。
本明細書で用いられる「発現」という用語は、遺伝子が生化学物質例えばポリペプチドを産生するプロセスを意味する。このプロセスは、限定されるものではないが、遺伝子ノックダウンさらには一過性発現及び安定発現の両方を含めて、細胞内の遺伝子機能の存在の任意の出現を含む。限定されるものではないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への遺伝子の転写及びポリペプチドへのかかるｍＲＮＡの翻訳を含む。最終的な所望の産物が生化学物質である場合、発現は、その生化学物質及び任意の前駆体の形成を含む。遺伝子の発現により「遺伝子産物」が産生される。本明細書で用いられる場合、遺伝子産物とは、いずれかの核酸、例えば、遺伝子の転写により産生されるメッセンジャーＲＮＡ、又は転写物から翻訳されるポリペプチドのことであり得る。本明細書に記載の遺伝子産物はさらに、ポリアデニル化などの翻訳後修飾を受けた核酸、又はメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットの会合、タンパク質分解切断などの翻訳後修飾を受けたポリペプチドを含む。
「治療」や「軽減」などの用語は、既存の診断された病理学的病態又は障害の症状の治癒、遅延、低減、及び／又はその進行の停止若しくは遅延を行う治療手段を意味する。「予防」、「回避」、「抑止」などの用語は、診断されていない標的の病理学的病態又は障害の発生の予防を行う予防手段を意味する。従って、「治療が必要とされる者」は、すでに障害を有する者、障害を起こしやすい者、及び障害を予防すべき者を含み得る。
ＯＸ４０又は「ＯＸ４０レセプター」は、活性化Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上、さらにはＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上に発現するタンパク質である（種々の名称があり、ＣＤ１３４、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー４、及びＡＣＴ−３５とも称される）。ナイーブＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞はＯＸ４０を発現しない（Ｃｒｏｆｔ，Ｍ．，（２０１０）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８：５７−７８）。
「ＯＸ４０リガンド」（「ＯＸ４０Ｌ」）（種々の名称があり、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー４、ｇｐ３４、ＴＡＸ転写活性化糖タンパク質１、及びＣＤ２５２とも称される）は、主に抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に見いだされ、活性化Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、形質細胞様ＤＣ、及びマクロファージ上に誘導され得る（同上）。活性化Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マスト細胞、内皮細胞、及び平滑筋細胞をはじめとする他の細胞は、炎症性サイトカインに反応してＯＸ４０Ｌを発現可能である（同上）。ＯＸ４０ＬはＯＸ４０レセプターに特異的に結合する。ヒトタンパク質は、ＰＣＴ国際公開第９５／２１９１５号パンフレットに記載されている。マウスＯＸ４０Ｌは、米国特許第５，４５７，０３５号明細書に記載されている。ＯＸ４０Ｌは、細胞の表面上に発現され、細胞内、膜貫通、及び細胞外レセプター結合ドメインを含む。機能活性可溶形ＯＸ４０Ｌは、例えば、米国特許第５，４５７，０３５号明細書及び同第６，３１２，７００号明細書並びに国際公開第９５／２１９１５号パンフレット（それらの開示はあらゆる目的で本明細書に組み込まれる）に記載されているように、細胞内ドメイン及び膜貫通ドメインを欠失させることにより産生可能である。機能活性形ＯＸ４０Ｌは、ＯＸ４０に特異的に結合する能力を保持する形態、すなわち、ＯＸ４０「レセプター結合ドメイン」を有する形態である。ＯＸ４０に特異的に結合するＯＸ４０Ｌ分子又は誘導体の能力を決定する方法は以下で考察される。ＯＸ４０Ｌ及びその誘導体（例えば、ＯＸ４０結合ドメインを含む誘導体）の作製方法及び使用方法は、国際公開第９５／２１９１５号パンフレットに記載されている。そこには、ヒト免疫グロブリン（「Ｉｇ」）Ｆｃ領域などの他のペプチドに結合される可溶形ＯＸ４０Ｌを含むタンパク質も記載されている。これは、培養細胞からのＯＸ４０リガンドの精製を容易にするために又は哺乳動物へのｉｎ ｖｉｖｏ投与後の分子の安定性を向上させるために産生可能である（米国特許第５，４５７，０３５号明細書及びＰＣＴ国際公開第２００６／１２１８１０号パンフレット（両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい）。
「被験体」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」とは、診断、予後判定、又は治療が望まれる任意の被験体とくに哺乳動物被験体を意味する。哺乳動物被験体としては、ヒト、家畜、農場動物、及び動物園用、スポーツ用、又はペット用の動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、イノシシ、ウシ、クマなどが挙げられる。
本明細書で用いられる場合、「療法が奏効すると思われる被験体」、「治療が必要とされる動物」などの語句は、ヒト化抗ＯＸ４０抗体の投与が奏効すると思われる被験体例えば哺乳動物被験体を含む。かかる抗体は、例えば、癌などの疾患の診断手順及び／又は治療若しくは予防のために使用が可能である。
ヒト化抗ＯＸ４０抗体及びその抗原結合断片
本開示は、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体例えばヒト化抗体に関する。ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体又はその断片は単離可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体又はその断片は実質的に純粋であり得る。ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体又はその断片は天然に存在しえない。
ある特定の態様では、本開示は、ＯＸ４０ｍＡｂ５、ＯＸ４０ｍＡｂ８、ＯＸ４０ｍＡｂ１０、ＯＸ４０ｍＡｂ１１、ＯＸ４０ｍＡｂ１２、ＯＸ４０ｍＡｂ１３、ＯＸ４０ｍＡｂ１４、ＯＸ４０ｍＡｂ１５、ＯＸ４０ｍＡｂ１６、ＯＸ４０ｍＡｂ１７、ＯＸ４０ｍＡｂ１８、ＯＸ４０ｍＡｂ１９、ＯＸ４０ｍＡｂ２０、ＯＸ４０ｍＡｂ２１、ＯＸ４０ｍＡｂ２２、ＯＸ４０ｍＡｂ２３、ＯＸ４０ｍＡｂ２４、ＯＸ４０ｍＡｂ２５、ＯＸ４０ｍＡｂ２５ａ、ＯＸ４０ｍＡｂ２６、ＯＸ４０ｍＡｂ２７、ＯＸ４０ｍＡｂ２８、ＯＸ４０ｍＡｂ２９、ＯＸ４０ｍＡｂ３０、ＯＸ４０ｍＡｂ３１、ＯＸ４０ｍＡｂ３２、又はＯＸ４０ｍＡｂ３７のＶＨ及びＶＬを含むヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。ある特定の態様では、本開示は、ＯＸ４０ｍＡｂ５、ＯＸ４０ｍＡｂ８、ＯＸ４０ｍＡｂ１０、ＯＸ４０ｍＡｂ１１、ＯＸ４０ｍＡｂ１２、ＯＸ４０ｍＡｂ１３、ＯＸ４０ｍＡｂ１４、ＯＸ４０ｍＡｂ１５、ＯＸ４０ｍＡｂ１６、ＯＸ４０ｍＡｂ１７、ＯＸ４０ｍＡｂ１８、ＯＸ４０ｍＡｂ１９、ＯＸ４０ｍＡｂ２０、ＯＸ４０ｍＡｂ２１、ＯＸ４０ｍＡｂ２２、ＯＸ４０ｍＡｂ２３、ＯＸ４０ｍＡｂ２４、ＯＸ４０ｍＡｂ２５、ＯＸ４０ｍＡｂ２５ａ、ＯＸ４０ｍＡｂ２６、ＯＸ４０ｍＡｂ２７、ＯＸ４０ｍＡｂ２８、ＯＸ４０ｍＡｂ２９、ＯＸ４０ｍＡｂ３０、ＯＸ４０ｍＡｂ３１、又はＯＸ４０ｍＡｂ３２の重鎖及び軽鎖を含むヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、抗体ＶＨ及び抗体ＶＬを含むヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。ただし、ＶＬは、参照アミノ酸配列の配列番号２９又は配列番号３２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある特定の態様では、本開示は、抗体ＶＨ及び抗体ＶＬを含むヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。ただし、ＶＬは、配列番号２９又は配列番号３２を含む。
本開示は、抗体ＶＨ及び抗体ＶＬを含むヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片をさらに提供する。ただし、ＶＨは、ＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列の配列番号８、ＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列の配列番号１４、配列番号１５、若しくは配列番号１６、及びＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列の配列番号２５、配列番号２６、若しくは配列番号２７と同一であるか又はＶＨ−ＣＤＲの１つ以上における８、７、６、５、４、３、２、若しくは１つの単一アミノ酸置換、欠失、若しくは挿入を除いて同一であるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
本開示は、抗体ＶＨ及び抗体ＶＬを含むヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片をさらに提供する。ただし、ＶＨは、式：
ＨＦＷ１−ＨＣＤＲ１−ＨＦＷ２−ＨＣＤＲ２−ＨＦＷ３−ＨＣＤＲ３−ＨＦＷ４、
を有するアミノ酸配列を含む。式中、ＨＦＷ１は配列番号６又は配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は配列番号８であり、ＨＦＷ２は配列番号９であり、ＨＣＤＲ２は配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６であり、ＨＦＷ３は配列番号１７であり、ＨＣＤＲ３は配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７であり、且つＨＦＷ４は配列番号２８である。ある特定の態様では、ＨＦＷ２のアミノ酸配列は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３である。ある特定の態様では、ＨＦＷ３のアミノ酸配列は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４である。
さらに、本開示は、抗体ＶＨ及び抗体ＶＬを含むヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。ただし、ＶＨは、参照アミノ酸配列の配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、又は配列番号６７に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一態様では、本開示は、抗体ＶＨ及び抗体ＶＬを含むヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。ただし、ＶＬはアミノ酸配列の配列番号２９を含み、且つＶＨはアミノ酸配列の配列番号５９を含む。
本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬのほかに、重鎖定常領域又はその断片を含み得る。ある特定の態様では、重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域又はヒトＩｇＧ４定常領域である。ある特定の態様では、本明細書の他の箇所に記載されるように、重鎖定常領域又はその断片、例えば、ヒトＩｇＧ定常領域又はその断片は、野生型ＩｇＧ定常領域に対して１つ以上のアミノ酸置換を含み得るとともに、この修飾ＩｇＧは、野生型ＩｇＧ定常領域と比較して１つ以上の望ましい性質を有する。例えば、ヒトＩｇＧ定常領域は、本明細書の他の箇所に記載されるように、ＩｇＧ４Ｐ定常領域又はＩｇＧ１−ＴＭ定常領域であり得る。
本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬのほかに、任意選択的に、重鎖定常領域又はその断片、軽鎖定常領域又はその断片を含み得る。ある特定の態様では、軽鎖定常領域は、κ又はλ軽鎖定常領域、例えば、ヒトκ定常領域又はヒトλ定常領域である。特定の態様では、軽鎖定常領域はヒトκ定常領域である。
ある特定の態様では、本開示は、抗体重鎖又はその断片と抗体軽鎖又はその断片とを含むヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。ただし、重鎖はアミノ酸配列の配列番号７１を含み、且つ軽鎖はアミノ酸配列の配列番号３０を含む。
本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、例えば、モノクローナル、ポリクローナル、組換え、多重特異的、又はそれらの任意の組合せであり得る。ヒト化抗ＯＸ４０抗体又は抗原結合断片は、例えば、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、ｄｓＦｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｃ（Ｆｖ）２断片、Ｆｄ断片、ジスルフィド結合Ｆｖ断片、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディー、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディー、Ｆ（ａｂ’）３断片、テトラボディー、トリアボディー、ダイアボディー、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ断片、ｍＡｂ２断片、（ｓｃＦｖ）２断片、又はｓｃＦｖ−Ｆｃ断片であり得る。
ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、ヒト、カニクイザル、又はアカゲザルＯＸ４０に特異的に結合可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、一次ヒト、カニクイザル、又はアカゲザルＣＤ４ Ｔ細胞又はジャーカット細胞の表面に特異的に結合可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、ヒト、カニクイザル、アカゲザル、又はそれらの任意の組合せに由来する活性化ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現されるＯＸ４０に特異的に結合可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、ヒト、カニクイザル、アカゲザル、又はそれらの任意の組合せに由来する一次活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現されるＯＸ４０に特異的に結合可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、ネズミ又はラットＯＸ４０に結合しない。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、関連ＴＮＦＲＳＦタンパク質、例えば、以下の実施例３の表３−１に列挙されたＴＮＦＲＳＦタンパク質と交差反応しない。
本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片の生化学的機能、例えば、ＯＸ４０に特異的に結合してシグナル伝達を惹起する機能を変化させることなくポリペプチド中に変化を引き起こすことが可能であるならば、１つ以上の保存アミノ酸変化、例えば、１０までの保存変化（例えば、２つの置換アミノ酸、３つの置換アミノ酸、４つの置換アミノ酸、又は５つの置換アミノ酸など）を含み得る。例えば、ＯＸ４０への結合能をブロックすることなく、本明細書に提供される抗体のレセプター結合ドメイン中に１つ以上の保存変化を引き起こすことが可能である。
そのほかに、ポリペプチドドメインの一部を欠失させることが可能であるが、それにより機能のすべてが損なわたり排除されたりするわけではない。同様に、以下に記載されるように、機能が損なわたり排除されたりすることなく、挿入又は付加、例えば、エピトープタグの付加をポリペプチド鎖中で行うことが可能である。ポリペプチドの１つ以上の機能が実質的に損なわれることなく行い得る他の修飾としては、例えば、異常アミノ酸が取り込まれるｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの化学的及び生化学的な修飾が挙げられる。当業者であれば容易に分かるであろうが、かかる修飾としては、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、標識化例えば放射性核種による標識化、及び種々の酵素修飾が挙げられる。ポリペプチドの様々な標識方法及びかかる目的に有用な標識は当該技術分野で周知であり、３２Ｐなどの放射性同位体、フルオロフォア、化学発光剤、酵素、及び抗リガンドが挙げられる。
本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、異種作用剤、例えば、安定化剤、免疫反応調整剤、又は検出可能剤をさらに含み得る。ある特定の態様では、異種作用剤は、ペプチド結合によるポリペプチドサブユニットに融合される１つ以上の追加のポリペプチド配列、例えば、シグナル配列（例えば、分泌シグナル配列）、リンカー配列、アミノ酸タグ若しくは標識、又は精製を容易にするペプチド配列若しくはポリペプチド配列を含む。ある特定の態様では、ドメインの機能特性が維持される限り、重鎖又は軽鎖の抗体サブユニットのいずれか又はその断片のＮ末端又はＣ末端に異種ポリペプチドを融合可能である。
ある特定の態様では、異種作用剤は、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片に化学的にコンジュゲート可能である。ポリペプチドサブユニットに化学的にコンジュゲート可能な例示的な異種作用剤としては、限定されるものではないが、リンカー、薬剤、毒素、イメージング剤、放射性化合物、有機及び無機のポリマー、並びにポリペプチドサブユニット自体により提供されない所望の活性を提供可能な任意の他の組成物が挙げられる。具体的な作用剤としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、細胞傷害剤、放射性核種、イメージング剤、ビオチンが挙げられる。
ある特定の態様では、本開示は、対照又は研究ツールとして使用されるある特定の抗ＯＸ４０抗体を提供する。例えば、本開示は、ＶＨ及びＶＬがそれぞれネズミＩｇＧ１重鎖及びネズミκ軽鎖に融合された以上に記載のヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。この「リバースキメラ」は、アカゲザルのｉｎ ｖｉｖｏ特徴付けに役立つ。別の例では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体上のＶＨ領域は、改変されたエフェクター機能を有する種々の重鎖定常領域に装着可能である。例えば、ヒトＩｇＧ４Ｐ又はヒトＩｇＧ１ＴＭが本明細書の他の箇所に記載されている。
本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、一次活性化Ｔ細胞、例えば、ヒト、カニクイザル、アカゲザル、又はそれらの任意の組合せに由来する一次活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞、一次活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び／又は調節性Ｔ細胞上に発現されるＯＸ４０に特異的に結合可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片、例えばＯＸ４０ｍＡｂ２４は、すべてフローサイトメトリーにより測定したときに、約０．０１ｐＭ〜約１ｎＭ、例えば約１ｐＭ〜約５００ｐＭ、例えば約１００ｐＭ〜約４００ｐＭ、例えば約２５０ｐＭ〜約３７０ｐＭの結合親和性で、一次活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現されるヒトＯＸ４０に結合可能である。例えば、ヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、すべてフローサイトメトリーにより測定したときに、約０．１ｐＭ、約０．５ｐＭ、約１ｐＭ、約１０ｐＭ、約５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約２００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２７５ｐＭ、約３００ｐＭ、約３２５ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３７０ｐＭ、約４００ｐＭ、約４２５ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４７５ｐＭ、約５００ｐＭ、約５５０ｐＭ、約６００ｐＭ、約６５０ｐＭ、約７００ｐＭ、約７５０ｐＭ、又は約１ｎＭの結合親和性で、一次活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現されるヒトＯＸ４０に結合可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、約３１２ｐＭの結合親和性で一次活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現されるヒトＯＸ４０に結合可能である。結合親和性は、いくつかの異なる方法及び／又は装置により測定可能であり、当業者によく理解されているように、相対結合親和性は、方法又は装置に依存して異なり得る。
本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、細胞例えば一次活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０分子の一部又は全部を占有して架橋することが可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーにより測定したときに、約０．０１ｐＭ〜約１ｎＭ、例えば約０．１ｐＭ〜約５００ｐＭ、例えば約１ｐＭ〜約２００ｐＭ、例えば約１０ｐＭ〜約１００ｐＭ、例えば約５０ｐＭ〜約１００ｐＭ、例えば約６３ｐＭ〜約９３ｐＭ、例えば約１ｐＭ、約１０ｐＭ、約２０ｐＭ、約３０ｐＭ、約４０ｐＭ、約５０ｐＭ、約６０ｐＭ、約７０ｐＭ、約７８ｐＭ、約８０ｐＭ、約９０ｐＭ、約１００ｐＭ、又は約１５０ｐＭの濃度で、一次活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現されるヒトＯＸ４０に結合可能であり、且つ一次活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上で２０％のレセプター占有率を達成可能である（ＥＣ２０）。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーにより測定したときに約７８ｐＭの濃度で一次活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上で２０％のレセプター占有率を達成可能である（ＥＣ２０）。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、すべてフローサイトメトリーにより測定したときに、約０．０１ｐＭ〜約１ｎＭ、例えば約１ｐＭ〜約５００ｐＭ、例えば約１００ｐＭ〜約４００ｐＭ、例えば約２５０ｐＭ〜約３７０ｐＭ、例えば約１００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約２００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２７５ｐＭ、約３００ｐＭ、約３２５ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３７０ｐＭ、約４００ｐＭ、約４２５ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４７５ｐＭ、又は約５００ｐＭの濃度で、一次活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現されるヒトＯＸ４０に結合可能であり、且つ一次活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上で５０％のレセプター占有率を達成可能である（ＥＣ５０）。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーにより測定したときに約３１２ｐＭの濃度で一次活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上で５０％のレセプター占有率を達成可能である（ＥＣ５０）。ある特定の態様では、ヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーにより測定したときに、約１００ｐＭ〜約１００ｎＭ、例えば約５００ｐＭ〜約１０ｎＭ、例えば約１ｎＭ〜約５００ｎＭ、例えば約２ｎＭ〜約４ｎＭ、例えば約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、又は約５ｎＭの濃度で、一次活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現されるヒトＯＸ４０に結合可能であり、且つ一次活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上で９０％のレセプター占有率を達成可能である（ＥＣ９０）。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーにより測定したときに約２２９０ｐＭ〜約３３３０ｐＭ、例えば約２８１０ｐＭの濃度で一次活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上で９０％のレセプター占有率を達成可能である（ＥＣ９０）。
ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーにより測定したときに約２５０ｐＭ〜約６００ｐＭ、例えば約４２４ｐＭの結合親和性でＯＸ４０過剰発現ジャーカット細胞上に発現されるヒトＯＸ４０に結合可能である。
ある特定の態様では、ヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、ＯＸ４０過剰発現ジャーカット細胞上に発現されるヒトＯＸ４０に結合可能であり、フローサイトメトリーにより測定したときに約６０〜約１５０ｐＭの濃度のＥＣ２０、約２５０〜約６００ｐＭの濃度のＥＣ５０、及び約２２６０〜約４３９０ｐＭの濃度のＥＣ９０を達成可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、ＯＸ４０過剰発現ジャーカット細胞上に発現されるヒトＯＸ４０に結合可能であり、フローサイトメトリーにより測定したときに約１０６ｐＭの濃度のＥＣ２０、約４２４ｐＭの濃度のＥＣ５０、及び約３８２０ｐＭの濃度のＥＣ９０を達成が可能である。
別の例では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーにより測定したときに約３４０ｐＭ〜約８２０ｐＭ、例えば約５８０ｐＭの結合親和性で一次活性化カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現されるカニクイザルＯＸ４０に結合可能である。別の例では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーにより測定したときに約１３０ｐＭ〜約６００ｐＭ、例えば約３７０ｐＭの結合親和性で一次活性化アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現されるアカゲザルＯＸ４０に結合可能である。
ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、プレートベースのアッセイで活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の用量依存性増殖を誘導可能である。例えば、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片、例えばＯＸ４０ｍＡｂ２４のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで、すべてフローサイトメトリーにより測定したときに、約１４ｐＭ〜約２８ｐＭ、例えば約２１ｐＭの抗体濃度で２０％最大増殖反応を一次活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞で達成可能であり（ＥＣ２０）、約０．３ｐＭ〜約１３０ｐＭ、例えば約２８ｐＭの抗体濃度で５０％最大増殖反応を一次活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞で達成することが可能であり（ＥＣ５０）、且つ約５０ｐＭ〜約９０ｐＭ、例えば約７２ｐＭの抗体濃度で９０％最大増殖反応を一次活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞で達成可能である（ＥＣ９０）。
ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞、例えば、ヒト一次活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞からの用量依存性サイトカイン放出を誘導可能である。ある特定の態様では、放出サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１β、又はそれらの任意の組合せである。ある特定の態様では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、又はそれらの任意の組合せである。同様に、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、一次活性化カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞及び一次活性化アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞でＣＤ４＋Ｔ細胞増殖及びサイトカイン放出を達成可能である。
そのほかの態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、ＦｃγＲ発現細胞の存在下でＯＸ４０発現Ｔ細胞のＮＦκＢ経路を活性化可能である。例えば、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、ＮＦκＢシグナル伝達経路の刺激に反応してルシフェラーゼを産生するＯＸ４０発現ジャーカットＮＦκＢルシフェラーゼレポーター細胞のＮＦκＢ経路を活性化可能である。他の選択肢として、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＯＸ４０、カニクイザルＯＸ４０、又はアカゲザルＯＸ４０を発現する細胞のＮＦκＢ経路を活性化可能である。
さらに別の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、癌治療が必要とされる被験体に有効用量で投与した場合、例えば、腫瘍成長を遅らせたり、腫瘍成長を停止させたり、又は存在する腫瘍のサイズを低減したりすることにより、癌治療を促進可能である。ある特定の態様では、癌治療の促進はＴ細胞の存在下で達成可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、治療が必要とされる被験体に有効用量で投与した場合、アイソタイプマッチ対照抗体の投与と比較して、腫瘍成長を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％低減可能である。
このほかのさらなる態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、ＯＸ４０への結合により活性化ＯＸ４０発現Ｔ細胞の増殖を誘導可能であり、それと同時に、ＯＸ４０発現Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び／又は調節性Ｔ細胞に対して補体依存性又は抗体依存性の細胞傷害性を惹起することが可能である。さらに、ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、ＯＸ４０への結合によりＯＸ４０発現Ｔ細胞、例えば、活性化ＯＸ４０発現ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び／又は調節性Ｔ細胞の増殖を誘導可能であり、それと同時にはＣ１ｑに結合可能であるか、又はＯＸ４０発現Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び／又は調節性Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介抗体依存性細胞傷害性を惹起することが可能である。
ある特定の態様では、本開示は、ネズミ重鎖定常領域に装着されたヒト化ＶＨとネズミ軽鎖定常領域に装着されたヒト化ＶＬとを含む抗ＯＸ４０抗体又はその断片を提供する。ただし、重鎖は配列番号８１を含み、且つ軽鎖は配列番号８３を含む。ある特定の態様では、重鎖定常領域は、例えば、ネズミＩｇＧ１定常領域であり得る。ある特定の態様では、軽鎖定常領域は、例えば、ネズミκ定常領域であり得る。
ある特定の態様では、本開示は、ラットＶＨ及びラットＶＬを含むラット抗マウスＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。ただし、ＶＨはアミノ酸配列の配列番号８５を含み、且つＶＬはアミノ酸配列の配列番号８８を含む。ある特定の態様では、この抗体又はその断片は、ＶＬのＣ末端に融合された軽鎖定常領域又はその断片をさらに含む。軽鎖定常領域は、例えば、ネズミκ定常領域であり得る。ある特定の態様では、この抗体又はその断片は、ＶＨのＣ末端に融合された重鎖定常領域又はその断片をさらに含む。重鎖定常領域は、例えば、ネズミＩｇＧ２ａ定常領域であり得る。ある特定の態様では、このラット抗マウスＯＸ４０抗体は、重鎖アミノ酸配列の配列番号８６及び軽鎖アミノ酸配列の配列番号８９を含む。ある特定の態様では、本明細書に提供されるラット抗マウスＯＸ４０抗体又はその断片は、マウスＯＸ４０に特異的に結合可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるラット抗マウスＯＸ４０抗体又はその断片を有効用量でマウスに投与することにより、マウスにおいてマウス癌細胞系成長を阻害可能である。
ある特定の態様では、本明細書に提供されるラット抗マウスＯＸ４０抗体断片は、例えば、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、ｄｓＦｖ断片、ｓｃＦｖ断片、若しくはｓｃ（Ｆｖ）２断片、又はそれらの任意の組合せであり得る。
ヒト化抗ＯＸ４０抗体、断片、又はサブユニットをコードするポリヌクレオチド
本開示は、ヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。例えば、本開示は、ヒト化抗ＯＸ４０抗体若しくはヒト化抗ＯＸ４０抗体のサブユニットをコードするか又はかかる抗体の抗原結合断片をコードする核酸配列を含む１種のポリヌクレオチド又は２種以上のポリヌクレオチドを提供する。本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ形又はＤＮＡ形であり得る。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ例えば修飾ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを含み、且つ二本鎖又は一本鎖であり得るとともに、一本鎖の場合、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であり得る。
ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは単離し得る。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは実質的に純粋であり得る。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは天然に存在しえない。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドはｃＤＮＡであり得るか又はｃＤＮＡに由来し得る。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは組換え産生し得る。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞からのポリペプチドの発現及び分泌を支援するポリヌクレオチド（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に同一のリーディングフレームで融合された、成熟ポリペプチドに対するコード配列を含み得る。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、リーダー配列が宿主細胞により切断されてポリペプチドの成熟形を形成可能である。
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体若しくはその抗原結合断片又は本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体若しくはその抗原結合断片のポリペプチドサブユニットをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。
また、１つ又は少数の欠失、付加、及び／又は置換を含む核酸配列を含むポリヌクレオチドが提供される。かかる変化は隣接可能であるか、又は核酸中の様々な位置に分布可能である。実質的に同一の核酸配列は、例えば、１又は２又は３又は４又はさらにはそれ以上のヌクレオチド欠失、付加、及び／又は置換を有し得る。ある特定の態様では、修飾（「突然変異」）されるが実質的に同一のポリペプチドが核酸の発現時に産生されるように、１つ以上の欠失、付加、及び／又は置換は、ポリヌクレオチド配列によりコードされるリーディングフレームを改変しない。
ある特定の態様では、本開示は、抗体ＶＬをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。ただし、ＶＬは、参照アミノ酸配列の配列番号２９又は配列番号３２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは、抗体軽鎖をコードし、且つ参照核酸配列の配列番号３１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
ある特定の態様では、本開示は、抗体ＶＬをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。ただし、ＶＬは配列番号２９又は配列番号３２を含む。
本開示は、抗体ＶＨをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。ただし、ＶＨは、ＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列の配列番号８、ＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列の配列番号１４、配列番号１５、若しくは配列番号１６、及びＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列の配列番号２５、配列番号２６、若しくは配列番号２７と同一であるか又はＶＨ−ＣＤＲの１つ以上における８、７、６、５、４、３、２、若しくは１つの単一アミノ酸置換、欠失、若しくは挿入を除いて同一であるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
本開示は、抗体ＶＨをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。ただし、ＶＨは、式：
ＨＦＷ１−ＨＣＤＲ１−ＨＦＷ２−ＨＣＤＲ２−ＨＦＷ３−ＨＣＤＲ３−ＨＦＷ４、
を有するアミノ酸配列を含む。式中、ＨＦＷ１は配列番号６又は配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は配列番号８であり、ＨＦＷ２は配列番号９であり、ＨＣＤＲ２は配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６であり、ＨＦＷ３は配列番号１７であり、ＨＣＤＲ３は配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７であり、且つＨＦＷ４は配列番号２８である。ある特定の態様では、ＨＦＷ２のアミノ酸配列は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３である。ある特定の態様では、ＨＦＷ３のアミノ酸配列は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４である。
さらに、本開示は、抗体ＶＨをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。ただし、ＶＨは、参照アミノ酸配列の配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、又は配列番号６７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは、参照核酸配列の配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、又は配列番号６８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
ある特定の態様では、本開示は、配列番号６０の核酸、配列番号３１の核酸、配列番号７２の核酸、又はそれらの任意の組合せを含むポリヌクレオチドを提供する。
さらに、以上に記載のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。好適なベクターは本明細書の他の箇所に記載されており、当業者に公知である。
ある特定の態様では、本開示は、以上に記載のポリヌクレオチド又はベクターを含み、任意選択的に１種以上の担体、希釈剤、賦形剤、又は他の添加剤をさらに含む組成物例えば医薬組成物を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、ＶＨをコードする核酸を含むポリヌクレオチドとＶＬをコードする核酸を含むポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチド組成物を提供する。この態様によれば、ＶＬ及びＶＨは、参照アミノ酸配列の配列番号２９又は配列番号３２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるＶＬアミノ酸配列と、（ａ）ＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列の配列番号８、ＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列の配列番号１４、配列番号１５、若しくは配列番号１６、及びＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列の配列番号２５、配列番号２６、若しくは配列番号２７と同一であるか又はＶＨ−ＣＤＲの１つ以上における８、７、６、５、４、３、２、若しくは１つの単一アミノ酸置換、欠失、若しくは挿入を除いて同一であるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、（ｂ）式：
ＨＦＷ１−ＨＣＤＲ１−ＨＦＷ２−ＨＣＤＲ２−ＨＦＷ３−ＨＣＤＲ３−ＨＦＷ４、
（式中、ＨＦＷ１は配列番号６又は配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は配列番号８であり、ＨＦＷ２は配列番号９であり、ＨＣＤＲ２は配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６であり、ＨＦＷ３は配列番号１７であり、ＨＣＤＲ３は配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７であり、且つＨＦＷ４は配列番号２８である）
を有するアミノ酸配列、又は（ｃ）参照アミノ酸配列の配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、又は配列番号６７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列、を含むＶＨと、を一体的に含み得る。ＶＨ（ｂ）では、ＨＦＷ２のアミノ酸配列は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、若しくは配列番号１３であり得るとともに、且つ／又はＨＦＷ３のアミノ酸配列は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、若しくは配列番号２４であり得る。
以上に記載のポリヌクレオチド組成物では、ＶＨをコードする核酸を含むポリヌクレオチド及びＶＬをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、単一のベクターに存在可能であるか、又は個別の同一でないベクターに存在可能である。それに応じて、本開示は、以上に記載のポリヌクレオチド組成物を含む１種以上のベクターを提供する。
いくつかの場合には、以上に記載のＶＨ及びＶＬをコードするポリヌクレオチド組成物は、ＯＸ４０、例えば、ヒトＯＸ４０、カニクイザルＯＸ４０、及び／又はアカゲザルＯＸ４０に特異的に結合可能なヒト化抗体又はその抗原結合断片をコード可能である。
ある特定の態様では、本開示は、ネズミ重鎖定常領域に装着されたヒト化ＶＨとネズミ軽鎖定常領域に装着されたヒト化ＶＬとを含む抗ＯＸ４０抗体又はその断片をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。ただし、重鎖は配列番号８１を含み、且つ軽鎖は配列番号８３を含む。ある特定の態様では、重鎖定常領域は、例えば、ネズミＩｇＧ１定常領域であり得る。ある特定の態様では、軽鎖定常領域は、例えば、ネズミκ定常領域であり得る。
ある特定の態様では、本開示は、ラットＶＨ及びラットＶＬを含むラット抗マウスＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。ただし、ＶＨはアミノ酸配列の配列番号８５を含み、且つＶＬはアミノ酸配列の配列番号８８を含む。ある特定の態様では、この抗体又はその断片は、ＶＬのＣ末端に融合された軽鎖定常領域又はその断片をさらに含む。軽鎖定常領域は、例えば、ネズミκ定常領域であり得る。ある特定の態様では、この抗体又はその断片は、ＶＨのＣ末端に融合された重鎖定常領域又はその断片をさらに含む。重鎖定常領域は、例えば、ネズミＩｇＧ２ａ定常領域であり得る。ある特定の態様では、このラット抗マウスＯＸ４０抗体は、重鎖アミノ酸配列の配列番号８６及び軽鎖アミノ酸配列の配列番号８９を含む。ある特定の態様では、本明細書に提供されるラット抗マウスＯＸ４０抗体又はその断片は、マウスＯＸ４０に特異的に結合可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるラット抗マウスＯＸ４０抗体又はその断片を有効用量でマウスに投与することにより、マウスにおいてマウス癌細胞系成長を阻害可能である。
本開示は、以上に提供されるポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド組成物、又はベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。ただし、宿主細胞は、いくつかの場合には、ＯＸ４０、例えば、ヒトＯＸ４０、カニクイザルＯＸ４０、又はアカゲザルＯＸ４０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を発現可能である。かかる宿主細胞は、本明細書に提供される抗体又はその抗原結合断片の作製方法に利用可能である。この方法は、（ａ）宿主細胞を培養する工程と、（ｂ）発現された抗体又はその抗原結合断片を宿主細胞から単離する工程と、を含む。
ポリヌクレオチド変異体も提供される。ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、又はその両方に改変を含み得る。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換、付加、又は欠失を生じる改変を含むが、コードポリペプチドの性質や活性を改変しない。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド変異体は、遺伝暗号の縮重に基づいてサイレント置換により産生される。ポリヌクレオチド変異体は、様々な理由で、例えば、特定の宿主でコドン発現を最適化するために（ヒトｍＲＮＡのコドンを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌宿主によるコドンに変化させるために）産生され得る。本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞も提供される。
いくつかの態様では、ヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片をコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて化学合成により構築可能である。かかるオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列と、対象の組換えポリペプチドを産生する宿主細胞に有利なコドンの選択と、に基づいて設計可能である。標準的方法を適用して、対象の単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列を合成可能である。例えば、完全アミノ酸配列を用いて逆翻訳遺伝子を構築可能である。さらに、特定の単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡオリゴマーを合成可能である。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成してからライゲートすることが可能である。個別のオリゴヌクレオチドは、相補的集合のために５’又は３’オーバーハングを含み得る。
集合させた後（合成、部位指向突然変異誘発、又は別の方法により）、対象の特定の単離ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、所望の宿主でのタンパク質発現に適した発現制御配列に作動的に連結可能である。適正な集合は、例えば、ヌクレオチド配列決定、制限切断マッピング、及び／又は好適な宿主での生物学的活性ポリペプチドの発現により確認可能である。宿主でトランスフェクト遺伝子の高い発現レベルを得るために、選択された発現宿主で機能する転写・翻訳発現制御配列に遺伝子を作動的に連結したり又は関連付けしたりすることが可能である。
ある特定の態様では、組換え発現ベクターは、ヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片をコードするＤＮＡの増幅及び発現のために使用される。組換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルス、又は昆虫の遺伝子に由来する好適な転写調節エレメント又は翻訳調節エレメントに作動的に連結された、ヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片のポリペプチド鎖をコードする合成ＤＮＡ断片又はｃＤＮＡ由来ＤＮＡ断片を有する複製可能なＤＮＡ構築物である。一例では、転写ユニットは、以下に詳細に記載されるように、（１）遺伝子エレメント又は遺伝子発現で調節的役割を担うエレメント、例えば、転写プロモーター又はエンハンサーと、（２）構造配列又はｍＲＮＡに転写されてタンパク質に翻訳されるコード配列と、（３）適切な転写及び翻訳の開始配列及び終止配列と、の集合を含み得る。かかる調節エレメントは、転写を制御するオペレーター配列を含み得る。宿主での複製能力、例えば、複製起点により付与される複製能力、及びトランスフォーマントの認識を容易にする選択遺伝子は、追加的に組込み可能である。互いに機能的に関連付けられている場合、ＤＮＡ領域は作動的に連結されている。例えば、ポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現されるのであれば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡはポリペプチドのＤＮＡに作動的に連結されており、配列の転写を制御するのであれば、プロモーターはコード配列に作動的に連結されており、又は翻訳を可能にするように配置されているのであれば、リボソーム結合部位はコード配列に作動的に連結されている。酵母発現系に使用することが意図される構造エレメントは、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。他の選択肢として、組換えタンパク質がリーダー配列や輸送配列を含まずに発現される場合、タンパク質はＮ末端メチオニンを含み得る。このメチオニンは、任意選択的に、発現された組換えタンパク質から後続的に切り離されて最終生成物を提供可能である。
発現制御配列及び発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存するであろう。多種多様な発現宿主／ベクターの組合せを利用可能である。真核宿主に有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、及びサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、公知の細菌プラスミド、例えば、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、及びそれらの誘導体を含めて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミド、より広範な宿主域のプラスミド、例えば、Ｍ１３及び糸状一本鎖ＤＮＡファージが挙げられる。
ヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を発現するのに好適な宿主細胞としては、適切なプロモーターの制御下にある原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は高等真核細胞が挙げられる。原核生物としては、グラム陰性又はグラム陽性の生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は桿菌が挙げられる。高等真核細胞としては、以下に記載の哺乳動物起源の樹立細胞系が挙げられる。細胞フリー翻訳システムを利用することも可能である。抗体産生を含めてタンパク質産生の方法に関する追加情報は、例えば、米国特許出願公開第２００８／０１８７９５４号明細書、米国特許第６，４１３，７４６号明細書及び同第６，６６０，５０１号明細書、並びに国際公開第０４００９８２３号パンフレット（それぞれその全体が本出願をもって参照により本明細書に組み込まれる）に見いだし得る。
種々の哺乳動物又は昆虫の細胞培養システムを利用してヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を発現させることも可能である。タンパク質が一般に適正にフォールディングされ、適切に修飾され、且つ完全に機能することから、哺乳動物細胞での組換えタンパク質の発現を行うことが可能である。好適な哺乳動物宿主細胞系の例としては、ＨＥＫ−２９３及びＨＥＫ−２９３Ｔ、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ ２３：１７５，１９８１）に記載のサル腎細胞のＣＯＳ−７系、並びに例えばＬ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、及びＢＨＫの細胞系をはじめとする他の細胞系が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、発現される遺伝子に連結された好適なプロモーター及びエンハンサー、並びに他の５’又は３’フランキング非転写配列、さらには５’又は３’非翻訳配列、例えば、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位、並びに転写終止配列を含み得る。昆虫細胞での異種タンパク質の産生に供されるバキュロウイルスシステムは、Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）にレビューされている。
トランスフォーム宿主により産生されたヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、任意の好適な方法に従って精製可能である。かかる標準的方法としては、クロマトグラフィー法（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイズカラムクロマトグラフィー法）、遠心分離法、溶解度差法、又は任意の他の標準的タンパク質精製技術による方法が挙げられる。適切なアフィニティーカラムに通して容易に精製できるように、ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのアフィニティータグをタンパク質に装着可能である。単離タンパク質は、タンパク質分解、核磁気共鳴、Ｘ線結晶解析などの技術を用いて物理的に特徴付けることも可能である。
例えば、培養培地中に組換えタンパク質を分泌するシステムの上清は、最初に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて濃縮可能である。濃縮工程に続いて、濃縮物を好適な精製マトリックスに適用可能である。他の選択肢として、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックス又は基材を利用可能である。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、又はタンパク質精製に一般に利用される他のタイプであり得る。他の選択肢として、陽イオン交換工程を利用可能である。好適な陽イオン交換体としては、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが挙げられる。最後に、ヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片をさらに精製するために、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば、ペンダントメチル基又は他の脂肪族基を有するシリカゲルを利用した１つ以上の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を利用可能である。均一な組換えタンパク質を提供するために、以上の精製工程の一部又は全部を種々の組合せで利用可能である。
細菌培養で産生されたヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、例えば、細胞ペレットからの初期抽出、１回以上の濃縮、塩析、水性イオン交換、又はサイズ排除クロマトグラフィーの工程により、単離可能である。最終精製工程のために高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用可能である。組換えタンパク質の発現に利用された微生物細胞は、凍結−解凍サイクル処理、超音波処理、機械的破砕、又は細胞溶解剤の使用をはじめとする任意の便利な方法により破砕可能である。
抗体及び他のタンパク質を精製するための当該技術分野で公知の方法としては、例えば、米国特許出願公開第２００８／０３１２４２５号明細書、同第２００８／０１７７０４８号明細書、及び同第２００９／０１８７００５号明細書（それぞれその全体が本出願をもって参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものも挙げられる。
医薬組成物及び投与方法
本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を調製する方法及び必要とされる被験体に、例えば、癌患者で免疫反応を増強するために、例えば、腫瘍成長を阻害又は低減するために投与する方法は、周知であるか又は当業者であれば容易に決定可能である。ヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入、又は局所であり得る。本明細書で用いられる非経口という用語は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経直腸、又は経膣の投与を含む。これらの投与形態はすべて好適な形態として明確に企図されるが、投与形態の別の例は、とくに静脈内又は動脈内の注射又は点滴に供される注射用の溶液であろう。通常、好適な医薬組成物は、限定されるものではないが、緩衝液（例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、又はクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含む。本明細書に記載の教示に適合可能な他の方法では、本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を有害な細胞集団部位に直接送達することにより治療剤への疾患組織の暴露を増加させることが可能である。
本明細書に提供されるある特定の医薬組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤、水性サスペンジョン剤、又は溶液剤をはじめとする許容可能な剤形で経口投与可能である。ある特定の医薬組成物は、鼻エアロゾル又は吸入による投与も可能である。かかる組成物は、ベンジルアルコール若しくは他の好適な保存剤、生物学的利用率を増強する吸収促進剤、及び／又は他の従来の可溶化剤若しくは分散剤を利用して、生理食塩水中の溶液として調製可能である。
単回投与製剤を作製するために担体材料と組合せ可能なヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片の量は、治療される被験体及び特定の投与モードに依存して異なるであろう。組成物は、単回用量、複数回用量として、又は確立された注入時間にわたり投与可能である。最適な所望の反応（例えば、治療反応又は予防反応）を提供するために、投与レジメンを調整することも可能である。
「治療上有効な用量若しくは量」又は「有効な量」とは、治療される疾患又は病態を有する患者の治療に対して投与時に陽性治療反応を引き起こすヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片の量であることが意図される。
キット
本開示は、本明細書に記載のヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を含み且つ本明細書に記載の方法を行うために使用可能なキットをさらに提供する。ある特定の実施形態では、キットは、１つ以上の容器内に少なくとも１種の精製されたヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を含む。当該技術分野で周知の確立されたキット方式の１つに開示されたヒト化抗ＯＸ４０抗体を容易に組込み可能であることは、当業者であれば容易に分かるであろう。
免疫アッセイ
ヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、当該技術分野で公知の任意の方法により特異的及び／又は選択的結合に関してアッセイ可能である。使用可能な免疫アッセイとしては、限定されるものではないが、いくつかの例として、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、蛍光フォーカスアッセイ（ＦＦＡ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル内拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫ラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫アッセイなどの技術を用いた競合及び非競合アッセイシステムが挙げられる。かかるアッセイはルーチンで行われており、当該技術分野で周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）Ｖｏｌ．１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体の結合特性の決定に好適な方法及び試薬は、当該技術分野で公知であり及び／又は入手可能である。かかる速度論的分析用として設計された装置及びソフトウェアは市販されている（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（登録商標）ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＫＩＮＥＸＡ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。
免疫増強方法及び治療方法
活性化Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又は活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＯＸ４０のエンゲージによる被験体（例えば、ヒト被験体などの哺乳動物被験体）における抗原特異的免疫反応の増強は、抗原の活性化時又は活性化後に多種多様な方法を用いて達成可能である。最適な方法は、免疫反応の増強が望まれる抗原のタイプに主に依存するであろう。また、利用可能な種々の方法は、以下で考察される。どんな方法を選択するにせよ、ヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、抗原によるＴ細胞のプライミング時又はその直後に被験体のＴ細胞に提示されるように被験体例えばヒト患者に投与可能である。
ある特定の態様では、本開示は、ヒト化抗ＯＸ４０抗体がＴ細胞、例えば、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又は活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合可能な条件下で、活性化Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又は活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞をヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片に接触させる工程を含む、活性化Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又は活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の生存又は増殖の促進方法を提供する。ある特定の態様では、接触はｉｎ ｖｉｔｒｏである。ある特定の態様では、接触はｉｎ ｖｉｖｏであり、例えば、治療が必要とされる被験体への有効用量のヒト化抗ＯＸ４０抗体の投与を介する。ある特定の態様では、接触はＴ細胞活性化例えば抗原活性化と同時に行うことが可能であり、ある特定の態様では、接触はＴ細胞活性化後に行うことが可能である。
さらなる態様では、本開示は、ヒト化抗ＯＸ４０抗体が活性化Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又は活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合可能な条件下で、活性化Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又は活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片に接触させる工程を含む、活性化Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又は活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞からのサイトカイン放出の誘導方法を提供する。ある特定の態様では、接触はｉｎ ｖｉｔｒｏである。ある特定の態様では、接触はｉｎ ｖｉｖｏであり、例えば、治療が必要とされる被験体への有効用量のヒト化抗ＯＸ４０抗体の投与を介する。ある特定の態様では、接触はＴ細胞活性化例えば抗原活性化と同時に行うことが可能であり、ある特定の態様では、接触はＴ細胞活性化後に行うことが可能である。ある特定の態様では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１β、又はそれらの任意の組合せであり得る。ある特定の態様では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、又はそれらの任意の組合せである。
ある特定の態様では、活性化Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又は活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞、カニクイザルＴ細胞、アカゲザルＴ細胞、又はそれらの組合せである。
本開示は、ヒト化抗ＯＸ４０抗体がＴ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合可能な条件下でＴ細胞を本明細書に提供されるヒト化抗ＯＸ４０抗体に接触させる工程を含む、Ｔ細胞活性化の促進方法をさらに提供する。ある特定の態様では、接触は抗原例えば腫瘍抗原の存在下で行われる。ある特定の態様では、この方法は、ヒト化抗ＯＸ４０抗体のＦｃドメインと、ＦｃγＲを発現する細胞、例えば、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、骨髄樹状細胞若しくは形質細胞様樹状細胞、濾胞樹状細胞、ランゲルハンス細胞、内皮細胞、ＮＫ細胞、活性化Ｔ細胞、好中球、好酸球、血小板、マスト細胞、一次ヒト腫瘍若しくは腫瘍流入領域若しくは非流入領域リンパ節に由来するＣＤ４５＋細胞、他の二次若しくは三次リンパ様構造に由来するＣＤ４５＋細胞、又はそれらの組合せと、の相互作用をさらに含む。ある特定の態様では、Ｔ細胞活性化はＮＦκＢシグナル伝達経路の刺激を介して測定可能である。ある特定の態様では、接触はｉｎ ｖｉｔｒｏである。ある特定の態様では、接触はｉｎ ｖｉｖｏであり、例えば、治療が必要とされる被験体への有効用量のヒト化抗ＯＸ４０抗体の投与を介する。
本開示は、有効量のヒト化抗ＯＸ４０抗体若しくはその抗原結合断片又はヒト化抗ＯＸ４０抗体を含む組成物若しくは製剤を治療が必要とされる被験体に投与する工程を含む、被験体における癌の治療方法をさらに提供する。ある特定の態様では、癌は固形腫瘍である。この方法によれば、ヒト化抗ＯＸ４０抗体又は組成物の投与により腫瘍成長の阻害、腫瘍縮小の促進、又はその両方が可能である。ある特定の態様では、腫瘍成長阻害はＴ細胞の存在下で達成される。
「癌」、「腫瘍」、「癌性」、及び「悪性」という用語は、典型的には無制御の細胞成長により特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を意味するか又は記述する。癌の例としては、限定されるものではないが、腺癌をはじめとする癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、及び白血病が挙げられる。かかる癌のより特定の例としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、膵癌、膠芽細胞腫、神経膠腫、頸癌、卵巣癌、肝癌腫や肝細胞腫などの肝癌、膀胱癌、乳癌（ホルモン媒介乳癌など、例えば、Ｉｎｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９４：１０５７−１０６５を参照のこと）、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、骨髄腫（例えば多発性骨髄腫）、唾液腺癌、腎細胞癌やウィルムス腫瘍などの腎癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、種々のタイプの頭頸部癌、限定されるものではないが、扁平上皮細胞癌など、並びに粘液起源の癌、例えば、卵巣粘液癌、胆管癌（肝臓）、腎乳頭状癌などが挙げられる。
本開示は、有効量のヒト化抗ＯＸ４０抗体若しくはその抗原結合断片、ヒト化抗ＯＸ４０抗体を含む組成物若しくは製剤、又は本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、若しくは宿主細胞を被験体に投与する工程を含む、必要とされる被験体における癌の防止方法又は治療方法をさらに提供する。
癌治療のための組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか又は動物であるか、投与される他の医薬、及び治療が予防的であるか又は治療的であるかをはじめとする多種多様な因子に依存して異なる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物をはじめとする非ヒト哺乳動物も治療可能である。治療投与量は、安全性及び有効性を最適化するように当業者に公知のルーチン法を用いて設定可能である。
本開示の組成物は、任意の好適な方法により、例えば、非経口、脳室内、経口、吸入スプレー、局所、経直腸、経鼻、頬腔内、経腟、又は植込みリザーバーにより投与可能である。本明細書で用いられる「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、脊髄内、肝臓内、病変内、及び頭蓋内への注射又は注入の技術を含む。
本開示は、治療有効量のヒト化抗ＯＸ４０抗体若しくはその抗原結合断片又はヒト化抗ＯＸ４０抗体を含む組成物若しくは製剤を治療が必要とされる被験体に投与する工程を含む、被験体における免疫反応の増強方法をさらに提供する。
治療される被験体は、治療が必要とされる任意の動物例えば哺乳動物であり得るとともに、ある特定の態様では、被験体はヒト被験体である。
最も単純な形態では、被験体に投与される調製物は、本明細書の他の箇所に記載の医薬賦形剤、担体、又は希釈剤と組合せ可能な従来の剤形で投与されるヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片である。
ヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、本明細書の他の箇所に記載の任意の好適な方法により、例えば、ＩＶ注入により投与可能である。ある特定の態様では、ヒト化抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、腫瘍中又は腫瘍細胞の近傍に導入可能である。
限定されるものではないが、乳癌、肺癌、膵癌、卵巣癌、腎癌、結腸癌、及び膀胱癌、さらには黒色腫、肉腫、及びリンパ腫を含めてすべてのタイプの腫瘍が、この方法による治療に潜在的に適合可能である。
抗原によるプライミング時又はその直後に活性化Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又は活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＯＸ４０レセプターのエンゲージメントを行うと、抗原に対する活性化Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又は活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の反応が増加する。本開示との関連では、「エンゲージメント」という用語は、ＯＸ４０レセプターへの結合及びＯＸ４０レセプターにより媒介される少なくとも１つの活性の刺激を意味する。例えば、抗原特異的活性化Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又は活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＯＸ４０レセプターのエンゲージメントを行うと、抗原単独に対する反応と比較してＴ細胞増殖が増加し且つサイトカイン産生が増加する。抗原に対する反応の亢進は、ＯＸ４０レセプターエンゲージメントの不在下よりも実質的に長時間にわたり維持可能である。従って、ＯＸ４０レセプターを介する刺激を行うと、抗原例えば腫瘍抗原のＴ細胞認識がブーストされて抗原特異的免疫反応が増強される。
ＯＸ４０アゴニストは、抗原によるＴ細胞のプライミング時又はその直後に被験体に投与した場合、被験体例えばヒト被験体における抗原特異的免疫反応を増強可能である。ＯＸ４０アゴニストは、ＯＸ４０リガンド（「ＯＸ４０Ｌ」）、例えば、可溶性ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質及び抗ＯＸ４０抗体又はその断片を含む。具体例は、ＯＸ４０に特異的に結合することによりシグナル伝達を惹起するヒト化抗体である。本開示により一群のヒト化抗ＯＸ４０モノクローナル抗体が提供される。また、かかる抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸も記載されている。本開示はまた、ヒト化抗ＯＸ４０モノクローナル抗体を用いて被験体において抗原特異的免疫反応を増強する方法も提供する。
ＯＸ４０エピトープ
抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的分子例えばＯＸ４０ポリペプチドの部分は、「エピトープ」又は「抗原決定基」である。標的分子例えばポリペプチドは、単一のエピトープであり得るが、典型的には少なくとも２つのエピトープを含み、標的分子のサイズ、コンフォメーション、及びタイプに依存して任意の数のエピトープを含み得る。
抗体により結合可能である標的ポリペプチド上のエピトープの最小サイズは、約４〜５アミノ酸であると考えられる。ペプチド又はポリペプチドのエピトープは、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１０、若しくは少なくとも約１５アミノ酸以上を含有可能である。抗体は三次形態のポリペプチド抗原を認識可能であるので、エピトープを構成するアミノ酸は隣接している必要はない。本明細書に提供されるＯＸ４０例えばヒトＯＸ４０のエピトープは、ＯＸ４０例えばヒトＯＸ４０の隣接又は非隣接アミノ酸を少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、又は約１０〜約３０含み得る。ある特定の態様では、本明細書に提供されるＯＸ４０例えばヒトＯＸ４０のエピトープは、１００アミノ酸以下、７５アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、４０アミノ酸以下、３５アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２５アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、又は１５アミノ酸以下のペプチドからなり、ＯＸ４０例えばヒトＯＸ４０の隣接又は非隣接アミノ酸を少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、又は約１０〜約３０含み得る。一方、本明細書に提供されるＯＸ４０例えばヒトＯＸ４０のエピトープは、ＯＸ４０例えばヒトＯＸ４０の隣接又は非隣接アミノ酸を４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、又は約１０〜約３０含み得る。
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗ＯＸ４０抗体又はその断片は、ＯＸ４０の第３のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ３）内、例えば、ヒトＯＸ４０のアミノ酸１０８〜１４６（配列番号９１）内に含まれる、ＯＸ４０、例えば、ヒトＯＸ４０、アカゲザルＯＸ４０、若しくはカニクイザルＯＸ４０のエピトープに結合するか、又は配列番号９１のアミノ酸１０８〜１４６に対して少なくとも１７％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも１００％同一であるペプチドに結合する。ＯＸ４０のＣＲＤ３「内に含まれる」とは、エピトープが、ＣＲＤ３領域、例えば、配列番号９１のアミノ酸１０８〜１４６からなるＯＸ４０の領域の隣接又は非隣接アミノ酸を４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、若しくは３０以上含むか、又は配列番号９１のアミノ酸１０８〜１４６に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも１００％同一であるペプチドを含むことを意味する。
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体に結合するＯＸ４０ ＣＲＤ３ペプチドは、配列番号９１のアミノ酸１１６に対応する位置にロイシン、及び配列番号９１のアミノ酸１２６に対応する位置にアラニンを保持する。例えば、本明細書に提供されるある特定の抗ＯＸ４０抗体又はその断片は、ヒトＯＸ４０に結合するが、マウス又はラットＯＸ４０に結合しない。マウスＯＸ４０のＣＲＤ３領域は、配列番号９２の約アミノ酸１０４〜約アミノ酸１４４に延在する。マウスＯＸ４０配列番号９２のアミノ酸Ｑ１１３は、ヒトＯＸ４０配列番号９１のアミノ酸Ｌ１１６に対応し、マウスＯＸ４０配列番号９２のアミノ酸Ｖ１２４は、ヒトＯＸ４０配列番号９１のアミノ酸Ａ１２６に対応する。実施例１０に示されるように、本明細書に提供されるＯＸ４０抗体例えばＯＸ４０ｍＡｂ２４は、Ｑ１１３Ｌ突然変異及びＶ１２４Ａを除いて配列番号９２を含むマウスＯＸ４０の変異体に結合可能である。
ある特定の態様では、本明細書に提供されるＯＸ４０抗体例えばＯＸ４０ｍＡｂ２４に特異的に結合するエピトープからなるか又はそれを含むペプチドである単離ペプチドが提供される。ある特定の態様では、ペプチドは、１００アミノ酸以下、７５アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、４０アミノ酸以下、３５アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２５アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、又は１５アミノ酸以下からなり、ＯＸ４０のＣＲＤ３の隣接又は非隣接アミノ酸を少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、又は約１０〜約３０含み、例えば、配列番号９１のアミノ酸１０８〜１４６に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％同一であるＯＸ４０領域を含む。ある特定の態様では、ペプチドは、配列番号９１のアミノ酸１１６に対応する位置にロイシン及び配列番号９１のアミノ酸１２６に対応する位置にアラニンを保持する。
かかる単離ペプチドは、例えば、ＯＸ４０に特異的に結合する結合分子に関してライブラリーをスクリーニングするために、又は被験体動物において抗ＯＸ４０抗体を産生する免疫原として、使用可能である。
本開示では、とくに指定がない限り、当該技術の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来技術を利用する。かかる技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，（１９８５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；専門書、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５；Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照のこと。
抗体工学の一般的原理は、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）に記載されている。タンパク質工学の一般的原理は、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．）に記載されている。抗体及び抗体−ハプテン結合の一般的原理は、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．）；及びＳｔｅｗａｒｄ（１９８４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に記載されている。そのほかに、とくに記載されていない当該技術分野で公知の免疫学の標準的方法は、一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９４）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ ｅｄ；Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）及びＭｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ）（１９８０）Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ＮＹ）に従う。
免疫学の一般的原理が記載されている標準的参照文献としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ（１９８２）Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）；Ｋｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９８４）“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｂｕｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｇｏｌｄｓｂｙ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（２０００）Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ ｅｄ．；Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ ＆ Ｃｏ．）；Ｒｏｉｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（６ｔｈ ｅｄ．；Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ）；Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（５ｔｈ ｅｄ．；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）；Ｌｅｗｉｎ（２００３）Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩＩ（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ ２００３）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（２００３）ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）が挙げられる。
以上で引用した参考文献はすべて、さらには本明細書で引用した参照文献はすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
例示を目的として以下の実施例を提供するが、これらに限定されるものではない。
略号及び用語の定義を表２に列挙する。
Figure 2017532037
Figure 2017532037
Figure 2017532037
Figure 2017532037
実施例１：抗ヒトＯＸ４０ネズミｍＡｂ９Ｂ１２のヒト化
ネズミｍＡｂ９Ｂ１２のＣＤＲを選択されたヒト生殖系列フレームワーク上にグラフトすることによりヒト化した。ネズミｍＡｂ９Ｂ１２の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列を公共ＮＣＢＩデータベースで入手可能なヒト抗体生殖系列配列と比較した。最も高い配列相同性に基づいてヒトアクセプターフレームワーク（ＦＲ）を特定した。最適アクセプターフレームワークを選択する際、結合に影響を及ぼす可能性があるマッチ残基（バーニアゾーン残基、カノニカルクラス残基、及びＶＨ／ＶＬインターフェース残基）や免疫原性の可能性（低い生殖系列頻度）などのいくつかの基準を考慮した。それぞれ個別のフレームワーク領域に対して最も相同なヒト免疫グロブリン生殖系列セグメントを選択することにより、ＶＨ及びＶＬの最適ハイブリッドヒトアクセプターＦＲ配列を独立して設計した。３つの異なる生殖系列アクセプター配列を組み合わせてヒト化ＶＨフレームワークバックボーンを形成し、一方、ＶＬについては２つの異なる生殖系列アクセプター配列を選択した。ＶＨ鎖（９Ｂ１２ＶＨ−ｈｕ）に対して選択された完全ヒト生殖系列アクセプターテンプレートは、ＩＧＶＨ４−３４＊０９（ＦＲ１）とＶＨ４−３９（ＦＲ２）とＶＨ６−１（ＦＲ３）とＪＨ４（ＦＲ４）との組合せであった。ＶＬ（９Ｂ１２ＶＬ−ｈｕ１）は、Ｏ１８（ＦＲ１）とＯ１８（ＦＲ２）とＬ２３（ＦＲ３）とＪＫ１（ＦＲ４）との組合せであった。ネズミ配列とヒトテンプレートアクセプター配列との間のフレームワーク相同性は、ＶＨでは７７％及びＶＬでは約７２％であった。
親ＣＤＲの機能的コンフォメーションに影響を及ぼし得るか又はそれを維持し得るとともにヒト生殖系列配列にマッチしないネズミフレームワーク残基を特定してヒトアクセプターＦＲ中に選択的に再導することにより、９Ｂ１２の結合親和性及び機能を最もよく保存するようにした。この場合、ＶＨ鎖のマウスＦＲ残基２７Ｄ、３９Ｋ、４７Ｙ、４８Ｍ、７１Ｒ、７８Ｙ、及び４４Ｖ並びにＶＬ鎖の９１Ｆ及び６８Ｒをヒトテンプレートで復帰突然変異させた。ヒト化抗体を生成するために、Ｋａｂａｔにより定義されたＣＤＲ残基をＶＨ及びＶＬの両方の設計されたアクセプターフレームワーク中に融合した。２つのヒト化ＶＨ遺伝子（９Ｂ１２ＶＨ−ｈｕ及び９Ｂ１２ＶＨ−ｈｕ３９Ｋ７１Ｒ）並びに２つのＶＬ遺伝子（９Ｂ１２ＶＬ−ｈｕ１及び９Ｂ１２ＶＬ−ｈｕ２）をＧｅｎｅＡＲＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）により合成し、次いで、インハウスｐＯＥ ＩｇＧ１発現ベクター中にクローニングした。
一群のヒト化変異体を作製してＴ細胞ベースの結合及び増殖アッセイで特徴付けた。重鎖可変領域にマウスＦＲ残基に復帰されたいくつかのフレームワークアミノ酸を含有するヒト化変異体は、９Ｂ１２と同程度の親和性及び類似の効力（Ｔ細胞増殖）で活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＯＸ４０に結合した。すべてのヒト化ＶＨ変異体とペアをなす可変軽鎖は、完全ヒト化フレームワークをコードする。免疫原性のリスクを低減するために、影響しないマウス残基を対応するヒト残基で置き換えることにより、ＶＨヒトＦＲ中のマウス残基の数をさらに低減した。配列ライアビリティーの可能性を除去するために、ＶＨ−ＣＤＲ２のＮＧ脱アミド化部位並びにＶＨ−ＣＤＲ３のＲＹＤインテグリン結合部位及びＤＧ異性化部位を独立して又は組み合わせて積極的に除去した。ヒトＩｇＧ１のＦｃエフェクター機能により媒介されるＡＤＣＣを回避するために、ヒト化リードｍＡｂに対してＩｇＧ４Ｐ及びＩｇＧ１ＴＭのＦｃ変異体を作製した。得られたＩｇＧ４Ｐ及びＩｇＧ１ＴＭの変異体は、ＯＸ４０に対してＩｇＧ１変異体と同一の結合活性を呈したが、ネズミｍＡｂ９Ｂ１２に最も類似したＡＤＣＣ活性を有意に低減した。要約すると、ヒト化変異体は、親マウスｍＡｂ９Ｂ１２と同程度の細胞結合親和性及びｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を呈した。すべてヒト化ＶＬとペアをなすヒト化ＶＨ変異体間のアミノ酸差を図１にまとめる。
アカゲザルでｉｎ ｖｉｖｏ特徴付けを行うためにリバースキメラを工学操作した。簡潔に述べると、ヒト化ｍＡｂ２４のＶＨ及びＶＬをネズミ９Ｂ１２の定常重鎖及び定常軽鎖にグラフトした。ｉｎ ｖｉｔｒｏ特徴付けを行ったところ、リバースキメラのＦａｂ部分はｍＡｂ２４と同程度にヒトＯＸ４０に結合することが実証された。
実施例２：活性化されたヒト、非ヒト霊長動物、ラット、及びマウスのＴ細胞の表面上に発現される天然ＯＸ４０へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合親和性及びレセプター占有率
２．１ 材料
この実施例で使用した材料を表２−１に列挙する。
Figure 2017532037
この実施例では、ヒト、非ヒト霊長動物、ラット、及びマウスのＴ細胞の細胞表面上に発現されるＯＸ４０に結合するＯＸ４０ｍＡｂ２４の見掛けの親和性を測定するために、細胞ベースの平衡結合アッセイを実施した。そのほかに、平衡結合アッセイを利用して、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上で２０％、５０％、又は９０％のヒトＯＸ４０レセプター占有率を達成するＯＸ４０ｍＡｂ２４の濃度を決定した。
ＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２の結合を比較するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞の表面上に発現されるヒト及び非ヒト霊長動物のＯＸ４０へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の由来源のネズミ抗ヒトＯＸ４０モノクローナル抗体９Ｂ１２の結合について、２０％、５０％、又は９０％レセプター占有率を達成するのに必要なＯＸ４０ｍＡｂ２４濃度も決定した。
２．２ アッセイ
２．２．１ 一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及びＯＸ４０発現ジャーカットＴ細胞へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合
ヒトＯＸ４０に結合するＯＸ４０ｍＡｂ２４の見掛けの平衡結合定数（Ｋｄ）及び平衡時に細胞表面ヒトＯＸ４０レセプターの２０％、５０％、又は９０％に結合するのに必要な濃度を、ＯＸ４０発現活性化一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞又はヒトＯＸ４０過剰発現ジャーカットＴ細胞へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合曲線から計算した。ＯＸ４０ｍＡｂ２４値との比較のために、類似の実験を同時に行ってこれらの細胞への９Ｂ１２の結合を評価した。
最初に、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ ＣＤ４＋Ｔ細胞富化キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）及び改良された製造業者のプロトコルを用いて、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｂｌｏｏｄ Ｄｏｎｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍにより、健常ドナーから得られたヘパリンナトリウム抗凝固処理全血から一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。
Ｔ細胞を活性化してＯＸ４０をアップレギュレートするために、２μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌ及び２０ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２と共に、一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を４８時間培養した。続いて、ＯＸ４０ｍＡｂ２４結合実験で＞９５％生存可能な活性化Ｔ細胞を使用した。ドナーはすべて、ユニークな個体である。すなわち、同一のドナーに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた繰返し結合実験は行わなかった。
活性化を必要とすることなくヒトＯＸ４０過剰発現ジャーカットＮＦκＢ−ルシフェラーゼクローン６４細胞を結合実験前に完全ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中で培養した。
ＯＸ４０ｍＡｂ２４（１０μｇ／ｍＬ）又は９Ｂ１２（１０μｇ／ｍＬ）を１７ポイント２倍希釈系列で希釈した。ＯＸ４０ｍＡｂ２４を１００，０００細胞（活性化一次ＣＤ４＋Ｔ細胞又はヒトＯＸ４０過剰発現ジャーカットＮＦｋＢ−ルシフェラーゼクローン６４細胞）／ウェルで添加して４℃で１時間インキュベートした。バックグラウンド結合を減算するために、二次抗体のみの存在下で細胞をインキュベートした。ＯＸ４０ｍＡｂ２４又は９Ｂ１２のＯＸ４０結合の特異性を示すために、ＯＸ４０過剰発現ジャーカットＴ細胞と共に、それぞれ、対照Ｒ３４７ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体及びマウスＩｇＧ１アイソタイプクローンＭＯＰＣ−２１を実験に使用した。インキュベーション後、細胞を２００μＬの冷（４℃）ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ＯＸ４０ｍＡｂ２４への結合のために）又は１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（９Ｂ１２への結合のために）と５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とを含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％の熱不活性化新生仔ウシ血清）と共にインキュベートした。二次抗体インキュベーション後、細胞を洗浄し、以下に記載されるようにＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを用いてフローサイトメトリー分析を行うために１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させた。
２．２．２ マウスＣＤ４＋Ｔ細胞へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合
活性化一次ＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現されるマウスＯＸ４０への結合に関してＯＸ４０ｍＡｂ２４を調べた。ＯＸ４０ｍＡｂ２４と比較するために、類似の実験を同時に行ってこれらの細胞への９Ｂ１２の結合を評価した。以下のプロトコルに従って、採取された正常Ｂａｌｂ／Ｃマウス脾臓からマウスＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。
脾臓を７０μＭナイロンフィルターに押し付けて潰して脾細胞を放出させ、１ｍＬの完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳ、１％抗生物質／抗真菌溶液、及び５５μＭ βメルカプトエタノール［ＢＭＥ］）でフィルターを濯いだ。脾細胞をペレット化し、上清を廃棄した。ペレットを５ｍＬのＩＸ赤血球（ＲＢＣ）溶解緩衝液で処理してインキュベートすることによりＲＢＣを溶解させた。インキュベーション時間の終了時に完全培地の添加によりオスモル濃度を回復した。
細胞をペレット化し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．２＋０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋２ｍＭエチレンジアミン四酢酸［ＥＤＴＡ］）で洗浄し、そして上清を廃棄した。ペレットを冷ＭＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、そしてＶｉＣｅｌｌカウンターでカウントして細胞数及び生存能を決定した。
製造業者の取扱い説明書に従ってＭｉｌｔｅｎｙｉプロセスキット（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてマウスＣＤ４＋Ｔ細胞の単離を行い、単離細胞を完全培地中に懸濁させた。
２μｇ／ｍＬの各ハムスター抗マウスＣＤ３及びハムスター抗マウスＣＤ２８抗体で被覆された９６ウェルプレート中でマウスＣＤ４＋Ｔ細胞（１５０，０００／ウェル、１００μＬ完全培地中）を一晩培養し、そしてＴ細胞を活性化してＯＸ４０発現を誘導した。インキュベーションプレートから活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を取り出して、結合アッセイのために１００，０００細胞を非組織培養物処理９６ウェル丸底プレートの各ウェルに導入し、そしてＦＡＣＳ緩衝液を用いて１回洗浄した。１０点データ曲線が得られるようにＦＡＣＳ緩衝液でそれぞれ３倍段階希釈された１０μｇ／ｍＬのＯＸ４０ｍＡｂ２４、９Ｂ１２、及びラット抗マウスＯＸ４０クローンＯＸ８６（陽性対照）抗体を用いて、結合を行った。陰性対照では、３点データ曲線が得られるように１０μｇ／ｍＬのＲ３４７ヒトＩｇＧ１、ＭＯＰＣ−２１マウスＩｇＧ１、又はＲＴＫ２０７１ラットＩｇＧ１を６倍希釈した。ＯＸ４０ｍＡｂ２４又は抗体を含有するＦＡＣＳ緩衝液（５０μＬ）をデュープリケートでＣＤ４＋Ｔ細胞に添加してインキュベートした。一次インキュベーション後、細胞を２００μＬの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗ヒト二次抗体、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗マウス二次抗体、又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗ラット二次抗体と、５μｇ／ｍＬのＰＩと、を含有する５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液と共にインキュベートした。二次抗体インキュベーション後、細胞を４℃のＦＡＣＳ緩衝液（２００μＬ／洗浄）で洗浄し、そして第２．３節に記載されるようにＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを用いてフローサイトメトリー分析を行うために１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させた。
２．２．３ ラットＣＤ４＋Ｔ細胞へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合
活性化一次ＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現されるラットＯＸ４０への結合に関してＯＸ４０ｍＡｂ２４を調べた。ＯＸ４０ｍＡｂ２４との比較が行えるように、９Ｂ１２を用いて類似の実験を同時に行った。製造業者の取扱い説明書に従ってＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍａｇｅｌｌｅｃｔキット（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いてラットＣＤ４＋Ｔ細胞の単離を行ったこと以外は、マウス脾細胞の単離に関連して以上に説明したプロトコルに従って、新たに採取した正常スプラーグドーリーラット脾臓からラットＣＤ４＋細胞を単離した。
Ｔ細胞を活性化してＯＸ４０発現を誘導するために、１μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）及び５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２の入ったＴ７５細胞培養フラスコ中でラットＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０６／ｍＬ完全培地）を一晩培養し、そして一晩インキュベートした。フラスコから活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を取り出して、結合アッセイのために１００，０００細胞を非組織培養物処理９６ウェル丸底プレートの各ウェルに導入し、そしてＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。１０点データ曲線が得られるようにＦＡＣＳ緩衝液で３倍段階希釈された１０μｇ／ｍＬのＯＸ４０ｍＡｂ２４、９Ｂ１２、又はマウス抗ラットＣＤ１３４クローンＯＸ４０（陽性対照）抗体を用いて、結合を行った。陰性対照では、３点データ曲線が得られるように１０μｇ／ｍＬのＲ３４７ヒトＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ１クローンＭＯＰＣ−２１を６倍段階希釈した。１００μＬのＯＸ４０ｍＡｂ２４対照タンパク質、９Ｂ１２、又はクローンＯＸ４０抗体をデュープリケートでＣＤ４＋Ｔ細胞に添加してインキュベートした。一次インキュベーション後、細胞を２００μＬ／洗浄の４℃のＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ及びヒト抗マウス二次抗体又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗マウス二次抗体と、５μｇ／ｍＬのＰＩと、を含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液と共にインキュベートした。二次抗体インキュベーション後、第２．３節に記載されるように細胞を処理してフローサイトメトリーに供した。
２．２．４ カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合
活性化一次ＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現されるカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＯＸ４０への結合に関してＯＸ４０ｍＡｂ２４を調べた。ＯＸ４０ｍＡｂ２４値との比較が行えるように、９Ｂ１２を用いて類似の実験を同時に行った。以下のプロトコルに従ってＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｐｒｉｍａｔｅｓ（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）製の健常カニクイザルドナー（Ｎ＝２）から得られたヘパリンナトリウム抗凝固処理全血からカニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。
５０ｍＬのコニカル遠心チューブ中の３０ｍＬの６０％Ｐｅｒｃｏｌｌ上に全血を層状化した。血液を遠心分離し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をインターフェースで捕集し、１２００ＲＰＭで冷（４℃）Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ緩衝液により１０分間洗浄した。上清を廃棄し、ペレットを５ｍＬの１×ＲＢＣ溶解緩衝液で処理し、そしてインキュベートした。インキュベーション時間の終了時に完全培地（１０％のＦＢＳ及び１％の抗生物質／抗真菌剤を含むＲＰＭＩ）をペレットに添加して溶解プロセスを停止した。
細胞をペレット化し、２０ｍＬの冷（４℃）Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄した。上清を廃棄し、細胞ペレットを冷（４℃）ＭＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、そしてＶｉＣｅｌｌカウンターでカウントして細胞数及び生存能を決定した。
製造業者の取扱い説明書に従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ非ヒト霊長動物キットを用いてカニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞の単離を行い、次いで、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＶｉＣｅｌｌカウンターでカウントし、そして以上に記載の完全培地中に１×１０６／ｍＬで懸濁させた。
２μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌ及び２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＴ７５細胞培養フラスコ中でカニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞（完全培地中１×１０６／ｍＬ）を４８時間インキュベートすることにより、Ｔ細胞を活性化してＯＸ４０発現を誘導した。フラスコから活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を取り出して、結合アッセイのために１００，０００細胞を非組織培養物処理９６ウェル丸底プレートの各ウェルに導入し、そして２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。１１点データ曲線が得られるようにＦＡＣＳ緩衝液で４倍段階希釈した１０μｇ／ｍＬのＯＸ４０ｍＡｂ２４若しくは９Ｂ１２、又は３点データ曲線が得られるように６倍段階希釈したＲ３４７ヒトＩｇＧ１若しくはマウスＩｇＧ１クローンＭＯＰＣ−２１（陰性対照）の両方を用いて結合を行った。ＯＸ４０ｍＡｂ２４、９Ｂ１２、又は対照タンパク質をＣＤ４＋Ｔ細胞に添加してインキュベートした。一次インキュベーション後、細胞を２００μＬ／洗浄の冷（４℃）ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗ヒト二次抗体又は１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗マウス二次抗体と、５μｇ／ｍＬのＰＩと、を含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液と共にインキュベートした。二次抗体インキュベーション後、第２．３節に記載されるように細胞を処理してフローサイトメトリーに供した。
２．２．５ アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合
活性化一次ＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現されるアカゲザルＯＸ４０への結合に関してＯＸ４０ｍＡｂ２４を調べた。ＯＸ４０ｍＡｂ２４値との比較が行えるように、９Ｂ１２を用いて類似の実験を同時に行った。以下のプロトコルに従ってＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｐｒｉｍａｔｅｓ（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）製の健常アカゲザルドナー（Ｎ＝２）から得られたヘパリンナトリウム抗凝固処理全血からアカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。
ヘパリン処理アカゲザル血液（２０ｍＬ）をＰＢＳで１：１希釈し、５０ｍｌのコニカル遠心チューブ中の１５ｍｌの９５％ＬＳＭ上に層状化した。血液を遠心分離し、ＰＢＭＣをインターフェースで捕集し、そして３０分間にわたり４００×ｇで冷Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ緩衝液を用いて２回洗浄した。上清を廃棄し、ペレットを５ｍＬのＩＸ ＲＢＣ溶解緩衝液で処理し、そしてインキュベートした。インキュベーション時間の終了時に完全培地（１０％のＦＢＳ及び１％の抗生物質／抗真菌剤を含むＲＰＭＩ）をペレットに添加して溶解プロセスを停止した。細胞をペレット化し、２０ｍＬの冷Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄した。上清を廃棄し、ペレットを冷ＭＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、そしてＶｉＣｅｌｌカウンターでカウントして細胞数及び生存能を決定した。製造業者の取扱い説明書に従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ非ヒト霊長動物キット（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてアカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞の単離を行った。
５μｇ／ｍＬのＣｏｎ−Ａ及び１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＴ７５細胞培養フラスコ中でアカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞（完全培地中１×１０６／ｍＬ）を４８時間培養することにより、Ｔ細胞を活性化してＯＸ４０発現を誘導した。１０点（実験１）又は１２点データ曲線（実験２）が得られるようにＦＡＣＳ緩衝液で３倍段階希釈した１０μｇ／ｍＬのＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２を用いて、並びに２データ点（実験１）又は４データ点（実験２）が得られるように６倍希釈した１０μｇ／ｍＬのヒト及びマウスアイソタイプ対照を用いて、１００，０００活性化アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞への結合を行った。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗ヒト二次抗体及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗マウス二次結合は、カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞に対して以上に記載した通りであり、フローサイトメトリーは、第２．３節に記載される通りである。
２．３ フローサイトメトリー
第２．１節に記載のアッセイのフローサイトメトリーは、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて行った。Ｆｌｏｗ Ｊｏサイトメトリー解析ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて細胞へのＯＸ４０ｍＡｂ２４、９Ｂ１２、及び対照タンパク質の結合を決定した。ＯＸ４０発現細胞（非染色でＰＩも二次抗体も無し）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識二次抗体試薬若しくはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識二次抗体試薬のみに結合される細胞、又は０．１％のサポニンで透過化されて１０μｇ／ｍＬのＰＩで処理された細胞を含有するウェルを単一染色補償対照として準備した。蛍光補償後、生存（ＰＩ陰性）細胞をゲート処理して二次抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。
２．４ 計算
２．４．１ 見掛けの平衡解離定数（Ｋｄ）の決定
Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ，ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）を用いてタンパク質濃度（Ｍ）に対してＯＸ４０ｍＡｂ２４結合のＭＦＩをプロットすることにより結合曲線を作成し、この曲線から見掛けのＫｄが決定した。ヒト、マウス、ラット、カニクイザル、又はアカゲザルのＯＸ４０へのＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２の結合に対する見掛けのＫｄを決定するために、一部位（特異的）結合に対する非線形回帰（曲線当てはめ）式を利用した。
２．４．２ ２０％、５０％、及び９０％レセプター占有率値の決定
レセプターに結合されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の量は、以下の結合関係式：
式１： レセプター（Ａ）＋ｍＡｂ（Ｂ）←→レセプター−ｍＡｂ複合体（ＡＢ）
から推定可能である。
それぞれの抗体の結合解離定数（Ｋｄ）は、式２：
Figure 2017532037
 により表される。式中、［Ａ］及び［Ｂ］は、それぞれ、遊離のレセプター及び抗体の濃度を表す。最後に、抗体に結合されるすべてのレセプター分子の占有率、分率（Ｆ）は、式３：
Figure 2017532037
 により計算可能である。式２を作成して式３に代入すると、式４：
Figure 2017532037
 が得られる。式４を単純化すると、式５：
Figure 2017532037
 が得られる。従って、すべてのレセプター分子のうち平衡条件で抗体に結合されるものの分率は、遊離ｍＡｂの濃度及びそれぞれの抗体の解離定数Ｋｄが既知であれば、計算可能である。Ｆとして表されるレセプター占有率に必要とされる抗体の濃度を計算する式を導くと、以下の式：
式６：
［Ｂ］＝Ｆ＊Ｋｄ／（１−Ｆ）
が得られる。式中、［Ｂ］は、ｍＡｂこの場合はＯＸ４０ｍＡｂ２４の濃度に等しい。この式（式６）を用いて２０、５０、及び９０％レセプター占有率（Ｆ＝０．２０、０．５０、又は０．９０）に必要とされるＯＸ４０ｍＡｂ２４の濃度を細胞結合実験から計算し、この濃度から以上に記載の一部位（特異的）結合に対する非線形回帰（曲線当てはめ）式を用いてＫｄ値を計算した。
２．５ 統計的方法
Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアで９５％の信頼水準の対応のないスチューデントの両側ｔ検定及び異なる標準偏差を含むデータセットを補正するウェルチ補正を利用し、ＯＸ４０発現ジャーカットＴ細胞と対比して活性化一次ヒトＣＤ４Ｔ細胞上のＯＸ４０へのＯＸ４０ｍＡｂ２４結合で決定された見掛けのＫｄ値間又は見掛けのレセプター占有率値間の統計学的有意差を決定した。記述統計量（すなわち、平均値及び平均値の標準誤差）は、まとめた図及び表に示される。
２．６ 結果
２．６．１ 一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合
６つの独立したＴ細胞ドナーを用いたｎ＝６の結合アッセイにおいて、ＯＸ４０ｍＡｂ２４は活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に結合し、見掛けのＫｄの平均は３１２ｐＭであり、２０％、５０％、及び９０％レセプター占有率値は、それぞれ、７８．１、３１２、及び２８１０ｐＭであった（図２Ａ及び２Ｂ並びに表２−２）。
それと比較して、９Ｂ１２は活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に結合し、平均Ｋｄは６６９ｐＭであり、２０％、５０％、及び９０％レセプター占有率値は、それぞれ、１６７、６６９、及び６０２０ｐＭであった（図２Ｃ及び２Ｄ並びに表２−２）。従って、９Ｂ１２の見掛けのＫｄ値とＯＸ４０ｍＡｂ２４の見掛けのＫｄ値との比は２．１〜１であり、ネズミモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体でヒトＯＸ４０への類似した結合親和性を反映している。
Figure 2017532037
２．６．２ ヒトＯＸ４０を過剰発現するように工学操作されたジャーカットＴ細胞株へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合
ＯＸ４０ｍＡｂ２４はＯＸ４０発現ジャーカットＴ細胞に結合し、平均Ｋｄは４２４ｐＭであり、２０％、５０％、及び９０％レセプター占有率値は、それぞれ、１０６、４２４、及び３８２０ｐＭであった。図３Ａ〜Ｃ及び表２−３。活性化一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及びＯＸ４０過剰発現ジャーカットＴ細胞により発現されるＯＸ４０へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の見掛けの結合親和性又はレセプター占有率には統計学的有意差はなかった（ｐ＝０．５９）。
それと比較して、９Ｂ１２はこれらの細胞に結合し、平均Ｋｄは７２６ｐＭであり、２０％、５０％、及び９０％レセプター占有率値は、それぞれ、１８２、７２６、及び６５４０ｐＭであった（図３Ｄ〜Ｆ及び表２−３）。従って、９Ｂ１２の見掛けのＫｄ値とＯＸ４０ｍＡｂ２４の見掛けのＫｄ値との比は１．７〜１であり、ＯＸ４０オン活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞への結合で計算された比に類似していた。
Figure 2017532037
２．６．３ マウス又はラットＣＤ４＋Ｔ細胞へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合
ＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２はいずれも、活性化マウスＣＤ４＋Ｔ細胞にも活性化ラットＣＤ４＋Ｔ細胞にも結合しなかった（データは示されていない）。市販の抗マウスＯＸ４０抗体及び抗ラットＯＸ４０抗体、それぞれ、クローンＯＸ８６及びＯＸ４０では、活性化マウスＣＤ４＋Ｔ細胞及び活性化ラットＣＤ４＋Ｔ細胞の陽性染色が観察された。９Ｂ１２は活性化マウスＣＤ４＋Ｔ細胞にも活性化ラットＣＤ４＋Ｔ細胞にも結合しなかった（データは示されていない）。
２．６．４ カニクイザル及びアカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合
ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、５８１ｐＭの平均Ｋｄで活性化カニクイザル細胞に結合した。カニクイザルＫｄは、ヒトＫｄの１．９倍であった（表２−４）。
９Ｂ１２は、１０８８ｐＭの平均Ｋｄで活性化カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞に結合した（表２−４）。この結果、９Ｂ１２の見掛けのＫｄ値とＯＸ４０ｍＡｂ２４の見掛けのＫｄ値との比は１．９〜１になった。
ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、３６９ｐＭの平均Ｋｄで活性化アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞に結合した（表２−４）。アカゲザルＫｄは、ヒトＫｄの１．２倍であった。
９Ｂ１２は、７１３ｐＭの平均Ｋｄで活性化アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞に結合した（表２−４）。この結果、９Ｂ１２の見掛けのＫｄ値とＯＸ４０ｍＡｂ２４の見掛けのＫｄ値との比は示されていないが２．８〜１になる。
Figure 2017532037
実施例３：ヒトＯＸ４０へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合特異性
この実施例では、ＮＧＦＲ（ＴＮＦＲＳＦ１６）、ＬＴβＲ（ＴＮＦＲＳＦ３）、ＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１β）、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＣＤ１３７（ＴＮＦＲＳＦ９）、及びＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）を含む関連アミノ酸配列を有する他のヒトＴＮＦＲＳＦメンバーと対比してヒトＯＸ４０へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の特異性を決定するために、フローサイトメトリーベースの細胞結合アッセイを行った。そのほかに、組換えヒトＴＮＦＲＳＦメンバーへのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合特異性をＥＬＩＳＡ方式で試験した。このメンバーには、以上に挙げたもののほか、ＤＲ６（ＴＮＦＲＳＦ２１）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、ＦＡＳ（ＴＮＦＲＳＦ６）、及びＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）が含まれる。
３．１ 材料
この試験で使用した材料を表３−１に列挙する。
Figure 2017532037
３．２ 方法
３．２．１ ヒトＯＸ４０に近い配列相同性を有するタンパク質の検索
ヒトＯＸ４０とのアミノ酸配列同一性を有するヒトタンパク質を同定するために、ＯＸ４０のタンパク質配列（ＣＣＤＳ１１／ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ４３４８９）を用いて、タンパク質配列相同性のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴＰ）検索を行った。１９種のＴＮＦＲＳＦファミリーメンバー／アイソフォームを同定した。ＣＣＤＳ及びＵｎｉＰｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）の両方を用いて、これらのタンパク質の全長配列を検証した。Ｃｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒバージョン９ソフトウェアでｂｌｏｓｕｍ６２スコア行列を用いてヒトＯＸ４０参照に対する集合アライメントを行うことにより、ヒトＯＸ４０とＢＬＡＳＴＰ検索で同定されたタンパク質との間のアミノ酸同一性のパーセントを決定した（表３−２）。
３．２．２ ＨＥＫ２９３細胞で発現される他のＴＮＦＲＳＦメンバーと対比したＯＸ４０へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合特異性
哺乳動物細胞にトランスフェクトしたときに個別のＴＮＦＲＳＦメンバーの発現を誘導可能なｃＤＮＡ構築物をＯｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手した。一過性トランスフェクションに使用するために、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｇｒｏｕｐ，ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤによりこれらのｃＤＮＡ構築物の増幅及び精製を行った。ＴＮＦＲＳＦメンバーをそれぞれ個別に発現させるために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００に対する製造業者の推奨プロトコルに従って、ＴＮＦＲＳＦメンバーの１つをコードする発現ベクターの０．５μｇのＤＮＡと組み合わせてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、トリプシン処理により組織培養プレートから細胞を取り出した。血清含有完全培地ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳの添加、それに続くに細胞のペレット化、及び完全培地による洗浄を行って、トリプシンを中和した。次いで、細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）中に懸濁させ、９６ウェル非組織培養物処理プレートにプレーティングし、ＴＮＦＲＳＦメンバー特異的ｍＡｂ（表３−３）及びＯＸ４０ｍＡｂ２４を用いた結合試験に供した。
抗体又はＯＸ４０ｍＡｂ２４を結合させるために、ＨＥＫ細胞をペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液を除去し、そして２μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と、製造業者により推奨された濃度のトランスフェクトＴＮＦＲＳＦメンバーに特異的な蛍光色素標識ｍＡｂ又は１μｇ／ｍＬの濃度のＯＸ４０ｍＡｂ２４と、を含有するＦＡＣＳ緩衝液中に細胞を懸濁させた。結合対照では、蛍光色素標識アイソタイプ対照抗体と共に細胞を個別にインキュベートした。４℃の暗所で抗体と共に細胞を１時間インキュベートした。その後、蛍光色素標識モノクローナル抗体と共にインキュベートされた細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いで、結合イベントを集め、そして第３．２．３節に記載されるように、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてフローサイトメトリーにより解析した。ＯＸ４０ｍＡｂ２４と共にインキュベートされた細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いで、２５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を懸濁させ、そして４℃の暗所でさらに３０分間インキュベートした。二次抗体結合対照では、ＯＸ４０ｍＡｂ２４の不在下で、ただし、蛍光色素標識二次抗体のみの存在下で、細胞をインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、冷ＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターによる解析に供した。
３．２．３ フローサイトメトリー解析
ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いてフローサイトメトリー標準（ＦＣＳ）データを検査した。ｍＡｂ結合を解析するために、最初に、細胞を生存（ＰＩ陰性）細胞に関してゲート処理し、次いで、イベントの全数に対してイベントの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をプロットして結合ヒストグラムを作成した。バックグラウンド（アイソタイプ対照又は二次抗体単独）に対するＭＦＩ倍率を決定できるように、各サンプルについてすべての生存細胞の幾何ＭＦＩを決定した。
３．２．４ ＯＸ４０ｍＡｂ２４結合特異性ＥＬＩＳＡ
ストックタンパク質をＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈した後、８点で各組換えヒトＴＮＦＲＳＦタンパク質の二倍希釈系列を調製した。続いて、５０μＬの各抗原希釈液をデュープリケートでＮｕｎｃ９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ平底プレートのウェルに導入し、４℃で一晩インキュベートしてタンパク質をプレートに吸着させた。その後、ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）プレートウォッシャーによりプレートをＰＢＳで３回洗浄して未結合タンパク質を除去した。抗ＯＸ４０ｍＡｂ２９、９Ｂ１２、及び対照抗体をＰＢＳで１０μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈して５０μＬのｍＡｂを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベートしてｍＡｂをプレート結合タンパク質に結合させた。その後、ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）プレートウォッシャーを用いてウェルをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（体積／体積）で洗浄した。ＨＲＰコンジュゲートのヤギ抗ヒト二次抗体又はヤギ抗マウス二次抗体を１０μｇ／ｍＬで各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した後、各ウェルに５０μＬのＴＭＢ基質を添加し、そして室温で５分間インキュベートして比色生成物を形成した。５０μＬの０．５モルＨ２ＳＯ４をウェルに添加することにより反応を停止させ、その直後、比色生成物を検出するためにＥｎｖｉｓｉｏｎ Ｃプレートリーダーを用いて４５０ｎｍでプレートを読み取った。Ｗｉｎｄｏｗｓ用ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０１で結果をグラフで示し、単一部位結合に対する非線形回帰分析を用いて結合曲線を作成した。
３．３ 結果
ヒトＯＸ４０に関するタンパク質配列相同性ＢＬＡＳＴＰ検索により、全長ＯＸ４０配列に対して１５〜２７％のアミノ酸配列同一性を共有する１９種のヒトＴＮＦＲＳＦタンパク質又はアイソフォームを同定した。タンパク質及びその配列同一性パーセントを表３−２に列挙する。
Figure 2017532037
以上の第３．１．３節に記載のフローサイトメトリーにより、ヒトＮＧＦＲ、ＬＴβＲ、ＴＮＦＲ２、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、又はＨＶＥＭを発現する一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合を評価した。各ヒトＴＮＦＲＳＦタンパク質に特異的な市販の抗体を用いて、ヒトＮＧＦＲ、ＬＴβＲ、ＴＮＦＲ２、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、及びＨＶＥＭの細胞表面発現を確認し、各ＴＮＦＲＳＦタンパク質に対するアイソタイプ対照抗体と比較してＭＦＩの増加倍率を表３−３に示す。ヒトＮＧＦＲ、ＬＴβＲ、ＴＮＦＲ２、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、又はＨＶＥＭを発現するＨＥＫ２９３細胞へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合は、上述の細胞への二次抗体単独の結合で見られたものを実質的に超えない（表３−３、図４Ａ）。これとは対照的に、ＯＸ４０を構成的に過剰発現するジャーカット細胞系へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合は、平均ＭＦＩで蛍光色素標識二次抗体単独の結合の４８倍であった（表３−３及び図４Ｂ）。
Figure 2017532037
ＥＬＩＳＡ方式では、ＯＸ４０ｍＡｂ２４のＦａｂアームを含有するがＩｇＧ１ Ｆｃドメインが３つのアミノ酸修飾を含有する抗体（ｍＡｂ２９）の結合は、ＯＸ４０に特異的であり（図５Ａ）、組換えヒトＮＧＦＲ（ＴＮＦＲＳＦ１６）、ＬＴβＲ（ＴＮＦＲＳＦ３）、ＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１β）、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＣＤ１３７（ＴＮＦＲＳＦ９）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）、ＤＲ６（ＴＮＦＲＳＦ２１）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、ＦＡＳ（ＴＮＦＲＳＦ６）、及びＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）へのバックグラウンドを超える特異的結合を示さなかった。ＯＸ４０ｍＡｂ２４を形成するために「ヒト化」されたマウス抗ヒトＯＸ４０ＩｇＧ１モノクローナル抗体９Ｂ１２は、これらのＴＮＦＲＳＦタンパク質への結合の類似の欠如を示した（図５Ｂ）。
３．４：結論
ヒトＯＸ４０へのＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２の結合は特異的であり、関連性の高いＴＮＦＲＳＦタンパク質と交差反応しない。
実施例４：ｉｎ ｖｉｔｒｏでＯＸ４０を介して一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を共刺激するＯＸ４０ｍＡｂ２４の能力
この実施例では、プレートベースのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞増殖及びサイトカイン放出アッセイを用いて、ＣＤ３／Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）複合体を介する活性化と組み合わせてＴ細胞の活性化を増強するＯＸ４０ｍＡｂ２４の能力を評価した。ＣＤ３／ＴＣＲシグナル伝達の不在下で可溶性ＯＸ４０ｍＡｂ２４及びプレート結合ＯＸ４０ｍＡｂ２４の活性を調べたのと同様に、可溶性ＯＸ４０ｍＡｂ２４の活性も調べた。
４．１ 材料
この試験で使用した材料を表４−１に列挙する。
Figure 2017532037
４．２ アッセイ
４．２．１ ＯＸ４０ｍＡｂ２４のプレート固定化バイオ活性
プレートベースの薬剤捕捉アッセイでヒトＣＤ４＋Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生を測定することによりＯＸ４０ｍＡｂ２４のバイオ活性を決定した（図６）。
製造業者のプロトコルに従ってＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ ＣＤ４＋Ｔ細胞富化キットを用いて健常ドナー全血から富化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。４つの独立したドナーから細胞を用いてアッセイを行った。
ＣＤ４＋Ｔ細胞を完全ＲＰＭＩ培養培地中に懸濁させ、細胞濃度を１．０×１０６／ｍＬに調整した。最終濃度で２μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン−ロイコアグルチニン（ＰＨＡ−Ｌ）及び２０ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−２を添加し、そして３７℃及び５％ＣＯ２の加湿組織培養インキュベーターで細胞を２日間培養することにより、Ｔ細胞を活性化してＯＸ４０をアップレギュレートした。
２μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＦｃγ特異的ＩｇＧ及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＦｃγ特異的ＩｇＧを含む１００μＬのＰＢＳ液で非組織培養処理丸底９６ウェルアッセイプレートを被覆した。可溶性ＯＸ４０ｍＡｂ２４活性のアッセイを意図したウェルにはヤギ抗ヒトＩｇＧ捕捉抗体を添加しなかった。プレートを４℃で一晩インキュベートし、２００μＬのＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を用いて３７℃で９０分間ブロックした。プレートをＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に再構成された２ｎｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＣＤ３クローンＯＫＴ３を３７℃で９０分間にわたりプレートに添加した。プレートをＰＢＳで洗浄して未結合ＯＫＴ３を除去し、ＯＸ４０ｍＡｂ２４、Ｒ３４７ヒトＩｇＧ１対照ｍＡｂ、９Ｂ１２、及びマウスＩｇＧ１対照ｍＡｂクローンＭＯＰＣ−２１を０．９１８μｇ／ｍＬ（３．０ｎＭ）から開始して１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中にそれぞれ再構成し、そして３倍希釈系列で段階希釈し、次いでアッセイプレートに添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。
活性化一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を捕集し、完全ＲＰＭＩ培地で洗浄し、そして濃度を１．０×１０６生存細胞／ｍＬに調整した。推奨された５μＭではなく１．２５μＭのＣＦＳＥを使用して３７℃で１０分間のインキュベートした以外は製造業者の説明書に従って、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を用いて細胞を標識した。標識後、細胞を完全ＲＰＭＩ培地中に懸濁させ、濃度を０．５×１０６／ｍＬに調整した。プレートをＰＢＳで洗浄し、そして２００μＬのＣＤ４＋Ｔ細胞（１００，０００／ウェル）を各ウェルに添加した。可溶性ＯＸ４０ｍＡｂ２４を含有するウェルでは、ＯＸ４０ｍＡｂ２４をプレート結合ＯＸ４０ｍＡｂ２４に使用される最高最終濃度に完全ＲＰＭＩ培地で希釈した。３８０×ｇで遠心分離することによりプレート中の細胞をペレットにし、３７℃で３日間インキュベートした。７２時間のインキュベーション時間の後、４０μＬの細胞培養上清を取り出してサイトカイン放出測定に供した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をペレット化し、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）で１回洗浄した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を同定するための抗ヒトＣＤ４ ｅＦｌｕｏｒ４５０（登録商標）標識抗体及び生存／非生存細胞を識別するためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する結合ミックス中に細胞を懸濁させ、３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、そしてＬＳＲＩＩフローサイトメーター及びフローサイトメトリー標準（ＦＣＳ）形式データを解析するためにＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてフローサイトメトリーにより解析した。
Ｔ細胞増殖を解析するために、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて生存（ＰＩ陰性）イベントをゲート処理し、ＣＦＳＥの希釈を示すＣＤ４ゲート処理細胞のパーセントを、増殖を起こしている細胞のパーセントの尺度として決定した。
サイトカイン放出を解析するために、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）製の１０プレックスヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン解析キットを用いて製造業者のプロトコルに従って、培養の７２時間後に得られた細胞培養上清をサイトカイン含有率に関して測定した。このキットは、次のヒトサイトカイン、すなわち、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、及びＩＬ−１βを定量的に測定する電気化学的検出方法を利用する。
Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ，ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）を用いて増殖値又はサイトカイン放出値のいずれかに対してｍＡｂ濃度の対数をプロットした。ＯＸ４０ｍＡｂ２４バイオ活性で２０％、５０％、及び９０％最大効果（ＥＣ２０、ＥＣ５０、及びＥＣ９０）値を生じる有効濃度を、ＥＣＡｎｙｔｈｉｎｇ機能を用いて用量−反応シグモイドバイオ活性曲線から計算した。
４．３ 結果
４つのドナーのそれぞれからの増殖データ及び１つのドナーからのサイトカイン放出データを図７Ａ〜Ｃ及び図８Ａ〜Ｅに示し、ヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖のＥＣ２０、ＥＣ５０、及びＥＣ９０の効力値を表４−２に示し、ヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞サイトカイン放出アッセイの効力値を表４−３〜表４−７に示し、ＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２の平均増殖値及びサイトカイン放出値を表４−８及び表４−９に示す。
ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、濃度依存的に一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（ｎ＝４）の増殖を共刺激し、ＥＣ２０、ＥＣ５０、及びＥＣ９０値は、それぞれ、２１、２８、及び７２ｐＭであった。９Ｂ１２は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を共刺激し、ＥＣ２０、ＥＣ５０、及びＥＣ９０値は、１０６、２１８、及び６２２ｐＭであった。従って、最大増殖反応の５０％を誘導するのに必要な９Ｂ１２濃度とＯＸ４０ｍＡｂ２４濃度との比は８〜１であった（表４−２）。
ＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２は、一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を共刺激してサイトカインを放出する（ｎ＝４）。平均のＥＣ２０、ＥＣ５０、及びＥＣ９０値は、増殖値よりも効力が低かった。これらは、表４−８及び表４−９にまとめられている。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、及びＩＬ−１βアッセイ結果では、用量−反応シグモイド曲線が不十分に作成されたか又は存在しなかったので、両方のｍＡｂで非線形回帰分析を行なうことができなかった。
Figure 2017532037
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非プレート結合可溶性ＯＸ４０ｍＡｂ２４の活性を決定した。可溶性ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞増殖（図７Ａ〜Ｃ）又はサイトカイン放出（図８Ａ〜Ｅ）のいずれについても、抗ＣＤ３抗体単独で又はＲ３４７ヒトＩｇＧ１対照ｍＡｂの存在下で観測されるレベルを超えて誘導することはなかった。プレート結合抗ＣＤ３抗体単独では、最小レベル〜中レベルの増殖及びサイトカイン放出を生じた。ここで可溶性ＯＸ４０ｍＡｂ２４により示された活性の欠如は、ＯＸ４０媒介ＮＦκＢシグナル伝達を測定した２細胞バイオ活性アッセイで細胞ベースの架橋を伴わない可溶性ＯＸ４０ｍＡｂ２４で観測された活性の不在と一致する（以下の実施例５を参照のこと）。
同様に、ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、プレート表面上に固定されたものでも可溶性未結合タンパク質として添加されたものでも、サブマイトジェニック抗ＣＤ３抗体シグナルの不在下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖（図７Ａ〜Ｃ）もサイトカイン放出（図８Ａ〜Ｅ）もほとんど又はまったく誘導しなかった。これらの結果から、この試験では、ＯＸ４０ｍＡｂ２４は同時ＣＤ３／ＴＣＲライゲーションの不在下で一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞で活性を有していないことが示された。
４．４ 結論
ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、ヒト化に用いられた抗体９Ｂ１２と同じように濃度依存的に一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖及びサイトカイン放出を誘導した（図８Ａ〜Ｅ及び図９Ａ〜Ｅ）。ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、プレート結合タンパク質として活性を示したが、可溶性タンパク質として活性を示さなかった。さらに、ＯＸ４０ｍＡｂ２４活性は、ＣＤ３／ＴＣＲシグナル伝達と同時に生じた。
実施例５：ジャーカットＮＦκＢルシフェラーゼレポーターＴ細胞を用いた２細胞ベースのバイオ活性アッセイでのＯＸ４０ｍＡｂ２４のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の決定
この実施例では、ヒトＯＸ４０を介してシグナル伝達するＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２の能力を一セットの２細胞レポーターバイオ活性アッセイにより評価した。ＯＸ４０共刺激を介するＴ細胞活性化の測定は、ＮＦκＢシグナル伝達経路の刺激に反応してルシフェラーゼを生成するＯＸ４０過剰発現ジャーカットＮＦκＢルシフェラーゼＴ細胞レポーター系を用いて達成された（図１０）。ＮＦκＢシグナル伝達は、ＯＸ４０エンゲージメントの下流に行われることが報告されており、増殖やサイトカイン放出などのＴ細胞活性化の他の尺度と相関し得る（Ｃｒｏｆｔ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２２９：１７３−９１（２００９））。細胞溶解物にルシフェラーゼ基質を添加して反応生成物により発せられる光をルミノメーターにより測定することにより、ルシフェラーゼの量つまりＴ細胞活性化を測定した。様々なＦｃγレセプター補体を発現するように工学操作された細胞を用いて架橋されたＯＸ４０ｍＡｂ２４、さらには可溶性非ＦｃγＲ架橋ＯＸ４０ｍＡｂ２４のバイオ活性を測定した。
５．１ 材料
この試験で使用した材料を表５−１に列挙する。
Figure 2017532037
５．２ ２細胞バイオ活性アッセイ
５．２．１ 一次ヒトＣＤ４５＋細胞の単離
一次ヒトＣＤ４５＋細胞をヒト腫瘍から単離した。腫瘍サンプルを輸送媒体から取り出し、無菌ペトリ皿に配置した。ハンク緩衝塩溶液を添加し、目視可能な壊死組織又はなんらかの正常組織を腫瘍サンプルから切除した。組織を小片（約１ｍｍ）にミンスし、５０ｍＬコニカルチューブに配置し、コラゲナーゼＩＩＩ酵素ミックス（２５０ＩＵ／ｍＬコラゲナーゼＩＩＩ、３ｍＭ ＣａＣｌ２、３１５μｇ／ｍＬ ＤＮＡアーゼ１）を添加し、混合し、そしてインキュベートした。消化サンプルを７０ミクロンフィルターに通して濾過し、ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄した。解離細胞をペレット化し、ＶｉＣｅｌｌカウンターを用いて細胞数及び生存能は決定した。細胞をＣＤ４５マイクロビーズと共にＭＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、そして氷上でインキュベートした。細胞を洗浄し、ＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＬＳカラムを用いたＣＤ４５＋細胞のポジティブ選択に供した。マグネットからカラムを取り出してＭＡＣＳ緩衝液をカラムに添加することにより、ビーズ結合ＣＤ４５＋細胞を溶出させた。細胞をペレット化し、完全ＲＰＭＩ培地中に再懸濁させ、そして以上に記載のバイオ活性アッセイで使用した。
５．２．２ アッセイプロトコル
２細胞バイオ活性アッセイを用いてＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２のバイオ活性を試験した。ヒトＯＸ４０過剰発現ジャーカットＮＦκＢルシフェラーゼレポータークローン６４（ＯＸ４０ジャーカットレポーター）を用いてＯＸ４０アゴニズム（ＮＦκＢ活性）を測定した。第２のＦｃγＲ発現細胞系を用いてＯＸ４０ｍＡｂ２４架橋を媒介した。この架橋は、ＯＸ４０ジャーカットレポーター細胞上のＯＸ４０をクラスター化及び活性化する（図１０）。架橋に使用したＦｃγＲ発現細胞系は、ＲａｊｉヒトＢ細胞リンパ腫系、ＣＤ３２Ａ発現ＨＥＫ２９３、ＣＤ３２Ｂ発現ＨＥＫ２９３、又は一次ヒト腫瘍から単離されたＣＤ４５＋免疫細胞を含んでいた。
ＯＸ４０ｍＡｂ２４の可溶分活性を決定するために、親ＨＥＫ２９３細胞（これはＦｃγＲヌルであるのでＯＸ４０ｍＡｂ２４を架橋できない）を用いて、又は共存する架橋細胞の不在下で、バイオ活性アッセイを行った。
使用前、ＯＸ４０ジャーカットレポーター細胞を０．５〜１．５×１０６／ｍＬの密度で組織培養インキュベーター内の完全ＲＰＭＩ培地中で培養した。バイオアッセイの前日、１０６細胞／ｍＬの最終密度で細胞を継代した。
ＯＸ４０ジャーカットレポーター細胞、ＦｃγＲ発現細胞系、又はＨＥＫ親細胞を捕集してペレット化した。一次ヒト腫瘍からＣＤ４５＋細胞及び正常近接組織を単離するために、組織を解離させ、ＣＤ４５＋細胞を単離し、以下に記載されるようにバイオ活性アッセイの使用に供した。
ＯＸ４０ｍＡｂ２４、９Ｂ１２、及び種々の対照抗体を完全ＲＰＭＩ培地で３倍段階希釈した。
ＯＸ４０ジャーカットレポーター細胞＋ＦｃγＲ発現細胞又はＨＥＫ親細胞を１００，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに添加した。ＯＸ４０ｍＡｂ２４、９Ｂ１２、又は対照抗体を１０μｇ／ｍＬの開始濃度で希釈系列で細胞に添加し、組織培養インキュベーター内で３７℃でインキュベートした。
１６〜２４時間のインキュベーション時間後、１００μＬの再構成Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を各ウェルに添加し、混合して細胞を溶解させ、次いでインキュベートしてルシフェラーゼシグナルを平衡化させた。Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ／ｓａｍｐｌｅライセート（１５０μＬ）を各ウェルから９６ウェル白色壁アッセイプレートに導入し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎルミネセンスリーダーを用いてルミネセンスを読み取った。
Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、ルミネセンスＲＬＵ（ｙ軸）に対してＯＸ４０ｍＡｂ２４、９Ｂ１２、Ｒ３４７ヒトＩｇＧ１、マウスＩｇＧ１クローンＭＯＰＣ−２１の濃度（ｘ軸はタンパク質濃度のｌｏｇ１０である）をプロットした。用量−反応シグモイド（変動傾き）バイオ活性曲線からｆ＝２０、ｆ＝５０、及びｆ＝９０でＥＣＡｎｙｔｈｉｎｇ（ＥＣｆ）を用いて、バイオ活性のＥＣ２０、ＥＣ５０、及びＥＣ９０値を決定した。
５．３ ２細胞バイオ活性アッセイの結果
ＯＸ４０ｍＡｂ２４及び対照抗体のバイオ活性の結果を図１１Ａ〜Ｄ、図１２Ａ〜Ｄ、及び表５−２に示す。
ＦｃγＲ発現細胞系（例えば、一次ヒト腫瘍から単離されたＣＤ３２Ａ発現ＨＥＫ２９３、ＣＤ３２Ｂ発現ＨＥＫ２９３、ＲａｊｉＢ細胞、又はＣＤ４５＋細胞）の存在下で、ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、ＮＦκＢ経路活性化により測定されるようにＯＸ４０過剰発現ジャーカットＮＦκＢレポーター細胞の強力な刺激を示した。第２の細胞型の不在下で又は外因的発現ＦｃγＲｓの欠如したＨＥＫ２９３細胞の存在下で、ＯＸ４０ｍＡｂ２４は最小のレポーター活性を呈した（図１１Ａ〜Ｄ）。
２細胞バイオアッセイでの効力値（ＥＣ２０、ＥＣ５０、及びＥＣ９０）を表５−２にまとめる。すべてのアッセイにわたる平均のＥＣ２０、ＥＣ５０、及びＥＣ９０値は、それぞれ、２２８、７５１、及び５６３０ｐＭであった。
９Ｂ１２及び対照抗体のバイオ活性の結果を図１２Ａ〜Ｄに示し、効力値を表５−３にまとめる。すべてのアッセイの平均のＥＣ２０、ＥＣ５０、及びＥＣ９０値は、それぞれ、５１９、２５３０、及び４１１００ｐＭであった。従って、９Ｂ１２の２細胞バイオ活性（ＥＣ５０）とＯＸ４０ｍＡｂ２４の２細胞バイオ活性（ＥＣ５０）との比は３．４〜１であると計算された。
Figure 2017532037
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５−４：結論
ＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２は、ＯＸ４０過剰発現ジャーカットＮＦκＢルシフェラーゼレポーター細胞系でＦκＢ経路の刺激により測定したときにヒトＴ細胞の活性化を媒介する。ＯＸ４０ｍＡｂ２４のＦｃドメインを介して架橋可能なＦｃγＲｓを発現する細胞の不在下では、最小のレポーター細胞系活性が測定された。しかしながら、ｍＡｂを架橋可能なＦｃγＲを発現する細胞と、Ｔ細胞活性化のリードアウトのためのジャーカット過剰発現ＮＦκＢルシフェラーゼレポーター系と、を含む２細胞システムでは、ＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２は、それぞれ、７５１ｐＭ及び２５３０ｐＭの平均ＥＣ５０値で強力なＯＸ４０活性化を媒介した。従って、２細胞アッセイシステムでのＯＸ４０ｍＡｂ２４のバイオ活性は、９Ｂ１２に類似していた。
実施例６：惹起エフェクター機能に対するＯＸ４０ｍＡｂ２４の能力
この実施例では、Ｆｃエフェクター機能を惹起するＯＸ４０ｍＡｂ２４の能力、すなわち、高レベルのＯＸ４０を発現する一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対してヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を惹起するＯＸ４０ｍＡｂ２４の能力、又は補体古典経路による補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の前提条件としてＣ１ｑに結合するＯＸ４０ｍＡｂ２４の能力に関して、評価した。ヒトＩｇＧ４Ｐ Ｆｃドメインを含有するＯＸ４０ｍＡｂ２４の形態（ｍＡｂ２８）又はＩｇＧ１ ＦｃドメインにＦｃγＲＩＩＩａ結合を低減する三重突然変異を含有するＯＸ４０ｍＡｂ２４の形態（ｍＡｂ２９）を利用して、ＡＤＣＣ活性を媒介するＯＸ４０ｍＡｂ２４ ＩｇＧ１ Ｆｃドメインの寄与を評価した。また、ＯＸ４０ｍＡｂ２４のエフェクター機能と、ＯＸ４０ｍＡｂ２４を形成するためにヒト化されたマウス抗ヒトＯＸ４０ ＩｇＧ１モノクローナル抗体９Ｂ１２と、を比較した。抗ＣＤ２０抗体リツキシマブは、ＣＤ２０を発現するＢ細胞に結合するので、陽性対照としてＡＤＣＣ実験に使用した。一次活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ２０を発現しないので、ＡＤＣＣアッセイシステムで使用されるＮＫ細胞の活性を検証するために、ＣＤ２０を発現するＴｏｌｅｄｏ Ｂ細胞系を用いた独立したアッセイを行った。
６．１ 材料
この試験で使用した材料を表７−１に列挙する。
Figure 2017532037
６．２ アッセイ
６．２．１ 抗体依存性細胞傷害性
エフェクターとして富化一次ヒトＮＫ細胞及び標的としてＯＸ４０発現一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて、９Ｂ１２と対比して及びＩｇＧ４Ｐ Ｆｃドメイン又は三重突然変異体（ＴＭ）ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインのいずれかと共にＯＸ４０ｍＡｂ２４のＦａｂアームを含有するモノクローナル抗体と対比して、ＯＸ４０ｍＡｂ２４のＡＤＣＣ活性を試験した。陽性対照として、Ｔｏｌｅｄｏ Ｂ細胞系のリツキシマブ指向性死滅を用いて各ＮＫ細胞調製物の活性を試験した。
一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を単離するために、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｂｌｏｏｄ Ｄｏｎｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍを介して健常ドナーから得られたヘパリン抗凝固処理全血を次のプロトコルに従って処理した。２０ｍＬの全血に対してＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ ＣＤ４Ｔ細胞単離キット抗体ミックス（１ｍＬ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ Ｃａｎａｄａ）を添加し、混合し、室温（ＲＴ）で２０分間（ｍｍ）インキュベートした。血液を無菌室温ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２ ＋ ２％熱不活性化新生仔ウシ血清）で１：１希釈し、ＤＭ−Ｌ培地上に層状化し、続いて２０分間遠心分離した。遠心分離後、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を含有するバフィーコートを取り出し、細胞をＲＴ ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、さらにＲＴ完全ＲＰＭＩ培地で１回洗浄した。ＶｉＣｅｌｌカウンターにより細胞をカウントして細胞数及び生存能を決定し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を１．０×１０６／ｍＬの濃度で完全ＲＰＭＩ培地中に懸濁させた。
３７℃及び５％ＣＯ２の加湿組織培養インキュベーター内で２μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌ及び２０ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２と共に一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（完全ＲＰＭＩ培地中１．０×１０６／ｍＬ）を４８時間培養することによりＴ細胞を活性化してＯＸ４０をアップレギュレートし、続いて、ＯＸ４０ｍＡｂ２４ ＡＤＣＣアッセイに使用した。以下で参照される図中のドナーはすべて、ユニークな個体を表す。すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、繰返しＡＤＣＣ実験のために同一のドナーから単離されたものではない。
細胞傷害性アッセイで標的Ｔ細胞又は培養Ｔｏｌｅｄｏ Ｂ細胞と精製ヒトＮＫ細胞とを識別するために、Ｖｙｂｒａｎｔ ＤｉＯ細胞標識溶液を用いて蛍光色素ＤｉＯを標的細胞の細胞膜に組み込んだ（サスペンジョン細胞標識のための製造業者のプロトコルに従って）。１ｍＬのＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット抗体ミックスの代わりに１ｍＬのＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ ＮＫ細胞単離キット抗体ミックスを使用した以外は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のための以上と同一のプロトコルを用いて、一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及びＴｏｌｅｄｏ Ｂ細胞の活性化及びＤｉＯ標識化の後、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｂｌｏｏｄ Ｄｏｎｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍからのヘパリンナトリウム抗凝固処理血液からエフェクターＮＫ細胞を単離した。単離された一次ヒトＮＫ細胞を暖かいＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ＋ＲＰＭＩ−１６４０）で２回洗浄し、次いで、２．６７×１０６／ｍＬの濃度で完全ＲＰＭＩ中に懸濁させた。同様に、活性化一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を暖かい完全ＲＰＭＩで２回洗浄し、２．６７×１０５／ｍＬの濃度で懸濁させた。その後、７５μＬの一次ヒトＮＫ細胞（２００，０００）及び７５μＬの活性化一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（２０，０００）を無菌非組織培養処理丸底９６ウェルプレートのウェルにエフェクターと標的との比を１０：１として添加した。いくつかの実験では、１０μｇ／ｍＬの最終濃度を与えるように、ＯＸ４０ｍＡｂ２４又は対照ｍＡｂを含有する完全ＲＰＭＩ培地（５０μＬ）を添加した。他の実験では、６７ｎＭの最終濃度が得られるようにＯＸ４０ｍＡｂ２４若しくは対照ｍＡｂの３倍希釈系列を含有する完全ＲＰＭＩ（５０μＬ）、又は６７ｎＭから出発して９Ｂ１２若しくはＲ３４７ヒトＩｇＧ１の２７倍希釈系列を含有する完全ＲＰＭＩ（５０μＬ）を、プレーティングされた細胞に添加した。活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ２０を発現しないので、ＯＸ４０発現活性化一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の代わりにＤｉＯ標識ＣＤ２０発現Ｔｏｌｅｄｏ Ｂ細胞を含有するウェルで、リツキシマブ（１０μｇ／ｍＬ、対照抗体）を陽性対照として使用した。ＲＴで遠心分離することによりＡＤＣＣアッセイの細胞を穏やかにペレット化し、続いて２４時間にわたり培養した。
インキュベーション時間の終了時、遠心分離により細胞をペレット化し、１０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＴ）を含有するＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させてＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーターによるフローサイトメトリー解析に供した。蛍光補償後、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＤｉＯ陽性標的ＣＤ４＋Ｔ細胞のうち非生存（ＰＴ陽性）細胞又はＴｏｌｅｄｏ Ｂ細胞を識別した。
平均値及び平均値の標準誤差の決定を含めてＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイのデータのグラフ図は、Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０１を用いて作成した。
６．２．２ Ｃ１ｑに結合するＯＸ４０ｍＡｂ２４
ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置を用いて表面プラズモン共鳴により、ＯＸ４０ｍＡｂ２４又は９Ｂ１２に対してプールヒト血清から精製されたヒト補体タンパク質Ｃ１ｑへのＯＸ４０ｍＡｂ２４又は９Ｂ１２の結合を決定した。標準的なアミンカップリングを用いてＧＬＣバイオセンサーチップの表面にＯＸ４０ｍＡｂ２４又は９Ｂ１２を固定した。ヒトＣ１ｑを２６ｎＭ〜１．６ｎＭの範囲内の５つの濃度でＰＢＳ／０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４中に懸濁させた。サンプルを３０μＬ／ｍｉｎで２００秒間注入し、続いて６００秒間の解離段階を設けた。１：１フィッティングを用いてＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ２．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によりセンサーグラムデータを処理した。
６．３ 結果
ＮＫ細胞及びＯＸ４０発現標的細胞の同種異系及び自己由来の両方の混合物を用いて、ＯＸ４０結合の飽和しレベル（１０μｇ／ｍＬ［６７ｎＭ］）（実施例２参照）で、ＡＤＣＣを媒介するＯＸ４０ｍＡｂ２４、９Ｂ１２、並びにＯＸ４０ｍＡｂ２４のヒトＩｇＧ４Ｐ型（ｍＡｂ２８）及びＩｇＧ１−ＴＭ型（ｍＡｂ２９）の能力を試験した（図１３Ａ及び図１４Ａ）。ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対する測定可能なＡＤＣＣ活性を示した。これとは対照的に、９Ｂ１２、ｍＡｂ２８、及びｍＡｂ２９は、陰性対照のＡＤＣＣ活性を超える活性を示さなかった。ヒトＣＤ２０に対する陽性対照抗体（リツキシマブ）は、同一のＮＫ細胞を用いてＡＤＣＣ活性を示したことから、ＮＫ細胞はすべて、ロバストなＡＤＣＣ活性が可能であることが示される（図１３Ｂ及び図１４Ｂ）。
用量−反応実験では、ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対する濃度依存性ＡＤＣＣ活性を示した（図１５Ａ〜Ｄ、図１６Ａ〜Ｄ、図１７Ａ〜Ｂ及び表６−２）。これとは対照的に、９Ｂ１２は、なんら検出可能なＡＤＣＣ活性を示さなかった。そのほかに、Ｒ３４７ヒトＩｇＧ１対照ｍＡｂは、なんら検出可能なＡＤＣＣ活性を示さなかったことから、ＯＸ４０ｍＡｂ２４により媒介されるＡＤＣＣ活性は、標的細胞上のＯＸ４０とのエンゲージメントに依存することが確認される。ヒトＣＤ２０に対する陽性対照抗体もまた、ＣＤ２０発現Ｂ細胞リンパ腫細胞系に対するＡＤＣＣを示した（図１３Ｂと図１４Ｂ）、これはアッセイの妥当性を支持する。まとめると、これらの実験の結果から、ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、細胞表面ＯＸ４０の発現を刺激することがすでに示されている条件下で培養された標的細胞に対するＡＤＣＣが可能であることが確認された。
Figure 2017532037
ヒト補体成分Ｃ１ｑに結合するＯＸ４０ｍＡｂ２４の可能性を表面プラズモン共鳴アッセイを用いて評価した。このアッセイでは、Ｃｌｑへの結合を補体依存性細胞傷害性アッセイの活性のサロゲートとして使用した（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １７７：１１２９−１１３８（２００６））。９Ｂ１２は陰性対照抗体として使用した。ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、精製ヒトＣｌｑタンパク質への濃度依存性結合能を示した（図１８Ａ）。これとは対照的に、９Ｂ１２は、Ｃ１ｑタンパク質への検出可能な結合をなんら示さなかった（図１８Ｂ）。
６．４ 結論
ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、Ｃ１ｑに結合し、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＮＫ媒介ＡＤＣＣを惹起する。
実施例７：ＯＸ４０ｍＡｂ２４並びにカニクイザル細胞及びアカゲザルＴ細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ比較試験
この実施例では、カニクイザル（ｃｙｎｏ）／アカゲザルＯＸ４０を発現するジャーカットＮＦκＢルシフェラーゼＴ細胞レポーター系を含む２細胞レポーターバイオ活性アッセイを用いて、Ｔ細胞の活性化を増強するＯＸ４０ｍＡｂ２４の能力を調べた。Ｆｃγレセプター媒介薬剤架橋は、アカゲザルＢ細胞系又は赤血球溶解後全血サンプル中のアカゲザルＦｃγレセプター発現細胞により媒介された。ＯＸ４０活性化は、一次ヒトＴ細胞活性化の下流のＮＦκＢシグナル伝達経路の刺激に反応して増加するルシフェラーゼ活性として測定した。ＮＦκＢシグナル伝達は、十分に研究されているＯＸ４０シグナル伝達の下流イベントであり、増殖やサイトカイン放出などのＴ細胞活性化の他の尺度と相関がある（Ｃｒｏｆｔ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２２９：１７３−９１（２００９））。そのほかに、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖が評価されるプレートベースのバイオ活性アッセイを用いて、アカゲザルＴ細胞のＴ細胞レセプター媒介活性化（共刺激）を増強するＯＸ４０ｍＡｂ２４の能力を試験した。アイソタイプ対照（ＮＩＰ２２８ ＩｇＧ１）を用いて特異的ＯＸ４０エンゲージメントを示した。
併行して、非ヒト霊長動物ＯＸ４０に対するＯＸ４０ｍＡｂ２４及び９Ｂ１２の活性の比較を行うために、ＯＸ４０ｍＡｂ２４の由来源のネズミ抗ＯＸ４０モノクローナル抗体９Ｂ１２のバイオ活性を測定した。
７．１ 材料
この試験で使用した材料を表７．１に列挙する。
Figure 2017532037
７．２ アッセイ
７．２．１ カニクイザル／アカゲザル２細胞バイオ活性アッセイ
２細胞レポーターアッセイを用いてＯＸ４０ｍＡｂ２４をバイオ活性に関して試験した。カニクイザル及びアカゲザルは同一のＯＸ４０アミノ酸配列を共有するので、ＯＸ４０アゴニズム（ＮＦκＢ活性）のリードアウト用としてカニクイザル／アカゲザルＯＸ４０発現ジャーカットＮＦκＢルシフェラーゼレポーター細胞系（クローンＢ２）を使用した。ジャーカットレポーター細胞上のＯＸ４０ｍＡｂ２４架橋つまりＯＸ４０クラスタリングを媒介するために、ＦｃγＲ発現細胞を含有する正常アカゲザルの全血に由来するＦｃγレセプター発現アカゲザルＢ細胞系、ＬＣＬ８６６４、又は白血球を使用した。ＯＸ４０ｍＡｂ２４を添加しない場合さらにはＦｃγＲ発現細胞の不在下の場合の両方でバックグラウンドバイオ活性を評価した。レポーター細胞上のＯＸ４０エンゲージメントの役割を示すために、ＯＸ４０ｍＡｂ２４の代わりにアイソタイプ対照を使用した。
次のプロトコルに従ってＬＣＬ８６６４を用いたＯＸ４０ｍＡｂ２４ ２細胞バイオ活性アッセイを行った。
使用前日、カニクイザル／アカゲザルＯＸ４０発現ジャーカットＮＦκＢルシフェラーゼレポータークローンＢ２及びＬＣＬ８６６４を完全ＲＰＭＩ培地（１０％ウシ胎仔血清［ＦＢＳ］及び１％抗生物質／抗真菌剤を有するＲＰＭＩ）中で培養し、それぞれ、約５×１０６細胞／ｍＬ及び４×１０５細胞／ｍＬの細胞密度を達成した。翌日、ＯＸ４０ジャーカットレポーター細胞及びＬＣＬ８６６４をペレット化し、完全培地中に懸濁させ、ＶｉＣｅｌｌカウンターを用いてカウントし、その後、両方の細胞系の細胞濃度を完全培地で２．５×１０６に調整した。
クローンＢ２及びＬＣＬ８６６４細胞を１００，０００細胞／ウェルで９６ウェル丸底非組織培養処理プレートに添加した。３０μｇ／ｍＬから開始して最終濃度まで３倍増分希釈で、ＯＸ４０ｍＡｂ２４を完全ＲＰＭＩ培地中の細胞に添加した。同様に、Ｒ３４７ＩｇＧ１（アイソタイプ対照）を１０μｇ／ｍＬの最終濃度で６倍増分希釈で使用した。同様にして、９Ｂ１２及びＭＯＰＣ−２１（アイソタイプ対照）を希釈した。プレートを加湿５％ＣＯ２雰囲気の３７℃のインキュベーターに導入した。
１６時間のインキュベート時間の後、１００μＬの再構成Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ溶液を各ウェルに添加し、混合して細胞を溶解させ、次いでインキュベートしてルシフェラーゼシグナルを平衡化させた。Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ／ｓａｍｐｌｅライセート（１５０μＬ）を各ウェルから９６ウェル白色壁アッセイプレートに導入し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎルミネセンスリーダーを用いてルミネセンスを読み取った。
次のプロトコルを用いて、健常インド起源アカゲザルから得られたヘパリンナトリウム抗凝固処理全血からＲＢＣ溶解アカゲザル細胞を取得した。
新鮮全血（５ｍＬ）を５０ｍＬコニカルチューブに添加し、４５ｍＬの塩化アンモニウム溶液を添加した。細胞混合物を氷上で１０分間インキュベートし、次いで、ペレット化し、完全ＲＰＭＩ培地で洗浄し、その後、細胞は２細胞バイオ活性アッセイに使用できる状態であった。
ＬＣＬ８６６４アカゲザルＢ細胞系で記載したように、アカゲザルＲＢＣ溶解全血細胞を用いた２細胞バイオ活性アッセイを行ったが、陰性対照抗体として１０μｇ／ｍＬのＮＩＰ２２８ＩｇＧ１を使用した。
７．２．２ アカゲザルＣＤ４ Ｔ細胞増殖アッセイ
次のプロトコルに従って、活性化一次アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞及びプレート捕捉薬剤を用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖アッセイでＯＸ４０ｍＡｂ２４のバイオ活性を決定した。世界的霊長動物の健常アカゲザル（ｎ＝２）から得られたヘパリンナトリウム抗凝固処理全血から単離されたアカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞を反応細胞源として使用した。
新鮮ヘパリン処理アカゲザル血液を室温（ＲＴ）でＰＢＳで希釈１：１した。次いで、２０ｍＬの希釈全血を５０ｍＬコニカル遠心チューブ中の１５ｍＬの９５％リンパ球分離培地（ＬＳＭ）上に重畳した。無制動、室温、４００×ｇで血液を３０分間遠心分離した。末梢血単核細胞をインターフェースで捕集し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、そしてペレット化した。細胞ペレットを赤血球溶解緩衝液で５分間処理し、完全ＲＰＭＩ培地を添加して溶解緩衝液を不活性化した。細胞を洗浄し、ＭＡＣＳ緩衝液中に懸濁させ、そしてＶｉＣｅｌｌカウンターでカウントして細胞数及び生存能を決定した。
製造業者の取扱い説明書に従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ非ヒト霊長動物キットを用いてアカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。次いで、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＶｉＣｅｌｌカウンターでカウントし、５１μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡ及び１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む完全ＲＰＭＩ培地中に１×１０６細胞／ｍＬで懸濁させ、３７℃及び５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で２日間培養することにより、Ｔ細胞を活性化してＯＸ４０発現を誘導した。２μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＦｃγ特異的ＩｇＧ及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＦｃγ特異的ＩｇＧを含む１００μＬのＰＢＳ液で非組織培養処理丸底９６ウェルアッセイプレートを被覆した。可溶性ＯＸ４０ｍＡｂ２４活性のアッセイを意図したウェルにはヤギ抗ヒトＩｇＧ捕捉抗体を添加しなかった。プレートを４℃で一晩インキュベートし、２００μＬのＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を用いて３７℃で９０分間ブロックした。プレートをＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に再構成した２ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（クローンＳＰ３４−２）を３７℃で９０分間にわたりプレートに添加した。プレートをＰＢＳで洗浄して未結合分を除去し、ＯＸ４０ｍＡｂ２４、Ｒ３４７ヒトＩｇＧ１対照ｍＡｂ、９Ｂ１２、及びマウスＩｇＧ１対照ｍＡｂ（クローンＭＯＰＣ−２１）をそれぞれ１．０１μｇ／ｍＬ（６．６７ｎＭ、実験１）又は１．５μｇ／ｍＬ（１０．０ｎＭ、実験２）から開始して３倍希釈系列で段階希釈して１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に再構成し、次いで、アッセイプレートに添加された、そして３７℃で９０分間インキュベートした。
活性化一次アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞を捕集し、完全ＲＰＭＩ培地で洗浄し、そして濃度を１．０×１０６生存細胞／ｍＬに調整した。推奨の５μＭの代わりに１．２５μＭのＣＦＳＥを用いて３７℃で１０分間のインキュベーションを行った以外は製造業者の説明書に従ってカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で細胞を標識した。標識後、細胞を完全ＲＰＭＩ中に懸濁させ、濃度を１．０×１０６／ｍＬに調整した。プレートをＰＢＳで洗浄し、２００μＬのＣＤ４＋Ｔ細胞（２００，０００／ウェル）を各ウェルに添加した。次いで、プレートを３７℃で３日間インキュベートした。
７２時間のインキュベーション時間の後、ＣＤ４＋Ｔ細胞をペレット化し、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）で１回洗浄した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を同定するための抗ＣＤ４ Ｖ４５０Ｒ標識抗体と生存／非生存細胞の識別のためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とを含有する結合ミックス中に細胞を懸濁させ、３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、そしてＬＳＲＩＩフローサイトメーター及びフローサイトメトリー標準（ＦＣＳ）形式データを解析するためにＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてフローサイトメトリーにより解析した。
一次アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて２つの独立した実験でアッセイを繰り返した。
細胞増殖を評価するために、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて生存イベント（ヨウ化プロピジウム陰性）をゲート処理し、ＣＦＳＥの希釈を示すＣＤ４＋ゲート処理細胞のパーセントを決定した。抗ＣＤ３抗体＋ＯＸ４０ｍＡｂ２４に反応してＣＳＦＥの希釈を示すＣＤ４＋ゲート処理細胞のパーセントから抗ＣＤ３単独に反応してＣＦＳＥの希釈を示すＣＤ４＋ゲート処理細胞のパーセントを減算することにより、ＯＸ４０ｍＡｂ２４の比活性を計算した。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、バージョン５．０１（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で非線形回帰分析（ｌｏｇ用量−反応、４パラメーターフィッティング曲線）を用いて、ジャーカットＮＦκＢレポーターアッセイ及び一次アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイで半値（ＥＣ５０）反応を達成したＯＸ４０ｍＡｂ２４の濃度を決定した。
７．３ 結果
７．３．１ カニクイザル／アカゲザル２細胞バイオ活性アッセイ
カニクイザル／アカゲザル２細胞バイオ活性アッセイの結果を表７−２、図１９Ａ〜Ｂ、図２０Ａ〜Ｂ及び図２１Ａ〜Ｂに示す。ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、１４５０ｐＭの平均ＥＣ５０（ｎ＝２実験）を有して、アカゲザルＢ細胞系ＬＣＬ８６６４の存在下でカニクイザル／アカゲザルＯＸ４０発現ジャーカットＴ細胞でＮＦκＢシグナル伝達により測定されるようにＯＸ４０シグナル伝達経路を活性化した。表７−２に示されるように、カニクイザル／アカゲザル２細胞アッセイでのＯＸ４０ｍＡｂ２４活性のＥＣ５０値は、Ｒａｊｉ Ｂ細胞系を用いたヒト２細胞アッセイでの値の１．３倍であり、一方、９Ｂ１２は、カニクイザル／アカゲザル２細胞アッセイで限られた活性を有し、ＥＣ５０値を決定できなかった。
そのほかに、表７−２に示されるように、ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、５５０ｐＭのＥＣ５０（ｎ＝１実験）を有して、Ｆｃγレセプター発現細胞を含有すると予想されるアカゲザルＲＢＣ溶解全血の存在下でジャーカットＴ細胞でＯＸ４０シグナル伝達経路を活性化した。同様に表７−２に示されるように、同一のアッセイで９Ｂ１２のＥＣ５０値は６０５２ｐＭであり、Ｒａｊｉ Ｂ細胞系を用いたヒト２細胞アッセイで４６８０ｐＭであった。
Figure 2017532037
７．３．２ アカゲザル一次Ｃ細胞増殖アッセイ
アカゲザル一次Ｔ細胞増殖アッセイの結果を表７−３、表７−４、及び図２２Ａ〜Ｄに示す。ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、４３６ｐＭの平均ＥＣ５０を有して一次アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導した（表７−３、ｎ＝２実験）。表７−５に示されるように、９Ｂ１２のＥＣ５０値は１１０ｐＭであった（表７−４、ｎ＝２実験）。ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、類似のアッセイ方式で２８ｐＭの平均ＥＣ５０を有して活性化一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導した（（表７−５、実施例４のデータ）。
Figure 2017532037
Figure 2017532037
Figure 2017532037
７．４ 結論
ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、アカゲザルＢ細胞又はＲＢＣ溶解アカゲザル全血内に含有されるＦｃγレセプター発現細胞の存在下でカニクイザル／アカゲザルＯＸ４０発現ジャーカットＴ細胞ＮＦκＢレポーター細胞系でＯＸ４０シグナル伝達経路を活性化した。そのほかに、ＯＸ４０ｍＡｂ２４は一次アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導した。
実施例８：ヒト癌のマウスモデルにおけるＯＸ４０ｍＡｂ２４の活性
この実施例は、ＯＸ４０ｍＡｂ２４が癌を治療するための単一作用剤療法として有効であるかを決定するために設計された。この試験は、免疫無防備非肥満糖尿病／重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスにおいてアロ反応性ヒトＴ細胞と混合されたヒト癌の異種移植モデルで行われた。
８．１ 材料
この試験で使用した材料及びそれらの供給元を表８−１に列挙する。
Figure 2017532037
８．２ 実験プロトコル
８．２．１ 試験動物
５〜９週齢の雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスをＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手した。動物は、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓの施設、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ及び米国農務省（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）の許可を得た施設で、Ｉｒｉｓｔｉｔｈｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより認可されたプロトコルに従って、人道的に処置及び飼育された。動物は、無菌の寝具及び食品並びに不断給餌の酸性化飲料水を備えた無菌マイクロアイソレーターユニットに維持された。環境条件は標準化した（室温：２０℃±１℃、相対湿度：５０％±１０％、１２時間の明暗周期）。動物は、有害な臨床徴候に関して毎日及び体重に関して毎週モニターした。
８．２．２ 異種移植の確立
ヒト黒色腫細胞系に由来するヒト癌性Ａ３７５細胞はＡＴＣＣから入手した。細胞は、５％ＣＯ２下３７℃の加湿インキュベーター内で１０％ＦＣＳを有するＤＭＥＭ中に成長させた。次いで、それを採取し、ＰＢＳで１回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中に再懸濁させた。
ヒト癌性Ａ３７５細胞は細胞培養物から採取した。それをＰＢＳ中に再懸濁させた。続いて、動物への移植前に、Ａ３７５細胞をＡ３７５腫瘍細胞系に対してアロ反応性のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞系と混合した。
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞系を生成するために、全血２０ｍＬ当たり１ｍＬのＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｔ細胞富化製品を添加することにより、健常ドナー由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞に関して富化した。この後、２０分間インキュベートし、続いて、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ ＤＭ−Ｌ密度媒体を用いて密度勾配遠心分離を行うことにより単離した。遠心分離後、細胞を２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が追加されたＰＢＳで３回洗浄し、１０％ＦＢＳが追加されたＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁させた。富化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、組換えヒトインターロイキン２（ｒｈＩＬ−２）が追加された培地中で７〜１０日間個別に培養し、そしてそれぞれマイトマイシンＣ処理Ａ３７５細胞と組み合わせた。Ｔ細胞は、採取してから、ｒｈＩＬ−２が追加された培地中で７〜１０日間個別に培養し、そしてマイトマイシンＣ処理Ａ３７５細胞と組み合わせた。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は採取してから２：１の比で組み合わせた。
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に関して富化されたＡ３７５細胞及びＰＭＢＣは、移植直前にＡ３７５細胞６対Ｔ細胞１の比で混合した。
異種移植は、動物の右側腹部で３．５×１０６細胞（ヒトＴ細胞は１：６のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）の比でＡ３７５細胞と混合し、２００μＬのＰＢＳ中に懸濁させた）の皮下（ＳＣ）注射により確立した。
８．２．３ ランダム化、群指定、及び用量レベル
細胞のＳＣ注射前に６匹の動物を各実験群にランダムに帰属した。動物の入替えはしなかった。各実験に対する群指定及び用量レベルを表８−２、表８−３及び表８−４に列挙する。試験抗体及び対照抗体はＰＢＳで適切な濃度に希釈し、２００μＬの全体積で腹腔内（ＩＰ）投与した。試験抗体及び対照抗体の初回用量は、癌／エフェクターＴ細胞の移植後３日目又は４日目に投与した。動物は、図に示される通り及び対応する図の説明に示される通りさらに３回まで試験抗体及び対照抗体の投与を受けた。各動物で腫瘍の形成が週１回又は２回観察された。この試験の主要エンドポイントは、２０００ｍｍ３の腫瘍体積又は全体的腫瘍壊死のいずれかであった。
８．２．４ 腫瘍の測定
各実験に対する図及び表に示される間隔でカリパスにより腫瘍を測定し、次式：
Ｖ（ｍｍ３）＝（長さ［ｍｍ］×幅［ｍｍ］×［幅ｍｍ］）／２
により腫瘍体積（Ｖ）を計算した。
各群に対して結果を算術平均で報告する。抗腫瘍効果は、腫瘍成長阻害パーセント（％ＴＧＩ）で表した。これは次のように計算した。
％ＴＧＩ＝（１−［治療群の平均腫瘍Ｖ］÷［対照群の平均腫瘍Ｖ］）×１００
８．３ 統計的方法
ＯＸ４０ｍＡｂ２４治療動物又は９Ｂ１２治療動物とアイソタイプ対照治療動物との間で比較を行って、マン・ホイットニー順位和検定による統計的有意性で群間差を解析した。
マン・ホイットニー順位和検定から得られた有意なｐ値は、算術平均値及び平均値の標準偏差に近接してまとめの表及び図に示される。
８．４ 結果
この試験ではヒト癌のマウスモデルにおける腫瘍の成長に対するＯＸ４０ｍＡｂ２４の活性を調べた。ヒト癌細胞系をアロ反応性ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞系と混合して免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤ雌動物に移植した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、健常ヒトドナーから単離されたＰＢＭＣに由来するものであった。異種移植の３日後又は４日後に動物に試験抗体及び対照抗体の最初の投与を行い、適応があれば試験抗体及び対照抗体の追加投与を行った。
３つの個別の実験で、ＯＸ４０ｍＡｂ２４＋アロ反応性ヒトＴ細胞は、アイソタイプ対照群と比較してＡ３７５細胞の成長を有意に最大８５％阻害した（表８−２、表８−３、及び表８−４；図２３Ａ、図２４Ａ、及び図２５）。対照９Ｂ１２＋アロ反応性ヒトＴ細胞もまた、アイソタイプ対照群と比較してＡ３７５細胞の成長を有意に最大７７％阻害した（表８−２〜８−４、図２３Ｂ及び図２４Ｂ）。
Figure 2017532037
Figure 2017532037
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８．５ 結論
ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、アロ反応性ヒトＴ細胞と混合されたヒト癌のマウスモデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示した。ＯＸ４０ｍＡｂ２４の抗腫瘍活性は、９Ｂ１２の抗腫瘍活性に類似していた。これらの結果は、ＯＸ４０ｍＡｂ２４がＴ細胞浸潤物を有する癌の患者の治療に単一作用剤療法として有効であり得ることを示す証拠となる。
実施例９：ラット／マウス抗マウスＯＸ４０ＩｇＧ２ａキメラ抗体クローンＯＸ８６は、同種同系モデルにおいてマウス癌細胞系の成長を阻害する
ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、マウス（ｍ）ＯＸ４０に交差反応しない（実施例２参照）。従って、免疫能のあるマウスモデルにおいてその活性を試験することはできない。ＯＸ８６は、ｍＯＸ４０に特異的に結合してそのシグナル伝達を惹起するラット抗ｍＯＸ４０ＩｇＧ１抗体であり（ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：１６９５−１６９９（１９９６））、癌の免疫能のあるマウスモデルにおいて抗腫瘍活性を有する（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ＡＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２１６０−２１６９（２０００））。ＯＸ４０ｍＡｂ２４に類似した機能上の性質を有するマウスサロゲート抗体を用いてＯＸ４０アゴニズムの効果をより完全に調べるために、ラット／マウス抗ｍＯＸ４０ＩｇＧ２ａキメラ抗体（ＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａ、ラット抗ＯＸ４０軽鎖及び重鎖の可変領域とマウスＩｇＧ２ａ定常領域とを有する）をＯＸ８６から作製した。この実施例では、癌の３つのマウスモデルにおいてＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａの単一作用剤抗腫瘍活性を評価する。
９．１ 材料
この試験で使用した材料及びそれらの供給元を表９−１に列挙する。
Figure 2017532037
９．２ 実験プロトコル
９．２．１ 試験動物
６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスをＭｅｄＩｍｍｕｎｅ ｆｒｏｍ Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で入手し、試験開始前の３日間にわたり気候順化を行った。その後、マウスの腫瘍移植部位を剃毛し、同定のためにマイクロチップトランスポンダーと共に移植した。
動物は、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓの施設、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ及び米国農務省（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）の許可を得た施設で、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより認可されたプロトコルに従って、飼育した。動物は、無菌の寝具及び食品並びに不断給餌の酸性化飲料水を備えた無菌マイクロアイソレーターユニットに維持された。環境条件は標準化した（室温：２０℃±１℃、相対湿度：５０％±１０％、１２時間の明暗周期）。動物は、有害な臨床徴候に関して毎日及び体重に関して隔週でモニターした。後肢麻痺、呼吸窮迫、２０％体重損失、又は２０００ｍｍ３超の腫瘍体積が認められた場合、動物はＣＯ２で窒息させて人道的にただちに屠殺した。
９．２．２ 同系腫瘍の確立及び移植
ＣＴ２６及び４Ｔ１は、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡのＡＴＣＣから入手した。ＭＣＡ２０５細胞は、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲから入手した。細胞はすべて、１０％ＦＢＳが追加されたＲＰＭＩ１６４０細胞培養培地で培養し、３７℃、５％ＣＯ２の加湿組織培養チャンバー内で成長させ、次いで採取し、ＦＢＳで１回洗浄し、次いでＰＢＳ中に再懸濁させた。
アロ移植は、０．１ｍＬのＰＢＳ中に懸濁された５．０×１０５ ＣＴ２６細胞又は１．０×１０５ ４Ｔ１細胞の皮下（ＳＣ）注射を７〜９週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの右側腹部内に行って確立し、一方、０．１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水中に懸濁された２．５×１０５ ＭＣＡ２０５細胞は、７〜９週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に注射した。
９．２．３ ランダム化、群指定、及び用量レベル
この試験ではＢＡＬＢ／ｃ（合計２１６匹）及びＣ５７ＢＬ／６（合計７０匹）雌マウスを使用した。ＣＴ２６腫瘍細胞が移植されたＢＡＬＢ／ｃマウスは、腫瘍が平均体積１２０ｍｍ３／コホートに成長した後（移植の９日後）又は２００ｍｍ３／コホートに成長した後（移植の１３日後）はランダムに帰属した。４Ｔ１腫瘍細胞が移植されたＢＡＬＢ／ｃマウスは、腫瘍が平均体積１２０ｍｍ３に成長した後（移植の１３日後）にランダムに帰属した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、腫瘍が平均体積９５ｍｍ３／コホートに成長した後（移植の１１日後）にランダムに帰属した。群指定、動物数、用量レベル、及び投与スケジュールを表９−２、表９−３、表９−４及び表９−５に示す。試験抗体及び対照抗体はすべて、腹腔内（ＩＰ）注射により投与した。動物の入替えはしなかった。
腫瘍体積が約２０００ｍｍ３に達成した場合又は腫瘍が潰瘍化若しくは壊死した場合、各群の動物を屠殺した。
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９．２．４ 腫瘍の測定
腫瘍はカリパスにより週２回測定し、次式：
腫瘍体積（Ｖ）＝［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２］／２
を用いて腫瘍体積を計算した。式中、長さはより長い辺であり、幅は長さに垂直なより短い辺として定義した。
各群の抗腫瘍効果は腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）として表現され、次のように計算した。
％ＴＧＩ＝（１−［治療群の平均Ｖ］÷［対照群の平均Ｖ］×１００）
測定可能な腫瘍がなかった場合、腫瘍成長反応は完全反応（ＣＲ）として分類した。
９．３ 統計的方法
一元配置ＡＮＯＶＡを用いて平均腫瘍体積差を決定した。有意なＦ検定では、ダネット又はシダックの多重比較検定を利用した（適切な場合）。適用可能な場合、異分散性を考慮して腫瘍体積にｌｏｇ１０変換を施した。ｐ値＜０．０５は有意であるとみなした。
９．４ 結果
ＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａによるマウスの治療は、未治療又は陰性又はアイソタイプの対照抗体で治療されたマウス対照と比較してＣＴ２６及びＭＣＡ２０５の腫瘍細胞の成長の有意な低減をもたらす（表９−６、表９−７、及び表９−８；図２６Ａ、図２７Ａ及び図２８Ａ）。ＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａによるマウスの治療は、未治療又はアイソタイプの対照抗体と比較して４Ｔ１腫瘍細胞の成長の遅延又は低減をもたらす（表９−９及び図２９Ａ）。
同種同系モデルでは、多くの場合、混合反応が現れるが、ＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａによる治療の劇的な反応は、個別の動物の腫瘍成長グラフからより明らかである（図２６Ｂ、図２７Ｂ、図２８Ｂ及び図２９Ｂ）。ＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａにより治療されたマウスでは、ＴＧＩに基づいて（表９−６、表９−７、表９−８、及び表９−９；図２６Ａ、図２７Ａ、図２８Ａ及び図２９Ａ）、又は完全反応を呈する動物数の増加に基づいて（表９−６、表９−７、表９−８及び表９−９）、用量反応は観察されなかった。
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９−５ 結論
腫瘍を有するマウスにＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａにより単一作用剤治療を施すと、未治療、陰性、及び／又はアイソタイプの対照治療群と比較して、多発性腫瘍の成長を有意に低減する抗腫瘍活性がもたらされる。
実施例１０：ＯＸ４０ｍＡｂ２４のエピトープの特徴付け
この実施例では、一連のヒト／マウスＯＸ４０キメラ変異体を用いてＯＸ４０ｍＡｂ２４のエピトープを調べる。
１０．１ この試験で使用した材料及びそれらの供給元を表１０−１に列挙する。
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１０．２ ヒト／マウスキメラ変異体の作製
ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、ヒトＯＸ４０（配列番号９１）に特異的に結合し、アミノ酸（ａａ）配列が６０％の同一性を共有するにもかかわらずマウスＯＸ４０（配列番号９２）を認識しない（図３０）。ヒトＯＸ４０とマウスＯＸ４０との間で細胞外ドメインの一部を交換するように工学操作してヒト／マウスキメラＯＸ４０変異体を作製した。オーバーラップ伸長ＰＣＲでヒト及びマウスＯＸ４０のｃＤＮＡ構築物を鋳型として用いて、組換えタンパク質の細胞表面発現のために膜貫通ドメインを有するキメラ変異体を構築した。ＯＸ４０は、３つの完全システインリッチドメイン（ＣＲＤ）及び１つのトランケートシステインリッチドメインを有する約４５ｋＤａのタンパク質である。構造はＴＮＦＲスーパーファミリーに特有である。
ヒトＯＸ４０の細胞外ドメインの以下の残基を対応するマウスＯＸ４０のａａ又はアラニンと置き換えることにより１３種のキメラノックアウト（ＫＯ／機能喪失）変異体を構築した（図３１）：
・ ・ＣＲＤ１（ヒトＯＸ４０ ａａ２９〜６５をマウスのカウンターパートで置き換えた）、
・ ・ＣＲＤ２（ヒトＯＸ４０ ａａ６６〜１０７をマウスのカウンターパートで置き換えた）、
・ ・ＣＲＤ３（ヒトＯＸ４０ ａａ１０８〜１４６をマウスのカウンターパートで置き換えた）、
・ ・ＣＲＤ４の＋リンカー（ヒトＯＸ４０ ａａ１４７〜２１４をマウスのカウンターパートで置き換えた）、
・ ・ＣＲＤ３＋４（ヒトＯＸ４０ ａａ１０８〜１６７をマウスのカウンターパートで置き換えた）、
・ ・Ａ１１１（ヒトＯＸ４０ ａａアラニン１１１をマウスのカウンターパートのプロリンで置き換えた）、
・ ・Ｌ１１６（ヒトＯＸ４０ ａａロイシン１１６をマウスのカウンターパートのグルタミンで置き換えた）、
・ ・Ｐ１２１（ヒトＯＸ４０ ａａプロリン１２１をマウスのカウンターパートのロイシンで置き換えた）、
・ ・Ａ１２６（ヒトＯＸ４０ ａａアラニン１２６をマウスのカウンターパートのバリンで置き換えた）、
・ ・Ｄ１３７（ヒトＯＸ４０ ａａアスパラギン酸１３７をマウスのカウンターパートのアスパラギンで置き換えた）、
・ ・Ａ１１１Ｐ１２１Ｄ１３７（ヒトＯＸ４０ ａａ Ａｌａ１１１、Ｐｒｏ１２１、及びＡｓｐ１３７をマウスのカウンターパートで置き換えた）、
・ ・Ｌ１１６Ａ１２６（ヒトＯＸ４０ ａａ Ｌｅｕ１１６及びＡｌａ１２６をマウスのカウンターパートで置き換えた）、
並びに
・ ・Ｄ１１７Ｓ１１８（ヒトＯＸ４０の ａａ Ａｓｐ１１７及びＳｅｒ１１８をＡｌａ突然変異で置き換えた）。
そのほかに、ＫＯ構築物（図３１）に対して以上に記載したのと同一の方法を用いてヒトＯＸ４０の以下の残基をマウスＯＸ４０内にグラフトすることにより５種のノックイン（ＫＩ／機能獲得）変異体を構築した：
・ＣＲＤ３（ヒトＯＸ４０ ａａ１０８〜１４６を対応するマウス領域にグラフトした）、
・Ａ１１１（ヒトＯＸ４０ ａａアラニン１１１を対応するマウス位置にグラフトした）、
・Ｌ１１６（ヒトＯＸ４０ ａａロイシン１１６を対応するマウス位置にグラフトした）、
・Ａ１２６（ヒトＯＸ４０ ａａアラニン１２６を対応するマウス位置にグラフトした）、
・Ｌ１１６Ａ１２６（ヒトＯＸ４０ ａａロイシン１１６及びアラニン１２６を対応するマウス位置にグラフトした）。
得られたキメラＤＮＡは、一過性哺乳動物発現用の哺乳動物発現ベクターｐＥＢＮＡ中に導入した。２９３Ｆ細胞は、０．７×１０６細胞／ｍＬの密度でトランスフェクションの前日に接種した。製造業者の説明書に従って５μＬの２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬を用い３．５μｇの発現ベクターを５ｍＬのＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。
１０．３ キメラＯＸ４０変異体へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合の特徴付け
トランスフェクションの４８時間後、１μｇ／ｍＬのＯＸ４０ｍＡｂ２４を含むＰＢＳ中、氷上でＨＥＫ２９３Ｆ細胞を１時間インキュベートした。結合されたＯＸ４０ｍＡｂ２４をフローサイトメトリーにより検出するために、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、１μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ４８０コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体と共に氷上で１時間インキュベートし、次いでＬＳＲＩＩフローサイトメーターを用いて解析した。
すべてのキメラＯＸ４０変異体の発現レベルもフローサイトメトリーによりモニターした。ＰＢＳ中でヒツジ抗ヒトＯＸ４０とヤギ抗マウスＯＸ４０ポリクローナル抗体との混合物と共に１μｇ／ｍＬで細胞を氷上で１時間インキュベートした。細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、次いでＡｌｅｘａ４８０コンジュゲート抗ヤギ及び抗ヒツジＩｇＧポリクローナル抗体の混合物と共にインキュベートした。冷ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞をＬＳＲＩＩフローサイトメーターで解析した。
１０．４ 結果
キメラヒト／マウス変異体を用いてＯＸ４０ｍＡｂ２４のエピトープの特徴付けを行った。ヒトＯＸ４０及びマウスＯＸ４０は、ａａ配列が６０％の同一性を共有する（図３０）。とはいえ、ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、ヒトＯＸ４０に特異的に結合するがマウスＯＸ４０を認識しない。この特異性を利用してＯＸ４０ｍＡｂ２４のエピトープを同定した。マウスＯＸ４０の細胞外ドメインの様々なドメインをヒトＯＸ４０中に（ＫＯ／機能喪失変異体）又はヒトＯＸ４０の様々なドメインをマウスＯＸ４０中に（ＫＩ／機能獲得変異体）スワップイン又はスワップアウトすることにより１８種のキメラ変異体を構築した（図３１）。変異体はすべて、キメラタンパク質の細胞表面発現用の膜貫通ドメインをコードしていた。これらの変異体へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合特性をフローサイトメトリーにより解析した。
ヒトＯＸ４０とマウスＯＸ４０との間で個別のドメインをスワッピングすることによりＯＸ４０ｍＡｂ２４のエピトープをヒトＯＸ４０のＣＲＤ３ドメインにマッピングした。ヒトＣＲＤ３ドメインをマウスのカウンターパートに置き換えた場合（ＫＯ＿ＣＲＤ３及びＫＯ＿ＣＲＤ３−４）、ヒトＯＸ４０へのＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合が消失した（図３２Ａ〜Ｃ）。他のヒトＣＲＤドメインをマウス領域で置換えても、ＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合に影響しなかった（ＫＯ＿ＣＲＤ１、ＫＯ＿ＣＲＤ２、及びＫＯ＿ＣＲＤ４＋リンカー）。さらに、ヒトＣＲＤ３ドメインをマウスＯＸ４０中にグラフトしたところ、ＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合をもたらした（ＫＩ＿ＣＲＤ３）。抗ヒト及び抗マウスＯＸ４０ポリクローナル抗体によりモニターしたところ、すべての変異体が発現された（図３２Ａ〜Ｃ）。ＯＸ４０ｍＡｂ２４の親ｍＡｂ（９Ｂ１２）も結合試験で特徴付けを行った。９Ｂ１２は、これらの変異体に対してＯＸ４０ｍＡｂ２４と同一の結合プロファイルを示したことから、両方のＩｇＧがＣＲＤ３ドメインの同一のエピトープを認識することが示唆される。
さらに、ヒト及びマウスのＯＸ４０間で異なるアミノ酸を突然変異することにより、きわめて重要なエピトープ残基Ｌｅｕ１１６及びＡｌａ１２６をＣＲＤ３ドメインで同定した。ヒトＣＲＤ３ドメインのＡｌａ１１１、Ｌｅｕ１１６、Ｐｒｏ１２１、Ａｌａ１２６、及びＡｓｐ１３７を含む５つのアミノ酸（図３０）を個別のアミノ酸又は様々な組合せとして対応するマウス残基又はＡｌａに突然変異させた（図３１）。ヒト残基Ｌｅｕ１１６及びＡｌａ１２６をマウスのカウンターパートに置き換えた場合（ＫＯ＿Ｌ１１６＋Ａ１２６）、ＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合が消失した。さらに、ＫＩ／機能獲得変異体からこれらの２つのきわめて重要な残基の重要性が確認された。マウスＯＸ４０中へのＬｅｕ１１６、Ａｌａ１２６、又は組合せのグラフトは、ＯＸ４０ｍＡｂ２４の結合をもたらした。
１０．５ 結論
きわめて重要な残基Ｌｅｕ１１６及びＡｌａ１２６を含めてヒト／マウスキメラ変異体を用いてエピトープＯＸ４０ｍＡｂ２４をヒトＯＸ４０のＣＲＤ３ドメインにマッピングした。ＯＸ４０ｍＡｂ２４及びその親９Ｂ１２との間ですべての変異体への結合プロファイルが同一であることから、それらはヒトＯＸ４０上の同一のエピトープを認識することが示唆される。
実施例１１：ナイーブマウス及び同系腫瘍を有するびマウスにおけるラット／マウス抗マウスＯＸ４０ＩｇＧ２ａキメラ抗体クローンＯＸ８６の薬力学的活性
ＯＸ８６は、ＭＯＸ４０に特異的に結合してＭＯＸ４０のシグナル伝達を惹起するラット抗ｍＯＸ４０ＩｇＧ１抗体であり（ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９６）、癌の免疫能のあるマウスモデルにおいて抗腫瘍活性を有する（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，２０００）。ＯＸ４０ｍＡｂ２４に類似した機能上の性質を有するマウスサロゲート抗体を用いてＯＸ４０アゴニズムの効果をより完全に調べるために、この実施例では実施例９に記載のラット／マウス抗ｍＯＸ４０ＩｇＧ２ａキメラ抗体ＯＸ８６を利用する。しかしながら、種間でいくつかの類似点を導くことは可能である。例えば、ｍＩｇＧ２ａ及びヒトＩｇＧ１は、多くの場合、機能的に等価であるとみなされる。なぜなら、両方のアイソタイプが複数のＦｃγレセプターに結合可能であり、高親和性Ｆｃγレセプター結合が可能であり、ＡＤＣＣを惹起することが可能であり、しかも補体古典経路による補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の前提条件であるヒトＣ１ｑへの結合を行うからである（Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１４、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ，２００６））。ＯＸ８６ｍＩＧｇ２ａはマウスＯＸ４０に結合するので（実施例９参照）、サロゲートマウスＯＸ４０アゴニスト抗体としてＯＸ４０ｍＡｂ２４に使用した。
この実施例では、ナイーブマウス及び腫瘍を有するマウスでＴ細胞を誘導するＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａの能力、細胞周期に入る能力、及び増殖する能力。さらに、ＯＸ４０アゴニスト活性の可能性のあるバイオマーカーとしてＫ１６７とＩＣＯＳを評価し、調べた。Ｔ細胞増殖活性及び抗腫瘍活性を癌の２つの同種同系マウスモデルで決定した。さらに最後に、ＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａのｉｎ ｖｉｖｏ活性で活性化（ＦｃγレセプターＩ、ＩＩＩ、及びＩＶ）及び／又は阻害（ＣｆγレセプターＩＩｂ）Ｆｃγレセプターの果たす役割を決定した。
１１．１ 材料及び方法
１１．１．１ 動物の受領及び同定
６〜８週齢の野生型Ｆｃｇｒ２ｂ−／−又はＦｃｅｒ１ｇ−／−ＢＡＬＢ／ｃ、及びＦｃｇｒ２ｂ−／−又はＦｃｅｒ１ｇ−／−Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ ｆｒｏｍ Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ又はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＫ））で受領し、試験開始前に１５日間以下で気候順化させた。その後、個別のマウスを同定するためにマウスにマイクロチップトランスポンダーを移植した。
１１．１．２ 飼育
動物は、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＵＳＡ）ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕｎｉｔ（ＵＫ）ａｔ ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，ａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ及び米国農務省（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）の許可を得た施設で、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＵＳＡ）ａｎｄ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ（ＵＫ）により認可されたプロトコルに従って、人道的に処置及び飼育された。動物は、無菌の寝具及び食品並びに不断給餌の酸性化飲料水（ＵＳＡ）又は上水（ＵＫ）を備えた無菌マイクロアイソレーターユニットに維持された。環境条件は標準化した（室温：２０℃±１℃（ＵＳＡ）又は２１℃±１℃（ＵＫ）、相対湿度：５０％±１０％（ＵＳＡ）又は５５±１０％（ＵＫ）、１２時間の明暗周期）。動物は、有害な臨床徴候に関して毎日及び体重に関して隔週でモニターした。後肢麻痺、呼吸窮迫、２０％体重損失、又は２０００ｍｍ３超の腫瘍体積が認められた場合、動物は頸椎脱臼又はＣＯ２窒息により人道的にただちに屠殺した。
１１．１．３ 同系腫瘍の確立
ＣＴ２６細胞系（マウス結腸癌）はＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手し、細胞系ＭＣＡ２０５（化学誘導マウス軟組織肉腫）はＰｒｏｖｉｄｅｎｃｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲから入手した。両方の細胞系を３７℃、５％ＣＯ２でＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ＦＢＳ中に維持した。
１０５ＣＴ２６細胞の皮下（ＳＣ）注射を７〜９週齢の野生型Ｆｃｇｒ２ｂ−／−又はＦｃｅｒ１ｇ−／−ＢＡＬＢ／ｃマウスの右側腹部に行って確立した。アロ移植はまた、０．１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁された２．５×１０５ＭＣＡ２０５細胞のＳＣ注射を７〜９週齢の野生型Ｆｃｇｒ２ｂ−／−又はＦｃｅｒ１ｇ−／−Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部中に行って確立した。
１１．１．４ ランダム化、群指定、及び用量レベル
この試験では野生型（ｎ＝７０）、Ｆｃｇｒ２ｂ−／−（ｎ＝３６）、又はＦｃｅｒ１ｇ−／−（ｎ＝３６）ＢＡＬＢ／ｃ、及びＦｃｇｒ２ｂ−／−（ｎ＝３６）又はＦｃｅｒ１ｇ−／−Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（ｎ＝３６）を使用した。マウスはすべて、治療群にランダムに帰属した。群指定、動物数、用量レベル、及び投与スケジュールを表１１−１、表１１−２及び表１１−３に示す。試験品及び対照品はすべて、腹腔内に投与した（ＩＰ）。動物の入替えはしなかった。
腫瘍体積が約２０００ｍｍ３に達した場合又は腫瘍が潰瘍化又は壊死した場合、各群の動物を屠殺した。
Figure 2017532037
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１１．１．５ 腫瘍の測定
腫瘍はカリパスにより週２回測定し、次式：
腫瘍体積（Ｖ）＝［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２］／２
を用いて腫瘍体積を計算した。式中、長さはより長い辺であり、幅は長さに垂直なより短い辺として定義した。
各群の抗腫瘍効果は腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）として表現され、次のように計算した。
％ＴＧＩ＝（１−［治療群の平均腫瘍Ｖ］÷［対照群の平均腫瘍Ｖ］×１００）
１１．１．６ 組織採取および単細胞の単離
１１．１．６．１ フローサイトメトリー解析のためのマウス血液細胞の調製
赤血球溶解（ＲＢＣＬ）緩衝液（２ｍＬ）を血液（５０μＬ）に添加し、５分間インキュベートした。インライフ採血から得られた体積は、２０μＬ〜５０μＬの範囲内であった。最終採血は５０μＬであった。ＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（８ｍＬ）を各サンプルに添加した。各サンプルの細胞をペレット化し（３００×ｇ、５ｍｉｎ）次いで０．３ｍＬのフロー緩衝液中で再懸濁させた。細胞懸濁液（２００μＬ）を９６ウェル丸底プレートの各ウェルに添加して蛍光抗体による染色に供した。非染色対照、単一抗体染色対照、アイソタイプ染色対照、及び蛍光マイナスオン（ＦＭＯ）抗体染色対照に対して、プール群サンプルを使用した。
１１．１．６．２ マウス流入領域リンパ節及び脾臓の単離並びにフローサイトメトリー解析用の単細胞浮遊液の作製
脾臓を１０ｍＬのＲＰＭＩ＋１Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ溶液中に配置し、４０μｍ細胞ストレーナーに通した。サンプルをペレット化し（３００×ｇ、５ｍｉｎ）、次いで１ｍＬのＲＢＣＬ緩衝液中に３分間再懸濁させた。ＲＰＭＩ＋ＦＢＳ１０％（９ｍＬ）を各サンプルに添加した。細胞懸濁液をペレット化し、１ｍＬのフロー緩衝液中に再懸濁させた（３００×ｇ、５ｍｉｎ）。細胞懸濁液（１００μＬ）を９６ウェル丸底プレートの各ウェルに添加し、蛍光抗体による染色に供した。プール基サンプルは使用された、非染色対照、単一抗体染色対照、アイソタイプ対照、及びＦＭＯ抗体染色対照に対して、プール群サンプルを使用した。
１１．１．６．３ フローサイトメトリー解析用のマウス腫瘍の単細胞浮遊液の調製
結合組織又は皮膚を採取しないように注意して安楽死マウスから無菌状態で腫瘍を摘出し、６ウェルディッシュ中のハンクス平衡塩溶液で希釈されたコラゲナーゼ中に配置した。酵素消化プロセスの効率を向上させるために、各腫瘍は、スカルペル又は小さな鋭いハサミを用いてより小さな小片にミンスした。ミンスされた腫瘍を１５ｍＬコニカルチューブ中に導入し、振盪プラットフォーム上に配置して３７℃で２０〜３０分間インキュベートした。コラゲナーゼを脱活性化させて免疫細胞の生存能を維持するために５ｍＬのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳを各サンプルに添加した。サンプルを７０μＭ細胞ストレーナーに通して、５０ｍＬコニカルチューブ中に配置した。各サンプルのアリコートをカウントのために取り出した。残りのサンプルを３３０×ｇの遠心分離機でペレット化し、１×１０７細胞／ｍＬの濃度でＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）中に再懸濁させた。
１１．１．７ フローサイトメトリー解析
１１．１．７．１ 腫瘍のないマウス由来の組織の解析
血液又は脾臓細胞の単細胞浮遊液をペレット化し（３００×ｇ、５ｍｉｎ）、５０μＬのＦｃブロック溶液（１：５０）中に再懸濁させ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｆｌｏｗ Ｂｕｆｆｅｒで希釈し、氷上で１０分間インキュベートした。５０マイクロリットルの蛍光標識抗体（２×ストック溶液）を各サンプルに添加した（最終体積１００μＬ）。単一抗体染色溶液（細胞外）を１μＬ／ウェルで添加し、細胞／抗体混合物を氷上で３０分間インキュベートした。細胞をペレット化し（３００×ｇ、５ｍｉｎ）、２回洗浄し（２００μＬフロー緩衝液／ウェル、３００×ｇ、５ｍｉｎ）、５０μＬのＦｉｘ／Ｐｅｎｎ緩衝液（３部の希釈液に対して１部の濃縮物）、次いで、４℃の暗所で一晩インキュベートした。
処理細胞を１×透過化緩衝液（水希釈）で２回洗浄した。細胞内標識抗体を透過化緩衝液（１００μＬ／ウェル）中に希釈して細胞に添加し、次いで、暗所で室温で３０分間インキュベートした。単一マーカー染色用の抗体（細胞内）を１μＬ／ウェルで細胞に添加して１００μＬの透過化緩衝液中に導入し、暗所で氷上で３０分間インキュベートした。細胞を透過化緩衝液で１回洗浄し、３．７％のホルムアルデヒド溶液（１００μＬ）中に再懸濁させ、その後、Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）による解析に供した。
１１．１．７．２ 腫瘍を有するマウス由来の組織の解析
１１．１．７．２．１ 細胞表面染色
ペレット化細胞の各サンプルをＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。ＦＡＣＳ緩衝液中の蛍光抗体混合物を適切なウェルに添加し、４℃の暗所で２０〜３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で解析した。
１１．１．７．２．２ 細胞内染色（固定及び透過化された細胞）
ペレット化細胞の各サンプルを、生存／非生存細胞の識別のための蛍光固定青色染料の５０μＬの１：５００希釈液中に再懸濁させ、４℃の暗所で１５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、Ｆｃブロックを含有する３０μＬのＰＢＳ＋４％正常マウス血清中に再懸濁させ、室温で１５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液中の蛍光抗体混合物を適切なウェルに添加し、４℃の暗所で２０〜３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、新たに調製された１５０μＬのＦｏｘＰ３ Ｆｉｘ／Ｐｅｎｎ作用液中に再懸濁させ、暗所で室温で３０分間インキュベートした。細胞を１×透過化緩衝液で２回洗浄し、抗体を含有する１００μＬの１×透過化緩衝液中に再懸濁させて細胞内抗原を染色し、暗所で室温で３０分間インキュベートした。細胞を１×透過化緩衝液で１回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで解析した。
１１．１．８ 統計的方法
一元配置ＡＮＯＶＡを用いてＫｉ６７＋又はＩＣＯＳ＋細胞の平均腫瘍体積差及び平均パーセントを決定した。有意なＦ検定では、ダネット又はシダックの多重比較検定を利用した（適切な場合）。適用可能な場合、異分散性を考慮してｌｏｇ１０変換を施した。ｐ値＜０．０５は有意であるとみなした。線形回帰分析にＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０を利用することにより、ＸからＹの最良予測が行われた最良当てはめ線、線の統計的有意水準、及び決定された最良当てはめ線の適合度（ｒ２）を得た。
１１．１．９ 材料
この試験で使用した材料及びそれらの供給元を表１１−４及び表１１−５に列挙する。
Figure 2017532037
Figure 2017532037
１１．２ 結果
抗ＯＸ４０抗体ＯＸ８６マウスＩｇＧ２ａ（ＯＸ８６ ｍＩｇＧ２ａ）でナイーブマウスの腹腔内治療を行ったところ、対照品で治療されたマウスと比較して、血中のＫｉ６７＋ＣＤ４＋及びＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントの有意な用量依存性且つ一過性の増加が経時的に得られた（図３３Ａ及びＣ）。Ｋｉ６７＋ＣＤ４＋及びＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の最大パーセントは１０日目に検出された。Ｋｉ６７＋ＣＤ４＋及びＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントの有意な増加は、対照品で治療されたマウスと比較して、ＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａの投与後の１０日目のマウスの脾臓中で測定した（図３３Ｂ及びＤ）。Ｋｉ６７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントとＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントとの間の統計的に有意な強い相関は、１０日目の血液及び脾臓は同定された（図３４Ａ及び３４Ｂ）。
ＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａによるナイーブマウスの治療でも、対照品で治療されたマウスと比較して、血中のＫｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントの有意且つ一過性の増加が経時的に得られた（図３５Ａ）。血中のＩＣＯＳ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントの経時的増加（図３５Ｃ）及び０日目の脾臓中のＫｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセント（図３５Ｂ）は、ＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａによる治療後に検出されたが、対照品による治療と比較して統計的に有意でなかった。ＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａによるナイーブマウスの治療は、対照品で治療されたマウスと比較して、１０日目の脾臓中のＩＣＯＳ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントの有意且つ用量依存性の増加を誘導した（図３５Ｄ）。血中及び脾臓中のＫｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントとＩＣＯＳ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントとの間には中程度であるが有意な相関が見られた（図３６Ａ及び３６Ｂ）。
ＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａによる腫瘍を有する野生型マウスの単一作用剤治療は、未治療群及びアイソタイプ対照治療群と比較して２つの組織学的に異なる腫瘍の成長を低減する抗腫瘍活性をもたらした（実施例９参照）。ＯＸ８６ｍＩＧｇ２ａによる治療は、阻害ＦｃγレセプターＩＩＢ（Ｆｃｇｒ２ｂ−／−マウス）の発現が欠如するように遺伝子工学操作されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける対照品による治療と比較して、２０日目にＭＣＡ２０５腫瘍の成長の有意な低減をもたらした（図３８Ａ、表１１−７）。ＣＴ２６腫瘍を有するマウスの同等な治療は、Ｆｃｇｒ２ｂ−／ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける対照品による治療と比較して腫瘍の成長の低減をもたらしたが１８日目に統計的有意性に達しなかった（図３７Ａ、表１１−６）。活性化Ｆｃγレセプターの発現が欠如するように遺伝子工学操作された腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスでは、いずれの作用剤による成長阻害も観察されなかった（Ｆｃｅｒ１ｇ−／−マウス、図３７Ｃ、図３８Ｃ）。混合反応は、多くの場合、同種同系モデルで観察される。しかしながら、Ｆｃγレセプターノックアウトマウスの２つの異なる株のＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａによる治療後の抗腫瘍反応が、個別の動物腫瘍成長グラフから識別可能であり（図３７Ｂ及びＤ、図３８Ｂ及びＤ）、ＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａによる治療は、ＣＴ２６及びＭＣＡ２０５腫瘍成長の阻害をもたらし、いくつかの場合にはＦｃｇｒ２ｂ−／−マウスで完全反応を誘導した（図３７Ｂ、図３８Ｂ）。
Figure 2017532037
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並行薬力学試験では、対照品と比較されるＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａによる治療は、脾臓のＫｉ６７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（図３９Ａ）並びに末梢血及び脾臓のＫｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントの有意な増加を引き起こしたが、ＣＴ２６腫瘍を有するＦｃｇｒ２ｂ−／−Ｂａｌｂ／ｃマウスの腫瘍ではそうではなかった（図４０Ａ）。対照品と比較して、ＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａによる治療後、ＣＴ２６腫瘍を有するＦｃｅｒ１ｇ−／−Ｂａｌｂ／ｃマウスの血液、脾臓、又は腫瘍で、Ｋｉ６７＋ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の増加は検出されなかった（図３９Ｂ、図４０Ｂ）。
そのほかに、並行研究では、対照品と比較されるＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａによる治療は、ＭＣＡ２０５腫瘍を有するＦｃｇｒ２ｂ−／−Ｃ５７ＢＬ／６マウスの流入領域リンパ節、脾臓、及び腫瘍のＫｉ６７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（図４１Ａ）並びに流入領域リンパ節及び脾臓のＫｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（図４２Ａ）のパーセントの有意な増加を引き起こした。ＭＣＡ２０５腫瘍を有するＦｃｇｒ２ｂ−／−Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍のＫｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントの増加は、統計的に有意でなかった（図４２Ａ）。対照品と比較されるＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａによる治療はまた、ＭＣＡ２０５腫瘍を有するＦｃｅｒ１ｇ−／−Ｃ５７ＢＬ／６マウスの流入領域リンパ節及び脾臓のＫｉ６７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントの有意な増加を誘導した（図４１Ｂ）。これらのマウスの脾臓のＫｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントの有意な増加も観察された（図４２Ｂ）。ＭＣＡ２０５腫瘍を有するＦｃｇｒ２ｂ−／−Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍のＫｉ６７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントの有意な増加検出されが（図４２Ｂ）、流入領域リンパ節又は腫瘍のＫｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は検出されなかった（図４２Ｂ）。
１１．３ 結論
ナイーブマウスにおける単回用量のＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａは、ＩＣＯＳ及びＫｉ６７の発現の増加により測定したとき、それぞれＴ細胞活性化及び増殖の一過性の増加を誘導した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＣＯＳ及びＫｉ６７のパーセントの有意な直線相関が見いだされた。ＣＴ２６及びＭＣＡ２０５の腫瘍の成長の阻害として測定されるＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａの抗腫瘍活性は、阻害ＦｃγレセプターＩＩＢではなく活性化ＦｃγレセプターＩ、ＩＩＩ、及びＩＶの発現に依存した。活性化Ｆｃγレセプターを発現する腫瘍を有するマウスにおける並行薬力学的実験では、末梢血、流入領域リンパ節、及び／又は脾臓のＴ細胞増殖の増加（Ｋｉ６７）が観測され、阻害Ｆｃγレセプターのみを発現するマウスにおいて、いくつかのＴ細胞増殖が観察された。理論により拘束されることを望むものではないが、ナイーブマウスからの薬力学的結果と合わせると、ＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａ抗腫瘍活性の可能性のある機構は、末梢及び腫瘍内のＴ細胞増殖（Ｋｉ６７）である。さらに、ＯＸ８６ｍＩｇＧ２ａのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性はＦｃγレセプターの活性化の発現時に生じる。
実施例１２：ヒト造血幹細胞が移植された免疫無防備マウスにおけるＯＸ４０ｍＡｂ２４療法に反応するＴ細胞薬力学的変化
この実施例では、再構成ヒト免疫系を有する免疫無防備マウスにおいてＯＸ４０ｍＡｂ２４がヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋記憶Ｔ細胞を活性化し増大し得るか又はヒトＴｒｅｇを低減し得るかを調べる。薬剤がヒトＴ細胞に対して免疫調節作用を有するか決定するために、ヒト免疫細胞で再構成されたｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルシステムにおいてＯＸ４０ｍＡｂ２４を試験した。
１２．１ 材料及び方法
１２．１．１ 試験動物
Ｎｏｄ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｙ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（ｎ＝１４、２３〜２６週齢）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。動物は、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓの施設、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ及びＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅの許可を得た施設で、Ｉｎｓｔｉｔｈｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより認可されたプロトコルに従って、人道的に処置及び飼育された。動物は、無菌の寝具及び食品並びに不断給餌の酸性化飲料水を備えた無菌マイクロアイソレーターユニットに維持された。環境条件は標準化した（室温：２０℃±１℃、相対湿度：５０％±１０％、１２時間の明暗周期）。動物は、試験期間中、有害な臨床徴候に関して毎日モニターした。
１２．１．２ ＨＳＣ移植（ヒト化）マウスにおけるＯＸ４０ｍＡｂ２４の薬力学
１２．１．２．１ ヒトＨＳＣ移植マウスの確立
ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣ移植マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。次のようにマウスを作製した。複数の臍帯血ドナー由来のプールヒトＣＤ３４＋細胞を単離し、Ｎｏｄ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ１１２ｒｇｔｍ１Ｗｙ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスのテール静脈に静脈内注射した。移植の１２週間後、マウス末梢血をサンプリングし、Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ赤血球溶解緩衝液で溶解し、次いで、ヒトＣＤ４５、ＣＤ１９、及びＣＤ３陽性細胞に関してフローサイトメトリーにより解析し、マウスにおけるヒト免疫細胞移植の程度を決定した。続いて、全生存可能血液細胞のうち２５％以上のＣＤ４５＋ヒト免疫細胞がうまく移植されたマウスをＭｅｄＩｍｍｕｎｅに輸送した。
１２．１．２．２ ヒトＨＳＣ移植マウスの抗原チャレンジ及びＯＸ４０ｍＡｂ２４治療
ヒトＣＤ３４細胞の注射の２２週間後にフローサイトメトリーによりＮＳＧマウスへのヒト免疫細胞の持続的移植を確認し、２３週間後に未治療状態又は治療された状態の３群のマウスに分けた（表１２−１）。実験開始の２２週前に最終的治療群間のヒトＣＤ４５＋細胞移植の平均パーセントに統計学的有意差はなかった。群１は４匹のマウスからなり、皮下（ＳＣ）キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）免疫化も抗体投与も受けなかった。群２は５匹のマウスからなり、２つの独立した注射ＳＣ部位で３００μｇ／５０μＬのＫＬＨ及び５０μＬの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の投与を受けた。この群のマウスはまた、ＫＬＨ免疫化の１日後、腹腔内（ＩＰ）に２ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の投与を受けた。群３は５匹のマウスからなり、以上に記載のＫＬＨ／ＣＦＡ ＳＣ免疫化を受けた。そのほかに、マウスはまた、１日後に単回ＩＰ用量の２ｍｇ／ｋｇのＯＸ４０ｍＡｂ２４の投与を受けた。ＫＬＨ／ＣＦＡ ＳＣ免疫化の当日、免疫化前（治療前）、及び７日後（治療後）、眼窩後方採血により全血を取得し、細胞の免疫表現型を調べ、フローサイトメトリーによりカウントした。
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１２．１．２．３ フローサイトメトリーによる免疫細胞解析
全血抗体結合プロトコルを用いてフローサイトメトリーにより細胞の免疫表現型を調べた。簡潔に述べると、一定体積のＥＤＴＡ抗凝固処理全血をディープウェルプレートのウェルに添加し、Ｔ細胞染色マスターミックスを細胞に添加して細胞表面抗原に結合させた。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２＋２％熱不活性化新生仔ウシ血清）で洗浄した後、１×ＲＢＣ溶解緩衝液を用いて赤血球（ＲＢＣ）を溶解し、ＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｆｉｘ及びＰｅｒｍ ｋｉｔを用いて製造業者のプロトコルに従って細胞の固定及び透過化を行った。続いて、抗ＦｏｘＰ３ｍＡｂ及び抗Ｋｉ６７ｍＡｂを細胞に結合させた。１×固定及び透過化緩衝液を用いて細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを用いてイベントを解析した。生のフローサイトメトリー標準（ＦＣＳ）データはＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて解析され、且つ細胞集団が、生存／死亡細胞の識別、及び二重線と細胞デブリの除去後に同定された。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団をゲート処理した後、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７発現プロファイルにより記憶Ｔ細胞を決定した。ナイーブＴ細胞はＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋として、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）はＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７−として、エフェクター記憶Ｔ細胞（Ｔｅｍ）はＣＤ４ＳＲＡ−／ＣＣＲ７−として、及び中枢記憶Ｔ細胞（Ｔｃｍ）はＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７＋として定義した。ＴｒｅｇはＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋細胞として定義した。
１２．１．２．４ 統計的方法
データのグラフ化及び統計解析のためにＷｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン６．０３）を使用した。
テューキーの検定後解析を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ多重比較を用いて実験群平均間の差を比較した。有意Ｆ検定では、シダックの多重比較を利用した。０．０５未満のｐ値は有意であるとみなした。
１２．１．３ 材料
この試験で使用した材料及びそれらの供給元を表１２−２に列挙する。
Figure 2017532037
１２．２ 結果
ＫＬＨによる免疫化の１日後にＯＸ４０ｍＡｂ２４又はｈｕＩｇＧ１対照抗体を投与した。ＯＸ４０ｍＡｂ２４は、ｈｕＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体が投与された群と比較して６日間後の末梢血中のＴｒｅｇのパーセントの統計的に有意な低減にもたらした（ｐ＝０．０１９、一元配置ＡＮＯＶＡ、図４３Ａ及び４３Ｂ）。治療群間のＴｒｅｇのパーセントの差は免疫化及び抗体投与の前に観察されなかった。
末梢血Ｔｒｅｇのパーセントの有意な減少のほかに、ｈｕＩｇＧ１アイソタイプマッチ対照と比較してＯＸ４０ｍＡｂ２４による治療後にＣＤ４＋Ｔｅｍ：Ｔｒｅｇ比に統計的に有意な増加が見られ（ｐ＝０．０４２）、且つ全ＣＤ４＋：Ｔｒｅｇ比（ｐ＝０．０５１）、ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ：Ｔｒｅｇ比（ｐ＝０．１０）、及びＣＤ４＋Ｔｅｍ：Ｔｒｅｇ比（ｐ＝０．０６９）が有意な増加傾向を示した（図４４Ａ〜Ｄ）。同様に、ｈｕＩｇＧ１アイソタイプ対照で治療されたマウスと比較して、有意性への傾向はＯＸ４０ｍＡｂ２４で治療されたマウスの末梢血でＣＤ８＋Ｔｅｆｆ：Ｔｒｅｇ比の有意な増加傾向（ｐ＝０．０６４）が観察された（図４５Ａ〜Ｂ）。
活性化後にＣＤ２５（ＩＬ−２レセプター）がＴ細胞上でアップレギュレートされたことから、活性化されたばかりのＴ細胞のマーカーであると考えられる。ｈｕＩｇＧ１治療群と比較してＯＸ４０ｍＡｂ２４治療群でＣＤ２５陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントの増加が、全ＣＤ８＋Ｔ細胞（ｐ＝０．０３８）、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞（ｐ＝０．０７６）、及びエフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（ｐ＝０．０４０）として観察され（図４６Ａ〜Ｃ）。従って、ＯＸ４０ｍＡｂ２４によるＯＸ４０のアゴニズムにより対照抗体と比較して活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化された。
１２．３ 結論
ヒト免疫細胞が移植されたマウスでは、抗原免疫化後のＯＸ４０ｍＡｂ２４による治療は、ヒトＩｇＧ１対照抗体の投与を受けたマウスと比較して末梢Ｔｒｅｇ細胞の減少をもたらした。同様に、Ｔｒｅｇ細胞に対する全エフェクター・記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞の比及びエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の比もまた、ｈｕＩｇＧ１対照抗体の投与を受けたものと比較して、ＯＸ４０ｍＡｂ２４の投与を受けたマウスの末梢血で増加した。最後に、細胞表面上にＣＤ２５を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントがＯＸ４０ｍＡｂ２４治療後に増加したことから、末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化のＯＸ４０誘発が示唆される。
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Claims (70)

  1. ヒト化重鎖可変領域（ＶＨ）とヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む抗体又はその抗原結合断片であって、
    前記ＶＨが、式：
    ＨＦＷ１−ＨＣＤＲ１−ＨＦＷ２−ＨＣＤＲ２−ＨＦＷ３−ＨＣＤＲ３−ＨＦＷ４
    （式中、ＨＦＷ１は配列番号６又は配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は配列番号８であり、ＨＦＷ２は配列番号９であり、ＨＣＤＲ２は配列番号１４、配列番号１５又は配列番号１６であり、ＨＦＷ３は配列番号１７であり、ＨＣＤＲ３は配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７であり、及びＨＦＷ４は配列番号２８である）を有するアミノ酸配列を含み、
    前記ＶＬがアミノ酸配列、配列番号２９又は配列番号３２を含み、及び
    ヒトＯＸ４０に特異的に結合することができる抗体又はその断片。
  2. 前記ＨＦＷ２のアミノ酸配列が、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３である、請求項１に記載の抗体又はその断片。
  3. 前記ＨＦＷ３のアミノ酸配列が、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４である、請求項１又は２に記載の抗体又はその断片。
  4. 前記ＶＨがアミノ酸配列、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、又は配列番号６７を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
  5. 前記ＶＬがアミノ酸配列、配列番号２９を含み、且つ前記ＶＨがアミノ酸配列、配列番号５９を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
  6. 前記ＶＬのＣ末端に融合した軽鎖定常領域又はその断片を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
  7. 前記軽鎖定常領域がヒトκ定常領域である、請求項６に記載の抗体又はその断片。
  8. 前記ＶＨのＣ末端に融合した重鎖定常領域又はその断片を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
  9. 前記重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域、ヒトＩｇＧ４Ｐ定常領域、ヒトＩｇＧ１ＴＭ定常領域又はマウスＩｇＧ１定常領域である、請求項８に記載の抗体又はその断片。
  10. 前記重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１定常領域である、請求項９に記載の抗体又はその断片。
  11. 重鎖アミノ酸配列、配列番号７１及び軽鎖アミノ酸配列、配列番号３０を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
  12. 前記抗原結合断片が、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、ｄｓＦｖ断片、ｓｃＦｖ断片、又はｓｃ（Ｆｖ）２断片、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体又は断片。
  13. カニクイザル、又はアカゲザルＯＸ４０に特異的に結合することができる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
  14. ヒト、カニクイザル、アカゲザル、又はこれらの任意の組み合わせ由来のジャーカット細胞、初代活性化ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現するとおりのＯＸ４０に特異的に結合することができる、請求項１３に記載の抗体又はその断片。
  15. マウス又はラットＯＸ４０に結合しない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
  16. 関連する腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）タンパク質と交差反応しない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
  17. 初代活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現するヒトＯＸ４０に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約２５０ｐＭ〜約３７０ｐＭである、請求項１４に記載の抗体又はその断片。
  18. 前記結合親和性が約３１２ｐＭである、請求項１７に記載の抗体又はその断片。
  19. フローサイトメトリーによって計測するとき、初代活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対する２０％レセプター占有率（ＥＣ２０）を約６３〜約９３ｐＭで、初代活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対する５０％レセプター占有率（ＥＣ５０）を約２５０〜約３７０ｐＭで、及び初代活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対する９０％レセプター占有率（ＥＣ９０）を約２２９０〜約３３３０ｐＭで実現することができる、請求項１７又は１８に記載の抗体又はその断片。
  20. ＥＣ２０が約７８ｐＭであり、ＥＣ５０が約３１２ｐＭであり、及びＥＣ９０が約２８１０ｐＭである、請求項１９に記載の抗体又はその断片。
  21. ＯＸ４０過剰発現ジャーカット細胞上に発現するヒトＯＸ４０に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約２５０ｐＭ〜約６００ｐＭである、請求項１４に記載の抗体又はその断片。
  22. 前記結合親和性が約４２４ｐＭである、請求項２１に記載の抗体又はその断片。
  23. フローサイトメトリーによって計測するとき、ＯＸ４０過剰発現ジャーカット細胞に対するＥＣ２０を約６０〜約１５０ｐＭで、ＯＸ４０過剰発現ジャーカット細胞に対するＥＣ５０を約２５０〜約６００ｐＭで、及びＯＸ４０過剰発現ジャーカット細胞に対するＥＣ９０を約２２６０〜約４３８０ｐＭで実現することができる、請求項２１又は２２に記載の抗体又はその断片。
  24. ＥＣ２０が約１０６ｐＭであり、ＥＣ５０が約４２４ｐＭであり、及びＥＣ９０が約３８２０ｐＭである、請求項２３に記載の抗体又はその断片。
  25. 初代活性化カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現するカニクイザルＯＸ４０に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約３４０ｐＭ〜約８２０ｐＭである、請求項１４に記載の抗体又はその断片。
  26. 前記結合親和性が約５８０ｐＭである、請求項２５に記載の抗体又はその断片。
  27. 初代活性化アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現するアカゲザルＯＸ４０に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約１３０ｐＭ〜約６００ｐＭである、請求項１４に記載の抗体又はその断片。
  28. 前記結合親和性が約３７０ｐＭである、請求項２７に記載の抗体又はその断片。
  29. プレートベースのアッセイにおいて活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の用量依存的増殖及び初代活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞における用量依存的サイトカイン放出を誘導することができる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
  30. 全てフローサイトメトリーによって計測するとき、２０％最大増殖応答（ＥＣ２０）を初代活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞において約１４ｐＭ〜約２８ｐＭの抗体濃度で実現することができ、５０％最大増殖応答（ＥＣ５０）を初代活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞において約０．３ｐＭ〜約１３０ｐＭの抗体濃度で実現することができ、及び９０％最大増殖応答（ＥＣ９０）を初代活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞において約５０ｐＭ〜約９０ｐＭの抗体濃度で実現することができる、請求項２９に記載の抗体又はその断片。
  31. ＥＣ２０が約２１ｐＭであり、ＥＣ５０が約２８ｐＭであり、及びＥＣ９０が約７２ｐＭである、請求項３０に記載の抗体又はその断片。
  32. 前記サイトカインが、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ ｐ７０、ＩＬ−１β、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
  33. 前記サイトカインが、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項３２に記載の抗体又はその断片。
  34. 初代活性化カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞及び初代活性化アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞においてＣＤ４＋Ｔ細胞増殖及びサイトカイン放出を実現することができる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
  35. ＦｃγＲ発現細胞の存在下でＯＸ４０発現Ｔ細胞のＮＦκＢ経路を活性化させることができる、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
  36. 前記ＯＸ４０発現Ｔ細胞が、ＮＦκＢシグナル伝達経路の刺激に応答してルシフェラーゼを産生するＯＸ４０発現ジャーカットＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター細胞である、請求項３５に記載の抗体又はその断片。
  37. ＯＸ４０発現細胞に対する補体依存性又は抗体依存性細胞傷害を惹起することができる、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
  38. Ｃ１ｑに結合して、前記ＯＸ４０発現細胞に対するＮＫ媒介性抗体依存性細胞傷害を惹起することができる、請求項３７に記載の抗体又はその断片。
  39. 癌治療を必要としている対象に有効用量を投与すると、前記対象の腫瘍成長を阻害することができる、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
  40. 前記腫瘍成長阻害がＴ細胞の存在下で実現する、請求項３９に記載の抗体又はその断片。
  41. アイソタイプ対応対照抗体又はその断片の投与と比較して、腫瘍成長が少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％阻害される、請求項３９又は４０に記載の抗体又はその断片。
  42. 請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗体又はその断片と担体とを含む組成物。
  43. 請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗体又はその断片、又は請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗体又はその断片のポリペプチドサブユニットをコードする核酸を含むポリヌクレオチド。
  44. 配列番号６０の核酸、配列番号３１の核酸、配列番号７２の核酸、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項４３に記載のポリヌクレオチド。
  45. 請求項４３又は請求項４４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  46. 請求項４３又は請求項４４に記載のポリヌクレオチド又は請求項４５に記載のベクターを含む宿主細胞。
  47. 抗体又はその断片の作製方法であって、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記抗体又はその断片が発現する条件下で請求項４６に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記抗体又はその断片を回収するステップとを含む方法。
  48. 活性化Ｔ細胞の生存又は増殖を促進する方法であって、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を活性化Ｔ細胞と接触させるステップを含み、前記抗体又はその断片が前記Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる、方法。
  49. 活性化Ｔ細胞からのサイトカイン放出を誘導する方法であって、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を活性化Ｔ細胞と接触させるステップを含み、前記抗体又はその断片が前記Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる、方法。
  50. 前記サイトカインが、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ ｐ７０、ＩＬ−１β、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記サイトカインが、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記活性化Ｔ細胞が、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はこれらの組み合わせである、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞、カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞、アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞、又はこれらの組み合わせである、請求項５２に記載の方法。
  54. Ｔ細胞活性化を促進する方法であって、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗体又はその断片をＴ細胞と接触させるステップを含み、前記抗体又はその断片が前記Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる、方法。
  55. ＮＦκＢシグナル伝達経路の刺激によってＴ細胞活性化を計測することができる、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記Ｔ細胞が、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はこれらの組み合わせである、請求項５４又は５５に記載の方法。
  57. 前記活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞、カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞、アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞、又はこれらの組み合わせである、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記接触させるステップが、対象に前記抗体又はその断片の有効量を投与するステップを含む、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 対象の癌を治療する方法であって、治療を必要としている対象に、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片又は請求項４２に記載の組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
  60. 前記癌が固形腫瘍である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記抗体若しくはその断片又は組成物の投与により腫瘍成長を阻害することができるか、腫瘍縮小を促進することができるか、又は両方である、請求項５９又は６０に記載の方法。
  62. 腫瘍成長阻害がＴ細胞の存在下で実現する、請求項６１に記載の方法。
  63. 対象の免疫応答を増強する方法であって、それを必要としている対象に、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片、又は請求項４２に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
  64. 前記対象がヒト対象である、請求項５９〜６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 配列番号９１のアミノ酸１０８〜１４６の範囲内にあるヒトＯＸ４０のエピトープに結合する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
  66. 前記エピトープが少なくとも配列番号９１のアミノ酸ロイシン１１６及びアラニン１２６を含む、請求項６５に記載の抗体又はその断片。
  67. Ｑ１１３Ｌ突然変異及びＶ１２４Ａ突然変異を除いて配列番号９２を含むマウスＯＸ４０変異体に結合する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗体。
  68. １００アミノ酸以下からなる単離ペプチドであって、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗体又はその断片が特異的に結合することのできるペプチド。
  69. 配列番号９１のアミノ酸１１６〜１２６を含む、請求項６８に記載のペプチド。
  70. Ｌ１１６及びＡ１２６を除く任意の位置における１、２、３、４、５、又は６個の単一アミノ酸置換、欠失、又は挿入を除いて配列番号９１のアミノ酸１０８〜１４６を含む、請求項６８又は６９に記載のペプチド。
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