JP2018519364A - モノクローナル抗ＩＬ−１ＲＡｃＰ抗体 - Google Patents

Abstract

インターロイキン１受容体タイプ１（ＩＬ−１ＲＡｃＰ）に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ａ）ＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２Ｈおよび／またはＣＤＲ３Ｈを含み、ＣＤＲ１Ｈ領域が、配列番号１５５〜２３１の群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２Ｈ領域が、配列番号２３２〜３０８の群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＣＤＲ３Ｈ領域が、配列番号３０９〜３８５の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、ｂ）ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２Ｌおよび／またはＣＤＲ３Ｌを含み、ＣＤＲ１Ｌ領域が、配列番号３８６〜４６２の群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２Ｌ領域が、配列番号４６３〜５３９の群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＣＤＲ３Ｌ領域が、配列番号５４０〜６１６の群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。該モノクローナル抗体は、それが、ＩＬ−１ＲＡｃＰに誘導されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とし、ＩＬ−１ＲＡｃＰ関連疾患の治療に有用である。

Description

本発明は、モノクローナル抗ＩＬ−１ＲＡｃＰ抗体、その製造方法およびその使用に関する。

背景
ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰ（Ｑ９ＮＰＨ３（ＩＬ１ＡＰ＿ＨＵＭＡＮ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ））は、ＩＬ−１ファミリーの受容体を通じたシグナルの伝達に必要とされるアクセサリータンパク質である。インターロイキン−１受容体複合体は、ＩＬ−１Ｒ１とＩＬ−１ＲＡｃＰとのヘテロ二量体である。ＩＬ−１が結合すると、ＩＬ−１Ｒ１はＩＬ−１ＲＡｃＰと会合して、機能的なシグナル伝達受容体複合体を形成し、それがＮＦκＢ活性を刺激する。

ＩＬ−３３と、その受容体のＳＴ２と、ＩＬ−１ＲＡｃＰとはまた、ＮＦκＢ活性化に関してＩＬ−１β／ＩＬ−１Ｒ１／ＩＬ−１ＲＡｃＰ複合体と類似の活性を有する複合体（ＩＬ−３３／ＳＴ２／ＩＬ−１ＲＡｃＰ）を形成する。ＩＬ−３６（ＩＬ−３６α（ＩＬ−１Ｆ６）、ＩＬ−３６β（ＩＬ−１Ｆ８）およびＩＬ−３６γ（ＩＬ−１Ｆ９））と、それらの受容体のＩＬ−３６Ｒと、ＩＬ−１ＲＡｃＰとはまた、ＮＦκＢ活性化に関してＩＬ−１β／ＩＬ−１Ｒ１／ＩＬ−１ＲＡｃＰ複合体と類似の活性を有する複合体（ＩＬ−３６／ＩＬ−３６Ｒ／ＩＬ−１ＲＡｃＰ）を形成する。

国際公開第１９９６２３０６７号（ＷＯ１９９６２３０６７）は、マウスＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質に特異的に結合するＩＬ−１ＲＡｃＰ抗体に関する。実施例１５および１６は、ＩＬ−１の生物学的活性を中和する抗ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰ抗体の生成を試みることを記載している。しかしながら、そのような抗体は、国際公開第１９９６２３０６７号（ＷＯ１９９６２３０６７）および実施例１６によって提供されておらず、ＩＬ−１誘導性ＩＬ−６アッセイの記載は仮説にすぎない。Ｄｏ−Ｙｏｕｎｇ Ｙｏｏｎ Ｄ−ＹおよびＣｈａｒｌｅｓ Ａ．Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ ＣＡは、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１６０：３１７０−３１７９において、ＩＬ−１β活性を阻害するが結合はしないマウスＩＬ−１ＲＡｃＰのドメインＩＩおよびＩＩＩに対するポリクローナル抗体を記載している。しかしながら、より高濃度のＩＬ−１β（１０００ｐｇ／ｍｌ）では、このポリクローナル抗血清は、Ｄ１０Ｓ細胞の増殖を阻止しなかった（Ｄ１０Ｓは、マイトジェンの不在下にフェムトモル濃度未満（アトモル濃度）のＩＬ−１βまたはＩＬ−１αまで増殖するマウスのＤ１０．Ｇ４．１ヘルパーＴ細胞のサブクローンである、Ｏｒｅｎｃｏｌｅ ＳＦ ａｎｄ Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ ＣＡ； Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １（１９８９）１４−２２を参照）。Ｊａｒａｓ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０７（２０１０）１６２８０−１６２８５は、ウサギポリクローナル抗ＩＬ１ＲＡｃＰ抗体ＫＭＴ−１の、ＣＭＬ幹細胞の殺滅のための使用を記載している。この抗体は、ＡＤＣＣをＩＬ１ＲＡｃＰに非依存的に誘導し、それはそのウサギＦｃ部によって引き起こされる。Ｊａｒａｓらは「可能性を秘めた未来の治療用ＩＬ１ＲＡＰターゲティング抗体は、正常な造血細胞に対する低い毒性を示すと予想される」と予想している。また、マウスＩＬ−１ＲＡｃＰに対するポリクローナルウサギ抗体は、Ｄｏ−Ｙｏｕｎｇ Ｙｏｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ａ．Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．４，Ｊｕｌｙ ２００７，ｐｐ．５６２−５７０でも述べられている。

マウス、ラットおよびヒトのＩＬ１ＲＡｃＰに結合するウサギポリクローナル抗体（ａｂ８１１０）は、Ａｂｃａｍ社（米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）から市販されている。Ａｂｃａｍ社製のａｂ８１０９は、ヒトＩＬ１ＲＡｃＰのみに結合する。ＢＡＬＡＧＵＲＵＮＡＴＨＡＮ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．７（２００８）３０７１−３０８０は、Ａｂｃａｍ社製のポリクローナルウサギ抗ＩＬ１ ＲＡＰ抗体を、膵臓腫瘍細胞の特定のために使用することを述べている。

国際公開第２００２０６４６３０号（ＷＯ２００２０６４６３０）はまた、ＩＬ−１ＲＡｃＰおよびその使用に関するが、ＩＬ−１ＲＡｃＰに対する抗体は記載されていない。国際公開第２００４０２２７１８号（ＷＯ２００４０２２７１８）および国際公開第２００９１２０９０３号（ＷＯ２００９１２０９０３）は、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＬ５Ｒ、ＩＮＳＲ、ＩＬ１ＲＬ１、ＬＴＫおよびＴＡＣＳＴＤ１に対する抗体は、従来技術に従って生成できることを理論的に述べている。しかしながら、ここでもＩＬ−１ＲＡｃＰに対する抗体は記載されていない。国際公開第２０１１０２１０１４号（ＷＯ２０１１０２１０１４）および国際公開第２０１２０９８４０７号（ＷＯ２０１２０９８４０７）（米国特許出願公開第２０１４００１７１６７号明細書（ＵＳ２０１４００１７１６７））は、ポリクローナルウサギ抗ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰ抗血清ＫＭＴ−１（Ｊａｒａｓ ｅｔ ａｌ．２０１０を参照）およびその使用に関する。国際公開第２０１４１００７７２号（ＷＯ２０１４１００７７２）は、ＩＬ−１ＲＡｃＰに結合する抗ＩＬ−１ＲＡｃＰ抗体に関する。しかしながら、ＮＦκＢ活性を刺激する機能的なシグナル伝達受容体複合体（ＩＬ−１β／ＩＬ−１Ｒ１／ＩＬ−１ＲＡｃＰ等）の阻害に関する活性は一切記載されていない。米国特許第６２８０９５５号明細書（ＵＳ６２８０９５５）はまた、ＩＬ−１ＲＡｃＰおよびその使用に関するが、またしてもＩＬ−１ＲＡｃＰに対する抗体は記載されていない。米国特許第７３９０８８０号明細書（ＵＳ７３９０８８０）は、ＩＬ１ＲＡｃＰのＮ末端断片を述べているが、またもやＩＬ−１ＲＡｃＰに対する抗体は記載されていない。

国際公開第２００４１００９８７号（ＷＯ２００４１００９８７）は、新生内膜過形成の治療のための薬剤の製造におけるインターロイキンＩ（ＩＬ−１）アンタゴニストの使用および新生内膜過形成の治療のためのＩＬ−１アンタゴニストの使用に関する。そのようなアンタゴニストとして、抗ＩＬ−１ＲＡｃＰ抗体が示唆されているが、さらに記載はされていない。米国特許出願公開第２００３０２６８０６号明細書（ＵＳ２００３０２６８０６）は、ＩＬ−１に結合する抗体に関する。国際公開第２００２０６４６３０号（ＷＯ２００２０６４６３０）はまた、ＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質に対するＩＬ−１アンタゴニストに関する。ＩＬ−１ＲＡｃＰアンタゴニストのスクリーニングのためのＩＬ−１ＲＡｃＰの使用が述べられているが、そのような方法またはアンタゴニストは開示されていない。

国際公開第２００３０１４３０９号（ＷＯ２００３０１４３０９）は、慢性骨髄性白血病の治療のためのＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質の使用に関する。国際公開第２０１３０２３０１５号（ＷＯ２０１３０２３０１５）は、ＡＭＬの予後の決定方法および初期幹細胞におけるＩＬ−１ＲＡｃＰの発現または活性を阻害する剤を投与することによるＡＭＬの治療方法に関する。そのような剤として、ＩＬ−１ＲＡｃＰのｓｈＲＮＡが挙げられている。

ヒトＮＦ−κＢは、炎症、免疫応答およびアポトーシスに関与する幾つかの遺伝子の発現の重要な調節因子であり、したがってＮＦκＢの機能障害は、自己免疫疾患、神経変性疾患、炎症および癌を含む様々な疾患の病理に関与している。例えば、ＮＦ−κＢ経路は、ＯＡの治療における重要なターゲットであり、ヒトＩＬ１βで刺激されるヒトＮＦκＢ活性の阻害は、例えば骨関節症の治療において重要となることがある。したがって、ヒトＩＬ−１Ｒ１／ＩＬ−１ＲＡｃＰ複合体のシグナル伝達活性の阻害を介してヒトＮＦκＢ経路を調節するモノクローナル抗体は、人間の様々な疾患の治療において有用な治療剤となると考えられる。

しかしながら、ヒトＩＬ１ＲＡｃＰに対する機能的なモノクローナル抗体を生成する約１５年を超える試みは成功に至っておらず、したがって今日でもそのような必要性が存在する。

発明の概要
本発明は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対するモノクローナル抗体を提供する。好ましくは、本発明による抗体は、マウスＩＬ−１ＲＡｃＰにさらに結合する。

本発明は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対するモノクローナル抗体であって、ＩＬ−１ＲＡｃＰに誘導されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とするモノクローナル抗体を提供する。

本発明は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。好ましくは、本発明による抗体は、マウスＩＬ−１ＲＡｃＰにさらに結合する。

本発明は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、ＩＬ−１ＲＡｃＰに誘導されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とするモノクローナル抗体を提供する。好ましくは、本発明による抗体は、マウスＩＬ−１ＲＡｃＰに誘導されるマウスＮＦκＢ活性をさらに阻害する。

本発明は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対するモノクローナル抗体であって、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６によって刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とするモノクローナル抗体を提供する。本発明は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対するモノクローナル抗体であって、ＩＬ−１αで刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とするモノクローナル抗体を提供する。本発明は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対するモノクローナル抗体であって、ＩＬ−１βで刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とするモノクローナル抗体を提供する。

本発明は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対するモノクローナル抗体であって、ＩＬ３３で刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とするモノクローナル抗体を提供する。本発明は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対するモノクローナル抗体であって、ＩＬ３６で刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とするモノクローナル抗体を提供する。

本発明は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対するモノクローナル抗体であって、ＩＬ−１β／ＩＬ−１Ｒ１／ＩＬ−１ＲＡｃＰ、ＩＬ−１α／ＩＬ−１Ｒ１／ＩＬ−１ＲＡｃＰ、ＩＬ−３３／ＳＴ２／ＩＬ−１ＲＡｃＰおよびＩＬ−３６／ＩＬ−３６Ｒ／ＩＬ−１ＲＡｃＰからなる群から選択される複合体によって刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とするモノクローナル抗体を提供する。

好ましくは、本発明による抗体は、マウスＩＬ−１ＲＡｃＰに結合し、かつマウスＩＬ−１ＲＡｃＰに誘導されるマウスＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする。

好ましくは、本発明による抗体は、５μｇ／ｍｌの濃度（ウサギＩｇＧアイソタイプは、１５０ＫＤの分子量を有する）で、０．５μｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６（分子量は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔを参照のこと）で刺激された２９３Ｔ／１７細胞溶解物（２９３Ｔ／１７［ＨＥＫ ２９３Ｔ／１７］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１１２６８（商標）））において、ＮＦκＢ活性を、本発明による前記抗体を用いない同様のアッセイに対して７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上も阻害することを特徴とする。

好ましくは、本発明による抗体は、５μｇ／ｍｌの濃度で、０．５μｇ／ｍｌのマウスＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６（分子量は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔを参照のこと）で刺激されたそれぞれのマウス細胞株溶解物において、ＮＦκＢ活性を、本発明による前記抗体を用いない同様のアッセイに対して７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上も阻害することを特徴とする。

好ましくは、本発明による抗体は、野生型のヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む本発明による抗体によって誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％以下、好ましくは少なくとも１０％以下まで低減されたＡＤＣＣを示すことを特徴とする。

好ましくは、本発明による抗体は、野生型のＩｇＧのＦｃ領域を含む本発明による抗体と比較して低減された、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩに対する親和性を示し、ここで、本発明による前記抗体によって誘導されるＡＤＣＣは、野生型のヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む本発明による抗体によって誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％まで低減されることを特徴とする。

好ましくは、本発明による抗体は、ＡＤＣＣおよび／またはＣ１ｑ結合の低減のようなエフェクター機能の低減を示す。特に、本発明は、野生型のヒトＩｇＧのＦｃ領域のＦｃ多様体を含む本発明による抗体を提供し、この前記Ｆｃ多様体は、位置Ｐｒｏ３２９に１つのアミノ酸置換と、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を含むものであり、ここで、それらの残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ってナンバリングされており、また、前記本発明による抗体は、野生型のＩｇＧのＦｃ領域を含む本発明による抗体と比較して低減された、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩに対する親和性を示し、またここで、本発明による前記抗体によって誘導されるＡＤＣＣは、野生型のヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む本発明による抗体によって誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％まで低減される。

特定の一実施形態においては、前記ポリペプチドにおける野生型のヒトＦｃ領域のＰｒｏ３２９は、グリシンもしくはアルギニンで、またはＦｃのプロリン３２９と、ＦｃγＲＩＩＩのトリプトファン残基Ｔｒｐ８７およびＴｒｐ１１０との間に形成されるＦｃγ受容体境界内のプロリンサンドウィッチを破壊するのに十分に大きいアミノ酸残基で置換される（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ ４０６，２６７−２７３（２０ Ｊｕｌｙ ２０００））。本発明のさらなる一態様においては、Ｆｃ多様体における少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７ＤまたはＰ３３１Ｓからなる群から選択され、さらにもう一つの実施形態においては、前記の少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅである。

本発明のもう一つの態様においては、提供される本発明による抗体は、野生型のヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む本発明による抗体と比較して、ヒト受容体ＦｃγＩ、ＦｃγＩＩＡおよびＣ１ｑを含む群の少なくとも１つのさらなる受容体に対して低減された親和性を示す。本発明のさらにもう一つの態様においては、本発明による抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃ領域を含む。

本発明のさらなる一態様は、野生型のヒトＩｇＧのＦｃ領域のＦｃ多様体を含み、グリシンで置換されたヒトＩｇＧのＦｃ領域のＰｒｏ３２９を有する抗体であって、ここで、前記残基がＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ってナンバリングされており、またヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＡに対する低減された親和性を示す本発明による抗体の、野生型のヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む本発明による抗体によって誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％までＡＤＣＣを抑制的調節するための、および／またはＡＤＣＣの抑制的調節をするための使用である。

本発明のもう一つの態様は、野生型のヒトＩｇＧのＦｃ領域のＦｃ多様体を含み、グリシンで置換されたヒトＩｇＧのＦｃ領域のＰｒｏ３２９を有する抗体であって、ここで、前記Ｆｃ多様体が、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４ＡおよびＬ２３５ＡならびにヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅでの少なくとも２つのさらなるアミノ酸置換を含み、前記残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ってナンバリングされており、またヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＡに対する低減された親和性を示す本発明による抗体の、野生型のヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む本発明による抗体によって誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％までＡＤＣＣを抑制的調節するための、および／またはＡＤＣＣの抑制的調節をするための使用である。

本発明のもう一つの態様においては、疾患を伴う個体を、グリシンで置換されたヒトＩｇＧのＦｃ領域のＰｒｏ３２９を有する本発明による抗体で処理する該個体の治療方法であって、前記残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ってナンバリングされており、ここで、前記本発明による抗体が、野生型のヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む本発明による抗体と比較して大きく低減されたＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡの結合を特徴とする治療方法において、前記個体に、有効量の本発明による前記抗体を投与することを含む方法が提供される。

本発明のさらにもう一つの態様においては、前記方法で使用される本発明による抗体は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅでの少なくとも２つのさらなるアミノ酸置換を含む。

本発明は、好ましくは、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対する抗体であって、重鎖可変（ＶＨ）領域が、配列番号１〜配列番号７７のＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域に対して少なくとも９０％同一である抗体を提供する。

本発明は、好ましくは、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対する抗体であって、軽鎖可変（ＶＬ）領域が、配列番号７８〜配列番号１５４のＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域に対して少なくとも９０％同一であることを特徴とする抗体を提供する。

本発明は、好ましくは、本発明による抗体であって、そのＶＨ領域が配列番号１＋ｎのＶＨ領域と少なくとも９０％同一であり、かつそのＶＬ領域が配列番号７８＋ｎのＶＬ領域と少なくとも９０％同一であり、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする抗体を提供する。

本発明は、好ましくは、本発明による抗体であって、そのＶＨ領域が配列番号１＋ｎのＶＨ領域からなる群から選択され、かつそのＶＬ領域が配列番号７８＋ｎのＶＬ領域からなる群から選択され、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする抗体を提供する。

本発明は、好ましくは、本発明による抗体であって、該抗体が、配列番号１５５＋ｎのＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２３２＋ｎのＣＤＲ２Ｈ領域、および配列番号３０９＋ｎのＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域の群から選択されるＶＨ領域を含み、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする抗体を提供する。

本発明は、好ましくは、本発明による抗体であって、該抗体が、配列番号３８６＋ｎのＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号４６３＋ｎのＣＤＲ２Ｌ領域、および配列番号５４０＋ｎのＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域の群から選択されるＶＬ領域を含み、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする抗体を提供する。

本発明は、好ましくは、本発明による抗体であって、該抗体が、配列番号１５５＋ｎのＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２３２＋ｎのＣＤＲ２Ｈ領域、および配列番号３０９＋ｎのＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域の群から選択されるＶＨ領域を含み、かつ前記抗体が、配列番号３８６＋ｎのＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号４６３＋ｎのＣＤＲ２Ｌ領域、および配列番号５４０＋ｎのＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域の群から選択されるＶＬ領域を含み、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする抗体を提供する。

本発明は、好ましくは、本発明による抗体であって、抗体Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｂ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ａ０５、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｃ０４、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｈ０１、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｄ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｅ０２、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０４、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０５、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０２、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｄ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｈ０１、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｆ０１、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｂ０４、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｃ０２、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｂ０５、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｈ０３およびＰ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｇ０５からなる群から選択される抗体のそれぞれのＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域およびＶＬ領域を含むことを特徴とする抗体を提供する。

本発明は、好ましくは、本発明による抗体であって、抗体Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｂ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ａ０５、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｃ０４、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｈ０１、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｄ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｅ０２、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０４、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０５、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０２、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｄ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｈ０１、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｆ０１、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｂ０４、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｃ０２、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｂ０５、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｈ０３およびＰ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｇ０５からなる群から選択される抗体のそれぞれのＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域およびＶＬ領域を含むことを特徴とする抗体を提供する。

本発明は、好ましくは、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに特異的に結合する抗体であって、抗体Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｂ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ａ０５、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｃ０４、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｈ０１、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｄ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｅ０２、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０４、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０５、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０２、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｄ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｈ０１、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｆ０１、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｂ０４、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｃ０２、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｂ０５、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｈ０３およびＰ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｇ０５の群から選択される抗体と同じエピトープに結合する、ＩＬ−１ＲＡｃＰに誘導されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする抗体を提供する。

本発明は、好ましくは、本発明による抗体であって、モノクローナルウサギ抗体、ウサギ／ヒトキメラ抗体またはヒト化ウサギ抗体であることを特徴とする抗体を提供する。

本発明は、本発明によるＩＬ１βで刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とするヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対するモノクローナルウサギ抗体の製造方法であって、
ｉ）前記ウサギをＩＬ−１ＲＡｃＰで免疫化した後に、前記ウサギから得られた多くの抗体産生単一細胞を単離するステップ、
ｉｉ）ＩＬ−１ＲＡｃＰへの結合を、前記単一細胞の上清について個別に測定するステップ、
ｉｉｉ）その上清がヒトおよびマウスＩＬ−１ＲＡｃＰへの結合を示し、かつＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６によって刺激されるＮＦκＢ活性を阻害する場合に、単一細胞を選択するステップ、
ｉｖ）ステップｉｉｉ）の特性を有する抗体を、前記選択された細胞から単離するステップ
を特徴とする製造方法を提供する。

好ましくは、ウサギ抗体産生単一細胞は、ウサギハイブリドーマ単一Ｂ細胞である。

本発明は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに結合し、かつＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６によって刺激されるＮＦκＢ活性を阻害するモノクローナルウサギ抗体の製造方法を提供する。

本発明は、本発明によるモノクローナルウサギ抗体の製造方法であって、前記ウサギを前記抗原で免疫化した後に、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰへの結合と、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６によって刺激されるＮＦκＢ活性の阻害とが、本発明により見出される場合に、抗体産生単一細胞、好ましくはＢ細胞由来の細胞を前記動物から単離するか、または前記ウサギから得られたウサギハイブリドーマ細胞を単離することを特徴とする方法を提供する。

本発明は、好ましくは、本発明による抗体の、医薬組成物の製造のための使用を提供する。

本発明は、抗体産生ウサギ単一細胞、好ましくは単一Ｂ細胞またはウサギハイブリドーマ細胞の上清であって、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰへと結合し、かつ本発明によるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６によって刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする上清を提供する。

本発明は、好ましくは、本発明による抗体産生ウサギ単一細胞、好ましくは単一Ｂ細胞またはウサギハイブリドーマ細胞の上清であって、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰへと結合し、かつ本発明によるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６により刺激されるＮＦκＢ活性を阻害し、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰへの結合、およびＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６により刺激されるＮＦκＢ活性の阻害は、前記細胞の上清について測定され、かつ前記抗体は、本発明による特性を示す場合に前記細胞から単離されることを特徴とする上清を提供する。

本発明は、本発明によるモノクローナルウサギ抗体の製造方法であって、
ｉ）前記ウサギを前記ターゲット抗原で免疫化した後に、前記ウサギから得られた多くの抗体産生単一細胞を単離するステップと、
ｉｉ）ＩＬ−１ＲＡｃＰへの結合を、前記単一細胞の上清について個別に測定するステップと、
ｉｉｉ）その上清がヒトおよびマウスＩＬ−１ＲＡｃＰへの結合を示し、かつ本発明によるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６によって刺激されるＮＦκＢ活性を阻害する場合に、単一細胞を選択するステップと、
ｉｖ）抗体がステップｉｉｉ）による特性を示す場合に、前記選択された細胞から抗体を単離するステップと
を特徴とする製造方法を提供する。

好ましくは、免疫化のために使用される抗原（ＩＬ−１ＲＡｃＰ）は、前記抗原およびヒトＦｃポリペプチドからなる融合ポリペプチドである。好ましくは、ステップｉ）においてＣＦＡがアジュバントとして使用される。好ましくは、ステップｉ）においてＣＦＡおよびＩＦＡが一緒にアジュバントとして使用される。

好ましくは、ステップｉｉ）においてＢ細胞はウサギの血液から単離される。Ｂ細胞は、好ましくはＰＢＭＣとして単離され、マクロファージが除去される。ステップｉｖ）においてＢ細胞の単離のために使用される抗原は、ターゲットタンパク質ＩＬ−１ＲＡｃＰまたはその機能的断片、好ましくはその細胞外ドメインまたはその部分、その表面上に抗原を提示する細胞等である。

好ましくはステップｉｉｉ）において、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧを分泌する単一Ｂ細胞は、好ましくはＦＡＣＳによって分離される。好ましくは、単一Ｂ細胞を次いで、ステップｉｖ）の実施前にフィーダー細胞で処理する。

好ましくはステップｉｉｉ）において、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに特異的に結合し、かつＩＬ−１ＲＡｃＰに誘導されるＮＦκＢ活性を阻害する抗体を分泌することを特徴とする単一Ｂ細胞が分離される。好ましくはステップｉｉｉ）において、ヒトおよびマウスのＩＬ−１ＲＡｃＰに特異的に結合し、かつマウスＩＬ−１ＲＡｃＰに誘導されるマウスＮＦκＢ活性をさらに阻害する抗体を分泌することを特徴とする単一Ｂ細胞が分離される。

好ましくはステップｉｉｉ）において、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６によって刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とするヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対する抗体を分泌することを特徴とする単一Ｂ細胞が分離される。好ましくはステップｉｉｉ）において、ＩＬ１αで刺激されるＮＦκＢ活性を阻害するヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対する抗体を分泌することを特徴とする単一Ｂ細胞が分離される。好ましくはステップｉｉｉ）において、ＩＬ１βで刺激されるＮＦκＢ活性を阻害するヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対する抗体を分泌することを特徴とする単一Ｂ細胞が分離される。

好ましくはステップｉｉｉ）において、ＩＬ３３で刺激されるＮＦκＢ活性を阻害するヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対する抗体を分泌することを特徴とする単一Ｂ細胞が分離される。好ましくはステップｉｉｉ）において、ＩＬ３６で刺激されるＮＦκＢ活性を阻害するヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対する抗体を分泌することを特徴とする単一Ｂ細胞が分離される。

好ましくはステップｉｉｉ）において、かつＩＬ−１β／ＩＬ−１Ｒ１／ＩＬ−１ＲＡｃＰ、ＩＬ−１α／ＩＬ−１Ｒ１／ＩＬ−１ＲＡｃＰ、ＩＬ−３３／ＳＴ２／ＩＬ−１ＲＡｃＰおよびＩＬ−３６／ＩＬ−３６Ｒ／ＩＬ−１ＲＡｃＰからなる群から選択される複合体によって刺激されるＮＦκＢ活性を阻害するヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対する抗体を分泌することを特徴とする単一Ｂ細胞が分離される。

好ましくはステップｉｉｉ）において、マウスＩＬ−１ＲＡｃＰに結合し、かつマウスＩＬ−１ＲＡｃＰに誘導されるマウスＮＦκＢ活性を阻害する抗体を分泌することを特徴とする単一Ｂ細胞が分離される。

好ましくはステップｉｉｉ）において、５μｇ／ｍｌの濃度（ウサギＩｇＧアイソタイプは、１５０ＫＤの分子量を有する）で、０．５μｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６（分子量は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔを参照のこと）で刺激された２９３Ｔ／１７細胞溶解物（２９３Ｔ／１７［ＨＥＫ ２９３Ｔ／１７］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１１２６８（商標）））において、ＮＦκＢ活性を、本発明による前記抗体を用いない同様のアッセイに対して７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上も阻害する抗体を分泌することを特徴とする単一Ｂ細胞が分離される。

好ましくはステップｉｉｉ）においては、５μｇ／ｍｌの濃度で、０．５μｇ／ｍｌのマウスＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６（分子量は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔを参照のこと）で刺激されたそれぞれのマウス細胞株溶解物において、ＮＦκＢ活性を、本発明による前記抗体を用いない同様のアッセイに対して７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上も阻害する抗体を分泌することを特徴とする単一Ｂ細胞が分離される。

好ましくはステップｉｉｉ）において、ＮＦ−κＢレポーター遺伝子の制御下にルシフェラーゼでトランスフェクションされた２９３Ｔ／１７細胞において、ｍｏｌ／ｌのＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６、例えば抗体ＸＸまたはそれより多くで刺激されて抗体を分泌することを特徴とする単一Ｂ細胞が分離される。

好ましくは本発明による方法は、ステップｉｉｉ）において、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに特異的に結合する抗体のＶＨ領域をコードするｍＲＮＡを含む単一Ｂ細胞を分離することを特徴とする。

好ましくは、抗体は、ウサギモノクローナル抗体である。

好ましくは、単一Ｂ細胞によって産生された抗体は、好ましくはＥＬＩＳＡによって、それがそれぞれの抗原に特異的に結合するか否かについて試験される。

好ましくは、該抗体は、それがＩＬ−１ＲＡｃＰに特異的に結合するか否かについて試験され、結合する場合に選択される。好ましくは、前記抗体は、組換え的にその核酸および／またはポリペプチド配列に基づいて製造される。

好ましくはステップｉｉｉ）において、配列番号１＋ｎのＶＨ領域と少なくとも９０％同一である、図２に規定されるＩＬ−１ＲＡｃＰ特異的抗体のＶＨ領域をコードするｍＲＮＡを含み、かつ配列番号７８＋ｎのＶＬ領域と少なくとも９０％同一である、ＩＬ−１ＲＡｃＰに特異的に結合する抗体のＶＬ領域をコードするｍＲＮＡを含む単一Ｂ細胞が選択され、ここで、ｎは、０〜７６の群から選択される数である。

本発明による「ｎは、０〜７６の群から選択される数である」とは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０，３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５および７６の群から選択される数を意味する。本発明による数「ｎ」は、同じ抗体、その重鎖および軽鎖、その可変領域およびＣＤＲ領域については同一であることを意味する。

本発明は、本明細書に記載されるアミノ酸配列に特異的に結合することを特徴とするモノクローナル抗体を含む。

ＩＬ−１ＲＡｃＰ特異的抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域は、好ましくは前記ＶＨ領域が、配列番号１〜配列番号７７のＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域に対して少なくとも９０％同一であることを特徴とする。ＨＥＲ特異的抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域は、好ましくは前記ＶＬ領域が、配列番号７８〜配列番号１５４のＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域に対して少なくとも９０％同一であることを特徴とする。本発明による抗体は、好ましくは、そのＶＨ領域が配列番号１＋ｎのＶＨ領域と少なくとも９０％同一であり、かつそのＶＬ領域が配列番号７８＋ｎのＶＬ領域と少なくとも９０％同一であり、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする。本発明による抗体は、好ましくは、そのＶＨ領域が配列番号１＋ｎのＶＨ領域からなる群から選択され、かつそのＶＬ領域が配列番号７８＋ｎのＶＬ領域からなる群から選択され、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする。本発明による抗体は、好ましくは、図２に列挙される抗体からなる群から選択される抗体のそれぞれのＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域およびＶＬ領域を含むことを特徴とする。本発明による抗体は、好ましくは、該抗体が、配列番号１５５＋ｎのＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２３２＋ｎのＣＤＲ２Ｈ領域、および配列番号３０９＋ｎのＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域の群から選択されるＶＨ領域を含み、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする。

本発明による抗体は、好ましくは、該抗体が、配列番号３８６＋ｎのＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号４６３＋ｎのＣＤＲ２Ｌ領域、および配列番号５４０＋ｎのＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域の群から選択されるＶＬ領域を含み、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする。

本発明による抗体は、好ましくは、該抗体が、配列番号１５５＋ｎのＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２３２＋ｎのＣＤＲ２Ｈ領域、および配列番号３０９＋ｎのＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域の群から選択されるＶＨ領域を含み、かつ前記抗体が、配列番号３８６＋ｎのＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号４６３＋ｎのＣＤＲ２Ｌ領域、および配列番号５４０＋ｎのＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域の群から選択されるＶＬ領域を含み、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする。

本発明はまた、組成物、Ｂ細胞、本発明による抗体の使用方法および産生方法を提供する。

本発明による抗体は、好ましくは、前記抗体のヒト化型またはキメラ化型であることを特徴とする。好ましくは、本発明による抗体は、非相同の非ヒト配列、ヒト配列、またはヒト化された配列（例えば、フレームワーク配列および／または定常ドメイン配列）にグラフトされたウサギドナー由来の抗原結合配列を含む抗体である。好ましくは、本発明の抗体は、ウサギＶ領域またはウサギＣＤＲ領域およびヒトＣ領域および／またはフレームワークを有する。好ましくは、ウサギ軽鎖ＣＤＲを含むウサギＶＬ領域またはヒトフレームワーク領域は、ヒトκ軽鎖定常領域に融合される。好ましくは、ウサギ重鎖ＣＤＲを含むウサギＶＨ領域またはヒトフレームワーク領域は、ヒト定常領域、好ましくはＩｇＧ１に融合される。好ましくは、本発明は、キメラまたはヒト化されたウサギ抗体であって、可変軽鎖ＶＬ中のアミノ酸７５〜８５の間の位置にあるシステインの代わりにセリンを含むことを特徴とする抗体に関する。

本発明はまた、本発明による抗体を含むことを特徴とする医薬組成物を提供する。本発明はまた、本発明による抗体の、医薬組成物の製造のための使用を提供する。本発明はまた、治療を必要とする、好ましくは癌の治療における治療を必要とする患者の治療のための本発明による抗体を提供する。本発明はまた、乳癌、結腸癌、肺癌または膵臓癌の治療のための本発明による抗体を提供する。本発明はまた、本発明による抗体の、治療を必要とする、好ましくは癌の治療における治療を必要とする患者の治療のための薬剤の製造のための使用を提供する。本発明はまた、本発明による抗体の、乳癌、結腸癌、肺癌または膵臓癌の治療のための薬剤の製造のための使用を提供する。本発明はまた、治療を必要とする、好ましくは癌の治療における、好ましくは乳癌、結腸癌、肺癌または膵臓癌の治療における治療を必要とする患者の治療において使用するための本発明による抗体を提供する。

本発明はまた、本発明による抗体をコードする核酸を提供する。本発明はまた、原核性宿主細胞または真核性宿主細胞における本発明による抗体の発現のための本発明による核酸を含むことを特徴とする発現ベクターを提供する。本発明はまた、本発明による核酸を含む原核性宿主細胞または真核性宿主細胞を提供する。本発明はまた、本発明による抗体の製造方法であって、本発明による核酸を原核性宿主細胞または真核性宿主細胞において発現させ、そして前記細胞または細胞培養上清から前記抗体を回収することを特徴とする方法を提供する。

好ましくは、本発明の抗体は、アンタゴニスト抗体である。

前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域または前記ＣＤＲ領域を含む前記抗体の配列は、図２に示されている。

発明の詳細な説明
本発明による用語「ウサギ」は、分類学上のウサギ目に属する動物、科（ノウサギおよびアナウサギ）ならびにナキウサギ科（ナキウサギ）、好ましくはアナウサギ属の動物を意味する。

用語「抗体」は、様々な抗体構造の形態、例えば制限されるものではないが、それが本発明による特性を示す限りは、全抗体および抗体フラグメントを包含する。本発明による抗体は、ウサギＢ細胞によって産生されたその一次形態であり、それはＩＬ−１ＲＡｃＰに結合する。したがって、本発明による抗体は、その抗原結合部、好ましくは３つのＶＨのＣＤＲを含むそのＶＨ領域および／または３つのＶＬのＣＤＲを含むそのＶＬ領域に基づきＩＬ−１ＲＡｃＰに特異的に結合する。

本発明による用語「ウサギモノクローナル抗体」は、ウサギを免疫化することによって産生され、前記抗原産生ウサギ細胞から単離されるモノクローナル抗体だけでなく、本発明による特徴的な特性が維持される限りは、さらに改変されたそのような抗体、好ましくはヒト化抗体、キメラ抗体、そのフラグメントまたはさらに遺伝子操作されて組換え的に製造された抗体を意味する。好ましくは、抗体は、前記ウサギＢ細胞またはウサギのハイブリドーマ細胞に由来する。

本発明による用語「抗体産生細胞」は、抗体産生ウサギＢ細胞、好ましくはＢ細胞またはウサギハイブリドーマ細胞を意味する。

「ネイティブ抗体」は、通常は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。それぞれの軽鎖は、重鎖へと１つの共有ジスルフィド結合によって結合されるが、ジスルフィド結合の数は、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖につき様々である。それぞれの重鎖および軽鎖はまた、規則的な間隔が置かれた鎖内ジスルフィド架橋を有する。それぞれの重鎖は、一方の端部に、多数の定常ドメインに続く可変ドメイン（ＶＨ）を有する。それぞれの軽鎖は、一方の端部に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、かつもう一方の端部に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと並んでおり、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の境界を形成すると考えられる。

用語「ＶＬ（またはＶＨ）領域」は、ＶＬ（またはＶＨ）ドメインと同じ意味を有する。本発明による抗体は、その一次形態において、単純な生殖系列抗体とは異なってよい成熟抗体である。理論によって縛れるものではないが、抗原の生殖系列抗体への結合は、大きな構造的再構成をもたらすことがあり、その一方で、成熟抗体の未結合状態は、その結合状態により近づき得る。したがって、抗体の成熟形は、おそらく生殖系列の形態よりも強固な構造を有する。したがって、生殖系列抗体は、よりコンホメーション的に柔軟であり得、こうしてより遅い結合速度がもたらされる（例えば、Ｗｅｄｅｍａｙｅｒ ＧＪ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９７ Ｊｕｎ １３；２７６（５３１９）：１６６５−９； Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅを参照）。成熟抗体のより柔軟性が低いと思われる構造は、例えば可溶性または凝集の低さから改善された治療特性がもたらされるため、本発明による抗体の物理化学的特性を改善し得る。ウサギＢ細胞から同定される本発明による抗体は、天然由来の可変領域を有する抗体である。「天然由来」は、本発明によれば、そのような抗体が、ウサギにおいて天然に存在する可変領域の配列とそのアミノ酸配列において同一である可変領域を有することを意味する。本発明による抗体は、さらに改変されていてよく、好ましくは、ウサギ抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、それらのフラグメント、または本発明による特徴的な特性が維持される限りは、さらに遺伝子操作されて組換え的に製造された抗体である。該抗体は、さらなる剤、例えば免疫結合体である剤に結合され得る。好ましくは、本発明による抗体は、ウサギ抗体である。

好ましくは、抗体のその一次形態は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰおよびマウスＩＬ−１ＲＡｃＰに特異的に結合する。

本発明による用語「単一細胞の上清」は、抗体産生ウサギ単一細胞、好ましくはＢ細胞またはウサギハイブリドーマ細胞の培養の上清を意味する。そのような上清は、本発明によるモノクローナル抗体を含む。したがって、Ｆｃ部／定常部は、天然に存在するグリコシル化状態にある。

本発明による用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するヒト受容体を指す。ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩのサブクラスの受容体、例えばアレル多様体およびこれらの受容体の選択的スプライシングされた形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｄａｅｒｏｎ，Ｍ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）のレビューを参照）。ＦｃＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）は、ＡＤＣＣに影響する。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５−３４（１９９４）、およびｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｌａｂ．ＣＨｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）においてレビューされている。これらの全てのその他のＦｃＲは、本明細書における用語「ＦｃＲ」によって包含される。その用語はまた、母親のＩｇＧを胎児に伝える役割がある新生児受容体ＦｃＲｎを含み（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））、より遅い異化に影響し、こうして半減期がより長くなる。

「定常ドメイン（定常部）」は、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、例えばエフェクター機能も示す。ヒトＩｇＧ１に相当する重鎖定常領域は、γ１鎖と呼ばれる。ヒトＩｇＧ３に相当する重鎖定常領域は、γ３鎖と呼ばれる。ヒト定常γ重鎖は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）およびＢｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６（１９８７）１３５１−１３６１；Ｌｏｖｅ，Ｔ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８（１９８９）５１５−５２７によって詳細に記載されている。ＩｇＧ１またはＩｇＧ３タイプの定常ドメインは、Ａｓｎ２９７でグリコシル化されている。本発明による「Ａｓｎ２９７」は、Ｆｃ領域中の位置２９７付近にあるアミノ酸アスパラギンを意味し、抗体の僅かな配列変動に基づき、Ａｓｎ２９７は、幾つかのアミノ酸だけ上流または下流に（通常は、＋３アミノ酸以下）にあることもある。

ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３のグリコシル化は、２つまでのＧａｌ（ガラクトース）残基を終端とするコアフコシル化された二分岐複合体オリゴ糖のグリコシル化としてＡｓｎ２９７に存在する。これらの構造は、末端Ｇａｌ残基の量に応じてＧ０、Ｇ１（α１，６もしくはα１，３）またはＧ２グリカン残基と呼ばれる（Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ １（２００３）４４−５３）。抗体Ｆｃ部のＣＨＯタイプのグリコシル化は、例えばＲｏｕｔｉｅｒ，Ｆ．Ｈ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．１４（１９９７）２０１−２０７によって記載される。本発明による抗体のＡＤＣＣのような細胞媒介型エフェクター機能は、Ｕｍａｎａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６−１８０，Ｎａｏｋｏ Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ａｎｄ Ｍｉｔｓｕｏ Ｓａｔｏｈ，ＭＡｂｓ．２００９；１（３）：２３０−２３６および米国特許第６，６０２，６８４号明細書（ＵＳ６，６０２，６８４）、国際公開第２００５／０４４８５９号（ＷＯ２００５／０４４８５９）、国際公開第２００４／０６５５４０号（ＷＯ２００４／０６５５４０）、国際公開第２００７／０３１８７５号（ＷＯ２００７／０３１８７５）に記載されるように、抗体のＦｃ領域に結合されたオリゴ糖の操作（脱フコシル化）によってさらに増強され得る。そのような方法は、例えば、低減された固有α−１，６フコシル化能を有する宿主細胞、例えばＬｅｃ１３、つまりＧＭＤ機能が部分的に欠損したＣＨＯ細胞の多様体、またはＹＢ２／０、つまり本来から低減されたＦＵＴ８活性を有するラット−ラットハイブリドーマ細胞の使用、α−１，６フコシル化関連遺伝子に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入、β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）およびゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）の同時導入、５８，８３，８４およびα−１，６−フコシル化の役割のあるゲノム遺伝子座の破壊である。

本明細書で使用される用語「抗体エフェクター機能」または「エフェクター機能」は、ＩｇＧのＦｃエフェクタードメイン（例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域）によって与えられる機能を指す。そのような機能は、例えばＦｃエフェクタードメインが食細胞活性または細胞溶解活性を有する免疫細胞上のＦｃ受容体に結合することによって、またはＦｃエフェクタードメインが補体系の成分に結合することによって発揮され得る。典型的なエフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣである。「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体とは異なる分子を指す。抗体フラグメントの例には、制限されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディー、一本鎖抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、および抗体フラグメントから形成される多重特異的抗体が含まれる。

参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、参照抗体のその抗原への結合を、競合アッセイにおいて５０％以上だけ遮断する抗体を指し、それに対して、参照抗体は、抗体のその抗原への結合を競合アッセイにおいて５０％以上だけ遮断する抗体を指す。例示的な競合アッセイは、本明細書に規定される。

「抗体依存性細胞介在性細胞障害」および「ＡＤＣＣ」は、ＦｃＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が、ターゲット細胞に結合された抗体を認識し、その後にそのターゲット細胞の溶解を引き起こす細胞介在性反応を指す。ＡＤＣＣを介在する一次細胞、つまりＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦＣγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦＣＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ，ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９（１９９１）４５７−４９２の第４６４頁の表３にまとめられている。用語「抗体依存性細胞貪食」および「ＡＤＣＰ」は、抗体で覆われた細胞が、全体または部分的のいずれかにおいて、免疫グロブリンＦｃ領域に結合する食細胞性免疫細胞（例えばマクロファージ、好中球および樹状細胞）によって取り込まれる過程を指す。

Ｃ１ｑは、免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合部位を含むポリペプチドである。Ｃ１ｑは、２つのセリンプロテアーゼＣ１ｒおよびＣ１ｓと一緒に複合体Ｃ１、つまり補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）経路の最初の成分を形成する。ヒトＣ１ｑは、例えばＱｕｉｄｅｌ（カリフォルニア州、サンディエゴ）から商業的に購入することができる。

抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。５つの主要な抗体のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらの幾つかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃、ＩｇＧ₄、ＩｇＡ₁およびＩｇＡ₂に分けることができる。種々のクラスの免疫グロブリンに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれａ、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。

「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプで様々な、抗体のＦｃ領域を原因とするこれらの生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃｌｑ結合および補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）、貪食（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下向き調節ならびにＢ細胞活性化が含まれる。本明細書で使用される「低減されたエフェクター機能」は、特定のエフェクター機能、例えばＡＤＣＣまたはＣＤＣのような機能が、対照（野生型Ｆｃ領域を有するポリペプチド）と比較して、少なくとも２０％だけ低減されることを指し、そして本明細書で使用される「大幅に低減されたエフェクター機能」は、特定のエフェクター機能、例えばＡＤＣＣまたはＣＤＣのような機能が、対照と比較して、少なくとも５０％だけ低減されることを指す。

剤、例えば医薬製剤の「有効量」は、必要な投与量で必要な時間にわたり、所望の治療成果または予防成果に達するために有効な量を指す。

本明細書における用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、ネイティブな配列のＦｃ領域および多様体のＦｃ領域を含む。一実施形態においては、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端までにおよぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても存在しなくてもよい。本明細書で特に記載がない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されるＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）によるものである。「多様体のＦｃ領域」は、本明細書で定義される少なくとも１つの「アミノ酸改変」により、「ネイティブ」または「野生型」配列のＦｃ領域のそれとは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、多様体のＦｃ領域は、ネイティブ配列のＦｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えばネイティブ配列のＦｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域において、約１から約１０までのアミノ酸置換を有し、好ましくは約１から約５までのアミノ酸置換を有する。本明細書における多様体のＦｃ領域は、好ましくは、ネイティブ配列のＦｃ領域と、および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％のホモロジーを有し、最も好ましくはそれと少なくとも約９０％のホモロジーを有し、より好ましくはそれと少なくとも約９５％のホモロジーを有するものとする。

本明細書で使用される用語「Ｆｃ多様体」は、Ｆｃドメインに改変を含むポリペプチドを指す。本発明のＦｃ多様体は、それらを構成するアミノ酸改変により定義される。このように、例えば、Ｐ３２９Ｇは、親Ｆｃポリペプチドに対して位置３２９でプロリンがグリシンで置換されたＦｃ多様体であり、ここで、ナンバリングは、ＥＵインデックスによるものである。野生型アミノ酸の同一性は、未特定であってよく、その場合に上述の多様体は、Ｐ３２９Ｇと呼ばれる。本発明で論じられる全ての位置について、ナンバリングは、ＥＵインデックスによるものである。ＥＵインデックスまたはＫａｂａｔもしくはＥＵナンバリングスキームでのＥＵインデックスは、ＥＵ抗体のナンバリングを指す（Ｅｄｅｌｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３（１９６９）７８−８５、参照によりその全体が本明細書で援用される）。改変は、付加、欠失または置換であってよい。置換は、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸を含んでよい。多様体は、非天然アミノ酸を含んでよい。例としては、米国特許第６，５８６，２０７号明細書（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，５８６，２０７）、国際公開第９８／４８０３２号（ＷＯ９８／４８０３２）、国際公開第０３／０７３２３８号（ＷＯ０３／０７３２３８）、米国特許出願公開第２００４／０２１４９８８号明細書（ＵＳ２００４／０２１４９８８Ａ１）、国際公開第０５／３５７２７号（ＷＯ０５／３５７２７Ａ２）、国際公開第０５／７４５２４号（ＷＯ０５／７４５２４Ａ２）、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２４（２００２）９０２６−９０２７、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．，ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １１（２００２）１１３５−１１３７、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＩＣＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９９（２００２）１１０２０−１１０２４、ならびにＷａｎｇ，Ｌ．，ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｃｈｅｍ．（２００２）１−１０が含まれ、それら全ては参照により本明細書で援用される。

用語「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」は、Ｆｃ領域を含むポリペプチド、例えば抗体またはイムノアドヘシン（定義は以下を参照）を指す。

用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載するために使用される。好ましいＦｃＲは、ネイティブ配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体を結合する受容体（γ受容体）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩのサブクラスの受容体、例えばアレル多様体およびこれらの受容体の選択的スプライシングされた形を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｄａｅｒｏｎ，Ｍ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５（１９９７）２０３−２３４におけるレビューを参照）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９（１９９１）４５７−４９２、Ｃａｐｅｌ，ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４（１９９４）２５−３４、およびｄｅ Ｈａａｓ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６（１９９５）３３０−４１においてレビューされている。その他のＦｃＲ、例えば将来的に特定されるＦｃＲは、本発明における用語「ＦｃＲ」によって包含される。その用語はまた、母親のＩｇＧを胎児に伝える役割がある新生児受容体ＦｃＲｎを含む（Ｇｕｙｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７（１９７６）５８７およびＫｉｍ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）２４９）。

本明細書で使用される「ＩｇＧのＦｃリガンド」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合して、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、それらに制限されるものではないが、ＦｃγＲ、ＦｃγＲ、ＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合性レクチン、マンノース受容体、スタフィロコッカスプロテインＡ、ストレプトコッカスプロテインＧおよびウイルス性ＦｃγＲが含まれる。Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲに相同であるＦｃ受容体のファミリーであるＦｃ受容体ホモログ（ＦｃＲＨ）も含まれる（Ｄａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９０（２００２）１２３−１３６、参照によりその全体が本明細書で援用される）。Ｆｃリガンドには、Ｆｃを結合する未発見の分子も含まれ得る。具体的なＩｇＧのＦｃリガンドは、ＦｃＲｎおよびＦｃγ受容体である。本明細書で使用される「Ｆｃリガンド」とは、抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。

本明細書で使用される「Ｆｃγ受容体」、「ＦｃγＲ」または「ＦｃガンマＲ」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、ＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質のファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトにおいて、このファミリーには、制限されるものではないが、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、例えばアイソフォームＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢおよびＦｃγＲＩＣ、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、例えばアイソフォームＦｃγＲＩＩＡ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＦｃγＲＩＩＢ−１およびＦｃγＲＩＩＢ−２を含む）、およびＦｃγＲＩＩｃ、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、例えばアイソフォームＦｃγＲＩＩＩＡ（アロタイプＶＩ５８およびＦ１５８を含む）、およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＢ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＢ−ＮＡ２を含む）（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２（２００２）５７−６５、参照によりその全体が本明細書で援用される）、ならびに任意の未発見のヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれる。ＦｃγＲは、制限されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含む任意の生物由来であってよい。マウスＦｃγＲには、制限されるものではないが、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）およびＦγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）ならびに任意の未発見のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれる。

本明細書で使用される「ＦｃＲｎ受容体」または「新生児Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、ＦｃＲｎ遺伝子によって少なくとも部分的にコードされるタンパク質を意味する。ＦｃＲｎは、制限されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含む任意の生物由来であってよい。当該技術分野で公知のように、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、しばしば重鎖および軽鎖と呼ばれる２つのポリペプチドを含む。軽鎖は、β−２−マイクログロブリンであり、かつ重鎖は、ＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。本明細書で特に記載がない限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖とβ−２−マイクログロブリンとの複合体を指す。

本明細書で使用される用語「ＩＬ−１ＲＡｃＰ特異的抗体」は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに特異的な抗体を指す。「ＩＬ−１ＲＡｃＰ特異的抗体」は、実施例１に規定されるＶＨ配列、ＶＬ配列およびＣＤＲ配列に関連して、図２に示される特異性を有する抗体を示す。したがって例えば、「そのＶＨ領域が、配列番号１＋ｎのＶＨ領域からなる群から選択され、かつそのＶＬ領域が、配列番号３７＋ｎのＶＬ領域からなる群から選択され、ここで、ｎは０から３までの数であることを特徴とするＩＬ−１ＲＡｃＰ特異的抗体」は、ＩＬ−１ＲＡｃＰ特異的抗体からなる群から選択される抗体であって、配列番号１のＶＨ領域および配列番号３７のＶＬ領域、配列番号２のＶＨ領域および配列番号３８のＶＬ領域、配列番号４のＶＨ領域および配列番号４０のＶＬ領域を特徴とする抗体、ならびにＩＬ−１ＲＡｃＰ特異的抗体であって、配列番号３のＶＨ領域および配列番号３９のＶＬ領域を特徴とする抗体を意味する。

「免疫結合体」は、１つ以上の細胞毒性剤、例えば化学療法剤、薬物、増殖抑制剤、トキシン、別の抗体または放射性同位体に結合された抗体を意味する。

「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部、好ましくはその可変領域またはその少なくとも抗原結合部位を含む。抗体フラグメントの例には、ダイアボディー、Ｆａｂフラグメント、および単鎖抗体分子が含まれる。ｓｃＦｖ抗体は、例えばＨｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６−８８に記載されている。

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。用語「キメラ抗体」は、ウサギ由来の可変領域、すなわち結合領域と、異なる起源または種から得られた定常領域の少なくとも一部とを含み、通常は組換えＤＮＡ技術によって製造されたモノクローナル抗体を指す。本発明によれば、ウサギの可変領域およびヒトの定常領域を含むキメラ抗体ならびにヒト化されたウサギ抗体が特に好ましい。本発明によって包含される「キメラ抗体」のその他の形態は、クラスまたはサブクラスが本来の抗体のそれから変更または変化されている抗体である。そのような「キメラ」抗体は、「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体の製造方法は、当該技術分野で目下良く知られている従来の組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション技術を含む（例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１９８４）６８５１−６８５５、米国特許第５，２０２，２３８号明細書（ＵＳ５，２０２，２３８）および米国特許第５，２０４，２４４号明細書（ＵＳ５，２０４，２４４）を参照）。

用語「ヒト化抗体」または「抗体のヒト化型」は、ヒト可変領域が本発明による抗体のＣＤＲを含むように改変された抗体を指す。好ましい一実施形態においては、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域中にグラフトさせることで、「ヒト化抗体」が製造される（例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３−３２７、およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３１４（１９８５）２６８−２７０を参照）。重鎖および軽鎖の可変フレームワーク領域は、同じまたは異なるヒト抗体配列から得ることができる。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であってよい。ヒトの重鎖および軽鎖の可変フレームワーク領域は、例えばＬｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０００） − Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＰ Ａ．１Ｐ．１−Ａ．１Ｐ．３７に列挙されており、ＩＭＧＴ，ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）またはｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋを介して利用可能である。

好ましくは、本発明は、キメラまたはヒト化されたウサギ抗体であって、可変軽鎖ＶＬ中のアミノ酸７５〜８５の間の位置にあるシステインの代わりにセリンを含むことを特徴とする抗体に関する。

本明細書で使用される用語「組換え抗体」は、組換え的手段によって製造される本発明による全ての抗体、宿主細胞にトランスフェクションされた組換え発現ベクターを使用して、例えばＮＳ０またはＣＨＯ細胞のような宿主細胞から製造された抗体を含むと解釈される。そのような組換えヒト抗体は、再構成された形で可変領域および定常領域を有する。

本明細書で使用される用語「ターゲットまたは抗ターゲット抗体に対して特異的に結合する」は、それぞれの抗原（ターゲット）への抗体の結合であって、ＥＬＩＳＡによって測定される結合を指す。その際、前記ＥＬＩＳＡは、好ましくは、それぞれの抗原を固体担体に被覆し、前記抗体を、それぞれの抗原またはタンパク質との免疫複合体を形成可能な条件下で添加し、前記免疫複合体を、本発明による抗体に結合する二次抗体を使用し、かつペルオキシダーゼを媒介する発色を使用して光学密度値（ＯＤ）を測定することによって検出することを含む。本発明による用語「抗原」は、免疫化のために使用される抗原または前記抗原をそのタンパク質配列の部分として含むタンパク質を指す。例えば、免疫化のためには、タンパク質の細胞外ドメインの断片（例えば、最初の２０アミノ酸）を使用することができ、そして検出／アッセイ等のためには、タンパク質の細胞外ドメインまたは全長タンパク質を使用することができる。

本明細書における用語「特異的に結合する」または「特異的に認識される」は、抗体が、抗原に対してはっきりと認められる親和性を示し、好ましくは大きな交差反応性を示さないことを意味する。「はっきりと認められる」結合親和性には、少なくとも１０⁷Ｍ^-1の、特に少なくとも１０⁸Ｍ^-1の、より具体的には少なくとも１０⁹Ｍ^-1の、またはなおもさらにより具体的には少なくとも１０¹⁰Ｍ^-1の親和性を有する結合が含まれる。「大きな交差反応性を示さない」抗体は、不所望なその他のタンパク質に、はっきりと認められる結合を示さない抗体である。本発明によるエピトープに特異的な抗体は、例えばＩＬ−１ＲＡｃＰ上のその他のエピトープと大きな交差反応性を示さない。特異的な結合は、そのような結合の測定のために当該技術分野で認められる任意の手段に従って測定することができる。幾つかの実施形態においては、特異的な結合は、競合結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）によって測定される。

本明細書で使用される用語「ＩＬ−１ＲＡｃＰに誘導されるＮＦκＢ活性を阻害する」は、ルシフェラーゼレポーター実験においてＮＦκＢ活性を阻害することを指す。ＮＦ−κＢ−ＲＥホタルルシフェラーゼレポーターを発現する２９３Ｔ／１７［ＨＥＫ ２９３Ｔ／１７］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１１２６８（商標））細胞は、ポリ−Ｄ−リジン−細胞培養プレートに播種される。ＩＬ−１ＲＡｃＰの刺激後に、細胞溶解物を、活性化されたＮＦ−κＢについてＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．米国、マディソン）を使用して試験する。機能的抗体を含む上清は、ＩＬ−１ＲＡｃＰに結合し、ＮＦ−κＢ活性化を阻害し、それは低いシグナルで示される。Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイキットは、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｄｅ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ−ｍａｎｕａｌｓ／０／ｓｔｅａｄｙ−ｇｌｏ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ−ａｓｓａｙ−ｓｙｓｔｅｍ−ｐｒｏｔｏｃｏｌ、およびＡｌａｍ，Ｊ．ａｎｄ Ｃｏｏｋ，Ｊ．Ｌ．（１９９０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８，２４５−５４、Ｗｏｏｄ，Ｋ．Ｖ．（１９９１） Ｉｎ：Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｐ．，ａｎｄ Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，５４３、Ｏｗ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４，８５６−９、Ｄｅ Ｗｅｔ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，７２５−３７、Ｗｏｏｄ，Ｋ．Ｖ．（１９９０）ＰｒｏｍｅｇａＮｏｔｅｓ ２８，１−３、Ｗｏｏｄ，Ｋ．Ｖ．（１９９１） Ｉｎ：Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｐ．ａｎｄ Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，１１、ならびに米国特許第５２８３１７９号明細書（ＵＳ５２８３１７９）、米国特許第５６４１６４１号明細書（ＵＳ５６４１６４１）、米国特許第５６５０２８９号明細書（ＵＳ５６５０２８９）に記載されている。

本発明による抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域またはそれらの部分を含み、それらは、２つが一緒になってそれぞれの抗原に特異的に結合するために十分である。

本明細書で使用される全てのタンパク質という用語は、ヒトのタンパク質を指す。別の種由来のタンパク質を意味する場合に、このことは明確に述べられる。

本明細書で使用される用語「ＩＬ−１ＲＡｃＰ」は、ＩＬ−３６シグナル伝達系におけるＩＬ１ＲＬ２についての補助受容体（類似性による）であるヒトＩＬ−１ＲＡｃＰ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９ＮＰＨ３）を指す。ＩＬ−１シグナル伝達系において、ＩＬ１Ｒ１に関する補助受容体は、ＩＬ１Ｒ１と会合してＩＬ１Ｂに結合され、ＮＦ−κＢのインターロイキン−１依存性活性化およびその他の経路に影響する高親和性インターロイキン−１受容体複合体を形成する（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）。本明細書で使用される用語「マウスＩＬ−１ＲＡｃＰ」は、マウスＩＬ−１ＲＡｃＰ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ６１７３０）を指す。

本明細書で使用される用語「ＩＬ−１α」は、ヒトＩＬ−１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０１５８３）を指す。本明細書で使用される用語「ＩＬ−１β」は、ヒトＩＬ−１β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０１５８４）を指す。ＩＬ−１は、ＩＬ−２放出、Ｂ細胞成熟および増殖、ならびに線維芽細胞成長因子活性を誘導することによって胸腺細胞増殖を刺激する。ＩＬ−１タンパク質は、炎症応答に関与し、内因性発熱物質として特定されている（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）。

本明細書で使用される用語「ＩＬ−３３」は、ヒトＩＬ−３３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｏ９５７６０）、つまりＩＬ１ＲＬ１／ＳＴ２受容体に結合し、それを通じてシグナルを伝達し、そのシグナルがまたターゲット細胞におけるＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路を活性化するサイトカインを指す。

本明細書で使用される用語「ＩＬ−３６」は、ヒトＩＬ−３６α（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９ＵＨＡ７）、ＩＬ−３６β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９ＮＺＨ７）および／またはＩＬ−３６γ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９ＮＺＨ８）を指す。ＩＬ−３６は、ＩＬ１ＲＬ２／ＩＬ−３６Ｒ受容体に結合し、それを通じてシグナルを伝達し、そのシグナルがまたターゲット細胞におけるＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路を活性化して、炎症性応答につながるサイトカインである。ＩＬ−３６シグナル伝達系の部分は、補助受容体ＩＬ１ＲＡＰを共用するＩＬ−１系と同様に、上皮バリアに存在し、局所的炎症応答に関与すると考えられている。ＩＬ−３６は、角化細胞、樹状細胞に作用し、そしてＴ細胞に間接的に作用して、組織浸潤、細胞成熟および細胞増殖を駆動することによって、皮膚炎症応答に関与すると考えられている（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）。

本明細書で使用される用語「ＮＦκＢ」は、ヒト核因子ＮＦ−κＢを指し、それは、ｐ１０５サブユニット（Ｐ１９８３８）およびｐ１００サブユニット（Ｑ００６５３）からなる。「ＮＦκＢの阻害」は、本発明によれば、ヒト細胞におけるＮＦκＢ依存性ルシフェラーゼ遺伝子発現の阻害として測定される。そのような方法は、例えばＷｉｎｄｈｅｉｍ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８（２００８）１７８３−１７９１、Ｈｕａｎｇ Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４（１９９７）１２８２９−１２８３２、Ｘｉａｏｘｉａ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．１９（１９９９）４６４３−４６５２に記載されている。２９３Ｔ／１７細胞におけるＩＬ１βに誘導されるＮＦκＢ発現の阻害として本発明により使用される方法は、本特許出願の実施例部に記載されている。マウスＮＦκＢを意味する場合に、本明細書ではそれは明確に述べられる。

本明細書で使用される「本発明による抗体の可変領域（またはドメイン）」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））は、抗体の抗原に対する結合に直接的に関与する軽鎖領域および重鎖領域のそれぞれの組を示す。可変軽鎖領域および可変重鎖領域は、同じ一般構造を有し、それぞれの領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結されている、配列が大幅に保存された４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。用語「抗体の抗原結合部」は、本明細書で使用される場合に、抗原結合の役割を担う抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部は、好ましくは、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。ＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）により定義される。このナンバリングシステムを使用して、事実上線状のアミノ酸配列は、可変領域のＦＲまたはＣＤＲの短縮またはそこへの挿入に相当するより少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含んでよい。例えば、重鎖可変領域は、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）を含んでよく、かつ重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えばＫａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃ等）を含んでよい。残基のＫａｂａｔナンバリングは、所定の抗体について、該抗体の配列と「標準の」Ｋａｂａｔナンバリングされた配列とのホモロジーの領域でのアライメントによって決定することができる。本発明による抗体の重鎖の可変ドメインは、単一の免疫グロブリンドメインから構成されており、約１１０〜１２０アミノ酸長である。本発明による抗体の軽鎖の可変ドメインは、単一の免疫グロブリンドメインから構成されており、約１１０〜１２０アミノ酸長である。

一実施形態においては、本発明による抗体は、ヒト起源から得られるＦｃ部または定常重鎖部および軽鎖部を含み、好ましくはヒト定常領域の全ての部分を含んでいる。本明細書で使用される場合に、用語「ヒト起源から得られるＦｃ部」は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部、例えばヒトＩｇＧ１サブクラス由来のＦｃ部、ヒトＩｇＧ１サブクラス由来の変異したＦｃ部（好ましくはＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａに変異を有する）、ヒトＩｇＧ４サブクラス由来のＦｃ部またはヒトＩｇＧ４サブクラス由来の変異したＦｃ部（好ましくはＳ２２８Ｐに変異を有する）のいずれかであるＦｃ部を示す。一実施形態においては、本発明による抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体である。ヒト定常鎖は、従来技術において良く知られており、例えばＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．（例えばＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．ａｎｄ Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（２０００）２１４−２１８を参照）に記載されている。

一実施形態においては、本発明による抗体は、本発明によるＶＨ配列の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％＞、９３％＞、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態においては、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して、置換（例えば保存的置換）、挿入または欠失を含み、それによっても、該抗体は、本発明によりそれぞれの抗原に特異的に結合する能力を保持する。特定の実施形態においては、全部で１個〜１０個のアミノ酸が、前記ＶＨ配列のそれぞれにおいて置換、挿入および／または欠失されている。特定の実施形態においては、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲ外部の領域に（すなわちＦＲにおいて）存在する。

一実施形態においては、本発明による抗体は、本発明によるＶＬ配列のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ｎは、０から５までの数である。特定の実施形態においては、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して、置換（例えば保存的置換）、挿入または欠失を含み、それによっても、該抗体は、それぞれの抗原に特異的に結合する能力を保持する。特定の実施形態においては、全部で１個〜１０個のアミノ酸が、前記ＶＬ配列において置換、挿入および／または欠失されている。特定の実施形態においては、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲ外部の領域に（すなわちＦＲにおいて）存在する。本発明はまた、当該技術分野で公知の方法により製造することができる親和性成熟抗体を含む。Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２）は、ＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残部のランダム変異誘導は、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９１：３８０９−３８１３（１９９４）、Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １６９：１４７−１５５（１９９５）、Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１ ５５：１９９４−２００４（１９９５）、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１ ５４（７）：３３１０−９（１９９５）、およびＨａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）ならびに国際公開第２０１０１０８１２７号（ＷＯ２０１０１０８１２７）によって記載されている。ペプチド配列またはポリペプチド配列に対する「パーセント（％）のアミノ酸配列同一性」は、配列のアライメントを行い、ギャップを導入し、必要であれば、最大パーセントの配列同一性を達成した後に、保存的置換を配列同一性の部分として一切考慮せずに、特定のペプチドまたはポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントのアミノ酸配列同一性を測定するためのアライメントは、当該技術分野における技能の範囲内である様々な方式で、例えば公共利用可能なコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して達成することができる。

本発明による抗体は、好ましくは組換え的手段によって生成される。そのような方法は、従来技術において広く知られており、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質発現に引き続き、抗体ポリペプチドを単離し、通常は医薬品に許容可能な純度にまで精製することを含む。タンパク質発現のために、本発明による抗体またはそのフラグメントの軽鎖および重鎖をコードする核酸は、標準的方法によって発現ベクター中に挿入される。発現は、適切な原核性宿主細胞または真核性宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母またはＥ．コリ細胞において行われ、かつ抗体は、該細胞から（上清からまたは細胞溶解後に）回収される。抗体の組換え的製造は、従来技術においてよく知られており、例えばＭａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１７（１９９９）１８３−２０２、Ｇｅｉｓｓｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．８（１９９６）２７１−２８２、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２０００）１５１−１６１、Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．４８（１９９８）８７０−８８０のレビュー論文において記載されている。抗体は、全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分的に精製された形で、もしくは純粋な形で存在してよい。精製は、その他の細胞成分またはその他の夾雑物、例えばその他の細胞性核酸またはタンパク質を、標準的な技術によって、例えばカラムクロマトグラフィーおよび当該技術分野で良く知られるその他の技術（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ，ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照）によって排除するために行われる。ＮＳＯ細胞における発現は、例えばＢａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（２０００）１０９−１２３、Ｂａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．７３（２００１）２６１−２７０によって記載される。一過性発現は、例えばＤｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３０（２００２）Ｅ９によって記載される。可変ドメインのクローニングは、Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）３８３３−３８３７、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（１９９２）４２８５−４２８９、Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４（１９９７）７７−８７によって記載される。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ ２９３）は、Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．−Ｊ．およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｋ．によってＣｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０（１９９９）７１−８３において記載され、かつＳｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．−Ｊ．によってＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９４（１９９６）１９１−１９９において記載される。モノクローナル抗体は、慣用の免疫グロブリン精製手順、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーまたは親和性クロマトグラフィーによって培養培地から適宜分離される。

モノクローナル抗体をコードするＤＮＡおよびＲＮＡは、慣用の手順を使用してシーケンシングされる。ＲＴ ＰＣＲを使用することが好ましい。

前記細胞株から得られる抗体は、本発明の好ましい実施形態である。抗体のアミノ酸配列多様体は、該抗体をコードするＤＮＡ中にヌクレオチド変化を導入するか、またはペプチド合成によって製造される。抗体の適切なコンホメーションを維持することに関与しない全てのシステイン残基は、分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋を抑えるために、一般的にセリンで置換されてもよい。その反対に、１つ以上のシステイン結合を、その安定性を改善するために抗体に付加してよい（特に、抗体がＦｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）。

本発明による重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、プロモーター、翻訳開始領域、定常領域、３’非翻訳領域、ポリアデニル化および転写終結の配列と組み合わされることで、発現ベクター構築物を形成する。重鎖および軽鎖の発現構築物は、単一のベクター中で組み合わされ、宿主細胞中に、同時トランスフェクションされ、連続トランスフェクションされ、または別々にトランスフェクションされ、次いで融合されて、両方の鎖を発現する単一の宿主細胞が形成され得る。

本発明の一態様は、本発明による抗体を含む医薬組成物である。本発明のもう一つの態様は、本発明による抗体の、医薬組成物の製造のための使用である。本発明のさらなる一態様は、本発明による抗体を含む医薬組成物の製造方法である。もう一つの態様においては、本発明は、本発明による抗体を含有し、医薬品担体と一緒に製剤化された組成物、例えば医薬組成物を提供する。

さらに、本発明による抗体は、ターゲットの調節障害が根底にある理由である疾患の治療のために特に有用である。本発明の一態様は、癌の治療のための医薬組成物である。

本発明のもう一つの態様は、癌の治療のための本発明による抗体である。このために、本発明による抗体は、それぞれのマウス腫瘍モデルにおいて、例えばＫｒｕｐｋｅ ＤＭ；Ｂｅｇｌｅｙ ＤＡ；Ｓｕｎｄｂｅｒｇ ＪＰ；Ｂｕｌｔ ＣＪ；Ｅｐｐｉｇ ＪＴ，Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｄａｔａｂａｓｅ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２００８ Ｊｕｎ；８（６）：４５９−６５に従って調査され得る。したがって、本発明の一態様は、癌の治療のための医薬組成物である。

本発明のもう一つの態様は、癌の治療のための本発明による抗体である。

本発明のもう一つの態様は、本発明による抗体の、癌の治療のための薬剤の製造のための使用である。

本発明のもう一つの態様は、癌を患う患者の治療方法であって、本発明による抗体をそのような治療を必要とする前記患者に投与することにより行う治療方法である。

本明細書で使用される場合に、「医薬用担体」には、生理学的に適合性の任意の全ての溶剤、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、該担体は、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与または表皮投与（例えば注射または注入による）のために適している。

本発明の組成物は、当該技術分野で公知の様々な方法によって投与することができる。当業者に明らかであるように、投与の経路および／または方式は、所望の成果に応じて様々であるものとする。特定の投与経路により本発明の化合物を投与するために、該化合物を、その不活性化を抑制する材料で被覆するか、または該化合物を前記材料と一緒に同時投与する必要がある場合がある。例えば、前記化合物は、被験体に適切な担体、例えばリポソームまたは希釈剤中で投与することができる。医薬品に許容可能な希釈剤には、生理食塩水および水性緩衝液が含まれる。医薬用担体には、滅菌水溶液または滅菌水性分散液ならびに滅菌の注射可能な溶液または分散液の即時調合調製物の滅菌粉末が含まれる。医薬品作用物質用のそのような媒体および剤の使用は、当該技術分野で公知である。

本明細書で使用される文言「非経口投与」および「非経口投与される」は、腸内投与および局所投与とは異なる投与方式を意味し、通常は注射による投与方式を意味し、それには、制限されるものではないが、静脈内、筋内、動脈内、髄内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内の注射および注入が含まれる。

本明細書で使用される用語「癌」は、例えば、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、細気管支肺胞上皮細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頚部癌、皮膚または眼内の黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、胃癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、頚部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の悪性腫瘍、ホジキン病、食道癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟部組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、膀胱の癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌腫、腎盂の癌腫、中皮腫、肝細胞癌、胆管癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊髄軸癌、脳幹膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ球性白血病、例えば前記癌のいずれかの難治型、または前記癌の１つ以上の組み合わせであってよい。好ましくは、そのような癌は、乳癌、結腸癌、肺癌または膵臓癌である。

これらの組成物は、補助剤、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤を含有してもよい。微生物の存在の抑制は、上記の滅菌手順と、様々な抗細菌剤および抗菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等を含めることの両者によって保証することができる。また、等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウム等を該組成物中に含めることが望ましいこともある。さらに、注射可能な医薬品形の持続吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって惹起することができる。選択された投与経路にかかわらず、適切な水和形で使用することができる本発明の化合物および／または本発明の医薬組成物は、当業者に公知の慣用の方法によって医薬品に許容可能な剤形に製剤化される。本発明の医薬組成物中の有効成分の事実上の用量レベルは、特定の患者、組成物、および投与方式のために望ましい治療応答を達成するために有効であるが、患者に毒性でない有効成分の量が得られるように様々であってよい。選択された用量レベルは、様々な薬物動態学的要因、例えば使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用されるその他の薬物、化合物および／または材料、年齢、性別、体重、容態、治療される患者の一般的な健康履歴および過去の病歴ならびに医学分野で良く知られる同様の要因に依存することとなる。

本発明による方法は、まとめると、免疫化のステップ、Ｂ細胞単離のステップ、Ｂ細胞の濃縮のステップ、単一Ｂ細胞の単離のステップ、好ましくはフィーダー細胞との同時培養のステップ、それぞれのｍＲＮＡを含む単一Ｂ細胞の選択のステップ、および本発明による抗体の製造のステップを含む。そのような方法は、単一特異的抗体の製造について、例えば国際公開第２０１１１４７９０３号（ＷＯ２０１１１４７９０３）、国際公開第２００７００３０４１号（ＷＯ２００７００３０４１）、国際公開第２００８０４５１４０号（ＷＯ２００８０４５１４０）、国際公開第２００４１０６３７７号（ＷＯ２００４１０６３７７）、欧州特許出願公開第１２５５７８０号明細書（ＥＰ１２５５７８０）および欧州特許出願公開第１６３３７８７号明細書（ＥＰ１６３３７８７）で述べられている。

免疫化
免疫化は、従来技術から公知の方法に従って、例えばターゲット抗原またはその断片、完全なタンパク質抗原またはその断片、抗原発現細胞のＤＮＡを使用することによって実施することができる。好ましくは、ＩＬ−１ＲＡｃＰ抗原は、前記抗原およびヒトＦｃポリペプチドからなる融合ポリペプチドである。好ましくは、ステップｉ）における免疫化は、少なくとも３回、適宜６回まで９０日間の間に繰り返される（本発明による抗体が、例えば４回目の免疫後に既に特定されている場合に、さらなる免疫化は必要ない）。好ましくは、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）またはＣＦＡおよび不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）がアジュバントとして使用される。

Ｂ細胞の単離
Ｂ細胞は、ウサギから、好ましくはウサギの血液から単離される。Ｂ細胞は、３回目ないし６回目の免疫化の後、８日目までに、好ましくは５日目〜７日目に単離される。好ましくは、ＰＢＭＣを単離し、マクロファージが除去され（例えば欧州特許第０４８８４７０号明細書（ＥＰ０４８８４７０）を参照）、そしてＢ細胞として使用される。Ｂ細胞の単離は、例えばまた、非Ｂ細胞を非Ｂ細胞マーカー、例えば抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ３６抗体、抗ＣＤ４３抗体および抗ＣＤ２３５ａ抗体で標識し、そして標識された非Ｂ細胞を標識されていないＢ細胞から分離することによって実施することもできる。

Ｂ細胞の濃縮
抗体を産生しかつ抗原特異的なＢ細胞は、好ましくは、Ｂ細胞を、免疫化に使用されるＩＬ−１ＲＡｃＰ抗原またはそれぞれの抗原を発現する細胞で処理することによって単離（濃縮）される。好ましくは、該抗原および該抗原を発現する細胞は、固定化された方式で使用されるため、その抗原特異的Ｂ細胞は、簡単に分離することができる。そのような方法は、例えばＫｏｄｉｔｕｗａｋｋｏ ＡＰ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００３）８１，１６３−１７０および欧州特許第０４８８４７０号明細書（ＥＰ０４８８４７０）に記載されている。

単一Ｂ細胞の単離
ウサギ単一Ｂ細胞の単離は、好ましくはＦＡＣＳによって行われる。好ましくは、ＦＡＣＳ選択のために、抗ウサギＩｇＧが使用される。そのような選択された単一Ｂ細胞は、抗体産生Ｂ細胞である。

フィーダー細胞との同時培養
好ましくは、抗原産生Ｂ細胞は、選択ステップ（以下参照）が実施される前にフィーダー細胞と同時培養される。そのようなフィーダー細胞は、好ましくは、胸腺腫細胞株、例えばマウスＥＬ４胸腺腫細胞株であって、好ましくは変異誘導されている細胞株であり、好ましくは、胸腺腫細胞株は、ブロモデオキシウリジン耐性変異体へと変異誘導されている（例えば、ＥＬ４−Ｂ５細胞、Ｗｅｎ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７（１９８７）８８７−９２）。これは、細胞上清中の抗体量を増加させ（例えばＺｕｂｌｅｒ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４（１９８４）３５７−６３、Ｗｅｎ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７（１９８７）８８７−９２、Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９６；１９６（１）：８５−９１、Ｒｏｙ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２００１；１０（６）：８７３−８０、Ｄｌｕ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．８４，ｐｐ．９１４０−９１４４，１９８７、および欧州特許第０４８８４７０号明細書（ＥＰ０４８８４７０）を参照）、そして分泌されたウサギ抗体の分析および選択を容易にする。

ｍＲＮＡを含む単一Ｂ細胞の選択
本発明による抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む単一Ｂ細胞の選択は、好ましくはフィーダー細胞と同時培養した後に、免疫化のために使用されたＩＬ−１ＲＡｃＰ抗原に特異的に結合する分泌されたウサギ抗体について細胞上清を分析することによって実施することができる。分析は、好ましくはＥＬＩＳＡによって行われる。次いで、免疫グロブリン配列を、選択された単一ヒトＢ細胞から、例えばｄｅ Ｗｉｌｄｔ ＲＭ，Ｈｏｅｔ ＲＭ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００２；１７８：１２１−３１に従って回収し、そして例えばＲＴ ＰＣＲによって分析することができる。

単一Ｂ細胞によって発現される本発明による抗体の製造は、組換え的手段によって行うことができる。

本明細書に記載されるまたは参照される技術および手順は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（２００３））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））に記載される広く用いられる方法である。

本発明により適切なチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞または細胞株は、チャイニーズハムスター（モンゴルキヌゲネズミ）の卵巣組織から確立された細胞株である任意の細胞である。例としては、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０８，９４５（１９５８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１２７５（１９６８）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５５，５１３（１９６８）、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，４１，１２９（１９７３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８，１１５（１９９６）、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４８，２６０（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６０，１２７５（１９６８）、Ｃｅｌｌ，６，１２１（１９７５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｉ，ＩＩ（ｐｐ．８８３−９００）等のような文献に記載されるＣＨＯ細胞が含まれる。さらに、ＡＴＣＣ（アメリカ合衆国培養細胞株保存機関）に登録されたＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ＤＵＸＢ１ １（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−９０９６）およびＰｒｏ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７８１）ならびにＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１１６１９）または該細胞株を様々な培地を使用して適合させることによって得られた亜細胞株を、本発明において使用してもよい。

以下に、本発明の具体的な実施形態を列挙する。

本発明は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに特異的に結合するモノクローナル抗体に関する。

そのモノクローナル抗体は、好ましくは、マウスＩＬ−１ＲＡｃＰにさらに結合することを特徴とする。

そのモノクローナル抗体は、さらに好ましくは、ＩＬ−１ＲＡｃＰに誘導されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする。

そのモノクローナル抗体は、さらに好ましくは、マウスＩＬ−１ＲＡｃＰに誘導されるマウスＮＦκＢ活性をさらに阻害することを特徴とする。

そのモノクローナル抗体は、さらに好ましくは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６で刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする。

前記抗体は、ＩＬ−１αで刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする。

前記抗体は、さらにＩＬ−１βで刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする。

前記抗体はまた、ＩＬ−３３で刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする。

前記抗体は、さらにＩＬ−３６で刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする。

その抗体は、ＩＬ−１β／ＩＬ−１Ｒ１／ＩＬ−１ＲＡｃＰ、ＩＬ−１α／ＩＬ−１Ｒ１／ＩＬ−１ＲＡｃＰ、ＩＬ−３３／ＳＴ２／ＩＬ−１ＲＡｃＰおよびＩＬ−３６／ＩＬ−３６Ｒ／ＩＬ−１ＲＡｃＰからなる群から選択される複合体によって刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする。

前記抗体は、５μｇ／ｍｌの濃度（ウサギＩｇＧアイソタイプは、１５０ＫＤの分子量を有する）で、０．５μｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６（分子量は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔを参照のこと）で刺激された２９３Ｔ／１７細胞溶解物（２９３Ｔ／１７［ＨＥＫ ２９３Ｔ／１７］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１１２６８（商標）））において、ＮＦκＢ活性を、本発明による前記抗体を用いない同様のアッセイに対して７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上も阻害することを特徴とする。

好ましくは、前記抗体は、５μｇ／ｍｌの濃度で、０．５μｇ／ｍｌのマウスＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６（分子量は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔを参照のこと）で刺激されたそれぞれのマウス細胞株溶解物において、ＮＦκＢ活性を、本発明による前記抗体を用いない同様のアッセイに対して７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上も阻害することを特徴とする。

その抗体は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６のそれぞれで刺激されたルシフェラーゼ活性を、２９３Ｔ／１７細胞（ＮＦ−κＢレポーター遺伝子の制御下にルシフェラーゼでトランスフェクションされた２９３Ｔ／１７−ＦＲ細胞）において阻害する。

その抗体はまた、野生型のヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む本発明による抗体によって誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％まで低減されたＡＤＣＣを示すことを特徴とする。

好ましくは、その抗体は、野生型のＩｇＧのＦｃ領域を含む本発明による抗体と比較して低減された、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩに対する親和性を示し、ここで、本発明による前記抗体によって誘導されるＡＤＣＣは、野生型のヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む本発明による抗体によって誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％まで低減されることを特徴とする。

前記抗体は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅでのアミノ酸置換を少なくとも含むことを特徴とする。

前記抗体は、さらに、重鎖可変（ＶＨ）領域が、配列番号１〜配列番号７７のＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域に対して少なくとも９０％同一であることを特徴とする。

前記抗体は、好ましくは、軽鎖可変（ＶＬ）領域が、配列番号７８〜配列番号１５４のＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域に対して少なくとも９０％同一であることを特徴とする。

前記抗体はまた、好ましくは、そのＶＨ領域が配列番号１＋ｎのＶＨ領域と少なくとも９０％同一であり、かつそのＶＬ領域が配列番号７８＋ｎのＶＬ領域と少なくとも９０％同一であり、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする。

本発明による抗体であって、該抗体が、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２８、配列番号１５６、配列番号１５９、配列番号１８３、配列番号１６４、配列番号１６３、配列番号１６１、配列番号１５７、配列番号１５５、配列番号１７４、配列番号１６６、配列番号１７３、配列番号１７７、配列番号１５８から選択される重鎖ＣＤＲＨ１配列、配列番号２９１、配列番号２９３、配列番号２９６、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号３０５、配列番号２３３、配列番号２３６、配列番号２６０、配列番号２４１、配列番号２４０、配列番号２３８、配列番号２３４、配列番号２３２、配列番号２５１、配列番号２４３、配列番号２５０、配列番号２５４、配列番号２３５の群から選択されるＣＤＲＨ２配列および配列番号３６８、配列番号３７０、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３７５、配列番号３８２、配列番号３１０、配列番号３１３、配列番号３３７、配列番号３１８、配列番号３１７、配列番号３１５、配列番号３１１、配列番号３０９、配列番号３２８、配列番号３２０、配列番号３２７、配列番号３３１、配列番号３１２の群から選択されるＣＤＲＨ３配列のそれぞれを含むＶＨ領域を含むことを特徴とする抗体が好ましい。

また、配列番号４４５、配列番号４４７、配列番号４５０、配列番号４５１、配列番号４５２、配列番号４５９、配列番号３８７、配列番号３９０、配列番号４１４、配列番号３９５、配列番号３９４、配列番号３９２、配列番号３８８、配列番号３８６、配列番号４０５、配列番号３９７、配列番号４０４、配列番号４０８、配列番号３８９の群から選択される軽鎖ＣＤＲＬ１配列、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２７、配列番号５２８、配列番号５２９、配列番号５３６、配列番号４６４、配列番号４６７、配列番号４９１、配列番号４７２、配列番号４７１、配列番号４６９、配列番号４６５、配列番号４６３、配列番号４８２、配列番号４７４、配列番号４８１、配列番号４８５、配列番号４６６の群から選択されるＣＤＲＬ２配列、および配列番号５９９、配列番号６０１、配列番号６０４、配列番号６０５、配列番号６０６、配列番号６１３、配列番号５４１、配列番号５４４、配列番号５６８、配列番号５４９、配列番号５４８、配列番号５４６、配列番号５４２、配列番号５４０、配列番号５５９、配列番号５５１、配列番号５５８、配列番号５６２、配列番号５４３の群から選択されるＣＤＲＬ３配列のそれぞれを含むＶＬ領域を含むことを特徴とする抗体も好ましい。

さらなる一実施形態においては、前記抗体は、そのＶＨ領域が、配列番号１〜配列番号７７のＶＨ領域からなる群から選択されることを特徴とする。

また、前記抗体は、そのＶＬ領域が、配列番号７８〜配列番号１５４のＶＬ領域からなる群から選択されることを特徴とする。

ＶＨ領域が配列番号６０、配列番号６２、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号７４、配列番号２、配列番号５、配列番号２９、配列番号１０、配列番号９、配列番号７、配列番号３、配列番号１、配列番号２０、配列番号１２、配列番号１９、配列番号２３、配列番号４のＶＨ領域からなる群から選択されることを特徴とする抗体がさらに好ましい。

好ましくは、重鎖可変領域（ＶＨ）配列は、配列番号６０、あるいは配列番号６２、または配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号７４、配列番号２、配列番号５、配列番号２９、配列番号１０、配列番号９、配列番号７、配列番号３、配列番号１、配列番号２０、配列番号１２、配列番号１９、配列番号２３、あるいは配列番号４である。

ＶＬ領域が配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１５１、配列番号７９、配列番号８２、配列番号１０６、配列番号８７、配列番号８６、配列番号８４、配列番号８０、配列番号７８、配列番号９７、配列番号８９、配列番号９６、配列番号１００、配列番号８１のＶＬ領域からなる群から選択されることを特徴とする抗体がさらに好ましい。

好ましくは、軽鎖可変領域（ＶＬ）配列は、配列番号１３７、あるいは配列番号１３９、または配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１５１、配列番号７９、配列番号８２、配列番号１０６、配列番号８７、配列番号８６、配列番号８４、配列番号８０、配列番号７８、配列番号９７、配列番号８９、配列番号９６、配列番号１００、あるいは配列番号８１である。

そのＶＨ領域が、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号７４、配列番号２、配列番号５、配列番号２９、配列番号１０、配列番号９、配列番号７、配列番号３、配列番号１、配列番号２０、配列番号１２、配列番号１９、配列番号２３、配列番号４のＶＨ領域からなる群から選択され、かつそのＶＬ領域が配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１５１、配列番号７９、配列番号８２、配列番号１０６、配列番号８７、配列番号８６、配列番号８４、配列番号８０、配列番号７８、配列番号９７、配列番号８９、配列番号９６、配列番号１００、配列番号８１のＶＬ領域からなる群から選択されることを特徴とする抗体が最も好ましい。

一実施形態においては、本発明による抗体は、配列番号１３７および配列番号６０または配列番号１３９および配列番号６２を含む。本発明による抗体はまた、配列番号１４２および配列番号６５、または配列番号１４３および配列番号６６、または配列番号１４４および配列番号６７、配列番号１５１および配列番号７４、または配列番号７９および配列番号２、または配列番号８２および配列番号５、または配列番号１０６および配列番号２９、または配列番号８７および配列番号１０、または配列番号８６および配列番号９、または配列番号８４および配列番号７、または配列番号８０および配列番号３、または配列番号７８および配列番号１を含み得る。あるいは本発明による抗体は、配列番号９７および配列番号２０、または配列番号８９および配列番号１２、または配列番号９６および配列番号１９、または配列番号１００および配列番号２３、または配列番号８１および配列番号４を含む。

配列番号７９および配列番号２、または配列番号８１および配列番号４、または配列番号１３９および配列番号６２、または配列番号８０および配列番号３、または配列番号７８および配列番号１を含む本発明による抗体が特に好ましい。

前記抗体は、好ましくは、そのＶＨ領域が配列番号１＋ｎのＶＨ領域からなる群から選択され、かつそのＶＬ領域が配列番号７８＋ｎのＶＬ領域からなる群から選択され、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする。

さらなる一実施形態においては、前記抗体は、該抗体が、配列番号１５５＋ｎのＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２３２＋ｎのＣＤＲ２Ｈ領域、および配列番号３０９＋ｎのＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域の群から選択されるＶＨ領域を含み、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする。

前記抗体は、好ましくは、該抗体が、配列番号３８６＋ｎのＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号４６３＋ｎのＣＤＲ２Ｌ領域、および配列番号５４０＋ｎのＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域の群から選択されるＶＬ領域を含み、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする。

前記抗体は、好ましくは、該抗体が、配列番号１５５＋ｎのＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２３２＋ｎのＣＤＲ２Ｈ領域、および配列番号３０９＋ｎのＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域の群から選択されるＶＨ領域を含み、かつ前記抗体が、配列番号３８６＋ｎのＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号４６３＋ｎのＣＤＲ２Ｌ領域、および配列番号５４０＋ｎのＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域の群から選択されるＶＬ領域を含み、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする。

前記抗体は、図２に列挙される抗体からなる群から選択される抗体のそれぞれのＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域およびＶＬ領域を含むことを特徴とし得る。

好ましくは、前記抗体は、抗体Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｂ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ａ０５、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｃ０４、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｈ０１、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｄ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｅ０２、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０４、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０５、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０２、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｄ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｈ０１、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｆ０１、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｂ０４、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｃ０２、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｂ０５、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｈ０３およびＰ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｇ０５からなる群から選択される抗体と同じエピトープに結合する、ＩＬ−１ＲＡｃＰに誘導されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする。

一実施形態においては、前記抗体は、ウサギ／ヒトのキメラ抗体またはヒト化抗体であることを特徴とする。

本発明はまた、本発明によるＩＬ１βで刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とするヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対するモノクローナルウサギ抗体の製造方法であって、
ｉ）前記ウサギをＩＬ−１ＲＡｃＰで免疫化した後に、前記ウサギから得られた多くの抗体産生単一細胞を単離するステップ、
ｉｉ）ＩＬ−１ＲＡｃＰへの結合を、前記単一細胞の上清について個別に測定するステップ、
ｉｉｉ）その上清がヒトおよびマウスＩＬ−１ＲＡｃＰへの結合を示し、かつＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６によって刺激されるＮＦκＢ活性を阻害する場合に、単一細胞を選択するステップ、
ｉｖ）ステップｉｉｉ）の特性を有する抗体を、前記選択された細胞から単離するステップ
を特徴とする製造方法に関する。

好ましくは、前記方法は、ウサギ抗体産生単一細胞が、ウサギハイブリドーマ単一Ｂ細胞であることを特徴とする。

前記方法はまた、前記ウサギを前記抗原で免疫化した後に、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰへの結合と、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６によって刺激されるＮＦκＢ活性の阻害とが見出された場合に、抗体産生単一細胞を前記動物から単離するか、または前記ウサギから得られたウサギハイブリドーマ細胞を単離することを特徴とする。

本発明は、前記抗体の、医薬組成物の製造のための使用に関する。

本発明は、抗体産生ウサギ単一細胞の上清であって、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰへと結合し、かつＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６によって刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする上清に関する。

本発明は、患者におけるＩＬ−１媒介疾患の治療方法であって、患者に医薬的有効量の抗体を投与することを含む治療方法に関する。

本発明は、医薬品に許容可能な担体と、実施形態のいずれか１つによる抗体の治療的有効量とを含む医薬組成物に関する。

本発明はまた、患者におけるＩＬ−１媒介疾患の治療方法であって、患者に本発明の医薬組成物を投与することを含む治療方法に関する。

実施例
実施例１：化合物

実施例２：ウサギの免疫化
ウサギを、ｈｕ−ＩＬ−１ＲＡｃＰ−Ｆｃで繰り返し免疫化した。これらの動物の血液を回収し、そのＢリンパ球を単離した。単一Ｂ細胞をマイクロタイタープレートのウェル中にソーティングし、増殖させた。これらのＢ細胞によって前処理された上清を、ｈｕ−ＩＬ−１ＲＡｃＰ ＥＬＩＳＡにおいて分析した。４０９種のモノクローナル抗体（＝全ての試験された上清の４．７％）が、ｈｕ−ＩＬ−１ＲＡｃＰに結合すると特定された。２３種のモノクローナル抗体は、マウスＩＬ−１ＲＡｃＰにも結合し、ＩＬ１βに誘導されるヒトまたはマウスのＮＦ−κＢ活性を阻害することが判明した。

ａ）ウサギの免疫化（スキーム１）
組換え型のヒトＦｃキメラタンパク質に融合されたヒトＩＬ−１ＲＡｃＰ（ＩＬ−１ＲＡｃＰ−Ｆｃ）を免疫原として使用した。２つの異なる免疫化スキーム、つまりスキーム１およびスキーム２を調査した。スキーム１による免疫化のために、３匹のニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）種のウサギを、１ｍｌの免疫原をそれぞれの動物に０日目、７日目、１４日目、２８日目、４２日目および５６日目に注射することによって免疫化した。タンパク質をＰＢＳ中で希釈し、等モル量でプールし、そして使用前に完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と１：１（容量／容量）で混合した。４００μｇの免疫原の最終濃度を動物当たりに１回目の免疫化のために使用し、２回目、３回目、４回目、５回目および６回目の免疫化のためには、２００μｇの免疫原を動物当たりに使用した。血液試料を、ＥＤＴＡで覆われたチューブに、３回目、４回目、５回目および６回目の免疫化の後に、免疫化の５日後、６日後および７日後に回収した。本発明による抗ＩＬ−１ＲＡｃＰ抗体を、３回目の免疫化の後に採取された血液試料から単離した。本発明による抗体を、３回目、４回目、５回目および６回目の免疫化の後に採取された血液試料から単離した。

ｂ）ウサギの免疫化（スキーム２）
スキーム２による免疫化のために、６匹のＮＺＷ種のウサギのそれぞれを、１ｍｌの免疫原で皮下的に０日目、７日目、１４日目、２８日目、４２日目、５６日目、７０日目および８４日目に免疫化した。１回目の注射のために、タンパク質をＰＢＳ中で希釈し、等モル量でプールし、そして使用前にＣＦＡと１：１（容量／容量）で混合した。２００μｇの最終濃度の免疫原を、動物あたりに１回目の免疫化のために使用した。２回目、３回目、４回目、５回目および６回目の免疫化のために、タンパク質をＰＢＳ中で希釈し、等モル量でプールし、そして使用前に不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と１：１（容量／容量）で混合した。１００μｇの免疫原を動物当たりに使用した。血液試料を、ＥＤＴＡで覆われたチューブに、２週間の間隔の３回目、４回目、５回目および６回目の免疫化の後に、免疫化の５日後、６日後および７日後に回収した。

実施例３
免疫原被覆／細胞調製
免疫化のために使用される融合タンパク質を、細胞培養６ウェルプレートの表面上にＰＢＳ中８μｇ／１０ｃｍ²の濃度で被覆し、インキュベートした。あるいはプレートのそのセル表面上に、細胞株ＢＴ−４７４（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ６４）を播種した。使用する１日前に、細胞をＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳ中で、２４時間後に約９０％のコンフルエンスとなる密度で播種した。

ウサギからの末梢血単核細胞の単離
ＰＢＭＣを、免疫化されたウサギの全血から単離した。その血液を、ＰＢＳで１：１希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（登録商標）上に製造元の指示（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、ＣＬ５１２０）に従って成層した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離（８００×ｇ、２０分、室温）によって赤血球から分離した。細胞を界面から取り出し、ＰＢＳ（８００×ｇ、１０分）で２回洗浄し、ＰＲＭＩ １６４０ベースの細胞培養培地中に懸濁した。

単球の除去
ＰＢＭＣを、プラスチック上で細胞培養培地中でインキュベートした。結合されなかったリンパ球を、インキュベート時間後に回収した。

抗原特異的細胞の濃縮
抗原特異的リンパ球を、免疫原で被覆されたプレート上で、またはＢＴ−４７４細胞上で直接的に濃縮した。リンパ球をＰＢＳで２回洗浄することで、非特異的な細胞を除去し、引き続き１０ｃｍ²の培養表面積当たりに７５０μｌのトリプシンと一緒に７分間〜１０分間にわたりインキュベートした。引き離された細胞を、さらなるステップのために細胞培養培地中に回収した。

免疫グロブリンＧを分泌するリンパ球の単一細胞ソーティング
ＰＢＭＣ／リンパ球を、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート異性体１）と結合されたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｂｄ Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＳＴＡＲ１２１Ｆ）で染色した。フローサイトメトリー分析および単一細胞ソーティングを、ＦＡＣＳサイトメーターを用いて実施した。単一の陽性のリンパ球を、３．０×１０⁶個の照射されたＥＬ−４ Ｂ５フィーダー細胞を覆っている２００μｌの細胞培養培地に直接ソーティングした。前記の細胞培養培地に、ウサギ由来の活性化されたＴ細胞マクロファージ上清を５％補填した（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ）。同時培養培地に、２×１０^-6ｇ／ｍｌのＳＡＣ（スタフィロコッカス・アウレウス・コワン）溶液を供給した。Ｂ細胞とフィーダー細胞の７日間の同時培養後に、上清を抗体検出に移し、１００μｌのＲＮＡ単離バッファー（Ｑｉａｇｅｎ、ＲＬＴ）中で細胞を採取した。

酵素結合免疫吸着アッセイを介した免疫グロブリンのスクリーニング
分泌されたウサギ抗体の検出は、上清をビオチニル化された捕捉抗体（ヤギにおいて産生された抗ウサギＩｇＧ抗体）を介して、ストレプトアビジンマイクロタイタープレート上に覆われた１μｇ／ｍｌのＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０の最終濃度で、そして１：７５００の最終濃度のセイヨウワサビペルオキシダーゼに結合された抗ウサギＩｇＧ検出抗体を介して分析することによって行った。洗浄ステップは、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を使用することによって実施した。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を基質として使用し、ＨＣｌを酵素反応の停止のために使用した。

Ｂ細胞上清におけるＩＬ−１ＲＡｃＰ特異的抗体の測定
マイクロタイタープレートを、ＩＬ−１ＲＡｃＰおよび／またはＩＬ１２Ｒβ１タンパク質（ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰまたはＩＬ１２Ｒβ１の組換えＦｃキメラ結合体）で被覆した。ブロッキング過程後に、Ｂ細胞上清からの特異的抗体は、ターゲットに結合し、次いでＰＯＤ標識された抗ウサギＩｇＧ抗体によって検出される。ＩＬ１２Ｒβ１結合は、カウンタースクリーニングとして使用した。ＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質に、ＩＬ１２Ｒβ１タンパク質と同様に、リンカーのｈｕＦｃおよびＨｉｓをタグ付けした。そのタグに結合する抗体は、両方のアッセイにおいて陽性であるが、抗原特異的抗体は、ＩＬ−１ＲＡｃＰにのみ結合して、ＩＬ１２Ｒβ１に結合しなかった。

ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬのＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質１２．５μＬをマイクロタイタープレートに移し、インキュベートし、洗浄バッファーで３回洗浄した。９０μＬのブロッキングバッファーをそれぞれのウェルに添加し、インキュベートし、洗浄した。１２．５μｌの標準抗体（ＩＬ−１ＲＡｃＰに対するウサギモノクローナル抗体、抗ＩＬ１２Ｒβ１抗体：ＩＬ−１２Ｒβ１抗体；ＧｅｎｅＴｅｘ；カタログ番号ＧＴＸ１０３９１７）または試料をＥＬＩＳＡバッファー中で希釈したものを添加し、インキュベートし、そして洗浄した。１：５０００のＰＯＤ抗体（ＥＬＩＳＡバッファー中）（抗ウサギＩｇＧ、ペルオキシダーゼに結合された種特異的Ｆａｂ２フラグメント（ロバ由来）（ＥＣＬ）；アッセイ希釈：１：５０００）１２．５μｌを添加し、インキュベートし、そして洗浄した。１５μｌのＴＭＢを添加し、１５μｌのＨＣｌを十分な進展後に添加した。吸光度（光学密度Ｏ．Ｄ．）は、４５０ｎｍ／６２０ｎｍで読み取った。結果を図１に示す。
ＥＬＩＳＡバッファー：ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０
洗浄バッファー：ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０
ブロッキングバッファー：ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０。

実施例４：ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに結合する抗体
アッセイの原理：
ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）３８４ウェルマイクロタイタープレートを、Ｐ０１３＿０３で被覆する。ブロッキング過程後に、Ｂ細胞上清からの特異的抗体は、抗原のヒト（Ｐ０１３−０３）またはマウスＩＬ−１ＲＡｃＰ（Ｐ０１３−０４）に結合し、次いでＰＯＤ標識された抗体によって検出される。試料は、１：２希釈で試験される。

材料：
プレート： ３８４ウェルのＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレート；カタログ番号４６４７１８
タンパク質：
Ｐ０１３−０３（濃度１．５ｍｇ／ｍｌ；アッセイ濃度０．５μｇ／ｍｌ）ヒト
Ｐ０１３−０４（濃度１．３ｍｇ／ｍｌ；アッセイ濃度０．５μｇ／ｍｌ）マウス
標準抗体： Ｐ０１３−０２（濃度１ｍｇ／ｍｌ；開始アッセイ濃度２μｇ／ｍｌ）
検出抗体： 抗ウサギＩｇＧ、ペルオキシダーゼに結合された種特異的全抗体（ロバ由来）（ＥＣＬ）；ＧＥ；カタログ番号ＮＡ９３４０；アッセイ希釈：１：５０００
ＰＢＳ： Ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ ａ Ｂｏｘ、プレミックスされたＰＢＳバッファー、１０×；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１１６６６７８９００１
ＢＳＡ： ウシ血清からのウシ血清アルブミンフラクションＶ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１０７３５０８６００１
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０： Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０；Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ；カタログ番号９１２７．２
ＴＭＢ： ＴＭＢ溶液；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号ＳＢ０２
ＨＣｌ： １ＭのＴｉｔｒｉｐｕｒ（登録商標）塩酸；Ｍｅｒｃｋ；カタログ番号１０９０５７１０００
ＥＬＩＳＡバッファー：ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）
洗浄バッファー：ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）
ブロッキングバッファー：ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）
試料：ＥＬＩＳＡバッファー中１：２希釈。

手順：
１． １２．５μＬのＰＢＳ中Ｐ０１３−０３（０．５μｇ／ｍｌ）を３８４ウェルのＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレートに添加し、室温で１時間にわたりインキュベートする。
２． ９０μｌの洗浄バッファーで３回洗浄する。
３． ９０μＬのブロッキングバッファーを各ウェルに添加し、室温で１時間にわたりインキュベートする。
４． 洗浄バッファーで３回洗浄する。
５． １２．５μＬの標準抗体（ＥＬＩＳＡバッファー中１：２希釈）または試料（ＥＬＩＳＡバッファー中１：２希釈）を添加し、室温で１時間にわたりインキュベートする。
６． 洗浄バッファーで３回洗浄する。
７． １：５０００のＰＯＤ抗体（ＥＬＩＳＡバッファー中）１２．５μＬを添加し、室温で１時間にわたりインキュベートする。
８． 洗浄バッファーで６回洗浄する。
９． １５μＬのＴＭＢを添加する。
１０． 十分な進展後に１５μＬのＨＣｌを添加する。
１１． ４５０ｎｍ／６２０ｎｍで吸光度を読み取る。

実施例５：マウスＩＬ−１ＲＡｃＰに結合する抗体
アッセイの原理：
ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）３８４ウェルマイクロタイタープレートを、Ｐ０１３＿０４で被覆する。ブロッキング過程後に、Ｂ細胞上清からの特異的抗体は、抗原に結合し、次いでＰＯＤ標識された抗体によって検出される。試料は、１：２希釈で試験される。

材料：
プレート： ３８４ウェルのＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレート；カタログ番号４６４７１８
タンパク質： Ｐ０１３−０４（濃度１．３ｍｇ／ｍｌ；アッセイ濃度０．５μｇ／ｍｌ）
標準抗体： Ｐ０１３−０２（濃度１ｍｇ／ｍｌ；開始アッセイ濃度２μｇ／ｍｌ）
検出抗体： 抗ウサギＩｇＧ、ペルオキシダーゼに結合された種特異的全抗体（ロバ由来）（ＥＣＬ）；ＧＥ；カタログ番号ＮＡ９３４０；アッセイ希釈：１：５０００
ＰＢＳ： Ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ ａ Ｂｏｘ、プレミックスされたＰＢＳバッファー、１０×；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１１６６６７８９００１
ＢＳＡ： ウシ血清からのウシ血清アルブミンフラクションＶ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１０７３５０８６００１
Ｔｗｅｅｎ ２０： Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０；Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ；カタログ番号９１２７．２
ＴＭＢ： ＴＭＢ溶液；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号ＳＢ０２
ＨＣｌ： １ＭのＴｉｔｒｉｐｕｒ（登録商標）塩酸；Ｍｅｒｃｋ；カタログ番号１０９０５７１０００
ＥＬＩＳＡバッファー：ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）
洗浄バッファー：ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）
ブロッキングバッファー：ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）
試料：ＥＬＩＳＡバッファー中１：２希釈。

手順：
１． １２．５μＬのＰＢＳ中Ｐ０１３−０４（０．５μｇ／ｍｌ）を３８４ウェルのＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレートに添加し、室温で１時間にわたりインキュベートする。
２． ９０μｌの洗浄バッファーで３回洗浄する。
３． ９０μＬのブロッキングバッファーを各ウェルに添加し、室温で１時間にわたりインキュベートする。
４． 洗浄バッファーで３回洗浄する。
５． １２．５μＬの標準抗体（ＥＬＩＳＡバッファー中１：２希釈）または試料（ＥＬＩＳＡバッファー中１：２希釈）を添加し、室温で１時間にわたりインキュベートする。
６． 洗浄バッファーで３回洗浄する。
７． １：５０００のＰＯＤ抗体（ＥＬＩＳＡバッファー中）１２．５μＬを添加し、室温で１時間にわたりインキュベートする。
８． 洗浄バッファーで６回洗浄する。
９． １５μＬのＴＭＢを添加する。
１０． 十分な進展後に１５μＬのＨＣｌを添加する。
１１． ４５０ｎｍ／６２０ｎｍで吸光度を読み取る。

実施例６：ＥＬＩＳＡにおけるＥＣ５０の測定
本発明による抗体のヒトＩＬ−１ＲＡｃＰへの結合を、ＥＬＩＳＡで分析した：ＥＣ５０値を、従来技術に従って計算した。

実施例７：ルシフェラーゼベースの遺伝子レポーターアッセイにおけるＩＬ−１ＲＡｃＰに対する抗体のＮＦ−κＢ中和活性
アッセイの原理：
ＮＦ−κＢ−ＲＥホタルルシフェラーゼレポーターを発現する２９３Ｔ／１７−ＦＲ細胞を、ポリ−Ｄ−リジン−細胞培養プレートに播種する。Ｐ０１３の刺激後に、２９３Ｔ／１７−ＦＲ溶解物を、活性化されたＮＦ−κＢについてＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキットを使用して試験する。機能的抗体を含む上清は、Ｐ０１３に結合し、ＮＦ−κＢ活性化を阻害し、それは低いシグナルで示される。試料は、Ｐ０１３溶液中１：２希釈で試験される。

材料：
プレート： セルプレート：３８４ウェルのＰＤＬ Ｃｏｓｔａｒ細胞培養プレート；カタログ番号３８４４
アッセイプレート： ３８４ウェルのＬｕｍｉｔｒａｃ（登録商標）白色プレート；Ｃｏｒｎｉｎｇ；カタログ番号３５７２
細胞： ２９３Ｔ／１７−ＦＲ；アッセイ濃度２５００００細胞／ｍｌ
タンパク質：
Ｐ０１３＿０５（濃度０．０３ｍｇ／ｍｌ；アッセイ濃度１１５ｐｇ／ｍｌ；作業濃度２３０ｐｇ／ｍｌ）
ＩＬ−１α、ＩＬ−３３およびＩＬ−３６
標準抗体： Ｐ０１３＿０６（濃度０．２ｍｇ／ｍｌ；開始作業濃度６μｇ／ｍｌ）
キット： Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム；Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｅ２５１０
細胞培地： ＤＭＥＭ培地；ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号Ｐ０４−０４５１０
ＦＣＳ： ウシ胎児血清、ＨｙＣｌｏｎｅ；Ｔｈｅｒｍｏ；カタログ番号Ｓｔ３００７０．０３
２９３Ｔ／１７−ＦＲ培地： ＤＭＥＭ培地、１０％ＦＣＳ（＋２０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ、培養の場合のみ）
前処理されたＢ細胞培地（ＭＡＢ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）
試料： ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＣＳ中のＰ０１３＿０５で１：２希釈。

手順：
１． コンフルエントな２９３Ｔ／１７−ＦＲ細胞を、毎月曜日（採取種細胞：５×１０⁶細胞／Ｔ１７５フラスコ）および毎金曜日（採取種細胞：３×１０⁶細胞／Ｔ１７５フラスコ）にトリプシン／ＥＤＴＡを用いて継代培養する（室温でちょうど３０秒間にわたりインキュベートする）。
２． ２５μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中の細胞（０．２５×１０⁶細胞／ｍｌ）を、３８４ウェルのＰＤＬプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ カタログ番号３８４４）に播種し、３７℃および５％ＣＯ₂で一晩インキュベートする。
３． 培地を吸引し、試料またはＰ０１３＿０６を、前処理された培地または前処理されたばかりの培地中で１：３希釈した希釈物１２．５μｌを添加し、３７℃および５％ＣＯ₂で３０分間にわたりインキュベートする（プログラム：３ Ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓａｍｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）。
４． ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中のＰ０１３＿０５を１２．５μｌ添加し、３７℃および５％ＣＯ₂で５時間にわたりインキュベートする（プログラム：４＿Ａｄｄ Ｐ０１３＿０５）。
５． 培養細胞を室温で１０分間にわたり平衡化する。
６． ２５μｌのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を添加し、ピペットで数回混合する（プログラム：６＿Ｓｔｅａｄｙ Ｇｌｏ（登録商標））。
７． ５分間待機した後に、４５μｌの上清を３８４ウェルのＬｕｍｉｔｒａｃ（登録商標）白色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ カタログ番号３５７２）に移す（プログラム：７＿Ｔｒａｎｓｆｅｒ ４５ｕｌ）。
８． ルミネッセンスをＴｅｃａｎ社製のリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、スイス）において測定する：積分時間：０．５秒。

実施例８：ＩＬ−１α中和アッセイ
材料：
細胞： ホタルルシフェラーゼＮＦ−κＢレポーターおよびウミシイタケルシフェラーゼ（正規化対照のため）を安定的に発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞。ＩＬ１ＲＡｃＰおよびＩＬ１Ｒ１は、内因的に発現される
培地： ＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ カタログ番号３０−２００２）＋１０％熱不活化ＦＢＳ
試薬：
ＩＬ−１α（Ｒ＆Ｄ 番号２００−ＬＡ）；１０μｇ／ｍｌのＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡ
抗ＩＬ１ＲＡｃＰポジティブコントロール抗体（Ｒ＆Ｄ 番号ＡＦ６７６）；２００μｇ／ｍｌ
ＭＡＢ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ抗体：
プレート１の抗体は、７５０μｇ／ｍｌ
プレート２の抗体は、２５０μｇ／ｍｌ
ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ 番号Ｅ１５００）。

手順：
１． 細胞を５００００個／ウェルで９６ウェルプレート中に１００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートする。
２． ４倍希釈の抗体をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で２×最終濃度で調製する。
３． 細胞を吸引分離し、抗体を６０μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中の２×最終濃度で添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ₂で３０分間インキュベートする。
４． ＩＬ−１αを１７５ｐｇ／ｍｌの最終濃度で６０μｌの完全培地において添加し（１７５ｐｇ／ｍｌはＥＣ₅₀である）、３７℃、５％ＣＯ₂で４時間インキュベートする。
５． 細胞を１５０μｌのＰＢＳで洗浄する。
６． 細胞を５０μｌの１×細胞培養溶解試薬（ルシフェラーゼアッセイシステムによる）中で振とう器において周囲温度で１５分間にわたり溶解する。
７． ピペットで出し入れを行い、２０μｌの溶解物をｌｕｍｉｔｒａｃ−２００プレートに移し、１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加し、ルミネッセンスを、液体インジェクタまたはその他の適切な光度計を備えたＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２を用いて読み取る。

実施例９：ＩＬ−１β中和アッセイ
材料：
細胞： ホタルルシフェラーゼＮＦ−κＢレポーターおよびウミシイタケルシフェラーゼ（正規化対照のため）を安定的に発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞。ＩＬ１ＲＡｃＰおよびＩＬ１Ｒ１は、内因的に発現される
培地： ＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ カタログ番号３０−２００２）＋１０％熱不活化ＦＢＳ
試薬：
ＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ 番号２０１−ＬＢ）；２５μｇ／ｍｌのＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡ
抗ＩＬ１ＲＡｃＰポジティブコントロール抗体（Ｒ＆Ｄ 番号ＡＦ６７６）；２００μｇ／ｍｌ
抗ＩＬ１ＲＡｃＰウサギｐＡｂポジティブコントロール抗体（ＯＮＣＯ ロットＡＰ１４）／２００μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ）
正常ウサギＩｇＧ（ＪＬ 番号０１１−０００−００３）；２００μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ）
ＭＡＢ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ抗体
プレート１の抗体は、７５０μｇ／ｍｌ
プレート２の抗体は、２５０μｇ／ｍｌ
ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ 番号Ｅ１５００）。

手順：
１． 細胞を５００００個／ウェルで９６ウェルプレート中に１００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ₂で一晩インキュベートする。
２． ４倍希釈の抗体をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で２×最終濃度で調製する。
３． 細胞を吸引分離し、抗体を６０μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中の２×最終濃度で添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ₂で３０分間インキュベートする。
４． ＩＬ−１βを１７５ｐｇ／ｍｌの最終濃度で６０μｌの完全培地において添加し（１７５ｐｇ／ｍｌはＥＣ₅₀である）、３７℃、５％ＣＯ₂で４時間インキュベートする。
５． 細胞を１５０μｌのＰＢＳで洗浄する。
６． 細胞を５０μｌの１×細胞培養溶解試薬（ルシフェラーゼアッセイシステムによる）中で振とう器において周囲温度で１５分間にわたり溶解する。
７． ピペットで出し入れを行い、２０μｌの溶解物をｌｕｍｉｔｒａｃ−２００プレートに移し、１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加し、ルミネッセンスを、液体インジェクタまたはその他の適切な光度計を備えたＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２を用いて読み取る。

実施例１０：ＩＬ−３３中和アッセイ
材料：
細胞： ＣＭＶプロモーターによって駆動されるホタルルシフェラーゼＮＦ−κＢレポーター、ウミシイタケルシフェラーゼ（正規化対照のため）およびＩＬ−３３Ｒで一過性トランスフェクションされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞。ＩＬ１ＲＡｃＰは、内因的に発現される
培地： ＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ カタログ番号３０−２００２）＋１０％熱不活化ＦＢＳ
試薬：
ＩＬ−３３（Ｒ＆Ｄ 番号３６２５−ＩＬ）；１０μｇ／ｍｌのＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡ
抗ＩＬ１ＲＡｃＰポジティブコントロール抗体（Ｒ＆Ｄ 番号ＡＦ６７６）；２００μｇ／ｍｌ
ＭＡＢ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ抗体
プレート１の抗体は、７５０μｇ／ｍｌ
プレート２の抗体は、２５０μｇ／ｍｌ
ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ 番号Ｅ１５００）。

手順：
１． 細胞を、ルシフェラーゼレポーターおよびＩＬ−３３Ｒで２５０００細胞／ウェルにおいて、アッセイ前に約２４時間にわたりトランスフェクションさせる。
２． ４倍希釈の抗体をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で２×最終濃度で調製する。
３． 細胞を吸引分離し、抗体を６０μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中の２×最終濃度で添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ₂で３０分間インキュベートする。
４． ＩＬ−３３を２５０ｐｇ／ｍｌの最終濃度で６０μｌの完全培地において添加し、３７℃、５％ＣＯ₂で４時間インキュベートする。
５． 細胞を１５０μｌのＰＢＳで洗浄する。
６． 細胞を５０μｌの１×細胞培養溶解試薬（ルシフェラーゼアッセイシステムによる）中で振とう器において周囲温度で１５分間にわたり溶解する。
７． ピペットで出し入れを行い、２０μｌの溶解物をｌｕｍｉｔｒａｃ−２００プレートに移し、１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加し、ルミネッセンスを、液体インジェクタまたはその他の適切な光度計を備えたＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２を用いて読み取る。

実施例１１：ＩＬ−３６β（ＩＬ１Ｆ８）中和アッセイ
材料：
細胞： ＣＭＶプロモーターによって駆動されるホタルルシフェラーゼＮＦ−κＢレポーター、ウミシイタケルシフェラーゼ（正規化対照のため）およびＩＬ−３６Ｒで安定的にトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞。ＩＬ１ＲＡｃＰは、内因的に発現される
培地： ＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ カタログ番号３０−２００２）＋１０％熱不活化ＦＢＳ
試薬：
ＩＬ−３６β（Ｒ＆Ｄ 番号６８３４−ＩＬ）；１００μｇ／ｍｌのＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡ
抗ＩＬ１ＲＡｃＰポジティブコントロール抗体（Ｒ＆Ｄ 番号ＡＦ６７６）；２００μｇ／ｍｌ
ＭＡＢ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ抗体
プレート１の抗体は、７５０μｇ／ｍｌ
プレート２の抗体は、２５０μｇ／ｍｌ
ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ 番号Ｅ１５００）。

手順：
１． 細胞を５００００個／ウェルで９６ウェルプレート中に１００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ₂で一晩インキュベートする。
２． ４倍希釈の抗体をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で２×最終濃度で調製する。
３． 細胞を吸引分離し、抗体を６０μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中の２×最終濃度で添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ₂で３０分間インキュベートする。
４． ＩＬ−３６βを１５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で６０μｌの完全培地において添加し（１５ｎｇ／ｍｌはＥＣ₅₀である）、３７℃、５％ＣＯ₂で４時間インキュベートする。
５． 細胞を１５０μｌのＰＢＳで洗浄する。
６． 細胞を５０μｌの１×細胞培養溶解試薬（ルシフェラーゼアッセイシステムによる）中で振とう器において周囲温度で１５分間にわたり溶解する。
７． ピペットで出し入れを行い、２０μｌの溶解物をｌｕｍｉｔｒａｃ−２００プレートに移し、１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加し、ルミネッセンスを、液体インジェクタまたはその他の適切な光度計を備えたＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２を用いて読み取る。

ヒトおよびマウスＩＬ−１ＲＡｃＰに結合する抗体。実施例３〜６に記載される実験の結果。 配列（一文字記号のアミノ酸）。Ｄ、Ａ、Ｓ、Ｋ、Ｌ、Ａ、Ｓは、ＤＡＳＫＬＡＳを意味する。図２の全てのその他についても同じことが言える。ＣＤＲＨ１：配列番号１５５〜配列番号２３１、ＣＤＲＨ２：配列番号２３２〜配列番号３０８、ＣＤＲＨ３：配列番号３０９〜配列番号３８５、ＣＤＲＬ１：配列番号３８６〜配列番号４６２、ＣＤＲＬ２：配列番号４６３〜配列番号５３９、ＣＤＲＬ３：配列番号５４０〜配列番号６１６。 リガンドに誘導されるシグナル伝達の阻害。最も見込みのある１８種の抗体についてのシグナル伝達阻害の結果の要約表が示されている。実験手順は、実施例８〜１１に詳説されている。 リガンドに誘導されるシグナル伝達の選択された抗体による阻害。実施例８〜１１に記載される実験結果の例示的グラフ。各図の表題に示される種々のリガンドのシグナル伝達によるＮＦκＢ刺激のパーセントが示されている。種々の色は、種々の抗体に対応する。試験された抗体の選択物だけが示されている。 ＩＬ−１ＲＡｃＰに対する選択された抗体のＮＦ−κＢ中和活性。実施例７に記載される実験の結果。ルシフェラーゼベースの遺伝子レポーターアッセイにおけるＩＬ−１ＲＡｃＰに対する抗体のＮＦ−κＢ中和活性が示されている。 好ましい配列を有する抗体のリガンドに誘導されるシグナル伝達の阻害。１９種の好ましい抗体についてのシグナル伝達実験の結果が示されている。実験手順は、実施例８〜１１に詳説されている。

Claims (36)

1. ＩＬ−１ＲＡｃＰに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
   ａ）ＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２Ｈおよび／またはＣＤＲ３Ｈを含み、
   ＣＤＲ１Ｈ領域が、配列番号１５５〜配列番号２３１の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
   ＣＤＲ２Ｈ領域が、配列番号２３２〜配列番号３０８の群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ
   ＣＤＲ３Ｈ領域が、配列番号３０９〜配列番号３８５の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、
   ｂ）ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２Ｌおよび／またはＣＤＲ３Ｌを含み、
   ＣＤＲ１Ｌ領域が、配列番号３８６〜配列番号４６２の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
   ＣＤＲ２Ｌ領域が、配列番号４６３〜配列番号５３９の群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ
   ＣＤＲ３Ｌ領域が、配列番号５４０〜配列番号６１６の群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と
   を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
2. 前記重鎖可変（ＶＨ）領域は、配列番号１〜配列番号７７のＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域に対して少なくとも９０％同一であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
3. 前記軽鎖可変（ＶＬ）領域は、配列番号７８〜配列番号１５４のＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域に対して少なくとも９０％同一であることを特徴とする、請求項１および２に記載の抗体。
4. 前記ＶＨ領域は、配列番号１＋ｎのＶＨ領域と少なくとも９０％同一であり、かつ前記ＶＬ領域は、配列番号７８＋ｎのＶＬ領域と少なくとも９０％同一であり、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載の抗体。
5. 前記ＶＨ領域は、配列番号１〜配列番号７７のＶＨ領域からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の抗体。
6. 前記ＶＬ領域は、配列番号７８〜配列番号１５４のＶＬ領域からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項に記載の抗体。
7. 前記ＶＨ領域は、配列番号１＋ｎのＶＨ領域からなる群から選択され、かつ前記ＶＬ領域は、配列番号７８＋ｎのＶＬ領域からなる群から選択され、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載の抗体。
8. 前記抗体は、配列番号１５５＋ｎのＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２３２＋ｎのＣＤＲ２Ｈ領域、および配列番号３０９＋ｎのＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域の群から選択されるＶＨ領域を含み、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項に記載の抗体。
9. 前記抗体は、配列番号３８６＋ｎのＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号４６３＋ｎのＣＤＲ２Ｌ領域、および配列番号５４０＋ｎのＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域の群から選択されるＶＬ領域を含み、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項に記載の抗体。
10. 前記抗体は、配列番号１５５＋ｎのＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２３２＋ｎのＣＤＲ２Ｈ領域、および配列番号３０９＋ｎのＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域の群から選択されるＶＨ領域を含み、かつ前記抗体は、配列番号３８６＋ｎのＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号４６３＋ｎのＣＤＲ２Ｌ領域、および配列番号５４０＋ｎのＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域の群から選択されるＶＬ領域を含み、ここで、ｎは、０〜７６からなる群から選択される数であることを特徴とする、請求項１から９までのいずれか１項に記載の抗体。
11. 表３に列挙される抗体からなる群から選択される抗体のそれぞれのＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域およびＶＬ領域を含むことを特徴とする、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の抗体。
12. ＩＬ−１ＲＡｃＰに誘導されるＮＦκＢ活性を阻害し、かつ抗体Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｂ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ａ０５、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｃ０４、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｈ０１、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｄ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｅ０２、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０４、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０５、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０２、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｄ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｈ０１、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｆ０１、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｂ０４、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｃ０２、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｂ０５、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｈ０３およびＰ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｇ０５の群から選択される抗体と同じエピトープに結合することを特徴とする、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の抗体。
13. 抗体Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｂ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ａ０５、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｃ０４、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｈ０１、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｄ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０１．Ｂ．Ｅ０２、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０４、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０５、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０２、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｄ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｈ０１、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｆ０１、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｂ０４、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｃ０２、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｂ０５、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ａ０３、Ｐ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｈ０３およびＰ０１３．Ｓ．０２．Ｂ．Ｇ０５からなる群から選択される抗体のそれぞれのＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域およびＶＬ領域を含むことを特徴とする、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の抗体。
14. ＩＬ−１ＲＡｃＰに誘導されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の抗体。
15. マウスＩＬ−１ＲＡｃＰに誘導されるマウスＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする、請求項１４のいずれか１項に記載の抗体。
16. ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６で刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする、請求項１４から１５までのいずれか１項に記載の抗体。
17. ＩＬ−１αで刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする、請求項１６に記載の抗体。
18. ＩＬ−１βで刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする、請求項１６に記載の抗体。
19. ＩＬ−３３で刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする、請求項１６に記載の抗体。
20. ＩＬ−３６で刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする、請求項１６に記載の抗体。
21. ＩＬ−１β／ＩＬ−１Ｒ１／ＩＬ−１ＲＡｃＰ、ＩＬ−１α／ＩＬ−１Ｒ１／ＩＬ−１ＲＡｃＰ、ＩＬ−３３／ＳＴ２／ＩＬ−１ＲＡｃＰおよび／またはＩＬ−３６／ＩＬ−３６Ｒ／ＩＬ−１ＲＡｃＰからなる群から選択される複合体によって刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする、請求項１６に記載の抗体。
22. ５μｇ／ｍｌの濃度（ウサギＩｇＧアイソタイプは、１５０ＫＤの分子量を有する）で、０．５μｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６（分子量は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔを参照のこと）で刺激された２９３Ｔ／１７細胞溶解物（２９３Ｔ／１７［ＨＥＫ ２９３Ｔ／１７］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１１２６８（商標）））において、ＮＦκＢ活性を、本発明による前記抗体を用いない同様のアッセイに対して７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上も阻害することを特徴とする、請求項１から２１までのいずれか１項に記載の抗体。
23. ５μｇ／ｍｌの濃度で、０．５μｇ／ｍｌのマウスＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６（分子量は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔを参照のこと）で刺激されたそれぞれのマウス細胞株溶解物において、ＮＦκＢ活性を、本発明による前記抗体を用いない同様のアッセイに対して７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上も阻害することを特徴とする、請求項１から２２までのいずれか１項に記載の抗体。
24. ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６のそれぞれで刺激されたルシフェラーゼ活性を、２９３Ｔ／１７細胞（ＮＦ−κＢレポーター遺伝子の制御下にルシフェラーゼでトランスフェクションされた２９３Ｔ／１７−ＦＲ細胞）において阻害することを特徴とする、請求項１から２３までのいずれか１項に記載の抗体。
25. 野生型のヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む本発明による抗体によって誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％まで低減されたＡＤＣＣを示すことを特徴とする、請求項１から２３までのいずれか１項に記載の抗体。
26. 野生型のＩｇＧのＦｃ領域を含む本発明による抗体と比較して低減された、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩに対する親和性を示し、ここで、本発明による前記抗体によって誘導されるＡＤＣＣは、野生型のヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む本発明による抗体によって誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％まで低減されることを特徴とする、請求項１から２３までのいずれか１項に記載の抗体。
27. ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅでのアミノ酸置換を少なくとも含むことを特徴とする、請求項１から２５までのいずれか１項に記載の抗体。
28. ウサギ／ヒトのキメラ抗体またはヒト化抗体であることを特徴とする、請求項１から２７までのいずれか１項に記載の抗体。
29. 本発明によるＩＬ１βで刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とするヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに対するモノクローナルウサギ抗体の製造方法であって、
    ｉ）前記ウサギをＩＬ−１ＲＡｃＰで免疫化した後に、前記ウサギから得られた多くの抗体産生単一細胞を単離するステップ、
    ｉｉ）ＩＬ−１ＲＡｃＰへの結合を、前記単一細胞の上清について個別に測定するステップ、
    ｉｉｉ）その上清がヒトおよびマウスＩＬ−１ＲＡｃＰへの結合を示し、かつＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６によって刺激されるＮＦκＢ活性を阻害する場合に、単一細胞を選択するステップ、
    ｉｖ）ステップｉｉｉ）の特性を有する抗体を、前記選択された細胞から単離するステップ
    を特徴とする、製造方法。
30. 前記ウサギ抗体産生単一細胞が、ウサギハイブリドーマ単一Ｂ細胞であることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
31. 前記ウサギを前記抗原で免疫化した後に、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰへの結合と、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６によって刺激されるＮＦκＢ活性の阻害とが見出された場合に、抗体産生単一細胞を前記動物から単離するか、または前記ウサギから得られたウサギハイブリドーマ細胞を単離することを特徴とする、請求項２９または３０に記載の方法。
32. 請求項１から２８までのいずれか１項に記載の抗体の、医薬組成物の製造のための使用。
33. 抗体産生ウサギ単一細胞の上清であって、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰへと結合し、かつＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６によって刺激されるＮＦκＢ活性を阻害することを特徴とする、上清。
34. 患者におけるＩＬ−１媒介疾患の治療方法であって、患者に請求項１から２８までのいずれか１項に記載の抗体の医薬的有効量を投与することを含む、治療方法。
35. 医薬品に許容可能な担体と、請求項１から２８までのいずれか１項に記載の抗体の治療的有効量とを含む医薬組成物。
36. 患者におけるＩＬ−１媒介疾患の治療方法であって、患者に請求項３５に記載の医薬組成物を投与することを含む、治療方法。

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