DE69738522T2 - Ein verfahren zur inhibierung immunglobulininduzierter toxizität aufgrund von der verwendung von immunoglobinen in therapie und in vivo diagnostik - Google Patents

Ein verfahren zur inhibierung immunglobulininduzierter toxizität aufgrund von der verwendung von immunoglobinen in therapie und in vivo diagnostik Download PDF

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Methoden zum Hemmen oder Reduzieren der durch Immunglobulin induzierten Toxizität, die aus der Therapie oder der in vivo-Diagnose herrührt. Spezifisch bietet die Erfindung statt der Verwendung unmodifizierter Antikörper oder rekombinanter Bindungsproteine zur Anwendung in vivo die Verwendung modifizierter Antikörper oder rekombinanter Bindungsproteine, die in der konstanten Domäne strukturell so geändert worden sind, dass die durch Immunglobulin induzierte Toxizität auf die Verabreichung hin reduziert oder gehemmt wird.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Im Laufe der Jahre haben Forscher versucht, das Immunsystem für die therapeutische Anwendung nutzbar zu machen. Immunglobulin-(Ig-)Moleküle, die einen wichtigen Teil des Immunsystems darstellen, sind deshalb von großem Interesse, weil sie (1) mit einer vielfältigen Familie von Liganden reagieren, (2) verschiedene Effektorfunktionen besitzen und (3) von großer biologischer Wichtigkeit sind. Trotz ihres Potentials hat ein hartnäckiges Problem bei der Immuntherapie mit Immunglobulin neben anderen Problemen aus der toxischen Auswirkung der Verwendung von Antikörpern, die sowohl normale als auch kranke Zellen erkennen, auf normale Zellen bestanden. Dieses Problem ist deshalb weitreichend, weil die meisten Antikörper, die zur Zeit zur Verfügung stehen, ein Target erkennen, das sowohl an normalen als auch kranken Zellen vorkommt (Slavin-Chiorini et al., Int. J. Cancer 53: 97–103 (1993)).
  • Die Konstantregion kann den Zelltod durch antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) oder durch komplementabhängige Zytotoxizität (CDC) fördern. Trotz der Deletion von Anteilen der Konstantregion, insbesondere der CH2-Domäne, kann die Antigenbindungsfunktion beibehalten werden (D. Yelton, M. Scharf, Mutant monoclonal antibody with alterations in biological functions – Mutanter monoklonaler Antikörper mit Änderungen der biologischen Funktionen –, J. Exp. Methods 156: 1131–1148 (1982)).
  • Andere haben einen CH2-deletierten Antikörper erzeugt (Mueller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5702–5705 (1990)). Ihre Ergebnisse zeigen, dass der CH2-deletierte Antikörper aus dem Blut tumortragender Mäuse viel schneller eliminiert wurde als der entsprechende intakte Antikörper. Andere in vivo-Befunde haben ebenfalls bestätigt, dass ein CH2-deletierter Antikörper, ch14.18DCH2 genannt, ein potentiell nützliches Reagenz für die Radioimmundetektion menschlicher Tumore aufgrund seiner reduzierten Immungenizität, erhöhten Targetspezifizität und schnellen Entfernung aus dem Blutkreislauf ist (Mueller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5702–5705 (1990)).
    • • G. J. Schreiber et al, Cancer Research, Band 52, 1992, S. 3262–3266, offenbaren das antikarzinogene murine BR96-Antikörper F(ab')2 IgG3-Polypeptid und eine klassengewechselte IgG1-Variante des ursprünglichen IgG3 BR96-Antikörpers, der keine antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizitäts-(ADCC) und keine komplementabhängige Zytotoxizitäts-(CDC)Effektorfunktionen besitzt. S. D. Gillies et al., Human Antibodies and Hybridomas (Menschliche Antikörper und Hybridome), Band 1, 1990, S. 47–54, offenbaren Antigenbindungs- und biologische Aktivitäten gentechnisch veränderter mutanter chimärer Antikörper mit menschlichen Tumorspezifizitäten. Die Konstantregion der IgG-Kette wurde entweder durch Deletion der CH2-Domäne oder durch Punktmutation von zwei Cysteinresten in der Scharnierregion des IgG-Moleküls strukturell geändert. Die CH2-Deletion führte zu einer drastisch reduzierten ADCC- und CDC-Aktivität. Die Cysteinmutation führte zu einer stark reduzierten ADCC-Aktivität und einer reduzierten, jedoch immer noch signifikanten, Fähigkeit, CDC zu verursachen. G. J. Weiner et al., Journal of Immunology, Band 152, 1994, S. 2385–2392, offenbaren einen hybriden Anti-CD3 x Antitumor F(ab')2-Antikörper, der für die Immuntherapie verwendet wird. Der Fc-Teil des Antikörpers ist entfernt worden, um die toxischen Nebenwirkungen, denen man bei einleitenden Studien an Subjekten begegnet ist, wie beispielsweise die ADCC und unspezifische T-Zellaktivierung, zu reduzieren. A. R. Duncan et al, Nature, Band 332, 1988, S. 738–740 offenbaren, dass gewisse Punktmutationen an den Resten 318 (Glu), 320 (Lys) und 322 (Lys) in der CH2-Domäne verschiedener IgG-Isotypen die CDC reduzieren und dass es IgG-Isotypen, wie beispielsweise IgG4, gibt, die nicht lytisch sind und daher keine CDC-Reaktion induzieren. Y. Xu et al., The Journal of Biological Chemistry, Band 269, 1994, S. 3469–3474, offenbaren, dass die C-terminale Region der CH2-Domäne (Reste 292–340) für die isotypspezifischen Unterschiede in der Komplementbindung und bei der Induktion der CDC-Reaktion verantwortlich ist. Außerdem wurde der Rest an Position 331 analysiert und es wurde gefunden, dass er für die Clq-Bindung und Komplementaktivierung im menschlichen IgG1 wichtig ist. Eine Punktmutation von Pro331 zu Ser311 eliminiert diese Aktivität, während eine Pro331-Punktmutation im IgG4-Isotyp, der gewöhnlich inaktiv ist, die lytische Aktivität des Isotyps wiederherstellte. J. Lund et al, The Journal of Immunology, Band 147, 1991, S. 2657–2662 offenbaren, dass die FcγRI- und FcγRII-Bindungsstellen in der CH2-Domäne des menschlichen IgG3-Isotyp für die toxische ADCC-Reaktion bei Subjekten, die mit Antikörpern behandelt werden, verantwortlich ist. Die Bindungsstellen überlappen sich teilweise in der Region der Reste 234 bis 239 an menschlichen IgG1- und IgG3-Isotypen. Eine Bindung an menschliches IgG2 kann nicht festgestellt werden. Des Weiteren führte eine Punktmutation an Position 235 zur stärksten Reduktion der FcγRI-Bindung, und Punktmutationen an den Positionen 234 und 237 führten zur stärksten Reduktion der FcγRII-Bindung. A. Morgan et al., Immunology, 1995, Band 86, S. 319–324 offenbaren, dass der Austausch des Leucins 235 in der CH2-Region von IgG1 die Lyse durch menschliches Komplement eliminierte und das Ersetzen von Glycin bei 237 durch Alanin von IgG1 die Lyse durch menschliches Komplement reduzierte. Das Ersetzen der gesamten Region 233–236 durch die Sequenz, die im menschlichen IgG2 vorgefunden wird, eliminierte die Lyse durch menschliches Komplement. Im Gegensatz dazu hatte das Ersetzen von Lysin 320 im vorher beschriebenen Clq-Bindungsmotiv durch Alanin keine Auswirkung auf die IgG1-vermittelte komplementabhängige Lyse. S. M. Canfield et al., J. Exp. Med. Band 173, Juni 1991, S. 1483–1491 offenbaren einen IgG-Antikörper mit zwei Mutationen an den Positionen 234 und 331, der eine reduzierte Fcγ-Rezeptorbindungsaktivität und daher eine reduzierte ADCC-Reaktion aufweist.
  • Im Allgemeinen bestehen ganze Antikörpermoleküle aus zwei schweren (S) und zwei leichten (L) Ketten, die durch kovalente Bindungen (Disulfid) und nichtkovalente Wechselwirkungen zusammengehalten werden. Jede Kette enthält eine variable Region (V) und eine Konstantregion (K). Die variablen Regionen an den Aminotermini der beiden Ketten bilden die Antigenbindungsregion. Die Konstantregion der S-Kette weist drei Komponenten oder Domänen auf. Ab und zu tritt die erste Domäne der Konstantregion (CH1) mit der K-Region der L-Kette durch hydrophobe Wechselwirkungen und normalerweise eine Disulfidbindung, je nach der Isotype, in Wechselwirkung. Der nächste Abschnitt der K-Region ist die als Scharnier wirkende Disulfidbindung, die auf stabile Weise zwischen die S-Ketten eingeführt ist. Die zweite Domäne der Konstantregion (CH2) liegt neben der Scharnierregion. CH2 enthält Sequenzen, die für Effektorfunktionen des Antikörpers wichtig sind, wie beispielsweise die Sequenzen, die für die Komplementbindung und die Fc-Rezeptorbindung verantwortlich sind. Die dritte Domäne der Konstantregion (CH3) ist am Carboxylterminus der S-Kette lokalisiert und wird als beim S-Kettenzusammenbau sowie bei einigen Funktionen der C-Region eine wichtige Rolle spielend betrachtet.
  • Heutzutage werden viele Antikörper in klinischen Versuchen gegen tumorassoziierte Antigene gerichtet. Die meisten tumorassoziierten Antigene sind nicht tumorspezifisch, sondern sind auch im Allgemeinen an der Zelloberfläche einiger normaler, nicht tumorerzeugender Zellen anzutreffen. Die klinische Verwendung einiger Antikörper, die gegen tumorassoziierte Antigene gerichtet sind, ist wegen der Toxizität, die mit ihrer Verwendung verbunden ist, beschränkt. Aus diesem Grund besteht ein Bedarf für Methoden zum Hemmen der Toxizität, die mit der Anwendung von Immunglobulin auf dem Gebiet der Krankheitstherapie (z. B. Therapie gegen Tumore, Nierenerkrankung und dergleichen) und in vivo-Diagnose verbunden ist.
  • Wir haben diesem Bedarf durch Entdecken von Methoden zum Hemmen oder Reduzieren von Toxizität für normale Zellen, die allgemein mit der Immunglobulinimmuntherapie oder in vivo-Diagnose verbunden ist, wobei das Immunglobulin sowohl kranke als auch normale Zellen erkennt, entsprochen. Unsere Entdeckung involviert die Erzeugung von Immunglobulinmolekülen oder Ig-Fusionsproteinen, die strukturell geänderte Konstantregionen aufweisen, die die durch Immunglobulin induzierte Toxizität hemmen oder reduzieren.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es werden hier Methoden zum Hemmen der durch Immunglobulin induzierten Toxizität durch Verwendung bekannter Immunglobulin- oder Ig-Fusionsproteinmoleküle offenbart, die in ihren Konstantregionen so strukturell geändert sind, dass die so gebildeten strukturell geänderten Immunglobulin- oder Ig-Fusionsproteinmoleküle eine reduzierte oder gehemmte Toxizität in vivo im Vergleich mit ihren ursprünglichen unmodifizierten Gegenstücken aufweisen.
  • Die vorliegende Erfindung bietet als Erstes einen BR96-Antikörper, der eine menschliche IgG1-Konstantregion aufweist, die in der CH2-Domäne strukturell geändert worden ist, wobei Leucin an der Aminosäureposition 235 zu Alanin mutiert wird; Glycin an der Aminosäureposition 237 zu Alanin mutiert wird; Glutaminsäure an der Aminosäureposition 318 zu Serin mutiert wird; Lysin an der Aminosäureposition 320 zu Serin mutiert wird; und Lysin an der Aminosäureposition 322 zu Serin mutiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung bietet auch einen BR96-Antikörper, der eine menschliche IgG1-Konstantregion aufweist, die in der CH2-Domäne strukturell geändert worden ist, wobei Leucin an der Aminosäureposition 235 zu Alanin mutiert wird; Glycin an der Aminosäureposition 237 zu Alanin mutiert wird; und Prolin an der Aminosäureposition 331 zu Alanin mutiert wird.
  • Außerdem bietet die vorliegende Erfindung einen BR96-Antikörper, der eine menschliche IgG1-Konstantregion aufweist, die in der CH2-Domäne strukturell geändert worden ist, wobei Leucin an der Aminosäureposition 235 zu Alanin mutiert wird; Glycin an der Aminosäureposition 237 zu Alanin mutiert wird; Glutaminsäure an der Aminosäureposition 318 zu Serin mutiert wird; Lysin an der Aminosäureposition 320 zu Serin mutiert wird; Lysin an der Aminosäureposition 322 zu Serin mutiert wird; und Prolin an der Aminosäureposition 331 zu Alanin mutiert wird.
  • Andere Ausgestaltungen der Erfindung sind in den angehängten Ansprüchen 4–18 beansprucht. Weitere Ausführungsformen, die durch die beanspruchte Erfindung nicht umfasst werden, sind ebenfalls in der vorliegenden Beschreibung offenbart.
  • Eine strukturelle Änderung der Konstantregion kann auf eine Reihe verschiedener Arten und Weisen durchgeführt werden, solange sie zum Reduzieren oder Hemmen durch Immunglobulin induzierter Toxizität fürt.
  • Die strukturelle Änderung der Konstantregion wird durch Deletion der gesamten Konstantregion bewirkt. In einer anderen Ausführungsform wird nur die CH2-Domäne deletiert. In einer anderen Ausführungsform wird nur der Teil der CH2-Domäne deletiert, der den Fc-Rezeptor bindet. In noch einer anderen Ausführungsform wird nur der Teil der CH2-Domäne deletiert, der die Komplementkomponente Clq bindet. Alternativ werden in einer anderen Ausführungsform multiple Deletionen in einzelnen Fc-Rezeptor- und Komplementkomponentenbindungsdomänen bewirkt.
  • Alternativ wird die strukturelle Änderung durch Einfachmutation oder multiple Mutationen in der CH2-Domäne, wie beispielsweise Aminosäureinsertionen und -substitutionen, durchgeführt. Die Mutation oder Mutationen müssen zum Hemmen der durch Immunglobulin induzierten Toxizität führen. Beispielsweise können die Aminosäuren in multiplen, mit Toxizität verbundenen Domänen in der Konstantregion so geändert werden, dass die Konstantregion unfähig ist, eine ADCC-Reaktion zu vermitteln oder Komplement zu aktivieren, wodurch die durch Immunglobulin induzierte Toxizität, die aus der Immuntherapie herrührt, gehemmt wird. Alternativ können multiple Aminosäuren in einer einzigen mit Toxizität verbundenen Domäne in der Konstantregion geändert werden.
  • Des Weiteren kann aternativ eine strukturelle Änderung durch Isotypwechsel bewirkt werden, der zu einem geänderten Immunglobulinmolekül führt, das entweder keine Toxizität oder eine beschränkte Toxizität induziert, jedoch keine schädliche Wirkung ausübt. Beispielsweise kann ein Isotypwechsel in der Konstantregion dazu führen, dass sie nicht in der Lage ist, eine CDC- oder ADCC-Reaktion oder irgendeine andere Aktivität, die Toxizität vermittelt, zu vermitteln.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 ist eine Koordinatengrafik, die die Ausscheidung am dem Plasma bei Hunden mit hoher LeY-Expression mit Hilfe von chimärem BR96 im Vergleich mit dem Konstantregionenmutanten cBR96-2 zeigt.
  • 2 ist ein schematisches Diagramm eines pTWD-cJVK.L1 genannten Plasmids, das die chimäre (c)BR96-Leichtkette (SEQ ID NO. 11) umfasst.
  • 3 ist ein schematisches Diagramm eines pD16hJ1.L1 genannten Plasmids, das die menschliche (h)BR96-Leichtkette (SEQ ID NO. 13) umfasst.
  • 4 ist ein schematisches Diagramm eines pD17-hJm14-dCH2.H1 genannten Plasmids von hBR96-2A (d. h. dem menschlichen mutanten BR96 mit den H1-, H2- und H3-Mutationen und der CH2-Deletion (PCT-Anmeldung Nr. 95/305444, am 6. März 1996 veröffentlicht)).
  • 5 ist ein schematisches Diagramm eines pD17-cJ-dCH2.H1 genannten Plasmids von cBR96-A (SEQ ID No. 10) (d. h. chimären BR96 mit der CH2-Deletion (PCT-Anmeldung Nr. 95/305444, am 6. März 1996 veröffentlicht)).
  • 6 ist ein schematisches Diagramm eines pD17-cJ.h1 genannten Plasmids von cBR96.
  • 7 ist eine Koordinatengrafik, die die Ergebnisse eines ELISA-Assays von (1) hBR96-2A-Dox gegen Ley (ausgefüllte Raute), (2) hBR96-2A gegen Ley (96:0006A2 R/A) (ausgefülltes Viereck), (3) hBR96-2A gegen Ley (96:0006B R/A) (ausgefülltes Dreieck) und BR96-Dox gegen Ley (X) zeigt.
  • 8 ist eine Koordinatengrafik, die die Ergebnisse eines ELISA-Assays von (1) BR96-A-Dox zu Ley (ausgefüllte Raute), (2) chiBR96 zu Ley (ausgefülltes Viereck), (3) cBR96-A zu Ley (96:0003 R/A) (ausgefülltes Dreieck) und cBR96-Dox zu Ley (X) zeigt.
  • Die 9a–c sind schematische Diagramme, die die Schritte zum Deletieren einer CH2-Domäne zeigen.
  • 10a–c sind schematische Diagramme, die die Konstruktion von BR96 IgG1 CH2-Domänenpunktmutationen zeigen.
  • 11 ist ein schematisches Diagramm, das die Konstruktion des pNg1/14-Vektors zeigt.
  • 12 ist ein schematisches Diagramm, das die Konstruktion von pD17-hBR96-2 zeigt.
  • 13 ist ein schematisches Diagramm, das die Konstruktion von pD17-hJmI4-dCH2.H1 zeigt.
  • Die 14A–J sind die Nucleinsäuresequenz von pD17-cJ-dCH2.H1, dem Plasmid, das in 5 gezeigt ist, des chimären BR96, das die CH2-Deletion aufweist.
  • 15 ist eine Koordinatengrafik, die die Ergebnisse eines ELISA-Assays zeigt, bei dem ganzer chiBR96 und chiBR96 mit deletiertem CH2 an Ley verglichen werden.
  • 16 ist eine Beschreibung der sieben strukturellen Änderungen.
  • 17 ist ein schematisches Diagramm eines pD17-hG1b genannten Plasmids.
  • Die 18A–F sind die Nucleinsäuresequenz von pD17-hJm14.H1.
  • Die 19A–N sind die Nucleinsäuresequenz von pD17-hG1b.
  • 20 ist eine Koordinatengrafik, die die komplementabhängige Zytotoxizität zeigt. In der Beschreibung ist das ausgefüllte Quadrat hBR96-1, die ausgefüllte Raute ist hBR96-2B, der ausgefüllte Kreis ist hBR96-2C, das ausgefüllte Dreieck ist hBR96-2D; das offene Quadrat ist hBR96-2H; der offene Kreis ist hBR96-2A und das offene Dreieck ist 2B8 mAb gegen Flagella des Typs b von Anti-Pseudonomas aeruginosa bestehende negative Kontrolle.
  • 21 ist eine Koordinatengrafik, die die antikörperabhängige, zellvermittelte Zytotoxizität zeigt. In der Beschreibung ist das ausgefüllte Quadrat hBR96-1; die ausgefüllte Raute ist hBR96-2B; der ausgefüllte Kreis ist hBR96-2C; das ausgefüllte Dreieck ist hBR96-2D; das offene Quadrat ist hBR96-2H; der offene Kreis ist hBR96-2A und das offene Dreieck ist 2B8, monoklonalem Antikörper (mAb) gegen Flagella des Typs b von Pseudonomas aeruginosa, negative Kontrolle.
  • 22 ist eine Koordinatengrafik, die die Bindungsaktivität von hBR96-2-Konstantregionmutanten an LeY-HASA zeigt. In der Beschreibung ist die ausgefüllte Raute hBR96-1; das ausgefüllte Quadrat ist hBR96-2A (CH2-Deletion); das ausgefüllte Dreieck ist hBR96-2B (235-, 237-Mutationen); das offene Quadrat ist hBR96-2C (318-, 320-, 322-Mutationen); der offene Kreis ist hBR96-2D (331-Mutation); und das offene Dreieck ist hBR96-2H (235-, 237-, 318-, 320-, 322-, 331-Mutationen).
  • 23 ist eine Koordinatengrafik, die die Bindungsaktivität von hBR96-2-Konstantregionmutanten an LNFPIII-RSA zeigt. LNFPIII ist eine Lacto-N-fucopentasose, ein Lewis X-Trisaccharid mit einem zusätzlichen Lactosespacer (V Labs, Covington, LA). In der Beschreibung ist die ausgefüllte Raute hBR96-1; das ausgefüllte Quadrat ist hBR96-2A (CH2-Deletion); das ausgefüllte Dreieck ist hBR96-2B (235, 237-Mutationen); das offene Quadrat ist hBR96-2C (318-, 320-, 322-Mutationen); der offene Kreis ist hBR96-2D (331-Mutation); und das offene Dreieck ist hBR96-2H (235-, 237-, 318-, 320-, 322-, 331-Mutationen).
  • Die 24A und 24B bieten eine Strategie für das Einführen multipler Mutationen durch RPCR. (A) Diagramm der 1,4 kpb IgG Schwerkettenregion, das die Scharnier-CH2- und CH3-Domänen als umrandete Regionen zeigt. Die stellenspezifischen Mutationen, die in die CH2-Positionen L1, L2 und L3 eingeführt werden sollen, werden durch komplementäre Sätze mutanter PCR-Primer (A1 und A2; B1 und B2; und C und C2) kodiert. Die Sternchen (*) zeigen die Anzahl von Aminosäureänderungen an, die an jeder L-Position eingeführt worden sind. Die beiden PCR-Primer, nämlich Rs (Rekombinations-sense) und Ra (Rekombinations-antisense), flankieren die Eco-47-III-Restriktionsstellen und vermitteln die homologe Rekombination mit Vektorenden. Die 3'-Enden der Oligonuldeotide sind durch Pfeilköpfe dargestellt. (B) Ein homologes Dreiwegrekombinationsgeschehen zwischen den Fragmenten RsA2, A1Ra und dem linearisierten Vektor bildet das L1-mutante IgG. Zwei distal gelegene Sätze von Mutationen (L1 und L2) werden gleichzeitig durch Erhöhen der Anzahl von rekombinierenden PCR-Produkten, die, wie gezeigt, in der Vierweg-Rekombination von RsA2, A1B2, B1Ra mit dem Vektor gebildet werden, eingeführt.
  • 25 ist ein Gel, das die Eco-47-III-Restriktionsendonukleaseanalyse von DNA zeigt, die aus Kolonien hergestellt werden, die durch multiple PCR-Fragment-RPCR erzeugt wurden. Bahn M: 1kb-Leiter-DNA-Marker (GIBCO-BRL Life Science Technology). Bahnen 1–12: Zwölf willkürlich ausgewählte Kolonien, die aus vierfachen homologen Rekombinationsereignissen resultieren, wurden zum Herstellen des Plasmids verwendet und mit Eco47-III verdaut. Die Klone 1, 2, 6 und 9 enthalten die vollständig zusammengebaute 1,4 kpb-Insertion.
  • 26 bietet die Aminosäuresequenz für die variable Schwerkettenregion von hBR96-2 und die menschliche IgG1-Konstantregion.
  • 27 bietet die Aminosäuresequenz für die variable Schwerkettenregion von hBR96-2A und die menschliche IgG1-Konstantregion ohne die CH2-Domäne.
  • 28 bietet die Aminosäuresequenz für die variable Schwerkettenregion von chi BR96 und die menschliche IgG1-Konstantregion ohne die CH2-Domäne.
  • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG DEFINITIONEN
  • Wie hier verwendet bedeutet der Begriff „Hemmen der durch Immunglobulin induzierten Toxizität" das Reduzieren oder Milder von Symptomen, die allgemein mit der Toxizität verbunden sind, die durch Immunglobulin- oder Ig-Fusionsproteintherapie verursacht wird, z. B. der Toxizität, die durch Effektorfunktionen des Fc-Rezeptors vermittelt werden. Beispielsweise erkennt und bindet der BR96-Antikörper das BR96-Antigen, das in gewissen Mengen im Magendarmkanal und in erhöhten Mengen in Tumoren (im Vergleich mit dem normalen Gewebe des Magendarmkanals) anzutreffen ist. Das Binden von BR96-Antikörper an BR96-Antigen in vivo verursacht Symptome, die mit Magendarm-Toxizität verbunden sind. Diese Symptome umfassen das schnelle Einsetzen von Erbrechen, oft mit Blut, und Übelkeit. Bei Menschen ist das Bluten auf den Magenfundus beschränkt, wobei es eine Erosion der Oberflächenschleimhaut des Magens verursacht.
  • Die Pathologie der Wunde ist beschränkt und sie bildet sich zurück. Jedoch definiert die extreme Natur der Übelkeit und des Erbrechens, die durch Antiemetika nicht gemildert werden, sie als die dosisbeschränkende Toxizität. Bei anderen Antigenen, die in stark erhöhter Konzentration im Zentralnervensystem (ZNS), in der Leber und an anderen Stellen vorkommen, ist die Toxizität durch andere als die oben beschriebenen Symptome gekennzeichnet.
  • Wie der Begriff hier verwendet wird, kann das „Immunglobulinmolekül" durch B-Zellen gebildet oder durch rekombinante Genmodifikation oder chemische Synthesemöglichkeiten erzeugt werden. Beispiele von Immunglobulinmolekülen umfassen (1) Antikörper, z. B. polyklonale und monoklonale Antikörper, chimäre oder humanisierte, und (2) rekombinante, Ig-enthaltende Bindungsproteine, z. B. Ig-Fusionsproteine. Rekombinante Ig-enthaltende Bindungsproteine umfassen Zelloberflächenproteine, z. B. CD-Antigene (in einer Ausführungsform CTLA4), an die ein Ig-Schwanz angehängt ist.
  • Wie hier verwendet, bedeuten die Begriffe „strukturell geändert" oder „strukturelle Änderung" das Manipulieren der Konstantregion derart, dass das so gebildete Molekül oder Protein eine reduzierte Fähigkeit zum Induzieren von Toxizität aufweist. Die strukturelle Änderung kann durch chemische Modifikation, proteolytische Änderung oder durch rekombinante genetische Mittel durchgeführt werden. Rekombinante genetische Mittel können die Deletion, Insertion und Substitution von Aminosäureanteilen umfassen, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „multiple mit Toxizität verbundene Domänen" mehr als eine einzelne mit Toxizität verbundene Domäne. Da im Immunglobulinmolekül mindestens zwei mit Toxizität verbundene Domänen vorzuliegen scheinen, wobei eine ungefähr bei Aminosäuren 231–238 und die andere ungefähr bei Aminosäuren 310–331 lokalisiert ist, umfasst ein Beispiel für die strukturelle Änderung von multiplen mit Toxizität verbundenen Domänen die Insertion, Substitution oder Deletion von Aminosäureresten in diesen beiden Domänen. Diese Definition schließt strukturelle Änderungen aus, die auf eine einzige mit Toxizität verbundene Domäne gerichtet sind.
  • Ausschließlich beispielsweise kann die Konstantregion des Immunglobulinmoleküls so strukturell geändert werden, dass das Molekül keine CDC- oder ADCC-Reaktion mehr vermittelt. Jedoch umfassen die erfindungsgemäßen Methoden die Verwendung strukturell geänderter Immunglobulinmoleküle, gleichgültig, ob sie eine CDC- oder ADCC-Antwort vermitteln. Das grundlegende Erfordernis besteht darin, dass das geänderte Molekül eine durch Immunglobulin induzierte Toxizität hemmen muss.
  • Die vorliegende Erfindung stellt als Erstes einen BR96-Antikörper bereit, der eine menschliche IgG1-Konstantregion aufweist, die in der CH2-Domäne strukturell geändert worden ist, wobei Leucin an der Aminosäureposition 235 zu Alanin mutiert wird; Glycin an der Aminosäureposition 237 zu Alanin mutiert wird; Glutaminsäure an der Aminosäureposition 318 zu Serin mutiert wird; Lysin an der Aminosäureposition 320 zu Serin mutiert wird; und Lysin an der Aminosäureposition 322 zu Serin mutiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch einen BR96-Antikörper bereit, der eine menschliche IgG1-Konstantregion aufweist, die in der CH2-Domäne strukturell geändert worden ist, wobei Leucin an der Aminosäureposition 235 zu Alanin mutiert wird; Glycin an der Aminosäureposition 237 zu Alanin mutiert wird; und Prolin an der Aminosäureposition 331 zu Alanin mutiert wird.
  • Außerdem stellt die vorliegende Erfindung einen BR96-Antikörper bereit, der eine menschliche IgG1-Konstantregion aufweist, die in der CH2-Domäne strukturell geändert worden ist, wobei Leucin an der Aminosäureposition 235 zu Alanin mutiert wird; Glycin an der Aminosäureposition 237 zu Alanin mutiert wird; Glutaminsäure an der Aminosäureposition 318 zu Serin mutiert wird; Lysin an der Aminosäureposition 320 zu Serin mutiert wird; Lysin an der Aminosäureposition 322 zu Serin mutiert wird; und Prolin an der Aminosäureposition 331 zu Alanin mutiert wird.
  • Andere Ausgestaltungen der Erfindung sind in den anhängenden Ansprüchen 4–18 beansprucht. Weitere Ausführungsformen, die die beanspruchte Erfindung nicht umfasst, sind ebenfalls in der vorliegenden Beschreibung offenbart.
  • Eine strukturelle Änderung kann auf eine Reihe verschiedener Arten und Weisen bewirkt werden. Beispielsweise kann die strukturelle Änderung durch Deletion der gesamten Konstantregion bewirkt werden.
  • Alternativ kann die strukturelle Änderung durch Deletion der gesamten CH2-Domäne der Konstantregion bewirkt werden. In diesem Fall kann die Deletion der gesamten CH2-Domäne das Molekül unfähig machen, (1) einen Fc-Rezeptor zu binden, wodurch die Fähigkeit des Moleküls, die antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) zu vermitteln, eliminiert wird, (2) Clq zu binden oder (3) das Komplement zu aktivieren.
  • Alternativ kann die strukturelle Änderung durch Deletion nur desjenigen Teils der CH2-Domäne bewirkt werden, der den Fc-Rezeptor oder das Komplement bindet.
  • Des Weiteren kann alternativ eine einzige Mutation oder können multiple Mutationen, wie Substitutionen und Insertionen, in der CH2-Domäne durchgeführt werden. Das grundlegende Erfordernis für irgendeine Mutation besteht darin, dass sie die durch Immunglobulin induzierte Toxizität hemmen, reduzieren oder blockieren muss. Beispielsweise lasst sich dies durch Mutation der Konstantregion derart, dass das geänderte Molekül unfähig gemacht wird, eine CDC-Reaktion oder eine ADCC-Reaktion zu vermitteln oder Komplement zu aktivieren, erreichen.
  • Alternativ kann eine strukturelle Änderung durch Isotypwechsel (auch als Klassenwechsel bekannt) bewirkt werden, derart, dass das geänderte Molekül im Subjekt keine Toxizität induziert. In einer Ausführungsform wird die Konstantregion des Immunglobulins strukturell so geändert, dass es den Fc-Rezeptor oder eine Komplementkomponente nicht mehr bindet, z. B. durch Wechseln des ursprünglichen IgG-Isotyps eines Moleküls von IgG1 zu IgG4. Der Isotypwechsel kann durchgeführt werden, gleichgültig um welche Spezies es sich handelt, d. h. ein Isotyp aus einer nichtmenschlichen Spezies kann durch einen Isotyp von einem Menschen ausgewechselt werden (E. D. Finkelman et al. (1990), Annu. Rev. Immunol. 8: 303–333; T. Honjo et al (1979) Cell 18: 559–568; T. Honjo et al. in „Immunoglobulin Genes (Immunoglobingene)" S. 124–149, Academic Press, London).
  • Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „Ig-Fusionsprotein" irgendein rekombinant erzeugtes Antigen oder eine rekombinant erzeugte Ligandenbindungsdomäne, das/die eine Konstantregion besitzt, die strukturell geändert werden kann.
  • Wie hier verwendet, umfasst „zytotoxisches Mittel" Antimetabolite, Alkylierungsmittel, Anthracycline, Antibiotika, Antimitotika und chemotherapeutische Mittel. Spezifische Beispiele innerhalb dieser Gruppen umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Ricin, Doxorubicin, Daunorubicin, Taxol, Ethidiumbromid, Mitomycin, Etoposid, Tenoposid, Vincristin, Vinblastin, Colchicin, Supporin, Gelonin, PE40, Bryodin, Dihydroxyanthracindion, Actinomycin D und 1-Dehydrotestosteron.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „BR96" auf (1) den ganzen monoklonalen BR96-Antikörper, der in PCT Nr. 95/305444, am 6. März 1996 veröffentlicht, offenbart ist, (2) den monoklonalen chimären BR96-Antikörper, der in PCT Nr. 95/305444, am 6. März 1996 veröffentlicht, offenbart ist oder (3) mutante BR96-Moleküle, die in PCT Nr. 95/305444, am 6. März 1996 veröffentlicht, offenbart sind.
  • Wie hier verwendet bedeutet „Behandeln" (1) das Herbeiführen einer Tumorregression derart, dass der Tumor für eine Zeitspanne nicht wahrnehmbar ist (Standardverfahren zur Messung von Tumoren können angewendet werden (A. B. Miller et al. „Reporting results of Cancer Treatment (Berichten der Ergebnisse der Krebsbehandlung)", Cancer 47: 207–214 (1981)); (2) die Stabilisation der Krankheit; oder (3) Herbeiführen irgendwelcher klinisch vorteilhaften Wirkungen.
  • Wie hier verwendet, ist eine „wirksame Menge" eine Menge des Antikörpers, Immunkonjugats oder rekombinanten Moleküls, die Zellen abtötet oder die Proliferation derselben hemmt.
  • Wie hier verwendet, bedeutet „Verabreichen" die orale Verabreichung, Verabreichung als Zäpfchen, durch topischen Kontakt, die intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre oder subkutane Verabreichung oder die Implantation einer langsam freisetzenden Vorrichtung, wie beispielsweise einer miniosmotischen Pumpe, dem bzw. in das Subjekt.
  • Wie hier verwendet umfasst „pharmazeutisch akzeptabler Träger" irgendein Material, das, wird es mit dem Antikörper kombiniert, die Spezifizität oder Wirksamkeit des Antikörpers beibehält und mit dem Immunsystem des Subjekts nicht reaktiv ist. Beispiele umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, irgendwelche pharmazeutischen Standardträger wie beispielsweise eine phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung, Wasser, Emulsionen wie beispielsweise Öl-/Wasseremulsion und verschiedene Typen von Benetzungsmitteln. Andere Träger können auch sterile Lösungen, Tabletten, einschließlich dragierter Tabletten und Kapseln, umfassen.
  • Typischerweise enthalten derartige Träger Vehikel wie Starke, Milch, Zucker, gewisse Arten von Ton, Gelatine, Stearinsäure oder Salze derselben, Magnesium- oder Calciumstearat, Talkum, Pflanzenfette oder -öle, Gummiarten, Glykole oder andere bekannte Vehikel. Derartige Träger können auch Geschmacksmittel und Färbemittel oder andere Bestandteile umfassen. Zusammensetzungen, die derartige Träger umfassen, werden durch allgemein bekannte herkömmliche Verfahren formuliert.
  • Wie hier verwendet bedeutet „Mutation" eine oder mehrere Aminosäure- oder Nucleinsäuremutation(en), eingeführt auf irgendeine Art und Weise, z. B. homologe Rekombination, fehleranfällige PCR oder ortsgerichtete Mutagenese.
  • Zum besseren Verständnis der hier beschriebenen Erfindung wird die folgende Beschreibung vorgelegt.
  • METHODEN DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
  • Offenbart ist hier eine Methode für das Hemmen der durch Immunglobulin induzierten Toxizität, die aus der Verwendung von Immunglobulin während einer Therapie oder in vivo-Diagnose herrührt. Beispielsweise wären die erfindungsgemäßen Methoden zum Minimieren der Toxizität nützlich, die mit langanhaltender klinischer Exposition Immunglobulin gegenüber bei seiner Anwendung während oder nach Visualisierung des Tumors mit radioaktiv markierten Antikörpern verbunden ist.
  • Der Praxis dieser Erfindung gemäß schließt das Subjekt, ist jedoch darauf beschränkt, menschliche, Pferde-, Schweine-, Rinder-, Maus-, Kaninchen-, Katzen- und Vogelsubjekte ein. Andere warmblütige Tiere sind ebenfalls in dieser Erfindung eingeschlossen.
  • Die Methode umfasst das Verabreichen eines Immunglobulimnoleküls dem Subjekt. Das Immunglobulin kann IgG, IgM oder IgA sein. IgG ist bevorzugt.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung erkennt und bindet das Immunglobulinmolekül Ley. In einer anderen Ausführungsform erkennt und bindet das Immunglobulin Lex. In einer weiteren Ausführungsform ist das Immunglobulin ein monoklonaler BR96-Antikörper, der von dem Hybridom produziert wird, das am 22. Februar 1989 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklaven Drive, Rockville, MD 20852 hinterlegt und dem die ATCC-Zulassungsnummer HB 10036 gewährt worden ist. in noch einer anderen Ausführungsform ist das Immunglobulin ein chimärer Antikörper ChiBR96, der von dem Hybridom produziert wird, das am 23. Mai 1990 bei ATCC, 12301 Parklaven Drive, Rockville, MD 20852 hinterlegt worden ist und dem die ATCC-Zulassungsnummer HB 10460 gewahrt worden ist.
  • Der Praxis der Erfindung gemäß kann das Immunglobulin ein hybrider Antikörper mit Bindungsspezifizität für zwei verschiedene Antigene sein, wobei eines der Antigene dasjenige ist, an das sich der monoklonale Antikörper BR96 sich bindet, der von dem Hybridom produziert wird, das die identifizierenden Charakteristiken von HB 10036 aufweist, wie es bei der ATCC hinterlegt worden ist. Ebenfalls der Praxis der Erfindung gemäß kann das Immunglobulin ein antiidiotypischer Antikörper sein.
  • Wie die Erfindung erfordert, wird mindestens ein Teil der Konstantregion des Immunglobulinmoleküls strukturell geändert. Die strukturelle Änderung kann durch verschiedene Möglichkeiten bewirkt werden. In einer Ausführungsform kann die gesamte Konstantregion, d. h. die CH1-, CH2- und CH3-Domänen, deletiert werden.
  • In einer anderen Ausführungsform wird nur die CH2-Domäne vom Immunglobulinmolekül (z. B. cBR96-A (5), hBR96-2A (4)) deletiert. In dieser Ausführungsform kann die CH2-Deletion zu einem Molekül führen, das nicht in der Lage ist, den Fc-Rezeptor oder eine Komplementkomponente zu binden.
  • In einer anderen Ausführungsform wird nur der Teil der CH2-Domäne, die die Komplementkomponente C1q bindet, deletiert. In noch einer anderen Ausführungsform werden Mutationen in spezifischen Teilen der CH2-Domäne durchgeführt. Beispielsweise kann das Immunglobulinmolekül durch strukturelles Ändern multipler, mit Toxizität verbundener Domänen in der Konstantregion so modifiziert werden, dass die durch Immunglobulin induzierte Toxizität gehemmt wird. Eine Diskussion derartiger Mutationen ist des Weiteren noch im Folgenden zu finden.
  • Gleichgültig, welche Möglichkeit benutzt wird, besteht das grundlegende Erfordernis für irgendeine strukturelle Änderung der Konstantregion darin, dass die durch Immunglobulin induzierte Toxizität dadurch wesentlich reduziert oder gehemmt wird. In einer Ausführungsform wird die durch Immunglobulin induzierte Toxizität durch strukturelles Ändern der Konstantregion derart geändert, dass die Fähigkeit des Moleküls, eine CDC-Reaktion oder ADCC-Reaktion zu vermitteln und/oder die Komplementkaskade zu aktivieren, eliminiert oder gehemmt wird. Methoden zum Bestimmen, ob das Molekül in der Lage ist, eine CDC-Reaktion zu hemmen, sind allgemein bekannt, z. B. involviert eine Methode einen 51Cr-Freisetztest (H. Garrigues et al. Int. J. Cancer 29: 511 (1982); I. Hellström et al. PNAS 82: 1499 (1985)). Methoden zum Bestimmen, ob das Molekül in der Lage ist, eine ADCC-Reaktion zu hemmen, sind allgemein bekannt (I. Hellström et al. PNAS 82: 1499 (1985)). Methoden zum Bestimmen, ob das Molekül in der Lage ist, eine Komplementkaskade zu aktivieren, sind allgemein bekannt.
  • Offenbart ist hier eine Methode, die das Verabreichen einem Subjekt eines Ig-Fusionsproteins umfasst, das eine strukturell geänderte Konstantregion aufweist. Die strukturelle Änderung der Konstantregion kann die Deletion der gesamten C-Region oder von Teilen derselben, z. B. die Änderung der CH2-Domäne derart, dass das geänderte Molekül den Fc-Rezeptor oder eine Komplementkomponente nicht mehr bindet, umfassen.
  • Offenbart ist hier eine Methode für das Hemmen der durch Immunglobulin induzierten Toxizität, die aus einer Immuntherapie bei einem Subjekt herrührt. Die Methode umfasst das Verabreichen dem Subjekt eines Antikörpers, der so modifiziert worden ist, dass mindestens ein Teil der Konstantregion, wie oben besprochen, strukturell geändert worden ist. In einer Ausführungsform erkennt und bindet der Antikörper Ley. In einer anderen Ausführungsform erkennt und bindet der Antikörper an Lex.
  • Der Antikörper kann der monoklonale Antikörper BR96 sein, der von dem Hybridom erzeugt wird, das die identifizierenden Charakteristiken von HB 10036 besitzt, wie es bei der ATCC hinterlegt worden ist. Alternativ kann der Antikörper der chimäre Antikörper ChiBR96 sein, der von dem Hybridom erzeugt wird, das die identifizierenden Charakteristiken von HB 10460 aufweist, wie es bei der ATCC hinterlegt worden ist. Des Weiteren kann der Antikörper ein hybrider Antikörper mit einer Bindungsspezifizität für zwei verschiedene Antigene sein, wobei eines der Antigene dasjenige ist, mit dem sich der monoklonale Antikörper BR96 bindet, der von dem Hybridom erzeugt wird, das die identifizierenden Charakteristiken von HB 10036 aufweist, wie es bei der ATCC hinterlegt worden ist.
  • Außerdem wird hier eine Methode für das Hemmen der durch Immunglobulin induzierten Toxizität, die aus einer Immuntherapie bei einer Krankheit in einem Subjekt herrührt, offenbart. Die Krankheit wird je nach dem Antigen, das gebunden werden soll, verschieden sein. Beispiele von Krankheiten umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, immunologische Krankheiten, Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, neurologische Erkrankungen, dermatologische Erkrankungen oder Nierenleiden.
  • Diese Methode umfasst die folgenden Schritte. Schritt eins bietet das Auswählen eines Antikörpers für ein Target. Im Allgemeinen ist das Target mit der Krankheit verbunden und der Antikörper, der auf das Target gerichtet wird, ist bekannt. Beispielsweise kann das Target das zu BR96-Antigen sein und der gewählte Antikörper ist BR96.
  • Schritt zwei dieser Methode bietet das strukturelle Ändern der Konstantregion des so gewählten Antikörpers derart, dass die durch Immunglobulin induzierte Toxizität gehemmt wird. Die Inaktivierung kann irgendeine der oben besprochenen Möglichkeiten umfassen. Beispielsweise kann die Inaktivierung durch strukturelles Ändern der mit multipler Toxizität verbundenen Domänen in der CH2-Domäne der Konstantregion des so gewählten Ig-Proteins bewirkt werden.
  • Schritt drei dieser Methode bietet das Verabreichen des strukturell geänderten Antikörpers aus Schritt zwei dem Subjekt unter Bedingungen, derart, dass der strukturell geänderte Antikörper das Target erkennt und bindet und dass ein derartiges Binden Symptome, die mit der Krankheit verbunden sind, direkt oder indirekt mildert.
  • In einer Ausführungsform bietet der Schritt eins das Auswählen eines Ig-Fusionsproteins für ein Target. Des Weiteren bietet die Methode das Mutieren des so gewählten Ig-Fusionsproteins durch strukturelles Ändern der CH2-Domäne der Konstantregion des Ig-Proteins durch die gleiche Möglichkeit wie oben besprochen.
  • Offenbart sind hier Methoden zum Behandeln menschlicher Karzinome. Beispielsweise können das Immunglobulin, der Antikörper oder das Ig-Fusionsprotein, die oben besprochen worden sind, in Kombination mit Standard- oder herkömmlichen Behandlungsmethoden, wie beispielsweise Chemotherapie, Strahlungstherapie, verwendet werden, oder sie können mit einem therapeutischen Arzneimittel oder Toxin sowie einem Lymphokin oder einem tumorhemmenden Wachstumsfaktor zur Abgabe des therapeutischen Mittels an die Stelle des Karzinoms konjugiert oder daran geknüpft werden.
  • Techniken für das Konjugieren therapeutischer Mittel an Immunglobuline sind allgemein bekannt (vergleiche z. B. Arnon et al., „Monoklonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs In Cancer Therapy", in Monoklonal Antibodies and Cancer Therapy (Monoklonale Antikörper für die gezielte immunologische Abgabe von Arzneimitteln bei der Krebstherapie, in Monoklonalen Antikörpern und Krebstherapie), Reisfeld et al. (Verfasser), S. 243–56 (Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellström et al., „Antibodies for Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (Antikörper zur Arzneimittelabgabe, in gezielte Arzneimittelabgabe) (zweite Ausgabe), Robinson et al. (Verfasser), S. 623–53 (Marcel Dekker, Inc., 1987); Thorpe, „Antibody Carriers of Zytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review", in Monoklonal Antibodies 1984: Biological And Clinical Applications, (Antikörper als Träger von zytotoxischen Mitteln bei der Krebstherapie: eine Übersicht, in Monoklonalen Antikörpern 1984: Biologische und klinische Anwendungen) Pinchera et al. (Verfasser), S. 475–506 (1985); und Thorpe et al., „The Preparation and Zytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates (Die Herstellung und zytotoxischen Eigenschaften von Antikörpertoxinkonjugaten)", Immunol. Rev., 62: 119–58 (1982)).
  • Alternativ kann der strukturell geänderte Antikörper oder das strukturell geänderte Ig-Fusionsprotein an einer Hochenergie-Strahlungsquelle, z. B. einen Radioisotop wie beispielsweise 131I gekoppelt werden, der, ist er an der Tumorstelle lokalisiert, zum Abtöten von Zellen in einer Entfernung von mehreren Zelldurchmessern führt (vergleiche z. B. Order, „Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", in Monoklonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Analyse, Ergebnisse und zukünftige Aussichten der therapeutischen Verwendung von radioaktiv markiertem Antikörper bei der Krebstherapie, in monoklonale Antikörper für die Krebserfassung und -therapie), Baldwin et al. (Verfasser), S. 303–16 (Academic Press 1985)). Noch einer anderen Ausführungsform gemäß kann der strukturell geänderte BR96-Antikörper an einen zweiten Antikörper zur Bildung eines Antikörperheterokonjugats für die Behandlung von Tumorzellen, wie von Segal im Patent der Vereinigten Staaten 4676980 beschrieben, konjugiert werden.
  • Noch andere therapeutische Anwendungen für den erfindungsgemäßen strukturell geänderten Antikörper oder das erfindungsgemäße strukturell geänderte Ig-Fusionsprotein umfassen das Konjugieren oder Verknüpfen, z. B. durch rekombinante DNA-Techniken oder proteinchemische Techniken, an ein Enzym, das dazu fähig ist, ein Prodrug zu einem zytotoxischen Arzneimittel umzuwandeln und die Anwendung dieses Antikörperenzymkonjugats in Kombination mit dem Prodrug zum Umwandeln des Prodrugs zu einem zytotoxischen Mittel an der Tumorstelle (vergleiche z. B. Senter et al., „Anti-Tumor Effects Of The Antibody-alkaline Phosphatase (Antitumorwirkungen von antikörperalkalischer Phosphatase)", Proc. Natl. Acad. Scie. USA, 85: 4842–46 (1988); „Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activities of Phosphorylated Mitomycin C and Etoposide Derivatives by Monoklonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates (Verbesserung der Antitumoraktivitäten in vitro und in vivo von phosphoryliertem Mitomycin C und Etoposidderivaten durch monoklonale antikörperalkalische Phosphatasekonjugate)", Cancer Research 49: 5789–5792 (1989); and Senter, „Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cancer Therapy (Aktivierung von Prodrugs durch Antikörperenzymkonjugate: ein neuer Ansatz bei der Krebstherapie)", FASEB J. 4: 188–193 (1990)).
  • Es ist daher offensichtlich, dass die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die Immunglobulinmolekale, Antikörper und Ig-Fusionsproteine enthalten, die alle strukturell geänderte CH2-Domänen aufweisen, und ihre Verwendung bei Methoden zum Behandeln menschlicher Karzinome einschließt. Beispielsweise umfasst die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von menschlichen Karzinomen, die eine pharmazeutisch wirksame Menge eines strukturell geänderten BR96 und eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers umfassen.
  • Die Zusammensetzungen können den strukturell geänderten Antikörper oder das strukturell geänderte Ig-Fusionsprotein oder strukturell geänderte Antikörperfragmente entweder unmodifiziert, an ein therapeutisches Mittel (z. B. ein Arzneimittel, Toxin, Enzym oder einen zweiten Antikörper) konjugiert enthalten. Die Zusammensetzungen können außerdem andere Antikörper oder Konjugate zum Behandeln von Karzinomen (z. B. einen Antikörpercocktail) umfassen.
  • Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können mit Hilfe herkömmlicher Verabreichungsmodi, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, intrathekaler, intravenöser, intraperitonealer, oraler, intralymphatischer, oder durch direkte Verabreichung in den Tumor verabreicht werden. Die intravenöse Verabreichung ist bevorzugt.
  • Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann in einer Reihe verschiedener Dosierformen vorliegen, die flüssige Lösungen oder Suspensionen, Tabletten, Pillen, Pulver, Zäpfchen, polymere Mikrokapseln oder Mikrovesikeln, Liposome und injizierbare oder durch Infusion einführbare Lösungen umfassen, jedoch nicht darauf beschränkt sind. Die bevorzugte Form hängt vom Verabreichungsmodus und der therapeutischen Anwendung ab.
  • Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen auch bevorzugt herkömmliche pharmazeutisch akzeptable Träger und Hilfsmittel, die im Stand der Technik bekannt sind, wie beispielsweise menschliches Serumalbumin, Ionenaustauscher, Aluminiumoxid, Lecithin, Puffersubstanzen wie Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat und Salze oder Elektrolyte wie beispielsweise Protaminsulfat.
  • Der Praxis der Erfindung gemäß kann der pharmazeutische Träger ein Lipidträger sein. Der Lipidträger kann ein Phospholipid sein. Des Weiteren kann der Lipidträger eine Fettsäure sein. Auch kann der Lipidträger ein Detergenz sein. Wie hier verwendet, ist ein Detergenz irgendeine Substanz, die die Oberflächenspannung einer Flüssigkeit ändert, indem es sie üblicherweise reduziert.
  • In einem Beispiel der Erfindung kann das Detergenz ein nichtionisches Detergenz sein. Beispiele nichtionischer Detergenzien umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Polysorbat 80 (auch als Tween® 80 oder (Polyoxyethylensorbitanmonoleat) bekannt, Brij® und Triton® (beispielsweise Triton® WR-1339 und Triton® A-20).
  • Alternativ kann das Detergenz ein ionisches Detergenz sein. Ein Beispiel eines ionischen Detergenz umfasst, ist jedoch nicht darauf beschränkt, Alkyltrimethylammoniumbromid.
  • Außerdem kann erfindungsgemäß der Lipidträger ein Liposom sein. Wie bei dieser Anwendung verwendet, ist ein „Liposom" irgendein membrangebundenes Vesikel, das irgendwelche erfindungsgemäße Moleküle oder Kombinationen derselben enthält.
  • Der wirksamste Verabreichungsmodus und die wirksamsten Dosiermöglichkeiten für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen hängen von der Schwere und dem Verlauf der Krankheit, der Gesundheit des Subjekts und der Reaktion auf die Behandlung und der Beurteilung durch den behandelnden Arzt ab.
  • Der Zusammenhang zwischen den Dosierungen für Tiere verschiedener Größen und Spezies und Menschen, auf mg/m2 Oberflächenbereich bezogen, wird von Freireich, E. J., et al., Cancer Chemother. (Krebschemotherapie), Rep. 50 (4): 219–244 (1966) beschrieben. Änderungen des Dosierplans können zum Optimieren des Hemmens des Wachstums der Tumorzellen und der Abtötungsreaktion gemacht werden, z. B. können Dosen geteilt und auf täglicher Basis verabreicht werden oder die Dosis kann je nach der Situation im Verhältnis reduziert werden (z. B. mehrere geteilte Dosen können täglich verabreicht oder je nach der spezifischen therapeutischen Situation im Verhältnis reduziert werden).
  • DIE MOLEKÜLE DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt als Erstes einen BR96-Antikörper bereit, der eine menschliche IgG1-Konstantregion aufweist, die in der CH2-Domäne strukturell geändert worden ist, wobei Leucin an der Aminosäureposition 235 zu Alanin mutiert wird; Glycin an der Ammnosäureposition 237 zu Alanin mutiert wird; Glutaminsäure an der Aminosäureposition 318 zu Serin mutiert wird; Lysin an der Aminosäureposition 320 zu Serin mutiert wird; und Lysin an der Aminosäureposition 322 zu Serin mutiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch einen BR96-Antikörper bereit, der eine menschliche IgG1-Konstantregion aufweist, die in der CH2-Domäne strukturell geändert worden ist, wobei Leucin an der Aminosäureposition 235 zu Alanin mutiert wird; Glycin an der Aminosäureposition 237 zu Alanin mutiert wird; und Prolin an der Aminosäureposition 331 zu Alanin mutiert wird.
  • Außerdem stellt die vorliegende Erfindung einen BR96-Antikörper bereit, der eine menschliche IgG1-Konstantregion aufweist, die in der CH2-Domäne strukturell geändert worden ist, wobei Leucin an der Aminosäureposition 235 zu Alanin mutiert wird; Glycin an der Aminosäureposition 237 zu Alanin mutiert wird; Glutaminsäure an der Aminosäureposition 318 zu Serin mutiert wird; Lysin an der Aminosäureposition 320 zu Serin mutiert wird; Lysin an der Aminosäureposition 322 zu Serin mutiert wird; und Prolin an der Aminosäureposition 331 zu Alanin mutiert wird.
  • Andere Ausgestaltungen der Erfindung sind in den anhängenden Ansprüchen 4–18 beansprucht. Weitere Ausführungsformen, die durch die beanspruchte Erfindung nicht umfasst werden, sind ebenfalls in der vorliegenden Beschreibung offenbart.
  • Offenbart sind hier strukturell geänderte BR96 oder BR96-Ig-Fusionsproteine. Strukturell geänderte BR96-Antikörper oder -Ig-Fusionsproteine weisen die variable Region von BR96 und eine modifizierte Konstantregion auf. Diese Modifikation stellt strukturell geänderte BR96-Antikörper oder Ig-Fusionsproteine mit der Fähigkeit bereit, die durch Immunglobulin induzierte Toxizität zu hemmen.
  • Verschiedene Ausführungsformen strukturell geänderter BR96 oder BR96-Ig-Fusionsproteine sind bereits hergestellt worden.
  • In einer Ausführungsform, cBR96-A genannt, wurde die gesamte CH2-Domäne von cBR96 deletiert. cBR96-A wird von dem Plasmid exprimiert, das die in SEQ. ID. NO. 10 gezeigte Sequenz aufweist. cBR96 wird von einem Plasmid exprimiert, das die Sequenz in SEQ ID NO 9 aufweist.
  • In einer anderen Ausführungsform, hBR96-2A genannt, wurde die gesamte CH2-Domäne von hBR96 deletiert. hBR96-A wird von dem Plasmid exprimiert, das die in SEQ. ID. NO. 12 gezeigte Sequenz aufweist. hBR96 ist ein mutanter BR96, der die H1-, H2- und H3-Mutationen, die in der PCT-Anmeldung Nr. 95/305444, am 6. März 1996 veröffentlicht, beschrieben sind, aufweist.
  • In noch einer anderen Ausführungsform, hBR96-2B genannt, ist der Leucinrest, der sich an der Aminosäureposition 235 befindet, zu Alanin mutiert. Außerdem ist der Glycinrest, der sich an der Aminosäureposition 237 befindet, zu Alanin mutiert. Die verwendete Nummerierung der Aminosäurepositionen ist bei Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest (Sequenzen von Proteinen, die von immunologischem Interesse sind), 5. Ausgabe (1991), United States Department of Health and Human Services, beschrieben.
  • In einer weiteren Ausführungsform, hBR96-2C genannt, ist der Glutaminsäurerest an Position 318 zu Serin mutiert; der Lyuinrest, der sich an Position 320 befindet, ist zu Serin mutiert; und der Lysinrest, der sich an Position 322 befindet, ist zu Serin unter Anwendung von Standardprotokollen (Alexander R. Duncan and Greg Winter „The binding site of Clq an IgG" (Die Bindungsstelle für Clq an IgG), Nature 332: 738 (1988)) mutiert.
  • In einer anderen Ausführungsform, hBR96-2D genannt, ist der Prolinrest an Position 331 zu Alanin mutiert (m-H. Tao et al., „Structural features of human Immunglobulin G that determine isotypespecific differences in complement activation (Strukturelle Merkmale von menschlichem Immunglobulin G, die die isotypspezifischen Unterschiede in der Komplementaktivierung bestimmen)", J. Exp. Med 178: 661–667 (1993); Y. Xu et al., „Residue at position 331 in the IgG1 and IgG4 domains contributes to their differential ability to bind and activate complement (Der Rest an Position 331 in den IgG1- und IgG4-Domänen ist mitbestimmend für ihre unterschiedliche Fähigkeit bei, Komplement zu binden und aktivieren)" J. Biol. Chem. 269: 3469–3474 (1994)).
  • In einer zusätzlichen Ausführungsform, hBR96-2E genannt, ist der Leucinrest an Position 235 zu Alanin mutiert; der Glycinrest, der sich an Position 237 befindet, ist zu Alanin mutiert; der Glutaminsäurerest, der sich an Position 318 befindet, ist zu Serin mutiert; der Lysinrest, der sich an Position 320 befindet, ist zu Serin mutiert; und der Lysinrest, der sich an Position 322 befindet, ist zu Seren mutiert (A. Morgan et al., „The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is necessary for C1q, Fc(gamma)RI and Fc(gamma)RIII binding (Das N-terminale Ende der CH2-Domäne von chimärem menschlichem IgG1-anti-HLA-DR ist für die Bindung von Clq, Fc(gamma)RI- und Fc(gamma)RIII notwendig)" Immunol. 86: 319–324 (1995)).
  • In noch einer weiteren Ausführungsform, hBR96-2F genannt, ist der Leucinrest, der sich an Position 235 befindet, zu Alanin mutiert; der Glycinrest, der sich an Position 237 befindet, ist zu Alanin mutiert; und der Prolinrest, der sich an Position 331 befindet, ist zu Alanin mutiert.
  • In noch einer anderen Ausführungsform, hBR96-2G genannt, ist der Glutaminsäurerest, der sich an Position 318 befindet, zu Seren mutiert; der Lysinrest, der sich an Position 320 befindet, ist zu Serin mutiert; der Lysinrest, der sich an Position 322 befindet, ist zu Seren mutiert; und der Prolinrest, der sich an Position 331 befindet, ist zu Alanin mutiert.
  • In einer anderen Ausführugsform, hBR96-2H genannt, ist der Leucinrest, der sich an Position 235 befindet, zu Alanin mutiert; der Glycinrest, der sich an Position 237 befindet, ist zu Alanin mutiert; der Glutaminsäurerest, der sich an Position 318 befindet, ist zu Serin mutiert; der Lysinrest, der sich an Position 320 befindet, ist zu Seren mutiert; der Lysinrest, der sich an Position 322 befindet, ist zu Serin mutiert; und der Prolinrest, der sich an Position 331 befindet, ist zu Alanin mutiert.
  • In Abhängigkeit von seiner Form kann ein strukturell geänderter BR96-Antikörper oder ein strukturell geändertes Fusionsprotein ein monofunktioneller Antikörper, wie beispielsweise ein monoklonaler Antikörper oder ein bifunktioneller Antikörper, wie beispielsweise ein hybrider Antikörper oder ein Heteroantikörper sein. Die Verwendung von strukturell geändertem BR96, d. h. als therapeutisches oder diagnostisches Mittel, bestimmt, welche der verschiedenen Formen von strukturell geändertem BR96 gebildet wird.
  • Es bestehen mehrere Möglichkeiten für die Antikörperexpression. Immunexpressionsbibliotheken können mit Transfektomtechnologie kombiniert werden, d. h. die Gene für die Fab-Moleküle, die aus der Immunglobulin-Genexpressionsbibliothek stammen, können mit den erwünschten Konstantdomänenexonen fusioniert werden. Diese rekombinanten Gene können dann transfiziert und in einem Transfektom exprimiert werden, das ein Antikörpermolekül sekretieren würde.
  • Sind sie einmal hergestellt, so können die erfindungsgemäßen Polypeptide modifiziert, d. h. durch Aminosäuremodifikationen innerhalb des Moleküls zur Bildung von Derivatmolekülen modifiziert werden. Derartige Derivatmoleküle würden die funktionelle Eigenschaft des Polypeptids beibehalten, nämlich würde das Molekül, das derartige Substitutionen aufweist, die Bindung des Polypeptids an das BR96-Antigen oder Teile davon immer noch gestatten.
  • Es ist ein allgemein akzeptiertes Prinzip der Proteinchemie, dass gewisse Aminosäuresubstitutionen, „konservative Aminosäuresubstitutionen" genannt, häufig in einem Protein ohne Ändern entweder der Konformation oder der Funktion des Proteins durchgeführt werden können.
  • Aminosäuresubstitutionen umfassen, sind jedoch nicht notwendigerweise darauf beschränkt, Aminosäuresubstitutionen, die im Stand der Technik als „konservativ" bekannt sind.
  • Derartige Änderungen umfassen das Substituieren von irgendeinem unter Isoleucin (I), Valin (V) und Leucin (L) für irgendeine andere dieser hydrophoben Aminosäuren; Asparaginsäure (D) für Glutaminsäure (E) und umgekehrt; Glutamin (Q) für Asparagin (N) und umgekehrt; und Serin (S) für Threonin (T) und umgekehrt.
  • Andere Substitutionen können ebenfalls, je nach der Umgebung der spezifischen Aminosäure und ihrer Rolle in der dreidimensionalen Struktur des Proteins als konservativ betrachtet werden. Beispielsweise können Glycin (G) und Alanin (A) häufig untereinander austauschbar sein, wie auch Alanin und Valin (V).
  • Methionin (M), das relativ hydrophob ist, kann häufig mit Leucin und Isoleucin und manchmal mit Valin getauscht werden. Lysin (K) und Arginin (R) werden häufig an Stellen ausgetauscht, an denen das signifikante charakteristische Merkmal des Aminosäurerests dessen Ladung ist und die unterschiedlichen pK-Werte dieser beiden Aminosäurereste nicht signifikant sind. Noch andere Änderungen können als „konservativ" in spezifischen Umgebungen betrachtet werden.
  • In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Polypeptid im Wesentlichen rein, d. h. von anderen Aminosäureresten frei, die die Bindung des Polypeptids an sein Target hemmen oder reduzieren und die Magendarm-Toxizität, die normalerweise während oder nach der Antikörpertherapie auftritt, hemmen oder reduzieren würden.
  • NUCLEINSÄUREMOLEKÜLE, DIE DIE VORLIEGENDE ERFINDUNG KODIEREN
  • Die Nukleotidsequenzen und Aminosäuresequenzen der variablen und Konstantregionen von BR96 sind bekannt. Die Sequenz für die Immunglobulinkonstantregion ist bekannt und in 18 dargestellt. Es wurden spezifische Mutationen in der Konstantregion des BR96-Antikörpers durchgeführt. Nucleinsäuremoleküle, die die sieben oben beschriebenen Mutanten (hBR96-2B bis hBR96-2H) kodieren, sind wie folgt:
    • In hBR96-2B ist Alarm in an den Aminosäurepositionen 235 und 237 durch die Kodone GCU, GCC, GCA oder GCT kodiert.
    • In hBR96-2C ist Serin an den Positionen 318, 320 und 322 durch UCU, UCC, UCA oder UGG kodiert.
    • In hBR96-2D ist Alanin in Position 331 durch die Kodone GCU, GCC, GCA oder GCG kodiert.
    • In hBR96-2E ist Alanin an den Positionen 235 und 237 durch die Kodone GCU, GCC, GCA oder GCG kodiert. Serin an den Positionen 318, 320 und 322 ist durch UCU, UCC, UCA oder UGG kodiert.
    • In hBR96-2F ist Alanin an den Positionen 235, 237 und 331 durch die Kodone GCU, GCC, GCA oder GCG kodiert.
    • In hBR96-2G ist Serin an den Positionen 318, 320, 322 durch UCU, UCC, UCA oder UGG kodiert. Des Weiteren ist Alanin an der Position 331 durch die Kodone GCU, GCC, GCA oder GCG kodiert.
    • In hBR96-2H ist Alanin an den Positionen 235, 237 und 331 durch die Kodone GCU, GCC, GCA oder GCG kodiert. Außerdem ist Serin an den Positionen 318, 320, 322 durch UCU, UCC, UCA oder UGG kodiert.
    • Irgendwelche der obigen können Desoxyribonucleinsäure (DNA), z. B. eine komplementäre DNA (cDNA) oder eine Ribonucleinsäure (RNA) sein.
  • IMMUNKONJUGATE
  • Immunkonjugate (die ganze Antikörper oder Ig-Fusionsproteine aufweisen) können unter Anwendung einer umfangreichen Reihe verschiedener chemotherapeutischer Mittel wie Folsäure und Anthracycline (Peterson et al., „Transport And Storage of Anthracyclines In Experimental Systems and Human Leukemia", in Anthracycline Antibiotics in Cancer Therapy (Transport und Lagerung von Anthracyclinen in Versuchssystemen und bei der menschlichen Leukämie, in Anthracyclinantibiotika bei der Krebstherapie), Muggia et al. (Verfasser), S. 132 (Martinus Nijhoff Publishers (1982); Smyth et al., „Specific Targeting of Chlorambucil to Tumors With the Use of Monoklonal Antibodies (Spezifisches Targeting von Chlorambucil auf Tumore unter Verwendung monoklonaler Antikörper)", J. Natl. Cancer Inst., 76: 503–510 (1986)) einschließlich Doxorubicin (DOX) (Yang und Reisfeld „Doxorubicin Conjugated with a Monoklonal Antibody Directed to a Human Melanoms-Associated Proteoglycan Suppresses Growth of Established Tumor xenografts in Nude Mice PNAS (USA) (Doxorubicin, mit einem monoklonalen Antikörper konjugiert, der gegen ein mit menschlichem Melanom assoziiertes Proteoglycan gerichtet ist, unterdrückt das Wachstum von vorhandenen Tumorxenotransplantaten in Nacktmäuse-PNAS (USA)" 85: 1189–1193 (1988)), Daunomycin (Arnon und Sela „In Vitro and in vivo Efficacy of Conjugates of Daunomycin With Anti-Tumor Antibodies (In vitro- und in vivo-Wirksamkeit von Konjugaten von Daunomycin mit Antitumor-Antikörpern)" Immunol. Rev., 65: 5–27 (1982)) und Morpholinodoxorubicin (Mueller et al., „Antibody Conjugates With Morpholinodoxorubicin and Acid-Cleavable Linken (Antikörperkonjugate mit Morpholinodoxorubicin und säurespaltbaren Linkem)", Bioconjugate Chem., 1: 325–330 (1990)) konstruiert werden.
  • BR96 ist bereits an Doxorubicin konjugiert worden und hat sich als bei der Therapie gewisser Krebsarten oder Karzinome wirksam erwiesen (Trail, P. A., Willner, D., Lasch, S. J., Henderson, A. J., Casazza, A. M., Firestone, R. A., Hellström, I., und Hellström, K. E. Cure of xenografted human karzinomas by BR96-doxorubicin immunoconjugates (Heilung von menschlichen Xenotransplantatkarzinomen durch BR96-Doxorubicinimmunkonjugate), Science, 261: 212–215, 1993).
  • Der Praxis der Erfindung gemäß können strukturell geänderte BR96 in Form von, einschließlich, unreduziertem IgG, reduziertem strukturell geändertem IgG und Fusionsproteinen (PCT-Anmeldung Nr. 95/305444, am 6. März 1996 veröffentlicht) verwendet worden.
  • Geeignete therapeutische Mittel zur Verwendung beim Herstellen des Immunkonjugats umfassen Pseunomonas exotoxin A (PE) in entweder der nativen PE- oder der LysPE40-Form. LysPE40 ist eine gestutzte Form, die einen genetisch modifizierten Aminoterminus aufweist, der für Konjugationszwecke einen Lysinrest umfasst. Doxorubicin ist ebenfalls ein geeignetes therapeutisches Mittel.
  • Zusätzliche Beispiele therapeutischer Mittel umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Antimetabolite, Alkylierungsmittel, Anthracycline, Antibiotika und Antimitotika.
  • Antimetabolite umfassen Methotrexat, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin, Cytabarin, 5-Fluorouracildecarbazin.
  • Alkylierungsmittel umfassen Mechlorethamin, Thiotepachlorambucil, Melphalan, Carmustin (BSNU) und Lomustin (CCNU), Cyclothosphamid, Busulfan, Dibrommannit, Streptozotocin, Mitomycin C und cis-Dichlordiaminplatin(II)(DDP-)Cisplatin.
  • Anthracycline umfassen Daunorubicin (früher Daunomycin) und Doxorubicin (hier auch als Adriamycin bezeichnet). Zusätzliche Beispiele umfassen Mitozantron und Bisantren.
  • Antibiotika umfassen Dactinomycin (früher Actinomycin), Bleomycin, Mithramycin und Anthramycin (AMC).
  • Antimitotika umfassen Vincristin und Vinblastin (die allgemein als Vincaalkaloide bezeichnet werden).
  • Andere zytotoxische Mittel umfassen Procarbazin, Hydroxyharnstoff, Asparaginase, Corticosteroide, Mytotan (O,P'-(DDD)), Interferone.
  • Weitere Beispiele zytotoxischer Mittel umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Ricin, Bryodin, Gelonin, Supporin, Doxorubicin, Taxol, Zytochalasin B, Gramicidin D, Ethidiumbromid, Etoposid, Tenoposid, Colchicin, Dihydroxyanthracindion, 1-Dehydrotestosteron und Glukocorticoid.
  • Offensichtlich sind Analoge und Homologe derartiger therapeutischer und zytotoxischer Mittel in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Beispielsweise gibt es zum chemotherapeutischen Mittel Aminopterin einen korrelativ verbesserten Analog, nämlich Methotrexat.
  • Des Weiteren ist der verbesserte Analog von Doxorubicin ein Fe-Chelat. Außerdem ist der verbesserte Analog von 1-Methylnitrosoharnstoff Lomustin. Des Weiteren ist der verbesserte Analog von Vinblastin Vincristin. Auch ist der verbesserte Analog von Mechlorethamin Cyclophosphamid.
  • METHODEN ZUM HERSTELLEN ERFINDUNGSGEMÄSSER MOLEKÜLE
  • Es gibt mehrere Ansätze zum Herstellen ortsspezifischer Mutation in der CH2-Domäne eines Immunglobulinmoleküls. Ein Ansatz umfasst die PCR-Amplifikation der CH2-Domäne mit den Mutationen, mit anschließender homologer Rekombination der mutierten CH2 in den Vektor, der das erwünschte Immunglobulin, z. B. hBR96-2, enthält. Beispielsweise sind hBR96-2B und hBR96-2D durch diese Methode hergestellt worden.
  • Ein anderer Ansatz wäre das Einführen von Mutationen durch ortsgerichtete Mutagenese von einzelsträngiger DNA. Beispielsweise weist der Vektor pD17-hG1b, der nur die Konstantregion von IgG1 und nicht die V-Domäne von hBR96 enthält, den f1-Ursprung der Replikation auf. Dies verleiht dem Vektor die Eigenschaften eines Phagemids und es können ortsgerichtete Mutageneseversuche der Methode von Kunkel, et al. entsprechend durchgeführt werden (Kunkel, T. A., J. D. Roberts und R. A. Zakour, 1987 Methods Enzymol. 154: 367–383) wie in dem Muta-Gene®-Kit zur in-vitro-Mutagenese von Phagemiden, Version 2, von Bio-Rad bereitgestellt. Beispielsweise wurden hBR96-2B, -C, -D, -E, -F, -G und -H mit dieser Methode hergestellt.
  • Zum vollständigeren Verständnis der hier beschriebene Erfindung werden folgende Beispiele aufgeführt. Man sollte sich im Klaren darüber sein, dass diese Beispiele nur veranschaulichenden Zwecken dienen und nicht als den Umfang dieser Erfindung in irgendeiner Weise einschränkend ausgelegt werden sollen.
  • BEISPIEL 1
  • Es wurde das folgende Standard-ELISA-Protokoll benutzt.
  • Materialien: Imqmulon2 96-Mikrotiterplatten und Probeverdünnungskonzentrat von Genetic Systems (10x); das Antikörperkonjugat war Ziege-anti-Mensch-Kappa-HRP, an Maus adsorbiert, Southern Biotech, in einer Verdünnung von 1:10.000 mit Konjugatverdünnungsmittel von Genetic Systems (1x); EIA Chromogen-Reagenzmittel (TMB) von Genetic Systems (1:100); EIA-gepuffertes Substrat von Genetic Systems (1x); der primäre Antikörper oder das Antigen waren Affinipure F(ab')2 Fragment-Ziege-anti-Mensch-IgG, Fc-fragmentspezifisch (Jackson Immuno Research), Ziege-anti-Mensch-Kappa-UNLB (Southern Biotechnology Associates), Ley-HSA (Alberts Research Council).
  • Methoden: Der primäre Antikörper oder das Antigen in 0,05 M Carbonat/Bicarbonatpuffer auf 1,0 μg/ml verdünnen. 100 μl der verdünnten Lösung pro Vertiefung in Immulon 2-Platten eingeben. Die Platten dicht verschließen und bei 4°C über Nacht inkubieren.
  • Lösungen entfernen durch Invertieren der Platten und blotten auf Papiertüchern. Zum Blockieren 200 μl/Vertiefung Probeverdünnugsmittelkonzentrat von Genetic Systems (1x) hinzugeben. Mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren und die Inhalte der Platten dann wegschütten. Die Platten 3x in physiologischer Kochsalzlösung/Tween waschen. Platten trockenblotten. Die Platten bei Raumtemperatur trocknen lassen (45 min bis 1 Stunde). Die Platten dicht verschließen und bei 4°C lagern.
  • Die Proben wie folgt prüfen. Die Proben und Standards in Probeverdümmungsmittel im Verhältnis von 1:10 verdünnen. Serienverdünnungen in einzelnen Rundbodenplatten durchführen. Von den endgültigen Verdünnungen 100 μl/Vertiefung in mit Antigen beschichtete Assayplatten übertragen; dann bei 4°C über Nacht inkubieren. Die Platten 3x mit physiologischer Kochsalzlösung/Tween waschen.
  • Zur Konjugation, 100 μl/Vertiefung Antikörper-HRP-Konjugat in Konjugatverdünnungsmittel von Genetic Systems (1x) hinzugeben. Die Platten 60 min lang bei Raumtemperatur inkubieren. Die Platten 3x in physiologischer Kochsalzlösung/Tween waschen.
  • 100 μl/Vertiefung EIA-Chromogenreagenz von Genetic Systems (TMB), 1:100, in EIA-gepuffertem Substrat (1x) hinzugeben. 15 min lang bei Raumtemperatur inkubieren und die Reaktion mit 100 μl/Vertiefung 1 N H2SO4 stoppen. Die Platte bei 450/630 nm im EIA-Plattenableser auswerten.
  • BEISPIEL 2
  • KONSTRUKTION VON CH2-DELETIERTEN BR96-MOLEKÜLEN
  • Strategie für das Deletieren von CH2-Domänen: Um CH2-deletierte BR96-Moleküle zu konstruieren, wurden die Scharnier-, CH2- und CH3-Domänen von chimärem BR96 und humanisiertem BR9696-2-IgG1-Molekülen entfernt durch Restriktionsverdau mit Eco47-III in nichtkodierenden Regionen humanisiert. Die Scharnier- und CH3-Domänen wurden durch Polymerasekettenreaktion (PCR) aus einem menschlichen IgG1-(pNγ1.14-)Molekül amplifiziert, dem die CH2-Domäne fehlt. Zwei Oligonukleotide (sense 49mer, antisense 50mer), die zu den Sequenzen zu beiden Seiten der IgG1-Konstantregion homolog waren, wodurch Eco47-III-Stellen konserviert wurden, wurden synthetisiert. Die amplifizierten Scharnier- und CH3-Domänen-PCR-Fragmente wurden in Eco47-III-Stellen in BR96-IgG1-Molekülen durch homologe in vivo-Rekombination eingesetzt (P. Subeck et al, Nucleic Acid Research (1993) 21: 3601–3602). Die neuen BR96-IgG1-Moleküle wurden durch Restriktionskartierung und Sequenzierung verifiziert.
  • Es wurde eine Sewing-PCR-Strategie für die Konstruktion des CH2-deletierten menschlichen IgG1 (pNγ1.14) benutzt (Robert M. Horton, et al. (1990) Biotech 8 (5) S. 528).
  • Die CH1-Domäne wurde als 580 bp-Fragment mit einem sense-Oligonuldeotid (5' TGG CAC CGA AAG CTT TCT GGG GCA GGC CAG GCC TGA 3') (Primer A) und einem antisense-Oligonukleotid (5' TCC GAG CAT GTT GGT ACC CAC GTG GTG GTC GAC GCT GAG CCT GGC TTC GAG CAG ACA 3') (Primer B) aus einem linearisierten menschlichen IgG1-Konstantregionsvektor (pNγ1.7) amplifiziert. Das PCR-Fragment erstreckt sich vom 5'-Ende der Hind-III-Stelle (fett gedruckt) über den Cel-II-, Sal-I-, Dra-III-, Kpn-I-, 6 bp-Nukleotidspacer und Mro-I-Stellen (fettgedruckt) am 3'-Ende der CH1-Domäne.
  • Die CH3-Domäne wurde dann teilweise (zur Xba-I-Stelle) mit einem sense-Primer (5' GTC GAC CAC CAC GTG GGT ACC AAC ATG TCC GGA GCC ACA TGG ACA GAG GCC GGC T 3') (Primer C) und einem antisense-Primer (5' CTG GTT CTT GTT CAT CTC CTC TCT AGA TGG 3') (Primer D) aus einem lirearisierten menschlichen IgG1-Konstantregionsvektor (pNγ1.7) teilweise amplifiziert. Ein PCR-Fragment (etwa 150 bp) mit Sal-I-, Dra-III-, Kpn-I-, 6 Nukleotidspacer und Mro-1-Stellen (fettgedruckt) an seinem 5'-Ende erstreckt sich nur bis einschließlich zur Xba-1-Stelle (fettgedruckt) innerhalb der CH3-Domäne.
  • Die CH1- und CH3-Partial-PRC-Fragmente wurden in einer PCR ohne irgendwelchen Primer kombiniert. Die Reaktion wurde für zwei volle Zyklen von Denaturierung und Reassoziierung durchgeführt, um es den Fragmenten zu erlauben, sich an der homologen Region an den 3'-Enden zu kombinieren. Die (oben beschriebenen) Primer A und D wurden der Reaktion hinzugegeben und der PCR-Zyklus wurde abgeschlossen. Die Polymerase verlängert die DNA mit dem Primer A und Primer D, wobei sich ein PCR-Fragment voller Länge (660 bp) ergibt. Das neu verlängerte PCR-Fragment ist in folgender Reihenfolge vom 5'-Ende bis zum 3'-Ende angeordnet: Hind-III-CH1-Cel-II-Sal-I-Dra-III-Kpn-I-6bp-Spacer-Mro-1-CH3-partial-Xba-1.
  • Das kombinierte PCR-Fragment, mit den CH1- und CH3-Partialdomänen, wurde dann durch eine blunt-end-Ligation in die Sma-I-Stelle von einem pEMBL18-Vektor kloniert und die Sequenz wurde durch Didesoxysequenzierung bestätigt (Sanger et al. (1977) PNAS (USA) 74: 5463–5466).
  • Um das CH1 und Partial-CH3 in einen Säugerexpressionsvektor zu überführen, wurden sowohl der pEMBL18- als auch der pNγ1.7-Vektor mit Hind-III und Xba-I verdaut. Die Hind-III- und Xba-I-Fragmente wurden an den entsprechenden Stellen von dem einem linearisierten pNγ1.7-Vektor ligiert. Das neue Konstrukt mit CH1 und einer vollen CH3-Domäne wurde pNγ1.10-Vektor genannt.
  • Das Scharnierfragment wurde aus einem mit Hind-III verdauten pNγ1.7-Vektor amplifiziert, wobei die Primer so gestaltet waren, dass sie das Scharnierexon mit einer Sal-I- und einer Dra-III-Klonierstelle an jedem Ende flankierten. Solche Stellen befinden sich auch zwischen den CH1- und CH3-Domänen des pNγ1.10-Konstrukts. Das sense-Oligonukleotid (5' ACC ATG GTC GAC CTC AGA CCT GCC AAG AGC CAT ATC 3') mit einem 6 bp-Spacer und einer Sal-I-Klonierstelle (fettgedruckt) und das antisense-Oligonukleotid (5' CAT GGT CAC GTG GTG TGT CCC TGG ATG CAG GCT ACT CTA G 3') mit einem 6 bp-Spacer und einer Dra-III-Klonierstelle (fettgedruckt) wurden zur Amplifikation des Scharnierfragments (250 bp) eingesetzt.
  • Das Scharnierregions-PCR-Fragment wurde in eine SMA-I-Stelle am pEMBL18 durch blunt-end-Ligation kloniert. Sowohl der pEMBL18 mit der Scharnierdomäne als auch der pNγ1.10 mit den CH2- und CH3-Domänen wurden mit Sal-I und Dra-III verdaut. Das so verdaute Scharnierfragment wurde in die entsprechenden Stellen des mit Sal-I und Dra-III lirearisierten pNγ1.10-Vektors kloniert. Das neue Konstrukt, das nun die CH1-, Scharnier- und CH3-Domänen trägt, wurde pNγ1.11 genannt.
  • Um das endgültige CH2-deletierte menschliche IgG1-Konstrukt herzustellen, wurden sowohl das pNγ1.11-Konstrukt als auch der pNγ1.11-Vektor mit BamH1 und HindIII verdaut. Ein Fragment, das die CH1-, Scharnier- und CH3-Domänen enthielt, wurde in den linearisierten pNγ1.1 1-Vektor kloniert. In dem neuen Konstantregion-IgG1-Konstrukt fehlt die CH2-Domäne und es wird pNγ1.14 genannt (11).
  • Zum Verdauen von BR96 IgG1 mit Eco47-III wurde ein Restriktionsfragment mit Scharnier-, CH2- und CH3-Domänen an der Konstantregionssequenz des BR96 IgG1-Vektors sowohl in chimären als auch humanisierten Molekülen identifiziert. Das 5'-Ende dieses Fragments liegt innerhalb des Introns zwischen CH1 und dem Scharnier und das 3'-Ende befindet sich innerhalb des CH3-Introns des BR96 IgG1-Moleküls. Die Scharnier-, CH2- und CH3-Domänen (1,368 kb-Fragment) wurden aus den BR96 IgG1-Molekülen durch Restriktionsverdau mit Eco47-III- an entfernt. Eco47-III ist ein blunt-end cutter. Die mit diesem Enzym verdaute BR96 IgG1-DNA erfordert keine Vorbehandlung vor dem Klonieren. 12 zeigt eine schematische Darstellung des pD17-hBR96-2-Vektors, die die Eco47-III-Stellen, die beim Klonieren verwendet wurden, zeigt.
  • Das CH2-deletierte BR96 IgG1 wurde dann wie folgt konstruiert. Die Scharnier- und CH3-Domänen wurden aus einem CH2-deletierten L6 IgG1-(pNγ1.14-)Konstrukt mit einem sense-Oligonukleotid (5' CAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCGCTGACCTCAG A 3') homolog zur Konstantregionsequenz von IgG1 am 5'-Ende der Eco47-III-Stelle (fettgedruckt) und einem antisense-Oligonukleotid (5' GGAAAGAACCATCACAGTCTCGCAGGGGCCCAGGGCAGCGC TGGGTGCTT 3') homolog zur Konstantregion von IgG1 am 3'-Ende der Eco47-III-Stelle (fettgedruckt) amplifiziert. Die Eco47-III-Stelle am 3'-Ende des pNγ1.14-Konstrukts wird durch den Klonierungsvorgang modifiziert. Die Eco47-III-Stelle wird so in einen Antisenseprimer eingeführt und bei der Amplifikation der Scharnier- und CH3-Domänen benutzt.
  • Der pD17-BR96 IgG1-Vektor wurde mit Eco47-III verdaut und die Scharnier-, CH2 und CH3-Domänen wurden entfernt. Der lirearisierte pD17-BR96 IgG1-Vektor wurde mit äquimolaren Mengen von Scharnier- und CH3-PCR-Fragmenten gemischt. Die Kotransformation des PCR-Fragments mit linearisierter DNA in kompetente E. coli DH5a Zellen führte zu einem rekombinanten Molekül, durch homologe Rekombination in Bakterien vermittelt. In diesem Konstrukt fehlt die CH2-Domäne der BR96 IgG1-Moleküle und wird pD17-BR96-dCH2 genannt (13).
  • 1,9 Gramm CH2-deletierter chimärer BR96 wurde als Rohmaterial aus 89 1 überstehender Kulturlösung erhalten.
  • BEISPIEL 3
  • Die Toxizität, Lokalisierung und Ausscheidung von CH2-deletiertem chimärem BR96 wurde in vivo wie folgt getestet.
  • Drei Hunde erhielten 400 mg/m2 cBR96-A, dem CH2-Deletionsmutanten von chimärem BR96 und zwei erhielten chimären BR96. Beide Moleküle waren unter milden Bedingungen reduziert und alkyliert worden. Dies ist notwendig, um die Dimerisierung der Deletionsmutante zu einer vierwertige Form zu verhindern. Beide Kontrollhunde erfuhren die typische GI-Toxizität und keine der drei, die die Mutante erhielten, wiesen irgendeine Toxizität auf. Die Kontrollhunde und zwei der Testhunde wurden nach 1 h getötet, um Gewebe des Zwölffingerdarms zum Messen der Antikörperposition zu erhalten. Beide Kontrollhunde wiesen eine auffallend sichtbare Magendarmpathologie auf und die Testhunde hatten ein normal aussehendes Magendarmgewebe. Der dritte Hund zeigt weiterhin keine Anzeichen von Toxizität.
  • Ergebnisse: Lokalisation des CH2-deletierten cBR96 (cBR96-A) zum Magendarmkanal erfolgte in signifikantem Maße bei Hunden, die mit 400 mg/m2 behandelt worden waren, obwohl das intakte chiBR96 etwas besser lokalisierte. Die Lokalisationsdaten zeigen, dass ungefähr äquivalente Mengen von intaktem und CH2-deletiertem cBR96 bei diesen Hunden dem Magendarmkanal zugeführt wurden. TABELLE 5. LOKALISATION VON CBR96 IM MAGENDARMGEWEBE
    Gruppe Tier Spezifische Lokalisierung Durchschnittswert
    cBR96 Nr. 271 Nr. 272 155 114 135
    cBR96-A Nr. 273 Nr. 274 126 52 89
  • Unter Berücksichtigung des durchschnittlichen Grades der spezifischen Lokalisation wurde eine Menge von cBR96-A, die zumindest 66% der Menge an cBR96 entsprach, dem Zielorgan der Toxizität, nämlich dem Zwölffingerdarm, zugeliefert. Auf der Basis der Ermittlung der Dosisbereiche, die mit cBR96 bei Hunden erfolgte (einige klinische Anzeichen von Toxizität wurden bei Dosen von 10 mg/m2 beobachtet), könnte dieser Unterschied, selbst wenn es sich um einen realen Unterschied handeln sollte, den Unterschied zwischen signifikanter Toxizität und keiner Toxizität nicht erklären; vorbehaltlich einer mikroskopischen histopathologischen Untersuchung zeigte die bisherige Beurteilung, dass Hunde, die mit cBR96-A behandelt worden sind, keine Toxizität aufweisen. Diese Beurteilung beruhte auf der Analyse von 2 gefrorenen Blöcken pro Hund und 2 Schnitten pro Block. Die Replikate waren ziemlich gut. Wir untersuchten auch aufbewahrte gefrorene Gewebe aus Hunden, die mit nativem cBR96 oder F(ab)2BR96 behandelt worden waren, und die Lokalisationsniveaus bei diesen Geweben betrugen 110 bzw. 0, im Einklang mit unseren früheren Daten.
  • Angenommen, dass bei nur leicht erhöhten (2X) Dosen von cBR96-A keine Toxizität besteht, so zeigen diese Daten an, dass die CH2-Domäne mit der Induktion akuter Gastroenteropathie verbunden ist und dass die Entfernung dieser Domäne die Induktion von durch BR96 vermittelter Gastroenteropathie verhindert.
  • Diese Studie bestätigt die Ergebnisse, die zeigen, dass F(ab')2 im Hundemodell nicht toxisch ist und dass die Toxizität durch die Konstantregion vermittelt wird. Die CH2-Deletionsmutante ist ein Kandidat für das klinische Targeting von Wirkstoffen. Aufgrund der sehr langen Halbwertzeit von chimärem BR96 sollte eine gewisse Abnahme der Halbwertzeit bei der Mutante hinnehmbar sein.
  • 1 zeigt die Messwerte für die Ausscheidung von cBR96-A in Hunden mit hoher Ley Expression. Bei der Studie wurde ein chimärer cBR96-2 zum Vergleich mit der Konstantregionsmutante von verwendet.
  • CBR96-2 wurde schneller ausgeschieden als der chimäre BR96. Die Lokalisation von cBR96-A am Magendarmepithel wird nicht signifikant durch diese schnellere Ausscheidung beeinflusst. Mehr als genug cBR96 wurde lokalisiert, um eine etwaige Toxizität hervorrufen zu können.
  • Diskussion: Die Konstantregion von chimärem igG ist für die Magendarm-Toxizität, die bei klinischen Versuchen zu sehen war, z. B. bei chiBR96-dox, verantwortlich. Die Magendarm-Toxizität, die im Hundemodell zu sehen war, ist der klinischen Toxizität sehr ähnlich. Sowohl beim Menschen als auch beim Hund vermittelt die Verabreichung des unkonjugierten Antikörpers eine akute Magendarm-Toxizität, die durch das schnelle Einsetzen von Erbrechen, oft mit Blut, gekennzeichnet ist.
  • Beim Menschen ist die Blutung auf den Magenfundus begrenzt, wobei sie die Erosion der Oberflächenschleimhaut des Magens verursacht. Obwohl die Pathologie der Wunde beschränkt ist und sie sich wieder zurückbildet, definiert die extreme Natur der Übelkeit und des Erbrechens, die durch Antiemetika nicht gemildert wird, sie als die dosisbegrenzende Toxizität.
  • Diese Toxizität wird bei Mensch und Hund durch das Antikörpermolekül als solches vermittelt. Bei höheren Dosen des Antikörper-dox-Konjugats ist im Hundemodell wahrscheinlich aufgrund von Doxorubicin noch eine zusätzliche Toxizität zu erkennen. Obwohl das intakte IgG von BR96 beim Hund und beim Menschen Toxizität verursacht, ist das F(ab')2-Molekül (zweiwertig, und nur ohne Konstantregion) bei Hunden nicht toxisch. Dieser Befund hat unsere Versuche mit hohen Dosen motiviert und diese verbessern die Affinität und Spezifizität von BR96 zum Tumorartigen.
  • Bekanntlich vermittelt die CH2-Domäne die Komplement- und die FcR-Bindung. Es war bisher nicht bekannt, dass die strukturelle Änderung der CH2-Domäne zu einer Hemmung der durch Immunglobulin induzierten Toxizität führen würde.
  • TOXIKOLOGIESTUDIE VON hBR96-2B
  • Die Toxizitätsstudie an hBR96-2B in Hunden mit starker Expression von Lewis Y (n = 2) zeigte, dass eine Dosis von 400 mg/m2 weder Bluterbrechen noch blutigen Stuhl verursachte, im Gegensatz zu BR96, das stets ein oder beide Indikationen verursacht. Ein nach 24 h getöteter Hund wies ein im Ganzen normales makroskopisches Aussehen des Magendarmkanals auf, wiederum im deutlichen Gegensatz zu chimärem BR96, der hämorrhagische Läsionen und Schleimhauterosionen hervorruft.
  • BEISPIEL 4
  • Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine vielseitige Technik, die weitverbreitete Anwendung findet, für die Amplifizierung und darauffolgende Modifizierung von Immunglobulingenen. Die Schnelligkeit und Genauigkeit, mit der Antikörpergene in vitro modifiziert werden können, hat zur Bildung einer Reihe verschiedener neuartiger Antikörpergene geführt. Beispielsweise sind PCR-Methoden zum gentechnischen Herstellen von Antikörpern mit einer erhöhten Affinität zum Antigen, zum „Humanisieren" von Antikörpern und zum Modulieren der Effektorfunktion verwendet worden (Marks, J. D., A. D. Griffiths, M. Malmqvist, T. Clackson, J. M. Bye und G. Winter. 1992. Bypassing immunization: high affinity human antibodies by chain shuffling (Umgehen des Immunisierens: menschliche Hochaffinitätsantikörper durch Kettenmischen). Bio/Technology 10: 779–783; Rosok, M. J., D. E. Yelton, L. J. Harris, J. Bajorath, K. -E. Hellström, I. Hellström, G. A. Cruz, K. Kristensson, H. Lin, W. D. Huse und S. M. Glaser. 1996. A combinatorial library strategy for the rapid humanization of antikarzinoma BR96 (Kombinatorische Bibliotheksstrategie für die schnelle Humanisierung von Antikarzinom-BR96) Fab. J. Biol. Chem. 271: 22611–22618; Morgan, A. N., D. Jones, A. M. Nesbitt, L. Chaplin, M. W. Bodmer und S. Emtage. 1995. The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is necessary for Clq, FcγRI and FcγRIII binding (Das N-terminale Ende der CH2-Domäne von chimärem menschlichen IgG-Anti-HLA-DR ist für die Clq-, FcγRI- und FcγRIII-Bindung erforderlich). Immunology. 86: 319–324) Als Teil einer umfangreicheren Studie wollten wir verschiedene ortsspezifische Mutationen in die CH2-Konstantdomäne von menschlichem IgG1 einführen. Es wurden sechs spezifische Aminosäurereste, die über die ganze CH2-Domäne verteilt sind, denen vorher Rollen bei der Immuneffektorfunktion zugeschrieben worden waren, als Targets für die Mutagenese ausgewählt (Morgan, A. N., D. Jones, A. M. Nesbitt, L. Chaplin, M. W. Bodmer und S. Emtage. 1995. The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is necessary for Clq, FcγRI and FcγRIII binding (Das N-terminale Ende der CH2-Domäne von chimärem menschlichen IgG-Anti-HLA-DR ist für die Clq-, FcγRI- und FcγRIII-Bindung erforderlich). Immunology. 86: 319–324; Duncan, A. R. und G. Winter. 1988. The binding site for Clq an IgG (Die Bindungsstelle für C1q an IgG). Nature 332: 738–740; Tao, M. -H., R. I. F. Smith und S. L. Morrison. 1993. Structural features of human Immunglobulin G that determine isotype-specific differences in complement activation (Strukturelle Merkmale von menschlichem Immunglobulin G, die isotypspezifische Unterschiede der Komplementaktivierung bestimmen) J. Exp. Med. 178: 661–667). Fünf der sechs Reste wurden in zwei Clustern gruppiert – wobei ein Cluster aus zwei Resten besteht, die zwei Aminosäuren von einander entfernt liegen (Position 1 oder L1); und ein zweiter Cluster aus drei Resten besteht, der sich über eine Sequenz von fünf Aminosäuren (L2) erstreckt. Die überbleibende Aminosäureposition (L3) ergab die Gesamtzahl von sechs Resten. Wir waren daran interessiert, einen Satz mutanter CH2-Domänen-IgG zu konstruieren, bestehend aus jeder L-Mutation für sich, aber auch in Kombination mit anderen L-Mutanten (z. B. L1; L1; und L2; L1, L2 und L3; usw.) bestehen.
  • Es sind verschiedene in vitro-Methoden beschrieben worden, wobei die PCR dazu verwendet wird, distal positionierte ortspezifische Mutationen innerhalb einer Gensequenz gleichzeitig einzuführen (Ho, S. N., H. D. Hunt, R. M. Horton, J. K. Pullen und L. R. Pease. 1989. Site-directed mutagenesis by overlap extension (Ortsgerichtete Mutagenese durch Überlappungsverlängerung). Gene 77: 51–59; Ge, L. und P. Rudolpf. 1996. Simultaneous introduction of multiple mutations using overlap extention PCR (Simultane Einführung multipler Mutationen mit Hilfe von Überlappungsverlängerungs-PCR). BioTechniques 22: 28–30). Alternativ dazu ist ein Rekombinations-PCR (RPCR) genanntes in vivo-Verfahren ebenfalls erfolgreich zum schnellen und effizienten Bilden von distal positionierten ortsspezifischen Mutationen verwendet worden (Jones, D. H. und S. C. Winistorfer. 1993. Use of polymerase chain reaction for making recombinant constructs (Anwendung der Polymerasekettenreaktion zum Bilden rekombinanter Konstrukte). S. 241–250. In B. A. White (Verfasser), Methods in Molecular Biology (Methoden der Molekularbiologie), Band 15, Humana Press Inc., Totowa, NJ, Jones, D. H. und B. H. Howard, 1991. A rapid method for recombination and site-specific mutagenesis by placing homologous ends an DNA using polymerase chain reaction (Eine Schnellmethode für die Rekombination und ortsspezifische Mutagenese durch Positionieren von homologen Enden an DNA unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion). BioTechniques 10: 62–66.) Bei der RPCR wird die Rekombinationsmaschinerie von E. coli zum Bilden intakter kreisförmiger rekombinanter Plasmide aus einer transfizierten Mischung von linearem durch PCR gebildetem Produkt und linearisiertem Vektor verwendet. Die in vivo-Rekombination wird durch das Verbinden von Nukleotidsequenzen vermittelt, die in die 5'-Enden beider PCR-Primer eingeführt werden, und die zu DNA-Sequenzen, die durch den Vektor kodiert werden, homolog sind. In diesem Bericht beschreiben wir eine Erweiterung des RPCR-Verfahrens für das gleichzeitige Einführen komplexer Kombinationen von Mutationen in eine Antikörper-CH2-Domäne.
  • Humanisierte BR96-Variabelregion-Schwer- und Leichtkettengene, die vorher als zusammengebautes aktives Fab-Fragment in einen M13-Phagenexpressionsvektor kloniert und coexprimiert worden waren, stellten das Ausgangsmaterial dar (Rosok, M. J., D. E. Yelton, L. J. Harris, J. Bajorath, K. -E. Hellström, I. Hellström, G. A. Cruz, K. Kristensson, H. Lin, W. D. Huse und S. M. Glaser. 1996. A combinatorial library strategy for the rapid humanization of antikarzinoma BR96 (Kombinatorielle Bibliotheksstrategie für die schnelle Humanisierung eines Antikarzinom-BR96) Fab. J. Biol. Chem. 271: 22611–22618). Die Schwer- und Leichtketten-V-Gene wurden durch PCR aus einer einzelsträngigen M13-DNA-Template amplifiziert und durch in vivo-Rekombination subldoniert (Jones, D. H. und B. H. Howard, 1991. A rapid method for recombination and site-specific mutagenesis by placing homologous ends an DNA using polymerase chain reaction (Eine Schnellmethode für die Rekombination und ortsspezifische Mutagenese durch Positionieren von homologen Enden an DNA unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion). BioTechniques 10: 62–66) in die Vektoren pD17-hG1a und pD16-hCκ, um pBR96-hG1a bzw. pBR96-hCκ zu bilden. pD17-hG1a und pD16-hCκ sind eukaryotische Immunglobulinexpressionsvektoren, die von pcDNA3 deriviert sind (Invitrogen, San Diego, CA). Das Plasmid pD17-hG1a wurde noch weiter durch ortsspezifische Mutagenese weitermodifiziert, um mit Hilfe von Standardverfahren zwei Eco47-III-Restriktionsstellen, die die Immunglobulinscharnier-CH2-CH3- Domänen flankieren, einzuführen. Der Empfangsvektor wurde dann durch Verdauen von pBR96-hG1a mit Eco47-III, Isolieren des Rückgrats des Vektors durch Agarosegelelektrophorese, gefolgt vom Extrahieren der Vektor-DNA aus der ausgeschnittenen Gelscheibe mit Hilfe des Qiagen-Gelextraktionskits (Qiagen, Chatsworth, CA) hergestellt.
  • Die Strategie für das Einführen multipler Mutationen innerhalb des Immunglobulin-CH2-Gens, in 24 gezeigt, gründet sich auf die homologe in vivo-Rekombination mehrerer unabhängig amplifizierter PCR-Produkte miteinander sowie mit der pBR96-hG1a-Vektor-DNA. Für das Einführen von Mutationen an zwei distalen Stellen werden zwei PCR-Produkte synthetisiert (24B). Das eine Ende jedes PCR-Produkts dient dem Rekombinieren mit einem homologen Ende des linearen Vektors und das andere Ende, das die Mutation bzw. Mutationen, die von Interesse ist bzw. sind, kodiert, dem Rekombinieren mit dem benachbarten PCR-Produkt. Wie in 24B gezeigt, können zusätzliche distal positionierte Mutationen in eine Targetsequenz durch anteilmäßiges Erhöhen der Anzahl der beteiligten PCR-Produkte eingeführt werden. Die Rekombination benachbarter PCR-Produkte erfolgt immer über die Regionen hinweg, die die erwünschten Mutationen enthalten, weshalb die Oligonukleotidprimer, die diese Enden (z. B. A1, A2) kodieren, komplementäre Mutantenreste enthalten. Diese mutagenen PCR-Primer enthalten an jeder Seite der mutanten Reste mindestens 15 flankierte Nukleotide der Wildtyp-Sequenz entweder zum Primen der Polymerisationsreaktion oder zum Vermitteln der Rekombination flankieren. Zwei 49 Nukleotide lange PCR-Sense- und Antisenseprimer (Rs und Ra) für PCR enthalten Sequenzen für die Rekombination mit den Endregionen des mit Eco47-III verdauten pBR96-hG1a-Vektors.
  • Jede L-Mutation wurde in einer getrennten PCR-Reaktion amplifiziert. Die Reaktionsbedingungen waren 250 ng intakte pBR96-hG1a-DNA-Template, 10 μl 1X Pfu-Puffer (Stratagene, Inc., San Diego, CA), 10 nmol dNTPs, jeweils 200 ng der geeigneten PCR-Primer, 10% Dimethylsulfoxid (ATCC, Rockville, MD) und 2,5 Einheiten klonierte Pfu-DNA-Polymerase in einem Reaktionsvolumen von 100 μl. Proben wurden zuerst 5 min lang bei 95°C denaturiert, 5 min lang auf 45°C abgekühlt und 1 min lang bei 72°C elongiert, darauf folgten von 25 Zyklen von Denaturierung bei 94°C für 45 sec, Annealing bei 45°C für 45 sec, und Elongieren für 1 min/kb bei 72°C, gefolgt von einem letzten Elongieren für 7 min bei 72°C in einem DNA-Thermocycler von Perkin-Elmer (Norwalk, CT). Die amplifizierten Produkte wurden aus 1% Agarosegel gereinigt, mit dem Qiagen-Gelextraktionskit extrahiert und die gewonnene DNA wurde quantifiziert. 50 ng von jedem PCR-Produkt wurden mit 25 ng von dem mit Eco47-III verdauten pBR96-hG1a-Vektors gemischt, der Verfahrensweise des Herstellers (GIBCO BRL/Life Technologies, Gaithersburg, MD) gemäß in kompetene Max E. Coli DH5α transfiziert und die gesamte Transfektionsreaktionsmischung wurde auf selektive LB-Agarplatten, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten, ausplattiert.
  • Die Ergebnisse von mehreren Klonierversuchen sind in der Tabelle, die folgt, zusammengefasst. Typischerweise führten die Transformationen zur Bildung von 80 bis 200 Bakterienkolonien. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt und über Nacht in 2 ml Flüssigkulturen angezüchtet zum Isolieren von Miniprep-Plasmid-DNA (Qiagen) und Analysieren durch Kartierung mit Restriktionsendonuklease Eco47-III. Unter 24 unabhängigen Transformanten, die aus dreifachen homologen Rekombinationsereignissen (zwei PCR-Produkte plus Vektor), die analysiert wurden, enthielten 11 Klone die vorausgesagte 1,4 kpb-DNA-Insertion.
  • 25 zeigt eine repräsentative diagnostische Restriktionsanalyse von DNA aus Klonen, die aus vierfachen homologen Rekombinationsereignissen (drei PCR-Produkten plus Vektor) hervorgegangen sind. Zusätzliche Probenahme aus Klonen, die von vierfacher Rekombination herrühren, ergaben eine Klonierungseffizienz von 29% (7 von 24 untersuchten Klonen enthielten Insertionen). Aufgrund der geringen Anzahl von untersuchten Proben wissen wir allerdings nicht, ob die Unterschiede in der Klonierungseffizienz, die zwischen den dreifachen und vierfachen Rekombinationsgeschehnissen beobachten worden sind, von Bedeutung sind.
  • Um die Expression der Leγ-Bindungsaktivität der CH2-mutanten IgG zu beurteilen, wurden Miniprep-DNA aus 6 Klonen, die aus der dreifachen Rekombinationsreaktion stammten und 6 Klonen, die aus der vierfachen Rekombinationsreaktion stammten, die alle die vorausgesagten diagnostischen Eco47-III-Restriktionsmuster aufwiesen, isoliert, mit pBR96-hCκ-DNA gemischt und zum Kotransfizieren von COS7-Zellen verwendet. 48 Stunden alte gebrauchte Überstände aus 3 ml-Kulturen wurden auf die Produktion von IgG insgesamt und Leγ-Bindungsaktivität hin mittels Enzym-Immunosorbent-Assay (EIA), wie beschrieben (Yelton, D. E., M. J. Rosok, G. A. Cruz, W. L. Cosand, J. Bajorath, I. Hellstom, K. -E. Hellstorm, W. D. Huse und S. M. Glaser. 1995. Affinity maturation of the BR96 anti-karzinoma antibody by codon-based mutagenesis (Affinitätsreifung des BR96-Antikarzinomantikörpers durch Mutagenese auf Kodonbasis). J. Immunol. 155: 1994–2004) untersucht. Es zeigte sich, dass alle zwölf Kulturen ungefähr 2–3 μg/ml Leγ-reaktives IgG sezernierten. Die Spektren der Leγ-Bindungsaktivitäten waren alle denjenigen von nativem humanisiertem BR96-IgG ähnlich, was anzeigt, dass die homolog rekombinierten Antikörper keine ausgedehnten Mutationen erwarben, die die Antigenbindung beeinflussen könnten. Um zu bestätigen, dass die erwünschten CH2-Mutationen eingebaut worden sind, und um die rekombinierten Gene auf falsch eingebaute Nukleotide hin zu beurteilen, wurden vier der Klone, die funktionellen Antikörper bilden, mit Hilfe des Sequenase-DNA-Sequenzierkits, Version 2 (United States Biochemical) sequenziert. Es zeigte sich, dass ein Klon eine einzige Nukleotidänderung innerhalb des Vorwärts-PCR-Primers, der zum Vermitteln der Rekombination mit Vektor-DNA verwendet wird, enthielt. Wir sind unsicher, ob dieser Fehler während der chemischen Synthese des Oligonukleotidprimers oder aufgrund eines falschen Einbaus während der PCR-Reaktion trotz der Tatsache erfolgte, dass wir eine wärmebeständige Polymerase mit Proofreadingaktivität verwendet haben.
  • Ein RPCR-Verfahren für das homologe Rekombinieren von bis zu drei einzelnen, durch PCR gebildeten mutierten Antikörpersequenzprodukten in einen eukaryotischen Expressionsvektor für die schnelle Konstruktion von gentechnisch veränderten IgG-Molekülen wird hier beschrieben. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht in der Möglichkeit, gleichzeitig multiple distal positionierte Mutationen mit PCR-Produkten einzuführen, die in einem einzigen PCR-Ansatz synthetisiert worden sind. Rekombinante DNA werden mit einer angemessen hohen Klonierungseffizienz und Treue korrekter Nukleotidsequenzen erzeugt. Die Fähigkeit, mehrere einzelne PCR-Produkte effizient zu verbinden, sollte Kombinationsstrategien für das Konstruieren komplex mutierter Proteindomänen sowie für das Erweitern der Anzahl und Position erwünschter Mutationen erlauben. Analyse von Transformanten, die durch Mehrfachfragment-RPCR gebildet worden sind
    Konstruiertes mutantes IgG PCR-Fragmente in Reaktion HRa-Ereignisse Analysierte Kolonien Klonierungseffizienzb
    2 2 Dreifach 24 45%
    2 3 Vierfach 24 33%
    aHR-homologe Rekombination
    bKlonierungseffizienz (Anzahl von Klonen,die 1,4 kbp Insertionen/Gesamtanzahl von Kolonien enthalten.
  • BEISPIEL 5
  • Dieses Beispiel bietet zwei Methoden zum Einführen von ortsspezifischen Mutationen in die CH2-Domäne von menschliche IgG1-Konstantregionen enthaltenden Vektoren.
  • Eine Methode involviert die PCR-Amplifikation eines Segments oder von Segmenten der Konstantregion, wobei Mutationen mit Hilfe von in geeigneter Weise konstruierten Oleonukleotiden eingeführt werden. Der das bzw. die Fragment(e) aufnehmende Vektor wird mit einem Restriktionsenzym zum Linearisieren des Vektors verdaut. PCR-Amplifikationsprimer sind so gestaltet, dass sie die 5'-Enden der PCR-Fragmente an die DNA-Sequenz der Vektoren hybridisieren können. Sollte mehr als ein PCR-Fragment amplifiziert werden, so werden den beiden Fragmenten gemeinsame Sequenzen durch Oligonukleotide eingeführt. Es werden Bakterien mit den PCR-Fragmenten und mit dem verdauten Vektor transfiziert. Die Fragmente und der Vektor können durch homologe Rekombination mit Hilfe der Rekombinationsmaschinerie der Bakterien rekombiniert werden. Es werden Bakterienkolonien ausgewählt und die DNA wird bezüglich ihrer Größe und ihrer Restriktionskarte als vorläufige Bestimmung analysiert, dass der Vektor und das bzw. die Fragmente richtig rekombiniert sind, analysiert. Die korrekte Insertion von Fragmenten mit den Mutationen wird durch Didesoxynukleotidsequenzanalyse bestätigt. Die DNA wird dann in Säugerzellen, wie für den CH2-deletierten Antikörper beschrieben, eingeführt und der exprimierte Antikörper hinsichtlich der Bindungs- und funktionellen Aktivität analysiert.
  • Als Beispiel wurden die Mutationen Leu zu Ala am Rest 235 in CH2 und Gly zu Ala am Rest 237 durch das in Beispiel 4 offenbarte Verfahren eingeführt. Der Schwerkettenvektor, der bei diesem Verfahren verwendet wurde, war pD17-hG1a, der dem hier beschriebenen pD17-BR96-Vektor ähnlich, mit der Ausnahme, dass humanisierte V-Regionen (Rosok, M. J., D. E. Yelton, L. J. Harris, J. Bajorath, K. E. Hellström, I. Hellstrom, G. A. Cruz, K. Kristensson, H. Lin, W. D. Huse und S. M. Glaser, 1996, J. Biol. Chem 271 37: 22611–22618) durch drei Affinitätsmutationen (H1-, H2- und H3-Mutationen) substituiert wurden.
  • pBR96-hG1a enthält zwei Eco47-III-Restriktionsstellen, die die Ig-Scharnier-CH2-CH3-Domänen flankieren. Der Aufnahmevektor wurde durch (1) den Verdau von pBR96-hG1a mit Eco47-III, (2) Isolieren des Vektors durch Agarosegelelektrophorese und (3) Extrahieren der Vektor-DNA aus der ausgeschnittenen Gelscheibe mit Hilfe des Qiagen-Gelextraktionskits (Qiagen, Chatsworth, CA) hergestellt. Um Mutationen an einem einzigen Ort, wie beispielsweise den Positionen 235 und 237, einzuführen, wurden zwei PCR-Produkte synthetisiert.
  • Um zwei distal positionierte Mutationen, wie beispielsweise bei der Mutante F (hier auch als hBR96-2F bezeichnet) mit Mutationen bei 235, 237, 331, sind 3 PCR-Produkte erforderlich. Die Rekombination benachbarter PCR-Produkte erfolgt über die Regionen hinweg, die die erwünschten Mutationen enthalten; daher enthalten die Oligonukleotidprimer, die diese Enden kodieren, komplementäre mutante Reste. Die mutagenen PCR-Primer enthalten mindestens 15 flankierende Nukleotide der Wildtyp-Sequenz an jeder Seite der mutanten Reste entweder zum Starten der Polymerisationsreaktion oder zum Vermitteln der Rekombination. Zwei 49-Nukleotide lange PCR-sense- und antisense-Primer enthalten Sequenzen für das Rekombinieren mit den Endregionen des mit Eco47-III verdauten pBR96-hG1a-Vektors.
  • Bei der PCR-Amplifikation wurden 250 ng intakte pBR96-hG1a-DNA-Template, 10 μl 10X Pfu-Puffer (Stratagene, Inc., San Diego, CA), 10 nmol dNTP, jeweils 200 ng der entsprechenden PCR-Primer, 10% Dimethylsulfoxid (ATCC, Rockville, MD) und 2,5 Einheiten klonierte Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene, Inc., San Diego, CA) in 100 μl Reaktionsmischung verwendet. Es wurden Proben 5 min lang bei 95°C denaturiert, 5 min lang bei 45°C einem Annealing und 1 min lang bei 72°C einer Elongation unterzogen, gefolgt von 25 Denaturierungszyklen für 45 sec bei 94°C, Annealing für 45 sec bei 45°C, Elongation für 1 min/kb bei 72°C und einer letzten Elongation für 7 min bei 72°C. Die amplifizierten Produkte wurden aus einem 1%-igen Agarosegel gereinigt, mit Hilfe des Qiagen-Gelextraktionskits extrahiert und quantifiziert. Jeweils 50 mg PCR-Produkt wurden mit 25 ng des mit Eco47-III verdauten pBR96-hG1a-Vektors gemischt und in MAX Efficiency E. Coli DH5αWZ den Anweisungen des Herstellers (GIBCO BRL/Life Technologies, Gaithersburg, MD) entsprechend transfiziert. Die gesamte Transfektionsreaktionsmischung wurde auf LB-Agarplatten, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten, ausplattiert.
  • Es wurden Bakterienkolonien ausgewählt und über Nacht in 2 ml Flüssigkulturen bei 37°C gezüchtet. DNA wurde isoliert und durch Kartierung mit Eco47-III-Restriktionsendonuklease analysiert. Klone mit einer Insertion von der richtigen Größe wurden sequenziert (Sequenase Version 2, U. S. Biochemical Corp., Cleveland, OH).
  • Die zweite Methode für das Einführen ortsspezifischer Mutationen in die CH2-Domäne von menschlichem IgG1 involvierte die Methode von Kunkel (1987 Methods Enzymology, supra). Für diesen Vorgang wurde pD17-hG1b-DNA mit dem F1-Replikationsursprung in elektrokompetentes E. coli CJ236 dut-ung-(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) mittels Elektroporation den Anleitungen des Herstellers gemäß eingeführt. PD17-hG1b ist ein Vektor, der eine Konstantregion, jedoch keine variable Region aufweist. Der F1-Replikationsursprung gestattet die Behandlung dieses Vektors wie ein Phagemid.
  • Bakterien, die das Plasmid enthalten, wurden durch Ampicillinresistenz ausgewählt. Uridinylierte Einzelstrang-DNA wurde mit Hilfe des Protokolls der Muta-Gene Phagemid in vitro Mutagenese, Version 2 (Bio-Rad) hergestellt. Es wurden Mutationen durch ortsgerichtete Mutagenese mit einem geeigneten antisense-Oligonukleotid eingeführt. Bei Molekülen mit Mutationen an mehr als einer Stelle wurden Mutationen durch eine der beiden oben besprochenen Methoden eingeführt. Eine Methode wäre, (1) eine Mutante, beispielsweise die Mutante 2C (hier auch als BR96-2C bezeichnet) mit Mutationen an den Resten 318, 320, 322 herzustellen, (2) ssDNA davon zu isolieren und (3) einen zweiten Satz Mutationen mit entsprechendem antisense-Oligonukleotid einzuführen. Die zweite Methode wäre, ein Annealing von zwei antisense-Oligonukleotiden mit derselben uridinylierten ssDNA durchzuführen und mit beiden Änderungssätzen nach Mutante zu screenen. Die Mutante 2H (hBR96-2H) wurde auch durch eine Kombination dieser Methoden hergestellt.
  • Die V-Region der humanisierten BR96-2-Schwerkette wurde durch die oben beschriebene homologe Rekombinationsmethode in pD17-hJm14.H1 eingeführt. Das pD17-hJm14.H1-Plasmid enthält die humanisierte variable Region des BR96 mit H1/H2/H3-Mutationen und dieses Plasmid wurde zum Transfizieren mutanter Sequenzen in Säugerzellen verwendet. Der pD17G1b-Vektor, der die Fc-Mutation(en) enthält, wurde mit NheI 3 h lang bei 37°C verdaut und die DNA mit den oben beschriebenen Methoden isoliert. Die Insertion der V-Region in den Vektor wurde aus der Größe und durch Restriktionsenzymkartierung bestimmt und durch Sequenzanalyse bestätigt.
  • Die transiente Expression ganzer Antikörper wurde mittels Transfektion von COS-Zellen durchgeführt. Zur Bildung von Antikörpern wurden stabile Transfektionen von CHO-Zellen durchgeführt (vergleiche die Beschreibung der deletierten CH2-Mutante). Alle Mutanten wurden aus CHO-Kulturüberständen durch Protein-A-Chromatografie gereinigt.
  • Die dem Vektor homologen Oligonukleotidprimer, die zum Einführen der Konstantregionmutationen verwendet wurden, waren wie folgt:
  • Vektorsequenzen homologe Oligonukleotide:
    • Sens(sense)CH2 E47-3-5: CAG GGA GGG AGG GTG TCT GCT GGA AGC CAG GCT CAG CGC TGA CCT CAGA
    • D CH2 E47-3 A (Antisense): GGA AAG AAC CAT CAC AGT CTC GCA GGG GCC CAG GGC AGC GCT GGG TGC TT
  • Oligonukleotide zum Mutieren von Leu235 zu Ala und Gly237 zu Ala (die unterstrichenen Sequenzen zeigen die Mutationsorte an):
  • Antisense CH2 L235-G237/aa: GAA GAG GAA GAC TGA CGG TGC CCC CGC GAG TTC AGG TGC TGA GG
  • SensCH2 L235-G237/AA: CCT CAG CAC CTG AAC TCG CGG GGG CAC CGT CAG TCT TCC TCT TC
  • Oligonukleotide zum Mutieren von Glu318, Lys320, Lys322 zu Ser
    • Antis(Antisense)CH2 EKK/SSS-2: CTG GGA GGG CTT TGT TGG AGA CCG AGC ACG AGT ACG ACT TGC CAT TCA GCC
  • Oligonukleotide zum Mutieren von Pro331 zu Ala:
    • Antis CH2 P331/A/3: GAT GGT TTT CTC GAT GGC GGC TGG GAG GGC
    • Sense CH2 P33/A: GCC CTC CCA GCC GCC ATC GAG AAA ACC ATC
  • Alternatives antisense-Oligo zum Einführen von Ala an 331 durch ortsgerichtete Mutation:
    • CH2P331A: GAT GGT TTT CTC GAT AGC GGC TGG GAG GGC TTT G
  • Oligonukleotide zum Mutieren von Glu318 zu Ser, Lys320 zu Ser, Lys322 zu Ser und Pro331 zu Ala:
    • Antis CH2 EKK/SSA-6: GAT GGT TTT CTC GAT GGC GGC TGG GAG GGC TTT GTT GGA GAC CGA GCA CGA GTA CGA CTT GCC ATT CAG CCA GTC CTG GTG
    • Sense CH2 EKKP/SSA-6: CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG TCG TAC TCG TGC TCG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC GCC ATC GAG AAA ACC ATC
  • IN VITRO ASSAYS DER MUTANTEN
  • Die Ergebnisse des CDC-Assays zeigen, dass mutanter hBR96-2B eine etwa 10 mal geringere Aktivität aufweist als das Kontroll-hBR96-1 (zwei Affinitätsmutationen, eine in H2 und eine in H3, vergleiche das oben erwähnte Patent (20)). Die Mutanten, die die geringste Fähigkeit aufweisen, Zellen in Gegenwart des Komplements zu töten, sind hBR96-2C mit den Dreifachmutationen an den Positionen 318, 320 und 322 und die hBR96-2H-Mutante (die am wenigsten zytotoxischen Antikörper in der Reihe), die alle sechs Mutationen an drei verschiedenen Orten enthält. Die ADCC-Aktivität wurde durch das CH2-deletierte hBR96-2-Molekül am stärksten beeinflusst (21).
  • hBR96-2B und -2H zeigten 100- bis 1000-fach weniger Abtötungsaktivität in Gegenwart von Effektorzellen. Im ADCC-Assay zeigte das hBR96-2B-Molekül auch etwa 10-fach weniger Aktivität (21).
  • Die 26–28 stellen die Aminosäuresequenzen bereit für die variable Schwerkettenregion für sowohl chimären als auch humanisierten BR96, der die H1-, H2- und H3-Mutationen aufweist. Die Aminosäuresequenz für die variable Leichtkettenregion ist bekannt und Verfahren zum Erzeugen derselben sind in der PCT-Anmeldung Nr. 95/305444 zu finden. Außerdem ist die Aminosäuresequenz für die IgG1-Konstantregion bereitgestellt. Die Mutationen in der Konstantregion sind hervorgehoben.
  • SEQUENZLISTE
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Claims (18)

  1. BR96-Antikörper, der eine menschliche IgG1-Konstantregion aufweist, die in der CH2-Domäne strukturell geändert worden ist, wobei Leucin an der Aminosäureposition 235 zu Alanin mutiert wird; Glycin an der Aminosäureposition 237 zu Alanin mutiert wird; Glutaminsäure an der Aminosäureposition 318 zu Serin mutiert wird; Lysin an der Aminosäureposition 320 zu Serin mutiert wird; und Lysin an der Aminosäureposition 322 zu Serin mutiert wird.
  2. BR96-Antikörper, der eine menschliche IgG1-Konstantregion aufweist, die in der CH2-Domäne strukturell geändert worden ist, wobei Leucin an der Aminosäureposition 235 zu Alanin mutiert wird; Glycin an der Aminosäureposition 237 zu Alanin mutiert wird; und Prolin an der Aminosäureposition 331 zu Alanin mutiert wird.
  3. BR96-Antikörper, der eine menschlicher IgG1-Konstantregion aufweist, die in der CH2-Domäne strukturell geändert worden ist, wobei Leucin an der Aminosäureposition 235 zu Alanin mutiert wird; Glycin an der Aminosäureposition 237 zu Alanin mutiert wird; Glutaminsäure an der Aminosäureposition 318 zu Serin mutiert wird; Lysin an der Aminosäureposition 320 zu Serin mutiert wird; Lysin an der Aminosäureposition 322 zu Serin mutiert wird; und Prolin an der Aminosäureposition 331 zu Alanin mutiert wird.
  4. Nucleinsäuremolekül, das einen Antikörper ausgewählt unter den BR96-Antikörpern nach den Ansprüchen 1–3 kodiert.
  5. cDNA nach Anspruch 4.
  6. Plasmid, das das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 4 umfasst.
  7. Wirtsvektorsystem umfassend ein Plasmid nach Anspruch 6 in einer geeigneten Wirtszelle.
  8. Methode für die Herstellung eines Proteins, umfassend das Züchten der Wirtszellen nach Anspruch 7, die das Plasmid enthalten, um das Protein in dem Wirt herzustellen, und das Gewinnen des so erzeugten Proteins.
  9. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen akzeptablen Träger und eine pharmazeutisch wirksame Menge eines Immunoglobulinmoleküls, das eine variable Region und eine Konstantregion aufweist, wobei das Immunoglobulinmolekül durch strukturelles Ändern multipler, mit Toxizität verbundener Domänen in der CH2-Domäne der konstanten Region eines monoklonalen Antikörpers BR96 modifiziert wird und die multiplen, mit Toxizität verbundenen Domänen so geändert werden, dass die Toxizität, die sonst durch den monoklonalen Antikörper BR96 induziert wird, gehemmt wird, wobei das modifizierte Immunoglobulinmolekül unter den Antikörpers nach den Ansprüchen 1–3 ausgewählt wird.
  10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das strukturell geänderte Immunoglobulinmolekül ein Target, das mit Krebs verbunden ist, erkennt und bindet.
  11. Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 10 für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei einer Methode für die Behandlung von Karzinomen in vivo, umfassend das Verabreichen einer pharmazeutisch wirksamen Menge der Zusammensetzung einem Patienten.
  12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei das strukturell geänderte Immunoglobulinmolekül in der Zusammensetzung mit einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Radiolabel, einem Enzym, einem Chromophor, einem Chemilumineszenzbildner und einem Fluoreszenzbildner so gelabelt wird, um direkt oder indirekt ein wahrnehmbares Signal zu erzeugen.
  13. Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 10 für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Patienten, der an Krebs leidet, wobei der Krebs als Gruppe von Zellen gekennzeichnet ist, die an der Zelloberfläche ein mit Tumor verbundenes Antigen aufweisen, durch Verabreichen dem Patienten einer krebstötenden Menge der Zusammensetzung umfassend ein zytotoxisches Mittel angeknüpftes Immunoglobulin unter Bedingungen, die es dem so angeknüpften Molekül erlauben, das mit dem Tumor verbundene Antigen an der Zelloberfläche so zu binden, dass die so gebundenen Zellen getötet werden, wodurch der Patient behandelt wird.
  14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Immunoglobulin an Doxorubicin konjugiert wird.
  15. Verwendung eines Immunoglobulinmoleküls, das eine variable Region und eine Konstantregion aufweist, wobei das Immunoglobulinmolekül durch strukturelles Ändern multipler, mit Toxizität verbundener Domänen in der CH2-Domäne der konstanten Region eines monoklonalen Antikörpers BR96 modifiziert wird und die multiplen, mit Toxizität verbundenen Domänen so geändert werden, dass die Toxizität, die sonst durch den monoklonalen Antikörper BTR96 induziert wird, gehemmt wird, für die Herstellung eines Medikaments für das Hemmen der durch Immunoglobulin induzierten Toxizität, die aus der Immunoglobulinimmuntherapie bei einem Patienten herrührt, wobei das modifizierte Immunoglobulinmolekül unter den Antikörpern nach den Ansprüchen 1–3 ausgewählt wird.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei das strukturell geänderte Molekül keine komplementabhängige Zytotoxizität oder antikörperabhängige Zellzytotoxizität mehr vermittelt.
  17. Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Immunoglobulinmolekül Ley erkennt und bindet.
  18. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9 zur Verwendung als therapeutisches Mittel.
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