JP2020002138A - 薬物送達タンパク質の輸送向上変異体の単離 - Google Patents

Abstract

【課題】薬物送達のための改善された細胞透過機能を有する新規タンパク質分子を含む担体の提供。【解決手段】Ｌｅｕ６０Ｔｒｐ変異を含む完全長ＰＢポリペプチドである、あるいは、Ｌｙｓ３７５Ｇｌｕ変異、Ｖａｌ４４９Ｍｅｔ変異及びＰｒｏ４６９Ｓｅｒ変異を含む完全長ＰＢポリペプチドである、等のペントンベース（ＰＢ）ポリペプチドを含む担体。【選択図】図７

Description

政府の権利
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって与えられた認可番号ＣＡ１２９８２２およびＣＡ１４０９９５の下で政府支援により行われた。政府は本発明において特定の権利を有する。

発明の分野
本発明は、特定の細胞小器官への薬物送達を改善するための細胞透過機能のための方法および組成物を提供する。

指向進化が、新規向性、低下した非特異性送達、および免疫回避を用いて偽型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドを生成するために使用されている（ＫｗｏｎおよびＳｃｈａｆｆｅｒ、２００８；Ｍａｈｅｓｈｒｉら、２００６）。異なる選択圧を用いたインビトロおよびインビボでのファージディスプレイおよび全ウイルスライブラリーのバイオパニングは、改善されたリガンド結合および取り込み、免疫相互作用、または酵素活性などの所望の特性を有する生成されたタンパク質を有する（Ｙｕａｎら、２００５）。したがって、この方法論は強力であり得、改善された特徴を有する新たなタンパク質バリアントを作製するための合理的変異に対する、より効果的な代替手段である。このプロセスに対する最近開発されたアプローチは、細胞特異的標的ベクターを選択するために異なる細胞種類に対してスクリーニングされ得るバリアントのライブラリーを作製するためにエラープローンＰＣＲを利用し、付着伸長を利用する（Ｚｈａｏら、１９９８）。今まで、改善された細胞内輸送機能を有するタンパク質バリアントを単離するためのプロセスは開発されていなかった。本発明は、本発明の手順から得られる薬物送達のための改善された細胞透過機能を有する新規手順および新規タンパク質分子を紹介する。

種々の実施形態は、細胞への輸送を向上させる方法であって、細胞侵入を向上させる１つまたは複数の変異を有するペントンベース（ＰＢ）タンパク質を含む組成物を準備する工程と、有効量の組成物を細胞に投与する工程とを含む、方法を含む。一実施形態において、１つまたは複数の変異は１１１Ｃおよび／または３３３Ｆである。別の実施形態において、組成物は細胞質および／または細胞核を標的とする。別の実施形態において、組成物は治療薬をさらに含む。別の実施形態において、細胞は腫瘍細胞である。別の実施形態において、１つまたは複数の変異は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および／または配列番号２０である。

他の実施形態は、細胞小器官を標的とする薬物送達分子を生成する方法を含む。その方法は、以下の工程：ａ）ペントンベース（ＰＢ）遺伝子をコードするポリヌクレオチドを得、前記ポリヌクレオチドの変異体を生成する工程と、ｂ）変異ポリヌクレオチドをファージベクター内でクローニングし、ファージベクターを含むファージライブラリーを生成する工程と、ｃ）細胞をファージライブラリーで形質転換する工程と、ｄ）形質転換した細胞を分画し、形質転換した細胞から細胞小器官を収集する工程と、ｅ）収集した細胞小器官からファージを増幅させる工程と、ｆ）収集した細胞小器官から増幅させたファージで細胞を形質転換する工程と、ｇ）工程（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）を反復する工程と、ｈ）各ラウンドから収集した細胞小器官からファージを滴定する工程と、ｉ）最も高い力価を有するファージを選択し、ファージから変異ポリヌクレオチドの配列を得る工程と、ｊ）前記配列によってコードされるポリペプチドを生成する工程と、を含み、前記ポリペプチドは細胞小器官を標的化する薬物送達分子である。別の実施形態において、細胞小器官は、ミトコンドリア、ゴルジ装置、小胞体、核、リボソーム、細胞膜および細胞質ゾルからなる群から選択される。別の実施形態において、細胞は哺乳動物または非哺乳動物細胞である。別の実施形態において、変異は、ＰＣＲベースの方法、化学変異誘発、紫外線誘導性変異誘発またはそれらの組み合わせのいずれか１つもしくは複数を使用して生成される。別の実施形態において、薬物送達分子は、標的ドメイン、エンドソーム溶解性リガンドドメインおよび正電荷を持つドメインを含む。

他の実施形態は、細胞小器官へ治療剤を送達するための担体であって、細胞侵入を向上させる１つまたは複数のペントンベース（ＰＢ）変異によってコードされるポリペプチドを含む、担体を含む。別の実施形態において、１つまたは複数のペントンベース（ＰＢ）変異は１１１Ｃおよび／または３３３Ｆを含む。別の実施形態において、担体はポリリシンモチーフをさらに含む。別の実施形態において、担体は、ヘレグリンの標的ドメインを更に含む。別の実施形態において、１つまたは複数のＰＢ変異はＣ末端欠失を含む。

他の実施形態は、細胞侵入を向上させる１つまたは複数のペントンベース（ＰＢ）変異によってコードされるポリペプチドおよび治療薬を含む、細胞小器官へ治療剤を送達するための担体を含む治療剤を含む。別の実施形態において、治療薬は化学療法剤である。

種々の他の実施形態は、増殖活性を有さない担体を生成する方法であって、ａ）ヘレグリン（Ｈｅｒ）の受容体結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを得、前記ポリヌクレオチドの変異体を生成する工程と、ｂ）変異Ｈｅｒポリヌクレオチドをファージベクター内でクローニングし、ファージベクターを含むファージライブラリーを生成する工程と、ｃ）有糸分裂阻害剤の存在下でＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞をファージライブラリーで形質転換する工程と、ｄ）形質転換した細胞を分画し、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の膜分画を抽出する工程と、ｅ）前記膜分画から膜ファージを収集する工程と、ｆ）有糸分裂阻害剤の存在下で膜ファージをＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞内で形質転換する工程と、ｇ）工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を反復する工程と、ｈ）各ラウンドにおいてＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の増殖をモニタし、最も低いＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞増殖を有する前記膜ファージを選択する工程と、ｉ）選択した膜ファージにおいてＨｅｒポリヌクレオチド変異の配列を得る工程と、ｊ）Ｈｅｒ配列およびペントンベース遺伝子によってコードされるポリペプチドを生成する工程と、を含み、前記ポリペプチドは増殖活性を有さない担体である、方法を含む。

他の実施形態は、変異Ｈｅｒ配列によってコードされるポリペプチドを含む、核に治療剤を送達するための担体を含む。別の実施形態において、担体は、ペントンベース（ＰＢ）タンパク質およびポリリシンモチーフをコードするポリペプチドをさらに含む。別の実施形態において、ＰＢタンパク質は変異ペントンベースタンパク質である。

他の実施形態は、担体および治療薬を含む治療剤を含む。

本明細書の実施形態に係る、バイオパニングストラテジーを示す。 本明細書の実施形態に係る、ペントンベース遺伝子のＰＣＲベースのランダム変異導入を示す。ＰＣＲ産物（１６００ｂｐバンドの真上）は、濃度測定分析に基づいて１００ｎｇのＤＮＡを含有し、約４８００ｎｇの全収率を得る。最初の標的ＤＮＡは９７ｎｇであったので、約５０の収率／初期比および約５．６の重複数を有し、製造業者のプロトコル（Ｇｅｎｅｍｏｒｐｈ ＩＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で提供される標準曲線に対して推定すると、約８／ｋｂの変異率に対応する。 本明細書の実施形態に係る、核分画において向上したパーティションを有するファージディスプレイペントンベースバリアントの単離を示す。ランダム変異したＰＢを示すＴ７ファージライブラリーを、細胞結合および取り込みのためのテキストに記載される条件に従って、１×１０＾８ｐｆｕにて１×１０＾６ＨｅＬａ細胞に加えた。細胞は、あらゆる表面結合ファージを取り除くためにトリプシン処理によって収集し、次いで市販の分画キット（Ｑｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して分画した。ファージを、標準的な手順に従って各分画から一晩ＰＥＧ沈殿させ、次いでＴＢ細菌培地に再懸濁し、ＢＬＴ５４０３細菌に加えて、単離したファージを増幅させた。増幅したファージをプラークアッセイによって滴定し、次いで上記と同じ力価および条件を使用してＨｅＬａ上で再びパニングした。細胞質分画から得たファージを３ラウンドの細胞質バイオパニングに供したのに対して、核分画から得たファージを２ラウンドに供した。 本明細書の実施形態に係る、バイオパニングから単離した輸送バリアントのアラインメントを示す。 本明細書の実施形態に係る、細胞質および核への向上した輸送を示す、完全長変異体、１１１Ｃを示す。図５（Ａ）は、タンパク質がアセトン沈殿によって各分画から沈殿したことを示し、ペレットを４０μＬの脱塩緩衝液に再懸濁し、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングにより分析した。図５（Ｂ）は、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用したバンド密度の分析が、野生型タンパク質と比較して、細胞質および核分画の両方における１１１Ｃの増加を示すことを示している。輸送および細胞分画アッセイ：フラスコ内で増殖させた接着ＨｅＬａ細胞を、５０分間撹拌しながら３７℃のインキュベーションにて５ｍＬの１×ＰＢＳ＋２ｍＭのＥＤＴＡを用いて解離し、１５ｍＬのコニカルチューブに移した。細胞の密度を測定し、細胞を５×１０６細胞／チューブにて別のチューブ内に分配した。細胞を、１×ＰＢＳ＋Ｃａ２＋＋Ｍｇ２＋で３回洗浄してＥＤＴＡを除去し、細胞ペレットを、０．７ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；２ｍＭのＭｇＣｌ２；ＤＭＥＭ中の３％ＢＳＡ）に再懸濁した。野生型（ＷＴ）または変異体（１１１Ｃ、３３３Ｆ）ペントンベースタンパク質（４５０μｇ）を別の細胞アリコートに加え、混合物を４℃にて２時間撹拌しながらインキュベートして、受容体結合を促進し、続いて３７℃にて２時間撹拌しながらインキュベートして、受容体結合タンパク質の内在化を促進した。コントロール処理は非タンパク質（ＮＰ）を与えた。次いで細胞を収集し、Ｑｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔアッセイキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞成分分画のために処理した。 本明細書の実施形態に係る、野生型ＰＢと比較して、向上した核侵入を示す、ＰＢ変異体、１１１Ｃおよび３３３Ｆを示す。図６（Ａ）は、細胞内輸送および免疫細胞化学を示す。確立したプロトコルに従う手順はＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００６）１３、８２１−８３６に詳細に述べられている。抗ペントンベース抗体（Ａｄ５抗体）を１：５００希釈で使用した。Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギを１：４００希釈にて使用した（二次抗体）。ファロイジンを１：１００希釈にて使用し、ＤＡＰＩを３００ｎＭにて使用した。緑、野生型（ＷＴ）または変異体（１１１Ｃ、３３３Ｆ）ＰＢ；赤、アクチン；青、核。図６（Ｂ）は、タンパク質輸送の定量を示す。左のパネルに表した各処理からの１６個の細胞を定量のために選択した。カウントは、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐで各画像のヒストグラムに基づいた。バーは、グリーンチャネルにおける８０〜２５５ウインドウ内のグリーンピクセルカウントを表す。 本明細書の実施形態に係る、ＰＢ変異体の更新されたアラインメントを示す。新たなペプチド長は変異体クローンの核酸配列から翻訳されたアミノ酸配列に基づく。配列は本明細書の図８〜１７に提供される。 本明細書の実施形態に係る、分画１１１クローンＡ（１１１Ａ）からの変異ＰＢの核酸およびペプチド配列を示す。 本明細書の実施形態に係る、分画１１１クローンＣ（１１１Ｃ）からの変異ＰＢの核酸および予測アミノ酸配列を示す。 本明細書の実施形態に係る、分画１１１クローンＧ（１１１Ｇ）からの変異ＰＢの核酸およびペプチド配列を示す。 本明細書の実施形態に係る、分画３３１クローンＥ（３３１Ｅ）からの変異ＰＢの核酸およびペプチド配列を示す。 本明細書の実施形態に係る、分画３３１クローンＩ（３３１Ｉ）からの変異ＰＢの核酸およびペプチド配列を示す。 本明細書の実施形態に係る、分画３３１クローンＪ（３３１Ｊ）からの変異ＰＢの核酸およびペプチド配列を示す。 本明細書の実施形態に係る、分画３３３クローンＡ（３３３Ａ）からの変異ＰＢの核酸およびペプチド配列を示す。 本明細書の実施形態に係る、分画３３３クローンＤ（３３３Ｄ）からの変異ＰＢの核酸およびペプチド配列を示す。 本明細書の実施形態に係る、分画３３３クローンＥ（３３３Ｅ）からの変異ＰＢの核酸およびペプチド配列を示す。 本明細書の実施形態に係る、分画３３３、クローンＦ、ＧおよびＨ（３３３Ｆ、３３３Ｇ、３３３Ｈ）からの変異ＰＢの核酸およびペプチド配列を示す。

本明細書で使用する場合、「ＰＢ」という省略形はペントンベースを意味する。

種々の試薬が、治療剤および薬物を疾患細胞に送達するために開発されており、それらには、リポソーム、合成ポリマー、ペプチド、タンパク質、ウイルスおよびウイルスナノ粒子が含まれる（Ｍｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅ、２００６；ＭｅｄｉｎａＫａｕｗｅら、２００５）。典型的に、これらの試薬によって形成される粒子は遺伝子の送達または薬物ペイロードを促進する修飾を必要とする。このような修飾には、付加する標的リガンドまたは抗体、膜透過剤、および／または細胞内標的（例えば核標的）剤が含まれる。これらの修飾は、通常、合理的設計により導入され、それにより、このような修飾によって生成される各々の新規バリアントは経験的試験を必要とする。これは時間を消費し、大きな労力を必要とし得、最適以下の活性を生じる危険性がある。

細胞膜透過および／または細胞内輸送を改善する過去および現在の試みは、細胞透過または細胞内標的ペプチドを薬物担体にコンジュゲートする合理的設計が使用されている。このようなアプローチは各分子の経験的試験を必要とする。

多くの種類の細胞透過ペプチドが、遺伝子および薬物送達の向上について試験されており、それらには、ＡｎｔＰ、ＴＡＴ、ＧＡＬＡ、ミツバチメリチン、および同様のペプチドが含まれる（Ｍｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅ、２００６；Ｍｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅら、２００５）。同様に、核標的活性が、ＳＶ４０、ＮＬＳ、ＨＭＧ−１、プロタミン、および同様のペプチドまたはタンパク質などの異なる多塩基ドメインの付加によって遺伝子送達剤に加えられている（ＭｅｄｉｎａＫａｕｗｅ、２００６；Ｍｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅら、２００５）。これらのペプチドの各々は、細胞膜を透過するかまたは核を含む細胞内コンパートメントを標的とする能力を有しているが、別の分子と共有結合した場合、または別の分子に対する融合タンパク質として発現された場合、これらの活性は変化する。さらに、これらのペプチドの各々の異なるバリアントの経験的試験は時間を消費し、大きな労力を必要とする。従って、合理的設計および経験的試験がこの問題に対する既存の解決策であるが、このアプローチはその制限を有する。

本明細書に記載される発明は、改善された細胞透過、細胞内輸送、および／または細胞成分標的化を獲得したタンパク質変異体を単離するための選択圧を使用することによって、細胞透過／細胞内輸送タンパク質／ペプチドの合理的設計および経験的試験に必要とされる時間および労力の問題を回避する。このプロセスから誘導されるタンパク質変異体は、人工進化／選択圧により獲得した改善された特徴のために、現在使用されている親タンパク質または既存の遺伝子／薬物送達タンパク質よりも特有の利点を有する。最後に、以下に記載されるプロセスによって単離された特定のタンパク質は、それらの改善された膜溶解および輸送特徴のために、既存の細胞透過ペプチドより利点を提供する。したがって、それらは遺伝子および薬物送達を増加させるために使用され得、それによりナノメディシンに使用される粒子の治療効果を向上させる。

本発明は、細胞小器官を標的とする薬物送達分子を生成する方法を提供する。その方法は、（ａ）ペントンベース遺伝子をコードするポリヌクレオチドを得、ポリヌクレオチドの変異体を生成する工程と、（ｂ）変異ポリヌクレオチドをファージベクター内でクローニングし、ファージベクターを含むファージライブラリーを生成する工程と、（ｃ）細胞をファージライブラリーで形質転換する工程と、（ｄ）形質転換した細胞を分画し、形質転換した細胞から細胞小器官を収集する工程と、（ｅ）収集した細胞小器官からファージを増幅させる工程と、（ｆ）収集した細胞小器官から増幅させたファージで細胞を形質転換する工程と、（ｇ）工程（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）を反復する工程と、（ｈ）各ラウンドから収集した細胞小器官からファージを滴定する工程と、（ｉ）最も高い力価を有するファージを選択し、ファージから変異ポリヌクレオチドの配列を得る工程と、（ｊ）前記配列によってコードされるポリペプチドを生成する工程と、を含み、ポリペプチドは細胞小器官を標的化する薬物送達分子である。

いくつかの実施形態において、細胞小器官は、ミトコンドリア、ゴルジ装置、小胞体、核、リボソーム、細胞膜および細胞質ゾルからなる群から選択される。細胞は哺乳動物または非哺乳動物細胞であってもよい。任意のランダム変異誘発法または標的変異誘発法を使用して変異体が生成されてもよい。変異体を生成するために使用され得る方法の例には、限定されないが、ＰＣＲベースの方法、化学変異誘発、紫外線誘導性変異誘発またはそれらの組み合わせのいずれか１つまたは複数が含まれる。ペントンベース遺伝子の変異は、挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせのいずれか１つまたは複数であってもよい。

本発明の一実施形態において、薬物送達分子は、標的ドメイン、エンドソーム溶解性リガンドドメインおよび正電荷を持つドメインを含む。

本発明はまた、変異ペントンベース遺伝子によってコードされるポリペプチドを含む、治療剤を細胞小器官に送達するための担体を提供する。ペントンベース遺伝子の変異は、（ａ）ペントンベース遺伝子をコードするポリヌクレオチドを得、ポリヌクレオチドの変異体を生成する工程と、（ｂ）変異ポリヌクレオチドをファージベクター内でクローニングし、ファージベクターを含むファージライブラリーを生成する工程と、（ｃ）細胞をファージライブラリーで形質転換する工程と、（ｄ）形質転換した細胞を分画し、形質転換した細胞から細胞小器官を収集する工程と、（ｅ）収集した細胞小器官からファージを増幅させる工程と、（ｆ）収集した細胞小器官から増幅させたファージで細胞を形質転換する工程と、（ｇ）工程（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）を反復する工程と、（ｈ）各ラウンドから収集した細胞小器官からファージを滴定する工程と、（ｉ）最も高い力価を有するファージを選択し、ファージから変異ポリヌクレオチドの配列を得る工程と、（ｊ）配列によってコードされるポリペプチドを生成する工程と、を含み、ポリペプチドは細胞小器官を標的化する薬物送達分子である、方法によって単離され得る。担体は、ポリリシンモチーフおよび標的ドメイン、例えば、ヘレグリンの標的ドメインをさらに含む。

本発明はさらに、上記の担体および治療薬を含む治療剤を提供する。治療薬は、例えば、疾患の作用を治療、阻害、予防、軽減し、疾患の重症度を減少させ、疾患の発症の可能性を減少させ、疾患の進行を遅延し、および／または疾患を治癒する任意の薬物であってもよい。治療剤が標的とする疾患は、限定されないが、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、芽細胞腫、種々の免疫細胞で発現される抗原、および種々の血液疾患に関連する細胞で発現される抗原、自己免疫疾患、および／または炎症性疾患を含む。治療剤は化学療法剤であってもよい。

本発明はまた、増殖活性を有さない担体を生成する方法を提供する。その方法は、（ａ）ヘレグリン（Ｈｅｒ）の受容体結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを得、前記ポリヌクレオチドの変異を生成する工程と、（ｂ）変異Ｈｅｒポリヌクレオチドをファージベクター内でクローニングし、前記ファージベクターを含むファージライブラリーを生成する工程と、（ｃ）有糸分裂阻害剤（例えば、タキソール）の存在下でＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞をファージライブラリーで形質転換する工程と、（ｄ）形質転換した細胞を分画し、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の膜分画を抽出する工程と、（ｅ）膜分画から膜ファージを収集する工程と、（ｆ）有糸分裂阻害剤の存在下で膜ファージをＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞内で形質転換する工程と、（ｇ）工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を反復する工程と、（ｈ）各ラウンドにおいてＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の増殖をモニタし、最も低いＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞増殖を有する膜ファージを選択する工程と、（ｉ）選択した膜ファージにおいてＨｅｒポリヌクレオチド変異の配列を得る工程と、（ｊ）Ｈｅｒ配列およびペントンベース遺伝子によってコードされるポリペプチドを生成する工程とを含み、前記ポリペプチドは増殖活性を有さない担体である。Ｈｅｒ遺伝子における変異は、挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせのいずれか１つまたは複数であってもよい。

本発明はさらに、治療剤を核に送達するための担体であって、変異Ｈｅｒ配列によってコードされるポリペプチドを含み、変異Ｈｅｒは上記の方法に従って得られる、担体を提供する。担体はさらに、ペントンベースタンパク質およびポリリシンモチーフをコードするポリペプチドを含む。ペントンベースタンパク質は変異タンパク質であってもよい。

実施例１
輸送向上変異体の単離
以前に、インビボおよびインビトロで種々の治療分子を腫瘍細胞に標的化し、送達するために、組換えアデノウイルスペントンベースタンパク質が開発された（Ａｇａｄｊａｎｉａｎら、２０１２；Ａｇａｄｊａｎｉａｎら、２００９；Ａｇａｄｊａｎｉａｎら、２００６；Ｍｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅら、２００１ａ；Ｍｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅら、２００１ｂ；Ｒｅｎｔｓｅｎｄｏｒｊら、２００８）。現在、ペントンベースの組換えタンパク質（治療剤をＨＥＲ２＋腫瘍細胞に標的化するために使用されるＨｅｒＰＢＫ１０の「ＰＢ」ドメインを含む同じもの；（Ａｇａｄｊａｎｉａｎら、２０１２；Ａｇａｄｊａｎｉａｎら、２００９；Ａｇａｄｊａｎｉａｎら、２００６；Ｍｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅら、２００１ｂ；Ｒｅｎｔｓｅｎｄｏｒｊら、２００８）は、細胞結合後に複数の細胞侵入経路を介して進み、そのうちの全てではないが、いくつかは膜透過および細胞質ゾル内への侵入をサポートする（Ｒｅｎｔｓｅｎｄｏｒｊら、２００６）。この機能を改善し、治療剤の細胞標的内への送達および透過を向上させるために、エンドソーム脱出により核内への侵入が可能となるので、指向進化アプローチが、読み出し情報として核内蓄積を使用することによって向上した細胞透過活性を有するペントンベースバリアントを単離するために使用された（Ｒｅｎｔｓｅｎｄｏｒｊら、２００６）。

手順：この２工程プロセスは以下を含む：１．ランダム変異導入による変異体ライブラリーの作製、および２．スクリーニングプロセスに応じて改良された機能を有するバリアントを単離するための選択圧の導入。ここで、細胞質ゾルおよび／または核内に生存侵入するファージの単離は選択圧として機能し、向上した細胞透過活性を有するバリアントを生じると予想される（図１に要約される）。したがって、本発明者らは、ランダムに変異導入したペントンベース遺伝子を有し、Ｋ．Ｔ７ファージベクター内でクローニングした変異体のライブラリーを生成した。以前に確立された指向進化研究（Ｃｈｅｒｒｙら、１９９９；Ｓｈａｆｉｋｈａｎｉら、１９９７；Ｗａｎら、１９９８；ＹｏｕおよびＡｒｎｏｌｄ、１９９６）に基づいて、本発明者らは、遺伝子につき１〜４アミノ酸変化（または２〜７ヌクレオチド変化）の変異頻度を目的とした。特別なエラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（ＧｅｎｅＭｏｒｐｈＩＩ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して生成された生成物に基づいて、本発明者らは、ペントンベース塩基遺伝子につき約８ヌクレオチド／ｋｂまたは１３．６ヌクレオチドの推定変異頻度を達成した（図２）。本発明者らは、この生成物をＴ７−選択ファージベクター内に挿入し、５×１０^１０ｐｆｕ／ｍＬの増幅したライブラリー力価を生成するために組換えファージをパッケージ化した。

ライブラリーはＨｅＬａ細胞（ＰＢタンパク質の結合および取り込みのためのインテグリン受容体を発現する）でパニングした。ファージを、取り込みではなく、受容体結合を促進するために４℃にて１時間、細胞でインキュベートし、次いで細胞を洗浄し、内在化を促進するために３７℃にて２時間インキュベートした。取り込み後、細胞質および核分画を単離するために、収集した細胞を分画した。各分画から増幅したファージを次いで反復バイオパニングに供し、対応する連続分画を細胞収集物から抽出した（すなわち、ラウンド１から単離した核ファージを増幅させ、細胞に戻し、続いて核ファージを再び得るために核分画の単離を反復した）。２回または３回のラウンドのバイオパニング後、各々の反復分画から単離したファージを、野生型ペントンベースを示すファージと比較して変異誘発ライブラリーからの核／細胞質ゾルファージの相対的濃縮を求めるために滴定した。

結果：変異導入していない親ファージ、Ｔ７−ＰＢは、１未満の核／細胞質ファージ力価を生じ、２時間までに核に到達するファージの比率は細胞質に残っているファージの比率未満であったことを示す（図３）。対照的に、２ラウンドのバイオパニングおよび核ファージ（３−３ａ）の単離後、Ｔ７−ＰＢと比較して有意な増加で、細胞質保持と比較して、より高い核内蓄積へのシフトを観察した（Ｐ＝０．０５）（図３）。さらに３ラウンドの細胞質分画パニングから単離したファージ（１−１−１）は、高い有意性ではないが（Ｐ＝０．０７）、Ｔ７−ＰＢと比較して核パーティションの増加を示した（図３）。

３ラウンドのバイオパニングならびに細胞質および核変異体の単離後、本発明者らは、各々の濃縮集団からランダムに選択したクローンをシークエンスし、細胞質および核分画の両方から単離したクローンの大部分が、カルボキシ−［Ｃ−］末端切断タンパク質をコードしたことを見出した（図４）。野生型ペントンベース（ｗｔ ＰＢ）線形配列の中央付近に位置する２８７ＬＤＶおよび３４０ＲＧＤインテグリン結合モチーフは、ほとんどの切断クローンにおいて保持されなかった。切断変異体の１つは、ＬＤＶを含有するが、ＲＧＤモチーフを含有しないのに対して、残りの切断型はＬＤＶおよびＲＧＤモチーフの両方を欠損する。バイオパニングから単離した完全長クローンはＬＤＶおよびＲＧＤモチーフの両方を保持するが、また、潜在的な機能を変化させるアミノ酸変化を導入するいくつかの点変異も含有する（図４）。これらの中で、細胞質分画クローン１１１ＣにおけるＬｅｕ６０Ｔｒｐ置換；ならびに核分画クローン３３３ＦにおけるＬｙｓ３７５Ｇｌｕ、Ｖａｌ４４９Ｍｅｔ、およびＰｒｏ４６９Ｓｅｒアミノ酸変化がある。向上した細胞質および／または核透過を与える各々の単離されたバリアントの能力を試験するために、各々の細胞内輸送を、免疫蛍光および共焦点顕微鏡法によって親タンパク質と比較し、細胞成分分画法によって確認する。具体的には、完全長変異体（１１１Ｃおよび３３３Ｆ）および変異体３３１Ｊはインテグリン結合モチーフを保持するので、これらのバリアントをｗｔ ＰＢと比較して試験する。なぜなら、それらはインテグリン結合および取り込みにより細胞に侵入すると予測されるからである。その一方で、残りの切断型バリアントは受容体結合モチーフを欠損するので、それらは、ＰＢドメインを置換するためにＨｅｒＰＢＫ１０内に挿入され、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）結合および取り込みにより細胞に侵入する親ＨｅｒＰＢＫ１０と比較して試験される。

実施例２
鈍いシグナル伝達を有する受容体結合およびエンドサイトーシス変異体の単離
原理：腫瘍標的細胞透過タンパク質、ＨｅｒＰＢＫ１０は、ＨｅｒＰＢＫ１０の「Ｈｅｒ」ドメインと本明細書に指定された、ヘレグリンの受容体結合ドメインを含めることにより、特異的にヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）に向けられる（Ｍｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅら、２００１ｂ）。しかしながら、ヘレグリン受容体のライゲーションは、受容体ヘテロダイマー比、リガンドサブタイプ、細胞種類、および特定の細胞内分子の存在を含むいくつかの要因に応じて、腫瘍細胞増殖、分化、一部の場合、アポトーシスを生じ得るシグナル伝達を誘導できる（Ａｇｕｉｌａｒら、１９９９；Ｌｅｗｉｓら、１９９６；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、１９９８）。腫瘍進行などの有害事象を誘導する可能性は、有糸分裂阻害剤によって導入される選択圧が、増殖シグナルを欠く受容体結合およびエンドサイトーシス変異体を選択できるかどうかを検査することにつながる。本発明者らは、Ｈｅｒバリアントを示すファージライブラリーを生成することによってこのアプローチを試験し、静止細胞から内在化したファージを単離し、非増殖ヒト乳癌細胞で再びパニングすることによって増殖シグナルを欠くＨｅｒ種を内在化するためのライブラリーをスクリーニングすることを提案した。

手順：コード配列にわたって分布している異なる変異体を含有するＨｅｒ配列のライブラリーは、エラープローンＰＣＲおよび付着伸長によって生成され、鋳型配列の最初のプライミング後の変性および簡単なアニーリング／伸長の反復サイクルを必要とする（Ｚｈａｏら、１９９８）。得られたライブラリーは、Ｔ７選択バクテリオファージ（全タンパク質を示すために開発される）内に転移するための適切なベクターアーム内に挿入され、組換えファージは製造業者の指示書（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）に従って生成した。進化したＡＡＶカプシドのバイオパニングに基づいて、１０＾１２ファージの初期力価が、タキソールなどの有糸分裂阻害剤を含有する培地に維持されるＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞に加えられ、約３０〜４５分後（結合および内在化に必要とされる時間；Ｍｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅら、２０００）、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡにより収集し（内在化していないファージを除去するため）、粗ウイルス（Ｑｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）のベシクル分画を単離するために膜抽出し、次いでそれはＣｓＣｌバンド形成により単離できる。３〜４ラウンドの選択（すなわち、単離したウイルスを新鮮な細胞に添加し、膜抽出を反復すること）を実施し、単離したウイルスを以下の方法で特徴付ける。最初に、濃縮したウイルスを受容する新鮮な細胞は固定され、単離したファージが内在化したままであることを確認するために抗ファージ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用して免疫蛍光のために処理される。並行して処理した別々の細胞を、代謝アッセイによって偽および未処理の細胞と比較して増殖率について評価する。第２に、単離したファージからのＨｅｒ配列を切除し、組換えタンパク質産生のための細菌発現ベクター内に挿入し（Ｍｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅら、２００１ａ）、次いで変異体Ｈｅｒを、親Ｈｅｒならびに偽および未処理の細胞と比較して、上記のＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌細胞において内在化および増殖活性について試験した。変異体クローンを、変異領域を識別するためにシークエンスし、親「Ｈｅｒ」を置換しているＨｅｒＰＢＫ１０発現カセット内に戻して挿入する。

上記の種々の方法および技術は、適用を実施するための多くの手段を提供する。もちろん、記載される全ての目的または利点は、本明細書に記載される任意の特定の実施形態によって必ずしも達成されなくてもよいことは理解される。したがって、例えば、当業者は、方法が、本明細書に教示または示唆される他の目的または利点を必ずしも達成しなくても、本明細書に教示される１つの利点またはいくつかの利点を達成または最適化するように実施されてもよいことを認識する。種々の代替手段が本明細書に述べられている。いくつかの好ましい実施形態は、特に、１つ、別、またはいくつかの特徴を含むが、他の実施形態は、特に、１つ、別、またはいくつかの特徴を含まなくてもよく、さらに他の実施形態は、１つ、別、またはいくつかの有益な特徴を含むことによって特定の特徴を軽減してもよいことは理解される。

さらに、当業者は、異なる実施形態から種々の特徴の適用性を認識する。同様に、上記の種々の要素、特徴および工程ならびに各々のこのような要素、特徴または工程についての他の公知の等価物が、本明細書に記載される原理に従って方法を実施するために、当業者により種々の組み合わせにおいて利用されてもよい。種々の要素、特徴および工程の中で、いくつかは、特に、異なる実施形態に含まれ、他は、特に、異なる実施形態で排除される。

本出願は特定の実施形態および実施例に関して記載しているが、本出願の実施形態は、具体的に開示された実施形態を超えて、他の代替の実施形態ならびに／またはそれらの使用および修飾および等価物にも及ぶことは当業者により理解される。

いくつかの実施形態において、「一つの（ａ）」および「一つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という用語ならびに本出願の特定の実施形態を記載する文脈（特に以下の請求項の特定の文脈）で使用される同様の参照は、単数および複数の両方を含むと解釈され得る。本明細書における値の範囲の列挙は単に、この範囲内の各々の別の値に対する個々の参照を簡潔にした方法として役立つことを意図する。本明細書に他に示されない限り、各々の個々の値は、本明細書に個々に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に他に示されない限り、または別様で文脈に明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。任意および全ての例の使用、または本明細書の特定の実施形態に対して提供される例示的な用語（例えば、「など」）は、本出願を単により良く例示することを意図し、別様で請求される本出願の範囲の制限を課しているわけではない。本明細書における用語は、本出願の実施に必須である請求されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。

本出願を実施するために本発明者に知られている最適な様式を含む、本出願の好ましい実施形態が本明細書に記載される。これらの好ましい実施形態に対する変更は、前述の説明を読んで当業者に明らかであろう。当業者は、必要に応じてこのような変更を利用でき、本出願は具体的に本明細書に記されているもの以外で実施されてもよいことを意図する。したがって、本出願の多くの実施形態は、適用可能な法律によって許可される添付の特許請求の範囲に記載される主題の全ての修飾および等価物を含む。さらに、全ての可能な変形における上記の要素の任意の組み合わせが、本明細書に他に示されない限り、または別様で文脈と矛盾しない限り、本出願に含まれる。

本文書と矛盾したまたは紛争中の等価物、等価物のいずれかに関連する訴訟ファイルの履歴、あるいは本文書に現在または後で関連する請求項の広範な範囲に関して制限する影響を有し得る等価物のいずれかを除いて、本明細書に参照される、全ての特許、特許出願、特許公報、および論文、書籍、仕様書、刊行物、文書、事柄などの他の資料が、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。例として、組み込まれた資料のいずれかに関連する用語の説明、定義および／または使用の間に不一致または矛盾が存在する場合、本文書における、説明、定義および／または使用に関連するものが有効である。

結びに、本明細書に開示される本出願の実施形態は、本出願の実施形態の原理の例示であると理解される。利用され得る他の修飾は本出願の範囲内であってもよい。したがって、例として、限定されないが、本出願の実施形態の代替の構造が本明細書の教示に従って利用されてもよい。したがって、本出願の実施形態は正確に示され、記載されているものに限定されない。

Claims (24)

1. 細胞への輸送を向上させる方法であって、
   細胞侵入を向上させる１つまたは複数の変異を有するペントンベース（ＰＢ）タンパク質を含む組成物を準備する工程と、
   有効量の前記組成物を前記細胞に投与する工程と、
   を含む、方法。
2. 前記１つまたは複数の変異が１１１Ｃおよび／または３３３Ｆである、請求項１に記載の方法。
3. 前記組成物が、細胞質および／または細胞核を標的とする、請求項１に記載の方法。
4. 前記組成物が、治療薬をさらに含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記細胞が、腫瘍細胞である、請求項１に記載の方法。
6. 前記１つまたは複数の変異が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および／または配列番号２０である、請求項１に記載の方法。
7. 細胞小器官を標的とする薬物送達分子を生成する方法であって、
   ａ．ペントンベース（ＰＢ）遺伝子をコードするポリヌクレオチドを得、前記ポリヌクレオチドの変異体を生成する工程と、
   ｂ．変異ポリヌクレオチドをファージベクター内でクローニングし、前記ファージベクターを含むファージライブラリーを生成する工程と、
   ｃ．細胞を前記ファージライブラリーで形質転換する工程と、
   ｄ．形質転換した細胞を分画し、前記形質転換した細胞から細胞小器官を収集する工程と、
   ｅ．収集した細胞小器官からファージを増幅させる工程と、
   ｆ．収集した前記細胞小器官から増幅させた前記ファージで細胞を形質転換する工程と、
   ｇ．工程（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）を反復する工程と、
   ｈ．各ラウンドから収集した前記細胞小器官から前記ファージを滴定する工程と、
   ｉ．最も高い力価を有するファージを選択し、前記ファージから変異ポリヌクレオチドの配列を得る工程と、
   ｊ．前記配列によってコードされるポリペプチドを生成する工程と、
   を含み、前記ポリペプチドは細胞小器官を標的化する薬物送達分子である、方法。
8. 前記細胞小器官は、ミトコンドリア、ゴルジ装置、小胞体、核、リボソーム、細胞膜および細胞質ゾルからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
9. 前記細胞は、哺乳動物または非哺乳動物細胞である、請求項７に記載の方法。
10. 変異体は、ＰＣＲベースの方法、化学変異誘発、紫外線誘導性変異誘発またはそれらの組み合わせのいずれか一つもしくは複数を使用して生成される、請求項７に記載の方法。
11. 前記薬物送達分子は、標的ドメイン、エンドソーム溶解性リガンドドメインおよび正電荷を持つドメインを含む、請求項７に記載の方法。
12. 細胞小器官へ治療剤を送達するための担体であって、細胞侵入を向上させる１つまたは複数のペントンベース（ＰＢ）変異によってコードされるポリペプチドを含む、担体。
13. 前記１つまたは複数のペントンベース（ＰＢ）変異が、１１１Ｃおよび／または３３３Ｆを含む、請求項１２に記載の担体。
14. ポリリシンモチーフをさらに含む、請求項１２に記載の担体。
15. ヘレグリンの標的ドメインをさらに含む、請求項１２に記載の担体。
16. １つまたは複数のＰＢ変異が、Ｃ末端欠失を含む、請求項１２に記載の担体。
17. 請求項１２に記載の担体および治療薬を含む、治療剤。
18. 前記治療薬が、化学療法剤である、請求項１７に記載の治療剤。
19. 増殖活性を有さない担体を生成する方法であって、
    （ａ）ヘレグリン（Ｈｅｒ）の受容体結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを得、前記ポリヌクレオチドの変異体を生成する工程と、
    （ｂ）変異Ｈｅｒポリヌクレオチドをファージベクター内でクローニングし、前記ファージベクターを含むファージライブラリーを生成する工程と、
    （ｃ）有糸分裂阻害剤の存在下でＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を前記ファージライブラリーで形質転換する工程と、
    （ｄ）形質転換した細胞を分画し、前記ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の膜分画を抽出する工程と、
    （ｅ）前記膜分画から膜ファージを収集する工程と、
    （ｆ）有糸分裂阻害剤の存在下で前記膜ファージを前記ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞内で形質転換する工程と、
    （ｇ）工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を反復する工程と、
    （ｈ）各ラウンドにおいてＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の増殖をモニタし、最も低いＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞増殖を有する膜ファージを選択する工程と、
    （ｉ）選択した前記膜ファージにおいてＨｅｒポリヌクレオチド変異の配列を得る工程と、
    （ｊ）Ｈｅｒ配列およびペントンベース遺伝子によってコードされるポリペプチドを生成する工程と、
    を含み、前記ポリペプチドは増殖活性を有さない担体である、方法。
20. 請求項１９に記載の変異Ｈｅｒ配列によってコードされるポリペプチドを含む、核に治療剤を送達するための担体。
21. ペントンベース（ＰＢ）タンパク質およびポリリシンモチーフをコードするポリペプチドをさらに含む、請求項２０に記載の担体。
22. 前記ＰＢタンパク質が、変異ペントンベースタンパク質である、請求項２０に記載の担体。
23. 請求項１９に記載の担体および治療薬を含む治療剤。
24. 前記治療薬が化学療法剤である、請求項２３に記載の治療剤。

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