JPH10505242A

JPH10505242A - キメラペントンベースタンパク質を含有する組換えアデノウイルス

Info

Publication number: JPH10505242A
Application number: JP8509488A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ウィッカム、トーマス; コウベスディ、イムリ; イー．ブロー、ダグラス; エル．マクヴェイ、ダンカン; ティー．ブルーダー、ジョセフ
Original assignee: ジェンベク、インコーポレイティッド
Priority date: 1994-09-08
Filing date: 1995-08-07
Publication date: 1998-05-26
Also published as: EP1679376A2; US5559099A; EP0778889A2; CA2198861A1; US5712136A; AU3212995A; DE69535103D1; US5731190A; EP0778889B1; AU684220B2; WO1996007734A2; WO1996007734A3; ATE332363T1; EP1679376A3

Abstract

(57)【要約】非ペントンベース配列を含むキメラペントンベースタンパク質および治療遺伝子を含有する組換えアデノウイルス、かかるアデノウイルスの使用を含む遺伝子治療方法、並びにかかる組換えアデノウイルスの産生のためのアデノウイルス運搬ベクターを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】キメラペントンベースタンパク質を含有する組換えアデノウイルス発明の属する技術分野本発明は、キメラアデノウイルスペントンベースタンパク質を含有する組換えアデノウイルスおよび遺伝子治療におけるキメラアデノウイルスペントンベースタンパク質を含有する組換えアデノウイルスの使用に関する。発明の背景アデノウイルスは、２つの属、すなわち、マストアデノウイルス属とアビアデノウイルス属とに分けられるアデノウイルス科に属する。アデノウイルスは、エンベロープのない、直径６５〜８０ｎｍの正二十面体である（Horne et al.，J. Mol．Biol.，1，84-86（1959））。キャプシドは２５２個のキャプソマー（そのうちの２４０個はヘキソンであり、１２個がペントンである）より構成される（ Ginsberg et al.，Virology，28，782-783（1966））。ヘキソンおよびペントンは３つの異なるウイルスポリペプチドに由来する（Maizel et al.，Virology，3 6，115-125(1968); Weber et al.，Virology，76，709-724（1977））。ヘキソンはそれぞれ９６７のアミノ酸からなる３つの同一のポリペプチド、すなわち、ポリペプチドIIを含む（Roberts et al.，Science，232，1148-1151(1986)）。ペントンはキャプシドに結合したペントンベースと、ペントンベースに非共有結合し且つそこから突き出したファイバーを含む。ファイバータンパク質はそれぞれ５８２のアミノ酸からなる３つの同一のポリペプチド、すなわち、ポリペプチドIVを含む。Ａｄ２ペントンベースタンパク質は、それぞれ５７１のアミノ酸からなる５つの同一のタンパクサブユニット、すなわち、ポリペプチドIII より構成される８×９ｎｍの環状の複合体である（Boudin et al.，Virology，92，125 -138（1979））。タンパク質IX，VIおよびIIIaもまた、アデノウイルスコート中に存在し、ウイルスキャプシドを安定化させると考えられている（Stewart et a l.，Cell，67，145-154(1991); Stewart et al.，EMBO J.，12(7)，2589-2599 (1993)）。一旦細胞に接着すると、アデノウイルスは受容体を介して細胞のクラスリンで被覆されたエンドサイトーシス小胞へと内部移行される（Svensson et al.，J． Virol.，51，687-694(1984); Chardonnet et al.，Virology，40，462-477（197 0））。細胞に侵入するビリオンは、多くのウイルス構造タンパク質の殼を脱ぎ捨てながら段階的に分解される（Greber et al.，Cell，75，477-486（1993））。脱被覆過程の間、ウイルス粒子はｐＨ依存的なメカニズムによって細胞のエンドソームの破壊を引き起こすが（Fitzgerald et al.，Cell，32，607-617（1983 ））、これについてはまだあまり理解されていない。次いで、ウイルス粒子は細胞の核孔複合体へと輸送され（Dales et al.，Virology，56，465-483(1973)）、そこでウイルスゲノムが核に侵入し、そうして感染を開始する。アデノウイルスは２つの別個の細胞受容体を使用するが、細胞に接着し効率良く感染するには、その両方が存在しなければならない（Wickham et al.，Cell， 73，309-319(1993)）。まず、ファイバータンパク質が、今のところまだ同定されていない受容体に結合することによって、ウイルスを細胞に接着させる。次いで、ペントンベースがα_Vインテグリンに結合する。インテグリンは、細胞外マトリックス分子であるフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンおよびコラーゲンや他の分子への細胞の接着を媒介するヘテロダイマーの細胞表面受容体ファミリーである（Hynes，Cell，69，11-25（1992））。インテグリンは、カルシウム流動化作用、タンパク質のリン酸化および細胞骨格の相互作用を含む細胞シグナル伝達過程に重要な役割を果たしていることが知られている（Hynes，上述）。インテグリンが、アデノウイルスと関連するリガンドのような特定のリガンドに結合する特異性は、対をなすインテグリンのαおよびβサブユニットの機能である。例えば、インテグリンα₆β₁はラミニンに結合し、インテグリンα₂β₁ はコラーゲンおよびラミニンに結合し、インテグリンα₃β₁はコラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンに結合する。さらに、組織種が異なれば片方が異なるインテグリンサブユニットを有する場合があり、それによってインテグリン− リガンド間シグナル伝達またはリガンドの内部移行を空間的に調節する様式を提供している。したがって、α_Vサブユニットを含むインテグリンのように数多くの細胞種で広く発現するインテグリンもあるが、一方でもっと狭い組織分布を有するインテグリンもある。例えば、β₂サブユニットを含むインテグリンは好中球やマクロファージのような白血球細胞でのみ発現し、α₄サブユニットを含むインテグリンはリンパ球や線維芽細胞でのみ発現し、α_IIbβ₃サブユニットによって定義づけられるインテグリンは血小板や巨核球でのみ発現する。特定のαおよびβサブユニットがウイルスが細胞に侵入できるか否かを指図するので、インテグリンサブユニットの相補体の特異性はまた、種々の血清型のアデノウイルスの細胞感染能にまで及ぶ。例えば、アデノウイルス血清型Ａｄ２のペントンベースはインテグリンα_Vβ₃およびα_Vβ₅に結合する（Wickham et al. (1993)，上述）。アデノウイルスが利用する両方の受容体がほとんどのヒト細胞で発現するなら、ヒト体内のほぼすべての細胞がアデノウイルスの感染を受けやすい。大多数のインテグリンは、特異的リガンドへの結合において短い直鎖状のアミノ酸部分を認識することがわかっている。ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチンおよびフィブリノーゲンを含む多くのマトリックスリガンドに見られるトリペプチドのモチーフarg-gly-asp（ＲＧＤ）がα₃β₁、α₅β₁ 、α_IIbβ₃、α_mβ₂、並びにα_Vを含む５つのインテグリンのすべてでないにせよそのほとんどの結合に関連することが示唆されている。マトリックスリガンド内でのＲＧＤ配列の配座がインテグリン特異性における主要な因子であると考えられている（Pierschbacher et al.，J．Biol．Chem.，262，17294-17298（1987 ））。ＲＧＤ配列に直に隣接する配列が、おそらくそれらがＲＧＤの配座に及ぼす効果のために、インテグリン特異性に影響することがわかってきている（Smit h et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90，10003-10007(1993)）。しかしながら、α₅β₁のフィブロネクチンへの結合に関して示されたように（Obara et a l.，Cell，53，649-657(1988)）、ＲＧＤから遠く離れた配列もまたインテグリン特異性において機能するかもしれない。ＲＧＤを利用しないインテグリンには、それらの特異的リガンド内にある類似の短い直鎖状のアミノ酸部分を結合させるものがあることがわかってきている。例えば、インテグリンα_IIbβ₃はフィブリノーゲン中のアミノ酸配列lys-gln-ala-gly-asp（ＫＱＡＧＤ）［配列番号：１］を介して結合し（Kloczewiak et al.，Biochemistry，23，1767-1774（1984））、一方、α₄β₁はフィブロネクチン中のコア配列glu-ile-leu-asp-val（ＥＩＬＤＶ）［配列番号：２］を介して結合する（Komoriya et al.，J．Biol．Chem. ，266，15075-15079(1991)）。α_Vを含むインテグリンのβサブユニット中に存在する構造モチーフ（すなわち、asn-pro-xaa-try（ＮＰＸＹ））が、内部移行のために重要であることが示されている（Suzuki et al.，Proc．Natl．Acad．S ci．USA，87，5354(1990)）。ペントンベース配列はアデノウイルスの血清型の中で非常によく保存されており、５コピーのＲＧＤトリペプチドモチーフを含んでいる（Neumann et al.，Ge ne，69，153-157(1988)）。外部から加えられたＲＧＤペプチドがペントンベースの結合およびアデノウイルスの感染を妨げ得ること（Wickham et al．(1993) ，上述）、また、ペントンベースのＲＧＤ配列に点変異を有するアデノウイルスは細胞に感染する能力を制限されること（Bai et al.，J．Virol.，67，5198-52 05（1993））から、ＲＧＤトリペプチドはα_Vインテグリンへの結合を媒介すると信じられている。アデノウイルスのＡｄ２，Ａｄ５，Ａｄ１２およびＡｄ４０血清型由来のペントンベース遺伝子が配列決定されている。該配列を照合したところ、Ｎ末端、並びに、Ａｄ２，Ａｄ５およびＡｄ１２においてはＲＧＤ配列を含む超可変領域を除いて、配列全体にわたって高度に保存されていることが明らかである。２つの腸内アデノウイルス血清型のうちの１つであるＡｄ４０だけはＲＧＤ配列を持たない。Ａｄ２およびＡｄ５は超可変領域が同一であり、ＲＧＤ配列に隣接するどちらかの側に大きなアミノ酸のインサートを含む。ＲＧＤを含む３つのペントンベースの超可変領域の二次構造解析から、それぞれの場合について、ＲＧＤはα −ヘリックスと接していることが予測される。このような構造がＡｄ２ペントンベースの低温電子顕微鏡写真（cryo-EM：低温電顕）の画像に見られる鋭く尖った部分を形成していると信じられている（Stewart et al．(1993),上述）。治療を必要とする罹患した細胞または組織に、１つまたはそれ以上の組換え遺伝子を、細胞をターゲッティングして送達するために組換えアデノウイルスベクターが使用されてきている。このようなベクターは、アデノウイルスタンパク質の発現のために宿主細胞の増殖を必要としないという更なる利点により特徴づけられ（Horwitz et al.，In Virology，Raven Press，New York，vol．2，pp．16 79-1721(1990); およびBerkner，BioTechniques，6，616（1988））、また、体細胞遺伝子治療の標的組織が肺であれば、これらのベクターは気道上皮に通常栄養依存するという更なる利点を有する（Straus，In Adenoviruses，Plenan Pres s，New York，pp．451-496（1984））。ヒト遺伝子治療のための可能性のあるベクターとしてのアデノウイルスの他の利点は以下の通りである： (i)組換えが稀である；(ii)ヒトのアデノウイルス感染はありふれているにもかかわらず、アデノウイルス感染とヒトの悪性腫瘍との関連性は知られていない； (iii)アデノウイルスゲノム（それは直鎖状の二本鎖ＤＮＡであるが）はかなりサイズが変動する外来遺伝子を収容するのに操作できる；(iv)アデノウイルスベクターは細胞の染色体中にそのＤＮＡを挿入しないので、その効果は永久的ではなく、おそらく細胞の通常の機能を妨げることはない；(v)アデノウイルスは脳や肺の細胞のような非分裂または最終分化した細胞に感染し得る；および(vi)本質的な特徴として複製能力を有する生のアデノウイルスが、ヒトワクチンとして安全に使用されている（Horwitz et al．(1990)，上述; Berkner et al．(1988) ,上述; Straus et al．(1984)，上述; Chanock et al.，JAMA，195，151(1966); Haj-Ahmad et al.，J．Virol.，57，267(1986); およびBalley et al.，EMBO， 4，3861（1985））。組換えアデノウイルスを遺伝子治療に用いることの問題点は、治療的処置を必要とする細胞だけでなく、アデノウイルスが細胞に接着し感染するのに使用する前述の２つの受容体を発現するすべての細胞が、投与される遺伝子を内部に移行させることである。同様に、リンパ球のようにα_Vインテグリンアデノウイルス受容体を欠く細胞では、アデノウイルスの取り込みがひどく損なわれて、アデノウイルスを介した遺伝子送達をたやすく受けないであろう。従って、特定の細胞へのアデノウイルスの侵入を制限すること、および／またはアデノウイルスを介した遺伝子治療に従順な細胞の範囲を拡大することは、現在の技術を超える意義ある進歩となるであろう。ターゲッティングされたアデノウイルス遺伝子の送達は、遺伝子治療に従順な細胞を拡大し、標的細胞で遺伝子を発現させるために必要なアデノウイルスベクターの量を減少させ、また、炎症や正常な健康細胞のトランスフェクションのようなアデノウイルスの投与量の増加による副作用や合併症を減少させるはずである。アデノウイルスのファイバータンパク質を抗体で立体的に妨害したり、ウイルス粒子に組織特異的抗体を化学的に結合させたりすることにより、特定の細胞へウイルスをターゲッティングする試みがなされてきている（Cotten et al.，Pro c．Natl．Acad．Sci．USA，89，6094-6098（1992））。この研究方法はターゲッティングされた遺伝子の送達に可能性があることを実証してきたが、この方法の複雑さと再現性は臨床試験への応用を妨げる重大な障害となっている。ウイルスをこれらの方法によりターゲッティングする際にこれまで直面した困難さとしては、必要とされる合成の方法、すなわち、ウイルス粒子の精製に続いてウイルス粒子中に大きな変化をなす方法がある。このような変化にはポリリジン、受容体リガンドおよび抗体のような巨大分子をウイルスに共有結合させる付加的工程がいる。ターゲッティングされる粒子複合体は構造的に均一ではなく、その効率は使用されるウイルス粒子、連結する分子およびターゲッティングさせる分子の相対比に鋭敏に反応する。本発明は、組換えアデノウイルスによる遺伝子治療の細胞および組織特異性の欠如という問題点を克服せんとするものである。本発明の目的は、受容体特異的、好ましくは細胞受容体特異的／組織受容体特異的な組換えアデノウイルスを提供することである。本発明の更なる目的は、このような組換えアデノウイルスを遺伝子発現のレベルで生成させ、それによって慣用の技術による組換えアデノウイルス粒子の精製を可能にする手段を提供することである。本発明の別の目的は、このような均一なアデノウイルスの使用を含み、追加の成分やさらなる修飾を必要としない遺伝子治療方法を提供することである。本発明のこれらの、そして他の目的および本発明の利点、並びに付加的な本発明の特徴は、後記の詳細な説明から明確になるであろう。発明の簡単な要約本発明は、所定の受容体、好ましくは細胞特異的／組織特異的受容体に選択的に結合するキメラペントンベースタンパク質を含む組換えアデノウイルス、キメラペントンベースタンパク質を生成するための組換えペントンベース遺伝子を含むアデノウイルス運搬ベクター、および遺伝子治療における治療遺伝子を含む受容体特異的な組換えアデノウイルスの使用方法を提供する。図面の簡単な説明図１はアデノウイルス運搬ベクター（ｐＡＴ）の部分的な制限地図である。図２はベクターｐＲｃＰＢ５（ΔＲＧＤ）の部分的な制限地図である。発明の詳細な説明本発明は、とりわけ、キメラペントンベースタンパク質を含む組換えアデノウイルスを提供する。該キメラペントンベースタンパク質は、野生型のペントンベースアミノ酸配列、好ましくは受容体との結合に特異的なアミノ酸配列、最も好ましくはＲＧＤアミノ酸配列に加えて、あるいはそれに代えて、受容体との結合に特異的であるか、受容体特異的抗体ドメインであるか、またはエピトープである非ペントンベースアミノ酸配列を含有する。「非ペントンベースアミノ酸配列」とは、野生型ペントンベース中に見出されないあらゆるアミノ酸配列を意味する。好ましくは、非ペントンベース配列は１０アミノ酸未満、より好ましくは５アミノ酸未満、最も好ましくは約３アミノ酸である。「ＲＧＤアミノ酸配列」とは、ＲＧＤアミノ酸配列、またはＲＧＤ配列のどちらか片側もしくは両側に３つまで、つまり３つを含むアミノ酸を伴ったＲＧＤ配列を意味する。当該非ペントンベースアミノ酸配列は、アデノウイルスを所定の受容体、好ましくは細胞特異的もしくは組織特異的受容体に、あるいは所定の受容体特異的抗体ドメインまたはエピトープに対して特異的にする。該受容体は、好ましくは野生型アデノウイルスが結合しないもの、または野生型アデノウイルスは結合するがキメラペントンベースタンパク質に非ペントンベースアミノ酸配列を導入することによってより大きな特異性を有するものである。好ましくは、ペントンベースタンパク質のＲＧＤアミノ酸配列を、ＤＮＡレベルで、所定の受容体に対するアミノ酸結合配列、受容体特異的抗体ドメイン、またはエピトープと置き換える。あるいは、ＲＧＤアミノ酸配列を、例えば挿入突然変異のようなＲＧＤアミノ酸配列の変異によってＤＮＡレベルで不活性化するか、または、例えばアデノウイルスのペントンベース遺伝子配列の中もしくは側にＤＮＡ配列を挿入することによって、ペントンベースタンパク質の中で配座的に接近不能にする。ここで「遺伝子配列」とは、完全なペントンベース遺伝子配列および機能的なペントンベースタンパク質として発現され得るあらゆる小さい遺伝子配列のことをいう。好ましくは、キメラペントンベースタンパク質中で、ＲＧＤアミノ酸配列が配座的に受容体と結合できないようにペントンベース遺伝子配列内でＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を移動させるために、該ＤＮＡ配列をＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列の近傍に挿入する。後者の場合、ペントンベースタンパク質中のＲＧＤアミノ酸配列を配座的に接近不能にする、挿入された非ペントンベース遺伝子配列は、好ましくは、受容体との結合に特異的なものであるか、受容体特異的抗体ドメインであるか、またはエピトープであるアミノ酸配列をコードするものである。このような組換えアデノウイルスは、例えば、受容体の結合、アデノウイルスの接着およびアデノウイルスの感染をインビトロまたはインビボで研究するのに用いることができる。本発明の好適な態様において、上記組換えアデノウイルスは、さらにウイルスが接着した細胞あるいはウイルスが内部移行した細胞内で発現され得る遺伝子を含有し、好ましくは治療上利用可能なものである。本発明のさらに別の好適な態様において、該組換えアデノウイルスはファイバーを持たないか、あるいは、さらに、受容体に特異的なものであるか、受容体特異的抗体ドメインであるか、またはエピトープであり、好ましくは非ペントンベース配列と同じ受容体に特異的なものであるか、該配列と同じ受容体特異的抗体ドメインであるか、または該配列と同じエピトープであるアミノ酸配列を含む、ファイバーやヘキソンのようなキメラコートタンパク質を含有する。このような組換えアデノウイルスは、例えば、所定の細胞または組織における遺伝子発現の効果をインビトロまたはインビボで研究するのに用いることができる。あるいはまた、該組換えアデノウイルスは遺伝子治療に用いることができる。キメラペントンベースタンパク質を含む組換えアデノウイルスおよび、さらに特定の細胞内で発現され得る遺伝子をさらに含む組換えアデノウイルスは、本発明に従ってウイルス運搬ベクター、好ましくはアデノウイルス運搬（ｐＡＴ）ベクターの使用により生成することが出来る。該ウイルス運搬ベクター、好ましくはｐＡＴベクターは、キメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列を含む。該キメラペントンベース遺伝子配列は、欠失したＲＧＤアミノ酸配列の代わりに、あるいは、上述のように、変異させたか、もしくは発現キメラペントンベースタンパク質中で配座的に接近不能にさせたＲＧＤ配列に加えて、非ペントンベース配列を含む。該非ペントンベース配列は、やはり上述のように、アデノウイルスを受容体、受容体特異的抗体ドメイン、またはエピトープとの結合に特異的にする。およそ４１のアデノウイルス血清型のうち５つの間でペントンベース遺伝子は９０％を超えて保存されていることが示されているので、いかなるアデノウイルス血清型でもペントンベースの源として使用し得ると予測される。しかしながら、ペントンベース遺伝子が配列決定されている血清型の１つを使用することが好ましい。アデノウイルスゲノムについて唯一の制限部位が、ペントンベース遺伝子配列中に導入される。好ましくは、このような制限部位は、ＰＣＲ変異誘発法のような適当な方法によって、ペントンベース遺伝子配列のＲＧＤ配列の中もしくはそれと並んで導入される。このような唯一の制限部位は、すでにペントンベース遺伝子中に存在しないいかなる制限部位であってもよく、好ましくはＥｃｏＲＩおよび／またはＳｐｅＩである。このような部位は、野生型アデノウイルスのような所定のアデノウイルスゲノム中のＲＧＤアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の除去、例えば配列の改変による不活性化、あるいはＲＧＤ配列を配座的に接近不能にすることを容易にし、それによってペントンベース分子がα_Vインテグリン受容体に結合する能力を変化または除去する。別のＤＮＡ配列、好ましくは、例えば受容体、好適には細胞特異的もしくは組織特異的な細胞表面受容体との結合、あるいは受容体特異的な抗体ドメインもしくはエピトープとの結合のための特異性をコードするＤＮＡ配列が、欠失したＲＧＤ配列と置き換わるか、あるいは、変異したかもしくは配座的に接近不能になったＲＧＤ配列に付随し得る。好ましくは、ｐＡＴベクターは、適当な受容体特異的配列はすべてでもすばやく挿入することができるものである。例えば、唯一のＳｐｅＩ制限部位がＲＧＤアミノ酸配列を除去するのに使用できる。あるいは、ＰＣＲで唯一の制限部位を要することなく配列をペントンベース遺伝子配列中に挿入することもできる。組換えアデノウイルスは、組換え配列とウイルスＤＮＡとの連結または相同組換えによって創製することができるので、ｐＡＴベクターは、好ましくは、(1)実施例４に記載されるように、ベクター断片を残りのウイルスゲノムの相補断片と結合させる唯一の制限部位か、(2)実施例５に記載されるように、ウイルスＤＮＡと効率よく相同組換えさせる、受容体特異的、あるいは、抗体ドメインもしくはエピトープに特異的な配列のどちらかの側にある適当な長さのＤＮＡ、のいずれかを有する。好適なｐＡＴベクターは図１中に示される。図１はこのようなベクターの部分的な制限地図である。図１のｐＡＴベクターは実施例１に記載されるようにして生成された。所定の受容体、好ましくは特定の細胞もしくは組織の受容体に結合することができ、白血球上に所在する受容体のような受容体によって内部移行され得る短いペプチド配列またはタンパク質ドメインをコードするＤＮＡは、ＲＧＤアミノ酸配列が欠失、変異するかもしくは配座的に接近不能になったペントンベース遺伝子配列中に挿入するのに好適である。しかしながら、受容体特異的な抗体ドメインをコードする配列や特定の抗体により認識される抗原エピトープをコードする配列のような他のＤＮＡ配列もまたＲＧＤアミノ酸配列を置換するのに使用され得る。ＲＧＤアミノ酸配列を置換するのに使用されるＤＮＡの大きさは、例えば、ペントンベースの妨害されたフォールディングおよびペントンベース／ファイバー複合体の不適切な集合によって束縛されるかもしれない。しかしながら、低温電顕分析によると、もしＲＧＤアミノ酸配列がペントンベースの鋭く尖った部分に存在するならば、フォールディングや集合が悪影響を受けることなしに大きなインサートを収容するかなりの余地があるかもしれない。また、Ａｄ５ペントンベースとＡｄ１２ペントンベースの超可変領域のサイズにおける大きな相違は、超可変領域が様々な大きさのインサートを収容し得るであろうことを示している。もちろん、ペントン複合体の集合は、おそらくファイバー分子なしに構築されるウイルスに関しては問題とならないであろう。標的受容体は、細胞により内部移行されるものであればいかなる受容体でもよいが、最適には細胞特異的もしくは組織特異的であり、望ましくは、治療すべき細胞もしくは組織でのみ発現するものである。組織特異的インテグリンは、４つの理由でキメラペントンベース分子の好適な標的受容体である。第一に、多くのインテグリンは短い直鎖状のアミノ酸部分を介してリガンドと結合するが、この部分は多くのインテグリンで同定されている。第二に、ある特定のインテグリンはターゲッティングされた遺伝子治療に感受性の細胞に対して組織特異的である。例えば、β₂を含有するインテグリンは白血球でのみ発現するので、通常は非感受性の標的細胞へのターゲッティングされた送達を可能にし、一方で通常は感受性の非標的細胞への送達を防ぐ。第三に、野生型のペントンベースは細胞に侵入するのにα_Vインテグリンを使用するため、関連するインテグリン分子の使用は関連のない受容体よりも成功しやすい。第四に、インテグリンは効率よく細胞内部に移行されるが（Bretscher，EMBO，11，405-410（1992））、これは細胞のウイルス感染に必要とされることである。細胞接着はアデノウイルスのファイバータンパク質によって媒介されるので、細胞特異的もしくは組織特異的な細胞表面受容体のような受容体を認識するようにペントンベースタンパク質を改変することは、一般的にはウイルス粒子の細胞への接着を変化させないであろう。しかしながら、ウイルスが細胞に侵入するためにはα_Vインテグリンの存在を必要とするので、キメラペントンベースタンパク質が接着した細胞の感染は一般に妨害されるであろう。それ故、変化したペントンベースを有するアデノウイルスは、ほとんどの細胞に結合するが、該キメラペントンベースの受容体（例えば、該インテグリン）を発現する細胞にしか侵入しないであろう。ウイルス粒子は細胞内に侵入できないから、適当な受容体を発現できない細胞は、それでもなお細胞膜上にアデノウイルス粒子を繋ぎ止めるであろう。したがって、繋ぎ止められたアデノウイルス粒子は免疫系に曝され、処理されるであろう。ファイバーを介した細胞へのウイルスの接着に続いて、キメラペントンベースによって認識される、細胞もしくは組織特異的な受容体を発現していない細胞に、非特異的にどうにか侵入するウイルスがいる。それ故、細胞特異的もしくは組織特異的発現に漏れが観察される場合があり得る。しかしながら、もしこれが正しければ、ペントンベースを主要な細胞接着タンパク質として用いるファイバー欠損ウイルス粒子を構築することができる。ファイバータンパク質は、ビリオンの集合や細胞の感染性には不可欠でないことが知られている（Falgout et al.， J．Virology，62，622-625（1988））。このようなファイバータンパク質を欠如する変異アデノウイルス粒子は、１０倍低い速度で細胞に吸着する。該変異ウイルスが、吸着はするが野生型より低い速度であることは、この吸着がペントンベースとα_Vインテグリンの相互作用により媒介されていることを示すものである。当該相互作用は、ファイバー／ファイバー受容体相互作用より３０倍低い親和性を有する（Wickham et al．(1993)，上述）。したがって、接着と内部移行の両方が、所望の組織特異的受容体を発現する細胞のみに制限され得る。野生型ペントンベース中の、細胞特異的もしくは組織特異的受容体のような所定の受容体に対して低親和性のＲＧＤアミノ酸配列を、該受容体に対して高親和性を有するアミノ酸配列で置換することにより、ファイバーを発現する野生型ウイルスと同等の、あるいはそれよりも高い標的細胞に対する親和性を有する、ファイバーを持たないウイルス粒子を生み出すことが可能である。キメラペントンベースを含む、ファイバーを持たないウイルス粒子は、ファイバーを含むウイルス粒子に比べてより効率的に組織にターゲッティングされ得る。なぜなら、該改変されたウイルスは、キメラペントンベースによって認識される細胞特異的もしくは組織特異的受容体を発現する細胞にのみ結合できるからである。望ましいリガンドおよび受容体の特徴は上述の通りである。組換えキメラペントンベース遺伝子配列は、発現並びに、受容体特異性、機能的親和性および他の生化学的特徴を評価するために、ｐＡＴベクターからバキュロウイルス、または適当な原核もしくは真核生物の発現ベクターへ移すことができる。したがって、本発明はまた、キメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列を含む組換えバキュロウイルス、並びに原核および真核生物の発現ベクターを提供する。キメラペントンベース遺伝子配列は、ＲＧＤアミノ酸配列のような受容体との結合に特異的な野生型ペントンベースアミノ酸配列に加えて、あるいはそれの代わりに、非ペントンベース配列を含む。キメラペントンベースタンパク質を含有する組換えアデノウイルスに関して上述したように、野生型ペントンベースアミノ酸配列は、欠失または変異しても、あるいは配座的に接近不能にしてもよい。キメラ遺伝子をｐＡＴからバキュロウイルス、または原核もしくは真核生物の発現ベクターに移すことによって、タンパク質の高発現が達成でき、結果として宿主の全タンパク質のおよそ５０％がキメラペントンベースとなる。したがって、本発明はまた、キメラペントンベースタンパク質を含む組換えバキュロウイルス、およびＲＧＤアミノ酸配列のように受容体との結合に特異的な野生型ペントンベースアミノ酸配列に加えてあるいはそれの代わりに、非ペントンベースアミノ酸配列を含むキメラアデノウイルスペントンベースタンパク質を提供する。該非ペントンベースアミノ酸配列は、上述のように、受容体との結合に特異的であるか、または受容体特異的抗体ドメインもしくはエピトープである。組換えキメラペントンベースタンパク質（ｒｃＰＢタンパク質、例えばｒｃＰＢ５）は、タンパク質の特性解析研究のために、上述のWickham et al．（1993）に記載された方法のようないずれかの適当な方法を用いて精製することができる。目的のペントンベースタンパク質の種々の特徴的なパラメーターは、以下のようにして調べることができる。ｒｃＰＢタンパク質とその指定の受容体との相互作用の特異性を評価するのに接着アッセイ、例えば、上述のWickham et al．(19 93)の方法が使用される。受容体／ｒｃＰＢ相互作用の特異性および親和性は、上述のWickham et al．(1993)によって野生型ペントンベースタンパク質について先に示されているように、スキャッチャード解析により調べられる。受容体特異性は、さらに、細胞へのｒｃＰＢ５の結合を妨げるために、標的受容体に特異的な抗体およびペプチドを用いて通常の方法により調べられる。内部移行は、例えば、上述のWickham et al．(1993)によって先に記載されているように、ｒｃＰＢタンパク質と組換えアデノウイルス、例えば、Ａｄ５ｒｃＰＢを用いて測定される。ファイバータンパク質へのｒｃＰＢの結合は、該ペントンベース分子に対する抗体を介してプロテインＡで被覆したビーズに連結した時に、放射性標識されたファイバー分子を沈殿させる能力により調べられる。あるいは、ファイバーの結合は、通常の方法で、ｒｃＰＢをＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、次いで固定化したｒｃＰＢを可溶性ファイバー分子とインキュベートするというＥＬＩＳＡに基づくアッセイによって調べられる。ｒｃＰＢタンパク質へのファイバーの結合は、通常の方法により、さらにファイバー分子に特異的な抗体とともにインキュベートすることによって調べられる。ウイルスの侵入および遺伝子発現は、まず、目的のインサートを含むｐＡＴベクターを用いて、キメラペントンベースタンパク質およびβ−グルクロニダーゼのようなマーカー遺伝子を発現する組換えウイルスを生じさせることにより評価される。β−グルクロニダーゼ遺伝子を含むアデノウイルス（Ａｄ−Ｇｌｕｃ）に感染した細胞におけるβ −グルクロニダーゼの発現は、細胞へのＡｄ−Ｇｌｕｃの添加後２時間ほどの早さで検出することができる。この手法は組換えウイルスの細胞侵入および遺伝子発現の迅速かつ効率的な分析を提供し、通常の技術を用いて当業者により容易に実施されるものである。ペントンベースタンパク質中にＲＧＤアミノ酸配列のような野生型の受容体に結合する配列を欠如する組換えウイルスは、以前に記述された技術を用いて（Ba i et al．(1993),上述）、ＲＧＤ配列を欠く組換えアデノウイルス粒子を複製することができることがわかっているヒト胚細胞株２９３（ＨＥＫ２９３）中で産生させることができる。ファイバータンパク質を欠き、ペントンベースがウイルス接着タンパク質と内部移行タンパク質のどちらとしても働く組換えウイルスは、ｒｃＰＢ５タンパク質がターゲッティングされる受容体を発現する細胞株中で産生させることができる。例えば、α_Vβ₃に特異的なインサートを含むＡｄ５ｒｃＰＢ５は、α_Vβ₃を発現するＨｅＬａ細胞またはα_Vβ₃の遺伝子でトランスフェクションされた２９３細胞中で産生させることができる。キメラペントンベースタンパク質は、ファイバーを有するウイルス粒子中に存在しても、ファイバーを有しないウイルス粒子中に存在してもよく（この場合、ｒｃＰＢタンパク質はウイルス接着タンパク質と内部移行タンパク質として働く）、また、細胞特異的もしくは組織特異的受容体のような受容体に特異的な組換えファイバー分子を有するウイルス粒子中に存在しても、あるいは細胞特異的もしくは組織特異的受容体のような受容体に特異的な組換えコートタンパク質を有するウイルス粒子中に存在してもよい。本発明のこれらの態様に関するさらなる記述については実施例４〜９を参照されたい。本発明の組換えアデノウイルスは、矯正ＤＮＡ、すなわち、欠損するか損なわれた機能をコードするＤＮＡ、または、例えば、細胞内でのみ活性のある細胞毒素をコードするＤＮＡのような慎重な殺傷剤、または、例えば、リボザイムやアンチセンス分子をコードするＤＮＡを標的細胞に送達することにより数多くの疾患のいずれかを治療するのに使用することができる。したがって、「治療遺伝子」なる術語の使用は、これらおよび遺伝子治療としてより一般的に言われ、当業者に知られている他の態様を包含する。このような治療の対象となり得る疾患としては、例えば、黒色腫や膠腫のような癌、嚢胞性線維症、遺伝病、およびＨＩＶ感染を含む病原性の感染が含まれる。例えば、α_V β₃受容体により認識されるペントンベース分子を有する組換えアデノウイルスは、黒色腫または膠腫の治療に用いることができ、また、α₃β₁受容体により認識され、嚢胞性線維症膜貫通型調節物質（ＣＦＴＲ）遺伝子を発現する組換えアデノウイルスは、肺上皮細胞への送達によって嚢胞性線維症の治療に用いることができる。さらに、種々の血液関連疾患は、好中球およびマクロファージをターゲッティングするためのα_mβ₂受容体により認識される組換えアデノウイルス、リンパ球をターゲッティングするためのα₄β₁受容体により認識される組換えアデノウイルス、血小板および巨核球をターゲッティングするためのα_IIbβ₃受容体により認識される組換えアデノウイルス、並びに血管形成中の内皮細胞をターゲッティングするためのα_Vβ₃インテグリンにより認識される組換えアデノウイルスを用いることによって治療することができる。当業者には、本発明の組換えアデノウイルスを遺伝子治療（例えば、Rosenfel d et al.，Science，252，431-434(1991); Jaffe et al.，Clin．Res.，39(2)， 302A(1991); Rosenfeld et al.，Clin．Res.，39(2)，311A(1991); Berkner，Bi oTechniques，6，616-629（1988）を参照）、化学療法および予防接種の目的で動物に投与するのに適当な方法がを用いることができ、１つ以上の経路がこのような組換えアデノウイルスを投与するのに使用することができるが、ある特定の経路が、他の経路よりもより迅速でより効果的な反応を提供し得ることがわかるであろう。医薬上許容され得る賦形剤もまた当業者によく知られており、容易に入手可能である。賦形剤の選択は組換えアデノウイルスの投与に使用される特定の方法によって部分的に決定されるであろう。したがって、本発明における使用には、非常に多様な好適な製剤がある。以下の方法および賦形剤は単なる例示であって何ら限定するものではない。経口投与に好適な製剤は、(a)液剤、例えば、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈剤に溶解された有効量の化合物、(b)それぞれ予め決められた量の有効成分を固形剤または顆粒剤として含むカプセル剤、サシェイ剤または錠剤、(c)適当な液体中の懸濁液剤、および(d)適当な乳液剤からなり得る。錠剤型は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、微晶質セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド性二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、着香剤、並びに薬理学上適合性の賦形剤の内の１つまたはそれ以上を含み得る。トローチ剤型は、有効成分を香味成分、通常はシュクロースおよびアカシアまたはトラガカントゴム中に含み得るし、また、香錠剤は有効成分をゼラチンおよびグリセリン、またはシュクロースおよびアカシアのような不活性な基剤中に含み、乳化剤、ゲル剤などは有効成分に加えて、当技術分野において知られているような賦形剤を含有する。本発明の組換えアデノウイルスは単独で、あるいは他の適当な成分と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることができる。このようなエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容される推進ガス中におくことができる。それらはまた、ネブライザー噴霧器やアトマイザー噴霧器中のような非加圧製剤用の医薬として製剤化され得る。非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および意図する受容者の血液と製剤を等張にする溶質を含み得る水性および非水性の等張滅菌注射溶液剤、並びに懸濁化剤、溶解補助剤、贈粘剤、安定化剤および保存剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液剤が挙げられる。当該製剤はアンプルやバイアルのような単位投与量または複数回投与量を封入した容器で提供され、注射用に、使用直前に滅菌した液状賦形剤、例えば水を添加すればよいだけのフリーズドライ（凍結乾燥）された状態で保存することができる。即席の注射溶液剤および懸濁液剤は、以前に記述した種類の滅菌した散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。さらに、本発明の組換えアデノウイルスは、乳化用基剤や水溶性基剤のような種々の基剤と混合することにより坐薬としてもよい。膣投与に適した製剤は、有効成分に加えて当技術分野において適当であると知られているような担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレー剤として提供され得る。目的の遺伝子、使用される組成物、投与方法および治療される特定部位および生物によるが、投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。本発明の組換えアデノウイルスに加えて、アデノウイルス運搬ベクターはまたインビトロでの有用性を有する。それは、アデノウイルスの細胞接着および細胞感染の研究における研究手段として、また、受容体−リガンド相互作用の測定方法に使用することができる。同様に、野生型の受容体結合配列、好ましくはＲＧＤ配列に加えて、あるいはそれの代わりに、非ペントンベースアミノ酸配列を含む組換えペントンベースタンパク質は、例えば、受容体−リガンドアッセイに、また、インビトロまたはインビボでの接着タンパク質として使用することができる。以下の実施例により本発明をさらに説明するが、もちろん、これらは本発明の範囲を何ら限定するように構成されたものではない。実施例１本実施例では、キメラペントンベース分子を作製するためのアデノウイルス運搬ベクター（ｐＡＴ）の構築について述べる。ｐＡＴ（その部分的な制限地図が図１に示してある）をＡｄ５ゲノム由来のユニークなBam HI/Pme I断片（１３２５９−２１５６１）をｐＮＥＢ１９３（New England Biolabs、ベバリー、マサチューセッツ州）の副次的な派生体であるｐＮＥＢ１９３Ｒ１−にクローニングすることにより作製し、そこから唯一のEco RI制限部位を除去した（配列表配列番号５）。得られたベクターをｐＮＥＢ１９３Ｒ１−［Ａｄ５（Bam HI/Pme I）］と命名した。２組のＰＣＲプライマーを合成し、ＲＧＤ配列から上流の領域（左側）および下流の領域（右側）を増幅させる為に用いた。唯一のSpe I部位を、ＲＧＤ配列とBst XI部位（１５０１７）との間の上流領域を増幅させるために用いられるアンチセンスプライマー（Ａ５ａ（１５１４７）Ｓ、配列表配列番号１４）に挿入した。Bst XI 部位はペントンベースの開始コドン（１５０５２）から３５ｂｐ上流にある。唯一のSpe I部位をまた、ＲＧＤアミノ酸配列とAsc I部位（１５６７１）との間の遺伝子の右側を増幅させるために、センスプライマー（Ａ５ａ（１５２０４）Ｓ、配列表配列番号１３）に挿入した。遺伝子の右側を増幅させる為に用いたアンチセンスプライマー（Ａ５ａ（１５６５９））は配列表配列番号１２に示している。遺伝子の左側の為のセンスプライマー（Ａ５ａ（１４１５３）Ｅ、配列表配列番号１１）は天然のBst XI 部位（１５０１７）を含有し、また、ペントンベース開始コドンから１３ｂｐ上流に唯一のEco RI部位（元来の配列中にはない）を有している。これらのプライマーを用いてペントンベース遺伝子の左および右側を増幅し、ｐＮＥＢ１９３Ｒ１’［Ａｄ５（Bam HI/Pme I）］にクローニングしてｐＡＴベクターを作製した。このクローニングの正味の結果として、バキュロウイルス運搬ベクターへのサブクローニングを容易にし、また、ｐＡＴベクターを用いた組換えアデノウイルスの製造を容易にするための唯一のEco RI部位が、ペントンベース開始コドン（配列表配列番号３）のすぐ上流に生じ、野生型ペントンベース内のα_vインテグリン結合ドメインを含んでいる８アミノ酸領域（配列表配列番号９）が欠失し、そして受容体結合アミノ酸モチーフまたは他のアミノ酸配列をコードする代わりのＤＮＡ配列がその部位に挿入され得るように、アミノ酸、すなわちスレオニンおよびセリンをコードする唯一のSpe I部位が、該欠失した領域（配列表配列番号７）の代わりに組み込まれた。実施例２本実施例では、組換えキメラＡｄ５ペントンベースタンパク質（ｒｃＰＢ５タンパク質）を発現させ、ｐＡＴや他の関連するベクターへ組み込むためのｒｃＰＢ５遺伝子を作製するための組換えバキュロウイルスを作製するのに用いられる、全てのクローニングの基礎となるベクターｐＲｃＰＢ５（△ＲＧＤ）の構築について述べる。ｐＲｃＰＢ５（△ＲＧＤ）（その部分的な制限地図が図２に示してある）をｐＡＴ由来のEco RI/Bgl II 断片をバキュロウイルス運搬ベクターｐＡｃＳＧ２（ Pharmingen、サンディエゴ、カリフォルニア州）にクローニングすることにより作製した。受容体結合ドメインをコードする新しい配列をｐＲｃＰＢ５（△ＲＧＤ）のペントンベース遺伝子中の唯一のSpe I部位に挿入する。得られたベクターは、次いで、ｒｃＰＢ５タンパク質を大量に生成させ評価することができるように、組換えバキュロウイルス構築物を創製するのに用いられる。該組換えタンパク質の評価に基づいて、ｐＲｃＰＢ５派生物由来のEco RI/Bgl II 断片をｐＡＴにクローニングして組換えアデノウイルス（Ａｄ５ｒｃＰＢ）を作製する。実施例３本実施例では、実施例２のｐＲｃＰＢ５（△ＲＧＤ）ベクターのSpe I部位へのインテグリン配列のクローニングについて述べる。特定のインテグリン受容体によって認識される配列を以下のようにしてペントンベースカセットにクローニングする。所望のインテグリン特異的な配列をコードする重複したセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成する。例えば、インテグリンα_Vβ₃に特異的な配列（配列表配列番号１５）をコードする重複したセンス（ベータ、３ＲＧＤｓ、配列表配列番号１７）およびアンチセンス（ベータ、３ＲＧＤａ、配列表配列番号１８）オリゴクレオチド、ならびにインテグリンα₄β₁に特異的な配列をコードする重複したセンス（ＣＳ−１ｓ、配列表配列番号２１）およびアンチセンス（ＣＳ−１ａ、配列表配列番号２２）オリゴクレオチドを合成する。センスおよびアンチセンス配列をそれぞれについて混合し、対になっていないヌクレオチドをクレノウ断片で埋めることによって全長の二本鎖に変換する。得られた二本鎖配列をｐＲｃＰＢ５（△ＲＧＤ）ベクターのSpe I部位へ挿入し、次いでエンドヌクレオチドXba IおよびSpe Iで消化する。得られたベクター、すなわちｐＲｃＰＢ５（α_Vβ₃）およびｐＲｃＰＢ５（α₄ β₁）を用いて、組換えバキュロウイルスベクターであるＡｃＮＰＶｒｃＰＢ５（α_Vβ₃）およびＡｃＮＰＶｒｃＰＢ５（α₄β₁）を作製する。ｒｃＰＢ５タンパク質は昆虫組換えバキュロウイルスベクター、ＡｃＮＰＶｒｃＰＢ５（ α_Vβ₃）およびＡｃＮＰＶｒｃＰＢ５（α₄β₁）で産生される。前述のバキュロウイルスベクターを用いて、昆虫細胞内で産生されたｒｃＰＢ５タンパク質は上述のようにして評価する。バキュロウイルス発現系における解析に基づいて、各々のベクター由来のEco RI/Bgl II 断片をｐＡＴベクターにクローニングして、アデノウイルスベクターであるｐＡＴｒｃＰＢ５（α_Vβ₃）およびｐＡＴｒｃＰＢ５（α₄β₁）を製造する。実施例４本実施例では、野生型のファイバータンパク質、およびα₄インテグリン類に特異的なキメラペントンベースを有する組換えアデノウイルス粒子（Ａｄ５ｒｃＰＢ５（α₄）：ｗｔＦｉｂｅｒ）の作製について説明する。 α₄インテグリンに特異的なキメラペントンベース（Ａｄ５ｒｃＰＢ５（α₄）：ｗｔＦｉｂｅｒ）はプラスミドＤＮＡとウイルスＤＮＡの連結によって構築することができ、該キメラ構築物は常法を用いて細胞にトランスフェクトすることができる。ペントンベースの所望のキメラ形態を有するｐＡＴベクターをXmn I で消化して、受容体特異的なコーディング配列を有する１ｋｂ断片のＤＮＡを調製する。Ａｄ５ＤＮＡを、Ａｄ５ゲノム内の１４５６１および１５７１０の位置で野生型Ａｄ５を切断する制限エンドヌクレアーゼXmn Iで消化する。ＲＧＤをコードしている配列を有するより小さな１ｋｂの断片から、２つの大きな断片を精製除去し、ｐＡＴベクター由来のXmn I断片と連結させる。そして、連結させた断片を、組換えウイルスを産生させるために適当な細胞系にトランスフェクトする。細胞から産生されたウイルスはプラーク精製され、ＰＣＲを用いてキメラペントンベースを含んでいることを確認することができる。Ａｄ５感染細胞で産生されるペントンベースもまた精製し、その受容体特異性を確認することができる。実施例５本実施例では、野生型のファイバータンパク質、およびα₄インテグリン類に特異的なキメラペントンベースを有する組換えアデノウイルス粒子（Ａｄ５ｒｃＰＢ５（α₄）：ｗｔＦｉｂｅｒ）の調製について説明する。 α₄インテグリン類に特異的なキメラペントンベースを保持するアデノウイルス粒子（Ａｄ５ｒｃＰＢ５（α₄）：ｗｔＦｉｂｅｒ）はプラスミドＤＮＡとウイルスＤＮＡの細胞へのトランスフェクションおよび相同組換えによる組換え体の作製によって構築することができる。ペントンベースの所望のキメラ形態を有するｐＡＴベクターを、Bam HI で消化することにより線状化する。Ａｄ５ＤＮＡを、Ａｄ５ゲノム内の１４５６１および１５７１０の位置で野生型Ａｄ５を切断する制限エンドヌクレアーゼXmn Iで消化する。Ａｄ５ゲノム内の、これら２つのユニークな部位はｐＡＴベクター内のSpe I部位に隣り合っている。線状化されたｐＡＴベクターおよびXmn Iで消化されたＡｄ５ＤＮＡを、２９３細胞等の適当な細胞にトランスフェクションして、相同組換えにより組換えウイルスを製造する。該細胞から産生されたウイルスはプラーク精製され、ＰＣＲを用いてキメラペントンベースを含んでいることを確認することができる。Ａｄ５感染細胞で産生されたペントンベースもまた精製し、その受容体特異性を確認することができる。実施例６本実施例では、ファイバータンパク質およびα₄インテグリン類に特異的なキメラペントンベースを欠いている組換えアデノウイルス粒子（Ａｄ５ｒｃＰＢ５（α₄）：−Ｆｉｂｅｒ）の調製について説明する。Ａｄ５ｒｃＰＢ５（α₄）：ｗｔＦｉｂｅｒウイルスＤＮＡはBam HI で消化して、０−５９マップ単位（ｍ．ｕ．）断片を精製することができる。ファイバー遺伝子は、Ａｄ５ Bam HI/Sal I断片（ゲノムマップ単位５９−１００）を有するプラスミドから欠失させることができる。次いで、得られたプラスミドをBa m HI およびSal Iで消化し、Ａｄ５ｒｃＰＢ５（α₄）：ｗｔＦｉｂｅｒＤＮＡの０−５９ｍ．ｕ．断片と連結させ、α₄インテグリン類を発現している細胞にトランスフェクトする。α₄インテグリン類はＡｄ５ｒｃＰＢ５（α₄）：− Ｆｉｂｅｒウイルスに対して、接着および内部移行の両方の受容体として働き得る。実施例７本実施例では、ファイバータンパク質を欠き、モノクローナル抗体によって認識されるエピトープ（抗体特異的な配列）を有するキメラペントンベースを含む組換えアデノウイルス粒子の作製について説明する。ウイルスＤＮＡを実施例６のようにしてファイバーを欠いているＡｄ５ウイルスより単離し、エンドヌクレアーゼXmn Iで実施例５のようにして消化する。抗体特異的なエピトープをコードする配列を含むキメラペントンベース遺伝子を含有しているｐＡＴベクターを実施例５のようにして調製する。消化したウイルスおよびｐＡＴＤＮＡを２９３細胞にトランスフェクトして、相同組換えによりウイルスを産生させる。細胞溶解物をａｖインテグリン類（２９３細胞で発現、内在化されている）およびキメラペントンベース上の抗体特異的なエピトープの両方に特異性を有する抗体とインキュベートし、それによって組換えウイルスを２９３細胞に接着させ感染させることにより、組換えウイルスを継代し、増幅させる。感染細胞由来からのウイルス子孫は、該二重特異的な抗体を欠いているので、感染細胞からのそれらの精製に続いて、キメラペントンベース内の抗体特異的なエピトープおよびＨＩＶｇｐ１２０の両方を特異的に認識する二重特異的抗体とそれらを組み合わせることにより、それらをＨＩＶ感染細胞にターゲッティングすることができる。実施例８本実施例では、シアリルルイスＸ抗原に特異的なキメラファイバータンパク質およびα₄インテグリン類に特異的なキメラペントンベースを有する組換えアデノウイルス粒子［Ａｄ５ｒｃＰＢ５（α₄）：ｒｄＦｉｂｅｒ（ｓＬＸ）］の作製について説明する。タンパク質ｐ−セレクチンは、リンパ球上に存在するシアリルルイスＸ抗原に結合する。ｐ−セレクチン由来の結合ドメインは、ウイルスの結合を仲介するために、ｒｃＦｉｂｅｒ（ｓＬＸ）タンパク質上に存在する。Ａｄ５ｒｃＰＢ５（ α₄）：ｗｔＦｉｂｅｒウイルスの左アーム（０−５９ｍ．ｕ．）はBam HI 消化によって調製、ついで精製することができる。ｒｃＦｉｂｅｒ（ｓＬＸ）遺伝子は、Ａｄ５ゲノムの５９−１００ｍ．ｕ．断片を含んでいるプラスミドにクローニングすることができる。ついで、ｒｃＦｉｂｅｒ（ｓＬＸ）遺伝子はｗｔＦｉｂｅｒ遺伝子にとって代わることができる。ｒｃＦｉｂｅｒ（ｓＬＸ）を有している５９−１００ｍ．ｕ．Ａｄ５断片をｒｃＰＢ５（α₄）を有する０−５９ｍ．ｕ．Ａｄ５断片と連結させることができる。連結した断片は、キメラウイルスＡｄ５ｒｃＰＢ５（α₄）：ｒｃＦｉｂｅｒ（ｓＬＸ）の接着のための受容体（シアリルルイスＸ）および内部移行のための受容体（α₄インテグリン類）を発現している細胞にトランスフェクトすることができる。実施例９本実施例では、シアリルルイスＸ抗原に特異的なキメラヘキソンタンパク質、 α₄インテグリン類に特異的なキメラペントンベースを有し、ファイバータンパク質を欠いている組換えアデノウイルス粒子［Ａｄ５ｒｃＰＢ５（α₄）：−Ｆｉｂｅｒ：ｒｃＨｅｘｏｎ（ｓＬＸ）］の作製について説明する。タンパク質ｐ−セレクチンは、リンパ球上に存在するシアリルルイスＸ抗原に結合する。ｐ−セレクチン由来の結合ドメインは、ｗｔＨｅｘｏｎ上の露出されたループ内に存在するので、結果として得られるｒｃＨｅｘｏｎ（ｓＬＸ）タンパク質はウイルスの結合を仲介することができる。ｒｃＰＢ５（α₄）およびｒｃＨｅｘｏｎ（ｓＬＸ）をコードする遺伝子を、ペントンベース遺伝子およびヘキソンタンパク質の露出したループをコードする領域を含むｐＡＴベクターにクローニングすることができる。３つの断片の連結を行い、組換えウイルスを調製することができる。Ａｄ５ｒｃＰＢ５（α₄）：−ＦｉｂｅｒウイルスをEco RI およびBam HI で消化してもよい。上流に向かってEco RI 部位までのゲノムの左端および下流に向かってBam HI 部位までのゲノムの右端を精製し、ｒｃＰＢ５（α₄）およびｒｃＨｅｘｏｎ（ｓＬＸ）を含むｐＡＴベクター由来のEco RI／B am HI 断片と連結させることができる。ついで、キメラウイルスＡｄ５ｒｃＰＢ５（α₄）：ｒｃＦｉｂｅｒ（ｓＬＸ）の接着のための受容体（シアリルルイスＸ）および内部移行のための受容体（α₄インテグリン類）を発現している細胞に該連結した断片をトランスフェクトすることができる。実施例１０本実施例では、バキュロウイルス中での、野生型Ａｄ５および変異ｒｃＰＢ５（△ＲＧＤ）ペントンベースタンパク質の発現について述べる。ＰＣＲを用いて、遺伝子の５’末端に挿入されたEco RI 部位で野生型Ａｄ５ペントンベースの配列を増幅した。当分野で公知の方法によって、この遺伝子をｐＡＴベクターにクローニングし、ｐＡｃＳＧ２バキュロウイルス運搬ベクターにサブクローニングした。Ａｄ５ペントンベース遺伝子（ＡｃＮＰＶｗｔＰＢ５）をコードしている組換えバキュロウイルスは、昆虫細胞中で、全細胞タンパク質のおよそ５０％を構成する程度のペントンベースを産生した。精製したｗｔＰＢ５タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、その既知の分子量に一致して移動し、そしてＡｄ２ペントンベースのように細胞接着を仲介することができる（Wick ham et al．(1993)，上述）。バキュロウイルス発現系におけるｒｃＰＢ５タンパク質発現用の、コアバキュロウイルス運搬ベクターであるｐＲｃＰＢ５（△ＲＧＤ）が、ｒｃＰＢ５タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスをつくるために用いられている。このｒｃＰＢ５タンパク質であるｒｃＰＢ５（△ＲＧＤ）は、ベクターｐＲｃＰＢ５（ △ＲＧＤ）の部分的な制限地図である図２に示す様に、ＲＧＤ領域に８アミノ酸の欠失を有している。このタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、その既知の分子量に一致して移動し、野生型のタンパク質（ｗｔＰＢ５）とは対照的に、細胞接着を仲介せず、このことは、ＲＧＤという細胞接着のモチーフを欠いていることと合致している。α_Vβ₃およびα₄インテグリン類に特異的なインサートをそれぞれ含む、キメラ組換えペントンベース分子であるｒｃＰＢ５（α_Vβ₃）およびｒｃＰＢ５（α₄）もまた、コアバキュロウイルス運搬ベクターであるｐＲｃＰＢ５（△ＲＧＤ）を介してそれぞれ産生される。ｒｃＰＢ５（α_Vβ₃）タンパク質は上皮細胞（α_V ⁺、α₄ ^-）の接着は仲介するが、リンパ球（α_V ^-、α₄ ⁺）の接着は仲介しない。対照的にＲｃＰＢ５（α₄）はリンパ球の接着は支援するが、上皮細胞の接着は支援しない。実施例１１本実施例では、アデノウイルスのリンパ球へのターゲッティングについて説明する。運搬ベクターｐＡＴ（α_Vβ₃）およびｐＡＴ（α₄）を各々のｐＲｃＰＢ５ベクター由来のEco RI／Bgl II 断片をｐＡＴ（△ＲＧＤ）ベクターにクローニングすることにより作製した。これらのｐＡＴベクターをBam HI 消化によって線状化し、Ｅ１およびＥ３領域を欠き、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を含む、Ａｄ５変異体由来の、Xmn Iで消化されたウイルスＤＮＡといっしょにトランスフェクトして、相同組換えにより組換えＡｄ５ウイルスであるＡｄ５ｒｃＰＢ（△ＲＧＤ）、Ａｄ５ｒｃＰＢ（α_Vβ₃ ）およびＡｄ５ｒｃＰＢ（α₄）を得た。Xmn Iエンドヌクレアーゼは野生型のＡｄ５をゲノム内の１４５６１および１５７１０の位置で切断する。一方ｐＡＴベクターに含まれるBam HI/Pme I断片は１３２５８から２１５６２のＡｄ５領域にわたる。つまり、左および右のウイルス配列とBam HI/Pme I断片間で、相同的に重複する領域はそれぞれ１３０３ｂｐおよび５８５１ｂｐである。Ａｄ５ｒｃＰＢ（α_Vβ₃）およびＡｄ５ｒｃＰＢ（α₄）ウイルス内でのキメラインサートの存在は、ＰＣＲによって確認される。野生型Ａｄ５および組換えＡｄ５ｒｃＰＢ（△ＲＧＤ）に関して、組換えアデノウイルスＡｄ５ｒｃＰＢ（α₄）を、各々のウイルスに曝露した細胞内でのレポーター遺伝子の発現の程度を測定することにより、そのターゲティング能力について解析する。Ａｄ５ｒｃＰＢ（△ＲＧＤ）や野生型Ａｄ５ウイルスを用いた時に比べてＡｄ５ｒｃＰＢ（α₄）を用いた時の方が、Ｂリンパ球細胞系であるＲａｍｏｓへの有意に高いβ−ガラクトシダーゼの送達を示した。逆に、β− ガラクトシダーゼの上皮由来細胞系への送達は、Ａｄ５ｒｃＰＢ（α₄）やＡｄ５ｒｃＰＢ（△ＲＧＤ）ウイルスと比較すると、野生型Ａｄ５ウイルスよりも有意に高い。これらの結果は、新しい受容体と相互作用するように該タンパク質を方向づけし直すペントンベースタンパク質における変化が、他の細胞や組織への送達を特に回避する一方で、ウイルスを新しい細胞や組織へターゲッティングすることに利用できることを示している。ここで述べられた全ての刊行物は、ここに言及したことで、引用により組み込まれるべく、個々に、詳細に示され、ここにその全てが明示されたと同程度に、明細書中に組み込まれるものである。本発明は好適な具体例を強調して記載したものであるが、好適な具体例は変更させて良いことは当業者には明白である。ここで詳細に記載された以外の方法で該発明を実行してもよい。従って、本発明は添付の請求項の精神および範囲内に包含される全ての変更を含むものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年８月３０日【補正内容】異性において機能するかもしれない。ＲＧＤを利用しないインテグリンには、それらの特異的リガンド内にある類似の短い直鎖状のアミノ酸部分を結合させるものがあることがわかってきている。例えば、インテグリンα_IIBβ₃はフィブリノーゲン中のアミノ酸配列lys-gln-ala-gly-asp（ＫＱＡＧＤ）［配列番号：１］を介して結合し（Kloczewiak et al.，Biochemistry，23，1767-1774（1984））、一方、α₄β₁はフィブロネクチン中のコア配列glu-ile-leu-asp-val（ＥＩＬＤＶ）［配列番号：２］を介して結合する（Komoriya et al.，J．Biol．Chem. ，266，15075-15079(1991)）。α_Vを含むインテグリンのβサブユニット中に存在する構造モチーフ（すなわち、asn-pro-xaa-tyr（ＮＰＸＹ））が、内部移行のために重要であることが示されている（Suzuki et al.，Proc．Natl．Acad．S ci．USA，87，5354(1990)）。ペントンベース配列はアデノウイルスの血清型の中で非常によく保存されており、５コピーのＲＧＤトリペプチドモチーフを含んでいる（Neumann et al.，Ge ne，69，153-157(1988)）。外部から加えられたＲＧＤペプチドがペントンベースの結合およびアデノウイルスの感染を妨げ得ること（Wickham et al．(1993) ，上述）、また、ペントンベースのＲＧＤ配列に点変異を有するアデノウイルスは細胞に感染する能力を制限されること（Bai et al.，J．Virol.，67，5198-52 05（1993））から、ＲＧＤトリペプチドはα_Vインテグリンへの結合を媒介すると信じられている。アデノウイルスのＡｄ２，Ａｄ５，Ａｄ１２およびＡｄ４０血清型由来のペントンベース遺伝子が配列決定されている。該配列を照合したところ、Ｎ末端、並びに、Ａｄ２，Ａｄ５およびＡｄ１２においてはＲＧＤ配列を含む超可変領域を除いて、配列全体にわたって高度に保存されていることが明らかである。２つの腸内アデノウイルス血清型のうちの１つであるＡｄ４０だけはＲＧＤ配列を持たない。Ａｄ２およびＡｄ５は超可変領域が同一であり、ＲＧＤ配列に隣接するどちらかの側に大きなアミノ酸のインサートを含む。ＲＧＤを含む３つのペントンベースの超可変領域の二次構造解析から、それぞれの場合について、ＲＧＤはα 複したセンス（ベータ、３ＲＧＤｓ、配列表配列番号１７）およびアンチセンス（ベータ、３ＲＧＤａ、配列表配列番号１８）オリゴクレオチド、ならびにインテグリンα₄β₁に特異的な配列をコードする重複したセンス（ＣＳ−１ｓ、配列表配列番号２１）およびアンチセンス（ＣＳ−１ａ、配列表配列番号２２）オリゴクレオチドを合成する。センスおよびアンチセンス配列をそれぞれについて混合し、対になっていないヌクレオチドをクレノウ断片で埋めることによって全長の二本鎖に変換する。得られた二本鎖配列をｐＲｃＰＢ５（△ＲＧＤ）ベクターのSpe I部位へ挿入し、次いでエンドヌクレアーゼXba IおよびSpe Iで消化する。得られたベクター、すなわちｐＲｃＰＢ５（α_Vβ₃）およびｐＲｃＰＢ５（α₄ β₁）を用いて、組換えバキュロウイルスベクターであるＡｃＮＰＶｒｃＰＢ５（α_Vβ₃）およびＡｃＮＰＶｒｃＰＢ５（α₄β₁）を作製する。ｒｃＰＢ５タンパク質は昆虫組換えバキュロウイルスベクター、ＡｃＮＰＶｒｃＰＢ５（ α_Vβ₃）およびＡｃＮＰＶｒｃＰＢ５（α₄β₁）で産生される。前述のバキュロウイルスベクターを用いて、昆虫細胞内で産生されたｒｃＰＢ５タンパク質は上述のようにして評価する。バキュロウイルス発現系における解析に基づいて、各々のベクター由来のEco RI/Bgl II 断片をｐＡＴベクターにクローニングして、アデノウイルスベクターであるｐＡＴｒｃＰＢ５（α_Vβ₃）およびｐＡＴｒｃＰＢ５（α₄β₁）を製造する。実施例４本実施例では、野生型のファイバータンパク質、およびα₄インテグリン類に特異的なキメラペントンベースを有する組換えアデノウイルス粒子（Ａｄ５ｒｃＰＢ５（α₄）：ｗｔＦｉｂｅｒ）の作製について説明する。 α₄インテグリンに特異的なキメラペントンベース（Ａｄ５ｒｃＰＢ５（α₄）：ｗｔＦｉｂｅｒ）はプラスミドＤＮＡとウイルスＤＮＡの連結によって構築することができ、該キメラ構築物は常法を用いて細胞にトランスフェクトすることができる。ペントンベースの所望のキメラ形態を有するｐＡＴベクターをXmn I 在化されている）およびキメラペントンベース上の抗体特異的なエピトープの両方に特異性を有する抗体とインキュベートし、それによって組換えウイルスを２９３細胞に接着させ感染させることにより、組換えウイルスを継代し、増幅させる。感染細胞由来からのウイルス子孫は、該二重特異的な抗体を欠いているので、感染細胞からのそれらの精製に続いて、キメラペントンベース内の抗体特異的なエピトープおよびＨＩＶｇｐ１２０の両方を特異的に認識する二重特異的抗体とそれらを組み合わせることにより、それらをＨＩＶ感染細胞にターゲッティングすることができる。実施例８本実施例では、シアリルルイスＸ抗原に特異的なキメラファイバータンパク質およびα₄インテグリン類に特異的なキメラペントンベースを有する組換えアデノウイルス粒子［Ａｄ５ｒｃＰＢ５（α₄）：ｒｃＦｉｂｅｒ（ｓＬＸ）］の作製について説明する。タンパク質ｐ−セレクチンは、リンパ球上に存在するシアリルルイスＸ抗原に結合する。ｐ−セレクチン由来の結合ドメインは、ウイルスの結合を仲介するために、ｒｃＦｉｂｅｒ（ｓＬＸ）タンパク質上に存在する。Ａｄ５ｒｃＰＢ５（ α₄）：ｗｔＦｉｂｅｒウイルスの左アーム（０−５９ｍ．ｕ．）はBam HI 消化によって調製、ついで精製することができる。ｒｃＦｉｂｅｒ（ｓＬＸ）遺伝子は、Ａｄ５ゲノムの５９−１００ｍ．ｕ．断片を含んでいるプラスミドにクローニングすることができる。ついで、ｒｃＦｉｂｅｒ（ｓＬＸ）遺伝子はｗｔＦｉｂｅｒ遺伝子にとって代わることができる。ｒｃＦｉｂｅｒ（ｓＬＸ）を有している５９−１００ｍ．ｕ．Ａｄ５断片をｒｃＰＢ５（α₄）を有する０−５９ｍ．ｕ．Ａｄ５断片と連結させることができる。連結した断片は、キメラウイルスＡｄ５ｒｃＰＢ５（α₄）：ｒｃＦｉｂｅｒ（ｓＬＸ）の接着のための受容体（シアリルルイスＸ）および内部移行のための受容体（α₄インテグリン類）を発現している細胞にトランスフェクトすること請求の範囲：１．キメラペントンベースタンパク質を含有する組換えアデノウイルスであって、該キメラペントンベースタンパク質が、野生型ペントンベースアミノ酸配列に加えて、あるいはそれの代わりに、(i)受容体との結合に特異的であるか、(ii) 抗体ドメインであるか、または(iii)エピトープである非ペントンベースアミノ酸配列を含むものである当該アデノウイルス。２．該野生型ペントンベースアミノ酸配列がＲＧＤアミノ酸配列である請求の範囲１の組換えアデノウイルス。３．該組換えアデノウイルスがファイバー欠損である請求の範囲１の組換えアデノウイルス。４．キメラペントンベースタンパク質に加えて、さらに、(i)受容体との結合に特異的であるか、(ii)抗体ドメインであるか、または(iii)エピトープであるアミノ酸配列を含むキメラコートタンパク質を含有する請求の範囲２の組換えアデノウイルス。５．(i)受容体との結合に特異的であるか、(ii)抗体ドメインであるか、または( iii)エピトープである、該キメラコートタンパク質中の該アミノ酸配列が、該キメラペントンベースタンパク質中の非ペントンベースアミノ酸配列と(i)同じ受容体に特異的であるか、(ii)該配列と同じ抗体ドメインであるか、または(iii) 該配列と同じエピトープである請求の範囲４の組換えアデノウイルス。６．該キメラコートタンパク質が、キメラファイバーおよびキメラヘキソンからなる群より選択される請求の範囲４の組換えアデノウイルス。７．(i)受容体との結合に特異的であるか、(ii)抗体ドメインであるか、または( iii)エピトープである、該キメラコートタンパク質中の該アミノ酸配列が、該キメラペントンベースタンパク質中の非ペントンベースアミノ酸配列と(i)同じ受容体に特異的であるか、(ii)該配列と同じ抗体ドメインであるか、または(iii) 該配列と同じエピトープである請求の範囲６の組換えアデノウイルス。８．キメラペントンベースタンパク質をコードするキメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列を含有する組換えバキュロウイルスであって、該キメラペントンベースタンパク質が、(a)(i)受容体との結合に特異的であるか(ii)抗体ドメインであるか、または(iii)エピトープであるアミノ酸配列をコードする非ペントンベース遺伝子配列、および(b)野生型ペントンベース遺伝子配列を含むものである当該バキュロウイルス。９．該野生型ペントンベース遺伝子配列がＲＧＤアミノ酸配列をコードする請求の範囲８の組換えバキュロウイルス。１０．ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が変異した請求の範囲９の組換えバキュロウイルス。１１．ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列内への非ペントンベース遺伝子配列の挿入によって変異した請求の範囲１０の組換えバキュロウイルス。１２．キメラペントンベースタンパク質中で、ＲＧＤアミノ酸配列が配座的に受容体と結合できないように、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列がペントンベース遺伝子配列内を移動させられた請求の範囲９の組換えバキュロウイルス。１３．ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列の近傍への非ペントンベース遺伝子配列の挿入によって、ペントンベース遺伝子配列内を移動させられた請求の範囲１２の組換えバキュロウイルス。１４．キメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列を含有する組換えバキュロウイルスであって、該キメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列が、野生型ペントンベース遺伝子配列の代わりに、(i)受容体との結合に特異的であるか、(ii)抗体ドメインであるか、または(iii)エピトープであるアミノ酸配列をコードする非ペントンベース遺伝子配列を含むものである当該バキュロウイルス。１５．該野生型ペントンベース遺伝子配列がＲＧＤアミノ酸配列をコードする請求の範囲１４の組換えバキュロウイルス。１６．野生型ペントンベースアミノ酸配列に加えて、あるいはそれの代わりに、 (i)受容体との結合に特異的であるか、(ii)抗体ドメインであるか、または(iii) エピトープである非ペントンベースアミノ酸配列を含有するキメラアデノウイルスペントンベースタンパク質。１７．該野生型ペントンベースアミノ酸配列がＲＧＤアミノ酸配列である請求の範囲１６のキメラアデノウイルスペントンベースタンパク質。１８．キメラペントンベースタンパク質をコードするキメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列を含有するウイルス運搬ベクターであって、該キメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列が、野生型ペントンベース遺伝子配列に加えて、あるいはそれの代わりに、(i)受容体との結合に特異的であるか、(ii)抗体ドメインであるか、または(iii)エピトープであるアミノ酸配列をコードする非ペントンベース遺伝子配列を含むものである当該ベクター。１９．該ウイルス運搬ベクターがアデノウイルス運搬ベクターである請求の範囲１８のウイルス運搬ベクター。２０．該野生型ペントンベース遺伝子配列がＲＧＤアミノ酸配列をコードする請求の範囲１９のウイルス運搬ベクター。２１．ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が変異した請求の範囲２０のウイルス運搬ベクター。２２．ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列内への非ペントンベース遺伝子配列の挿入によって変異した請求の範囲２１のウイルス運搬ベクター。２３．キメラペントンベースタンパク質中で、ＲＧＤアミノ酸配列が配座的に受容体と結合できないように、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列がペントンベース遺伝子配列内を移動させられた請求の範囲２０のウイルス運搬ベクター。２４．ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列の近傍への非ペントンベース遺伝子配列の挿入によって、ペントンベース遺伝子配列内を移動させられた請求の範囲２３のウイルス運搬ベクター。２５．キメラペントンベースタンパク質をコードするキメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列を含有する原核または真核生物の発現ベクターであって、該キメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列が、野生型ペントンベース遺伝子配列に加えて、あるいはそれの代わりに、(i)受容体との結合に特異的であるか、(ii)抗体ドメインであるか、または(iii)エピトープであるアミノ酸配列をコードする非ペントンベース遺伝子配列を含むものである当該ベクター。２６．該野生型ペントンベース遺伝子配列がＲＧＤアミノ酸配列をコードする請求の範囲２５の原核または真核生物の発現ベクター。２７．ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が変異した請求の範囲２６の原核または真核生物の発現ベクター。２８．ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列内への非ペントンベース遺伝子配列の挿入によって変異した請求の範囲２７の原核または真核生物の発現ベクター。２９．キメラペントンベースタンパク質中で、ＲＧＤアミノ酸配列が配座的受容体と結合できないように、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列がペントンベース遺伝子配列内を移動させられた請求の範囲２６の原核または真核生物の発現ベクター。３０．ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列の近傍への非ペントンベース遺伝子配列の挿入によって、ペントンベース遺伝子配列内を移動させられた請求の範囲２９の原核または真核生物の発現ベクター。３１．請求の範囲１〜７のいずれかの組換えアデノウイルスであって、さらに、該組換えアデノウイルスが接着または内部移行した細胞内で発現し得る治療遺伝子を含む当該アデノウイルス。３２．該野生型ペントンベースアミノ酸配列が、受容体との結合に特異的なものである請求の範囲２の組換えアデノウイルス。３３．該野生型ペントンベース遺伝子配列が、受容体との結合に特異的なアミノ酸配列をコードする請求の範囲８の組換えバキュロウイルス。３４．該野生型ペントンベース遺伝子配列が、受容体との結合に特異的なアミノ酸配列をコードする請求の範囲１４の組換えバキュロウイルス。３５．該野生型ペントンベースアミノ酸配列が、受容体との結合に特異的なものである請求の範囲１６の組換えバキュロウイルス。３６．該野生型ペントンベース遺伝子配列が、受容体との結合に特異的なアミノ酸配列をコードする請求の範囲１８のウイルス運搬ベクター。３７．該野生型ペントンベース遺伝子配列が、受容体との結合に特異的なアミノ酸配列をコードする請求の範囲２５の原核または真核生物の発現ベクター。３８．遺伝子治療を必要とする患者に、請求の範囲１〜７、３１および３２のいずれかの組換えアデノウイルスを、治療上有効な量投与することを含む遺伝子治療方法。３９．医薬の調製への使用のための請求の範囲１〜７、３１および３２のいずれかの組換えアデノウイルス。【図１】【図２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ブロー、ダグラスイー. アメリカ合衆国、メリーランド州 20832、オルネイ、シャロウブルックレーン、 3900 (72)発明者マクヴェイ、ダンカンエル. アメリカ合衆国、メリーランド州 20855、ダーウッド、マンキャスターミルロード、6016 (72)発明者ブルーダー、ジョセフティー. アメリカ合衆国、メリーランド州 20879、ゲイダーズバーグ、リンドスコート、 20423

Claims

【特許請求の範囲】１．(a)キメラペントンベースタンパク質および(b)治療遺伝子を含有する組換えアデノウイルスであって、該キメラペントンベースタンパク質が、受容体との結合に特異的な野生型ペントンベースアミノ酸配列に加えて、あるいはそれの代わりに、受容体との結合に特異的であるか、受容体特異的抗体ドメインであるか、またはエピトープである非ペントンベースアミノ酸配列を含み、また、該治療遺伝子が、該組換えアデノウイルスが接着するか、あるいは内部移行された細胞内で発現し得るものである当該アデノウイルス。２．該野生型ペントンベースアミノ酸配列が、ＲＧＤアミノ酸配列である請求の範囲１の組換えアデノウイルス。３．該組換えアデノウイルスがファイバーを有しない請求の範囲２の組換えアデノウイルス。４．該キメラペントンベースタンパク質に加えて、さらに、受容体との結合に特異的であるか、受容体特異的抗体ドメインであるか、またはエピトープであるアミノ酸配列を含むキメラコートタンパク質を含有する請求の範囲２の組換えアデノウイルス。５．該キメラコートタンパク質中の、受容体との結合に特異的であるか、受容体特異的抗体ドメインであるか、またはエピトープである該アミノ酸配列が、該キメラペントンベースタンパク質中の非ペントンベースアミノ酸配列と同じ受容体、抗体ドメイン、またはエピトープとの結合に特異的なものである請求の範囲４の組換えアデノウイルス。６．該キメラコートタンパク質が、キメラファイバーおよびキメラヘキソンからなる群より選択される請求の範囲４の組換えアデノウイルス。７．該キメラコートタンパク質中の、受容体との結合に特異的であるか、受容体特異的抗体ドメインであるか、またはエピトープである該アミノ酸配列が、該キメラペントンベースタンパク質中の非ペントンベースアミノ酸配列と同じ受容体、抗体ドメイン、またはエピトープとの結合に特異的なものである請求の範囲６の組換えアデノウイルス。８．キメラペントンベースタンパク質をコードするキメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列を含有する組換えバキュロウイルスであって、キメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列が、(a)受容体との結合に特異的であるか、受容体特異的抗体ドメインであるか、またはエピトープであるアミノ酸配列をコードする非ペントンベース遺伝子配列および(b)受容体との結合に特異的なアミノ酸配列をコードする野生型ペントンベース遺伝子配列を含む当該バキュロウイルス。９．該野生型ペントンベース遺伝子配列が、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする請求の範囲８の組換えバキュロウイルス。１０．ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が変異した請求の範囲９の組換えバキュロウイルス。１１．ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列への非ペントンベース遺伝子配列の挿入によって変異した請求の範囲１０の組換えバキュロウイルス。１２．キメラペントンベースタンパク質中で、ＲＧＤアミノ酸配列が配座的に受容体と結合できないように、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列がペントンベース遺伝子配列内を移動させられた請求の範囲９の組換えバキュロウイルス。１３．ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列の近傍への非ペントンベース遺伝子配列の挿入によってペントンベース遺伝子配列内を移動させられた請求の範囲１２の組換えバキュロウイルス。１４．受容体との結合に特異的なアミノ酸配列をコードする野生型ペントンベース遺伝子配列の代わりに、受容体との結合に特異的であるか、受容体特異的抗体ドメインであるか、またはエピトープであるアミノ酸配列をコードする非ペントンベース遺伝子配列を含むキメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列を含有する組換えバキュロウイルス。１５．該野生型ペントンベース遺伝子配列が、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする請求の範囲１４の組換えバキュロウイルス。１６．受容体との結合に特異的な野生型ペントンベースアミノ酸配列に加えて、あるいはそれの代わりに、受容体との結合に特異的であるか、受容体特異的抗体ドメインであるか、またはエピトープである非ペントンベースアミノ酸配列を含むキメラアデノウイルスペントンベースタンパク質。１７．該野生型ペントンベースアミノ酸配列が、ＲＧＤアミノ酸配列である請求の範囲１６のキメラアデノウイルスペントンベースタンパク質。１８．キメラペントンベースタンパク質をコードするキメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列を含有するウイルス運搬ベクターであって、該キメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列が、受容体との結合に特異的なアミノ酸配列をコードする野生型ペントンベース遺伝子配列に加えて、受容体との結合に特異的であるか、受容体特異的抗体ドメインであるか、またはエピトープであるアミノ酸配列をコードする非ペントンベース遺伝子配列を含むものである当該ベクター。１９．該ウイルス運搬ベクターがアデノウイルス運搬ベクターである請求の範囲１８のウイルス運搬ベクター。２０．該野生型ペントンベース遺伝子配列がＲＧＤアミノ酸配列をコードする請求の範囲１９のウイルス運搬ベクター。２１．ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が変異した請求の範囲２０のウイルス運搬ベクター。２２．ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列中への非ペントンベース遺伝子配列の挿入によって変異した請求の範囲２１のウイルス運搬ベクター。２３．キメラペントンベースタンパク質中で、ＲＧＤアミノ酸配列が配座的に受容体と結合できないように、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列がペントンベース遺伝子配列内を移動させられた請求の範囲２０のウイルス運搬ベクター。２４．ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列の近傍への非ペントンベース遺伝子配列の挿入によってペントンベース遺伝子配列内を移動させられた請求の範囲２３のウイルス運搬ベクター。２５．キメラペントンベースタンパク質をコードするキメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列を含有するウイルス運搬ベクターであって、該キメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列が、受容体との結合に特異的なアミノ酸配列をコードする野生型ペントンベース遺伝子配列の代わりに、受容体との結合に特異的であるか、受容体特異的抗体ドメインであるか、またはエピトープであるアミノ酸配列をコードする非ペントンベース遺伝子配列を含むものである当該ベクター。２６．該ウイルス運搬ベクターがアデノウイルス運搬ベクターである請求の範囲２５のウイルス運搬ベクター。２７．該野生型ペントンベース遺伝子配列がＲＧＤアミノ酸配列をコードする請求の範囲２６のウイルス運搬ベクター。２８．キメラペントンベースタンパク質をコードするキメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列を含有する原核または真核生物の発現ベクターであって、該キメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列が、受容体との結合に特異的なアミノ酸配列をコードする野生型ペントンベース遺伝子配列の代わりに、受容体との結合に特異的であるか、受容体特異的抗体ドメインであるか、またはエピトープであるアミノ酸配列をコードする非ペントンベース遺伝子配列を含むものである当該ベクター。２９．該野生型ペントンベース遺伝子配列がＲＧＤアミノ酸配列をコードする請求の範囲２８の原核または真核生物の発現ベクター。３０．キメラペントンベースタンパク質をコードするキメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列を含有する原核または真核生物の発現ベクターであって、該キメラアデノウイルスペントンベース遺伝子配列が、受容体との結合に特異的なアミノ酸配列をコードする野生型ペントンベース遺伝子配列に加えて、受容体との結合に特異的であるか、受容体特異的抗体ドメインであるか、またはエピトープであるアミノ酸配列をコードする非ペントンベース遺伝子配列を含むものである当該ベクター。３１．該野生型ペントンベース遺伝子配列がＲＧＤアミノ酸配列をコードする請求の範囲３０の原核または真核生物の発現ベクター。３２．ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が変異した請求の範囲３１の原核または真核生物の発現ベクター。３３．ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列中への非ペントンベース遺伝子配列の挿入によって変異した請求の範囲３２の原核または真核生物の発現ベクター。３４．キメラペントンベースタンパク質内で、ＲＧＤアミノ酸配列が配座的に受容体と結合できないように、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列がペントンベース遺伝子配列内を移動させられた請求の範囲３１の原核または真核生物の発現ベクター。３５．ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が、ＲＧＤアミノ酸配列をコードする遺伝子配列の近傍への非ペントンベース遺伝子配列の挿入によってペントンベース遺伝子配列内を移動させられた請求の範囲３４の原核または真核生物の発現ベクター。３６．遺伝子治療を必要とする患者に治療上有効な量の請求の範囲１の組換えアデノウイルスを投与することを含む遺伝子治療方法。３７．遺伝子治療を必要とする患者に、請求の範囲２の組換えアデノウイルスを治療上有効な量投与することを含む遺伝子治療方法。３８．遺伝子治療を必要とする患者に、請求の範囲３の組換えアデノウイルスを治療上有効な量投与することを含む遺伝子治療方法。３９．遺伝子治療を必要とする患者に、請求の範囲４の組換えアデノウイルスを治療上有効な量投与することを含む遺伝子治療方法。４０．遺伝子治療を必要とする患者に、請求の範囲５の組換えアデノウイルスを治療上有効な量投与することを含む遺伝子治療方法。４１．遺伝子治療を必要とする患者に、請求の範囲６の組換えアデノウイルスを治療上有効な量投与することを含む遺伝子治療方法。４２．遺伝子治療を必要とする患者に、請求の範囲７の組換えアデノウイルスを治療上有効な量投与することを含む遺伝子治療方法。