JP2020030136A - 目的物質の検出方法 - Google Patents
目的物質の検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020030136A JP2020030136A JP2018156553A JP2018156553A JP2020030136A JP 2020030136 A JP2020030136 A JP 2020030136A JP 2018156553 A JP2018156553 A JP 2018156553A JP 2018156553 A JP2018156553 A JP 2018156553A JP 2020030136 A JP2020030136 A JP 2020030136A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- particles
- target substance
- influenza
- detection
- light
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】磁力を利用する被検体からの目的物質の検出において、複数種の目的物質を検出できる目的物質の検出方法を提供する。
【解決手段】目的物質１２ａ、１２ｂに磁気粒子１４と標識粒子１６ａ、１６ｂとを結合させて、磁力によって結合体２０ａ、２０ｂを移動させることで、目的物質を検出するに際し、異なる目的物質に結合する複数種の標識粒子を用い、複数種の標識粒子が、粒子のサイズが互いに異なる第１条件、および、光の照射によって信号光を生じるものであり信号光が互いに異なる第２条件の、少なくとも一方の条件を満たすことにより、課題を解決する。
【選択図】図１
【解決手段】目的物質１２ａ、１２ｂに磁気粒子１４と標識粒子１６ａ、１６ｂとを結合させて、磁力によって結合体２０ａ、２０ｂを移動させることで、目的物質を検出するに際し、異なる目的物質に結合する複数種の標識粒子を用い、複数種の標識粒子が、粒子のサイズが互いに異なる第１条件、および、光の照射によって信号光を生じるものであり信号光が互いに異なる第２条件の、少なくとも一方の条件を満たすことにより、課題を解決する。
【選択図】図１
Description
本発明は、被検体から細菌等の目的物質を検出する際に利用される目的物質の検出方法に関する。
蛋白質、ウイルスおよび細菌等の微小生物の検出では、目的物質が少量であっても、高い感度で検出ができるのが好ましい。特に、インフルエンザウイルスおよびノロウイルスなど感染症の拡大が懸念されるウイルスは、検体中の量が微量であっても、確実に検出できることが重要である。
少量のウイルス等の検出が可能である高感度な検出方法として、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction））が知られている。
ポリメラーゼ連鎖反応法では、ポリメラーゼ連鎖反応によって、検査対象となる塩基配列だけを増幅することにより、検査対象となるウイルス等を２０サイクルで約１００万倍に増幅できる。そのため、高感度なウイルス等の検出が可能である。
その反面、ポリメラーゼ連鎖反応法は、夾雑物の影響が大きい、前処理が複雑である、試薬試験等の冷蔵または冷凍保存が必要である等の問題がある。
ポリメラーゼ連鎖反応法では、ポリメラーゼ連鎖反応によって、検査対象となる塩基配列だけを増幅することにより、検査対象となるウイルス等を２０サイクルで約１００万倍に増幅できる。そのため、高感度なウイルス等の検出が可能である。
その反面、ポリメラーゼ連鎖反応法は、夾雑物の影響が大きい、前処理が複雑である、試薬試験等の冷蔵または冷凍保存が必要である等の問題がある。
これに対して、少量のウイルス等を簡便に検出できる方法として、特許文献１および特許文献２に記載される、検出板に近接場を形成して、検出板表面上の目的物質（標的物質）を含む結合体を、光信号として検出する光学的検出方法が知られている。
特許文献１および特許文献２に記載される光学的検出方法は、例えば、抗原−抗体反応を用いて、目的物質に磁気粒子および標識粒子（蛍光粒子または光散乱粒子）を結合させた結合体を生成する。一方で、検出板の表面に、裏面側から全反射条件で照射される光によって近接場を生成する。この状態で、生成した結合体を、磁力によって、近接場（検出板）に引き付け、かつ、検出板に平行に移動させる。特許文献１および特許文献２に記載される光学的検出方法では、この被検体の移動によって生じる光量変動および光（輝点）の移動等を測定することにより、目的物質を検出する。
特許文献１および特許文献２に記載される光学的検出方法は、例えば、抗原−抗体反応を用いて、目的物質に磁気粒子および標識粒子（蛍光粒子または光散乱粒子）を結合させた結合体を生成する。一方で、検出板の表面に、裏面側から全反射条件で照射される光によって近接場を生成する。この状態で、生成した結合体を、磁力によって、近接場（検出板）に引き付け、かつ、検出板に平行に移動させる。特許文献１および特許文献２に記載される光学的検出方法では、この被検体の移動によって生じる光量変動および光（輝点）の移動等を測定することにより、目的物質を検出する。
蛍光粒子等の標識粒子のみを目的物質に結合させる光学的な検出方法では、非特異的な吸着によって目的物質以外に吸着した標識粒子がノイズになって、検出感度が低下し、高感度な目的物質の検出ができない、という問題がある。
これに対して、特許文献１および特許文献２に記載される方法では、目的物質以外に非特異的に吸着した標識粒子は磁力によって移動せず、磁気粒子と目的物質と標識粒子との結合体のみが、蛍光または散乱光を発生しつつ磁力によって移動する。そのため、特許文献１に記載される方法によれば、光（輝点）の移動を検出することで、非特異的に吸着した標識粒子によるノイズを除去して、目的物質を高い感度で検出できる。
これに対して、特許文献１および特許文献２に記載される方法では、目的物質以外に非特異的に吸着した標識粒子は磁力によって移動せず、磁気粒子と目的物質と標識粒子との結合体のみが、蛍光または散乱光を発生しつつ磁力によって移動する。そのため、特許文献１に記載される方法によれば、光（輝点）の移動を検出することで、非特異的に吸着した標識粒子によるノイズを除去して、目的物質を高い感度で検出できる。
しかしながら、特許文献１および特許文献２に記載される検出方法では、１種の目的物資は好適に検出できるが、複数種の目的物質を検出することができない。
本発明の目的は、このような従来技術の問題点を解決することにあり、目的物質に磁気粒子と標識粒子とを結合させ、磁力によって結合体を移動させることで目的物質を検出する検出方法において、複数種の目的物質を検出できる、目的物質の検出方法を提供することにある。
この課題を解決するために、本発明は、以下の構成を有する。
［１］ 目的物質に磁気粒子と標識粒子とを結合させて、磁力によって目的物質と磁気粒子と標識粒子との結合体を移動させることで、目的物質を検出する検出方法であって、
互いに異なる目的物質に結合する複数種の標識粒子を用い、
複数種の標識粒子は、粒子のサイズが互いに異なる第１条件、および、光の照射によって信号光を生じるものであり、信号光が互いに異なる第２条件の、少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする、目的物質の検出方法。
［２］ 複数種の標識粒子が第１条件を満たす場合に、最もサイズが近い標識粒子同士において、大きい標識粒子のサイズが、小さい標識粒子のサイズの２倍以上である、［１］に記載の目的物質の検出方法。
［３］ 複数種の標識粒子が第２条件を満たす場合に、標識粒子は、光の照射によって発光する粒子であり、最も発光波長が近い標識粒子同士において、発光波長の差が１５ｎｍ以上である、［１］または［２］に記載の目的物質の検出方法。
［４］ 複数種の標識粒子が、第１条件および第２条件の両方を満たす、［１］〜［３］のいずれかに記載の目的物質の検出方法。
［５］ 目的物質の検出を、標識粒子に信号光を生じさせる光を照射して行う、［１］〜［４］のいずれかに記載の目的物質の検出方法。
［６］ 目的物質の検出を、目的物質の検出視野を拡大して、目的物質の検出位置を観察するための観察光を用いて行う、［１］〜［４］のいずれかに記載の目的物質の検出方法。
［７］ 目的物質の検出を、磁力よって結合体を移動しつつ行う、［１］〜［６］のいずれかに記載の目的物質の検出方法。
［８］ 目的物質の検出を、磁力による結合体の移動を行った後に行う、［１］〜［６］のいずれかに記載の目的物質の検出方法。
［１］ 目的物質に磁気粒子と標識粒子とを結合させて、磁力によって目的物質と磁気粒子と標識粒子との結合体を移動させることで、目的物質を検出する検出方法であって、
互いに異なる目的物質に結合する複数種の標識粒子を用い、
複数種の標識粒子は、粒子のサイズが互いに異なる第１条件、および、光の照射によって信号光を生じるものであり、信号光が互いに異なる第２条件の、少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする、目的物質の検出方法。
［２］ 複数種の標識粒子が第１条件を満たす場合に、最もサイズが近い標識粒子同士において、大きい標識粒子のサイズが、小さい標識粒子のサイズの２倍以上である、［１］に記載の目的物質の検出方法。
［３］ 複数種の標識粒子が第２条件を満たす場合に、標識粒子は、光の照射によって発光する粒子であり、最も発光波長が近い標識粒子同士において、発光波長の差が１５ｎｍ以上である、［１］または［２］に記載の目的物質の検出方法。
［４］ 複数種の標識粒子が、第１条件および第２条件の両方を満たす、［１］〜［３］のいずれかに記載の目的物質の検出方法。
［５］ 目的物質の検出を、標識粒子に信号光を生じさせる光を照射して行う、［１］〜［４］のいずれかに記載の目的物質の検出方法。
［６］ 目的物質の検出を、目的物質の検出視野を拡大して、目的物質の検出位置を観察するための観察光を用いて行う、［１］〜［４］のいずれかに記載の目的物質の検出方法。
［７］ 目的物質の検出を、磁力よって結合体を移動しつつ行う、［１］〜［６］のいずれかに記載の目的物質の検出方法。
［８］ 目的物質の検出を、磁力による結合体の移動を行った後に行う、［１］〜［６］のいずれかに記載の目的物質の検出方法。
本発明によれば、目的物質に磁気粒子と標識粒子とを結合させ、磁力によって結合体を移動させることで目的物質を検出する検出方法において、複数種の目的物質を検出できる。
以下、本発明の目的物質の検出方法について、添付の図面に示される好適実施例を基に詳細に説明する。
本明細書において「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。
本発明の目的物質の検出方法は、目的物質に、磁気粒子と標識粒子とを結合させた結合体を形成し、磁力によって結合体を移動させて、結合体すなわち目的物質に結合した標識粒子を検出することで、目的物質を検出するものである。
ここで、本発明の検出方法では、互いに異なる目的物質に結合する、複数種の標識粒子を用いる。
また、複数種の標識粒子は、第１条件および第２条件の少なくとも一方を満たす。第１条件とは、複数の標識粒子において、粒子のサイズが互いに異なる、という条件である。第２条件とは、標識粒子が光の照射によって信号光を生じるものであり、複数の標識粒子において、信号光が互いに異なる、という条件である。
複数種の標識粒子は、第１条件のみを満たすものでも、第２条件のみを満たすものでも、第１条件および第２条件の両者を満たすものでもよい。すなわち、複数種の標識粒子は、サイズが互いに異なるのみでもよく、あるいは、生じる信号光が互いに異なるのみでもよく、あるいは、サイズが互いに異なり、かつ、生じる信号光が互いに異なってもよい。
また、複数種の標識粒子は、第１条件および第２条件の少なくとも一方を満たす。第１条件とは、複数の標識粒子において、粒子のサイズが互いに異なる、という条件である。第２条件とは、標識粒子が光の照射によって信号光を生じるものであり、複数の標識粒子において、信号光が互いに異なる、という条件である。
複数種の標識粒子は、第１条件のみを満たすものでも、第２条件のみを満たすものでも、第１条件および第２条件の両者を満たすものでもよい。すなわち、複数種の標識粒子は、サイズが互いに異なるのみでもよく、あるいは、生じる信号光が互いに異なるのみでもよく、あるいは、サイズが互いに異なり、かつ、生じる信号光が互いに異なってもよい。
図１に、磁気粒子および標識粒子を含有する検出液１０に、被検体を検出液１０に溶解した状態を、概念的に示す。なお、本発明において、『検出液１０に溶解』とは、検出液１０に物質が溶解された状態のみならず、検出液１０に物質が分散された状態も含む。
検出液１０は、透明なセル２４に収容されている。検出液１０は、磁気粒子１４、ならびに、第１の標識粒子１６ａおよび第２の標識粒子１６ｂが溶解している。
この検出液１０に、被検体を溶解することで、検出液１０に、例えば第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂが供給される。
なお、検出液１０に被検体を溶解した後は、所定時間静置してもよく、攪拌を行ってもよく、所定時間静置した後に攪拌を行ってもよく、攪拌を行った後に所定時間静置してもよい。
この検出液１０に、被検体を溶解することで、検出液１０に、例えば第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂが供給される。
なお、検出液１０に被検体を溶解した後は、所定時間静置してもよく、攪拌を行ってもよく、所定時間静置した後に攪拌を行ってもよく、攪拌を行った後に所定時間静置してもよい。
磁気粒子１４は、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂに、特異的に結合するものである。第１の標識粒子１６ａは、第１の目的物質１２ａに特異的に結合するものである。第２の標識粒子１６ｂは、第２の目的物質１２ｂに特異的に結合するものである。
従って、検出液１０への被検体の溶解によって、第１の目的物質１２ａと磁気粒子１４と第１の標識粒子１６ａとが結合した結合体２０ａ、および、第２の目的物質１２ｂと磁気粒子１４と第２の標識粒子１６ｂとが結合した結合体２０ｂ、が形成される。
なお、図示は省略するが、検出液１０中には、第１の目的物質１２ａと磁気粒子１４との結合体、第２の目的物質１２ｂと磁気粒子１４との結合体、第１の目的物質１２ａと磁気粒子１４と第１の標識粒子１６ａ、および、第２の目的物質１２ｂと第２の標識粒子１６ｂとの結合体等も存在する。
従って、検出液１０への被検体の溶解によって、第１の目的物質１２ａと磁気粒子１４と第１の標識粒子１６ａとが結合した結合体２０ａ、および、第２の目的物質１２ｂと磁気粒子１４と第２の標識粒子１６ｂとが結合した結合体２０ｂ、が形成される。
なお、図示は省略するが、検出液１０中には、第１の目的物質１２ａと磁気粒子１４との結合体、第２の目的物質１２ｂと磁気粒子１４との結合体、第１の目的物質１２ａと磁気粒子１４と第１の標識粒子１６ａ、および、第２の目的物質１２ｂと第２の標識粒子１６ｂとの結合体等も存在する。
ここで、第１の標識粒子１６ａおよび第２の標識粒子１６ｂは、前述のように、互いにサイズが異なる第１条件、および、光の照射によって信号光を生じる粒子で、生じる信号光が互いに異なる第２条件の、少なくとも一方を満たす。
図示例の第１の標識粒子１６ａおよび第２の標識粒子１６ｂは、サイズは同じで、励起光の照射によって蛍光を発光する蛍光粒子であって、発光波長が互いに異なる。一例として、第１の標識粒子１６ａは、励起光の照射によって赤色の蛍光を発光し、第２の標識粒子１６ｂは、励起光の照射によって青色の蛍光を発光する。すなわち、図示例において、第１の標識粒子１６ａおよび第２の標識粒子１６ｂは、第２条件のみを満たす。
本発明の目的物質の検出方法は、このような構成を有することにより、複数種の目的物質の検出を可能にしている。
この点に関しては、後に詳述する。
図示例の第１の標識粒子１６ａおよび第２の標識粒子１６ｂは、サイズは同じで、励起光の照射によって蛍光を発光する蛍光粒子であって、発光波長が互いに異なる。一例として、第１の標識粒子１６ａは、励起光の照射によって赤色の蛍光を発光し、第２の標識粒子１６ｂは、励起光の照射によって青色の蛍光を発光する。すなわち、図示例において、第１の標識粒子１６ａおよび第２の標識粒子１６ｂは、第２条件のみを満たす。
本発明の目的物質の検出方法は、このような構成を有することにより、複数種の目的物質の検出を可能にしている。
この点に関しては、後に詳述する。
本発明において、検出対象となる目的物質（標的物質）には制限はない。一例として、ウイルス、細菌、エクソソーム、ＤＮＡ（deoxyribonucleic acid）、ＲＮＡ（ribonucleic acid）、蛋白質、多糖、および、汚染物質等が例示される。中でも、ウイルス、蛋白質および多糖は、目的物質として好適である。
また、目的物質の検出対象となる被検体（採取する試料）にも制限はなく、目的物質を含むと考えられる各種のものが利用可能である。被検体としては、一例として、血液およびリンパ等の体液、細胞、内皮（上皮細胞）、唾液、汗、鼻水、涙、嘔吐物、尿、糞、薬品、環境水、上水、下水、ならびに、拭き取り液等が例示される。
これらの被検体は、被検体に応じた公知の方法で採取すればよい。例えば、食中毒等が発生した現場のドアノブおよびテーブル等を、スワブ（綿棒）等によって拭き取って被検体を採取する方法が例示される。別の方法として、嘔吐物および尿等にスワブを接触させて、被検体を採取する方法が例示される。また、細胞および内皮等は、内視鏡等を用いて採取すればよい。
また、目的物質の検出対象となる被検体（採取する試料）にも制限はなく、目的物質を含むと考えられる各種のものが利用可能である。被検体としては、一例として、血液およびリンパ等の体液、細胞、内皮（上皮細胞）、唾液、汗、鼻水、涙、嘔吐物、尿、糞、薬品、環境水、上水、下水、ならびに、拭き取り液等が例示される。
これらの被検体は、被検体に応じた公知の方法で採取すればよい。例えば、食中毒等が発生した現場のドアノブおよびテーブル等を、スワブ（綿棒）等によって拭き取って被検体を採取する方法が例示される。別の方法として、嘔吐物および尿等にスワブを接触させて、被検体を採取する方法が例示される。また、細胞および内皮等は、内視鏡等を用いて採取すればよい。
磁気粒子（磁気粒子、磁性体、磁性物質）にも、制限はなく、磁気を利用する目的物質の検出に用いられる公知のものが、各種、利用可能である。一例として、磁気ビーズ、および、磁性粉体等が例示される。これらは、市販品も利用可能である。
標識粒子にも制限はなく、光の照射によって生じる信号光を利用する方法、撮像した画像の観察あるいはさらに画像解析、ならびに、顕微鏡および拡大光学系などを用いる拡大観察等によって、種類を識別可能なものであれば、公知の各種の粒子が利用可能である。
標識粒子としては、一例として、励起光の照射によって蛍光を発光する蛍光粒子、および、照射された光を散乱して散乱光を生じる光散乱粒子が、好適に例示される。
標識粒子としては、一例として、励起光の照射によって蛍光を発光する蛍光粒子、および、照射された光を散乱して散乱光を生じる光散乱粒子が、好適に例示される。
蛍光粒子には、制限はなく、上述した特許文献１および特許文献２に記載されるような目的物質の検出において、標識粒子として用いられる公知の蛍光粒子が、各種、利用可能である。蛍光粒子としては、一例として、蛍光色素、蛍光顔料および希土類等を含むポリマー粒子、シリカ粒子、および、シリコン粒子等が例示される。さらに、量子ドット、および、生物学的蛍光分子等も利用可能である。これらは、市販品も利用可能である。また、標識粒子は、蓄光粒子であってもよい。
標識粒子として蛍光粒子を用いる場合には、複数の標識粒子は、サイズが同じで、生じる信号光の波長すなわち発光波長（蛍光波長）が互いに異なる第２条件のみを満たすものであってもよく、または、発光波長が同じで、サイズが互いに異なる、第１条件のみを満たすものであってもよく、または、第１条件および第２条件の両者を満たすものであってもよい。
標識粒子として蛍光粒子を用いる場合には、複数の標識粒子は、サイズが同じで、生じる信号光の波長すなわち発光波長（蛍光波長）が互いに異なる第２条件のみを満たすものであってもよく、または、発光波長が同じで、サイズが互いに異なる、第１条件のみを満たすものであってもよく、または、第１条件および第２条件の両者を満たすものであってもよい。
光散乱粒子にも制限はなく、同様に、上述した特許文献１および特許文献２に記載されるような目的物質の検出において、標識粒子として用いられる公知の光散乱粒子が、各種、利用可能である。光散乱粒子としては、一例として、ポリスチレンビーズ、金粒子などの金属粒子およびシリコン粒子等が例示される。これらは、市販品も利用可能である。
なお、目的物質の種類によっては、励起光の照射によって、目的物質が蛍光を発生する場合も有る。この際には、目的物質が標識粒子を兼ねてもよい。
また、標識粒子の種類によっては、標識粒子が磁性を帯びている場合も有る。この場合には、標識粒子が磁気粒子を兼ねてもよい（磁気粒子が標識粒子を兼ねてもよい）。
また、標識粒子の種類によっては、標識粒子が磁性を帯びている場合も有る。この場合には、標識粒子が磁気粒子を兼ねてもよい（磁気粒子が標識粒子を兼ねてもよい）。
目的物質と磁気粒子との結合方法、さらには、目的物質と標識粒子との結合方法にも、制限はなく、目的物質および磁気粒子、ならびに、目的物質および標識粒子の種類に応じた公知の方法が利用可能である。一例として、物理吸着、抗原−抗体反応、受容体とリガンドとの結合、ＤＮＡハイブリダイゼーション、キレート結合、および、アミノ結合等が例示される。
物理吸着は、水素結合などの静電的な結合力を利用して、目的物質と磁気粒子とを結合する方法である。物理吸着は、磁気粒子の処理等が不要であることから、実施が容易である。その反面、物理吸着では、磁気粒子および標識粒子が目的物質と特異的に吸着するわけでは無いので、選択性が低い。すなわち、物理吸着では、磁気粒子および標識粒子が、被検体に含まれる目的物質以外の物質と結合する可能性もある。
これに対して、抗原−抗体反応および受容体とリガンドとの結合等は、目的物質との特異的な結合を利用するので、磁気粒子および標識粒子と、目的物質とを、選択的に結合できるという利点がある。
これに対して、抗原−抗体反応および受容体とリガンドとの結合等は、目的物質との特異的な結合を利用するので、磁気粒子および標識粒子と、目的物質とを、選択的に結合できるという利点がある。
なお、抗原−抗体反応を利用する際に、目的物質が、例えば細菌、ウイルスおよびエクソソーム等の抗原である場合には、事前に、磁気粒子および標識粒子の少なくとも一方を、目的物質に対する抗体で修飾して、抗体修飾磁気粒子および抗体修飾標識粒子等にしておく必要がある。また、目的物質が細菌、ウイルスおよびエクソソーム等そのものである場合には、事前に、これらの目的物質の表面等に存在する抗原に対する抗体を、磁気粒子および標識粒子の少なくとも一方に結合させておく必要がある。
また、受容体とリガンドとの結合を利用する場合には、事前に、目的物質に特異的に結合する受容体またはリガンドを、磁気粒子および標識粒子の少なくとも一方に結合させておく必要が有る。さらに、目的物質が細菌、ウイルスおよびエクソソーム等そのものである場合、事前に、これらの目的物質の表面等に存在する受容体に対するリガンド、または、これらの目的物質の表面等に存在するリガンドに対する受容体を、磁気粒子および標識粒子の少なくとも一方に結合させておく必要がある。
また、受容体とリガンドとの結合を利用する場合には、事前に、目的物質に特異的に結合する受容体またはリガンドを、磁気粒子および標識粒子の少なくとも一方に結合させておく必要が有る。さらに、目的物質が細菌、ウイルスおよびエクソソーム等そのものである場合、事前に、これらの目的物質の表面等に存在する受容体に対するリガンド、または、これらの目的物質の表面等に存在するリガンドに対する受容体を、磁気粒子および標識粒子の少なくとも一方に結合させておく必要がある。
目的物質に、磁気粒子および標識粒子の両方を結合させる場合には、少なくとも一方の結合は、抗原−抗体反応、および、受容体とリガンドとの結合のように、目的物質との特異的な結合であるのが好ましい。
目的物質に、磁気粒子および標識粒子の両方を結合させる場合に、結合が、いずれも非特異的な結合である場合には、目的物質以外の異物に、磁気粒子および標識粒子の両方が結合してしまう場合があり、この際には、目的物質と異物との区別ができなくなるという不都合が生じる。
目的物質に、磁気粒子および標識粒子の両方を結合させる場合に、結合が、いずれも非特異的な結合である場合には、目的物質以外の異物に、磁気粒子および標識粒子の両方が結合してしまう場合があり、この際には、目的物質と異物との区別ができなくなるという不都合が生じる。
なお、上述のように、本発明においては、励起光の照射によって蛍光を生じる磁気粒子のように、光の照射によって信号光を生じる磁気粒子（磁気を帯びている標識粒子）も利用可能である。
この場合には、励起光の照射によって蛍光を発する磁気粒子と、目的物質と粒子との結合は、抗原−抗体反応等のように、目的物質との特異的な結合であるのが好ましい。励起光の照射によって蛍光を発する磁気粒子と、目的物質との結合が非特異的な結合である場合には、目的物質以外の異物に、励起光の照射によって蛍光を発する磁気粒子が結合してしまう場合があり、この際には、目的物質と異物との区別ができなくなるという不都合が生じる。
この場合には、励起光の照射によって蛍光を発する磁気粒子と、目的物質と粒子との結合は、抗原−抗体反応等のように、目的物質との特異的な結合であるのが好ましい。励起光の照射によって蛍光を発する磁気粒子と、目的物質との結合が非特異的な結合である場合には、目的物質以外の異物に、励起光の照射によって蛍光を発する磁気粒子が結合してしまう場合があり、この際には、目的物質と異物との区別ができなくなるという不都合が生じる。
本発明において、検出液１０には、被検体、磁気粒子および目的物質を溶解可能な液体が、各種、利用可能である。具体的には、検出液１０には、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、水、および、水系の液体等が例示される。水は、純水、イオン交換水、および、蒸留水のいずれかを用いるのが好ましい。
以下、本発明の目的物質の検出方法について、図１および図２を参照して、より詳細に説明する。
上述したように、図１に示される例では、透明なセル２４に収容されている検出液１０には、磁気粒子１４、ならびに、第１の標識粒子１６ａおよび第２の標識粒子１６ｂが溶解されている。第１の標識粒子１６ａおよび第２の標識粒子１６ｂは、共に、蛍光粒子であり、励起光の照射によって、第１の標識粒子１６ａは赤色の蛍光を発光し、第２の標識粒子１６ｂは青色の蛍光を発光するのも、上述したとおりである。
この検出液１０に、被検体を溶解することで、検出液１０に、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂが供給される。
この検出液１０に、被検体を溶解することで、検出液１０に、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂが供給される。
なお、本発明の目的物の検出方法では、先に検出液に被検体を溶解し、その後、検出液に、磁気粒子および標識粒子を、同時に、または、順次、溶解（分散）してもよい。
すなわち、本発明の目的物の検出方法では、検出液への、被検体（目的物質）、磁気粒子、および、標識粒子の溶解順（供給順）には、制限はない。
すなわち、本発明の目的物の検出方法では、検出液への、被検体（目的物質）、磁気粒子、および、標識粒子の溶解順（供給順）には、制限はない。
検出液１０に被検体を溶解して、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂを供給することにより、第１の目的物質１２ａと磁気粒子１４と第１の標識粒子１６ａとが結合した結合体２０ａ、および、第２の目的物質１２ｂと磁気粒子１４と第２の標識粒子１６ｂとが結合した結合体２０ｂ、が形成される。
なお、図示は省略するが、検出液１０中では、磁気粒子と目的物質との結合体、および、標識粒子と目的物質との結合体も形成されるのは、上述のとおりである。
なお、図示は省略するが、検出液１０中では、磁気粒子と目的物質との結合体、および、標識粒子と目的物質との結合体も形成されるのは、上述のとおりである。
一例として、図２に概念的に示すようにセル２４の図中右側に磁石２８を配置する。磁石２８は、公知の磁石である。
また、セル２４の底面から、セル２４の内部に励起光を照射するように、光源３０と集光光学系３２とを有する励起光照射手段３４を設ける。また、セル２４の底面から、セル２４の内部における、励起光照射手段３４による励起光の照射領域を撮影するように、撮像素子３６と集光光学系３８とを有する撮像手段４０を設ける。
なお、撮像手段４０による撮像位置（撮像の焦点）は、セル２４の壁面（近接場）ではなく、セル２４の内部とするのが好ましい。
なお、撮像手段４０による撮像位置（撮像の焦点）は、セル２４の壁面（近接場）ではなく、セル２４の内部とするのが好ましい。
光源３０は、第１の標識粒子１６ａおよび第２の標識粒子１６ｂを励起して、蛍光を発光させる光を照射できる光源が、各種、利用可能である。一例として、水銀灯などの電球、蛍光灯、ハロゲンランプ、ＬＥＤ（Light Emitting Diode）、および、半導体レーザなどのレーザ等が例示される。
撮像素子３６も、第１の標識粒子１６ａおよび第２の標識粒子１６ｂが発光した蛍光を測定可能な撮像素子が、各種、利用可能である。一例として、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサ（ＣＭＯＳカメラ）、および、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）イメージセンサ（ＣＣＤカメラ）等が例示される。
集光光学系は、共に、公知の集光光学系である。
なお、光源３０には、必要に応じて、バンドパスフィルターなどの光学フィルターを設けてもよい。また、撮像素子３６および／または集光光学系３８には、必要に応じて、シャープカットフィルターなどの光学フィルターを設けてもよい。
撮像素子３６も、第１の標識粒子１６ａおよび第２の標識粒子１６ｂが発光した蛍光を測定可能な撮像素子が、各種、利用可能である。一例として、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサ（ＣＭＯＳカメラ）、および、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）イメージセンサ（ＣＣＤカメラ）等が例示される。
集光光学系は、共に、公知の集光光学系である。
なお、光源３０には、必要に応じて、バンドパスフィルターなどの光学フィルターを設けてもよい。また、撮像素子３６および／または集光光学系３８には、必要に応じて、シャープカットフィルターなどの光学フィルターを設けてもよい。
なお、本発明の目的物質の検出方法は、このような励起光を照射する光学系、および、撮像を行う光学系を用いる構成に制限はされず、セル２４内の標識粒子に蛍光を生じさせつつ、セル２４内を観察可能であれば、各種の方法が利用可能である。
例えば、セル２４内を蛍光顕微鏡によって観察可能な場合には、蛍光顕微鏡を用いてセル２４内を観察することで、目的物質の検出を行ってもよい。この際には、必要に応じて、蛍光顕微鏡による顕微鏡画像をＣＣＤイメージセンサ等で撮像してもよい。
また、本発明の目的物質の検出方法では、撮像手段４０を用いてセル２４内を撮像する構成に制限はされず、目視観察によって、後述する結合体（標識粒子）の移動を観察して、目的物質の検出を行ってもよい。
例えば、セル２４内を蛍光顕微鏡によって観察可能な場合には、蛍光顕微鏡を用いてセル２４内を観察することで、目的物質の検出を行ってもよい。この際には、必要に応じて、蛍光顕微鏡による顕微鏡画像をＣＣＤイメージセンサ等で撮像してもよい。
また、本発明の目的物質の検出方法では、撮像手段４０を用いてセル２４内を撮像する構成に制限はされず、目視観察によって、後述する結合体（標識粒子）の移動を観察して、目的物質の検出を行ってもよい。
励起光照射手段３４によって、セル２４の内部に励起光を照射し、かつ、撮像手段４０によってセル２４内部の励起光照射領域を撮像しつつ、磁石２８を作用させる。
励起光の照射によって、第１の標識粒子１６ａは赤色の蛍光を発光し、また、第２の標識粒子１６ｂは青色の蛍光を発光する。
また、磁石２８の磁力によって、磁気粒子１４、第１の目的物質１２ａと磁気粒子１４と第１の標識粒子１６ａとが結合した結合体２０ａ、および、第２の目的物質１２ｂと磁気粒子１４と第２の標識粒子１６ｂとが結合した結合体２０ｂが、磁力によって磁石２８に向かって移動する。
励起光の照射によって、第１の標識粒子１６ａは赤色の蛍光を発光し、また、第２の標識粒子１６ｂは青色の蛍光を発光する。
また、磁石２８の磁力によって、磁気粒子１４、第１の目的物質１２ａと磁気粒子１４と第１の標識粒子１６ａとが結合した結合体２０ａ、および、第２の目的物質１２ｂと磁気粒子１４と第２の標識粒子１６ｂとが結合した結合体２０ｂが、磁力によって磁石２８に向かって移動する。
ここで、第１の標識粒子１６ａおよび第２の標識粒子１６ｂ（さらに、目的物質と標識粒子との結合体）は、励起光の照射によって蛍光は発光するが、磁気粒子を有さないので、磁力によって移動しない。
他方、磁気粒子１４（さらに、目的物質と磁気粒子との結合体）は、磁力によって移動はするが、標識粒子を有さないので、蛍光を発光しない。
すなわち、検出液１０の中に、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂの少なくとも一方が存在した場合のみ、目的物質と磁気粒子と標識粒子との結合体が形成され、励起光の照射および磁石２８の磁力によって、磁石２８に向かって蛍光（発光体）が移動する。
他方、磁気粒子１４（さらに、目的物質と磁気粒子との結合体）は、磁力によって移動はするが、標識粒子を有さないので、蛍光を発光しない。
すなわち、検出液１０の中に、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂの少なくとも一方が存在した場合のみ、目的物質と磁気粒子と標識粒子との結合体が形成され、励起光の照射および磁石２８の磁力によって、磁石２８に向かって蛍光（発光体）が移動する。
具体的には、検出液１０すなわち被検体中に、第１の目的物質１２ａのみが含まれている場合には、第１の目的物質１２ａと磁気粒子１４と第１の標識粒子１６ａとが結合した結合体２０ａのみが形成され、第２の目的物質１２ｂと磁気粒子１４と第２の標識粒子１６ｂとが結合した結合体２０ｂは形成されない。
従って、この場合には、励起光の照射によって、赤色の蛍光および青色の蛍光が生じるが、磁石２８の磁力によって、赤色の蛍光のみが磁石２８に向かって移動する。
従って、この場合には、励起光の照射によって、赤色の蛍光および青色の蛍光が生じるが、磁石２８の磁力によって、赤色の蛍光のみが磁石２８に向かって移動する。
検出液１０すなわち被検体中に、第２の目的物質１２ｂのみが含まれている場合には、第２の目的物質１２ｂと磁気粒子１４と第２の標識粒子１６ｂとが結合した結合体２０ｂのみが形成され、第１の目的物質１２ａと磁気粒子１４と第１の標識粒子１６ａとが結合した結合体２０ａは形成されない。
従って、この場合には、励起光の照射によって、赤色の蛍光および青色の蛍光が生じるが、磁石２８の磁力によって、青色の蛍光のみが磁石２８に向かって移動する。
従って、この場合には、励起光の照射によって、赤色の蛍光および青色の蛍光が生じるが、磁石２８の磁力によって、青色の蛍光のみが磁石２８に向かって移動する。
検出液１０すなわち被検体中に、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂの両方が含まれている場合には、第１の目的物質１２ａと磁気粒子１４と第１の標識粒子１６ａとが結合した結合体２０ａ、および、第２の目的物質１２ｂと磁気粒子１４と第２の標識粒子１６ｂとが結合した結合体２０ｂが、形成される。
従って、この場合には、励起光の照射によって、赤色の蛍光および青色の蛍光が生じ、磁石２８の磁力によって、赤色の蛍光および青色の蛍光が、共に、磁石２８に向かって移動する。
従って、この場合には、励起光の照射によって、赤色の蛍光および青色の蛍光が生じ、磁石２８の磁力によって、赤色の蛍光および青色の蛍光が、共に、磁石２８に向かって移動する。
さらに、被検体中に第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂがいずれも含まれていない場合には、結合体２０ａおよび結合体２０ｂは形成されない。従って、この場合には、励起光の照射によって、赤色の蛍光および青色の蛍光が生じるが、磁石２８の磁力によって移動する蛍光は存在しない。
従って、撮像素子３６が撮像した画像を解析して、画像中で、赤色の蛍光の移動、および、青色の蛍光の移動を検出し、あるいはさらに計数することにより、被検体中に、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂが存在するか否かを、検出できる。
すなわち、互いに異なる目的物質に結合し、かつ、互いに異なる蛍光を発光する、複数種の標識粒子を用いる本発明によれば、複数種の目的物質を検出できる。
以上の例は、光源３０が照射する励起光が、第１の標識粒子１６ａおよび第２の標識粒子１６ｂの両者を励起して、蛍光を発光させられる例である。しかしながら、１種の励起光では、第１の標識粒子１６ａおよび第２の標識粒子１６ｂの両者を励起できない場合も有る。
この場合には、第１の標識粒子１６ａを励起して蛍光を発光させる第１の励起光照射手段と、第２の標識粒子１６ｂを励起して蛍光を発光させる第２の励起光照射手段とを設け、例えば、最初に第１の励起光照射手段を用いて、第１の標識粒子１６ａを有する結合体２０ａの検出を行い、その後、第２の励起光照射手段を用いて、第２の標識粒子１６ｂを有する結合体２０ｂの検出し、あるいはさらに計数を行うようにすればよい。
または、ハロゲンランプ等の広帯域の光を照射可能な光源と、第１の標識粒子１６ａを励起して蛍光を発光させる光を透過する第１フィルタ、および、第２の標識粒子１６ｂを励起して蛍光を発光させる光を透過する第２フィルタとを用い、例えば、最初に第１フィルタを光路に挿入して、第１の標識粒子１６ａを有する結合体２０ａの検出を行い、その後、第２フィルタを光路に挿入して、第２の標識粒子１６ｂを有する結合体２０ｂの検出し、あるいはさらに計数を行うようにしてもよい。
さらに、ハロゲンランプ等の広帯域の光を照射可能な光源または各標識粒子を励起可能な複数の光源と、各種の蛍光波長を受光する複数の受光素子とを配備し、それぞれの結合体に対応する蛍光を、対応する受光素子で検出し、あるいはさらに計数を行うようにしてもよい。
この場合には、第１の標識粒子１６ａを励起して蛍光を発光させる第１の励起光照射手段と、第２の標識粒子１６ｂを励起して蛍光を発光させる第２の励起光照射手段とを設け、例えば、最初に第１の励起光照射手段を用いて、第１の標識粒子１６ａを有する結合体２０ａの検出を行い、その後、第２の励起光照射手段を用いて、第２の標識粒子１６ｂを有する結合体２０ｂの検出し、あるいはさらに計数を行うようにすればよい。
または、ハロゲンランプ等の広帯域の光を照射可能な光源と、第１の標識粒子１６ａを励起して蛍光を発光させる光を透過する第１フィルタ、および、第２の標識粒子１６ｂを励起して蛍光を発光させる光を透過する第２フィルタとを用い、例えば、最初に第１フィルタを光路に挿入して、第１の標識粒子１６ａを有する結合体２０ａの検出を行い、その後、第２フィルタを光路に挿入して、第２の標識粒子１６ｂを有する結合体２０ｂの検出し、あるいはさらに計数を行うようにしてもよい。
さらに、ハロゲンランプ等の広帯域の光を照射可能な光源または各標識粒子を励起可能な複数の光源と、各種の蛍光波長を受光する複数の受光素子とを配備し、それぞれの結合体に対応する蛍光を、対応する受光素子で検出し、あるいはさらに計数を行うようにしてもよい。
本発明の目的物質の検出方法において、磁力による結合体２０ａおよび結合体２０ｂの移動および検出は、各種の方法が利用可能である。
例えば、図３に概念的に示すように、磁石２８を、１個、配置し、セル２４の内部に励起光を照射して、励起光の照射領域で撮像を行いつつ、磁石２８の磁力によって結合体２０ａおよび結合体２０ｂを一方向に移動して、撮像した画像中で磁石２８に向かって移動する蛍光の検出あるいはさらに計数を行うことで、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂの検出を行ってもよい。なお、この方法は、磁石を、複数、有する構成でも利用可能である。
また、図４に概念的に示すように、セル２４を挟むように２つの磁石２８を配置し、セル２４の内部に励起光を照射して、励起光の照射領域で撮像を行いつつ、２つの磁石を交互に作用させることで、磁力によって結合体２０ａおよび結合体２０ｂを往復動させて、撮像した画像中で往復動する蛍光の検出あるいはさらに計数を行うことで、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂの検出を行ってもよい。あるいは、図中のセル２４の上下にも磁石を配置して、セル２４の内部に励起光を照射して、励起光の照射領域で撮像を行いつつ、各磁石を、順次、作用させて、磁力によって結合体２０ａおよび結合体２０ｂを二次元的（矩形状）に移動させることで、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂの検出を行ってもよい。
さらに、図５に概念的に示すように、磁石２８を、１個、配置し、まず、磁石２８を作用させて、磁力によって結合体２０ａおよび結合体２０ｂをセル２４内の磁石２８側に集める。その後、必要に応じて磁石２８を作用させないようにして、セル２４内の結合体２０ａおよび結合体２０ｂを集めた領域に励起光を照射し、かつ、励起光の照射領域の撮像を行い、撮像した画像中において、磁石２８側に位置する蛍光の検出あるいはさらに計数を行うことにより、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂの検出を行ってもよい。なお、この方法も、磁石を、複数、有する構成でも利用可能である。
例えば、図３に概念的に示すように、磁石２８を、１個、配置し、セル２４の内部に励起光を照射して、励起光の照射領域で撮像を行いつつ、磁石２８の磁力によって結合体２０ａおよび結合体２０ｂを一方向に移動して、撮像した画像中で磁石２８に向かって移動する蛍光の検出あるいはさらに計数を行うことで、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂの検出を行ってもよい。なお、この方法は、磁石を、複数、有する構成でも利用可能である。
また、図４に概念的に示すように、セル２４を挟むように２つの磁石２８を配置し、セル２４の内部に励起光を照射して、励起光の照射領域で撮像を行いつつ、２つの磁石を交互に作用させることで、磁力によって結合体２０ａおよび結合体２０ｂを往復動させて、撮像した画像中で往復動する蛍光の検出あるいはさらに計数を行うことで、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂの検出を行ってもよい。あるいは、図中のセル２４の上下にも磁石を配置して、セル２４の内部に励起光を照射して、励起光の照射領域で撮像を行いつつ、各磁石を、順次、作用させて、磁力によって結合体２０ａおよび結合体２０ｂを二次元的（矩形状）に移動させることで、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂの検出を行ってもよい。
さらに、図５に概念的に示すように、磁石２８を、１個、配置し、まず、磁石２８を作用させて、磁力によって結合体２０ａおよび結合体２０ｂをセル２４内の磁石２８側に集める。その後、必要に応じて磁石２８を作用させないようにして、セル２４内の結合体２０ａおよび結合体２０ｂを集めた領域に励起光を照射し、かつ、励起光の照射領域の撮像を行い、撮像した画像中において、磁石２８側に位置する蛍光の検出あるいはさらに計数を行うことにより、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂの検出を行ってもよい。なお、この方法も、磁石を、複数、有する構成でも利用可能である。
図示例の目的物質の検出方法では、第１の標識粒子１６ａと第２の標識粒子１６ｂとは光の照射によって生じる信号光が互いに異なるものである。具体的には、第１の標識粒子１６ａおよび第２の標識粒子１６ｂは、励起光の照射によって蛍光を発光するものであり、第１の標識粒子１６ａは赤色の蛍光を、第２の標識粒子１６ｂを青色の蛍光を発光する、発光波長が互いに異なるものである。
このように、複数種の標識粒子が、励起光等の光の照射によって発光する粒子で、本発明における第２条件を満たす場合には、最も発光波長が近い標識粒子同士において、発光波長の差が１５ｎｍ以上であるのが好ましく、２５ｎｍ以上であるのがより好ましく、５０ｎｍ以上であるのがさらに好ましい。
発光波長の差を１５ｎｍ以上とすることにより、目的物質に結合して移動する複数種の標識粒子の識別を、より好適に行うことが可能になり、複数種の目的物質の検出を、より高精度、かつ、容易に行うことが可能になる。
このように、複数種の標識粒子が、励起光等の光の照射によって発光する粒子で、本発明における第２条件を満たす場合には、最も発光波長が近い標識粒子同士において、発光波長の差が１５ｎｍ以上であるのが好ましく、２５ｎｍ以上であるのがより好ましく、５０ｎｍ以上であるのがさらに好ましい。
発光波長の差を１５ｎｍ以上とすることにより、目的物質に結合して移動する複数種の標識粒子の識別を、より好適に行うことが可能になり、複数種の目的物質の検出を、より高精度、かつ、容易に行うことが可能になる。
図１および図２に示す例は、いずれも、２種の目的物質の検出を行うものであるが、本発明は、これに制限はされず、第３の目的物質、第４の目的物質、…、第ｎの目的物質のように、３種以上の目的物質を検出することも可能である。
この場合には、生じる信号光が異なり、かつ、他とは異なる目的物質に特異的に結合する、第３の標識粒子、第４の標識粒子、…、第ｎの標識粒子を用いて、同様に目的物質の検出を行えばよい。
この場合には、生じる信号光が異なり、かつ、他とは異なる目的物質に特異的に結合する、第３の標識粒子、第４の標識粒子、…、第ｎの標識粒子を用いて、同様に目的物質の検出を行えばよい。
また、図１および図２に示す例では、同じ磁気粒子１４が、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質の両方に特異的に結合するが、本発明は、これに制限はされない。
すなわち、本発明においては、後に実施例でも示すように、磁気粒子は、第１の目的物質１２ａに特異的に結合する磁気粒子、および、第２の目的物質１２ｂに特異的に結合する磁気粒子を用いてもよい。この場合には、第１の目的物質１２ａに特異的に結合する磁気粒子と、第２の目的物質に特異的に結合する磁気粒子とは、サイズ、磁力、および、形成材料等が異なる、異なる種類の磁気粒子であってもよい。
また、３種以上の目的物質の検出に対応する場合には、１個の目的物質に特異的に結合する磁気粒子と、複数の目的物質に特異的に結合する磁気粒子とが、混在してもよい。
すなわち、本発明においては、後に実施例でも示すように、磁気粒子は、第１の目的物質１２ａに特異的に結合する磁気粒子、および、第２の目的物質１２ｂに特異的に結合する磁気粒子を用いてもよい。この場合には、第１の目的物質１２ａに特異的に結合する磁気粒子と、第２の目的物質に特異的に結合する磁気粒子とは、サイズ、磁力、および、形成材料等が異なる、異なる種類の磁気粒子であってもよい。
また、３種以上の目的物質の検出に対応する場合には、１個の目的物質に特異的に結合する磁気粒子と、複数の目的物質に特異的に結合する磁気粒子とが、混在してもよい。
以上の点については、後述する、複数種の標識粒子が、互いにサイズが異なる粒子であるという第１条件を満たす場合、および、複数の標識粒子が第１条件および第２条件の両者を満たす場合でも、同様である。
図６に、複数種の標識粒子が、互いにサイズが異なる第１条件を満たす場合における、本発明の検出方法の一例を概念的に示す。
なお、図６に示す例では、上述した図１等と同じ物質には同じ符号を付し、説明は、異なる物質を主に行う。
なお、図６に示す例では、上述した図１等と同じ物質には同じ符号を付し、説明は、異なる物質を主に行う。
図６に示す例において、第１の標識粒子４６ａおよび第２の標識粒子４６ｂは、サイズが、互いに異なる。図示例においては、第１の標識粒子４６ａが、第２の標識粒子４６ｂよりも大きい。以下の説明では、標識粒子の大きさを検出するために照射する光を、便宜的に『検出光』とも言う。
なお、複数種の標識粒子が、互いにサイズが異なる第１条件のみを満たす場合には、標識粒子として、発光波長が同じ蛍光粒子を用いてもよいのは、上述したとおりである。
なお、複数種の標識粒子が、互いにサイズが異なる第１条件のみを満たす場合には、標識粒子として、発光波長が同じ蛍光粒子を用いてもよいのは、上述したとおりである。
また、第１の標識粒子４６ａは、上述した第１の標識粒子１６ａと同様に、第１の目的物質１２ａに特異的に結合する。他方、第２の標識粒子４６ｂは、上述した第２の標識粒子１６ｂと同様に、第２の目的物質１２ｂに特異的に結合する。
従って、磁気粒子１４、第１の標識粒子４６ａおよび第２の標識粒子４６ｂを含有する検出液１０に、被検体が溶解され、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂが供給されると、第１の目的物質１２ａと磁気粒子１４と第１の標識粒子４６ａとが結合した結合体５０ａ、および、第２の目的物質１２ｂと磁気粒子１４と第２の標識粒子４６ｂとが結合した結合体５０ｂが形成される。
従って、磁気粒子１４、第１の標識粒子４６ａおよび第２の標識粒子４６ｂを含有する検出液１０に、被検体が溶解され、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂが供給されると、第１の目的物質１２ａと磁気粒子１４と第１の標識粒子４６ａとが結合した結合体５０ａ、および、第２の目的物質１２ｂと磁気粒子１４と第２の標識粒子４６ｂとが結合した結合体５０ｂが形成される。
上述のように、第１の標識粒子４６ａおよび第２の標識粒子４６ｂは、第１の標識粒子４６ａが、第２の標識粒子４６ｂよりも大きい。従って、第１の標識粒子４６ａおよび第２の標識粒子４６ｂを含む検出液１０に、検出光が照射されると、サイズの異なる２種の標識粒子が観察され、かつ、第１の標識粒子４６ａの方が、第２の標識粒子４６ｂよりも大きい。なお、標識粒子が蛍光粒子である場合には、サイズが異なる２種の蛍光が観察される。
複数種の標識粒子が、互いにサイズが異なるという第１条件を満たす場合には、前述の発光波長が異なる複数種の標識粒子を用いる場合と同様の作用で、移動する標識粒子、および、この標識粒子のサイズの違いによって、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂを検出できる。
なお、複数種の標識粒子が、互いにサイズが異なる第１条件を満たす場合には、標識粒子のサイズの違いを、散乱光として検出することもできる。
この際には、第１の標識粒子４６ａおよび第２の標識粒子４６ｂを含む検出液１０に、検出光が照射されると、光としては同じ信号光であるが、サイズが異なる２種の散乱光が観察され、かつ、第１の標識粒子４６ａの方が、第２の標識粒子４６ｂよりも大きな散乱光を生じる。なお、標識粒子が蛍光粒子である場合には、サイズが異なる２種の蛍光が観察される。
複数種の標識粒子が、互いにサイズが異なるという第１条件を満たし、かつ検出光の照射によって散乱光を生じる場合には、前述の発光波長が異なる複数種の標識粒子を用いる場合と同様の作用で、移動する散乱光、および、この散乱光のサイズの違いによって、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂを検出できる。
複数種の標識粒子が、互いにサイズが異なるという第１条件を満たす場合には、前述の発光波長が異なる複数種の標識粒子を用いる場合と同様の作用で、移動する標識粒子、および、この標識粒子のサイズの違いによって、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂを検出できる。
なお、複数種の標識粒子が、互いにサイズが異なる第１条件を満たす場合には、標識粒子のサイズの違いを、散乱光として検出することもできる。
この際には、第１の標識粒子４６ａおよび第２の標識粒子４６ｂを含む検出液１０に、検出光が照射されると、光としては同じ信号光であるが、サイズが異なる２種の散乱光が観察され、かつ、第１の標識粒子４６ａの方が、第２の標識粒子４６ｂよりも大きな散乱光を生じる。なお、標識粒子が蛍光粒子である場合には、サイズが異なる２種の蛍光が観察される。
複数種の標識粒子が、互いにサイズが異なるという第１条件を満たし、かつ検出光の照射によって散乱光を生じる場合には、前述の発光波長が異なる複数種の標識粒子を用いる場合と同様の作用で、移動する散乱光、および、この散乱光のサイズの違いによって、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂを検出できる。
具体的には、検出液１０すなわち被検体中に、第１の目的物質１２ａのみが含まれている場合には、第１の目的物質１２ａと磁気粒子１４と第１の標識粒子４６ａとが結合した結合体５０ａのみが形成され、第２の目的物質１２ｂと磁気粒子１４と第２の標識粒子４６ｂとが結合した結合体５０ｂは形成されない。
従って、この場合には、検出光の照射によって大きな標識粒子と小さな標識粒子とが検出されるが、磁石２８の磁力によって、大きな標識粒子である第１の標識粒子４６ａが結合した結合体５０ａのみが磁石２８に向かって移動する。
従って、この場合には、検出光の照射によって大きな標識粒子と小さな標識粒子とが検出されるが、磁石２８の磁力によって、大きな標識粒子である第１の標識粒子４６ａが結合した結合体５０ａのみが磁石２８に向かって移動する。
検出液１０すなわち被検体中に、第２の目的物質１２ｂのみが含まれている場合には、第２の目的物質１２ｂと磁気粒子１４と第２の標識粒子４６ｂとが結合した結合体５０ｂのみが形成され、第１の目的物質１２ａと磁気粒子１４と第１の標識粒子５６ａとが結合した結合体５０ａは形成されない。
従って、この場合には、検出光の照射によって大きな標識粒子と小さな標識粒子とが検出されるが、磁石２８の磁力によって、小さな標識粒子である第２の標識粒子４６ｂが結合した結合体５０ｂのみが磁石２８に向かって移動する。
従って、この場合には、検出光の照射によって大きな標識粒子と小さな標識粒子とが検出されるが、磁石２８の磁力によって、小さな標識粒子である第２の標識粒子４６ｂが結合した結合体５０ｂのみが磁石２８に向かって移動する。
検出液１０すなわち被検体中に、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂの両方が含まれている場合には、第１の目的物質１２ａと磁気粒子１４と第１の標識粒子４６ａとが結合した結合体５０ａ、および、第２の目的物質１２ｂと磁気粒子１４と第２の標識粒子４６ｂとが結合した結合体５０ｂが、形成される。
従って、この場合には、検出光の照射によって大きな標識粒子と小さな標識粒子とが検出され、磁石２８の磁力によって、大きな標識粒子である第１の標識粒子４６ａが結合した結合体５０ａ、および、小さな標識粒子である第２の標識粒子４６ｂが結合した結合体５０ｂが、共に、磁石２８に向かって移動する。
従って、この場合には、検出光の照射によって大きな標識粒子と小さな標識粒子とが検出され、磁石２８の磁力によって、大きな標識粒子である第１の標識粒子４６ａが結合した結合体５０ａ、および、小さな標識粒子である第２の標識粒子４６ｂが結合した結合体５０ｂが、共に、磁石２８に向かって移動する。
さらに、被検体中に第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂのいずれも含まれていない場合には、結合体５０ａおよび結合体５０ｂは形成されない。
従って、この場合には、検出光の照射によって大きな標識粒子と小さな標識粒子とが検出されるが、磁石２８を作用させても、移動する標識粒子は存在しない。
従って、この場合には、検出光の照射によって大きな標識粒子と小さな標識粒子とが検出されるが、磁石２８を作用させても、移動する標識粒子は存在しない。
従って、撮像素子３６が撮像した画像を観察あるいはさらに画像解析して、画像中で、大きな標識粒子である第１の標識粒子４６ａが結合した結合体５０ａの移動、および、小さな標識粒子である第２の標識粒子４６ｂが結合した結合体５０ｂの移動を検出し、あるいはさらに計数することにより、被検体中に、第１の目的物質１２ａおよび第２の目的物質１２ｂが存在するか否かを、検出できる。
すなわち、互いに異なる目的物質に結合し、かつ、互いにサイズが異なる、複数種の標識粒子を用いる本発明によれば、複数種の目的物質を検出できる。
なお、本例においては、光源３０は、第１の標識粒子４６ａおよび第２の標識粒子４６を観察可能にする検出光を照射する光源が用いられ、撮像素子３６は、光源３０が出射した検出光を測定可能な撮像素子が用いられる。
光源３０および撮像素子３６は、共に、上記条件を満たすものであれば、上述した公知のものが、各種、利用可能である。
光源３０および撮像素子３６は、共に、上記条件を満たすものであれば、上述した公知のものが、各種、利用可能である。
撮像素子３６によって撮像した画像は、画像処理を行ってもよい。例えば、各標識粒子のサイズに応じた粒径フィルターを設け、粒径フィルターによってサイズを識別して、各標識粒子（蛍光）を検出してもよい。また、光の強度に閾値を設定して、閾値を超える光を計数するようにしてもよい。
さらに、必要に応じて、検出光（励起光）の強度を変化させて、標識粒子の検出あるいはさらに計数を行ってもよい。
以上の点に関しては、上述した、複数種の標識粒子が生じる蛍光等の信号光が異なる第２条件を満たす場合でも、利用可能である。
さらに、必要に応じて、検出光（励起光）の強度を変化させて、標識粒子の検出あるいはさらに計数を行ってもよい。
以上の点に関しては、上述した、複数種の標識粒子が生じる蛍光等の信号光が異なる第２条件を満たす場合でも、利用可能である。
複数種の標識粒子が、互いにサイズが異なるという第１条件を満たす場合には、複数種の標識粒子は、最もサイズが近い標識粒子同士において、大きい標識粒子のサイズが、小さい標識粒子のサイズの２倍以上であるのが好ましく、２．５倍以上であるのがより好ましく、３倍以上であるのがさらに好ましい。
最もサイズが近い標識粒子同士において、サイズの差を２倍以上とすることにより、目的物質に結合して移動する複数種尾の標識粒子の識別を、より好適に行うことが可能になり、複数種の目的物質の検出を、より高精度、かつ、容易に行うことが可能になる。
なお、本発明において、標識粒子のサイズとは、標識粒子の最大長であり、すなわち、標識粒子を内包して内接する最小の球の直径である。また、標識粒子として市販の粒子を用いる場合には、カタログ等に記載される平均粒径を、標識粒子のサイズとしてもよい。本発明においては、標識粒子のサイズの差は、最もサイズが近い標識粒子同士において、最大長およびカタログ値の少なくとも一方が、２倍以上であればよい。
最もサイズが近い標識粒子同士において、サイズの差を２倍以上とすることにより、目的物質に結合して移動する複数種尾の標識粒子の識別を、より好適に行うことが可能になり、複数種の目的物質の検出を、より高精度、かつ、容易に行うことが可能になる。
なお、本発明において、標識粒子のサイズとは、標識粒子の最大長であり、すなわち、標識粒子を内包して内接する最小の球の直径である。また、標識粒子として市販の粒子を用いる場合には、カタログ等に記載される平均粒径を、標識粒子のサイズとしてもよい。本発明においては、標識粒子のサイズの差は、最もサイズが近い標識粒子同士において、最大長およびカタログ値の少なくとも一方が、２倍以上であればよい。
本発明の目的物質の検出方法において、複数種の標識粒子が、互いにサイズが異なるという第１条件を満たす場合にも、目的物質の検出は、図３に示すように、光源３０からの光の照射および撮像素子３６による撮像を行いつつ、結合体を一方向にのみ移動して行ってもよく、または、図４に示すように、光源３０からの光の照射および撮像素子３６による撮像を行いつつ、結合体を往復動させて行ってもよく、または、図５に示すように、結合体を磁石２８側に移動した後に、結合体が移動した位置に光源３０からの検出光の照射および撮像素子３６による撮像を行ってもよい。
この点に関しては、複数種の標識粒子が、第１条件および第２条件の両者を満たす場合でも、同様である。
この点に関しては、複数種の標識粒子が、第１条件および第２条件の両者を満たす場合でも、同様である。
以上の例では、励起光の照射によって標識粒子に蛍光を発光させることにより、または、検出光の照射によってサイズの異なる標識粒子を検出することにより、目的物質の検出を行っているが、本発明は、これに制限はされない。
すなわち、本発明の目的物質の検出方法は、標識粒子を発光させる励起光等の照射、および、標識粒子を検出するための検出光の照射のように、標識粒子に信号光を生じさせる光を照射して検出を行う方法には、制限されない。
例えば、蛍光顕微鏡等によるセル２４内部の観察が可能な場合、および、撮像手段４０の集光光学系３８の撮像倍率を大きくできる場合など、特に信号光を生じさせるための光の照射を行わずに、セル２４の内部を観察するための観察光によって、標識粒子を、直接的に、目視または撮像可能である場合には、標識粒子に信号光を生じさせるための光の照射を行わず、観察光を用いた観察あるいはさらに撮像によって、目的物質の検出を行ってもよい。
なお、本発明において、観察光のみを用いて目的物質を検出する場合には、観察光には、セル２４が存在する環境における環境光も含む。
すなわち、本発明の目的物質の検出方法は、標識粒子を発光させる励起光等の照射、および、標識粒子を検出するための検出光の照射のように、標識粒子に信号光を生じさせる光を照射して検出を行う方法には、制限されない。
例えば、蛍光顕微鏡等によるセル２４内部の観察が可能な場合、および、撮像手段４０の集光光学系３８の撮像倍率を大きくできる場合など、特に信号光を生じさせるための光の照射を行わずに、セル２４の内部を観察するための観察光によって、標識粒子を、直接的に、目視または撮像可能である場合には、標識粒子に信号光を生じさせるための光の照射を行わず、観察光を用いた観察あるいはさらに撮像によって、目的物質の検出を行ってもよい。
なお、本発明において、観察光のみを用いて目的物質を検出する場合には、観察光には、セル２４が存在する環境における環境光も含む。
本発明の目的物質の検出方法は、複数種の標識粒子が、サイズが互いに異なる第１条件のみを満たす構成、または、生じる信号光が互いに異なる第２条件のみを満たす構成に制限はされない。すなわち、本発明の目的物質の検出方法は、複数種の標識粒子が、サイズが互いに異なる第１条件、および、生じる信号光が互いに異なる第２条件の、両者を満たしてもよい。
複数種の標識粒子が第１条件および第２条件の両者を満たすことにより、例えば、発光波長（色）およびサイズが異なる蛍光の移動を検出することで、複数種の目的物質の検出を行うことが可能になるので、より高精度かつ高感度な目的物質の検出が可能になり、より好ましい。
複数種の標識粒子が第１条件および第２条件の両者を満たすことにより、例えば、発光波長（色）およびサイズが異なる蛍光の移動を検出することで、複数種の目的物質の検出を行うことが可能になるので、より高精度かつ高感度な目的物質の検出が可能になり、より好ましい。
以上、本発明の目的物質の検出方法について詳細に説明したが、本発明は上述の例に限定はされず、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の改良や変更を行ってもよいのは、もちろんである。
以下に実施例を挙げて本発明の特徴をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、試薬、使用量、物質量、割合、処理内容、および、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
＜抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子の作製＞
マウスモノクロナール抗インフルエンザＡ（核蛋白）抗体をBiotin Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所製）を用いてプロトコールに従ってビオチン修飾を行った。
次に、得られたビオチン化修飾抗体と、スプレプトアビジン結合磁気粒子Dynabeads MyOne Streptavidin C1（Thermo Fisher Scientific Inc.製、平均粒径1μｍ）とを用いて、プロトコールに従って抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子を作製した。
マウスモノクロナール抗インフルエンザＡ（核蛋白）抗体をBiotin Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所製）を用いてプロトコールに従ってビオチン修飾を行った。
次に、得られたビオチン化修飾抗体と、スプレプトアビジン結合磁気粒子Dynabeads MyOne Streptavidin C1（Thermo Fisher Scientific Inc.製、平均粒径1μｍ）とを用いて、プロトコールに従って抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子を作製した。
＜抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子の作製＞
マウスモノクロナール抗インフルエンザＡ（核蛋白）抗体に変えて、マウスモノクロナール抗インフルエンザＢ（核蛋白）抗体を用いた以外は、同様にして、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子を作製した。
マウスモノクロナール抗インフルエンザＡ（核蛋白）抗体に変えて、マウスモノクロナール抗インフルエンザＢ（核蛋白）抗体を用いた以外は、同様にして、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子を作製した。
＜抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ１の作製＞
マウスモノクロナール抗インフルエンザＡ（核蛋白）抗体（抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子の作製で使用したマウスモノクロナール抗インフルエンザＡ（核蛋白）抗体とは異なる抗体を使用した）を、Biotin Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所製）を用いて、プロトコールに従ってビオチン修飾を行った。
次に、得られたビオチン化修飾抗体と、スプレプトアビジン結合蛍光粒子Streptavidin Fluoresbrite YG Microspheres，６．０μｍ（Polysciences Inc.社製、平均粒径６μｍ）とを用いて、プロトコールに従って抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ１を作成した。
この標識粒子は、平均粒径６μｍ、励起波長ピーク４４１ｎｍ、発光波長ピーク４８６ｎｍの蛍光粒子である。
マウスモノクロナール抗インフルエンザＡ（核蛋白）抗体（抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子の作製で使用したマウスモノクロナール抗インフルエンザＡ（核蛋白）抗体とは異なる抗体を使用した）を、Biotin Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所製）を用いて、プロトコールに従ってビオチン修飾を行った。
次に、得られたビオチン化修飾抗体と、スプレプトアビジン結合蛍光粒子Streptavidin Fluoresbrite YG Microspheres，６．０μｍ（Polysciences Inc.社製、平均粒径６μｍ）とを用いて、プロトコールに従って抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ１を作成した。
この標識粒子は、平均粒径６μｍ、励起波長ピーク４４１ｎｍ、発光波長ピーク４８６ｎｍの蛍光粒子である。
＜抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ１の作製＞
マウスモノクロナール抗インフルエンザＢ（核蛋白）抗体（抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子の作製で使用したマウスモノクロナール抗インフルエンザＢ（核蛋白）抗体とは異なる抗体を使用した）を、Biotin Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所製）を用いてプロトコールに従ってビオチン修飾を行った。
次に、得られたビオチン化修飾抗体と、スプレプトアビジン結合蛍光粒子Streptavidin Fluoresbrite YG Microspheres，１．０μｍｍ（Polysciences Inc.社製、平均粒径１μｍ）とを用いて、プロトコールに従って抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ１を作製した。
この標識粒子は、平均粒径１μｍ、励起波長ピーク４４１ｎｍ、発光波長ピーク４８６ｎｍの蛍光粒子である。
マウスモノクロナール抗インフルエンザＢ（核蛋白）抗体（抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子の作製で使用したマウスモノクロナール抗インフルエンザＢ（核蛋白）抗体とは異なる抗体を使用した）を、Biotin Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所製）を用いてプロトコールに従ってビオチン修飾を行った。
次に、得られたビオチン化修飾抗体と、スプレプトアビジン結合蛍光粒子Streptavidin Fluoresbrite YG Microspheres，１．０μｍｍ（Polysciences Inc.社製、平均粒径１μｍ）とを用いて、プロトコールに従って抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ１を作製した。
この標識粒子は、平均粒径１μｍ、励起波長ピーク４４１ｎｍ、発光波長ピーク４８６ｎｍの蛍光粒子である。
＜検出液−１の調製＞
作製した、
抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子、
抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子、
抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ１（平均粒径６μｍ、励起波長ピーク４４１ｎｍ、発光波長ピーク４８６ｎｍ）、および、
抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ１（平均粒径１μｍ、励起波長ピーク４４１ｎｍ、発光波長ピーク４８６ｎｍ）
を、１ｍＬ（リットル）のＰＢＳに分散させ、検出液−１を調製した。各粒子の添加量は、全て、１×１０7個とした。
この検出液−１を用いる目的物質の検出は、目的物質として、インフルエンザＡ型抗体およびインフルエンザＢ型抗体を検出するものである。
作製した、
抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子、
抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子、
抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ１（平均粒径６μｍ、励起波長ピーク４４１ｎｍ、発光波長ピーク４８６ｎｍ）、および、
抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ１（平均粒径１μｍ、励起波長ピーク４４１ｎｍ、発光波長ピーク４８６ｎｍ）
を、１ｍＬ（リットル）のＰＢＳに分散させ、検出液−１を調製した。各粒子の添加量は、全て、１×１０7個とした。
この検出液−１を用いる目的物質の検出は、目的物質として、インフルエンザＡ型抗体およびインフルエンザＢ型抗体を検出するものである。
［実施例１］
＜サイズが異なる標識粒子（第１条件）によるインフルエンザＡ型核たんぱく抗原の検出＞
調製した検出液−１、１００μＬに、１×１０3ＰＦＵ（Plaque Forming Unit、プラーク形成単位）の濃度に調節した、同量のインフルエンザＡ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液を加えた混合液を調製した。
次に、得られた混合液を、セル（Photon Silde Ultra-low Fluorescence Counting Slides、Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ社製）に入れて、３分間静置した。
次いで、永久磁石をセルに近づけて、手動によって永久磁石を動かしつつ、図２に概念的に示すように、青色ＬＥＤ光源（ピーク波長４４０ｎｍ）によってセルの内部に励起光を照射し、セル内部の励起光照射領域を、一般的なカラーＣＣＤイメージセンサ、シャープカットフィルター（透過限界波長５２０ｎｍ）および集光光学系からなる撮像手段によって撮像した。
＜サイズが異なる標識粒子（第１条件）によるインフルエンザＡ型核たんぱく抗原の検出＞
調製した検出液−１、１００μＬに、１×１０3ＰＦＵ（Plaque Forming Unit、プラーク形成単位）の濃度に調節した、同量のインフルエンザＡ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液を加えた混合液を調製した。
次に、得られた混合液を、セル（Photon Silde Ultra-low Fluorescence Counting Slides、Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ社製）に入れて、３分間静置した。
次いで、永久磁石をセルに近づけて、手動によって永久磁石を動かしつつ、図２に概念的に示すように、青色ＬＥＤ光源（ピーク波長４４０ｎｍ）によってセルの内部に励起光を照射し、セル内部の励起光照射領域を、一般的なカラーＣＣＤイメージセンサ、シャープカットフィルター（透過限界波長５２０ｎｍ）および集光光学系からなる撮像手段によって撮像した。
撮像した画像を解析した結果、サイズが約６μｍの緑色の蛍光が、３５個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認された。また、検出液中には、サイズが約１μｍの緑色の蛍光も認められたが、この蛍光は、磁石を移動しても、移動しなかった。
これにより、混合液中で、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが６μｍの抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ１との結合体が形成され、かつ、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが１μｍの抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ１との結合体は形成されず、混合液中に、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原が存在し、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原が存在しないことが確認された。
これにより、混合液中で、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが６μｍの抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ１との結合体が形成され、かつ、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが１μｍの抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ１との結合体は形成されず、混合液中に、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原が存在し、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原が存在しないことが確認された。
［実施例２］
＜サイズが異なる標識粒子（第１条件）によるインフルエンザＢ型核たんぱく抗原の検出＞
インフルエンザＡ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液に変えて、同濃度で同量のインフルエンザＢ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液を用いて、混合液を調製した。
この混合液を用いた以外は、実施例１と同様に、目的物質の検出を行った。
その結果、サイズが約１μｍの緑色の蛍光が、２８個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認された。また、検出液中には、サイズが約６μｍの緑色の蛍光も認められたが、この蛍光は、磁石を移動しても、移動しなかった。
これにより、混合液中で、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが１μｍの抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ１との結合体が形成され、かつ、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが６μｍの抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ１との結合体は形成されず、混合液中に、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原が存在し、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原が存在しないことが確認された。
＜サイズが異なる標識粒子（第１条件）によるインフルエンザＢ型核たんぱく抗原の検出＞
インフルエンザＡ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液に変えて、同濃度で同量のインフルエンザＢ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液を用いて、混合液を調製した。
この混合液を用いた以外は、実施例１と同様に、目的物質の検出を行った。
その結果、サイズが約１μｍの緑色の蛍光が、２８個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認された。また、検出液中には、サイズが約６μｍの緑色の蛍光も認められたが、この蛍光は、磁石を移動しても、移動しなかった。
これにより、混合液中で、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが１μｍの抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ１との結合体が形成され、かつ、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが６μｍの抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ１との結合体は形成されず、混合液中に、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原が存在し、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原が存在しないことが確認された。
［実施例３］
＜サイズが異なる標識粒子（第１条件）によるインフルエンザＡ型核たんぱく抗原、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原の検出＞
調製した検出液−１、１００μＬに、１×１０3ＰＦＵの濃度に調節した、同量の、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液を加えて、混合液を調製した。
この混合液を用いた以外は、実施例１と同様に、目的物質の検出を行った。
その結果、サイズが約６μｍの緑色の蛍光が、２４個、永久磁石の移動に同期して移動していること、および、サイズが約１μｍの緑色の蛍光が、３１個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認された。
これにより、混合液中で、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが６μｍの抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ１との結合体、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが１μｍの抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ１との結合体が形成され、検出液中に、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原が存在することが確認された。
＜サイズが異なる標識粒子（第１条件）によるインフルエンザＡ型核たんぱく抗原、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原の検出＞
調製した検出液−１、１００μＬに、１×１０3ＰＦＵの濃度に調節した、同量の、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液を加えて、混合液を調製した。
この混合液を用いた以外は、実施例１と同様に、目的物質の検出を行った。
その結果、サイズが約６μｍの緑色の蛍光が、２４個、永久磁石の移動に同期して移動していること、および、サイズが約１μｍの緑色の蛍光が、３１個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認された。
これにより、混合液中で、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが６μｍの抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ１との結合体、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが１μｍの抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ１との結合体が形成され、検出液中に、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原が存在することが確認された。
また、実施例１〜３により、本発明によれば、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原を高感度に検出できることが明らかになった。
＜抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ２の作製＞
マウスモノクロナール抗インフルエンザＡ（核蛋白）抗体（抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子の作製で使用したマウスモノクロナール抗インフルエンザＡ（核蛋白）抗体とは異なる抗体を使用した）を、Biotin Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所製）を用いて、プロトコールに従ってビオチン修飾を行った。
次に、得られたビオチン化修飾抗体と、スプレプトアビジン結合蛍光粒子FS Cyanine3 Streptavidin beads（多摩川精機社製）とを用いて、プロトコールに従って抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ２を作成した。
この標識粒子は、平均粒径０．４μｍ、励起波長ピーク５５０ｎｍ、発光波長ピーク５７６ｎｍの蛍光粒子である。
マウスモノクロナール抗インフルエンザＡ（核蛋白）抗体（抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子の作製で使用したマウスモノクロナール抗インフルエンザＡ（核蛋白）抗体とは異なる抗体を使用した）を、Biotin Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所製）を用いて、プロトコールに従ってビオチン修飾を行った。
次に、得られたビオチン化修飾抗体と、スプレプトアビジン結合蛍光粒子FS Cyanine3 Streptavidin beads（多摩川精機社製）とを用いて、プロトコールに従って抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ２を作成した。
この標識粒子は、平均粒径０．４μｍ、励起波長ピーク５５０ｎｍ、発光波長ピーク５７６ｎｍの蛍光粒子である。
＜抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ２の作製＞
マウスモノクロナール抗インフルエンザＢ（核蛋白）抗体（抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子の作製で使用したマウスモノクロナール抗インフルエンザＢ（核蛋白）抗体とは異なる抗体を使用した）を、Biotin Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所製）を用いて、プロトコールに従ってビオチン修飾を行った。
次に、得られたビオチン化修飾抗体と、スプレプトアビジン結合蛍光粒子FS Eu Streptavidin beads（多摩川精機社製）とを用いて、プロトコールに従って抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ２を作製した。
この標識粒子は、平均粒径０．４μｍ、励起波長ピーク３４０ｎｍ、発光波長ピーク６１６ｎｍの蛍光粒子である。
マウスモノクロナール抗インフルエンザＢ（核蛋白）抗体（抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子の作製で使用したマウスモノクロナール抗インフルエンザＢ（核蛋白）抗体とは異なる抗体を使用した）を、Biotin Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所製）を用いて、プロトコールに従ってビオチン修飾を行った。
次に、得られたビオチン化修飾抗体と、スプレプトアビジン結合蛍光粒子FS Eu Streptavidin beads（多摩川精機社製）とを用いて、プロトコールに従って抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ２を作製した。
この標識粒子は、平均粒径０．４μｍ、励起波長ピーク３４０ｎｍ、発光波長ピーク６１６ｎｍの蛍光粒子である。
＜検出液−２の調製＞
作製した、
抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子、
抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子、
抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ２（平均粒径０．４μｍ、励起波長ピーク５５０ｎｍ、発光波長ピーク５７６ｎｍ）、および、
抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ２（平均粒径０．４μｍ、励起波長ピーク３４０ｎｍ、発光波長ピーク６１６ｎｍ）
を、１ｍＬのＰＢＳに分散させ、検出液−２を調製した。各粒子の添加量は、全て、１×１０7個とした。
この検出液−２を用いる目的物質の検出は、目的物質として、インフルエンザＡ型抗体およびインフルエンザＢ型抗体の検出を行うものである。
作製した、
抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子、
抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子、
抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ２（平均粒径０．４μｍ、励起波長ピーク５５０ｎｍ、発光波長ピーク５７６ｎｍ）、および、
抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ２（平均粒径０．４μｍ、励起波長ピーク３４０ｎｍ、発光波長ピーク６１６ｎｍ）
を、１ｍＬのＰＢＳに分散させ、検出液−２を調製した。各粒子の添加量は、全て、１×１０7個とした。
この検出液−２を用いる目的物質の検出は、目的物質として、インフルエンザＡ型抗体およびインフルエンザＢ型抗体の検出を行うものである。
［実施例４］
＜発光波長が異なる標識粒子（第２条件）によるインフルエンザＡ型核たんぱく抗原の検出＞
調製した検出液−２、１００μＬに、１×１０3ＰＦＵの濃度に調節した、同量のインフルエンザＡ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液を加えた。
次に、得られた混合液を、セル（Photon Silde Ultra-low Fluorescence Counting Slides、Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ社製）に入れて、３分間静置した。
次いで、永久磁石をセルに近づけて、手動によって永久磁石を動かしつつ、図２に概念的に示すように、セルの内部に、緑色ＬＥＤ光源によってピーク波長５１０ｎｍの励起光を、紫外線ＬＥＤ光源によってピーク波長３４０ｎｍの励起光を、順次、照射し、セル内部の励起光照射領域を、一般的なカラーＣＣＤイメージセンサ、シャープカットフィルター（透過限界波長５６０ｎｍ）および集光光学系からなる撮像手段によって撮像した。
＜発光波長が異なる標識粒子（第２条件）によるインフルエンザＡ型核たんぱく抗原の検出＞
調製した検出液−２、１００μＬに、１×１０3ＰＦＵの濃度に調節した、同量のインフルエンザＡ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液を加えた。
次に、得られた混合液を、セル（Photon Silde Ultra-low Fluorescence Counting Slides、Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ社製）に入れて、３分間静置した。
次いで、永久磁石をセルに近づけて、手動によって永久磁石を動かしつつ、図２に概念的に示すように、セルの内部に、緑色ＬＥＤ光源によってピーク波長５１０ｎｍの励起光を、紫外線ＬＥＤ光源によってピーク波長３４０ｎｍの励起光を、順次、照射し、セル内部の励起光照射領域を、一般的なカラーＣＣＤイメージセンサ、シャープカットフィルター（透過限界波長５６０ｎｍ）および集光光学系からなる撮像手段によって撮像した。
撮像した画像を解析した結果、ピーク波長５１０ｎｍの励起光を照射している状態では、橙色の蛍光が、２１個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認された。これに対し、ピーク波長３４０ｎｍの励起光を照射している状態では、赤色の蛍光が確認されたが、この蛍光は、磁石を移動しても、移動しなかった。
これにより、混合液中で、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子と、橙色の蛍光を呈する抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ２との結合体が形成され、かつ、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子と、赤色の蛍光を呈する抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ｂ２との結合体は形成されず、混合液中には、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原が存在し、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原が存在しないことが確認された。
これにより、混合液中で、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子と、橙色の蛍光を呈する抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ２との結合体が形成され、かつ、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子と、赤色の蛍光を呈する抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ｂ２との結合体は形成されず、混合液中には、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原が存在し、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原が存在しないことが確認された。
［実施例５］
＜発光波長が異なる標識粒子（第２条件）によるインフルエンザＢ型核たんぱく抗原の検出＞
インフルエンザＡ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液に変えて、同濃度で同量のインフルエンザＢ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液を用いて、混合液を調製した。
この混合液を用いた以外は、実施例４と同様に、目的物質の検出を行った。
その結果、ピーク波長５１０ｎｍの励起光を照射している状態では、橙色の蛍光が確認されたが、永久磁石を移動しても蛍光は移動しなかった。これに対し、ピーク波長３４０ｎｍの励起光を照射している状態では、赤色の蛍光が、１９個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認された。
これにより、混合液中で、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子と、赤色の蛍光を呈する抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ２との結合体が形成され、かつ、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子と、橙色の蛍光を呈する抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ａ２との結合体は形成されず、混合液中に、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原が存在し、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原が存在しないことが確認された。
＜発光波長が異なる標識粒子（第２条件）によるインフルエンザＢ型核たんぱく抗原の検出＞
インフルエンザＡ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液に変えて、同濃度で同量のインフルエンザＢ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液を用いて、混合液を調製した。
この混合液を用いた以外は、実施例４と同様に、目的物質の検出を行った。
その結果、ピーク波長５１０ｎｍの励起光を照射している状態では、橙色の蛍光が確認されたが、永久磁石を移動しても蛍光は移動しなかった。これに対し、ピーク波長３４０ｎｍの励起光を照射している状態では、赤色の蛍光が、１９個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認された。
これにより、混合液中で、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子と、赤色の蛍光を呈する抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ２との結合体が形成され、かつ、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子と、橙色の蛍光を呈する抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ａ２との結合体は形成されず、混合液中に、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原が存在し、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原が存在しないことが確認された。
［実施例６］
＜発光波長が異なる標識粒子（第２条件）によるインフルエンザＡ型核たんぱく抗原、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原の検出＞
調製した検出液−２、１００μＬに、１×１０3ＰＦＵの濃度に調節した、同量の、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液を加えて、混合液を調製した。
この混合液を用いた以外は、実施例４と同様に、目的物質の検出を行った。
その結果、ピーク波長５１０ｎｍの励起光を照射している状態では、橙色の蛍光が、２３個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認され、さらに、ピーク波長３４０ｎｍの励起光を照射している状態では、赤色の蛍光が、２４個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認された。
これにより、混合液中で、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子と、橙色の蛍光を呈する抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ２との結合体、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子と、赤色の蛍光を呈する抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−２との結合体が形成され、混合液中に、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原が存在することが確認された。
＜発光波長が異なる標識粒子（第２条件）によるインフルエンザＡ型核たんぱく抗原、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原の検出＞
調製した検出液−２、１００μＬに、１×１０3ＰＦＵの濃度に調節した、同量の、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液を加えて、混合液を調製した。
この混合液を用いた以外は、実施例４と同様に、目的物質の検出を行った。
その結果、ピーク波長５１０ｎｍの励起光を照射している状態では、橙色の蛍光が、２３個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認され、さらに、ピーク波長３４０ｎｍの励起光を照射している状態では、赤色の蛍光が、２４個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認された。
これにより、混合液中で、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子と、橙色の蛍光を呈する抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ２との結合体、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子と、赤色の蛍光を呈する抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−２との結合体が形成され、混合液中に、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原が存在することが確認された。
また、実施例４〜６により、本発明によれば、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原を高感度に検出できることが明らかになった。
＜抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ３の作製＞
マウスモノクロナール抗インフルエンザＡ（核蛋白）抗体（抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子の作製で使用したマウスモノクロナール抗インフルエンザＡ（核蛋白）抗体とは異なる抗体を使用した）を、Biotin Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所製）を用いて、プロトコールに従ってビオチン修飾を行った。
次に、得られたビオチン化修飾抗体と、スプレプトアビジン結合蛍光粒子Streptavidin Fluoresbrite YG Microspheres，１．０μｍｍ（Polysciences Inc.社製、平均粒径１μｍ）とを用いて、プロトコールに従って抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ３を作製した。
この標識粒子は、平均粒径１μｍ、励起波長ピーク４４１ｎｍ、発光波長ピーク４８６ｎｍの蛍光粒子である。
マウスモノクロナール抗インフルエンザＡ（核蛋白）抗体（抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子の作製で使用したマウスモノクロナール抗インフルエンザＡ（核蛋白）抗体とは異なる抗体を使用した）を、Biotin Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所製）を用いて、プロトコールに従ってビオチン修飾を行った。
次に、得られたビオチン化修飾抗体と、スプレプトアビジン結合蛍光粒子Streptavidin Fluoresbrite YG Microspheres，１．０μｍｍ（Polysciences Inc.社製、平均粒径１μｍ）とを用いて、プロトコールに従って抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ３を作製した。
この標識粒子は、平均粒径１μｍ、励起波長ピーク４４１ｎｍ、発光波長ピーク４８６ｎｍの蛍光粒子である。
＜抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ３の作製＞
マウスモノクロナール抗インフルエンザＢ（核蛋白）抗体（抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子の作製で使用したマウスモノクロナール抗インフルエンザＢ（核蛋白）抗体とは異なる抗体を使用した）を、Biotin Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所製）を用いて、プロトコールに従ってビオチン修飾を行った。
次に、得られたビオチン化修飾抗体と、スプレプトアビジン結合蛍光粒子FS Eu Streptavidin beads（多摩川精機社製）とを用いて、プロトコールに従って抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ３を作製した。
この標識粒子は、平均粒径０．４μｍ、励起波長ピーク３４０ｎｍ、発光波長ピーク６１６ｎｍの蛍光粒子である。
マウスモノクロナール抗インフルエンザＢ（核蛋白）抗体（抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子の作製で使用したマウスモノクロナール抗インフルエンザＢ（核蛋白）抗体とは異なる抗体を使用した）を、Biotin Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所製）を用いて、プロトコールに従ってビオチン修飾を行った。
次に、得られたビオチン化修飾抗体と、スプレプトアビジン結合蛍光粒子FS Eu Streptavidin beads（多摩川精機社製）とを用いて、プロトコールに従って抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ３を作製した。
この標識粒子は、平均粒径０．４μｍ、励起波長ピーク３４０ｎｍ、発光波長ピーク６１６ｎｍの蛍光粒子である。
＜検出液−３の調製＞
作製した、
抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子、
抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子、
抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ３（平均粒径１μｍ、励起波長ピーク４４１ｎｍ、発光波長ピーク４８６ｎｍ）、および、
抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ３（平均粒径０．４μｍ、励起波長ピーク３４０ｎｍ、発光波長ピーク６１６ｎｍ）
を、１ｍＬのＰＢＳに分散させ、検出液−３を調製した。各粒子の添加量は、全て、１×１０7個とした。
この検出液−３を用いる目的物質の検出は、目的物質として、インフルエンザＡ型抗体およびインフルエンザＢ型抗体の検出を行うものである。
作製した、
抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子、
抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子、
抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ３（平均粒径１μｍ、励起波長ピーク４４１ｎｍ、発光波長ピーク４８６ｎｍ）、および、
抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ３（平均粒径０．４μｍ、励起波長ピーク３４０ｎｍ、発光波長ピーク６１６ｎｍ）
を、１ｍＬのＰＢＳに分散させ、検出液−３を調製した。各粒子の添加量は、全て、１×１０7個とした。
この検出液−３を用いる目的物質の検出は、目的物質として、インフルエンザＡ型抗体およびインフルエンザＢ型抗体の検出を行うものである。
［実施例７］
＜サイズ（第１条件）および発光波長（第２条件）が異なる標識粒子によるインフルエンザＡ型核たんぱく抗原の検出＞
調製した検出液−３、１００μＬに、１×１０3ＰＦＵの濃度に調節した、同量のインフルエンザＡ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液を加えた。
次に、得られた混合液を、セル（Photon Silde Ultra-low Fluorescence Counting Slides、Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ社製）に入れて、３分間静置した。
次いで、永久磁石をセルに近づけて、手動によって永久磁石を動かしつつ、図２に概念的に示すように、セルの内部に、緑色ＬＥＤ光源によってピーク波長４４０ｎｍの励起光を、紫外線ＬＥＤ光源によってピーク波長３４０ｎｍの励起光を、順次、照射し、セル内部の励起光照射領域を、一般的なカラーＣＣＤイメージセンサ、シャープカットフィルター（透過限界波長５２０ｎｍ）および集光光学系からなる撮像手段によって撮像した。
＜サイズ（第１条件）および発光波長（第２条件）が異なる標識粒子によるインフルエンザＡ型核たんぱく抗原の検出＞
調製した検出液−３、１００μＬに、１×１０3ＰＦＵの濃度に調節した、同量のインフルエンザＡ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液を加えた。
次に、得られた混合液を、セル（Photon Silde Ultra-low Fluorescence Counting Slides、Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ社製）に入れて、３分間静置した。
次いで、永久磁石をセルに近づけて、手動によって永久磁石を動かしつつ、図２に概念的に示すように、セルの内部に、緑色ＬＥＤ光源によってピーク波長４４０ｎｍの励起光を、紫外線ＬＥＤ光源によってピーク波長３４０ｎｍの励起光を、順次、照射し、セル内部の励起光照射領域を、一般的なカラーＣＣＤイメージセンサ、シャープカットフィルター（透過限界波長５２０ｎｍ）および集光光学系からなる撮像手段によって撮像した。
撮像した画像を解析した結果、ピーク波長４４０ｎｍの励起光を照射している状態では、サイズが約１μｍの緑色の蛍光が、２１個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認された。これに対し、ピーク波長３４０ｎｍの励起光を照射している状態では、サイズが約０．４μｍの赤色の蛍光が確認されたが、この蛍光は、磁石を移動しても、移動しなかった。
これにより、混合液中で、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが１μｍで緑色の蛍光を呈する抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ３との結合体が形成され、かつ、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが０．４μｍで赤色の蛍光を呈する抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ３との結合体は形成されず、混合液中には、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原が存在し、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原が存在しないことが確認された。
これにより、混合液中で、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが１μｍで緑色の蛍光を呈する抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ３との結合体が形成され、かつ、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが０．４μｍで赤色の蛍光を呈する抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ３との結合体は形成されず、混合液中には、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原が存在し、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原が存在しないことが確認された。
［実施例８］
＜サイズ（第１条件）および発光波長（第２条件）が異なる標識粒子によるインフルエンザＢ型核たんぱく抗原の検出＞
インフルエンザＡ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液に変えて、同濃度で同量のインフルエンザＢ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液を用いて、混合液を調製した。
この混合液を用いた以外は、実施例７と同様に、目的物質の検出を行った。
その結果、ピーク波長４４０ｎｍの励起光を照射している状態では、サイズが約１μｍの緑色の蛍光が確認されたが、永久磁石を移動しても蛍光は移動しなかった。これに対し、ピーク波長３４０ｎｍの励起光を照射している状態では、サイズが約０．４μｍの赤色の蛍光が、１９個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認された。
これにより、混合液中で、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが０．４μｍで赤色の蛍光を呈する抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ３との結合体が形成され、かつ、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが１μｍで緑色の蛍光を呈する抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ３との結合体は形成されず、混合液中に、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原が存在し、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原が存在しないことが確認された。
＜サイズ（第１条件）および発光波長（第２条件）が異なる標識粒子によるインフルエンザＢ型核たんぱく抗原の検出＞
インフルエンザＡ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液に変えて、同濃度で同量のインフルエンザＢ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液を用いて、混合液を調製した。
この混合液を用いた以外は、実施例７と同様に、目的物質の検出を行った。
その結果、ピーク波長４４０ｎｍの励起光を照射している状態では、サイズが約１μｍの緑色の蛍光が確認されたが、永久磁石を移動しても蛍光は移動しなかった。これに対し、ピーク波長３４０ｎｍの励起光を照射している状態では、サイズが約０．４μｍの赤色の蛍光が、１９個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認された。
これにより、混合液中で、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが０．４μｍで赤色の蛍光を呈する抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ３との結合体が形成され、かつ、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが１μｍで緑色の蛍光を呈する抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ３との結合体は形成されず、混合液中に、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原が存在し、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原が存在しないことが確認された。
［実施例９］
＜サイズ（第１条件）および発光波長（第２条件）が異なる標識粒子によるインフルエンザＡ型核たんぱく抗原、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原の検出＞
調製した検出液−２、１００μＬに、１×１０3ＰＦＵの濃度に調節した、同量の、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液を加えて、混合液を調製した。
この混合液を用いた以外は、実施例７と同様に、目的物質の検出を行った。
その結果、ピーク波長４４０ｎｍの励起光を照射している状態では、サイズが約１μｍの緑色の蛍光が、２３個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認され、さらに、ピーク波長３４０ｎｍの励起光を照射している状態では、サイズが約０．４μｍの赤色の蛍光が、２４個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認された。
これにより、混合液中で、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが１μｍで緑色の蛍光を呈する抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ３との結合体、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが０．４μｍで赤色の蛍光を呈する抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ３との結合体が形成され、混合液中に、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原が存在することが確認された。
＜サイズ（第１条件）および発光波長（第２条件）が異なる標識粒子によるインフルエンザＡ型核たんぱく抗原、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原の検出＞
調製した検出液−２、１００μＬに、１×１０3ＰＦＵの濃度に調節した、同量の、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原のＰＢＳ溶液を加えて、混合液を調製した。
この混合液を用いた以外は、実施例７と同様に、目的物質の検出を行った。
その結果、ピーク波長４４０ｎｍの励起光を照射している状態では、サイズが約１μｍの緑色の蛍光が、２３個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認され、さらに、ピーク波長３４０ｎｍの励起光を照射している状態では、サイズが約０．４μｍの赤色の蛍光が、２４個、永久磁石の移動に同期して移動していることが確認された。
これにより、混合液中で、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＡ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが１μｍで緑色の蛍光を呈する抗インフルエンザＡ型抗体修飾標識粒子−Ａ３との結合体、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原と、抗インフルエンザＢ型抗体修飾磁気粒子と、サイズが０．４μｍで赤色の蛍光を呈する抗インフルエンザＢ型抗体修飾標識粒子−Ｂ３との結合体が形成され、混合液中に、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原が存在することが確認された。
また、実施例７〜９により、本発明によれば、第１条件と第２条件とを満たすことにより、標識粒子のサイズと発光波長（発光の色）との組み合わせによって、より好適に、インフルエンザＡ型核たんぱく抗原、および、インフルエンザＢ型核たんぱく抗原を高感度に検出できることが明らかになった。
以上の結果より、本発明の効果は明らかである。
以上の結果より、本発明の効果は明らかである。
医療および研究等におけるウイルス等の検出に好適に利用可能である。
１０ 検出液
１２ａ 第１の目的物質
１２ｂ 第２の目的物質
１４ 磁気粒子
１６ａ，４６ａ 第１の標識粒子
１６ｂ，４６ｂ 第２の標識粒子
２０ａ，２０ｂ，５０ａ，５０ｂ 結合体
２４ セル
２８ 磁石
３０ 光源
３２，３８ 集光光学系
３４ 励起光照射手段
３６ 撮像素子
４０ 撮像手段
１２ａ 第１の目的物質
１２ｂ 第２の目的物質
１４ 磁気粒子
１６ａ，４６ａ 第１の標識粒子
１６ｂ，４６ｂ 第２の標識粒子
２０ａ，２０ｂ，５０ａ，５０ｂ 結合体
２４ セル
２８ 磁石
３０ 光源
３２，３８ 集光光学系
３４ 励起光照射手段
３６ 撮像素子
４０ 撮像手段
Claims (8)
- 目的物質に磁気粒子と標識粒子とを結合させて、磁力によって目的物質と磁気粒子と標識粒子との結合体を移動させることで、前記目的物質を検出する検出方法であって、
互いに異なる前記目的物質に結合する複数種の前記標識粒子を用い、
前記複数種の標識粒子は、粒子のサイズが互いに異なる第１条件、および、光の照射によって信号光を生じるものであり、前記信号光が互いに異なる第２条件の、少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする、目的物質の検出方法。 - 前記複数種の標識粒子が前記第１条件を満たす場合に、最もサイズが近い前記標識粒子同士において、大きい前記標識粒子のサイズが、小さい前記標識粒子のサイズの２倍以上である、請求項１に記載の目的物質の検出方法。
- 前記複数種の標識粒子が前記第２条件を満たす場合に、前記標識粒子は、光の照射によって発光する粒子であり、最も発光波長が近い前記標識粒子同士において、発光波長の差が１５ｎｍ以上である、請求項１または２に記載の目的物質の検出方法。
- 前記複数種の標識粒子が、前記第１条件および前記第２条件の両方を満たす、請求項１〜３のいずれか１項に記載の目的物質の検出方法。
- 前記目的物質の検出を、前記標識粒子に信号光を生じさせる光を照射して行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の目的物質の検出方法。
- 前記目的物質の検出を、前記目的物質の検出視野を拡大して、前記目的物質の検出位置を観察するための観察光を用いて行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の目的物質の検出方法。
- 前記目的物質の検出を、前記磁力よって前記結合体を移動しつつ行う、請求項１〜６のいずれか１項に記載の目的物質の検出方法。
- 前記目的物質の検出を、前記磁力による前記結合体の移動を行った後に行う、請求項１〜６のいずれか１項に記載の目的物質の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018156553A JP2020030136A (ja) | 2018-08-23 | 2018-08-23 | 目的物質の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018156553A JP2020030136A (ja) | 2018-08-23 | 2018-08-23 | 目的物質の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2020030136A true JP2020030136A (ja) | 2020-02-27 |
Family
ID=69624250
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018156553A Pending JP2020030136A (ja) | 2018-08-23 | 2018-08-23 | 目的物質の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2020030136A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021006356A1 (ja) * | 2019-07-11 | 2021-01-14 | シチズン時計株式会社 | 被測定物質の検知装置 |
| JPWO2020040308A1 (ja) * | 2018-08-23 | 2021-08-10 | 富士フイルム株式会社 | 目的物質の検出方法 |
| WO2022085770A1 (ja) * | 2020-10-23 | 2022-04-28 | シチズン時計株式会社 | 被測定物質の検知装置及び検知方法 |
-
2018
- 2018-08-23 JP JP2018156553A patent/JP2020030136A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2020040308A1 (ja) * | 2018-08-23 | 2021-08-10 | 富士フイルム株式会社 | 目的物質の検出方法 |
| JP7148616B2 (ja) | 2018-08-23 | 2022-10-05 | 富士フイルム株式会社 | 目的物質の検出方法 |
| US12203851B2 (en) | 2018-08-23 | 2025-01-21 | Fujifilm Corporation | Method for detecting objective substance |
| WO2021006356A1 (ja) * | 2019-07-11 | 2021-01-14 | シチズン時計株式会社 | 被測定物質の検知装置 |
| US12000783B2 (en) | 2019-07-11 | 2024-06-04 | Citizen Watch Co., Ltd. | Device for detecting substance being measured |
| WO2022085770A1 (ja) * | 2020-10-23 | 2022-04-28 | シチズン時計株式会社 | 被測定物質の検知装置及び検知方法 |
| JPWO2022085770A1 (ja) * | 2020-10-23 | 2022-04-28 | ||
| JP7730835B2 (ja) | 2020-10-23 | 2025-08-28 | シチズン時計株式会社 | 被測定物質の検知装置及び検知方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7927561B2 (en) | Rapid particle detection assay | |
| US20230071162A1 (en) | Methods and apparatus for magnetic multi-bead assays | |
| CN108431575B (zh) | 基于双重图像的生物成像装置和技术 | |
| JP5699083B2 (ja) | 分析物を検出する方法 | |
| JP6301322B2 (ja) | 標的成分の定量的判定又は定性的判定のための方法及びシステム | |
| US20060129327A1 (en) | Ultrasensitive sensor and rapid detection of analytes | |
| TW201113523A (en) | Integrated sample preparation and analyte detection | |
| EP2960651B1 (en) | Bioanalysis device and biomolecule analyser | |
| US20220168735A1 (en) | Point of Care Concentration Analyzer | |
| WO2014007034A1 (ja) | 分析装置及び分析方法 | |
| JP2017515130A (ja) | 合成糸をベースとする側方流動イムノアッセイ | |
| JP2020030136A (ja) | 目的物質の検出方法 | |
| CN109804235B (zh) | 目标物质检测装置及目标物质检测方法 | |
| US12203851B2 (en) | Method for detecting objective substance | |
| JP2013238420A (ja) | 試料分析装置及び試料分析方法 | |
| US20230221319A1 (en) | A Method, A System, An Article, A Kit And Use Thereof For Biomolecule, Bioorganelle, Bioparticle, Cell And Microorganism Detection | |
| WO2019138865A1 (ja) | 検出装置および検出方法 | |
| CN116298240B (zh) | 一种免疫检测方法及系统 | |
| WO2020064626A1 (en) | Microfluidic droplet-based assay process and apparatus | |
| EP4425180A1 (en) | Immunoassay using magnetic microspheres | |
| WO2004109283A1 (ja) | 生化学検出装置及び検出方法 | |
| WO2019181400A1 (ja) | 被検体の処理方法および被検体処理用容器 | |
| JP2019124521A (ja) | 検出装置および検出方法 |