JP2020170010A - 組織サンプルを分析するための方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】分離不要で区別できない構造の特徴付けおよび定量を可能にする、組織サンプルを分析するための方法を提供する。【解決手段】不飽和化合物を含む組織サンプルを得る工程、不飽和化合物内の炭素−炭素二重結合を標的にするラジカル反応を組織サンプルにおいて行う工程であって、複数の化合物異性体を生成する工程、複数の化合物異性体を質量分析に供する工程であって、不飽和化合物内の炭素−炭素二重結合の位置を特定する工程、および正常組織と罹患組織とを識別するために複数の化合物異性体を定量する工程を含む方法を提供する。特に、ラジカル反応（例えば、パターノ・ビューチ反応）をタンデム質量分析と連結することによって、組織における脂質Ｃ＝Ｃ異性体の包括的な特徴付けおよび定量を可能にする。【選択図】図１ＡＢ

Description

関連出願
本願は、２０１５年５月９日に出願された米国仮出願第６２／１６８，０３３号の優先権の利益を主張し、その内容全体が、本明細書中に参照によって援用される。
政府援助
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＧＭ１０６０１６、および米国国立科学財団によって授与されたＣＨＥ１３０８１１４のもとの政府援助によって行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、概して、組織サンプルを分析するための方法に関する。
背景
脂質は、種々の異なる頭部基、骨格および疎水性アシル鎖からなるという点において構造的に多様な分子である。脂質は、原形質膜の基本単位として働き、生体系のシグナル伝達およびエネルギー貯蔵において重要な役割を果たす。脂質の頭部基、アシル鎖長および不飽和度が様々であることは、膜の特性および機能（例えば、粘度、脂質−タンパク質相互作用および脂質−脂質相互作用（これらのすべてが正常な細胞機能にとって重要である））の調節に利用される。同様に、全脂質組成の変化は疾患に結びつくため、脂質プロファイルは、実際の診断において病状を探索するためのマーカーとしてますます使用されるようになっている。
しかしながら、質量分析を用いた脂質プロファイリングの場合、異性体のおよび／または同重体の脂質は、単一ピークとして現れることから、スペクトルの解釈および詳細な組成情報（例えば、ある組成に含まれている脂質種の量）の取得が困難である。既存の研究によって、脂質のアシル鎖におけるＣ＝Ｃの数および位置が生物学的に重要であることが示されているので（Ｇｒｏｅｇｅｒら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ６，４３３−４４１（２０１０）；Ｌｏｍｂａｒｄら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏ １０，５０７−５１５（２０１２）；およびＢｌａｎｋｓｂｙら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３，４３３−４６５（２０１０））、上記のことには、大きな意義がある例えば。オメガ−６およびオメガ−３脂肪酸アシルを有するリン脂質（ＰＬ）は、インビボにおいて、逆の生物学的活性を有する化合物に変換され得る（Ｇｒｏｅｇｅｒら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ６，４３３−４４１（２０１０））。
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）および液体クロマトグラフィー（ＬＣ）は、脂質（および／またはそれらのＣ＝Ｃ異性体）の定量を可能にする従来の方法である。しかしながら、退屈なサンプル調製、専用のＧＣカラムおよび時間のかかるクロマトグラフ条件最適化が必要である。リピドームにおける多数かつ様々なタイプの脂質を考慮すると、分離不要で区別できない構造の特徴付けおよび定量を可能にする方法が非常に望ましい。質量分析（ＭＳ）は、優れた感度および特異性を提供することから、現在、脂質分析において最適な方法になっているが、ＭＳ法を全リピドームの完全な構造の特徴付け（「トップダウン」リピドミクス）と定量を同時に行うことに拡大することは、実現が難しいままである。飽和脂質のプロファイリングと比べて、不飽和脂質の分析は、２つの点：Ｃ＝Ｃの数および位置の特定、ならびに脂質Ｃ＝Ｃ異性体の定量において課題に直面している。過去２０年間で、化学誘導体化ベースの方法が継続的に発展し、それらの方法は脂質Ｃ＝Ｃ異性体の特徴付けに成功した。しかしながら、これらの異性体の定量を試みたものはそれらのうちのいくつかしかなかった。
Ｇｒｏｅｇｅｒら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ６，４３３−４４１（２０１０） Ｌｏｍｂａｒｄら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏ １０，５０７−５１５（２０１２） Ｂｌａｎｋｓｂｙら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３，４３３−４６５（２０１０）） Ｇｒｏｅｇｅｒら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ６，４３３−４４１（２０１０）
要旨
不飽和脂質は、生物内の全脂質の大部分を構成しており、それらの物理的特性、化学反応性および生体内変換は、種々の生理学的機能および生理化学的機能と密接な関係がある。しかしながら、脂質Ｃ＝Ｃ異性体、特に、複雑な混合物由来の脂質Ｃ＝Ｃ異性体の同定と定量を同時に行うことは、現在のところ困難である。本発明は、ラジカル反応（例えば、パターノ・ビューチ反応）をタンデム質量分析と連結することによって、組織における脂質Ｃ＝Ｃ異性体の包括的な特徴付けおよび定量を可能にする方法を提供する。それらの方法を用いて、ラットにおいて、脂肪酸（ＦＡ）１８：１およびＣ１８：１含有リン脂質がすべて、２つのＣ＝Ｃ異性体型：Ｃ１８：１ ｎ−７およびＣ１８：１ ｎ−９として存在し、しかしながら、それらの相対比は、脂質および組織タイプによって異なるすることが実証された。マウスの正常乳房組織と癌性乳房組織との間で、ＦＡ１８：１およびＣ１８：１含有ホスホコリンの異性体組成の有意差が観察された。特許請求される方法は、定量的ショットガンリピドミクスに適しており、基礎をなす不飽和脂質の精密定量による高度な生物学的研究に寄与する。
他の態様において、本発明の方法は、ショットガンリピドミクスに応用され得る。脂質は、組織サンプルから抽出され、次いで、ＰＢ試薬を含む溶媒に移される。その溶媒は、ナノＥＳＩチューブに移される。適切な波長のＵＶ光が提供されることにより、反応が促進される。溶媒に印加される高電圧などのスプレーイオン化条件は確立されており、ＰＢ反応生成物に対してイオンが生成され、続いてそれらがＭＳおよびタンデムＭＳ分析によって質量分析される。
ある特定の実施形態において、本発明の方法は、オンラインＨＰＬＣ−ＭＳに使用され得る。ＰＢ試薬が、ＨＰＬＣの溶出液に混合される。ＨＰＬＣとＭＳを接続しているキャピラリーの一部が、適切な波長のＵＶ光に曝露されることにより、反応が可能になる。次いで、溶液中の生成物が、ＭＳおよびタンデムＭＳを用いた分析に向けてイオン化される。
上で論じられたように、本発明の方法は、定量分析に使用され得る。特徴的なフラグメントイオンが、脂質のＰＢ生成物イオンのＣＩＤ、すなわち、ＰＢ試薬のニュートラルロスから得られ、Ｃ＝Ｃ診断用イオンが、定量のために使用される。アセトンが、ＰＢ試薬として使用されるとき、５８Ｄａのニュートラルロススキャン（ＮＬＳ）が、Ｃ−Ｃ二重結合からなる脂肪酸、グリセロール脂質およびステロール脂質の定量のために使用される。脂質Ｃ＝Ｃ異性体を定量する場合、Ｃ＝Ｃ診断用イオンのイオン強度が、相対定量または絶対定量のために使用される。
ある特定の実施形態において、本発明の方法は、インビボ組織の分析に使用され得る。針を用いて組織サンプルに触れ、次いで、溶媒およびＰＢ試薬を含むナノＥＳＩチューブに挿入する。針によってサンプリングされた脂質が、溶媒に溶解される。適切な波長の光が提供されることにより、ＰＢ反応が可能となり、反応生成物をイオン化するスプレー条件が確立され、続いて、その反応生成物がＭＳおよびタンデムＭＳを用いて分析される。そのような方法は、例えば、Ｐｕｒｄｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎに対する国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４／１２０４１１（その内容の全体が、参照により本明細書中に援用される）に記載されている抽出スプレー（ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｐｒａｙ）に基づき得る。
本発明の方法は、ＭＳイメージングにも使用され得る。ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは、反応試薬は、ＭＡＬＤＩマトリックス中で混合され得るか、または別々に組織上にスプレーされ得る。その反応は、ＭＡＤＬＩ用のＵＶレーザーが脱離イオン化のために適用されると、可能になり得る。ＭＡＬＤＩレーザーに加えて、別個の光源もＰＢ反応のためだけに提供され得る。上に記載された方法は、表面分析のためのレーザーアブレーション、例えば、レーザーアブレーションエレクトロスプレーイオン化（ＬＡＥＳＩ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１０；６５６：１５９−７１．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−６０７６１−７４６−４＿９）およびエレクトロスプレーレーザー脱離イオン化（Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００５；１９（２４）：３７０１−４）を用いるアンビエントＭＳ法に適用される。ナノＤＥＳＩ（Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２０１２ Ｊａｎ ３；８４（１）：１４１−８．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃ２０２１３２２）または液体抽出表面分析（ＬＥＳＡ，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１１ Ｄｅｃ １５；２５（２３）：３５８７−９６．ｄｏｉ：１０．１００２／ｒｃｍ．５２７４）などの方法を用いる表面分析のためのアンビエントＭＳ。これらの方法では、１つのチャネル（チャネルＩ）が、化学的化合物を抽出するための溶媒を送達するために使用され、別のチャネル（チャネルＩＩ）が、分析種を含む溶媒をＭＳインレットに向かって移動させるために使用され、ここで、抽出された分析種をイオン化するためのイオン化条件は、確立されている。ＰＢ試薬を抽出溶媒に混合し、チャネルＩＩ内の溶媒を適切な波長のＵＶ光に曝露することによって、ＰＢ反応が実行され得る。
ある特定の態様において、本発明は、組織サンプルを分析するための方法を提供し、その方法は、不飽和化合物を含む組織サンプルを得る工程を含む。その組織サンプル上で、不飽和化合物内の炭素−炭素二重結合を標的にするラジカル反応を行うことにより、複数の化合物異性体を生成する。それらの複数の化合物異性体を質量分析に供することにより、不飽和化合物内の炭素−炭素二重結合の位置を特定する。次いで、正常組織と罹患組織とを識別するために、複数の化合物異性体を定量する。本発明の方法は、数多くの異なるタイプの不飽和化合物に対して行うことができる。例示的な不飽和化合物としては、脂質または脂肪酸が挙げられる。
その反応が不飽和化合物内の炭素−炭素二重結合を標的にする限り、数多くの異なるタイプのラジカル反応を本発明の方法とともに用いることができる。ある特定の実施形態において、ラジカル反応は、不飽和化合物およびラジカル反応用の試薬を紫外線に曝露する工程を含む。ある特定の実施形態において、ラジカル反応は、パターノ・ビューチ（ＰＢ）反応である。そのような実施形態では、パターノ・ビューチ（ＰＢ）反応は、アセトンを含む溶媒混合物中で行われ得る。
ラジカル反応は、不飽和化合物が質量分析プローブ内に存在している間に行われ得る。そのような実施形態では、質量分析プローブの少なくとも一部は、紫外線に対して透過性であり得る。例えば、質量分析プローブは、およそ２００ｎｍの波長の紫外線に対して透過性である材料から構成され得る。他の実施形態において、ラジカル反応は、容器内で行われ、その反応の後、化合物異性体が質量分析プローブに移される。他の実施形態において、ラジカル反応は、高圧液体クロマトグラフィーシステムと関連して行われ、そのラジカル反応用の試薬は、溶出溶媒中に存在する。
本発明の他の態様は、組織サンプルを分析するための方法を提供し、その方法は、不飽和化合物がサンプリングプローブ上に保持されるように、不飽和化合物を含む組織にサンプリングプローブを接触させる工程を含む。そのサンプリングプローブを中空体に挿入し、ここで、ラジカル反応用の試薬が、中空体内に存在し、そのラジカル反応は、不飽和化合物内の炭素−炭素二重結合を標的にする。ラジカル反応を中空体内で行うことにより、反応生成物を生成する。反応生成物を、中空体の遠位端から放出させる。次いで、不飽和化合物内の炭素−炭素二重結合の位置を特定するために、放出された反応生成物を、質量分析計において分析する。本発明の方法は、数多くの異なるタイプの不飽和化合物に対して行うことができる。例示的な不飽和化合物としては、脂質または脂肪酸が挙げられる。
サンプルプローブにとって数多くの配置が可能であり、遠位端を有する分析プローブが本発明の方法に適合している。ある特定の実施形態において、サンプリングプローブは、針を備える。
その反応が不飽和化合物内の炭素−炭素二重結合を標的にする限り、数多くの異なるタイプのラジカル反応を本発明の方法とともに用いることができる。ある特定の実施形態において、ラジカル反応は、不飽和化合物およびラジカル反応用の試薬を紫外線に曝露する工程を含む。ある特定の実施形態において、ラジカル反応は、パターノ・ビューチ（ＰＢ）反応である。そのような実施形態では、パターノ・ビューチ（ＰＢ）反応は、アセトンを含む溶媒混合物中で行われ得る。
ラジカル反応は、不飽和化合物が質量分析プローブ内に存在している間に行われ得る。そのような実施形態では、不飽和化合物は、その反応が行われている間に、中空体を通過し得る。そのような実施形態では、質量分析プローブの少なくとも一部は、紫外線に対して透過性であり得る（例えば、すべての中空体の少なくとも一部が、石英ガラスまたは溶融石英から構成され得る）。例えば、質量分析プローブは、およそ２００ｎｍの波長の紫外線に対して透過性である材料から構成され得る。
本発明の他の態様は、組織サンプルをイメージングするための方法を提供する。そのような方法は、不飽和化合物を含む組織にラジカル反応用の試薬を導入する工程を含み得、ここで、そのラジカル反応は、不飽和化合物内の炭素−炭素二重結合を標的にする。ラジカル反応を行うことにより、反応生成物を生成する。反応生成物が時間分解的に脱離され、イオン化されるように、組織を走査する。脱離され、イオン化された反応生成物を質量分析計において分析する。分析工程の結果に基づいて、組織のイメージを生成する。ある特定の実施形態において、ラジカル反応を行う工程と走査する工程は、同時に行われる。他の実施形態において、それらの工程は、連続的に行われる。
ある特定の実施形態において、走査は、組織上の複数の異なる位置において脱離エレクトロスプレーイオン化プローブを用いて脱離エレクトロスプレーイオン化法を行うことを含む。ラジカル反応用の試薬は、脱離エレクトロスプレーイオン化プローブを介して組織に導入され得、その組織に紫外線が適用され得る。ある特定の実施形態において、ラジカル反応を行う工程と走査する工程は、同時に行われる。他の実施形態において、それらの工程は、連続的に行われる。
他の実施形態において、導入工程は、ＭＡＬＤＩマトリックス中のラジカル反応用の試薬を組織に適用する工程を含む。そのような実施形態では、走査は、組織上の複数の異なる位置においてＭＡＬＤＩソースを用いてＭＡＬＤＩ法を行うことを含む。ある特定の実施形態において、ラジカル反応を行う工程と走査する工程は、同時に行われる。他の実施形態において、それらの工程は、連続的に行われる。
ある特定の実施形態において、脂質および組織の分析は、小型質量分析計の使用を含む。適切な波長のＬＥＤまたはＬＥＤアレイが、ＰＢ反応に必要な光を提供するために使用され得る。ＰＢ反応イオン化源は、タンデムＭＳの能力を有するＤＡＰＩ−ＭＳ機器と組み合わされ得る。
当該分野で公知の任意のタイプの質量分析計が、本発明の方法とともに使用され得る。例えば、質量分析計は、標準的なベンチトップ質量分析計であり得る。他の実施形態において、質量分析計は、小型質量分析計である。例示的な小型質量分析計は、例えば、Ｇａｏら（Ｚ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，７８，５９９４−６００２）（この内容の全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。小型質量分析計は通常、数千ワットの電力を用いるラボスケールの機器に使用されるポンピングシステムと比較して、それより小さいポンピングシステム、例えば、Ｇａｏらに記載されているシステム用の、わずか５Ｌ／分（０．３ｍ３／時）の隔膜ポンプおよび１１Ｌ／ｓのターボポンプを備える１８Ｗポンピングシステムを有する。他の例示的な小型質量分析計は、例えば、Ｇａｏら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８０：７１９８−７２０５，２００８）、Ｈｏｕら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８３：１８５７−１８６１，２０１１）およびＳｏｋｏｌら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２０１１，３０６，１８７−１９５）（これらの各内容の全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。小型質量分析計は、例えば、Ｘｕら（ＪＡＬＡ，２０１０，１５，４３３−４３９）；Ｏｕｙａｎｇら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，８１，２４２１−２４２５）；Ｏｕｙａｎｇら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，２，１８７−２１４）；Ｓａｎｄｅｒｓら（Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２００９，１６，１１−２０）；Ｇａｏら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００６，７８（１７），５９９４−６００２）；Ｍｕｌｌｉｇａｎら（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍ．，２００６，１７０９−１７１１）；およびＦｉｃｏら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，７９，８０７６−８０８２）（これらの各内容の全体が参照により本明細書中に援用される）にも記載されている。
本発明の方法は、必要に応じて、不連続なインターフェースの使用を含み得、中性分子のイオン化が、不連続なインターフェースの操作と同期され得る。そのようなシステムおよび方法は、例えば、Ｏｕｙａｎｇら（米国特許第８，３０４，７１８号）およびＯｕｙａｎｇら（米国特許第８，７８５，８４６号）（これらの各内容の全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
特定の実施形態において、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
組織サンプルを分析するための方法であって、該方法は、
不飽和化合物を含む組織サンプルを得る工程；
該不飽和化合物内の炭素−炭素二重結合を標的にするラジカル反応を該組織サンプルにおいて行うことにより、複数の化合物異性体を生成する工程；
該複数の化合物異性体を質量分析に供する工程であって、該不飽和化合物内の該炭素−炭素二重結合の位置を特定する工程；および
正常組織と罹患組織とを識別するために該複数の化合物異性体を定量する工程
を含む、方法。
（項目２）
前記不飽和化合物が、脂質または脂肪酸である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ラジカル反応が、前記不飽和化合物および該ラジカル反応用の試薬を紫外線に曝露する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記不飽和化合物が質量分析プローブ内に存在している間に、前記ラジカル反応が行われる、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記質量分析プローブの少なくとも一部が紫外線に対して透過性である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記質量分析プローブが、およそ２００ｎｍの波長の紫外線に対して透過性である材料から構成される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ラジカル反応が容器内で行われ、該反応の後、前記化合物異性体が質量分析プローブに移される、項目３に記載の方法。
（項目８）
前記ラジカル反応が、高圧液体クロマトグラフィーシステムと関連して行われ、該ラジカル反応用の試薬が、溶出溶媒中に存在する、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ラジカル反応が、パターノ・ビューチ（ＰＢ）反応である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記パターノ・ビューチ（ＰＢ）反応が、アセトンを含む溶媒混合物中で行われる、項目８に記載の方法。
（項目１１）
組織サンプルを分析するための方法であって、該方法は、
不飽和化合物がサンプリングプローブ上に保持されるように、該不飽和化合物を含む組織に該サンプリングプローブを接触させる工程；
該サンプリングプローブを中空体に挿入する工程であって、ここで、ラジカル反応用の試薬が、該中空体内に存在し、該ラジカル反応は、該不飽和化合物内の炭素−炭素二重結合を標的にする、工程；
該ラジカル反応を該中空体内で行う工程であって、反応生成物を生成する工程；
該反応生成物を該中空体の遠位端から放出する工程；および
該不飽和化合物内の該炭素−炭素二重結合の位置を特定するために、放出された反応生成物を質量分析計において分析する工程
を含む、方法。
（項目１２）
前記不飽和化合物が、脂質または脂肪酸である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記サンプリングプローブが、針を備える、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記ラジカル反応が、前記不飽和化合物および前記ラジカル反応用の試薬を紫外線に曝露する工程を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記反応が行われている間に、前記不飽和化合物を前記中空体に通過させる、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記中空体の少なくとも一部が、紫外線に対して透過性である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記中空体が、およそ２００ｎｍの波長の紫外線に対して透過性である材料から構成される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記中空体が、石英ガラスまたは溶融石英から構成される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記ラジカル反応が、パターノ・ビューチ（ＰＢ）反応である、項目１１に記載の方法。
（項目２０）
前記パターノ・ビューチ（ＰＢ）反応が、アセトンを含む溶媒混合物中で行われる、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
組織サンプルをイメージングするための方法であって、該方法は、
不飽和化合物を含む組織にラジカル反応用の試薬を導入する工程であって、ここで、該ラジカル反応は、該不飽和化合物内の炭素−炭素二重結合を標的にする、工程；
該ラジカル反応を行う工程であって、反応生成物を生成する工程；
該反応生成物が時間分解的に脱離され、イオン化されるように、該組織を走査する工程；該脱離され、イオン化された反応生成物を質量分析計において分析する工程；および
該分析工程の結果に基づいて該組織のイメージを生成する工程
を含む、方法。
（項目２２）
走査が、前記組織上の複数の異なる位置において脱離エレクトロスプレーイオン化プローブを用いて脱離エレクトロスプレーイオン化法を行うことを含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ラジカル反応用の前記試薬が、前記脱離エレクトロスプレーイオン化プローブを介して前記組織に導入され、紫外線が、該組織に適用される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記ラジカル反応を行う工程と前記走査する工程が同時に行われる、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記導入する工程が、ＭＡＬＤＩマトリックス中のラジカル反応用の試薬を前記組織に適用する工程を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
走査が、前記組織上の複数の異なる位置においてＭＡＬＤＩソースを用いてＭＡＬＤＩ法を行うことを含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記ラジカル反応を行う工程と前記走査する工程が同時に行われる、項目２６に記載の方法。
図１Ａ〜Ｂは、不飽和脂質を同定および定量するための光化学誘導体化−タンデムＭＳの原理を示している。図１Ａは、Ｐ−Ｂ反応とナノＥＳＩ−ＭＳとを連結する例示的な構成を示している。図１Ｂは、異なる脂質Ｃ＝Ｃ異性体に特異的な異なる診断用イオンの生成を図示しているスキームである（右）。＋／−は、正／負電荷を表す。電荷を有するフラグメントだけが診断用イオンとして検出可能である。図１Ｃは、ＦＡ１８：１ ｎ−９とＦＡ１８：１ ｎ−７との４：１混合物のＰ−Ｂ反応スペクトルであり、ここで、Ｐ−Ｂ反応生成物の形成が観察された（ｍ／ｚ３３９．３）。図１Ｄは、インタクトなＦＡ１８：１ ｎ−９のＣＩＤ質量スペクトルである。Ｃ＝Ｃの位置情報を取り出せない。図１Ｅは、ＣＩＤにおいて、ＦＡ１８：１混合物のＰ−Ｂ反応生成物が、ｍ／ｚ１７１．１／１９７．２およびｍ／ｚ１９９．１／２２５．２という２つの異なる診断用イオン対を放出することを示している質量スペクトルであり、２つのＦＡ１８：１ ｎ−９およびｎ−７異性体の存在を明らかに示している。図１Ｆは、等モルのＰＣ１８：１ ｎ−９／１８：１ ｎ−９およびＰＣ１８：１ ｎ１２／１８：１ ｎ１２（ｍ／ｚ７８６．６）の反応質量スペクトルである。図１Ｇは、Ｃ＝Ｃの位置情報を取り出せないインタクトなＰＣ（ｍ／ｚ７８６．６）のインタクトなＣＩＤ質量スペクトルである。図１Ｈは、上記ＰＣ混合物からのＰ−Ｂ反応生成物（ｍ／ｚ８４４．６）のＣＩＤ質量スペクトルである。各ＰＣ異性体におけるＣ＝Ｃの位置に対応する２対の診断用イオン（ｍ／ｚ６３４．５／６６０．５およびｍ／ｚ６７６．６／７０２．６）が高い存在比で形成された。 図１Ａ〜Ｂは、不飽和脂質を同定および定量するための光化学誘導体化−タンデムＭＳの原理を示している。図１Ａは、Ｐ−Ｂ反応とナノＥＳＩ−ＭＳとを連結する例示的な構成を示している。図１Ｂは、異なる脂質Ｃ＝Ｃ異性体に特異的な異なる診断用イオンの生成を図示しているスキームである（右）。＋／−は、正／負電荷を表す。電荷を有するフラグメントだけが診断用イオンとして検出可能である。図１Ｃは、ＦＡ１８：１ ｎ−９とＦＡ１８：１ ｎ−７との４：１混合物のＰ−Ｂ反応スペクトルであり、ここで、Ｐ−Ｂ反応生成物の形成が観察された（ｍ／ｚ３３９．３）。図１Ｄは、インタクトなＦＡ１８：１ ｎ−９のＣＩＤ質量スペクトルである。Ｃ＝Ｃの位置情報を取り出せない。図１Ｅは、ＣＩＤにおいて、ＦＡ１８：１混合物のＰ−Ｂ反応生成物が、ｍ／ｚ１７１．１／１９７．２およびｍ／ｚ１９９．１／２２５．２という２つの異なる診断用イオン対を放出することを示している質量スペクトルであり、２つのＦＡ１８：１ ｎ−９およびｎ−７異性体の存在を明らかに示している。図１Ｆは、等モルのＰＣ１８：１ ｎ−９／１８：１ ｎ−９およびＰＣ１８：１ ｎ１２／１８：１ ｎ１２（ｍ／ｚ７８６．６）の反応質量スペクトルである。図１Ｇは、Ｃ＝Ｃの位置情報を取り出せないインタクトなＰＣ（ｍ／ｚ７８６．６）のインタクトなＣＩＤ質量スペクトルである。図１Ｈは、上記ＰＣ混合物からのＰ−Ｂ反応生成物（ｍ／ｚ８４４．６）のＣＩＤ質量スペクトルである。各ＰＣ異性体におけるＣ＝Ｃの位置に対応する２対の診断用イオン（ｍ／ｚ６３４．５／６６０．５およびｍ／ｚ６７６．６／７０２．６）が高い存在比で形成された。 図１Ａ〜Ｂは、不飽和脂質を同定および定量するための光化学誘導体化−タンデムＭＳの原理を示している。図１Ａは、Ｐ−Ｂ反応とナノＥＳＩ−ＭＳとを連結する例示的な構成を示している。図１Ｂは、異なる脂質Ｃ＝Ｃ異性体に特異的な異なる診断用イオンの生成を図示しているスキームである（右）。＋／−は、正／負電荷を表す。電荷を有するフラグメントだけが診断用イオンとして検出可能である。図１Ｃは、ＦＡ１８：１ ｎ−９とＦＡ１８：１ ｎ−７との４：１混合物のＰ−Ｂ反応スペクトルであり、ここで、Ｐ−Ｂ反応生成物の形成が観察された（ｍ／ｚ３３９．３）。図１Ｄは、インタクトなＦＡ１８：１ ｎ−９のＣＩＤ質量スペクトルである。Ｃ＝Ｃの位置情報を取り出せない。図１Ｅは、ＣＩＤにおいて、ＦＡ１８：１混合物のＰ−Ｂ反応生成物が、ｍ／ｚ１７１．１／１９７．２およびｍ／ｚ１９９．１／２２５．２という２つの異なる診断用イオン対を放出することを示している質量スペクトルであり、２つのＦＡ１８：１ ｎ−９およびｎ−７異性体の存在を明らかに示している。図１Ｆは、等モルのＰＣ１８：１ ｎ−９／１８：１ ｎ−９およびＰＣ１８：１ ｎ１２／１８：１ ｎ１２（ｍ／ｚ７８６．６）の反応質量スペクトルである。図１Ｇは、Ｃ＝Ｃの位置情報を取り出せないインタクトなＰＣ（ｍ／ｚ７８６．６）のインタクトなＣＩＤ質量スペクトルである。図１Ｈは、上記ＰＣ混合物からのＰ−Ｂ反応生成物（ｍ／ｚ８４４．６）のＣＩＤ質量スペクトルである。各ＰＣ異性体におけるＣ＝Ｃの位置に対応する２対の診断用イオン（ｍ／ｚ６３４．５／６６０．５およびｍ／ｚ６７６．６／７０２．６）が高い存在比で形成された。
図２Ａ〜Ｄは、脂質Ｃ＝Ｃ異性体の相対定量および絶対定量の原理を示している。図２Ａは、定量のための診断用イオンを生成するための、Ｐ−Ｂ反応とタンデムＭＳとの連結のスキームである。図２Ｂは、モル比と、対応する強度比：ＰＣ Ｃ＝Ｃ異性体（左）およびＦＡ Ｃ＝Ｃ異性体（右）との間の直線関係を示している。図２Ｃは、Ｃ１８：１ ｎ−６（ＩＳ、２２．７０μＭ）を用いたときの、ＦＡ１８：１ ｎ−９またはｎ−７の絶対定量のための検量線を示している。図２Ｄは、この研究において開発された２つの絶対定量方法の性能の検証を示している。 図２Ａ〜Ｄは、脂質Ｃ＝Ｃ異性体の相対定量および絶対定量の原理を示している。図２Ａは、定量のための診断用イオンを生成するための、Ｐ−Ｂ反応とタンデムＭＳとの連結のスキームである。図２Ｂは、モル比と、対応する強度比：ＰＣ Ｃ＝Ｃ異性体（左）およびＦＡ Ｃ＝Ｃ異性体（右）との間の直線関係を示している。図２Ｃは、Ｃ１８：１ ｎ−６（ＩＳ、２２．７０μＭ）を用いたときの、ＦＡ１８：１ ｎ−９またはｎ−７の絶対定量のための検量線を示している。図２Ｄは、この研究において開発された２つの絶対定量方法の性能の検証を示している。 図２Ａ〜Ｄは、脂質Ｃ＝Ｃ異性体の相対定量および絶対定量の原理を示している。図２Ａは、定量のための診断用イオンを生成するための、Ｐ−Ｂ反応とタンデムＭＳとの連結のスキームである。図２Ｂは、モル比と、対応する強度比：ＰＣ Ｃ＝Ｃ異性体（左）およびＦＡ Ｃ＝Ｃ異性体（右）との間の直線関係を示している。図２Ｃは、Ｃ１８：１ ｎ−６（ＩＳ、２２．７０μＭ）を用いたときの、ＦＡ１８：１ ｎ−９またはｎ−７の絶対定量のための検量線を示している。図２Ｄは、この研究において開発された２つの絶対定量方法の性能の検証を示している。
図３Ａ〜Ｆは、ラット脳における不飽和脂質の相対定量を示している。図３Ａは、１６〜２２個の炭素の範囲の鎖長を有する、ＭＵＦＡ（ＦＡ１６：１、ＦＡ１８：１、ＦＡ１９：１、ＦＡ２０：１およびＦＡ２２：１）およびＰＵＦＡ（ＦＡ１８：１、ＦＡ２０：４）の異性体組成を示している。図３Ｂは、Ｃ１８：１含有ＰＬの異性体組成を示している。図３Ｃは、リゾＰＥ２０：１の異性体組成を示している。図３Ｄは、ＰＣ１：０／１６：１の異性体組成を示している。図３Ｅは、Ｃ１８：２含有ＰＬの異性体組成を示している。図３Ｆは、リゾＰＥ２２：５の異性体組成を示している。図３Ｇは、Ｃ２２：４含有ＰＬの異性体組成を示している。図３Ｈは、Ｃ２０：４含有ＰＬの異性体組成を示している。図３Ｉは、Ｃ２２：６含有ＰＬの異性体組成を示している。異性体組成は、全異性体由来の診断用イオンの総強度に対する、１つの異性体に対する診断用イオンの総強度のパーセンテージとして表される。 図３Ａ〜Ｆは、ラット脳における不飽和脂質の相対定量を示している。図３Ａは、１６〜２２個の炭素の範囲の鎖長を有する、ＭＵＦＡ（ＦＡ１６：１、ＦＡ１８：１、ＦＡ１９：１、ＦＡ２０：１およびＦＡ２２：１）およびＰＵＦＡ（ＦＡ１８：１、ＦＡ２０：４）の異性体組成を示している。図３Ｂは、Ｃ１８：１含有ＰＬの異性体組成を示している。図３Ｃは、リゾＰＥ２０：１の異性体組成を示している。図３Ｄは、ＰＣ１：０／１６：１の異性体組成を示している。図３Ｅは、Ｃ１８：２含有ＰＬの異性体組成を示している。図３Ｆは、リゾＰＥ２２：５の異性体組成を示している。図３Ｇは、Ｃ２２：４含有ＰＬの異性体組成を示している。図３Ｈは、Ｃ２０：４含有ＰＬの異性体組成を示している。図３Ｉは、Ｃ２２：６含有ＰＬの異性体組成を示している。異性体組成は、全異性体由来の診断用イオンの総強度に対する、１つの異性体に対する診断用イオンの総強度のパーセンテージとして表される。 図３Ａ〜Ｆは、ラット脳における不飽和脂質の相対定量を示している。図３Ａは、１６〜２２個の炭素の範囲の鎖長を有する、ＭＵＦＡ（ＦＡ１６：１、ＦＡ１８：１、ＦＡ１９：１、ＦＡ２０：１およびＦＡ２２：１）およびＰＵＦＡ（ＦＡ１８：１、ＦＡ２０：４）の異性体組成を示している。図３Ｂは、Ｃ１８：１含有ＰＬの異性体組成を示している。図３Ｃは、リゾＰＥ２０：１の異性体組成を示している。図３Ｄは、ＰＣ１：０／１６：１の異性体組成を示している。図３Ｅは、Ｃ１８：２含有ＰＬの異性体組成を示している。図３Ｆは、リゾＰＥ２２：５の異性体組成を示している。図３Ｇは、Ｃ２２：４含有ＰＬの異性体組成を示している。図３Ｈは、Ｃ２０：４含有ＰＬの異性体組成を示している。図３Ｉは、Ｃ２２：６含有ＰＬの異性体組成を示している。異性体組成は、全異性体由来の診断用イオンの総強度に対する、１つの異性体に対する診断用イオンの総強度のパーセンテージとして表される。 図３Ａ〜Ｆは、ラット脳における不飽和脂質の相対定量を示している。図３Ａは、１６〜２２個の炭素の範囲の鎖長を有する、ＭＵＦＡ（ＦＡ１６：１、ＦＡ１８：１、ＦＡ１９：１、ＦＡ２０：１およびＦＡ２２：１）およびＰＵＦＡ（ＦＡ１８：１、ＦＡ２０：４）の異性体組成を示している。図３Ｂは、Ｃ１８：１含有ＰＬの異性体組成を示している。図３Ｃは、リゾＰＥ２０：１の異性体組成を示している。図３Ｄは、ＰＣ１：０／１６：１の異性体組成を示している。図３Ｅは、Ｃ１８：２含有ＰＬの異性体組成を示している。図３Ｆは、リゾＰＥ２２：５の異性体組成を示している。図３Ｇは、Ｃ２２：４含有ＰＬの異性体組成を示している。図３Ｈは、Ｃ２０：４含有ＰＬの異性体組成を示している。図３Ｉは、Ｃ２２：６含有ＰＬの異性体組成を示している。異性体組成は、全異性体由来の診断用イオンの総強度に対する、１つの異性体に対する診断用イオンの総強度のパーセンテージとして表される。
図４Ａ〜Ｂは、ラット器官（脳、脂肪、腎臓、肝臓および筋肉を含む）およびマウス乳癌組織におけるＣ１８：１含有ＰＣおよびＦＡ１８：１異性体の異性体組成のばらつきを示している。図４Ａは、ラット器官におけるＰＣ１６：０／１８：１異性体の組成を示している。図４Ｂは、ラット器官におけるＦＡ１８：１異性体の組成を示している。 図４Ｃ〜Ｆは、正常（ＷＴ）マウス乳房組織と癌性マウス乳房組織との間のＦＡ１８：１およびＣ１８：１含有ＰＣ（ＰＣ１６：０／１８：１、ＰＣ１８：０／１８：１、ＰＣ１８：１／１８：１）の異性体組成の比較を示している。（図４Ｃ）ＦＡ１８：１。（図４Ｄ）ＰＣ１６：０／１８：１。（図４Ｅ）ＰＣ１８：０／１８：１。（図４Ｆ）ＰＣ１８：１／１８：１。
図５Ａ〜Ｂは、プリカーサーイオン注入時間が、異なる逆Ｐ−Ｂ反応チャネルに対して無視できる影響を及ぼすことを示している（診断用イオンの生成に至るもの、およびアセトンのニュートラルロスに起因するｍ／ｚ２８１に至るもの）。図５Ａは、イオン注入時間（１０〜２００ミリ秒）に対する、プリカーサーイオン（ｍ／ｚ３３９）、５８Ｄａニュートラルロスに起因するイオン（ｍ／ｚ２８１）および診断用イオン（ｍ／ｚ１７１／１９７）の絶対強度を示している。図５ｂは、注入時間（１０〜２００ミリ秒）の関数としての、ニュートラルロスフラグメントおよび診断用イオンの相対強度を示している。診断用イオン（ｍ／ｚ１７１および１９７）およびニュートラルロスフラグメント（ｍ／ｚ２８１）の相対量は、１０ミリ秒から２００ミリ秒まで２０倍の増加を経たイオン注入時間とは無関係であった。 図５Ａ〜Ｂは、プリカーサーイオン注入時間が、異なる逆Ｐ−Ｂ反応チャネルに対して無視できる影響を及ぼすことを示している（診断用イオンの生成に至るもの、およびアセトンのニュートラルロスに起因するｍ／ｚ２８１に至るもの）。図５Ａは、イオン注入時間（１０〜２００ミリ秒）に対する、プリカーサーイオン（ｍ／ｚ３３９）、５８Ｄａニュートラルロスに起因するイオン（ｍ／ｚ２８１）および診断用イオン（ｍ／ｚ１７１／１９７）の絶対強度を示している。図５ｂは、注入時間（１０〜２００ミリ秒）の関数としての、ニュートラルロスフラグメントおよび診断用イオンの相対強度を示している。診断用イオン（ｍ／ｚ１７１および１９７）およびニュートラルロスフラグメント（ｍ／ｚ２８１）の相対量は、１０ミリ秒から２００ミリ秒まで２０倍の増加を経たイオン注入時間とは無関係であった。
図６は、２５４ｎｍのＵＶ照射下でアセトンを用いたＰＣ１８：１／１８：１（２つのＣ＝Ｃ異性体の混合物）の間のＰ−Ｂ反応の動態を示している。速い反応速度が観察された：０．４分以内に反応が安定になった。その後、各異性体に対する診断用イオン間の比は一定になり、定量分析の基礎を築く（時点１、２および３における３つのタンデムスペクトルを参照のこと）。
図７Ａ〜Ｄは、オレイン酸／ｃｉｓ−バクセン酸混合溶液（種々のモル比）のＰ−Ｂ反応生成物のＣＩＤ質量スペクトルである。 図７Ａ〜Ｄは、オレイン酸／ｃｉｓ−バクセン酸混合溶液（種々のモル比）のＰ−Ｂ反応生成物のＣＩＤ質量スペクトルである。 図７Ａ〜Ｄは、オレイン酸／ｃｉｓ−バクセン酸混合溶液（種々のモル比）のＰ−Ｂ反応生成物のＣＩＤ質量スペクトルである。
図８Ａ〜Ｃは、脂質Ｃ＝Ｃ異性体の絶対定量を可能にする３つの方法を示している。原理を実証する一例としてＦＡ１８：１異性体を使用した。ＩＳ：内部標準。 図８Ａ〜Ｃは、脂質Ｃ＝Ｃ異性体の絶対定量を可能にする３つの方法を示している。原理を実証する一例としてＦＡ１８：１異性体を使用した。ＩＳ：内部標準。 図８Ａ〜Ｃは、脂質Ｃ＝Ｃ異性体の絶対定量を可能にする３つの方法を示している。原理を実証する一例としてＦＡ１８：１異性体を使用した。ＩＳ：内部標準。
図９Ａ〜Ｂは、ポジティブおよびネガティブモードでのＣＩＤによるＰＬの相対定量を示している（ＰＣ１８：０／１８：１およびリゾＰＥ１８：１を例として使用）。図９Ａは、ＰＣ１８：０／１８：１を示している：インタクトなＰＣのＣＩＤは、ｍ／ｚ１８４．１のシグニチャイオンを生成するが、Ｃ＝Ｃの位置情報を伴わない。Ｐ−Ｂ反応およびタンデムＭＳの後、２対の診断用イオンが生成された（ｍ／ｚ６７８．５／７０４．６および７０６．６／７３２．６）ことから、ＰＣ１８：０／１８：１ ｎ９およびＰＣ１８：０／１８：１ ｎ１１の存在が示唆された。図９Ｂは、リゾＰＥの場合、アシル鎖情報（Ｃ１８：１、ｍ／ｚ２８１．３）も、脱プロトン化イオンのＣＩＤによって取得できることを示している。興味深いことに、Ｐ−Ｂ反応の後、Ｐ−Ｂ反応生成物のＣＩＤは、誘導体化された（ｄｒｉｖａｔｉｚｅｄ）脂肪酸アシル（ｍ／ｚ３３９．３）を診断用イオンなしに放出する。Ｃ＝Ｃの位置情報を取得するために、別の段階のフラグメンテーションを、ｍ／ｚ３３９．３に適用する必要があり、情報価値のある診断用イオンを生成する。実際に、ＭＳ３−ＣＩＤの後、２対の診断用イオン（ｍ／ｚ１７１．０／１９７．０および１９９．０／２２５．１）が観察されたことから、リゾＰＥ１８：１が、リゾＰＥ１８：１ ｎ９およびリゾＰＥ１８：１ ｎ１１の混合物として存在することが示唆される。使用されたＰＣ１８：０／１８：１およびリゾＰＥ１８：１は、それぞれラット脳および腎臓に由来した。 図９Ａ〜Ｂは、ポジティブおよびネガティブモードでのＣＩＤによるＰＬの相対定量を示している（ＰＣ１８：０／１８：１およびリゾＰＥ１８：１を例として使用）。図９Ａは、ＰＣ１８：０／１８：１を示している：インタクトなＰＣのＣＩＤは、ｍ／ｚ１８４．１のシグニチャイオンを生成するが、Ｃ＝Ｃの位置情報を伴わない。Ｐ−Ｂ反応およびタンデムＭＳの後、２対の診断用イオンが生成された（ｍ／ｚ６７８．５／７０４．６および７０６．６／７３２．６）ことから、ＰＣ１８：０／１８：１ ｎ９およびＰＣ１８：０／１８：１ ｎ１１の存在が示唆された。図９Ｂは、リゾＰＥの場合、アシル鎖情報（Ｃ１８：１、ｍ／ｚ２８１．３）も、脱プロトン化イオンのＣＩＤによって取得できることを示している。興味深いことに、Ｐ−Ｂ反応の後、Ｐ−Ｂ反応生成物のＣＩＤは、誘導体化された（ｄｒｉｖａｔｉｚｅｄ）脂肪酸アシル（ｍ／ｚ３３９．３）を診断用イオンなしに放出する。Ｃ＝Ｃの位置情報を取得するために、別の段階のフラグメンテーションを、ｍ／ｚ３３９．３に適用する必要があり、情報価値のある診断用イオンを生成する。実際に、ＭＳ３−ＣＩＤの後、２対の診断用イオン（ｍ／ｚ１７１．０／１９７．０および１９９．０／２２５．１）が観察されたことから、リゾＰＥ１８：１が、リゾＰＥ１８：１ ｎ９およびリゾＰＥ１８：１ ｎ１１の混合物として存在することが示唆される。使用されたＰＣ１８：０／１８：１およびリゾＰＥ１８：１は、それぞれラット脳および腎臓に由来した。
図１０は、ラット脂肪組織におけるＦＡ１８：２のＰ−Ｂ反応生成物のＭＳ２イオントラップＣＩＤ質量スペクトルを示している。ｍ／ｚ１７１．０／１９７．１および２１１．０／２３７．１の２対の診断用イオンが検出された。その２対の間の４０Ｄａの質量差は、ＦＡ１８：２における２つのＣ＝Ｃがメチレンによって分断されていることを示唆する。
図１１Ａ〜Ｄは、ラット腎臓におけるＦＡ２０：４の構造の特徴付けを示している。図１１Ａは、１％（ｗｔ）ＬｉＣｌが加えられたラット腎臓ＦＡ抽出物の＋ナノＥＳＩ質量スペクトルを示している。図１１Ｂは、同じサンプルのＵＶ照射後の＋ナノＥＳＩ質量スペクトルを示している。図１１Ｃは、リチウム化されたＦＡ２０：４のＰ−Ｂ反応生成物（ｍ／ｚ３１１．３）のフラグメンテーションが、アラキドン酸（ａｒｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＦＡ２０：４ ｎ６）の４つのＣ＝Ｃに対応する４対の診断用イオン（ｍ／ｚ１２３／１４９、１６３／１８９、２０３／２２９、２４３／２６９、青色）を生成することを示している。図１１Ｄは、２０：４ ｎ３を同じＦＡ抽出物サンプルに加えたとき、別の異なる診断用イオンのセットがｍ／ｚ１６５／１９１、２０５／２３１、２４５／２７１および２８５／３１１に出現することを示しており、これらは、ＦＡ２０：４異性体の定量のために使用され得る。図１１Ｅは、Ω−６アラキドン酸およびΩ−３アラキドン酸の診断用イオンを示している。 図１１Ａ〜Ｄは、ラット腎臓におけるＦＡ２０：４の構造の特徴付けを示している。図１１Ａは、１％（ｗｔ）ＬｉＣｌが加えられたラット腎臓ＦＡ抽出物の＋ナノＥＳＩ質量スペクトルを示している。図１１Ｂは、同じサンプルのＵＶ照射後の＋ナノＥＳＩ質量スペクトルを示している。図１１Ｃは、リチウム化されたＦＡ２０：４のＰ−Ｂ反応生成物（ｍ／ｚ３１１．３）のフラグメンテーションが、アラキドン酸（ａｒｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＦＡ２０：４ ｎ６）の４つのＣ＝Ｃに対応する４対の診断用イオン（ｍ／ｚ１２３／１４９、１６３／１８９、２０３／２２９、２４３／２６９、青色）を生成することを示している。図１１Ｄは、２０：４ ｎ３を同じＦＡ抽出物サンプルに加えたとき、別の異なる診断用イオンのセットがｍ／ｚ１６５／１９１、２０５／２３１、２４５／２７１および２８５／３１１に出現することを示しており、これらは、ＦＡ２０：４異性体の定量のために使用され得る。図１１Ｅは、Ω−６アラキドン酸およびΩ−３アラキドン酸の診断用イオンを示している。 図１１Ａ〜Ｄは、ラット腎臓におけるＦＡ２０：４の構造の特徴付けを示している。図１１Ａは、１％（ｗｔ）ＬｉＣｌが加えられたラット腎臓ＦＡ抽出物の＋ナノＥＳＩ質量スペクトルを示している。図１１Ｂは、同じサンプルのＵＶ照射後の＋ナノＥＳＩ質量スペクトルを示している。図１１Ｃは、リチウム化されたＦＡ２０：４のＰ−Ｂ反応生成物（ｍ／ｚ３１１．３）のフラグメンテーションが、アラキドン酸（ａｒｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＦＡ２０：４ ｎ６）の４つのＣ＝Ｃに対応する４対の診断用イオン（ｍ／ｚ１２３／１４９、１６３／１８９、２０３／２２９、２４３／２６９、青色）を生成することを示している。図１１Ｄは、２０：４ ｎ３を同じＦＡ抽出物サンプルに加えたとき、別の異なる診断用イオンのセットがｍ／ｚ１６５／１９１、２０５／２３１、２４５／２７１および２８５／３１１に出現することを示しており、これらは、ＦＡ２０：４異性体の定量のために使用され得る。図１１Ｅは、Ω−６アラキドン酸およびΩ−３アラキドン酸の診断用イオンを示している。 図１１Ａ〜Ｄは、ラット腎臓におけるＦＡ２０：４の構造の特徴付けを示している。図１１Ａは、１％（ｗｔ）ＬｉＣｌが加えられたラット腎臓ＦＡ抽出物の＋ナノＥＳＩ質量スペクトルを示している。図１１Ｂは、同じサンプルのＵＶ照射後の＋ナノＥＳＩ質量スペクトルを示している。図１１Ｃは、リチウム化されたＦＡ２０：４のＰ−Ｂ反応生成物（ｍ／ｚ３１１．３）のフラグメンテーションが、アラキドン酸（ａｒｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＦＡ２０：４ ｎ６）の４つのＣ＝Ｃに対応する４対の診断用イオン（ｍ／ｚ１２３／１４９、１６３／１８９、２０３／２２９、２４３／２６９、青色）を生成することを示している。図１１Ｄは、２０：４ ｎ３を同じＦＡ抽出物サンプルに加えたとき、別の異なる診断用イオンのセットがｍ／ｚ１６５／１９１、２０５／２３１、２４５／２７１および２８５／３１１に出現することを示しており、これらは、ＦＡ２０：４異性体の定量のために使用され得る。図１１Ｅは、Ω−６アラキドン酸およびΩ−３アラキドン酸の診断用イオンを示している。 図１１Ａ〜Ｄは、ラット腎臓におけるＦＡ２０：４の構造の特徴付けを示している。図１１Ａは、１％（ｗｔ）ＬｉＣｌが加えられたラット腎臓ＦＡ抽出物の＋ナノＥＳＩ質量スペクトルを示している。図１１Ｂは、同じサンプルのＵＶ照射後の＋ナノＥＳＩ質量スペクトルを示している。図１１Ｃは、リチウム化されたＦＡ２０：４のＰ−Ｂ反応生成物（ｍ／ｚ３１１．３）のフラグメンテーションが、アラキドン酸（ａｒｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＦＡ２０：４ ｎ６）の４つのＣ＝Ｃに対応する４対の診断用イオン（ｍ／ｚ１２３／１４９、１６３／１８９、２０３／２２９、２４３／２６９、青色）を生成することを示している。図１１Ｄは、２０：４ ｎ３を同じＦＡ抽出物サンプルに加えたとき、別の異なる診断用イオンのセットがｍ／ｚ１６５／１９１、２０５／２３１、２４５／２７１および２８５／３１１に出現することを示しており、これらは、ＦＡ２０：４異性体の定量のために使用され得る。図１１Ｅは、Ω−６アラキドン酸およびΩ−３アラキドン酸の診断用イオンを示している。
図１２は、ｃＦＡ２０：４ ｎ６／ｃＦＡ２０：４ ｎ３に対するＩＦＡ２０：４ ｎ６／ＩＦＡ２０：４ ｎ３の直線関係を図示している検量線を示している。
図１３は、Ｃ１８：２が、ＰＣ１８：０／１８：２においてＣ１８：２ ｎ６の形態で純粋であることを示している。ＰＣ３６：２のアシル鎖情報が、［ＰＣ３６：２＋Ｃｌ］−のＣＩＤを介して取得された。この場合、ＰＣ３６：２（ラット肝臓由来）は、ＰＣ１８：０／１８：２と特徴付けられた。Ｐ−Ｂ反応およびタンデムＭＳの後、Ｃ１８：２におけるＣ＝Ｃの位置を、９Ｚおよび１２Ｚに存在すると割り当てることができる。
図１４Ａ〜Ｂは、ＰＥ１６：０／２０：４におけるＣ２０：４脂肪酸アシルが、Ｃ２０：４ ｎ６の形態で純粋であることを示している。図１４Ｃは、ＰＣ１６：０／２０：４ ｎ６に対する診断用イオンの化学構造を示している。 図１４Ａ〜Ｂは、ＰＥ１６：０／２０：４におけるＣ２０：４脂肪酸アシルが、Ｃ２０：４ ｎ６の形態で純粋であることを示している。図１４Ｃは、ＰＣ１６：０／２０：４ ｎ６に対する診断用イオンの化学構造を示している。 図１４Ａ〜Ｂは、ＰＥ１６：０／２０：４におけるＣ２０：４脂肪酸アシルが、Ｃ２０：４ ｎ６の形態で純粋であることを示している。図１４Ｃは、ＰＣ１６：０／２０：４ ｎ６に対する診断用イオンの化学構造を示している。
図１５は、ＰＣ１６：０／２２：６内のＣ２２：６脂肪酸アシルがＣ２２：６ ｎ３の形態で純粋であることを示している。
図１６は、ラット組織におけるオレイン酸およびｃｉｓ−バクセン酸に対する生合成経路を示している。
図１７Ａ〜Ｄは、ラット組織由来の複雑な脂質抽出物サンプルの代表的なＰＩＳおよびＮＬＳ質量スペクトルを示している。 図１７Ａ〜Ｄは、ラット組織由来の複雑な脂質抽出物サンプルの代表的なＰＩＳおよびＮＬＳ質量スペクトルを示している。 図１７Ａ〜Ｄは、ラット組織由来の複雑な脂質抽出物サンプルの代表的なＰＩＳおよびＮＬＳ質量スペクトルを示している。 図１７Ａ〜Ｄは、ラット組織由来の複雑な脂質抽出物サンプルの代表的なＰＩＳおよびＮＬＳ質量スペクトルを示している。
図１８Ａ〜Ｆは、Ｃ１６：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：０、Ｃ２０：４、Ｃ２２：６またはＣ２２：４を含む脂質の集団が示されたＰＩＳ質量スペクトルを示している。 図１８Ａ〜Ｆは、Ｃ１６：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：０、Ｃ２０：４、Ｃ２２：６またはＣ２２：４を含む脂質の集団が示されたＰＩＳ質量スペクトルを示している。 図１８Ａ〜Ｆは、Ｃ１６：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：０、Ｃ２０：４、Ｃ２２：６またはＣ２２：４を含む脂質の集団が示されたＰＩＳ質量スペクトルを示している。 図１８Ａ〜Ｆは、Ｃ１６：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：０、Ｃ２０：４、Ｃ２２：６またはＣ２２：４を含む脂質の集団が示されたＰＩＳ質量スペクトルを示している。 図１８Ａ〜Ｆは、Ｃ１６：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：０、Ｃ２０：４、Ｃ２２：６またはＣ２２：４を含む脂質の集団が示されたＰＩＳ質量スペクトルを示している。 図１８Ａ〜Ｆは、Ｃ１６：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：０、Ｃ２０：４、Ｃ２２：６またはＣ２２：４を含む脂質の集団が示されたＰＩＳ質量スペクトルを示している。
図１９は、ラット脳において同定されたＰＬおよびそれらのＣ＝Ｃ異性体の要約を提供している円グラフのセットである。それらのグラフは、同定されたリン脂質の数およびタイプの本方法（左）と文献報告（右）との比較を示している。
図２０は、ラット腎臓、肝臓および筋肉におけるＣ１８：１含有ＰＬの異性体組成を示している。
図２１は、Ｐ−Ｂ反応の前（上）および後（下）のラット脳由来のＦＡ抽出物サンプルのナノＥＳＩ質量スペクトルを示している。
図２２は、ＦＡ１８：１のＰ−Ｂ反応生成物（ｍ／ｚ３３９．３）のタンデムＭＳによるＦＡ１８：１異性体の相対定量を示している（ラット脳、肝臓、筋肉、脂肪および腎臓）。
図２３Ａ〜Ｄは、正常マウス乳房組織（ＷＴ）の結果と比べて、マウス乳癌組織においてＦＡ１８：１ ｎ７およびＣ１８：１ ｎ７含有ＰＣの一貫した増加が観察されたことを示している。正常組織（各パネルの左）および癌性組織（各パネルの右）由来の、（図２３Ａ）ＦＡ１８：１、（図２３Ｂ）ＰＣ３４：１、（図２３Ｃ）ＰＣ３６：１および（図２３Ｄ）ＰＣ３６：２のＰ−Ｂ反応生成物のＣＩＤ質量スペクトル。（図２３Ｄ）では、ＰＣ１８：０／１８：２の相対量の減少も同様に、明らかに観察された。ＰＣ１８：０／１８：２の同定をもたらす診断用イオンは、ｍ／ｚ６７８．５／７０４．５および７１８．５／７４４．６であった。 図２３Ａ〜Ｄは、正常マウス乳房組織（ＷＴ）の結果と比べて、マウス乳癌組織においてＦＡ１８：１ ｎ７およびＣ１８：１ ｎ７含有ＰＣの一貫した増加が観察されたことを示している。正常組織（各パネルの左）および癌性組織（各パネルの右）由来の、（図２３Ａ）ＦＡ１８：１、（図２３Ｂ）ＰＣ３４：１、（図２３Ｃ）ＰＣ３６：１および（図２３Ｄ）ＰＣ３６：２のＰ−Ｂ反応生成物のＣＩＤ質量スペクトル。（図２３Ｄ）では、ＰＣ１８：０／１８：２の相対量の減少も同様に、明らかに観察された。ＰＣ１８：０／１８：２の同定をもたらす診断用イオンは、ｍ／ｚ６７８．５／７０４．５および７１８．５／７４４．６であった。
図２４は、光化学的生成物の形成の速度を調べるために使用された不連続なＵＶ曝露反応の構成の描写を示している。
図２５Ａ〜Ｅは、７：３アセトン：Ｈ２Ｏ １％酢酸中のＮ２をパージされた５μＭ ＰＣ１６：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ）を含む溶液へのＵＶ曝露を描写している質量スペクトルおよび時系列グラフを示している。図２５Ａは、ＵＶ曝露前のｍ／ｚ７６０．６のプリカーサーシグナルを示しているＭＳ１スペクトルを示している。図２５Ｂは、６秒間の累積ＵＶ曝露の定常状態反応条件（Ｎ２パージ溶液）を示しており、ここで、ｍ／ｚ８１８．６がＰ−Ｂ反応生成物である。図２５Ｃは、ｍ／ｚ６５０．６および６７６．６のＣ＝Ｃ診断用イオンを示すｍ／ｚ８１８．６のビーム型ＣＩＤを示している。図２５Ｄは、６秒間の定常状態ＵＶ曝露の前、その間およびその後のｍ／ｚ７６０．６および８１８．６のＸＩＣクロマトグラムを示している。図２５Ｅは、４．５μＬ／分の流速でＵＶ累積曝露時間を延長したときのプリカーサー（ｍ／ｚ７６０．６）およびＰ−Ｂ反応生成物（ｍ／ｚ８１８．６）イオンの強度を示している。 図２５Ａ〜Ｅは、７：３アセトン：Ｈ２Ｏ １％酢酸中のＮ２をパージされた５μＭ ＰＣ１６：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ）を含む溶液へのＵＶ曝露を描写している質量スペクトルおよび時系列グラフを示している。図２５Ａは、ＵＶ曝露前のｍ／ｚ７６０．６のプリカーサーシグナルを示しているＭＳ１スペクトルを示している。図２５Ｂは、６秒間の累積ＵＶ曝露の定常状態反応条件（Ｎ２パージ溶液）を示しており、ここで、ｍ／ｚ８１８．６がＰ−Ｂ反応生成物である。図２５Ｃは、ｍ／ｚ６５０．６および６７６．６のＣ＝Ｃ診断用イオンを示すｍ／ｚ８１８．６のビーム型ＣＩＤを示している。図２５Ｄは、６秒間の定常状態ＵＶ曝露の前、その間およびその後のｍ／ｚ７６０．６および８１８．６のＸＩＣクロマトグラムを示している。図２５Ｅは、４．５μＬ／分の流速でＵＶ累積曝露時間を延長したときのプリカーサー（ｍ／ｚ７６０．６）およびＰ−Ｂ反応生成物（ｍ／ｚ８１８．６）イオンの強度を示している。
図２６Ａ〜Ｄは、図２４の実験装置を用いて、７：３アセトン：Ｈ２Ｏ １％ＮＨ４ＯＨ中のＮ２をパージされた５μＭオレイン酸（ｎ−９Ｚ）に適用されたオンラインＰ−Ｂ反応を示している。図２６Ａは、ＵＶ前のオレイン酸のＭＳ１スペクトル（ｍ／ｚ２８１．２）を示している。図２６Ｂは、ｍ／ｚ３３９．３にＰ−Ｂ生成物を示している、６秒間のＵＶ曝露の場合のＭＳ１反応スペクトルを示している。図２６Ｃは、ｍ／ｚ３３９．３のビーム型ＣＩＤがｍ／ｚ１７０．１および１９７．１の診断用イオンに加えて一不飽和オレイン酸イオン（ｍ／ｚ２８１．２）を示していることを示している。図２６Ｄは、累積ＵＶ曝露の関数としてｍ／ｚ２８１．２および３３９．３の相対強度を描写している時系列グラフを示している。 図２６Ａ〜Ｄは、図２４の実験装置を用いて、７：３アセトン：Ｈ２Ｏ １％ＮＨ４ＯＨ中のＮ２をパージされた５μＭオレイン酸（ｎ−９Ｚ）に適用されたオンラインＰ−Ｂ反応を示している。図２６Ａは、ＵＶ前のオレイン酸のＭＳ１スペクトル（ｍ／ｚ２８１．２）を示している。図２６Ｂは、ｍ／ｚ３３９．３にＰ−Ｂ生成物を示している、６秒間のＵＶ曝露の場合のＭＳ１反応スペクトルを示している。図２６Ｃは、ｍ／ｚ３３９．３のビーム型ＣＩＤがｍ／ｚ１７０．１および１９７．１の診断用イオンに加えて一不飽和オレイン酸イオン（ｍ／ｚ２８１．２）を示していることを示している。図２６Ｄは、累積ＵＶ曝露の関数としてｍ／ｚ２８１．２および３３９．３の相対強度を描写している時系列グラフを示している。
図２７Ａは、流速を徐々に高めた５秒間のＵＶ曝露を用いたときの、７：３アセトン：Ｈ２Ｏ １％酢酸中のＮ２をパージされた５μＭ ＰＣ１６：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ）に対する、プリカーサーとＰ−Ｂ生成物との強度比を示している。図２７Ｂは、７０：１５：１５アセトン：Ｈ２Ｏ：溶媒１％酢酸から構成された５μＭ ＰＣ１６：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ）溶液に対する６秒間のＵＶ曝露後のＰ−Ｂ収率を示しており、ここで、溶媒が、棒グラフのｘ軸に示されている。最後のカラムのデータでは酢酸の代わりにギ酸アンモニウム（ＡＦ）（２ｍＭ）を使用した。 図２７Ａは、流速を徐々に高めた５秒間のＵＶ曝露を用いたときの、７：３アセトン：Ｈ２Ｏ １％酢酸中のＮ２をパージされた５μＭ ＰＣ１６：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ）に対する、プリカーサーとＰ−Ｂ生成物との強度比を示している。図２７Ｂは、７０：１５：１５アセトン：Ｈ２Ｏ：溶媒１％酢酸から構成された５μＭ ＰＣ１６：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ）溶液に対する６秒間のＵＶ曝露後のＰ−Ｂ収率を示しており、ここで、溶媒が、棒グラフのｘ軸に示されている。最後のカラムのデータでは酢酸の代わりにギ酸アンモニウム（ＡＦ）（２ｍＭ）を使用した。
図２８Ａ〜Ｅは、負イオン化モードで分析された、商業的に購入した酵母極性脂質抽出物への直接注入Ｐ−Ｂ反応の適用を示している。図２８Ａは、ＵＶ前のＭＳ１スペクトルを示している。図２８Ｂは、ＵＶの間のＭＳ１反応スペクトルを示している（Ｐ−Ｂ生成物は赤色で示されている）。図２８Ｃは、異性体ＰＥ１６：０＿１８：１（ｎ−９）およびＰＥ１８：０＿１６：１（ｎ−７）に対するＰ−Ｂ生成物（ｍ／ｚ７７４．５）のＭＳ２ビーム型ＣＩＤを示している。図２８Ｄは、図２８Ｂのｍ／ｚ３３９．２のＭＳ３イオントラップＣＩＤを示している。図２８Ｅは、図２８Ｂのｍ／ｚ３１１．２のＭＳ３イオントラップＣＩＤを示している。 図２８Ａ〜Ｅは、負イオン化モードで分析された、商業的に購入した酵母極性脂質抽出物への直接注入Ｐ−Ｂ反応の適用を示している。図２８Ａは、ＵＶ前のＭＳ１スペクトルを示している。図２８Ｂは、ＵＶの間のＭＳ１反応スペクトルを示している（Ｐ−Ｂ生成物は赤色で示されている）。図２８Ｃは、異性体ＰＥ１６：０＿１８：１（ｎ−９）およびＰＥ１８：０＿１６：１（ｎ−７）に対するＰ−Ｂ生成物（ｍ／ｚ７７４．５）のＭＳ２ビーム型ＣＩＤを示している。図２８Ｄは、図２８Ｂのｍ／ｚ３３９．２のＭＳ３イオントラップＣＩＤを示している。図２８Ｅは、図２８Ｂのｍ／ｚ３１１．２のＭＳ３イオントラップＣＩＤを示している。 図２８Ａ〜Ｅは、負イオン化モードで分析された、商業的に購入した酵母極性脂質抽出物への直接注入Ｐ−Ｂ反応の適用を示している。図２８Ａは、ＵＶ前のＭＳ１スペクトルを示している。図２８Ｂは、ＵＶの間のＭＳ１反応スペクトルを示している（Ｐ−Ｂ生成物は赤色で示されている）。図２８Ｃは、異性体ＰＥ１６：０＿１８：１（ｎ−９）およびＰＥ１８：０＿１６：１（ｎ−７）に対するＰ−Ｂ生成物（ｍ／ｚ７７４．５）のＭＳ２ビーム型ＣＩＤを示している。図２８Ｄは、図２８Ｂのｍ／ｚ３３９．２のＭＳ３イオントラップＣＩＤを示している。図２８Ｅは、図２８Ｂのｍ／ｚ３１１．２のＭＳ３イオントラップＣＩＤを示している。
図２９Ａ〜Ｂは、抽出スプレーとＰ−Ｂ反応とを組み合わせて、組織中の脂質のＣ＝Ｃ結合の位置を直接特定することの模式的な全体像を示している。図２９Ａは、ステンレス鋼プローブ（外径２００μｍ）による組織サンプリングおよび脂質のキャピラリー内抽出に続く、ナノ−ＥＳＩおよびＵＶ光（λ＝２５４ｎｍ）によるＭＳ分析を示している。図２９Ｂは、アセトンと脂肪酸との間のパターノ・ビューチ（Ｐ−Ｂ）反応を、二重結合の位置を特定するための逆Ｐ−Ｂ反応において生成され得るフィンガープリントフラグメントイオンと関連して、示している。 図２９Ａ〜Ｂは、抽出スプレーとＰ−Ｂ反応とを組み合わせて、組織中の脂質のＣ＝Ｃ結合の位置を直接特定することの模式的な全体像を示している。図２９Ａは、ステンレス鋼プローブ（外径２００μｍ）による組織サンプリングおよび脂質のキャピラリー内抽出に続く、ナノ−ＥＳＩおよびＵＶ光（λ＝２５４ｎｍ）によるＭＳ分析を示している。図２９Ｂは、アセトンと脂肪酸との間のパターノ・ビューチ（Ｐ−Ｂ）反応を、二重結合の位置を特定するための逆Ｐ−Ｂ反応において生成され得るフィンガープリントフラグメントイオンと関連して、示している。
図３０Ａ〜Ｉは、オンラインＰ−Ｂ反応と抽出スプレー質量分析との組み合わせによる直接脂質分析を示している。図３０Ａ〜Ｃは、−ナノＥＳＩのＵＶ照射によって誘起されるＰ−Ｂ反応の前および後の、抽出スプレーによる、ラット脳、腎臓および肝臓からサンプリングされた脂質の質量スペクトルを示している。図３０Ｄは、頭部基およびアシル鎖長を特定するためのｍ／ｚ７７８．５のＰＳ１８：０−１８：１のＭＳ２ＣＩＤを示している。図３０Ｅ〜Ｆは、化学的ノイズを差し引く（ｄｅｄｕｃｔｉｏｎ）ための、Ｐ−Ｂ反応の前の、不飽和脂質のＰ−Ｂ反応生成物と同じｍ／ｚ値のバックグラウンドピークのＭＳ２ＣＩＤを示している（ＦＡ１８：１、ｍ／ｚ３３９．３；ＰＳ１８：０−１８：１、ｍ／ｚ８４６．５）。図３０Ｇ〜Ｈは、Ｐ−Ｂ反応後の不飽和脂質のＰ−Ｂ反応生成物のＭＳ２ＣＩＤを示している。腎臓におけるＦＡ１８：１の二重結合は、新しく生成されたフィンガープリントピーク（ｎ−９に対してｍ／ｚ１７１．０および１９７．０；ｎ−７に対してｍ／ｚ１９９．０および２２５．１）に従って、ｎ−９およびｎ−７と直接特定できる。ＰＳ１８：０−１８：１の場合、不飽和アシル鎖１８：１のＰ−Ｂ反応生成物が形成され、ｍ／ｚ３３９．３のスペクトルとして現れた。図３０Ｉは、ＰＳ１８：０−１８：１のＰ−Ｂ反応生成物からのｍ／ｚ３３９．３のＭＳ３ＣＩＤを示しており、ｎ−９およびｎ−７における二重結合の位置を示唆している。 図３０Ａ〜Ｉは、オンラインＰ−Ｂ反応と抽出スプレー質量分析との組み合わせによる直接脂質分析を示している。図３０Ａ〜Ｃは、−ナノＥＳＩのＵＶ照射によって誘起されるＰ−Ｂ反応の前および後の、抽出スプレーによる、ラット脳、腎臓および肝臓からサンプリングされた脂質の質量スペクトルを示している。図３０Ｄは、頭部基およびアシル鎖長を特定するためのｍ／ｚ７７８．５のＰＳ１８：０−１８：１のＭＳ２ＣＩＤを示している。図３０Ｅ〜Ｆは、化学的ノイズを差し引く（ｄｅｄｕｃｔｉｏｎ）ための、Ｐ−Ｂ反応の前の、不飽和脂質のＰ−Ｂ反応生成物と同じｍ／ｚ値のバックグラウンドピークのＭＳ２ＣＩＤを示している（ＦＡ１８：１、ｍ／ｚ３３９．３；ＰＳ１８：０−１８：１、ｍ／ｚ８４６．５）。図３０Ｇ〜Ｈは、Ｐ−Ｂ反応後の不飽和脂質のＰ−Ｂ反応生成物のＭＳ２ＣＩＤを示している。腎臓におけるＦＡ１８：１の二重結合は、新しく生成されたフィンガープリントピーク（ｎ−９に対してｍ／ｚ１７１．０および１９７．０；ｎ−７に対してｍ／ｚ１９９．０および２２５．１）に従って、ｎ−９およびｎ−７と直接特定できる。ＰＳ１８：０−１８：１の場合、不飽和アシル鎖１８：１のＰ−Ｂ反応生成物が形成され、ｍ／ｚ３３９．３のスペクトルとして現れた。図３０Ｉは、ＰＳ１８：０−１８：１のＰ−Ｂ反応生成物からのｍ／ｚ３３９．３のＭＳ３ＣＩＤを示しており、ｎ−９およびｎ−７における二重結合の位置を示唆している。 図３０Ａ〜Ｉは、オンラインＰ−Ｂ反応と抽出スプレー質量分析との組み合わせによる直接脂質分析を示している。図３０Ａ〜Ｃは、−ナノＥＳＩのＵＶ照射によって誘起されるＰ−Ｂ反応の前および後の、抽出スプレーによる、ラット脳、腎臓および肝臓からサンプリングされた脂質の質量スペクトルを示している。図３０Ｄは、頭部基およびアシル鎖長を特定するためのｍ／ｚ７７８．５のＰＳ１８：０−１８：１のＭＳ２ＣＩＤを示している。図３０Ｅ〜Ｆは、化学的ノイズを差し引く（ｄｅｄｕｃｔｉｏｎ）ための、Ｐ−Ｂ反応の前の、不飽和脂質のＰ−Ｂ反応生成物と同じｍ／ｚ値のバックグラウンドピークのＭＳ２ＣＩＤを示している（ＦＡ１８：１、ｍ／ｚ３３９．３；ＰＳ１８：０−１８：１、ｍ／ｚ８４６．５）。図３０Ｇ〜Ｈは、Ｐ−Ｂ反応後の不飽和脂質のＰ−Ｂ反応生成物のＭＳ２ＣＩＤを示している。腎臓におけるＦＡ１８：１の二重結合は、新しく生成されたフィンガープリントピーク（ｎ−９に対してｍ／ｚ１７１．０および１９７．０；ｎ−７に対してｍ／ｚ１９９．０および２２５．１）に従って、ｎ−９およびｎ−７と直接特定できる。ＰＳ１８：０−１８：１の場合、不飽和アシル鎖１８：１のＰ−Ｂ反応生成物が形成され、ｍ／ｚ３３９．３のスペクトルとして現れた。図３０Ｉは、ＰＳ１８：０−１８：１のＰ−Ｂ反応生成物からのｍ／ｚ３３９．３のＭＳ３ＣＩＤを示しており、ｎ−９およびｎ−７における二重結合の位置を示唆している。 図３０Ａ〜Ｉは、オンラインＰ−Ｂ反応と抽出スプレー質量分析との組み合わせによる直接脂質分析を示している。図３０Ａ〜Ｃは、−ナノＥＳＩのＵＶ照射によって誘起されるＰ−Ｂ反応の前および後の、抽出スプレーによる、ラット脳、腎臓および肝臓からサンプリングされた脂質の質量スペクトルを示している。図３０Ｄは、頭部基およびアシル鎖長を特定するためのｍ／ｚ７７８．５のＰＳ１８：０−１８：１のＭＳ２ＣＩＤを示している。図３０Ｅ〜Ｆは、化学的ノイズを差し引く（ｄｅｄｕｃｔｉｏｎ）ための、Ｐ−Ｂ反応の前の、不飽和脂質のＰ−Ｂ反応生成物と同じｍ／ｚ値のバックグラウンドピークのＭＳ２ＣＩＤを示している（ＦＡ１８：１、ｍ／ｚ３３９．３；ＰＳ１８：０−１８：１、ｍ／ｚ８４６．５）。図３０Ｇ〜Ｈは、Ｐ−Ｂ反応後の不飽和脂質のＰ−Ｂ反応生成物のＭＳ２ＣＩＤを示している。腎臓におけるＦＡ１８：１の二重結合は、新しく生成されたフィンガープリントピーク（ｎ−９に対してｍ／ｚ１７１．０および１９７．０；ｎ−７に対してｍ／ｚ１９９．０および２２５．１）に従って、ｎ−９およびｎ−７と直接特定できる。ＰＳ１８：０−１８：１の場合、不飽和アシル鎖１８：１のＰ−Ｂ反応生成物が形成され、ｍ／ｚ３３９．３のスペクトルとして現れた。図３０Ｉは、ＰＳ１８：０−１８：１のＰ−Ｂ反応生成物からのｍ／ｚ３３９．３のＭＳ３ＣＩＤを示しており、ｎ−９およびｎ−７における二重結合の位置を示唆している。 図３０Ａ〜Ｉは、オンラインＰ−Ｂ反応と抽出スプレー質量分析との組み合わせによる直接脂質分析を示している。図３０Ａ〜Ｃは、−ナノＥＳＩのＵＶ照射によって誘起されるＰ−Ｂ反応の前および後の、抽出スプレーによる、ラット脳、腎臓および肝臓からサンプリングされた脂質の質量スペクトルを示している。図３０Ｄは、頭部基およびアシル鎖長を特定するためのｍ／ｚ７７８．５のＰＳ１８：０−１８：１のＭＳ２ＣＩＤを示している。図３０Ｅ〜Ｆは、化学的ノイズを差し引く（ｄｅｄｕｃｔｉｏｎ）ための、Ｐ−Ｂ反応の前の、不飽和脂質のＰ−Ｂ反応生成物と同じｍ／ｚ値のバックグラウンドピークのＭＳ２ＣＩＤを示している（ＦＡ１８：１、ｍ／ｚ３３９．３；ＰＳ１８：０−１８：１、ｍ／ｚ８４６．５）。図３０Ｇ〜Ｈは、Ｐ−Ｂ反応後の不飽和脂質のＰ−Ｂ反応生成物のＭＳ２ＣＩＤを示している。腎臓におけるＦＡ１８：１の二重結合は、新しく生成されたフィンガープリントピーク（ｎ−９に対してｍ／ｚ１７１．０および１９７．０；ｎ−７に対してｍ／ｚ１９９．０および２２５．１）に従って、ｎ−９およびｎ−７と直接特定できる。ＰＳ１８：０−１８：１の場合、不飽和アシル鎖１８：１のＰ−Ｂ反応生成物が形成され、ｍ／ｚ３３９．３のスペクトルとして現れた。図３０Ｉは、ＰＳ１８：０−１８：１のＰ−Ｂ反応生成物からのｍ／ｚ３３９．３のＭＳ３ＣＩＤを示しており、ｎ−９およびｎ−７における二重結合の位置を示唆している。 図３０Ａ〜Ｉは、オンラインＰ−Ｂ反応と抽出スプレー質量分析との組み合わせによる直接脂質分析を示している。図３０Ａ〜Ｃは、−ナノＥＳＩのＵＶ照射によって誘起されるＰ−Ｂ反応の前および後の、抽出スプレーによる、ラット脳、腎臓および肝臓からサンプリングされた脂質の質量スペクトルを示している。図３０Ｄは、頭部基およびアシル鎖長を特定するためのｍ／ｚ７７８．５のＰＳ１８：０−１８：１のＭＳ２ＣＩＤを示している。図３０Ｅ〜Ｆは、化学的ノイズを差し引く（ｄｅｄｕｃｔｉｏｎ）ための、Ｐ−Ｂ反応の前の、不飽和脂質のＰ−Ｂ反応生成物と同じｍ／ｚ値のバックグラウンドピークのＭＳ２ＣＩＤを示している（ＦＡ１８：１、ｍ／ｚ３３９．３；ＰＳ１８：０−１８：１、ｍ／ｚ８４６．５）。図３０Ｇ〜Ｈは、Ｐ−Ｂ反応後の不飽和脂質のＰ−Ｂ反応生成物のＭＳ２ＣＩＤを示している。腎臓におけるＦＡ１８：１の二重結合は、新しく生成されたフィンガープリントピーク（ｎ−９に対してｍ／ｚ１７１．０および１９７．０；ｎ−７に対してｍ／ｚ１９９．０および２２５．１）に従って、ｎ−９およびｎ−７と直接特定できる。ＰＳ１８：０−１８：１の場合、不飽和アシル鎖１８：１のＰ−Ｂ反応生成物が形成され、ｍ／ｚ３３９．３のスペクトルとして現れた。図３０Ｉは、ＰＳ１８：０−１８：１のＰ−Ｂ反応生成物からのｍ／ｚ３３９．３のＭＳ３ＣＩＤを示しており、ｎ−９およびｎ−７における二重結合の位置を示唆している。 図３０Ａ〜Ｉは、オンラインＰ−Ｂ反応と抽出スプレー質量分析との組み合わせによる直接脂質分析を示している。図３０Ａ〜Ｃは、−ナノＥＳＩのＵＶ照射によって誘起されるＰ−Ｂ反応の前および後の、抽出スプレーによる、ラット脳、腎臓および肝臓からサンプリングされた脂質の質量スペクトルを示している。図３０Ｄは、頭部基およびアシル鎖長を特定するためのｍ／ｚ７７８．５のＰＳ１８：０−１８：１のＭＳ２ＣＩＤを示している。図３０Ｅ〜Ｆは、化学的ノイズを差し引く（ｄｅｄｕｃｔｉｏｎ）ための、Ｐ−Ｂ反応の前の、不飽和脂質のＰ−Ｂ反応生成物と同じｍ／ｚ値のバックグラウンドピークのＭＳ２ＣＩＤを示している（ＦＡ１８：１、ｍ／ｚ３３９．３；ＰＳ１８：０−１８：１、ｍ／ｚ８４６．５）。図３０Ｇ〜Ｈは、Ｐ−Ｂ反応後の不飽和脂質のＰ−Ｂ反応生成物のＭＳ２ＣＩＤを示している。腎臓におけるＦＡ１８：１の二重結合は、新しく生成されたフィンガープリントピーク（ｎ−９に対してｍ／ｚ１７１．０および１９７．０；ｎ−７に対してｍ／ｚ１９９．０および２２５．１）に従って、ｎ−９およびｎ−７と直接特定できる。ＰＳ１８：０−１８：１の場合、不飽和アシル鎖１８：１のＰ−Ｂ反応生成物が形成され、ｍ／ｚ３３９．３のスペクトルとして現れた。図３０Ｉは、ＰＳ１８：０−１８：１のＰ−Ｂ反応生成物からのｍ／ｚ３３９．３のＭＳ３ＣＩＤを示しており、ｎ−９およびｎ−７における二重結合の位置を示唆している。
図３１Ａ〜Ｅは、オンラインＰ−Ｂ反応と抽出スプレー質量分析との組み合わせによる直接脂質分析を示している。ＵＶ照射によって誘起されるＰ−Ｂ反応の前（図３１Ａ）および後（図３１Ｂ）の負イオンモードにおける抽出スプレーによるラット腎臓からサンプリングされた脂質の質量スペクトル。図３１Ｃは、腎臓におけるＦＡ１８：１の二重結合を決定するためのｍ／ｚ３３９．３のＰ−Ｂ反応生成物のＭＳ２ＣＩＤを示している。図３１Ｄは、頭部基およびアシル鎖長を特定するためのｍ／ｚ７７８．５のＰＳ１８：０−１８：１のＭＳ２ＣＩＤを示している。図３１Ｅは、ＰＳ１８：０−１８：１のＰ−Ｂ反応生成物からのｍ／ｚ３３９．４のＭＳ３ＣＩＤを示している。 図３１Ａ〜Ｅは、オンラインＰ−Ｂ反応と抽出スプレー質量分析との組み合わせによる直接脂質分析を示している。ＵＶ照射によって誘起されるＰ−Ｂ反応の前（図３１Ａ）および後（図３１Ｂ）の負イオンモードにおける抽出スプレーによるラット腎臓からサンプリングされた脂質の質量スペクトル。図３１Ｃは、腎臓におけるＦＡ１８：１の二重結合を決定するためのｍ／ｚ３３９．３のＰ−Ｂ反応生成物のＭＳ２ＣＩＤを示している。図３１Ｄは、頭部基およびアシル鎖長を特定するためのｍ／ｚ７７８．５のＰＳ１８：０−１８：１のＭＳ２ＣＩＤを示している。図３１Ｅは、ＰＳ１８：０−１８：１のＰ−Ｂ反応生成物からのｍ／ｚ３３９．４のＭＳ３ＣＩＤを示している。 図３１Ａ〜Ｅは、オンラインＰ−Ｂ反応と抽出スプレー質量分析との組み合わせによる直接脂質分析を示している。ＵＶ照射によって誘起されるＰ−Ｂ反応の前（図３１Ａ）および後（図３１Ｂ）の負イオンモードにおける抽出スプレーによるラット腎臓からサンプリングされた脂質の質量スペクトル。図３１Ｃは、腎臓におけるＦＡ１８：１の二重結合を決定するためのｍ／ｚ３３９．３のＰ−Ｂ反応生成物のＭＳ２ＣＩＤを示している。図３１Ｄは、頭部基およびアシル鎖長を特定するためのｍ／ｚ７７８．５のＰＳ１８：０−１８：１のＭＳ２ＣＩＤを示している。図３１Ｅは、ＰＳ１８：０−１８：１のＰ−Ｂ反応生成物からのｍ／ｚ３３９．４のＭＳ３ＣＩＤを示している。 図３１Ａ〜Ｅは、オンラインＰ−Ｂ反応と抽出スプレー質量分析との組み合わせによる直接脂質分析を示している。ＵＶ照射によって誘起されるＰ−Ｂ反応の前（図３１Ａ）および後（図３１Ｂ）の負イオンモードにおける抽出スプレーによるラット腎臓からサンプリングされた脂質の質量スペクトル。図３１Ｃは、腎臓におけるＦＡ１８：１の二重結合を決定するためのｍ／ｚ３３９．３のＰ−Ｂ反応生成物のＭＳ２ＣＩＤを示している。図３１Ｄは、頭部基およびアシル鎖長を特定するためのｍ／ｚ７７８．５のＰＳ１８：０−１８：１のＭＳ２ＣＩＤを示している。図３１Ｅは、ＰＳ１８：０−１８：１のＰ−Ｂ反応生成物からのｍ／ｚ３３９．４のＭＳ３ＣＩＤを示している。
図３２Ａ〜Ｅは、脂質抽出のための溶媒の最適化を示している。７０％アセトン＋１０％Ｈ２Ｏ＋２０％Ｘ（Ｘ＝（図３２Ａ）Ｈ２Ｏ、（図３２Ｂ）イソプロパノール（Ｉｓｏｐｒｏｐａｎａｌ）（ＩＰＡ）、（図３２Ｃ）アセトニトリル（ＡＣＮ））を含む配合において直接抽出された脂質のＭＳスペクトル。図３２Ｄ〜Ｅは、ＦＡ１８：０［（Ｍ−Ｈ）−、ｍ／ｚ２８３．３］、ＦＡ１８：１［（Ｍ−Ｈ）−、ｍ／ｚ２８１．３］およびＰＳ１８：０−１８：１［（Ｍ−Ｈ）−、ｍ／ｚ７８８．５］のシグナル強度に対する溶媒の影響を示している。 図３２Ａ〜Ｅは、脂質抽出のための溶媒の最適化を示している。７０％アセトン＋１０％Ｈ２Ｏ＋２０％Ｘ（Ｘ＝（図３２Ａ）Ｈ２Ｏ、（図３２Ｂ）イソプロパノール（Ｉｓｏｐｒｏｐａｎａｌ）（ＩＰＡ）、（図３２Ｃ）アセトニトリル（ＡＣＮ））を含む配合において直接抽出された脂質のＭＳスペクトル。図３２Ｄ〜Ｅは、ＦＡ１８：０［（Ｍ−Ｈ）−、ｍ／ｚ２８３．３］、ＦＡ１８：１［（Ｍ−Ｈ）−、ｍ／ｚ２８１．３］およびＰＳ１８：０−１８：１［（Ｍ−Ｈ）−、ｍ／ｚ７８８．５］のシグナル強度に対する溶媒の影響を示している。 図３２Ａ〜Ｅは、脂質抽出のための溶媒の最適化を示している。７０％アセトン＋１０％Ｈ２Ｏ＋２０％Ｘ（Ｘ＝（図３２Ａ）Ｈ２Ｏ、（図３２Ｂ）イソプロパノール（Ｉｓｏｐｒｏｐａｎａｌ）（ＩＰＡ）、（図３２Ｃ）アセトニトリル（ＡＣＮ））を含む配合において直接抽出された脂質のＭＳスペクトル。図３２Ｄ〜Ｅは、ＦＡ１８：０［（Ｍ−Ｈ）−、ｍ／ｚ２８３．３］、ＦＡ１８：１［（Ｍ−Ｈ）−、ｍ／ｚ２８１．３］およびＰＳ１８：０−１８：１［（Ｍ−Ｈ）−、ｍ／ｚ７８８．５］のシグナル強度に対する溶媒の影響を示している。
図３３Ａ〜Ｃは、脂質およびアセトンのＰ−Ｂ反応のための溶媒の最適化を示している。図３３Ａは、ＦＡ１８：１［（Ｍ−Ｈ）−、ｍ／ｚ２８１．３、反応生成物イオン、ｍ／ｚ３３９．３］の反応時間に対する溶媒の影響を示している。図３３Ｂは、ＦＡ１８：１およびＰＳ１８：０−１８：１［（Ｍ−Ｈ）−、ｍ／ｚ７８８．５、反応生成物イオン、ｍ／ｚ３３９．３］の反応収率に対する溶媒の影響を示している。図３３Ｃは、ＦＡ１８：１およびＰＳ１８：０−１８：１［（Ｍ−Ｈ）−、ｍ／ｚ７８８．５、反応生成物イオン、ｍ／ｚ３３９．３］の反応収率に対する溶媒の影響を示している。 図３３Ａ〜Ｃは、脂質およびアセトンのＰ−Ｂ反応のための溶媒の最適化を示している。図３３Ａは、ＦＡ１８：１［（Ｍ−Ｈ）−、ｍ／ｚ２８１．３、反応生成物イオン、ｍ／ｚ３３９．３］の反応時間に対する溶媒の影響を示している。図３３Ｂは、ＦＡ１８：１およびＰＳ１８：０−１８：１［（Ｍ−Ｈ）−、ｍ／ｚ７８８．５、反応生成物イオン、ｍ／ｚ３３９．３］の反応収率に対する溶媒の影響を示している。図３３Ｃは、ＦＡ１８：１およびＰＳ１８：０−１８：１［（Ｍ−Ｈ）−、ｍ／ｚ７８８．５、反応生成物イオン、ｍ／ｚ３３９．３］の反応収率に対する溶媒の影響を示している。
図３４Ａ〜Ｂは、脂質およびアセトンのＰ−Ｂ反応のためのランプ条件の最適化を示している。ＵＶランプ（λ＝２５４ｎｍ）の予熱あり（図３４Ａ）またはなし（図３４Ｂ）でのＦＡ１８：１［（Ｍ−Ｈ）−、ｍ／ｚ２８１．３］およびそのＰ−Ｂ反応生成物イオン［（Ｍ＋５８−Ｈ）−、ｍ／ｚ３３９．３］の全イオン電流。 図３４Ａ〜Ｂは、脂質およびアセトンのＰ−Ｂ反応のためのランプ条件の最適化を示している。ＵＶランプ（λ＝２５４ｎｍ）の予熱あり（図３４Ａ）またはなし（図３４Ｂ）でのＦＡ１８：１［（Ｍ−Ｈ）−、ｍ／ｚ２８１．３］およびそのＰ−Ｂ反応生成物イオン［（Ｍ＋５８−Ｈ）−、ｍ／ｚ３３９．３］の全イオン電流。
図３５Ａ〜Ｃは、分析された脂質のダイナミックレンジを示している。図３５Ａは、全脂肪酸のうち、特定された脂肪酸のモルパーセントを示している。図３５Ｂは、全脂質のうち、特定されたリン脂質のモルパーセントを示している。図３５Ｃは、ｍ／ｚ３８１．３のＦＡ２１：１のＭＳ２ＣＩＤスペクトルを示しており、図３５Ｄは、二重結合の位置を決定するためのラット脳におけるｍ／ｚ３３９．３のＰＧ３４：２のＭＳ３ＣＩＤスペクトルを示している。 図３５Ａ〜Ｃは、分析された脂質のダイナミックレンジを示している。図３５Ａは、全脂肪酸のうち、特定された脂肪酸のモルパーセントを示している。図３５Ｂは、全脂質のうち、特定されたリン脂質のモルパーセントを示している。図３５Ｃは、ｍ／ｚ３８１．３のＦＡ２１：１のＭＳ２ＣＩＤスペクトルを示しており、図３５Ｄは、二重結合の位置を決定するためのラット脳におけるｍ／ｚ３３９．３のＰＧ３４：２のＭＳ３ＣＩＤスペクトルを示している。 図３５Ａ〜Ｃは、分析された脂質のダイナミックレンジを示している。図３５Ａは、全脂肪酸のうち、特定された脂肪酸のモルパーセントを示している。図３５Ｂは、全脂質のうち、特定されたリン脂質のモルパーセントを示している。図３５Ｃは、ｍ／ｚ３８１．３のＦＡ２１：１のＭＳ２ＣＩＤスペクトルを示しており、図３５Ｄは、二重結合の位置を決定するためのラット脳におけるｍ／ｚ３３９．３のＰＧ３４：２のＭＳ３ＣＩＤスペクトルを示している。
図３６は、下丘（左および右）、運動皮質（ｍｏｔｅｒ ｃｏｒｔｅｘ）（左および右）、小脳および脳幹を含む、５つのラット脳の６つの領域におけるＰＡ１８：１−１８：１の異性体比（ｎ−９対ｎ−７）（±ＳＤ、Ｎ＝５）を示している。
図３７Ａ〜Ｄは、負イオンモードでの反応抽出スプレー質量分析によるラット脳および腎臓における脂質の２Ｄ異性体比（±ＳＤ、Ｎ＝３）のイメージを示している。（図３７Ａ）インタクトなラット脳および（図３７Ｂ）腎臓に分布するＦＡ１８：１の２Ｄ異性体比イメージ（ｎ−９対ｎ−７）。インタクトなラット脳に分布する（図３７Ｃ）ＬＰＡ１８：１（ｎ−９対ｎ−７）および（図３７Ｄ）ＰＡ１８：１−１８：１（ｎ−９対ｎ−７）の２Ｄ異性体比（±ＳＤ、ｎ＝３）イメージ。 図３７Ａ〜Ｄは、負イオンモードでの反応抽出スプレー質量分析によるラット脳および腎臓における脂質の２Ｄ異性体比（±ＳＤ、Ｎ＝３）のイメージを示している。（図３７Ａ）インタクトなラット脳および（図３７Ｂ）腎臓に分布するＦＡ１８：１の２Ｄ異性体比イメージ（ｎ−９対ｎ−７）。インタクトなラット脳に分布する（図３７Ｃ）ＬＰＡ１８：１（ｎ−９対ｎ−７）および（図３７Ｄ）ＰＡ１８：１−１８：１（ｎ−９対ｎ−７）の２Ｄ異性体比（±ＳＤ、ｎ＝３）イメージ。
図３８Ａ〜Ｄは、負イオンモードでの反応抽出スプレー質量分析によるラット脳における不飽和脂質の２次元異性体比イメージを示している。（図３８Ａ）背側のラット脳および（図３８Ｂ）ラット腎臓切片の機能領域の模式図。図３８Ｃは、ラット脳におけるＰＡ１８：１−１８：１の２次元異性体比（±ＳＤ、Ｎ＝３〜９）イメージを示している。図３８Ｄは、５０回のサンプリングの前および後のラット脳の写真のセットである。 図３８Ａ〜Ｄは、負イオンモードでの反応抽出スプレー質量分析によるラット脳における不飽和脂質の２次元異性体比イメージを示している。（図３８Ａ）背側のラット脳および（図３８Ｂ）ラット腎臓切片の機能領域の模式図。図３８Ｃは、ラット脳におけるＰＡ１８：１−１８：１の２次元異性体比（±ＳＤ、Ｎ＝３〜９）イメージを示している。図３８Ｄは、５０回のサンプリングの前および後のラット脳の写真のセットである。
図３９Ａ〜Ｄは、ラット脳の前頭前皮質および脳幹における脂肪酸およびリン脂質の不飽和を示している。 図３９Ａ〜Ｄは、ラット脳の前頭前皮質および脳幹における脂肪酸およびリン脂質の不飽和を示している。 図３９Ａ〜Ｄは、ラット脳の前頭前皮質および脳幹における脂肪酸およびリン脂質の不飽和を示している。
図４０は、脂質の不飽和に対する凍結および解凍の影響を示している。新鮮なラット脳および−２０℃で１４日間凍結され、解凍された脳の６つの解剖領域（左および右の下丘、左および右の運動皮質、小脳ならびに脳幹を含む）におけるＰＡ１８：１−１８：１の異性体比。
図４１は、Ｐ−Ｂ反応が光化学反応であることを示している。
図４２は、小型質量分析計を用いて組織分析するために用いられる例示的な構成を示している。
図４３Ａ〜Ｅは、脂質プロファイリングの結果を示している。 図４３Ａ〜Ｅは、脂質プロファイリングの結果を示している。 図４３Ａ〜Ｅは、脂質プロファイリングの結果を示している。
図４４は、ホスホコリンのＣＩＤを示している。
図４５は、標準的な化合物を用いときのオンラインＰ−Ｂ反応を示している。
図４６は、ラット脳サンプルを用いたときのオンラインＰ−Ｂ反応を示している。
図４７Ａは、Ｃ＝Ｃを決定するためのＰＢ−ＭＳ／ＭＳの構成および原理を示している。図４７Ｂは、１％ＮＨ４ＯＨが加えられた１：１アセトン：Ｈ２Ｏ中の１０μＭのＦＡ１８：１（９Ｚ）のナノＥＳＩを示している。図４７Ｃは、ＵＶ光を点灯したときのＰＢ反応スペクトルを示している。図４７Ｄは、ＰＢ生成物（ｍ／ｚ３３９．３）のＭＳ２ＣＩＤが、ｍ／ｚ１７１および１９７にＣ＝Ｃ診断用イオンの形成をもたらすことを示している。 図４７Ａは、Ｃ＝Ｃを決定するためのＰＢ−ＭＳ／ＭＳの構成および原理を示している。図４７Ｂは、１％ＮＨ４ＯＨが加えられた１：１アセトン：Ｈ２Ｏ中の１０μＭのＦＡ１８：１（９Ｚ）のナノＥＳＩを示している。図４７Ｃは、ＵＶ光を点灯したときのＰＢ反応スペクトルを示している。図４７Ｄは、ＰＢ生成物（ｍ／ｚ３３９．３）のＭＳ２ＣＩＤが、ｍ／ｚ１７１および１９７にＣ＝Ｃ診断用イオンの形成をもたらすことを示している。 図４７Ａは、Ｃ＝Ｃを決定するためのＰＢ−ＭＳ／ＭＳの構成および原理を示している。図４７Ｂは、１％ＮＨ４ＯＨが加えられた１：１アセトン：Ｈ２Ｏ中の１０μＭのＦＡ１８：１（９Ｚ）のナノＥＳＩを示している。図４７Ｃは、ＵＶ光を点灯したときのＰＢ反応スペクトルを示している。図４７Ｄは、ＰＢ生成物（ｍ／ｚ３３９．３）のＭＳ２ＣＩＤが、ｍ／ｚ１７１および１９７にＣ＝Ｃ診断用イオンの形成をもたらすことを示している。
図４８Ａ〜Ｄは、ＰＳ１６：１（９Ｚ）／１８：１（９Ｚ）における二重結合の位置の解明を示している。図４８Ａは、ＰＳ１６：１（９Ｚ）／１８：１（９Ｚ）の構造および観察された開裂部位を示している。図４８Ｂは、ｍ／ｚ８１６．５におけるＰＳのＰ−Ｂ反応生成物のＭＳ２ＣＩＤを示している。図４８Ｃは、ＰＳのＰ−Ｂ反応生成物からのｍ／ｚ３３９．４のＭＳ３ＣＩＤを示している。図４８Ｄは、ＰＳのＰ−Ｂ反応生成物からのｍ／ｚ３１１．３のＭＳ３ＣＩＤを示している。 図４８Ａ〜Ｄは、ＰＳ１６：１（９Ｚ）／１８：１（９Ｚ）における二重結合の位置の解明を示している。図４８Ａは、ＰＳ１６：１（９Ｚ）／１８：１（９Ｚ）の構造および観察された開裂部位を示している。図４８Ｂは、ｍ／ｚ８１６．５におけるＰＳのＰ−Ｂ反応生成物のＭＳ２ＣＩＤを示している。図４８Ｃは、ＰＳのＰ−Ｂ反応生成物からのｍ／ｚ３３９．４のＭＳ３ＣＩＤを示している。図４８Ｄは、ＰＳのＰ−Ｂ反応生成物からのｍ／ｚ３１１．３のＭＳ３ＣＩＤを示している。
図４９Ａは、７０：３０アセトン／Ｈ２Ｏ中に５μＭで調製されたＰＣ１６：０／１８：１のＰＢ反応ＭＳスペクトルを示している。図４９Ｂは、インタクトなＰＣイオン（ｍ／ｚ７６０．６）およびそのＰＢ生成物（ｍ／ｚ８１８．６）のＸＩＣを示している。
図５０Ａは、ＰＢ反応のための直接注入の構成を示している。図５０Ｂは、５秒間のＵＶ曝露のための流速４．５μＬ／分での５μＭ ＰＣ１６：０／１８：１（９Ｚ）（７：３のアセトン：１％酢酸を含むＨ２Ｏ）のＰＢ反応ＭＳスペクトルを示している。挿入図は、インタクトなＰＣおよびそのＰＢ生成物のＸＩＤを示している。図５０Ｃは、ＵＶ曝露時間の関数としてインタクトなＰＣおよびＰＢ生成物のプロットを示している。図５０Ｄは、ＰＢ反応のためのフロー注入の構成を示している。ランプをキャピラリーから０．５ｃｍ離して置いている。 図５０Ａは、ＰＢ反応のための直接注入の構成を示している。図５０Ｂは、５秒間のＵＶ曝露のための流速４．５μＬ／分での５μＭ ＰＣ１６：０／１８：１（９Ｚ）（７：３のアセトン：１％酢酸を含むＨ２Ｏ）のＰＢ反応ＭＳスペクトルを示している。挿入図は、インタクトなＰＣおよびそのＰＢ生成物のＸＩＤを示している。図５０Ｃは、ＵＶ曝露時間の関数としてインタクトなＰＣおよびＰＢ生成物のプロットを示している。図５０Ｄは、ＰＢ反応のためのフロー注入の構成を示している。ランプをキャピラリーから０．５ｃｍ離して置いている。
図５１Ａは、Ｎｏｒｒｉｓｈ Ｔｙｐｅ Ｉ反応、および脂質の酸化を含むその後のラジカル反応を示している。ＰＢ反応収率の改善のために溶媒系からＯ２を排除する：ＰＣ１６：０／１８：１（９Ｚ）の１０秒間のＰＢ反応のＭＳスペクトル。図５０Ｂは、Ｎ２パージなしを示している。図５０Ｃは、Ｎ２パージありを示している。 図５１Ａは、Ｎｏｒｒｉｓｈ Ｔｙｐｅ Ｉ反応、および脂質の酸化を含むその後のラジカル反応を示している。ＰＢ反応収率の改善のために溶媒系からＯ２を排除する：ＰＣ１６：０／１８：１（９Ｚ）の１０秒間のＰＢ反応のＭＳスペクトル。図５０Ｂは、Ｎ２パージなしを示している。図５０Ｃは、Ｎ２パージありを示している。
図５２Ａは、３５１ｎｍのＵＶ照射下でＰＢ試薬としてベンズアルデヒドを用いたときのＰＣ１８：１（６Ｚ）／１８：１（６Ｚ）のＰＢ反応を示している。図５２Ｂは、ＰＢ生成物のＭＳ２ＣＩＤがｍ／ｚ６４８．４および７２２．５にＣ＝Ｃ診断用イオンを生成することを示している。 図５２Ａは、３５１ｎｍのＵＶ照射下でＰＢ試薬としてベンズアルデヒドを用いたときのＰＣ１８：１（６Ｚ）／１８：１（６Ｚ）のＰＢ反応を示している。図５２Ｂは、ＰＢ生成物のＭＳ２ＣＩＤがｍ／ｚ６４８．４および７２２．５にＣ＝Ｃ診断用イオンを生成することを示している。
図５３Ａは、ＦＡ１８：１（９Ｚ）および（１１Ｚ）の予測されるＣ＝Ｃ診断用イオンを示している。図５３Ｂは、ＦＡ１８：１（９Ｚ）および（１１Ｚ）混合物のＰＢ生成物のＭＳ２ＣＩＤを示している。
図５４は、内部標準としてＦＡ１７：１（１０Ｚ）を用いてＦＡ１８：１（９Ｚ）を定量するためのＮＬ５８スキャンを示している。挿入図：検量線。
図５５Ａは、定量のためのＣ＝Ｃ診断用イオン強度の使用を示している。図５５Ｂは、ＦＡ１８：１（９Ｚ）および（１１Ｚ）混合物のＭＳ２ＣＩＤスペクトルを示している。図５５Ｃは、モル比に対するＣ＝Ｃ診断用イオン強度比からの相対定量を示している。図５５Ｄは、ＦＡ１８：１（９Ｚ）および（１１Ｚ）に対する内部標準としてＦＡ１８：１（６Ｚ）を使用した絶対定量を示している。 図５５Ａは、定量のためのＣ＝Ｃ診断用イオン強度の使用を示している。図５５Ｂは、ＦＡ１８：１（９Ｚ）および（１１Ｚ）混合物のＭＳ２ＣＩＤスペクトルを示している。図５５Ｃは、モル比に対するＣ＝Ｃ診断用イオン強度比からの相対定量を示している。図５５Ｄは、ＦＡ１８：１（９Ｚ）および（１１Ｚ）に対する内部標準としてＦＡ１８：１（６Ｚ）を使用した絶対定量を示している。 図５５Ａは、定量のためのＣ＝Ｃ診断用イオン強度の使用を示している。図５５Ｂは、ＦＡ１８：１（９Ｚ）および（１１Ｚ）混合物のＭＳ２ＣＩＤスペクトルを示している。図５５Ｃは、モル比に対するＣ＝Ｃ診断用イオン強度比からの相対定量を示している。図５５Ｄは、ＦＡ１８：１（９Ｚ）および（１１Ｚ）に対する内部標準としてＦＡ１８：１（６Ｚ）を使用した絶対定量を示している。
図５６は、ショットガン分析に適用されたＰＢ−ＭＳ／ＭＳからＣ＝Ｃが特定された酵母極性抽出物由来のＧＰを示している。
図５７は、ポストカラム分離およびＥＳＩ−ＭＳにおけるＰＢの連結のスキームを示している。
図５８Ａ〜Ｃは、ラット脳からの（図５８Ａ）ＦＡ、ＧＰ（図５８Ｂ）および（図５８Ｃ）Ｃ＝Ｃ異性体の組成を示している。図５８Ｄは、種々の組織タイプ間のＦＡ１８：１およびＰＣ１６：０／１８：１のＣ＝Ｃ異性体の分布を示している。 図５８Ａ〜Ｃは、ラット脳からの（図５８Ａ）ＦＡ、ＧＰ（図５８Ｂ）および（図５８Ｃ）Ｃ＝Ｃ異性体の組成を示している。図５８Ｄは、種々の組織タイプ間のＦＡ１８：１およびＰＣ１６：０／１８：１のＣ＝Ｃ異性体の分布を示している。 図５８Ａ〜Ｃは、ラット脳からの（図５８Ａ）ＦＡ、ＧＰ（図５８Ｂ）および（図５８Ｃ）Ｃ＝Ｃ異性体の組成を示している。図５８Ｄは、種々の組織タイプ間のＦＡ１８：１およびＰＣ１６：０／１８：１のＣ＝Ｃ異性体の分布を示している。
図５９Ａ〜Ｆは、ＦＡ１７：１（１０Ｚ）およびＦＡ１８：１（９Ｚ）の等モル混合物（０．１％ＮＨ４ＯＨが加えられたアセトン／Ｈ２Ｏ＝５０／５０、ｖ／ｖ中でそれぞれ３．５μＭ）の負イオンモードナノＥＳＩ質量スペクトルを示している：図５９Ａは、アセトンによる光化学的タギングの前を示しており、図５９Ｂは、後を示している。図５９Ｃは、タグ化されたＦＡ１７：１（ｍ／ｚ３２５）のＭＳ２ビーム型ＣＩＤを示している。タグのロスは、主なフラグメンテーションチャネルである。ヒト血漿由来のＦＡ抽出物の負イオンモードナノＥＳＩ−ＭＳ：図５９Ｄは、アセトンタギングの前を示しており、図５９Ｅは、後を示している。図５９Ｆは、アセトンタギング後の５８Ｄａニュートラルロススキャン（ＮＬＳ）を示している。ＦＡの注釈における「＊」記号の数は、ＦＡに対するアセトンタギングの数を表す（ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ）。 図５９Ａ〜Ｆは、ＦＡ１７：１（１０Ｚ）およびＦＡ１８：１（９Ｚ）の等モル混合物（０．１％ＮＨ４ＯＨが加えられたアセトン／Ｈ２Ｏ＝５０／５０、ｖ／ｖ中でそれぞれ３．５μＭ）の負イオンモードナノＥＳＩ質量スペクトルを示している：図５９Ａは、アセトンによる光化学的タギングの前を示しており、図５９Ｂは、後を示している。図５９Ｃは、タグ化されたＦＡ１７：１（ｍ／ｚ３２５）のＭＳ２ビーム型ＣＩＤを示している。タグのロスは、主なフラグメンテーションチャネルである。ヒト血漿由来のＦＡ抽出物の負イオンモードナノＥＳＩ−ＭＳ：図５９Ｄは、アセトンタギングの前を示しており、図５９Ｅは、後を示している。図５９Ｆは、アセトンタギング後の５８Ｄａニュートラルロススキャン（ＮＬＳ）を示している。ＦＡの注釈における「＊」記号の数は、ＦＡに対するアセトンタギングの数を表す（ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ）。 図５９Ａ〜Ｆは、ＦＡ１７：１（１０Ｚ）およびＦＡ１８：１（９Ｚ）の等モル混合物（０．１％ＮＨ４ＯＨが加えられたアセトン／Ｈ２Ｏ＝５０／５０、ｖ／ｖ中でそれぞれ３．５μＭ）の負イオンモードナノＥＳＩ質量スペクトルを示している：図５９Ａは、アセトンによる光化学的タギングの前を示しており、図５９Ｂは、後を示している。図５９Ｃは、タグ化されたＦＡ１７：１（ｍ／ｚ３２５）のＭＳ２ビーム型ＣＩＤを示している。タグのロスは、主なフラグメンテーションチャネルである。ヒト血漿由来のＦＡ抽出物の負イオンモードナノＥＳＩ−ＭＳ：図５９Ｄは、アセトンタギングの前を示しており、図５９Ｅは、後を示している。図５９Ｆは、アセトンタギング後の５８Ｄａニュートラルロススキャン（ＮＬＳ）を示している。ＦＡの注釈における「＊」記号の数は、ＦＡに対するアセトンタギングの数を表す（ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ）。 図５９Ａ〜Ｆは、ＦＡ１７：１（１０Ｚ）およびＦＡ１８：１（９Ｚ）の等モル混合物（０．１％ＮＨ４ＯＨが加えられたアセトン／Ｈ２Ｏ＝５０／５０、ｖ／ｖ中でそれぞれ３．５μＭ）の負イオンモードナノＥＳＩ質量スペクトルを示している：図５９Ａは、アセトンによる光化学的タギングの前を示しており、図５９Ｂは、後を示している。図５９Ｃは、タグ化されたＦＡ１７：１（ｍ／ｚ３２５）のＭＳ２ビーム型ＣＩＤを示している。タグのロスは、主なフラグメンテーションチャネルである。ヒト血漿由来のＦＡ抽出物の負イオンモードナノＥＳＩ−ＭＳ：図５９Ｄは、アセトンタギングの前を示しており、図５９Ｅは、後を示している。図５９Ｆは、アセトンタギング後の５８Ｄａニュートラルロススキャン（ＮＬＳ）を示している。ＦＡの注釈における「＊」記号の数は、ＦＡに対するアセトンタギングの数を表す（ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ）。
図６０Ａ〜Ｂは、２５倍希釈の後の２μＬのラット血液由来のＦＡ抽出物の負イオンモードナノＥＳＩ質量スペクトルを示している：図６０Ａは、タギングの前を示しており、図６０Ｂは、タギング後のＮＬＳ（５８Ｄａ）を示している。「＃」記号は、化学的干渉を示している。 図６０Ａ〜Ｂは、２５倍希釈の後の２μＬのラット血液由来のＦＡ抽出物の負イオンモードナノＥＳＩ質量スペクトルを示している：図６０Ａは、タギングの前を示しており、図６０Ｂは、タギング後のＮＬＳ（５８Ｄａ）を示している。「＃」記号は、化学的干渉を示している。
図６１Ａは、光化学反応中の、インタクトなおよびアセトンでタグ化されたＦＡ１７：１およびＦＡ１８：１の抽出イオンクロマトグラムを示している。 図６１Ｂは、タグ化されたＦＡ１７：１およびＦＡ１８：１のＮＬＳ（５８Ｄａ）を示している。挿入図は、ＮＬＳに基づくＦＡ１８：１（９Ｚ）に対する検量線を示している（ＦＡ１７：１（１０Ｚ）をＩＳとして使用した）。 図６１Ｃおよび６１Ｄは、異なる反応溶媒条件を用いたときのＦＡ２０：４（５Ｚ、８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ）の光化学反応ＭＳスペクトルを示している：図６１Ｃでは、アセトン／水（５０／５０、ｖ／ｖ）を使用し、図６１Ｄでは、エタノール／アセトン／水（４０／３０／３０、ｖ／ｖ／ｖ）を使用している。 図６１Ｃおよび６１Ｄは、異なる反応溶媒条件を用いたときのＦＡ２０：４（５Ｚ、８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ）の光化学反応ＭＳスペクトルを示している：図６１Ｃでは、アセトン／水（５０／５０、ｖ／ｖ）を使用し、図６１Ｄでは、エタノール／アセトン／水（４０／３０／３０、ｖ／ｖ／ｖ）を使用している。
図６２Ａ〜Ｅは、ヒト血漿由来のＦＡ Ｃ＝Ｃ位置の異性体の分析を示している。図６２Ａは、タグ化されたＦＡ１８：１（ｍ／ｚ３３９．３）のＰＢ−ＭＳ／ＭＳを示している。Δ９およびΔ１１位にＣ＝Ｃを有する２つの異性体が検出される。図６２Ｂは、ＦＡ１８：１ Δ９およびΔ１１異性体の相対定量のための検量線を示している。図６２Ｃは、９１．５％Δ９および８．５％Δ１１異性体からなるＦＡ１８：１混合物の５８Ｄａ ＮＬＳに基づいて全ＦＡ１８：１を定量するための検量線を示している。図６２Ｄは、ω−３およびω−６ ＦＡ１８：３異性体（リチウム化されたｍ／ｚ３４３．３）の等モル混合物のＰＢ−ＭＳ／ＭＳを示している。各異性体のＣ＝Ｃ診断用イオンが明らかに検出される。図６２Ｅは、ヒト血漿由来のＦＡ１８：３のＣ＝Ｃ診断用イオンに対する拡大された領域のＰＢ−ＭＳ／ＭＳを示している。ω−６ ＦＡ１８：３が、ω−３異性体よりも大量である。 図６２Ａ〜Ｅは、ヒト血漿由来のＦＡ Ｃ＝Ｃ位置の異性体の分析を示している。図６２Ａは、タグ化されたＦＡ１８：１（ｍ／ｚ３３９．３）のＰＢ−ＭＳ／ＭＳを示している。Δ９およびΔ１１位にＣ＝Ｃを有する２つの異性体が検出される。図６２Ｂは、ＦＡ１８：１ Δ９およびΔ１１異性体の相対定量のための検量線を示している。図６２Ｃは、９１．５％Δ９および８．５％Δ１１異性体からなるＦＡ１８：１混合物の５８Ｄａ ＮＬＳに基づいて全ＦＡ１８：１を定量するための検量線を示している。図６２Ｄは、ω−３およびω−６ ＦＡ１８：３異性体（リチウム化されたｍ／ｚ３４３．３）の等モル混合物のＰＢ−ＭＳ／ＭＳを示している。各異性体のＣ＝Ｃ診断用イオンが明らかに検出される。図６２Ｅは、ヒト血漿由来のＦＡ１８：３のＣ＝Ｃ診断用イオンに対する拡大された領域のＰＢ−ＭＳ／ＭＳを示している。ω−６ ＦＡ１８：３が、ω−３異性体よりも大量である。 図６２Ａ〜Ｅは、ヒト血漿由来のＦＡ Ｃ＝Ｃ位置の異性体の分析を示している。図６２Ａは、タグ化されたＦＡ１８：１（ｍ／ｚ３３９．３）のＰＢ−ＭＳ／ＭＳを示している。Δ９およびΔ１１位にＣ＝Ｃを有する２つの異性体が検出される。図６２Ｂは、ＦＡ１８：１ Δ９およびΔ１１異性体の相対定量のための検量線を示している。図６２Ｃは、９１．５％Δ９および８．５％Δ１１異性体からなるＦＡ１８：１混合物の５８Ｄａ ＮＬＳに基づいて全ＦＡ１８：１を定量するための検量線を示している。図６２Ｄは、ω−３およびω−６ ＦＡ１８：３異性体（リチウム化されたｍ／ｚ３４３．３）の等モル混合物のＰＢ−ＭＳ／ＭＳを示している。各異性体のＣ＝Ｃ診断用イオンが明らかに検出される。図６２Ｅは、ヒト血漿由来のＦＡ１８：３のＣ＝Ｃ診断用イオンに対する拡大された領域のＰＢ−ＭＳ／ＭＳを示している。ω−６ ＦＡ１８：３が、ω−３異性体よりも大量である。
図６３Ａは、ヒト血漿中の不飽和ＦＡの定量を示している。 図６３Ｂは、ＲＷＰＥ１およびＰＣ３細胞における主要な不飽和ＦＡ量の比較を示している。（ｄ）ＲＷＰＥ１およびＰＣ３細胞におけるＦＡ１８：１のΔ９およびΔ１１異性体の量。図６３ＡおよびＢにおいて、エラーバーは、標準偏差、ｎ＝３を表す。ＲＷＰＥ１細胞におけるＦＡとＰＣ３細胞におけるＦＡとの差を、両側スチューデントｔ検定を用いて統計的有意性について評価した（＊＊＊ｐ＜０．０００５）。
図６４は、上部において、ＭＳ／ＭＳの間のＰＢ反応および逆ＰＢ反応の反応スキームを示している。図６４の下部は、ＮＬＳによって不飽和ＦＡを定量するためにＡＢ Ｓｃｉｅｘ Ｑｔｒａｐ ４０００ＭＳにおいてナノＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳとＰＢ反応を連結する実験の構成を示している。
図６５は、ヒト血漿中のＦＡの回収率を推定する原理を図示している（ＬＩＰＩＤ−ＭＡＰＳ ＦＡ抽出プロトコルを用いる）。
図６６Ａ〜Ｃは、異なる溶媒条件下でのＰＢ反応によるアラキドン酸（ＦＡ２０：４（５Ｚ、８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ））の光化学的タギングを示している。図６６Ａは、溶媒としてアセトン／水（５０／５０、ｖ／ｖ）を用いたときのＦＡ２０：４のＰＢ反応質量スペクトルを示している。図６６Ｂは、溶媒としてエタノール／アセトン／水（４０／３０／３０、ｖ／ｖ）を用いたときのＦＡ２０：４のＰＢ反応質量スペクトルを示している。図６６Ｃは、ｍ／ｚ３６１．３でのＦＡ２０：４のＰＢ生成物のＣＩＤスペクトルを示しており、ここで、主なフラグメンテーションチャネルは、５８Ｄａ（アセトン）および４４Ｄａ（ＣＯ２）のニュートラルロスである。
図６７は、各異性体の２つの診断用イオンの相対強度によるＦＡ１８：１ Ｃ＝Ｃ異性体組成の測定を示している。挿入図は、診断用イオンに対する質量範囲の拡大図および診断用イオン強度比を異性体組成に変換する検量線である。
図６８Ａは、純粋なオレイン酸（ＦＡ１８：１（９Ｚ））およびｃｉｓ−バクセン酸（ＦＡ１８：１（１１Ｚ））に対する検量線を示している。各異性体のタグ化された生成物が、異なる程度のタグロスを示すので、これらの２つの検量線が、互いと重なり合わないことに注意されたい。 図６８Ｂは、８０％ＦＡ１８：１（９Ｚ）と２０％ＦＡ１８：１（１１Ｚ）との混合物の検量線を示している。
図６９Ａ〜Ｂは、ヒト血漿中のＰＵＦＡ（ＦＡ１８：３およびＦＡ２０：４）の分析を示している。図６９Ａは、ＩＳとして７．５μＭ ＦＡ１７：１を加えたＦＡ抽出物のナノＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示している。図６９Ｂは、ＰＢ反応後のＮＬＳスペクトルを示している。乾燥させたＦＡ抽出物（２０μＬのヒト血漿由来）を、７．４６μＭ ＩＳを加えた４００μＬの溶媒で再構成した。
図７０Ａ〜Ｄは、ヒト血漿中のＦＡ１８：３がω−３（ＦＡ１８：３（９Ｚ、１２Ｚ、１５Ｚ）、α−リノール酸、ＡＬＡ）異性体とω−６（ＦＡ１８：３（６Ｚ、９Ｚ、１２Ｚ）、γ−リノール酸、ＧＬＡ）異性体の混合物である場合を示している。ＦＡ１８：３は、ＰＵＦＡであるので、ＭＳ／ＭＳにおける大量の診断用イオンは、より優勢な４４Ｄａロス（負イオンモードにおける）に起因して、タギング後に生成され得ない。ゆえに、本発明者らは、塩化リチウム（５ｍＭ）を加えることによって、＋ナノＥＳＩ−ＭＳによるＦＡ１８：３の分析を可能にした。大量の診断用イオンがしかるべく生成され得、４４Ｄａニュートラルロスが抑制される。図７０Ａは、５ｍＭ ＬｉＣｌを加えた後のＦＡ抽出物のナノＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示している。溶媒は、アセトン／水（５０／５０、ｖ／ｖ）中の１０％エタノールである。図７０Ｂは、光化学的タギング後のＦＡ抽出物のナノＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示している。赤色で標識されたピークは、ＦＡ１８：３（ｍ／ｚ３４３．５）、ＦＡ１８：２（ｍ／ｚ３４５．５）およびＦＡ１８：１（ｍ／ｚ３４７．５）のタグ化された生成物である。図７０Ｃは、ｍ／ｚ３４３．３のバックグラウンドイオンのＣＩＤスペクトルを示している。図７０Ｄは、タグ化されたＦＡ１８：３（ｍ／ｚ３４３．３）のＣＩＤスペクトルを示している。 図７０Ａ〜Ｄは、ヒト血漿中のＦＡ１８：３がω−３（ＦＡ１８：３（９Ｚ、１２Ｚ、１５Ｚ）、α−リノール酸、ＡＬＡ）異性体とω−６（ＦＡ１８：３（６Ｚ、９Ｚ、１２Ｚ）、γ−リノール酸、ＧＬＡ）異性体の混合物である場合を示している。ＦＡ１８：３は、ＰＵＦＡであるので、ＭＳ／ＭＳにおける大量の診断用イオンは、より優勢な４４Ｄａロス（負イオンモードにおける）に起因して、タギング後に生成され得ない。ゆえに、本発明者らは、塩化リチウム（５ｍＭ）を加えることによって、＋ナノＥＳＩ−ＭＳによるＦＡ１８：３の分析を可能にした。大量の診断用イオンがしかるべく生成され得、４４Ｄａニュートラルロスが抑制される。図７０Ａは、５ｍＭ ＬｉＣｌを加えた後のＦＡ抽出物のナノＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示している。溶媒は、アセトン／水（５０／５０、ｖ／ｖ）中の１０％エタノールである。図７０Ｂは、光化学的タギング後のＦＡ抽出物のナノＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示している。赤色で標識されたピークは、ＦＡ１８：３（ｍ／ｚ３４３．５）、ＦＡ１８：２（ｍ／ｚ３４５．５）およびＦＡ１８：１（ｍ／ｚ３４７．５）のタグ化された生成物である。図７０Ｃは、ｍ／ｚ３４３．３のバックグラウンドイオンのＣＩＤスペクトルを示している。図７０Ｄは、タグ化されたＦＡ１８：３（ｍ／ｚ３４３．３）のＣＩＤスペクトルを示している。
図７１は、ヒト血漿中のＦＡ１８：３異性体の同定および定量を示している。図７１は、ＦＡ１８：３ω−３／ω−６異性体の１：１混合物のＣＩＤスペクトルを示している。赤色のピークは、ω−６異性体に属し、青色のピークは、ω−３異性体に属する。同じピークセットが下に拡大されており、ＦＡ１８：３ω−３／ω−６異性体の存在を示し、それらの相対強度を定量のために使用した。
図７２Ａ〜Ｂは、ＡＭＰＰ法を用いたときのヒト血漿中の不飽和ＦＡの定量を示している。図７２Ａは、ＡＭＰＰ誘導体化後のヒト血漿のＦＡ抽出物のナノＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示している。図７２Ｂは、ＡＭＰＰ誘導体化後の同じ抽出物のｍ／ｚ１８３．１のプリカーサーイオンスキャンスペクトルを示している。回収率を評価するために、抽出前にＦＡ１８：２−ｄ１１およびＦＡ１８：１−ｄ１７を加えた。
図７３Ａ〜Ｂは、正常および癌性前立腺細胞のＦＡプロファイルを示している。図７３Ａは、正常前立腺細胞（ＲＷＰＥ１細胞）におけるＦＡのナノＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示している。図７３Ｂは、癌性前立腺細胞（ＰＣ３細胞）におけるＦＡのナノＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示している。ＦＡ１７：１（１０Ｚ）をＩＳとして使用した。
図７４Ａ〜Ｂは、正常および癌性ヒト前立腺細胞におけるＦＡ１８：１が９Ｚおよび１１Ｚ異性体の混合物であることを示している。図７４Ａは、正常前立腺細胞におけるＦＡ１８：１のＰＢ反応生成物（ｍ／ｚ３３９．３）のトラップＣＩＤスペクトルを示している。図７４Ｂは、前立腺癌細胞におけるＦＡ１８：１のＰＢ反応生成物のトラップＣＩＤスペクトルを示している。図７４Ａ〜ＢにおけるトラップＣＩＤの条件は、以下であった：Ｑ３エントリーバリア（ｅｎｔｒｙ ｂａｒｒｉｅｒ）、２Ｖ；活性化時間、２００ミリ秒；ＡＦ２（フラグメンテーションエネルギー）、５０（任意単位）。ｍ／ｚ１７１．１／１９７．２の診断用イオンは、Δ９異性体に特有であり、ｍ／ｚ１９９．２／２２５．２の診断用イオンは、Δ１１異性体に特有である。Δ９異性体の相対量は、前立腺癌細胞においてより多い。
図７５は、不飽和脂肪酸を高度に選択的に定量するための方法が、光化学反応およびタンデム質量分析の使用を必要とすることを図示している。このような方法は、ショットガンリピドミクスアプローチにおいて、複雑な生体サンプル中の脂肪酸の分析に直接適用できる。
詳細な説明
本発明の方法は、光化学誘導体化をタンデム質量分析と組み合わせたものであり（ＰＣＤ−ＭＳｎ）、これによって、ショットガンリピドミクスアプローチにおいて、複雑な脂質混合物由来の脂質Ｃ＝Ｃ異性体の包括的な特徴付けおよび定量が可能になる。本発明の方法は、ラジカル反応（例えば、パターノ・ビューチ（Ｐ−Ｂ）反応）を使用することにより、不飽和脂質の中のＣ＝Ｃの位置を正確に指摘する。作動原理は、３つの主要コンポーネントを含む（図１Ａ）：（１）まず、２５４ｎｍのＵＶ照射下でのアセトン（ナノＥＳＩ溶媒としても同様に使用される）を用いたＰ−Ｂ反応を介して、Ｃ＝Ｃ結合をそれらの対応するＰ−Ｂ反応生成物に変換する。（２）次いで、反応生成物を連続的に単離し、ＣＩＤによって断片化することにより（タンデムＭＳ）、元のＣ＝Ｃ結合に形成されたオキセタン環が破壊されて、異性体特異的診断用イオン（診断用イオン）が選択的に生成される。（３）次いで、診断用イオンの相対存在比を用いることにより、様々な脂質種のＣ＝Ｃ異性体の相対定量および絶対定量が可能な強力な方法が開発される。本発明の方法は、ＰＣＤ−ＭＳｎが、脂質標的化を改善し、ラット脳における脂質Ｃ＝Ｃ異性体を含む９６個のユニークな脂質種を同定し、３５個の不飽和脂質を定量したことを示す。それは、ラット器官における不飽和脂質の異性体組成の不均一性も明らかにした。癌性組織では、ＦＡ１８：１およびＣ１８：１含有ホスホコリン（ＰＣ）のＣ＝Ｃ異性体の相対量の有意な変化が検出されたことから、診断方法、例えば、癌の診断方法としての本発明の方法の有用性が実証された。脂質Ｃ＝Ｃ異性体の産生に関与する種々の生合成経路を考慮すると、本方法は、細胞生物学および疾患診断法などの脂質Ｃ＝Ｃ異性体が関わる研究分野における広範な応用を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明の方法は、（１）ラット脳におけるＦＡおよびＰＬのＣ＝Ｃ異性体の組成の定量；（２）種々のラット組織におけるＰＬの異性体組成の測定および比較；（３）正常組織と癌性組織との間のＰＬの異性体組成の比較に使用され得る。ナノＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳと連結されたＰ−Ｂ反応が、大量の異なる診断用イオンを介して脂質Ｃ＝Ｃ異性体の効率的で信頼性の高い特徴付けを可能にすることが本明細書中で示される。この方法論は、診断用イオンの相対強度を比較することによる脂質Ｃ＝Ｃ異性体の精密定量に拡張され得る。
タンデムＭＳと連結される光化学誘導体化のストラテジーの原理
Ｐ−Ｂ反応がナノＥＳＩ−ＭＳと連結される実験装置の概略図が、図１Ａに図示されている。ＵＶ源として主に２５４ｎｍを発光する低圧水銀（ＬＰ−Ｈｇ）ランプをＰ−Ｂ反応のために使用した。３５０．３〜０．５分後に安定状態に達するという点において反応動力学は速い（下記の実施例を参照のこと）。１つのＣ＝Ｃを含む脂質の場合、アセトンの中のＵＶによって活性化されるカルボニルがその脂質におけるＣ＝Ｃに付加されるとき、位置選択性が存在しないので、反応生成物は、２つのオキセタン位置異性体の混合物である。その結果、ＣＩＤにおいて、Ｐ−Ｂ反応生成物は、それぞれが１つの位置異性体に由来する２つの診断用イオンを生成する（図１Ｂ）。ＣＩＤの後に大量のＣ＝Ｃ特異的診断用イオンが選択的に形成されることは、フラグメンテーション抵抗性のＣ＝Ｃの反応生成物として、ＣＩＤ感受性の高エネルギーのオキセタン環の恩恵を受ける。さらに、診断用イオン対の中の特徴的な２６Ｄａの質量差が、特に干渉が存在する場合、診断用イオンの同定において有用である。脂質Ｃ＝Ｃ異性体の混合物の分析に対するＰＣＤ−ＭＳｎの能力を実証するために、オレイン酸（Ｃ１８：１ ｎ−９）とｃｉｓ−バクセン酸（Ｃ１８：１ ｎ−７）との４：１模擬（ｍｏｃｋ）混合物を調製し、分析した。ｍ／ｚ２８１のインタクトなＦＡの（ｉｆ）フラグメンテーション（脱プロトン化型）は、Ｃ＝Ｃの位置を正確に指摘するのに有用な情報価値のあるイオンを生成しない。対照的に、Ｐ−Ｂ反応およびタンデムＭＳの後、２つの異なる診断用イオン対が、ｍ／ｚ１７１．１／１９７．２（ＦＡ１８：１ ｎ−９）およびｍ／ｚ１９９．１／２２５．１（ＦＡ１８：１ ｎ−７）に現れる（図１Ｅ）。各診断用イオン対は、それらの特定の脂質Ｃ＝Ｃ異性体に特有であるので、ＰＣＤ−ＭＳｎは、無限の数の異性体を同時に分析できる。
続いて、ＰＣＤ−ＭＳｎを、＋ナノＥＳＩによって極性脂質を構造的に特徴付けるために拡張した。一例として、２つのＰＣ Ｃ＝Ｃ異性体、すなわち、１，２−ジペトロセレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＣ１８：１ ｎ−１２／１８：１ ｎ−１２）と１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＣ１８：１ ｎ−９／１８：１ ｎ−９）との等モル混合物を調製した。各ＰＣが、２つの同一のアシル鎖、Ｃ１８：１ ｎ１２またはｎ−９を含む。不飽和ＦＡと同様に、インタクトなＰＣのＣＩＤの後に、ｍ／ｚ１８４のシグニチャイオン（ＰＣまたはスフィンゴミエリンにおけるホスホコリン頭部基、図１Ｇ）以外の診断用イオンは形成され得ない。Ｐ−Ｂ反応およびタンデムＭＳの後、ｍ／ｚ６３４．５／７０２．６およびｍ／ｚ６７６．５／７０２．６の２つの診断用イオン対が生成され、これは、各ＰＣ１８：１／１８：１種におけるＣ１８：１ ｎ−１２およびＣ１８：１ ｎ−９と一致した。ゆえに、例としてＦＡ（−ナノＥＳＩ）およびＰＣ異性体（＋ナノＥＳＩ）を使用したとき、本発明の方法は、それらが有する電荷に関係なくすべての極性脂質を分析でき、このような利点がＰ−Ｂ反応のラジカルの性質に帰することが実証された３６，３７。さらに、Ｐ−Ｂ反応が、異なる位置におけるＣ＝Ｃに非選択的であり、すべてのＣ＝Ｃが、誘導体化される可能性を有することは、注目に値する。この理由から、１つより多いＣ＝Ｃを含むＰＬの場合、第一段階のＰ−Ｂ反応生成物のＣＩＤ質量スペクトルは、存在するすべてのＣ＝Ｃの情報を含む。そのようなスペクトルは、後段の反応生成物のスペクトルよりもかなり容易に解釈できるので、タンデムＭＳ分析を容易にするために常に前者を選択した。
脂質Ｃ＝Ｃ異性体を定量分析するためのＰＣＤ−ＭＳｎの検証
ＰＣＤ−ＭＳｎを、脂質Ｃ＝Ｃ異性体を定量する方法として検証するために、異なるモル比の異性体混合物を調製し、分析（典型的なＣＩＤ質量スペクトルのための分析、下記の実施例を参照のこと）に供した。すべてのＰＣ１８：１／１８：１またはＦＡ１８：１異性体に対して、異性体のモル比と、対応する診断用イオン間の強度比（図２Ａ）との間に優れた線形性が観察された（Ｒ２＝０．９９９２および０．９９９４）ことから、脂質Ｃ＝Ｃ異性体におけるＰＣＤ−ＭＳｎのロバストネスが示唆される（図２Ｂ）。強度比は、１つの異性体に対する診断用イオンの強度と別の異性体に対する診断用イオンの強度との比、すなわち、
と定義される。
精度は、ＰＣ１８：１／１８：１およびＦＡ１８：１の相対定量においてそれぞれ９０％および９５％（ｍｏｌ）を超える。反応質量スペクトルによると、不飽和脂質は、対応する反応生成物に完全に変換されなかった。しかしながら、いったん反応が安定になると、診断用イオン対の間の強度比も安定になる（下記の実施例を参照のこと）。ＰＣＤ−ＭＳｎのそのようなユニークかつ極めて有用な特徴は、Ｃ＝Ｃに対するＰ−Ｂ反応の高い特異性のおかげであり、それによって、脂質Ｃ＝Ｃ異性体の迅速かつ再現性のある定量分析が可能になる。
ＦＡ Ｃ＝Ｃ異性体の絶対定量
Ｃ＝Ｃ異性体の相対定量の基礎が確立されたら、絶対定量のための方法が開発された。２つの異性体（オレイン酸およびｃｉｓ−バクセン酸）を定量する必要があり、かつ第３の異性体（ペトロセレン酸、ＦＡ１８：１ ｎ１２）が利用可能である場合、絶対定量のために２つの検量線（オレイン酸およびｃｉｓ−バクセン酸に対する）が作成できる（図２Ｃ）。ここでは、ＦＡ１８：１ ｎ１２を共通の内部標準（ＩＳ）として使用した。ＩＳ濃度を一定（２２．７μＭ）に維持しつつ、オレイン酸またはｃｉｓ−バクセン酸の濃度を１．４〜４５．４μＭの範囲で変化させることによって、検量線を作成した。ＩＳは、両方のＦＡと混合されるので、オレイン酸とｃｉｓ−バクセン酸が共存することが定量の性能に影響するかを調べることは重要である。ｃｉｓ−バクセン酸／ＩＳおよびオレイン酸／ＩＳの検量線から計算された傾き（０．３５８７／０．２０７５＝１．７２９、図２Ｄ）を、ｃｉｓ−バクセン酸／オレイン酸混合物を用いて直接計測された傾き（Ａ＝１．６９４）（図２Ｂ）と比較した。これらの２つの傾きは一致することが見出された。ゆえに、複数の異性体の共存は、それらの互いの量的相互関係に対して検出可能な影響を及ぼさないと結論付けられた。この特徴のおかげで、ＰＣＤ−ＭＳｎが、無限の数の脂質Ｃ＝Ｃ異性体を特徴付けることおよび定量することが可能である。
第３の異性体が利用可能でない場合、絶対定量のための代替方法を開発することができる。これらは、ＰＣＤ−ＭＳｎによる相対定量と組み合わされたナノＥＳＩにおける標準物質の添加（下記の実施例を参照のこと）およびＩＳの使用を含む（下記の実施例を参照のこと）。これらの３つの方法の分析性能は、４：１のモル比のＦＡ１８：１ ｎ−９／ｎ−７の模擬混合物（ｃＦＡ１８：１ ｎ−７＝０．００３２ｍｇ／ｍＬ）およびラット脳由来のＦＡ抽出物の分析を通じて実証された。ＰＣＤ−ＭＳｎ法の定量能力は、ＦＡ異性体を定量する際の異なる方法の間での一貫性およびその精度によって証明される。全体的に見て、最初の２つの方法の分析性能（実験誤差＜７％、ｓ．ｅ．＜１５％）が、第３の方法より良好であり、これはおそらく後者におけるイオン化効率のばらつきに起因する。
ラット脳におけるＦＡおよびＰＬ Ｃ＝Ｃ異性体の相対定量
確立されたら、ＰＣＤ−ＭＳｎを、ラット脳由来の複雑なＦＡおよびＰＬ抽出物由来の脂質Ｃ＝Ｃ異性体を定量するために応用した。オゾン誘起解離（ＯｚＩＤ）などのＣ＝Ｃの位置を特定できる方法とクロマトグラフィーを組み合わせることによってＰＬ種のＣ＝Ｃ異性体の存在を報告した論文は、最近までほとんどなかった。脂質Ｃ＝Ｃ異性体の特徴付けに加えて、本発明の方法は、相対定量によって脂質Ｃ＝Ｃ異性体の組成情報も提供できる。いかなるクロマトグラフィー分離も行わずに、ＰＣＤ−ＭＳｎをショットガンリピドミクスとつなげることによって、分析を行った。不飽和ＦＡの場合、それらには、モノ不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）およびポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）が含まれる。ＦＡ２０：４を除いては、それらのＰ−Ｂ反応生成物のフラグメンテーションは、大量の診断用イオンを放出する。ラット脳における不飽和ＦＡのうち、ＦＡ１６：１、１８：２および２０：４が、ＦＡ１６：１ ｎ−７、ＦＡ１８：２ ｎ−６およびＦＡ２０：４ ｎ−６の形態で純粋であることが見出された。対照的に、ＦＡ１９：１は、ｎ−８およびｎ−１０異性体の混合物であり、ＦＡ１８：１および２０：１も、ｎ−７およびｎ−９異性体の混合物であり、ＦＡ２２：１は、３つのｎ−７、ｎ−９およびｎ−１１異性体からなる（図３Ａ）。ＦＡ２０：４のＰ−Ｂ反応収率は高いが、しかしながら、ＰＵＦＡおよびそれらの反応生成物のＣＩＤの際の主なＣＯ２ロス（−４４Ｄａ）に起因して、診断用イオンは生成されなかった。この問題を回避するために、Ｌｉ＋を電荷担体として使用したところ、［ＰＵＦＡ＋Ｌｉ］＋付加体を形成することによって、ＣＯ２ロスの抑制に成功した。このようなストラテジーは、ＰＣＤ−ＭＳｎとも適合し、ＰＵＦＡ Ｃ＝Ｃ異性体の定量を可能にする（下記の実施例を参照のこと）。リチウム化されたＦＡ２０：４のＰ−Ｂ反応生成物のＣＩＤによって、４対のリチウム化された診断用イオンが大量に放出される（下記の実施例を参照のこと）。続いて、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、リゾＰＣ（ＬＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、リゾＰＥ（ＬＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、リゾＰＩ（ＬＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびリゾＰＳ（ＬＰＳ）を含む、検出されたすべての不飽和ＰＬの包括的分析を行った。ネガティブＣＩＤによる不飽和ＰＬ異性体の定量原理は、下記の実施例（ポジティブＣＩＤによる定量原理については図１Ｇに言及している）で詳述されている。ＦＡ１８：１ ｎ−７およびｎ−９異性体が共存することと一致して、ラット脳におけるすべてのＣ１８：１含有ＰＬも、ｎ−７およびｎ−９異性体の混合物に特定される。これは、他のＦＡおよび対応する脂肪酸アシルを含むそれらの対応するＰＬ（Ｃ１８：２、Ｃ２０：１、Ｃ２０：４およびＣ２２：６）にとって普遍的真実である（図３Ａおよび下記の実施例）。このような知見は、遊離ＦＡが基質として使用される良く確立したＰＬ合成機構に基づく。
ラット組織における脂質Ｃ＝Ｃ異性体の不均一組成
種々のラット器官における脂質Ｃ＝Ｃ異性体の異性体組成を調査し、比較するために、５つのラット器官の組織由来のＦＡおよびＰＬ抽出物を分析した。すべての器官に共通の大量のＰＣ種、ＰＣ１６：０／１８：１を本発明の方法の最初の標的とした。そのＰ−Ｂ反応生成物のタンデムＭＳは、ＰＣ１６：０／１８：１ ｎ−７およびｎ−９異性体の存在を強く示唆する２対の診断用イオン（ｍ／ｚ６５０．５／６７６．６および６７８．５／７０４．５）を生成する（図４Ａ〜Ｂ）。驚いたことに、ＰＣ１６：０／１８：１の異性体組成は、ラット器官において大きなばらつきを示した。このばらつきは、脳と筋肉の間で最も有意であり：脳では、ｎ−９異性体の診断用イオンは、ｎ−７異性体の診断用イオンよりも大量であったのに対して、筋肉ではその逆であった。分析されたすべてのラット器官におけるＰＣ１６：０／１８：１ ｎ−７の相対量は、脳＜脂肪＜腎臓＜肝臓＜筋肉の順序に従う。このデータは、遊離ＦＡとＰＬにおける対応する脂肪酸アシルとの間に相関関係があることを示している。ＦＡ１８：１およびＣ１８：１含有ＰＬを分析した。脳以外のすべての器官において、脂肪、腎臓、肝臓から筋肉まで、ＦＡ１８：１ ｎ−９およびＣ１８：１ ｎ−９含有ＰＬの相対量の一貫した増加が観察された。脳、筋肉、腎臓および肝臓は２４〜２６％、脂肪は１３％のＦＡ１８：１ ｎ−７を含む。これらの結果から、ＦＡ異性体の組成が、原形質膜の主要な構成要素であって正常なタンパク質の機能に不可欠なＰＬの異性体組成の測定において役割を果たすことが実証される。ラット腎臓、肝臓および筋肉において、各器官由来の３セットのＣ１８：１含有ＰＬの異性体組成に関して、不均一性が観察された（下記の実施例を参照のこと）。概して、ｎ−７異性体は、脳、腎臓、肝臓から筋肉において相対量の増加が見られたが、多くのＰＬは、３つすべての器官において検出できなかった。
癌性組織におけるＰＬ Ｃ＝Ｃ異性体の組成の変化
種々のラット器官における脂質Ｃ＝Ｃ異性体の組成の変化が確認された後、正常細胞／組織と癌性細胞／組織との間に同様の差異が存在し得るかに関して調査した。マウス乳癌を研究のモデルとして選択し、正常なマウス乳房組織をコントロール（野生型、ＷＴ）として使用することによって、本発明の方法を検証した。すべての極性脂質抽出物から、ＰＣが、＋ナノＥＳＩによって検出された最も多い脂質種であった。ゆえに、次いで、Ｃ１８：１を含むＰＣ（ＰＣ１６：０／１８：１、ＰＣ１８：０／１８：１、ＰＣ１８：１／１８：１を含む）をＰ−Ｂ反応およびタンデムＭＳに供することにより、異性体組成を測定した（下記の実施例を参照のこと）。異なるプロトコルを用いてＦＡを抽出し、ＦＡ１８：１の異性体を定量して、Ｃ１８：１含有ＰＣと比較した。
予想のとおり、調べたすべてのＣ１８：１含有ＰＣおよびＦＡ１８：１が、ｎ−９およびｎ−７異性体からなる（下記の実施例を参照のこと）。最も興味深いのは、図４Ｃ〜Ｆが示すような、ＦＡ１８：１ ｎ−７およびＣ１８：１ ｎ−７含有ＰＣの相対量がラット乳癌組織において増加した現象である（ＰＣ１６：０／１８：１を除く）。最も有意なｎ−７異性体の増加は、ＦＡ１８：１およびＰＣ１８：１／１８：１において見られた。ＰＣ１８：１／１８：１の場合、別の異性体、すなわち、ＰＣ１８：０／１８：２ ｎ−６も観察された。ＦＡ１８：１ ｎ−７およびＣ１８：１ ｎ−７含有ＰＣとは反対に、ＰＣ１８：０／１８：２ ｎ−６の相対量は、乳癌組織において激しく下方制御された（下記の実施例を参照のこと）。これらの知見の根底にある考えられる機序は、癌細胞におけるＦＡおよびＰＬ Ｃ＝Ｃ異性体の合成、変換および代謝の変化であり得る。そのような差異は、脂質Ｃ＝Ｃ異性体組成などの詳細な脂質組成情報に焦点を当てることによって、悪性疾患および病状を特定するための新しい展望をもたらす。
定量方法
本明細書中のデータは、複雑な組織抽出物中の脂質Ｃ＝Ｃ異性体の効率的かつ正確な定量に対するＰＣＤ−ＭＳｎストラテジーの能力を示す。この方法は、以下の理由から、不飽和脂質を定量分析するための日常的な手法として使用できる：（１）この方法は、構造の特徴付けと異性体定量の両方の能力を有することにより、無限の数の脂質Ｃ＝Ｃ異性体の分析が可能である。（２）定量分析にとって極めて望ましい非常に高い信号雑音比（Ｓ／Ｎ）を、診断用イオンに対して達成できる。第１に、ＣＩＤが適用されて、診断用イオンが生成され、この間にＭＳ１におけるほとんどの干渉が除去された。第２に、オキセタン環は、選択的に開裂されて大量の診断用イオンを生成し得る高エネルギー構造である。（３）Ｐ−Ｂ反応は、Ｃ＝Ｃに対して非常に選択的であるがＣ＝Ｃの位置に関係ない、ラジカルに基づく反応であるので、すべてのタイプの不飽和脂質が、誘導体化され得、ポジティブモードとネガティブモードの両方において分析され得る。（４）診断用イオンは、タンデムＭＳにおいて生成されたので、それらは、それらのプリカーサー脂質に容易にマッピングされ得ることから、複雑な混合物の直接的な分析が可能になる。ゆえに、ＰＣＤ−ＭＳｎは、大規模な定量分析のためのショットガンリピドミクスに適合しており、それと容易に組み合わせることができ、前段のクロマトグラフィーによる分離または後段の機器による修飾が不要である。
細胞によって進化されたセンサーおよび伝達経路のネットワークによって維持される脂質Ｃ＝Ｃ異性体組成は、一連の細胞プロセスに不可欠な膜ホメオスタシス（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）にとって重大である。しかしながら、頑健かつ高感度な方法がないゆえ、脂質Ｃ＝Ｃ異性体組成の体系的なモニタリングおよびプロファイリングは、非常に困難である。本方法は、生化学的研究において解き明かされていない問題、例えば、器官における脂質Ｃ＝Ｃ異性体組成の不均一性を維持するために用いられている根本的な機序は何か？、脂質のＣ＝Ｃ異性体の相対量の変化は、細胞の代謝にどのように影響するか、およびどのように病原に関係するか？、Ｃ＝Ｃ異性体組成は、疾患診断法に利用できるのか、または外来性の脂質Ｃ＝Ｃ異性体は、疾患の進行を妨害する、停止するまたは逆行させる治療薬として使用できるのか？に対して重要な証拠を与えることができる、そのような分析のための好適なアプローチを提供する。ＰＣＤ−ＭＳｎおよびショットガンリピドミクスから得られた結果はすでに、ＦＡおよびＰＬの異性体組成が、正常細胞／組織と癌性細胞／組織との間で有意に異なることを示している。ゆえに、ＰＣＤ−ＭＳｎに基づくリピドミクスは、疾患診断に向けたバイオマーカーを発見するのと同様に生物学的プロセスにおける脂質Ｃ＝Ｃ異性体の役割を調べるための新しい機会を提供する。
参照による援用
他の文書（例えば、特許、特許出願、特許公報、学術誌、書籍、論文、ウェブコンテンツ）に対する参照および引用は、本開示全体を通して行われる。そのような文書はすべて、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書中に援用される。
等価物
本明細書中に示されるおよび記載されるものに加えて、本発明およびその多くのさらなる実施形態の様々な改変は、本明細書に引用される科学文献および特許文献への言及を含む本文書の全内容から当業者に明らかになるだろう。本明細書中の主題は、様々な実施形態およびそれらの等価物において本発明の実施に適応され得る重要な情報、例証および指針を含む。
実施例１：材料および方法
脂肪酸抽出プロトコル：１ｍＬのＭｅＯＨおよび２５ｍＭ ＨＣｌ（１％ｖ）を５０ｍｇの組織に加えた後、ガラス管の中でサンプルを均質化した。次いで、そのサンプルを３０秒間ボルテックスした後、２７００ｒｐｍで１０分間遠心した。その後、上清を除去し、乾燥するまで蒸発させた。
リン脂質抽出プロトコル：５０ｍｇの組織に、３００μＬの脱イオン水を加えた後、ガラス管の中でサンプルを均質化した。抽出溶媒であるクロロホルム／メタノール（１／１；ｖ／ｖ）（溶媒Ａ）ならびに１０および５０ｎＭ ＬｉＣｌ溶液を調製する。クロロホルムをＶＷＲ（ＩＬ，ＵＳＡ）から入手し、ＬｉＣｌをＡｌｆ Ａｅｓａｒ（ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した。均質化の後、４ｍＬの溶媒Ａを抽出のためにガラス管に加え、水相の最終体積が２ｍＬになるように適切な体積の５０ｍＭ ＬｉＣｌを加えた。次いで、その管にふたをかぶせ、サンプルを２０秒間ボルテックスした。その後、サンプルを２７００ｒｐｍで１０分間遠心する。下層を新しいホウケイ酸ガラス管に回収し、２ｍＬのクロロホルムを、上層が残留している個々のガラス管に加えた。次いで、管にふたをかぶせ、２０秒間ボルテックスした。サンプルを再度、２７００ｒｐｍで１０分間遠心した。下層を回収し、最後の工程で回収されたものと合わせた。合わせた下層を、完全に乾燥するまで、窒素エバポレーターを用いて窒素気流下で蒸発させた。個々の残渣を４ｍＬの溶媒Ａに懸濁した後、２ｍＬの１０ｍＭ ＬｉＣｌを加えた。管にふたをかぶせ、２０秒間ボルテックスし、次いで、２７００ｒｐｍで１０分間遠心した。上記の２工程を繰り返した。個々の脂質抽出残渣を溶媒Ａに再懸濁した。最後に、脂質抽出物に窒素を流し、それにふたをかぶせ、ＭＳ分析のために−２０℃で保管した。
ＧＣ−ＭＳ分析：まず、脂肪酸サンプルを減圧下で乾燥させ、次いで、酢酸エチルで再構成した。
ＧＣ−ＭＳ分析の前に、２５ｕＬのサンプルを２５ｕＬの誘導体化試薬と混合した。次いで、０．５ｕＬの最終溶液を１０：１の分割比で注入した。
ナノＥＳＩ−ＭＳ、オンラインパターノ・ビューチ反応およびタンデムＭＳ分析：ＭＳ分析の前に、ＦＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ＰＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）およびラット組織抽出物をすべて、５０／５０（ｖ／ｖ）アセトン／水に溶解した。−ナノＥＳＩによるＦＡの検出を容易にするために、０．５％ＮＨ４ＯＨをサンプルに加えた。アセトンとＣ＝Ｃとの間のＰ−Ｂ反応のために、２５４ｎｍで発光する低圧水銀（ＬＰ−Ｈｇ）ランプ（Ｍｏｄｅｌ Ｎｏ．：８０−１０５７−０１，ＢＨＫ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。すべてのＭＳ実験を、４０００ＱＴＲＡＰ三連四重極／リニアイオントラップ（ＬＩＴ）ハイブリッド質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｓｃｉｅｘ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）において行った。この機器は、論文に記載されているように、ＰＩＳおよびＮＬＳが可能である。使用した機器パラメータは、以下のとおりである：ＥＳＩ電圧、±１２００〜１８００Ｖ；カーテンガス、１０ｐｓｉ；インターフェースヒーター温度、４０Ｃ；デクラスタリング電位：±２０。プリカーサーイオン選択幅（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｗｉｄｔｈ）を１．０Ｔｈに設定した。イオン注入時間を１０〜２００ミリ秒以内に維持することによって、プリカーサーイオン強度をＭＳ／ＭＳに対しておよそ４×１０６カウントで維持した。Ｐ−Ｂ反応生成物に対して使用した衝突エネルギーは、３５Ｖ（ビームＣＩＤ）または５０ａ．ｕ．（トラップＣＩＤ）であった。
実施例２：タンデムＭＳ後の診断用イオンの相対強度に対するイオン注入時間の影響
図５Ａ〜Ｂおよび表１におけるデータは、イオン注入時間が長くなる（１０〜２００ミリ秒）に従って、プリカーサーイオン（Ｐ−Ｂ反応生成物）、５８Ｄａニュートラルロス後のイオンおよびＤＩのすべての絶対強度が同様に上昇したことを例証している。しかしながら、ＤＩおよび５８Ｄａニュートラルロス後のイオンの相対強度は、注入時間が２０倍長くなっても非常に安定している。ＤＩおよびニュートラルロスイオンの生成は、２つの逆Ｐ−Ｂ反応経路であるので、これらの結果は、その２つの逆経路の間の分岐が注入時間に依存しないことを示唆している。このような重要な特徴は、ＣＩＤ分析のためのイオントラップに入れられるプリカーサーイオンの量を慎重に調節することを不要にする。
実施例３：Ｐ−Ｂ反応動態
ＰＣ１８：１ ｎ９／１８：１ ｎ９と１８：１ ｎ１２／１８：１ ｎ１２との混合物を用いて、＋ナノＥＳＩによってＰ−Ｂ反応動態を研究した。Ｐ−Ｂ反応生成物の量をそれらの抽出イオン電流（ＥＩＣ）によって表した。ＬＰ−Ｈｇランプが温まったら、反応生成物の量の急増が観察された。この反応は、約０．３〜０．５分後に安定になり、プラトーに達した。
図６は、２５４ｎｍのＵＶ照射下においてアセトンを用いたＰＣ１８：１／１８：１（２つのＣ＝Ｃ異性体の混合物）のＰ−Ｂ反応の動態を示している。速い反応速度が観察された：０．４分以内に反応は安定になった。その後、各異性体に対する診断用イオン間の比は、一定になり、これは、定量分析の基礎を築く（時点１、２および３における３つのタンデムスペクトルを参照のこと）。
不飽和脂肪酸に対して同様の結果が−ナノＥＳＩによって観察された。ｃｉｓ−バクセン酸溶液のＰ−Ｂ反応生成物（ｍ／ｚ３３９．３）のＥＩＣ、ならびにＥＩＣの拡大図（Ｐ−Ｂ反応開始後の３分間）が、図７Ａ〜Ｄに示されている。
実施例４：Ｐ−Ｂ反応およびタンデムＭＳに基づいて脂質Ｃ＝Ｃ異性体の絶対定量を可能にする３つの方法の原理
方法１：ＩＳとして第３の異性体を使用する絶対定量：定量されるべきものとは異なる１つのＣ＝Ｃ異性体を内部標準（ＩＳ）として使用した。次いで、ＩＳの診断用イオンとサンプル中の分析されるべきＣ＝Ｃ異性体由来の診断用イオンとの比が、計算され得る。Ｃ＝Ｃ異性体の絶対量は、そのＩＳを用いて各異性体に対して作成された検量線から求めることができる。
方法２：標準添加法：既知量の１つの異性体（分析用サンプル中に存在するもの、例えば、ＦＡ１８：１ ｎ１１）を混合物に加えた。標準添加法の結果として、２対の診断用イオン間の強度比は、変化し得る。
以下のパラメータを以下のとおり定義する：
Ｉ１：標準添加法の前の２対の診断用イオン間の強度比
Ｉ２：標準添加法の後の２対の診断用イオン間の強度比
Δｃ：異性体濃度の増加（この場合、ＦＡ１８：１ ｎ１１の濃度）
ｃ１：ＦＡ１８：１ ｎ１１の濃度
ｃ２：ＦＡ１８：１ ｎ９の濃度。
Ｃ１８：１ ｎ１１とＣ１８：１ ｎ９との間の検量線は、Ｉ＝１．６９４２ｘ−０．０１７（ｘは、濃度比（ＦＡ１８：１ ｎ１１対ＦＡ１８：１ ｎ９）である）であるので、以下が導かれる：
ゆえに、ＦＡ１８：１ ｎ１１およびＦＡ１８：１ ｎ９の元の濃度を容易に求めることができる。
方法３（Ｐ−Ｂ反応／タンデムＭＳを介する相対定量と組み合わされたナノＥＳＩによる総濃度の絶対定量）：異なる数の炭素を含む内部標準（ＩＳ）（例えば、ＦＡ１７：１）をＦＡ１８：１異性体の混合物に加える。定量されるべきＦＡの絶対定量のためにナノＥＳＩ−ＭＳ分析を行う。（１．予め検量線を作成する必要がある。２．ＦＡ Ｃ＝Ｃ異性体は、等しいイオン化効率を有すると仮定する）。Ｃ１８：１異性体の総濃度を計算する。各ＦＡ異性体の相対量は、Ｐ−Ｂ反応／タンデムＭＳによって測定され、その後、各異性体の絶対濃度が測定され得る。
実施例５：種々のタイプのリン脂質のＣ＝Ｃ異性体の相対定量
ＰＬ頭部基の極性に応じて、ＰＬは、正または負イオンモードで分析され得る。したがって、ＰＣは、＋ナノＥＳＩによって分析し、ＰＡ、ＰＩ、ＰＥおよびＰＳは、−ナノＥＳＩによって分析した。ここで、本発明者らは、２つの例（ＰＣ１８：０／１８：１およびリゾＰＥ１８：１）を用いて、Ｐ−Ｂ反応／タンデムＭＳを用いたＰＬの相対定量を実証する。ＰＬにおけるアシル鎖情報は、それらのギ酸付加体、酢酸付加体または塩素付加体の（−）ＣＩＤを介して得ることができる（図９Ａ〜Ｂを参照のこと）。
実施例６：ＰＵＦＡの構造の特徴付けおよび定量
すべてのラット器官におけるＦＡ１８：２について、そのＰ−Ｂ反応生成物のＣＩＤは、Ｃ９およびＣ１２におけるメチレンによって分断された２つのＣ＝Ｃと一致する２対の診断用イオンを放出する（ＦＡ１８：２ ｎ６）。図１０を参照のこと。
しかしながら、それよりはるかに多い数のＣ＝Ｃを含むＰＵＦＡの場合、インタクトなＰＵＦＡとそれらのＰ−Ｂ反応生成物の両方のフラグメンテーションの間のＣＯ２ロス（−４４Ｄａ）のフラグメンテーション経路が優勢になる。他のフラグメンテーション経路は抑制されるようになり、結局、Ｃ＝Ｃの位置の割り当てが困難になる。この問題を回避するために、リチウムを故意に付加して、ＦＡを［ＦＡ＋Ｌｉ］＋として＋ナノＥＳＩによって検出可能にする。図１１Ａ〜Ｄに示されているように、リチウム化されたＰ−Ｂ反応生成物のタンデムＭＳは、ＣＯ２ロスがここで完全に抑制された状態で大量の診断用イオン（リチウム化された形態）を生成した。このようなストラテジーは、ＰＵＦＡ異性体の汎用性のある効果的な特徴付けおよび定量を可能にする。
図１２は、ＩＦＡ２０：４ ｎ６／ＩＦＡ２０：４ ｎ３ 対 ｃＦＡ２０：４ ｎ６／ｃＦＡ２０：４ ｎ３の直線関係を例証している検量線を示している。下記の表２にデータも示す。
実施例７：ＰＬにおける多価不飽和脂肪酸アシル（Ｃ１８：２、Ｃ２０：４、Ｃ２２：６など）は、ラット器官において純粋なｎ６異性体として存在する
ラット器官からのＰＬ抽出物を分析したところ、それらの結果は、多価不飽和脂肪酸アシルが、純粋な異性体として存在するという結論に至り（Ｃ１８：２およびＣ２０：４はＣ１８：２ ｎ６およびＣ２０：４ ｎ６として；ならびにＣ２２：６はＣ２２：６ ｎ３として）、これは、以前に特定されたＰＵＦＡと一致する。
Ｃ１８：２脂肪酸アシル（図１３）：ｍ／ｚ７８６．６（＋ナノＥＳＩ）のイオンは、ＰＣ１８：０／１８：２であると特定された（［ＰＣ＋Ｃｌ］−の−ナノＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを介して）。二重結合の位置は、対応するＰ−Ｂ反応生成物のフラグメンテーションの後に特定された。ＰＣ１８：０／１８：２は、２つのＣ＝Ｃを有するので、２対の診断用イオンが、ｍ／ｚ６７８．５／７０４．６およびｍ／ｚ７１８．５／７４４．６に観察された。その２対の間の４０Ｄａの質量差は、四角の中に示されているように、メチレンによって分断された２つのＣ＝Ｃの存在を示唆する。さらに、他の任意の診断用イオン対が存在しないことによって、ＰＣ１８：０／１８：２の他の異性体が存在しないことが確認される。
Ｃ２０：４脂肪酸アシル：ｍ／ｚ７８２．６（＋ナノＥＳＩ）のイオンが、ＰＣ１６：０／２０：４とＰＣ１８：２／１８：２（少量）の混合物として特定された。脂肪酸アシルの情報は、［ＰＣ＋Ｃｌ］−の−ＭＳ／ＭＳを介して得られた。ＰＣ１６：０／２０：４に対して、Ｃ２０：４に４つのＣ＝Ｃが存在することと一致する４対の診断用イオンが観察された。ＰＣ１８：２／１８：２に対する２対の診断用イオンは、６７４．６／６９２．６および７１４．６／７４０．６における、ＰＣ１６：０／２０：４ ｎ６に対する４対のうちの２対と偶然重複する。したがって、ＰＣ１８：２／１８：２におけるＣ１８：２は、ＰＣ１８：０／１８：２の中のＣ１８：２について特徴付けられた異性体型と同じ異性体型であるＣ１８：２ ｎ６であると特定された。実際に、多価不飽和脂肪酸アシル（ここではＣ２０：４によって例証された）の場合、たとえいかなるタイプのＰＬ種が存在していたとしても、同じ純粋な異性体型である（他の多価不飽和脂肪酸アシルについてのデータ示さず）。
ＰＣ１６：０／２０：４ ｎ６（ラット脳；図１４Ａ）：左のパネル：［ＰＣ３６：４＋ＣＨ３ＣＯＯ］−のＣＩＤ質量スペクトルから、２つのＰＣ種、ＰＣ１６：０／２０：４およびＰＣ１８：２／１８：２の存在が明らかに示唆される。右のパネル：ＰＣ３６：４のＰ−Ｂ反応生成物のＣＩＤ質量スペクトル。診断用イオンを用いることによって、各ＰＣ種における二重結合の位置を容易に割り当てることができる。図１４Ｃは、ＰＣ１６：０／２０：４ ｎ６に対する診断用イオンの化学構造を示している。
ＰＣ１６：０／２０：４ ｎ６（ラット肝臓；図１４Ｂ）：同様の分析によって、ＰＥ１６：０／２０：４におけるＣ２０：４脂肪酸アシル（ラット肝臓由来）も、Ｃ２０：４
ｎ６として特徴付けられた。
Ｃ２２：６脂肪酸アシル：ｍ／ｚ８０６．６（＋ナノＥＳＩ）のイオンは、ＰＣ１６：０／２２：６であると特定された（ここで、脂肪酸アシルの情報は、［ＰＣ＋ＣＨ３ＣＯＯ］−付加体の−ＭＳ／ＭＳを介して得られた）。同様に、Ｃ＝Ｃの位置は、対応するＰ−Ｂ反応生成物の＋ナノＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって推定され得る。本発明者らは、Ｃ２２：６における６つのＣ＝Ｃの存在と一致する６対の診断用イオンを観察した。これらの６対の診断用イオンの質量電荷比（５８０．５／６０６．６、６２０．５／６４６．６、６６０．４／６８６．６、７００．５／７２６．６、７４０．５／７６６．６、７８０．６／８０６．６；奇数のｍ／ｚを有する共存イオンは、おそらくＰＣ１６：０／２２：６以外のＰＬ由来のフラグメントであった）を用いることにより、その６つのＣ＝Ｃの位置が４、７、１０、１３、１６および１９に存在すると明確に割り当てることができる。ゆえに、Ｃ２２：６は、Ｃ２２：６ ｎ３の形態で純粋である。
ＰＣ１６：０／２２：６ ｎ３（ラット脳；図１５）：左のパネル：Ｃ２２：６がＰＣ３８：６内のｓｎ−２位に存在し、Ｃ１６：０がｓｎ−１位に存在することを示している、［ＰＣ３８：６＋ＣＨ３ＣＯＯ］−のＣＩＤ質量スペクトル。右のパネル：ＰＣ１６：０／２２：６のＰ−Ｂ反応生成物のＣＩＤ質量スペクトル。
実施例８：複雑な混合物中のある特定のタイプの脂質のプリカーサーイオンスキャン（ＰＩＳ）およびニュートラルロススキャン（ＮＬＳ）のスピード分析（ｓｐｅｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）
図１６は、ラット組織におけるオレイン酸およびｃｉｓ−バクセン酸の生合成経路を示している。ラット組織由来のＰＬ抽出物の組成上の複雑さを考慮して、特定のクラスに属するＰＬおよびそれらの脂肪酸アシルの特定を速めるために、プリカーサーイオンスキャン（ＰＩＳ）およびニュートラルロススキャン（ＮＬＳ）を利用することができる。例えば、ｍ／ｚ１８４（＋ＭＳ／ＭＳにおける）のイオンを用いることにより、すべてのＰＣ、リゾＰＣおよびＳＭの情報をはっきり限定して抽出することができ、ｍ／ｚ２４１（−ＭＳ／ＭＳにおける）のイオンを用いることにより、複雑な脂質混合物由来のすべてのＰＩの情報を抽出することができる。１８７Ｄａおよび１４１Ｄａのニュートラルロスは、それぞれＰＳおよびＰＥに特徴的である。ラット脳の代表的なＰＩＳおよびＮＬＳスペクトルを図１７Ａ〜Ｄに示す。
ＰＬの脂肪酸アシル組成は、−ＭＳ／ＭＳによって得ることができる。このプロセスをより効率的にするために、共通の各脂肪酸アシルのｍ／ｚのＰＩＳを行うことにより、走査された脂肪酸アシルを含むすべてのＰＬのプロファイルを得ることができる。Ｃ１６：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：０、Ｃ２０：４、Ｃ２２：６およびＣ２２：４のＰＩＳ質量スペクトルを図１８Ａ〜Ｆに示す。各ＰＬは、２つの脂肪酸アシルを含むので、これらのスペクトルの２つに共通のｍ／ｚシグナルが現れる場合、ＰＬ内の２つの脂肪酸アシルを容易に特定できる。
図１９および下記の表３は、ラット脳から特定されたＰＬ異性体の数および構造の要旨を提供する。
実施例９：種々のラット組織におけるＰＬ Ｃ＝Ｃ異性体組成の変化
本明細書中のデータは、分析されたすべてのラット組織におけるＰＣ１６：０／１８：１の異性体組成が種々の器官の間で様々であることを示している。問うべき当然の疑問は、ＰＣ１６：０／１８：１に対して観察された傾向は他のＰＬに当てはまるのか？である。この疑問に答えるために、腎臓、肝臓および筋肉をはじめとした他のラット組織におけるＣ１８：１含有ＰＬを分析した。ＰＬ抽出物のナノＥＳＩ質量スペクトルから証明されたように、これらの組織における脂質組成は異なるので（図２０）、調べた器官に共通する大量のＰＬ種は、ほとんどなかった。しかしながら、この事実は、種々の器官におけるＰＬ異性体組成の不均一性を見抜くことを妨げない。各器官において最も大量だったＣ１８：１含有ＰＬを選択したところ、それらの異性体組成が似ていると見られることが観察された。より興味深いことに、ＰＬ異性体組成の器官間のばらつきは、明白であり、図２０に示されているように、ＰＣ１６：０／１８：１の異性体組成（図４）と一致する。Ｃ１８：１ ｎ７異性体の相対量は、筋肉で最も多く、腎臓で最も少なかったとみられる。
図２１は、ラット器官におけるＦＡ１８：１異性体の組成を示している。図２２は、ＦＡ１８：１のＰ−Ｂ反応生成物（ｍ／ｚ３３９．３）のタンデムＭＳによるＦＡ１８：１異性体の相対定量を示している（ラット脳、肝臓、筋肉、脂肪および腎臓）。
実施例１０：正常および癌性マウス乳房組織の分析
図２３に示されているように、正常マウス乳房組織（ＷＴ）の結果と比べて、ＦＡ１８：１ ｎ７およびＣ１８：１ ｎ７含有ＰＣの一貫した増加がマウス乳癌組織において観察された。正常組織（各パネルの左）および癌性組織（各パネルの右）由来の（図２３Ａ）ＦＡ１８：１、（図２３Ｂ）ＰＣ３４：１、（図２３Ｃ）ＰＣ３６：１および（図２３Ｄ）ＰＣ３６：２のＰ−Ｂ反応生成物のＣＩＤ質量スペクトル。（図２３Ｄ）では、ＰＣ１８：０／１８：２の相対量の減少も同様に明らかに観察された。ＰＣ１８：０／１８：２の特定に導く診断用イオンは、ｍ／ｚ６７８．５／７０４．５および７１８．５／７４４．６であった。下記の表４〜５も参照のこと。
実施例１１：パターノ・ビューチ反応と直接注入ＥＳＩ−ＭＳとの連結
ソフトイオン化と連結されたタンデム質量分析（ＭＳｎ、ここで、ｎは質量分析工程の数である）は、脂質分析のための好ましいプラットフォームとして登場している。すでに論じたように、Ｃ＝Ｃ結合の位置を明確に決定することは、分析上の難題であり続けている。上記のことは、パターノ・ビューチ（Ｐ−Ｂ）反応（ＵＶによって励起されたアセトンと不飽和脂質中のＣ＝Ｃ結合との間の付加環化）の変法をオンラインナノエレクトロスプレーイオン化（ナノＥＳＩ）ＭＳｎに適用することによって、複雑な混合物中のリン脂質および脂肪酸に対するＣ＝Ｃ結合の位置が、高い信頼性で決定できることを例証している。Ｐ−Ｂ反応は、ボロシリケートナノＥＳＩエミッターのＵＶ照射およびスプレープルームを介して実施され得る。この実施例では、ＥＳＩの前にその反応を溶融石英キャピラリーである「マイクロリアクター」において実施することによって、上記方法を改変した。シリンジポンプによって、長い光化学反応時間にわたって、溶液がコイル状のキャピラリーを通って加圧送液された。パラメトリック研究から、４．５μＬ／分での６秒以内のＵＶ曝露において、７：３アセトン：Ｈ２Ｏ １％モディファイヤー溶媒条件において、ＰＣ１６：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ）およびオレイン酸（ｎ−９Ｚ）に対してそれぞれ５０％および４０％Ｐ−Ｂ反応収率が達成されたことが示された。この反応は、０．１〜４．５μＬ／分の流速範囲にわたって首尾良く実行され、脂質溶液における種々のＬＣ溶媒とも適合した。最後に、この方法が生物学的抽出混合物に適用できることを実証するために、酵母極性脂質抽出物を分析することによって、この方法の有用性を試験し、合計３５個の不飽和リン脂質に対してＣ＝Ｃの位置が明らかにされた。
緒言
脂質は、疎水性の特色を有する多様な分子であり、脂質は、主要な生体分子脂質として、細胞膜の形成、細胞のシグナル伝達およびエネルギーの貯蔵などの重要な生物学的機能を果たす。生体系における脂質の理解を深めるために、生体系における脂質種の構造同定、空間的および時間的分布に関して完全に特徴付けることを目的に、リピドミクスという分野が強力なツールとして登場した。最先端の脂質分析は、タンデムＭＳ（ＭＳｎ、ここでｎは質量分析工程の数である）を介して高レベルの構造情報を得る際に、その低濃度での感度および選択性に起因して質量分析（ＭＳ）と連結される、大気圧の「ソフト」イオン化源、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）をほとんど例外なく利用する。
ＭＳ脂質分析の１つの応用法は、例えば、ＩＩ型糖尿病および自閉症に対する、疾患バイオマーカーの発見におけるものである。より効果的なバイオマーカーの探索が進歩するにつれて、最小のサンプル調製での高レベルの脂質構造情報の必要がますます重要になり、分析化学者にとって難しい問題を生み出している。例えば、脂肪酸アシル（ＦＡ）上のＣ＝Ｃ結合の位置が、リン脂質（ＰＬ）とコレステロールとの相互作用およびタンパク質結合において絶対必要な因子（ｉｎｔｅｇｒａｌ ｆａｃｔｏｒ）として登場しているが、最も商業的に入手可能なＭＳプラットフォームは、飽和度に対するデータを提供できるが、Ｃ＝Ｃの位置は、仮定されることが多く、報告されないことが多い。
ＭＳ法を用いてＣ＝Ｃの位置を決定するための方法は、いくつか存在し、タンデムＭＳまたは化学誘導体化の利用のように広くカテゴリー化され得る。タンデムＭＳの例としては、高エネルギーＣＩＤ（＞１ｋｅＶ）タンデム飛行時間型（ＴＯＦ）、リニアイオントラップ（ＬＩＴ）タンデムＭＳおよびＬＣ−イオン移動度タンデムＭＳが挙げられる。化学誘導体化ストラテジーは、Ｃ＝Ｃ結合を直接特定するために使用される結合特異的反応を必要とする。文献における卓越した方法は、オゾン反応を必要とし、ここで、ＬＣ分離後の液相オゾン分解、エレクトロスプレープルーム内でのオゾン分解（ＯｚＥＳＩ）、およびオゾン誘起解離（ＯｚＩＤ）と呼ばれる、減圧下での質量選択イオンをはじめとしたいくつかの変法が報告されている。
本明細書中の本発明の方法は、不飽和ＦＡおよびＰＬのＣ＝Ｃ結合の分析のために、ある形態のパターノ・ビューチ（Ｐ−Ｂ）反応を用いる、オンライン誘導体化を必要とし得る。そのＰ−Ｂ反応は、ナノＥＳＩプルームの紫外線（約２５０ｎｍのＵＶ照射）、およびその後の光励起したアセトンと脂肪酸アシルのオレフィン官能基との間での分子間の［２＋２］付加環化（ｃｙｃｌａｄｄｉｔｉｏｎ）によって実施されて、オキセタン生成物を生成し得る。そのオキセタン反応生成物に対する低エネルギーＣＩＤによって、元のＣ＝Ｃの位置に２６ダルトン（Ｄａ）の間隔をあけて２つの診断用フラグメントイオンが生成された（反応の概略図のスキーム１を参照のこと）。
この実施例は、連続フロー型光化学マイクロリアクターを用いて本発明の方法を実行することに焦点を当てる。分析化学では、光化学反応容器は、液体クロマトグラフィーにおけるカラム後の反応を介した電気化学的検出における感度および選択性を高めるために広範に使用されてきた。フロー型の光化学は、有機合成における発展途上の分野でもあり、そのフロー型の光化学では、従来のバッチ反応容器を、溶液を主に内径＜１ｍｍのキャピラリーに連続的に流すことに置き換えるか、またはそれによって高められる。分子間の光付加に加えて、分子内の［２＋２］連続フロー型光化学反応のフロー型化学の文献に例がいくつかある。連続的な溶液流をマイクロリアクターの寸法と組み合わせることにより、溶液のＵＶ曝露を正確に制御できるようになり、過度のまたは不均一なＵＶ曝露による望まれない副生成物を減少させることによって、生成物の収率を上昇させることができる。
この実施例では、一不飽和ホスファチジルコリン（ＰＣ）１６：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ）を、曝露時間、流速および溶媒組成を含む種々の実験条件下で反応収率を調査するためのモデル系として使用した。６秒間の累積ＵＶ曝露および４．５μＬ／分のフローにおいて、７：３アセトン：Ｈ２Ｏ １％酢酸中の５μＭ ＰＣ１６：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ）で、５０％という最大収率が達成された。酢酸の代わりにＮＨ４ＯＨを含む塩基性条件下の負イオン化モードにおいて、オレイン酸（ｎ−９Ｚ）およびホスファチジン酸（ＰＡ）１８：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ）に対する比較収率も得た。さらに、この反応は、０．１〜４．５μＬ／分の流速範囲およびＰＬの液体クロマトグラフィー分離にとって妥当な種々の溶媒条件下で首尾良く実行された。最後に、このＰ−Ｂ反応を、商業的に購入した酵母極性脂質抽出物の複雑な混合物の分析に適用したところ、ＥＳＩタンデムＭＳを介して３５個の不飽和ＰＬに対してＣ＝Ｃの位置が特定された。
下記のスキーム１は、ＵＶによって励起したアセトンと一不飽和脂肪酸との間の反応を示している。オキセタン環が形成されて、ＭＳ／ＭＳの衝突誘起解離（ＣＩＤ）において診断用イオンが生成され、そのイオンがＣ＝Ｃ結合の位置を特定する。
脂質命名法：Ｌｉｐｉｄ Ｍａｐｓプロジェクト（Ｆａｈｙら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２００９，５０，Ｓ９）ならびにＢｌａｎｋｓｂｙおよびＭｉｔｃｈｅｌｌによる近著（Ｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１５，１）の簡単な表記法を脂質の構造同定に使用した。ＰＬ標準物質に対して、頭部基、脂肪酸アシルの立体位置、炭素数、不飽和度およびＣ＝Ｃ立体配向を特定した。例えば、ＰＣ１６：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ）は、グリセロールのｓｎ１およびｓｎ２位にそれぞれ１６および１８炭素の脂肪酸アシル鎖を有するグリセロホスホコリン頭部基を表す。炭素数の後の「０」および「１」とは、脂肪酸アシルの不飽和度のことを指す。末端の炭素からアシル鎖のエステルに向かって連続した炭素の数を数えることによって、Ｃ＝Ｃ結合の位置を特定した。すなわち、ｎ−９位のＣ＝Ｃ結合は、脂肪酸アシルの炭素９と１０の間に配置されている。Ｃ＝Ｃ結合の立体配置に対するＺおよびＥ命名法は、Ｃ＝Ｃの位置の識別子の後に続く。酵母抽出物におけるＰＬ分析の場合、ｓｎ１およびｓｎ２脂肪酸アシルの位置は、任意に割り当て、アルケンのＺおよびＥ立体配置は、割り当てなかった。
化学物質：標準的な脂質および酵母極性抽出物のすべてを、１０または２５ｍｇ／ｍＬのクロロホルム溶液としてＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）から購入した。１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＣ１６：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ））、１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＰＡ１８：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ））およびｃｉｓ−９−オクタデセン酸（ｏｃｔａｄｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）（オレイン酸（ｎ−９Ｚ））を標準物質として使用した。クロロホルム溶液の原液をイソプロパノール（ＬＣグレード；Ｍａｃｒｏｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）で希釈した後、最終的な使用溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に希釈した。ＥＳＩの使用溶液において使用した主要な有機溶媒は、すべてＬＣグレードであり、アセトン（Ｍａｃｒｏｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、メタノール（Ｍａｃｒｏｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、アセトニトリル（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ヘキサン（９５％ｎ−ヘキサン；Ａｖａｎｔｏｒ；Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）およびイソプロパノールからなった。超高純度のＨ２Ｏを、０．０３μＳ・ｃｍの精製システム（モデル：ＣＡＳＣＡＤＡ ＡＮ ＭＫ２；Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）から入手した。水酸化アンモニウム（ＮＨ３として２８〜３０％；Ｍａｃｒｏｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）および氷酢酸（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｈａｚｅｌｗｏｏｄ，ＭＯ，ＵＳＡ）を、それぞれ（ｒｅｓｐｅｃｔｆｕｌｌｙ）ネガティブおよびポジティブＥＳＩモードにおける脂質のイオン化を高めるために溶液改質剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）として使用した。
Ｐ−Ｂ反応および直接注入ＥＳＩ：１８５ｎｍの発光がフィルタリングされる、２０ｍＡ、２．５４ｃｍのランプ長、０．９５ｃｍ直径の二重管低圧水銀（ＬＰ Ｈｇ）ランプ（モデル番号：８０−１０５７−０１；ＢＨＫ，Ｉｎｃ．；Ｏｎｔａｒｉｏ，ＣＡ）を使用して、ＰＢ反応を惹起した。製造者からのランプの仕様書には、２０ｃｍの距離における２５４ｎｍの主要な発光強度は６０μＷ／ｃｍ２であると記載されている。
シリンジポンプ（ポンプ１１ Ｅｌｉｔｅ；Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ；Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、脂質溶液で満たされたシリンジ（気密シリンジ、１７００シリーズ；Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｒｅｎｏ，ＮＶ，ＵＳＡ）を注入した。フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）管、ＦＥＰ管のスリーブ、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）付属品およびＰＥＥＫジャンクション（ＩＤＥＸ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ，ＷＡ，ＵＳＡ）を用いて、シリンジと溶融石英とを接続し、次いで、それをＥＳＩ源に接続した。溶融石英（ｐａｒｔ１０６８１５０１４０；外径３６３μｍ、内径１００μｍ；Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｍｏｌｅｘ；Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ，ＵＳＡ）は、製造者が提供する仕様書によると、３１０ｎｍにおいて＞１０％のＵＶ透過率を可能にするフルオロポリマーコーティングからなった。≧１μＬ／分の流速を用いる実験には市販のＥＳＩ源を使用した（Ｔｕｒｂｏ ＶＴＭ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｓｃｉｅｘ；Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）。ガス１、ガス２およびインターフェースヒーターをすべての実験でゼロに設定した。＜１μＬ／分の流速のために、チップ内径が８μｍの溶融石英ナノＥＳＩチップ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ；Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ；ＵＳＡ）を使用した。ステンレス鋼ユニオン（Ｖａｌｃｏ；Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を用いて、溶融石英ナノＥＳＩチップとＵＶ透過性溶融石英とをつなぎ、それは、印加される高電圧ＤＣに対する位置でもあった。溶液の調製およびＭＳの条件のさらなる詳細は、補足情報に見られる。
結果
不連続な曝露を介するＰ−Ｂ反応とオンラインＥＳＩ ＭＳｎを実施するためのこの実施例での構成を図２４に示す。この配置は、ＵＶ曝露の程度を変動させるときの実験条件に対する妨げが最小であることに起因して探索的研究に最適であると考えられた。表面積：体積比が２０，０００ｍ２／ｍ３（マイクロリアクター寸法）である、フルオロポリマーでコーティングされた溶融石英キャピラリー（内径１００μｍ）をＥＳＩ源に接続し、ＵＶ透過性材料として利用した。溶融石英を、直径２．５ｃｍの高密度ポリエチレンチューブに巻きつけ、一巻きに対して１ｃｍの長さがランプに曝露されるように、アルミニウム箔を用いて、その溶融石英を永久に覆った。それぞれの露出部分から０．５ｃｍの距離にランプを配置し、不連続な部分をアルミニウム箔で覆う／覆わないことによって、累積曝露時間を制御した。ＵＶに曝露される溶融石英管の総容積をサンプルの流速で除算することによって、累積曝露時間を決定した。
図２４における構成を用いてＰ−Ｂ生成物の形成速度を調べるために、７：３アセトン：Ｈ２Ｏ １％酢酸中に５μＭ一不飽和ＰＣ１６：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ）を含むＮ２パージ溶液をモデル系として使用した。各曝露時間に対して、反応を数分間実施し、定常状態の反応条件から平均されたスペクトルから、報告されたイオン強度を得た。生成物およびプリカーサーに対して同じイオン化効率を仮定して、反応中のＰ−Ｂの強度を反応前のプリカーサー強度で除算することによって、反応収率を推定した。サンプルをＵＶ光に曝露する前のＭＳ１スペクトルは、ｍ／ｚ７６０．６にプリカーサーシグナルを示し（図２５Ａ）、６秒間の累積ＵＶ曝露を行うと、ｍ／ｚ８１６．６にＰ−Ｂ反応生成物が、主要な反応生成物として観察された（図２５Ｂ）。ｍ／ｚ８１６．６のビーム型ＣＩＤは、ｍ／ｚ６５０．６および６７６．５におけるＣ＝Ｃの位置推定のための診断用イオンに加えて、ｍ／ｚ１８４．１３６のホスホコリン頭部基を明らかにした（図２５Ｃ）。これらの診断用イオンは、アセトンからのアルデヒド（ｍ／ｚ６５０．６）またはＣ（ＣＨ３）２（ｍ／ｚ６７６．５）で置換された一不飽和脂肪酸アシルからＣ９Ｈ１８が失われることに対応する。これらのイオンは、Ｃ＝Ｃの位置が１８Ｃ脂肪酸アシル上の９炭素と１０炭素との間に存在することを明らかに示している。
ＭＳ１反応スペクトルでは、ｍ／ｚ１００〜３００の低存在比の化学ノイズに加えて、比較的低い強度の副反応が、ｍ／ｚ８０２．６および８７６．６に観察された。ｍ／ｚ８０２．６は、アセトンの光誘起ホモリテック開裂に起因するＮｏｒｒｉｓｈ型反応およびその後の脂肪酸鎖におけるＣ＝Ｃ結合との共有結合性の反応と関連すると考えられる。ｍ／ｚ８７６．６の反応生成物は、現在のところ不明であるが、Ｐ−Ｂ生成物に対する非共有結合性のアセトン付加体に由来するかもしれない。観察された反応現象が、図２４における実験装置に起因しなかったことを確かめるために、連続的なＵＶ曝露のための実験構成を実行した。約９秒間の反応に対する不連続なＵＶ曝露と連続的なＵＶ曝露との間のＭＳ１スペクトルの比較によって、同様の反応現象が明らかにされたことから、それらの副反応が、不連続なＵＶ曝露の人為的結果ではなかったことが確認された。
バッチ条件と比べたときのフロー型光化学の利点の１つは、サンプルのＵＶ曝露を高度に制御できる点であり、それは、望まれない副反応を最小限に抑えることができ、長時間にわたって一定したイオン強度を維持できる。これは、低存在比のイオンシグナルを平均する目的で長い注入時間が必要とされることが多いショットガンリピドミクス研究に対して重要な意味を持つ。フロー型光化学の構成の長い反応時間に対する能力が、６秒間の累積曝露の場合のプリカーサーおよびＰ−Ｂ生成物のピーク面積の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を介して図２５Ｄに示される。図２４における装置を用いる典型的な実験の場合、ＵＶ曝露の点からＭＳインレットまでの総滞留時間は、４．５μＬ／分の流速において約１．２分であった。ゆえに、光子がＰＢ反応を惹起し、ランプを消すことでクエンチされることを確認する反応生成物のタイミングが、予測できた。いったんＰ−Ｂ反応生成物が観察されると、定常状態反応条件に達するのに約１分が必要であり、これは、６秒間の不連続なサンプル曝露に対する全ループ内におけるおよその総滞留時間であった。定常状態の反応条件における約２分間のイオン電流のゆらぎが小さいことは、低存在比のイオンシグナルを平均するための長い分析時間の実行可能性を実証する。
ＵＶ曝露の関数としてのＰ−Ｂ生成物形成の限界を調べるために、プリカーサーおよびＰ−Ｂ生成物の強度を約１秒の増分で記録した（図２５Ｅ）。１分を超える定常状態反応条件について平均された反応スペクトルのピーク高さから強度の値を得た。それらの条件では、Ｐ−Ｂ反応収率の線形増加が、４秒まで観察され、７秒後にプラトーが５０％反応収率で観察されるまで、傾きが減少し始めた。同様のアセトン系に対する収率は、過剰なアセトンおよび長い反応時間（＞２時間）において、シクロペンテン（２８％）およびシクロヘキセン（８％）について報告された。したがって、オレフィン生成に対する本明細書中の収率が、文献における以前の報告と比べて妥当であったことが見出された。
酸性条件下の正イオン化に加えて、多くの脂質が、リン酸の容易な脱プロトン化に起因して、塩基性溶液条件下の負イオン化ＥＳＩ ＭＳで分析される。負イオン化においてＰ−Ｂ反応を調べるために、オレイン酸（ｎ−９Ｚ）を、図２４と同じ実験構成を用いて、７：３アセトン：Ｈ２Ｏ １％ＮＨ４ＯＨ（５μＭ）のＮ２パージ溶液中のモデル化合物として使用した。図２６Ａは、ｍ／ｚ２８１．２のプリカーサーシグナルを示しているＭＳ１スペクトルであり、図２６Ｂは、６秒間の累積ＵＶ曝露後のＭＳ１反応スペクトルであった。ｍ／ｚ３２３．３、３９５．３および３９７．３における小さいピークに加えて、ｍ／ｚ３３９．３に大量のＰ−Ｂ生成物が観察された。Ｐ−Ｂ反応生成物（ｍ／ｚ３３９．３）に対するビーム型ＣＩＤは、ＦＡ上の炭素９と炭素１０との間にＣ＝Ｃ結合を位置づけるｍ／ｚ１７０．１および１９７．１のＣ＝Ｃ診断用イオンを示した。それらのｍ／ｚ値は、アセトンからのアルデヒド（ｍ／ｚ１７０．１）またはＣ（ＣＨ３）２（ｍ／ｚ１９７．１）で置換された一不飽和脂肪酸アシルからＣ９Ｈ１８が失われることに対応する。所与の実験条件に対するオレイン酸およびＰ−Ｂ生成物の強度の時系列グラフの知見は、Ｐ−Ｂ生成物が約６秒間のＵＶ曝露において４０％収率でプラトーに達することを明らかにした（図２６Ｄ）。さらに、ＰＡ１８：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ）を用いた負イオン化実験も、４０％の収率をもたらした。このことから、一不飽和ＰＬおよびＦＡに対するＰ−Ｂ反応収率が、関連する溶液のｐＨおよびイオン化極性とは無関係であることが実証される。
Ｐ−Ｂ生成物の収率を上げるために、直接注入の前に溶液にＮ２をパージした。Ｎ２パージは、溶液から酸素を排除するための確立された方法であり、蛍光の定量的測定において日常的に用いられている。溶液中の基底状態の分子状酸素は、エネルギーの衝突移動を介する効率的な３重項ラジカルスカベンジャーであり、蛍光強度の測定値を低下させる。溶液中に酸素が存在することが、Ｐ−Ｂ反応収率も低下させると立証されている。７：３アセトン：Ｈ２Ｏ １％酢酸中の５μＭ ＰＣ１６：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ）にＮ２パージを行わないと、低ｍ／ｚ値に観察される化学ノイズに加えて、ｍ／ｚ６５０．４、６２２．４および６０６．４に副反応ピークが観察される。Ｐ−Ｂ反応収率は、約２秒の曝露時間の後に約１０％という最大値に達する。このデータは、オンラインＰ−Ｂ反応を実施する前に酸素の溶液をパージすることが、所与の実験条件下でのＰ−Ｂ収率を最大にする際に重要であることを示している。
連続フロー型Ｐ−Ｂ反応の実験構成の性能をさらに調べるために、曝露時間を５秒に固定したときの流速の関数として収率を測定した（図２７Ａ）。絶対イオン強度が流速とともに変化するがゆえに同じグラフ内で直接比較できないので、定常状態の条件の反応中における強度比［Ｐ−Ｂ強度／（Ｐ−Ｂ強度＋プリカーサー強度）］をｙ軸に使用した。同じグラフにおいて、溶融石英ナノＥＳＩチップ（内径８μｍ）を１００〜７５０ｎＬ／分のために使用し、それより速い流速では市販のＥＳＩ源を使用した。強度比の極値は、０．４〜０．６の範囲であるが、しかしながら、大部分は０．４５〜０．５５であり、これは、ほぼ２桁の流速範囲にわたって一貫したＰ−Ｂ生成物形成と良く一致する。
上記データにおいて観察された１つの傾向は、各源に対して、より遅い流速を用いたときの強度比のわずかな低下である。この低下は、以前にＰ−Ｂ収率を低下させると実証された、より遅い流速では大気中の酸素が溶液ラインに多く拡散する結果であると推測される。さらに、２つのイオン化源の間で異なる強度比が観察され、これは、実験装置および条件の差、例えば、曝露の長さおよびランプの位置によって生じ得る。それにもかかわらず、上記データは、ほぼ２桁の流速範囲にわたって強度比が比較的一定であることを示し、これは、分析応用の可能性の範囲を拡大する。
これまで、７：３アセトン：Ｈ２Ｏ １％酢酸という固定された溶媒条件で反応条件を探索してきた。しかしながら、実際には、種々の溶媒条件がＥＳＩ ＭＳ脂質分析に使用される。ＣＨＣｌ３は、生物学的抽出のための溶媒として使用されるので、最も一般的な直接注入脂質溶媒であり、良好な脂質イオン化効率も提供する。残念なことに、ＣＨＣｌ３の存在は、Ｐ−Ｂ反応収率には有害であるので、他の妥当な溶媒系を調べた。
本明細書中に報告される体系的調査は、７０：１５：１５アセトン：Ｈ２Ｏ：溶媒 １％酢酸および６秒間のＵＶ曝露において、５μＭ ＰＣ１６：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ）に溶媒としてメタノール、イソプロパノール、アセトニトリルおよびヘキサンの添加を含んだ（図２７Ｂ）。すべての溶媒が、リン脂質の順相および逆相ＬＣ分離の両方にとって妥当であり、ギ酸アンモニウム（酢酸の代わりに使用した）が、共通のＬＣ−ＭＳ移動相の塩である。結果から、より小さいおよびより極性の溶媒、例えば、アセトニトリルおよびメタノールが、Ｈ２Ｏおよびアセトンを含むＰＬ溶液に加えられたとき、約１０％の収率をもたらした、より大きいおよびより極性の低い溶媒（ＩＰＡおよびヘキサン）と比べて、より高いＰ−Ｂ収率（２５％）をもたらしたことが示された。ＩＰＡおよびヘキサンを用いたとき観察された低い収率は、脂肪酸アシル鎖の溶媒和のためのアセトンとの競合に影響を与え、したがって、励起したアセトンがオレフィン官能基と反応する確率が低下すると推測される。さらに、ＵＶによって励起したアセトンを用いたときに、ヘキサンからの水素引き抜きなどの競合する反応経路が生じ、ゆえにＰ−Ｂ収率が低下することが知られている。最小のアセトン溶媒比に関する調査から、１：１Ｈ２Ｏ：アセトニトリル１％酢酸中の１％アセトンに対して１０％のＰ−Ｂ収率が明らかになった。モディファイヤーを含んで＜１のアセトン：Ｈ２Ｏ比の場合、ＰＣ１６：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ）に対するイオン化効率は悪かったが、アセトニトリルを加えると、イオン化効率は大幅に上昇した。これらの実験は、Ｐ−Ｂ反応をＬＣ溶媒と連結する実行可能性を実証し、それは、Ｐ−Ｂ反応をオンラインＬＣ−ＭＳと連結することを可能にする。
この実施例におけるＰ−Ｂ反応の観察は、これまで、制御された条件下で標準的な脂質を用いて行われてきた。生物学的サンプルのリピドミクス応用において、顕著な方法は、ほとんどサンプル調製せずに脂質抽出物を質量分析計に直接注入することである。生物学的材料の脂質抽出物は、Ｐ−Ｂ反応の有効性を潜在的に低下させ得る、標準液と比べて数桁高い化学的複雑さを有する。しかしながら、Ｐ−Ｂ反応の利点は、タンデムＭＳ中に診断用イオンが生成される点であり、これによって、個々のＰＬ種におけるＣ＝Ｃの特定における高い選択性および感度が可能になる。
Ｐ−Ｂ反応が生物学的抽出物に適用できることを、７：３アセトン：Ｈ２Ｏ １％酸／塩基モディファイヤー（０．１ｍｇ／ｍｌ）に希釈された、商業的に購入した酵母極性脂質抽出物の直接注入によって実証した。製造者に従って、アセトンおよびジエチルエーテルを、ジエチルエーテル相中のＰＬ内容物とともに、クロロホルム：メタノールの全抽出物に加え、それを濃縮し、クロロホルムに溶解した。ＰＬの分析のために、まず、三連四重極プリカーサーイオンスキャンおよびニュートラルロススキャンを用いて、特徴的なフラグメンテーション経路によってＰＬ種の頭部基を特定した。次いで、ＬＩＴ ＭＳ３走査を利用して、脂肪酸アシル鎖の長さおよび飽和度を特定した。最後に、サンプルを６秒間のＵＶ照射に曝露し、不飽和脂質のＰ−Ｂ生成物に対して予測されるｍ／ｚを、Ｃ＝Ｃ診断用イオンの検出のためにＬＩＴ ＭＳ３走査に供した。
負イオン化の場合の酵母脂質抽出物に対するＭＳ１ＬＩＴスペクトルを図２８Ａ〜Ｂに示す。ＵＶへの曝露の前に、ＰＬ種に対する大量のシグナルが観察され（図２８Ａ）、ＵＶ照射中に、赤色フォントで示されるスペクトルにおいていくつかのＰ−Ｂ反応ピークが観察される（図２８Ｂ）。ＭＳ１反応スペクトルにおいて明らかに観察されなかった反応生成物は、三連四重極およびプロダクトイオンの走査からのＰＬの同定に基づいて、Ｐ−Ｂ反応生成物に対するｍ／ｚ予測値によってさらに分析できた。例えば、図２８Ｃ〜Ｅは、Ｐ−Ｂ反応生成物ｍ／ｚ７７４．５における異性体ＰＥ１８：０＿１６：１（ｎ−７）およびＰＥ１６：０＿１８：１（ｎ−９）に対するタンデムＭＳスペクトルを示している。ｍ／ｚ７７４．５のビーム型ＣＩＤは、飽和および一不飽和脂肪酸アシルのフラグメントイオン（それぞれｍ／ｚ２８３．２、２５５．２および２８１．２、２５３．２）に加えて、ｍ／ｚ３１１．２および３３９．２のフラグメントイオンを生成した（図２８Ｃ）。図２８Ｂのｍ／ｚ３３９．２のＭＳ３イオントラップＣＩＤは、ｍ／ｚ１７１．０および１９７．１の診断用イオンとともに、１８−Ｃ一不飽和脂肪酸アシルのフラグメントイオン（ｍ／ｚ２８１．２）を示したことから、ｎ−９位におけるＣ＝Ｃ結合が示唆された（図２８Ｄ）。さらに、図２８Ｂからのｍ／ｚ３１１．２のＭＳ３イオントラップＣＩＤは、ｍ／ｚ１７１．０および１９７．１の診断用イオンとともに、１６−Ｃ一不飽和脂肪酸アシルのフラグメントイオン（ｍ／ｚ２５３．２）を示したことから、ｎ−７位におけるＣ＝Ｃ結合が示唆された（図２８Ｅ）。表６は、記載されたように分析された酵母極性抽出物中でＣ＝Ｃの位置が特定された３５個の不飽和ＰＬの要旨である。これらの結果は、Ｃ＝Ｃ診断用イオンの高感度の検出をもたらす、バックグラウンドノイズの減少におけるＭＳ３ＣＩＤの能力を示している。
結論
不飽和脂質におけるＣ＝Ｃ結合の位置を特定するために、代表的な［２＋２］パターノ・ビューチ反応をオンラインＥＳＩ ＭＳｎに結合するための方法を示した。流速、溶媒組成およびＵＶ曝露時間をはじめとした一連のＥＳＩ ＭＳ条件について、反応の限界を探索した。５０％という最高収率が、７：３アセトン：Ｈ２Ｏ １％酢酸において６秒間の累積ＵＶ曝露を用いたとき、５μＭ ＰＣ１６：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ）で達成された。負イオンモードにおけるオレイン酸およびＰＡ１８：０＿１８：１（ｎ−９Ｚ）の塩基性溶液で、４０％という収率が得られた。溶液中に分子状酸素が存在するとＰ−Ｂ反応収率が低下したので、分析の前に溶液にＮ２をパージした。その反応は、０．１〜４．５μＬ／分の流速範囲において首尾良く実行され、比較的一定した反応生成物の形成を示した。さらに、ＬＣ分離において日常的に使用される、アセトニトリル、メタノール、イソプロパノールおよびヘキサンなどの代替溶媒を加えることによっても、Ｐ−Ｂ反応を行った。最後に、酵母極性抽出物の複雑な混合物のオンライン分析へのこの方法の適用が実証された。反応環境が、上記モデル系と比べてかなり複雑であったにもかかわらず、合計３５個の不飽和リン脂質のＣ＝Ｃの位置が特定された。このような研究から、本明細書中の本発明が、複雑な混合物中の脂質のＣ＝Ｃの決定のために、カラム分離後のティー接合部を介して、Ｐ−Ｂ反応をオンラインＬＣ−ＭＳと連結することを達成することが可能になる。
実施例１２：組織中の不飽和脂質のプロファイリング
単純な手順を用いた質量分析（ＭＳ）による直接組織分析は、リピドミクス分析、特に、異性体脂質の不飽和に関する研究のためのリピドミクス分析を加速させる際に鍵となる工程である。この実施例では、まず、組織由来の不飽和脂質の異性体構造を、体系的な構造プロファイルを用いて、オンラインのパターノ・ビューチ（Ｐ−Ｂ）反応および抽出スプレー質量分析によって実行されたアンビエント質量分析によって単一工程で直接決定した。大きな塊の組織にステンレス鋼ワイヤを刺し、次いで、ＥＳＩ−ＭＳによる抽出、反応および検出のための溶媒が予め充填されたナノＥＳＩキャピラリーに浸漬することによって、脂質を直接抽出した。ＵＶ光（λ＝２５４ｎｍ）を用いてＰ−Ｂ反応を促進することにより、元のＣ＝Ｃ結合（ｂｏｕｎｄ）の位置にオキセタン環が付加された反応生成物イオン（＋５８Ｄａ）が形成され、それはその後、ＣＩＤによって開裂されて、特徴的なフラグメントイオンが生成する。広範なダイナミックレンジの濃度（ラット脳における全脂質の０．００１３％〜０．５％）の脂質の不飽和が、良好な再現性で特定され得る（検出される脂質の異性体比：ＲＳＤ＜１０％、１つの組織の同じ領域においてサンプリング；ＲＳＤ＜２１％、同じタイプの組織の同じ領域においてサンプリング）。本方法のサンプル消費は、１０μｇ／サンプルという少なさで達成され得るので、不飽和脂質の異性体比を、まず、ラット脳および腎臓に対してマッピングした。リゾホスファチジン酸（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｃ ａｃｉｄ）（ＬＰＡ）１８：１およびホスファチジン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｃ ａｃｉｄ）（ＰＡ）１８：１−１８：１の異性体比の有意差が、ラット脳の異なる領域において観察されたが、脂肪酸（ｆａｔｔｙ ａｉｃｄ）（ＦＡ）１８：１の異性体比は、ラット脳および腎臓の両方において比較的安定していた。
本研究は、まず、パターノ・ビューチ反応と抽出スプレー質量分析との統合によって、Ｃ＝Ｃ結合の位置とともに、組織由来の脂質の構造を直接決定した。サンプル消費が、約１０μｇという少なさであるので、小領域（０．５ｍｍ×０．５ｍｍ）における脂質の異性体を迅速に測定することができ、まず、脳および腎臓における異性体比の２次元（２Ｄ）マップとしてプロファイルできる。この手法は、組織の生物学的機能、生合成経路およびそれによる組織の病状に対する脂質の不飽和の影響を理解するために不飽和脂質をモニターするための有力なプラットフォームを提供する。
諸言
脂質は、細胞膜の発生、エネルギーの産生および貯蔵、ホルモンの産生、疎水性環境における膜タンパク質の隔離および保護、ならびにそれらの自己集合および集団的挙動を介した細胞のシグナル伝達プロセスにおいて緊急の物理化学的特性を示す天然に存在する分子群である。脂質の不飽和、すなわち、Ｃ＝Ｃ結合の数および位置は、脂質の形状を決定する重要なパラメータの１つとして、膜透過性、膜貫通構造および酵素作用との関連において細胞膜の湾曲に影響することによって組織の生物学的機能および病状と密接に関係する。例えば、膜内の秩序化は、Ｃ＝Ｃ結合がアシル鎖の中央に位置するとき、最も弱いと見出されたので、膜の流動性を高める。さらに、脂質のメチル末端から３番目に位置するシグニチャＣ＝Ｃ結合とともに１８〜２２個の炭素を含むオメガ−３脂肪酸が、脳の発達において重要であること、ならびに冠状動脈心疾患の一次および二次予防の試験（ｔｒａｉｌｓ）の両方において心保護機能を発揮することが見出された。しかしながら、Ｃ＝Ｃの位置の特定は、なおも大きな難題であり、分子構造をプロファイルするためおよび脂質の異性体を考えられる多くのものと識別するための信頼できる分析プラットフォームが必要とされている。
対照的に、質量分析（ＭＳ）は、詳細な分子情報を提供できるので、その高感度、選択性および広い質量範囲に起因して、個々の脂質の同一性の判断および量の測定において広く使用されている。ＭＳ分析の前に高エネルギーの衝突誘起解離（ＣＩＤ）による脂質の直接的なフラグメンテーションまたは化学誘導体化を用いてＣ＝Ｃ結合を測定するための、ＭＳに基づく一連の方法が開発された。通常、脂質は、ＭＳ分析の前にいくつかの工程において抽出、分離および精製される必要があり、それには、最大１日にわたる研究室での集中的な作業が必要であり得る。このタイプの多工程の手順は、大きなバッチのサンプルの分析ではうまくいく。一方、一工程ベースのストラテジーとしてのアンビエントイオン化質量分析は、標的の分析種を分析する際に望ましい成績を示した。
アンビエントイオン化質量分析では、分析種は、最小のサンプル調製で、その本来の状態のサンプルから直接イオン化され、ＭＳ分析のための気相に送られる。多くのアンビエントイオン化法（例えば、脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＤＥＳＩ）、マトリックス支援二次イオン質量分析、プローブエレクトロスプレーイオン化（ＰＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離エレクトロスプレーイオン化（ＭＡＬＤＥＳＩ）、簡単なアンビエントソニックスプレーイオン化（ｅａｓｙ ａｍｂｉｅｎｔ ｓｏｎｉｃ−ｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＥＡＳＩ）、大気圧赤外マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＡＰ ＩＲ−ＭＡＬＤＩ）、ペーパースプレー、ならびに針生検およびスプレーイオン化）が開発され、直接脂質分析、ならびに組織上の分布の２次元（２Ｄ）イメージングに応用された。二重結合の位置の決定におけるアンビエントイオン化質量分析の適用は、低温プラズマイオン化質量分析（ＬＴＰ−ＭＳ）によって細菌サンプル由来の微生物の脂肪酸エチルエステル混合物において最初に達成された。しかしながら、組織サンプル中の二重結合の直接的な位置特定にほとんど前進しなかった。加えて、脂質濃度の分布が、多くの強力なイメージングプラットフォームによって高分解能で首尾よくプロファイルされたが、異性体脂質の比率と組織の領域との関係性は明らかにならないままであった。
この実施例では、組織サンプル由来の不飽和脂質の異性体構造を、アンビエント質量分析によって、体系的な構造プロファイルを用いて初めて直接決定し、これは、抽出スプレーおよびオンラインのパターノ・ビューチ（Ｐ−Ｂ）反応によって実行された。また、脂質の異性体比の空間分布を初めてラット脳および腎臓においてイメージングした。
サンプルの回収：ラットをＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）から入手して収容し、呼吸停止時に断頭した。すべての手術を、Ｐｕｒｄｕｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ＣｏｍｍｉｔｔｅｅガイドラインおよびＡＲＲＩＶＥガイドラインに従って行った。脳、腎臓および肝臓を含む組織を身体から取り出し、直ちに−８０℃で凍結した。分析の前に、組織を−２０℃の冷凍庫内、次いで４℃でそれぞれ１時間、徐々に解凍した。次いで、組織をスライドガラス上に移し、実験で使用するためにアイスボックス内で保管した。
脂質のサンプリング、抽出およびイオン化：図２９Ａに示されているように、組織の直接分析のために抽出スプレーを実行した。組織生検と類似の手順を用いて、ステンレス鋼ワイヤ（外径２００ｍ）を組織に約２ｍｍの深さまで挿入し、次いで、ナノＥＳＩ用のプルドチップ（ｐｕｌｌｅｄ ｔｉｐ）を用いてガラスキャピラリー（外径１．５ｍｍおよび内径０．８６ｍｍ）内の２０μＬの溶媒に浸漬した。溶媒を、リン脂質にはアセトン：アセトニトリル：水（ｖ：ｖ：ｖ＝７０：２０：１０）として、脂肪酸にはアセトン：水（ｖ：ｖ：ｖ＝７０：３０）として調製した。次いで、サンプリングされた脂質をその溶媒に移し、そのワイヤに１．８ｋＶ ＤＣを印加して、ナノＥＳＩを行った。
質量分析法：すべての質量スペクトルを、ＱＴｒａｐ４０００三連四重極／リニアイオントラップハイブリッド質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｓｃｉｅｘ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）によって記録した。通常、その４０００ ＱＴＲＡＰ ＭＳの機器の構成は、以下のとおりであった：カーテンガス、８ｐｓｉ；デクラスタリング電位、±２０Ｖ；インターフェースヒーター温度、４０℃；および走査速度、１０００Ｄａ／ｓ、リニアイオントラップとしてＱ３を使用。
タンデム質量分析によって不飽和脂肪酸上のＣ＝Ｃ結合の位置を特定するために、パターノ・ビューチ（Ｐ−Ｂ）反応生成物の脂質をＱ１四重極アレイによって単離し、次いで、オン共鳴活性化（ｏｎ−ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）（イオントラップＣＩＤ）のためにＱ３リニアイオントラップに送った。励起エネルギー（ＡＦ２）を、各脂肪酸に応じて３０〜７０Ｖの範囲で設定した。不飽和リン脂質の場合、脂質またはそれらのＰ−Ｂ反応生成物をＱ１四重極アレイによって単離し、次いで、ビーム型衝突誘起解離（ＣＩＤ）のためにＱ２四重極アレイに向かって加速させた。衝突エネルギー（ＣＥ）は、種々の分子種において２５〜５０Ｖで様々であった。リン脂質のＣ＝Ｃの位置の決定は、プロダクトイオンのフラグメントの１つがビーム型（ｂｒｅａｍ−ｔｙｐｅ）ＣＩＤによって形成され、Ｑ２において単離され；次いで、３０〜７０ＶのＡＦ２を印加することによってさらなるフラグメンテーションがＱ３リニアイオントラップにおいて行われるＭＳ３ＣＩＤにおけるスペクトルに従った。
脂質の同定：報告された文献とタンデムＭＳスペクトルパターンを比較することによって、脂質の同定を行った。
パターノ・ビューチ（Ｐ−Ｂ）反応：低圧水銀ランプ（ＢＨＫ Ｉｎｃ．，Ｏｎｔａｒｉｏ，ＣＡ）を用いて、２５４ｎｍのＵＶ照射を適用することにより、不飽和脂質とアセトンとの間のパターノ・ビューチ反応を促進した。その低圧水銀ランプは、０．５〜１．０ｃｍの距離でナノＥＳＩチップに対して直交的に配置された。脂質および反応生成物をＱＴｒａｐ４０００によって分析した。
結果
デザインおよび手順を図２９Ａに示した。大きな塊の組織にステンレス鋼ワイヤを刺し、次いで、抽出および反応のための溶媒が予め充填されたナノＥＳＩキャピラリーに浸漬することによって、脂質を直接抽出した。そのワイヤに高電圧を印加して、ナノＥＳＩを行った。２５４ｎｍのＵＶ光の低圧水銀ランプを用いて、元のＣ＝Ｃ結合の位置にオキセタン環が付加された反応生成物イオン（＋５８Ｄａ）を形成させるためのＰ−Ｂ反応を促進し、その後、その反応生成物イオンをＣＩＤによって開裂させて、特徴的なフラグメントイオンを生成した（図２９Ｂ）。
組織からの脂質の抽出プロセスは、ラットの脳、腎臓および肝臓組織における実証として、抽出スプレーによって非常に効率的であることが示された。脂肪酸およびリン脂質は、ＥＳＩチップに高電圧を印加したとき、ｍ／ｚ２００〜９００の質量範囲にすぐに現れ、２０秒以内に強度平衡に達した。従来の脂質抽出物のスペクトルと同様のＭＳピークパターンについても、脂質抽出の良好な信頼性が立証された。一方、ＭＳピークパターンは、多様な組織タイプで異なる（図３０Ａ〜Ｉ）。各リン脂質または各リゾリン脂質の頭部基およびアシル鎖は、タンデム質量分析によって容易に特定され得る（図３１Ａ〜Ｅ）。有機溶媒の選択は、極めて重要である。有機溶媒は、脂質に対する良好な溶解度を有する必要があり、エレクトロスプレーに適する必要があり、脂質の高い反応効率を保証する必要がある。溶媒のいくつかの配合を試験した（図３２Ａ〜Ｅ）。７０％アセトン：３０％Ｈ２Ｏ（ｖ：ｖ）ならびに７０％アセトン：２０％ＡＣＮ：１０％Ｈ２Ｏ（ｖ：ｖ：ｖ）の溶媒が、それぞれ脂肪酸およびリン脂質の分析にとって最適な成績を提供すると見出された。
脂質の各アシル鎖における個々の二重結合の位置を特定するために、Ｐ−Ｂ反応を行った。図３１Ａ〜Ｂに示されているように、ＵＶ光の照射後、不飽和脂肪酸またはリン脂質の強度は、有意に低下したが、多くの新しいピークがＰ−Ｂ反応のプロダクトイオンとして出現した。イオントラップ質量分析法におけるＣＩＤによる逆Ｐ−Ｂ反応から誘導されたフィンガープリントフラグメントに従って二重結合の位置が示唆された。Ｐ−Ｂ反応における脂肪酸（ＦＡ）１８：１のプロダクトイオンとしてのｍ／ｚ３３９．３のＭＳ２ＣＩＤ質量スペクトルを、図３１Ｃに示した。Ｐ−Ｂ反応の前および後のＭＳ２スペクトルの比較において、ｍ／ｚ１７１．０および１９７．１ならびにｍ／ｚ１９９．０および２２５．１の２対の新しく生成されたフラグメントに基づいて、二重結合が、それぞれ脂質のメチル末端から９番目（ｎ−９）または７番目（ｎ−７）の炭素に存在すると指摘された。切断された不飽和アシル鎖に対するＰ−Ｂ反応のプロダクトイオンのＭＳ３ＣＩＤスペクトルに基づいて、ホスファチジルセリン（ＰＳ）１８：０−１８：１のアシル鎖１８：１においても同じ結果が得られた（図３１Ｅ）。メタノール（ＭｅＯＨ）またはアセトニトリル（ＡＣＮ）の添加は、リン脂質の抽出を助けたが、Ｐ−Ｂ反応生成物の収率は、ＭｅＯＨまたはＡＣＮがＵＶを吸収して２５４ｎｍと類似の波長においてラジカルを形成することに起因して様々な程度で減衰した（図３３Ａ〜Ｃ）。興味深いことに、光強度および波長の最適条件をより速く達成させるためにランプを予熱することによって、Ｐ−Ｂ反応生成物の半増加時間（ｈａｌｆ ｇｒｏｗｔｈ ｔｉｍｅ）は、１．５分から０．５分に加速した（図３４Ａ〜Ｂ）。
反応抽出スプレーは、広範なダイナミックレンジの濃度の不飽和脂質の分析において良好な成績を示した。表７〜８に示されるように、ラット脳における３桁にわたる濃度の３１個の不飽和脂質が、異性体比について良好な再現性で分析された（ＲＳＤ＜１０％、１つの組織の同じ領域においてサンプリング、Ｎ＝３）。
さらに、微量レベルの不飽和脂質も、良好な信号雑音比で分析できる。ＦＡ２１：１の場合の全脂肪酸の０．１４％およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）３４：２の場合の全脂質の０．００１３％のように、最も低い存在比の脂質が、ラット脳の直接分析において分析された（図３５Ａ〜Ｄ）。図３５Ｃ〜Ｄは、Ｐ−Ｂ反応後に二重結合を決定するためのＦＡ２１：１およびＰＧ３４：２の典型的なＣＩＤスペクトルを示した。フィンガープリントピークに従って、ＦＡ２１：１の可能性のある４つの位置（ｎ−８、ｎ−９、ｎ−１０およびｎ−１２）および可能性のある２つの位置（ｎ−７およびｎ−９）が見出された。
高感度に加えて、小さなサンプリング面積（０．０４ｃｍ２）および少ないサンプル消費（約１０μｇ）という注目すべき利点の恩恵を受けて、不飽和脂質の異性体比が初めてラットの脳および腎臓に対してマッピングされた。２Ｄイメージングを行うために、インタクトなラット脳または切開された腎臓を、５００μｍの分解能の方眼紙上に置いた。次いで、サンプリングプローブを、正確な座標位置を用いてその組織に約２ｍｍの深さまで挿入した。代表的な異性体比を得るために、各領域の１〜３ヶ所から１ヶ所につき３つずつサンプリングした。ホスファチジン酸（ＰＡ）１８：１−１８：１、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）１８：１およびＦＡ１８：１を、それらの周知のメッセンジャー機能、およびグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼまたはリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐａｔｉｃ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が連係して働く分子合成における密接な関係に起因して、標的分子として選択した。ラット脳イメージングのために、選択された１４の解剖学的領域（脊髄、脳幹、小脳、傍片葉（左および右）、下丘（左および右）、松果体、頭頂皮質（左および右）、運動皮質（ｍｏｏｒ ｃｏｒｔｅｘ）（左および右）および嗅覚神経（左および右）を含む）における上記３つの脂質を対称的に特定し、定量的にマッピングした（図３６および３７Ａ〜Ｄ）。ＰＡ１８：１−１８：１のより網羅的なマップを、ラット脳の２６の領域における異性体比を用いて図３８Ｃに提供した。少ないサンプル消費のおかげで、５０回サンプリングされた後も、脳は良好な状態で維持された（図３８Ｄ）。
興味深いことに、ＬＰＡ１８：１およびＰＡ１８：１−１８：１の異性体比の有意差が、ラット脳の種々の領域において観察されたが、ＦＡ１８：１の異性体比は、調査中のラット脳と腎臓の両方において比較的安定していた。同様の条件であるが異なるバッチ由来の５つの脳の選択された６つの解剖領域の間で比較したとき、ＲＳＤがすべて２１％未満であったので、ＰＡ１８：１−１８：１の異性体比の分布の良好な一貫性が実証された。さらに、３１種の脂質の特有の異性体比も、同じラット脳の右前頭前皮質と脳幹との間で様々な程度で異なると観察された（図３９Ａ〜Ｄおよび表７〜８）。この結果は、ＰＡ１８：１−１８：１およびＬＰＡ１８：１を合成するための異性体ＦＡ１８：１の選択が、ランダムなプロセスでなく、組織の領域と密接に関係することを示唆し得る。経路は明らかでないが、本プラットフォームは、それを明らかにする大きな可能性をもたらし、組織の機能に対する脂質の不飽和の影響を理解するための裏付けとなるプラットフォームも提供する。さらに、３つの新鮮なラット脳と、−２０℃で１４日間凍結された別の３つのラット脳との間のＰＡ１８：１−１８：１の異性体比を比較することによって、脂質の不飽和に対するサンプル貯蔵の影響も調査した（図４０）。下丘（左および右）、運動皮質（左および右）、小脳および脳幹を含むラット脳の６つの領域を選択した。サンプルを−２０℃で短時間凍結したとき、ＰＡ１８：１−１８：１の安定かつ一貫した不飽和が実証された。
結論として、抽出スプレーとＰ−Ｂ反応との組み合わせによって、組織内の不飽和脂質をより網羅的に特徴付けるために、不飽和ＦＡ鎖の中の二重結合の位置を直接特定することが可能になった。研究室において複雑な設定が定期的に必要な多工程でのサンプル前処理が、たった１工程のナノスプレーチップに単純化され得る。広範なダイナミックレンジの濃度の複数のタイプの不飽和脂質が、ＲＳＤ＜１０％という良好な異性体比の再現性でプロファイルされ得る。より重要なことには、小さなサンプリング面積および少ないサンプル消費という注目すべき利点の恩恵を受けて、不飽和脂質の異性体比が初めて２次元でプロファイルされた。反応抽出スプレーは、組織の生物学的機能および病状に対する不飽和脂質の影響を研究するための強力なイメージングプラットフォームを提供する。
実施例１３：小型質量分析計を用いた直接組織分析および不飽和脂質の特徴付け
ヒト疾患に対するバイオマーカー発見のための有望な分野としてリピドミクスが登場した。分子情報が提供され得る直接組織分析は、臨床診断において利用可能であり得る。生物組織由来の脂肪酸および脂質をプロファイリングするために、この実施例では、ポイントオブケア適用のために設計された卓上用のＭｉｎｉ１２を、直接サンプリングイオン化とともに使用した。脂質の不飽和異性体の相対存在比を定量するために、パターノ・ビューチ（ＰＢ）反応を用いた光化学誘導体化も実行した。
Ｐ−Ｂ反応は、カルボニルおよびアルケンから４員のオキセタン環を形成する光化学反応である。それは、多くの天然有機物に対して広く使用されている（図４１）。図４２は、この実施例において組織分析のために使用された設定を示している。直接的なラット組織分析は、抽出スプレー法を用いた。ナノＥＳＩスプレー溶媒は、１００％メタノールである。＊Ｐ−Ｂ反応スプレー溶媒としてＨ２Ｏ：アセトン＝１：１。
図４５は、標準的な化合物を使用したときのオンラインＰ−Ｂ反応を示している。図４６は、ラット脳サンプルを使用したときのオンラインＰ−Ｂ反応を示している。脂質プロファイリングの結果を図４３Ａ〜Ｅに示す。図４３Ａ、４３Ｃおよび４３Ｅは、３つのラット器官サンプルにおける脂肪酸の脂質プロファイルを示している。図４３Ｂ、図４３Ｄおよび図４３Ｅは、リン脂質に対する脂質プロファイルを示している。それらの両方が、ナノＥＳＩ（−）モードを使用した。図４４は、ホスホコリンのＣＩＤを示している。そのデータは、脂質プロファイリングが、疾患に対する潜在的なバイオマーカーの特定を支援できることを示している。この抽出スプレー法は、サンプル調製および減圧環境を用いない脂質プロファイリングを発見し得る。
ヒトの身体において、全脂質の４０％が不飽和である。ミニＭＳシステムと組み合されたＰ−Ｂ反応は、ラット脳組織の脂肪酸におけるＣ＝Ｃ二重結合の位置を高い信頼性で効率的に決定できる。
実施例１４：定性的および定量的な脂質分析のために、Ｃ＝Ｃの位置の特異性を用いた質量分析法
この実施例は、脂質における炭素−炭素二重結合（Ｃ＝Ｃ）の位置を決定するための方法の開発ならびに定性的および定量的リピドミクスに対するその使用を示す。
脂質は、構造的に多様かつ複雑な化合物群であり、８つの主要なクラスおよび多くのサブクラスにカテゴリー化され得る（用語はＬＩＰＩＤ ＭＡＰＳに従う）。脂質の構造多様性および細胞、組織または生物における大きなダイナミックレンジに起因して、生物学的サンプルからの完全な脂質組成の分析（リピドーム）は、伝統的に困難であった。ＭＳの進歩、特に、ソフトイオン化法（分離との連係）およびタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の開発によって、ＭＳベースの脂質分析がリピドミクス研究のための主要なツールになった。注目に値する多くの分析性能指数の中でも、分子構造の高い特異性が、脂質分析のためのＭＳベースのアプローチの独特の特徴である。例えば、脂質クラス、結合タイプ、脂肪酸アシル／アルキル組成、およびさらに時には脂肪酸アシル／アルキル鎖の位置を含む、脂質のいくつかのレベルの構造情報が、ＭＳ／ＭＳから容易に獲得できる。しかしながら、Ｃ＝Ｃ結合の位置およびそれらの配置（ｃｉｓ対ｔｒａｎｓ）の情報は、ほとんどのＭＳプラットフォームにおけるＭＳ／ＭＳではめったに得られないので、脂質分析に関する科学報告書の大部分において報告も仮定もされない。不飽和脂質は、生物系の全脂質のかなりの割合を占め、それらの物理的特性、化学反応性および生体内変換は、種々の生理学的機能および生理化学的機能と密接に関係する。脂質のＣ＝Ｃ結合の位置の異性体が存在し、それが様々な生合成経路を介して生成されるとき、Ｃ＝Ｃの位置を決定することができないかまたは不飽和脂質異性体を識別および定量することができないと、Ｃ＝Ｃの位置の違いに関連する生化学的および生物学的結果に関する理解が著しく妨害される。
この実施例は、Ｃ＝Ｃの位置の特異性、ならびに生物学的サンプル中の広範囲の脂質種に対して不飽和脂質の異性体を定量する能力を提供するＭＳプラットフォームの開発を例証する。この手法の技術革新は、光化学（パターノ・ビューチ、ＰＢ）反応（脂質のＣ＝Ｃに対して高度に特異的な反応性を有する）とＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ（ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化）とのオンライン連結にある。ＰＢ反応生成物が、ＭＳ／ＭＳに供されると、Ｃ＝Ｃの位置特異的なフラグメントイオンが生成され、それは構造の同定と定量の両方に使用できる。脂質分析のための頑健かつ広く応用可能なプラットフォームを開発するために、オンラインＰＢ−ＥＳＩのための強い光反応器のデザイン、脂質の構造分析のための網羅的なＭＳ／ＭＳ手順の開発、自動化された同定および定量のためのデータ分析ツール、ならびに小動物由来の種々の組織タイプに対する不飽和脂質の網羅的なデータベースを含む一連の問題が対処される。この実施例は、パターノ・ビューチ（ＰＢ）反応とＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳとのオンライン連結のための反応／イオン化源の開発および最適化；種々の脂質クラスに対する不飽和脂質の構造決定および定量のためのＭＳ／ＭＳ法の開発；ショットガンおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳリピドミクス分析のためのＰＢ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳワークフローの開発；ならびに種々のラット器官の組織サンプルを用いたリピドミクス分析のための分析プラットフォームの検証を示す。
本明細書中の研究の成果は、定性的および定量的なショットガンならびにＬＣベースのリピドミクス分析のための頑健かつ広く応用可能なプラットフォームの確立である。本明細書中で収集されたデータは、種々の器官のラット組織における不飽和脂質アイソフォームのＣ＝Ｃの位置、組成および量に関する情報を含む不飽和脂質の初めてのデータベースに寄与する。この新しい脂質分析の能力は、脂質分子生物学、機能的リピドミクス、メタボロミクスおよびバイオマーカー発見を含むがこれらに限定されない生物科学の多くの分野における研究を前進させる。
背景
生体分子の重要な１クラスとしての脂質は、エネルギー貯蔵および細胞膜の構造成分に関するこれまで認識されていた役割ならびに制御性のシグナル伝達分子および細胞−細胞シグナル伝達分子として後に確立される役割などの多様な機能を果たす。脂質のこれらの多様な機能は、それらの多様な構造に起因する。約４０，０００（２０１５年４月２日現在）のユニークな脂質構造が、ＬＩＰＩＤ ＭＡＰＳデータベースによって記述されており、それらは、細胞（すなわち膜）内で、および細胞小器官間で、一様に分布していない。脂質研究の大きな難題の１つは、細胞がどのようにして脂質ホメオスタシスを維持および制御しているかを理解することである。生物学および生物分析ツールが進歩するにつれて、完全な細胞の脂質組成の特徴付け（リピドーム）ならびに脂質−脂質および脂質−タンパク質の相互作用は、いまやシステムレベルでアプローチ可能である。細胞の脂質に対する質量分析ベースの分析は、包括的な脂質の同定および定量を提供するためのリピドミクスにおける主要なツールとして確立されている。このようにして得られた脂質プロファイルは、疾患に結びつく全脂質組成の変化を研究するためにますます使用される。リピドミクスはまだ、比較的初期の段階にあり、高感度、高特異性およびハイスループットの脂質分析ツールの開発が、脂質の多様性および脂質ホメオスタシスの機能的意義に関する研究を大きく押し進め得る。
ＭＳベースのリピドミクスアプローチ：ＭＳの高い感度および分子特異性ならびに液体クロマトグラフィー（ＬＣ）などの分離法との連結によって、ＭＳは脂質分析において最も高い頻度で使用される（８０％）手法になった。２つのＭＳアプローチ：ショットガンおよびＬＣ−ＭＳが、包括的脂質分析のためにほぼ等しく使用されている。ショットガンアプローチの場合、通常、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）をイオン化源として用いて、脂質抽出物を質量分析計に直接注入する。あるいは、脂質抽出物は、ＭＳ分析の前にＬＣによって分離され得る。これらの２つのアプローチのうちの選択は、分析の目的に依存する。ショットガンアプローチは、速度が速いので、正常／罹患サンプル由来の包括的脂質プロファイルの比較による疾患診断法にとって魅力的である。精密な脂質定量または非常に複雑なサンプルからの低存在比の脂質種の同定の場合は、連結型のアプローチが、高い忠実度の構造同定と精密定量の両方を可能にする。ＥＳＩと同様に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）も、脂質イオン化に使用できるもう１つの効率的な方法である。近年、ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、そのイメージング能力に起因して、ますます研究上の関心を集めている。
ＭＳ／ＭＳによる脂質の同定および定量：高分解能質量分析計による単純な質量測定は、元素組成を提供するが、しかしながら、多くの分子の同重体種および異性体種が共存する可能性があることに起因して、詳細な構造情報を提供することはできないだろう。タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）は、脂質の同定および定量において用いられる鍵となる手法である。ＭＳ／ＭＳ実験は、少なくとも３つの鍵となるエレメントを含む：プリカーサーイオンの生成および単離、そのプリカーサーイオンを解離する気相反応、ならびにプロダクトイオンの質量分析。過去３０年の度重なる努力から、広範囲の脂質クラスに対する網羅的な（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｖｅ）ＭＳ／ＭＳ法が開発された。これらのＭＳ／ＭＳ法の大部分は、低エネルギー衝突誘起解離（ＣＩＤ）を備えたＭＳ機器において確立された。タンデムインスペース（Ｔａｎｄｅｍ−ｉｎ−ｓｐａｃｅ）機器、例えば、三連四重極ＭＳまたはハイブリッド（ｈｉｇｈｂｒｅｄ）ＭＳが、連結されたＭＳ／ＭＳ実験（ニュートラルロススキャン、プリカーサーイオンスキャン、プロダクトイオンスキャン）を行うことができ、それらは、複雑な混合物から脂質を迅速に分類すること、ならびに高感度で検出（反応モニタリング）および定量することを可能にする。タンデムインタイム（Ｔａｎｄｅｍ−ｉｎ−ｔｉｍｅ）質量分析計、例えば、四重極（ｑｕａｄｒｕｐｌｅ）イオントラップＭＳは、より高い段階のＭＳ／ＭＳ実験（すなわち、ＭＳ３またはＭＳ４）および異なるタイプの活性化を可能にして、詳細な構造の特徴付けを達成する。
構造特異的分析における難題：脂質は、８つのクラスおよび多くのサブクラスに分けることができる構造的に多様な分子である。哺乳動物細胞において検出される主な脂質クラスとしては、脂肪酸（ＦＡ）、グリセロ脂質（ＧＬ）、グリセロールリン脂質（ＧＰ）、スフィンゴ脂質（ｓｐｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）（ＳＰ）およびステロール脂質（ＳＴ）が挙げられる。ＧＰはさらに、グリセロールホスホコリン（ＰＣ）、グリセロホスホエタノールアミン（ＰＥ）、グリセロホスホセリン（ＰＳ）、グリセロホスホグリセロール（ＰＧ）、グリセロホスホイノシトール（ＰＩ）およびグリセリンリン酸（ＰＡ）に分けることができる。ＬＩＰＩＤ ＭＡＰＳによると、構造の特徴付けには５つの異なるレベルがあり、最も低いレベルから最も高いレベルまで以下のように列挙される：レベル１．脂質クラス／種の特定；レベル２．結合タイプ／ヒドロキシル基の特定；レベル３．脂肪酸アシル／アルキル；レベル４．脂肪酸アシル／アルキルの位置；およびレベル５．立体化学および炭素−炭素二重結合（Ｃ＝Ｃ）の位置／幾何学を含む確定した化学構造。現在、脂質構造分析は、脂質中の脂肪酸アシルまたはアルキル（ａｋｙｌ）の組成を特徴付けるレベル３で日常的に達成され得る。慎重なデータ解釈を用いれば、アシル／アルキル鎖の位置に関するレベル４の情報を引き出すことができる。例えば、７５９．６ｇ／ｍｏｌの分子量を有するホスファチジルコリン（ＰＣ）は、正イオンモードでのＭＳ／ＭＳ ＣＩＤによる特徴的なｍ／ｚ１８４（ホスホコリン）フラグメントイオンの観察結果、ならびにＰＣ酢酸アニオン付加体（［ＰＣ＋ＣＨ３ＣＯＯ］−）：ｍ／ｚ２５７（１６：０、１６個の炭素原子を有する飽和アシル鎖）およびｍ／ｚ２８１（１８：１、１８個の炭素および１つのＣ＝Ｃ）のＭＳ／ＭＳ ＣＩＤからの脂肪酸アシルアニオンの検出から、ＰＣ１６：０／１８：１と特定され得る。さらに、ｓｎ−２は通常、ｓｎ−１アシルアニオンよりも高い強度で生成されるという経験則に従って、１６：０および１８：１アシル鎖は、それぞれｓｎ−１位およびｓｎ−２位に割り当てることができる。しかしながら、Ｃ＝Ｃの位置および配置などのレベル５の特定は、たいていの市販のＭＳプラットフォームに備わる低エネルギーＣＩＤでは得にくい。この難しさは基本的に、Ｃ−ＣまたはＣ＝Ｃ結合を切断するためには著しく高い活性化エネルギーが必要である点に原因があり、Ｃ＝Ｃの周りにはフラグメントイオンが生成されず、Ｃ＝Ｃの位置を決定するための手掛かりが得られない。
Ｃ＝Ｃを決定するための既存の方法：この問題に対処するために、Ｃ＝Ｃを決定するためのＭＳベースの方法を発展させる際に、２つの異なるアプローチが取られた。１つのアプローチは、ＭＳ分析の前のＣ＝Ｃ選択的反応（例えば、オゾン分解、アルキルチオ化、メトキシ水銀化、エポキシ化など）を含む。これらの反応は、Ｃ＝Ｃ官能基を、ＭＳまたは低エネルギーＣＩＤによってより容易に分析され得る他の基に変換する。これらのうち、オフラインまたはオンラインオゾン分解が、ＨＰＬＣ、ＥＳＩと連結できる点およびより広範なクラスの脂質に適用可能である点に起因して、最も大きな影響を及ぼす。しかしながら、複雑な脂質混合物が分析されたとき、種々の脂質種が同じオゾン分解産物をもたらし得るので、Ｃ＝Ｃの位置について決定的でない結果に達することが多い。ＭＳ前のＣ＝Ｃ誘導体化に代わるものとして、高エネルギーＣＩＤ（約ｋｅＶ）を用いるインタクトな脂質のチャージリモートフラグメンテーション、ジリチウム化されたリピド付加イオンの多段階ＭＳ／ＭＳ ＣＩＤ、およびオゾン誘起解離（ＯｚＩＤ）をはじめとしたいくつかのタンデム−ＭＳベースの方法が、Ｃ＝Ｃの決定のために開発された。これらの方法は、特殊なＭＳ機器を使用する必要性またはイオン化条件に起因して、リピドミクス研究に広く適用されていない。
ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳと連結されるオンラインパターノ・ビューチ（ＰＢ）反応
Ｃ＝Ｃのユニークな化学的特性は、ラジカル攻撃を受けやすい点であり、それは、ラジカルが関わるＭＳ分析による研究を促す。本明細書中の実施例は、ＥＳＩとＭＳとのインターフェース領域において脂質のＣ＝Ｃを標的にするラジカル反応の開発に焦点を当てる。このアプローチには、ＥＳＩベースのリピドミクスにとって２つの魅力的な特徴がある。第１に、ラジカル反応は、速く（制限された拡散速度）、直接ＥＳＩ注入法と容易に連結できるか、または分離の後かつＥＳＩ−ＭＳの前にオンラインで行うことができる。第２に、反応が質量分析計の外で起きるので、その反応は、ＥＳＩインターフェースからなる任意のタイプのＭＳに適用できる。しかしながら、有機化学からＣ＝Ｃに対して報告された多くのラジカル反応の中でも、脂質分析に対する優れた反応候補は、以下の因子を満たすべきである：１．Ｃ＝Ｃに対する高い特異性、２．妥当な反応収率；３．インタクトな脂質と、さらなる構造分析のために反応によって改変された脂質との間に検出可能な関連があるようなＣ＝Ｃの直接的な開裂がないこと；脂質のＭＳ分析に対する妨害（例えば、イオン化効率、荷電特性）が最小の反応体。
古典的な［２＋２］光化学反応であるパターノ・ビューチ（Ｐ−Ｂ）反応が、オンラインＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳと連結でき、複雑な脂質抽出物からＣ＝Ｃの位置を高速かつ高感度で決定することが本明細書中で示される。反応機構は、アルデヒドまたはケトン内のカルボニル基からその励起状態へのＵＶ励起を含み、その後、その励起状態は、Ｃ＝Ｃに付加して、ジラジカルを形成する。そのジラジカルの閉環によって、４員のオキセタン環が形成される。カルボニルとＣ＝Ｃ結合との相対位置に応じて、図４７Ａに示されているように２つのオキセタン（ｏｘｔａｎｅ）位置異性体（構造１および２）が形成される。ＰＢ反応生成物は、安定であり、質量単離され得、ＣＩＤに供され得る。予備的研究において、脂質分析種を１：１水／アセトンに溶解する（ここで、アセトンは、ＰＢ反応試薬として機能する）。この反応は、単純にナノＥＳＩ源の領域において実行され、２５４ｎｍを中心とするＵＶランプの発光波長によって照射された（構成が図４７Ａの挿入図に示されている）。図４７Ｃは、ネガティブモードナノＥＳＩにおいてオンラインで分析されたオレイン酸であるＦＡ１８：１（９Ｚ）（１０μＭ）のＰＢ反応を示している。ＵＶ照射を行ったときにだけ、インタクトなＦＡアニオン（ｍ／ｚ２８１）と比べて５８Ｄａ（アセトンの質量）の質量が増加した大量のＰＢ反応生成物（ｍ／ｚ３３９）が観察された（ＵＶをオフにしたときの図４７Ｂと比較のこと）。ＰＢ反応生成物（ｍ／ｚ３３９．３）のＭＳ２ＣＩＤによって、逆ＰＢ反応を促した（図４７Ａ）。中性アセトン（５８Ｄａ）を失うことによって、ｍ／ｚ２８１のプロダクトイオンが逆ＰＢ経路から生じた。ｍ／ｚ１７１のプロダクトイオン（３の構造を有する）およびｍ／ｚ１９７のプロダクトイオン（４の構造を有する）が、それぞれＰ−Ｂ反応生成物１および２の中の元のＣ＝ＯおよびＣ＝Ｃ部位で破壊するオキセタン環の逆ＰＢ経路から生じた。３および４の構造を有するフラグメントイオンは、元のＣ＝Ｃ部位に「Ｃ３Ｈ６」に対して「Ｏ」を付加する差に起因して、常に２６Ｄａだけ質量が分離した。したがって、これらのイオンは、Ｃ＝Ｃ診断用イオンと呼ばれる。それらの相補的なフラグメントは、それらが中性としての存在することに起因して検出されない。
このＰＢ−ＭＳ／ＭＳストラテジーは、ＧＰなどの他のクラスの脂質、ならびに異なるアシル鎖における個々のＣ＝Ｃの位置を正確に指摘することにも適用され得る。図４８Ａは、ＰＳ１６：１（９Ｚ）／１８：１（９Ｚ）（ｍ／ｚ７５８．６の脱プロトン化イオン、図４７Ｄに示される構造）からのＣ＝Ｃの決定の例を示している。ｍ／ｚ８１６．５のＰＢ反応生成物のＭＳ２ＣＩＤによって、ＰＳに特異的な８７Ｄａのニュートラルロス（ＮＬ）ならびに２つの遊離アシル鎖に対応するイオンであるｍ／ｚ２５３．２および２８１．２のＲ１ＣＯＯ−およびＲ２ＣＯＯ−がもたらされた。ＰＢ反応によって改変された２つのアシル鎖も、それぞれｍ／ｚ３１１．２および３３９．３に観察された。これらのＰＢ反応のプロダクトイオンのＭＳ３ＣＩＤデータを図４８Ｃおよび４８Ｄに示す。Ｃ＝Ｃ診断用イオン３の一般化学式ＣｎＨ（２ｎ−３）Ｏ３ −に基づいて、二重結合が、各アシル鎖に対してＣ９とＣ１０との間に位置すると高い信頼性で決定できる。アシル鎖の組成情報をまとめると、一方のアシル鎖が、Ｃ９とＣ１０との間に二重結合を有するＣ１６であり、他方が、Ｃ９とＣ１０との間に二重結合を含むＣ１８鎖であると明白に結論付けられる。上記の手順は、不飽和脂質の構造の特徴付けの基礎となる。
ＦＡおよびＧＰのモデルに関する研究からは、異なるクラスの脂質または特定のＣ＝Ｃの位置もしくは配置に対するアセトンベースのＰＢ反応に対する反応性または選択性の明らかな違いは観察されなかった。この特徴は、それが、不飽和脂質分析のためのより一般的な方法として機能する可能性を有することを示唆する。他の魅力的な特徴としては、「ショットガン」リピドミクスと適合性であること、反応のための実験装置が単純かつ低コストであること（ＵＶランプ装置のコストは２００ドル未満）、質量分析計を改変する必要がないこと、質量スペクトルが解釈しやすいこと、および安価な再誘導体化（ｒｅｐｒｉｖａｔｉｚｉｎｇ）試薬が挙げられる。これらの点は、ＰＢ反応を、ショットガンとＬＣ−ＭＳベースの両方のリピドミクスアプローチにとって頑健かつ広く応用可能なツールとしてのさらなる開発にとって理想的な候補にする。
Ｃ＝Ｃの位置特異的なリピドミクスツールがないことは、Ｃ＝Ｃ異性体を識別および定量することができないことにつながるので、全脂質のかなりの割合に寄与する不飽和脂質の研究に欠けた部分をもたらす。ゆえに、Ｃ＝Ｃの位置の違いに関連する生物学的意義が理解されておらず、病的条件において変化したリピドームを研究する際に正しく評価されない。本明細書中の方法は、Ｃ＝Ｃの位置特異性、ならびに生物学的サンプル中の広範囲の脂質種の不飽和脂質の異性体を定量する能力を提供するＭＳプラットフォームを提供する。本明細書中で論じられるように、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳと連結されるオンラインＰＢ反応が、これらのニーズを満たす。本明細書中で収集されたデータは、小動物の異なる組織における不飽和脂質アイソフォームのＣ＝Ｃの位置、組成および量の情報を含む不飽和脂質の初めてのデータベースにも寄与し得る。この新しい脂質分析の能力は、脂質分子生物学、機能的リピドミクス、メタボロミクスおよびバイオマーカー発見を含むがこれらに限定されない生物科学の多くの分野における研究を前進させる。
パターノ・ビューチ（ＰＢ）反応をＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳとオンライン連結するための反応／イオン化源の最適化
ＰＢ反応は、従来、有機合成においてバルク溶液中で行われてきた。このタイプの反応の比較的低い量子収率（０．０１〜０．１）を考慮して、有機合成では、高濃度の反応体（ｍＭ〜Ｍ）、長い反応時間（３〜２４時間のＵＶ照射）および無極性溶媒が使用される。これらの条件は、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いるときの典型的な脂質分析条件とも、ＰＢ反応とＭＳ／ＭＳとのオンライン連結の要件とも、直接適合しない。これらの問題に対処するために、オンライン光化学反応ならびにＭＳによるインサイチュでの反応のモニタリングおよび生成物の分析の実施を可能にする反応容器および方法を開発した。この研究によって、ＭＳによって良好なＰＢ反応収率および高感度の脂質検出を達成するために重要な因子を特徴付けることができた。
有機合成におけるフロー型光化学は、発展途上の分野であり、そのフロー型光化学では、従来のバッチ反応容器を、溶液を主に内径＜１ｍｍのキャピラリー（マイクロリアクター）に連続的に流すことに置き換える。連続的な溶液流をマイクロリアクターの寸法と組み合わせることにより、溶液のＵＶ曝露を正確に制御できるようになり、過度のまたは不均一なＵＶ曝露による望まれない副生成物を減少させることによって、生成物の収率が上昇する。連続フロー型光化学反応を行うための例がいくつかあり、例えば、分子間の光付加および「フットプリンティング」のためのタンパク質を用いたＯＨ反応である。これらの成功例に基づいて、ナノＥＳＩエミッターのソース領域およびＥＳＩのための分析種の送液ライン（別個の反応およびＥＳＩ）で行うＰＢ反応を開発した。
はじめに、さらなる溶媒ポンピングを行わないスタティックナノＥＳＩ源をＰＢ反応に使用した（図４７Ａ）。種々の脂質種のＰＢ反応が実行されたが、しかしながら、典型的には低〜中程度の反応収率（１０〜４０％）であった。例えば、ＰＣ１６：０／８：１（９Ｚ）（５μＭ）のＰＢ反応生成物は、ｍ／ｚ８１８．６に約１０％の反応収率で生成される（図４９Ａ）。さらに、図４９Ｂに示される抽出イオンクロノグラム（ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈｒｏｎｏｇｒａｍ）（ＸＩＣ）から示されるように、この反応が定常状態に達するためには、通常、３０秒から１分のリードタイムが必要である。この現象は、反応のかなりの部分が、およそミリ秒の反応時間（ソース領域での液滴の寿命）しか許容しないナノＥＳＩのプルーム領域以外のナノＥＳＩチップ内で起きることを明らかに示唆する。ナノＥＳＩスプレーエミッターは、チップ先端の薄壁領域（１００μｍ未満と推定される）において２５０ｎｍを部分的に透過するホウケイ酸ガラスからできている。スタティックナノＥＳＩの低流速（１０ｎＬ／分）を考慮すると、スプレーに起因する分子濃度の変化は、スプレーチップにおいて無視できる（約１μＬの体積）。ゆえに、ナノＥＳＩチップの内側での反応によって、Ｐ−Ｂ反応生成物が時間の関数として蓄積し、最終的に、最初の２〜３分で定常状態に達する。この仮説は、それよりかなり速い流速を用いたところ（約１〜５μＬ／分）、明らかなＰ−Ｂ反応生成物が観察されかった実験から正しいと立証される。
ＰＢ反応は、主としてナノＥＳＩチップにおいて起きるので、反応収率を改善するために、ナノＥＳＩチップの材料として石英ガラスまたは溶融石英が使用され得る。これらの２つのタイプの材料は、およそ２００ｎｍの波長を通すので、より多くの光子を通過させる。反応収率に対するナノＥＳＩチップおよびＭＳインターフェースとＵＶランプとの位置の影響も調べた。予備的研究において、主要な発光波長がおよそ２５４ｎｍの５Ｗの低圧水銀（ＬＰ−Ｈｇ）ランプを使用した。他のタイプのＵＶランプ（例えば、２００〜３００ｎｍの範囲の著しい光強度を発生するキセノンプラズマフラッシュランプおよび反応領域の小型化を可能にするＬＥＤ ＵＶランプ）が調査され得る。
ＰＢ反応を、μＬ／分の範囲の流速での注入型ＥＳＩ源に適合させる目的では、ＥＳＩ送液ラインにおいてＰ−Ｂ反応を行うことがより適している。ＵＶ透過性コーティングを有する溶融石英キャピラリーが、送液ラインとして選択される。反応領域のために、キャピラリーをコイル状にし（直径３ｃｍ）、ＵＶランプをキャピラリーから０．５ｃｍ離して中心に配置する（図５０Ａ）。４．５μＬ／分の溶液の流速の場合、１ｃｍの曝露は、そのキャピラリーにおける１．１秒間の反応時間に対応する。図５０Ｂは、５秒間のＵＶ曝露後のＰＣ１６：０／１８：１（９Ｚ）（７：３アセトン：Ｈ２Ｏ、１％酢酸中、５μＭ）のＥＳＩ ＭＳスペクトルを示している。ＰＢ生成物（ｍ／ｚ８１８．６）が４５％の収率で形成され、ナノＥＳＩ源で達成された収率よりもはるかに高かった（図４７Ａ）。さらに、図５０Ｂの挿入図に示されるＸＩＣから分かるように、ＰＢ反応生成物のシグナルは、ＵＶがオンの時間中、非常に安定していた。この特徴は、ＰＢ生成物に対するＭＳ／ＭＳで優れた性能を達成するために重要である。この直接注入の設定は、動力学的情報を得ることができるように溶液の流速またはＵＶに曝露されるキャピラリーの長さを変更することによって、ＵＶ曝露時間を変動させることが可能であった。溶媒として７：３アセトン：Ｈ２Ｏ、１％酢酸を用いたＰＣ１６：０／１８：１（９Ｚ）のＰＢ反応は、１０秒以内に６８％収率に達することができたことが見出された。この有望な結果に基づいて、ＥＳＩベースの脂質分析のために一般に使用される範囲のＥＳＩ流速（１００ｎＬ〜５０μＬ）に対して、「直接注入」の設定の配置（ランプの距離、ランプの電力）をさらに最適化しようと計画した。
直接注入の設定の場合、Ｐ−Ｂ反応試薬、すなわち、アセトンが、ＥＳＩのための共溶媒として使用されるが、しかしながら、アセトンは、順相または逆相ＨＰＬＣ分離のための溶出溶媒として通常使用されない。この制限を乗り越えるために、「フロー注入のコンセプト」を用いて、ＰＢ反応試薬を、ＥＳＩ源に向かってサンプル輸送ラインを通ってＴ字形注入（Ｔｅｅ−ｉｎ）し、光化学反応領域をその「Ｔ」接合部の後に配置する。この「フロー注入」の模式的な構成を図５０Ｄに示す。このデバイスを、ＰＣ１６：０／１８：１（９Ｚ）を用いて試験した。この脂質を、順相ＬＣ分離の通常の溶媒組成であるイソプロパノール／Ｈ２Ｏ、７０％／３０％に溶解し、１μＬ／分の流速でＥＳＩ源にポンピングした。アセトンを、別のシリンジポンプによって１μＬ／分で送達し、脂質送液ラインにＴ字形注入した。その溶液の組成は、混合後、アセトン：イソプロパノール：Ｈ２Ｏ（５０％／３５％／１５％）となる。その後のＰ−Ｂ反応（５秒）は、図５０Ｂと非常によく似たスペクトルを提供した。この設定を、下記に論じるようなオンラインＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳとの連結についてさらに調べた。
図５０Ｄに示される反応の設定を使用し、哺乳動物細胞由来の主要な脂質クラス（ＦＡ、ＧＬ、ＧＰ、ＳＰ、ＳＴ）の代表であるモデル脂質化合物を用いて、ＰＢ反応の性能ならびに脂質検出にとって重要な実験パラメータを特徴付けた。評価される重要な点としては、副反応を最小限に抑える条件、ＰＢに適切でありかつ脂質のＥＳＩと適合する溶媒系、および異なるタイプのカルボニル化合物をＰＢ試薬として使用する分析上の有用性が挙げられる。
ＰＢ反応を引き起こすＵＶ励起波長は、Ｎｏｒｒｉｓｈ Ｔｙｐｅ Ｉ反応も惹起でき、それによって、アセトンのα−炭素結合の光化学的開裂ならびにアセチルラジカルおよびメチルラジカルの形成がもたらされる（図５１Ａ）。これらの２つのラジカルは、有機溶媒および脂質からＨ原子を抜き取って、種々の二次ラジカルを形成するかまたはＣ＝Ｃ結合に付加することができる。その溶液が、微量のＯ２からなるとき、二次脂質ラジカルは、十分特徴付けられた脂質過酸化経路を経て、酸化されたおよび分解された脂質生成物を形成する。これは、実際に、調製されたばかりの溶液でさえも観察される。図５１Ｂは、アセトン：水（１：１）中の５μＭ ＰＣ１６：０／１８：１（９Ｚ）の１０秒間のＰＢ反応を示している。低いｍ／ｚ範囲（１００〜３００）の新しいピーク群は、ラジカルによって誘導された脂質分解に起因し、それによって脂質イオンシグナルが相当失われたことから、ＰＢ反応収率は、たった１２％（ＵＶ照射前のインタクトな脂質シグナルで正規化された）である。微量のＯ２を除去するために、この脂質溶液のＮ２パージを試みたところ、７０％の高いＰＢ反応収率が達成された（図５１Ｃ）。これらの予備的な結果は、良好なＰＢ反応収率を達成するために、競合する副反応を制御する重要性を意味している。本明細書に含められる実験の場合、Ｎ２パージは、ＰＢ反応の直前の脂質溶液に対して行われ得る。Ｎｏｒｒｉｓｈ Ｔｙｐｅ ＩＩ反応の関与および影響の程度が、種々のクラスのモデル脂質を用いて特徴付けられ得る。副反応の程度に対する有機溶媒の影響が調べられ得る。
予備的研究において、有機溶媒を使用するとき、ＰＢ反応収率を最大にするためおよび生じ得るラジカル副反応を減少させるために５０〜７０％アセトン（容積％）からなる水性溶媒系を使用した。しかしながら、上記の条件は、必ずしもＥＳＩによるイオン化および検出にとって最善の条件ではない。さらに、脂質の抽出、分離およびＥＳＩでは、通常、ＣＨＣｌ３、ヘキサン、アセトニトリルおよび脂肪族アルコールなどの有機溶媒が使用されるので、Ｐ−Ｂ反応とＥＳＩの両方の性能に対する有機溶媒組成の影響を調べる必要がある。以下の溶媒組成を試験した：アセトン：Ｈ２Ｏ：Ｘ＝７０：１５：１５（ｖ：ｖ：ｖ）（ここで、Ｘは有機溶媒である）。ＰＣ１６：０／１８：１（９Ｚ）を正イオンモードのＥＳＩ（「直接注入の設定）に対するモデル化合物として使用したとき、１５％のＣＨＣｌ３の条件だけが、ＰＢ反応に対して有意な干渉を示し、他のすべての有機溶媒が、６秒間のＵＶ曝露に対して許容され得るＰＢ反応収率（２０〜３０％）を示した。主要なクラスの標準的な化合物が試験され、ＰＢ反応とＥＳＩ分析の両方にとって好適な溶液組成が決定され得る。鍵となる評価基準としては、ＰＢ反応収率、インタクトな脂質およびＰ−Ｂ反応生成物の絶対イオン数（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｉｏｎ ｃｏｕｎｔｓ）、副反応の程度、ＬＣ溶媒との適合性が挙げられる。
ＰＢ試薬としてのアセトンは、極性および無極性の脂質および溶媒の両方における良好な共溶解度（ｃｏ−ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、ならびにＥＳＩ−ＭＳ検出を干渉しないという利点を有する。上記の理由から、本発明者らが提案する研究の多くにおいて、方法の開発および最適化のためにアセトンが使用される。脂質分析に対するＰＢ反応の有用性をさらに調べるために、より大きなプールのカルボニル化合物をＰＢ試薬として調査することが有益である。それらの候補が有するべきいくつかの特性としては、高いＰＢ反応選択性、良好な反応収率、ＰＢ反応生成物の低エネルギーＣＩＤからのＣ＝Ｃ診断用イオンの優先的形成が挙げられる。種々のタイプの光源が使用できるように、より長い波長（３００〜５００ｎｍ）と適合するＰＢ試薬を探すことも興味深いだろう。表９は、調査され得るいくつかの候補、ｎ→π＊転移の場合のそれらの最大吸収（ｍａｘｉｍｕｍ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）波長（λｍａｘ）（ＰＢ反応に関与する）およびＣ＝Ｃ位置決定のための特徴的な診断用イオン対の間のΔ質量を列挙している。
予備的研究は、ＵＶ３５０ｎｍランプを用いたとき、ベンズアルデヒドが妥当な効率でＰＣ１８：１（６Ｚ）／１８：１（６Ｚ）と反応できたことを示した（図５２Ａ）。ＰＢ生成物（ｍ／ｚ８３６．６、図５２Ｂ）のＭＳ２ＣＩＤは、７４Ｄａという特徴的なΔ質量を有するｍ／ｚ６４８．５および７２２．５の大量のＣ＝Ｃ診断用イオンを生成した。ベンズアルデヒドを用いたとき、ＰＢ試薬としてアセトンを使用した場合と比べて、副反応がより少なく、これは、使用されたより低いエネルギーのＵＶ光子に関係し得る。表９に列挙された試薬は、種々の脂質クラスの代表的なモデル化合物を用いる反応に適用され、不飽和脂質のＣ＝Ｃ分析に対するそれらの性能が調査される。中性のＰＢ試薬に加えて、本発明者らは、コレステロールおよびグリセロール脂質などの中性脂質に対するイオン化効率を高める目的で、電荷官能化（ｃｈａｒｇｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｅｄ）ケトンも調べる。
ある特定の代替の装置では、条件を独立して最適化できるようにするために、ＰＢ反応をＥＳＩ−ＭＳから切り離すことができる。例えば、ＰＢ反応のためのコイル状のＵＶ透過性溶融石英の装置は、フロー型マイクロリアクターとしてオフラインで使用され得る。ＰＢ反応収率を最大にするために、脂質分子が、純粋なアセトンに高濃度で溶解され得る。反応の後、乾燥することによってアセトンが除去され、残った脂質が、ＥＳＩにとって適切な溶媒に溶解され得る。
さらに、本発明の方法は、ＭＡＬＤＩを用いて行うことができる。本発明者らが表９において調べることを提案したＰＢ試薬のいくつか（すなわち、ベンズアルデヒド、ベンゾフェノンおよびアセトフェノン）は、ＵＶ ＭＡＬＤＩ波長（３３７または３５５ｎｍ）と重複するＵＶ吸収帯を有する。これらの試薬は、不飽和脂質分子とマトリックスに同時に溶解される場合、脱離およびイオン化の間に、ＵＶによって励起され得、Ｃ＝Ｃと反応し得る。このＰＢ反応の能力は、生体ＭＳイメージングにおける多くの応用法のための不飽和脂質の構造の特徴付けを劇的に高め得る。
不飽和脂質の構造決定および定量分析のためのＭＳ／ＭＳ法の開発
Ｃ＝Ｃを決定するためのＰＢ−ＭＳ／ＭＳの分析能力は、特定の不飽和脂質のＰＢ反応生成物の気相フラグメンテーション挙動に大いに依存する。種々の脂質クラスの構造多様性を考慮して、本発明者らは、頭部基、アシル鎖、Ｃ＝Ｃ位置の決定を含む、得ることができる構造情報の量を最大にすることに関して、タンデムＭＳ法を特定の各脂質クラスに調整する。本発明者らは、脂質Ｃ＝Ｃ位置の異性体を特徴付けるための方法の開発および確立されたＭＳ／ＭＳ条件に基づいてそれらを定量することにも焦点を当てる。主要な脂質クラスの、Ｃ＝Ｃの位置が既知である純粋な不飽和脂質を、方法を開発するためのモデルとして使用する。この実施例は、不飽和脂質の構造情報と定量情報の両方を得るためにＣＩＤベースのＭＳ／ＭＳを使用するための標準的なガイドラインを提供する。
衝突活性化に基づくＭＳ／ＭＳ法は、種々のクラスの脂質を分析するために十分確立されている。豊富な構造情報が、クラス／下部構造に特異的なフラグメンテーションチャネルから規則正しく得られる（ＭＳ／ＭＳからのリンク走査と呼ばれる）。ゆえに、多重レベルの構造情報を得ることができるように、これらの既存のＭＳ／ＭＳ法にＣ＝Ｃの位置を決定する能力を追加することは、非常に興味深い。予備的研究において、ＦＡおよびＧＰの少数セットの標準的な化合物に対するＰＢ−ＭＳ／ＭＳを、これらの２つのクラスの脂質に対して確立されたイオン化およびＣＩＤの条件を用いて調べた。通常、Ｃ＝Ｃ診断用イオンの形成のために、２つの現象が観察される：１）容易なフラグメンテーションチャネルであり、様々なイオン型の脂質からもたらされ得る；および２）インタクトな脂質イオンに対して確立されたＭＳ／ＭＳ条件を用いたとき、構造に関する情報価値のあるフラグメントイオンを干渉しないかまたは抑制しない。確立されたすべての知識がデータの解釈に直接適用され得るので、後者が有益である。ＰＢ生成物のイオン型が、実際にＣ＝Ｃ診断用イオンの形成に影響することも注目された。正イオンモードにおけるリチウムイオン付加体としてのα−リノレン酸、ＦＡ１８：３（９Ｚ、１２Ｚ、１５Ｚ）のＰＢ生成物（ｍ／ｚ３４３．３）のＣＩＤは、３つのＣ＝Ｃ結合の３対の診断用イオンを高存在比で生成した。しかしながら、脱プロトン化ＰＢ生成物（ｍ／ｚ３３５．３）のＣＩＤは、９Ｚ位から１対の診断用イオンしか比較的高い強度で生成しなかった；他の２対は、比較的低い強度で存在するか、または主な５８Ｄａロスと重複して存在する。明らかに、リチウム付加体のＣＩＤが、Ｃ＝Ｃの特徴付けにとってより好ましい。
これらの実施例において、５つの主要な脂質クラス（ＦＡ、ＧＬ、ＧＰ、ＳＰ、ＳＴ）およびそれらのサブクラス（表１０に列挙される）を代表する脂質を用いて、拡張された研究が試みられた。
十分に認められたＭＳ／ＭＳ条件を用いるＰＢ−ＭＳ／ＭＳから得ることができる構造情報（例えば、頭部基、アシル鎖、Ｃ＝Ｃの位置）の量を評価した。これらの条件は、イオンの性質、すなわち、イオンの電荷極性（正イオン 対 負イオン）および電荷担体の同一性（例えば、Ｈ＋対Ｌｉ＋）を操作することによって、さらに改善され得る。種々のタイプのＣＩＤ（例えば、ビーム型衝突活性化 対 オン共鳴衝突活性化）が、三連四重極／リニアイオントラップ質量分析計を用いて比較され得る。
ＰＢ−ＭＳ／ＭＳは、Ｃ＝Ｃ結合の位置情報を含む診断用フラグメントイオンを生成するというユニークな特性を有するので、それは、特徴的な診断用イオンの観察に基づいて、各Ｃ＝Ｃ位置異性体の区別を可能にする。予備的研究において、このことを、マウスおよびヒト脳組織分析から観察された、ＦＡ１８：１のＣ＝Ｃ異性体、すなわち、オレイン酸（９Ｚ）およびｃｉｓ−バクセン酸（１１Ｚ）を用いて試験した。１１Ｚおよび９Ｚの２：１モル比混合物をＰＢ−ＭＳ／ＭＳに供した（ｍ／ｚ３３９．３、図５３Ａ〜Ｂ）。予想のとおり、１１Ｚ（ｍ／ｚ１９９、２２５）および９Ｚ（ｍ／ｚ１７１、１９７）に対してそれぞれ異なるＣ＝Ｃ診断用イオン対が形成されたことから、それらのＰＢ反応生成物がいかなる質量の差を有しなくても、９Ｚおよび１１Ｚ Ｃ＝Ｃ位置異性体の明白な検出が可能だった。このデータセットは、Ｃ＝Ｃ異性体の構造の特徴付けにおけるＰＢ−ＭＳ／ＭＳの潜在能力を明らかに示す。この実施例では、一連の商業的に入手可能なモデルＣ＝Ｃ結合異性体（ＭＵＦＡ（ＦＡ２０：１ ９Ｚ対１１Ｚ）、ＰＵＦＡ（ＦＡ２０：４ ｎ−６対ｎ−３）およびリン脂質（ＰＣ１８：１（６Ｚ）／１８：１（６Ｚ）対ＰＣ１８：１（９Ｚ）／１８：１（９Ｚ））を含む）を調べた。ブレークダウンカーブ法（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｃｕｒｖｅ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて診断用イオンを形成するためのＣＩＤ条件および異性体混合物の分析に対するその影響に注意した。各Ｃ＝Ｃ位置異性体が、異なる質量を有する診断用イオンを提供したので、ＰＢ−ＭＳ／ＭＳ法は、混合物中に共存するＣ＝Ｃ結合異性体の数によって制限されなかった。それを、ＦＡ１８：１（９Ｚ）、（１１Ｚ）および（６Ｚ）異性体混合物を用いて試験した。
Ｃ＝Ｃ診断用イオンを生成する能力は、ＰＢ−ＭＳ／ＭＳを用いたときの不飽和脂質の定量能力も広げる。この実施例は、以下の２つの状況に対する定量方法の開発を実証する：１）Ｃ＝Ｃ位置異性体のない不飽和脂質の絶対定量またはＣ＝Ｃ異性体が存在する場合の総定量、および２）Ｃ＝Ｃ位置異性体の相対定量および絶対定量。
タンデムＭＳは、高い分子特異性および高い感度を達成するためにクラスまたはサブクラス特異的フラグメンテーションチャネル（リンク走査）を用いることによる脂質定量に広く使用されている。主として利用可能なフラグメンテーション法である低エネルギーＣＩＤでは、インタクトなＦＡイオンから構造に関する情報価値のあるフラグメントイオンを形成することが難しいので、ＦＡを定量するためのＭＳ／ＭＳの開発は、遅れをとっている。ＦＡを定量する場合、ＧＣ−ＭＳまたはＨＰＬＣ−ＭＳが、現在の分析の選択肢である；しかしながら、分析前にオフラインでのサンプルの誘導体化が常に必要である。ゆえに、分析段階でＦＡ混合物を定量するためのＭＳ／ＭＳベースの方法が開発されると、分子の特異性、感度、定量精度および線形のダイナミックレンジが大幅に高まり得る。ＮＬ ５８Ｄａは、異なる鎖長を有するＭＵＦＡのＰＢ−ＭＳ／ＭＳから観察される共通のフラグメンテーションチャネルであり、総フラグメントイオン強度の６０〜７０％を占める。これらの２つの点は、５８ＤａのＮＬが、定量目的の良好な候補であるはずであることを示唆する。内部標準としてＦＡ１７：１（１０Ｚ）を使用して、ＦＡ１８：１（９Ｚ）の定量について試験を行った。図５４は、ＦＡ１８：１（９Ｚ）（１．１μＭ、ｍ／ｚ３３９．４）およびＦＡ１７：１（ｍ／ｚ３２５．３、０．７５μＭ）のＰＢ生成物の５８ＤａスペクトルのＮＬを示している。０．４〜６μＭの範囲および０．２μＭという検出限界（ＬＯＤ）から検量線を得た。この結果は、通常使用されるＧＣ−ＭＳ法に十分匹敵する。ＮＬ５８スキャンを、哺乳動物細胞に天然に存在する１６〜２４の範囲の炭素数を有するＭＵＦＡおよびＰＵＦＡの定量についてさらに評価した。内部標準（鎖長および不飽和度）、衝突エネルギーおよび他のパラメータの選択の影響を、その分析性能指数のために特徴付ける。ＦＡ Ｃ＝Ｃ異性体の総定量に対するＮＬ ５８Ｄａの適用可能性を、ＦＡ１８：１（９Ｚ）および（１１Ｚ）を用いて評価した。
異なる診断用イオンが、異なるＣ＝Ｃ結合位置の異性体のＣＩＤから形成されることを考慮すれば、直接的なアプローチは、図５５Ａに示されるような定量のために、計測可能なものとして診断用イオンのイオン強度を使用する。この考えの実行可能性を試験するために、ＦＡ１８：１（９Ｚ）およびＦＡ１８：１（１１Ｚ）を使用した。図５５Ｂは、９Ｚおよび１１Ｚの混合物から生じるｍ／ｚ３３９．３スペクトルの拡大したＰＢ−ＭＳ２ＣＩＤを示している（ここで、総濃度を１０μＭで維持したが、しかしながら種々のモル比（Ｃ１１Ｚ：Ｃ９Ｚ＝４：１〜１：４）を用いた）。各診断用イオン対のイオン強度を合計し、イオン強度比（Ｉ１１Ｚ：Ｉ９Ｚ）を濃度比（Ｃ１１Ｚ：Ｃ９Ｚ）に対してプロットする。そのような検量線を図５５Ｃに示す。線形フィットは、０．９９５２というＲ２値および１０％未満の相対標準偏差（ＲＳＤ）を有する。この結果は、診断用イオン強度が、Ｃ＝Ｃ異性体の定量に使用できることを示している。
検量線の相対標準偏差における、ＣＩＤに使用された活性化エネルギーおよびＣＩＤのタイプ（オン共鳴ＣＩＤ 対 ビーム型ＣＩＤ）を調べた。それによって、定量分析のための異性体脂質の各群の最適化されたＣＩＤ条件が確立された。この知識は、複雑な混合物の分析に直接変換可能である。
検量線は、イオン強度比および濃度比から確立されるので、異なる濃度範囲に対して同じ直線関係が保持されるかを評価することが重要である。ＦＡ１８：１（９Ｚ）および（１１Ｚ）に基づく本発明者らの予備的研究は、０．１ｕＭ〜１００ｕＭの総濃度範囲内において検量線の変動がほとんどないことを示した。異性体比に対する線形のダイナミックレンジの程度も推定した。
２つの異なるアプローチを試験し、脂質異性体の定量分析のためのそれらの分析性能指数に関して比較した。ＦＡ１８：１ Ｃ＝Ｃ異性体を方法の開発に使用した。不飽和脂質の定量のためにＰＢ−ＭＳ／ＭＳを用いる原理（図５５Ｃ）は、Ｃ＝Ｃ診断用イオンの強度に基づくので、最善の内部標準（ＩＳ）は、その系に天然に存在しないＣ＝Ｃ結合異性体であるべきである。ペトロセリン酸ＦＡ１８：１（６Ｚ）は、マウスまたはヒト細胞において通常検出されないので、ＦＡ１８：１（９Ｚ）および（１１Ｚ）異性体を定量するための内部標準の良好な選択肢である。６ＺのＰＢ反応生成物の衝突活性化によって、ｍ／ｚ１５５および１８１の診断用イオンが生成される。９Ｚ／６Ｚおよび１１Ｚ／６Ｚの診断用イオン強度比に基づいて、図５５Ｄに示されているような９Ｚおよび１１Ｚに対する２つの検量線を得た（ここで、６Ｚの濃度を１０μＭで一定に維持し、９Ｚおよび１１Ｚの濃度を１．５〜４５μＭの範囲で変動させた）。９Ｚ異性体と１１Ｚ異性体の両方に対して優れた直線関係が得られた。ＰＢ反応、イオン化およびＣＩＤの効率に起因する実験の変動を回避することによるこのＩＳ法は、有益である。
利用可能性に応じて、Ｃ＝Ｃ異性体の１つが、標準添加法のための参照として使用できる。ＦＡ１８：１ ９Ｚおよび１１Ｚ異性体の模擬混合物に対する標準添加法を行うためにＦＡ１８：１（１１Ｚ）の使用を試験した。標準添加法の前および後で、ＰＢ−ＭＳ２ＣＩＤを記録した。この情報を使用し、図５５Ｃに記載されている相対検量線（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｄ）を用いることによって、標準添加法の前後の１１Ｚ対９Ｚの濃度比を計算した。上記の情報と標準添加法の既知の量とを組み合わせると、９Ｚと１１Ｚの両方の絶対濃度がそれぞれ良好な精度で測定された。
リピドミクス研究のためのＰＢ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳプラットフォームの開発
ＭＳベースのリピドミクス分析は、生物学的サンプル由来の脂質抽出物に対して直接行うことができる（いわゆるショットガンリピドミクス）か、またはＬＣ分離と連結することができる。ショットガン法は、構造情報と定量情報の両方を提供することによってリピドームのハイスループットな包括的プロファイリングを容易にし、バイオマーカーの検出および検証のための強力なツールになる。低存在比の脂質、イオン化効率が低い脂質、ならびに脂質異性体の同定および定量は、高度の複雑さ（２００〜４００個の脂質種）、異なる化学的−物理的特性、および広範なダイナミックレンジ（４〜６桁の濃度差）に起因して、生物学的サンプル由来の脂質抽出物を分析する際のショットガンアプローチにとって常に難題である。この課題は、ＬＣなどの分離をＭＳ分析の前にまたはＭＳ分析とオンラインで行うと、効果的に対処される。現在、ショットガン法およびＬＣ−ＭＳ（／ＭＳ）法は、ほぼ等しい頻度で用いられており、合わせると、リピドミクスに関する科学報告の８０％を占める。複雑な脂質混合物の分析によるＣ＝Ｃ特異性を高めるために、これらの２つのプラットフォームの両方においてＰＢ−ＭＳ／ＭＳストラテジーを実施することは、非常に興味深い。
ナノＥＳＩとＥＳＩの両方の構成を、商業的に入手した酵母由来酵母極性抽出物（Ａｖａｎｔｉ）のショットガン分析のためのＰＢ−ＭＳ／ＭＳを実施するために使用した。この酵母極性抽出物は、主に、ＦＡおよびＧＰからなり、各サブクラスの相対組成は、記述されている。直接注入ＥＳＩの構成と連結されたＰＢ−ＭＳ／ＭＳは、Ｃ＝Ｃの位置の決定とともに、ＰＣ、ＰＥ、ＰＩ、ＰＡ、ＰＳ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＡ、ＬＰＳを含む３５個の不飽和ＧＰ種の同定を可能にした（詳細な分子情報を図５６に示す）。ＰＢ−ＭＳ／ＭＳ法は、Ｃ＝Ｃの絶対配置を提供できないので、Ｃ＝Ｃをカウントする命名法は、生物学的サンプルから同定された脂質に対するＣ＝Ｃの位置を検出するためにアシル鎖のメチル末端から追跡した（例えば、ｎ−７またはｎ−９）。同定されたＧＰは、１６：０、１８：０、１６：１（ｎ−７）および１８：１（ｎ−９）のアシル鎖の組み合わせを含んだ。約０．１％のｍｏｌ％を有するいくつかの低濃度種（例えば、ＬＰＡ１８：１（ｎ−９）およびＬＰＳ１６：１（ｎ−７））を、高い信頼性で同定できることに注意することが重要である。興味深いことに、Ｃ＝Ｃ位置の異性体は、この系からは観察されなかった。これらの予備的な結果は、オンラインＰＢ−ＭＳ／ＭＳをショットガン脂質分析に適用する実行可能性を実証する。
Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ＨＰＬＣは、ＴｕｒｂｏＥＳＩ−ＱＴＲＡＰ ４０００ ＭＳインターフェース（両方ともＰＩのラボにおいて利用可能）に連結され得る。ＰＢ試薬（アセトン）を溶出剤中にＴ字形注入する上に記載された「フロー注入デバイス」を用いて、ＬＣ分離の後かつＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析の前に、ＰＢ反応を実行した。全体の構成の概略図を図５７に示す。この配置によって、分離プロセスに対する妨害が最小になる。この実施例に対する上に記載された条件を用いることにより、試験するための最初のパラメータを選択する際の指針が提供された。これらには、混合のための脂質溶出剤／アセトン比、そのような溶媒条件下でのＰＢの反応時間（ＵＶ曝露時間）、およびＵＶ曝露用の溶融石英キャピラリーの必要な長さが含まれる。現行のＨＰＬＣシステムが管理できる最低流速は、２５０μＬ／分である。この流速は、最適化された溶媒条件下における１０秒間のＵＶ曝露時間に対して溶融石英キャピラリーの約３ｍの曝露を必要とする。最初の試験では、ＨＰＬＣ溶出剤の２４：１分割を行い、１０μＬ／分の溶出剤を、曝露のための２０ｃｍのキャピラリー長に相当する１０秒間のＰＢ反応のために、５〜１０μＬ／分のアセトン溶液にＴ字形注入した。この条件を、「フロー注入」の構成を用いて模倣した。１つのシリンジを、Ｈ２Ｏ：ＡＣＮ：ＩＰＡ（４３：４２：１５）に溶解された標準的なＰＣ、５ｍＭギ酸アンモニウム（ＡＦ）、通常のＬＣ均一濃度（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）分離条件のために、１０μＬ／分でポンピングした。アセトンを１０ｕＬ／分で送達したところ、ＰＣの良好なＰＢ反応収率が達成された。
ＣＩＤベースのＰＢ−ＭＳ／ＭＳ法は、種々のクラスの不飽和脂質に対してＣ＝Ｃ特異的な構造情報および定量情報を提供できる。そのような方法を大規模なリピドミクス研究に応用するために、発見モードと標的化された脂質分析の両方のために、ＰＢ反応生成物のユニークなＣＩＤフラグメンテーション化学に基づいてＭＳ／ＭＳデータ収集ワークフローを合理的にデザインすることが重要である。
その後のＭＳ／ＭＳのためのＰＢ生成物の容易な同定は、Ｃ＝Ｃ結合の位置情報と定量の両方を得るために重要な工程である。ＰＢ反応が、不飽和脂質からさらなるｍ／ｚピーク（分子種）をもたらすことを考えれば、これはショットガンアプローチに役立つが、生物学的サンプルの脂質抽出物から得られるすでに密集したＭＳスペクトルをさらに悪くする。この難問に対処するために、５８Ｄａのニュートラルロス（ＮＬ５８）スキャンおよびデータに依存したＰＢ探索を含む２つの方法を試験した。上記のＮＬ５８スキャンの予備的研究は、ＮＬ５８（オキセタン環からのアセトンのロス）がＰＢ反応生成物に特徴的であり、ＦＡおよび中性脂質（すなわちＣＥ、ＭＧ）に共通して観察されることを示す。ゆえに、ＮＬ５８ ＭＳ／ＭＳスキャンは、それらの脂質クラスのＰＢ反応生成物の迅速かつ高感度の発見を可能にするはずである。Ｐ−Ｂ反応生成物だけが検出されるので、スペクトルは、高感度で非常に単純化される。酵母抽出物をモデル系として使用して、そのＮＬ５８スキャンをさらに最適化した。評価は、同定され得る脂質種の数および検出限界に基づいた。ＮＬ５８が大量のフラグメンテーションチャネルではない脂質クラス（例えば、ＧＰ）のバーチャルな（Ｖｉｒｔｕｅ）ＰＢ探索、本発明者らはまず、負イオンモードで「マルチプルプリカーサーイオンスキャン（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｏｎ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）（ＭＰＩＳ）」アプローチ（例えば、ＰＩＳ ｍ／ｚ２７９（ＦＡ１８：２）、２８１（ＦＡ１８：１）、３０１（ＦＡ２０：５））を用いることによって不飽和アシル鎖からなるＧＰを標的にする。ＰＢ ｍ／ｚリストは、それらの不飽和脂質種に５８Ｄａを付加することによってコンピュータによって生成され、さらにＰＢ−ＭＳ／ＭＳ分析のために選択される。
多くのリピドミクス研究の場合、検出および定量のために既知の脂質種の選択を標的にすることが興味深い。これは、典型的には、三連四重極ＭＳなどのタンデムインスペース質量分析計において、選択された反応のモニタリング（ＭＲＭ（マルチプルリアクションモニタリング）としても知られるＳＲＭ）を用いて行われる。親イオンとフラグメントイオンとの間の定義された関係性（「トランジション」という言葉が造られている）が、最終的には、この方法の分析性能指数を決定する。ＰＢ反応生成物に関連するユニークなフラグメント、すなわち、Ｃ＝Ｃ診断用イオンＮＬ５８Ｄａの形成を考慮すると、それらをトランジションにおいて使用することは単純明快である。特異的かつ高感度の検出のためのトランジションの最適数を決定する目的で、酵母抽出物に加えられた脂質標準物質を標的にすることによって、これらのトランジションを試験した。
ＰＢ反応生成物のＣＩＤスペクトルから自動的にＣ＝Ｃの位置を決定することを容易にするデータ処理ツールが、開発され得る。そのプログラムは、ｍａｔｌａｂで書かれ、最初の試験は、モデル脂質種から取得されたデータに対して行われ、次いで、生物学的サンプル由来の脂質抽出物を用いて最適化される。このプログラムは、以下のファンクション層を有し得る：１）診断用イオン選択の法則。標準的な選択アルゴリズム（３×ノイズレベル）に加えて、２６Ｄａの質量差（ＰＢ試薬としてアセトンを使用したことに起因する）を有するピークが選択され得る。２）Ｃ＝Ｃの位置の決定。クラス特異的アルゴリズムをＣ＝Ｃ結合の位置を決定するために使用し得る。ＭＵＦＡおよびＧＰの場合、負イオンモードで収集されたＰＢ−ＭＳ２またはＭＳ３ＣＩＤデータを使用する。簡単にするために、診断用イオン対のうちより低い質量ピーク（ＣｎＨ（２ｎ−３）Ｏ３ −）からＣ＝Ｃ結合の位置を計算し得る。数字ｎは、カルボン酸から数えたときのＣ＝Ｃ結合の位置を表す。ＰＵＦＡ、ＣＥおよびＧＬの場合、電荷担体としてアルカリ金属付加体を用いて正イオンモードで収集されたＰＢ−ＭＳ２／ＭＳ３ＣＩＤデータを使用し、診断用イオンの構造を反映させるためにしかるべくＣ＝Ｃの決定式を改変する。ＰＵＦＡの場合、Ｃ＝Ｃの決定は、メチレン基で分離されるＣ＝Ｃに対するシグニチャである、同じシリーズ（ｓｉｒｅｓ）の診断用イオンの４０Ｄａ（Ｃ３Ｈ４）のスペーシングによってクロスチェックされる。
Ｃ＝Ｃが特定された種は、脂質標準物質から生成されたＭＳ／ＭＳスペクトルデータベースおよび脂質抽出物から取得され手動で解釈されたデータと比較される。スペクトル類似性スコアが、Ｃ＝Ｃの位置とともにスコアリングシステムに報告され、類似性スコアが低いものは、手動で評価される。
ラット脂質分析に対する検証および適用
ＰＢ−ＭＳ／ＭＳを行うために最適化されたパラメータに基づいて、ラット組織由来の脂質抽出物を使用し、不飽和脂質分析に対するその有用性を、Ｃ＝Ｃ位置の異性体の検出および定量のユニークな能力に重点を置いて検証した。このタイプの情報は、哺乳動物のリピドームの内在性の多くの脂質クラスで獲得されていないので、さらなる方法の開発、およびＣ＝Ｃの決定を可能にする他の分析方法（例えば、ＯｚＩＤ）との相互比較のためのベンチマークを形成し得る。このプロジェクトの別の目標は、信頼性の高いＣ＝Ｃ割り当て、ならびにＣ＝Ｃ異性体が存在する場合、その組成を含む、生物学的サンプル由来の不飽和脂質のデータベースを確立することである。このデータベースは、自動的な未知脂質Ｃ＝Ｃのためにも使用され得る。
上に記載されたナノＥＳＩの構成を用いて、ラット脳由来の極性脂質抽出物に対する最初のショットガン脂質分析を行った。脂質抽出を、確立された抽出条件を用いて２０〜５０ｍｇの組織において行った。Ｎ２で乾燥させた抽出物を、正または負イオン化モードでＰＢ−ＭＳ／ＭＳを行うために１％酸または塩基を加えた１：１アセトン／Ｈ２Ｏ溶液で再構成した。ＦＡ１６：１（ｎ−７）、１８：２（ｎ−６）および２０：４（ｎ−６）を除く検出されたすべての遊離ＦＡが、Ｃ＝Ｃ位置の異性体を有すると見出された。例えば、ＦＡ１９：１は、ｎ−８およびｎ−１０異性体の混合物であり、ＦＡ１８：１および２０：１は、ｎ−７およびｎ−９異性体の混合物であり、ＦＡ２２：１は、Ｃ＝Ｃがｎ−７、ｎ−９またはｎ−１１に位置する３つの異性体からなる（図５８Ａ）。それらの相対組成は、上で論じられたＣ＝Ｃ特異的診断用イオンの強度比に基づいて確立された。ＰＢ−ＭＳ／ＭＳによって観察されたＣ＝Ｃ組成は、ラット脳由来の遊離ＦＡの同定および定量のためにＧＣ−ＭＳを用いた以前の報告と一致するが、しかしながら、サンプル消費がかなり少なく、分析時間が短いことに注目することが重要である。遊離ＦＡ１８：１ Ｃ＝Ｃの異性体組成と一致して、ラット脳におけるすべての１８：１含有ＧＰが、ｎ−７およびｎ−９異性体の混合物であるが、これらの２つの（ｔｏｗ）Ｃ＝Ｃ異性体の相対比は、異なる種で様々であった。同じアシル鎖を含む遊離ＦＡとＧＰとの間にＣ＝Ｃ異性体組成の一貫性が広く観察された。ラット脳のＧＰ分析によって、（Ｌ）／ＰＳ、ＰＥ、ＰＣ、ＰＩ、ＰＡから８５個の分子種（それらの５０％が少なくとも１つのＣ＝Ｃ異性体型を有する）の完全構造が割り当てられた。これは、生物学的サンプルからの、Ｃ＝Ｃ位置ならびにＣ＝Ｃ異性体組成の分子特異性を有する幅広いＧＰに関する初めての証拠文献である。
他のクラスの脂質（ＣＬ、ＧＬ、ＣＥ、ＳＭ）の構造の特徴付けを拡張すること、定量分析を行うこと、低存在比の脂質の分析に対する限界を押し広げることを目的に、ラット脳組織の脂質抽出物を用いて、ショットガンリピドミクスのためのＰＢ−ＭＳ／ＭＳを、上で特定された条件を用いてさらに検証した。ラット脳の脂質抽出物を、上に記載されたＨＰＬＣ−ＰＢ−ＭＳ／ＭＳプラットフォームの検証にも使用した。これらの２つのアプローチから収集されたデータを相互比較し、両方のアプローチから特定された不飽和脂質をプールすることによって、比較的完成した脂質プロファイルを構築する。手動で注釈を付けた質量スペクトルデータを用いて、検索可能なデータベースを構築し、コンピュータによって支援されるＣ＝Ｃの決定およびＣ＝Ｃ異性体の相対定量を評価または訓練する。ラット脳脂質の分析は、サンプル調製、脂質の抽出、分離、ＰＢ−ＭＳ／ＭＳおよびデータ解釈という局面を包含する一連のプロトコルの確立ももたらす。
このデータは、ショットガンまたは分離ベースのプラットフォームを用いて、ＰＢ−ＭＳ／ＭＳが、異なるタイプの生物学的サンプル（例えば、血漿および様々な組織タイプ）に適用できることを例証している。このデータは、遊離ＦＡ１８：１およびＰＣ１６：０／１８：１のｎ−７およびｎ−９ Ｃ＝Ｃ異性体型が、種々のタイプのラット（ｒａｔｅ）組織（例えば、脳、脂肪、腎臓、肝臓および筋肉）で一貫して観察されるが、これらの２つの異性体型の相対比は、異なる組織の間で様々であることを示している（筋肉由来のＰＣ１６：０／１８：１（ｎ−７）異性体がその他のものと比べてより高い寄与であることに注意されたい、図５８Ｄ）。これらの知見は、Ｃ＝Ｃ異性体の分布が種々のタイプの組織で同じではなく、それらの局所的環境におけるそれらのユニークな生物学的機能と結びついていることを初めて実証しているので、重要である。
実施例１５：質量分析法による不飽和脂肪酸の迅速な定量のための光化学的タギング
脂肪酸（ＦＡ）のプロファイリングは、表現型情報を提供するので、広範囲の生物学的および生物医学的研究にとってかなり興味深い。不飽和ＦＡの定量、特に、高い信頼性で炭素−炭素二重結合（Ｃ＝Ｃ）の位置を割り当てることを伴う不飽和ＦＡの定量は、従来のガスクロマトグラフィー−質量分析を用いるとき、サンプルと時間の両方を消費する。この研究において、本発明者らは、クロマトグラフ分離を頼りにせずに不飽和ＦＡをプロファイリングするための迅速かつ高感度の定量的方法を開発した。この方法は、ＦＡにおけるＣ＝Ｃの溶液中での光化学的タギングと、その後のニュートラルロススキャンタンデム質量分析による気相デタギング（ｄｅ−ｔａｇｇｉｎｇ）との組み合わせに基づいた。この方法は、生物学的サンプル（血液、血漿および細胞株）由来の一連の不飽和ＦＡの直接的な定量を可能にした。ここで、従来から見過ごされていたＦＡのＣ＝Ｃ位置の異性体の定量情報を得ることができ、正常なヒト前立腺細胞と癌性ヒト前立腺細胞との間のＦＡの変化の研究に応用できた。
脂肪酸は、広範囲の生物学的機能において重要な役割を果たすことによって、生存しているすべての生物にとって必須である。脂肪酸は、エネルギーの貯蔵を容易にし、シグナル伝達において必須の役割を果たし、リン脂質、糖脂質、コレステロールエステルなどの複雑な脂質の基本単位である。ＦＡの構造および生物物理的（ｂｉｏｐｈｙｉｓｃａｌ）特性は、鎖の長さならびに炭素−炭素二重結合（Ｃ＝Ｃ）の数、位置および配置によって規定される。多くの不飽和ＦＡが、Ｃ＝Ｃ位置の異性体を有すると知られており、それらの異性体の各々が、異なる生物学的機能を発揮する。例えば、オメガ−６ポリ不飽和脂肪酸（ω−６ ＰＵＦＡ）は、メチル末端から数えて６番目の炭素に位置に最初のＣ＝Ｃを有し；それらは、ω−３のＣ＝Ｃ位置の異性体と比べて異なる炎症促進性および抗炎症性の機能を果たすと報告されている。不飽和ＦＡの組成の変化といくつかの慢性疾患の発症および進行との間の相関関係を示す強い証拠がある。
ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）は、未だにＦＡ分析のための方法の主流であるが、操作が容易であること、速度が速いこと、および複数のクラスについての脂質プロファイルを得ることが可能であることを理由に、ショットガン脂質分析が次第に用いられるようになってきた。ショットガンアプローチでは、粗脂質抽出物中のＦＡは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によってイオン化され、分離なしでＭＳによって分析される。正確な質量の測定値から、ＦＡの鎖長および不飽和度などの分子情報が容易に推定できる。残念なことに、定性分析と定量分析の両方にとって強力な手法であると判明しているタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）は、インタクトなＦＡの分析に直接適用できない。これは、構造に関する情報価値のあるフラグメントイオンが、低エネルギー条件での衝突誘起解離（ＣＩＤ）によってＦＡアニオンからほとんど生成され得ないことが理由である。この状況は、不飽和ＦＡ、特に、一不飽和ＦＡ（ＭＵＦＡ）におけるＣ＝Ｃ結合の位置を正確に指摘することも不可能にしている。
代替のアプローチが探索された。ＦＡのカルボン酸官能基の電荷スイッチ（Ｃｈａｒｇｅ−ｓｗｉｔｃｈ）誘導体化が、ＦＡ分析においていくつかの利点を有すると示された。第１に、それは、ポジティブＥＳＩモードにおけるＦＡのイオン化効率を大幅に改善することから、分析の感度が改善される。より重要なことには、誘導されたＦＡイオンのＣＩＤが、大量のシグニチャフラグメントイオンを提供できたことから、不飽和ＦＡの検出および定量が可能になる。適切な誘導体化基を選択することによって、構造に関する情報価値のあるフラグメントイオンが、ＭＳ／ＭＳから生成され得、Ｃ＝Ｃの位置の手掛かりを提供し得る。科学文献は、電荷スイッチ誘導体化およびショットガン分析によって、ヒト血漿中に比較的低い濃度で存在したＦＡ１８：３のＣ＝Ｃ位置の異性体であるα−およびγ−リノレン酸（ω−３およびω−６ ＦＡ１８：３とも称されることが多い）の同定を報告している。
この研究において、本発明者らは、溶液中での光化学的タギングに続いてＭＳ／ＭＳによる気相デタギングを用いることによって、複雑なサンプル中の不飽和ＦＡを釣り上げ、定量する新しいアプローチを探索した。本発明者らの研究は、光化学反応、すなわち、パターノ・ビューチ（ＰＢ）反応とオンラインＭＳ／ＭＳとの連結によって、様々なクラスの脂質に対するＣ＝Ｃの位置を高い信頼性で割り当てることを可能にすると最近示した。このアプローチでは、脂肪酸アシル鎖における各Ｃ＝Ｃを、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）プロセス中にＵＶ照射において電子的に励起されたアセトンによってタグ化する。次いで、ＥＳＩによってイオン化された、アセトンでタグ化された脂質を、Ｃ＝Ｃ結合の位置に特異的なフラグメントイオン（Ｃ＝Ｃ診断用イオンと呼ばれる）を生成するＭＳ／ＭＳによって分析する。Ｃ＝Ｃ診断用イオンのＭＳ測定値は、Ｃ＝Ｃ位置の異性体の同定と定量の両方のための情報を提供する。Ｃ＝Ｃ診断用イオンの生成に加えて、タグのロス（−５８Ｄａ、すなわちアセトンのロス）が、タグ化された不飽和ＦＡのＣＩＤにおける主なフラグメンテーションチャネルであると見出される。このアセトンロスが大量にあることが、Ｃ＝Ｃ診断用イオンの検出に基づくＦＡ分析の感度を制限する。しかしながら、本明細書で報告される新しく開発されたアプローチでは、このアセトンロスフラグメントチャネルを利用して、複雑な生物学的サンプルから不飽和ＦＡを釣り上げて定量する効果的な手段を導いた。ニュートラルロススキャンを用いることにより、アセトンによって特異的にタグ化された不飽和ＦＡを選択し、それらの定量を容易に行うことができる。
この概念を試験するために、ＦＡ１８：１（９Ｚ）（オレイン酸）とＦＡ１７：１（１０Ｚ））（ｃｉｓ−１０−ヘプタデセン酸）との等モル混合物を、ＰＢ反応を介してアセトン光化学的タギングに供した。図５９Ａおよび５９Ｂは、それぞれ光化学的タギングの前および後の、そのような混合物の負イオンモードナノＥＳＩスペクトルを示している（それぞれ、０．１％ＮＨ４ＯＨを含むアセトン／Ｈ２Ｏ（５０／５０、ｖ／ｖ）中に３．５μＭ）。ｍ／ｚ３２５および３３９に、アセトンでタグ化されたＦＡの形成が良好な強度で明らかに検出された（それぞれ対応するインタクトなＦＡ（ｍ／ｚ２６７のＦＡ１７：１およびｍ／ｚ２８１のＦＡ１８：１）から質量が５８Ｄａ増加していた）。タグ化されたＦＡ、すなわち、タグ化されたＦＡ１７：１（ｍ／ｚ３２５）のＭＳ２ＣＩＤ（ＰＢ−ＭＳ／ＭＳとも称される）は、主なタグロス（−５８Ｄａ）およびシグニチャ２６Ｄａ質量分離を有するＣ＝Ｃ診断用イオン対をもたらした（図５９Ｃ）。この実験セットから、溶液中でのアセトンタギングおよび気相中でのアセトンデタギングのプロセスが効率的であることが実証される。
次いで、この方法を、ヒト血漿（２０μＬ）由来のＦＡ抽出物の分析に適用した。その抽出物に、ＦＡ１７：１（１０Ｚ）を、ヒト血漿中で無視できる存在比を与える内部標準（ＩＳ）として加えた。ナノＥＳＩ−ＭＳは、その抽出物が、種々の飽和および不飽和ＦＡを含むことを明らかにした（図５９Ｄ）。主要な種としては、ＦＡ１４：０（ｍ／ｚ２２７．３）、１６：１（ｍ／ｚ２５３．３）、１６：０（ｍ／ｚ２２５．４）、１８：２（ｍ／ｚ２７９．３）、１８：１（ｍ／ｚ２８１．３）、１８：０（ｍ／ｚ２８３．３）および２０：４（ｍ／ｚ３０３．３）が挙げられた。光化学的タギングの後（図５９Ｅ）、不飽和ＦＡの相対強度は有意に低下し、同時に、タグ化されたＦＡが出現した（「＊」で示されている、例えば、ＦＡ１６：１に対するｍ／ｚ３１１．４、ＦＡ１８：２に対するｍ／ｚ３３７．５および３９５．５、ＦＡ１８：１に対するｍ／ｚ３３９．３、ＩＳに対するｍ／ｚ３２５．２）。タギング反応（ＰＢ反応）は、１００％の収率ではないので、込み入ったスペクトルを導く。しかしながら、ＣＩＤを介したニュートラルロススキャンを活用することによって、反応スペクトルは、大幅に単純化され、混合物から不飽和ＦＡだけが検出された（図５９Ｆ）。飽和ＦＡが、ＮＬＳ（５８Ｄａ）スペクトル（図５９Ｆ）に全く現れないことは注目に値し、これは、不飽和ＦＡに対するＰＢ反応によるタギングが高い選択性であることの証拠である。
分析ワークフローにＭＳ／ＭＳを組み込むと、ＭＳのみの分析と比べて、不飽和ＦＡの検出および同定が、より高感度かつ特異的になる。図６０ＡおよびＢは、２μＬのラット全血サンプルを分析した場合のそのような比較を要約している。ＦＡ抽出物に対して２５倍希釈を行ったところ、ｍ／ｚ２５５および２８３などのＭＳスペクトルにおける最も大量のピークが、実際にバックグラウンドの化学的干渉に起因した（図６０Ａにおいて「＃」で注釈）。ｍ／ｚ２５３、２７９、２８１および３０３における低い強度ピークは、ＦＡ１６：１、１８：２、１８：１および２０：４と質量が一致したが、しかしながら、正確な質量測定がなければ、それらの同一性は疑わしかった。５８ＤａのＮＬＳを適用することによって、図６０Ｂに示されているように、タグ化されたＦＡ１６：１、１８：２および１８：１が明らかに特定された。そのタギングおよびデタギングのプロセスが不飽和ＦＡに特異的であるので、これらのＦＡに対する同一性の割り当てに対する信頼性は高い。
不飽和ＦＡに対する選択的検出の達成により、本発明者らは、定量分析へのその適用をさらに評価した。タギングは、ＰＢ反応におけるアセトンの量子収率によって制限されるので、ＭＵＦＡの場合、３０〜６０％収率でしか達成できない。この状況下において、比較的一定のタギング効率を維持することは、定量分析にとって重要である。図６１Ａは、ＦＡ１８：１（９Ｚ）と１７：１（１０Ｚ）との等モル混合物に対するインタクトなＦＡおよびタグ化されたＦＡの抽出イオンクロマトグラムを示している。両方のＦＡが、同様の動態で反応したことが明らかである：タギングは、３０秒間のＵＶ照射の間にプラトーに達し、タグ化されたＦＡシグナルは、分析時間中（１０〜２０分）、安定していた。興味深いことに、ＦＡ１７：１（１０Ｚ）は、ＦＡ１８：１（９Ｚ）（約５０％）よりもわずかに高い反応収率（約５８％）を有した。５８ＤａのＮＬＳ（図６１Ｂ）に基づき、ＦＡ１７：１（１０Ｚ）をＩＳ（７．５μＭ）として用いてＦＡ１８：１（９Ｚ）に対する検量線を得た。それは、優れた線形性（Ｒ２＝０．９９９９）と高感度の検出（検出限界、ＬＯＤ＝１５ｎＭ）の両方を示し、これは、従来のＧＣ−ＭＳ分析に匹敵する。良好な線形性および検出限界を有する検量線は、１６〜２４個の炭素のＭＵＦＡに対して一貫して得られた（表１１を参照のこと）。
ＦＡ１８：１のモル組成は、９１．５％オレイン酸および８．５％ｃｉｓ−バクセン酸であると予め定め、それを用いて、ＦＡ１８：１に対する検量線を作成するための標準液を調製した。ＦＡ１６：１、ＦＡ１８：１およびＦＡ１８：２に対する溶媒条件は、アセトン／Ｈ２Ｏ中の５％エタノールである。ＦＡ１８：２、１８：３および２０：４に対する溶媒条件：アセトン／Ｈ２Ｏ中の４０％エタノール。
アセトン／水（５０／５０、ｖ／ｖ）は、反応速度が速いことに起因して、ＭＵＦＡをタギングするための良好な反応溶媒系である。しかしながら、この条件は、ＰＵＦＡにおける複数のＣ＝Ｃを連続的にタグ化する。例えば、アラキドン酸（ＦＡ２０：４（５Ｚ、８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ））は、４つのＣ＝Ｃを有するので、図６１Ｃに示されているように、４つのアセトンタグ化生成物（ｍ／ｚ３６１、４１９、４７７、５３５）が形成され得る。しかしながら、この過剰な程度の反応は、構造同定にとって最も有用な、１つだけタグ化された生成物の量を減少させるので、望ましくない。さらに、副反応、例えば、Ｎｏｒｒｉｓｈ Ｔｙｐｅ Ｉ反応（ｍ／ｚ３４７．４、４０５．４、４６３．４、５１９．４のイオンを形成する）が、より競合的であると見出され、不飽和ＦＡの検出および定量を干渉した。エタノールは、電子的に励起されたアセトンの光還元によってＰＢ反応を減速させると示されている。本発明者らは、反応溶媒系へのエタノールの添加、すなわち、エタノール／アセトン／水（４０／３０／３０、ｖ／ｖ／ｖ）が、ＰＵＦＡに対して、単一のアセトンでタグ化された生成物を最大にすることを見出した。図６１Ｄに示されているように、ＦＡ２０：４の単一のアセトンでタグ化された生成物（ｍ／ｚ３６１）が、タグ化された全生成物の約８０％を占め、その絶対強度は、アセトン／水（５０／５０）を使用した図６１Ｃと比べて約５倍上昇した。この生成物（ｍ／ｚ３６１）のＭＳ２ＣＩＤは、主なタグロスおよびＰＵＦＡに対して共通して観察された小さな連続的な４４Ｄａロスを示した（図６６）。ＩＳとしてＦＡ１７：１（１０Ｚ）を用いたときのＦＡ２０：４の定量は、良好な線形性を有する５８ＤａのＮＬＳおよびエタノール／アセトン／水（４０／３０／３０、ｖ／ｖ／ｖ）の溶媒条件を用いて得られた８０ｎＭのＬＯＤで達成された。
哺乳動物のリピドームにおいて、多くの不飽和ＦＡは、Ｃ＝Ｃ位置の異性体の混合物として存在することから、Ｃ＝Ｃ位置の各異性体の定量を達成する強力な分析方法が必要とされる。光化学的タギングおよび５８ＤａのＮＬＳによって、Ｃ＝Ｃ位置の異性体の総量が、より高感度で定量できる。Ｃ＝Ｃ位置の異性体のモル比は、本発明者らが以前確立した方法を用いて、ＰＢ−ＭＳ／ＭＳデータからＣ＝Ｃ診断用イオン強度比を計測することによって得ることができる。次いで、各異性体に対する定量は、Ｃ＝Ｃ位置の異性体のモル比の情報と総量を組み合わせることによって、達成され得る。このアプローチは、ＦＡ１８：１ Δ９およびΔ１１異性体の一連の混合物に対して行われた実験で成功したと見出された。Ｃ＝Ｃ位置の異性体が、同じＣＩＤ条件下において種々の程度のタグロスを有し得ることは注目に値する。ゆえに、純粋な異性体に対する検量線は、互いに重なり合わない（図６８）。この現象は、ＦＡ Ｃ＝Ｃ位置の異性体の混合物の定量に対して良好な精度を達成するために、較正用溶液が、真のサンプルから検出されるものと同じ異性体組成を用いて調製されるべきであることを示唆している。
ヒト血漿中の不飽和ＦＡ分析
光化学的タギングに続く５８Ｄａ ＮＬＳの方法を、ヒト血漿（２０μＬ）におけるＦＡ分析に適用した。ＦＡ１７：１（１０Ｚ）（７．５μＭ）をＩＳとして抽出物に加えた。ナノＥＳＩ−ＭＳからのＦＡのプロファイルは、図５９Ｄに示され、一方、不飽和ＦＡのプロファイルは、５８ＤａのＮＬＳから見出すことができる（図５９Ｆ）。Ｃ＝Ｃの位置を決定するためおよびＣ＝Ｃ位置の任意の異性体の存在を判定するために、定量的研究の前に、ＰＢ−ＭＳ／ＭＳを各個別の不飽和ＦＡ（単一のアセトンでタグ化されたＦＡ）に適用した。本発明者らは、ＦＡ１６：１（９）、１８：２（９，１２）および２０：４（５，８，１１，１４）が、純粋な形態として存在することを見出した（ここで、括弧内の数字はＣ＝Ｃの位置を示している）。次いで、これらのＦＡの定量を５８Ｄａ ＮＬＳから得、以下のとおり測定された：２８．９±１．６μＭのＦＡ１６：１、１９３±２０μＭのＦＡ１８：２および１８．２±２．３μＭのＦＡ２０：４（図６９）。ＰＢ−ＭＳ／ＭＳは、ＦＡ１８：１およびＦＡ１８：３が、Ｃ＝Ｃ位置の異性体からなることを明らかにした。図６２Ａに示されているように、タグ化されたＦＡ１８：１（ｍ／ｚ３３９）のＭＳ／ＭＳ ＣＩＤが、ｍ／ｚ１７１、１９７およびｍ／ｚ１９９、２２５に２対の診断用イオンを生成した。これらの診断用イオンの検出は、それぞれΔ９およびΔ１１におけるＣ＝Ｃ位置の異性体の存在を明らかに示唆した。それらの２つの異性体のＣ＝Ｃ診断用イオン強度比（Δ１１／Δ９＝０．０６６２）および確立されたモル比検量線（図６２Ｂ）に基づいて、ＦＡ１８：１は、９１．５％Δ９および８．５％Δ１１異性体からなると見出された。
同じ組成のＣ＝Ｃ位置の異性体からなるが総濃度が異なる較正用溶液のセットを調製し、図６２Ｃに示されているような５８Ｄａ ＮＬＳの検量線の作成に使用した。ＦＡ１８：１の総濃度は、２７６±３６μＭであると見出され、これは、２５３±３３μＭ Δ９異性体および２３±３μＭ Δ１１異性体に対応する。ＰＢ−ＭＳ／ＭＳは、ＦＡ１８：３が、ω−３（Δ９、１２、１５にＣ＝Ｃ）およびω−６（Δ６、９、１２にＣ＝Ｃ）異性体の混合物であることを示した（図７０）。ヒト血漿中の存在量が比較的少ないこと（７．５±１．５μＭ）によって制限されるので、これらの２つの異性体間のモル比を正確に測定することは困難だった。それにもかかわらず、ＦＡ１８：３ ω−３およびω−６標準物質の１：１（モル比）混合物から観察されたＣ＝Ｃ診断用イオン（図６２Ｄ）をヒト血漿由来のもの（図６２Ｅ）と比較することによって、ω−３異性体が、ω−６異性体よりも大量に存在することが見出された（図７１）。この知見は、文献における以前の報告と一致する。
ヒト血漿中の不飽和ＦＡの主要６種の定量的データを図６３Ａに要約する。文献に報告された電荷スイッチ法を、相互検証のために、同じセットのヒト血漿サンプルにも適用した。これらの２つの方法は、１０％以内の相対誤差で一致した定量測定値を提供した（図７２）。しかしながら、オンライン光化学的タギングと５８Ｄａ ＮＬＳとを連結した方法は、不飽和ＦＡおよびそれらのＣ＝Ｃ位置の異性体を高い信頼性で同定および定量できるという明確な利点を提供した。例えば、ＦＡ１８：１ Ｃ＝Ｃ位置の異性体は、ＦＡ１８：１におけるΔ１１異性体の濃度が比較的低いこと（＜１０％）におそらく起因して、電荷スイッチ法によって報告されなかった。
正常および癌性ヒト前立腺細胞における不飽和ＦＡの定量
癌生物学の研究を助けるために、脂肪酸などの代謝産物の変化の定量的モニタリングが、ますます用いられる。ＦＡのプロファイルは、細胞代謝の変化に起因して、正常細胞から癌（ｃａｎｃｅｌ）細胞に有意に変化することが示された。しかしながら、不飽和ＦＡの同一性は、代表的には、Ｃ＝Ｃの位置特異性のレベルで測定されない；ゆえに、異性体における個々のＣ＝Ｃの位置の変化は、未知である。光化学的タギングに続く５８Ｄａ ＮＬＳという本発明者らの方法を用いることによって、不飽和ＦＡに対して高い分子特異性で定量することが可能であった。正常ヒト前立腺細胞（ＲＷＰＥ１）および癌性ヒト前立腺細胞（ＰＣ３細胞）を比較研究のためのモデル系として使用した。主要なＦＡ種は、ＦＡ１６：０、１６：１、１８：０、１８：１および１８：２を含むと見出された（図７３に要約された２つの細胞株のＦＡプロファイル）。ＦＡ１６：１およびＦＡ１８：２は、本発明者らの方法を用いて純粋であると判定され、両方の細胞株でＣ＝Ｃが、それぞれΔ９およびΔ９、１２に位置し、ＦＡ１８：１は、Δ９およびΔ１１異性体からなった（図７４）。
不飽和ＦＡ（１６：１、１８：１および１８：２）の量の有意な増加が、前立腺癌細胞において検出され（ＰＣ３、図６３Ｂ）、文献の報告と一致した。詳細には、両方の細胞株における最も大量の不飽和ＦＡ種として、ＰＣ３細胞におけるＦＡ１８：１の総量は、ＲＷＰＥ１細胞における総量の６．０±１．７倍である（図６３Ｃ）。ＦＡ１６：１およびＦＡ１８：２も、それぞれ、ＲＷＰＥ１細胞と比べてＰＣ３細胞において３．４±０．５および３．７±０．７倍増加した。興味深いことに、ＦＡ１８：１のΔ９およびΔ１１異性体の絶対量は、両方ともＰＣ３細胞において増加したが、ＦＡ１８：１におけるΔ１１異性体の相対的寄与は、低下した。図６３Ｂの挿入図の円グラフに示されているように、Δ１１異性体の％組成は、ＲＷＰＥ１細胞における４８．０±１．３％から、ＰＣ３細胞における３１．０±０．９％に低下した。ＦＡ１８：１のΔ９およびΔ１１異性体は、ＦＡ１６：０（パルミチン酸）からではあるが、鎖の伸長と不飽和化が逆の順序で、生合成される。正常から癌性前立腺癌細胞へのＦＡ１８：１ Ｃ＝Ｃ位置の異性体の絶対量と相対濃度の両方の有意な変化は、２つの細胞株間のＦＡ１８：１の生合成経路または代謝経路の変化を示唆する。
溶液中での光化学的タギングとオンラインタンデムＭＳ（５８Ｄａ ＬＳ）との組み合わせを利用して、不飽和ＦＡおよびそれらのＣ＝Ｃ位置の異性体の迅速かつ高感度の定量を可能にする新しい方法が開発される。この方法は、生物学的サンプル由来の複雑なＦＡ混合物を分析するためのショットガンリピドミクスのワークフローに適合する。この方法を用いて、不飽和ＦＡの定量が、従来のＧＣ−ＭＳ法および電荷スイッチ誘導体化法に匹敵する性能で、ヒト血漿およびヒト細胞株に対して達成された。より重要なことには、ここで、ＦＡ Ｃ＝Ｃ位置の異性体分析は、高い信頼性で行うことができる。ここで、不飽和ＦＡ異性体の組成および相対的存在量などの情報は、それぞれＦＡ１８：１およびＦＡ１８：３ ω−３／ω−６を用いて実証されるように、生物学的研究のために容易に入手可能であり得る。疾患研究のためのこの方法の適用は、脂質バイオマーカーの発見に至り得る、ＦＡ異性体を制御する生物学的プロセスの別のレベルの理解をもたらすと予想される。
脂肪酸標準物質、ラット全血およびヒト血漿サンプルを、商業的供給業者から購入した。ＦＡの抽出は、ＬＩＰＩＤ−ＭＡＰＳプロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｐｉｄｍａｐｓ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ＰＰ００００００５３０１．ｐｄｆ）に従って行った。２５４ｎｍにおける主要な発光バンドを有する低圧水銀ランプをナノＥＳＩエミッターから１．０ｃｍ離して置いて、光化学反応を惹起した。すべてのＭＳ実験を４０００ＱＴＲＡＰ三連四重極／リニアイオントラップ質量分析計（Ｓｃｉｅｘ）において行った。
化学物質および材料
すべてのＦＡおよびジュウテリウムで標識されたＦＡ標準物質をＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）から購入し、さらに精製せずに使用した。プールされたヒト血漿（抗凝固薬としてＬｉヘパリン）をＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｎｏｖｉ，ＭＩ）から購入した。他の化学物質は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
細胞培養
すべての細胞を、３７℃の湿度恒温器内において５％ＣＯ２供給で培養した。前立腺癌ＰＣ３細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンが補充されたＦ−１２Ｋ培地中で維持した。正常な前立腺上皮ＲＷＰＥ１細胞を、３０μｇ／ｍｌウシ下垂体抽出物および０．２ｎｇ／ｍｌヒト組換え上皮成長因子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が補充されたケラチノサイト無血清培地中で培養した。
ヒト血漿およびヒト細胞からＦＡを抽出するためのプロトコル
以下の方法を用いて、ヒト血漿からＦＡを抽出した。
１６ｍｍ×１２５ｍｍガラス管内の２０μＬのヒト血漿に３０μＬのｄＰＢＳを加えた後、６０μＬのメタノールを加える。次いで、その混合物を、２５ｍＭの最終濃度に達するように１Ｍ ＨＣｌで酸性化する。
０．１ｍＬのイソオクタンを加えた後、サンプルをボルテックスし、３０００ｇで１分間遠心して、層を分離する。上層を取り出し、１０ｍｍ×７５ｍｍガラス管に移す。
工程２を一度繰り返す。
有機層を合わせる。抽出物を減圧下でまたは窒素流を用いて乾燥させる。
以下の方法を用いて、細胞からＦＡを抽出した：
１６ｍｍ×１２５ｍｍガラス管内の１ｍＬのＨ２Ｏ中の５００万個の細胞を３０００ｒｐｍで２分間遠心した後、上層の水層を廃棄した。
細胞に３００μＬのｄＰＢＳを加えた後、６００μＬのメタノールを加えた。細胞懸濁液を、２５ｍＭの最終濃度に達するようにＨＣｌで酸性化した。
１ｍＬのイソオクタン（２，２，４−トリメチルペンタン）を加えた後、サンプルをボルテックスし、３０００ｇで１分間遠心して、層を分離した。上層を取り出し、１０ｍｍ×７５ｍｍガラス管に移した。
工程３を繰り返す。
有機層を合わせる。抽出物を減圧下または窒素流下で乾燥させる。
光化学的タギングおよびタンデムＭＳ分析
定量に向けて、ＭＳ分析の前に、ＭＵＦＡをアセトン／水（５０／５０ｖ／ｖ）中の５％エタノールに溶解し、一方、ＰＵＦＡをアセトン／水（５０／５０ｖ／ｖ）中の４０％エタノールに溶解した。ネガティブモードナノＥＳＩ−ＭＳによるＦＡの検出を容易にするために、０．５％（ｖ／ｖ）ＮＨ４ＯＨ（ＮＨ３として２８％〜３０％）をすべてのＦＡ溶液に加えた。ホウケイ酸ガラスキャピラリーチップ（外径１．５ｍｍおよび内径０．８６ｍｍ）を用いて、Ｐ−１０００ Ｆｌａｍｉｎｇ／Ｂｒｏｗｎマイクロピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって、外径が約１０μｍのナノＥＳＩチップを引き延ばして作製した。そのホウケイ酸ガラスチップの後ろの開口部から脂質溶液を充填した。電気接点として働くそのチップにステンレス鋼ワイヤを挿入し、ナノＥＳＩチップをＭＳサンプリングオリフィスと整列させた。ＰＢ反応１を介した光化学的タギングを惹起するために、低圧水銀（ＬＰ−Ｈｇ）ランプ（２５４ｎｍ，Ｍｏｄｅｌ Ｎｏ．：８０−１０５７−０１，ＢＨＫ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）をナノＥＳＩエミッターから１．０ｃｍに配置した。すべてのＭＳ実験を４０００ＱＴＲＡＰ三連四重極／リニアイオントラップ（ＬＩＴ）ハイブリッド質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｓｃｉｅｘ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）において行い、その概略図を図６４に示す。機器のパラメータは、以下のとおりであった：ＥＳＩ電圧、−１２００〜１８００Ｖ；カーテンガス、１０ｐｓｉ；インターフェースヒーター温度、４０℃；デクラスタリング電位：−２０Ｖ。選択されたＰＢ反応生成物のＭＳ／ＭＳ分析のために、単離幅を１．５Ｔｈに設定し、プリカーサー強度をおよそ４×１０６カウントで維持した。イオン注入時間は、１０〜２００ミリ秒であった。ＦＡのＰＢ反応生成物のために使用した衝突エネルギー（ＣＥ）は、３５Ｖ（ビーム型ＣＩＤ）または５０ａ．ｕ．（共鳴トラップＣＩＤ）であるように最適化された。ニュートラルロススキャン（ＮＬＳ）の場合、３５ＶのＣＥを使用した。
ヒト血漿中の遊離ＦＡの分析
図６５に示すスキームに従って、ＦＡ抽出効率を推定した（同位体で標識された内部標準を用いて）。結果を表１２に示す。
図６６に示されているように、ＰＵＦＡのタギングの条件を最適化した。ＦＡ Ｃ＝Ｃ異性体組成を以下のとおり測定した。診断用イオンの質量電荷比を用いることにより、各ＦＡ Ｃ＝Ｃ異性体におけるＣ＝Ｃの位置を正確に決定することができる。さらに、本発明者らの最近の研究は、診断用イオンの総強度を用いることによっても、脂質Ｃ＝Ｃ異性体を定量することができることを示した２。図６６は、プールされたヒト血漿中のＦＡ１８：１のＰＢ生成物のＣＩＤ質量スペクトル（ｍ／ｚ３３９．３）を示しており、２対の診断用イオン（ｍ／ｚ１７１、１９７およびｍ／ｚ１９９、２２５）が、２つのＦＡ１８：１Ｃ＝Ｃ異性体（Δ９およびΔ１１）の存在を明らかに示唆する。２対の診断用イオン間の比を検量線に入力することによって（図６６における挿入図）、本発明者らは、プールされたヒト血漿中のＦＡ１８：１が、９１．５％のΔ９異性体および８．５％のΔ１１異性体からなることを明らかにした。
低存在比のＰＵＦＡおよびそれらの異性体を、図６９〜７２に示されているように定量した。
ＦＡの電荷スイッチ（ｃｈａｒｇｅｄ−ｓｗｉｔｃｈｅｄ）ＡＭＰＰ誘導体化によって、相互検証を行った。ＡＭＰＰ誘導体化は、脂肪酸に対する検出感度を改善するための効果的な方法として開発された。この研究において、本発明者らは、このストラテジーをヒト血漿中の脂肪酸の定量のために用いて、内部標準としてリノール酸−ｄ１１およびオレイン酸−ｄ１７を使用して、開発されたＰＢ／ＮＬＳ法を検証した。アイソトポログ（ｉｓｏｔｏｐｏｌｏｇｕｅ）は、対応する脂肪酸と同じイオン化効率を有する。誘導体化の後、すべての脂肪酸および内部標準を、ポジティブナノＥＳＩ−ＭＳによって高感度で検出でき、ＡＭＰＰによって誘導体化された各脂肪酸は、ＣＩＤにおいてｍ／ｚ１８３．３に特徴的なイオンを生成する（図７０）。プリカーサーイオンスキャン（ＰＩＳ）スペクトルにおいて脂肪酸と対応するアイソトポログとの間のピーク比を比較することによって、ヒト血漿中のＦＡ１８：１およびＦＡ１８：２の濃度が、２５４μＭおよび１８０μＭであると測定され、ＰＢ／ＮＬＳ法によって得られた結果（２７６．４±３５．６μＭおよび１９３．３±２０．３μＭ）と一致した。
図７３および７４に示されているように、正常前立腺細胞および癌性前立腺細胞における不飽和ＦＡを分析した。

Claims (10)

  1. 組織サンプルを分析するための方法であって、該方法は、
    ホスホコリンおよび脂肪酸を含む組織サンプルを得る工程；
    該ホスホコリンおよび脂肪酸のそれぞれの炭素−炭素二重結合を標的にするラジカル反応を該組織サンプルにおいて行うことにより、複数のホスホコリンおよび脂肪酸の異性体を生成する工程；
    該複数のホスホコリンおよび脂肪酸の異性体を質量分析に供する工程であって、該ホスホコリンおよび脂肪酸のそれぞれの該炭素−炭素二重結合の位置を特定する工程；および
    正常組織と罹患組織とを識別するために該複数のホスホコリンおよび脂肪酸の異性体を定量する工程
    を含む、方法。
  2. 前記罹患組織が、癌性組織である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ラジカル反応が、前記ホスホコリン、脂肪酸および該ラジカル反応用の試薬を紫外線に曝露する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ホスホコリンおよび脂肪酸が質量分析プローブ内に存在している間に、前記ラジカル反応が行われる、請求項３に記載の方法。
  5. 前記質量分析プローブの少なくとも一部が紫外線に対して透過性である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記質量分析プローブが、およそ２００ｎｍの波長の紫外線に対して透過性である材料から構成される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ラジカル反応が容器内で行われ、該反応の後、前記ホスホコリンおよび脂肪酸の異性体が質量分析プローブに移される、請求項３に記載の方法。
  8. 前記ラジカル反応が、高圧液体クロマトグラフィーシステムと関連して行われ、該ラジカル反応用の試薬が、溶出溶媒中に存在する、請求項１に記載の方法。
  9. 前記ラジカル反応が、パターノ・ビューチ（ＰＢ）反応である、請求項１に記載の方法。
  10. 前記パターノ・ビューチ（ＰＢ）反応が、アセトンを含む溶媒混合物中で行われる、請求項８に記載の方法。
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