JP2021000096A - ヒト化ｔ細胞補助受容体を発現するマウス - Google Patents

Abstract

【課題】ヒト化Ｔ細胞補助受容体を発現するマウスを提供すること。【解決手段】本発明は、キメラヒト／非ヒトＴ細胞補助受容体ポリペプチド（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β）を発現する遺伝子改変非ヒト動物、ならびに当該ポリペプチドを含む胚、細胞、および組織を提供する。前記遺伝子改変動物を作出するための構築物およびそれを作出する方法も提供される。種々の実施形態では、本明細書では、キメラヒト／非ヒトＴ細胞補助受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変非ヒト動物が提供される。【選択図】なし

Description

関連出願との相互参照
本出願は、２０１３年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／８９０，９１５号および２０１３年２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／７６６，７６２号に対する利益を、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． §１１９（ｅ）の下に主張し、これらの出願はその全体が参考として本明細書に援用される。

配列表
本明細書では、２０１４年２月２０日に「２０１０７９４−０４４１＿ＳＴ２５」という名称のａｓｃｉｉ．ｔｘｔファイルとして電子形式で提出された配列表に言及する。この．ｔｘｔファイルは２０１４年２月１３日に作成されたものであり、サイズは４７ｋｂである。

発明の分野
本発明は、ヒト化Ｔ細胞補助受容体を発現するように遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えばマウスまたはラット）に関する。本発明は、ヒト化ＣＤ４またはＣＤ８補助受容体を発現するように遺伝子操作された非ヒト動物、ならびに当該補助受容体を発現する胚、組織、および細胞に関する。本発明は、さらに、ヒト化ＣＤ４補助受容体およびヒト化主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）ＩＩを同時発現するように工学的に操作された非ヒト動物に関する。本発明は、さらに、ヒト化ＣＤ８補助受容体およびヒト化ＭＨＣ Ｉを同時発現するように工学的に操作された非ヒト動物に関する。ヒト化Ｔ細胞補助受容体（例えば、ヒト化ＣＤ４またはＣＤ８）を発現する遺伝子操作された動物を作出するための方法も提供される。ヒト治療薬を開発するためにヒト化Ｔ細胞補助受容体を発現する遺伝子操作された動物を使用するための方法も提供される。

発明の背景
適応免疫応答では、外来抗原がＢリンパ球上の受容体分子（例えば、免疫グロブリン）およびＴリンパ球上の受容体分子（例えばＴ細胞受容体すなわちＴＣＲ）によって認識される。これらの外来抗原は、一般的に主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と称される特殊化されたタンパク質によって、細胞の表面上にペプチド断片として提示される。Ｔ細胞媒介性応答の間、ＭＨＣ分子により提示される抗原はＴ細胞受容体によって認識される。しかし、有効な免疫応答のためには、ＭＨＣ−抗原複合体のＴ細胞受容体認識を超えるものが必要である。Ｔ細胞補助受容体分子（例えば、ＣＤ４またはＣＤ８）がＭＨＣの不変部分に結合することも必要である。

Ｔ細胞にはヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞を含めたいくつかの種類がある。ヘルパーＴ細胞は補助受容体ＣＤ４を発現し、そしてＭＨＣ ＩＩ分子に結合した抗原を認識する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、免疫系における他のエフェクター細胞を活性化する、例えば、ＭＨＣ ＩＩ発現Ｂ細胞を活性化して抗体を産生させる、ＭＨＣ ＩＩ発現マクロファージを活性化して病原体を破壊するなどである。ＣＤ４およびＴ細胞受容体の同じＭＨＣ
ＩＩに提示された外来抗原への結合により、その抗原に対するＴ細胞の感受性が著しく高くなる。

対照的に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、補助受容体ＣＤ８を発現し、ＭＨＣ Ｉ分子に結合した外来抗原を認識する。ＣＴＬは、それ自体の膜に結合したＴＣＲによって認識されるＭＨＣ Ｉ結合ペプチドを担持するいかなる細胞をも死滅させるように特殊化されている。細胞により通常は存在しない細胞タンパク質に由来するペプチド（例えば、ウイルス、腫瘍、または他の非自己起源のもの）がディスプレイされる場合、そのようなペプチドはＣＴＬによって認識され、それによりＣＴＬが活性化し、そのペプチドをディスプレイしている細胞を死滅させる。ＣＤ４と同様に、ＣＤ８の会合により、ＭＨＣ Ｉに提示された抗原に対するＣＴＬの感受性がより高くなる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
キメラヒト／非ヒトＴ細胞補助受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
該キメラポリペプチドの非ヒト部分が、非ヒトＴ細胞補助受容体の少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、遺伝子改変非ヒト動物であって、
キメラＴ細胞補助受容体ポリペプチドを発現する非ヒト動物。
（項目２）
前記ヌクレオチド配列が内在性Ｔ細胞補助受容体遺伝子座に存在する、項目１に記載の動物。
（項目３）
内在性遺伝子座に由来する機能的な内在性非ヒトＴ細胞補助受容体を発現しない、項目１に記載の動物。
（項目４）
前記キメラＴ細胞補助受容体ポリペプチドが前記非ヒト動物のＢ細胞上で発現されない、項目１に記載の動物。
（項目５）
前記Ｔ細胞補助受容体遺伝子座がＣＤ４遺伝子座であり、前記Ｔ細胞補助受容体ポリペプチドがＣＤ４である、項目１に記載の動物。
（項目６）
前記キメラＣＤ４ポリペプチドがＢ細胞またはＣＤ８系列のＴ細胞上で発現されない、項目５に記載の動物。
（項目７）
前記キメラＴ細胞補助受容体遺伝子座がＣＤ８遺伝子座であり、前記Ｔ細胞補助受容体ポリペプチドがＣＤ８α、ＣＤ８β、またはこれらの組合せから選択されるＣＤ８ポリペプチドである、項目１に記載の動物。
（項目８）
ＣＤ８αポリペプチドおよびＣＤ８βポリペプチドを含むキメラヒト／非ヒトＣＤ８タンパク質を発現する、項目７に記載の動物。
（項目９）
前記キメラＣＤ８タンパク質がＢ細胞またはＣＤ４系列のＴ細胞上で発現されない、項目８に記載の動物。
（項目１０）
げっ歯類である、項目１に記載の動物。
（項目１１）
マウスである、項目１０に記載の動物。
（項目１２）
キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
前記キメラポリペプチドのヒト部分が、図１に記載されているヒトＣＤ４ポリペプチドのドメインを少なくとも含み、
前記キメラポリペプチドのマウス部分が、マウスＣＤ４ポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、遺伝子改変マウスであって、
キメラヒト／マウスＣＤ４を発現するマウス。
（項目１３）
前記ヒト部分が、前記ヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外ドメインを含む、項目１２に記載のマウス。
（項目１４）
前記ヌクレオチド配列が内在性ＣＤ４遺伝子座に存在する、項目１２に記載のマウス。（項目１５）
内在性マウスＣＤ４遺伝子座に由来する機能的な内在性マウスＣＤ４を発現しない、項目１２に記載のマウス。
（項目１６）
前記ヌクレオチド配列がマウスプロモーター配列および調節配列に作動可能に連結している、項目１２に記載のマウス。
（項目１７）
前記キメラＣＤ４タンパク質がＢ細胞またはＣＤ８系列のＴ細胞上で発現されない、項目１２に記載のマウス。
（項目１８）
ヒトまたはヒト化ＭＨＣ ＩＩタンパク質をさらに含み、該ＭＨＣ ＩＩタンパク質が、ヒトＭＨＣ ＩＩαポリペプチドの細胞外ドメインおよびヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチドの細胞外ドメインを含む、項目１２に記載のマウス。
（項目１９）
前記ヌクレオチド配列が前記マウスの生殖細胞系列に含まれる、項目１２に記載のマウス。
（項目２０）
マウスのＣＤ４遺伝子座を、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドを発現するように改変する方法であって、マウスの内在性ＣＤ４遺伝子座において、内在性マウスＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をキメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換えるステップを含む方法。
（項目２１）
前記キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドのヒト部分が、図１に記載されているヒトＣＤ４ポリペプチドのドメインを少なくとも含み、内在性マウスＣＤ４ポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記ヒト部分が、前記ヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外ドメインを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
キメラヒト／マウスＣＤ８αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／マウスＣＤ８βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、該第１のヌクレオチド配列が、ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外ドメインならびにマウスＣＤ８αポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列を含み、
該第２のヌクレオチド配列が、ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外ドメインならびにマウスＣＤ８βポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列を含む、遺伝子改変マウスであって、
キメラヒト／マウスＣＤ８タンパク質を発現するマウス。
（項目２４）
前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列が、それぞれ内在性ＣＤ８α遺伝子座および内在性ＣＤ８β遺伝子座に存在する、項目２３に記載のマウス。
（項目２５）
内在性ＣＤ８遺伝子座に由来する機能的な内在性ＣＤ８タンパク質を発現しない、項目２３に記載のマウス。
（項目２６）
前記キメラヒト／マウスＣＤ８タンパク質がＢ細胞またはＣＤ４系列のＴ細胞上で発現されない、項目２３に記載のマウス。
（項目２７）
前記第１のヌクレオチド配列がマウスＣＤ８αプロモーター配列および調節配列に作動可能に連結しており、前記第２のヌクレオチド配列がマウスＣＤ８βプロモーター配列および調節配列に作動可能に連結している、項目２３に記載のマウス。
（項目２８）
ヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉポリペプチドをさらに含み、該ＭＨＣ ＩポリペプチドがヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドの細胞外ドメインを含む、項目２３に記載のマウス。
（項目２９）
ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをさらに含む、項目２８に記載のマウス。
（項目３０）
前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列が前記マウスの生殖細胞系列に含まれる、項目２３に記載のマウス。
（項目３１）
マウスのＣＤ８遺伝子座を、キメラヒト／マウスＣＤ８ポリペプチドを発現するように改変する方法であって、マウスの内在性ＣＤ８遺伝子座において、内在性マウスＣＤ８ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をキメラヒト／マウスＣＤ８ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換えるステップを含む方法。
（項目３２）
前記ＣＤ８ポリペプチドがＣＤ８α、ＣＤ８β、またはこれらの組合せから選択される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記キメラヒト／マウスＣＤ８ポリペプチドが、ヒトＣＤ８ポリペプチドの細胞外ドメインならびに内在性マウスＣＤ８ポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
キメラヒト／マウスＣＤ８αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
該キメラヒト／マウスＣＤ８αポリペプチドが、ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外ドメインならびにマウスＣＤ８αポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、遺伝子操作されたマウスであって、
キメラヒト／マウスＣＤ８αポリペプチドを発現するマウス。
（項目３５）
前記ヌクレオチド配列が内在性マウスＣＤ８遺伝子座に存在する、項目３４に記載のマウス。
（項目３６）
内在性ＣＤ８遺伝子座に由来する機能的な内在性ＣＤ８αポリペプチドを発現しない、項目３４に記載のマウス。
（項目３７）
前記ヌクレオチド配列がマウスＣＤ８αプロモーター配列および調節配列に作動可能に連結している、項目３４に記載のマウス。
（項目３８）
キメラヒト／マウスＣＤ８βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
該キメラヒト／マウスＣＤ８βポリペプチドが、ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外ドメインならびにマウスＣＤ８βポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、遺伝子操作されたマウスであって、
キメラヒト／マウスＣＤ８βポリペプチドを発現するマウス。
（項目３９）
前記ヌクレオチド配列が内在性マウスＣＤ８遺伝子座に存在する、項目３８に記載のマウス。
（項目４０）
内在性ＣＤ８遺伝子座に由来する機能的な内在性ＣＤ８βポリペプチドを発現しない、項目３８に記載のマウス。
（項目４１）
前記ヌクレオチド配列がマウスＣＤ８βプロモーター配列および調節配列に作動可能に連結している、項目３８に記載のマウス。

寛容機構に起因して、全ての抗原によりＴ細胞活性化が惹起されるとは限らない。しかし、いくつかの疾患（例えば、がん、自己免疫疾患）では、自己タンパク質に由来するペプチドは免疫系の細胞構成成分の標的になり、それにより、そのようなペプチドを提示している細胞の破壊がもたらされる。臨床的に重要な抗原（例えば、種々の型のがんに関連する抗原）の認識に関しては著しく前進している。しかし、ヒトＴ細胞における適切な応答を惹起するペプチドの同定および選択を改善するためには、特に臨床的に重要な抗原のペプチドに関しては、依然として、ヒト免疫系の態様を模倣するｉｎ ｖｉｖｏ系およびｉｎ ｖｉｔｒｏ系が必要である。したがって、ヒト免疫系の構成成分をディスプレイすることができる生物系（例えば、遺伝子改変非ヒト動物および細胞）が必要とされている。

細胞性免疫応答において機能するヒトまたはヒト化分子を発現する非ヒト細胞を含む非ヒト動物が提供される。ヒトまたはヒト化Ｔ細胞補助受容体（例えば、ＣＤ４および／またはＣＤ８）タンパク質をコードするヒト化げっ歯類遺伝子座も提供される。ヒトまたはヒト化Ｔ細胞補助受容体（例えば、ＣＤ４および／またはＣＤ８）タンパク質を発現するヒト化げっ歯類細胞も提供される。１種または複数種のヒトまたはヒト化免疫系分子を発現するヒト化げっ歯類細胞を含むｉｎ ｖｉｖｏ系およびｉｎ ｖｉｔｒｏ系が提供される。

本明細書では、ゲノム内にヒトまたはヒト化Ｔ細胞補助受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変非ヒト動物が提供される。種々の実施形態では、本明細書では、キメラヒト／非ヒトＴ細胞補助受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変非ヒト動物が提供される。一実施形態では、ヌクレオチド配列は内在性Ｔ細胞補助受容体遺伝子座に存在する。一実施形態では、キメラＴ細胞補助受容体ポリペプチドのヒト部分は、ヒトＴ細胞補助受容体の細胞外ドメインの全てまたは実質的に全てを含み、非ヒト動物は機能的なキメラＴ細胞補助受容体ポリペプチドを発現する。一実施形態では、キメラＴ細胞補助受容体ポリペプチドの非ヒト部分は、非ヒトＴ細胞補助受容体の少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、非ヒト動物は機能的なキメラＴ細胞補助受容体ポリペプチドを発現する。本発明の一態様では、キメラＴ細胞補助受容体ポリペプチドは非ヒト動物のＴ細胞上にのみ発現し、例えば、非ヒト動物のＢ細胞上で発現されない。一態様では、動物は、その内在性非ヒトＴ細胞補助受容体遺伝子座に由来する機能的な非ヒトＴ細胞補助受容体を発現しない。本発明の一態様では、キメラＴ細胞補助受容体ポリペプチドは、非ヒト動物の生殖細胞系列に含まれる。一態様では、動物は、内在性Ｔ細胞補助受容体遺伝子座にキメラＴ細胞補助受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つまたは２つのコピーを含み、したがって、動物は、キメラＴ細胞補助受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列についてヘテロ接合性であってもホモ接合性であってもよい。

一実施形態では、Ｔ細胞補助受容体はＣＤ４である。したがって、一態様では、本発明は、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変非ヒト動物を提供する。一実施形態では、ヌクレオチド配列は内在性ＣＤ４遺伝子座に存在する。一実施形態では、動物は、げっ歯類、例えばマウスまたはラットである。したがって、一実施形態では、内在性ＣＤ４遺伝子座にキメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、当該キメラＣＤ４ポリペプチドのヒト部分がヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外ドメインの全てまたは実質的に全てを含み、当該キメラＣＤ４ポリペプチドのマウス部分がマウスＣＤ４ポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、遺伝子改変マウスであって、機能的なキメラヒト／マウスＣＤ４を発現するマウスが提供される。一実施形態では、本明細書では、内在性ＣＤ４遺伝子座にキメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、当該キメラポリペプチドのヒト部分がヒトＣＤ４ポリペプチドのドメインＤ１〜Ｄ３の全てまたは実質的に全てを少なくとも含み、当該キメラポリペプチドのマウス部分がマウスＣＤ４の少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、遺伝子改変マウスであって、機能的なキメラヒト／マウスＣＤ４を発現するマウスが提供される。一態様では、マウスは、その内在性マウスＣＤ４遺伝子座に由来する機能的な内在性マウスＣＤ４を発現しない。一実施形態では、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、内在性マウスプロモーター配列および調節配列に作動可能に連結している。したがって、一実施形態では、マウスは、Ｂ細胞またはＣＤ８系列のＴ細胞上でキメラＣＤ４タンパク質を発現しない。一実施形態では、キメラＣＤ４タンパク質のヒト部分は、配列番号５７に記載のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドは配列番号４に記載されている。

一態様では、本明細書に記載のキメラＣＤ４ポリペプチドを含む遺伝子改変非ヒト動物、例えば遺伝子改変マウスは、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ ＩＩタンパク質をさらに含み、ＭＨＣ ＩＩタンパク質は、ヒトＭＨＣ ＩＩαポリペプチドの細胞外ドメインおよびヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチドの細胞外ドメインを含む。一態様では、動物は、ヒト化ＭＨＣ ＩＩタンパク質を含む。一実施形態では、動物はマウスであり、マウスは、内在性ＭＨＣ ＩＩ遺伝子座に、（１）キメラヒト／マウスＭＨＣ ＩＩαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、このＭＨＣ ＩＩαポリペプチドのヒト部分が、ヒトＭＨＣ ＩＩαの細胞外ドメインならびに内在性マウスＭＨＣ ＩＩαポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むヌクレオチド配列、および（２）キメラヒト／マウスＭＨＣ ＩＩβポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、このＭＨＣ
ＩＩβポリペプチドのヒト部分が、ヒトＭＨＣ ＩＩβの細胞外ドメインならびに内在性マウスＭＨＣ ＩＩβポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むヌクレオチド配列を含む。キメラヒト／非ヒトＭＨＣ ＩＩ、例えばヒト／マウスＭＨＣ ＩＩをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む遺伝子改変非ヒト動物、例えばマウスは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／６６１，１１６号および同第１３／７９３，９３５号においてより詳細に記載されている。一実施形態では、ヒト化ＣＤ４および／またはＭＨＣ ＩＩタンパク質を発現する動物は、それぞれＣＤ４遺伝子座および／またはＭＨＣ ＩＩ遺伝子座における内在性非ヒト、例えばマウスＣＤ４遺伝子および／またはＭＨＣ ＩＩ遺伝子の一部を置き換えることによって作製される。

したがって、非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えばマウスのＣＤ４遺伝子座を、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドを発現するように改変する方法であって、内在性ＣＤ４遺伝子座において、内在性非ヒト、例えばマウスＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をキメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換えるステップを含む方法も提供される。一実施形態では、キメラヒト／非ヒト、例えば、ヒト／げっ歯類、例えば、ヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドは、ヒトＣＤ４ポリペプチドのドメインＤ１〜Ｄ３の全てまたは実質的に全てを少なくとも含み、内在性非ヒト、例えば、げっ歯類、例えばマウスＣＤ４ポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。一実施形態では、発現するキメラヒト／マウスＣＤ４は配列番号４に記載されている。

別の実施形態では、Ｔ細胞補助受容体はＣＤ８である。したがって、一態様では、本発明は、キメラヒト／非ヒトＣＤ８ポリペプチド、例えばキメラヒト／非ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む遺伝子改変非ヒト動物を提供する。一実施形態では、ヌクレオチド配列は内在性ＣＤ８遺伝子座に存在する。一実施形態では、動物は、げっ歯類、例えばマウスまたはラットである。したがって、一実施形態では、内在性ＣＤ８遺伝子座（例えば、内在性ＣＤ８αおよび／またはＣＤ８β遺伝子座）に、キメラヒト／マウスＣＤ８αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／マウスＣＤ８βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、この第１のヌクレオチド配列が、ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外ドメインの全てまたは実質的に全て、ならびにマウスＣＤ８αポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列を含み、この第２のヌクレオチド配列が、ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外ドメインの全てまたは実質的に全て、ならびにマウスＣＤ８βポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列を含む、遺伝子改変マウスであって、機能的なキメラヒト／マウスＣＤ８タンパク質を発現するマウスが提供される。一態様では、マウスは、その内在性マウスＣＤ８遺伝子座に由来する機能的な内在性マウスＣＤ８ポリペプチドを発現しない。一実施形態では、第１のヌクレオチド配列は内在性マウスＣＤ８αプロモーター配列および調節配列に作動可能に連結しており、第２のヌクレオチド配列は内在性マウスＣＤ８βプロモーター配列および調節配列に作動可能に連結している。したがって、一実施形態では、マウスは、Ｂ細胞またはＣＤ４系列のＴ細胞上でキメラＣＤ８タンパク質を発現しない。一実施形態では、キメラＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチドの免疫グロブリンＶ様ドメインを含む。一実施形態では、キメラヒト／マウスＣＤ８αポリペプチドのヒト部分は、配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、キメラヒト／マウスＣＤ８βポリペプチドのヒト部分は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、キメラヒト／マウスＣＤ８αポリペプチドは配列番号５４に記載されており、キメラヒト／マウスＣＤ８βポリペプチドは配列番号５３に記載されている。

一態様では、本明細書に記載のキメラＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチドを含む遺伝子改変非ヒト動物、例えば遺伝子改変マウスは、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉタンパク質をさらに含み、このＭＨＣ Ｉタンパク質は、ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドの細胞外ドメインを含む。一態様では、動物は、ヒト化ＭＨＣ Ｉ複合体を含む。したがって、動物は、ヒト化ＭＨＣ Ｉタンパク質およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを含み得る。一実施形態では、動物はマウスであり、このマウスは、内在性ＭＨＣ Ｉ遺伝子座にキメラヒト／マウスＭＨＣ Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ＭＨＣ Ｉポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドの細胞外ドメインならびに内在性マウスＭＨＣ Ｉポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、動物はまた、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座に、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列も含む。キメラヒト／非ヒト、例えば、ヒト／マウスＭＨＣ Ｉおよびβ２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む遺伝子改変非ヒト動物、例えばマウスは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／６６１，１５９号および同第１３／７９３，８１２号においてより詳細に記載されている。一実施形態では、ヒト化ＣＤ８、ＭＨＣ Ｉ、および／またはβ２ミクログロブリンタンパク質（複数可）を発現する動物は、それぞれＣＤ８遺伝子座、ＭＨＣ Ｉ遺伝子座および／またはβ２ミクログロブリン遺伝子座における内在性非ヒト、例えばマウスＣＤ８遺伝子、ＭＨＣ Ｉ遺伝子、および／またはβ２ミクログロブリン遺伝子の一部を置き換えることによって作製される。

したがって、非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えばマウスのＣＤ８遺伝子座を、キメラヒト／マウスＣＤ８ポリペプチドを発現するように改変する方法であって、内在性ＣＤ８遺伝子座において、内在性非ヒト、例えばマウスＣＤ８ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をキメラヒト／マウスＣＤ８ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換えるステップを含む方法も提供される。一態様では、ＣＤ８ポリペプチドは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、キメラヒト／非ヒト、例えば、ヒト／げっ歯類、例えば、ヒト／マウスＣＤ８ポリペプチド（ＣＤ８αおよび／またはＣＤ８β）は、ヒトＣＤ８ポリペプチドの細胞外ドメインの全てまたは実質的に全て、ならびに内在性非ヒト、例えば、げっ歯類、例えばマウスＣＤ８ポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。

本明細書では、本明細書に記載の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えばマウスまたはラット）に由来する細胞、例えばＴ細胞も提供される。本明細書に記載の非ヒト動物に由来する組織および胚も提供される。

そうではないと指定があるまたは文脈から明らかである場合を除き、本明細書に記載されている実施形態および態様はいずれも、互いと併せて使用することができる。以下の詳細な説明の検討から他の実施形態が当業者に明らかになるであろう。以下の詳細な説明は、本発明の種々の実施形態の例示的な表示を含み、これは特許請求された本発明を限定するものではない。添付図は本明細書の一部を構成し、その説明と共に、単に実施形態を例示するものとして機能し、本発明を限定するものではない。

図１は、ヒト化ＣＤ４遺伝子座を作製するための方法の図示（縮尺不定）である。シグナルペプチドのすぐ後ろから始まるマウスエクソン３〜６の配列を、まずシグナルペプチドの下流のヒトエクソン３の配列で置き換え（上）、その後、制限消化／ライゲーションによってヒトエクソン４〜６をヒトエクソン３の下流に挿入した。

図２は、ＷＴマウスまたはヒトＣＤ４についてヘテロ接合性であるマウス（１７６６ＨＥＴ）に由来する脾細胞の抗ヒトＣＤ４抗体および抗マウスＣＤ４抗体を用いたＦＡＣＳ分析（Ａ）；およびＷＴマウスに由来するＴ細胞と、１７６６ＨＥＴマウスに由来するＴ細胞と、ＪｕｒｋａｔヒトＣＤ４Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を示すグラフである。

図３は、マウスＣＤ８βエクソン２〜３をヒトＣＤ８βエクソン２〜３で置き換えることによってヒト化ＣＤ８ｂ遺伝子座（ＭＡＩＤ１７３７）を作製するための方法の図示（縮尺不定）である。マウスエクソン配列が黒塗りの四角で表されており、ヒトエクソン配列が斜線の入った四角で表されている。

図４は、マウスエクソン１およびエクソン２の一部を、エクソン１の開始点にあるマウスリーダー配列は保持しながらヒトエクソン２〜３で置き換えることによってヒト化ＣＤ８ａ遺伝子座（ＭＡＩＤ１７３８）を作製するための方法の図示（縮尺不定）である。マウスエクソン配列が黒塗りの四角で表されており、ヒトエクソン配列が斜線の入った四角で表されている。

図５は、ヒト化ＣＤ８ｂおよびＣＤ８ａ遺伝子をコードする配列を含むヒト化遺伝子座を作製するための逐次的なターゲティング方法の図示（縮尺不定）である。マウスエクソン配列が黒塗りの四角で表されており、ヒトエクソン配列が斜線の入った四角で表されている。

図６は、ＷＴマウス、または、選択カセットを除去した、ヒトＣＤ８ｂおよびＣＤ８ａの両方についてヘテロ接合性であるマウス（１７３９Ｈｅｔ、１７４０Ｈｅｔ）のいずれか由来の脾細胞のマウスＣＤ８ｂ抗体、マウスＣＤ８ａ抗体、ヒトＣＤ８ｂ抗体、またはヒトＣＤ８ａ抗体のいずれかを用いたＦＡＣＳ分析を示す図である。

図７は、ＷＴマウスまたは１７３９ＨＥＴ／１７４０ＨＥＴ（ＣＤ８ｂおよびＣＤ８ａの両方についてヘテロ接合性であるマウス）マウスのいずれかから得た胸腺細胞のマウスＣＤ８ｂ、マウスＣＤ８ａ、ヒトＣＤ８ｂ、ヒトＣＤ８ａ、またはＣＤ４のいずれかを用いたＦＡＣＳ分析を示すグラフである。

定義
本発明は、ヒト化Ｔ細胞補助受容体ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物（例えばマウス、ラット、ウサギなど）；当該ポリペプチドを含む胚、細胞、および組織；それらを作出する方法；ならびにそれらの使用方法を提供する。別段の定義のない限り、本明細書で使用される全ての用語および句は、それに反することが明示されているまたはその用語もしくは句が使用される文脈から明らかである場合を除き、その用語および句が当技術分野において得ている意味を包含する。

「保存的」という用語は、保存的アミノ酸置換について記載するために使用される場合、アミノ酸残基の、化学的性質（例えば、電荷または疎水性）が類似した側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基での置換を含む。保存的アミノ酸置換は、保存的置換をコードするヌクレオチドの変化が導入されるようにヌクレオチド配列を改変することによって実現することができる。一般に、保存的アミノ酸置換により、タンパク質の目的の機能的性質、例えば、ＣＤ４またはＣＤ８の、それぞれＭＨＣ ＩＩまたはＭＨＣ Ｉに結合する能力は実質的に変化せず、また、ＭＨＣに提示された抗原に対するＴＣＲの感度が増大する。化学的性質が類似した側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、脂肪族側鎖、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンなど；脂肪族ヒドロキシル側鎖、例えばセリンおよびトレオニンなど；アミドを含有する側鎖、例えばアスパラギンおよびグルタミンなど；芳香族側鎖、例えばフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンなど；塩基性側鎖、例えばリシン、アルギニン、およびヒスチジンなど；酸性側鎖、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸など、ならびに、硫黄を含有する側鎖、例えばシステインおよびメチオニンなどが挙げられる。保存的アミノ酸置換群としては、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リシン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが挙げられる。一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えばアラニンスキャニング変異誘発で使用されるように、タンパク質内の任意のネイティブな残基のアラニンでの置換であってよい。一部の実施形態では、保存的置換は、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔら（（１９９２年）Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ Ｍａｔｃｈｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｔｉｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６巻：１４４３〜４５頁）に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有するように成される。一部の実施形態では、置換は、置換がＰＡＭ２５０対数尤度行列において負ではない値を有する、中程度に保存的な置換である。

したがって、ヒト化Ｔ細胞補助受容体ポリペプチド（例えば、ＣＤ４またはＣＤ８ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列をゲノム内に含み（例えば、内在性遺伝子座において）、当該ポリペプチドが本明細書に記載のアミノ酸配列（複数可）の保存的アミノ酸置換を含む遺伝子改変非ヒト動物も本発明に包含される。

本明細書に記載のヒト化Ｔ細胞補助受容体ポリペプチドをコードする核酸残基に加えて、遺伝暗号の縮重に起因して他の核酸が本発明のポリペプチドをコードし得ることが当業者には理解されよう。したがって、保存的アミノ酸置換を伴うＴ細胞補助受容体ポリペプチド（例えば、ＣＤ４またはＣＤ８ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列をゲノム内に含む遺伝子改変非ヒト動物に加えて、遺伝暗号の縮重に起因して本明細書に記載のものとは異なるヌクレオチド配列をゲノム内に含む非ヒト動物も提供される。

「同一性」という用語は、配列に関連して使用される場合、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列同一性を測定するために使用することができる当技術分野で公知のいくつかの異なるアルゴリズムによって決定される同一性を包含する。本明細書に記載の一部の実施形態では、オープンギャップペナルティ（ｏｐｅｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）１０．０、伸長ギャップペナルティ（ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）０．１を使用し、Ｇｏｎｎｅｔ類似度マトリックス（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ Ｉｎｃ．、２００８年）を使用したＣｌｕｓｔａｌＷ ｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アラインメントを使用して同一性を決定する。配列の同一性に関して比較される配列の長さは特定の配列に左右される。種々の実施形態では、同一性は、成熟タンパク質のＮ末端からＣ末端までの配列を比較することによって決定する。種々の実施形態では、キメラヒト／非ヒト配列とヒト配列を比較する場合、ヒト配列とキメラヒト／非ヒト配列のヒト部分との間の同一性のレベルを確認するために、キメラヒト／非ヒト配列のヒト部分を比較に使用する（非ヒト部分は使用しない）（例えばキメラヒト／マウスタンパク質のヒト外部ドメインとヒトタンパク質のヒト外部ドメインとを比較する）。

「相同性」または「相同な」という用語は、配列、例えばヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に関しては、最適にアラインメントおよび比較すると、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約７５％、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約８０％、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約９０〜９５％、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の９７％超が同一である２つの配列を意味する。最適な遺伝子ターゲティングのためには、ターゲティング構築物は内在性ＤＮＡ配列と相同なアーム（すなわち、「相同性アーム」）を含有すべきであり、それにより、ターゲティング構築物と標的とされる内在性配列との間で相同組換えが起こり得ることが当業者には理解されよう。

「作動可能に連結した」という用語は、そのように記載されている構成成分が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある、近位を指す。そのように、適切な転写調節が保持されるように、タンパク質をコードする核酸配列を調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結することができる。さらに、細胞内のタンパク質の適切なフォールディング、プロセシング、ターゲティング、発現、および他の機能的性質を保持するために、本発明のキメラタンパク質またはヒト化タンパク質の種々の部分を作動可能に連結することができる。別段の指定のない限り、本発明のキメラタンパク質またはヒト化タンパク質の種々のドメインは、互いに作動可能に連結している。

「置き換え」という用語は、遺伝子の置き換えに関しては、内在性遺伝子座に外因性遺伝物質を配置し、それにより内在性遺伝子の全部または一部をオルソロガスなまたは相同な核酸配列で置き換えることを指す。下記の実施例において実証されている通り、マウスＣＤ４またはＣＤ８（ＣＤ８αおよび／またはＣＤ８β）ポリペプチドの一部をコードする内在性遺伝子座の核酸配列を、それぞれヒトＣＤ４またはＣＤ８（ＣＤ８αおよび／またはＣＤ８β）ポリペプチドの一部をコードするヌクレオチド配列で置き換えた。

「機能的」とは、本明細書で使用される場合、例えば、機能的なポリペプチドに関しては、ネイティブなタンパク質に通常付随する少なくとも１つの生物活性を保持するポリペプチドを指す。例えば、本発明の一部の実施形態では、内在性遺伝子座における置き換え（例えば、内在性非ヒトＣＤ４またはＣＤ８遺伝子座における置き換え）により、機能的な内在性ポリペプチドを発現することができない遺伝子座がもたらされる。

遺伝子改変ＣＤ４非ヒト動物、例えば、動物の種類；動物の系統；細胞型；スクリーニング、検出および他の方法；使用方法などに関する下記のいくつかの態様は、遺伝子操作されたＣＤ８動物に適用可能である。
遺伝子改変ＣＤ４動物

種々の実施形態では、本発明は、一般に、ゲノム内、例えば、内在性ＣＤ４遺伝子座にヒト化ＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、したがって、ヒト化ＣＤ４ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物を提供する。

ヒトＣＤ４遺伝子は第１２染色体に局在しており、１０エクソンを含有すると考えられている。ＣＤ４遺伝子は、遺伝子のエクソン２およびエクソン３によりコードされるアミノ末端疎水性シグナル配列を有するタンパク質をコードする。当該タンパク質は、一般にＤ１〜Ｄ４ドメインと称される４つの免疫グロブリン様ドメインを含む。Ｍａｄｄｏｎら（１９８７年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ Ｔ４ ｇｅｎｅｓ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４巻：９１５５〜５９頁。Ｄ１ドメインはエクソン３（シグナルペプチドの下流の配列）およびエクソン４によりコードされ、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４はそれぞれ別々のエクソン−それぞれエクソン５、エクソン６、およびエクソン７によりコードされると考えられている。Ｌｉｔｔｍａｎ（１９８７年）Ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＣＤ４ ａｎｄ ＣＤ８ Ｇｅｎｅｓ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５巻：５６１〜８４頁；Ｈａｎｎａら（１９９４年）Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｍａｔｕｒｅ ＣＤ４＋ＣＤ８− ａｎｄ Ｉｍｍａｔｕｒｅ ＣＤ４＋ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ、Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １４巻（２号）：１０８４〜９４頁；Ｍａｄｄｏｎら、上記。Ｔ細胞と抗原提示細胞が接触する領域などのタンパク質濃度が高い領域では、分子は対立するＤ４ドメイン間の相互作用を通じてホモ二量体化する傾向がある。Ｚａｍｏｙｓｋａ（１９９８年）ＣＤ４ ａｎｄ ＣＤ８： ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｏｆ
ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ？ Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０巻：８２〜８７頁；Ｗｕら（１９９７年）Ｄｉｍｅｒｉｃ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ４、Ｎａｔｕｒｅ ３８７巻：５２７頁；Ｍｏｌｄｏｖａｎら（２００２年）ＣＤ４ Ｄｉｍｅｒｓ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９巻：６２６１〜６８頁。

ＣＤ４のＤ１ドメインは免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメインと似ており、Ｄ２ドメインの一部と共に、ＭＨＣ ＩＩに結合すると考えられている。Ｈｕａｎｇら（１９９７年）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔａｃｔ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ＣＤ４
Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｗｉｔｈ Ｃｌａｓｓ ＩＩ ＭＨＣ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８巻：２１６〜２５頁。今度は、ＭＨＣ ＩＩが、ＭＨＣ ＩＩ
α２ドメインとＭＨＣ ＩＩ β２ドメインの間の接合部にある疎水性間隙においてＴ細胞補助受容体ＣＤ４と相互作用する。ＷａｎｇおよびＲｅｉｎｈｅｒｚ（２００２年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｂｏｕｎｄ ｔｏ ＭＨＣ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３８巻：１０３９〜４９頁。

ＣＤ４補助受容体のドメインＤ３およびドメインＤ４は、これらの２つのドメインを置換するとＣＤ４のＴＣＲと結合する能力が抑止されるので、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体と相互作用すると考えられている。Ｖｉｇｎａｌｉら（１９９６年）Ｔｈｅ Ｔｗｏ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｘｉｍａｌ Ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ＣＤ４ Ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８３巻：２０９７〜２１０７頁。ＣＤ４分子は二量体として存在し、分子のＤ４ドメイン内の残基がＣＤ４二量体化に関与すると考えられている。Ｍｏｌｄｏｖａｎら（２００２年）ＣＤ４ Ｄｉｍｅｒｓ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９巻：６２６１〜６８頁。

ＣＤ４遺伝子のエクソン８は膜貫通ドメインをコードし、遺伝子の残部は細胞質ドメインをコードする。ＣＤ４細胞質ドメインは多くの別個の機能を有する。例えば、ＣＤ４の細胞質ドメインによりチロシンキナーゼＬｃｋが動員される。ＬｃｋはＣＤ４およびＣＤ８の細胞質ドメインと会合するＳｒｃファミリーキナーゼであり、補助受容体とＴＣＲの同じＭＨＣへの同時結合により、ＴＣＲ複合体のＣＤ３およびζ鎖のチロシンのリン酸化が増加し、今度は、Ｔ細胞活性化において役割を果たす他の因子が動員される。Ｉｔａｎｏおよび共同研究者は、トランスジェニックマウスにおけるＣＤ８細胞外ドメインおよびＣＤ４細胞質尾部を含むハイブリッドタンパク質の発現を設計し試験することにより、ＣＤ４の細胞質尾部により、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞からＣＤ４＋系列への分化も促進されることを提唱した。Ｉｔａｎｏら（１９９６年）Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＣＤ４ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＣＤ４ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｔ Ｃｅｌｌｓ、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８３巻：７３１〜４１頁。ハイブリッドタンパク質の発現により、ＭＨＣ Ｉに特異的なＣＤ４系列Ｔ細胞の発生が導かれた。同文献。

ＣＤ４補助受容体は、ＨＩＶウイルスに対する主要な受容体であると思われ、ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇は疾患の進行の指標になっている。ＣＤ４の細胞質尾部は、ＨＩＶに誘導されるアポトーシスにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞へのアポトーシスシグナルの送達に必須であると思われる。特に、ＣＤ４とＬｃｋの相互作用により、これらの細胞におけるＨＩＶに誘導されるアポトーシスが強化されることが示された。Ｃｏｒｂｅｉｌら（１９９６年）ＨＩＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ＣＤ４ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｔａｉｌ ａｎｄ Ｉｓ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｂｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４ ｗｉｔｈ ｐ５６ｌｃｋ、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８３巻：３９〜４８頁。

Ｔ細胞は胸腺において発生し、未成熟ＣＤ４−／ＣＤ８−（ダブルネガティブまたはＤＮ）胸腺細胞からＣＤ４＋／ＣＤ８＋（ダブルポジティブまたはＤＰ）胸腺細胞まで進行し、最終的には、正の選択を受けてＣＤ４＋またはＣＤ８＋（シングルポジティブまたはＳＰ）Ｔ細胞のいずれかになる。ＭＨＣ Ｉ制限ＴＣＲを通じてシグナルを受け取るＤＰ胸腺細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞に分化し、ＭＨＣ ＩＩ制限ＴＣＲを通じてシグナルを受け取るＤＰ胸腺細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞に分化する。ＤＰ細胞が受け取る、そのＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞への分化を導くきっかけは多数の研究の対象となっている。ＣＤ４／ＣＤ８系列選択の種々のモデルが提唱されており、Ｓｉｎｇｅｒら（２００８年）Ｌｉｎｅａｇｅ ｆａｔｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｅ ｄｅｂａｔｅ： ｍｙｔｈｓ， ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＣＤ４− ｖｅｒｓｕｓ ＣＤ８− ｌｉｎｅａｇｅ ｃｈｏｉｃｅ、Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８巻：７８８〜８０１頁に概説されている。

正の選択の結果としての特定のＴ細胞補助受容体の非活性化は転写調節の産物である。ＣＤ４に関しては、ＣＤ４のエクソン１の１３ｋｂ上流に位置するエンハンサーにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ４発現が上方制御されることが示されている。Ｋｉｌｌｅｅｎら（１９９３年）Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ４ ｒｅｓｃｕｅｓ ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＣＤ４、ＥＭＢＯ Ｊ． １２巻：１５４７〜５３頁。マウスＣＤ４遺伝子の第１のイントロン内に位置するシス作用性転写サイレンサーは、ＣＤ４＋Ｔ細胞以外の細胞におけるＣＤ４の発現をサイレンシングするように機能する。Ｓｉｕら（１９９４年）Ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｓｉｌｅｎｃｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ４ ｇｅｎｅ、ＥＭＢＯ Ｊ． １３巻：３５７０〜３５７９頁。

以前に開発されたヒトＣＤ４を発現するトランスジェニックマウスのいくつかの系統ではＣＤ４系列選択を制御する重要な転写調節因子（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなど）が欠けているので、これらのマウスでは正常なＴ細胞系列の発生を再現することができず、また、ＣＤ４を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞以外の免疫細胞が産生された。例えば、Ｌａｗら（１９９４年）Ｈｕｍａｎ ＣＤ４ Ｒｅｓｔｏｒｅｓ Ｎｏｒｍａｌ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ＣＤ４、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９巻：１２３３〜４２頁（ＣＤ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ）；Ｆｕｇｇｅｒら（１９９４年）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ−ＤＲ４ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ＣＤ４ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ β−ｃｈａｉｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｎ ＨＬＡ−Ｄ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１巻：６１５１〜５５頁（ＣＤ４ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ｏｎ ａｌｌ ＣＤ３＋ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ）を参照されたい。したがって、一実施形態では、動物に正常なＴ細胞の発生および系列選択を受けることができるＴ細胞を産生させるために、内在性マウスプロモーターおよび他の調節エレメントを保持する遺伝子改変動物を開発することには利点があり得る。

したがって、種々の実施形態では、本発明は、例えば、内在性Ｔ細胞補助受容体遺伝子座（例えば、ＣＤ４遺伝子座）に、キメラヒト／非ヒトＴ細胞補助受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変非ヒト動物を提供する。一実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＴ細胞補助受容体の細胞外ドメインの全てまたは実質的に全てを含む。一実施形態では、キメラポリペプチドの非ヒト部分は、非ヒトＴ細胞補助受容体の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。一実施形態では、非ヒト動物は機能的なキメラＴ細胞補助受容体ポリペプチドを発現する。したがって、一態様では、本発明は、内在性ＣＤ４遺伝子座にキメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、当該キメラポリペプチドのヒト部分がヒトＣＤ４の細胞外ドメインの全てまたは実質的に全てを含み、非ヒト部分が非ヒトＣＤ４の少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、遺伝子改変非ヒト動物であって、機能的なキメラＣＤ４ポリペプチドを発現する動物を提供する。一態様では、非ヒト動物は、ヒト化ＣＤ４ポリペプチド、すなわちキメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドのみを発現し、その内在性ＣＤ４遺伝子座に由来する機能的な内在性非ヒトＣＤ４タンパク質を発現しない。

一実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドのヒト部分は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外ドメインの全てまたは実質的に全てを含む。別の実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドは、ヒトＣＤ４ポリペプチドのＭＨＣ ＩＩ結合性ドメイン（例えば、Ｄ１ドメインおよびＤ２ドメインの実質的な部分）の全てまたは実質的に全てを少なくとも含み、一実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドのヒト部分は、ヒトＣＤ４ポリペプチドのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、およびＤ３ドメインの全てまたは実質的に全てを含み、さらに別の実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドのヒト部分は、ＣＤ４の免疫グロブリン様ドメイン、例えば、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４と称されるドメインの全てまたは実質的に全てを含む。さらに別の実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドのヒト部分は、そのヒト部分に、ＭＨＣ ＩＩとの相互作用に関与するヒトＣＤ４配列および／またはＴ細胞受容体の細胞外部分の全てまたは実質的に全てを含む。さらに別の実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドのヒト部分は、ＭＨＣ ＩＩとの相互作用に関与するヒトＣＤ４の細胞外部分および／またはＴ細胞受容体の可変ドメインの全てまたは実質的に全てを含む。したがって、一実施形態では、キメラＣＤ４ポリペプチドのヒト部分をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ４のドメインＤ１〜Ｄ２のコード配列の全てまたは実質的に全て（例えば、ヒトＣＤ４遺伝子のエクソン３の一部およびエクソン４〜５）を含み、別の実施形態では、キメラＣＤ４ポリペプチドのヒト部分をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ４のＤ１〜Ｄ３のコード配列の全てまたは実質的に全て（例えば、ヒトＣＤ４のエクソン３の一部およびエクソン４〜６）を含む。したがって、一実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ４をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ４のＤ１〜Ｄ３ドメインの全てまたは実質的に全てをコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、キメラＣＤ４ポリペプチドのヒト部分をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ４遺伝子のＤ１〜Ｄ４ドメインのコード配列を含む。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、マウスＣＤ４シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列、例えばマウス遺伝子のエクソン２〜３の一部によりコードされる領域を含み得る。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ４シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。一実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み、当該キメラポリペプチドのヒト部分はおよそ配列番号４のアミノ酸２７〜３１９にわたる（配列番号５７に別に記載されている）。

一実施形態では、非ヒト動物はキメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチド配列を発現する。一実施形態では、キメラＣＤ４配列のヒト部分は、１つまたは複数の保存的改変または非保存的改変を含む。

一態様では、ヒトＣＤ４配列を発現する非ヒト動物であって、ヒトＣＤ４配列が、ヒトＣＤ４配列と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である非ヒト動物が提供される。特定の実施形態では、ヒトＣＤ４配列は、実施例に記載のヒトＣＤ４配列と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一実施形態では、ヒトＣＤ４配列は、１つまたは複数の保存的置換を含む。一実施形態では、ヒトＣＤ４配列は、１つまたは複数の非保存的置換を含む。

一部の実施形態では、キメラＣＤ４の一部、例えばヒト部分は、本明細書で示されている配列の実質的に全て（例えば、本明細書で示されているタンパク質ドメインの実質的に全て）を含み得る。実質的に全ての配列は、一般に、タンパク質の特定の部分（例えば、特定の機能的なドメインなど）を表すと考えられるアミノ酸の８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。機能的なドメインの境界は使用するアラインメントおよびドメイン予測方法に応じてわずかに変動し得ることが当業者には理解されよう。

一態様では、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドの非ヒト部分は、非ヒトＣＤ４ポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。ＣＤ４細胞質ドメインが果たす重要な機能に起因して、遺伝子操作された動物内に内在性非ヒト（例えばマウス）配列が保持されることにより、適切な細胞内シグナル伝達および補助受容体の他の機能の保存が確実になる。一実施形態では、非ヒト動物はマウスであり、非ヒトＣＤ４ポリペプチドはマウスＣＤ４ポリペプチドである。実施例には特定のマウスＣＤ４配列が記載されているが、それに由来する任意の適切な配列、例えば保存的／非保存的アミノ酸置換を含む配列が本明細書に包含される。一実施形態では、キメラＣＤ４補助受容体の非ヒト部分は、ヒト化されていない内在性ＣＤ４の任意の配列を含む。

本明細書に記載の非ヒト動物は、その内在性遺伝子座にキメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。一態様では、これにより、内在性ＣＤ４遺伝子の一部がヒトＣＤ４ポリペプチドの一部をコードするヌクレオチド配列で置き換えられる。一実施形態では、そのような置き換えは、例えば非ヒトＣＤ４の細胞外ドメインの全てまたは実質的に全てをコードする内在性ヌクレオチド配列、例えば非ヒトＣＤ４の少なくとも第１の免疫グロブリン様ドメイン（すなわち、Ｄ１）の全てまたは実質的に全てをコードする配列（例えば、非ヒトＣＤ４のドメインＤ１〜Ｄ２の全てまたは実質的に全てをコードする配列、例えば、非ヒトＣＤ４のドメインＤ１〜Ｄ３の全てまたは実質的に全てをコードする配列、例えば、非ヒトＣＤ４のドメインＤ１〜Ｄ４の全てまたは実質的に全てをコードする配列）の、それをコードするヒトヌクレオチド配列での置き換えである。一実施形態では、置き換えにより、ＭＨＣ ＩＩとの相互作用に関与するヒトＣＤ４配列および／またはＴ細胞受容体の細胞外部分を含むキメラタンパク質がもたらされる。さらに別の実施形態では、置き換えにより、ＭＨＣ ＩＩとの相互作用に関与するヒトＣＤ４配列および／またはＴ細胞受容体の可変ドメインを含むキメラタンパク質がもたらされる。一実施形態では、置き換えは、非ヒトＣＤ４ポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするＣＤ４配列の置き換えを含まない。したがって、一態様では、非ヒト動物は、内在性非ヒトＣＤ４遺伝子座に由来するキメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドを発現する。さらに別の実施形態では、置き換えにより、配列番号４に記載されているポリペプチド配列を含むタンパク質がもたらされる。

一実施形態では、本明細書に記載のキメラヒト／非ヒトＣＤ４遺伝子座（例えばキメラヒト／げっ歯類ＣＤ４遺伝子座、例えばキメラヒト／マウスＣＤ４遺伝子座）のヌクレオチド配列が提供される。一態様では、キメラヒト／非ヒト（例えば、ヒト／げっ歯類、例えば、ヒト／マウス）ＣＤ４配列は内在性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えばマウス）ＣＤ４遺伝子座に位置するので、第１のＣＤ４エクソンの上流に位置するＣＤ４エンハンサーエレメントを保持する。一実施形態では、内在性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えばマウス）ＣＤ４遺伝子座における置き換えは、例えば、ＣＤ４ポリペプチドのＤ１をコードするエクソン３の一部、およびＤ１の残部およびＤ２〜Ｄ３をコードするエクソン４〜６の置き換えを含み、したがって、一態様では、キメラＣＤ４遺伝子座には、非ヒト（例えばマウス）ＣＤ４遺伝子のイントロン１に位置するシス作用性サイレンサーが保持される。したがって、一実施形態では、キメラ遺伝子座には、内在性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えばマウス）ＣＤ４プロモーターおよび調節エレメントが保持される。別の実施形態では、キメラ遺伝子座は、ヒトプロモーターおよび調節エレメントを、それらにより適切なＣＤ４発現、ＣＤ４＋Ｔ細胞の発生、ＣＤ４系列選択、および補助受容体機能が可能になる限りでは、含有してよい。したがって、一部の態様では、本発明の動物は、Ｔ細胞の適切な系列選択および発生が変更されない遺伝子改変を含む。一態様では、本発明の動物（例えば、げっ歯類、例えばマウス）は、通常ＣＤ４を発現する細胞以外の免疫細胞上でキメラＣＤ４ポリペプチドを発現しない。一態様では、動物は、Ｂ細胞またはＣＤ８＋ＳＰ Ｔ細胞上でＣＤ４を発現しない。一実施形態では、置き換えにより、ＣＤ４発現の適切な空間的調節および時間的調節を可能にするエレメントの保持がもたらされる。

本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌ウシ、雄ウシ、スイギュウ）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）からなる群から選択することができる。適切な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が容易に入手可能でない非ヒト動物については、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作出するために他の方法が使用される。そのような方法としては、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変すること、および核移植を使用して、改変されたゲノムを適切な細胞、例えば卵母細胞に移植すること、および改変された細胞（例えば、改変された卵母細胞）を非ヒト動物において適切な条件下で熟させて胚を形成することが挙げられる。

一態様では、非ヒト動物は哺乳動物である。一態様では、非ヒト動物は、例えばＤｉｐｏｄｏｉｄｅａ上科またはＭｕｒｏｉｄｅａ上科の小さな哺乳動物である。一実施形態では、遺伝子改変動物はげっ歯類である。一実施形態では、げっ歯類は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。一実施形態では、げっ歯類は、Ｍｕｒｏｉｄｅａ上科から選択される。一実施形態では、遺伝子改変動物は、Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ（例えばマウス様ハムスター（ｍｏｕｓｅ−ｌｉｋｅ ｈａｍｓｔｅｒ））、Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ（例えば、ハムスター、新世界ラットおよび新世界マウス（Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄ ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ）、ハタネズミ）、Ｍｕｒｉｄａｅ（真性マウスおよび真性ラット（ｔｒｕｅ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｔｓ）、スナネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ（キノボリマウス（ｃｌｉｍｂｉｎｇ ｍｉｃｅ）、イワマウス（ｒｏｃｋ ｍｉｃｅ）、オジロハムスターモドキ（ｗｉｔｈ−ｔａｉｌｅｄ ｒａｔ）、マダガスカルラットおよびマダガスカルマウス（Ｍａｌａｇａｓｙ ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ））、Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ（例えば、トゲヤマネ）、およびＳｐａｌａｃｉｄａｅ（例えば、メクラネズミ（ｍｏｌｅ ｒａｔｅ）、タケネズミ、およびモグラネズミ）から選択される科の動物である。特定の実施形態では、遺伝子改変げっ歯類は、真性マウスまたは真性ラット（Ｍｕｒｉｄａｅ科）、スナネズミ、トゲマウス、およびタテガミネズミから選択される。一実施形態では、遺伝子改変マウスはＭｕｒｉｄａｅ科のメンバーである。一実施形態では、動物はげっ歯類である。特定の実施形態では、げっ歯類はマウスおよびラットから選択される。一実施形態では、非ヒト動物はマウスである。

特定の実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスであるげっ歯類である。別の実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される１２９系統である（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇら（１９９９年）Ｒｅｖｉｓｅｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｓｔｒａｉｎ １２９ ｍｉｃｅ、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０巻：８３６頁を参照されたい、Ａｕｅｒｂａｃｈら（２０００年）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒａ Ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ １２９／ＳｖＥｖ− ａｎｄ Ｃ５７ＢＬ／６−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓも参照されたい）。特定の実施形態では、遺伝子改変マウスは、上述の１２９系統と上述のＣ５７ＢＬ／６系統の混合である。別の特定の実施形態では、マウスは、上述の１２９系統の混合、または上述のＢＬ／６系統の混合である。特定の実施形態では、混合の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。さらに別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統と別の上述の系統の混合である。

一実施形態では、非ヒト動物はラットである。一実施形態では、ラットは、ウィスターラット、ＬＥＡ系統、スプラーグドーリー系統、フィッシャー系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択される。一実施形態では、ラット系統は、ウィスター、ＬＥＡ、スプラーグドーリー、フィッシャー、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される２種以上の系統の混合である。

したがって、一実施形態では、本発明は、ゲノム内、例えば内在性ＣＤ４遺伝子座に、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、当該キメラポリペプチドのマウス部分がマウスＣＤ４ポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、遺伝子改変マウスであって、キメラヒト／マウスＣＤ４を発現するマウスを提供する。一実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外ドメインの全てまたは実質的に全てを少なくとも含む。一実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＣＤ４タンパク質の少なくともＤ１ドメインの全てまたは実質的に全てを含む。一実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＣＤ４タンパク質のＤ１〜Ｄ２ドメインの全てまたは実質的に全てを少なくとも含む、例えば、ヒトＣＤ４タンパク質のＤ１〜Ｄ３ドメインの全てまたは実質的に全てを少なくとも含む、例えば、ヒトＣＤ４タンパク質のＤ１〜Ｄ４ドメインの全てまたは実質的に全てを含む。したがって、一実施形態では、マウスは、内在性ＣＤ４遺伝子座に、ヒトＣＤ４遺伝子のエクソン４、エクソン５、およびエクソン６の全てまたは実質的に全てを少なくとも含むヌクレオチド配列、例えば、ヒトＣＤ４のＤ１ドメインの一部をコードするヒトＣＤ４遺伝子のエクソン３の配列およびヒトＣＤ４遺伝子のエクソン４〜６を含むヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、マウスは、内在性ＣＤ４遺伝子座に、ＭＨＣ ＩＩとの相互作用に関与するヒトＣＤ４配列および／またはＴ細胞受容体の細胞外部分を含むキメラヒト／マウスＣＤ４を含む。別の実施形態では、マウスは、内在性ＣＤ４遺伝子座に、ＭＨＣ ＩＩとの相互作用に関与するヒトＣＤ４配列および／またはＴ細胞受容体の可変ドメインを含むキメラヒト／マウスＣＤ４を含む。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、マウスＣＤ４シグナルペプチドをコードする配列を含む。一実施形態では、マウスは、マウスＣＤ４細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列の、ヒトＣＤ４細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列での置き換えを含む。別の実施形態では、マウスは、少なくともマウスＣＤ４ Ｄ１ドメインの全てまたは実質的に全てをコードするヌクレオチド配列、例えば、少なくともマウスＣＤ４ Ｄ１〜Ｄ２ドメインの全てまたは実質的に全てをコードするヌクレオチド配列、例えば、少なくともマウスＣＤ４ Ｄ１〜Ｄ３ドメインの全てまたは実質的に全てをコードするヌクレオチド配列の、それをコードするヒトヌクレオチド配列での置き換えを含む。一実施形態では、マウスは、その内在性マウスＣＤ４遺伝子座に由来する機能的な内在性マウスＣＤ４を発現しない。一実施形態では、本明細書に記載のマウスは、マウスの生殖細胞系列内にキメラヒト／マウスＣＤ４ヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、マウスはヒト化されていない任意の内在性配列を保持し、例えばマウスが、Ｄ１〜Ｄ３ドメインの全てまたは実質的に全てをコードするヌクレオチド配列の置き換えを含む実施形態では、マウスは、マウスＣＤ４ Ｄ４ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列ならびにマウスＣＤ４の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするヌクレオチド配列を保持する。

一態様では、キメラヒト／マウスＣＤ４タンパク質を発現するマウスは、マウスＣＤ４プロモーター配列および調節配列を保持する。例えば、キメラヒト／マウスＣＤ４をコードするマウス内のヌクレオチド配列は、内在性マウスＣＤ４プロモーター配列および調節配列に作動可能に連結している。一態様では、本発明の遺伝子操作された動物内に保持されるこれらのマウス調節配列は、Ｔ細胞の発生の間の適切な段階でキメラタンパク質の発現を調節する配列を含む。したがって、一態様では、マウスは、Ｂ細胞またはＣＤ８系列のＴ細胞上でキメラＣＤ４を発現しない。一態様では、マウスは、同様に、通常内在性ＣＤ４を発現しないいかなる細胞型、例えば、いかなる免疫細胞型上でもキメラＣＤ４を発現しない。

種々の実施形態では、本明細書に記載の通りキメラＣＤ４遺伝子座に由来する機能的なキメラＣＤ４タンパク質を発現する非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えばマウスまたはラット）は、細胞表面上、例えばＴ細胞表面上にキメラタンパク質をディスプレイする。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒトにおいて観察されるものと同じ細胞分布で、細胞表面上にキメラＣＤ４タンパク質を発現する。一態様では、本発明のＣＤ４タンパク質は、第２の細胞、例えば抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現するＭＨＣ ＩＩタンパク質と相互作用することができる。

一実施形態では、本発明の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えばマウス）は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ ＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、したがって、動物のＴ細胞の表面上に発現するキメラＣＤ４タンパク質は、第２の細胞、例えば抗原提示細胞の表面上に発現するヒトまたはヒト化ＭＨＣ ＩＩと相互作用することができる。一実施形態では、ＭＨＣ ＩＩタンパク質は、ヒトＭＨＣ ＩＩαポリペプチドの細胞外ドメインおよびヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチドの細胞外ドメインを含む。ヒトまたはヒト化ＭＨＣ ＩＩポリペプチドを発現する遺伝子改変動物の例は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１２年１０月２６日出願の米国特許出願第１３／６６１，１１６号、および２０１３年３月１１日出願の米国特許出願第１３／７９３，９３５号に記載されている。したがって、一実施形態では、本明細書に記載のキメラＣＤ４タンパク質を含む動物は、ヒト化ＭＨＣ ＩＩタンパク質をさらに含んでよく、当該ヒト化ＭＨＣ ＩＩタンパク質は、（１）ヒトＭＨＣ ＩＩα細胞外ドメインならびに内在性の、例えばマウスＭＨＣ ＩＩの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むヒト化ＭＨＣ ＩＩαポリペプチドであって、ヒトＭＨＣ ＩＩαのα１ドメインおよびα２ドメインを含むヒトＭＨＣ ＩＩα細胞外ドメイン、および（２）ヒトＭＨＣ ＩＩβ細胞外ドメインならびに内在性の、例えばマウスＭＨＣ ＩＩの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むヒト化ＭＨＣ ＩＩβポリペプチドであって、ヒトＭＨＣ ＩＩβのβ１ドメインおよびβ２ドメインを含むヒトＭＨＣ ＩＩβ細胞外ドメインを含む。一態様では、ヒト化ＭＨＣ ＩＩαポリペプチドとヒト化ＭＨＣ ＩＩβポリペプチドはどちらも、それぞれ内在性ＭＨＣ ＩＩα遺伝子座および内在性ＭＨＣ ＩＩβ遺伝子座に位置するヌクレオチド配列によりコードされ、一態様では、動物は、機能的な内在性ＭＨＣ ＩＩαポリペプチドおよび内在性ＭＨＣ ＩＩβポリペプチドを発現しない。したがって、動物によって発現するＭＨＣ ＩＩは、キメラヒト／非ヒト、例えば、ヒト／げっ歯類（例えば、ヒト／マウス）ＭＨＣ ＩＩタンパク質であってよい。キメラＭＨＣ ＩＩタンパク質のヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰからなる群から選択されるヒトＨＬＡクラスＩＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＱ２．５、ＨＬＡ−ＤＱ８、またはヒト集団内に存在する任意の他のＨＬＡクラスＩＩ分子由来のものであってよい。動物がマウスである実施形態では、キメラＭＨＣ ＩＩポリペプチドの非ヒト（すなわち、マウス）部分は、Ｈ−２ＥおよびＨ−２Ａから選択されるマウスＭＨＣ ＩＩタンパク質由来のものであってよい。一態様では米国特許出願第１３／６６１，１１６号および同第１３／７９３，９３５号に記載のキメラヒト／非ヒトＣＤ４およびヒト化ＭＨＣ ＩＩを含む非ヒト動物は、本明細書に記載のキメラＣＤ４遺伝子座を含む動物とヒト化ＭＨＣ ＩＩ遺伝子座を含む動物を掛け合わせることによって作製することができる。動物は、例えば、内在性ＣＤ４遺伝子座における置き換えのために、ヒト化ＭＨＣ ＩＩ遺伝子座を含む動物のＥＳ細胞にキメラＣＤ４をコードするヌクレオチド配列を導入すること、またはキメラＣＤ４遺伝子座を含む動物のＥＳ細胞にヒト化ＭＨＣ ＩＩをコードするヌクレオチド配列を導入することによって作製することもできる。

一実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ４とヒトまたはヒト化ＭＨＣ ＩＩの両方を含む遺伝子改変非ヒト動物（例えばマウス）は、これらのタンパク質をコードする遺伝子の１つまたは２つのコピーを含んでよく、したがって、動物は、それぞれキメラＣＤ４およびＭＨＣ ＩＩ（すなわち、ＭＨＣ ＩＩαおよび／またはＭＨＣ ＩＩβ）をコードする遺伝子についてヘテロ接合性であってもホモ接合性であってもよい。

遺伝子操作された非ヒト動物に加えて、非ヒト胚（例えば、げっ歯類、例えばマウスまたはラットの胚）であって、本明細書に記載の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えばマウスまたはラット）に由来するドナーＥＳ細胞を含む胚も提供される。一態様では、胚は、キメラＣＤ４遺伝子を含むＥＳドナー細胞、および宿主胚細胞を含む。

本明細書に記載の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えばマウスまたはラット）に由来し、キメラＣＤ４タンパク質を発現する組織も提供される。

さらに、本明細書に記載の非ヒト動物から単離された非ヒト細胞が提供される。一実施形態では、細胞はＥＳ細胞である。一実施形態では、細胞はＴ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞である。一実施形態では、細胞はヘルパーＴ細胞（Ｔ_Ｈ細胞）である。一実施形態では、Ｔ_Ｈ細胞はエフェクターＴ_Ｈ細胞、例えばＴ_Ｈ１細胞またはＴ_Ｈ２細胞である。

本明細書に記載の非ヒト動物の染色体またはその断片を含む非ヒト細胞も提供される。一実施形態では、非ヒト細胞は、本明細書に記載の非ヒト動物の核を含む。一実施形態では、非ヒト細胞は、核移植の結果として染色体またはその断片を含む。

一態様では、本明細書に記載のキメラＣＤ４ポリペプチドをコードする遺伝子を含む非ヒト人工多能性細胞が提供される。一実施形態では、人工多能性細胞は、本明細書に記載の非ヒト動物に由来する。

一態様では、本明細書に記載の非ヒト動物の細胞に由来するハイブリドーマまたはクアドローマが提供される。一実施形態では、非ヒト動物はマウスまたはラットである。

一態様では、表面上にキメラＣＤ４タンパク質を担持するＴ細胞およびキメラＣＤ４に結合する第２の細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ調製物が提供される。一実施形態では、第２の細胞は、ＭＨＣ ＩＩポリペプチド、例えばキメラヒト／非ヒトＭＨＣ ＩＩタンパク質を発現する細胞、例えばＡＰＣである。一実施形態では、第１の細胞の表面上のキメラＣＤ４は、第２の細胞の表面上のキメラＭＨＣ ＩＩと相互作用する。一実施形態では、キメラＣＤ４タンパク質は、内在性細胞質ゾルの分子、例えば内在性細胞質ゾルシグナル伝達分子（例えば、内在性Ｌｃｋなど）との相互作用を保持する。

本明細書に記載の遺伝子操作された非ヒト動物（例えば遺伝子操作されたげっ歯類、例えばマウスまたはラット）を作出するための方法も提供される。一実施形態では、遺伝子操作された非ヒト動物を作出するための方法により、内在性ＣＤ４遺伝子座にキメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む動物がもたらされる。一部の実施形態では、当該方法では、実施例に記載の通り、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術、ＥＳ細胞への構築物の導入、およびＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を使用したマウス胚への標的ＥＳ細胞クローンの導入を使用して作出されたターゲティング構築物を利用する。

一実施形態では、本発明は、本明細書に記載のキメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドを発現する非ヒト動物のＣＤ４遺伝子座を改変する方法を含む。一実施形態では、本発明は、マウスのＣＤ４遺伝子座を、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドを発現するように改変する方法であって、マウスの内在性ＣＤ４遺伝子座において、内在性マウスＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をキメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換えるステップを含む方法を提供する。当該方法の一態様では、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドは、ヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外ドメインの全てまたは実質的に全て、および内在性マウスＣＤ４ポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。当該方法の別の態様では、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドは、ヒトＣＤ４ポリペプチドのＤ１〜Ｄ２ドメインの全てまたは実質的に全てを含む。さらに別の実施形態では、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドは、ヒトＣＤ４ポリペプチドのＤ１〜Ｄ３ドメインの全てまたは実質的に全てを含む。さらに別の実施形態では、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドは、ＭＨＣ ＩＩとの相互作用に関与するヒトＣＤ４および／またはＴ細胞受容体の細胞外ドメインのアミノ酸配列の全てまたは実質的に全てを含む。さらに別の実施形態では、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドは、ＭＨＣ ＩＩとの相互作用に関与するヒトＣＤ４および／またはＴ細胞受容体の可変ドメインのアミノ酸配列の全てまたは実質的に全てを含む。

したがって、本明細書に記載の遺伝子改変動物を作製するためのヌクレオチド構築物も提供される。一態様では、ヌクレオチド配列は、５’および３’相同性アーム、ヒトＣＤ４遺伝子配列（例えば、ヒトＣＤ４細胞外ドメイン遺伝子配列、例えば、ヒトＣＤ４のドメインＤ１〜Ｄ２の全てまたは実質的に全ての遺伝子配列、例えば、ヒトＣＤ４のドメインＤ１〜Ｄ３および／またはＤ２〜Ｄ３の全てまたは実質的に全ての遺伝子配列、例えば、ヒトＣＤ４のドメインＤ１〜Ｄ４の全てまたは実質的に全ての遺伝子配列）を含むＤＮＡ断片、ならびに組換え部位と隣接する選択カセットを含む。一実施形態では、ヒトＣＤ４遺伝子配列は、ヒトＣＤ４のイントロンおよびエクソンを含むゲノム配列である。一実施形態では、相同性アームは、非ヒト（例えばマウス）ＣＤ４ゲノム配列と相同である。本発明の例示的な構築物は図１、下の図に示されている。

選択カセットは、目的の構築物に組み込まれた細胞（例えば、ＥＳ細胞）の選択を容易にするためにターゲティング構築物に挿入されるヌクレオチド配列である。いくつかの適切な選択カセットが当技術分野で公知である。一般に、選択カセットにより、特定の抗生物質（例えば、Ｎｅｏ、Ｈｙｇ、Ｐｕｒ、ＣＭ、ＳＰＥＣなど）の存在下での正の選択が可能になる。さらに、選択カセットは、リコンビナーゼ酵素で処理した際に選択カセットの欠失を可能にする組換え部位と隣接していてよい。一般に使用される組換え部位は、それぞれＣｒｅ酵素およびＦｌｐ酵素によって認識されるｌｏｘＰおよびＦｒｔであるが、他のものが当技術分野で公知である。選択カセットは、構築物のコード領域の外側のどこにでも位置してよい。一実施形態では、選択カセットは、ヒトＣＤ４配列のエクソン３とエクソン４の間に位置する。

遺伝子ターゲティングが完了したら、ＥＳ細胞または遺伝子改変非ヒト動物をスクリーニングして、目的の外因性のヌクレオチド配列が上首尾に組み入れられたことまたは外因性のポリペプチドが発現することを確認する。多数の技法が当業者に公知であり、それらとして（これだけに限定されないが）、サザンブロット法、ロングＰＣＲ、定量的ＰＣＲ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を使用したリアルタイムＰＣＲ）、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法、フローサイトメトリー、ウエスタン分析、免疫細胞化学的検査、免疫組織化学的検査などが挙げられる。１つの例では、目的の遺伝子改変を担持する非ヒト動物（例えばマウス）は、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３年）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２１巻（６号）：６５２〜６５９頁に記載の対立遺伝子アッセイの改変を使用して、マウス対立遺伝子喪失および／またはヒト対立遺伝子獲得についてスクリーニングすることによって同定することができる。遺伝子改変動物における特定のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を同定する他のアッセイは、当業者に公知である。

一態様では、単一細胞において、本明細書に記載のヌクレオチド構築物からキメラＣＤ４タンパク質を発現させるステップを含む、キメラヒト／非ヒトＣＤ４分子を作出するための方法が提供される。一実施形態では、ヌクレオチド構築物はウイルスベクターであり、特定の実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。一実施形態では、細胞は、ウイルス核酸配列（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）を発現するＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、および網膜細胞から選択される。

一態様では、キメラＣＤ４タンパク質を発現する細胞が提供される。一実施形態では、細胞は、本明細書に記載のキメラＣＤ４配列を含む発現ベクターを含む。一実施形態では、細胞は、ウイルス核酸配列（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）を発現するＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、および網膜細胞から選択される。

本明細書に記載の非ヒト動物により産生されるキメラＣＤ４分子も提供され、一実施形態では、キメラＣＤ４分子は、ヒトＣＤ４タンパク質の細胞外ドメインの全てまたは実質的に全て、ならびに非ヒトＣＤ４タンパク質、例えばマウスＣＤ４タンパク質由来の少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物により産生されるキメラＣＤ４分子であって、ヒトＣＤ４のＤ１ドメインの少なくとも全てまたは実質的に全て、例えば、ヒトＣＤ４のＤ１〜Ｄ２ドメインの少なくとも全てまたは実質的に全て、例えば、ヒトＣＤ４のＤ１〜Ｄ３ドメインの少なくとも全てまたは実質的に全てのアミノ酸配列、例えば、ＭＨＣ ＩＩおよび／またはＴＣＲの細胞外ドメインの結合に関与するヒトＣＤ４のアミノ酸配列、例えば、ＭＨＣ ＩＩおよび／またはＴＣＲの可変ドメインの結合に関与するヒトＣＤ４のアミノ酸配列を含み、当該タンパク質の残部（例えば、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、細胞外ドメインのヒト化されていない任意の部分）が内在性非ヒトタンパク質配列に由来するキメラＣＤ４分子が提供される。

上記の種々の実施形態は、キメラＣＤ４タンパク質を発現する動物、ならびに当該タンパク質を含む細胞および組織と関連して、下記のキメラヒト／非ヒトＣＤ８を発現する非ヒト動物、または他の重要なキメラヒト／非ヒトＴ細胞補助受容体を発現する動物が記載されている実施形態に適用可能である。
遺伝子改変ＣＤ８動物

種々の実施形態では、本発明は、一般に、ゲノム内、例えば内在性ＣＤ８遺伝子座に、ヒト化ＣＤ８ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、したがって、ヒト化ＣＤ８ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物を提供する。種々の実施形態では、本発明は、ゲノム内、例えば内在性ＣＤ８遺伝子座に、ヒト化ＣＤ８αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および／またはヒト化ＣＤ８βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物を提供する。したがって、本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、ヒト化ＣＤ８αおよび／またはヒト化ＣＤ８βポリペプチド（複数可）を発現する。

ヒトＣＤ８タンパク質は、一般には、細胞表面上に２つのポリペプチド、ＣＤ８αおよびＣＤ８βのヘテロ二量体として発現するが、ジスルフィド連結したホモ二量体およびホモ多量体も検出されている（例えば、ＣＤ８ααを発現するＮＫ細胞および腸のγδＴ細胞）。ヒトＣＤ８αおよびＣＤ８βをコードする遺伝子は、第２染色体において互いの極めて近傍に位置する。Ｎａｋａｙａｍａら（１９９２年）Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｗｏ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ β−ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅｓ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８巻：１９１９〜２７頁。ＣＤ８αタンパク質は、リーダーペプチド、免疫グロブリンＶ様領域、ヒンジ領域、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を含有する。Ｎｏｒｍｅｎｔら（１９８９年）Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ Ｓｐｌｉｃｅｄ ｍＲＮＡ Ｅｎｃｏｄｅｓ ａ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｆｏｒｍ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８α． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８α
ｇｅｎｅ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４２巻：３３１２〜１９頁。ＣＤ８α遺伝子のエクソン／イントロンは図４および図５に概略的に示されている。

ヒトＣＤ８β遺伝子は、第２染色体上のＣＤ８α遺伝子の上流にある。ＣＤ８β遺伝子の代替スプライシングによって作製される多数のアイソフォームが報告されており、１つのアイソフォームは、膜貫通ドメインを欠き、分泌タンパク質を生成することが予測される。Ｎｏｒｍｅｎｔら（１９８８年）Ａ ｓｅｃｏｎｄ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＣＤ８
ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ、ＥＭＢＯ Ｊ． ７巻：３４３３〜３９頁。ＣＤ８β遺伝子のエクソン／イントロンは図３および図５に概略的に示されている。

膜に結合したＣＤ８βタンパク質は、Ｎ末端シグナル配列、その後に免疫グロブリンＶ様ドメイン、短い細胞外ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、および細胞質尾部を含有する。Ｌｉｔｔｍａｎ（１９８７年）Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＣＤ４ ａｎｄ ＣＤ８ ｇｅｎｅｓ、Ａｎｎ Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５巻：５６１〜８４頁を参照されたい。ヒンジ領域は、コンフォメーションが維持され、プロテアーゼによる切断からタンパク質が保護されると考えられている、広範囲にわたるグリコシル化の部位である。Ｌｅａｈｙ（１９９５年）Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｖｉｅｗ ｏｆ ＣＤ４ ａｎｄ ＣＤ８、ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９巻：１７〜２５頁。

ＣＤ８タンパク質は、一般に細胞傷害性Ｔ細胞上に発現し、ＭＨＣ Ｉ分子と相互作用する。相互作用は、ＭＨＣ Ｉのα_３ドメインとＣＤ８の結合によって媒介される。ＭＨＣクラスＩへのＣＤ８の結合はＴＣＲのＭＨＣクラスＩへの結合の約１００分の１であるが、ＣＤ８の結合により、ＴＣＲの結合の親和性が増強される。Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅら（２０１０年）ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｗｉｔｈ Ｓｕｐｅｒｅｎｈａｎｃｅｄ ＣＤ８ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｂｙｐａｓｓ ｔｈｅ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｃｏｇｎａｔｅ ＴＣＲ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖａｔｅ ＣＴＬ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８４巻：３３５７〜３３６６頁。

ＭＨＣクラスＩ分子へのＣＤ８の結合は種特異的であり、ＣＤ８のマウスホモログ、Ｌｙｔ−２は、α３ドメインにおいてＨ−２Ｄ^ｄ分子に結合するが、ＨＬＡ−Ａ分子には結合しないことが示された。Ｃｏｎｎｏｌｌｙら（１９８８年）Ｔｈｅ Ｌｙｔ−２ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｌａｓｓ Ｉ α３ Ｄｏｍａｉｎ ｉｎ Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６８巻：３２５〜３４１頁。示差的な結合は、おそらくヒトとマウスの間で保存的ではないＣＤ８上のＣＤＲ様決定因子（ＣＤＲ１様およびＣＤＲ２様）に起因するものであった。Ｓａｎｄｅｒｓら（１９９１年）Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＣＤ８ ｔｈａｔ Ａｆｆｅｃｔ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−ＣＤ８ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７４巻：３７１〜３７９頁；Ｖｉｔｉｅｌｌｏら（１９９１年）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ
Ｃａｒｒｙｉｎｇ ａ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｈｕｍａｎ−Ｍｏｕｓｅ Ｃｌａｓｓ Ｉ
Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３巻：１００７〜１０１５頁、および、Ｇａｏら（１９９７年）Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｕｍａｎ ＣＤ８αα ａｎｄ ＨＬＡ−Ａ２、Ｎａｔｕｒｅ ３８７巻：６３０〜６３４頁。ＣＤ８は、α３ドメインの保存的領域（２２３〜２２９位）においてＨＬＡ−Ａ２に結合することが報告されている。ＨＬＡ−Ａにおける単一の置換（Ｖ２４５Ａ）により、ＣＤ８とＨＬＡ−Ａの結合性が低下し、同時にＴ細胞媒介性溶解が大きく低下する。Ｓａｌｔｅｒら（１９８９年）、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ α_３ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＨＬＡ−Ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｆｆｅｃｔｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＣＤ８、Ｎａｔｕｒｅ ３３８巻：３４５〜３４８頁。一般に、ＨＬＡ−Ａ分子のα３ドメインにおける多型も、ＣＤ８との結合に影響を及ぼす。同文献。マウスでは、Ｈ−２Ｄ^ｄの残基２２７におけるアミノ酸置換により、マウスＬｙｔ−２とＨ−２Ｄ^ｄの結合が影響を受け、変異Ｈ−２Ｄ^ｄをトランスフェクトした細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞によって溶解されなかった。Ｐｏｔｔｅｒら（１９８９年）Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ａｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ２２７ ｏｆ Ｈ−２ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｂｒｏｇａｔｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＣＤ８−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ、ｂｕｔ ｎｏｔ ＣＤ８−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ、ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ ３３７巻：７３〜７５頁。したがって、ヒトまたはヒト化ＣＤ８の発現は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉによって示される抗原に対するＴ細胞応答を試験するために有益であり得る。

ＣＤ４と同様に、ＣＤ８の細胞質ドメインはチロシンキナーゼＬｃｋと相互作用し、それにより今度はＴ細胞活性化が導かれる。ＬｃｋはＣＤ８αの細胞質ドメインと相互作用するように見えるが、ＣＤ８β細胞質ドメインの変異または欠失によりＣＤ８αに関連するＬｃｋ活性が低下するので、この相互作用はＣＤ８βの細胞質ドメインの存在によって調節されると思われる。Ｉｒｉｅら（１９９８年）Ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＣＤ８β Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｌｃｋ Ｋｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１巻：１８３〜９１頁。Ｌｃｋ活性の低下はＴ細胞の発生における欠陥に関連した。同文献。

適切な細胞、例えば細胞傷害性Ｔ細胞でのＣＤ８の発現は、ＣＤ８遺伝子座全体にわたって位置する種々のエンハンサーエレメントによってしっかりと調節される。例えば、ＣＤ８遺伝子座において、少なくとも４つのＤＮａｓｅ Ｉ高感受性領域、調節因子の結合に関連することも多い領域が同定されている。Ｈｏｓｅｒｔら（１９９７年）Ａ ＣＤ８
ｇｅｎｏｍｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｔｈａｔ ｄｉｒｅｃｔｓ ｓｕｂｓｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８巻：４２７０〜８１頁。ＣＤ８遺伝子座においてこれらのＤＮａｓｅ Ｉ高感受性領域が発見されてから、ＣＤ８遺伝子座全体にわたって広がる、ＤＰ、ＣＤ８ ＳＰ Ｔ細胞、またはγδＴＣＲを発現している細胞を含めた種々の系列のＴ細胞におけるＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βの発現を調節するエンハンサーエレメントが少なくとも５種同定されている。例えば、Ｋｉｏｕｓｓｉｓら（２００２年）Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｎｄ ＣＤ４， ＣＤ８Ａ， ａｎｄ ＣＤ８Ｂ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｙｍｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． ２巻：９０９〜９１９頁およびＯｎｌｉｎｅ Ｅｒｒａｔｕｍ；Ｅｌｌｍｅｉｅｒら（１９９８年）Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
Ｓｔａｇｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅ ＣＤ８ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｉｎ Ｔｈｙｍｕｓ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｔ ｃｅｌｌｓ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９巻：４８５〜９６頁を参照されたい。

したがって、ヒトまたはヒト化ＣＤ４遺伝子改変動物について内在性ＣＤ４プロモーターおよび調節エレメントを保持することから得られる利点と同様に、一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＣＤ８の発現を制御する内在性マウスプロモーターおよび調節エレメントを保持する遺伝子改変非ヒト動物を開発することには利点があり得る。本明細書に記載の通りＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βタンパク質をコードする内在性非ヒト配列の、ヒトまたはヒト化ＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βタンパク質をコードする配列での置き換えを含む遺伝子改変動物を創製することには特定の利点があり得る。

種々の実施形態では、本発明は、ゲノム内、例えば内在性ＣＤ８遺伝子座に、キメラヒト／非ヒトＣＤ８ポリペプチド（例えば、ＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を少なくとも１つ含み、当該ポリペプチドのヒト部分がヒトＣＤ８（例えば、ＣＤ８αおよび／またはＣＤ８β）の細胞外ドメインの全てまたは実質的に全てを含み、非ヒト部分が非ヒトＣＤ８（例えば、ＣＤ８αおよび／またはＣＤ８β）の少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、遺伝子改変非ヒト動物であって、キメラＣＤ８ポリペプチド（例えば、ＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチド）を発現する動物を提供する。したがって、一実施形態では、本発明は、内在性非ヒトＣＤ８遺伝子座に、キメラヒト／非ヒトＣＤ８αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／非ヒトＣＤ８βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列が、ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外ドメインの全てまたは実質的に全て、ならびに非ヒトＣＤ８αポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列を含み、第２のヌクレオチド配列が、ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外ドメインの全てまたは実質的に全て、ならびに非ヒトＣＤβポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列を含む、遺伝子改変非ヒト動物であって、機能的なキメラヒト／非ヒトＣＤ８タンパク質を発現する動物を提供する。一態様では、非ヒト動物は、内在性ＣＤ８遺伝子座に由来するヒト化ＣＤ８ポリペプチド（例えばキメラヒト／非ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチド）のみを発現し、対応する機能的な非ヒトＣＤ８ポリペプチド（複数可）は発現しない。

一実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ８αポリペプチドは、ヒト部分に、ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外ドメインの全てまたは実質的に全てを含む。一実施形態では、キメラＣＤ８αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＣＤ８αポリペプチドのＭＨＣ Ｉ結合性ドメインを少なくとも含む。一実施形態では、キメラＣＤ８αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＣＤ８αの免疫グロブリンＶ様ドメインの全てまたは実質的に全ての配列を少なくとも含む。一実施形態では、キメラＣＤ８αポリペプチドのヒト部分をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外ドメインをコードするエクソンを少なくとも含む。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ｉｇ Ｖ様ドメインをコードするエクソンを少なくとも含む。一実施形態では、ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外ドメインは、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインではないポリペプチドのドメインを包含する領域である。一実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ８αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えばマウス）ＣＤ８αシグナルペプチドをコードする配列を含む。あるいは、ヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８αシグナル配列をコードする配列を含み得る。一実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ８αポリペプチドは、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含み、キメラポリペプチドのヒト部分は配列番号５４のアミノ酸２８〜１７９に記載されている（別途配列番号５９に表されている）。

同様に、一実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ８βポリペプチドは、ヒト部分に、ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外ドメインの全てまたは実質的に全てを含む。一実施形態では、キメラＣＤ８βポリペプチドのヒト部分は、ＣＤ８βの免疫グロブリンＶ様ドメインの全てまたは実質的に全ての配列を含む。一実施形態では、キメラＣＤ８βポリペプチドのヒト部分をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするエクソンを少なくとも含む。一実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ８βポリペプチドのヒト部分は、ＣＤ８βのＩｇＧ Ｖ様ドメインをコードするエクソンを少なくとも含む。一実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ８βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えばマウス）ＣＤ８βシグナルペプチドをコードする配列を含む。あるいは、ヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８βシグナル配列をコードする配列を含み得る。一実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ８βポリペプチドは、配列番号５３に記載のアミノ酸配列を含み、キメラポリペプチドのヒト部分は、配列番号５３のアミノ酸１５〜１６５に記載されている（別途配列番号５８に表されている）。

一実施形態では、非ヒト動物は、キメラヒト／非ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチドを発現する。一部の実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチドのヒト部分は、１つまたは複数の保存的修飾または非保存的修飾（複数可）を含む。

一態様では、ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチド配列を発現する非ヒト動物であって、当該ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチド配列が、それぞれヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチド配列と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である非ヒト動物が提供される。特定の実施形態では、ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチド配列は、それぞれ実施例に記載のヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチド配列と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一実施形態では、ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチド配列は、１つまたは複数の保存的置換を含む。一実施形態では、ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチド配列は、１つまたは複数の非保存的置換を含む。

一部の実施形態では、キメラＣＤ８の一部、例えばヒト部分は、本明細書で示されている配列の実質的に全て（例えば、本明細書で示されているタンパク質ドメインの実質的に全て）を含み得る。実質的に全ての配列は、一般に、タンパク質の特定の部分（例えば、特定の機能的なドメインなど）を表すと考えられるアミノ酸の８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。機能的なドメインの境界は使用するアラインメントおよびドメイン予測方法に応じてわずかに変動し得ることが当業者には理解されよう。

一態様では、キメラヒト／非ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチドの非ヒト部分は、それぞれ、非ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチドの少なくとも膜貫通および／または細胞質ドメインを含む。ＣＤ８細胞質ドメインが果たす重要な機能に起因して、遺伝子操作された動物内に内在性非ヒト（例えばマウス）配列が保持されることにより、適切な細胞内シグナル伝達および補助受容体の他の機能の保存が確実になる。一実施形態では、非ヒト動物はマウスであり、非ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチドは、それぞれマウスＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチドである。実施例には特定のマウスＣＤ８αおよびＣＤ８β配列が記載されているが、それに由来する任意の適切な配列、例えば保存的／非保存的アミノ酸置換を含む配列が本明細書に包含される。一実施形態では、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えばマウス）は任意のヒト化されていない内在性配列を保持する。

本明細書に記載の非ヒト動物は、内在性遺伝子座に、キメラヒト／非ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。一態様では、これにより、内在性ＣＤ８α遺伝子の一部がヒトＣＤ８αポリペプチドの一部をコードするヌクレオチド配列で置き換えられ、かつ／または内在性ＣＤ８β遺伝子の一部がヒトＣＤ８βポリペプチドの一部をコードするヌクレオチド配列で置き換えられる。一実施形態では、そのような置き換えは、非ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βの細胞外ドメインの全てまたは実質的に全てをコードする内在性ヌクレオチド配列の、それをコードするヒトヌクレオチド配列での置き換えである。一実施形態では、そのような置き換えは、非ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βの免疫グロブリンＶ様ドメインの全てまたは実質的に全てを少なくともコードする配列の、それをコードするヒトヌクレオチド配列での置き換えである。一実施形態では、置き換えは、非ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするＣＤ８αおよび／またはＣＤ８β配列の置き換えを含まない。したがって、非ヒト動物は、内在性非ヒトＣＤ８遺伝子座に由来するキメラヒト／非ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチドを発現する。さらに別の実施形態では、置き換えにより、それぞれ配列番号５４および／または５３に記載されているポリペプチド配列を含むＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βタンパク質がもたらされる。

一実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ８遺伝子座（例えばキメラげっ歯類ＣＤ８遺伝子座、例えばキメラマウスＣＤ８遺伝子座）のヌクレオチド配列が提供される。一態様では、キメラヒト／非ヒト（例えば、ヒト／げっ歯類、例えば、ヒト／マウス）ＣＤ８αおよび／またはＣＤ８β配列はそれぞれの内在性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えばマウス）ＣＤ８αおよび／またはＣＤ８β遺伝子座に位置し、内在性ＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βプロモーターおよび調節エレメントを保持する。別の実施形態では、キメラ遺伝子座は、ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βプロモーターおよび調節エレメントを、それらにより、適切なＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βの発現（適切な空間的および時間的なタンパク質の発現）、ＣＤ８＋Ｔ細胞の発生、ＣＤ８系列選択、および補助受容体機能が可能になる限りでは含有してよい。したがって、一態様では、本発明の動物は、Ｔ細胞の適切な系列選択および発生が変更されない遺伝子改変を含む。一態様では、本発明の動物（例えば、げっ歯類、例えばマウス）は、通常ＣＤ８を発現する細胞以外の免疫細胞ではキメラＣＤ８タンパク質を発現せず、例えば、動物は、Ｂ細胞またはＣＤ４＋ＳＰ Ｔ細胞上でＣＤ８を発現しない。一実施形態では、置き換えにより、ＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βの発現の適切な空間的調節および時間的調節を可能にするエレメントが保持される。

本明細書に記載のヒトまたはヒト化ＣＤ８ポリペプチドを含む遺伝子改変非ヒト動物は、上のヒト化ＣＤ４動物に関する節に記載されている任意の動物から選択することができる。一実施形態では、非ヒト動物は、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウスであってよい。

したがって、一実施形態では、本発明は、ゲノム内、例えば内在性ＣＤ８遺伝子座に、キメラヒト／マウスＣＤ８αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／マウスＣＤ８βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む遺伝子改変マウスを提供する。一実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外ドメインの全てまたは実質的に全て、ならびにマウスＣＤ８αポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列を含み、第２のヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外ドメインの全てまたは実質的に全て、ならびにマウスＣＤ８βポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列を含み、マウスは機能的なキメラヒト／マウスＣＤ８タンパク質を発現する。一実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８αポリペプチドの少なくとも免疫グロブリンＶ様ドメインおよびマウスＣＤ８αポリペプチドの免疫グロブリンＶ様ドメイン以外の配列をコードする配列を含み、第２のヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８βポリペプチドの少なくとも免疫グロブリンＶ様ドメインおよびマウスＣＤ８βポリペプチドの免疫グロブリンＶ様ドメイン以外の配列をコードする配列を含む。一実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８αポリペプチドの少なくともＭＨＣ Ｉ結合性ドメインを含む。一実施形態では、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、それぞれ、少なくともヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするエクソンを含む。一実施形態では、ヒトＣＤ８αポリペプチドおよび／またはＣＤ８βポリペプチドの細胞外ドメインは、ヒトＣＤ８αポリペプチドおよび／またはＣＤ８βポリペプチドの膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインではないドメインを包含する領域である。一実施形態では、ヒトＣＤ８αポリペプチドのドメインは、図４および図５において概略的に示されている通りである。一実施形態では、ヒトＣＤ８βポリペプチドのドメインは、図３および図５に概略的に示されている通りである。一実施形態では、キメラヒト／マウスＣＤ８αポリペプチドおよび／またはＣＤ８βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それぞれマウスＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βシグナルペプチドをコードする配列を含む。あるいは、ヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βシグナル配列をコードする配列を含み得る。一実施形態では、マウスは、マウスＣＤ８αおよび／またはＣＤ８β細胞外ドメインの全てまたは実質的に全てをコードするヌクレオチド配列の、それぞれヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８β細胞外ドメインの全てまたは実質的に全てをコードするヌクレオチド配列での置き換えを含む。

一実施形態では、マウスは、その内在性ＣＤ８遺伝子座に由来する機能的な内在性マウスＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチドを発現しない。一実施形態では、本明細書に記載のマウスは、その生殖細胞系列内にキメラヒト／マウスＣＤ８配列を含む。

一態様では、キメラヒト／マウスＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチドを発現するマウスは、マウスＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βプロモーター配列および調節配列を保持する、例えばマウスにおいてキメラヒト／マウスＣＤ８をコードするヌクレオチド配列は、内在性マウスＣＤ８プロモーター配列および調節配列に作動可能に連結している。一態様では、マウスにおいて保持されるこれらの調節配列としては、Ｔ細胞の発生の適切な段階においてＣＤ８タンパク質の発現を調節する配列が挙げられる。一態様では、遺伝子改変マウスは、Ｂ細胞もしくはＣＤ４系列のＴ細胞、または通常内在性ＣＤ８を発現しない任意の細胞、例えば免疫細胞上でキメラＣＤ８を発現しない。

種々の実施形態では、本明細書に記載のキメラＣＤ８遺伝子座に由来する機能的なキメラＣＤ８タンパク質（例えば、ＣＤ８αβまたはＣＤ８αα）を発現する非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えばマウスまたはラット）は、細胞表面上にキメラタンパク質をディスプレイする。一実施形態では、非ヒト動物は、細胞表面上にキメラＣＤ８タンパク質をヒトにおいて観察されるものと同じ細胞分布で発現する。一態様では、本発明のＣＤ８タンパク質は、第２の細胞の表面上に発現するＭＨＣ Ｉタンパク質と相互作用することができる。

一実施形態では、本発明の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えばマウス）は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、したがって、動物のＴ細胞の表面上に発現するキメラＣＤ８タンパク質は、第２の細胞、例えば抗原提示細胞の表面上に発現するヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉと相互作用することができる。一実施形態では、ＭＨＣ Ｉタンパク質は、ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドの細胞外ドメインを含む。一実施形態では、動物は、ヒトまたはヒト化β−２ミクログロブリンポリペプチドをさらに含む。ヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉポリペプチドおよび／またはβ−２ミクログロブリンポリペプチドを発現する遺伝子改変動物の例は、どちらもそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年１０月２６日出願の米国特許出願第１３／６６１，１５９号、および２０１３年３月１１日出願の米国特許出願第１３／７９３，８１２号に記載されている。したがって、一実施形態では、本明細書に記載のキメラＣＤ８タンパク質を含む動物は、ヒト化ＭＨＣ Ｉ複合体をさらに含み得、当該ヒト化ＭＨＣ
Ｉ複合体は、（１）例えば、ヒトＭＨＣ Ｉ細胞外ドメインならびに内在性（例えばマウス）ＭＨＣ Ｉの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むヒト化ＭＨＣ Ｉポリペプチド、例えば、ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを含むヒト化ＭＨＣ Ｉポリペプチド、ならびに（２）ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを含む（例えば、動物は、そのゲノム内に、ヒトβ２ミクログロブリンのエクソン２、エクソン３、およびエクソン４に示されているヌクレオチド配列を含む）。一態様では、ヒト化ＭＨＣ Ｉおよびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドはどちらも、それぞれ内在性ＭＨＣ Ｉ遺伝子座およびβ２ミクログロブリン遺伝子座に位置するヌクレオチド配列によりコードされる；一態様では、動物は、機能的な内在性ＭＨＣ Ｉおよびβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現しない。したがって、動物によって発現するＭＨＣ Ｉは、キメラヒト／非ヒト、例えば、ヒト／げっ歯類（例えば、ヒト／マウス）ＭＨＣ Ｉポリペプチドであってよい。キメラＭＨＣ Ｉポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃからなる群から選択されるヒトＨＬＡクラスＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｃｗ６、またはヒト集団内に存在する任意の他のＨＬＡクラスＩ分子由来のものであってよい。動物がマウスである実施形態では、キメラＭＨＣ Ｉポリペプチドの非ヒト（すなわち、マウス）部分は、Ｈ−２Ｄ、Ｈ−２ＫおよびＨ−２Ｌから選択されるマウスＭＨＣ Ｉタンパク質由来のものであってよい。一態様では、本明細書に記載のキメラヒト／非ヒトＣＤ８および米国特許出願第１３／６６１，１５９号および同第１３／７９３，８１２号に記載のヒト化ＭＨＣ Ｉおよび／またはβ−２ミクログロブリンを含む非ヒト動物は、本明細書に記載のキメラＣＤ８遺伝子座（例えばキメラＣＤ８αおよび／またはＣＤ８β遺伝子座）を含む動物とヒト化ＭＨＣ Ｉおよび／またはβ−２ミクログロブリン遺伝子座を含む動物を掛け合わせることによって作製することができる。動物は、例えば、内在性ＣＤ８遺伝子座（例えばキメラＣＤ８αおよび／またはＣＤ８β遺伝子座）における置き換えのために、ヒト化ＭＨＣ Ｉおよび／またはβ−２ミクログロブリン遺伝子座を含む動物のＥＳ細胞にキメラＣＤ８（例えばキメラＣＤ８αおよび／またはＣＤ８β）をコードするヌクレオチド配列を導入することによって、またはキメラＣＤ８遺伝子座（例えばキメラＣＤ８αおよび／またはＣＤ８β遺伝子座）を含む動物のＥＳ細胞に、ヒト化ＭＨＣ Ｉおよび／またはβ−２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列（複数可）を導入することによって作製することもできる。

遺伝子操作された非ヒト動物に加えて、非ヒト胚（例えば、げっ歯類、例えばマウスまたはラットの胚）も提供され、当該胚は、本明細書に記載の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えばマウスまたはラット）に由来するドナーＥＳ細胞を含む。一態様では、胚は、キメラＣＤ８遺伝子を含むＥＳドナー細胞、および宿主胚細胞を含む。

本明細書に記載の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えばマウスまたはラット）に由来し、キメラＣＤ８タンパク質を発現する組織も提供される。

さらに、本明細書に記載の非ヒト動物から単離された非ヒト細胞が提供される。一実施形態では、細胞はＥＳ細胞である。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞である。一実施形態では、細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。

本明細書に記載の非ヒト動物の染色体またはその断片を含む非ヒト細胞も提供される。一実施形態では、非ヒト細胞は、本明細書に記載の非ヒト動物の核を含む。一実施形態では、非ヒト細胞は、核移植の結果として染色体またはその断片を含む。

一態様では、本明細書に記載のキメラＣＤ８ポリペプチド（例えば、ＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチド）をコードする遺伝子を含む非ヒト人工多能性細胞が提供される。一実施形態では、人工多能性細胞は、本明細書に記載の非ヒト動物に由来する。

一態様では、本明細書に記載の非ヒト動物の細胞に由来するハイブリドーマまたはクアドローマが提供される。一実施形態では、非ヒト動物はマウスまたはラットである。

一態様では、表面上にキメラＣＤ８タンパク質を担持するＴ細胞、およびキメラＣＤ８に結合する第２の細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ調製物が提供される。一実施形態では、第２の細胞は、ＭＨＣ Ｉポリペプチド、例えばキメラヒト／非ヒトＭＨＣ Ｉタンパク質を発現する細胞である。一実施形態では、第１の細胞の表面上のキメラＣＤ８は、第２の細胞の表面上のキメラＭＨＣ Ｉと相互作用する。一実施形態では、キメラＣＤ８タンパク質は、内在性細胞質ゾルの分子、例えば内在性細胞質ゾルシグナル伝達分子（例えば、内在性Ｌｃｋなど）との相互作用を保持する。

本明細書では、本明細書に記載の遺伝子操作された非ヒト動物を作出するための方法も提供される。当該方法により、内在性ＣＤ８遺伝子座に、キメラヒト／非ヒトＣＤ８αおよび／またはＣＤ８βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む動物がもたらされる。当該方法では、実施例に記載の通り、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して作出されたターゲティング構築物、ＥＳ細胞への構築物の導入、およびＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を使用したマウス胚への標的ＥＳ細胞クローンの導入を利用することができる。

一実施形態では、本発明は、非ヒト動物のＣＤ８遺伝子座を、本明細書に記載のキメラヒト／非ヒトＣＤ８ポリペプチドを発現するように改変する方法を提供する。一態様では、マウスのＣＤ８遺伝子座を、キメラヒト／マウスＣＤ８ポリペプチドを発現するように改変する方法であって、マウスの内在性ＣＤ８遺伝子座において、内在性マウスＣＤ８ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をキメラヒト／マウスＣＤ８ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換えるステップを含む方法が提供される。ＣＤ８ポリペプチドは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、およびその組合せから選択することができる。一態様では、キメラポリペプチドは、ヒトＣＤ８ポリペプチドの細胞外ドメインの全てまたは実質的に全て、ならびに内在性マウスＣＤ８ポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。

したがって、本明細書に記載の遺伝子改変動物を作製するためのヌクレオチド構築物も提供される。一態様では、ヌクレオチド構築物の配列は、５’および３’相同性アーム、ヒトＣＤ８αまたはＣＤ８β配列を含むＤＮＡ断片、および組換え部位と隣接する選択カセットを含む。一部の実施形態では、ヒト配列は、ヒトＣＤ８αまたはＣＤ８βのイントロンおよびエクソン、例えば、それぞれヒトＣＤ８αまたはＣＤ８βの細胞外ドメインをコードするエクソンを含む。一実施形態では、相同性アームは、非ヒトＣＤ８αまたはＣＤ８β配列と相同である。ＣＤ８αおよびＣＤ８βについての構築物の例はそれぞれ図４および図３に示されている。

ＣＤ８αおよびＣＤ８βをコードする遺伝子は染色体内で近くに局在化するので、２つの遺伝子を逐次的にターゲティングすることにより、上首尾のヒト化の機会が改善される。一実施形態では、ターゲティング戦略は、本明細書に記載のキメラＣＤ８β構築物をＥＳ細胞に導入するステップ、標的ＥＳ細胞からマウスを作製するステップ、該マウスから遺伝子改変ＥＳ細胞を引き出すステップ、および本明細書に記載のキメラＣＤ８α構築物を該遺伝子改変ＥＳ細胞に導入するステップを含む。別の実施形態では、ターゲティング戦略は、本明細書に記載のキメラＣＤ８β構築物をＥＳ細胞に導入するステップ、キメラＣＤ８β構築物が組み入れられた細胞を選択するステップ、本明細書に記載のキメラＣＤ８α構築物を、キメラＣＤ８β構築物が組み入れられ、それを有するＥＳ細胞に導入するステップ、およびキメラＣＤ８βおよびＣＤ８αの両方が組み入れられた細胞を選択するステップを含む。この実施形態の一態様では、選択するステップは、異なる選択マーカーを利用して実施する。代替の実施形態では、ＣＤ８αのヒト化を最初に実現することができる。遺伝子ターゲティングが完了したら、遺伝子改変非ヒト動物のＥＳ細胞をスクリーニングして、目的の外因性のヌクレオチド配列が上首尾に組み入れられたことまたは外因性のポリペプチドが発現することを、種々の方法（例えば、ＣＤ４のヒト化について上で記載されている方法、例えば、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記に記載の対立遺伝子アッセイの改変）によって確認することができる。

一態様では、キメラヒト／非ヒトＣＤ８分子（例えば、ＣＤ８αおよび／またはＣＤ８β）を作出するための方法であって、単一細胞において本明細書に記載のヌクレオチド構築物（複数可）からキメラＣＤ８ポリペプチド（複数可）を発現させるステップを含む方法が提供される。一実施形態では、ヌクレオチド構築物はウイルスベクターであり、特定の実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。一実施形態では、細胞は、ウイルス核酸配列（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）を発現するＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、および網膜細胞から選択される。

一態様では、キメラＣＤ８タンパク質を発現する細胞が提供される。一実施形態では、細胞は、本明細書に記載のキメラＣＤ８配列（複数可）を含む発現ベクターを含む。一実施形態では、細胞は、ウイルス核酸配列（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）を発現するＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、および網膜細胞から選択される。

本明細書に記載の非ヒト動物によって作製されるキメラＣＤ８分子であって、ヒトＣＤ８タンパク質（例えば、ＣＤ８αおよび／またはＣＤ８β）由来の細胞外ドメインの全てまたは実質的に全て、ならびに非ヒトＣＤ８タンパク質、例えばマウスＣＤ８タンパク質由来の少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むキメラＣＤ８分子も提供される。例示的なキメラＣＤ８αポリペプチドは配列番号５４に記載されており、例示的なキメラＣＤ８βタンパク質は配列番号５３に記載されている。
遺伝子改変ＣＤ４動物および遺伝子改変ＣＤ８動物の使用

ヒト化ＣＤ４およびＭＨＣ ＩＩまたはヒト化ＣＤ８およびＭＨＣ Ｉのいずれかを含む遺伝子改変非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えばマウスまたはラットは、複合体の構成成分の実質的に全てがヒトのものまたはヒト化されたものであるので、ペプチドをＴ細胞（それぞれＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞）にヒト様の様式で提示する。本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、ヒト化動物におけるヒト免疫系の機能を試験するため；例えば、ワクチン開発において使用するための、免疫応答を引き出す抗原および抗原エピトープ（例えばＴ細胞エピトープ、例えば、独特のヒトがんエピトープ）を同定するため；例えば、適応Ｔ細胞療法（ａｄａｐｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）において使用するための、ヒト病原体またはがん抗原に対する高親和性Ｔ細胞（すなわち、ヒトＭＨＣ Ｉ複合体の状況で抗原に高い結合活性で結合するＴ細胞）を同定するため；ワクチン候補および他のワクチン戦略を評価するため；ヒト自己免疫を研究するため；ヒト感染症を研究するため；および他の点で、ヒトＭＨＣおよびＣＤ４／ＣＤ８発現に基づくよりよい治療戦略を考案するために使用することができる。

したがって、種々の実施形態では、本発明の遺伝子操作された動物は、とりわけ、ヒトにおける免疫応答を開始させる抗原の能力を評価するため、および抗原の多様性を生じさせ、ヒトワクチン開発において使用することができる特定の抗原を同定するために有用である。

一態様では、ペプチドによりヒトにおける細胞性免疫応答が惹起されるかどうかを決定するための方法であって、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物をペプチドに曝露するステップ、非ヒト動物に免疫応答を開始させるステップ、および本明細書に記載のキメラヒト／非ヒトＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩ分子によって提示されたペプチドの配列に結合する非ヒト動物細胞（例えば、それぞれヒトＣＤ８またはＣＤ４を含むＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞）を検出するステップを含む方法が提供される。一実施形態では、曝露後の非ヒト動物は、ペプチドに結合するＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む。別の実施形態では、曝露後の非ヒト動物は、ペプチドに結合するＭＨＣ ＩＩ制限ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。

一態様では、ヒトＴ細胞エピトープを同定するための方法であって、本明細書に記載の非ヒト動物を、推定Ｔ細胞エピトープを含む抗原に曝露するステップ、非ヒト動物に免疫応答を開始させるステップ、非ヒト動物から、エピトープに結合するＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞またはＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞を単離するステップ、および該Ｔ細胞が結合したエピトープを同定するステップを含む方法が提供される。

一態様では、ヒトにおけるＴ細胞応答を生じさせる抗原を同定するための方法であって、推定抗原を本明細書に記載のマウスに曝露するステップ、マウスに免疫応答を生じさせるステップ、およびＨＬＡクラスＩ制限分子またはクラスＩＩ制限分子が結合した抗原を同定するステップを含む方法が提供される。

一態様では、推定抗原が、ヒト免疫系に曝露するとＨＬＡクラスＩ制限免疫応答またはクラスＩＩ制限免疫応答を生じるエピトープを含有するかどうか決定するための方法であって、本明細書に記載のマウスを推定抗原に曝露するステップ、およびマウスにおける抗原特異的なＨＬＡクラスＩ制限免疫応答またはＨＬＡクラスＩＩ制限免疫応答を測定するステップを含む方法が提供される。

さらに、本明細書に記載の遺伝子操作された非ヒト動物は、目的の抗原、例えば、腫瘍または別の疾患の抗原を認識するＴ細胞受容体、例えば、結合活性が高いＴ細胞受容体を同定するために有用であり得る。当該方法は、本明細書に記載の非ヒト動物を抗原に曝露するステップ、非ヒト動物に抗原に対する免疫応答を開始させるステップ、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩによって提示される抗原に結合するＴ細胞受容体を含む非ヒト動物Ｔ細胞を単離するステップ、および該Ｔ細胞受容体の配列を決定するステップを含み得る。

一実施形態では、推定ヒト治療薬によるＴ細胞活性化を決定するための方法であって、本明細書に記載の遺伝子改変動物を推定ヒト治療薬に曝露する（または、例えば、そのような動物のヒトまたはヒト化ＭＨＣ ＩＩ発現細胞またはＭＨＣ Ｉ発現細胞を推定治療薬のペプチド配列に曝露する）ステップ、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ／ペプチド複合体をディスプレイする遺伝子改変動物の細胞を、遺伝子改変動物の細胞に結合することができるキメラヒト／非ヒト（例えば、ヒト／マウス）ＣＤ４またはＣＤ８を含むＴ細胞に曝露するステップ、および遺伝子改変動物のペプチドをディスプレイしている細胞によって誘導されるＴ細胞の活性化を測定するステップを含む方法が提供される。

ヒト病原体または新生物から抗原および抗原エピトープを同定できることに加えて、本発明の遺伝子改変動物は、ヒト自己免疫疾患、例えば、１型糖尿病、多発性硬化症などに関連する自己抗原を同定するために使用することができる。また、本発明の遺伝子改変動物は、ヒト自己免疫疾患の種々の態様を研究するために使用すること、および自己免疫疾患モデルとして利用することもできる。

本明細書に記載の遺伝子改変動物、すなわち、ヒトまたはヒト化Ｔ細胞補助受容体（例えばキメラヒト／非ヒトＣＤ４またはＣＤ８）を含み、任意選択で、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ ＩＩまたはＩタンパク質をさらに含む動物の他の使用は、本開示から明らかになるであろう。

本発明を以下の非限定的な実施例によりさらに例示する。これらの実施例は本発明の理解を補助するために記載されており、いかなる形でもその範囲を限定するものではなく、そのように解釈されるべきである。実施例には、当業者には周知であろう従来の方法（分子クローニング技法など）の詳細な説明は含まれない。別段の指定のない限り、部分は重量による部分であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏で示されており、圧力は大気または大気付近の圧力である。
（実施例１）
遺伝子改変ＣＤ４マウスの構築および特徴付け
実施例１．１：キメラＣＤ４遺伝子座の工学的操作

マウスＣＤ４遺伝子座を、ヒト細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡおよびマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡからＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３年）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ
ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照されたい）を使用して独特のターゲティングベクターを構築することによって単一のステップでヒト化した。ターゲティングベクターを作製するために、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡを使用した一連の細菌相同組換え（ＢＨＲ）、ならびに他の工学的操作ステップを行った。

簡単に述べると、４つのＤＮＡ断片（１）マウスシグナルペプチド（マウスＣＤ４遺伝子のエクソン２およびエクソン３によりコードされる）を含有する断片、（２）マウスシグナルペプチドの下流のヒトエクソン３を含有する断片、（３）Ａｓｃ Ｉ部位およびＰＩ−ＳｃｅＩ部位が隣接するＳＰＥＣ耐性カセットを含有する断片、および（４）マウスＣＤ４エクソン６の約２００ｂｐ下流で始まる１６０ｂｐのマウスＣＤ４イントロン６（エクソン６とエクソン７の間のイントロン）を含有する断片をインフュージョンライゲーション（ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｌｉｇａｔｉｏｎ）（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）によって接合した。生じたＤＮＡ断片は、５’から３’までに、マウスエクソン２、マウスイントロン２、シグナルペプチドを含有するマウスエクソン３の一部、ヒトシグナルペプチドの下流のヒトエクソン３、ヒトイントロン３の一部、ＳＰＥＣカセット、マウスイントロン６の一部を含有した。このＤＮＡ断片をＢＨＲに使用して、マウスＣＤ４ Ｉｇ様ドメイン１〜３をコードするマウス配列が欠失するように、およびヒトＣＤ４のエクソン３が導入されるように、マウスＢＡＣクローンＢＭＱ３９１Ｆ０８を改変した。ＢＡＣのＣＭカセットでＳＰＥＣカセットを置換し、それにより、第１のＢＡＣベクターがもたらされた（図１、上の図）。

ヒトＢＡＣ ＲＰ１１−１０１Ｆ２１をＢＨＲにより、ＡｓｃＩ−ＬｏｘＰ−ＰＧＫ−ｎｅｏ−ｌｏｘＰカセットがヒトエクソン３の６０ｂｐ下流に導入されるように、およびＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位およびＳＰＥＣカセットがエクソン６の約１００ｂｐ下流に導入されるように改変し、これにより、第２のＢＡＣベクターがもたらされた（図１、中央の図）。このステップの後に、ＡｓｃＩ制限酵素およびＰＩ−ＳｃｅＩ制限酵素を用いた消化の後、第１のＢＡＣベクターおよび第２のＢＡＣベクターのＢＡＣ間ライゲーションを行って、ＣＤ４ターゲティングベクターを作製した（図１、下の図）。マウス−ヒト配列およびヒト−マウス配列の上流および下流の接合部は、それぞれ以下の表１に列挙されており、また、配列表に記載されている。ヒトイントロン３−ｌｏｘ−ｎｅｏカセット接合部（カセットの５’末端）にわたる配列は配列番号５５に記載されており、ｌｏｘ−ｎｅｏカセット−ヒトイントロン３接合部（カセットの３’末端）にわたる配列は配列番号５６に記載されており、どちらの配列も、表１にも列挙されている。図１に示されているｐｇｋ−ｎｅｏカセットを含めたヒト化ＣＤ４片の完全な核酸配列は配列番号３に記載されている。ｐｇｋ−ｎｅｏカセットは配列番号３の残基３０７〜２１７６にわたり、２つのｌｏｘ部位は残基２６７〜３００および２１８２〜２２１５に位置し、ヒト配列は残基１〜２３４および２２２２〜１８２６３にわたる。完全ヒト化ＣＤ４タンパク質のアミノ酸配列は配列番号４に記載されており、ヒト配列はアミノ酸２７〜３１９にわたる（配列番号５７に記載されている）。

ヒトＣＤ４ターゲティングベクターを、ＮｏｔＩを用いて直線化し、Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞に電気穿孔により導入した。ヒト化ＣＤ４遺伝子座を担持する標的ＥＳ細胞を、対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら）の改変を使用した遺伝子型決定によって同定し、それによりネオマイシンカセットおよびヒトＣＤ４遺伝子、ならびにマウスＣＤ４遺伝子の１つのコピーの存在が検出された。このアッセイにおいて使用したプライマーおよびプローブは表２に示されており、また、配列表に記載されている。

ヒト化ＣＤ４遺伝子座を含有するＥＳ細胞にＣｒｅリコンビナーゼを発現するプラスミドを電気穿孔により導入することによってＦｌｏｘｅｄネオマイシン耐性カセットを除去した。

耐性マーカーを有さないヒト化ＣＤ４遺伝子座を担持する標的ＥＳ細胞を遺伝子型決定によって同定し、それによりネオマイシンカセットの不在、ヒトＣＤ４遺伝子の１つのコピーおよびマウスＣＤ４遺伝子の１つのコピーの存在が検出された。

上記の標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７年）Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｅ ｔｈａｔ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい）によって８細胞期マウス胚に導入した。キメラＣＤ４遺伝子を独立に担持するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）を、対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記）の改変を使用した遺伝子型決定によって同定し、それにより独特のヒトＣＤ４遺伝子配列の存在が検出された。
（実施例１．２）
遺伝子操作されたマウスにおけるキメラＣＤ４の発現

ＷＴまたはヘテロ接合性ヒト化ＣＤ４マウス（「１７６６ＨＥＴ」）由来の脾臓を、コラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて灌流し、ＡＣＫ溶解緩衝液を用いて赤血球を溶解させた。ヒトＣＤ４またはマウスＣＤ４の細胞表面での発現を、それぞれ抗ヒトＣＤ４抗体または抗マウスＣＤ４抗体のいずれかを使用したＦＡＣＳによって分析した。図２Ａおよび図２Ｂに示されている通り、本明細書に記載のヒト化ＣＤ４についてヘテロ接合性であるマウスから得られたＴ細胞の表面上でヒトＣＤ４が発現された。
（実施例２）
遺伝子改変ＣＤ８マウスの構築および特徴付け

ＣＤ８タンパク質は、ジスルフィド連結したホモ二量体（例えば、ＣＤ８αホモ二量体）もしくは２つのサブユニットのホモ多量体のいずれかとして、または２つのタンパク質、ＣＤ８α（ＣＤ８ａ）およびＣＤ８β（ＣＤ８ｂ）のヘテロ二量体として存在する。ＣＤ８αおよびＣＤ８β遺伝子はゲノム内、例えば、マウス第６染色体上に共局在しており、これらは互いと約３７ｋｂ離れて位置する。そのような近いつながりにより、掛け合わせによってＣＤ８α遺伝子座とＣＤ８β遺伝子座の両方にヒト化を含む遺伝子改変マウスを作製することが非常に難しいものになっている。したがって、まず１つの遺伝子、例えばＣＤ８βを導入し、その後、第２の遺伝子、例えばＣＤ８αを導入する逐次的なターゲティングが実施される。
（実施例２．１）
キメラＣＤ８β遺伝子座の工学的操作

マウスＣＤ８ｂ遺伝子座を、マウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡから、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３年）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照されたい）を使用して独特のターゲティングベクターを構築することにより単一のステップでヒト化した。ＣＤ８ｅｃｔｏドメイン（イントロン１内の５’接合部からイントロン３内の３’接合部まで）をコードするマウスエクソン２〜３の、相同なヒト配列での置き換えが含有されるように、ＢＡＣ ＲＰ２３−４３１Ｍ６由来のＤＮＡをＢＨＲによって改変して大きなターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）、ＭＡＩＤ１７３７を作製した（図３）。ｌｏｘｐ−Ｕｂ−Ｈｙｇカセットをイントロン３内の３’接合部に挿入した。生じたベクターの種々の接合部にあるヌクレオチド配列は表３に列挙されており、また、配列表に記載されている。ヒト化ＣＤ８βタンパク質の完全なアミノ酸配列は配列番号５３に記載されており、ヒト配列はアミノ酸１５〜１６５にわたる（配列番号５８に記載されている）。

ターゲティングベクターをＦ１Ｈ４マウスＥＳ細胞に電気穿孔により導入した（図５、左側）。ヒト化ＣＤ８ｂ遺伝子座を担持する標的ＥＳ細胞を、対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら）の改変を使用した遺伝子型決定によって同定し、それによりヒトＣＤ８ｂ遺伝子の存在が検出された。このアッセイにおいて使用したプライマーおよびプローブは表４に示されており、また、配列表に記載されている。

上記の標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７年）Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｅ ｔｈａｔ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい）によって８細胞期マウス胚に導入した。キメラＣＤ８ｂ遺伝子を独立に担持するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）を対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記）の改変を使用した遺伝子型決定によって同定し、それにより独特のヒトＣＤ８ｂ遺伝子配列の存在が検出された。

選択カセットは当業者に公知の方法によって除去することができる。例えば、ヒトＣＤ８ｂ遺伝子配列を含有するターゲティング構築物を挿入することによって導入した「ｌｏｘｅｄ」ハイグロマイシンカセットを除去するために、キメラヒト／マウスＣＤ８ｂ遺伝子座を担持するＥＳ細胞に、Ｃｒｅを発現する構築物をトランスフェクトすることができる。ハイグロマイシンカセットは、任意選択で、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するマウスと掛け合わせることによって除去することができる。任意選択で、ハイグロマイシンカセットはマウス内に保持される。一実施形態では、カセットを欠失させてＭＡＩＤ１７３９を作製する。
（実施例２．２）
キメラＣＤ８α遺伝子座の工学的操作

マウスＣＤ８ａ遺伝子座を、マウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡから、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記を参照されたい）を使用して独特のターゲティングベクターを構築することにより単一のステップでヒト化した。ＣＤ８ａ ｅｃｔｏドメイン（マウスエクソン１内のＡｌａコドン２７にある５’接合部からマウスイントロン２内の３’接合部まで）をコードするマウスエクソン１〜２の、相同なヒト配列（ヒトエクソン２内の５’接合部からイントロン３内の３’接合部まで（図４））での置き換えが含有されるように、ＢＡＣ ＲＰ２３−４３１Ｍ６由来のＤＮＡをＢＨＲによって改変して大きなターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）、ＭＡＩＤ１７３８を作製した。これにより、エクソン１の開始点にあるマウスリーダー配列は保持される。ｌｏｘ２３７２−Ｕｂ−Ｎｅｏカセットをヒト／マウスの配列の３’接合部に挿入した。生じたベクターの種々の接合部にあるヌクレオチド配列は表５に列挙されており、また、配列表に記載されている。ヒト化ＣＤ８αポリペプチドの完全なアミノ酸配列は配列番号５４に記載されており、ヒト配列はアミノ酸２８〜１７９にわたる（配列番号５９に記載されている）。

上記のヒト化ＣＤ８ａターゲティングベクターを、ヒト化ＣＤ８ｂ遺伝子座を含有するマウスＥＳ細胞に電気穿孔により導入して、ヒト化ＣＤ８ｂおよびＣＤ８ａ遺伝子座を含む改変ＥＳ細胞を創製した（図５）。ヒト化ＣＤ８ａ遺伝子座を担持する標的ＥＳ細胞を、対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら）の改変を使用した遺伝子型決定によって同定し、それによりヒトＣＤ８ａ遺伝子の存在が検出された。このアッセイにおいて使用したプライマーおよびプローブは表６に示されており、また、配列表に記載されている。

上記の標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら、上記を参照されたい）によって８細胞期マウス胚に導入した。キメラＣＤ８ｂ遺伝子およびキメラＣＤ８ａ遺伝子を担持するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）を対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記）の改変を使用した遺伝子型決定によって同定し、それにより独特のヒトＣＤ８ｂおよびＣＤ８ａ遺伝子配列の存在が検出された。

あるいは、本明細書に記載のヒト化ＣＤ８ａターゲティングベクターを、ヒト化ＣＤ８ｂ遺伝子座を含有しないマウスＥＳ細胞に電気穿孔により導入して、ヒト化ＣＤ８ａ遺伝子座のみを含むマウスを作製する。

ＣＤ８ａ遺伝子座内の選択カセットは、例えば、上の実施例２．１に記載の通り、当業者に公知の方法によって除去することができる。一実施形態では、選択カセットを欠失させてＭＡＩＤ１７４０マウスを作製する。
（実施例２．３）
遺伝子操作されたマウスにおけるキメラＣＤ８の発現

ヒト化ＣＤ８ａ遺伝子（ＭＡＩＤ１７４０）およびＣＤ８ｂ遺伝子（ＭＡＩＤ１７３９）の両方についてヘテロ接合性であるマウスを、ヒトＣＤ８の発現について分析した。

ヒトＣＤ８ａおよびＣＤ８ｂの発現は、ヘテロ接合体の脾臓に由来するＣＤ３＋ＣＤ４−Ｔ細胞の表面上では明白に検出可能であったが、野生型動物では明白には検出可能でなかった（図６）。

ヒトＣＤ８ａおよびＣＤ８ｂの発現は、ヘテロ接合性から得た胸腺細胞の表面上でも検出可能であったが、野生型動物では明白には検出可能でなかった（図７）。
均等物

当業者は、常套的な実験だけを使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの均等物を理解する、または確認することができる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。

全ての非特許文献、本出願全体を通して引用されている特許出願および特許の全内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (1)

1. 図面に記載の発明。