RS58962B1 - Miševi koji ispoljavaju humanizovane t-ćelijske koreceptore - Google Patents

Miševi koji ispoljavaju humanizovane t-ćelijske koreceptore

Info

Publication number
RS58962B1
RS58962B1 RS20190870A RSP20190870A RS58962B1 RS 58962 B1 RS58962 B1 RS 58962B1 RS 20190870 A RS20190870 A RS 20190870A RS P20190870 A RSP20190870 A RS P20190870A RS 58962 B1 RS58962 B1 RS 58962B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
polypeptide
human
mouse
rodent
mhc
Prior art date
Application number
RS20190870A
Other languages
English (en)
Inventor
Lynn Macdonald
Andrew J Murphy
Naxin Tu
Vera Voronina
Cagan Gurer
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS58962B1 publication Critical patent/RS58962B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70514—CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/02—Cells from transgenic animals

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Description

Opis
SPISAK SEKVENCI
[0001] Predmetna specifikacija se poziva na spisak sekvenci podnet u elektronskoj formi kao ascii .txt datoteka pod nazivom „2010794-0441_ST25“ 20. februara, 2014..txt datoteka je stvorena 13. februara, 2014. i veličine je 47 kb.
OBLAST PRONALASKA
[0002] Predmetni pronalazak se odnosi na glodara, (npr. miša ili pacova) koji je genetski modifikovan kako bi ispoljavao humanizovani T-ćelijski koreceptor. Pronalazak se odnosi na glodara modifikovanog kako bi koispoljavao humanizovani CD4 koreceptor i humanizovani glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) II. Pronalazak se dalje odnosi na glodara modifikovanog kako bi ko-ispoljavao humanizovani CD8 koreceptor i humanizovani MHC I. Metode za pravljenje genetski modifikovanog glodara koji ispoljava humanizovani T-ćelijski koreceptor (npr. humanizovani CD4 ili CD8) su takođe date. Metode za upotrebu genetski modifikovanih životinja koje ispoljavaju humanizovane T ćelijske koreceptore za razvijanje terapeutskih sredstava za ljude su takođe obelodanjene.
POZADINA PRONALASKA
[0003] U adaptivnom imunom odgovoru, spoljašnji antigeni se prepoznaju molekulima receptora na B limfocitima (npr. imunoglobulini) i T limfocitima (npr. T ćelijski receptor ili TCR). Ovi spoljašnji antigeni su predstavljeni na površini ćelija kao fragmenti peptida specijalnim proteinima, koji se generički nazivaju kao molekuli glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC). Za vreme odgovora posredovanog T ćelijama, antigeni predstavljeni MHC molekulima su prepoznati od strane T ćelijskog receptora. Međutim, potrebno je više od prepoznavanja od strane T ćelijskog receptora MHC antigenskog kompleksa za delotvoran imuni odgovor. Vezivanje molekula T ćelijskog koreceptora (npr. CD4 ili CD8) za invarijantni proton MHC je takođe potrebno.
[0004] T ćelije imaju nekoliko varijanti, uključujući pomoćne T ćelije i citotoksične T ćelije. Pomoćne T ćelije ispoljavaju koreceptor CD4 i prepoznaju antigene vezane za molekule MHC II. CD4+ T ćelije aktiviraju druge efektorske ćelije u imunom sistemu, npr. aktiviraju MHC II koji ispoljava B ćelije za proizvodnju antitela, aktiviraju MHC II koji ispoljava makrofage za uništavanje patogena, itd. Vezivanje CD4 i T ćelijskog receptora isti MHC II-predstavljeni spoljašnji antigen čini T ćelije značajno osetljivije na taj antigen.
[0005] U suprotnosti, citotoksične T ćelije (CTL) ispoljavaju koreceptor CD8 i prepoznaju spoljašnje antigene vezane za molekule MHC I. CTL su specijalizovane za ubijanje bilo koje ćelije koja nosi MHC I-vezani peptid prepoznat od strane TCR vezanog za njegovu sopstvenu membranu. Kada ćelija prikazuje peptide izvedene iz ćelijskih proteina koji obično nisu prisutno (npr. virusnog, tumorskog ili drugog porekla koje nije originalno), takvi peptidi se prepoznaju od strane CTL, koje postaju aktivirane i ubijaju ćeliju koja prikazuje peptid. Slično CD4, angažovanje CD8 čini CTL osetljivije na MHC I-predstavljeni antigen.
[0006] Neće svi antigeni izazvati aktiviranje T ćelija zbog mehanizama tolerancije. Međutim, kod nekih bolesti (npr. rak, autoimune bolesti) peptidi izvedeni iz originalnih proteina postaju cilj ćelijske komponente imunog sistema, što za rezultat daje uništavanje ćelija koje predstavljaju takve peptide. Došlo je do značajnog napredovanja pri prepoznavanju antigena koji su klinički značajni (npr. antigeni povezani sa različitim tipovima raka). Međutim, u cilju poboljšavanja identifikacije i odabira peptida koji će izazvati pogodan odgovor u ljudskim T ćelijama, naročito za peptide klinički značajnih antigena, i dalje preostaje potreba za in vivo i in vitro sistemima koji oponašaju aspekte ljudskom imunog sistema. Zbog toga, postoji potreba za biološkim sistemima (npr. genetski modifikovane životinje koje nisu čovek i ćelije) koji mogu prikazati komponente ljudskog imunog sistema.
[0007] US 2007/0209083 opisuje transgene miševe kod kojih je međudejstvo između molekula MHC i T-ćelijskog koreceptora delimično humanizovano.
REZIME PRONALASKA
[0008] Glodari koji sadrže ne-ljudske ćelije koje ispoljavaju ljudske ili humanizovane molekule koji imaju funkciju u ćelijskom imunom odgovoru su dati.
[0009] Ovde je dat genetski modifikovani glodar, koji sadrži u svom genomu nukleotidnu sekvencu koja kodira ljudski ili humanizovani polipeptid T-ćelijskog koreceptora. U različitim otelotvorenjima, ovde je dat genetski modifikovani glodar, koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni polipeptid T ćelijskog koreceptora čoveka/glodara. Nukleotidna sekvenca je prisutna u endogenom lokusu T-ćelijskog koreceptora. U jednom otelotvorenju, ljudski deo himernog polipeptida T-ćelijskog koreceptora sadrži ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen ljudskog T-ćelijskog koreceptora, i glodar ispoljava funkcionalni himerni polipeptid T-ćelijskog koreceptora. Deo himernog polipeptida T-ćelijskog koreceptora glodara sadrži bar transmembranske i citoplazmatske domene T-ćelijskog koreceptora glodara, i glodar ispoljava funkcionalni himerni polipeptid T-ćelijskog koreceptora. U jednom aspektu pronalaska, himerni polipeptid T-ćelijskog koreceptora se ispoljava samo na T ćelijama glodara, npr. ne ispoljava se na B ćelijama glodara. Glodar ne ispoljava funkcionalni T-ćelijski koreceptor glodara u svom endogenom receptoru T-ćelijskog koreceptora glodara. U jednom aspektu pronalaska, himerni polipeptid T-ćelijskog koreceptora se nalazi u germinalnoj liniji glodara. U jednom aspektu, glodar sadrži u endogenom lokusu T-ćelijskog koreceptora jednu ili dve kopije nukleotidne sekvence koja kodira himerni polipeptid T-ćelijskog koreceptora; zbog toga, glodar može biti heterozigotan ili homozigotan za nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni polipeptid T-ćelijskog koreceptora.
[0010] U jednom otelotvorenju, T-ćelijski koreceptor je CD4. Zbog toga, pronalazak pruža genetski modifikovanog glodara koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD4 polipeptid čoveka/glodara. Nukleotidna sekvenca je prisutna u endogenom lokusu CD4. Glodar je, npr., miš ili pacov. Prema tome, u jednom otelotvorenju, dat je genetski modifikovani miš koji sadrži u svom endogenom lokusu CD4 nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD4 polipeptid čoveka/miša, gde ljudski deo himernog CD4 polipeptida sadrži ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen ljudskog CD4 polipeptida, dok deo himernog CD4 polipeptida miša sadrži bar transmembranske i citoplazmatske domene CD4 polipeptida miša i gde miš ispoljava funkcionalni himerni CD4 čoveka/miša. U jednom otelotvorenju, dat je genetski modifikovani miš koji sadrži u svom endogenom lokusu CD4 nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD4 polipeptid čoveka/miša, gde ljudski deo himernog CD4 polipeptida sadrži bar ceo ili suštinski sve domene D1-D3 CD4 polipeptida čoveka, dok deo himernog CD4 polipeptida miša sadrži bar transmembranske i citoplazmatske domene CD4 polipeptida miša i gde miš ispoljava funkcionalni himerni CD4 čoveka/miša. Miš ne ispoljava funkcionalni endogeni CD4 miša u svom endogenom lokusu CD4 miša. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira himerni CD4 polipeptid čoveka/miša je operativno spojena sa endogenim promoterom miša i regulatornim sekvencama. Prema tome, u jednom otelotvorenju, miš ne ispoljava himerni CD4 protein na B ćelijama ili T ćelijama CD8 porekla. U jednom otelotvorenju, ljudski deo himernog CD4 proteina sadrži aminokiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO:57. U jednom otelotvorenju, himerni CD4 polipeptid čoveka/miša je iznet u SEQ ID NO:4.
[0011] Genetski modifikovani glodar, npr. genetski modifikovani miš, koji sadrži himerni CD4 polipeptid koji je ovde opisan dalje sadrži humanizovani MHC II protein, gde MHC II protein sadrži vanćelijski domen ljudskog MHC II α polipeptida i vanćelijski domen ljudskog MHC II β polipeptida. U jednom otelotvorenju, životinja je miš i miš sadrži u endogenom lokusu MHC II (1) nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni MHC II α polipeptid čoveka/miša gde ljudski deo MHC II α polipeptida sadrži vanćelijski domen ljudskog MHC II α, i transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC II α polipeptida miša, i (2) nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni MHC II β polipeptid čoveka/miša, gde ljudski deo MHC II β polipeptida sadrži vanćelijski domen ljudskog MHC II β, i transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC II β polipeptida miša. Genetski modifikovani glodari, npr. miš, koji sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju himerne MHC II čoveka/glodara, npr. čoveka/miša su opisani detaljnije u patentnim prijavama SAD br. 13/661,116 i 13/793,935. U jednom otelotvorenju, životinja koja ispoljava humanizovane CD4 i/ili MHC II proteine je stvorena zamenjivanjem dela gena endogenog CD4 i/ili MHC II glodara, npr. miša na CD4 i/ili MHC II lokusima, respektivno.
[0012] Prema tome, takođe je data metoda za modifikovanje CD4 lokusa glodara, npr. miša, kako bi ispoljavao himerni CD4 polipeptid čoveka/miša koji obuhvata zamenjivanje na endogenom CD4 lokusu nukleotidne sekvence koja kodira endogeni CD4 polipeptid glodara, npr. miša sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni CD4 polipeptid čoveka/miša. U jednom otelotvorenju, himerni CD4 polipeptid čoveka/glodara, npr. čoveka/miša sadrži bar cele ili suštinski cele domene D1-D3 CD4 polipeptida čoveka i bar transmembranske i citoplazmatske domene endogenog CD4 polipeptida glodara, npr. miša. U jednom otelotvorenju, ispoljeni himerni CD4 čoveka/miša je iznet u SEQ ID NO:4.
[0013] U drugom otelotvorenju, T-ćelijski koreceptor je CD8. Zbog toga, u jednom aspektu, pronalazak pruža genetski modifikovanog glodara koji sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju himerni CD8α i/ CD8β polipeptid čoveka/glodara. Nukleotidna sekvenca je prisutna u endogenom lokusu CD8. U jednom otelotvorenju, životinja je glodar, npr. miš ili pacov. Prema tome, u jednom otelotvorenju, dat je genetski modifikovani miš koji sadrži u svom endogenom CD8α i CD8β lokusu) prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD8α polipeptid čoveka/miša i drugu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD8β polipeptid čoveka miša, gde prva nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu koja kodira ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen ljudskog CD8α polipeptida i bar transmembranske i citoplazmatske domene CD8α polipeptida miša, i gde druga nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu koja kodira ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen ljudskog CD8β polipeptida i bar transmembranske i citoplazmatske domene CD8β polipeptida miša, gde miš ispoljava funkcionalni himerni CD8 protein čoveka/miša. Miš ne ispoljava funkcionalni endogeni CD8 polipeptid miša u svom endogenom lokusu CD8 miša. U jednom otelotvorenju, prva nukleotidna sekvenca je operativno spojena sa endogenim CD8α promoter miša i regulatorne sekvence, i druga nukleotidna sekvenca je operativno spojena sa endogenim CD8β promoterom miša i regulatornim sekvencama. Prema tome, u jednom otelotvorenju, miš ne ispoljava himerni CD8 protein na B ćelijama ili T ćelijama CD4 porekla. U jednom otelotvorenju, ljudski deo himernog CD8α i/ili β polipeptida sadrži imunoglobulin V-nalik domen ljudskog CD8α i/ili β polipeptida. U jednom otelotvorenju, ljudski deo himernog CD8α polipeptida čoveka/miša sadrži aminokiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO:59. U jednom otelotvorenju, ljudski deo himernog CD8β polipeptida čoveka/miša sadrži aminokiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO:58. U jednom otelotvorenju, himerni CD8α polipeptid čoveka/miša je iznet u SEQ ID NO:54, a himerni CD8β polipeptid čoveka/miša je iznet u SEQ ID NO:53.
[0014] Genetski modifikovani glodar, npr. genetski modifikovani miš, koji sadrži himerni CD8α i/ β polipeptid koji je ovde opisan dalje sadrži humanizovani MHC I protein, gde MHC I protein sadrži vanćelijski domen ljudskog MHC I polipeptida. Prema tome, glodar može sadržati humanizovani MHC I protein i ljudski ili humanizovani β2 mikroglobulin polipeptid. U jednom otelotvorenju, glodar je miš i miš sadrži u endogenom MHC I lokusu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni MHC I polipeptid čoveka/miša, gde ljudski deo MHC I polipeptida sadrži vanćelijski domen ljudskog MHC I polipeptida i transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC I polipeptida miša; i glodar takođe sadrži u endogenom β2 mikroglobulin lokusu nukleotidnu sekvencu koja kodira ljudski ili humanizovani β2 mikroglobulin. Genetski modifikovani glodari, npr. miš, koji sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju himerni MHC I i β2 mikroglobulin čoveka/glodara, npr. čoveka/miša su opisani detaljnije u patentnim prijavama SAD br.13/661,159 i 13/793,812. U jednom otelotvorenju, glodar koja ispoljava humanizovane CD8, MHC I i/ili β2 mikroglobulin proteine je stvoren zamenjivanjem delova endogenih CD8, MHC I i/ili β2 mikroglobulin gena koji nisu od čoveka, npr. od miša na CD8, MHC I i/ili β2 mikroglobulin lokusima, respektivno.
[0015] Prema tome, takođe je data metoda za modifikovanje CD8 lokusa miša, kako bi ispoljavao himerni CD8 polipeptid čoveka/miša koji obuhvata zamenjivanje na endogenom CD8 lokusu nukleotidne sekvence koja kodira endogeni CD8 polipeptid miša sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni CD8 polipeptid čoveka/miša. CD8 polipeptid je kombinacija CD8α i CD8β. U jednom otelotvorenju, himerni čoveka/miša; CD8 polipeptid (CD8α i CD8β) sadrže ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen ljudskog CD8 polipeptida i bar transmembranske ili citoplazmatske domene endogenog CD8 polipeptida miša.
[0016] Takođe su ovde obelodanjene ćelije, npr. T ćelije izvedene iz glodara (npr. miševa ili pacova) koji su ovde opisani. Tkiva i embrioni izvedeni iz životinja koje nisu čovek koji su ovde opisani su takođe obelodanjeni.
[0017] Bilo koje od otelotvorenja i aspekata koji su ovde opisani se mogu koristiti u međusobnoj konjunkciji, ukoliko nije drugačije ukazano ili očigledno iz konteksta. Druga otelotvorenja će postati očigledna stručnjacima u ovoj oblasti iz razmatranja kasnijeg detaljnog opisa. Sledeći detaljni opis obuhvata primerne reprezentacije različitih otelotvorenja pronalaska, koje nisu ograničavajuće po pronalazak kao što je zahtevano. Priložene slike čine deo ove specifikacije i, zajedno sa opisom, služe samo za prikazivanje otelotvorenja a ne za ograničavanje pronalaska.
KRATAK OPIS SLIKA
[0018]
SL. 1 je šematsko predstavljanje (nije u razmeri) strategije za stvaranje humanizovanog CD4 lokusa. Sekvenca egzona 3-6 miša koja počinje odmah nakon signalnog peptida, je prvo zamenjena sa sekvencom egzona 3 čoveka nizvodno od signalnog peptida (gore) i sledeći egzoni 4-6 čoveka su uneti nizvodno od egzona 3 čoveka restrikcionom razgradnjom/ligacijom.
SL. 2 prikazuje FACS analizu sa anti-ljudskim CD4 i anti-mišijim CD4 antitelima splenocita izvedenih iz WT miša ili miša heterozigotnog za ljudski CD4 (1766HET) (A); i FACS analizu T ćelija izvedenih iz WT miša u poređenju sa 1766HET mišem u poređenju sa Jurkat ljudskom CD4 T ćelijskom linijom.
SL. 3 je šematsko predstavljanje (nije u razmeri) strategije za stvaranje humanizovanog CD8b lokusa (MAID 1737) zamenjivanjem CD8β egzona 2-3 miša sa CD8β egzonima 2-3 čoveka. Sekvence egzona miša su predstavljene ispunjenim pravougaonicima, sekvence egzona čoveka su predstavljene isprekidanim pravougaonicima.
SL. 4 je šematsko predstavljanje (nije u razmeri) strategije za stvaranje humanizovanog CD8a lokusa (MAID 1738) zamenjivanjem dela egzona 1 i egzona 2 miša sa egzonima 2-3 čoveka, zadržavajući vodeću sekvencu miša na početku egzona 1. Sekvence egzona miša su predstavljene ispunjenim pravougaonicima, sekvence egzona čoveka su predstavljene isprekidanim pravougaonicima.
SL. 5 je šematsko predstavljanje (nije u razmeri) sekvencijalne strategije za ciljanje za stvaranje humanizovanih lokusa koji sadrže sekvencu koja kodira humanizovane CD8b i CD8a gene. Sekvence egzona miša su predstavljene ispunjenim pravougaonicima, sekvence egzona čoveka su predstavljene isprekidanim pravougaonicima.
SL. 6 je FACS analiza ili sa mišijim CD8b, mišijim CD8a, ljudskim CD8b ili ljudskim CD8a antitelima splenocita ili iz WT miša ili miša heterozigotnog i za CD8b i za CD8a čoveka, sa uklonjenim kasetama za selekciju (1739 Het, 1740 Het).
SL. 7 je FACS analiza ili za mišiji CD8b, mišiji CD8a, ljudski CD8b, ljudski CD8a, ili CD4 timocita dobijenih ili iz WT ili 1739HET/1740HET miševa (miševi heterozigotni i za CD8b i za CD8a).
DETALJNI OPIS PRONALASKA
Definicije
[0019] Predmetni pronalazak se odnosi na genetski modifikovane glodare (npr. miševe, pacove, zečeve, itd.) koji ispoljavaju humanizovane polipeptide T-ćelijskog koreceptora; embrione, ćelije i tkiva koja sadrže iste; metode za pravljenje istih; kao i metode za upotrebu istih. Ukoliko nije drugačije definisano, svi termini i fraze koje se ovde koriste obuhvataju značenje koje termini i fraze imaju u struci, ukoliko suprotno nije jasno naznačeno ili jasno očigledno iz konteksta u kom se termin ili fraza koriste.
[0020] Termin „konzervativni“, kada se koristi za opisivanje konzervativne aminokiselinske zamene obuhvata zamenu aminokiselinskog ostatka sa drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima R grupu bočnog lanca sa sličnim hemijskim svojstvima (npr. naelektrisanje ili hidrofobnost). Konzervativne aminokiselinske zamene se mogu postići modifikovanjem nukleotidne sekvence tako da se uvede nukleotidna izmena koja će kodirati konzervativnu zamenu. Uopšteno, konzervativna aminokiselinska zamena neće suštinski izmeniti funkcionalna svojstva od interesa proteina, na primer, sposobnost CD4 ili CD8 da se vežu za MHC II ili MHC I, respektivno, i i povećaju osetljivost na TCR na MHC-predstavljeni antigen. Primeri grupa amino kiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima obuhvataju alifatične bočne lance kao što su glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; alifatične-hidroksil bočne lance kao što su serin i treonin; bočne lance koji sadrže amid kao što su asparagin i glutamin; aromatične bočne lance kao što su fenilalanin, tirozin i triptofan; bazne bočne lance kao što su lizin, arginin i histidin; kisele bočne lance kao što su asparginova kiselina i glutaminska kiselina; i bočne lance koje sadrže sumpor kao što su cistein i metionin. Konzervativne aminokiselinske zamene obuhvataju, na primer, valin/leucin/izoleucin, fenilalanin/tirozin, lizin/arginin, alanin/valin, glutamat/aspartat i asparagin/glutamin. U nekim otelotvorenjima, konzervativna aminokiselinska zamena može biti zamena bilo kog izvornog ostatka u proteinu sa alaninom, kao što se koristi, na primer, u mutagenezi sa skeniranjem alanina. U nekim otelotvorenjima, konzervativna zamena je napravljena koja ima pozitivnu vrednost u matrici PAM250 log-sličnosti obelodanjenoj u Gonnet i dr. ((1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45). U nekim otelotvorenjima, zamena je umereno konzervativna zamena gde zamena ima vrednost koja nije negativna u matrici PAM250 log-sličnosti.
[0021] Zbog toga, takođe je pronalaskom obuhvaćen genetski modifikovani glodar čiji genom sadrži (npr. u endogenom lokusu) nukleotidnu sekvencu koja kodira humanizovani polipeptid T-ćelijskog koreceptora (npr. CD4 ili CD8 polipeptid), gde polipeptid sadrži konzervativne aminokiselinske zamene aminokiselinskih sekvenci ovde obelodanjenih.
[0022] Stručna osoba u ovoj struci će razumeti da se pored ostataka nukleinske kiseline koji kodiraju humanizovane polipeptide T-ćelijskog koreceptora ovde opisane, zbog degeneracije genetskog koda, druge nukleinske kiseline mogu kodirati polipeptide. Prema tome, pored genetski modifikovanog glodara koji sadrži u svom genomu nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid T-ćelijskog koreceptora (npr. CD4 ili CD8 polipeptid) sa konzervativnim aminokiselinskim zamenama, takođe je dat glodar čiji genom sadrži nukleotidnu sekvencu koja se razlikuje od one ovde opisane zbog degeneracije genetskog koda.
[0023] Termin „identičnost“ kada se koristi u vezi sa sekvencom obuhvata identičnost kao što je određeno brojem različitih algoritama poznatih u struci koji se mogu koristiti za merenje identičnosti nukleotidne i/ili aminokiselinske sekvence. U nekim otelotvorenjima ovde opisanim, identičnosti su određene upotrebom ClustalW v. 1.83 (sporog) poravnanja upotrebom kazne otvorenog prostora od 10,0, i kazne za prošireni prostor od 0,1, i upotrebom Gonnet matrice sličnosti (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). Dužina sekvenci u poređenju sa identičnosti sekvenci će zavisiti od naročitih sekvenci. U različitim otelotvorenjima, identičnost je određena poređenjem sekvence zrelog proteina iz njegovog N-terminusa sa njegovim C-terminusom. U različitim otelotvorenjima kada se poredi himerna sekvenca čoveka/glodara sa ljudskom sekvencom, ljudski deo himerne sekvence čoveka/glodara (ali ne i deo od glodara) se koristi pri pravljenju poređenja za svrhe utvrđivanja nivoa identičnosti između ljudske sekvence i ljudskog dela himerne sekvence čoveka/glodara (npr. poređenje ljudskog ektodomena himernog proteina čoveka/miša sa ljudskim ektodomenom ljudskog proteina).
[0024] Termini „homologija“ ili „homologni“ kada se odnose na sekvence, npr. nukleotidne ili aminokiselinske sekvence označavaju sekvence koje su, nakon optimalnog poravnanja i poređenja, identične npr. bar oko 75% nukleotida ili amino kiselina, npr. bar oko 80% nukleotida ili amino kiselina, npr. bar oko 90-95% nukleotida ili amino kiselina, npr., više od 97% nukleotida ili amino kiselina. Stručna osoba u ovoj oblasti će prihvatiti da bi za optimalno ciljanje gena, ciljani konstrukt trebalo da sadrži ruke homologne sa endogenim DNK sekvencama (tj. „homologne ruke“); zbog toga, homologna rekombinacija se može odviti između ciljanog konstrukta i ciljane endogene sekvence.
[0025] Termin „operativno spojen“ se odnosi na jukstapoziciju gde su tako opisane komponente u odnosu koji im dozvoljava funkcionisanje na namenjeni način. Kao takve, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju protein mogu biti operativno spojene sa regulatornim sekvencama (npr. sekvence za promovisanje, pojačavanje, utišavanje, itd.) tako da se zadržava pravilna transkripciona regulacija. Dodatno, različiti delovi himernog ili humanizovanog proteina mogu biti operativno spojeni kako bi zadržali ispravno savijanje, procesiranje, ciljanje, ispoljavanje i druga funkcionalna svojstva proteina u ćeliji. Ukoliko nije drugačije navedeno, različiti domeni himernih ili humanizovanih proteina su međusobno operativno spojeni.
[0026] Termin „zamenjivanje“ kada se odnosi na zamenjivanje gena odnosi se na postavljanje egzogenog genetskog materijala u endogenom genetskom lokusu, time zamenjujući ceo ili deo endogenog gena sa ortolognom ili homolognom sekvencom nukleinske kiseline. Kao što je demonstrirano u Primerima ispod, sekvence nukleinske kiseline endogenog lokusa kodiraju delove CD4 ili CD8 (CD8α i/ili CD8β) polipeptida miša su zamenjene sa nukleotidnim sekvencama delova ljudskih CD4 ili CD8 (CD8α i/ili CD8β) polipeptida, respektivno.
[0027] „Funkcionalno“ kao što se ovde koristi, npr. kada se odnosi na funkcionalni polipeptid, se odnosi na polipeptid koji zadržava bar jednu biološku aktivnost koja je obično povezana sa izvornim proteinom. Na primer, u nekim otelotvorenjima pronalaska, zamenjivanje u endogenom lokusu (npr. zamenjivanje u endogenom CD4 ili CD8 lokusu glodara) kao rezultat daje lokus koji nije u stanju da ispolji funkcionalni endogeni polipeptid.
[0028] Nekoliko ovde kasnije opisanih aspekata za genetski modifikovanje CD4 glodare, npr. tip životinje; sojevi životinje; tipovi ćelije; skrining, detekcija i druge metode; metode za upotrebu; itd. će moći da se primene na genetski modifikovane CD8 životinje.
Genetski modifikovane CD4 životinje
[0029] U različitim otelotvorenjima, pronalazak uopšteno pruža genetski modifikovanog glodara koji sadrži u svom genomu, endogeni CD4 lokus, nukleotidnu sekvencu koja kodira humanizovani CD4 polipeptid; zbog toga, životinje ispoljavaju humanizovani CD4 polipeptid.
[0030] Ljudski CD4 gen je lokalizovan za hromozom 12 i smatra se da sadrži 10 egzona. CD4 gen kodira protein sa amino-terminalnom hidrofobnom signalnom sekvencom, kodiranom egzonima 2 i 3 od gena. Protein sadrži 4 domena nalik imunoglobulinu, koji se obično nazivaju kao D1-D4 domeni. Maddon i dr. (1987) Structure and expression of the human and mouse T4 genes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9155-59. Veruje se da se D1 domen kodira od strane egzona 3 (sekvenca nizvodno od signalnog peptida) i egzona 4, a D2, D3 i D3 se svaki kodira odvojenim egzonom -- egzoni 5, 6 i 7 respektivno. Littman (1987) The Structure of the CD4 and CD8 Genes, Ann. Rev. Immunol.5:561-84; Hanna i dr. (1994) Specific Expression of the Human CD4 Gene in Mature CD4+CD8-and Immature CD4+CD8+ T cells and in Macrophages of Transgenic Mice, Mol. Cell. Biol. 14(2):1084-94; Maddon i dr., iznad. Na mestima sa visokom koncentracijom proteina, kao što je mesto dodira između T ćelije i ćelije koja predstavlja antigen, molekul teži da izvrši homogenizaciju interakcijama između suprotnih D4 domena. Zamoyska (1998) CD4 and CD8: modulators of T cell receptor recognition of antigen and of immune responses? Curr. Opin. Immunol.10:82-87; Wu i dr. (1997) Dimeric association and segmental variability in the structure of human CD4, Nature 387:527; Moldovan i dr. (2002) CD4 Dimers Constitute the Functional Component Required for T Cell Activation, J. Immunol.169:6261-68.
[0031] D1 domen od CD4 predstavlja varijabilni (V) domen imunoglobulina i, zajedno sa delom D2 domena, veruje se da se vezuje za MHC II. Huang i dr. (1997) Analysis of the contact sites on the CD4 Molecule with Class II MHC Molecule, J. Immunol. 158:216-25. Zauzvrat, MHC II interaguje sa T-ćelijskim koreceptorom CD4 u hidrofobnom otvoru na spoju između MHC II α2 i β2 domena. Wang and Reinherz (2002) Structural Basis of T Cell Recognition of Peptides Bound to MHC Molecules, Molecular Immunology, 38:1039-49.
[0032] Domeni D3 i D4 od CD4 koreceptora se veruju da interaguju sa TCR-CD3 kompleksom kao zamena za ova dva domena ukidanjem sposobnosti vezivanja CD4 za TCR. Vignali i dr. (1996) The Two Membrane Proximal Domains of CD4 Interact with the T Cell Receptor, J. Exp. Med.183:2097-2107. CD4 molekul postoji kao dimer, i ostaci u D4 domenu molekula se veruju da su odgovorni za CD4 dimerizaciju. Moldovan i dr. (2002) CD4 Dimers Constitute the Functional Components Required for T Cell Activation, J. Immunol.169:6261-68.
[0033] Egzon 8 CD4 gena kodira transmembranski domen, dok ostatak gena kodira citoplazmatski domen. CD4 citoplazmatski domen ima mnogo različitih funkcija. Na primer, citoplazmatski domen CD4 regrutuje Lck tirozinske kinaze. Lck je Src porodica kinaza koja je povezana sa CD4 i CD8 citoplazmatskim domenima i istovremeno vezivanje koreceptora i TCR za isti MHC dovodi do povećane tirozinske fosforilacije CD3 i ζ lanca u TCR kompleksu, što zauzvrat dovodi do regrutovanja drugih faktora koji imaju ulogu u aktivaciji T ćelije. Itano i saradnici su predložili da citoplazmatski rep od CD4 takođe promoviše diferencijaciju CD4+CD8+ T ćelija u CD4+ rod dizajniranjem i testiranjem ispoljavanja hibridnog proteina koji sadrži CD8 vanćelijski domen i CD4 citoplazmatski rep kod transgenih miševa. Itano i dr. (1996) The Cytoplasmic Domain of CD4 Promotes the Development of CD4 Lineage T Cells, J. Exp. Med. 183:731-41. Ispoljavanje hibridnih proteina je dovelo do razvijanja MHC I-specifičnih, T ćelija CD4 roda. Id.
[0034] CD4 koreceptor deluje da je primarni receptor za HIV virus, sa deplecijom CD4+ T ćelija kao indikatorom napredovanja bolesti. Citoplazmatski rep CD4 deluje da je od suštinskog značaja za isporučivanje aptoptičkog signala u CD4+ T ćelije u apoptozi uzrokovanoj HIV virusom. Naročito, interakcija CD4 i Lck je pokazana da potencira apoptozu uzrokovanu HIV virusom kod ovih ćelija. Corbeil i dr. (1996) HIV-induced Apoptosis Requires the CD4 Receptor Cytoplasmic Tail and Is Accelerated by Interaction of CD4 with p56lck, J. Exp. Med.
183:39-48.
[0035] T ćelije razvijaju u timusu koje se razvijaju iz nezrelih CD4-/CD8- (dvostruko negativni ili DN) timocita u CD4+/CD8+ (dvostruko pozitivni ili DP) timocite, koje se na kraju podvrgavaju pozitivnoj selekciji kako bi postale ili CD4+ ili CD8+ (jednom pozitivni ili SP) T ćelije. DP timociti koji primaju signale preko MHC Iograničenog TCR vrše diferencijaciju u CD8+ T ćelije, dok DP timociti koji primaju signale preko MHC II-ograničenog TCR vrše diferencijaciju u CD4+ T ćelije. Signali dobijeni sa DP ćelijom koji dovode do njene diferencijacije ili u CD4+ ili u CD8+ T ćeliju su bili subjekat mnogih istraživanja. Različiti modeli za odabir CD4/CD9 roda su predloženi i razmatrani u Singer i dr. (2008) Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8- lineage choice, Nat. Rev. Immunol.8:788-801.
[0036] Deaktivacija specifičnog T-ćelijskog koreceptora kao rezultat pozitivnog odabira je proizvod transkripcione regulacije. Za CD4, pokazano je da pojačivač koji se nalazi 13 kb uzvodno od egzona 1 CD4 reguliše na gore CD4 ispoljavanje kod CD4+ i CD8+ T ćelija. Killeen i dr. (1993) Regulated expression of human CD4 rescues helper T cell development in mice lacking expression of endogenous CD4, EMBO J. 12:1547-53. Cis-delujući transkripcioni prigušivač koji se nalazi u prvom intronu mišijeg CD4 gena deluje kako bi prigušio ispoljavane CD4 u ćelijama koje nisu CD4+ T ćelije. Siu i dr. (1994) A transcriptional silencer control the developmental expression of the CD4 gene, EMBO J.13:3570-3579.
[0037] Zbog značajnih transkripcionih regulatora (npr. promoteri, pojačivači, prigušivači, itd.) koji kontrolišu odabir CD4 roda su nedostajali kod nekoliko sojeva prethodno razvijenih transgenih miševa koji ispoljavaju ljudski CD4, ovi miševi nisu bili u stanju da rekapitulišu normalni razvoj T ćelija, i proizveli su imune ćelije koje nisu CD4+ T ćelije koje ispoljavaju CD4. Videti npr., Law i dr. (1994) Human CD4 Restores Normal T Cell Development and Function in Mice Deficient in CD4, J. Exp. Med.179:1233-42 (CD4 expression in CD8+ T cells and B cells); Fugger i dr. (1994) Expression of HLA-DR4 and human CD4 transgenes in mice determines the variable region β-chain T-cell repertoire and mediates an HLA-D-restricted immune response, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:6151-55 (CD4 se ispoljio na svim CD3+ timocitima i B ćelijama). Zbog toga, u jednom otelotvorenju, može postojati koristi u razvijanju genetski modifikovane životinje koja zadržava endogeni promoter miša i druge regulatorne elemente u cilju kako bi životinja proizvela T ćelije koje su u stanju da budu podvrgnute odabiru normalnog razvijanja i roda T ćelija.
[0038] Zbog toga, u različitim otelotvorenjima, pronalazak pruža genetski modifikovanog glodara koji sadrži, u svom endogenom lokusu T-ćelijskog koreceptora (npr. CD4 lokus) nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni polipeptid T-ćelijskog koreceptora čoveka/glodara. Ljudski deo himernog polipeptida sadrži ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen ljudskog T-ćelijskog koreceptora. Deo himernog polipeptida od glodara sadrži transmembranske i citoplazmatske domene T-ćelijskog koreceptora glodara. Glodar ispoljava funkcionalni himerni polipeptid T-ćelijskog koreceptora. Zbog toga, u jednom aspektu, pronalazak pruža genetski modifikovanog glodara koji sadrži u svom endogenom CD4 lokusu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD4 polipeptid čoveka/glodara, gde ljudski deo himernog polipeptida sadrži ceo ili suštinski ceo domen ljudskog CD4, gde deo od glodara sadrži bar transmembranske i citoplazmatske domene CD4 glodara, i gde životinja ispoljava funkcionalni himerni CD4 polipeptid. Glodar ispoljava samo humanizovani CD4 polipeptid, tj. himerni CD4 polipeptid čoveka/glodara a ne ispoljava funkcionalni endogeni CD4 protein glodara u svom endogenom CD4 lokusu.
[0039] U jednom otelotvorenju, ljudski deo himernog CD4 polipeptida čoveka/glodara sadrži ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen ljudskog CD4 polipeptida. Himerni CD4 polipeptid čoveka/glodara sadrži bar ceo ili suštinski ceo MHC I i vezujući domen (npr. suštinski deo D1 i D2 domena) CD4 polipeptid čoveka; U jednom otelotvorenju, ljudski deo himernog CD4 polipeptida čoveka/glodara sadrži sve ili suštinski sve D1, D2 i D3 domene ljudskog CD4 polipeptida; U još jednom otelotvorenju, ljudski deo himernog CD4 polipeptida čoveka/glodara sadrži sve ili suštinski sve domene CD4 nalik imunoglobulinu, npr. domene koji se nazivaju D1, D2, D3 i D4. Ljudski deo himernog CD4 polipeptid čoveka/glodara sadrži u svom ljudskom delu celu ili suštinski celu ljudski CD4 sekvencu koja je odgovorna za međudejstvo sa MHC II i/ili vanćelijskim delom T ćelijskog receptora. Ljudski deo himernog CD4 polipeptida čoveka/glodara sadrži ceo ili suštinski ceo vanćelijski deo ljudskog CD4 koji je odgovoran za međudejstvo sa MHC II i/ili varijabilnim domenom T ćelijskog receptora. Nukleotidna sekvenca koja kodira ljudski deo himernog CD4 polipeptida sadrži celu ili suštinski celu kodirajuću sekvencu domena D1-D2 ljudskog CD4 (npr. deo egzona 3 i egzona 4-5 ljudskog CD4 gena); u drugom otelotvorenju, sadrži celu ili suštinski celu kodirajuću sekvencu D1-D3 ljudskog CD4 (npr. deo egzona 3 i egzona 4-6 ljudskog CD4). Zbog toga, u jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira himerni CD4 čoveka/glodara sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju cele ili suštinski cele D1-D3 domene ljudskog CD4. U drugom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira ljudski deo himernog CD4 polipeptida sadrži kodirajuću sekvencu D1-D4 domena ljudskog CD4 gena. U drugom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca može sadržati nukleotidnu sekvencu koja kodira CD4 signalni peptid miša, npr. region koji je kodiran od strane delova egzona 2-3 gena miša. U drugom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca može sadržati nukleotidnu sekvencu koja kodira ljudski CD4 signalni peptid. U jednom otelotvorenju, himerni CD4 polipeptid čoveka/glodara sadrži aminokiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO:4 i ljudski deo himernog polipeptida se prostire oko amino kiselina 27-319 u SEQ ID NO:4 (izneto odvojeno u SEQ ID NO:57).
[0040] Glodar ispoljava himernu CD4 polipeptidnu sekvencu čoveka/koja nije od čoveka. U jednom otelotvorenju, ljudski deo himerne CD4 sekvence sadrži jednu ili više konzervativnih ili modifikacija koje nisu konzervativne.
[0041] U jednom aspektu, dat je glodar koji ispoljava ljudsku CD4 sekvencu, gde je ljudska sekvenca bar oko 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična sa ljudskom CD4 sekvencom. U specifičnom otelotvorenju, ljudska CD4 sekvenca je bar oko 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična sa ljudskom CD4 sekvencom opisanom u Primerima. U jednom otelotvorenju, ljudska CD4 sekvenca sadrži jednu ili više konzervativnih zamena. U jednom otelotvorenju, ljudska CD4 sekvenca sadrži jednu ili više zamena koje nisu konzervativne.
[0042] U nekim otelotvorenjima, deo, npr., ljudski deo himernog CD4 može sadržati suštinski celu sekvencu koja je ovde naznačena (npr. suštinski ceo proteinski domen koji je ovde ukazan). Suštinski cela sekvenca uopšteno obuhvata 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% amino kiselina za koje se veruje da predstavljaju naročiti deo proteina (npr. naročiti funkcionalni domen, itd.). Stručna osoba u ovoj oblasti će prihvatiti da granice funkcionalnog domena mogu blago varirati u zavisnosti od poravnanja i upotrebljene metode za predviđanje domena.
[0043] Deo od glodara himernog CD4 polipeptida čoveka/glodara sadrži bar transmembranske i citoplazmatske domene CD4 polipeptida glodara. Zbog značaja funkcija pruženih CD4 citoplazmatskim domenom, zadržavanje sekvence endogenog glodara (npr. miša) u genetski modifikovanim životinjama osigurava zaštitu odgovarajućeg unutarćelijskog signaliziranja i drugih funkcija koreceptora. U jednom otelotvorenju, glodar je miš, i CD4 polipeptid glodara je CD4 polipeptid miša. Iako je specifična CD4 sekvenca miša opisana u Primerima, bilo koja pogodna sekvenca izvedena iz njega, npr. sekvenca koja sadrži konzervativne/ne-konzervativne aminokiselinske zamene, je ovde obuhvaćena. U jednom otelotvorenju, deo himernog CD4 koreceptora glodara sadrži bilo koju sekvencu endogenog CD4 koji nije humanizovan.
[0044] Ovde opisani glodar može sadržati u svom endogenom lokusu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD4 polipeptid čoveka/glodara. U jednom aspektu, ovo za rezultat daje zamenjivanje dela endogenog CD4 gena sa nukleotidnom sekvencom koja kodira deo ljudskog CD4 polipeptida. U jednom otelotvorenju, takvo zamenjivanje je zamenjivanje endogene nukleotidne sekvence koja kodira, npr. ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen CD4 koji nije od čoveka, npr. sekvencu koja kodira bar ceo ili suštinski ceo prvi domen nalik imunoglobulinu (tj. D1) CD4 glodara (npr. sekvenca koja kodira sve ili suštinski sve domene D1-D2 CD4 glodara, npr. sekvenca koja kodira sve ili suštinski sve domene D1-D3 CD4 glodara, npr. sekvenca koja kodira sve ili suštinski sve domene D1-D4 CD4 glodara) sa ljudskom nukleotidnom sekvencom koja kodira isti. Zamenjivanje za rezultat daje himerni protein koji sadrži ljudski CD4 sekvencu koji je odgovorna za interakciju sa MHC II i/ili vanćelijskim delom T ćelijskog receptora. U još jednom otelotvorenju, zamenjivanje za rezultat daje himerni protein koji sadrži ljudsku CD4 sekvencu koji je odgovoran za interakciju sa MHC II i/ili varijabilnim domenom T ćelijskog receptora. Zamenjivanje ne obuhvata zamenjivanje CD4 sekvence koja kodira bar transmembranske i citoplazmatske domene CD4 polipeptida glodara. Zbog toga, glodar ispoljava himerni CD4 polipeptid čoveka/glodara u endogenom CD4 lokusu glodara. U još jednom otelotvorenju, zamenjivanje za rezultat daje protein koji sadrži polipeptidnu sekvencu iznetu u SEQ ID NO:4.
[0045] Data je nukleotidna sekvenca himernog CD4 lokusa čoveka/glodara (npr. himernog CD4 lokusa čoveka/miša) koja je ovde opisana. U jednom aspektu, zbog himernog čoveka/glodara, npr. čoveka/miša) CD4 sekvenca se postavlja u endogeni CD4 lokus glodara (npr. miša), i zadržava element pojačavanja CD4 koji se nalazi uzvodno od prvog CD4 egzona. U jednom otelotvorenju, zamenjivanje endogenog CD4 lokusa glodara (npr. miša) obuhvata zamenjivanje npr. dela egzona 3 koji kodira D1, i egzona 4-6 koji kodiraju ostatak D1 i D2-D3 CD4 polipeptida; zbog toga, u jednom aspektu, himerni CD4 lokus zadržava cis-delujući prigušivač koji se nalazi u intronu 1 CD4 gena glodara (npr. miša). Zbog toga, u jednom otelotvorenju, himerni lokus zadržava endogeni CD4 promoter glodara (npr. miša) i regulatorne elemente. U drugom otelotvorenju, himerni lokus može sadržati ljudski promoter i regulatorne elemente za proširivanje onih koji omogućavaju pravilno ispoljavanje CD4, CD4+ T ćelijsko razvijanje, odabir CD4 roda i koreceptorsku funkciju. Zbog toga, u nekim aspektima, glodari pronalaska sadrže genetsku modifikaciju koja ne menja pravilna svojstva roda i razvijanje T ćelija. U jednom aspektu, glodari (npr. miševi) pronalaska ne ispoljavaju himerni CD4 polipeptid na imunim ćelijama koje nisu ćelije koje obično ispoljavaju CD4. U jednom aspektu, glodari ne ispoljavaju CD4 na B ćelijama ili CD8+ SP T ćelijama. U jednom otelotvorenju, zamenjivanje za rezultat daje zadržavanje elemenata koji omogućavaju ispravnu prostornu i trenutnu regulaciju CD4 ispoljavanja.
[0046] U jednom otelotvorenju, glodar je izabran iz miša, pacova i hrčka. U jednom otelotvorenju, glodar je izabran iz superfamilije Muroidea. U jednom otelotvorenju, genetski modifikovani glodar je iz familije izabrane iz Calomyscidae (npr. hrčci nalik miševima), Cricetidae (npr. hrčak, pacovi i miševi Novog Sveta, poljski miševi), Muridae (pravi miševi i pacovi, skoči miševi, Acomys, grivasti pacovi), Nesomyidae (miševi penjači, Chaetodipus intermedius, pacovi sa belim repom, malagaški pacovi i miševi), Platacanthomyidae (npr.., Platacanthomys lasiurus), i Spalacidae (npr., slepo kule, Rhizomyini, i zokori). U specifičnom otelotvorenju, genetski modifikovani glodar je izabran iz pravog miša ili pacova (familija Muridae), skoči miša i grivastog pacova. U jednom otelotvorenju, genetski modifikovani miš je član porodice Muridae. U specifičnom otelotvorenju, glodar je izabran iz miša i pacova. U jednom otelotvorenju, glodar je miš.
[0047] U specifičnom otelotvorenju, glodar je miš C57BL soja izabran iz C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, i C57BL/Ola. U drugom otelotvorenju, miš je 129 soj izabran iz grupe koju čini soj koji je 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (npr. 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (videti npr. Festing i dr. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, videti takođe, Auerbach i dr (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). U specifičnom otelotvorenju, genetski modifikovani miš je mešavina prethodno spomenutog 129 soja i prethodno spomenutog C57BL/6 soja. U drugom specifičnom otelotvorenju, miš je mešavina prethodno spomenutih 129 sojeva ili mešavina prethodno spomenutih BL/6 sojeva. U specifičnom otelotvorenju, 129 soj mešavine je 129S6 (129/SvEvTac) soj. U drugom otelotvorenju, miš je BALB soj, npr. BALB/c soj. U još jednom otelotvorenju, miš je mešavina BALB soja sa drugim prethodno spomenutim sojem.
[0048] U jednom otelotvorenju, glodar je pacov. U jednom otelotvorenju, pacov je izabran iz Wistar pacova, LEA soja, Sprague Dawley soja, Fischer soja, F344, F6 i Dark Agouti. U jednom otelotvorenju, soj pacova je mešavina dva ili više soja izabrana iz grupe koju čine Wistar, LEA, Sprague Dawey, Fischer, F344, F6 i Dark Agouti.
[0049] Zbog toga, u jednom otelotvorenju, pronalazak pruža genetski modifikovanog miša koji sadrži u svom genomu, npr. u svom endogenom CD4 lokusu, nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD4 polipeptid čoveka/miša, gde deo od miša himernog polipeptida sadrži bar transmembranske i citoplazmatske domene CD4 polipeptida miša, i gde miš ispoljava himerni CD4 čoveka/miša. U jednom otelotvorenju, ljudski deo himernog polipeptida sadrži ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen ljudskog CD4 polipeptida. Ljudski deo himernog polipeptida sadrži bar sve ili suštinski sve D1-D2 domene ljudskog CD4 proteina, npr. bar sve ili suštinski sve D1-D3 domene ljudskog CD4 proteina, npr. sve ili suštinski sve D1-D4 domene ljudskog CD4 proteina. Zbog toga, u jednom otelotvorenju, miš sadrži u svom endogenom CD4 lokusu nukleotidnu sekvencu koja sadrži bar sve ili suštinski sve egzone 4, 5 i 6 ljudskog CD4 gena, npr. sekvencu egzona 3 ljudskog CD4 gena koja kodira deo D1 domena ljudskog CD4 i egzone 4-6 ljudskog CD4 gena. Miš sadrži u endogenom CD4 lokusu himerni CD4 čoveka/miša koji sadrži ljudsku CD4 sekvencu koja je odgovorna za interakciju sa MHC II i/ili vanćelijskim delom T ćelijskog receptora. Miš sadrži u endogenom CD4 lokusu himerni CD4 čoveka/miša koji sadrži ljudsku CD4 sekvencu koja je odgovorna za interakciju sa MHC II i/ili varijabilnim domenom T ćelijskog receptora. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca može sadržati sekvencu koja kodira CD4 signalni peptid miša. U jednom otelotvorenju, miš sadrži zamenu nukleotidne sekvence koja kodira CD4 vanćelijski domen miša sa nukleotidnom sekvencom koja kodira CD4 vanćelijski domen čoveka. U drugom otelotvorenju, miš sadrži zamenu nukleotidne sekvence koja kodira bar ceo ili suštinski ceo CD4 D1 domen miša, npr. nukleotidnu sekvencu koja kodira bar sve i suštinski sve CD4 D1-D2 domene miša, npr. nukleotidnu sekvencu koja kodira bar sve ili suštinski sve CD4 D1-D3 domene miša, sa nukleotidnom sekvencom koja kodira isti. Miš ne ispoljava funkcionalni endogeni CD4 miša u svom endogenom lokusu CD4 miša. U jednom otelotvorenju, ovde opisani miš sadrži himernu CD4 nukleotidnu sekvencu čoveka/miša u germinalnoj liniji miša. U jednom otelotvorenju, miš zadržava endogene sekvence koje nisu bile humanizovane, npr. u otelotvorenju gde miš sadrži zamene nukleotidne sekvence koje kodiraju sve ili suštinski sve D1-D3 domene, miš sadržava endogenu nukleotidnu sekvencu koja kodira CD4 D4 domen miša kao i nukleotidnu sekvencu koja kodira transmembranske i citoplazmatske domene CD4 miša.
[0050] U jednom aspektu, miš koji ispoljava himerni CD4 protein čoveka/miša zadržava CD4 promoter miša i regulatorne sekvence, npr. nukleotidna sekvenca kod miša koja kodira himerni CD4 čoveka/miša je operativno spojena sa endogenim CD4 promoterom miša i regulatornim sekvencama. U jednom aspektu, ove regulatorne sekvence miša zadržane u genetski modifikovanoj životinji pronalaska obuhvataju sekvence koje regulišu ispoljavanje himernog proteina u odgovarajućim fazama za vreme razvoja T ćelije. Zbog tome, u jednom aspektu, miš ne ispoljava himerni CD4 protein na B ćelijama ili T ćelijama CD8 roda. U jednom aspektu, miš takođe ne ispoljava himerni CD4 na bilo kom tipu ćelije, npr. bilo kom tipu imune ćelije, koja obično ne ispoljava endogeni CD4.
[0051] U različitim otelotvorenjima, glodar (npr. miš ili pacov) koji ispoljava funkcionalni himerni CD4 protein iz himernog CD4 lokusa kao što je ovde opisano prikazuje himerni protein na ćelijskoj površini, npr. T ćelijskoj površini. U jednom otelotvorenju, glodar ispoljava himerni CD4 protein na ćelijskoj površini u ćelijskoj raspodeli koja je ista kao što je primećeno kod čoveka. U jednom aspektu, ovde obelodanjeni CD4 protein je u stanju da interaguje sa MHC II proteinom koji se ispoljava na površini druge ćelije, npr. ćelije koja predstavlja antigen (APC).
[0052] Glodar (npr. miš) pronalaska dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira ljudski ili humanizovani MHC II protein, kao što je himerni CD4 protein koji se ispoljava na površini T ćelije životinje koja je u stanju da interaguje sa ljudskim ili humanizovanim MHC II koji se ispoljava na površini druge ćelije, npr. ćelije koja predstavlja antigen. MHC II protein sadrži vanćelijski domen ili ljudski MHC II α polipeptid i vanćelijski domen ljudskog MHC II β polipeptida. Primerne genetski modifikovane životinje koje ispoljavaju ljudski ili humanizovani MHC II polipeptid su opisane u patentnoj prijavi SAD br.13/661,116, podnetoj 26. oktobra, 2012, i patentnoj prijavi SAD br. 13/793,935, podnetoj 11. marta, 2013. Ovde obelodanjeni glodar koji sadrži CD4 protein dalje sadrži humanizovani MHC II protein, gde humanizovani MHC II protein sadrži: (1) humanizovani MHC II α polipeptid koji sadrži ljudski MHC II α vanćelijski domen i transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC II, npr. miša, gde ljudski MHC II α vanćelijski domen sadrži α1 i α2 domene ljudskog MHC II α i (2) humanizovani MHC II β polipeptid koji sadrži ljudski MHC II β vanćelijski domen i transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC II, npr. miša, gde ljudski MHC II β vanćelijski domen sadrži β1 i β2 domene ljudskog MHC II β. U jednom aspektu, i humanizovani MHC II α i β polipeptidi su kodirani od strane nukleotidne sekvence koja se nalazi u endogenim MHC II α i β lokusima, respektivno; glodar ne ispoljava funkcionalne MHC II α i β polipeptide. Zbog toga, MHC II koji se ispoljava od strane glodara može biti himerni MHC II protein čoveka/glodara (npr. čoveka/miša). Ljudski deo himernog MHC II proteina može biti izveden iz ljudskog HLA klase II proteina izabranog iz grupe koju čine HLA-DR, HLA-DQ, i HLA-DP, npr. HLA-DR4, HLA-DR2, HLA-DQ2.5, HLA-DQ8, ili bilo kog drugog HLA klase II molekula prisutnog u ljudskoj populaciji. U otelotvorenju, kada je glodar miš, deo od glodara (tj. miša) himernog MHC II polipeptida može biti izveden iz MHC II proteina miša izabranog iz H-2E i H-2A. U jednom aspektu, glodar koji sadrži himerni CD4 čoveka/glodara i humanizovani MHC II opisan u patentnim prijavama SAD. 13/661,116 i 13/793,935 se može stvoriti razmnožavanjem životinje koja sadrži himerni CD4 lokus kao što je ovde opisano sa životinjom koja sadrži humanizovani MHC II lokus. Glodar se takođe može stvoriti uvođenjem u ES ćelije glodara koji sadrži humanizovani MHC II lokus nukleotidne sekvence koja kodira himerni CD4, npr. za zamenjivanje endogenog CD4 lokusa; ili uvođenje u ES ćelije glodara koji sadrži himerni CD4 lokus nukleotidne sekvence koja kodira humanizovani MHC II.
[0053] U jednom otelotvorenju, genetski modifikovani glodar (npr. miš) koji sadrži i himerni CD4 čoveka/glodara i ljudski ili humanizovani MHC II može sadržati jednu ili dve kopije gena koji kodiraju ove proteine; zbog toga, glodar može biti heterozigotni ili homozigotni za gene koji kodiraju himerni CD4 i MHC II (tj. MHC II α i/ili MHC II β), respektivno.
[0054] Takođe je data metoda za pravljenje genetski modifikovanog glodara (npr. miš ili pacov) koji je ovde opisan. U jednom otelotvorenju, metoda za pravljenje genetski modifikovanog glodara za rezultat daje glodara koji sadrži u endogenom CD4 lokusu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD4 postupak čoveka/glodara. U nekim otelotvorenjima, metoda koristi konstrukt za ciljanje napravljen upotrebom VELOCIGENE® tehnologije, uvođenjem konstrukta u ES ćelije, i uvođenjem ciljanih ES ćelijskih klonova u embrion miša upotrebom VELOCIGENE® tehnologije, kao što je opisano u Primerima.
[0055] U jednom otelotvorenju, pronalazak obuhvata metodu za modifikovanje CD4 lokusa glodara kako bi ispoljavao himerni CD4 polipeptid čoveka/glodara kao što je ovde opisano. U jednom otelotvorenju, pronalazak pruža metodu za modifikovanje CD4 lokusa miša, kako bi ispoljavao himerni CD4 polipeptid čoveka/miša koji obuhvata zamenjivanje na endogenom CD4 lokusu nukleotidne sekvence koja kodira endogeni CD4 polipeptid miša sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni CD4 polipeptid čoveka/miša. U jednom aspektu metode, himerni CD4 polipeptid čoveka/glodara sadrži ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen ljudskog CD4 polipeptida i bar transmembranske i citoplazmatske domene endogenom CD4 polipeptida miša. U drugom aspektu metode, himerni CD4 polipeptid čoveka/miša sadrži sve ili suštinski sve D1-D2 domene ljudskog CD4 polipeptida. U još jednom otelotvorenju, himerni CD4 polipeptid čoveka/miša sadrži sve ili suštinski sve D1-D3 domene ljudskog CD4 polipeptida. U još jednom otelotvorenju, himerni CD4 polipeptid čoveka/miša sadrži celu ili suštinski celu aminokiselinsku sekvencu ljudskog CD4 koja je odgovorna za međudejstvo sa MHC II i/ili vanćelijskim domenom T ćelijskog receptora. U još jednom otelotvorenju, himerni CD4 polipeptid čoveka/miša sadrži celu ili suštinski celu aminokiselinsku sekvencu ljudskog CD4 koja je odgovorna za međudejstvo sa MHC II i/ili varijabilnim domenom T ćelijskog receptora.
[0056] Kaseta za selekciju je nukleotidna sekvenca uneta u konstrukt za ciljanje kako bi se olakšala selekcija ćelija (npr. ES ćelija) koje imaju ugrađeni konstrukt od interesa. Broj pogodnih kaseta za selekciju je poznat u struci. Obično, kaseta za selekciju omogućava pozitivnu selekciju u prisustvu naročitih antibiotika (npr. Neo, Hyg, Pur, CM, SPEC, itd.). Dodatno, kaseta za selekciju može biti između mesta rekombinacije, što omogućava brisanje kasete za selekciju nakon tretiranja enzimima rekombinaze. Obično korišćena mesta rekombinacije su loxP i Frt, prepoznati od strane Cre i Flp enzima, respektivno, ali su drugi poznati u struci. Kaseta za selekciju se može nalaziti bilo gde u konstruktu van regiona kodiranja. U jednom otelotvorenju, kaseta za selekciju se nalazi između egzona 3 i egzona 4 ljudske CD4 sekvence.
[0057] Nakon završetka ciljanja gena, vrši se skrining ES ćelije ili genetski modifikovanog glodara kako bi se potvrdilo uspešno ugrađivanje egzogene nukleotidne sekvence od interesa ili ispoljavanje egzogenog polipeptida. Brojne tehnike su poznate stručnjacima u ovoj oblasti, i obuhvataju (ali nisu ograničene na) Southern blot, duga PCR, kvantitativna PCR (npr. PCR u realnom vremenu upotrebom TAQMAN®), fluorescencija in situ hibridizacija, Northern blot, protočna citometrija, Western analiza, imunocitohemija, imunohistohemija, itd. U jednom primeru, glodar (npr. miš) koji nosi genetsku modifikaciju od interesa se može identifikovani sa skriningom za gubitak alela miša i/ili dobitak alela čoveka upotrebom testa modifikacije alela opisanog u Valenzuela i dr. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659. Drugi testovi koji identifikuju specifičnu nukleotidnu ili aminokiselinsku sekvencu u genetski modifikovanim životinjama su poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
[0058] Različita ovde opisana otelotvorenja u vezi sa glodarima koji ispoljavaju himerni CD4 protein, kao i ćelije i tkiva koja sadrže isti, mogu se primeniti na otelotvorenja koja opisuju glodare koji ispoljavaju himerni CD8 čoveka/glodara, opisana ispod, ili životinje koje ispoljavaju druge značajne himerne T-ćelijske koreceptore čoveka/glodara.
Genetski modifikovane CD8 životinje
[0059] U različitim otelotvorenjima, pronalazak uopšteno pruža genetski modifikovanog glodara koji sadrži u svom genomu, endogeni CD8 lokus, nukleotidnu sekvencu koja kodira humanizovani CD8 polipeptid; zbog toga, životinje ispoljavaju humanizovani CD8 polipeptid. Pronalazak pruža glodare koji u svom genomu sadrže, u endogenom CD8 lokusu, nukleotidnu sekvencu koja kodira humanizovani CD8α polipeptid i nukleotidnu sekvencu koja kodira humanizovani CD8β polipeptid. Prema tome, genetski modifikovani glodar pronalaska ispoljava humanizovani CD8α i/ili humanizovani CD8β polipeptid.
[0060] Ljudski CD8 protein se obično ispoljava na ćelijskoj površini kao heterodimer dva polipeptida, CD8α i CD8β, iako su disulfidno-povezani homodimeri i homomultimeri takođe detektovani (npr. u NK ćelijama i intestinalnim γδ T ćelijama, koje ispoljavaju CD8αα). Geni koji kodiraju ljudski CD8α i CD8β se nalaze u blizini na hromozomu 2. Nakayama i dr. (1992) Recent Duplication of the Two Human CD8 β-chain genes, J. Immunol.
148:1919-27. CD8α protein sadrži vodeći peptid, region nalik imunoglobulinu V, zglobni region, transmembranski domen i citoplazmatski rep. Norment i dr. (1989) Alternatively Spliced mRNA Encodes a Secreted Form of Human CD8α. Characterization of the Human CD8α gene, J. Immunol. 142:3312-19. Egzoni/introni CD8α gena su prikazani sistemski na SL-ma 4 i 5.
[0061] Ljudski CD8β gen se nalazi nizvodno od CD8α gena na hromozomu 2. Više izoformi stvorenih alternativnim splajsovanjem CD8β gena je zabeleženo, gde je jedna izoforma predviđena da ima nedostatak transmembranskog domena i stvara izlučeni protein. Norment i dr. (1988) A second subunit of CD8 is expressed in human T cells, EMBO J.7:3433-39. Egzoni/introni CD8β gena su prikazani sistemski na SL-ma 3 i 5.
[0062] CD8β protein vezan za membranu sadrži N-terminalnu signalnu sekvencu, što je praćeno domenom nalik Imunoglobulinu V, kratkim vanćelijskim zglobniom regionom, transmembranskim domenom i citoplazmatskim repom. Videti, Littman (1987) The structure of the CD4 and CD8 genes, Ann Rev. Immunol. 5:561-84. Zglobni region je mesto intenzivne glikozilacije, za koje se smatra da održava konformaciju i zaštitu proteina iz deljenja proteazom. Leahy (1995) A structural view of CD4 and CD8, FASEB J.9:17-25.
[0063] CD8 protein se obično ispoljava na citotoksičnim T ćelijama, i interaguje sa MHC I molekulima. Interakcija je posredovana CD8 vezivanjem za α3d domen MHC I. Iako je vezivanje MHC klase I za CD8 oko 100 puta slabije od vezivanja TCR za MHC klase I, CD8 vezivanje pojačava afinitet TCR vezivanja. Wooldridge i dr. (2010) MHC Class I Molecules with Superenhanced CD8 Binding Properties Bypass the Requirement for Cognate TCR Recognition and Nonspecifically Activate CTLs, J. Immunol.184:3357-3366.
[0064] CD8 vezivanje za molekule MHC klase I je specifično za vrstu; miš homologan za CD8, Lyt-2 je pokazan da vezuje H-2D<d>molekule na α3 domenu ali ne vezuje HLA-A molekule. Connolly i dr. (1988) The Lyt-2 Molecule Recognizes Residues in the Class I α3 Domain in Allogeneic Cytotoxic T Cell Responses, J. Exp. Med.
168:325-341. Diferencijalno vezivanje je verovatno zbog determinanti nalik CDR (nalik CDR1 i CDR2) na CD8 koji nisu konzervisani između ljudi i miševa. Sanders i dr. (1991) Mutations in CD8 that Affect Interactions with HLA Class I and Monoclonal Anti-CD8 Antibodies, J. Exp. Med.174:371-379; Vitiello i dr. (1991) Analysis of the HLA-restricted Influenza-specific Cytotoxic T Lymphocyte Response in Transgenic Mice Carrying a Chimeric Human-Mouse Class I Major Histocompatibility Complex, J. Exp. Med.173:1007-1015; i, Gao i dr. (1997) Crystal structure of the complex between human CD8αα and HLA-A2, Nature 387:630-634. Zabeleženo je da CD8 vezuje HLA-A2 u konzervisanom regionu α3 domena (na poziciji 223-229). Jedna zamena (V245A) u HLA-A je smanjila vezivanje CD8 za HLA-A sa pratećom velikom redukcijom razlaganja posredovanog T ćelijama. Salter i dr. (1989), Polymorphism in the α3 domain of HLA-A molecules affects binding to CD8, Nature 338:345-348. Uopšteno, polimorfizam u α3 domenu HLA-A molekula je takođe uticao na vezivanje za CD8. Id. Kod miševa, aminokiselinska zamena na ostatku 227 u H-2D<d>je uticala na vezivanje Lyt-2 miša za H-2D<d>, i ćelije transfektovane sa mutiranim H-2D<d>nisu razložene sa CD8+ T ćelijama. Potter i dr. (1989) Substitution at residue 227 of H-2 class I molecules abrogates recognition by CD8-dependent, but not CD8-independent, cytotoxic T lymphocytes, Nature 337:73-75. Zbog toga, ispoljavanje ljudskog ili humanizovanog CD8 može biti od koristi za ispitivanje T ćelijskih odgovora na antigen prisutan u ljudskom ili humanizovanom MHC I.
[0065] Slično sa CD4, citoplazmatski domen CD8 interaguje sa Lck tirozinskom kinazom, što zauzvrat dovodi do aktiviranja T ćelija. Iako Lck deluje da interaguje sa citoplazmatskim domenom CD8α, deluje da je ova interakcija regulisana prisustvom citoplazmatskog domena CD8β zato što mutacije ili brisanja CD8β citoplazmatskog domena za rezultat daju redukovanu Lck aktivnost povezanu sa CD8α. Irie i dr. (1998) The cytoplasmic domain of CD8β Regulates Lck Kinase Activation and CD8 T cell Development, J. Immunol.161:183-91. Smanjenje Lck aktivnosti je povezano sa pogoršanim T ćelijskim razvojem. Id.
[0066] Ispoljavanje CD8 u odgovarajućim ćelijama, npr. citotoksičnim T ćelijama, je usko regulisano različitim elementima za pojačavanja koji se nalaze širom CD8 lokusa. Na primer, bar 4 regiona hipersenzitivnosti DNaze I, gde su regioni često povezani sa regulatorskim vezivanje, su identifikovani u CD8 lokusu. Hosert i dr. (1997) A CD8 genomic fragment that directs subset-specific expression of CD8 in transgenic mice, J. Immunol.158:4270-81. Od otkrića ovih hipersenzitivnih regiona DNaze I CD8 lokusu, bar 5 elemenata za pojačavanje je identifikovano, koji se prostiru u CD8 lokusu, koji regulišu ispoljavanje CD8α i/ili β u te ćelijama različitog porekla, uključujući DP, CD8 SP T ćelije ili ćelije koje ispoljavaju γδTCR. Videti, npr. Kioussis i dr. (2002) Chromatin and CD4, CD8A, and CD8B gene expression during thymic differentiation, Nature Rev.2:909-919 i Online Erratum; Ellmeier i dr. (1998) Multiple Development Stage-Specific Enhancers Regulate CD8 Expression in Developing Thymocytes and in Thymus-Independent T cells, Immunity 9:485-96.
[0067] Zbog toga, slično koristi dobijene zadržavanjem endogenog CD4 promotera i regulatornih elemenata za ljudske ili humanizovane CD4 genetski modifikovane glodare, u nekim otelotvorenjima, može postojati korist od razvijanja genetski modifikovanog glodara koji zadržava endogeni promoter i regulatorne elemente od miša koji bi kontrolisao ispoljavanje ljudskog ili humanizovanog CD8. Može postojati naročita koristi pri stvaranju genetski modifikovanih životinja koje obuhvata zamenjivanje endogenih sekvenci glodara koje kodiraju CD8α i/ili β proteina sa onim koje kodiraju ljudske ili humanizovane CD8α i/ili β proteine, kao što je ovde opisano.
[0068] U različitim otelotvorenjima, pronalazak pruža genetski modifikovanog glodara koji sadrži u svom genomu, u svom endogenom CD8 lokusu, bar jednu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD8α polipeptid čoveka/glodara, gde ljudski deo himernog polipeptida sadrži ceo ili suštinski ceo domen ljudskog CD8α i/ β, gde deo od glodara sadrži bar transmembranske i citoplazmatske domene CD8α i/ β glodara, i gde životinja ispoljava funkcionalni himerni CD8α i β polipeptid. Zbog tome, u jednom otelotvorenju, pronalazak pruža genetski modifikovanog glodara koji sadrži u svom endogenom CD8 lokusu prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD8α polipeptid čoveka/glodara i drugu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD8β polipeptid čoveka/glodara, gde prva nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu koja kodira ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen ljudskog CD8α polipeptida i bar transmembranske i citoplazmatske domene CD8α polipeptida glodara, i gde druga nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu koja kodira ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen ljudskog CD8β polipeptida i bar transmembranske i citoplazmatske domene CD8β polipeptida glodara, gde životinja ispoljava funkcionalni himerni CD8 protein čoveka/glodara. Glodar ispoljava samo humanizovani CD8 polipeptid, (npr. himerni CD8α i/ili β polipeptid čoveka/glodara) a ne ispoljava funkcionalni endogeni CD8 polipeptid glodara u svom endogenom CD8 lokusu.
[0069] U jednom otelotvorenju, himerni CD8α polipeptid čoveka/glodara sadrži u svom ljudskom delu ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen ljudskog CD8α polipeptida. Ljudski deo himernog CD8α polipeptida čoveka/glodara sadrži bar MHC I vezujući domen ljudskog CD8α polipeptida. U jednom otelotvorenju, ljudski deo himernog CD8α polipeptida sadrži sekvencu bar celog ili suštinski celog domena nalik imunoglobulinu V ljudskog CD8α. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira ljudski deo himernog CD8α polipeptida sadrži bar egzone koji kodiraju vanćelijski domen ljudskog CD8α polipeptida. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca sadrži bar egzone koji kodiraju domene nalik Ig V. U jednom otelotvorenju, vanćelijski domen ljudskog CD8α polipeptida je region koji obuhvata domen polipeptida koji nije transmembranski ili citoplazmatski domen. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira himerni CD8α polipeptid čoveka/glodara sadrži sekvencu koja kodira CD8α signalni peptid glodara (npr. miša). Alternativno, nukleotidna sekvenca može sadržati sekvencu koja kodira ljudsku CD8α signalnu sekvencu. U jednom otelotvorenju, himerni CD8α polipeptid čoveka/glodara sadrži aminokiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO:54 i ljudski deo himernog polipeptida je iznet oko amino kiselina 28-179 u SEQ ID NO:54 (predstavljeno odvojeno u SEQ ID NO:59).
[0070] Slično, u jednom otelotvorenju, himerni CD8β polipeptid čoveka/glodara sadrži u svom ljudskom delu ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen ljudskog CD8β polipeptida. U jednom otelotvorenju, ljudski deo himernog CD8β polipeptida sadrži sekvencu bar celog ili suštinski celog domena nalik imunoglobulinu V ljudskog CD8β. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira ljudski deo himernog CD8β polipeptida sadrži bar egzone koji kodiraju vanćelijski domen ljudskog CD8β polipeptida. U jednom otelotvorenju, ljudski deo himernog CD8β polipeptida čoveka/glodara sadrži bar egzone koji kodiraju domen nalik IgG V CD8β. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira himerni CD8β polipeptid čoveka/glodara sadrži sekvencu koja kodira CD8β signalni peptid glodara (npr. miša). Alternativno, nukleotidna sekvenca može sadržati sekvencu koja kodira ljudsku CD8β signalnu sekvencu. U jednom otelotvorenju, himerni CD8β polipeptid čoveka/glodara sadrži aminokiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO:53 i ljudski deo himernog polipeptida je iznet oko amino kiselina 15-165 u SEQ ID NO:53 (predstavljeno odvojeno u SEQ ID NO:58).
[0071] Glodar ispoljava himerne CD8α i/ili CD8β polipeptide čoveka/glodara. U nekim otelotvorenjima, ljudski deo himernog CD8α i/ili β polipeptida čoveka/glodara sadrži jednu ili više konzervativnih ili nekonzervativnih modifikacija.
[0072] U jednom aspektu, dat je glodar koji ispoljava ljudsku CD8α i/ili β polipeptidnu sekvencu, gde je ljudska CD8α i/ili β polipeptidna sekvenca bar oko 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična sa ljudskom CD8α i/ili β polipeptidnom sekvencom, respektivno. U specifičnom otelotvorenju, ljudska CD8α i/ili β polipeptidna sekvenca je bar oko 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična sa odgovarajućom ljudskom CD8α i/ili β polipeptidnom sekvencom opisanom u Primerima. U jednom otelotvorenju, ljudska CD8α i/ili β sekvenca sadrži jednu ili više konzervativnih zamena. U jednom otelotvorenju, ljudska CD8α i/ili β sekvenca sadrži jednu ili više nekonzervativnih zamena.
[0073] U nekim otelotvorenjima, deo, npr., ljudski deo himernog CD8 može sadržati suštinski celu sekvencu koja je ovde naznačena (npr. suštinski ceo proteinski domen koji je ovde ukazan). Suštinski cela sekvenca uopšteno obuhvata 5%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% amino kiselina za koje se veruje da predstavljaju naročiti deo proteina (npr. naročiti funkcionalni domen, itd.). Stručna osoba u ovoj oblasti će prihvatiti da granice funkcionalnog domena mogu blago varirati u zavisnosti od poravnanja i upotrebljene metode za predviđanje domena.
[0074] Deo od glodara himernog CD8α i/ili β polipeptida čoveka/glodara sadrži bar transmembranski i/ili citoplazmatski domen CD8α i/ili β polipeptida glodara, respektivno. Zbog značaja funkcija pruženih CD8 citoplazmatskim domenom, zadržavanje sekvence endogenog glodara (npr. miša) u genetski modifikovanim životinjama osigurava zaštitu odgovarajućeg unutarćelijskog signaliziranja i drugih funkcija koreceptora. U jednom otelotvorenju, glodar je miš, i CD8α i/ili β polipeptid glodara je CD8α i/ili β polipeptid miša, respektivno. Iako su specifične CD8α i/ili β sekvence miša opisane u Primerima, bilo koja pogodna sekvenca izvedena iz nje, npr. sekvenca koja sadrži konzervativne/ne-konzervativne aminokiselinske zamene, je ovde obuhvaćena. U jednom otelotvorenju, glodar (npr. miš) zadržava bilo koju endogenu sekvencu koja nije bila humanizovana.
[0075] Ovde opisani glodar može sadržati u svom endogenom lokusu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD8α i/ili β polipeptid čoveka/glodara. U jednom aspektu, ovo za rezultat daje zamenjivanje dela endogenog CD8α gena sa nukleotidnom sekvencom koja kodira deo ljudskog CD8α polipeptida i/ili zamenjivanje dela endogenog CD8β gena sa nukleotidnom sekvencom koja kodira deo ljudskog CD8β polipeptida. U jednom otelotvorenju, takvo zamenjivanje je zamenjivanje endogene nukleotidne sekvence koja kodira ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen CD8α i/ili β glodara sa ljudskim nukleotidnom sa ljudskom nukleotidnom sekvencom koja kodira isti. U jednom otelotvorenju, takvo zamenjivanje je zamenjivanje sekvence koja kodira bar ceo ili suštinski ceo domen nalik imunoglobulinu V CD8α i/ili β glodara sa ljudskom nukleotidnom sekvencom koja kodira isti. U jednom otelotvorenju, zamenjivanje ne obuhvata zamenjivanje CD8α i/ili β sekvence koja kodira transmembranski i citoplazmatski domen CD8α i/ili β polipeptida. Zbog toga, glodar ispoljava himerni CD8α i/ili β polipeptid čoveka/glodara u endogenom CD8 lokusu koji nije ljudski. U još jednom otelotvorenju, zamenjivanje za rezultat daje CD8α i/ili β protein koji sadrži polipeptidnu sekvencu iznetu u SEQ ID NO:54 i/ili 53, respektivno.
[0076] U jednom aspektu, zbog toga što se himerna CD8α i/ili β sekvenca čoveka/glodara (npr. čoveka/miša) nalazi u odgovarajućem endogenom CD8α i/ili β lokusu glodara (npr. miša), zadržava endogeni CD8α i/ili β promoter i regulatorne sekvence. U drugom otelotvorenju, himerni lokus može sadržati ljudski CD8α i/ili β promoter i regulatorne elemente za proširivanje onih koji omogućavaju pravilno ispoljavanje CD8α i/ili β (pravilno prostorno i temporalno ispoljavanje proteina), CD8+ T ćelijsko razvijanje, odabir CD8 roda i koreceptorsku funkciju. Zbog toga, u jednom aspektu, glodari pronalaska sadrže genetsku modifikaciju koja ne menja pravilna svojstva roda i razvijanje T ćelija. U jednom aspektu, glodari pronalaska ne ispoljavaju himerni CD8 protein na imunim ćelijama koje nisu ćelije koje obično ispoljavaju CD8, npr. glodari ne ispoljavaju CD8 na B ćelijama ili CD+ SP T ćelijama. U jednom otelotvorenju, zamenjivanje za rezultat daje zadržavanje elemenata koji omogućavaju ispravnu prostornu i temporalnu regulaciju CD8α i/ili β ispoljavanja.
[0077] Genetski modifikovani glodar sadrži ljudske ili humanizovane CD8 polipeptide koji su ovde opisani može se izabrati iz životinja koje su opisane iznad u delu koji se odnosi na humanizovane CD4 životinje. U jednom otelotvorenju, glodar može biti, npr. pacov ili miš.
[0078] Prema tome, u jednom otelotvorenju, pronalazak pruža genetski modifikovanog miša koji u svom genomu sadrži, u endogenom CD8 lokusu, prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD8α polipeptid čoveka/miša i drugu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD8β polipeptid čoveka/miša. U jednom otelotvorenju, prva nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu koja kodira ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen ljudskog CD8α polipeptida i bar transmembranske i citoplazmatske domene CD8α polipeptida miša, i druga nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu koja kodira ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen ljudskog CD8β polipeptida i bar transmembranske i citoplazmatske domene CD8β polipeptida miša, i gde miš ispoljava funkcionalni himerni CD8 protein čoveka/miša. U jednom otelotvorenju, prva nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu koja kodira bar domen nalik imunoglobulinu V ljudskog CD8α polipeptida i preostale sekvence CD8α polipeptida miša i druga nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu koja kodira bar domen imunoglobulinu V domen ljudskog CD8β polipeptida i preostale sekvence CD8β polipeptida miša. Prva nukleotidna sekvenca sadrži bar MHC I-vezujući domen ljudskog CD8α polipeptida. U jednom otelotvorenju, prva i druga nukleotidna sekvenca sadrže bar egzone koji kodiraju vanćelijski domen ljudskog CD8α polipeptid i/ili CD8β polipeptida, respektivno. U jednom otelotvorenju, vanćelijski domen ljudskog CD8α polipeptid i/ili CD8β polipeptid je region koji obuhvata domen ljudskog CD8α polipeptida i/ili CD8β polipeptid koji nije transmembranski ili citoplazmatski domen. U jednom otelotvorenju, domeni ljudskog CD8α polipeptida su šematski prikazani na SL-ma 4 i 5. U jednom otelotvorenju, domeni ljudskog CD8β polipeptida su šematski prikazani na SL-ma 3 i 5. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira himerni CD8α polipeptid i/ili CD8β polipeptid čoveka/miša sadrži sekvencu koja kodira CD8α i/ili CD8β signalni peptid miša, respektivno. Alternativno, nukleotidna sekvenca može sadržati sekvencu koja kodira ljudsku CD8α i/ili CD8β signalnu sekvencu. U jednom otelotvorenju, miš sadrži zamenjivanje nukleotidne sekvence koja kodira ceo ili suštinski ceo CD8α i/ili CD8β vanćelijski domen miša sa nukleotidnom sekvencom koja kodira ceo ili suštinski ceo ljudski CD8α i/ili CD8β vanćelijski domen, respektivno.
[0079] Miš ne ispoljava funkcionalne endogene CD8α i CD8β polipeptide miša u svom endogenom lokusu CD8 miša. U jednom otelotvorenju, ovde opisani miš sadrži himernu CD8 nukleotidnu sekvencu čoveka/miša u svojoj germinalnoj liniji.
[0080] U jednom aspektu, miš koji ispoljava himerne CD8α i CD8β proteine čoveka/miša zadržava CD8α i/ili CD8β promoter miša i regulatorne sekvence, npr. nukleotidna sekvenca kod miša koja kodira himerni CD8 čoveka/miša je operativno spojena sa endogenim CD8 promoterom miša i regulatornim sekvencama. U jednom aspektu, ove regulatorne sekvence zadržane u mišu obuhvataju sekvence koje regulišu ispoljavanje CD8 protein u odgovarajućim fazama razvoja T ćelija. U jednom aspektu, genetski modifikovani miš ne ispoljava himerni CD8 na B ćelijama ili T ćelijama CD4 porekla, ili bilo kojoj ćeliji, npr. imunoj ćeliji, koja obično ne ispoljava endogeni CD8.
[0081] U različitim otelotvorenjima, glodar (npr. miš ili pacov) koji ispoljava funkcionalni himerni CD8αβ protein) iz himernog CD8 lokusa kao što je ovde opisano prikazuje himerni protein na ćelijskoj površini. U jednom otelotvorenju, glodar ispoljava himerni CD8 protein na ćelijskoj površini u ćelijskoj raspodeli koja je ista kao što je primećeno kod čoveka. U jednom aspektu, CD8 protein je u stanju da interaguje sa MHC I proteinom koji se ispoljava na površini druge ćelije.
[0082] Glodar (npr. miš) pronalaska dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira ljudski ili humanizovani MHC II protein, kao što je himerni CD8 protein koji se ispoljava na površini T ćelije životinje koja je u stanju da interaguje sa ljudskim ili humanizovanim MHC I koji se ispoljava na površini druge ćelije, npr. ćelije koja predstavlja antigen. MHC I protein sadrži vanćelijski domen ljudskog MHC I polipeptida. U jednom otelotvorenju, glodar dalje sadrži ljudski ili humanizovani β-2 mikroglobulin polipeptid. Primerni genetski modifikovani glodar koje ispoljava ljudski ili humanizovani MHC I polipeptid i/ili β-2 mikroglobulin polipeptid je opisan u patentnoj prijavi SAD br. 13/661,159, podnetoj 26. oktobra, 2012, i patentnoj prijavi SAD br. 13/793,812, podnetoj 11. marta, 2013. Prema tome, u jednom otelotvorenju, ovde opisani glodar koji sadrži CD8 protein može dalje da sadrži humanizovani MHC I kompleks, gde humanizovani MHC I kompleks sadrži: (1) humanizovani MHC I polipeptid, npr. gde humanizovani MHC I polipeptid sadrži ljudski MHC I vanćelijski domen i transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC I (npr. miša), npr. gde humanizovani MHC I sadrži α1, α2, i α3 domene ljudskog MHC I polipeptida i (2) ljudski ili humanizovani β2 mikroglobulin polipeptid (npr. životinja koja sadrži u svom genomu nukleotidnu sekvencu iznetu u egzonima 2, 3 i 4 ljudskog β2 mikroglobulina). I humanizovani MHC I i ljudski β2 mikroglobulin polipeptidi su kodirani nukleotidnim sekvencama koje se nalaze na endogenim MHC I i β2 mikroglobulin lokusima, respektivno. životinja ne ispoljava funkcionalne MHC I i β2 mikroglobulin polipeptide. Zbog toga, MHC I koji se ispoljava od strane glodara može biti himerni MHC I protein čoveka/glodara (npr. čoveka/miša). Ljudski deo himernog MHC I proteina može biti izveden iz ljudskog HLA klase I proteina izabranog iz grupe koju čine HLA-A, HLA-B, i HLA-C, npr. HLA-A2, HLA-B27, HLA-B7, HLA-Cw6, ili bilo kog drugog HLA klase I molekula prisutnog u ljudskoj populaciji. U otelotvorenju, kada je glodar miš, deo od glodara (tj. miša) himernog MHC I polipeptida može biti izveden iz MHC I proteina miša izabranog iz H-2D, H-2K i H-2L. U jednom aspektu, glodar koji sadrži himerni CD8 čoveka/glodara i humanizovani MHC I i/ili β-2 mikroglobulin opisan u patentnim prijavama SAD. 13/661,159 i 13/793,812 se može stvoriti razmnožavanjem životinje koja sadrži himerni CD8 lokus (npr. himerni CD8 α i/ili β lokus) kao što je ovde opisano sa životinjom koja sadrži humanizovani MHC I i/ili β-2 mikroglobulin lokus. Glodar se takođe može stvoriti uvođenjem u ES ćelije glodara koji sadrži humanizovani MHC I i/ili β-2 mikroglobulin lokus nukleotidne sekvence koja kodira himerni CD8 (npr. himerni CD8 α i/ili β), npr. za zamenjivanje endogenog CD8 lokusa (npr. himernog CD8 α i/ili β lokusa); ili uvođenjem u ES ćelije životinje koja sadrži himerni CD8 lokus (npr. himerni CD8 α i/ili β lokus) nukleotidne sekvence koja kodira humanizovani MHC I i/ili β-2 mikroglobulin.
[0083] Takođe je data metoda za pravljenje genetski modifikovanog glodara koji je ovde opisan. Metoda za rezultat daje glodara koji sadrži u svom endogenom CD8 lokusu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD8α i/ili CD8β polipeptid čoveka/glodara. Metoda može koristi konstrukt za ciljanje napravljen upotrebom VELOCIGENE® tehnologije, uvođenjem konstrukta u ES ćelije, i uvođenjem ciljanih ES ćelijskih klonova u embrion miša upotrebom VELOCIGENE® tehnologije, kao što je opisano u Primerima.
[0084] U jednom otelotvorenju, pronalazak obuhvata metodu za modifikovanje CD8 lokusa glodara kako bi ispoljavao himerni CD8 polipeptid čoveka/glodara kao što je ovde opisano. U jednom aspektu, data je metoda za modifikovanje CD8 lokusa miša, kako bi ispoljavao himerni CD8 polipeptid čoveka/miša koji obuhvata zamenjivanje na endogenom CD8 lokusu nukleotidne sekvence koja kodira endogeni CD8 polipeptid miša sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni CD8 polipeptid čoveka/miša. CD8 polipeptid je kombinacija CD8α i CD8β. U jednom aspektu, himerni CD4 polipeptid čoveka/glodara sadrži ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen ljudskog CD8 polipeptida i bar transmembranske i citoplazmatske domene endogenom CD8 polipeptida miša.
[0085] Zbog toga, nukleotidni konstrukt za stvaranje genetski modifikovanih životinja koje su ovde opisano je takođe obelodanjeno. U jednom aspektu, sekvenca nukleotidnog konstrukta sadrži 5' i 3' homologne ruke, DNK fragment koji sadrži ljudsku CD8α i CD8β sekvence, i kasete za selekciju između mesta rekombinacije. U nekim otelotvorenjima, ljudska sekvenca sadrži introne i egzone ljudskog CD8α ili CD8β, npr. egzone koji kodiraju vanćelijski domen ljudskog CD8α ili CD8β, respektivno. U jednom otelotvorenju, homologne ruke su homologne za sekvencu CD8α ili CD8β glodara. Primerni konstrukti za CD8α i CD8β su prikazani na Sl-ma 4 i 3, respektivno.
[0086] Zbog bliske hromozomne lokalizacije gena koji kodiraju CD8α i CD8β, sekvencijalno ciljanje dva gena poboljšava verovatnoću uspešne humanizacije. U jednom otelotvorenju, strategija ciljanja obuhvata uvođenje himernog CD8β konstrukta ovde opisanog u ES ćelije, stvaranjem miša iz ciljane ES ćelije, izvođenje genetski modifikovanih ES ćelija iz navedenog miša, i uvođenje himernog CD8α konstrukta ovde opisanog u navedene genetski modifikovane ES ćelije. U drugom otelotvorenju, strategija ciljanja obuhvata uvođenje himernog CD8β konstrukta ovde opisanog u ES ćelije, selekciju ćelija koje su ugrađene u himerni CD8β konstrukt, uvođenje himernog CD8α konstrukta ovde opisanog u ES ćelije koje su ugrađene i koje nose himerni CD8β konstrukt i selekciju ćelija koje imaju ugrađene i himerni CD8β i CD8α. U jednom aspektu ovog otelotvorenja, koraci za selekciju su izvršeni upotrebom različitih markera za selekciju. U alternativnim otelotvorenjima, CD8α humanizacija se može prvo postići. Nakon završetka ciljanja gena, ES ćelije genetski modifikovanog glodara se mogu proveriti za potvrđivanje uspešnog ugrađivanja egzogene nukleotidne sekvence od interesa ili ispoljavanje egzogenog polipeptida različitim metodama (npr. metode opisane iznad za CD4 humanizaciju, npr. test modifikacije alela opisan u Valenzuela i dr., iznad).
[0087] U jednom aspektu, data je metoda za pravljenje himernog CD8 molekula čoveka/glodara (npr. CD8α i/ili CD8β) koja obuhvata ispoljavanje u jednoj ćeliji himernog CD8 polipeptida iz nukleotidnog konstrukta kao što je ovde opisano. U jednom otelotvorenju, nukleotidni konstrukt je virusni vektor; u specifičnom otelotvorenju, virusni vektor je lentivirusni vektor. U jednom otelotvorenju, ćelija je izabrana iz CHO, COS, 293, HeLa, i renitalne ćelije koja ispoljava virusnu sekvencu nukleinske kiseline (npr. PERC.6™ ćelija).
Upotreba genetski modifikovanih CD4 i CD8 životinja
[0088] Genetski modifikovani glodari, npr. miševi ili pacove, koji sadrže ili humanizovani CD4 i MHC II ili humanizovani CD8 i MHC I, predstavljaju peptide T ćelijama (CD4+ ili CD8+ T ćelijama, respektivno) na način nalik čoveku, zato što su suštinski sve komponente kompleksa od čoveka ili su humanizovane. Genetski modifikovani glodar pronalaska se može koristiti za ispitivanje funkcije ljudskog imunog sistema u humanizovanim glodaru za identifikaciju antigena i antigenskih epitopa koji izazivaju imuni odgovor (npr. T ćelijski epitopi, npr. jedinstveni epitopi raka kod čoveka) npr. za upotrebu pri razvijanju vakcine; za identifikaciju T ćelija sa visokim afinitetom za ljudske patogene ili antigene raka (tj. T ćelije koje vezuju antigen u kontekstu ljudskog MHC I kompleksa sa visokim aviditetom), npr. za upotrebu u adaptivnom T ćelijskoj terapiji; za procenjivanje kandidata za vakcinu i drugih strategija za vakcinu; za ispitivanje autoimuniteta kod ljudi; za ispitivanje infektivnih bolesti kod ljudi; i u suprotnom za pronalaženje boljih terapeutskih strategija na osnovu ispoljavanja MHC i CD4/CD8 čoveka.
[0089] Zbog toga, genetski modifikovani glodari predmetnog pronalaska su od koristi, između ostalih stvari, za procenjivanje kapaciteta antigena da izazove imuni odgovor kod čoveka i za stvaranje različitih antigena i identifikovanje specifičnog antigena koji se može koristiti za razvijanje ljudske vakcine.
[0090] Ovde je obelodanjena metoda za razvijanje ili peptida koji je izazvati ćelijski imuni odgovor kod čoveka, koja obuhvata izlaganje genetski modifikovanog glodara kao što je ovde opisano peptidu, što omogućava glodaru da nametne imuni odgovor, i detektovanje ćelije u glodaru (npr. CD8+ or CD4+ T ćelije, koja sadrži ljudski CD8 ili CD4, respektivno) koja vezuje sekvencu peptida predstavljenu himernim MHC I ili II molekulom čoveka/glodara kao što je ovde opisano. U jednom otelotvorenju, glodar nakon izlaganja sadrži MHC klase I-ograničen CD8+ citotoksični T limfocit (CTL) koji vezuje peptid. U drugom otelotvorenju, glodar nakon izlaganja sadrži MHC II-ograničenu CD4+ T ćeliju koja vezuje peptid.
[0091] Ovde je obelodanjena metoda za identifikovanje ljudskog T ćelijskog epitopa, koja obuhvata izlaganje glodara kao što je ovde opisano antigenu koji sadrži navodni T ćelijski epitop, što omogućava glodaru da nametne imuni odgovor, izolovanje iz glodara MHC klase I- ili MHC klase II-ograničenu T ćeliju koja vezuje epitopa i identifikovanje epitopa vezanog navedenom T ćelijom.
[0092] Ovde je obelodanjena metoda koja pruža identifikovanje antigena koji stvara T ćelijski odgovor kod čoveka, koja obuhvata izlaganje navodnog antigena mišu kao što je ovde opisano, što omogućava stvaranje imunog odgovora miša i identifikovanje antigena vezanog sa HLA klase I- ili klase II-ograničeni molekul.
[0093] Ovde je obelodanjena metoda za određivanje toga da li navodni antigen sadrži epitop koji će nakon izlaganja imunog sistema čoveka stvoriti HLA klase I- ili klase II-ograničeni imuni odgovor, koja obuhvata izlaganje miša kao što je ovde opisano navodnom antigenu i merenje antigen-specifičnog HLA klase I- ili HLA klase II-ograničenog imunog odgovora kod miša.
[0094] Dodatno, genetski modifikovani glodar koji je ovde opisan može biti od koristi za identifikaciju T ćelijskih receptora, npr. T ćelijskih receptora sa visokim aviditetom, koji prepoznaju antigen od interesa, npr. tumorski ili drugi antigen bolesti. Metoda može obuhvatati: izlaganje ovde opisanog glodara antigenu, što omogućava glodaru da nametne imuni odgovor antigenu, izolovanje iz glodara T ćelije koja sadrži T ćelijski receptor koji vezuje antigen predstavljen ljudskim ili humanizovanim MHC I ili MHC Ii i određivanje sekvence navedenog T ćelijskog receptora.
[0095] Ovde je obelodanjena metoda koja pruža određivanje aktiviranja T ćelije navodnim ljudskim terapeutskim sredstvom, koja obuhvata izlaganje genetski modifikovane životinje kao što je ovde opisano navodnom ljudskom terapeutskom sredstvu (ili npr. izlaganje ljudske ili humanizovane ćelije koja ispoljava MHC II- ili MHC I takve životinje peptidnoj sekvenci navodnog terapeutskog sredstva), izlaganje ćelije genetski modifikovane životinje koja prikazuje ljudski ili humanizovani MHC/peptidni kompleks T ćeliji koja sadrži himerni CD4 ili CD8 čoveka/glodara (npr. čoveka/miša) koji je u stanju da veže ćeliju genetski modifikovane životinje, i merenje aktiviranja T ćelije koje je uzrokovanu ćelijom koja prikazuje peptid genetski modifikovane životinje.
[0096] Dodatno sposobnosti da se identifikuje antigen i antigenski epitopi iz ljudskih patogena ili neoplazme, genetski modifikovani glodari pronalaska se mogu koristiti za identifikovanje autoantigena relevantnih za autoimune bolesti, npr. tip I dijabetes, multiplu sklerozu, itd. Takođe, genetski modifikovani glodari pronalaska se mogu koristiti za ispitivanje različitih aspekata autoimune bolesti kod ljudi, i mogu se koristiti za modele autoimune bolesti.
[0097] Druge upotrebe genetski modifikovanih životinja koje su ovde opisane, tj. životinja koje sadrže ljudski ili humanizovani T-ćelijski koreceptor (npr. himerni CD4 ili CD8 čoveka/glodara), opciono dalje sadrže ljudski ili humanizovani MHC II ili I protein, će biti očigledne iz predmetnog obelodanjivanja.
PRIMERI
[0098] Pronalazak će dalje biti prikazan sledećim neograničavajućim primerima. Ovi Primeri su izneti kako bi pomogli razumevanje pronalaska ali nisu namenjeni da, i ne bi ih trebalo tumačiti da, ograničavaju njegov okvir na bilo koji način. Primeri ne obuhvataju detaljne opise konvencionalnih metoda koje bi bile dobro poznate stručnima u ovoj oblasti (tehnike molekularnog kloniranja, itd.). Ukoliko nije drugačije naznačeno, delovi su delovi po masi, molekulska masa je srednja molekulska masa, temperatura je naznačena u stepenima Celzijusa i pritisak je pri ili blizu atmosferskom.
Primer 1. Konstruisanje i karakterizacija genetski modifikovanog CD4 miša
Primer 1.1: Inženjering himernog CD4 lokusa
[0099] CD4 lokus miša je humanizovan u jednom koraku konstruisanjem jedinstvenog vektora za ciljanje iz DNK baterijskog veštačkog hromozoma (BAC) čoveka i miša upotrebom tehnologije VELOCIGENE® (videti, npr. pat. SAD No. 6,586,251 i Valenzuela i dr. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659). Za stvaranje vektora za ciljanje, niz bakterijskih homolognih rekombinacija (BHR) upotrebom DNK bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC), kao i drugih koraka inženjeringa, je izvršeno.
[0100] Ukratko, četiri DNK fragmenta (1) fragment koji sadrži signalni peptid miša (kodiran egzonima 2 i 3 CD4 gena miša), (2) fragment koji sadrži ljudski egzon 3 nizvodno od signalnog peptida miša, (3) fragment koji sadrži kasetu SPEC otpornosti koja je između Asc I i PI-Scel mesta, i (4) fragment koji sadrži 160 bp CDR4 introna 6 miša (intron između egzona 6 i 7), koji počinje oko 200 bp nizvodno od CD4 egzona 6 miša su spojena infuzionom ligacijom (Clonetech). Dobijeni DNK fragment je sadržao, od 5' do 3': egzon 2 miša, intron 2 miša, deo egzona 3 miša koji je sadržao signalni peptid, egzon 3 čoveka nizvodno od ljudskog signalnog peptida, deo introna 3 čoveka, SPEC kasetu, deo introna 6 miša. Ovaj DNK fragment je korišćen u BHR kako bi modifikovao BAC klon BMQ391F08 u cilju brisanja sekvence miša koja kodira CD4 Ig-nalik domene 1-3 i uvođenja egzona 3 CD4 čoveka. CM kaseta od BAC je zamenjena sa SPEC kasetom što je za rezultat dalo prvi BAC vektor (SL.1, gornji dijagram).
[0101] Ljudski BAC RP11-101F21 je modifikovan sa BHR kako bi se uvela Ascl-LoxP-PGK-neo-loxP kaseta 60 bp nizvodno od ljudskog egzona 3, i kako bi se uvelo mesto PI-Scel restrikcije i SPEC kaseta oko 100 bp nizvodno od egzona 6, što za rezultat daje drugi BAC vektor (SL.1, srednji dijagram). Ovaj korak je praćen BAC do BAC ligacijom prvog i drugog BAC vektora nakon razgradnje sa Ascl i PI-Scel restrikcionim enzimima kako bi se stvorio vektor koji cilja CD4 (SL. 1, donji dijagram). Uzvodno i nizvodno spajanje sekvenci miš-čovek i čovekmiš, respektivno, je dato u Tabeli 1 ispod i izneto je u spisku sekvenci. Sekvenca duž spoja kasete introna 3 - loxneo čoveka (5' kraj kasete) je izneta u SEQ ID NO:55 i sekvenca duž spoja lox-neo kasete - ljudskog introna 3 (3’ kraj kasete) je izneta u SEQ ID NO:56; obe sekvence su takođe date u Tabeli 1. Potpuna sekvence nukleinske kiseline humanizovanog CD4 dela, uključujući pgk-neo kasetu prikazano na Sl.1 su iznete u SEQ ID NO:3. Pgkneo kaseta predstavlja opseg ostataka 307-2176 od SEQ ID NO:3, dva lox mesta se nalaze na ostacima 267-300 i 2182-2215 dok se ljudska sekvenca predstavlja opseg ostataka 1-234 i 2222-18263. Aminokiselinska sekvenca potpunog humanizovanog CD4 proteina je izneta u SEQ ID NO:4, sa ljudskog sekvencom u opsegu amino kiselina 27-319 (izneto u SEQ ID NO: 57).
Tabela 1. Spajanje sekvenci himernog CD4 vektora za ciljanje
[0102] Ljudski vektor za ciljanje CD4 je linearizovan sa Notl i izložen elektroporaciji u F1H4 ES ćelija miša. Ciljane ES ćelije koje nose humanizovani CD4 lokus su identifikovane genotipovanjem upotrebom modifikacije testa alela (Valenzuela i dr.) što je detektovalo prisustvo neomicin kasete i ljudskog CD4 gena, kao i jednu kopiju mišijeg CD4 gena. Prajmeri i probe korišćene u testu su prikazane u Tabeli 2 i iznete u spisku sekvenci.
Tabela 2. Prajmeri i probe za genotipski himerni CD4
[0103] Spregnuta neomicin kaseta je uklonjena elektroporacijom plazmida koji ispoljava Cre rekombinazu u ES ćelije koje sadrže humanizovani CD4 lokus.
[0104] Ciljane ES ćelije koje nose humanizovani CD4 lokus bez markera za otpornost su identifikovane genotipovanjem koje je detektovalo odsustvo neomicin kasete, prisustvo jedne kopije ljudskog CD4 gena i jednu kopiju CD4 gena miša.
[0105] Ciljane ES ćelije opisane iznad su korišćene kao donor ES ćelije i uvedene su u fazu sa 8-ćelija embriona miša sa VELOCIMOUSE® metodom (videti, npr. pat. SAD No.7,294,754 i Poueymirou i dr. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech.25(1):91-99). VELOCIMICE® (F0 miševa je potpuno izvedeno iz donor ES ćelije) koja nezavisno nosi himerni CD4 gen je identifikovana genotipovanjem upotrebom modifikacije testa alela (Valenzuela i dr. iznad) koji detektuje prisustvo jedinstvenih sekvenci CD4 gena čoveka.
Primer 1.2: Ispoljavanje himernog CD4 u genetski modifikovanim miševima
[0106] Slezine iz WT i heterozigotnih humanizovanih CD4 miševa („1766HET“) su prelivene preko sa kolagenazom D (Roche Bioscience) i eritrocitima koji su lizirani sa ACK puferom za lizu. Ispoljavanje na površini ćelije CD4 čoveka ili CD4 miša je analizirano FACS upotrebom ili anti-ljudskih CD4 ili anti-mišijih CD4 antitela, respektivno. Kao što je prikazano na SL-ma. 2A i 2B, CD4 čoveka se ispoljava na površini T ćelija dobijenih iz miša heterozigotnog za humanizovani CD4 koji je ovde opisan.
Primer 2: Konstruisanje i karakterizacija genetski modifikovanog CD8 miša
[0107] CD8 protein se javlja ili kao disulfidno povezani homodimer (npr. CD8α homodimer) ili homomultimer sa dve pod jedinice ili kao heterodimer sa dva proteina CD8α (CD8a) i CD8β (CD8b). CD8α i CD8β geni su kolokalizovani u genomu, npr. na mišijem hromozomu 6, nalaze se oko 37 kb jedan od drugog. Takve bliske veze se veoma teško stvaraju kod genetski modifikovanih miševa koji sadrže humanizacije na oba CD8α i CD8β lokusima razmnožavanjem. Prema tome, ciljanje sekvence, prvo uvođenjem jednog gena, npr. CD8β, praćeno uvođenjem drugog gena, npr. CD8α, se vrši.
Primer 2.1: Inženjering himernog CD8β lokusa
[0108] CD8b lokus miša je humanizovan u jednom koraku konstruisanjem jedinstvenog vektora za ciljanje iz DNK baterijskog veštačkog hromozoma (BAC) čoveka i miša upotrebom tehnologije VELOCIGENE® (videti, npr. pat. SAD No.6,586,251 i Valenzuela i dr. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659). DNK iz BAC RP23-431M6 je modifikovana sa BHR kako bi se stvorio veliki vektor za ciljanje (LTVEC), MAID 1737, kako bi sadržao zamenjivanje egzona 2-3 miša koji kodiraju CD8 ekto domen (iz 5' spoja u intronu 1 do 3' spoja u intronu 3), sa homolognim ljudskim sekvencama (SL.3). Loxp-Ub-Hyg kaseta je uvedena na 3' spoju u intronu 3. Nukleotidna sekvenca na različitim spojevima dobijenog vektora je data u Tabeli 3 i izneta u spisku sekvenci. Potpuna aminokiselinska sekvenca humanizovanog CD8β proteina je izneta u SEQ ID NO:53; sa ljudskim sekvencama u opsegu amino kiselina 15-165 (izneto u SEQ ID NO:58).
Tabela 3. Spajanje sekvenci himernog CD8β vektora za ciljanje
[0109] Vektor za ciljanje je podvrgnut elektroporaciji u F1H4 mišijim ES ćelijama (Sl. 5, desna strana). Ciljane ES ćelije koje nose humanizovani CD8b lokus su identifikovane genotipovanjem upotrebom modifikacije testa alela (Valenzuela i dr.) što je detektovalo prisustvo CD8b gena čoveka. Prajmeri i probe korišćene u testu su prikazane u Tabeli 4 i iznete u spisku sekvenci.
Tabela 4: Prajmeri i probe za genotipski himerni CD8β
[0110] Ciljane ES ćelije opisane iznad su korišćene kao donor ES ćelije i uvedene su u fazu sa 8-ćelija embriona miša sa VELOCIMOUSE® metodom (videti, npr. pat. SAD No.7,294,754 i Poueymirou i dr. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech.25(1):91-99). VELOCIMICE® (F0 miševa je potpuno izvedeno iz donor ES ćelije) koja nezavisno nosi himerni CD8b gen je identifikovana genotipovanjem upotrebom modifikacije testa alela (Valenzuela i dr. iznad) koji detektuje prisustvo jedinstvenih sekvenci CD8b gena čoveka.
[0111] Odabrana kaseta se može ukloniti metodama poznatim stručnoj osobi. Na primer, ES ćelije koje nose himerni CD8b lokus čoveka/miša mogu biti transfektovane sa konstruktom koji ispoljava Cre u cilju uklanjanja „/oxed“ higromicin kasete uvođenjem unošenja konstrukta za ciljanje koji sadrži gensku sekvencu CD8b čoveka. Higromicin kaseta može opciono biti uklonjena razmnožavanjem miševa koji ispoljavaju Cre rekombinazu. Opciono, higromicin kaseta se zadržava u miševima. U jednom otelotvorenju, kaseta je izbrisana kako bi se stvorio MAID 1739.
Primer 2.2: Inženjering himernog CD8α lokusa
[0112] CD8a lokus miša je humanizovan u jednom koraku konstruisanjem jedinstvenog vektora za ciljanje iz DNK baterijskog veštačkog hromozoma (BAC) čoveka i miša upotrebom tehnologije VELOCIGENE® (videti, npr. pat. SAD Br. 6,586,251 i Valenzuela i dr., iznad). DNK iz BAC RP23-431M6 je modifikovana sa BHR kako bi se stvorio veliki vektor za ciljanje (LTVEC), MAID 1738, kako bi sadržao zamenjivanje egzona 1-2 miša koji kodiraju CD8a ekto domen (od 5' spoja na Ala kodonu 27 u egzonu 1 miša do 3' spoja u intronu 2 miša), sa homolognim ljudskim sekvencama (od 5' spoja u ljudskom egzonu 2 do 3' spoja u intronu 3 (Sl.4)). Ovo zadržava vodeću sekvencu miša na početku egzona 1. Lox2372-Ub-Neo kaseta je uneta na 3' spoju sekvenci čovek/miš. Nukleotidna sekvenca na različitim spojevima dobijenog vektora je data u Tabeli 5 i izneta u spisku sekvenci. Potpuna aminokiselinska sekvenca humanizovanog CD8α proteina je izneta u SEQ ID NO:54, sa ljudskog sekvencom u opsegu amino kiselina 28-179 (izneto u SEQ ID NO: 59).
Tabela 5. Spajanje sekvenci himernog CD8α vektora za ciljanje
[0113] Humanizovani CD8a vektor za ciljanje opisan iznad je elektroporisan u mišije ES ćelije koje su sadržale humanizovani CD8b lokus kako bi se stvorile modifikovane ES ćelije koje sadrže humanizovani CD8b i CD8a lokuse (Sl.5). Ciljane ES ćelije koje nose humanizovani CD8a lokus su identifikovane genotipovanjem upotrebom modifikacije testa alela (Valenzuela i dr.) što je detektovalo prisustvo CD8a gena čoveka. Prajmeri i probe korišćene u testu su prikazane u Tabeli 6 i iznete u spisku sekvenci.
Tabela 6: Prajmeri i probe za genotipski himerni CD8α
[0114] Ciljane ES ćelije opisane iznad su korišćene kao donor ES ćelije i uvedene su u fazu sa 8-ćelija embriona miša sa VELOCIMOUSE® metodom (videti, npr. pat. SAD Br. 7,294,754 i Poueymirou i dr, iznad). VELOCIMICE® (F0 miševa je potpuno izvedeno iz donor ES ćelije) koja nosi himerni CD8b gen i himerni CD8a gen je identifikovana genotipovanjem upotrebom modifikacije testa alela (Valenzuela i dr. iznad) koji detektuje prisustvo jedinstvenih sekvenci CD8b i CD8a gena čoveka.
[0115] Alternativno, humanizovani CD8a vektori za ciljanje koji su ovde opisani su elektroporisani u mišije ES ćelije koje ne sadrže humanizovane CD8b lokuse kako bi se stvorio miš koji sadrži samo humanizovani CD8a lokus.
[0116] Odabrana kaseta u CD8a lokusu može biti uklonjena metodama poznatim stručnjaku u ovoj oblasti, npr. kao što je opisano u Primeru 2.1 iznad. U jednom otelotvorenju, odabrana kaseta je izbrisana kako bi se stvorio MAID 1740 miš.
Primer 2.3: Ispoljavanje himernog CD8 u genetski modifikovanim miševima
[0117] Miševi heterozigotni i za humanizovane CD8a (MAID 1740) i CD8b (MAID 1739) gene su analizirani za ispoljavanje CD8 čoveka.
[0118] Ispoljavanje CD8a i CD8b čoveka se može jasno detektovati na površini CD3+CD4- T ćelija izvedenih iz slezina heterozigota ali ne i kod životinja divljeg tipa (Sl.6).
[0119] Ispoljavanje CD8a i CD8b čoveka se takođe može detektovati na površini timocita dobijenih iz heterozigota ali ne i kod životinja divljeg tipa (SL.7).

Claims (9)

Patentni zahtevi
1. Genetski modifikovani glodar, koji sadrži
nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD4 polipeptid čoveka/glodara, nukleotidnu sekvencu koja kodira humanizovani MHC II α polipeptid i nukleotidnu sekvencu koja kodira humanizovani MHC II β polipeptid,
gde su nukleotidna sekvenca koja kodira himerni CD4 polipeptid čoveka/glodara prisutna u endogenom lokusu CD4 koreceptora glodara, i nukleotidna sekvenca koja kodira humanizovani MHC II α polipeptid i humanizovani MHC II β polipeptid prisutne u endogenom MHC II lokusu glodara; gde glodar ne ispoljava funkcionalni endogeni CD4 koreceptor glodara u svom endogenom CD4 lokusu,
gde glodar ne ispoljava funkcionalni endogeni MHC II α polipeptid u svom endogenom MHC II lokusu, gde glodar ne ispoljava funkcionalni endogeni MHC II β polipeptid u svom endogenom MHC II lokusu, gde himerni CD4 polipeptid čoveka/glodara sadrži bar MHC II vezujući domen ljudskog CD4 polipeptida i bar transmembranske i citoplazmatske domene CD4 polipeptida glodara,
gde humanizovani MHC II α polipeptid sadrži α1 i α2 domene ljudskog MHC II α polipeptida i transmembranske i citoplazmatske domene MHC II α polipeptid glodara,
gde humanizovani MHC II β polipeptid sadrži β1 i β2 domene ljudskog MHC II β polipeptida i transmembranske i citoplazmatske domene MHC II β polipeptid glodara,
gde glodar ispoljava himerni CD4 polipeptid čoveka/glodara i humanizovani MHC II protein koji sadrži humanizovani MHC II α i humanizovani MHC II β polipeptid, i
gde su himerni CD4 polipeptid čoveka/glodara i humanizovani MHC II protein u interakciji.
2. Glodar prema patentnom zahtevu 1, gde se himerni CD4 polipeptid čoveka/glodara ne ispoljava u B ćelijama ili pojedinačnim CD8 pozitivnim T ćelijama.
3. Genetski modifikovani glodar, koji sadrži
sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni CD8α polipeptid čoveka/glodara, sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni CD8β polipeptid čoveka/glodara, sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humanizovani MHC I polipeptid i opciono sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ljudski ili humanizovani β2 mikroglobulin polipeptid,
gde je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni CD8α polipeptid čoveka/glodara prisutna u endogenom lokusu CD8α receptora glodara, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni CD8β polipeptid čoveka/glodara prisutna u endogenom lokusu CD8β koreceptora glodara, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humanizovani MHC I polipeptid prisutna u endogenom MHC I lokusu glodara i nukleotidna sekvenca koja kodira ljudski ili humanizovani β2 mikroglobulin, kada je prisutna, prisutna je u endogenom β2 mikroglobulin lokusu glodara;
gde glodar ne ispoljava funkcionalni endogeni CD8 koreceptor glodara u endogenom CD8 lokusu, funkcionalni endogeni MHC I polipeptid glodara u endogenom MHC I lokusu ili funkcionalni endogeni β2 mikroglobulin glodara u endogenom β2 mikroglobulin lokusu glodara kada sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ljudski ili humanizovani β2 mikroglobulin;
gde himerni CD8α polipeptid čoveka/glodara sadrži bar MHC I vezujući domen ljudskog CD8α polipeptida i bar transmembranske i citoplazmatske domene CD8α polipeptida glodara,
gde himerni CD8β polipeptid čoveka/glodara sadrži bar MHC I vezujući domen ljudskog CD8β polipeptida i bar transmembranske i citoplazmatske domene CD8β polipeptida glodara,
gde humanizovani MHC II i polipeptid sadrži α1, α2 i α3 domene ljudskog MHC I i polipeptida i transmembranske i citoplazmatske domene MHC I polipeptida glodara,
gde glodar ispoljava himerni CD8 protein čoveka/glodara koji sadrži CD8α i CD8β polipeptide i humanizovani MHC I polipeptid i opciono ljudski ili humanizovani β2 mikroglobulin, i
gde su himerni CD8 polipeptid čoveka/glodara i humanizovani MHC I protein u interakciji.
4. Glodar prema patentnom zahtevu 3, gde se himerni CD8 polipeptid čoveka/glodara ne ispoljava u B ćelijama ili pojedinačnim CD4 pozitivnim T ćelijama.
5. Glodar prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je glodar miš.
6. Miš prema patentnom zahtevu 5, gde je nukleotidna sekvenca koja kodira himerni CD4 polipeptid čoveka/miša operativno povezana za endogeni CD4 promoter miša i regulatorne sekvence ili gde je nukleotidna sekvenca koja kodira himerni CD8α polipeptid čoveka/miša operativno povezana za CD8α promoter miša i regulatorne sekvence i sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni CD8β polipeptid čoveka/miša je operativno povezana za endogeni CD8β p promoter miša i regulatorne sekvence.
7. Miš prema patentnom zahtevu 5 ili 6, gde je nukleotidna sekvenca koja kodira himerni CD4 polipeptid čoveka/miša ili sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni CD8α polipeptid čoveka/miša i sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni CD8β polipeptid čoveka/miša sadržana u germinalnoj liniji miša.
8. Metoda za modifikovanje miša kako bi ispoljavao himerni CD4 polipeptid čoveka/miša koja obuhvata zamenjivanje u endogenom CD4 lokusu miša prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira endogeni CD4 polipeptid miša sa drugom nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni CD4 polipeptid čoveka/miša, gde himerni CD4 polipeptid čoveka/miša sadrži bar MHC II vezujući domen ljudskog CD4 polipeptida i bar transmembranske i citoplazmatske domene CD4 polipeptida miša,
gde miš ispoljava (1) himerni CD4 polipeptid čoveka/miša i (2) humanizovani MHC II koji sadrži (a) α1 i α2 domene ljudskog MHC II α polipeptida i transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC II α polipeptida miša, i (b) β1 i β2 domene ljudskog MHC II β polipeptida i transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC II β polipeptida miša, i
gde su himerni CD4 polipeptid čoveka/miša i humanizovani MHC II protein u interakciji.
9. Metoda za modifikovanje miša kako bi ispoljavao himerni CD8 polipeptid čoveka/miša koja obuhvata (i) zamenjivanje u endogenom CD8α lokusu miša prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira endogeni CD8α polipeptid miša sa drugom nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni CD8α polipeptid čoveka/miša, gde himerni CD8α polipeptid čoveka/miša sadrži bar MHC II vezujući domen ljudskog CD8α polipeptida i bar transmembranske i citoplazmatske domene CD8α polipeptida miša; i (ii) zamenjivanje u endogenom CD8β lokusu miša prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira endogeni CD8β polipeptid miša sa drugom nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni CD8β polipeptid čoveka/miša, gde himerni CD8β polipeptid čoveka/miša sadrži bar MHC II vezujući domen ljudskog CD8β polipeptida i bar transmembranske i citoplazmatske domene CD8β polipeptida miša; gde miš ispoljava himerni CD8 protein čoveka/miša koji sadrži CD8α i CD8β polipeptide i humanizovani MHC I polipeptid koji sadrži α1, α2 i α3 domene ljudskog MHC I polipeptida i transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC I polipeptida miša, i
gde su himerni CD8 polipeptid čoveka/miša i humanizovani MHC I protein u interakciji.
RS20190870A 2013-02-20 2014-02-20 Miševi koji ispoljavaju humanizovane t-ćelijske koreceptore RS58962B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361766762P 2013-02-20 2013-02-20
US201361890915P 2013-10-15 2013-10-15
EP14708430.5A EP2958938B1 (en) 2013-02-20 2014-02-20 Mice expressing humanized t-cell co-receptors
PCT/US2014/017395 WO2014130671A1 (en) 2013-02-20 2014-02-20 Mice expressing humanized t-cell co-receptors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58962B1 true RS58962B1 (sr) 2019-08-30

Family

ID=50236327

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190870A RS58962B1 (sr) 2013-02-20 2014-02-20 Miševi koji ispoljavaju humanizovane t-ćelijske koreceptore

Country Status (19)

Country Link
US (4) US9848587B2 (sr)
EP (3) EP3543253B1 (sr)
JP (5) JP6444895B2 (sr)
KR (5) KR102313047B1 (sr)
CN (2) CN111484999B (sr)
AU (4) AU2014218897C1 (sr)
CA (1) CA2900832A1 (sr)
CY (1) CY1121979T1 (sr)
DK (1) DK2958938T3 (sr)
ES (2) ES2987445T3 (sr)
HR (1) HRP20191280T1 (sr)
HU (1) HUE045478T2 (sr)
LT (1) LT2958938T (sr)
PL (1) PL2958938T3 (sr)
PT (1) PT2958938T (sr)
RS (1) RS58962B1 (sr)
SI (1) SI2958938T1 (sr)
SM (1) SMT201900429T1 (sr)
WO (1) WO2014130671A1 (sr)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SMT201900478T1 (it) 2011-10-28 2019-09-09 Regeneron Pharma Topi con complesso maggiore di istocompatibilita' geneticamente modificati
US9591835B2 (en) 2011-10-28 2017-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex animals
SMT202200205T1 (it) 2011-10-28 2022-07-21 Regeneron Pharma Topi geneticamente modificati che esprimono molecole chimeriche del complesso maggiore di istocompatibilità (mhc) ii
US9043996B2 (en) 2011-10-28 2015-06-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex animals
CN111484999B (zh) * 2013-02-20 2024-10-25 瑞泽恩制药公司 人源化的t细胞共受体的小鼠
US20150342163A1 (en) 2013-02-22 2015-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex mice
EP3699190B9 (en) 2013-02-22 2023-10-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Murine cell expressing humanized major histocompatibility complex
TR201901782T4 (tr) 2013-09-23 2019-03-21 Regeneron Pharma İnsanlaştirilmiş bi̇r si̇nyal düzenleyi̇ci̇ protei̇n geni̇ne sahi̇p olan i̇nsan dişi hayvanlar.
CA2929846C (en) 2013-11-19 2020-09-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized b-cell activating factor gene
CN111690052B (zh) 2014-04-08 2024-06-04 瑞泽恩制药公司 具有人源化FC-γ受体的非人动物
NO2785538T3 (sr) 2014-05-07 2018-08-04
IL287519B2 (en) 2014-06-19 2024-01-01 Regeneron Pharma Non-human animals having a humanized programmed cell death 1 gene
JP2017529841A (ja) 2014-09-19 2017-10-12 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． キメラ抗原受容体
RU2726446C2 (ru) * 2014-11-24 2020-07-14 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Не относящиеся к человеку животные, экспрессирующие гуманизированный комплекс cd3
HUE064960T2 (hu) 2014-12-05 2024-04-28 Regeneron Pharma Differenciációs 47 gén humanizált klasztert tartalmazó nem-humán állatok
CN113412818B (zh) * 2014-12-09 2022-11-04 瑞泽恩制药公司 具有人源化分化簇274基因的非人动物
EP4248744A3 (en) 2015-04-06 2023-12-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized t cell mediated immune responses in non-human animals
CA2996887A1 (en) * 2015-09-11 2017-03-16 Agenus Inc. Engineered host cells and methods of use thereof
WO2017087780A1 (en) 2015-11-20 2017-05-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized lymphocyte-activation gene 3
WO2017150763A1 (ko) * 2016-02-29 2017-09-08 (주)메디톡스 인간 cd3 발현 동물모델 및 이의 용도
DK3422845T3 (da) 2016-02-29 2021-08-30 Regeneron Pharma Gnavere med et humaniseret tmprss-gen
KR102483193B1 (ko) 2016-06-03 2023-01-04 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소를 발현하는 비인간 동물
JP7361031B2 (ja) 2017-11-30 2023-10-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｔｒｋｂ遺伝子座を含む非ヒト動物
IL314733A (en) 2018-03-26 2024-10-01 Regeneron Pharma Humanized rodents for testing therapeutic agents
CA3097396A1 (en) * 2018-04-19 2019-10-24 Baylor College Of Medicine Reprogramming cd4 t cells into cytotoxic cd8 cells by forced expression of cd8ab and class 1 restricted t cell receptors
HRP20240999T1 (hr) 2018-07-16 2024-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Glodavački modeli bolesti ditra i njihova upotreba
US12234473B2 (en) 2020-12-31 2025-02-25 Immatics US, Inc. CD8 polypeptides, compositions, and methods of using thereof
CN118511853A (zh) 2021-03-31 2024-08-20 瑞泽恩制药公司 包含具有改善的tcrb组库多样性的人源化细胞免疫系统组分的基因修饰的小鼠
AU2023347224A1 (en) 2022-09-22 2025-03-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified mice expressing components of human cellular immune system
TW202520975A (zh) 2023-08-09 2025-06-01 英商劍橋企業有限公司 基因改造之囓齒動物及囓齒動物細胞以及其等用途
GB2640828A (en) 2024-04-22 2025-11-12 T Therapeutics Ltd Methods and products for the generation and identification of T cells and TCRs
GB2642411A (en) 2024-04-22 2026-01-14 T Therapeutics Ltd T Cell Receptor identification and provision

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5958678A (en) * 1986-08-21 1999-09-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA encoding the T cell surface protein T4 and use of fragments of T4 in the treatment of AIDS
US5574205A (en) 1989-07-25 1996-11-12 Cell Genesys Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
JPH04501510A (ja) 1989-07-25 1992-03-19 セル　ジェネシス，インコーポレイティド 普遍的なドナー細胞及びキメラ性哺乳類宿主のための相同性組換え
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US7041871B1 (en) * 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9100481D0 (en) 1991-01-10 1991-02-20 Inst Nat Sante Rech Med Genetically engineered mice
WO1993005817A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 President And Fellows Of Harvard College Transgenic mhc class i and class ii antigen-deficient mammals
EP0663952A4 (en) 1992-09-11 1997-06-11 Univ California Transgenic non-human animals having targeted lymphocyte transduction genes.
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
GB9315303D0 (en) 1993-07-23 1993-09-08 Zeneca Ltd Polypeptide
US5965787A (en) 1995-08-31 1999-10-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research HLA-DRBI peptides with specific binding affinity for HLA-DQ molecules: prevention and treatment of rheumatoid arthritis
US6002066A (en) 1996-01-16 1999-12-14 Ortho Pharmaceutical Corp. H2-M modified transgenic mice
CA2246333A1 (en) 1996-03-05 1997-09-12 The Scripps Research Institute Recombinant constructs encoding t cell receptors specific for human hla-restricted tumor antigens
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
CA2302779C (en) 1997-09-16 2010-02-02 Oregon Health Sciences University Recombinant mhc molecules useful for manipulation of antigen-specific t-cells
US6372955B1 (en) 1998-02-17 2002-04-16 Ortho Mcneil Pharmaceutical, Inc. Methods for Producing B cells and antibodies from H2-O modified transgenic mice
AU1023401A (en) 1999-10-12 2001-04-23 Institut Pasteur Design of a polyepitopic construct for the induction of hla-a2.1 restricted hiv 1 specific ctl responses using hhd mice
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
WO2002047474A1 (en) 2000-12-13 2002-06-20 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Transgenic animal expressing hla-a24 and utilization thereof
ES2389251T3 (es) 2000-12-19 2012-10-24 Altor Bioscience Corporation Animales transgénicos que comprenden un sistema inmunitario humanizado
US7811816B2 (en) 2001-05-15 2010-10-12 Ortho-Mcneil Pharmaeutical, Inc. Isolated CD8 +T lymphocytes specifically cytotoxic for a disease causing target cell
FR2827302B1 (fr) * 2001-07-13 2003-10-10 Genoway Cellule et animal transgenique modelisant la presentation antigenique humaine et leurs utilisations
US20050042217A1 (en) * 2003-03-19 2005-02-24 Yan Qi Specific inhibition of allorejection
US7663017B2 (en) 2003-07-30 2010-02-16 Institut Pasteur Transgenic mice having a human major histocompatability complex (MHC) phenotype, experimental uses and applications
US7745690B2 (en) 2004-03-09 2010-06-29 Nagoya Industrial Science Research Institute Transgenic nonhuman mammal representing the pathologic conditions of human rheumatoid arthritis
CA2574802A1 (en) * 2004-07-20 2006-02-02 Isogenis, Inc. Specific inhibition of autoimmunity and diseases associated with autoantigens
ES2463476T3 (es) 2004-10-19 2014-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Método para generar un ratón homocigótico para una modificación genética
EP1878342A1 (en) 2006-07-13 2008-01-16 Institut Pasteur Immunodeficient mice transgenic for HLA class I and HLA class II molecules and their uses
EP1878798A1 (en) 2006-07-13 2008-01-16 Institut Pasteur Method of producing a multichimeric mouse and applications to study the immunopathogenesis of human tissue-specific pathologies
TWI476280B (zh) 2008-03-07 2015-03-11 Regeneron Pharma 來自二倍體宿主胚胎注射之ｅｓ－細胞衍生的老鼠
KR102057826B1 (ko) 2008-04-11 2019-12-20 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
US20090328240A1 (en) 2008-06-24 2009-12-31 Sing George L Genetically modified mice as predictors of immune response
AU2009298458B2 (en) * 2008-09-30 2015-10-08 Ablexis, Llc Non-human mammals for the production of chimeric antibodies
WO2010099463A2 (en) * 2009-02-27 2010-09-02 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Joint bioscaffolds
DK3622815T3 (da) 2009-07-08 2023-06-26 Kymab Ltd Gnavermodeller og terapeutiske molekyler
GB2472108B (en) * 2009-08-27 2011-07-13 Budha Singh Dhinjan Wall bead
SMT202600080T1 (it) 2010-02-08 2026-03-09 Regeneron Pharma Topo con catena leggera comune
WO2011100761A2 (en) 2010-02-15 2011-08-18 Indiana University Research And Technology Corporation Cd4 t-cells involved in mammalian host response to epithelial cell infection and uses thereof
JP5932670B2 (ja) * 2010-03-11 2016-06-08 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ｐＨ依存性の抗原結合を有する抗体
US9557323B2 (en) 2010-09-24 2017-01-31 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Humanized transgenic mouse model
US9043996B2 (en) 2011-10-28 2015-06-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex animals
CN108866101A (zh) 2011-10-28 2018-11-23 瑞泽恩制药公司 人源化il-6和il-6受体
SMT201900478T1 (it) 2011-10-28 2019-09-09 Regeneron Pharma Topi con complesso maggiore di istocompatibilita' geneticamente modificati
SMT202200205T1 (it) 2011-10-28 2022-07-21 Regeneron Pharma Topi geneticamente modificati che esprimono molecole chimeriche del complesso maggiore di istocompatibilità (mhc) ii
US9591835B2 (en) 2011-10-28 2017-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex animals
MX377561B (es) 2012-11-05 2025-03-10 Regeneron Pharma Animales no humanos genéticamente modificados y métodos de uso de los mismos.
CN111484999B (zh) * 2013-02-20 2024-10-25 瑞泽恩制药公司 人源化的t细胞共受体的小鼠
US20150342163A1 (en) 2013-02-22 2015-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex mice
EP3699190B9 (en) 2013-02-22 2023-10-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Murine cell expressing humanized major histocompatibility complex
JP6456350B2 (ja) 2013-03-11 2019-01-23 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． キメラ主要組織適合複合体（ｍｈｃ）クラスｉｉ分子を発現する遺伝子導入マウス
CA2902543A1 (en) 2013-03-11 2014-10-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transgenic mice expressing chimeric major histocompatibility complex (mhc) class i molecules
EP4248744A3 (en) 2015-04-06 2023-12-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized t cell mediated immune responses in non-human animals
JP7172900B2 (ja) * 2019-07-26 2022-11-16 株式会社デンソー 走行中給電システム

Also Published As

Publication number Publication date
PL2958938T3 (pl) 2019-11-29
CN111484999A (zh) 2020-08-04
SI2958938T1 (sl) 2019-08-30
EP2958938A1 (en) 2015-12-30
US12063915B2 (en) 2024-08-20
EP3543253A1 (en) 2019-09-25
JP2023184695A (ja) 2023-12-28
CN105164153B (zh) 2020-04-24
HUE045478T2 (hu) 2019-12-30
AU2021290271A1 (en) 2022-01-27
AU2014218897C1 (en) 2019-03-07
KR102313047B1 (ko) 2021-10-19
HRP20191280T1 (hr) 2019-10-18
CY1121979T1 (el) 2020-10-14
CN111484999B (zh) 2024-10-25
KR20220028187A (ko) 2022-03-08
KR20210124541A (ko) 2021-10-14
CA2900832A1 (en) 2014-08-28
US20250000070A1 (en) 2025-01-02
EP3543253B1 (en) 2024-03-27
JP2016506761A (ja) 2016-03-07
US9848587B2 (en) 2017-12-26
EP3543253C0 (en) 2024-03-27
DK2958938T3 (da) 2019-07-15
KR102369454B1 (ko) 2022-03-04
US10820581B2 (en) 2020-11-03
US20140245466A1 (en) 2014-08-28
EP4374690A3 (en) 2024-08-21
AU2018271383B2 (en) 2022-01-20
WO2014130671A1 (en) 2014-08-28
AU2021290271B2 (en) 2024-10-10
AU2014218897B2 (en) 2018-08-30
AU2018271383A1 (en) 2018-12-20
PT2958938T (pt) 2019-07-23
US20180084768A1 (en) 2018-03-29
SMT201900429T1 (it) 2019-09-09
JP2021000096A (ja) 2021-01-07
ES2736052T3 (es) 2019-12-23
US20210068378A1 (en) 2021-03-11
KR20230135166A (ko) 2023-09-22
EP2958938B1 (en) 2019-04-17
HK1213908A1 (en) 2016-07-15
JP6752842B2 (ja) 2020-09-09
KR20240147707A (ko) 2024-10-08
CN105164153A (zh) 2015-12-16
JP6444895B2 (ja) 2018-12-26
ES2987445T3 (es) 2024-11-14
AU2025200206A1 (en) 2025-01-30
AU2014218897A1 (en) 2015-09-10
JP7261772B2 (ja) 2023-04-20
KR20150119409A (ko) 2015-10-23
WO2014130671A8 (en) 2015-10-01
JP2018126169A (ja) 2018-08-16
JP2022121465A (ja) 2022-08-19
EP4374690A2 (en) 2024-05-29
KR102579405B1 (ko) 2023-09-18
KR102714111B1 (ko) 2024-10-11
LT2958938T (lt) 2019-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021290271B2 (en) Mice expressing humanized t-cell co-receptors
US11224208B2 (en) Genetically modified major histocompatibility complex mice
US10314296B2 (en) Genetically modified major histocompatibility complex mice
RS64540B1 (sr) Imunski odgovori posredovani humanizovanim t ćelijama kod ne-humanih životinja
HK40111794A (en) Mice expressing humanized t-cell co-receptors
HK40013874B (en) Mice expressing humanized t-cell co-receptors
HK40013874A (en) Mice expressing humanized t-cell co-receptors
HK40007414B (en) Method of generating non-human animals expressing humanized major histocompatibility complex
HK40007414A (en) Method of generating non-human animals expressing humanized major histocompatibility complex
HK1213908B (en) Mice expressing humanized t-cell co-receptors