JP2022010128A - 評価用基材の製造方法、及び評価用基材の製造装置 - Google Patents

Abstract

【課題】短時間で細胞を基材に接着することができる評価用基材の製造方法の提供。
【解決手段】基材に、固定材Ａを含有する溶液を付与する固定材Ａ含有溶液付与工程と、前記固定材Ａに対して混合が可能な固定材Ｂ及び細胞を含有する懸濁液を付与する固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与工程と、を含み、前記固定材Ａと、前記固定材Ｂとのそれぞれ少なくとも一部が混合されてハイドロゲルを形成し、前記細胞が、前記ハイドロゲルを介して前記基材に固定される評価用基材の製造方法である。
【選択図】図９Ｂ

Description

本発明は、評価用基材の製造方法、及び評価用基材の製造装置に関する。

近年、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける毒性乃至薬効評価ツールの需要が高まってきている。

その理由の１つとして、動物実験の３Ｒｓ（「代替（Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」、「削減（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、及び「改善（Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）」）の促進により実験動物数の削減、さらに実験動物に替わる代替法が求められていることなどが挙げられる。

前記動物実験の３Ｒｓの促進以外の理由には、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける毒性乃至薬効評価ツールは、動物実験にかかる経費の削減や試験時間の短縮など多くの利点を有していることなどが挙げられる。

一方で、組織工学の進展に伴い、複数の細胞からなる組織を人工的に形成する技術の開発が行われている。中でも、バイオプリンターは、固定材の種類によっては細胞を培養容器底面やゲル上に迅速に固定することができるため、三次元組織モデルの構築において注目されている。しかし、生体における細胞の機能や薬剤への反応の過程をｉｎ ｖｉｔｒｏで完全に再現することは難しく、課題が多く残っていることが既に知られている。

そこで、細胞の固定化領域を有する培養用基体、容器、及び製造方法を提供する目的で、細胞の固定化領域のパターン形成方法や異なる細胞培養制御物質を配置する工程、及び細胞培養制御物質を配置する工程を含んだ基体の製造方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。

また、培養容器に形成された複数の培養空間内で、株化肝細胞を１２時間以上７２時間以内で培養して相当直径が５０μｍ以上２００μｍ未満の複数のスフェロイドを作製する工程等を含む化合物のスクリーニング方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。

本発明は、短時間で細胞を基材に接着することができる評価用基材の製造方法を提供することを目的とする。

前記課題を解決するための手段としての本発明の評価用基材の製造方法は、基材に、固定材Ａを含有する溶液を付与する固定材Ａ含有溶液付与工程と、前記固定材Ａに対して混合が可能な固定材Ｂ及び細胞を含有する懸濁液を付与する固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与工程と、を含み、前記固定材Ａと、前記固定材Ｂとのそれぞれ少なくとも一部が混合されてハイドロゲルを形成し、前記細胞が、前記ハイドロゲルを介して前記基材に固定される。

本発明によると、短時間で細胞を基材に接着することができる評価用基材の製造方法を提供することができる。

図１Ａは、本発明の評価用基材の製造方法により製造された評価用基材の一例を示す概略平面図である。 図１Ｂは、図１Ａの評価用基材のＡ－Ａ’断面図である。 図２Ａは、電磁バルブ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。 図２Ｂは、ピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。 図２Ｃは、図２Ｂにおけるピエゾ方式の吐出ヘッドの変形例の模式図である。 図３Ａは、圧電素子に印加する電圧の一例を示す模式図である。 図３Ｂは、圧電素子に印加する電圧の他の一例を示す模式図である。 図４Ａは、液滴の状態の一例を示す模式図である。 図４Ｂは、液滴の状態の一例を示す模式図である。 図４Ｃは、液滴の状態の一例を示す模式図である。 図５は、液滴形成装置の一例を示す模式図である。 図６は、図５の制御手段のハードウェアブロックを例示する図である。 図７は、図５の液滴形成装置の他の変形例を示す模式図である。 図８Ａは、固定材Ａ含有溶液付与工程の一例を示す概略図である。 図８Ｂは、固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与工程の一例を示す概略図である。 図８Ｃは、培地を付与する工程の一例を示す概略図である。 図９Ａは、固定材Ａ含有溶液付与工程の一例を示す概略図である。 図９Ｂは、固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与工程の一例を示す概略図である。 図９Ｃは、固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液を付与する工程の一例を示す概略図である。 図９Ｄは、培地を付与する工程の一例を示す概略図である。 図１０は、実施例１で作製した評価用基材を光学顕微鏡で観察したときの細胞の状態を示す写真である。 図１１Ａは、比較例３における培養時間が０時間後の細胞の状態を示す写真である。 図１１Ｂは、比較例３における培養時間が３時間後の細胞の状態を示す写真である。 図１１Ｃは、比較例３における培養時間が１０時間後の細胞の状態を示す写真である。 図１２は、実施例１及び比較例３における細胞生存率を示すグラフである。 図１３は、実施例１及び比較例３における細胞膜損傷率を示すグラフである。 図１４は、実施例１及び比較例３における炎症物質の分泌量を示すグラフである。

（評価用基材の製造方法、及び評価用基材の製造装置）
本発明の評価用基材の製造方法は、基材に、固定材Ａを含有する溶液を付与する固定材Ａ含有溶液付与工程と、前記固定材Ａに対して混合（若しくは反応）が可能な固定材Ｂ及び細胞を含有する懸濁液を付与する固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与工程と、を含み、前記固定材Ａと、前記固定材Ｂとのそれぞれ少なくとも一部が混合（若しくは反応）されてハイドロゲルを形成し、前記細胞が、前記ハイドロゲルを介して前記基材に固定され、前記固定材Ａ及び前記固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液を付与する工程を含むことが好ましく、更に必要に応じて、培地を付与する工程、その他の工程を含む。

本発明の評価用基材の製造方法は、従来の基体の製造方法、及び化合物のスクリーニング方法では、試験をする前準備として試験に使用する細胞を培養容器に播種して、細胞が培養容器に自ら接着するまで約２４時間の培養時間を必要とするという問題があるという知見に基づくものである。

また、本発明の評価用基材の製造方法は、従来の基体の製造方法、及び化合物のスクリーニング方法では、少ない細胞数で培養容器に播種すると培養容器に接着する細胞が想定よりも少ない細胞数となり、正確な試験結果を得られないことがあり、かつ薬効乃至毒性の評価における試験時間や細胞数にかなり制約があるという問題があるという知見に基づくものである。さらに、１つの試験を行うためには、細胞が培養容器に接着するまでの時間を確保しなければならず、細胞数を一定数以上担保することが難しい細胞において、薬効乃至毒性試験をすることができず、試験方法や試験を行う細胞種に制限があるという問題があるという知見に基づくものである。

本発明の評価用基材の製造装置は、基材と、前記基材に、固定材Ａを含有する溶液を付与する固定材Ａ含有溶液付与手段と、前記固定材Ａに対して混合（若しくは反応）が可能な固定材Ｂ及び細胞を含有する懸濁液を付与する固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与手段と、を有し、前記細胞が、前記固定材Ａと、前記固定材Ｂとのそれぞれ少なくとも一部が混合（若しくは反応）されて形成されたハイドロゲルを介して前記基材に固定され、前記固定材Ａ及び前記固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液を付与する手段を有することが好ましく、更に必要に応じて、培地を付与する手段、その他の手段を有する。

図１Ａは、本発明の評価用基材の製造方法により製造された評価用基材の一例を示す概略平面図である。図１Ｂは、図１Ａの評価用基材のＡ－Ａ’断面図である。

本発明の評価用基材の製造方法によれば、図１Ａに示すように、基材２上に、固定材Ａ及び固定材Ｂのそれぞれ少なくとも一部が混合されて形成されたハイドロゲル３に、細胞４が所望の位置に配置された評価用基材１を得ることができる。また、図１Ｂに示すように、細胞４は、ハイドロゲル３に固定されることにより、ハイドロゲルを介して、基材２に接着することができる。これにより、細胞が培養されて基材に接着する時間を短縮することができ、短時間で評価用基材１を得ることができる。

また、本発明の評価用基材の製造方法によれば、所望の位置に細胞を配置した評価用基材を得ることができる。

＜固定材Ａ含有溶液付与工程、及び固定材Ａ含有溶液付与手段＞
固定材Ａ含有溶液付与工程は、基材に、固定材Ａを含有する溶液を付与する工程である。

固定材Ａ含有溶液付与手段は、基材に、固定材Ａを含有する溶液を付与する手段である。

固定材Ａ含有溶液付与工程は、固定材Ａ含有溶液付与手段により好適に実施することができる。

＜＜基材＞＞
基材としては、細胞の活性や増殖を阻害しないものであれば、その大きさ、形状、構造、材質等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

基材の大きさとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

基材の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ディッシュ、マルチプレート、フラスコ、セルインサート等の立体形状；ガラスプレート、スライドガラス、カバーガラス等の平板状；平膜状などが挙げられる。

基材の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、多孔質構造、メッシュ構造、凹凸構造、ハニカム構造などが挙げられる。

基材の材質としては、例えば、有機材料、無機材料などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

有機材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、ウレタンアクリレート等のアクリル系材料、セルロースなどが挙げられる。

無機材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス、セラミックスなどが挙げられる。

－固定材Ａを含有する溶液－
固定材Ａを含有する溶液は、固定材Ａを含み、更に必要に応じてその他の成分を含有する。

－－固定材Ａ－－
固定材Ａとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、フィブロイン等の生体由来ポリマー；フィブリノーゲン等の凝固因子；フィブロネクチン、ラミニン、リコンビナントペプチド等の接着因子；アルギン酸、ジェランガム等の多糖化合物金属塩；ポリ乳酸等の合成ポリマーなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、凝固因子が好ましく、フィブリノーゲンがより好ましい。

－その他の成分－
その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地、架橋剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤などが挙げられる。

固定材Ａを付与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マイクロピペット等を用いたピペット分注法、マイクロマニピュレーター法、アスピレータ法、液滴吐出法（インクジェット法）、ゲル押し出し法、スクリーン印刷法等の転写法などが挙げられる。

＜固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与工程、並びに固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与手段＞
固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与工程は、固定材Ａに対して混合が可能な固定材Ｂ及び細胞を含有する懸濁液を付与する工程である。

固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与手段は、固定材Ａに対して混合が可能な固定材Ｂ及び細胞を含有する懸濁液を付与する手段である。

固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与工程は、固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与手段により好適に実施することができる。

固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与工程、並びに固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与手段としては、インクジェット法を好適に用いることができる。

－固定材Ａに対して混合が可能な固定材Ｂ及び細胞を含有する懸濁液－
固定材Ａに対して混合が可能な固定材Ｂ及び細胞を含有する懸濁液は、固定材Ｂ、及び細胞を含み、更に必要に応じてその他の成分を含有する。

－－固定材Ｂ－－
固定材Ｂとしては、固定材Ａと固定材Ｂとが混合されてハイドロゲルを形成するものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、固定材Ａ及び固定材Ｂが、混合により増粘することが好ましい。

固定材Ｂとしては、固定材Ａと固定材Ｂとが混合されてハイドロゲルを形成するものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、多糖類、多価金属塩、フィブリノーゲン、トロンビン、フィブロネクチン、ラミニン、リコンビナントペプチド、キトサン、キチンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、固定材Ａがフィブリノーゲンである場合、固定材Ｂとしてはトロンビンが好ましい。

－－細胞－－
細胞は、その種類等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、分類学的に、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、すべての細胞について使用することができる。

真核細胞としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞が好ましく、前記細胞が細胞集合体を形成する場合は、細胞と細胞とが互いに接着し、物理化学的な処理を行わなければ単離しない程度の細胞接着性を有する接着性細胞がより好ましい。

接着性細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化した細胞、未分化の細胞などが挙げられる。

分化した細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞；星細胞；クッパー細胞；血管内皮細胞；類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞；骨芽細胞；砕骨細胞；歯根膜由来細胞；表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞；消化管上皮細胞；子宮頸部上皮細胞；角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞；ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞；腎細胞；膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞；骨細胞などが挙げられる。前記接着性細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、又はそれらを何代か継代させたものでもよい。

未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞；ｉＰＳ細胞などが挙げられる。

原核細胞としては、例えば、真正細菌、古細菌などが挙げられる。

細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、正常ヒト皮膚線維芽細胞などが挙げられる。

正常ヒト皮膚線維芽細胞としては、市販品を用いることができ、前記市販品としては、例えば、商品名：ＣＣ２５０７（Ｌｏｎｚａ社製）などが挙げられる。

－その他の成分－
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地、架橋剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤などが挙げられる。

固定材Ａ及び固定材Ｂにおいて用いられる材料としては、固定材Ａで列挙される材料を固定材Ｂとして固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与工程に用い、固定材Ｂで列挙される材料を固定材Ａとして固定材Ａ含有溶液付与工程に用いてもよく、目的に応じて適宜、入れ替えることができる。

固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与手段としては、液滴吐出法（インクジェット法）により、固定材Ｂ及び細胞を含有する懸濁液として吐出する手段（以下、「吐出ヘッド」とも称することがある）を好適に用いることができる。ただし、固定材Ｂを付与する方法としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、液滴（懸濁液）を所望の位置に付与できる方法であればよく、本実施例にて記載するインクジェット法以外にも、例えば、マイクロマニピュレーター法、ゲル押し出し法、スクリーン印刷法等の転写法などが挙げられる。なお、インクジェット法とはノズルより液滴を連続的に滴下させる方法である。

インクジェット法としては、例えば、オンデマンド方式、コンティニュアス方式などが挙げられる。これらの中でも、コンティニュアス方式の場合、安定的な吐出状態に至るまでの空吐出、液滴量の調整、ウェルプレートの各ウェル間を移動する際にも連続的に液滴形成を行い続ける等の理由から、用いる懸濁液のデッドボリュームが多くなる傾向にある。本発明では細胞数を調整する観点からデッドボリュームによる影響を低減させることが好ましく、そのため上記２つの方式では、オンデマンド方式の方がより好適である。

オンデマンド方式としては、例えば、液体に圧力を加えることによって液体を吐出する圧力印加方式、加熱による膜沸騰によって液体を吐出するサーマル方式、静電引力によって液滴を引っ張ることによって液滴を形成する静電方式等の既知の複数の方式などが挙げられる。これらの中でも、以下の理由から、圧力印加方式が好ましい。

静電方式は、懸濁液を保持して液滴を形成する吐出部に対向して電極を設置する必要がある。本発明の評価用基材の製造方法では、液滴を受けるための基材が対向して配置されており、基材構成の自由度を上げるため電極の配置は無いほうが好ましい。

サーマル方式は、局所的な加熱が発生するため生体材料である細胞への影響や、ヒーター部への焦げ付き（コゲーション）が懸念される。熱による影響は、含有物や基材の用途に依存するため、一概に除外する必要はないが、圧力印加方式は、サーマル方式よりヒーター部への焦げ付きの懸念がないという点から好ましい。

圧力印加方式としては、ピエゾ素子を用いて液体に圧力を加える方式、電磁バルブ等のバルブによって圧力を加える方式などが挙げられる。懸濁液の液滴吐出に使用可能な液滴生成デバイスの構成例を図２Ａ～図２Ｃに示す。

図２Ａは、電磁バルブ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。電磁バルブ方式の吐出ヘッドは、電動機１３ａ、電磁弁１１２、液体収容部としての液室を構成する液室壁１１ａ、懸濁液３００ａ、及びノズル１１１ａを有する。

電磁バルブ方式の吐出ヘッドとしては、例えば、ＴｅｃｈＥｌａｎ社のディスペンサなどを好適に用いることができる。

また、図２Ｂは、ピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。ピエゾ方式の吐出ヘッドは、圧電素子１３ｂ、液体収容部としての液室を構成する液室壁１１ｂ、懸濁液３００ｂ、及びノズル１１１ｂを有する。

ピエゾ方式の吐出ヘッドとしては、Ｃｙｔｅｎａ社のシングルセルプリンターなどを好適に用いることができる。

これらの吐出ヘッドのいずれも用いることが可能であるが、電磁バルブによる圧力印加方式では高速に繰り返し液滴を形成することができないため、評価用基材の製造のスループットを上げるためにはピエゾ方式を用いることが好ましい。また、一般的な圧電素子１３ｂを用いたピエゾ方式の吐出ヘッドでは、沈降によって細胞濃度のムラが発生することや、ノズル詰まりが生じることが問題として生じることがある。

このため、より好ましい構成として図２Ｃに示した構成などが挙げられる。図２Ｃは、図２Ｂにおける圧電素子を用いたピエゾ方式の吐出ヘッドの変形例の模式図である。図２Ｃの吐出ヘッドは、圧電素子１３ｃ、液体収容部としての液室を構成する液室壁１１ｃ、懸濁液３００ｃ、及びノズル１１１ｃを有する。

図２Ｃの吐出ヘッドでは、図示していない制御装置からの圧電素子１３ｃに対して電圧印加することにより、紙面横方向に圧縮応力が加わりメンブレンを紙面上下方向に変形させることができる。

オンデマンド方式以外の方式としては、例えば、連続的に液滴を形成させるコンティニュアス方式などが挙げられる。コンティニュアス方式では、液滴を加圧してノズルから押し出す際に圧電素子やヒーターによって定期的なゆらぎを与え、それによって微小な液滴を連続的に作り出すことができる。さらに、飛翔中の液滴の吐出方向を電圧を印加することによって制御することにより、ウェルに着弾させるか、回収部に回収するかを選ぶことも可能である。このような方式は、セルソーター、又はフローサイトメーターで用いられており、例えば、ソニー株式会社製の装置名：セルソーターＳＨ８００を用いることができる。

図３Ａは、圧電素子に印加する電圧の一例を示す模式図である。また、図３Ｂは、圧電素子に印加する電圧の他の一例を示す模式図である。図３Ａは、液滴を形成するための駆動電圧を示す。電圧（Ｖ_Ａ、Ｖ_Ｂ、Ｖ_Ｃ）の強弱により、液滴を形成することができる。図３Ｂは、液滴の吐出を行わずに懸濁液を撹拌するための電圧を示している。

液滴を吐出しない期間中に、液滴を吐出するほどには強くない複数のパルスを入力することによって、液質内の懸濁液を撹拌することが可能であり、細胞沈降による濃度分布の発生を抑制することができる。

本発明において使用することができる吐出ヘッドの液滴形成動作に関して、以下に説明する。

吐出ヘッドは、圧電素子に形成された上下電極に、パルス状の電圧を印加することにより液滴を吐出することができる。図４Ａ～図４Ｃは、それぞれのタイミングにおける液滴の状態を示す模式図である。図４Ａは、まず、圧電素子１３ｃに電圧を印加することにより、メンブレン１２ｃが急激に変形することによって、液室壁１１ｃとノズル部が形成されるメンブレン１２ｃとによって形成される液室内に保持された懸濁液とメンブレン１２ｃとの間に高い圧力が発生し、この圧力によってノズル部から液滴が外に押し出される。次に、図４Ｂに示すように、圧力が上方に緩和するまでの時間、ノズル部からの液押し出しが続き液滴が成長する。最後に、図４Ｃに示すように、メンブレン１２ｃが元の状態に戻る際に懸濁液とメンブレン１２ｃとの界面近傍の液圧力が低下し、液滴３１０’が形成される。

本発明に用いられる液滴形成装置について、図５から図７を用いて説明する。

図５は、液滴形成装置の一例を示す模式図である。図５に示すように、液滴形成装置１Ａは、吐出ヘッド（液滴吐出手段）１０と、駆動手段２０と、制御手段７０とを有する。

吐出ヘッド１０は、液室壁１１と、メンブレン１２と、駆動素子１３とを有しており、固定材Ｂ及び細胞３５０を含有する懸濁液３００を液滴として吐出することができる。

液室壁１１とノズル部が形成されるメンブレン１２とによって形成される液室は、固定材Ｂ及び細胞３５０を含有する懸濁液３００を保持する液体保持部であり、下面側には貫通孔であるノズル１１１が形成されている。液室は、例えば、金属やシリコン、セラミックス等から形成することができる。

メンブレン１２は、液室壁１１の上端部に固定された膜状部材である。メンブレン１２の平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。

駆動素子１３は、メンブレン１２の上面側に設けられている。駆動素子１３の形状は、メンブレン１２の形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン１２の平面形状が円形である場合には、円形の駆動素子１３を設けることが好ましい。

駆動素子１３に駆動手段２０から駆動信号を供給することにより、メンブレン１２を振動させることができる。メンブレン１２の振動により、細胞３５０を含有する液滴を、ノズル１１１から吐出させることができる。

駆動素子１３として圧電素子を用いる場合には、例えば、圧電材料の上面及び下面に電圧を印加するための電極を設けた構造とすることができる。この場合、駆動手段２０から圧電素子の上下電極間に電圧を印加することによって紙面横方向に圧縮応力が加わり、メンブレン１２を紙面上下方向に振動させることができる。圧電材料としては、例えば、ジルコン酸チタン酸鉛（ＰＺＴ）を用いることができる。この他にも、ビスマス鉄酸化物、ニオブ酸金属物、チタン酸バリウム、或いはこれらの材料に金属や異なる酸化物を加えたもの等、様々な圧電材料を用いることができる。

制御手段７０は、駆動手段２０を制御する機能を有している。以下、図６を参照し、制御手段７０の動作を含有する液滴形成装置１Ａの動作について説明する。

図６は、図５の制御手段のハードウェアブロックを例示する図である。

図６に示すように、制御手段７０は、ＣＰＵ７１と、ＲＯＭ７２と、ＲＡＭ７３と、Ｉ／Ｆ７４と、バスライン７５とを有している。ＣＰＵ７１、ＲＯＭ７２、ＲＡＭ７３、及びＩ／Ｆ７４は、バスライン７５を介して相互に接続されている。

ＣＰＵ７１は、制御手段７０の各機能を制御する。記憶手段であるＲＯＭ７２は、ＣＰＵ７１が制御手段７０の各機能を制御するために実行するプログラムや、各種情報を記憶している。記憶手段であるＲＡＭ７３は、ＣＰＵ７１のワークエリア等として使用される。また、ＲＡＭ７３は、所定の情報を一時的に記憶することができる。Ｉ／Ｆ７４は、液滴形成装置１Ａを他の機器等と接続するためのインターフェイスである。液滴形成装置１Ａは、Ｉ／Ｆ７４を介して、外部ネットワーク等と接続されてもよい。

図７は、図５の吐出ヘッドの他の変形例を示す模式図である。図７に示すように、液滴形成装置１Ｂは、液滴吐出手段１０が液滴吐出手段１０Ｂに置換された点が、液滴形成装置１Ａ（図５参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。

液滴吐出手段１０Ｂは、液室壁１１Ｂと、メンブレン１２Ｂと、駆動素子１３Ｂとを有している。液室壁１１Ｂにより構成される液室は、液室内を大気に開放する大気開放部１１５を上部に有しており、懸濁液３００中に混入した気泡を大気開放部１１５から排出可能に構成されている。

メンブレン１２Ｂは、液室壁１１Ｂにより構成される液室の下端部に固定された膜状部材である。メンブレン１２Ｂの略中心には貫通孔であるノズル１２１が形成されており、液室に保持された懸濁液３００はメンブレン１２Ｂの振動によりノズル１２１から液滴として吐出される。メンブレン１２Ｂの振動の慣性により液滴を形成するため、高表面張力（高粘度）の懸濁液３００でも吐出が可能である。メンブレン１２Ｂの平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。

メンブレン１２Ｂの材質としては特に限定はないが、柔らか過ぎるとメンブレン１２Ｂが簡単に振動し、吐出しないときに直ちに振動を抑えることが困難であるため、ある程度の硬さがある材質を用いることが好ましい。メンブレン１２Ｂの材質としては、例えば、金属材料やセラミックス材料、ある程度硬さのある高分子材料等を用いることができる。

特に、細胞を用いる際には、細胞やタンパク質に対する付着性の低い材料であることが好ましい。細胞の付着性は一般的に材質の水との接触角に依存性があると言われており、材質の親水性が高い又は疎水性が高いときには細胞の付着性が低い。親水性の高い材料としては各種金属材料やセラミックス（金属酸化物）を用いることが可能であり、疎水性が高い材料としてはフッ素樹脂等を用いることが可能である。

このような材料の他の例としては、例えば、ステンレス鋼やニッケル、アルミニウム等や、二酸化ケイ素、アルミナ、ジルコニアなどを挙げることができる。これら以外にも、材料表面をコーティングすることで細胞接着性を低下させることも考えられる。例えば、材料表面を前述の金属又は金属酸化物材料でコーティングすることや、細胞膜を模した合成リン脂質ポリマー（例えば、日油株式会社製、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ）によってコーティングすることが可能である。

ノズル１２１は、メンブレン１２Ｂの略中心に実質的に真円状の貫通孔として形成されていることが好ましい。この場合、ノズル１２１の径としては、特に限定はないが、細胞３５０がノズル１２１に詰まることを避けるため、細胞３５０の大きさの２倍以上とすることが好ましい。細胞３５０が、例えば、動物細胞、特にヒトの細胞である場合、ヒトの細胞の大きさは一般的に５μｍ～５０μｍ程度であるため、ノズル１２１の径を、使用する細胞に合わせて１０μｍ以上が好ましく、１００μｍ以上がより好ましい。

一方で、ノズル１２１の径は、２００μｍ以下であることが好ましい。つまり、液滴吐出手段１０Ｂにおいては、ノズル１２１の径は、典型的には１０μｍ～２００μｍの範囲となる。

駆動素子１３Ｂは、メンブレン１２Ｂの下面側に形成されている。駆動素子１３Ｂの形状は、メンブレン１２Ｂの形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン１２Ｂの平面形状が円形である場合には、ノズル１２１の周囲に平面形状が円環状（リング状）の駆動素子１３Ｂを形成することが好ましい。駆動素子１３Ｂの駆動方式は、駆動素子１３と同様とすることができる。

駆動手段２０は、メンブレン１２Ｂを振動させて液滴を形成する吐出波形と、液滴を形成しない範囲でメンブレン１２Ｂを振動させる撹拌波形とを駆動素子１３Ｂに選択的に（例えば、交互に）付与することができる。

例えば、吐出波形及び撹拌波形を何れも矩形波とし、吐出波形の駆動電圧よりも撹拌波形の駆動電圧を低くすることで、撹拌波形の印加により液滴が形成されないようにすることができる。つまり、駆動電圧の高低により、メンブレン１２Ｂの振動状態（振動の程度）を制御することができる。

液滴吐出手段１０Ｂでは、駆動素子１３Ｂがメンブレン１２Ｂの下面側に形成されているため、駆動素子１３Ｂによりメンブレン１２が振動すると、液室の下部方向から上部方向への流れを生じさせることが可能である。

この時、細胞３５０の動きは下から上への運動となり、液室内で対流が発生して固定材Ｂ及び細胞３５０を含有する懸濁液３００の撹拌が起きる。液室の下部方向から上部方向への流れにより、沈降、凝集した細胞３５０が液室の内部に均一に分散する。

つまり、駆動手段２０は、吐出波形を駆動素子１３Ｂに加え、メンブレン１２Ｂの振動状態を制御することにより、液室に保持された固定材Ｂ及び細胞３５０を含有する懸濁液３００をノズル１２１から液滴として吐出させることができる。又、駆動手段２０は、撹拌波形を駆動素子１３Ｂに加え、メンブレン１２Ｂの振動状態を制御することにより、液室に保持された固定材Ｂ及び細胞３５０を含有する懸濁液３００を撹拌することができる。なお、撹拌時には、ノズル１２１から液滴は吐出されない。

このように、液滴を形成していない間に固定材Ｂ及び細胞３５０を含有する懸濁液３００を撹拌することにより、細胞３５０がメンブレン１２Ｂ上に沈降、凝集することを防ぐと共に、細胞３５０を固定材Ｂを含有する懸濁液３００中にムラなく分散させることができる。これにより、ノズル１２１の詰まりを抑えることが可能となる。その結果、固定材Ｂ及び細胞３５０を含有する懸濁液３００を、長時間連続して安定的に液滴として吐出することができる。

また、固定材Ｂ及び細胞３５０を含有する懸濁液３００中に気泡が混入する場合がある。この場合でも、吐出ヘッド１０Ｂにおいては、液室の上部に大気開放部１１５が設けられているため、固定材Ｂ及び細胞３５０を含有する懸濁液３００中に混入した気泡を、大気開放部１１５を通じて外気に排出できる。これによって、気泡排出のために大量の液を捨てることなく、連続して安定的に液滴を形成することが可能となる。

すなわち、ノズル１２１の近傍に気泡が混入した場合や、メンブレン１２Ｂ上に多数の気泡が混入した場合には吐出状態に影響を及ぼすため、長い時間安定的に液滴の形成を行うためには、混入した気泡を排出する必要がある。通常、メンブレン１２Ｂ上に混入した気泡は、自然に若しくはメンブレン１２Ｂの振動によって上方に移動するが、液室には大気開放部１１５が設けられているため、混入した気泡を大気開放部１１５から排出可能となる。そのため、液室に気泡が混入しても不吐出が発生することを防止可能となり、連続して安定的に液滴を形成することができる。

なお、液滴を形成しないタイミングで、液滴を形成しない範囲でメンブレン１２Ｂを振動させ、積極的に気泡を液室の上方に移動させてもよい。

－ハイドロゲル－
ハイドロゲルとしては、固定材Ａと、固定材Ｂとのそれぞれ少なくとも一部が混合（反応）されて形成される。

細胞の周囲は、固定材Ａと、固定材Ｂとのそれぞれ少なくとも一部が混合されてハイドロゲルを形成していればよく、ハイドロゲル以外にも、固定材Ａ及び固定材Ｂが共存している状態でもよい。

ハイドロゲルは、基材上において、細胞を基材に固定する。

ハイドロゲルは、細胞の少なくとも一部を被覆することが好ましく、細胞の全体を被覆することがより好ましい。ハイドロゲルが、細胞の少なくとも一部を被覆することにより、細胞の乾燥を防止することができる。

＜固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液を付与する工程、及び固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液を付与する手段＞
固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液を付与する工程は、固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液に少なくとも一部が被覆された細胞が乾燥する時間に達した場合に、固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液を付与する工程である。

固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液を付与する手段は、固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液に少なくとも一部が被覆された細胞が乾燥する時間に達した場合に、固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液を付与する手段である。

固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液を付与する工程は、固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液を付与する手段により好適に実施することができる。

固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液を付与する工程は、基材上に付与された細胞の表面の少なくとも一部が露出している（被覆されていない）場合に、実施することが好ましい。固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液を付与することにより、細胞の乾燥を防止することができる。

固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液としては、少なくとも一部が露出している細胞の表面に付与することが好ましい。

固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液に少なくとも一部が被覆された細胞が乾燥する時間としては、例えば、予め細胞の乾燥時間を実験により求めておくことなどが挙げられる。

被覆されていない細胞に付与する材料としては、固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかが好ましく、固定材Ａ及び固定材Ｂの両方を付与して、少なくとも一部がハイドロゲルを形成することがより好ましく、完全にハイドロゲルを形成することが特に好ましい。

また、固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液以外にも、細胞の乾燥防止の点から、露出した細胞を被覆することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地などを用いることもできる。

＜培地を付与する工程、及び培地を付与する手段＞
培地を付与する工程は、細胞が、ハイドロゲルを介して前記基材に固定された後に、ハイドロゲル上に培地を付与する工程である。

培地を付与する工程は、培地を付与する手段により好適に実施することができる。

培地を付与する手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マイクロピペット等を用いたピペット分注法、マイクロマニピュレーター法、アスピレータ法、インクジェット法、スクリーン印刷法等の転写法などが挙げられる。

－培地－
培地としては、組織体の形成と維持に必要な成分を含み、乾燥を防ぎ、浸透圧などの外部環境を整える溶液であり、当該分野で公知のものを適宜選択することができる。常時培地液内に浸しておく必要のない場合においては適宜除去してもよい。

培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、天然培地、半合成培地、合成培地等の組成により分類される培地；半固形培地、液体培地、粉末培地（以下、「粉培地」とも称することがある）等の形状により分類される培地などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。細胞が動物由来である場合、動物細胞の培養に用いられる培地であればいずれも用いることができる。

動物細胞の培養に用いられる培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；Ｄ－ＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ－６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ或いはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、ＰＳＧｒｏ ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＣＳＴＩ－７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ－Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、Ｓｆ－９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

培地中の二酸化炭素濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２％以上５％以下が好ましく、３％以上４％以下がより好ましい。前記二酸化炭素濃度が、２％以上５％以下であると、細胞を好適に培養させることができる。

ここで、図８Ａから図８Ｃを用いて、本発明の評価用基材の製造方法について説明する。図８Ａは、固定材Ａ含有溶液付与工程の一例を示す概略図である。図８Ｂは、固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与工程の一例を示す概略図である。図８Ｃは、培地を付与する工程の一例を示す概略図である。

図８Ａに示すように、固定材Ａを含有する溶液２１を、マイクロピペット２２により基材２０に付与する。次に、図８Ｂに示すように、インクジェットヘッド２３を用いて、インクジェット法により、固定材Ｂ及び細胞２６を含有する懸濁液を液滴２４にして吐出して、固定材Ａを含有する溶液２１を含有する基材２０に付与する。固定材Ｂ及び細胞２６を含有する懸濁液を固定材Ａを含有する溶液２１に接触させることにより、固定材Ａと固定材Ｂとが反応して、ハイドロゲル２５が形成される。形成されたハイドロゲル２５を介して、細胞２６が基材２０に接着した評価用基材を作製することができる。次に、図８Ｃに示すように、細胞２６を含有するハイドロゲル２５上に、培地２７をマイクロピペット２２により滴下して、ハイドロゲル２５の乾燥防止や評価の前準備をすることができる。

次に、図９Ａから図９Ｄを用いて、本発明の評価用基材の製造方法における固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液を付与する工程を含有する場合について説明する。図９Ａは、固定材Ａ含有溶液付与工程の一例を示す概略図である。図９Ｂは、固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与工程の一例を示す概略図である。図９Ｃは、固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液を付与する工程の一例を示す概略図である。図９Ｄは、培地を付与する工程の一例を示す概略図である。

まず、図９Ａに示すように、固定材Ａを含有する溶液２１を、マイクロピペット２２により基材２０に付与する。次に、図９Ｂに示すように、インクジェットヘッド２３を用いて、インクジェット法により、固定材Ｂ及び細胞２６を含有する懸濁液を液滴２４にして吐出して、固定材Ａを含有する溶液２１を含有する基材２０に付与する。この場合、固定材Ｂ及び細胞２６を含有する懸濁液を固定材Ａを含有する溶液２１に接触させることにより、固定材Ａと固定材Ｂとの少なくとも一部が混合されて、ハイドロゲル２８が形成されるが、細胞２６の表面の一部が、ハイドロゲル２８から露出している。

そこで、図９Ｃに示すように、（ハイドロゲルに被覆されていない）細胞上に、固定材Ａ及び固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液を液滴２４’にてインクジェットヘッド２３’からインクジェット法により吐出して、細胞２６の（ハイドロゲルに被覆されていない）表面に付与して、固定材Ａ、固定材Ｂ、ハイドロゲル、又はこれらの混ざった被覆膜２４”を形成する。これにより、細胞２６のハイドロゲルに被覆されていない表面が乾燥することを防止することができる。なお、細胞２６の乾燥防止については、例えば、予め細胞２６の乾燥時間を実験により求めておき、その実験データから得られた乾燥時間に基づいて、適切な時間間隔（タイミング）で、該当する細胞に対し、固定材Ｂ（又は固定材Ａ）を吐出させることにより、細胞の乾燥を防止する方法が一例として考えられる。

次に、図９Ｄに示すように、細胞２６を含有するハイドロゲル２８上に、培地２７をマイクロピペット２２により滴下して、ハイドロゲル２８の乾燥防止や評価の前準備をすることができる。

本発明の評価用基材としては、薬効乃至毒性の評価に好適に用いることができる。

本発明の評価用基材としては、薬効乃至毒性の評価に用いる場合は、図８Ｃ及び図９Ｄに示す培地に、薬効乃至毒性の評価を行う試薬を事前に添加したものを用いることにより評価を行うことができる。

薬効の評価を行う試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、オキサゾロン、ベンゾキノン、２，４－ジニトロコロベンジン、４－フェニレンジアミン、グルタルアルデヒド、ベンゾイルペルオキシド、４－メチルアミノフェノール硫酸塩、ホルムアルデヒド、シンナムアルデヒド、エチレンジアミン、アクリル酸２－ヒドロキシエチル、イソオイゲノール、硫酸ニッケル（ＩＩ）、ベンジリデンアセトン、２－ノニン酸メチル、サルチル酸ベンジル、ジエチレントリアミン、チオグリセロール、２－メルカプトベンゾチアゾール、フェニルアセトアルデヒド、ヘキシルシンナムアルデヒド、ジヒドロオイゲノール、ベンゾイソチアゾリオーネ、シトラール、レゾルシノール、安息香酸フェニル、オイゲノール、アビエチン酸、アミノ安息香酸エチル、ベンジルシンナメート、シンナミルアルコール、ヒドロキシシトロネラール、イミダゾリジニル尿素、ブチルグリシジルエーテル、エチレングリコールジメタクリラート、グリオキサール、４－ニトロベンジルブロミドなどが挙げられる。

毒性の評価を行う試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化亜鉛、１－ブタノール、安息香酸、エチルバニリン、４－ヒドロキシ安息香酸、スルファニル酸、酒石酸、サリチル酸メチル、サリチル酸、ラウリル硫酸ナトリウム、乳酸、ベンジルアルコール、デキストラン、ジエチルフタレート、グリセロール、プロピルパラベン、Ｔｗｅｅｎ８０、ジメチルイソフタレート、フェノール、クロロベンゼン、スルファニルアミド、オクタン酸などが挙げられる。

本発明の評価用基材としては、例えば、ガラスプレート、スライドガラス、カバーガラス等の平板状の基材を用いた場合、評価用基材を、培地等を添加した別容器に浸漬し、ハイドロゲルを介して固定された細胞を培養することも可能である。

以下に、本発明の実施例及び比較例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
＜固定材Ａを含有する溶液の調製＞
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（商品名：ＤＰＢＳ（１×）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）１ｍＬに、固定材Ａとしてフィブリノーゲン（商品名：Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｐｌａｓｍａ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）２５ｍｇを添加して、２５ｍｇ／ｍＬフィブリノーゲン水溶液（固定材Ａを含有する溶液）を調製した。

＜固定材Ｂ及び細胞を含有する懸濁液の調製例＞
市販の正常ヒト皮膚線維芽細胞（商品名：ＣＣ２５０７、Ｌｏｎｚａ社製、以下、「ＮＨＤＦ」とも称することがある）２×１０^４個／ｍＬを、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（商品名：ＤＭＥＭ（１×）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）１０ｍＬ入れた１００ｍｍディッシュに添加して、インキュベーター（装置名：ＫＭ－ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５％ＣＯ_２環境）内で、７２時間培養した。培養した正常ヒト皮膚線維芽細胞を含有する培養液を除去し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＤＰＢＳ」とも称することがある）を２ｍＬ添加して洗浄した。ＤＰＢＳを除去し、トリプシン（商品名：０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（１×）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）２ｍＬを加えて、インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ_２環境）で５分間、トリプシン処理して細胞を単離した。

単離した細胞を、トロンビン（商品名：Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ Ｐｌａｓｍａ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）２０Ｕ／ｍＬに、細胞数が４×１０^６個／ｍＬの濃度になるように添加して、固定材Ｂ及び細胞を含有する懸濁液を得た。

９６ウェルプレート（商品名：９６ｗｅｌｌ細胞培養用プレート 平底 低蒸発タイプ、フタ付 ポリスチレン、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウェルに、マイクロピペットを用いて、２５ｍｇ／ｍＬフィブリノーゲン水溶液（固定材Ａを含有する溶液）１０μＬを添加した（図９Ａ参照）。

次に、固定材Ｂ及び細胞を含有する懸濁液をインクジェット法のバイオプリンター（装置名：細胞対応インクジェット装置、自社開発品）を用いて、細胞が重ならないように配置されるように、９６プレートのウェル上に吐出した（図９Ｂ参照）。固定材Ａと固定材Ｂとが混合されてハイドロゲルを形成し、細胞が固定されるまで３７℃のＣＯ_２インキュベーター内に静置した。

細胞が固定された９６ウェルプレートにおいて、細胞がハイドロゲルに被覆されていない細胞には、インクジェット方式のバイオプリンターを用いて、トロンビン２０Ｕ／ｍＬを細胞表面に付与して被覆して（図９Ｃ参照）、評価用基材を得た。得られた評価用基材を、光学顕微鏡（装置名：ＣＫＸ５３、オリンパス株式会社製）を用いて観察した。その結果、細胞が１層に配置されているのが確認できた。光学顕微鏡で観察した細胞の状態を図１０に示す。

（比較例１）
実施例１において、固定材Ａを含有する溶液を、フィブリノーゲン（固定材Ａ）を添加しなかった以外は、実施例１と同様にして、固定材Ａを含まない溶液を得た。

次に、実施例１において、固定材Ａを含有する溶液を固定材Ａを含有しない溶液に変更した以外は、実施例１と同様にして、評価用基材を得た。

（比較例２）
実施例１において、固定材Ｂ及び細胞を含有する懸濁液を、トロンビン（固定材Ｂ）を添加しなかった以外は、実施例１と同様にして、細胞を含有する懸濁液を得た。

次に、実施例１において、固定材Ｂ及び細胞を含有する懸濁液を細胞を含有する懸濁液（固定材Ｂを含まない）に変更した以外は、実施例１と同様にして、評価用基材を得た。

得られた評価用基材を用いて、以下のようにして、ハイドロゲル形成時間を測定した。

評価用基材の作製において、溶液に、懸濁液を添加した後、３７℃のＣＯ_２インキュベーター内に静置した。その後、９６ウェルプレートを手で振盪し、目視で細胞が固定されていて動かないかを確認することによりハイドロゲルが形成されるまでの時間を測定した。結果を下記表１に示す。

表１から分かるように、実施例１では９分間でハイドロゲルが形成（増粘）され、細胞がハイドロゲルを介して９６ウェルプレート（基材）に接着したことが確認でき、短時間で、評価用基材を作製できることが分かった。

一方、比較例１及び２では、ハイドロゲルは形成されず、細胞は固定されなかった。

（比較例３）
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（商品名：ＤＭＥＭ（１Ｘ）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１０ｍＬ入れた容器（商品名：Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｄｉｓｈ、旭硝子株式会社製）に、ＮＨＤＦ（商品名：ＣＣ２５０７、Ｌｏｎｚａ社製）を５×１０^４個／ｍＬとなるように添加し、インキュベーター（装置名：ＫＭ－ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５％ＣＯ_２環境）内で、１０時間培養した。培養時間が０時間後、３時間後、及び１０時間後に、光学顕微鏡（装置名：ＣＫＸ５３、オリンパス株式会社製）を用いて、細胞を観察した。結果を図１１Ａ（０時間後）、図１１Ｂ（３時間後）、及び図１１Ｃ（１０時間後）に示す。図１１Ａ～図１１Ｃの結果から、培養時間が０時間後及び３時間後では、細胞は基材に接着していないが、１０時間後には、細胞は基材にほぼ全て接着していることが分かる。

実施例１の評価用基材、及び比較例３の評価用基材を用いて、以下のようにして、「細胞生存率」、「細胞膜損傷率」、及び「炎症物質の分泌量」を評価した。

（細胞生存率）
実施例１及び比較例３の評価用基材に、被験物質として、０μＭ、１００μＭ、１６０μＭ、及び２２０μＭの４つの濃度条件の塩化亜鉛をそれぞれ添加したダルベッコ変法イーグル培地（和光純薬工業株式会社製、以下、「Ｄ－ＭＥＭ」とも称することがある）をマイクロピペットで１００μＬ加え、一晩（２０時間）、３７℃のＣＯ_２インキュベーター内に静置した。

次に、塩化亜鉛による細胞生存率への影響を評価するため、ＷＳＴ－１試薬（商品名：Ｐｒｅｍｉｘ ＷＳＴ－１ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、タカラバイオ株式会社製）を１ウェルあたり１０μＬ添加し、１時間、３７℃のＣＯ_２インキュベーターに静置して反応させた。その後、プレートリーダー（装置名：Ｃｙｔａｔｉｏｎ５、ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いて、４５０ｎｍ、リファレンスの値として５７０ｎｍの吸光度を測定して、「細胞生存率」を評価した。結果を図１２に示す。

（細胞膜損傷率）
細胞生存率の評価と同様にして、塩化亜鉛を添加したＤ－ＭＥＭを添加して、一晩（２０時間）、３７℃のＣＯ_２インキュベーター内に静置した。

塩化亜鉛による細胞膜損傷への影響を評価するため、マイクロピペットを用いて、培地のみ回収し、９６ウェルプレートに入れ、さらに、ＬＤＨ測定試薬（商品名：Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ社製）をそれぞれ添加し、室温（２３℃）にて５分間反応させた。その後、プレートリーダーを用いて４９２ｎｍ、リファレンスの値として６２０ｎｍの吸光度を測定して、「細胞膜損傷率」を評価した。結果を図１３に示す。

（炎症物質の分泌量）
細胞生存率の評価と同様にして、塩化亜鉛を添加したＤ－ＭＥＭを添加して、一晩（２０時間）、３７℃のＣＯ_２インキュベーター内に静置した。

塩化亜鉛による炎症物質の分泌量への影響を評価するため、マイクロピペットを用いて、培地のみ回収した。タンパク質測定キット（商品名：Ｈｕｍａｎ ＩＬ－８ ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ！（登録商標）、ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて、ＥＬＩＳＡ法にてＩＬ－８の分泌量を、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍ、リファレンスの値として５７０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１４に示す。

図１２から図１４の結果からも分かるように、実施例１の評価用基材と、比較例３の評価用基材とでは、塩化亜鉛に対する細胞生存率、細胞膜損傷率、及び炎症物質の分泌量がほぼ同様の毒性反応の傾向を示した。これらの結果より、本発明の評価用基材は、毒性反応を評価するために有効であることが分かる。

本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。

＜１＞ 基材に、固定材Ａを含有する溶液を付与する固定材Ａ含有溶液付与工程と、
前記固定材Ａに対して混合が可能な固定材Ｂ及び細胞を含有する懸濁液を付与する固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与工程と、を含み、
前記固定材Ａと前記固定材Ｂとのそれぞれ少なくとも一部が混合されてハイドロゲルを形成し、
前記細胞が、前記ハイドロゲルを介して前記基材に固定されることを特徴とする評価用基材の製造方法である。

＜２＞ 前記細胞の少なくとも一部が前記ハイドロゲルに被覆される前記＜１＞に記載の評価用基材の製造方法である。

＜３＞ 前記固定材Ａ及び前記固定材Ｂが、混合により増粘する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の評価用基材の製造方法である。

＜４＞ 前記固定材Ａ及び前記固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液に少なくとも一部が被覆された細胞が乾燥する時間に達した場合に、前記固定材Ａ及び前記固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液を付与する工程をさらに含む前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の評価用基材の製造方法である。

＜５＞ 前記評価用基材を別容器に浸漬し、前記ハイドロゲルを介して固定された細胞を培養する前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の評価用基材の製造方法である。

＜６＞ 前記固定材Ａが、生体由来ポリマー、凝固因子、接着因子、多糖化合物金属塩、及び合成ポリマーから選択される少なくとも１種である前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の評価用基材の製造方法である。

＜７＞ 前記生体由来ポリマーが、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、及びフィブロインから選択される少なくとも１種である前記＜６＞に記載の評価用基材の製造方法である。

＜８＞ 前記凝固因子が、フィブリノーゲンである前記＜６＞から＜７＞のいずれかに記載の評価用基材の製造方法である。

＜９＞ 前記接着因子が、フィブロネクチン、ラミニン、及びリコンビナントペプチドから選択される少なくとも１種である前記＜６＞から＜８＞のいずれかに記載の評価用基材の製造方法である。

＜１０＞ 前記多糖化合物金属塩が、アルギン酸、及びジェランガムの少なくともいずれかである前記＜６＞から＜９＞のいずれかに記載の評価用基材の製造方法である。

＜１１＞ 前記固定材Ｂが、多糖類、多価金属塩、フィブリノーゲン、トロンビン、フィブロネクチン、ラミニン、リコンビナントペプチド、キトサン、及びキチンから選択される少なくとも１種である前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の評価用基材の製造方法である。

＜１２＞ 前記固定材Ｂが、トロンビンである前記＜１１＞に記載の評価用基材の製造方法である。

＜１３＞ 培地を付与する工程をさらに含む前記＜１＞から＜１２＞のいずれかに記載の評価用基材の製造方法である。

＜１４＞ 基材と、 前記基材に、固定材Ａを含有する溶液を付与する固定材Ａ含有溶液付与手段と、 前記固定材Ａに対して混合が可能な固定材Ｂ及び細胞を含有する懸濁液を付与する固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与手段と、を有し、
前記細胞が、前記固定材Ａと、前記固定材Ｂとのそれぞれ少なくとも一部が混合されて形成されたハイドロゲルを介して前記基材に固定されることを特徴とする評価用基材の製造装置である。

＜１５＞ 前記固定材Ａが、生体由来ポリマー、凝固因子、接着因子、及び多糖化合物金属塩、合成ポリマーから選択される少なくとも１種である前記＜１４＞に記載の評価用基材の製造装置である。

＜１６＞ 前記固定材Ａが、凝固因子である前記＜１５＞に記載の評価用基材の製造装置である。

＜１７＞ 前記凝固因子が、フィブリノーゲンである前記＜１６＞に記載の評価用基材の製造装置である。

＜１８＞ 前記固定材Ｂが、トロンビンである前記＜１４＞から＜１７＞のいずれかに記載の評価用基材の製造装置である。

＜１９＞ 培地を付与する手段をさらに有する前記＜１４＞から＜１８＞のいずれかに記載の評価用基材の製造装置である。

＜２０＞ 前記細胞が、正常ヒト皮膚線維芽細胞である前記＜１４＞から＜１９＞のいずれかに記載の評価用基材の製造装置である。

前記＜１＞から＜１３＞のいずれかに記載の評価用基材の製造方法、及び前記＜１４＞から＜２０＞のいずれかに記載の評価用基材の製造装置は、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。

特開２００２－３５５０２６号公報 特開２００５－２６９９０２号公報

２、２０ 基材
３、２５、２８ ハイドロゲル
４、２６ 細胞
２２ 固定材Ａ含有溶液付与手段
２３ 固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与手段

Claims (6)

1. 基材に、固定材Ａを含有する溶液を付与する固定材Ａ含有溶液付与工程と、
   前記固定材Ａに対して混合が可能な固定材Ｂ及び細胞を含有する懸濁液を付与する固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与工程と、を含み、
   前記固定材Ａと、前記固定材Ｂとのそれぞれ少なくとも一部が混合されてハイドロゲルを形成し、
   前記細胞が、前記ハイドロゲルを介して前記基材に固定されることを特徴とする評価用基材の製造方法。
2. 前記細胞の少なくとも一部が前記ハイドロゲルに被覆される請求項１に記載の評価用基材の製造方法。
3. 前記固定材Ａ及び前記固定材Ｂが、混合により増粘する請求項１から２のいずれかに記載の評価用基材の製造方法。
4. 前記固定材Ａ及び前記固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液に少なくとも一部が被覆された細胞が乾燥する時間に達した場合に、前記固定材Ａ及び前記固定材Ｂの少なくともいずれかを含有する溶液を付与する工程をさらに含む請求項１から３のいずれかに記載の評価用基材の製造方法。
5. 前記評価用基材を別容器に浸漬し、前記ハイドロゲルを介して固定された細胞を培養する請求項１から４のいずれかに記載の評価用基材の製造方法。
6. 基材と、
   前記基材に、固定材Ａを含有する溶液を付与する固定材Ａ含有溶液付与手段と、
   前記固定材Ａに対して混合が可能な固定材Ｂ及び細胞を含有する懸濁液を付与する固定材Ｂ及び細胞含有懸濁液付与手段と、を有し、
   前記細胞が、前記固定材Ａと、前記固定材Ｂとのそれぞれ少なくとも一部が混合されて形成されたハイドロゲルを介して前記基材に固定されることを特徴とする評価用基材の製造装置。

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