JP2022551002A

JP2022551002A - 椎間板変性疾患の治療のためのカンナビジオール補助療法

Info

Publication number: JP2022551002A
Application number: JP2022521971A
Authority: JP
Inventors: オヒーロン、ピート; イチム、トーマス
Original assignee: Figene LLC
Current assignee: Figene LLC
Priority date: 2019-10-13
Filing date: 2020-10-13
Publication date: 2022-12-06
Also published as: EP4725549A2; JP2026004398A; US20220395572A1; EP4041210B1; WO2021076465A1; CA3156239A1; EP4041210A1; EP4041210A4; AU2020368344A1

Abstract

全身及び／又は局所投与のいずれかによる、椎間板変性疾患の治療におけるアジュバントとしての使用のためのカンナビジオールの利用が開示される。いくつかの実施形態において、カンナビジオールは、線維芽細胞の治療活性及び／又は再生活性を増強するために利用される。他の実施形態において、カンナビジオールは、単球、間葉幹細胞、及び／又は造血幹細胞を含む他の再生細胞の修復効果を増大させるために利用される。いくつかの実施形態において、カンナビジオールは、前記細胞の投与前に再生細胞の培養培地において利用される。【選択図】図１

Description

（関連出願の参照）
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年１０月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／９１４，５２３号の優先権を主張する。
（技術分野）
本開示の実施形態は、少なくとも分子生物学、細胞生物学、及び医学の分野を含む。

腰痛は、少なくとも大部分の患者では腰椎椎間板変性と併発して起こる炎症性事象によって引き起こされる。炎症と疼痛の関連性は、放射線学的に変性した椎間板が多数の被験者において疼痛と関連していないことを示す研究で確立されている。対照的に、局所的な炎症の存在は侵害受容の原因と考えられている肉芽組織の存在及び慢性の難治性の腰痛の症状（１，２）によって例示されるように、椎間板変性と関連し得る。

椎間板変性は、世界中で多大な、そして増え続ける影響を与え続けているが、現在の治療選択肢は、根本的な原因に対処していない。現在の治療法には、床上安静、病態初期の非ステロイド性抗炎症薬、及び以前のアプローチで疼痛が改善されなかった後期の椎間板切除術、関節形成術（関節置換術）、人工髄核の注入及び固定などの手技がある。これまで言及したようなアプローチは予測不可能であるばかりでなく、ほぼ末期の臨床症状のみを扱うため、疾患過程そのものを変化させることは何もしない。さらに、椎体固定などの処置は作業負荷の生体力学的分布の変化により、隣接椎間板における椎間板変性の発生率増加をもたらす。

近年、バイオテクノロジーの進歩と椎間板の生化学的構成と環境の理解の両方により、変性の過程への関心が高まり、椎間板保存を直接目的とした新規治療法の開発の可能性が高まっている。円板内のマトリックス合成と異化に重大な影響を及ぼすことが明らかにされたある種の遺伝子は、両者のバランスを変化させようとする科学者の標的を提供してきた。この目的のために、過去数年間の多くの注目が遺伝子治療を中心としており、これらの取り組みにより椎間板変性の治療への使用に関して有望な前臨床結果が得られている（３）。残念ながら、これらのアプローチのいずれも執筆時点で臨床実施に近いものではない。さらに、椎間板再生のみが遺伝子治療又は他の介入手段を介して達成され得る状況においてさえ、本来変性を引き起こした基礎的プロセスは、再発を防止するために対処されなければならないことに注意することが重要である。

現在、椎間板変性に対して広く利用できる生物学的治療法はない。しかしながら、潜在的な治療上の利益を有する多くの異なる分子が研究されている。分子療法の焦点は、椎間板細胞外マトリックスにおけるこれらの変化の１つ以上の局面を予防又は逆転させることであった。少なくとも４つの異なるクラスの分子が、椎間板修復において有効であり得る。これらには、抗カタボリックス、マイトジェン、軟骨形成モルフォゲン及び細胞内調節因子が含まれる（４－６）。

椎間板変性の特徴として、椎間板マトリックス中のプロテオグリカン、水、及びＩＩ型コラーゲンの喪失が含まれる。さらに、高分子量プロテオグリカンの損失、及び定量化がより困難な他の変化（コラーゲン架橋、プロテオグリカンの組織化など）を含む、マトリックスの定性的変化はあまり明確ではない。椎間板変性における重要な過程は、髄核における分化軟骨細胞表現型のより線維化した表現型への変化であると思われる。これらの椎間板基質の変化を合わせると、最終的には病的状態と関連する椎間板及び椎骨の解剖学的構造の変化につながる（７、８）。

マトリックス損失は、マトリックス合成と劣化との間の不均衡であるので、合成を増加させることによって、又は劣化を減少させることによって、ディスクマトリックスを増加させることが可能である。１つのアプローチは、分解酵素を阻害することによってマトリックス損失を防止することである。

変性したディスクは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の濃度が上昇している。マトリックス内では、ＭＭＰ活性は通常ＭＭＰ（ＴＩＭＰ）の組織阻害物質によって阻害される（９－１１）。Ｗａｌｌａｃｈらは、これらの抗異化分子の１つＴＩＭＰ－１がマトリックスプロテオグリカンの蓄積を増加させることができるかどうかを、ｉｎｖｉｔｒｏの実験で検証した。研究者らは、椎間板細胞におけるＴＩＭＰ－１発現が実際に蓄積を増加させ、プロテオグリカンの「測定合成速度」も増加させることを見出した（１１）。炎症過程は、変性椎間板疾患に関連することがよく知られている。椎間板変性患者では、インターロイキン－１（１２－１６）；ＴＮＦ－α（１７－２０）；及びインターロイキン－６（２１）などの炎症性サイトカインの上昇が複数の研究で示されている。炎症性サイトカインは、細胞外マトリックスを破壊するマトリックスメタロプロテアーゼ（２２，２３）の刺激（１７，２４）、ならびに髄核細胞のアポトーシスを引き起こす一酸化窒素産生の刺激（２５，２６）を含むいくつかの機構によって、変性を加速するのに役立つ。変性椎間板の細胞は、炎症性サイトカインを産生するだけでなく、他の炎症性サイトカインに応答してより多量の炎症性サイトカインを産生するという点で、炎症性サイトカインに対して過敏であることは興味深い。これは、自己増幅フィードバックループ（２７）の存在を示唆する。また、炎症性サイトカインが細胞外マトリックスタンパク質の産生に与える影響も、再生活性を低下させることで一部変性に寄与すると考えられている（２８）。例えば、ある研究では、ｉｎｖｉｔｒｏで発生させた研究者が髄核組織を形成し、それを４８時間にわたって炎症性サイトカインＴＮＦ－α（最大５０ｎｇ／ｍＬ）で処理した。組織学的外観、プロテオグリカン及びコラーゲン含量、ならびにプロテオグリカン及びコラーゲン合成について、組織を評価した。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ＮＰ細胞遺伝子発現に対するＴＮＦ－αの効果を測定した。プロテオグリカン分解はイムノブロット解析により評価した。１～５ｎｇ／ｍＬの用量で、ＴＮＦ－αは以下を含む複数の細胞応答を誘導した：アグリカン及びＩＩ型コラーゲン遺伝子の両方の発現の減少；アグリカン及びコラーゲンの蓄積及び全体的な合成の減少；ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－１３、ＡＤＡＭ－ＴＳ４、及びＡＤＡＭ－ＴＳ５の発現の増加；ＡＤＡＭ－ＴＳ依存性プロテオグリカン分解の誘導。４８時間以内に、これらの細胞応答は、その元のプロテオグリカン含量のわずか２５％のＮＰ組織をもたらした。これらの結果は髄核細胞の機能を強力に阻害し、再生能力を遮断するＴＮＦ－αの能力を強く支持する（２９）。

椎間板変性症における炎症性サイトカインの重要性は、身体病理の直接的な原因となるだけでなく、疼痛を直接誘発する効果を示す研究によっても強調される。例えば、Ｈａｒｉｉらはラットの椎間板を神経支配する後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンにおけるカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）発現という疼痛の分子モデルに対するＴＮＦ－α阻害薬、エタネルセプトの効果を調べるために、逆行性神経追跡及び免疫組織化学を用いた。その考えは、腰椎椎間板の変性が腰痛の原因であるというものであった。椎間板におけるＴＮＦ‐αは椎間板痛の主要な寄与因子である可能性がある。ＤＲＧニューロンにおけるＣＧＲＰ発現に対するＴＮＦ‐α阻害の効果を評価した。Ｌ４／５椎間板を神経支配するフッ化金標識ニューロンは、全ての基でＬ１～Ｌ６ＤＲＧ全体に分布していた。ＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ標識ニューロンのうち、ＣＧＲＰ免疫反応性ニューロンの割合は、シャム手術対照群で２１％±４％、穿刺＋生理食塩水群で３２％±７％、穿刺＋エタネルセプト群で２３％±４％であった。ＣＧＲＰ免疫反応性ニューロンの割合は、穿刺＋生理食塩水群の方が偽管理及び穿刺＋エタネルセプト群と比較して有意に大きかった。著者らはこのモデルでは損傷椎間板を神経支配するＤＲＧニューロンでＣＧＲＰがアップレギュレートされており、椎間板穿刺直後にエタネルセプトを椎間板内に直接適用すると、損傷椎間板を神経支配するＤＲＧニューロンにおけるＣＧＲＰ発現が抑制されると結論付けた（３０）。他の研究では、ＴＮＦ－αのほか、ＩＬ－１などの他の炎症性サイトカイン（３１）が直接的な疼痛の誘発と関連していることが報告されている（３２－４３）。

間葉系幹細胞、線維芽細胞、造血幹細胞、さらには免疫細胞を含む再生細胞は、すべて、その治癒機能を遂行するために移植されると適切な環境を必要とする。本開示は椎間板変性症の患児に投与された場合に、炎症を減少させ、再生細胞及び／又は増殖因子の効力を刺激する手段としてのカンナビジオールの利用を提供する。

本開示は、椎間板変性疾患（変性椎間板疾患）の治療に関する方法及び組成物を対象とする。特定の実施形態は、変性椎間板疾患を有するか、有する疑いがあるか、又はその危険性がある個体への１つ以上の組成物の投与に関する。いくつかの実施形態では個体に投与される組成物が変性椎間板疾患に対する治療的介入のための任意の形態のカンナビジオール（ＣＢＤ）を含み、これにはいくつかの実施形態では変性椎間板疾患に対する少なくとも１つの治療的介入又は予防的介入と組み合わせることが含まれる。変性椎間板疾患に対する治療的介入は、一例として、治療有効量の線維芽細胞を含み得る。

特定の実施形態は、個体へのカンナビジオールの投与に関する。カンナビジオールは個体に全身的及び／又は局所的に（例えば、椎間板に）投与され得る。カンナビジオールの投与は、髄核における内因性及び／又は外因性細胞を含む、髄核における細胞のアポトーシスを減少させるのに十分な用量及び頻度で、個体に投与することができる。髄核内の外因性細胞は、例として、線維芽細胞、脊索細胞に分化した線維芽細胞、及び／又は軟骨細胞に分化した線維芽細胞を含む、本明細書に包含される変性椎間板疾患に対する治療的介入を含み得る。髄核内の内因性細胞は、軟骨細胞、脊索細胞、脊索前駆細胞、軟骨細胞前駆細胞、又はそれらの組み合わせを含み得る。カンナビジオールは、治療効果のために必要とされる任意の投薬量（５０ｍｇ～５００ｍｇの間の投薬量、又はその中で誘導可能な任意の範囲を含む）で、個体に毎日投与され得る。カンナビジオールは、毎日、毎日２回、毎週、隔週、毎月、隔月などを含む、治療効果に必要とされる任意の頻度で投与され得る。カンナビジオールは、（－）－カンナビジオールを含んでもよく、又は（－）－カンナビジオールからなってもよい。カンナビジオールは、浸透増強ゲルを含むことができるゲル製剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、カンナビジオールは、ヒアルロン酸及び／又は長鎖ヒアルロン酸分子を含む１つ以上の細胞外マトリックス分子を含み得る局在化組成物と共に投与され得る。

個体に投与されるか又は投与されない線維芽細胞を含む、本明細書に包含される線維芽細胞は、操作されてもされなくてもよい。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、脊索細胞又は軟骨細胞などの非線維芽細胞に分化する。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、少なくとも特定の場合において、免疫調節活性を増大させるカンナビジオール、ｈＣＧ、オキシトシン、又はそれらの組み合わせと接触される。ｈＣＧは、線維芽細胞１００万個当たり１ｎＭ～１μＭ、又は１０ｎＭ～１００ｎＭ、又はその中で誘導可能な任意の範囲の濃度で、細胞に接触又は投与することができる。オキシトシンは、１ｎＭ～１０μＭ、又は１００ｎＭ～１μＭ、又はその中で誘導可能な任意の範囲の濃度で、細胞に接触又は投与され得る。線維芽細胞は、脂肪組織、皮膚組織、骨髄、末梢血、ウォートンのジェリー（Ｗｈａｒｔｏｎ‘ｓＪｅｌｌｙ）、胎盤、卵膜、動員された末梢血、及びそれらの組合せからなる群より選択される１つ以上の組織からであってよい。本明細書に包含される線維芽細胞は、細胞増殖当たり１４～２１時間の速度で増殖し得る。本明細書に包含される線維芽細胞は、１００万個の線維芽細胞の培養物あたり０．１ｐｇ～７７ｐｇのインターロイキン－１を、表面上の７５％コンフルエンスで分泌し得る。本明細書に包含される線維芽細胞は、１００万個の線維芽細胞の培養物あたり１ｐｇ～５００ｐｇのＦＧＦ－１を、表面上の７５％コンフルエンスで分泌し得る。いくつかの実施形態では、線維芽細胞が混合リンパ球反応において増殖する応答性Ｔ細胞の能力を、例えば約２０％を超えて実質的に減少させることができる。

いくつかの実施形態では、線維芽細胞をカンナビジオールと接触させて、線維芽細胞の再生活性を増大させる。線維芽細胞とカンナビジオールとの接触は、少なくともいくつかの場合において、ＩＧＦ－１及び／又はＥＧＦ－１の産生を増強し得る。カンナビジオールは、（－）－カンナビジオールを含んでもよく、又は（－）－カンナビジオールからなってもよい。

上記は以下の詳細な説明がより良く理解され得るように、本開示の特徴及び技術的利点をかなり広く概説した。本明細書の特許請求の範囲の主題を形成する追加の特徴及び利点を以下に説明する。開示された概念及び特定の実施形態は本設計の同じ目的を実行するために他の構造を修正又は設計するための基礎として容易に利用され得ることが、当業者によって理解されるべきである。また、そのような同等の構成は、添付の特許請求の範囲に記載される精神及び範囲から逸脱しないことが当業者によって理解されるべきである。本明細書に開示される設計の特徴であると考えられる新規な特徴はさらなる目的及び利点とともに、動作の構成及び方法の両方に関して、添付の図面と関連して考慮される場合、以下の説明からより良く理解される。しかしながら、各図は、例示及び説明の目的のためだけに提供され、本開示の限定の定義として意図されないことが明確に理解されるべきである。

本開示をより完全に理解するために、添付の図面と併せて以下の説明を参照する。

図１は、種々の濃度でのＣＢＤ（カンナビジオール、ｃａｎｎａｂｉｄｉｏｌ）による線維芽細胞からのＩＧＦ－１の刺激を示す。３つのバーのグループ分けにおいて、各濃度での中央のバーは、示された濃度でＣＢＤと共培養された１００，０００の線維芽細胞を表す。各濃度における右の棒は、示された濃度でＣＢＤと共培養された２００，０００の線維芽細胞を表す。各濃度の左の棒は、示された濃度でＣＢＤと共培養された０個の線維芽細胞を表す。

図２は、種々の濃度でのＣＢＤによる線維芽細胞からのＥＧＦ－１の刺激を示す。３つのバーのグループ分けにおいて、各濃度での中央のバーは、示された濃度でＣＢＤと共培養された１００，０００の線維芽細胞を表す。各濃度における右の棒は、示された濃度でＣＢＤと共培養された２００，０００の線維芽細胞を表す。各濃度における左の棒は、示された濃度でＣＢＤと共培養された０個の線維芽細胞を表す。

長年の特許法条約に従い、用語「ａ」及び「ａｎ」は、特許請求の範囲を含む、本明細書中で使用される場合、「１つ又は複数の」ことを意味し、開示の一部の実施形態は、開示の１つ又は複数の要素、方法ステップ、及び／又は方法から成るか、又は本質的に成ることができる。本明細書に記載の任意の方法又は組成物は本明細書に記載の任意の他の方法又は組成物に関して実施することができ、異なる実施形態を組み合わせることができることが企図される。

本明細書全体を通して、文脈が別段の要求をしない限り、用語「備える」、「備える」、及び「備える」は、記載されたステップ又は要素、又はステップ又は要素のグループの包含を意味するが、他のステップ又は要素、又はステップ又は要素のグループの排除を意味しないことが理解されるのであろう。「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ」とは、用語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ」の後に続くものを含むことを意味し、これに限定されるものではない。したがって、用語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ」は、列挙された要素が必須又は必須であること、及び他の要素が存在しないことを示す。「から本質的になる」とは、語句の後に列挙される任意の要素を含むことを意味し、列挙される要素についての開示において特定される活性又は作用を妨害しないか、又はそれに寄与しない他の要素に限定される。したがって、用語「から本質的になる」は、列挙された要素が必要又は必須であることを示すが、他の要素は任意ではなく、列挙された要素の活動又は作用に影響を及ぼすかどうかに応じて存在しても存在しなくてもよい。

本明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「特定の実施形態」、「追加の実施形態」、又は「さらなる実施形態」、又はそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して記載された特定の機能、構成、又は特徴が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを手段する。したがって、本明細書全体の様々な箇所における前述の語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を参照しているわけではない。さらに、特別な特徴、構造又は特質は１以上の実施形態において任意の適当な方法で組み合わせられ得る。

Ｉ．カンナビジオール

本明細書中で使用される場合、「カンナビジオール」又は「ＣＢＤ」は、カンナビジオール；カンナビジオールプロドラッグ；カンナビジオールの薬学的に許容される誘導体（カンナビジオール、カンナビジオールプロドラッグ、及びカンナビジオール誘導体の薬学的に許容される塩を含む）をいう。ＣＢＤには、２－［３－メチル－６－（１－メチルエテニル）－２－シクロヘキセン－１－イル］－５－ペンチル－１，３－ベンゼンジオール、ならびにその薬学的に許容される塩、溶媒和物、代謝産物（例えば、皮膚代謝産物）、及び代謝前駆体が含まれる。ＣＢＤの合成は、例えば、Ｐｅｔｉｌｋａら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，５２：１１０２（１９６９）、およびＭｅｃｈｏｕｌａｍら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８７：３２７３（１９６５）に記載されており、これらは、本明細書中に参考として援用される）。

本開示の特定の実施形態はカンナビジオール（ＣＢＤ）の使用に関し、再生細胞活性又は再生細胞治療に対するアジュバント（補助剤、ａｄｊｕｖａｎｔ）として含まれる。特定の実施形態では、カンナビジオールは、椎間板変性又は変性椎間板疾患の治療のために再生細胞と一緒に投与される。カンナビジオールの投与は、全身的及び／又は局所的に行うことができる。いくつかの実施形態において、ＣＢＤは、移植前にインビトロ又はエキソビボで再生細胞を活性化するために利用される。特定の実施形態において、ＣＢＤは全身的に投与され、これは再生細胞活性を維持するための微小環境の適合性を増加し得、炎症を抑制し得、そして／又は再生細胞を直接刺激して、治癒機能を実行し得る。

ＣＢＤは、合成ＣＢＤであってもなくてもよい。ＣＢＤは、精製されたＣＢＤであってもよい。ＣＢＤは、植物由来であり得る。ＣＢＤは、被験体の上腕及び肩に経皮的に投与してもよい。いくつかの実施形態では、ＣＢＤが対象の大腿又は背中に経皮的に投与される。ＣＢＤは、それが変性の徴候を示しているか否かにかかわらず、椎間板に直接投与することができる。特定の場合に有効量のカンナビジオール（ＣＢＤ）を局所投与することは、ＣＢＤを経口投与することと比較して、少なくとも１つの有害事象又は副作用の強度を減少させることができる。少なくとも１つの有害事象又は副作用は、胃腸（ＧＩ）有害事象である可能性がある。少なくとも１つの有害事象又は副作用は、肝機能に影響を及ぼす有害事象又は副作用であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの有害事象は傾眠である。いくつかの実施形態では、傾眠の頻度及び強度が経皮投与による有害事象として低減される。

いくつかの実施形態では、ＣＢＤが（－）－ＣＢＤを含むか、又は（－）－ＣＢＤからなる。ＣＢＤの有効量（例えば、治療有効量）は、１日当たり約５０ｍｇ～約５００ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、個体に投与され得るＣＢＤの有効量が約５０ｍｇ／日で開始され、約５００ｍｇ／日まで滴定される。いくつかの実施形態では、個体に投与され得るＣＢＤの有効量が毎日約５０ｍｇで開始され、毎日約２５０ｍｇまで滴定される。いくつかの実施形態では、個体に投与され得るＣＢＤの有効量が２５０ｍｇ／日で開始される。いくつかの実施形態では、個体に投与され得るＣＢＤの有効量が毎日５００ｍｇで開始される。いくつかの実施形態において、５００ｍｇの１日用量は、３５ｋｇを超える体重の患者に投与される。ＣＢＤは、１日１回投与、又は１日２回投与を含む、治療効果に有用な頻度で投与してもよい。いくつかの実施形態では、ＣＢＤの有効量が分割された１日用量で３９０ｍｇであり得る。

本明細書中で使用される場合、用語「経皮的に」は、投与の文脈において、ＣＢＤが皮膚を貫通するのに有効な条件下で、ＣＢＤを患者又は被験体の皮膚と接触させることをいう。特定の実施形態において、ＣＢＤは、ゲル又は油状として処方される。いくつかの実施形態において、ＣＢＤは、浸透増強ゲルとして処方される。ゲルは、１％（ｗｔ／ｗｔ）～７．５％（ｗｔ／ｗｔ）のＣＢＤを含有し得る。いくつかの実施形態では、ゲルが４．２％（ｗｔ／ｗｔ）のＣＢＤを含有する。いくつかの実施形態では、ゲルが７．５％（ｗｔ／ｗｔ）のＣＢＤを含有する。いくつかの実施形態において、経皮調製物は、クリーム、軟膏又は軟膏であり得る。ＣＢＤは、包帯、パッド又はパッチによって送達することができる。ＣＢＤは、ゲル形態であり得、そして１日１回又は２回の投薬で経皮的に制御された薬物送達を提供するように設計される、透明な透過増強ゲルとして薬学的に産生され得る。ＣＢＤゲルは、１％（ｗｔ／ｗｔ）ＣＢＤ～７．５％（ｗｔ／ｗｔ）ＣＢＤの間、又はその中で誘導可能な任意の範囲であり得る。ＣＢＤゲルは例えば、４．２％（ｗｔ／ｗｔ）ＣＢＤ又は７．５％（ｗｔ／ｗｔ）ＣＢＤを有することができる。ＣＢＤゲルは、患者又は介護者によって、患者の上腕及び肩、背中、大腿、又はそれらの任意の組み合わせに局所的に適用され得る。ＣＢＤゲルは、希釈剤及び担体、ならびに湿潤剤、防腐剤、ならびに懸濁剤及び分散剤などの他の従来の賦形剤を含むことができる。

ＣＢＤゲルは、可溶化剤、浸透促進剤、可溶化剤、酸化防止剤、増粘剤、増粘剤、及び／又はｐＨ調整剤を含むことができる。ＣＢＤゲルの組成物は例えば、組成物の約０．１％～約２０％（ｗｔ／ｗｔ）の量で存在するカンナビジオール；組成物の約１５％～約９５％（ｗｔ／ｗｔ）の量で存在する１～６個の炭素原子を有する低級アルコール；組成物の約０．１％～約２０％（ｗｔ／ｗｔ）の量で存在する第１の浸透増強剤；及び組成物が合計１００％（ｗｔ／ｗｔ）に十分な量の水であり得る。ＣＢＤゲルの他の配合物は国際公開第ＷＯ２０１０／１２７０３３号に見ることができ、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態において、カンナビノイド（例えば、カンナビジオール又はカンナビジオールのプロドラッグ）は、個体において治療的に有効な血漿濃度を達成するために全身的に送達される。しかしながら、カンナビオールを含むものを含むカンナビノイド経口投薬形態は、治療的に有効な全身濃度を達成するために、いくつかの障害を克服しなければならない。第一に、カンナビノイドは一般に、高度に親油性である。それらの限定された水溶性は、それによって、胃腸管における吸収に利用可能なカンナビノイドの量を制限する。第二に、カンナビジオールは他のカンナビノイドと同様に、ヒトの消化管から吸収されると、実質的な初回通過代謝を受ける。最後に、患者が経口薬の服用を回避するか、経口剤形が全用量を放出して治療濃度を達成するのに十分な期間胃腸管に留まらないため、患者が悪心又は嘔吐を患った場合、いかなる生成物の経口バイオアベイラビリティもさらに減少する。したがって、上記を考慮して、カンナビノイド（疼痛、変性椎間板疾患、悪心又は食欲刺激を含む）に応答する１つ以上の医学的状態の治療のために、カンナビノール又はカンナビオールプロドラッグなどの治療有効量のカンナビノイドを、それを必要とする哺乳動物に、哺乳動物の胃腸管からの吸収に依存しない投与経路によって全身的に送達することが望ましい。

カンナビジオールの全身送達のための１つの非経口投与経路は、経皮投与である。加えて、ヒト及びモルモットのような多くの哺乳動物の表皮及び真皮は、角質層を通過する活性薬剤を代謝することができる酵素を含有する。ヒトのような哺乳動物の皮膚において生じる代謝プロセスは、カンナビノールのようなカンナビノイドの薬学的に有効な量を、それを必要とする哺乳動物の全身循環に送達するために利用され得る。カンナビノイドのプロドラッグ（例えば、カンナビジオールプロドラッグ）、及びカンナビノイドのプロドラッグを含む組成物であって、ヒトのような哺乳動物に経皮的に投与され得、その結果、皮膚における代謝から生じる代謝産物は、カンナビノイドに応答する医学的状態の処置のために全身的に利用可能なカンナビノイドでプロドラッグを含む組成物が本明細書中に包含される。残念ながら、カンナビジオールはその高度に親油性の性質のために、ヒトを含む哺乳動物の皮膚などの膜を介してはほとんど吸収されない。したがって、治療有効量のカンナビジオールを、それを必要とする哺乳動物に、妥当な時間枠内で、適切な表面積にわたって経皮的に投与することの成功は、実質的に制限されてきた。

いくつかの実施形態では、カンナビジオールは、個体に局所的に投与され、例えば、個体の椎間板に投与される。カンナビジオールは、本明細書に包含される投薬量及び頻度を含む、任意の投薬量及び頻度で個体に局所的に投与され得る。局所的に投与されるカンナビジオールは、本明細書に包含される細胞療法を含む、１つ以上の他の組成物と共に投与され得る。いくつかの実施形態では、個体において椎間板に投与されるカンナビジオールは、個体の椎間板を含む細胞のアポトーシスを減少させる。ディスクを含む細胞は、内因性（脊索細胞、脊索前駆細胞、軟骨細胞、及び／又は軟骨細胞前駆細胞を含む）及び／又は個体に投与される任意の細胞治療を含む外因性細胞であり得る。

いくつかの実施形態では、個体へのカンナビジオールの投与は、炎症を阻害する他の薬剤と一緒に行われる。１つの実施形態において、タンパク質、遺伝子、及び／又はｍＲＮＡを含むインターロイキン－１（ＩＬ－１）受容体アンタゴニストの投与は炎症のいくつかの局面を減少させるために行われ、これはカンナビジオールの投与と予想外に相乗する。

いくつかの実施形態において、変性椎間板疾患のための１つ以上の治療介入を伴うカンナビジオール又はカンナビジオールは、局在化組成物と共に投与される。局在化組成物は、ヒアルロン酸及び／又は長鎖ヒアルロン酸を含む１つ以上の細胞外マトリックス分子であり得る。

いくつかの実施形態において、カンナビジオールは、細胞における再生活性を増大させ得る線維芽細胞などの細胞と接触させられるか、それと培養されるか、又はそれに投与される。カンナビジオール（（－）－カンナビジオールを含む、又は（－）－カンナビジオールからなるカンナビジオールを含む）と接触、培養、又は投与された線維芽細胞を含む細胞は、ＩＧＦ－１及び／又はＥＧＦ－１の産生を増加させ得る。カンナビジオール（（－）－カンナビジオールを含むか、又は（－）－カンナビジオールからなるカンナビジオールを含む）と接触、培養、又は投与された線維芽細胞は、本明細書に包含される方法のために使用され得る。カンナビジオール（（－）－カンナビジオールを含む、又は（－）－カンナビジオールからなるカンナビジオールを含む）と接触、培養、又は投与された線維芽細胞は変性椎間板疾患を有する、又は有する危険性がある個体を含む個体に、局所的に（椎間板内を含む）及び／又は全身的に投与することができる。

ＩＩ．椎間板変性疾患に対する治療介入

本開示の特定の実施形態は、線維芽細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞、及び組織を治癒する能力を有する他の細胞を含む、再生細胞を含む様々な細胞療法を含み得る、変性椎間板疾患のための１つ以上の治療介入の使用に関する。特定の実施形態では、線維芽細胞をカンナビジオールと一緒に個体に投与する。線維芽細胞は、任意の自己由来、同種由来、又は異種由来の源由来であってもよい。線維芽細胞は、脂肪組織、皮膚組織、骨髄、末梢血、ウォートンジェリー（Ｗｈａｒｔｏｎ‘ｓＪｅｌｌｙ）、胎盤、卵膜、動員された末梢血、及びそれらの組合せからなる群より選択される組織からであってよい。

特定の実施形態において、操作された線維芽細胞又は操作されていない線維芽細胞を含む線維芽細胞は、変性椎間板疾患の処置を必要とする個体のような個体に、例えば、椎間板に局所的に送達される。線維芽細胞は、ヒドロゲルを含む製剤として投与することができる。ヒドロゲルは、例えば、ゲル化剤としてバトロキソビン（ＢＴＸ）とブレンドされた多血小板血漿（ＰＲＰ）及びヒアルロン酸（ＨＡ）から構成され得る。線維芽細胞は、ＰＲＰ／ＨＡ／ＢＴＸヒドロゲル中にカプセル化され得、そして増殖培地及びＴＧＦ－β１を含むか又は含まない培地の両方において、２１日目まで培養され得る。一実施形態では、ヒドロゲルは、前記線維芽細胞が高い細胞生存率及び増殖を維持するように、１５分２０℃及び３分３７℃でゼリー化する。一実施形態では、線維芽細胞が変性椎間板疾患を有する患者における椎間板内注射に使用される。このような実施形態において、前記線維芽細胞は、ＧＡＧ産生を増強する手段で培養され、これは、サイトカイン（例えば、ＴＧＦ－β）を用いた培養によって達成され得る。線維芽細胞特異的使用のために改変され得る、間葉幹細胞の増殖のための方法論は、以下に提供され、これは参考として援用される（４４）。

特定の実施形態は、治療的使用の前の線維芽細胞の活性化、及び／又は線維芽細胞のための「再生アジュバント」として作用する薬剤の投与に関する。製剤中の細胞は、培養単層中で増殖する場合、典型的な線維芽細胞形態を示し得る。具体的には細胞が細長い延長部を有する細長い紡錘形又は紡錘形の外観を示し得るか、又は細胞は細胞質の前縁を有し得る、より大きく平坦な星状細胞として現れ得る。これらの形態の混合物も観察することができる。細胞は、線維芽細胞特異的マーカー、ＣＤ９０（Ｔｈｙ－１）、３５ｋＤａの細胞表面糖タンパク質、及び細胞外マトリックスタンパク質、コラーゲンを含む、正常な線維芽細胞に特徴的なタンパク質を発現し得る。線維芽細胞投薬処方物は、標準的な組織培養手順を使用して、各個体自身の皮膚の生検から増殖された、自己線維芽細胞の懸濁液から構成される自己細胞治療生成物であり得る。特定の実施形態において、線維芽細胞はまた、組織修復又は再生のための他の細胞型を作製するために使用され得る。

本明細書に包含される線維芽細胞は、本明細書に包含される投与を受ける個体の皮膚（自己調製物の場合）又は健康なドナーの皮膚（同種調製物の場合）の生検からの増殖によって生成され得る。皮膚由来線維芽細胞は、例として開示されるが、本開示に包含される線維芽細胞は任意の供給源又は組織に由来し得る。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、若年ドナーから使用される。別の実施形態において、線維芽細胞は、増殖の増強及びヘイフリック限界の克服を可能にする遺伝子でトランスフェクトされる。標準的な細胞培養技術を用いた培養における細胞増殖の誘導に続いて。前記技術は、液体媒体中での膨張、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ、又はＡＩＭ－Ｖなどの媒体の利用を含む。組織培養のための標準的な技術は、当該分野で周知であり、そして細胞を解離する必要性を含む。いくつかの実施形態では、解離が細胞継代を可能にするためのトリプシン又はコラーゲンによる処理を含む。皮膚組織（真皮及び表皮層）は、被験者の耳介後領域から生検することができる。非限定的な例を説明する目的で開示された一実施形態では、出発物質が標準的な無菌実施を使用して収集された３つの３ｍｍパンチ皮膚生検材料から構成される。生検材料は、当業者によって収集され、滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含むバイアルに入れられる。生検材料は２～８℃で出荷される。冷蔵荷送人は製造施設に戻る。一実施形態では、製造施設に到着した後、生検が検査され、受け入れられると、製造エリアに直接移送される。プロセスの開始時に、次いで、生検組織は、酵素消化の前に洗浄される。洗浄後、リベラーゼ消化酵素液をミンチなしで添加し、生検組織を３７．０＋／－２．０℃で１時間インキュベートする。１時間。生検組織消化の時間は、培養中の細胞の生存率及び増殖速度に影響を及ぼし得る重要なプロセスパラメータである。リベラーゼは、ＬｏｎｚａＷａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）から処方され、ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏｒｐ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）から未処方で入手したコラゲナーゼ／中性プロテアーゼ酵素カクテルである。あるいは、他の市販のコラゲナーゼ（例えば、ＳｅｒｖａＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅＮＢ６（Ｈｅｌｉｄｅｌｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））が使用され得る。消化後、開始増殖培地（ＩＭＤＭ、ＧＡ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））を添加して酵素を中和し、細胞を遠心分離によってペレット化し、５．０ｍＬの開始増殖培地に再懸濁する。あるいは遠心分離は行われず、酵素の完全な不活性化は開始増殖培地のみの添加によって生じる。細胞増殖及び増殖の開始のために、細胞懸濁液をＴ－１７５細胞培養フラスコに播種する前に、増殖開始培地を添加する。Ｔ－７５フラスコの代わりにＴ－７５、Ｔ－１５０、Ｔ－１８５又はＴ－２２５フラスコを使用することができる。細胞を３７＋／２．０℃でインキュベートする。５．０＋／１．０％ＣＯ_２で、フレッシュコンプリートグロウメディアでおよそ３～５日おきに給紙する。このプロセスにおける全ての供給は完全増殖培地の半分を除去し、そして同じ体積を新鮮な培地で置換することによって行われる。あるいは、完全な供給を行うことができる。継代の約３０日前まで、細胞はＴ－１７５フラスコ中に残ってはならない。コンフルエンスは培養分裂の間の適切な播種密度を確実にするために、プロセス全体を通してモニターされる。細胞コンフルエンスがＴ－１７５フラスコ中で４０％以上である場合、使用済み培地を除去し、細胞を洗浄し、トリプシン－ＥＤＴＡで処理してフラスコ中の接着細胞を溶液中に放出させることによって、細胞を継代する。次いで、細胞をトリプシン処理し、Ｔ－５００フラスコに播種して、細胞増殖を続ける。あるいは、１つ又は２つのＴ－３００フラスコ、１つの層セルスタック（１ＣＳ）、１つの層セルファクトリ（１ＣＦ）又は２つの層セルスタック（２ＣＳ）を、Ｔ－５００フラスコの代わりに使用することができる。

各継代及び採取前に形態を評価して、プロセス全体にわたる培養純度をモニターする。形態学は、観察された試料を、細胞培養物の形態学的試験のための視覚的標準と比較することによって評価される。細胞は、培養された単層中で増殖する場合、典型的な線維芽細胞形態を示す。細胞は、細長い延長部を有する細長い紡錘形又は紡錘形の外観を示すか、又は細胞質の前縁を有し得る、より大きく平坦な星状細胞として現れ得る。これらの形態の混合物も観察することができる。コンフルエントでない領域の線維芽細胞は同様の形状であり得るが、ランダムに配向され得る。細胞培養物中のケラチノサイトの存在も評価する。角化細胞は丸く不規則な形状に見え、そしてより高いコンフルエンスではそれらはコブルストーン形成に組織化されて見える。より低いコンフルエンスでは、ケラチノサイトが小さなコロニーにおいて観察可能である。細胞を３７＋／２．０℃でインキュベートする。５．０＋／１．０％ＣＯ２で、Ｔ－５００フラスコ中で３～５日ごとに、１０層電池スタック（１０ＣＳ）中で５～７日ごとに継代した。細胞は継代前に１０日間以上Ｔ－５００フラスコ中に留まってはならない。バルク原薬（細胞）の安全性に関する品質管理（ＱＣ）放出試験には、無菌試験及びエンドトキシン試験が含まれる。Ｔ－５００フラスコ中の細胞コンフルエンスが＞９５％である場合、細胞を１０ＣＳ培養容器に継代する。あるいは、２つの５層セルスタック（５ＣＳ）又は１０層セルファクトリ（１０ＣＦ）を、１０ＣＳの代わりに使用することができる。１０ＣＳへの通過は使用済み培地を除去し、細胞を洗浄し、トリプシン－ＥＤＴＡで処理して、フラスコ中の接着細胞を溶液中に放出することによって行われる。次いで、細胞を１０ＣＳに移す。追加の完全増殖培地を加えてトリプシンを中和し、Ｔ－５００フラスコからの細胞を、新鮮な完全増殖培地を含む２Ｌボトルにピペットで移す。２Ｌボトルの内容物を１０ＣＳに移し、全ての層に播種する。次いで、細胞を３７＋／２．０℃でインキュベートする。５．０＋／１．０％ＣＯ_２で、５～７日ごとにフレッシュコンプリートグロウメディアで給紙する。細胞は継代前２０日間以上１０ＣＳ中に留まるべきではない。一実施形態では、継代された真皮線維芽細胞は、増殖した線維芽細胞をタンパク質を含まない培地中で一定期間インキュベートすることによって、培養培地中に存在する免疫原性タンパク質を実質的に含まないようにされ、一次収穫１０ＣＳ中の細胞集密が９５％以上である場合、細胞が収穫される。回収は使用済み培地を除去し、細胞を洗浄し、トリプシン－ＥＤＴＡで処理して接着細胞を溶液中に放出させ、追加の完全増殖培地を添加してトリプシンを中和することによって行う。細胞を遠心分離によって収集し、再懸濁し、そしてインプロセスＱＣ試験を行って、総生存細胞数及び細胞生存率を決定する。

いくつかの実施形態では、一次１０ＣＳ採取からの細胞計数結果を受け取った後に多数の細胞が必要とされる場合、複数の細胞スタック（最大４つの１０ＣＳ）へのさらなる継代が行われる。さらなる継代のために、初代採取物からの細胞を、新鮮な完全増殖培地を含有する２Ｌ培地ボトルに添加する。再懸濁した細胞を複数の細胞スタックに添加し、３７＋／２．０℃でインキュベートする。５．０＋／１．０％ＣＯ_２で。細胞集密が細胞採取の前に８０％以上でなければならないことを除いて、細胞スタックを上記のように供給し、採取する。採取手順は、上記の一次採取について記載したものと同じである。細胞及び使用済み培地からのマイコプラズマ試料を収集し、細胞計数及び生存率を、上記の一次採取について記載したように実施する。この方法は、動物由来の試薬からの免疫原性タンパク質の導入を回避することによって、免疫原性タンパク質を減少又は排除する。プロセス残留物を減らすために、細胞をタンパク質を含まない凍結培地中に凍結保存し、次いで解凍し、洗浄してから、残留物をさらに減らすために、最終注入の前処理を行う。さらなる継代からの細胞の採取及び凍結保存が完了した後に、さらなる薬物物質が必要な場合、凍結薬物物質のアリコート凍結バイアルを解凍し、５ＣＳ又は１０ＣＳ培養容器に播種するために使用する。あるいは、５ＣＳ又は１０ＣＳの代わりに、４層セルファクトリ（４ＣＦ）、２つの４ＣＦ、又は２つの５ＣＳを使用することができる。細胞の凍結した凍結バイアルを解凍し、洗浄し、新鮮な完全増殖培地を含有する２Ｌ培地ボトルに添加し、上記のように培養し、回収し、凍結保存する。細胞懸濁液に細胞集密は、細胞採取前に８０％以上でなければならない。

培養増殖の完了時に、細胞を回収し、洗浄し、次いで、２．２×１０^７細胞／ｍＬ又はそれ以上の標的を有する１００，０００細胞～２．７×１０^７細胞／ｍＬ又はそれ以上を含有するように処方する。あるいは、標的を製剤範囲内で調節して、異なる適応用量に適応させることができる。原薬は、Ｉｓｃｏｖｅ‘ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓＭｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）及びＰｒｏｆｒｅｅｚｅ－ＣＤＭ（商標）（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）＋７．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる凍結保存培地中に懸濁された生存可能な自己ヒト線維芽細胞の集団を含む。あるいは、より低いＤＭＳＯ濃度が７．５％の代わりに使用され得るか、又はＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ５又はＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅＳｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）がＩＭＤＭ／Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ／ＤＭＳＯの代わりに使用され得る。細胞数及び生存率に加えて、薬物物質の純度／同一性が実施され、懸濁液が９８％以上の線維芽細胞を含有することを確認しなければならない。通常の細胞汚染物質には、ケラチノサイトが含まれる。純度／同定アッセイは線維芽細胞集団のパーセント純度を定量するために、ＣＤ９０及びＣＤ１０４（それぞれ、線維芽細胞及びケラチノサイト細胞についての細胞表面マーカー）に対する蛍光タグ化抗体を使用する。ＣＤ９０（Ｔｈｙ－１）は、３５ｋＤａの細胞表面糖タンパク質である。ＣＤ９０タンパク質に対する抗体は、ヒト線維芽細胞に対して高い特異性を示すことが示されている。ＣＤ１０４，インテグリンβ４鎖は２０５ｋＤａの膜貫通糖蛋白であり、インテグリンα６鎖（ＣＤ４９ｆ）と結合してα６／β４錯体を形成する。この複合体は、ケラチノサイト細胞の分子マーカーとして作用することが示されている（ＡｄａｍｓおよびＷａｔｔ１９９１）。

ＣＤ１０４タンパク質に対する抗体は、ヒトケラチノサイト細胞の１００％に結合する。細胞数及び生存率はビアマウント染料試薬（ＶｉａｃｏｕｎｔＤｙｅＲｅａｇｅｎｔ）と共に試料をインキュベートし、ＧｕａｖａＰＣＡシステムを使用して試料を分析することによって決定される。この試薬は２つの染料、すなわち、全ての有核細胞を染色する膜透過性染料、及び損傷細胞又は死細胞のみを染色する膜不透過性染料から構成される。この色素組み合わせの使用は、ＧｕａｖａＰＣＡシステムが試料中に存在する細胞の総数を推定すること、及びどの細胞が生存可能であるか、アポトーシス性であるか、又は死んでいるかを決定することを可能にする。この方法は、自己培養線維芽細胞の純度／同一性を決定する際に使用するために特別にカスタム開発された。

あるいは、Ｔ－１７５フラスコ（またはその代替品）またはＴ－５００フラスコ（またはその代替品）のいずれかから、細胞増殖表面としてマイクロキャリアを含むスピナーフラスコに細胞を継代することができる。マイクロキャリアは、浮遊培養におけるアンカレッジ依存性細胞の増殖表面として使用される小さなビーズ状の構造物である。少量で大きな細胞収量が得られるように設計されている。この装置では、５００ｍＬ、ＩＬまたは２Ｌの滅菌済み使い捨てスピナーフラスコに、５０ｍＬ～３００ｍＬの完全増殖培地を加える。滅菌済みマイクロキャリアをスピナーフラスコに加える。３７＋／－２．０°Ｃ，５．０＋／－．０％ＣＯ_２インキュベーター内で短時間（１－２４時間）、培養液を静置するか、低速回転（１５－３０ＲＲＭ）でスターティングプレート上に置き、細胞をキャリアに付着させる。付着期間終了後、スピンプレートの回転数を上げる（３０－１２０ＲＰＭ）。細胞は、１～５日おきに、または培地の色が変化して使用済みと思われるときに、新しい完全培養培地を供給される。細胞は、マイクロキャリアをサンプリングし、細胞を分離し、細胞数および生存率分析を行うことにより、一定の間隔で収集される。担体あたりの細胞濃度は、培養をスケールアップするタイミングを決定するために使用される。十分な細胞が生産されたら、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン－ＥＤＴＡを用いてマイクロキャリアから細胞を採取し、より大量のマイクロキャリアとより大量の完全増殖培地（３００ｍＬ－２Ｌ）を用いてスピナーフラスコに再び播種する。あるいは、既存のマイクロキャリア培養物を含むスピナーフラスコに、追加のマイクロキャリアと完全増殖培地を直接加えることができ、トリプシン処理と再播種を使用せずに、細胞を直接ビーズからビーズへ移動させることが可能である。あるいは、最初のＴ－１７５またはＴ－５００フラスコから十分な細胞が生産された場合、細胞をスケールアップした量のマイクロキャリアに直接播種することができます。接着期間終了後、スピンプレートの速度を上げる（３０－１２０ＲＰＭ）。１～５日おきに、または培地の色が変化して使用済みとなった時点で、新しいＣｏｍｐｌｅｔｅＧｒｏｗｔｈＭｅｄｉａを細胞に供給する。濃度が目的の適応症に必要な細胞数に達したら、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン－ＥＤＴＡを用いて細胞を回収する。使い捨てスピナーフラスコ内で使用されるマイクロキャリアは、ＢｉｏＮＯＣＩＩ（登録商標）（ＣｅｓｃｏＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＢｅｌｌｃｏＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｉｎｅｌａｎｄ，Ｎ．Ｊ．）やＦｉｂｒａＣｅｌ（登録商標）（ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）などのポリブレンド、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ－Ｇ（ＰｅｒｃｅｌｌＢｉｏｌｙｔｉｃａ，Ａｓｔｒｏｐ，Ｓｗｅｄｅｎ）などのゼラチン、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標）（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）などのセルロース、または、２ＤＭｉｃｒｏＨｅｘ（登録商標）（Ｎｕｎｃ，Ｗｅｉｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、または、Ｈｙ－ＱＳｐｈｅｒｅ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＨｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）などのコーティング／非コーティングポリスチレンから作られてもよい。

別の実施形態において、スピナーフラスコ装置の代わりにＦｉｂｒａＳｔａｇｅ（登録商標）（ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｄｉｓｏｎ、Ｎ．Ｊ．）またはＢｅｌｌｏＣｅｌｌ（登録商標）（ＣｅｓｃｏＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＤｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｂｙＢｅｌｌｃｏＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｉｎｅｌａｎｄ，Ｎ．Ｊ．）などの自動ベローシステムを使用して、ＢｉｏＮＯＣＩＩ（登録商標）．やＦｉｂｒａＣｅｌ（登録商標）などのポリブレンド２Ｄマイクロキャリア上で細胞を処理することが可能である。Ｔ－１７５（または代替品）またはＴ－５００（または代替品）フラスコの細胞は、適量の完全増殖培地を入れたマイクロキャリアの入ったベローボトルに継代され、システムに設置される。システムは、培地をマイクロキャリアー上に供給し、酸素を供給するために培地を排出することを一定のサイクルで繰り返す。細胞は、上記と同じ順序でモニター、供給、洗浄、収穫される。
あるいは、自動化装置を用いて細胞を処理することもできる。生検組織の消化後、または最初の継代が完了した後（Ｔ－１７５フラスコまたは代替物）、細胞を自動化装置に播種することができる。一つの方法は、ＡＣＥ（ＡｕｔｏｍａｔｅｄＣｅｌｌｕｌａｒＥｘｐａｎｓｉｏｎ）システムであり、これは一連の市販またはカスタム製作されたコンポーネントを連結して細胞増殖プラットフォームを形成し、その中で細胞を人間の介入なしに増殖させることができるシステムである。細胞は、アンカレッジ依存性の細胞接着をサポートする円盤の積み重ねからなるセルタワーで拡張される。細胞増殖終了後は、自動的に培地が循環し、トリプシン処理により細胞が回収される。

あるいは、ＡＣＥシステムが細胞増殖表面、送達管、培地及び試薬、ならびに加熱／冷却、培地移動及び自動プログラミングサイクルの実行のための機構及びコンピュータ処理能力を収容する永久ベースからなる使い捨て構成要素からなる単一ロットユニットバージョンを含む、縮小することができる。受領後、各滅菌照射ＡＣＥ使い捨てユニットは、その包装から開封され、予め充填されたバッグを吊り下げ、バッグを無菌コネクタを介して既存のチューブに接続することによって、培地及び試薬が装填される。このプロセスは以下のように続く：ａ）生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）の内部で、酵素的に消化された生検からの細胞の懸濁液を、抗生物質を含有する開始増殖培地で既に満たされている「増殖前チャンバー」（細胞塔の上部の小さなユニット）に導入する。ＢＳＣから、使い捨て品は既に所定の位置にある永久ＡＣＥユニットに移される；ｂ）約３日後、予備増殖チャンバー内の細胞はトリプシン処理され、完全増殖培地で予備充填された細胞塔自体に導入される。ここで、ＣＯ_２噴射によって引き起こされる「泡立ち作用」は細胞が下方に螺旋状に回転し、均一に分布した様式でディスクの面上に沈降するような速度で媒体を循環させる；ｃ）約７日間、細胞は増殖することが可能である。このとき、コンフルエンスを確認し（書き込み時の方法は不明）、培養物が増殖していることを確認する。また、この時点で、完全増殖培地は、新鮮な完全増殖培地と置き換えられる。ＣＧＭは７日毎に３～４週間交換される。培養期間の終わりに、コンフルエンスをもう一度チェックして、意図した処理のために所望の量の細胞をおそらく産生するのに十分な増殖があることを確認する；ｄ）培養物が十分にコンフルエントである場合、それを回収する。使用済み培地（上清）を容器から排出する。次いで、ＰＢＳは（培地を洗浄するために、細胞からＦＢＳを）容器にポンプ輸送され、ほぼ直ちに排出される。トリプシン－ＥＤＴＡは増殖表面から細胞を分離するために、容器中にポンプ輸送される。トリプシン／細胞混合物は、容器から排出され、紡糸分離器に入る。凍結保存剤を容器にポンプで送り込んで、ディスクの表面から残留細胞をリンスし、スピンセパレータにも送る。スピンセパレーターは細胞を収集し、次いで、輸送／注入培地中に細胞を均一に再懸濁する。スピンセパレーターから、細胞は、インライン自動化細胞計数デバイス、又は実験室分析による細胞計数及び生存率試験のために収集された試料を通って送られる。特定の数の細胞がカウントされ、適切な細胞濃度に達したら、採取された細胞は、低温凍結のために試料をアリコートするために除去することができる収集バイアルに送達される。

いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、免疫調節活性を増強し得るｈＣＧ及び／又はオキシトシンと共に培養されるか、又は投与される。線維芽細胞は、１ｎＭ～１μＭ、又は１０ｎＭ～１００ｎＭ、又はその中で誘導可能な任意の範囲の濃度で、ｈＣＧと共に培養され得るか、又はｈＣＧを投与され得る。線維芽細胞は、１ｎｍ～１０μＭの間、又は１００ｎｍ～１μＭの間、又はその中で誘導可能な任意の範囲の濃度で、オキシトシンと共に培養され得るか、又はオキシトシンを投与され得る。

以下の実施例は本発明の好ましい具体例を示すために含める。以下の実施例に開示される技術は本発明の実施において良好に機能することが本発明者によって発見された技術を表し、したがって、本発明の実施のための好ましい形態を構成すると考えることができることを当業者は理解されたい。しかしながら、当業者であれば、本発明の開示を考慮して、開示されかつ同様の結果を得られる特定の実施例において、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、多くの変更が可能であることは理解できるのであろう。

実施例１
カンナビジオールはＩＧＦ‐１とＥＧＦ‐１の線維芽細胞産生を刺激する
皮膚線維芽細胞をＡｌｌｃｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．から入手し、指示された濃度のＣＢＤ中で４８時間培養した。図１に見られるように、ＩＧＦ－１の増大が観察された。図２に見られるように、ＥＧＦ－１の増大が観察された。培養は、１０％ウシ胎仔血清を含むＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地中で行った。
参考文献
本明細書に参照される全ての刊行物、特許及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許又は特許出願がその全体が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されたかのように、その全体が参照により組み込まれる。
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本開示及びその利点を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義される設計の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換、及び変更を本明細書で行うことができることを理解されたい。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載されたプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、及びステップの特定の実施形態に限定されることを意図していない。当業者であれば、本開示から容易に理解するように、本明細書で説明される対応する実施形態と実質的に同じ機能を実行するか、又は実質的に同じ結果を達成する、現在存在するか又は後に開発されるプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法、又はステップを、本開示に従って利用することができる。したがって、添付の特許請求の範囲はその範囲内に、そのようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、又はステップを含むことが意図される。

Claims

個体における椎間板変性疾患を治療する方法であって、個体にカンナビジオール及び椎間板変性疾患に対する少なくとも１つの治療介入を投与することを含む、方法。
カンナビジオール及び治療的介入は、個体に同時に又は異なる時間に投与される、請求項１記載の方法。
カンナビジオールは、治療的介入の投与前、投与中、または投与後に投与される、請求項２記載の方法。
椎間板変性疾患に対する治療的介入は、治療上有効な量の線維芽細胞を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
椎間板変性疾患に対する治療的介入は、脊索細胞、軟骨細胞、又はそれらの混合物に分化した線維芽細胞を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
線維芽細胞は、脂肪組織、皮膚組織、骨髄、末梢血、ウォートンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ‘ｓＪｅｌｌｙ）、胎盤、卵膜、動員された末梢血、及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上の組織由来である、請求項４～５のいずれか一項に記載の方法。
線維芽細胞は、真皮組織由来である、請求項４～６のいずれか１項に記載の方法。
カンナビジオールは、全身投与される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
カンナビジオールは、個体の椎間板に局所的に投与される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
カンナビジオールは、髄核における細胞のアポトーシスを減少させるのに十分な用量及び頻度で投与される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
髄核中の細胞は、軟骨細胞、脊索細胞、脊索前駆細胞、軟骨細胞前駆細胞、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
髄核中の細胞は、外因的に投与された細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
髄核内の細胞は、椎間板変性疾患に対する治療的介入を含む、請求項１０に記載の方法。
椎間板変性疾患に対する治療的介入は、治療有効量の線維芽細胞、脊索細胞に分化した線維芽細胞、軟骨細胞に分化した線維芽細胞、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
前記外因的に投与された細胞は、線維芽細胞再生細胞である、請求項１２に記載の方法。
線維芽細胞は、細胞増殖当たり１４～２１時間の速度で増殖している、請求項４～１５のいずれか１項に記載の方法。
線維芽細胞は、１００万個の線維芽細胞の培養物あたり０．１ｐｇ～７７ｐｇのインターロイキン１を、表面上の７５％コンフルエンスで分泌する、請求項４～１６のいずれか１項に記載の方法。
線維芽細胞は、１００万個の線維芽細胞の培養物あたり１ｐｇ～５００ｐｇのインターロイキンＦＧＦ－１を、表面上の７５％コンフルエンスで分泌する、請求項４～１６のいずれか１項に記載の方法。
線維芽細胞は、混合リンパ球反応において増殖するＴ細胞に応答する能力を減少させる、請求項４～１８のいずれか１項に記載の方法。
前記増殖の減少は、線維芽細胞が添加されていない対照混合リンパ球反応と比較して２０％を超える減少を含む、請求項１９に記載の方法。
線維芽細胞をヒト絨毛性ゴナドロピン（ｈＣＧ）で治療して、免疫調節活性を増大させる、請求項４～２０のいずれか１項に記載の方法。
前記ｈＣＧは、１ｎＭ～１μＭの濃度で細胞に投与される、請求項２１に記載の方法。
前記ｈＣＧは、１０ｎＭ～１００ｎＭの濃度で細胞に投与される、請求項２１に記載の方法。
前記線維芽細胞は、免疫調節活性を増強するためにオキシトシンで処理される、請求項４～２３のいずれか１項に記載の方法。
前記オキシトシンは、１ｎＭ～１０μＭの濃度で細胞に投与される、請求項２４に記載の方法。
オキシトシンは、１００ｎＭ～１μＭの濃度で細胞に投与される、請求項２４に記載の方法。
カンナビジオールは、（－）－カンナビジオールを含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
カンナビジオールは、（－）－カンナビジオールからなる、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
カンナビジオールの有効量は、合計約５０ｍｇ～約５００ｍｇ／日である、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
カンナビジオールは、ゲル製剤を含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
ゲル製剤は、浸透増強ゲルを含む、請求項３０に記載の方法。
カンナビジオール及び／又は治療介入を投与することは、個体に１日１回投与することを含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
カンナビジオール及び／又は治療介入を投与することは、個体に１日２回投与することを含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
カンナビジオール及び／又は治療介入を投与することは、個体にカンナビジオールを経皮的に投与することを含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
カンナビジオールを投与することは、個体にカンナビジオールを椎間板内投与することを含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
前記カンナビジオールは、局在化組成物と一緒に投与される、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
前記局在化組成物は、持続放出を提供するように作用することができる細胞外マトリックスを含む、請求項３６に記載の方法。
前記細胞外マトリックスは、ヒアルロン酸である、請求項３７に記載の方法。
前記ヒアルロン酸は、長鎖ヒアルロン酸分子からなる、請求項３８に記載の方法。
線維芽細胞を有効量のカンナビジオールと接触させることを含む、線維芽細胞の再生活性を増大させる方法。
再生活性を増大させることは、ＩＧＦ－１の産生を増大させることを含む、請求項４０に記載の方法。
再生活性を増大させることは、ＥＧＦ－１の産生を増大させることを含む、請求項４０又は４１に記載の方法。
カンナビジオールは、（－）－カンナビジオールを含む、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
カンナビジオールは、（－）－カンナビジオールからなる、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
カンナビジオールと接触させた線維芽細胞の有効量を、それを必要とする個体に提供する工程をさらに含む、請求項４０～４４のいずれか１項に記載の方法。