JP2023519087A - ダイズにおける飽和脂肪の増加 - Google Patents

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Abstract

Figure 2023519087000001
ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子、またはＳＡＣＰＤ－ＣおよびＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の両方の発現を調節する１つ以上の変異の結果として変化した油組成を有するダイズ品種を作製するための材料および方法が提供される。例えば、１つ以上の変異を欠く対応するダイズ植物、植物部分、または植物細胞から産生された油と比較して増加した飽和脂肪酸含有量を有する油を産生するダイズ植物、植物部分、または植物細胞が提供される。

Description

ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）は、大気窒素を固定するその能力に起因して世界的に重要なマメ科作物である。ダイズはまた、動物飼料タンパク質の主要な供給源として作用し、その油は、調理／油料理から工業用用途およびバイオディーゼルまでの範囲の用途を有する。ダイズ油は、１１％のパルミチン酸（Ｃ１６：０）、４％のステアリン酸（Ｃ１８：０）、２３％のオレイン酸（Ｃ１８：１）、５４％のリノール酸（Ｃ１８：２）、および７．６％のリノレン酸（Ｃ１８：３）を含有する。総飽和脂肪酸（パルミチン酸およびステアリン酸）は、総脂肪酸組成の約１５％を占める。
上記のダイズ油の脂肪酸組成は、特定の食品および化粧品製造用途における使用に最適ではないことがある。いくつかの制限は、化学的水素添加によって克服され得るが、部分水素添加の結果として生成されるトランス脂肪酸は、好ましくない健康への影響に関連している。パーム油またはパーム核油（これらの両方はアブラヤシの木（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）に由来する）は、室温で固体であり、その画分は広範囲の機能的融解プロファイルを提供することから、食品用途における部分水素添加油の代用品として作用している。この油は、高い融点を有し、飽和脂肪が高く、これは、クリームおよび化粧品のための望ましい肌触り感覚、および菓子のための魅力的な口当たりを作り出すのに理想的である。パーム油の独特な化学はまた、調理に伴う高温に耐えることができ、腐敗に対する油の耐性は、この油を含有する製品に長い貯蔵寿命を付与する。
パーム油の栽培は、しばしば環境の持続可能性の問題に関係し、これは、パーム油を不人気な選択にしている。食品および化粧品用途のためのパーム油の代替品を見つけることの圧力が存在する。シア、ココアバター、およびその他のものなどの外国産脂肪に基づく非パーム脂肪の主要な欠点の１つは、原料の高い価格である。さらに、これらの脂肪は持続可能性の懸念も有し得る。ナタネ油、ヒマワリ油またはダイズ油などの液体油は、すべての用途においてすべてのパーム画分に取って代わることはできない。パーム油画分の特性を再現するように使用され得る有する固形脂肪を産生ために十分に上昇したパルミチン酸およびステアリン酸含有量を有するダイズ品種を提供できることが非常に望ましい。
ダイズ油の栄養的および商業的品質の改善は、油ベースの製品にさらなる価値を付加し得る。より高い栄養素含有量およびより高い安定性の製品を提供するために、飽和脂肪酸含有量を増加させるダイズ油含有量および組成の変化が必要とされる。さらに、増加した飽和脂肪酸含有量を有するダイズ油は、食品用途のための多価不飽和油の工業的水素添加の必要性を低減し得、それによってトランス脂肪に関連する健康への負の影響を低減し得る。
本開示は、上昇した飽和脂肪酸含有量を有する油を産生するダイズ植物、植物部分、および植物細胞を特徴とする。本文書は、総脂肪酸含有量の約１５重量％超の飽和脂肪酸含有量を有するダイズを産生するダイズ品種を作製するための材料および方法を提供する。本明細書における開示は、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞におけるＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子、またはＳＡＣＰＤ－ＣおよびＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の両方の発現を調節する変異が、水素添加なしでの、パーム油、ココアバターまたは他の外国産脂肪の機能的融解プロファイルを有する固形脂肪またはその画分の産生のために、ステアリン酸およびパルミチン酸などの飽和脂肪酸の蓄積を増強し得るという発見に少なくとも部分的に基づいている。さらに、本開示は、完全ノックアウト変異体または非特異的過剰発現変異体で見られる発生に対する有害な効果などの、ランダム変異誘発に関連する多面的欠損を回避する、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子、またはＳＡＣＰＤ－ＣおよびＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の両方の発現を調節する標的化された変異に基づく。
したがって、本開示の一態様は、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子、またはＳＡＣＰＤ－ＣおよびＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の両方の発現を調節する１つ以上の変異を含むダイズ植物、植物部分または植物細胞であって、当該植物、植物部分、または植物細胞は、１つ以上の変異を欠く対応するダイズ植物、植物部分、または植物細胞から産生された油と比較して増加した飽和脂肪酸含有量を有する油を産生し、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現を調節する１つ以上の変異は、低頻度切断エンドヌクレアーゼによって誘発された標的化された変異を含む、ダイズ植物、植物部分または植物細胞を特徴とする。
ダイズ植物、植物部分、または植物細胞は、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現の低下をもたらす変異を含み得る。ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現の低下をもたらす変異は、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の１つ以上の対立遺伝子またはその作動的に連結されたプロモーターにおける変異であり得る。ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現の低下をもたらす変異は、ノックアウト変異であり得る。ノックアウト変異は、種子特異的ノックアウト変異であり得る。種子特異的ノックアウト変異は、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子のネイティブなゲノム遺伝子座における種子特異的プロモーターの、発生中のダイズ種子において低活性を有するかまたは検出可能な活性を有しないプロモーターでの置換を含み得る。ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現の低下をもたらす変異は、配列番号１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、または４７に示される配列におけるものであり得る。ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現の低下をもたらす変異は、発生中のダイズ種子において低活性を有するかまたは検出可能な活性を有しないプロモーターに作動可能に連結された機能的ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子のノックイン変異であり得る。上記の実施形態のうちの１つ以上における、発生中のダイズ種子において低活性を有するかまたは検出可能な活性を有しないプロモーターは、根粒特異的遺伝子プロモーターであり得る。上記の実施形態のうちの１つ以上では、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞は、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の発現の増加をもたらす変異を含む。ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の発現を増加させる変異は、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の内因性プロモーターの、過剰発現プロモーターでの標的化された置換であり得る。過剰発現プロモーターは、強い種子特異的プロモーター、任意選択で、ＦＡＤ２ＡプロモーターまたはＦＡＤ２Ｂプロモーターであり得る。
別の態様では、本開示は、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子、またはＳＡＣＰＤ－ＣおよびＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の両方の発現を調節する変異を含むダイズ植物を生成するための方法であって、
（ａ）総脂肪酸組成の約１５％の飽和脂肪酸含有量を有する油を産生するダイズ植物からのダイズ植物細胞の集団を、
（ｉ）ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現の低下をもたらす変異であって、変異は、低頻度切断エンドヌクレアーゼによって誘発された標的化された変異である、変異、
（ｉｉ）ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の発現の増加をもたらす変異、または
（ｉｉｉ）それらの組み合わせ、を含む１つ以上の核酸配列と接触させることと、
（ｂ）集団から、発現ＳＡＣＰＣ－Ｃ遺伝子が低下しているか、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の発現が増加しているか、または発現ＳＡＣＰＣ－Ｃ遺伝子が低下し、かつＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の発現が増加している細胞を選択することと、
（ｃ）選択された植物細胞をダイズ植物に再生することと、を含む、方法を特徴とする。
ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現を低下させることは、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の１つ以上の対立遺伝子またはその作動的に連結されたプロモーターにおける変異を誘発することを含み得る。誘発された変異は、ノックアウト変異または種子特異的ノックアウト変異であり得る。ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現を低下させることは、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子のネイティブなゲノム遺伝子座における種子特異的プロモーターを、発生中のダイズ種子において低活性を有するかまたは検出可能な活性を有しないプロモーターで置換することを含み得る。ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現を低下させることは、ダイズ植物細胞の集団に、発生中のダイズ種子において低活性を有するかまたは検出可能な活性を有しないプロモーターに作動可能に連結された機能的ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子を含む発現カセットを送達することをさらに含み得る。発生中のダイズ種子において低活性を有するかまたは検出可能な活性を有しないプロモーターは、根粒特異的プロモーターであり得る。上記の１つ以上の実施形態では、方法は、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の内因性プロモーターを、過剰発現プロモーターで置換することによって、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の発現を増加させることを含み得る。ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の発現を増加させることは、ダイズ植物細胞の集団に、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の１つ以上のコピーを含む発現カセットを送達することを含み得る。ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の１つ以上のコピーは、強い種子特異的プロモーターに作動可能に連結され得る。
別の態様では、本開示は、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子、またはＳＡＣＰＤ－ＣおよびＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の両方の発現を調節する１つ以上の変異を含むダイズ植物、植物部分、または植物細胞によって産生されたダイズ油を含む、ダイズ油組成物であって、ダイズ油は、１つ以上の変異を欠く対応するダイズ植物、植物部分、または植物細胞から産生された油と比較して増加した飽和脂肪酸含有量を有し、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現を調節する１つ以上の変異は、低頻度切断エンドヌクレアーゼによって誘発された標的化された変異を含む、ダイズ油組成物を特徴とする。ダイズ油組成物は、１０％超のステアリン酸含有量、１０％超のパルミチン酸含有量、または２０％超の飽和脂肪酸含有量を有し得、すべてのパーセンテージは、油の総脂肪酸の重量ベースである。
１つ以上の例の詳細は、以下の説明に示される。他の特徴、目的、および利点は、説明および特許請求の範囲から明らかである。
本書面開示は、非限定的かつ非網羅的である例示的な実施形態を記載する。図面（これは、必ずしも縮尺どおりに描かれていない）において、同様の数字は、いくつかの図面全体を通して実質的に同様の構成要素を記載する。異なる末尾文字を有する同様の数字は、実質的に同様の構成要素の異なる例を表す。図面は、一般に、限定としてではなく、例として、本文書で考察される様々な実施形態を示す。
以下で、図に示される例示的な実施形態に言及する。
異なる組織における根粒特異的遺伝子Ｇｌｙｍａ０５ｇ０１３６０、Ｇｌｙｍａ１３ｇ４４９７０およびＧｌｙｍａ１４ｇ２７９９０（ＳＡＣＰＤ－Ｃ）の発現プロファイルを示す。 異なる組織における種子特異的遺伝子ＦＡＤ２Ａ（Ｇｌｙｍａ１０ｇ４２４７０）、ＦＡＤ２Ｂ（Ｇｌｙｍａ２０ｇ２４５３０）およびＦＡＴＢ－１Ａ（Ｇｌｙｍａ０５ｇ０８０６０）の発現プロファイルを示す。 正規化後の異なる組織における候補遺伝子発現プロファイルを記載する表１を示す。（Ａ）は、若葉、花、１ｃｍ鞘、鞘（１０および１４満開後日（ＤＡＦ））、根および根粒組織を含む。 図３Ａの続きである。（Ｂ）は、種子組織（１０、１４、２１、２５、２８、３５、および４２ＤＡＦ）を含む。 本開示の１つ以上の実施形態（例えば、アプローチ１Ａおよび１Ｂ）による、ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子発現を調節するためのＴＡＬＥＮ（配列番号１５～４７）を記載する表２を示す。 本開示の１つ以上の実施形態（例えば、アプローチ１Ｃ）による、ＧｍＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子発現を調節するためのＴＡＬＥＮ（配列番号４８～６２）を記載する表３を示す。 再生したＴ０植物からのいくつかの確認された変異体プロファイルの代表的なＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ ＤＮＡ配列を示す。下線を付した配列は、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのための標的部位を示す。（Ａ）野生型ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ配列を、配列番号６３に示し、変異体配列を、配列番号６４～６６に示す。 再生したＴ０植物からのいくつかの確認された変異体プロファイルの代表的なＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ ＤＮＡ配列を示す。下線を付した配列は、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのための標的部位を示す。（Ｂ）追加の変異体配列を、配列番号６７～７０に示す。 再生したＴ０植物からのいくつかの確認された変異体プロファイルの代表的なＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ ＤＮＡ配列のアラインメントを示す。下線を付した配列は、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのための標的部位を示す。野生型ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ配列を、配列番号７１に示し、変異体配列を、配列番号７２～７６に示す。 ＳＡＣＰＤ－Ｃの種子特異的サイレンシングのためのアプローチ１Ｂを記載する。（Ａ）ＴＡＬＥＮ対およびドナーテンプレートを含むＳＡＣＰＤ－Ｃコード配列の上流を標的とするための例示的なジェミニウイルスバイナリベクターの構成要素を示す。根粒特異的プロモーターおよび５’ＵＴＲの２ｋｂの配列（Ｇｌｙｍａ１３ｇ４４９７０）は、左ホモロジーアーム（ＬＨＡ）および右ホモロジーアーム（ＲＨＡ）に隣接している。（Ｂ）ヌクレアーゼによる切断およびドナーテンプレートレプリコンとの相同組換えに際しての遺伝子ターゲティング事象を示す。本開示の一実施形態によれば、標的化されたプロモーター置換ドナーテンプレート配列は、配列番号７９に示され、予想される編集されたＲＨＡ配列は、配列番号８０に示される。 アプローチ１Ｂのための代表的な標的化されたプロモーター置換ドナーテンプレート配列（配列番号７９）を示す。 内因性ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子プロモーターを置換するための、図９のテンプレートを使用した予想される編集されたＲＨＡ配列（配列番号８０）を示す。 ＦＡＴＢ－１Ａの種子特異的過剰発現（ＯＥ）のためのアプローチ１Ｃを記載する。（Ａ）ＬＨＡおよびＲＨＡに隣接した、ＴＡＬＥＮ対およびドナーテンプレートを含む、ＦＡＴＢ－１Ａコード配列の上流を標的とするための例示的なジェミニウイルスバイナリベクターの構成要素を示す。（Ｂ）ヌクレアーゼによる切断およびドナーテンプレートレプリコンとの相同組換えに際しての遺伝子ターゲティング事象を示す。 アプローチ１Ｃのための代表的な標的化されたプロモーター置換ドナーテンプレート配列（配列番号８１）を示す。 ＳＡＣＰＤ－ＣおよびＦＡＴＢ－１Ａの組織特異的発現を有する植物、植物部分または植物種子を産生するためのアプローチ２ＡのためのＤＮＡ構築物の描写を示し、示される構築物は、２つの発現カセット、ＳＡＰＣＤ－Ｃのコード配列ならびにＧｌｙｍａ１３ｇ４４９７０のプロモーター（根粒特異的）およびターミネーター配列を有するカセット１、ＦＡＴＢ－Ａ１のコード配列ならびにＦＡＤ２Ａのプロモーターおよびターミネーター配列を有するカセット２を含む。アプローチ２Ａのための代表的な構築物の配列を、配列番号８２に示す。
本開示は、植物細胞内での脂肪酸合成に関与する遺伝子の発現を調節する１つ以上の変異の結果として上昇した飽和脂肪酸含有量を有する油を産生するために使用され得るダイズ植物、植物部分および植物細胞、ならびにそのような植物、およびそのような植物に由来する油を生成するための方法を特徴とする。本明細書に記載される方法を使用して、少なくとも１０％のステアリン酸含有量および／または少なくとも１０％のパルミチン酸含有量を有する油を有するダイズ品種を生成し得る。いくつかの実施形態では、油組成物の変化は、ダイズＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現を、完全にもしくは種子特異的な方法で、変化させるか、またはダイズＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子を過剰発現させることによって達成される。本明細書で提供される方法のいくつかによれば、改変は非トランスジェニック技術を使用して達成される。本明細書に記載される標的化された変異は、ダイズ作物における有害な表現型を導き得る多面的効果を最小化するかまたは回避する。
定義
本開示について、用語は以下のように定義される。
「シスジェニック（ｃｉｓ－ｇｅｎｉｃ）」という用語は、植物自体または性的に適合性のドナー植物からの形質をコードする、天然遺伝子での植物の遺伝子改変を指す。シスジェニック改変は、植物が非交配可能種からの遺伝子または合成遺伝子で遺伝子改変される、トランスジェニック改変と区別可能である。
「内因性遺伝子」は、野生型植物において生じる野生型配列の配列、またはコードされる産物の機能を保持することを可能にするパーセント同一性を有する配列（例えば、少なくとも９０％の同一性を有する配列）を含む核酸分子を指し、植物または細胞の植物部分から得られ得るか、または合成的に生成され得る。さらなる実施形態は、配列が少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有することを規定する。本明細書に記載される実施形態では、内因性遺伝子ヌクレオチド配列は、野生型遺伝子のものとは異なる遺伝子座に挿入され得、野生型遺伝子とは異なるプロモーターに作動可能に連結され得る。
「ＳＡＣＰＤ」は、Δ９－ステアロイル－アシルキャリアタンパク質デサチュラーゼを指す。したがって、「ＳＡＣＰＤ遺伝子」は、Δ９－ステアロイル－アシルキャリアタンパク質デサチュラーゼタンパク質をコードする遺伝子を指す。ダイズにおいて、ＳＡＣＰＤ遺伝子の３つのアイソフォームが同定されている。この遺伝子のアイソフォームのうちの２つ、ＳＡＣＰＤ－ＡおよびＳＡＣＰＤ－Ｂは、栄養組織および生殖組織の両方において発現され、一方、第３のもの、ＳＡＣＰＤ－Ｃ（Ｇｌｙｍａ１４ｇ２７９９０）は、主に発生中の種子および根粒において発現される。
「ＦＡＴＢ」は、パルミトイルアシルキャリアタンパク質チオエステラーゼをコードする遺伝子を指す。
「ダイズ植物」または「植物部分」という用語は、任意の発生段階のダイズ植物、または植物カッティング、植物細胞、植物細胞培養物、植物器官、植物種子、および小植物を含むダイズ植物の部分を含むように広く使用される。植物細胞は、プロトプラストおよび細胞壁を含む、植物の構造的および生理学的単位である。植物細胞は、単離された単一細胞もしくは細胞の凝集体、例えば、脆いカルス、または培養細胞の形態であり得るか、あるいはより高度に組織化された単位の一部、例えば、植物組織、植物器官、または植物であり得る。したがって、植物細胞は、プロトプラスト、配偶子産生細胞、または植物全体に再生し得る細胞もしくは細胞の集合であり得る。そのため、複数の植物細胞を含み、植物全体に再生することができる種子は、本開示の目的のための植物細胞であると考えられる。植物組織または植物器官は、種子、プロトプラスト、カルス、または構造的もしくは機能的単位に組織化される植物細胞の任意の他の群であり得る。植物の特に有用な部分には、収穫可能な部分および子孫植物の繁殖に有用な部分が含まれる。植物の収穫可能な部分は、植物の任意の有用な部分、例えば、花、花粉、実生、葉、茎、鞘、種子、根、根粒などであり得る。繁殖に有用な植物の部分には、例えば、種子、鞘、カッティング、実生、根茎などが含まれる。「種子」は、それが受精の存在下または非存在下で形成されるかどうかにかかわらず、かつ種子構造が稔性または不稔性であるか否かにかかわらず、開花時のその正常な成熟点に続いて、植物の胚珠の連続的な分化によって形成される任意の植物構造を指す。
「発現カセット」は、適切な宿主細胞における特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができるＤＮＡ配列であって、任意選択で終結シグナルおよび／または他の調節エレメントに作動可能に連結された、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、ＤＮＡ配列を意味する。、発現カセットはまた、ヌクレオチド配列の適正な翻訳に必要とされる配列を含み得る。コード領域は、通常、目的のタンパク質をコードするが、目的の機能的ＲＮＡ、例えば、アンチセンスＲＮＡまたは非翻訳ＲＮＡもまた、センスまたはアンチセンス方向でコードし得る。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであり得、これは、その構成要素のうちの少なくとも１つが、その他の構成要素のうちの少なくとも１つに関して異種であることを意味する。発現カセットはまた、天然に存在するが、異種発現に有用な組換え形態で得られたものであり得る。発現カセットは、完全に細胞外で（例えば、組換えクローニング技術によって）組み立てられ得る。しかしながら、発現カセットはまた、部分的に内因性構成要素を使用して組み立てられ得る。例えば、発現カセットは、内因性配列の上流にプロモーター配列を配置する（または挿入する）（内因性配列は、それによって、当該プロモーター配列によって機能的に連結され、制御されるようになる）ことによって得られ得る。
Ａ．ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子発現変異体
本開示の実施形態は、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現を調節する１つ以上の変異を含むダイズ植物、植物部分、または植物細胞を特徴とする。１つ以上の変異は、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子のコード配列または非コード配列中に存在し得る。１つ以上の変異は、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子内に、すなわち、遺伝子のオープンリーディングフレーム内に、またはＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現を調節する領域に、すなわち、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の調節領域内に、またはそれらの組み合わせに存在し得る。例えば、ＳＡＣＰＤ－Ｃプロモーターの結合配列を破壊するプロモーター標的化変異は、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現を低下させ得る。いくつかの場合では、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現を変化させる１つ以上の変異は、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子のイントロン領域、エクソン領域、エンハンサー領域、プロモーター領域、非翻訳領域（ＵＴＲ５’もしくは３’）、またはこれらの領域のうちの２つ以上の組み合わせ中に存在する。Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子のゲノム配列は公開されている。例えば、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子のネイティブなゲノム配列、Ｇｌｙｍａ．１４ｇ２７９９０は、Ｓｏｙｂａｓｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｓｏｙｂａｓｅ．ｏｒｇ）からダウンロードされ得る。ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現を調節する変異は、遺伝子の１つ以上の対立遺伝子中にあり得る。天然に存在するＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＳＡＣＰＤ－Ｃヌクレオチド配列のコード配列の代表的な例を（配列番号１）に示す。コードするＣＤＳは、ネイティブなイントロンを含有せず、ネイティブなゲノム配列と同じポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるダイズ植物、細胞、植物部分、種子、およびその子孫は、各内因性ＳＡＣＰＤ－Ｃ対立遺伝子またはそのプロモーター（例えば、種子特異的プロモーター）中に変異を有し得、その結果、遺伝子の発現は、植物においてまたは特定の組織において低下されるかまたは完全に阻害される。したがって、いくつかの場合では、植物、細胞、植物部分、種子、および子孫は、内因性ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子から発現されるΔ９－ステアロイル－アシルキャリアタンパク質デサチュラーゼの検出可能なレベルを示さない。
特定の実施形態では、発現は、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子またはそのプロモーターの変異によって低下される。植物、植物部分または植物細胞における遺伝子の発現を低下させることは、遺伝子を阻害、妨害、ノックアウト、またはノックダウンすることを含み、その結果、遺伝子の転写および／またはコードされたポリペプチドの翻訳は、遺伝子またはポリペプチドの発現が阻害、妨害、ノックアウト、またはノックダウンされていない対応する対照植物、植物細胞、または植物もしくは植物細胞の集団と比較して低下している。例えば、ＲＮＡｉ技術を使用した遺伝子ノックダウンが用いられ得る。低下は、対応する対照植物、植物細胞、または植物もしくは植物細胞の集団と比較しての、発現レベルの任意の減少（例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または１００％さえの減少）を包含する。いくつかの実施形態では、発現を５０％以上低下させることは、特に有用であり得る。発現レベルは、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ノーザンブロッティング、ドットブロットハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、核ランオンおよび／または核ランオフ、ＲＮａｓｅプロテクションなどの方法、あるいはＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、およびウエスタンブロッティングなどの免疫学的および酵素的方法を使用して測定され得る。
いくつかの場合では、本明細書で提供される植物、植物細胞、植物部分、種子、および子孫は、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の１つ以上の対立遺伝子において標的化されたノックアウトを行うために低頻度切断エンドヌクレアーゼ（例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ））システムを使用して生成され得る。ノックアウトのために標的とされる遺伝子は、配列番号１に示されるコード配列、または配列番号１に対する少なくとも７５％の配列同一性を有するＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子を有し得る。
特定の核酸と特定の配列番号によって参照される配列との間のパーセント配列同一性は、以下のように決定される。まず、核酸は、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．１４を含むＢＬＡＳＴＺのスタンドアローンバージョンからのＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｂｌ２ｓｅｑ）プログラムを使用して、特定の配列番号に示された配列と比較される。２つの比較された配列が相同性を共有する場合、指定された出力ファイルは、それらの相同性の領域を整列された配列として提示する。２つの比較された配列が相同性を共有しない場合、指定された出力ファイルは、整列された配列を提示しない。一旦整列されると、マッチの数は、同一のヌクレオチド残基が両方の配列において示される位置の数を計数することによって決定される。パーセント配列同一性は、マッチの数を、特定された配列（例えば、配列番号１）に示された配列の長さ、または分節された長さ（例えば、特定された配列に示された配列からの１００個の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基）のいずれかで割り、続いて、得られた値に１００を掛けることによって決定される。パーセント配列同一性の値は、最も近い１０分の１に丸められる。例えば、ノックアウトされた遺伝子は、配列番号１に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するコード配列を有し得る。
本開示は、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の標的化されたノックアウトに起因する、高飽和脂肪酸油を提供するために特に好適であるダイズ植物および関連産物（例えば、種子および植物部分）を生成するために、低頻度切断エンドヌクレアーゼ（例えば、ＴＡＬＥヌクレアーゼ）を使用するための材料および方法を提供する。操作されたメガヌクレアーゼ／ホーミングエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｉ－ＳｃｅＩまたはＩ－ＣｒｅＩ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、およびクラスター化され規則的に配置された短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）を含む、他の配列特異的ヌクレアーゼもまた、所望の植物材料を生成するために使用され得る。
低頻度切断エンドヌクレアーゼは、約１２～４０ｂｐ長（例えば、長さ１４～４０、１５～３６、または１６～３２、例えば、Ｂａｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：２３－２６，２０１２を参照されたい）の認識配列（標的配列）を有する核酸配列に対するエンドヌクレアーゼ活性を有する天然のまたは操作されたタンパク質であり得る。典型的な低頻度切断エンドヌクレアーゼは、それらの認識部位の内部で切断を引き起こし、３’ＯＨまたは５’ＯＨオーバーハングを有する４ヌクレオチド（ｎｔ）の互い違いの切断を残す。いくつかの実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、例えば、野生型またはバリアントホーミングエンドヌクレアーゼ（例えば、ドデカペプチドファミリーに属するホーミングエンドヌクレアーゼ（ＷＯ２００４／０６７７３３３６を参照されたい）であり得る。別の型の低頻度切断エンドヌクレアーゼは、本明細書において「Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステム」と称される。このシステムは、細菌Ｃａｓ９ファミリーからのエンドヌクレアーゼと、当該エンドヌクレアーゼを一般に２０塩基対のＤＮＡ標的配列に誘導する一本鎖ガイドＲＮＡとの併用によって特徴付けられる。このＤＮＡ標的は、一般に、Ｃａｓ９によって認識されるいわゆるＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列モチーフ（ＮＧＧまたはＮＡＧ）の上流のゲノムに位置するように選択される。ガイドＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）（これは、一般に、一本鎖ＲＮＡである）は、生細胞中に導入されて、Ｃａｓ９に切断および特異性を付与する。これは、ＰＡＭの上流のゲノムにおける所望の２０ｂｐの配列と一致するように設計された合成ＲＮＡである。植物におけるＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲの使用は、Ｂｅｌｈａｊ ｅｔ ａｌ．（２０１３）（参照により組み込まれる）によって概説されている。いくつかの実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメインと、切断活性を有する触媒ドメインとを含有する融合タンパク質であり得る。ＴＡＬＥヌクレアーゼおよびＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインの、エンドヌクレアーゼであるＦｏｋＩの触媒ドメインとの融合物の例である。特別注文のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮ（商標）の商品名の下で市販されている（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）。転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターの特異性は、エフェクター可変反復に依存する。多型は、主に反復位置１２および１３に存在し、これは、本明細書において反復可変二残基（ＲＶＤ）と称される。
ＴＡＬエフェクターのＲＶＤは、その標的部位におけるヌクレオチドに、直接的で直線的な様式で、１つのヌクレオチドに対して１つのＲＶＤで、いくらかの縮重を有して、見かけ上の文脈依存なしで対応する。タンパク質－ＤＮＡ認識のためのこの機構は、新たな標的特異的ＴＡＬエフェクターのための標的部位予測、ならびに選択された部位に対する結合特異性を有する新たなＴＡＬエフェクターの標的部位選択および操作を可能にする。
ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを、エンドヌクレアーゼ配列などの他の配列に融合させ、特異的な選択されたＤＮＡ配列を標的とするキメラエンドヌクレアーゼをもたらし、標的化された配列でのまたはその付近でのＤＮＡのその後の切断を導き得る。ＤＮＡにおけるそのような切断（二本鎖切断）は、例えば、ＮＨＥＪまたは相同組換えを介して野生型ＤＮＡ配列中に変異を誘発し得る。いくつかの場合では、ＴＡＬＥヌクレアーゼを使用して、複雑なゲノムにおける部位特異的変異誘発を促進し、高い精度および高い効率で遺伝子機能をノックアウトするかまたはそうでなければ変化させ得る。本明細書に記載されるように、Ｇ．ｍａｘ ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子を標的とするＴＡＬＥヌクレアーゼを使用して、内因性遺伝子を変異誘発し、ＳＡＣＰＤ－Ｃの検出可能な発現を有しない植物または植物組織をもたらし得る。いくつかのエンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）がダイマーとして機能するという事実は、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼの標的特異性を増強するために使用され得る。例えば、いくつかの場合では、異なるＤＮＡ配列（例えば、図４に示される標的配列、配列番号１６および１７、１９および２０、２２および２３、２５および２６、２８および２９、３１および３２、３４および３５、３７および３８、４０および４１、４３および４４、ならびに４６および４７）を標的とするＴＡＬＥヌクレアーゼモノマーの対が使用され得る。プロセスにおいて有用な関連する配列には、開示される配列の「機能的バリアント」が含まれる。機能的バリアントには、例えば、１つ以上のヌクレオチド置換、欠失または挿入を有する配列が含まれ、ここで、バリアントは、所望の活性を保持している。機能的バリアントは、当業者に利用可能ないくつかの方法のうちのいずれかによって、例えば、部位特異的変異誘発、誘発変異、対立遺伝子バリアントとして同定、制限酵素の使用を通した切断などによって作製され得る。
２つのＴＡＬＥヌクレアーゼ認識部位が近接している場合、不活性モノマーは、ＤＮＡを切断する機能的酵素を作製するように集合し得る。ヌクレアーゼを活性化するためにＤＮＡ結合を必要とすることによって、高度に部位特異的な制限酵素が作製され得る。内因性標的配列を選択し、そのような配列を標的とするＴＡＬＥヌクレアーゼを生成するための方法は、他所に記載されているように行われ得る。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．ＵＳ２０１１／０１４５９４０Ａ１（２０１１年６月）（参照により組み込まれる）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼ認識部位を特異的に同定するソフトウェア。
本開示の方法は、低頻度切断エンドヌクレアーゼ（例えば、ＴＡＬＥヌクレアーゼ）を使用して、１つ以上の内因性遺伝子における変異を有するダイズ植物、植物細胞、または植物部分を生成することを含む。例えば、選択されたＳＡＣＰＤ－Ｃ配列（例えば、表２に示されるＳＡＣＰＤ－Ｃ配列、「ｈｉｔＳｅｑ」（図４、すなわち、配列番号１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、もしくは４５、または表２中の配列に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列）を標的とするＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸が、植物細胞（例えば、プロトプラスト）中に形質転換され得、そこでそれらは発現され得る。いくつかの場合では、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼタンパク質が、植物細胞（例えば、プロトプラスト）中に導入され得る。その後、細胞、または細胞から生成された植物細胞株もしくは植物部分を、例えば、上記のような発現レベルを検出するための核酸ベースのアッセイもしくはタンパク質ベースのアッセイを通じて、またはゲノム遺伝子座における変異を検出するための核酸ベースのアッセイ（例えば、ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンシング、もしくはＰＣＲおよびそれに続くＴ７Ｅ１アッセイ）を使用して分析して、変異が標的部位（複数可）に導入されているかどうかを決定し得る。Ｔ７Ｅ１アッセイにおいて、ゲノムＤＮＡを、プールされたカルスから単離し得、ＳＡＣＰＤ－ＣのためのＴＡＬＥヌクレアーゼ認識部位に隣接する配列をＰＣＲ増幅し得る。次いで、増幅産物を、変性および再アニールさせ得る。再アニールさせられたフラグメントがヘテロ二重鎖を形成する場合、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩは、ミスマッチの部位で切断する。消化された産物を、ゲル電気泳動によって可視化して、ＴＡＬＥヌクレアーゼの変異誘発活性を定量化し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、機能的ＳＡＣＰＤ－Ｃ対立遺伝子を有するダイズ植物細胞（例えば、プロトプラスト）の集団を、内因性ＳＡＣＰＤ－Ｃ配列を標的とする低頻度切断エンドヌクレアーゼと接触させることと、集団から、少なくとも１つのＳＡＣＰＤ－Ｃ対立遺伝子が不活性化されている細胞を選択することと、選択された細胞をダイズ植物に成長させることと、を含み得る。植物は、不活性化されたＳＡＣＰＤ－Ｃ対立遺伝子を含有しない対照ダイズ植物と比較して、上昇した飽和脂肪酸レベルを有する油を産生し得る。低頻度切断エンドヌクレアーゼは、低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、ベクターもしくはｍＲＮＡ）を介して、またはタンパク質として、細胞の集団中に導入され得る。いくつかの場合では、本明細書で提供される方法は、不活性化されたＳＡＣＰＤ－Ｃ対立遺伝子（複数可）を含有する植物細胞を培養して、１つ以上の植物系統を生成するステップを含み得る。加えて、またはあるいは、本明細書で提供される方法は、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子座の少なくとも一部を含有するゲノムＤＮＡを植物細胞から単離するステップを含み得る。
いくつかの実施形態では、配列特異的ヌクレアーゼをダイズ植物に送達するための方法には、配列特異的ヌクレアーゼをコードするＴ－ＤＮＡを用いた植物部分または植物細胞（例えば、葉、茎、葉柄、節間外植片、カルス、またはプロトプラスト）のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換、配列特異的ヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸を用いた植物部分または植物細胞の微粒子銃形質転換、および／あるいは精製された配列特異的ヌクレアーゼまたは配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）を用いた植物部分または植物細胞の細胞透過性ペプチド媒介性形質転換が含まれ得る。微粒子銃形質転換は微粒子銃を利用する。この方法は、ダイズを含む、様々な作物植物においてゲノム編集試薬を送達するために用いられている。微粒子銃は、金属粒子（例えば、金またはタングステン粒子）を使用した植物細胞中への核酸配列の直接的送達に基づく。システムは、タンパク質を送達するように適合され得る。送達される核酸配列は、ＤＮＡ（大きなＤＮＡフラグメントを含む）およびＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）であり得る。例としてＤＮＡを使用する場合、方法は、粒子をＤＮＡでコーティングすることと、植物組織および細胞壁を貫通する目的のために、コーティングされた粒子を植物組織に高速で撃つことと、を含み、それによって、いくつかの粒子は植物細胞の内側に留まるようになる。一旦細胞の内側に入ると、ＤＮＡは粒子から溶出し、一過性に発現されるかまたは宿主ゲノム中に安定に組み込まれるようになる。核酸配列の細胞への物理的送達は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍについて時おり遭遇する宿主範囲の制限を回避し、バイナリベクターの必要性はない。様々な組織および細胞型が、微粒子銃によって形質転換され得る。複数のプラスミドを、高頻度の同時形質転換で送達し得る。さらなる送達方法には、当該技術分野において標準的である方法に従う、昆虫ベクター、移植、またはＤＮＡ研磨（ＤＮＡ ａｂｒａｓｉｏｎ）が含まれる。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＳＡＣＰＤ－Ｃ対立遺伝子における変異を有するダイズ系統は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介性形質転換によって生成され得る。例えば、プロトプラストは、表面滅菌された葉から単離され、１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼをコードするプラスミドを用いてＰＥＧの存在下で形質転換され得る。形質転換効率は、ＹＦＰプラスミドなどの検出可能なマーカーの送達によってモニターされ得、これは、蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリーを使用して可視化され得る。ＰＥＧ媒介性形質転換の後、プロトプラストは、プロトプラスト培養の当業者に既知の方法および培地を使用して培養され得る。培養物中での好適な長さの時間の後、変異体として同定されたプロトプラスト由来のカルスは、増殖させられ、シュート誘導培地に移され、次いで（一旦根が形成されると）土壌に移され、種子生産のために成熟するまで成長させられ得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼのダイズ植物への送達は、一過性送達または宿主ゲノム中への安定的組み込みを通じて達成され得る。配列特異的ヌクレアーゼを一過性に送達するために、形質転換されたダイズ植物部分または植物細胞（上記の方法を使用して）を、選択薬剤を含有しない再生培地上に置き得、ダイズ植物を再生し得る。次いで、再生した植物をスクリーニングして、ヌクレアーゼ誘発性変異を含有するものを同定し得る。ゲノム操作試薬を宿主ゲノム中に安定に組み込むために、配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を、植物選択マーカーをコードする核酸と共に同時送達し得る。選択マーカーは、配列特異的ヌクレアーゼ（複数可）と同じベクター上に保持され得るか、または別個のベクターとして送達され得る。形質転換の後、ダイズ植物部分または植物細胞を適切な選択薬剤を含有する再生培地上に置き得、トランスジェニックダイズ植物を再生し得る。好ましい実施形態では、ダイズ植物は、導入遺伝子を含まない。
いくつかの実施形態では、配列特異的ヌクレアーゼ誘発性変異誘発効率を増加させるために、ヌクレアーゼを、本明細書に記載される送達方法（例えば、微粒子銃）を使用して、１つ以上のエキソヌクレアーゼタンパク質をコードするプラスミドと共に植物細胞に同時送達し得る。そのようなエキソヌクレアーゼには、ＴＲＥＸ２などの、エキソヌクレアーゼのＴＲＥＸ（治療的赤血球交換エキソヌクレアーゼ）ファミリーのメンバーが含まれるが、これらに限定されない。他のエキソヌクレアーゼもまた、本明細書で提供される方法において使用され得る。
本明細書で提供される方法において使用され得る別のゲノム操作ツールは、ＩＩ型原核生物ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され規則的に配置された短い回文反復）適応免疫系からのＲＮＡガイドＣａｓ９ヌクレアーゼに基づく。このシステムは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される短い配列モチーフに隣接するＤＮＡ配列の切断を可能にする。切断は、標的配列に相補的である特異的ｃｒＲＮＡを操作することによって達成される。ｃｒＲＮＡは、異種性に発現されるＣａｓ９エンドヌクレアーゼと生細胞中に会合する。ｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体において、二重のｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ構造は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを同族標的配列に方向付けるガイドＲＮＡとして作用する。ダイズＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子中に存在するＰＡＭモチーフは、その中にＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよびｃｒＲＮＡがトランスフェクトされ、次いで発現される、ダイズ植物細胞内で、変異を導入するかまたは１つ以上のＳＡＣＰＤ－Ｃ対立遺伝子を不活性化するための、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子に特異的なｃｒＲＮＡの設計を可能にする。したがって、いくつかの実施形態では、このアプローチを、本明細書に記載されるようなＳＡＣＰＤ－Ｃ変異体植物を得るために使用し得る。
植物遺伝子の発現は、植物遺伝子のゲノム配列またはコード配列を含む核酸配列のコピーを、植物における遺伝子の遺伝子座とは異なるゲノム遺伝子座に挿入することによって変化させられ得る。ゲノム配列またはコード配列のコピーは、プロモーターに作動可能に連結され、ここで、異なるゲノム遺伝子座は、転写活性を有する。挿入される配列は、シスジェニックまたは内因的であり得、植物から得られ得るか、または合成的に作製され得る。いくつかの場合では、本明細書で提供される方法は、元の内因性ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の標的化されたノックアウト、および別のゲノム遺伝子座で所望の発現プロファイルを提供するプロモーターに作動可能に連結されたシスジェニックＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子のコード配列を含むＳＡＣＰＤ－Ｃ発現カセットの挿入を含み得る。「作動可能に連結」により、それぞれのコード配列はプロモーターにインフレームで融合され、その結果、コード配列は忠実に転写、スプライシング、および翻訳される。カセットが挿入されるゲノム遺伝子座は、元の内因性ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子とは異なるゲノム内の位置であり得る。遺伝子座は、元の内因性ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子とは異なる染色体、または同じ染色体上にあり得る。好ましくは、挿入が内因性遺伝子と同じ染色体上にある場合、挿入のゲノム遺伝子座は、元の内因性ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子からのプロモーターの転写活性を捕えない。
プロモーターは、典型的には、転写が開始する点の上流の（一般に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための開始部位付近の）、ＤＮＡ分子の領域から構成される発現制御配列である。プロモーターは、転写を開始および調節するためのＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与する。プロモーターは、典型的には、少なくともコア（基本）プロモーターを含む。プロモーターはまた、上流エレメントなどの少なくとも１つの制御エレメントを含み得る。そのようなエレメントには、上流活性化領域（ＵＡＲ）および、任意選択で、合成上流エレメントなどのポリヌクレオチドの転写に影響を与える他のＤＮＡ配列が含まれる。方法において有用なプロモーターの選択は、達成しようとするる所望の発現の型に依存する。効率、選択性、誘導性、所望の発現レベル、および細胞または組織特異性を含むがこれらに限定されない因子。例えば、それぞれ、特定の組織、器官、および細胞型においてのみまたはそれらにおいて優勢に転写を付与する組織、器官、および細胞優先性プロモーターが使用され得る。いくつかの実施形態では、幹、柔組織、基本分裂組織、維管束、形成層、師部、皮層、茎頂端分裂組織、側枝分裂組織、根頂端分裂組織、側根分裂組織、葉原基、葉肉、または葉表皮などの栄養組織に特異的なプロモーターは、好適な調節領域であり得る。いくつかの実施形態では、種子において活性でないプロモーターが有用であり得る。プロモーターの他のクラスには、誘導性プロモーター、例えば、化学薬剤、発生刺激、または環境刺激などの外部刺激などの、誘導物質に応答して転写を付与するプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。プロモーターは、特定の組織、器官もしくは植物の他の部分に優先的に発現するプロモーターであり得るか、または特定の発生段階の間にもしくは特定の条件下で発現し得る。優先的発現へ言及されるときに、意味されるのは、他の植物組織よりも高いレベルでの特定の植物組織における発現である。
目的のプロモーターは、強いまたは弱い転写活性を有し得る。当業者は、プロモーター配列を、作動可能に連結された異種核酸分子の一定範囲の発現レベルを提供するように改変し得ることを理解する。一般に、「弱いプロモーター」によって、低レベルでのコード配列の発現を駆動するプロモーターが意図される。「低レベル」によって、約１／１０，０００転写物～約１／１００，０００転写物～約１／５００，０００転写物のレベルが意図される。逆に、強いプロモーターは、高レベルで、または約１／１０転写産物～約１／１００転写産物～約１／１，０００転写産物で、コード配列の発現を駆動する。転写レベルを増加させるために、エンハンサーがプロモーター領域との組み合わせで利用され得ることが認識される。
元の内因性ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子のノックアウト変異を用いて発現を変化させることは、すべてのＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子発現が、作動可能に連結されたプロモーターから制御されることをもたらし得る。ノックインされるＳＡＣＰＤ－Ｃのために、根粒特異的プロモーターが所望され得る。いくつかの場合では、方法は、所望の発現プロファイルと一致する内因性遺伝子を同定することと、内因性遺伝子の調節エレメントをクローニングすることと、を含む。例えば、根粒特異的ＳＡＣＰＤ－Ｃ発現のための発現カセットに含めるのに好適なプロモーターには、例えば、根粒特異的遺伝子Ｇｌｙｍａ０５ｇ０１３６０およびＧｌｙｍａ１３ｇ４４９７０のプロモーターが含まれ得る。配列番号２～５は、Ｇｌｙｍａ０５ｇ０１３６０およびＧｌｙｍａ１３ｇ４４９７０のためのプロモーターおよびターミネーター配列を示す。他の状況では、組織特異的、段階特異的または誘導性発現が所望され得る。
効率的な形質転換を提供する任意の方法が用いられ得る。例えば、植物細胞形質転換のための方法には、ＴｉまたはＲｉプラスミドの使用、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ＤＮＡ微粒子銃、リポソーム融合などが含まれる。多くの場合では、構築物を、一方または両方の側でＴ－ＤＮＡによって境界形成されるようにする、特に左および右の境界、より特定すると右の境界を有するようにすることが望ましい。これは、構築物がＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを形質転換ための様式として使用するときに特に有用であるが、Ｔ－ＤＮＡ境界は、他の形質転換様式についての使用を見出し得る。
一実施形態では、本明細書で提供される方法は、元の内因性ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の標的化されたノックアウト、および目的のプロモーター付近の遺伝子配列を有する遺伝子座へのＳＡＣＰＤ－Ｃ（ゲノムまたはＣＤＳ）の標的化された挿入を含み得る。元の内因性ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子をノックアウトすることは、すべてのＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子発現が、目的のプロモーターから制御されることをもたらし得る。好ましくは、プロモーターは、発生中の種子において活性でなく、例えば、根粒または根特異的プロモーターである。他の状況では、段階特異的または誘導性発現が所望され得る。いくつかの場合では、方法は、所望の発現プロファイルと一致する内因性遺伝子を同定することを含む。所望の発現特性を有する遺伝子を同定するための、いくつかの方法およびソフトウェアプログラムが利用可能である。これらには、ＲＮＡシーケンシング（全トランスクリプトームショットガンシーケンシング）が含まれるが、これに限定されない。一旦所望の発現プロファイルを有する遺伝子が同定されると、プロモーターによって発現される実際の遺伝子とは対照的に、プロモーター配列（通常、目的の遺伝子の上流または近傍にある）が、方法において使用される重要な構成要素であることが理解される。最後のステップは、同定されたプロモーターの転写活性を捕えるために必要とされるゲノム編集の特定の型を決定することである。
いくつかの場合では、本明細書で提供される方法は、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の種子特異的ノックアウトを含み得る。例えば、ジェミニウイルス配列は、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の内因性プロモーターを標的とし、発生中の種子において活性でないプロモーターで置換するための遺伝子ターゲティングベクターとして使用され得る。ジェミニウイルスは、環状の一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する植物ウイルスの大きなファミリーであり、その配列は、遺伝子ターゲティングベクターとして使用され得る。例えば、ジェミニウイルスゲノムは、標的遺伝子座に対する相同性の配列に隣接した所望の改変を含有するように操作され得る。いくつかの場合では、これは、非必須ジェミニウイルスヌクレオチド配列（例えば、ＣＰ配列）を、所望の修復テンプレートで置換することによって達成され得る。ジェミニウイルスの例としては、キャベツ葉巻ウイルス、トマトゴールデンモザイクウイルス（ｔｏｍａｔｏ ｇｏｌｄｅｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、マメ黄萎ウイルス、アフリカキャッサバモザイクウイルス、コムギ委縮ウイルス、オギ条斑マストレウイルス（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｔｒｅａｋ ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ）、タバコ黄萎ウイルス、トマト黄化葉巻ウイルス、マメゴールデンモザイクウイルス（ｂｅａｎ ｇｏｌｄｅｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、ビートカーリートップウイルス（ｂｅｅｔ ｃｕｒｌｙ ｔｏｐ ｖｉｒｕｓ）、トウモロコシ条斑ウイルス、およびトマトシュードカーリートップウイルス（ｔｏｍａｔｏ ｐｓｅｕｄｏ－ｃｕｒｌｙ ｔｏｐ ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。
したがって、修復テンプレートは、内因性ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子のプロモーター配列に対する相同性を含有する。典型的には、修復テンプレートは、標的の両側の内因性配列に相同な配列に隣接した、植物内の内因性標的配列を置換する核酸を含む。隣接する相同配列は、「相同アーム」と称され得る。この場合、内因性配列は、上記のプロモーター配列のうちの１つで置換される。修復テンプレート内で、隣接相同配列は、任意の好適な長さを有し得る。隣接相同配列に好適な長さは、所望の置換の長さに関連する。したがって、長さは、少なくとも約２５ｎｔであり得、７５０ｎｔ、またはそれ以上である配列を含み得る。いくつかの場合では、隣接相同配列は、８００ｎｔ、９００ｎｔより長くあり得、または１，０００ｎｔより長くあり得る。修復テンプレートおよびＤＮＡウイルスプラスミドは、当該技術分野において標準的である技術を使用して調製され得る。修復テンプレートを含有する構築物（複数可）は、例えば、微粒子銃を使用して、植物細胞に送達され得る。あるいは、修復テンプレートは、当該技術分野におおいて標準的である方法に従って、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換、昆虫ベクター、移植、またはＤＮＡ研磨を使用して送達され得る。
修復テンプレートに加えて、この方法は、特定のヌクレオチド配列を標的とし、その配列においてまたはその配列付近で二本鎖切断を生成するように特別注文され得るエンドヌクレアーゼを含む。そのような特別注文可能なエンドヌクレアーゼの例としては、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、およびＴＡＬＥヌクレアーゼ、ならびに上記のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが挙げられる。ＴＡＬＥヌクレアーゼと同様に、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素（Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよびｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド）をジェミニウイルス構築物中で細胞に送達し得る。
植物を修復テンプレートおよび関連するエンドヌクレアーゼを用いて感染またはトランスフェクトした後、任意の好適な方法を使用して、内因性ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の種子特異的ノックアウトが生じたかどうかを決定し得る。例えば、ＰＣＲベースの方法を使用して、ゲノム標的部位が修復テンプレート配列を含有しているかどうか、および／または正確な組換えが修復テンプレートの５’および３’末端で生じているかどうかを確認することもできる。
開示される戦略は、従来の育種を、上記の標的化されたアプローチと組み合わせ得る。ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子発現の標的化された遺伝子編集を、限定されないが、目的のダイズの任意の系統、種または栽培品種に対して行い得る。いくつかの実施形態では、標的化された遺伝子編集または他の遺伝子改変を、上昇した飽和油含量を有する油を産生するための特徴（例えば、遺伝的素因）をすでに持つ生殖質または他の植物組織において行い得る。
Ｂ．ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子発現変異体
本開示の実施形態は、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の発現を調節する１つ以上の変異を含むダイズ植物、植物部分、または植物細胞を特徴とする。１つ以上の変異は、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子のエンハンサー領域、プロモーター領域、ＵＴＲ領域（５’もしくは３’）、サイレンサー領域、または領域の組み合わせなどの、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の調節領域中にあり得る。Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子座に関連するゲノム配列は公開されている。例えば、ネイティブなダイズＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子、Ｇｌｙｍａ０５ｇ０８０６０の配列は、Ｓｏｙｂａｓｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｓｏｙｂａｓｅ．ｏｒｇ）からダウンロードされ得る。変異は、内因性ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子とは異なるゲノム遺伝子座にあり得る。例えば、天然に存在するＧ．ｍａｘ ＦＡＴＢ－１Ａヌクレオチド配列のコード配列（例えば、代表的な配列を（配列番号６）に示す）を、ゲノムの任意の遺伝子座に、または複数の遺伝子座に挿入し得、それによって、少なくとも２つの機能的ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子を提供し得る。コードするＣＤＳは、ネイティブなイントロンを含有せず、ネイティブなゲノム配列と同じポリペプチドをコードし、その結果、遺伝子の発現は植物においてまたは特定の組織において（例えば、発生中の種子において）上昇または増加させられる。したがって、いくつかの場合では、植物、細胞、植物部分、種子、および子孫は、１つ以上のダイズＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子から発現されるアシル－ＡＣＰチオエステラーゼの上昇したレベルを示す。
ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現を調節するための上記の遺伝子編集技術は、ＦＡＴＢ－１Ａの発現を増強するように改変され得る。１つ以上の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＦＡＴＢ－１Ａプロモーターの、過剰発現プロモーターでの標的化された置換を含み得る。プロモーターは、ネイティブなダイズプロモーターであり得、これは、βコングリシニンおよびレクチンをコードする遺伝子のプロモーターなどの種子特異的プロモーターであり得る。好適なプロモーターは、種子特異的遺伝子の発現プロファイルに基づいて選択され得る。いくつかの場合では、方法は、所望の発現プロファイルと一致する内因性遺伝子を同定することを含む。所望の発現特性を有する遺伝子を同定するための、いくつかの方法およびソフトウェアプログラムが利用可能である。これらには、ＲＮＡシーケンシング（全トランスクリプトームショットガンシーケンシング）が含まれるが、これに限定されない。一旦所望の発現プロファイルを有する遺伝子が同定されると、プロモーターによって発現される実際の遺伝子とは対照的に、プロモーター配列（通常、目的の遺伝子の上流または近傍にある）が、方法において使用される重要な構成要素であることが理解される。最後のステップは、同定されたプロモーターの転写活性を捕えるために必要とされるゲノム編集の特定の型を決定することである。好適な種子特異的プロモーターは、特定の発生段階で発現を駆動するプロモーターであり得る。好ましくは、プロモーターは、発生中の種子における高発現を提供する。より好ましくは、種子、例えば、発生中の種子における高発現は、他の組織における発現なしまたは非常に低いレベルの発現と組み合わされる。いくつかの場合では、プロモーターは、脂肪酸デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子からのものである。例えば、実施例に記載されるように、ＧｍＦＡＤ２Ａ（Ｇｌｙｍａ１０ｇ４２４７０）およびＧｍＦＡＤ２Ｂ（Ｇｌｙｍａ２０ｇ２４５３０）の発現プロファイルは、ＦＡＴＢ－１Ａの過剰発現を駆動するために好適な候補として発明者らによって同定されている。したがって、ジェミニウイルスを、内因性ＦＡＴＢ－１Ａプロモーターを標的とし、内因性ＦＡＤ２ＡまたはＦＡＤ２Ｂ遺伝子のプロモーターで置換するように設計し得る。ＦＡＴＢ－１Ａ ５’－ＵＴＲ領域を標的とするＴＡＬＥＮは、５’－ＵＴＲ配列に基づいて設計され得る。例示的なＴＡＬＥＮを、配列番号４９および５０、５２および５３、５５および５６、５８および５９、ならびに６１および６２を示す図５（表３）に示す。
いくつかの場合では、ダイズＦＡＴＢ－１Ａの発現を増強する変異が非標的化（ｕｎｔａｒｇｅｔ）され得る。例えば、強いプロモーターまたは種子プロモーターに作動可能に連結されたダイズＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子のコード配列を含む発現カセットを、任意のゲノム遺伝子座に挿入し得る（例えば、微粒子銃方法によって）。好適なシスジェニックプロモーターを、所望の発現プロファイルに基づいて選択し得る。例えば、プロモーターを、発生中の種子における高発現、および他の組織における発現なしまたは低レベルの発現に基づいて選択し得る。いくつかの場合では、作動可能に連結されたプロモーターは、配列番号７または８に示される配列であり得る。カセットは、ＧｍＦＡＤ２Ａ（Ｇｌｙｍａ１０ｇ４２４７０）またはＧｍＦＡＤ２Ｂ（Ｇｌｙｍａ２０ｇ２４５３０）の終結配列を含み得る（それぞれ、配列番号９および１０）。
発現の増加は、対応する対照植物、植物細胞、または植物もしくは植物細胞の集団と比較しての、総発現レベルの任意の程度の増加（例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または１００％以上さえの増加）を包含する。例えば、発現は、対照植物、植物細胞、またはその集団と比較して、約２倍、約５倍、または約１０倍増加し得る。発現レベルは、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ノーザンブロッティング、ドットブロットハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、核ランオンおよび／または核ランオフ、ＲＮａｓｅプロテクションなどの方法、あるいはＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、およびウエスタンブロッティングなどの免疫学的および酵素的方法を使用して測定され得る。
開示される戦略は、従来の育種を、上記の標的化されたアプローチと組み合わせ得る。ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子発現の標的化された遺伝子編集を、限定されないが、目的のダイズの任意の系統、種または栽培品種に対して行い得る。いくつかの実施形態では、標的化された遺伝子編集または他の遺伝子改変を、上昇した飽和油含量を有する油を産生するための特徴（例えば、遺伝的素因）をすでに持つ生殖質または他の植物組織において行い得る。
Ｃ．積み重ねられた形質
ＳＡＣＰＤ－ＣおよびＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の両方の発現を調節する変異を有するダイズ植物、植物部分、または植物細胞を特徴とする実施形態であって、当該植物、植物部分、または植物細胞は、１つ以上の変異を欠く対応するダイズ植物、植物部分、または植物細胞から産生された油と比較して増加した飽和脂肪酸含有量を有する油を産生する、実施形態は、本開示の範囲内である。特に、本開示は、産生される油の飽和脂肪酸含有量を増加させることに向けられた１つより多い変異を有する植物系統を特徴とする。いくつかの場合では、植物系統は、ダイズステアロイル－ＡＣＰデサチュラーゼの組織特異的発現および／またはダイズステアロイル－ＡＣＰチオエステラーゼの過剰発現と共同して１つ以上の他の目的の配列の転写または転写および翻訳を提供し得る。
併用効果のために形質転換された植物を提供することは、複数の別個の核酸構築物または形質転換事象の使用を含み得る。例えば、上記のような複数の構築物は、得られる産物がそのゲノム中に組み込まれた両方の特徴を有する植物である限り、２つの転写カセットを単一の形質転換ベクター中に含めることによるそのような形質の導入、２つの発現構築物の同時形質転換、第２の遺伝子のための発現構築物を用いた、１つの構築物を発現する植物組織を使用した再形質転換、または伝統的な植物育種方法を介してトランスジェニック植物を交配させることによる、を含む同じかまたは異なる方法によって植物細胞中に導入され得る。いくつかの場合では、ダイズ植物を、上記の構築物を使用して形質転換し、再生する。所望の配列を持つ再生した植物は、遺伝子編集プラスミドを除去し、標的化された変異を保持するために自家受粉（ｓｅｌｆ）される。次いで、特定の変異を有する得られたヌル分離個体植物の系統を交配させて、併用効果を示す植物種子または植物を提供し得る。例えば、種子特異的ＳＡＣＰＤ－Ｃノックアウト系統のヌル分離個体を、種子特異的ＦＡＴＢ－１Ａ過剰発現系統のヌル分離個体と交配させ得、遍在性ノックアウトＳＡＣＰＤ－Ｃ系統のヌル分離個体を、ＳＡＣＰＤ－ＣおよびＦＡＴＢ－１Ａの両方を種子特異的な方法で過剰発現するヌル分離個体と交配させ得る。
アプローチの任意の組み合わせが、組み合わせのＧｍＳＡＣＰＤ－ＣおよびＧｍＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子調節を達成するために利用され得る。例えば、組み合わせの調節は、１つ以上のＳＡＣＰＤ－Ｃ対立遺伝子のＴＡＬＥＮ媒介性ノックアウト、ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃのコード配列に作動可能に連結された根粒プロモーターを含む第１の直鎖状シスジェニックカセットの挿入、およびＧｍＦＡＴＢ－１Ａのコード配列に作動可能に連結された種子プロモーターを含む第２の直鎖状シスジェニックカセットの挿入を含み得る。いくつかの場合では、第１の直鎖状シスジェニックカセットは、根粒Ｇｌｙｍａ１３ｇ４４９７０プロモーター－ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｇｌｙｍａ１３ｇ４４９７０ターミネーターを含む、配列番号１３に示される配列を有し、第２のシスジェニックカセットは、種子ＦＡＤ２Ａプロモーター－ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－ＦＡＤ２Ａターミネーターを含む、配列番号１４に示される配列を有する。
１つ以上のダイズ植物は、個々の変異誘発された植物細胞（およびそれから成長した植物）から得られ得、植物のうちの少なくとも１つは、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子またはＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の発現を調節する変異を含有するとして同定され得る。共通の遺伝子プールを共有するダイズ植物の集団およびが提供される。例えば、「Ｍ０」は、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼに曝露された植物細胞（およびそれから成長した植物）を指すために使用され得、一方、「Ｍ１」は、自家受粉されたＭ０植物によって産生された種子、およびそのような種子から成長した植物を指す。「Ｍ２」は、自家受粉されたＭｉ植物の子孫（種子および植物）であり、「Ｍ３」は、自家受粉されたＭ２植物の子孫であり、「Ｍ４」、「Ｍ５」、「Ｍ６」などは、各々、前の世代の自家受粉された植物の子孫である。本明細書で使用される「自家受粉された（ｓｅｌｆｅｄ）」という用語は、自家受粉された（ｓｅｌｆ－ｐｏｌｌｉｎａｔｅｄ）を意味する。
いくつかの場合では、植物のうちの少なくとも１つは、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子における変異を含有するとして同定され得、植物のうちの少なくとも１つは、ノックインされたＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子を含有するとして同定され得る。変異体対立遺伝子を保有するダイズ植物は、新規で有用な系統および品種を作製するための植物育種プログラムにおいて使用され得る。したがって、いくつかの実施形態では、内因性ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子における変異を含有するダイズ植物は、発生中の種子において発現を駆動しないプロモーターに作動可能に連結されたＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の少なくとも１つの挿入を含有する第２のダイズ植物と交配され、その中に遺伝子変異が存在する交配種の子孫が同定される。他の実施形態では、ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現を調節する少なくとも１つの変異と、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の発現を調節する少なくとも１つの変異とを含有するダイズ植物は、第２のダイズ植物と交配され、その中に遺伝子変異が存在する交配種の子孫が同定される。第２のダイズ植物は、それが交配される植物と同じ変異、異なる変異を含有し得るか、またはＳＡＣＰＤ－ＣもしくはＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子発現に関して野生型であり得ることが理解される。
育種は、既知の手順を介して実施され得る。ＤＮＡフィンガープリンティング、ＳＮＰまたは類似の技術を、マーカー支援選抜（ＭＡＳ）育種プログラムにおいて使用して、ＳＡＣＰＤ－ＣまたはＦＡＴＢ－１Ａ対立遺伝子の発現を調節する変異を他のダイズ植物に移し得るかまたは育種し得る。例えば、育種者は、農学的に望ましい遺伝子型を有する変異体対立遺伝子を含有する遺伝子型の交雑から分離集団を作製し得る。Ｆ２世代または戻し交配世代の植物は、変異体配列から開発されたマーカーまたはそのフラグメントを使用してスクリーニングされ得る。変異を持つとして同定された植物を、戻し交配させるか、または自家受粉させて、スクリーニングされる第２の集団を作製すし得る。予想される遺伝パターンまたは使用されるＭＡＳ技術に応じて、所望の個々の植物の同定を支援するために、戻し交配の各サイクルの前に、選択された植物を自家受粉させる必要があり得る。反復親の所望の表現型が回復するまで、戻し交配または他の育種手順が繰り返され得る。
成功した交配は、稔性でありかつ、所望であれば、親の１つと戻し交配され得るＦ１植物をもたらす。いくつかの実施形態では、Ｆ２世代の植物集団を、ＳＡＣＰＤ－ＣおよびＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子発現についてスクリーニングし、例えば、標準的な方法に従って、発生中の種子においてＳＡＣＰＤ－Ｃを発現できず、変異に起因してＦＡＴＢ－１Ａを過剰発現する植物を同定する。次いで、選択された植物を、親のうちの１つと交配させ、第１戻し交配（ＢＣ１）世代植物を自家受粉させて、ＢＣ１Ｆ２集団を産生し、これをバリアント遺伝子発現について再びスクリーニングする。戻し交配、自家受粉、およびスクリーニングのプロセスを、例えば、最終スクリーニングが、稔性でありかつ反復親と合理的に類似した植物を産生するまで、少なくとも４回繰り返す。この植物を、所望であれば、自家受粉し得、その後、子孫を再びスクリーニングして、植物が発生中の種子におけるＳＡＣＰＤ－Ｃ発現を欠き、ＦＡＴＢ－１Ａを過剰発現することを確認し得る。選択された植物の細胞遺伝学的分析を任意選択で行って、染色体補完および染色体対合関係を確認し得る。選択された植物の育種者の種子は、例えば、ステアリン酸およびパルミチン酸を含む、飽和脂肪酸のレベルを決定するための油の分析を含む、標準的な方法を使用して産生され得る。
第１の変異体ダイズ親と第２の野生型ダイズ親との間の交配から得られた元のＦ１ハイブリッドが、変異体ダイズ親に交雑または戻し交配される状況では、戻し交配の子孫を自家受粉させて、ＢＣ１Ｆ２世代を作製し得、これを変異についてスクリーニングする。
本明細書に記載される変異体ダイズ植物を使用した植物育種プログラムの結果は、新規で有用な系統および品種であり得る。本明細書で使用される場合、「品種」という用語は、それらを同じ種の他の植物から分ける不変の特徴を共有する植物の集団を指す。品種は、しばしば（常にではないが）市販されている。１つ以上の特有の形質を持つ一方で、品種は、その品種内の個体間の非常に小さな全体的な変動によってさらに特徴付けられ得る。「純系」品種は、数世代の自家受粉および選択、または組織もしくは細胞培養技術を使用した単一の親からの栄養繁殖によって作製され得る。品種は、本質的に、別の系統または品種に由来し得る。品種は、ａ）それが、初期品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせから生じる本質的特徴の発現を保持しながら、初期品種に優勢に由来する、または初期品種に優勢に由来する品種に由来する場合、ｂ）それが、初期品種から明確に区別可能である場合、およびｃ）誘導の行為から生じる差異を除いて、それが、初期品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせから生じる本質的特徴の発現において初期品種に一致する場合、初期品種に「本質的に由来する」。本質的に由来する品種は、例えば、天然のもしくは誘発された変異体の選択、体細胞繁殖系バリアント、初期品種の植物からのバリアント個体、戻し交配、または形質転換によって得られ得る。品種と区別される「系統」は、ほとんどの場合、例えば植物研究において、非商業的に使用される植物の群を示す。系統は、典型的には、１つ以上の目的の形質についての個体間での全体的な変動をほとんど示さないが、他の形質については個体間でいくらかの変動が存在し得る。
本明細書で提供される方法は、野生型植物からの対応する植物部分または産物と比較して、増加した飽和脂肪酸含有量を有する植物部分（例えば、種子）または植物産物（例えば、油）を産生するために使用され得る。植物部分または植物産物の脂肪酸含有量は、標準的な方法を使用して評価され得る。
Ｄ．高飽和脂肪酸ダイズおよびその使用
本明細書に記載される変異は、１つ以上の変異を欠く対応するダイズ植物、植物部分、または植物細胞から産生された油と比較して増加した飽和脂肪酸含有量を有する油を産生し得るダイズ植物、植物部分、または植物細胞を提供する。
本開示の１つ以上の実施形態では、変異は、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％および最大約８０％の総飽和脂肪酸含有量を含む油を産生し得るダイズ植物、植物部分、または植物細胞をもたらす。総飽和脂肪酸含有量は、好ましくは、約２０％～約５０％の範囲内である。本明細書で示される脂肪酸のパーセンテージは、別段指定されない限り、重量ベースである。ダイズ植物によって産生されたダイズ種子から抽出された油は、より低い飽和脂肪酸含有量を有する、標準的なダイズ種子から抽出された油と比較して増加した安定性および優れた調理特性を持つ。さらに、油は、商品ダイズ油よりも高いレベルの固形を有し、これにより、マーガリン、ダイズ粉、豆乳、およびショートニングなどの食品製品の調製のためにより好ましい材料となる。油のエステル交換は、固形分、および食品製品の調製における油の有用性をさらに高め得る。より高い飽和脂肪酸含有量は、例えば、パーム油画分またはカカオバターの代用品を提供し得る。
より高い飽和脂肪酸含有量は、ステアリン酸のレベルの増加およびパルミチン酸のレベルの増加のうちの１つ以上の結果であり得る。例えば、本開示の実施形態は、総脂肪酸組成の少なくとも約１０％、例えば、約１０～２４％のステアリン酸含有量を有するダイズ油、総脂肪酸組成の少なくとも約１０％、例えば、約１０～２４％のパルミチン酸含有量を有するダイズ油、およびそれらの組み合わせを含む。例えば、得られるパルミチン酸濃度は、総脂肪酸組成の少なくとも約１４％であり得、一方、得られるステアリン酸濃度は、総脂肪酸組成の少なくとも約１０％であるか、または、本発明のダイズ系統のパルミチン酸含有量は、少なくとも約１０％であり得、一方、ステアリン酸含有量は、少なくとも約２０％以上である。特定の用途は、一般に、所望される総飽和脂肪酸含有量を決定する。例えば、パルミチン酸およびステアリン酸含有量の相対的なレベルを変動させて、特定の酸含有量を用途の特定の必要性に合わせ得る。
本開示の実施形態は、所望のパルミチン酸およびステアリン酸含有量を有し、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸の様々な含有量を有するダイズを含む。これらの脂肪酸および他のもののレベルは、特定の用途のために調節され得る。例えば、本明細書に記載されるダイズ植物、植物部分、および植物細胞を、所望され得る他の脂肪酸を含めること（遺伝子変化または他の手段による）によって変化させることは、本発明の範囲内である。
ダイズおよびその抽出された油は、様々な用途において使用され得る。例えば、本明細書に記載されるダイズ油は、部分的にまたは完全に、パーム油、カカオバター、または他の外国産油に取って代わるように使用され得る。ダイズ油は、他の飽和脂肪および／またはトリアシルグリセロールのエステル交換との費用効果がある混合のための原料として作用し得る。食品用途には、例えば、マーガリンおよびショートニング、ならびにこれらの成分を含有する製品（例えば、焼き菓子および菓子）が含まれる。高い飽和脂肪酸含有量はまた、スキンケア組成物のために有利である。例えば、パルミチン酸は、天然油の再生を促進し、皮膚がその保護バリアを保持するのを助ける。ステアリン酸は、主に潤滑剤として作用する。それは、肌が適正な水分バランスを保持することを可能にする。したがって、抽出されたダイズ油は、毛髪、皮膚および爪に容易に塗布され得る、クリーム、ローション、およびスプレーオイルを含む局所組成物に含まれ得る。
高飽和脂肪酸ダイズは、豆腐および豆乳などの、ダイズベースの食品製品の製造において使用され得る。さらに、ダイズは、キャンディー、グレイビー、ソース、冷凍デザート、パスタ、肉製品、および焼き菓子において使用され得る、全脂ダイズ粉に粉砕され得る。ダイズ粉は、食感に影響を与えることなしに焼き菓子のタンパク質含有量を増加させるために使用され得る。
以下の実施例は、上記の発明を例示することを意図しており、その範囲を狭めるように解釈されるべきではない。当業者は、本発明が実施され得る多くの他の方法を審査官が示唆することを容易に認識する。本発明の範囲内に留まりながら、多数の変形および改変がなされ得る。
Ｉ．ＳＡＣＰＤ遺伝子の発現プロファイル
ダイズ油中のステアリン酸含有量について同定された変動の大部分の根源は、Δ９－ステアロイル－アシルキャリアタンパク質デサチュラーゼ（ＳＡＣＰＤ）遺伝子における変異を伴う。これらの酵素は、プラスチドにおいてステアロイル－ＡＣＰをオレオイル－ＡＣＰに不飽和化する。ダイズにおいて、ＳＡＣＰＤの３つのアイソフォームが同定されている。アイソフォームのうちの２つ、ＳＡＣＰＤ－ＡおよびＳＡＣＰＤ－Ｂは、栄養組織および生殖組織の両方において活性であり、一方、第３のもの、ＳＡＣＰＤ－Ｃ（Ｇｌｙｍａ１４ｇ２７９９０）は、主に発生中の種子および根粒において発現される。ダイズにおいて、化学的に変異誘発されたＳＡＣＰＤ－Ｃ変異体系統は、６～１４％の範囲のステアリン酸含有量を有する油を産生するとして報告されており、これは、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２栽培品種の野生型種子に含有されるレベルの１．５～３倍である。候補遺伝子のシーケンシングは、これらの系統のすべてが、ステアリン酸のオレイン酸への変換に必要とされるＳＡＣＰＤ－Ｃをコードする遺伝子におけるアミノ酸置換を保有していることを明らかにした。さらなる研究はまた、ＳＡＣＰＤ－Ｃ変異体は、窒素固定根粒および葉構造におけるいくつかの欠損を有することを明らかにした。
ＩＩ．ＦａｔＡおよびＦａｔＢ遺伝子の発現プロファイル
脂肪酸生合成経路における最後のステップとして、アシル－アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）チオエステラーゼは、細胞質ゾルにおけるさらなる代謝のためにプラスチドを離れるアシル基の鎖長を決定する。高等植物アシル－ＡＣＰチオエステラーゼは、アミノ酸配列に基づいて２つの異なるクラスに分けられ得る。ＦａｔＡおよびＦａｔＢと称され、それぞれ、ＦａｔＡチオエステラーゼは主に不飽和１６：１および１８：１－ＡＣＰを加水分解し、ＦａｔＢはＣ８～Ｃ１６飽和アシル－ＡＣＰのためのものである。
ＩＩＩ．ＧｍＳＡＣＰＤの発現の調節
ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子を完全に不活性化またはノックアウトするために（別名、「偏在性ノックアウト」）、配列特異的ヌクレアーゼを設計した。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ対を、第１エクソン上のＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃを標的とするように設計した（表２を示す図４）。
ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼを、ダイズ細胞における発現のために選択する。これらのＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの活性を、ダイズにおけるそれらの内因性標的部位において評価した。各ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼを、誘導性プロモーターの下流でＴ－ＤＮＡベクター中にクローニングし、次いで、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの株中に形質転換し、次いで、これを使用して、ダイズの半子葉を感染させ、トランスジェニック毛状根を作製する。感染の３週間後に、毛状根を採取し、液体窒素中で凍結し、ゲノムＤＮＡを標準的な方法を使用して調製した。
ＮＨＥＪ媒介性変異が、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼによってダイズゲノム中の標的部位において作製されるかどうかを決定するために、９個の毛状根からのＤＮＡをＰＣＲ濃縮アッセイに供する。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ誘発性ＮＨＥＪ変異を有する試料は、スペーサー配列内の制限酵素部位を欠き得、これは、ゲル上で完全長バンドとして見える未消化ＰＣＲ産物をもたらす。したがって、未消化ＰＣＲ産物が、ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子について観察される。
未消化ＰＣＲ産物をクローニングし、シーケンシングして、それらがＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ誘発性変異を含有することを検証する。市販のクローニングキットを製造業者の説明書に従って使用してＰＣＲ産物をクローニングする。所与の未消化フラグメントに由来する個々のクローンをシーケンシングし、ＤＮＡ配列を野生型ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子配列と整列させる。
不活性化またはノックアウトされたＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子を含む植物を成長させて、根粒形成表現型を評価する。
不活性化またはノックアウトされたＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子を含む根または根粒組織におけるＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子発現をレスキューするために使用され得るシスジェニック発現カセットを提供するために、ダイズ発現データベースＳｏｙＢａｓｅを検索して、２つの根粒特異的遺伝子を同定した。Ｇｌｙｍａ０５ｇ０１３６０およびＧｌｙｍａ１３ｇ４４９７０を、それらの発現プロファイルに基づいて候補として選択した。両方の遺伝子は、ＳＡＣＰＤ－Ｃのように根粒および根において高度に発現され、一方、発生中の種子においては発現を示さないかまたは非常に低いレベルの発現を示す（図１および３Ａ～Ｂ）。配列番号２～５は、Ｇｌｙｍａ０５ｇ０１３６０およびＧｌｙｍａ１３ｇ４４９７０のためのそれぞれのプロモーターおよびターミネーター配列を示す。ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃに作動可能に連結された根粒プロモーターを含む直鎖状シスジェニックカセットをクローニングし、微粒子銃方法を使用してダイズ植物に導入する。
ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃの種子特異的ノックアウトを提供するために、内因性ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃプロモーターを、根粒特異的プロモーターで置換するようにジェミニウイルスを設計する。。構築物を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換を介してダイズ植物に送達する。
ＩＶ．ＧｍＦＡＴＢ－１Ａの発現の調節
発生中の種子におけるＧｍＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の過剰発現を、以下の方法のうちの１つ以上を使用して達成する。
２つの種子特異的遺伝子ＧｍＦＡＤ２Ａ（Ｇｌｙｍａ１０ｇ４２４７０）およびＧｍＦＡＤ２Ｂ（Ｇｌｙｍａ２０ｇ２４５３０）を、発現プロファイル（すなわち、発生中の種子において高度に発現され、他の組織においては発現なしまたは非常に低いレベルの発現（図２および３Ａ～Ｂ）に基づいて種子プロモーターの候補として選択した。配列番号６は、ＧｍＦＡＴＢ－１Ａのコード配列を示す。配列番号７～１０は、ＧｍＦＡＤ２Ａ（Ｇｌｙｍａ１０ｇ４２４７０）およびＧｍＦＡＤ２Ｂ（Ｇｌｙｍａ２０ｇ２４５３０）のためのプロモーターおよびターミネーター配列を示す。
ＧｍＦＡＴＢ－１Ａの発現の増強を提供するために、ＧｍＦＡＴＢ－１Ａに作動可能に連結された種子プロモーターを含む直鎖状シスジェニックカセットを合成する。シスジェニックカセットを、微粒子銃同時送達を介して、直鎖状または環状選択マーカー遺伝子と一緒にダイズ植物に導入する。
並行して、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の過剰発現を駆動するための種子特異的プロモーターノックインを提供するために、内因性ＧｍＦＡＴＢ－１Ａプロモーターを、内因性ＧｍＦＡＤ２ＡまたはＧｍＦＡＤ２Ｂの発現を駆動するプロモーター配列で置換するようにジェミニウイルスを設計する。ＧｍＦＡＤ２ＡおよびＧｍＦＡＤ２Ｂのコード配列を、それぞれ配列番号１１および１２に提供する。内因性ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子座の上流にＧｍＦＡＤ２Ａ（またはＧｍＦＡＤ２Ｂ）を標的化するＴＡＬＥＮを、第１エクソン上に設計する。構築物を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換を介してダイズ植物に送達する。
Ｖ．ＧｍＳＡＣＰＤ－ＣおよびＧｍＦＡＴＢ－１Ａの両方の発現の調節（アプローチ２Ａ）
ｇｍＳＡＣＰＤ－ＣのＴＡＬＥＮ媒介性ノックアウトのための技術を、Ｇｌｙｍａ１３ｇ４４９７０ターミネーターを有するＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃコード配列に作動可能に連結されたＧｌｙｍａ１３ｇ４４９７０プロモーターを有する直鎖状シスジェニックカセット、およびＦＡＤ２Ａターミネーターを有するＧｍＦＡＴＢ－１Ａに作動可能に連結されたＦＡＤ２Ａプロモーターを有する直鎖状シスジェニックカセットの導入と組み合わせる。
ＶＩ．脂肪酸組成分析
脂肪酸含有量を、上記の構築物のうちの１つ以上を用いて形質転換したダイズ系統の種子から分析する。ノックアウト、シスジェニックおよび対照ダイズ系統の各々の１～５個の種子を、油抽出のために粉砕する。粉砕したダイズ種子からの油を抽出し、メチルエステルに誘導体化する。得られた脂肪酸メチルエステルを、ヘキサン中で抽出し、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分離する。
種子油からの脂肪酸組成分析の結果は、ステアレート（Ｃ１８：０）レベルおよび／またはパルミテートレベル（Ｃ１６：０）が、非形質転換対照植物の種子油から得られたレベルを上回って有意に増加していることを示す。総飽和脂肪酸レベルは、約２０～４０％に増加している。
ＶＩＩ．標的化された変異によるＳＡＣＰＤ－Ｃの発現の低下（アプローチ１Ａ）
ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼが内因性標的部位において標的化された改変を作製したことの検証の後、ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃにおける変異を有するダイズ植物を作製するために実験を行った。これを達成するために、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ対を細菌ベクター中にクローニングし、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換によって、または微粒子銃を使用することによって、植物細胞に送達した。
ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼを発現するトランスジェニックダイズ植物を、標準的な形質転換プロトコルを使用して生成した。ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０３ ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードする配列を用いたダイズ（ｃｖ ＢＥＲＴ）の形質転換の後に、推定上トランスジェニックの植物を再生した。植物を土壌に移し、およそ４週間の成長の後、ＤＮＡ抽出および遺伝子型決定のために小さな葉を各植物から採取した。独立した形質転換から、標的部位に二対立遺伝子変異またはホモ接合変異を有する事象＃１～＃５を生成した。ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０３ ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ結合部位に隣接するＧｍＳＡＣＰＤ－ＣのＤＮＡ配列の次世代シーケンシングによってＤＮＡ試料を分析した。次いで、得られたリードを野生型配列に対して整列させて、対立遺伝子型を決定した。結果を表４に要約し、代表的な配列である配列番号６３～７１を図６Ａ～Ｂおよび７に示す。合わせると、これらの結果は、Ｔ０ダイズ植物内でのＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃの、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０３を用いた成功した変異誘発を確認した。
Figure 2023519087000002
ＶＩＩ．標的化されたプロモーター置換によるＳＡＣＰＤ－Ｃの種子特異的サイレンシング（アプローチ１Ｂ）
内因性ＳＡＣＰＤ－Ｃプロモーターを根粒特異的プロモーターで置換するためのゲノム操作試薬を、ダイズプロトプラストに送達した。プロトプラストを、従来の方法を使用して調製した。簡潔に述べると、ダイズ種子を、形質転換の５日前にインビトロで発芽培地上で無菌条件下で成長させた。次いで、ダイズ実生の最初の真葉および胚軸を一晩消化した。単離および形質転換を、一晩の消化の翌日に行った。単離の間、プロトプラストをまずスクリーニングして、１００万個の細胞の適正な収量を確実にした。これらの細胞を、洗浄緩衝液中での数回の洗浄に供し、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）カセットを通じた検証またはそのゲノムＤＮＡの抽出のいずれかのために使用される各構築物について２００，０００個の細胞に分けた。
標的化されたプロモーター置換のためのジェミニウイルスバイナリベクターを構築した（図８の（Ａ）に模式的に示す）。プロトプラスト細胞を、ＭＭｇ緩衝液の懸濁培養物中のポリエチレングリコールを介して、各ＴＡＬＥＮ対をコードするプラスミド（「ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ１０」配列番号４２および４３）を、ジェミニウイルスドナー分子（配列番号７９）と共に用いて形質転換した。図８の（Ｂ）は、標的化された置換事象を示す。
プロトプラストからゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行って、根粒プロモーターを含有するインサートＤＮＡの各ホモロジーアームを増幅することによって、遺伝子ターゲティングおよびドナー分子の成功した挿入を分子的に検出した。２つのプライマー対を、各ホモロジーアームを増幅するために設計した。各対について、一方のプライマーは、ホモロジーアームの外側のゲノムＤＮＡに結合し、他方は、新たに挿入されたＤＮＡ、この場合は根粒プロモーターに結合する。これらのＰＣＲ反応から増幅される予想されるＤＮＡバンド長は、左ホモロジーアーム（ＬＨＡ）については１１４４塩基対であり、右ホモロジーアーム（ＲＨＡ）については１１７１塩基対であった。ゲル電気泳動により、ＳＡＣＰＤ－Ｃ部位における標的化された編集を確認した。ＲＨＡ配列の予想される配列を図１０に示す（配列番号８０）。
ＶＩＩＩ．標的化されたプロモーター置換によるＦＡＴＢ－１Ａの種子特異的上方調節（アプローチ１Ｃ）
ＦＡＴＢ－１Ａのためのゲノム操作試薬を、ダイズプロトプラストに送達した。ここで、ダイズ種子を、形質転換の５日前にインビトロで発芽培地上で無菌条件下で成長させた。次いで、ダイズ実生の最初の真葉および胚軸を一晩消化した。単離および形質転換を、一晩の消化の翌日に行う。単離の間、プロトプラストをまずスクリーニングして、１００万個の細胞の適正な収量を確実にする。これらの細胞を、洗浄緩衝液中での数回の洗浄に供し、それらは黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）カセットを通じて検証するかまたはそのゲノムＤＮＡについて抽出するかのいずれかのために使用される各構築物について２００，０００個の細胞に分かれた。
標的化されたプロモーター置換のためのジェミニウイルスバイナリベクターを、それぞれ、ＴＡＬＥＮ対「ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－Ｔ２」配列番号５２および５３、「ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－Ｔ３」配列番号５５および５６、「ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－Ｔ４」配列番号５８および５９を用いて構築した（図１１の（Ａ）に模式的に示す）。プロトプラスト細胞を、ＭＭｇ緩衝液の懸濁培養物中のポリエチレングリコールを介して、各ＴＡＬＥＮ対をコードするプラスミドを、ジェミニウイルスドナー分子（配列番号８１）と共に用いて形質転換した。図１１（Ｂ）は、標的化された置換事象を示す。プロトプラストからゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行って、ＦＡＤ２Ａプロモーターを含有するインサートＤＮＡの各ホモロジーアームを増幅することによって、遺伝子ターゲティングおよびドナー分子の成功した挿入を分子的に検出した。２つのプライマー対を、各ホモロジーアームを増幅するために設計した。各対について、一方のプライマーは、ホモロジーアームの外側のゲノムＤＮＡに結合し、他方は、新たに挿入されたＤＮＡ、この場合はＦＡＤ２Ａプロモーターに結合する。これらのＰＣＲ反応から増幅される予想されるＤＮＡバンド長は、ＬＨＡについては１３６５塩基対であり、ＲＨＡについては１４３０塩基対であった。ゲル電気泳動により、ＦＡＴＢ－１Ａ部位における標的化された編集を確認した。ＴＡＬＥＮ対の活性に基づいて、配列番号５５および５６を前進のために選択した。
ＩＸ．シスジェニックカセットによるＦＡＴＢ－１Ａの種子特異的上方調節およびＳＡＣＰＤ－Ｃの根粒／葉特異的発現（アプローチ２Ａ）
配列番号８２に示される配列を有する、ＳＡＣＰＤ－ＣおよびＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の組織特異的発現のための直鎖状シスジェニック構築物を構築する。
未成熟の子葉を未成熟のダイズ鞘から切り取り、ダイズ体細胞胚形成カルスが形成されるまで（４～８週間）シェーカー上で液体培養物中で増殖させる。ダイズ体細胞胚形成カルスを、カセット１および２（図１３）ならびに選択マーカーを有するＤＮＡ構築物でコーティングされた金粒子を用いて同時微粒子銃処理（ｃｏ－ｂｏｍｂａｒｄ）する。再生培地中での１週間の静止後、選択薬剤を添加する。選択培地を、およそ４週間毎週交換する。次いで、形質転換された胚形成カルスを１～２ｍｍの小片に切断し、チャコールリッチ成熟培地上に４～８週間置く。形質転換された成熟胚を乾燥させた後、発根培地に移す。
本開示の他の実施形態が可能である。上記の説明は多くの特異性を含むが、これらは、本開示の範囲を限定するものではなく、単に本開示の現在好ましい実施形態のいくつかの例示を提供するものであると解釈されるべきである。実施形態の特定の特徴および態様の様々な組み合わせまたは部分的組み合わせがなされ得、かつ依然として本開示の範囲内に入ることもまた企図される。開示された実施形態の様々な特徴および態様は、様々な実施形態を形成するために、互いに組み合わされ得るか、または互いに置換され得る。したがって、本開示の少なくともいくらかの範囲は、本明細書に記載される実施形態によって限定されるべきではないことが意図される。
本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲およびそれらの法的等価物によって決定されるべきである。本開示の範囲は、当業者に明らかとなり得る他の実施形態を包含する。したがって、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲以外の何物によっても限定されず、ここで、単数形の要素への言及は、明示的にそのように述べられない限り「唯一」を意味することを意図せず、むしろ「１つ以上」である。当業者に知られている上述の好ましい実施形態の要素に対するすべての構造的、化学的、および機能的等価物は、参照により本明細書に明示的に組み込まれ、本特許請求の範囲によって包含されることが意図される。さらに、デバイスまたは方法は、それが本特許請求の範囲によって包含されるために、本開示によって解決されようとするすべての課題に対処する必要はない。さらに、本開示における要素、構成要素、または方法ステップは、要素、構成要素、または方法ステップが特許請求の範囲に明示的に記載されているかどうかにかかわらず、公衆に開放されることを意図していない。
本開示の様々な好ましい実施形態の前述の記載は、例示および説明の目的のために提示されている。網羅的であること、または正確な実施形態に開示を限定することは意図されず、上記の教示に照らして多くの改変および変形が明らかに可能である。上記のような、例の実施形態は、本開示の原理およびその実用的な応用を最もよく説明して、それによって、他の当業者が、意図される特定の使用に適するように様々な実施形態において、様々な改変を伴って本開示を最もよく利用することを可能にするために選択および記載された。本開示の範囲は、本明細書に添付される特許請求の範囲によって定義されることが意図される。
様々な例が記載されている。これらおよび他の例は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
［配列表］
１）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃコード配列（配列番号１）
ＡＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＣＴＡＡＡＧＡＧＴＴＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＴＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＧＣＧＣＴＴＣＣＣＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＣＧＡＧＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＴＧＧＧＣＣＧＴＧＴＧＧＡＣＣＣＧＧＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＧＧＧＧＡＴＣＴＧＣＴＣＡＧＡＡＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＣＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＴＴＧＡＣＡＴＧＧＣＴＡＡＧＧＴＣＧＡＡＡＡＧＡＣＣＧＴＡＣＡＴＴＡＣＣＴＣＡＴＴＴＣＡＧＣＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＡＡＣＡＡＣＣＣＡＴＡＴＴＴＧＧＧＧＴＴＴＧＴＧＴＡＣＡＣＧＴＣＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＧＡＧＣＡＡＣＡＴＴＴＧＴＧＧＣＧＣＡＣＧＧＧＡＡＣＡＣＧＧＣＴＣＧＧＣＴＣＧＣＧＡＡＧＧＡＧＧＧＣＧＧＧＧＡＴＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＴＡＴＧＣＧＧＧＡＣＣＡＴＣＧＣＡＧＣＧＧＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＧＣＡＣＧＡＧＡＡＣＧＣＧＴＡＣＴＣＡＡＧＡＡＴＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＣＣＣＣＡＣＣＧＧＧＧＣＡＡＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＡＧＧＧＡＡＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＣＧＧＣＧＣＡＣＣＴＴＡＴＧＴＡＣＧＡＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＡＴＴＣＧＡＧＣＡＣＴＡＣＴＣＣＧＣＴＧＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＣＡＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＡＣＣＧＣＣＡＡＣＧＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＡＴＣＴＴＧＧＡＧＴＴＴＣＴＣＧＴＴＧＡＡＣＧＧＴＧＧＡＧＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＡＧＧＧＧＡＡＧＣＧＧＧＣＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＧＴＧＴＧＧＧＴＴＧＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＴＴＡＧＧＡＧＧＴＴＧＣＡＡＧＡＧＣＧＣＧＣＴＧＡＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＴＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＴＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＡＧＴＴＣＡＧＴＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＡ
２）根粒特異的Ｇｌｙｍａ０５ｇ０１３６０プロモーター配列２ＫＢ（配列番号２）
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３）根粒特異的Ｇｌｙｍａ１３ｇ４４９７０プロモーター配列２ＫＢ（配列番号３）
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４）根粒特異的Ｇｌｙｍａ０５ｇ０１３６０ターミネーター配列９０３ｂｐ（配列番号４）
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５）根粒特異的Ｇｌｙｍａ１３ｇ４４９７０ターミネーター配列１ＫＢ（配列番号５）
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６）ＧｍＦＡＴＢ－１Ａコード配列（配列番号６）
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７）種子特異的ＧｍＦＡＤ２Ａプロモーター配列２ＫＢ（配列番号７）
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８）種子特異的ＧｍＦＡＤ２Ｂプロモーター配列２ＫＢ（配列番号８）
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９）種子特異的ＧｍＦＡＤ２Ａターミネーター配列１ＫＢ（配列番号９）
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１０）種子特異的ＧｍＦＡＤ２Ｂターミネーター配列１ＫＢ（配列番号１０）
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１１）ＧｍＦＡＤ２Ａコード配列（配列番号１１）
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１２）ＧｍＦＡＤ２Ｂコード配列（配列番号１２）
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１３）直鎖状シスジェニックカセット１［根粒Ｇｌｙｍａ１３ｇ４４９７０プロモーター－ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｇｌｙｍａ１３ｇ４４９７０ターミネーター］（配列番号１３）
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１４）直鎖状シスジェニックカセット２［種子ＦＡＤ２Ａプロモーター－ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－ＦＡＤ２Ａターミネーター］（配列番号１４）
ＴＧＣＧＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＴＡＴＡＡＴＡＴＡＴＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＡＡＴＴＡＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＣＴＡＡＡＡＴＴＡＡＧＡＡＴＴＴＧＴＣＴＡＡＡＡＴＡＡＧＡＡＴＡＡＡＧＴＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＴＡＡＡＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＧＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＧＧＧＡＡＡＡＣＧＡＡＡＡＴＣＡＣＡＴＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＴＡＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＴＴＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＡＣＴＴＴＴＡＡＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＴＡＣＡＴＣＣＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡＧＧＧＴＧＣＡＡＴＴＧＴＡＡＧＴＴＴＡＴＴＡＧＣＡＣＴＣＴＴＧＴＴＴＴＴＡＣＣＴＧＣＡＴＴＴＧＴＧＴＧＴＧＣＴＡＡＣＣＡＡＡＴＴＧＣＡＴＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＡＣＡＴＡＡＴＧＴＡＴＴＴＧＡＴＴＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＡＣＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＴＡＣＧＴＧＴＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＡＴＡＣＡＡＡＴＧＣＴＧＴＣＴＧＧＴＡＣＴＧＧＣＡＡＴＴＴＧＧＴＡＡＡＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＣＴＣＴＡＡＴＴＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＴＣＴＧＡＡＧＡＴＴＣＣＴＣＴＧＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＴＧＣＴＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＣＡＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＡＴＡＴＴＴＣＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＣＣＡＡＧＴＡＴＧＴＣＡＴＡＴＴＴＴＧＡＴＣＣＡＴＣＴＴＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＴＧＴＣＡＴＧＴＡＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＴＡＴＣＡＣＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴＡＡＡＧＣＡＴＴＧＡＴＴＡＧＴＣＴＧＴＡＧＧＣＡＡＴＡＴＴＧＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＣＴＧＣＣＴＴＣＡＡＴＣＡＣＣＡＧＴＴＡＴＧＧＧＡＧＡＴＧＧＡＴＧＴＡＡＴＡＣＴＡＡＡＴＡＣＣＡＴＡＧＴＴＧＴＴＣＴＧＣＴＴＧＡＡＧＴＴＴＡＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＧＴＴＣＴＧＣＴＴＧＡＡＧＴＴＴＡＧＴＴＧＴＧＴＧＴＡＡＴＧＴＴＴＣＡＧＣＧＴＴＧＧＣＴＴＣＣＣＣＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＴＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＡＡＴＣＴＴＣＡＴＴＧＣＴＴＴＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＣＣＧＡＡＴＡＧＴＴＴＧＡＡＧＴＴＴＧＡＡＣＴＡＴＴＧＣＣＴＡＴＴＣＡＴＧＴＡＡＣＴＴＡＴＴＣＡＣＣＣＡＡＴＣＴＴＡＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＣＴＧＧＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＡＴＡＡＡＴＴＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＡＣＴＴＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＣＡＡＴＴＴＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＧＣＧＴＡＧＡＧＡＧＴＴＴＡＡＴＧＧＣＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＡＴＴＧＡＣＣＴＧＴＡＧＴＣＡＴＡＡＴＴＡＣＡＣＴＧＧＧＣＣＣＴＣＴＣＧＧＡＧＴＴＴＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＣＧＣＴＧＴＧＴＴＴＧＧＴＴＣＴＧＣＡＴＧＴＴＡＧＣＣＴＣＡＣＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＡＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＴＴＣＴＧＣＡＴＡＴＡＡＧＣＣＴＣＡＣＡＣＧＴＡＴＡＣＴＡＡＡＣＧＡＧＴＧＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＴＣＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＡＣＣＴＡＴＴＧＡＧＴＧＡＡＡＴＴＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＧＣＡＴＧＴＧＡＧＴＡＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣＣＣＣＧＧＴＴＴＴＣＡＴＡＴＴＧＣＡＡＴＧＴＧＣＴＡＣＴＧＴＧＧＴＧＡＴＴＡＡＣＣＴＴＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＴＡＴＧＴＡＴＡＴＴＧＡＴＡＣＣＡＴＡＡＡＴＴＡＴＴＡＣＴＡＧＴＡＴＡＴＣＡＴＴＴＴＡＴＡＴＴＧＴＣＣＡＴＡＣＣＡＴＴＡＣＧＴＧＴＴＴＡＴＡＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＡＣＡＴＧＴＡＡＴＴＧＡＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＣＴＴＡＡＴＴＡＣＧＴＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＧＡＴＧＣＴＣＴＴＧＡＣＴＡＧＡＡＴＴＧＴＧＡＴＣＴＣＣＴＡＧＴＴＴＣＣＴＡＡＣＣＡＴＡＴＡＣＴＡＡＴＡＴＴＴＧＣＴＴＧＴＡＴＴＧＡＴＡＧＣＣＣＣＴＣＣＧＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＴＡＴＡＡＡＡＣＴＧＣＡＴＣＧＡＡＴＡＡＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＴＡＧＧＣＡＴＧＧＴＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＣＣＴＣＧＧＧＡＴＡＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＧＴＴＣＡＴＣＡＴＡＴＴＴＧＴＴＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＣＧＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＡＴＧＣＡＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＴＴＴＣＴＡＧＡＴＴＴＣＣＴＧＡＡＧＧＣＴＴＡＧＧＴＧＴＡＧＧＣＡＣＣＴＡＧＣＴＡＧＴＡＧＣＴＡＣＡＡＴＡＴＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴＣＴＣＴＡＴＴＧＡＴＡＡＡＣＡＡＴＴＧＧＣＴＧＴＡＡＴＧＣＣＧＣＡＧＴＡＧＡＧＧＡＣＧＡＴＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＡＣＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＴＧＴＴＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＣＧＣＣＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＣＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＣＴＧＣＡＡＡＣＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＴＡＡＡＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＧＴＣＴＴＣＴＧＧＴＧＧＣＴＴＧＡＡＧＧＣＡＡＡＧＧＣＧＣＡＡＧＣＣＣＣＴＴＣＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＴＴＧＴＴＡＣＡＴＣＴＡＡＡＧＡＡＡＧＣＴＴＣＡＡＧＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴＡＣＣＴＴＣＧＣＣＴＣＣＣＣＣＣＡＧＡＡＣＴＴＴＴＡＴＣＡＡＣＣＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＴＴＧＧＡＧＣＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧＣＴＧＣＴＡＴＣＡＣＡＡＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＧＧＣＣＧＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＴＧＡＴＴＧＧＡＡＧＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＣＡＴＧＣＴＴＡＴＴＧＡＣＣＣＣＴＴＴＧＧＧＡＴＡＧＧＡＡＡＡＡＴＴＧＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＴＣＴＴＧＴＧＴＴＣＣＧＴＧＡＡＡＡＣＴＴＴＴＣＴＡＴＴＡＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＴＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＣＧＴＡＣＣＧＣＡＴＣＴＡＴＡＧＡＡＡＣＡＧＴＡＡＴＧＡＡＣＣＡＴＴＴＧＣＡＡＧＡＡＡＣＴＧＣＡＣＴＴＡＡＴＣＡＴＧＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＴＧＧＣＴＴＴＧＧＴＴＣＣＡＣＧＣＣＡＧＡＡＡＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＴＧＡＴＡＴＧＧＧＴＧＧＴＴＡＣＴＣＧＧＡＴＧＣＡＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＣＧＣＴＡＴＣＣＴＡＣＡＴＧＧＧＧＴＧＡＣＡＴＡＧＴＴＣＡＡＧＴＧＧＡＣＡＣＴＴＧＧＧＴＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＴＡＴＧＣＧＣＣＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＴＴＴＡＣＧＴＧＡＣＴＧＣＡＡＡＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＴＣＴＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＣＡＧＴＧＴＴＴＧＧＧＴＣＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡＡＧＣＴＡＡＣＡＣＧＧＡＧＧＣＴＧＴＣＴＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＴＣＡＧＡＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＣＣＡＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＡＡＣＡＧＡＡＡＡＣＴＧＡＣＴＡＡＡＣＴＴＧＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＧＡＴＴＡＴＡＴＴＣＧＴＡＣＣＧＧＴＴＴＡＡＧＴＣＣＴＡＧＧＴＧＧＡＧＴＧＡＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＡＡＴＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＧＴＡＣＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＧＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＣＣＡＡＴＣＴＴＧＧＡＧＡＧＴＣＡＴＧＡＧＣＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＴＴＴＡＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧＴＡＧＧＧＡＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧＧＧＣＡＡＴＣＴＡＧＣＴＣＡＣＡＧＣＧＧＧＣＡＴＧＴＴＧＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＡＴＴＧＴＧＡＧＧＧＧＣＡＧＧＡＣＴＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＣＣＡＡＡＣＣＴＧＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＴＧＧＴＧＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＣＡＡＴＧＧＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＴＡＴＧＧＡＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＴＧＴＡＴＴＡＧＴＡＣＡＴＡＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＴＧＴＴＡＴＡＡＡＴＡＡＧＴＧＧＡＴＴＴＧＣＣＧＣＧＴＡＡＴＧＡＣＴＴＴＧＴＧＴＧＴＡＴＴＧＴＧＡＡＡＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＡＡＴＧＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＴＣＴＧＧＴＡＴＴＡＡＴＴＡＣＡＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＴＡＴＡＧＣＴＴＴＣＴＧＣＣＴＡＡＡＡＴＧＣＡＣＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＡＣＡＡＴＡＴＣＡＴＴＧＧＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＴＧＡＧＧＣＴＡＣＴＣＡＴＡＡＴＡＣＴＡＴＣＣＡＴＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＡＧＡＣＡＴＧＴＴＧＣＡＴＴＧＡＣＴＴＴＡＡＧＣＡＧＡＧＧＴＴＣＡＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴＡＧＧＣＴＴＧＡＡＣＴＡＣＡＡＧＴＡＡＴＴＴＡＡＧＧＧＡＣＧＡＧＡＧＣＡＡＣＴＴＴＡＧＣＴＣＴＡＣＣＡＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＧＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＧＡＴＣＴＴＡＴＴＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＴＴＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＣＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＡＴＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣＴＡＡＡＴＴＧＧＡＣＴＧＡＴＴＴＴＴＡＧＡＴＴＣＡＡＡＴＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＣＴＡＡＡＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＡＴＴＴＴＡＴＡＡＴＡＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＴＡＴＡＴＣＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＴＡＴＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＡＴＴＡＧＴＴＡＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＴＣＣＡＣＴＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＡＧＴＡＴＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＡＴＧＡＴＴＴＧＴＡＴＧＡＧＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＴＡＴＣＡＴＡＡＴＡＧＡＧＡＣＡＡＡＡＧＴＴＡＡＴＡＣＴＧＡＴＧＧＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＴＴＡＴＴＧＧＧＡＧＣＡＴＡＴＧＧＴＡＡＧＡＴＡＡＧＡＣＧＧＡＴＡＡＡＡＡＴＡＴＧＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＣＴＡＡＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＡＡＧＴＧＡＣＡＡＣＴＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＡＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴＴＴＣＴＡＣＴＴＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＣＡＴＡＡＡＡＴＡＣＴＧＡＴＴＴＴＡＡＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＡＴＴＣＴＴＴＧＴＴＡＡＧＡＧＡＡＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＴＡＴＴＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＴＧＴＡ
１５）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子コード配列を標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０１（ｈｉｔＳｅｑ）（配列番号１５）
ＴＧＧＡＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡ
１６）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子コード配列を標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０１（ｌｅｆｔＳｅｑ）（配列番号１６）
ＴＧＧＡＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧ
１７）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子コード配列を標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０１（ｒｔＳｅｑ）（配列番号１７）
ＴＣＣＡＣＧＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧ
１８）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子コード配列を標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０２（ｈｉｔＳｅｑ）（配列番号１８）
ＴＧＧＧＴＣＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡ
１９）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子コード配列を標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０２（ｌｅｆｔＳｅｑ）（配列番号１９）
ＴＧＧＧＴＣＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴ
２０）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子コード配列を標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０２（ｒｔＳｅｑ）（配列番号２０）
ＴＴＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＴ
２１）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子コード配列を標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０３（ｈｉｔＳｅｑ）（配列番号２１）
ＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡ
２２）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子コード配列を標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０３（ｌｅｆｔＳｅｑ）（配列番号２２）
ＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣ
２３）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子コード配列を標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０３（ｒｔＳｅｑ）（配列番号２３）
ＴＴＣＡＣＣＴＧＡＴＧＧＣＴＧＡＡ
２４）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子コード配列を標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０４（ｈｉｔＳｅｑ）（配列番号２４）
ＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡ
２５）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子コード配列を標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０４（ｌｅｆｔＳｅｑ）（配列番号２５）
ＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＴ
２６）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子コード配列を標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０４（ｒｔＳｅｑ）（配列番号２６）
ＴＣＣＴＴＣＡＣＣＴＧＡＴＧＧＣＴ
２７）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子コード配列を標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０５（ｈｉｔＳｅｑ）（配列番号２７）
ＴＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＴＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡ
２８）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子コード配列を標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０５（ｌｅｆｔＳｅｑ）（配列番号２８）
ＴＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴ
２９）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子コード配列を標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０５（ｒｔＳｅｑ）（配列番号２９）
ＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＣＣＡＴＡＴＣ
３０）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０６（ｈｉｔＳｅｑ）（配列番号３０）
ＴＣＣＧＣＧＧＣＧＣＣＧＴＴＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＣＡＡＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡ
３１）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０６（ｌｅｆｔＳｅｑ）（配列番号３１）
ＴＣＣＧＣＧＧＣＧＣＣＧＴＴＣＡＡ
３２）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０６（ｒｔＳｅｑ）（配列番号３２）
ＴＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＴＴＧＡＧ
３３）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０７（ｈｉｔＳｅｑ）（配列番号３３）
ＴＡＡＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＡＴＣＡＣＴＡＧＴＣＡＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＡＡＡ
３４）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０７（ｌｅｆｔＳｅｑ）（配列番号３４）
ＴＡＡＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＣＣ
３５）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０７（ｒｔＳｅｑ）（配列番号３５）
ＴＴＴＧＴＡＡＡＧＧＧＴＧＴＧＡＣ
３６）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０８（ｈｉｔＳｅｑ）（配列番号３６）
ＴＡＧＴＣＡＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＡＡＡＴＡＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＴＴＣＣＡＣＴＣＡＡ
３７）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０８（ｌｅｆｔＳｅｑ）（配列番号３７）
ＴＡＧＴＣＡＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＡ
３８）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０８（ｒｔＳｅｑ）（配列番号３８）
ＴＴＧＡＧＴＧＧＡＡＣＴＧＴＧＧＡ
３９）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０９（ｈｉｔＳｅｑ）（配列番号３９）
ＴＣＡＡＧＴＡＣＡＡＴＡＧＡＣＡＣＧＴＡＡＴＣＡＡＡＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＡＣＧＡＡＣＣＴＧＣＣＡ
４０）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０９（ｌｅｆｔＳｅｑ）（配列番号４０）
ＴＣＡＡＧＴＡＣＡＡＴＡＧＡＣＡＣ
４１）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ０９（ｒｔＳｅｑ）（配列番号４１）
ＴＧＧＣＡＧＧＴＴＣＧＴＡＴＣＴＧ
４２）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ１０（ｈｉｔＳｅｑ）（配列番号４２）
ＴＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＣＴＴＣＣＡＣＡＡＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＴＡＧＡＡＡＡＧＣＣＣＡ
４３）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ１０（ｌｅｆｔＳｅｑ）（配列番号４３）
ＴＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＣＴＴ
４４）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ１０（ｒｔＳｅｑ）（配列番号４４）
ＴＧＧＧＣＴＴＴＴＣＴＡＧＡＡＧＡ
４５）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ１１（ｈｉｔＳｅｑ）（配列番号４５）
ＴＴＣＣＧＣＣＧＴＴＡＡＡＣＧＣＴＧＣＧＧＴＴＴＣＣＧＣＧＧＣＧＣＣＧＴＴＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＡＡ
４６）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ１１（ｌｅｆｔＳｅｑ）（配列番号４６）
ＴＴＣＣＧＣＣＧＴＴＡＡＡＣＧＣＴ
４７）ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＳＡＣＰＤ－Ｃ－Ｔ１１（ｒｔＳｅｑ）（配列番号４７）
ＴＴＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＡＡＣＧＧ
４８）ＧｍＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－Ｔ０１（ｈｉｔＳｅｑ）（配列番号４８）
ＴＴＡＧＴＣＣＧＡＴＴＧＡＴＴＴＣＴＣＧＡＴＡＴＣＡＴＴＴＡＡＧＧＣＴＡＡＧＧＴＴＧＡＣＣＴＣＴＡ
４９）ＧｍＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－Ｔ０１（ｌｅｆｔＳｅｑ）（配列番号４９）
ＴＴＡＧＴＣＣＧＡＴＴＧＡＴＴＴＣ
５０）ＧｍＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－Ｔ０１（ｒｔＳｅｑ）（配列番号５０）
ＴＡＧＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＴＡＧＣ
５１）ＧｍＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－Ｔ０２（ｈｉｔＳｅｑ）（配列番号５１）
ＴＣＴＴＣＴＡＡＣＴＴＧＣＧＴＡＴＡＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＴＴＡＧＡＡＡＴＴＣＡＴＴＡ
５２）ＧｍＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－Ｔ０２（ｌｅｆｔＳｅｑ）（配列番号５２）
ＴＣＴＴＣＴＡＡＣＴＴＧＣＧＴＡＴ
５３）ＧｍＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－Ｔ０２（ｒｔＳｅｑ）（配列番号５３）
ＴＡＡＴＧＡＡＴＴＴＣＴＡＡＧＧｈ
５４）ＧｍＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－Ｔ０３（ｈｉｔＳｅｑ）（配列番号５４）
ＴＴＴＧＣＡＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＴＡＴＣＣＣＣＴＴＴＣＴＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＡＧＧＧＡＡＡＡ
５５）ＧｍＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－Ｔ０３（ｌｅｆｔＳｅｑ）（配列番号５５）
ＴＴＴＧＣＡＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴ
５６）ＧｍＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－Ｔ０３（ｒｔＳｅｑ）（配列番号５６）
ＴＴＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣ
５７）ＧｍＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－Ｔ０４（ｈｉｔＳｅｑ）（配列番号５７）
ＴＧＴＧＡＴＡＴＡＡＣＴＧＡＴＧＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＴＴＴＧＧＧＧＴＧＡ
５８）ＧｍＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－Ｔ０４（ｌｅｆｔＳｅｑ）（配列番号５８）
ＴＧＴＧＡＴＡＴＡＡＣＴＧＡＴＧＴ
５９）ＧｍＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－Ｔ０４（ｒｔＳｅｑ）（配列番号５９）
ＴＣＡＣＣＣＣＡＡＡＴＡＡＣＡＡＡ
６０）ＧｍＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－Ｔ０５（ｈｉｔＳｅｑ）（配列番号６０）
ＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＴＴＴＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＧＧＧＴＧＡＡＣＴＴＧＧＡ
６１）ＧｍＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－Ｔ０５（ｌｅｆｔＳｅｑ）（配列番号６１）
ＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＴＴＴＧ
６２）ＧｍＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子５’ＵＴＲを標的とするＴＡＬＥＮ ＧｍＦＡＴＢ１Ａ－Ｔ０５（ｒｔＳｅｑ）（配列番号６２）
ＴＣＣＡＡＧＴＴＣＡＣＣＣＡＡＡＡ
６３）ＧｍＳＡＣＰＤ－ＣフラグメントＢｅｒｔ ｗｔ（配列番号６３）
ＣＡＡＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＣＴＡＡＡＧＡＧＴＴＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＴＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＧＣＧＣＴＴＣＣＣＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＣＧＡＧ
６４）ＧｍＳＡＣＰＤ－ＣフラグメントＴ０事象＃１（－２６ｎｔ）（配列番号６４）
ＣＡＡＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＣＴＡＡＡＧＡＧＴＴＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＴＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＧＣＧＣＴＴＣＣＣＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＣＧＡＧ
６５）ＧｍＳＡＣＰＤ－ＣフラグメントＴ０事象＃２（－１４ｎｔ）（配列番号６５）
ＣＡＡＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＣＴＡＡＡＧＡＧＴＴＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＴＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＧＣＧＣＴＴＣＣＣＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＣＧＡＧ
６６）ＧｍＳＡＣＰＤ－ＣフラグメントＴ０事象＃３（－５２ｎｔ）（配列番号６６）
ＣＡＡＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＣＴＡＡＡＧＡＧＴＴＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＴＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＧＣＧＣＴＴＣＣＣＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＣＧＡＧ
６７）ＧｍＳＡＣＰＤ－ＣフラグメントＴ０事象＃４対立遺伝子１（－５ｎｔ）（配列番号６７）
ＣＡＡＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＣＴＡＡＡＧＡＧＴＴＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＴＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＧＣＧＣＴＴＣＣＣＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＣＧＡＧ
６８）ＧｍＳＡＣＰＤ－ＣフラグメントＴ０事象＃４対立遺伝子２（－７／＋３ｎｔ）（配列番号６８）
ＣＡＡＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＴＣＧＴＣＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＣＴＡＡＡＧＡＧＴＴＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＴＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＧＣＧＣＴＴＣＣＣＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＣＧＡＧ
６９）ＧｍＳＡＣＰＤ－ＣフラグメントＴ０事象＃５対立遺伝子１（－８ｎｔ）（配列番号６９）
ＣＡＡＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＡＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＣＴＡＡＡＧＡＧＴＴＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＴＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＧＣＧＣＴＴＣＣＣＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＣＧＡＧ
７０）ＧｍＳＡＣＰＤ－ＣフラグメントＴ０事象＃５対立遺伝子２（－１４ｎｔ）（配列番号７０）
ＣＡＡＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＣＴＡＡＡＧＡＧＴＴＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＴＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＧＣＧＣＴＴＣＣＣＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＣＧＡＧ
７１）ＧｍＳＡＣＰＤ－ＣフラグメントＢｅｒｔ ｗｔ（配列番号７１）
ＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴ
７２）ＧｍＳＡＣＰＤ－ＣフラグメントＴ０事象＃１（配列番号７２）
ＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴ
７３）ＧｍＳＡＣＰＤ－ＣフラグメントＴ０事象＃２（配列番号７３）
ＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴ
７４）ＧｍＳＡＣＰＤ－ＣフラグメントＴ０事象＃３（配列番号７４）
ＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴ
７５）ＧｍＳＡＣＰＤ－ＣフラグメントＴ０事象＃４対立遺伝子１（配列番号７５）
ＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴ
７６）ＧｍＳＡＣＰＤ－ＣフラグメントＴ０事象＃４対立遺伝子２（配列番号７６）
ＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＴＣＧＴＣＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴ
７７）ＧｍＳＡＣＰＤ－ＣフラグメントＴ０事象＃５対立遺伝子１（配列番号７７）
ＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＡＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴ
７８）ＧｍＳＡＣＰＤ－ＣフラグメントＴ０事象＃５対立遺伝子２（配列番号７８）
ＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴ
７９）ＳＡＣＰＤ－Ｃの種子特異的サイレンシングのための人工配列（標的化されたプロモーター置換ドナーテンプレート配列ＬＨＡ（ＳＡＣＰＤ－Ｃ）－根粒Ｐｒｏおよび５’ＵＴＲ（Ｇｌｙｍａ１３ｇ４４９７０）－ＲＨＡ（ＳＡＣＰＤ－Ｃ））（配列番号７９）
ＡＴＡＣＧＴＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＡＡＴＴＡＴＡＴＡＴＡＣＴＴＴＧＡＴＣＡＡＴＡＴＧＴＴＴＡＧＴＧＡＴＡＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＴＣＴＡＣＡＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＡＴＡＡＡＡＴＣＣＣＴＣＡＡＡＧＡＡＴＣＴＡＴＡＣＣＣＡＡＡＡＡＣＡＧＣＴＡＧＣＡＡＡＡＡＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡＴＣＧＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＴＡＡＣＴＣＴＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＣＡＡＡＴＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＴＣＣＴＡＧＴＣＧＡＧＣＴＴＧＴＡＡＴＴＴＧＴＡＴＧＧＴＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＣＡＴＡＴＴＡＡＡＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＴＴＡＡＧＡＴＡＴＡＴＧＴＡＣＧＡＡＴＡＡＡＧＣＴＡＡＣＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＴＴＡＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡＧＴＴＡＡＴＴＴＣＴＴＴＴＡＣＡＧＴＡＡＡＴＴＡＴＡＴＴＣＡＡＴＴＣＡＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＴＧＡＡＧＡＴＡＴＡＴＡＴＴＴＡＴＣＴＴＡＡＧＴＡＡＡＴＡＣＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＴＡＴＣＴＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＴＴＴＡＡＡＡＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＴＴＴＣＴＴＧＴＡＡＧＴＴＡＴＴＡＧＡＣＣＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴＣＡＴＡＴＡＣＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＣＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＡＴＡＡＣＡＴＡＴＡＴＴＴＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＣＡＡＡＡＴＴＴＡＴＡＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＧＴＡＧＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＴＧＡＴＴＡＴＧＡＡＣＡＣＴＧＣＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴＣＡＴＡＡＴＣＣＡＣＴＧＴＴＡＡＣＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＴＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＴＡＡＡＴＧＡＣＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＧＡＣＴＴＡＡＧＣＧＴＣＡＧＡＧＴＡＣＣＴＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣＧＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＧＡＡＴＡＣＣＡＡＧＴＡＧＡＡＧＡＴＴＡＧＡＴＴＡＴＴＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＧＡＴＴＴＧＡＡＧＡＧＣＡＣＴＴＣＡＧＴＧＧＴＡＡＧＡＡＣＡＴＴＴＣＣＴＡＡＡＴＴＡＣＡＴＴＴＣＴＡＡＴＴＴＧＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＴＴＣＡＴＡＣＴＡＴＡＧＡＴＧＣＡＡＧＴＡＴＴＧＴＧＣＴＡＡＡＡＴＧＡＴＧＴＡＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＡＡＣＴＣＡＡＡＴＧＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＴＧＴＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＣＣＧＧＣＣＣＴＡＧＡＧＡＣＴＴＴＧＡＣＧＴＴＴＧＡＴＣＣＡＣＡＣＣＡＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＣＣＴＴＴＣＡＧＡＡＧＴＡＴＴＧＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＣＴＴＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＧＣＣＡＣＣＴＧＡＧＣＴＡＡＡＴＡＣＴＧＧＴＧＴＧＣＴＣＴＡＡＴＴＡＡＣＴＣＴＡＴＧＡＴＧＴＧＣＴＣＴＧＣＴＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＡＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＣＴＡＡＧＣＴＣＡＡＡＴＣＣＴＴＴＣＣＣＡＧＴＧＣＴＡＣＴＡＡＴＴＴＣＴＴＴＧＴＣＣＴＣＴＧＡＡＣＴＡＡＴＡＣＣＡＡＴＡＡＧＧＡＴＧＧＡＡＴＧＴＧＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＧＡＴＡＧＣＡＧＧＴＣＡＡＣＡＣＡＡＡＣＡＡＴＡＴＡＧＣＡＴＡＴＴＡＣＣＡＴＡＡＴＴＣＣＡＴＡＡＡＴＴＡＡＴＴＧＧＡＣＡＡＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＣＴＣＡＡＴＴＣＡＡＴＴＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴＴＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＡＣＣＡＴＴＧＣＧＡＡＧＣＡＣＡＴＧＴＡＡＴＡＴＡＧＴＡＡＡＴＧＴＣＴＡＡＴＧＡＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡＴＧＣＡＴＴＴＡＴＡＧＴＴＡＡＧＴＧＴＡＧＡＣＡＴＴＡＧＡＣＡＧＣＡＴＴＡＡＣＡＡＡＴＡＴＡＴＴＧＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＡＴＴＡＣＣＴＴＴＣＴＧＡＴＴＴＣＡＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＴＡＴＡＡＡＡＣＴＧＡＧＣＡＴＴＧＴＧＧＧＧＡＣＣＡＴＧＴＴＧＴＴＣＡＴＴＡＴＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＣＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＴＣＴＧＣＴＣＡＴＡＡＧＧＧＡＡＧＡＡＡＴＣＴＣＡＣＴＣＧＣＧＣＧＣＧＧＴＴＡＧＧＧＣＴＣＣＡＴＡＧＴＣＴＴＡＴＣＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＴＡＴＴＴＧＧＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＡＡＴＴＡＴＴＡＴＡＡＴＡＴＧＴＴＧＡＴＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＴＴＡＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＡＴＴＴＴＴＧＴＴＡＣＴＧＴＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＧＧＣＡＣＣＴＧＧＴＣＴＡＡＴＡＴＴＣＡＴＴＴＴＧＴＧＴＴＧＧＣＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＡＴＡＴＴＡＡＡＡＴＧＡＴＡＴＡＴＣＣＴＧＴＴＡＣＡＡＡＡＡＴＣＡＴＣＴＡＴＴＴＴＡＡＴＡＡＡＴＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＣＡＡＣＴＣＡＴＴＡＴＡＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＡＡＡＧＧＣＴＡＴＣＡＣＴＡＴＴＴＡＴＣＣＣＴＡＡＡＡＧＴＧＡＴＧＧＡＴＴＣＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＡＣＴＧＣＡＣＴＴＴＡＡＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＡＡＣＴＡＡＴＡＣＴＡＧＴＡＣＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＣＡＴＴＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＴＣＡＴＣＡＴＧＴＴＡＧＡＧＡＡＴＡＣＣＡＣＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＧＴＣＣＴＡＡＧＧＣＣＴＴＡＧＡＡＧＧＡＣＴＣＡＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＴＡＴＣＴＴＴＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＴＡＴＴＡＴＧＴＡＣＴＴＡＣＧＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡＡＴＴＴＡＴＴＡＴＡＴＡＴＡＣＴＴＡＣＧＴＡＴＴＴＴＴＧＧＴＡＴＡＡＴＴＣＴＡＴＴＴＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＴＴＴＴＴＴＡＣＴＣＴＴＴＡＴＣＴＡＴＴＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＴＡＧＡＡＣＡＴＡＴＧＴＧＴＧＡＴＡＡＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＧＴＡＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＴＡＡＣＴＴＴＡＴＴＴＡＡＣＡＡＴＴＡＴＡＡＣＡＡＡＴＴＡＴＴＡＡＡＡＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＧＴＡＴＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＧＴＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＧＴＧＡＴＡＡＡＧＧＡＡＧＡＴＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＴＣＣＡＴＴＡＣＡＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＡＴＡＴＡＴＴＴＧＴＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＣＡＣＡＣＴＡＡＡＣＣＡＧＧＧＧＣＧＡＡＴＡＡＡＴＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＡＴＴＡＧＣＡＴＴＴＡＴＡＧＣＣＡＡＧＣＣＡＡＧＣＴＡＧＡＴＣＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＴＧＴＧＴＴＧＣＴＴＡＡＣＧＴＴＡＡＣＡＴＧＴＴＣＣＡＣＴＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＴＧＡＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＣＴＡＡＡＧＡＧＴＴＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＴＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＧＣＧＣＴＴＣＣＣＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＣＧＡＧＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＴＧＧＧＣＣＧＴＧＴＧＧＡＣＣＣＧＧＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＧＧＧＧＡＴＣＴＧＣＴＣＡＧＡＡＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＣＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＴＴＧＡＣＡＴＧＧＣＴＡＡＧＧＴＣＧＡＡＡＡＧＡＣＣＧＴＡＣＡＴＴＡＣＣＴＣＡＴＴＴＣＡＧＣＴＧＧＣＡＴＧＧＴＡＡＧＴＧＴＴＴＣＡＣＴＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＡＡＴＴＴＧＡＡＴＴＣＧＧＴＴＧＡＣＴＡＧＡＴＴＣＴＡＴＴＧＡＴＴＧＧＧＴＧＡＧＴＡＴＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＣＴＴＧＡＣＡＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＧＴＡＡＴＴＴＣＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＡＣＧＴＧＴＴＴＡＡＡＡＴＴＧＧＡＴＡＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＡＧＣＧＡＴＴＴＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＴＣＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＧＡＧＡＴＧＴＡＣＣＡＴＴＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＧＡＡＡＴＴＴＡＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＡＧＧＴＧＡＴＡＴＴＣＴＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＴＣＡＴＡＡＣＡＡＴＡＴＡＴ
８０）予想される編集されたＲＨＡ配列－根粒プロモーター／ＵＴＲインサート－ＲＨＡ（配列番号８０）
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８１）ＦＡＴＢ－１Ａの種子特異的上方調節のための人工配列（標的化されたプロモーター置換ドナーテンプレート配列ＬＨＡ（ＦＡＴＢ－１Ａ）－ＦＡＤ２Ａ Ｐｒｏおよび５’ＵＴＲ（Ｇｌｙｍａ１０ｇ４２４７０）－ＲＨＡ（ＦＡＴＢ－１Ａ））
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８２）ＳＡＣＰＤ－ＣおよびＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の組織特異的発現のための人工配列（配列番号８２）
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Claims (20)

  1. ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子、または前記ＳＡＣＰＤ－ＣおよびＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の両方の発現を調節する１つ以上の変異を含むダイズ植物、植物部分、または植物細胞であって、前記植物、植物部分、または植物細胞は、前記１つ以上の変異を欠く対応するダイズ植物、植物部分、または植物細胞から産生された油と比較して増加した飽和脂肪酸含有量を有する油を産生し、前記ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の前記発現を調節する前記１つ以上の変異は、低頻度切断エンドヌクレアーゼによって誘発された標的化された変異を含む、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  2. 前記ダイズ植物、植物部分、または植物細胞が、前記ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現の低下をもたらす変異を含む、請求項１に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  3. 前記ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現の低下をもたらす前記変異が、前記ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の１つ以上の対立遺伝子またはその作動的に連結されたプロモーターにおける変異である、請求項２に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  4. 前記ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現の低下をもたらす前記変異が、ノックアウト変異である、請求項２または３に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  5. 前記ノックアウト変異が、種子特異的ノックアウト変異である、請求項４に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  6. 前記種子特異的ノックアウト変異が、前記ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子のネイティブなゲノム遺伝子座における種子特異的プロモーターの、発生中のダイズ種子において低活性を有するかまたは検出可能な活性を有しないプロモーターでの置換を含む、請求項５に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  7. 前記変異が、配列番号１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、もしくは４５に示される配列、または配列番号１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、もしくは４５に示される配列に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列におけるものである、請求項７に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  8. 発生中のダイズ種子において低活性を有するかまたは検出可能な活性を有しないプロモーターに作動可能に連結された機能的ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子のノックイン変異を含む、請求項２～７のいずれか一項に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  9. 前記発生中のダイズ種子において低活性を有するかまたは検出可能な活性を有しないプロモーターが、根粒特異的遺伝子プロモーターである、請求項６または８に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  10. 前記ダイズ植物、植物部分、または植物細胞が、前記ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の発現の増加をもたらす変異を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  11. 前記ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の発現を増加させる前記変異が、前記ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の内因性プロモーターの、過剰発現プロモーターでの標的化された置換である、請求項１０に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  12. 前記プロモーターまたは過剰発現プロモーターが、強い種子特異的プロモーター、任意選択で、ＦＡＤ２ＡプロモーターまたはＦＡＤ２Ｂプロモーターである、請求項１１に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  13. ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子、または前記ＳＡＣＰＤ－ＣおよびＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の両方の発現を調節する変異を含むダイズ植物を生成するための方法であって、
    （ａ）総脂肪酸組成の約１５％の飽和脂肪酸含有量を有する油を産生するダイズ植物からのダイズ植物細胞の集団を、
    （ｉ）前記ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現の低下をもたらす変異であって、前記変異は、低頻度切断エンドヌクレアーゼによって誘発された標的化された変異である、変異、
    （ｉｉ）前記ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の発現の増加をもたらす変異、または
    （ｉｉｉ）それらの組み合わせ、を含む１つ以上の核酸配列と接触させることと、
    （ｂ）前記集団から、発現ＳＡＣＰＣ－Ｃ遺伝子が低下しているか、前記ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の発現が増加しているか、または発現ＳＡＣＰＣ－Ｃ遺伝子が低下し、かつ前記ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の発現が増加している細胞を選択することと、
    （ｃ）選択された植物細胞をダイズ植物に再生することと、を含む、方法。
  14. 前記ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現を低下させることが、前記ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の１つ以上の対立遺伝子またはその作動的に連結されたプロモーターにおける変異を誘発することを含み、任意選択で、前記誘発された変異が、ノックアウト変異または種子特異的ノックアウト変異である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の発現を低下させることが、前記ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子のネイティブなゲノム遺伝子座における種子特異的プロモーターを、発生中のダイズ種子において低活性を有するかまたは検出可能な活性を有しないプロモーターで置換することを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ダイズ植物細胞の集団に、発生中のダイズ種子において低活性を有するかまたは検出可能な活性を有しないプロモーターに作動可能に連結され、任意選択で、根粒特異的プロモーターに作動可能に連結された機能的ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子を含む発現カセットを送達することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の発現を増加させることが、前記ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の内因性プロモーターを、過剰発現プロモーターで置換することを含む、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の発現を増加させることが、前記ダイズ植物細胞の集団に、任意選択で、強い種子特異的プロモーターに作動可能に連結された、前記ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の１つ以上のコピーを含む発現カセットを送達することを含む、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子、ＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子、または前記ＳＡＣＰＤ－ＣおよびＦＡＴＢ－１Ａ遺伝子の両方の発現を調節する１つ以上の変異を含むダイズ植物、植物部分、または植物細胞によって産生されたダイズ油を含む、ダイズ油組成物であって、前記ダイズ油は、前記１つ以上の変異を欠く対応するダイズ植物、植物部分、または植物細胞から産生された油と比較して増加した飽和脂肪酸含有量を有し、前記ＳＡＣＰＤ－Ｃ遺伝子の前記発現を調節する前記１つ以上の変異は、低頻度切断エンドヌクレアーゼによって誘発された標的化された変異を含む、ダイズ油組成物。
  20. 前記ダイズ油が、１０％超のステアリン酸含有量、１０％超のパルミチン酸含有量、または２０％超の飽和脂肪酸含有量を有し、すべてのパーセンテージが、前記油の総脂肪酸の重量ベースである、請求項１９に記載のダイズ油組成物。
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