JPH09505470A

JPH09505470A - 植物アシルａｃｐチオエステラーゼ配列

Info

Publication number: JPH09505470A
Application number: JP7514071A
Authority: JP
Inventors: アロイスボルカー，トニー; ユアン，リン; クリードル，ジーン; ホーキンス，デボラ; ジョーンズ，オーブレイ
Original assignee: カルジーン，インコーポレイティド
Priority date: 1993-11-10
Filing date: 1994-11-10
Publication date: 1997-06-03
Also published as: CA2176137A1; EP0728212A1; US5723761A; WO1995013390A3; WO1995013390A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、植物チオエステラーゼ、特にパルミトイル−ACP基質に対して実質的な活性を有する植物アシル−ACPチオエステラーゼに関する。植物種子細胞において植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼの発現のために有用なDNA構造体を記載する。そのような構造体は、その構造体がトランスジェニック植物において発現される場合、他の植物組織と比較して、種子組織における植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼの発現を選択的に指令できる調節要素の制御下で対象の植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼをコードするDNA配列を含むであろう。本発明は、植物種子細胞に生成される遊離脂肪酸の割合の修飾のために植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼをコードするDNA配列を用いる方法にも関する。本明細書で例示される植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼ配列は、クフェア、ニラ、マンゴ及びニレを包含する。それらのパルミトイル−ACPチオエステラーゼ配列の発現の結果としてそれらの種子における高められたレベルのＣ16：０脂肪酸を有するトランスジェニック植物をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】植物アシルACPチオエステラーゼ配列発明の分野本発明は、植物への遺伝子工学技法の適用に関する。より特に、本発明は植物アシル−ACPチオエステラーゼ配列及びそのような配列の使用方法に関する。背景脂肪酸は約４〜24個の炭素の炭化水素鎖を有する有機酸である。鎖長において、及び二重結合の存在、数及び位置においてお互い異なる多くの異なった種類の脂肪酸が知られている。細胞内では、脂肪酸は典型的には、共有結合形で存在し、そのカルボキシル部分は脂肪アシル基といわれる。それらの分子の鎖長及び飽和の程度がしばしば、式CX：Ｙ（式中、“Ｘ”は炭素の数を示し、そして“Ｙ” は二重結合の数を示す）により示される。脂肪アシル基は多くの脂質の主要成分であり、そしてそれらの長い非極性炭化水素鎖はそれらの脂質分子の水不溶性性質の原因となる。脂肪アシル基の他の因子への共有結合のタイプは変化することができる。たとえば、生合成反応において、それらは特定の酵素反応に依存して、チオエステル結合を通してアシルキャリヤータンパク質(ACP)又は補酵素Ａ(CoA)に共有結合されることができる。ワックスにおいて、脂肪アシル基はエステル結合を通して脂肪アルコールに結合され、そしてトリアシルグリセロールはエステル結合を通してグリセロール分子に結合される３個の脂肪アシル基を有する。油の脂肪酸組成はその物性及び化学的性質、及び従ってその用途を決定する。植物、特に植物種子において多量の油を合成する植物種は食用及び産業使用の両者のために重要な油源である。パルミテート含有率により列挙された、主要油種子の脂肪酸組成が下記表Ｉに示される。ココヤシの実の胚乳及びヤシの仁のラウレート（Ｃ12：０）源を除いて、通常の食用油のすべては、基本的に16：０，18：０，18：１（オレエート）、18：２（リノレエート）及び18：３（リノレネート）から成る。植物栽培家は、植物交雑及び所望する特性を担持する子孫の選択により所望する特性を未来に導びくプログラムを通して種々の植物種子油の収量及び脂肪酸組成を都合良く修正してきた。従って、本技法の適用は、同じ植物種内に見出される特性に限定される。他方、突然誘発剤への暴露は、植物種子油の組成に変化をもたらすことができる特性をも導びく。しかしながら、脂肪酸合成(FAS)が葉（クロロプラスト）及び種子組織（プロプラスチド）において生じることを注目することが重要である。従って、突然変異誘発アプローチは時々、植物種子油の組成の所望する変性をもたらすけれども、植物の他の組織におけるFA Sを変えないであろう変化をもたらすことは困難である。広範囲の新規植物油組成、及び／又は生合成又は天然植物源から脂肪酸組成を得又は操作するための改良された手段は、種々の意図された使用のために必要とされる。突然変異誘発による植物栽培は、この必要性を満たすことはできず、そして標的の植物遺伝子プール外であるいづれかの油性質の導入を提供する。高等植物は、FAS複合体の一部として、植物プラスチドオルガネラ（すなわちクロロプラスト、プロプラスチド又は他の関連するオルガネラ）における通常の代謝経路を通して脂肪酸を合成すると思われる。（脂肪酸とは遊離脂肪酸及びアシル−脂肪酸基を意見する）。プラスチドオルガネラを除いて、脂肪酸はトリアシルグリセロール（トリグリセリド）中に組込まれ、そして植物膜及び中性脂質において使用される。油が生成され、そして未来での使用のためにエネルギー源として貯蔵される種子を開発する場合、FASがプロプラスチドに存在する。脂肪酸の生成は、酵素、β−ケトアシル−ACPシンターゼIIIにより触媒されるブチリル−ACPを生成するためにアセチル−CoAとマロニル−ACPとの間での反応によりプラスチドにおいて始まる。16−及び18−炭素の脂肪酸へのアセチル−AC Pの拡張は、次の反応の順の環化作用を包含する：β−ケトアシル−ACPを形成するためのマロニル−ACPからの２炭素ユニットとの縮合（β−ケトアシル−ACPシンターゼ）、アルコールへのケト−機能の還元（β−ケトアシル−ACPレダクターゼ）、エノイル−ACPを形成するための脱水（β−ヒドロキシアシル−ACPデヒドラーゼ）及び最後に、拡張された飽和アシル−ACPを形成するためのエノイル−ACPの還元（エノイル−ACPレダクターゼ）。β−ケトアシル−ACPシンターゼＩはパルミトイル−ACP(Ｃ16：０)までの拡張を触媒し、そしてβ−ケトアシル−ACPシンターゼIIはステアロイル−ACP(Ｃ18：０)への最終拡張を触媒する。FASにより生成される最長鎖の脂肪酸は典型的には18個の炭素の長さである。一飽和脂肪酸はまた、デサチュラーゼ酵素の作用を通してプラスチドにおいて生成される。プラスチドに存在する追加の脂肪酸生化学段階は、ステアレート、すなわち、 18炭素アシル−ACPに対するその高い活性のために、しばしば、“ステアロイル −ACPデサチュラーゼ”ともいわれるΔ−９デサチュラーゼによりしばしば触媒される反応においてオレオイル−ACP(Ｃ18：１)を形成するためのステアロイル −ACP(Ｃ18：０)の不飽和化である。デサチュラーゼ酵素は、下記反応（Ｉ）に従って９番目の炭素で二重結合を付加するように働く：ステアロイル−ACP＋フェレドキシン（II）＋Ｏ₂＋２Ｈ⁺→ オレオイル−ACP＋フェレドキシン（III）＋２Ｈ₂Ｏ．プラスチドにおける炭素−炭素伸張は、グリセロール３−ホスフェートへのアシル基の移行により停止され、そして得られるグリセロ脂質がプラスチドの“原核性”脂質生合成経路に保持される。他方、特定のチオエステラーゼは、遊離脂肪酸及びACPへのその新しく生成されるアシル−ACPの加水分解により原核性経路を阻止することができる。続いて、遊離脂肪酸はプラスチドを出、そしてリン脂質、トリグリセリド及び他の中性脂質の形成を担当する小胞体において“真核性 ”脂質生合成経路中に導入される。これまでは、18：１−ACPチオエステラーゼに対して特異的な植物アシル−ACP チオエステラーゼは知られており、そして“長鎖”−又は“オレオイル”−ACP チオエステラーゼと称せられる。核遺伝子によりコードされる18：１−ACPチオエステラーゼは、細胞質においてプレタンパク質として合成され、そして続いて、プラスチド中に導入される。配列はいくつかの被子植物から得られており、そして遷移性ペプチドにおける高い変動性は別として、それらはお互いひじょうに類似する。最近、Pollard，et al.，（Arch．of Biochem．and Biophys．（1991）284：１−７）は、California Bay のウンベリュラリアカリホルニア(Umbellularia california)の発育する油種子において中間鎖のアシル−ACPチオエステラーゼ活性を同定した。この活性は、発育する子葉がラウロイル（12：０）及びカプロイル（10：０）脂肪酸とのトリグリセリドのほぼ独占的な生成を開始する場合にのみ現れる。この研究は植物における中間鎖脂肪酸合成のための機構についての第１の証拠を表わした。続いて月桂樹のチオエステラーゼがDavies et al.，（Arch．Biochem．Biophys．（199 1）290：37−45）により精製されており、これは関連するクローンを得、そして植物のトリグリセド組成を変性するために使用されて来た対応するcDNAのクローニングを可能にした(Voelker et al．（1992）Science 257：72−74；WO91／164 21及びWO92／20236)。小胞体への遊離脂肪酸の輸送に続いて、トリグリセリドのための続く連続的な段階が生じ得る。たとえば、多不飽和脂肪アシル基、たとえばリノレオイル及び α−リノレノイルが、膜結合性酵素の作用によりオレオイルアシル基の連続的な不飽和化の結果として生成される。そのような膜結合性酵素の可溶化の困難性が、それらの酵素を特徴づけるため努力を妨げて来た。追加の二重結合が12位の炭素で付加され、そしてその後、付加された場合、それぞれΔ−12デサチュラーゼ及びΔ−15デサチュラーゼの作用を通して15位の炭素で付加される。従って、それらの“デサチュラーゼ”は、それぞれ一又は多不飽和脂肪酸を創造する。次に、トリグリセリドが１−，２−及び３−アシル−ACPトランスフェラーゼ酵素、グリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ及びジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの作用により形成される。植物細胞の脂肪酸組成は、アシルトランスフェラーゼ活性の結果としてトリグリセリド中に組込まれる遊離脂肪酸プール及び脂肪酸（脂肪アシル基）の反映である。従って、トリグリセリド分子においては、下記式（Ｉ）：〔式中、Ｘ，Ｙ及びＺは、お互い同じであっても良く又はお互い異なっていても良い脂肪アシル基をそれぞれ表わす〕として表わされる。トリグリセリドにおける異なった位置での脂肪アシル基の種々の組合せが、トリグリセリドの性質を変えるであろう。たとえば、脂肪アシル基がほとんど飽和された脂肪酸である場合、トリグリセリドは室温で固体であろう。しかしながら、一般的に植物油は異なったトリグリセリドの混合物であろう。従って、トリグリセリド油の性質は、それらのそれぞれの脂肪アシル組成により影響される、油を製造するトリグリセリドの組合せの結果である。たとえば、ココアバターは、そのトリグリセリド組成の機能である一定の所望する性質（マウスフィール、鋭い融点、等）を有する。ココアバターは、およそ 24.4％のパルミテート（16：０）、34.5％のステアレート（18：０）、39.1％のオレエート（18：１）及び２％のリノレエート（18：２）を含む。従って、ココアバターにおいては、パルミトイル−オレオイル−ステアロイル(POS)（すなわち、Ｘ，Ｙ及びＺはそれぞれ式Ｉにおける通りである）は、トリグリセリド組成物のほとんど50％を包含し、そしてステアレート−オレエート−ステアレート(SOS )及びパルミトイル−オレオイル−パルミトイル(POP)は、トリグリセリド組成物のそれぞれ39％及び16％のバランスでの主要部分を包含する。対象の他の新規油組成物は、トリグリセリド分子の個々の位置で中間鎖の脂肪酸を有するトリエルシン（３個のエルカ酸）又はトリグリセリドを包含する。パルミトイルが式ＩのＸ及びＺ位置でエステル化されており、そしてＣ18脂肪アシル基がＹで存在するトリグリセリド分子が特に興味の対象である。そのようなPXP(パルミトイル−Ｃ18−パルミトイル)分子に富んでいる植物油はショートニング用途に一定の所望する性質を有し、そして消費者又は産業食品製造者のために機能的な効果を高めるために固体ショートニングへの添加剤として使用されるであろう。たとえば、ジパルミテートは、ケーキベーキング用途のために全体の脂肪の適切な結晶化を付与するためにベーキング及びフライ用途のためのショートニングに添加され得る。さらに、ジパルミテートは他の可能な脂肪添加剤、たとえばジステアレートよりも溶融性質に対して低い効果を有し、そしてベーキング物内で高い“広がり能力”を有するショートニングを製造するために使用され得る。ジパルミテート含有ショートニングのこの性質は、ショートニングがたとえばパイ皮又は甘味物において積層成分として使用される場合、特に興味の対象である。さらに、パルミテート及び／又はステアレート脂肪酸からの、飽和脂肪酸含有に富む植物油は室温で固体でありがちである。そのような植物脂肪は、化学的な水素化の必要性を伴わないで、ショートニング、マーガリン及び他の“広がる” 食品に直接的に使用され得る。水素化は、液体油における不飽和脂肪酸を飽和形に転換する工程であり、この工程は油をマーガリン及びショートニング用途に有用な固体脂肪に転換する。化学的な水素化に関連する費用及び他のいづれかの要因は、植物油が植物種子において富んでいるパルミテート及び／又はステアレートであるように構築される場合に回避され得る。パルミテート及びステアレートがトリグリセリドのsn−２位から除外されている植物油がこれに関して特に興味の対象である。さらに、パルミトイル及びステアロイル脂肪アシル基の有意な割合（すなわち 40％）を含む植物油に由来する脂肪酸は、そのような植物油から得られるパルミテートに富む画分の所望する軟化性質のために食品乳化用途に使用される。従って、種々の植物油変性、たとえば一定の油製品のための代用の収穫物源及び／又は植物種子のための新規脂肪酸組成物を付与するための手段が所望される。図面の説明図１．マンゴ・クラスＩアシル−ACPチオエステラーゼcDNAクローンの核酸配列及び翻訳されたアミノ酸配列を提供する。図２．マンゴ・クラスIIアシル−ACPチオエステラーゼcDNAクローン（MANI− ２）の核酸配列及び翻訳されたアミノ酸配列を提供する。図３．ニラからの部分的なクラスIIアシル−ACPチオエステラーゼcDNAクローン８−２のDNA配列を提供する。図４．ニラからの完全な長さのクラスIIアシル−ACPチオエステラーゼcDNAクローン９−１のDNA配列を提供する。図５．月桂樹のクラスIIＣ12好適アシル−ACPチオエステラーゼcDNAクローンの核酸配列及び翻訳されたアミノ酸配列を提供する。図６．完全な長さのクラスIIクフェアホーケリアナ(Cuphea hookeriana)チオエステラーゼ（CUPH−２）cDNAクローン、CMT７の核酸配列及び翻訳されたアミノ酸配列を提供する。図７．完全な長さのクラスIIクフェアホーケリアナチオエステラーゼ（CUPH− １）cDNAクローン、CMT９の核酸配列及び翻訳されたアミノ酸配列を提供する。図８．ニレＣ10：０−ACPチオエステラーゼ（クラスII）部分的cDNAクローンの核酸配列及び翻訳されたアミノ酸配列７を提供する。図９．樟脳PCR−生成チオエステラーゼをコードする配列７の核酸配列及び翻訳されたアミノ酸配列を提示する。図10．月桂樹のチオエステラーゼ遺伝子のクラスIIを表わす、月桂樹のチオエステラーゼクローン、月桂樹のＤの核酸配列及び翻訳されたアミノ酸配列を提示する。図11．ブラシカカンペストリス(Brassica campestris)の長鎖アシルACPチオエステラーゼクローンの核酸配列及び翻訳されたアミノ酸配列を示す。図12．第２のマンゴクラスIIクローン（Ｍ４−23）の核酸配列及び翻訳されたアミノ酸配列を提供する。図13．Ｃ16：０−ACPチオエステラーゼCUPH-１（Ch FatB1）構造体pCGN4800により形質転換された植物からのブラシカナプス(Brassica napus)212／86プールの種子サンプルの脂肪酸分析。図14．ニレのクラスIIアシル−ACPチオエステラーゼ構造体PCGN4803により形質転換された植物からのブラシカナプス212／86プールの種子サンプルの脂肪酸分析。発明の要約本発明は、植物チオエステラーゼ、特異的にはトランスジェニック植物種子においてＣ16：０（パルミテート）脂肪酸を生成できる植物アシル−ACPチオエステラーゼに関する。そのようなアシル−ACPチオエステラーゼはパルミトイル−A CPチオエステラーゼとして本発明においては言及されるが、しかしまた、種々の鎖長の他のアシル−ACPに対する活性をも示す。本発明によれば、植物種子細胞において植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼの発現のために有用なDNA構造体が記載される。そのような構造体は、そのような構造体がトランスフェニック植物において発現される場合、他の植物組織と比較して、種子組織において選択的に発現を指図できる調節要素の制御下でパルミトイル−ACP加水分解活性を有する植物チオエステラーゼをコードするDNA配列を含むであろう。DNA構造体の少なくとも１種の要素は少なくとも１種の他の要素に対して異種であり、又は植物細胞に見出される場合、少なくとも１種の要素が植物細胞に対して異種であろう。異なった態様において、植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼを発現できる第１のDNA構造体、及びアンチセンスステアロイル−アシルACPデサチュラーゼ配列を発現できる第２のDNA構造体を含む宿主植物細胞が所望される。そのような第１のDNA構造体は、そのような構造体がトランスゲニック植物において発現される場合、他の植物組織に比較して、種子組織において植物チオエステラーゼの発現を選択的に指図できる調節要素の制御下で対象の植物パルミトイル−ACP チオエステラーゼをコードするDNA配列を含むであろう。第２のDNA構造体は、植物宿主の種子細胞において植物ステアロイル−アシルACPデサチュラーゼアンチセンス配列の転写を指図できる調節要素の制御下でアンチセンス配向に位置する植物ステアロイル−アシルACPデサチュラーゼ要素をコードするDNA配列を含むであろう。さらに異なった態様において、本発明は、植物種子細胞に生成される遊離脂肪酸の割合の変性のために植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼをコードするD NA配列を用いる方法に関する。同様のやり方で、本発明は、トリグリセリドの組成、すなわち高められたレベルのＣ16脂肪アシル基を含むように植物種子により生成される植物油を変性するためにそのような植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼをコードする配列を用いる方法に関する。植物及び植物部分、特に種子及びそのような変性された脂肪酸組成を有する、そのような種子から抽出された油が本明細書において企図される。本明細書において例示される植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼ配列は、ニラ類、マンゴ、クフェアホーケリアナ及びニレから得られる配列を包含する。発明の詳細な記載本発明により、植物においてパルミテート（Ｃ16：０）の高められた蓄積のための機構が立証される。すなわち、Ｃ16：０−ACP基質に対する活性を有する植物アシル−ACPチオエステラーゼを、提供し、そしてトランスゲニック植物の種子に発現される場合、高められたレベルのパルミテートの生成を導びくことを立証する。多くの植物アシル−ACPチオエステラーゼのコード配列及び翻訳されたアミノ酸配列の分析は、“クラスＩ”又は“Fat Ａ”（脂肪アシルトランスフェラーゼタイプＡ）及び“クラスII”（又は“Fat Ｂ”）として命名した、植物アシル− ACPチオエステラーゼの２種の進化クラスの存在を示した。それらのクラスは、チオエステラーゼをコードする配列が得られた種々の植物の系統分類関係の単純な考えではない。たとえば、クフェアホーケリアナFat Ａクローン（WO94／10288の図10におけるクローンCLT７）は、ベニバナFatＡクローン（WO9 2／20236の図４に提供される配列）に密接して関連する。対照的に、クフェアホーケリアナFat Ｂクローン（図７のCUPH−１クローン）は、クフェアホーケリアナFat Ａクローン及びベニバナFat Ａクローンとは進化関係において同程度に異なっている。クラスＩチオエステラーゼは、マンゴ（図１）、ベニバナ、ブラシカカンペストリス及びクフエアホーケリアナに見出されており、これらの配列は現在継続中である1992年９月21日に出願されたUSSN07／949，102及びWO92／20236及びWO94 ／10288に提供される。クラスIIチオエステラーゼはカリフォルニアの月桂樹（図５及び１０）、ニレ（図８）、クフェアホーケリアナ（図６及び７）、及び樟脳（図９）に発見されている。現在、すべての既知植物の中間鎖を好むアシル− ACPチオエステラーゼはクラスIIタイプのものであり、そしてすべての既知の18 ：１−ACPチオエステラーゼはクラスＩタイプのものである。驚くべきことには、図７に示されるクフェアホーケリアナクラスIIクローンは、パルミトイル−ACP脂肪酸に対して選択的な活性を有し、そしてトランスゲニック植物の種子において発現される場合、トリグリセリド中に組込まれるＣ16：０脂肪アシル基の含有率を高めるように脂質合成経路を変えることができることが発見された。この発見は、このクフェア種がその種子貯蔵脂質においてＣ８及びＣ10脂肪アシル基を主に蓄積するので予想できなかった。クフェアＣ16：０− ACPチオエステラーゼは、種々の植物組織、たとえば葉、茎及び根に発現されることが示されており、ところがＣ８：０及びＣ10：０基質に対して選択的に活性である異なったクフェアクラスIIチオエステラーゼ（CUPH−２；図６）は種子組織に選択的に発現された。クラスIIアシル−ACPチオエステラーゼクローンは、月桂樹のＣ12：０−ACPチオエステラーゼクローンに対するランダムにクローン化されたcDNAフラグメントの相同性に基づいてアラビドプシスシリク(Arabidopsis silique)cDNAライブラリーにも発見された。アラビドプシスのチオエステラーゼをコードする完全な長さのcDNAクローンがまた得られ、そして広範囲のアシル−ACP基質、たとえば16 ：０−ACPに対する活性を有するチオエステラーゼをコードすることが示された。従って、クラスIIタイプの脂肪アシル−ACPチオエステラーゼ配列は中間鎖の長さの脂肪酸を蓄積することが知られていない植物種に見出され得ることが現在わかっている。そのようなアシル−ACPチオエステラーゼ配列がたとえば、Ｃ16 ：０−ACP基質に対する有意な又は好ましい活性を有するそれらのクローンを同定するために、Ｅ．コリ（E.coli）又は植物細胞における発現により試験され得る。本出願においては、クフェアホーケリアナのパルミトイル−ACPチオエステラーゼのcDNA配列（図７）、並びにマンゴ（図２及び12）及びニラ類（図３及び４）からの追加のＣ16：０−ACPチオエステラーゼ配列が提供される。さらに、ニレアシル−ACPチオエステラーゼクローンのDNA配列が提供される（図８）。トランスジェニック植物種子におけるニレクローンの発現は、トリグリセリドにおける高められた割合のＣ16：０脂肪アシル基、並びにＣ16：０脂肪アシル基の割合のより低い上昇率をもたらす。トランスジェニク植物種子油のパルミトイル含有率を高めるために使用され得る、それらのすべてのアシル−ACPチオエステラーゼ配列は、他のクラスII植物チオエステラーゼタンパク質との有意な配列の同一性を示す。Ｃ16：０脂肪酸の有意な存在性を有する植物はまた、天然由来のパルミトイル−ACPを好む植物チオエステラーゼを得るための候補体でもある。しかしながら、パルミテートの有意な存在性を有さない他の植物源はまた、他の酵素源としてスクリーンされ得ることもまた認識される。上記で論ぜられたように、パルミトイル−ACPチオエステラーゼ活性を示すタンパク質は、“クラスII ”チオエステラーゼとして本明細書において知られている特定クラスのアシル− ACPチオエステラーゼに関して、DNA及びアミノ酸レベルで高い程度の相同性を示すであろうと思われる。従って、いづれかの対象の植物において追加の植物のパルミトイル−ACPチオエステラーゼについて容易にスクリーンすることが可能である。次の例により詳細に記載されているように、Ｃ16：０脂肪酸に対する活性を有するアシル−ACPチオエステラーゼは、種子トリグリセリドにおけるＣ16：０脂肪酸の百分率の上昇を伴って、標的のトランスジェニック植物の種子に発現され得る。たとえば、トランスジェニック性ブラシカナプス(Brassica napus)植物の種子においてのクフェア・ホーケリアナ（Cuphea hookeriana）クローン、CUPH −１（Ch Fat Ｂ１）としても知られている）の発現は、プールされた種子サンプルにおいて７〜26モル％の範囲のＣ16：０種子脂肪酸含有率を有する形質転換体をもたらす。選択された形質転換体からの個々の種子の分析は、34モル％までのＣ16：０脂肪酸含有率を示した。同様に、マンゴクラスIIクローン（図２に示されるMANT−２配列）の発現は、プールされた種子サンプルにおいて７〜16モル％の範囲のＣ16：０種子脂肪酸含有率を有する形質転換体をもたらす。ニレからのクラスIIアシル−ACPチオエステラーゼの発現（図８）は、15〜32モル％の範囲のＣ16：０のプールされた種子脂肪酸含有率を有するトランスジェニックブラシカナプスを生成する。さらに、Ｃ14：０脂肪酸含有率は、２〜12モル％の範囲のレベルにそれらの種子において高められ、そしてＣ10：０（４モル％まで）及びＣ12：０（ 15モル％まで）における上昇がまた観察される。形質転換された種類の非トランスジェニック種子におけるＣ12：０，Ｃ14：０及びＣ16：０脂肪酸のバックグラウンド・レベルはそれぞれ、約0.02，0.14及び６モル％である。非トランスジェニック種子におけるＣ10：０脂肪酸は典型的には、１％以下で存在するものとして決定される。（対照におけるＣ10：０バックグラウンド値は、そのレベルが非トランスジェニックブラシカナプス植物種子の分析において０〜１％に変化する場合、非Ｃ10：０ピークの機械読み取りの結果であり得る。）記載されたトランスジェニック植物のTAG位置分析は、その種子トリグリセリドのsn−２位置からのＣ16：０脂肪アシル基の除外を示すことが予測される。ブラシカ（Brassica）植物における種子ミクロソーム２−アシルトランスフェラーゼは、Ｃ18：１−Co A以外の基質に対して効果的な活性を示さない。さらに、月桂樹Ｃ12：０−ACPチオエステラーゼにより形質転換された植物における種子脂質は50モル％までのＣ 12：０脂肪酸を含むが、しかしＣ12：０アシル基はトリグリセリドのsn−１及び sn−３位置にほとんど独占的に位置した(WO92／20236)。本発明の植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼDNA配列はタンパク質、ポリペプチド又はペプチドフラグメントの形でアミノ酸をコードし、このアミノ酸は植物酵素反応条件下でパルミトイル−ACP基質からＣ16：０遊離脂肪酸（すなわちパルミテート）の生成を触媒する能力を示す。“酵素反応条件”とは、いづれかの必要な条件が酵素の機能を可能にするであろう環境（すなわち、温度、pH、阻害物質の欠乏のような因子）に利用できることを意味する。抗体調製物、核酸プローブ(DNA及びRNA)及び同様のものが調製され得、そして種々の植物源から“相同”又は“関連する”パルミトイル−ACPチオエステラーゼをスクリーンし、そして回収するために使用され得ることを当業者は容易に認識することができるであろう。典型的には、核酸プローブは、酵素又は他の方法もまた使用され得るが、好ましくは放射能によりラベルされ、検出を可能にされる。免疫学的なスクリーニング方法に関しては、抗体調製物、たとえばモノクローナル又はポリクローナル抗体が利用される。ポリクローナル抗体は、ほとんど特異的ではないが、典型的には、遺伝子単離においてより有用である。検出に関しては、抗体は放射能を用いて、又は市販の種々の第２抗体／酵素結合体システムのいづれか１つを用いてラベルされる。前記利用できる抗体検出システムのいくつかの例がOberfilder（Focus（1989）BRL Life Te chnol.，Inc.，11：１〜５）により記載されている。相同の配列が、配列の同一性が存在する場合、見出され、そして配列の情報、核酸又はアミノ酸の比較、又は既知のチオエステラーゼと候補体源との間のハイブリダイゼーション反応を通して決定され得る。保存性変化、たとえばGlu／Asp ，Val／Ile，Ser／Thr，Arg／Lys、及びGln／Asnはまた、配列の相同性を決定することにおいても考慮され得る。典型的には、長い核酸配列は、50〜60％の配列同一性及びより好ましくは少なくとも約70％の配列同一性を、標的の配列と存在し、そしてさらに関連していると思われるいづれかの欠失を除外する対象の一定の植物チオエステラーゼとの間に示すことができる。アミノ酸配列は、２種の完全な成熟タンパク質間に25％ほどの配列同一性により相同であると思われる。（一般的に、Doolittle，R.F.，OF URFS and ORFS(University Science Books，CA ，1986)を参照のこと）すべての植物チオエステラーゼは核酸レベルで約50％の配列同一性を示すが、クラスIIのメンバー間における配列同一性の百分率は少なくとも60％に高まる。アミノ酸レベルで、カリフォルニア月桂樹におけるアミノ酸60〜アミノ酸150に相当する領域は、クラスIIチオエステラーゼのメンバー間にひじょうに高い程度の保存性を示すであろう。追加のパルミトイル−ACPチオエステラーゼを得るためには、対象の候補体植物源から調製されたゲノム又は他の適切なライブラリーは、相同的に関連する配列を同定するために１又は複数のクラスII植物チオエステラーゼからの保存された配列によりプローブされる。次に、陽性クローンが、制限酵素消化及び／又は配列決定により分析される。ゲノムライブラリーが使用される場合、コード領域並びそのような植物源からのチオエステラーゼ遺伝子の転写調節要素の両者を供給する１又は複数の配列が同定され得る。プローブはまた、完全な配列よりも相当に短い。オリゴヌクレオチドが使用され得るが、しかし少なくとも約10、好ましくは少なくとも約15、より好ましくは少なくとも20個の長さのヌクレオチドであるべきである。より短い長さの領域が比較のために使用される場合、より高い程度の配列同一性がより長い配列のためによりも必要とされる。より短いプローブは、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)のために、特に高く保存された配列が同定され得る場合、特に有用である。(Gould，et al.，PNAS USA（1989）86：1934−1938 を参照のこと）より長い核酸フラグメントがプローブとして使用される場合(100bp以上)、特に完全な又は大きなcDNA配列を用いる場合、20〜50％の偏差を伴っての標的サンプルからのシグナル、すなわち相同配列を得るためには、中適度に高い緊縮性(s tringencies)（たとえば最少の洗浄を伴って37℃で50％のホルムアミドを用いる）を伴ってさらにスクリーンすることができる。（スクリーニング技法に関する追加の情報のためには、Beltz，et al.，Meth．Enzymology（1983） 100：266〜285を参照のこと）再び、図２〜10に示されるような配列が相同の植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼを同定するために使用され得るのみならず、また、それから得られる配列は他の植物源から植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼを得るための追加の方法を提供できる。特に、PCRは、本明細書は提供される配列データから関連する植物チオエステラーゼを得るために有用な技法であり得る。当業者は、配列の比較又は典型的には高く保存された配列の領域に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを企画することができるであろう。核酸配列が得られた後すぐに、宿主細胞における植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼの転写、又は転写及び翻訳（発現）が、酵素の容易な源を生成し、そして／又は脂肪酸及び／又は本明細書において見出されるトリグリセリドの組織を変性するために所望される。他の有用な用途は、宿主細胞が植物宿主細胞である場合、インビトロ及びインビボで見出される。たとえば、植物FAS複合体に利用できるパルミトイル−ACPを好むチオエステラーゼの量を高めることによって、パルミテートの高められた百分率が提供され得る。同様の態様において、いくつかの用途に関して、利用できるパルミトイル− ACPチオエステラーゼの量の上昇と同時に植物FAS複合体に利用できるステアロイル−ACPデサチュラーゼの量を低めることによって、飽和脂肪酸及びパルミテートの実質的な上昇が得られる。植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼをコードする核酸配列が種々の構造体において、たとえば追加の配列を得るためのプローブとして使用され得る。他方、それらの配列は、ヒンビトロ又はインビボでの酵素の回収又は研究のために宿主細胞における対象のそれぞれのチオエステラーゼのレベルを高めるために、又は宿主細胞が植物実在物、たとえば植物細胞、植物部分（種子、切り枝又は組織に限定されない）及び植物である場合、いくつかの用途のために対象のそれぞれのチオエステラーゼのレベルを低めるために適切な調節配列と一緒に使用され得る。本発明の植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼをコードする核酸配列は、ゲノム、cDNA又はmRNA配列を包含することができる。“コードする(encoding)” とは、配列が特定のアミノ酸配列にセンス又はアンチセンス方向において一致することを意味する。“染色体外”とは、その配列が天然において関連する植物ゲノムの外部に存在することを意味する。“組換え体”とは、その配列が変異誘発による操作、制限酵素及び同様のものを通して、遺伝的に構築された変性を含むことを意味する。cDNA配列は、プレプロセッシング配列、たとえば輸送(transit )ペプチド配列を含んでも又は含まなくても良い。輸送ペプチド配列は、一定のオルガネラへのタンパク質の輸送を促進せしめ、そしてオルガネラ中への侵入に基づいてアミノ酸成分から切断され、“成熟”配列が放される。前駆体植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼDNA配列の使用は、植物細胞発現カセットにおいて好ましい。他のプラスチド輸送ペプチド配列、たとえば種子ACPの輸送ペプチドは、対象の種々のオルガネラに本発明の植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼをトランスロケートするために使用され得る。11／15／89に出願されたU.S. 07／437,764号及びヨーロッパ特許出願公開第189,707号を参照のこと。同様の態様において、一定の植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼ輸送ペプチドが得られた後すぐに、それは、その天然のコード領域以外の配列をトランスロケートするために使用され得る。種々のクラスIIチオエステラーゼクローンに対する配列の比較は、それらのチオエステラーゼクローンのための輸送ペプチド領域についての情報を提供する。精製された月桂樹Ｃ12：０−ACPチオエステラーゼの成熟Ｎ−末端は、残基84としてのアミノ酸配列決定により本来決定された(Voelker et al．（1992）Science 257：72−74)。しかしながら、これは、すべてのFat Ｂ代表物（月桂樹チオエステラーゼのためには残基60−82；図５）間に保存されるほとんどのＮ−末端領域を輸送ペプチド中に配置する。この配列は、高い程度の配列保存のためのみならず、また、それが疎水性ドメインに類似するチラコイド遷移性ペプチドを含むので、ストロマ輸送ペプチドのためには異例であろう。この保存された領域は輸送配列の一部ではなく、そしてそれはプロセスされた成熟タンパク質のＮ−末端部分に含まれると思われる。トランスゲニックカノラ種子における月桂樹チオエステラーゼの発現は40KD、すなわち34KDの精製された種子タンパク質よりも長いMrを有する月桂樹チオエステラーゼを生成するこの仮説と調和する。この40KD形は月桂樹チオエステラーゼのインビボ状態を表わし、そして34KD 形は精製の間の限定されたＮ−末端のタンパク質加水分解に起因する。さらに、上記で論ぜられたように、植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼの完全なゲノム配列が、プローブ、たとえばcDNAプローブによりゲノムライブラリーをスクリーニングし、そして種子組織における発現を調節するそれらの配列を単離することによって得られる。この態様においては、植物パルミトイル−AC Pチオエステラーゼの転写及び翻訳開始領域、イントロン及び／又は転写終結領域が、チオエステラーゼ構造遺伝子を伴って又はそれを伴わないで、種々のDNA 構造体への使用のために得られる。従って、本発明の植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼに対応する核酸配列はまた、プラスチド中への輸送を指図するのに有用なシグナル配列、有用な組織及びタイミングプロフィールを有する５′上流の非コード調節領域（プロモーター）、転写及び翻訳調節領域として有用な３′下流の非コード調節領域も提供することができ、そして遺伝子の他の特徴に対する洞察力を寄与する。所望する植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼ核酸配列が得られた後すぐに、それは種々の手順で操作され得る。その配列が非コード領域を包含する場合、フランキング領域は再切断、変異誘発、等にゆだねられ得る。従って、トランジッション、トランスバージョン（変異）欠失及び挿入が、天然に存在する配列に対して実施され得る。さらに、その配列のすべて又は一部が合成され得る。構造遺伝子においては、１又は複数のコドンが、変性されたアミノ酸配列を提供するために変性され得、又は１又は複数のコドン変異が構成又は発現に関与する便利な制限部位又は他の目的を提供するために導入され得る。構造遺伝子は、合成アダプター、１又は複数の便利な制限部位を導入するためのリンカー又は同様のものを用いることによってさらに変性され得る。本発明の植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼをコードする核酸又はアミノ酸配列は種々の手段で他の非天然の又は“異種(heterologous)”配列と組合され得る。 “異種”配列とは、植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼに連結されることが天然において見出されていないいづれかの配列を意味し、そしてたとえば、天然において一緒に連結することが見出されていない同じ植物からの核酸配列の組合せを意味する。本発明の植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼをコードするDNA配列は、そのチオエステラーゼに通常関連する遺伝子配列のすべて又は一部に関して使用され得る。その成分部分においては、DNAチオエステラーゼコード配列が、転写の５′から３′方向に、宿主細胞において転写及び翻訳を促進できる転写開始制御領域、植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼをコードするDNA配列及び転写及び翻訳終結領域を有するDNA構造体において組合される。可能性ある宿主細胞は原核及び真核細胞の両者を包含する。宿主細胞は単細胞であり得、又はその意図された使用に依存して多細胞分化又は未分化有物に見出され得る。本発明の細胞は、本明細書に存在する野生型細胞に関係しない植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼを有することにより、たとえば植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼをコードする組換え核酸構造体を有することにより区別され得る。宿主に依存して、調節領域、たとえばウィルス、プラスミド又は染色体遺伝子からの領域、又は同様のものは変化するであろう。原核又は真核微生物、特に単細胞宿主における発現のためには、広範囲の種類の構成又は調節可能なプロモーターが使用され得る。微生物における発現は、植物酵素の整った源を提供することができる。これまで記載されて来た転写開始領域間には、細菌及び酵母宿主、たとえばＥ．コリ（E.coli），Ｂ．サブチリス（B.subtilis）、サッカロミセスセレビシアエ(Sacchromyces cerevisiae)からの領域、たとえばβ−ガラクトシダーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、トリプトファンＥ及び同様のものが存在する。ほとんどの場合、構造体は植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼの変性された生成及びたぶん、脂肪酸組成の変性を提供する植物において機能的な調節領域を包含するであろう。植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼ又はその機械的なフラグメントをコードする読み取り枠が、その５′端で、転写開始調節領域、たとえばチオエステラーゼ構造遺伝子に向かって上流の５′に天然において見出される野生型配列に連結されるであろう。広範囲の種類の構成上の又は調節可能な、たとえば誘発できる、構造遺伝子機能の転写を提供する多くの他の転写開始領域が利用できる。植物のために使用される転写開始領域間には、例えばナパリン及びマンノピン・シンターゼのための構造遺伝子、又はナピン、ACPプロモーター及び同様のものに関連するそのような領域が存在する。そのような構造遺伝子に対応する転写／翻訳開始領域がそれぞれの開始コドンに対してすぐの５′上流で見出される。チオエステラーゼタンパク質の発現が植物宿主において所望される態様においては、完全な植物パルミトイル−AC Pチオエステラーゼ遺伝子のすべて又は一部の使用が所望され；すなわち構造遺伝子配列及び３′下流の非コード領域と一緒に、５′上流の非コード領域（プロモーター）のすべて又は一部が使用され得る。異なったプロモーター、たとえば対象の植物宿主に生来のプロモーター、又は変性されたプロモーター、すなわち１つの遺伝子源に由来する転写開始領域及び異なった遺伝子源に由来する翻訳開始領域（ここで対象の植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼをコードする配列を包含する）を有するプロモーター、又は増強されたプロモーター、たとえば二重35Ｓ CaMVプロモーターが所望される場合、その配列は標準の技法を用いて一緒に連結され得る。５′上流の非コード領域が種子の成熟の間に調節される他の遺伝子から得られるそのような出願には、植物胚組織において選択的に発現されるもの、たとえは ACP及びナピン由来の転写開始制御領域が記載されている。そのような“種子特異的プロモーター”が得られ、そして１／25／88出願のアメリカ特許出願第07／ 147,781号（現在、７／９／90出願のアメリカ特許出願第07／550,804号）及び表題“Novel Sequences Preferentially Expressed In Early Seed Development a nd Methods Related Thereto”を有する、1990年３月16日に出願されたアメリカ特許出願第07／494,722号の教授に従って使用され得る。種子組織において選択的に発現される、すなわち他の植物部分において検出できない転写開始領域が、遺伝子生成物のいづれかの分裂性又は逆効果を最少にするために脂肪酸変性のために所望されると思われる。調節転写終結領域は、同様に本発明のDNA構造体に供給され得る。転写終結領域は、植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼをコードするDNA配列又は異なった遺伝子源に由来する便利な転写終結領域、たとえば転写開始領域に天然において関与する転写終結領域により提供され得る。転写終結領域が異なった遺伝子源からである場合、それは少なくとも約0.5kb、好ましくは約１〜３kbの配列を含み、ここで前記配列は終結領域が由来する構造遺伝子の３′側に存在する。高められた又は低められた発現のための対象のDNA配列として植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼを有する植物発現又は転写構造体が、広範囲の種類の植物生命体、特に食用及び産業使用のために植物油の生成に関与する植物生命体を伴って使用され得る。適切な油性種子収穫物が最とも好ましい。対象の植物は、ナタネの種子（カノラ及び高エルカ酸品種）、ヒマワリ、ベニバナ、綿花、クフェア（Cuphea）、ダイズ、ナンキンマメ、ココヤシの実及びヤシ油及びトウモロコシを包含するが、但しこれだけには限定されない。宿主細胞中に組換え構造体を導入するための方法に依存して、他のDNA配列が必要とされ得る。重要なことには、本発明は双子葉類及び単子葉類種に適用でき、そして新規及び／又は改良された形質転換及び調節技法に容易に適用できるであろう。形質転換の方法は本発明に臨界ではなく；植物形質転換の種々の方法が現在利用できる。より新しい方法が収穫物を形質転換するために利用できるので、それらはここで直接的に適用され得る。たとえば、アグロバクテリウムの感染に対して天然において敏感な多くの植物種は、アグロバクテリウム介在形質転換の三元又は二元ベクター法を通して都合良く形質転換され得る。さらに、種々の単子葉及び双子葉植物種の形質転換を可能にする、マイクロインジェクション、DNA粒子衝撃、エレクトロポレーションの技法が開発されて来た。 DNA構造体を開発する場合、その構造体又はそのためのフラグメントの種々の成分が、細菌宿主、たとえばＥ．コリにおいて複製できる便利なクローニングベクター中に通常挿入されるであろう。文献に記載されて来た種々のベクターが存在する。個々のクローニングの後、プラスミドが単離され、そして所望する配列の成分を適合せしめるために追加の操作、たとえば制限、新規フラグメントの挿入、連結、欠失、挿入、再切断、等にゆだねられ得る。構造体が完結された後すぐに、次にそれは宿主細胞の形質転換の方法に従って追加の操作のために適切なベクターにトランスファーされ得る。通常、DNA構造体に包含されるものは、宿主における発現のための必要な調節領域を有し、そして形質転換細胞の選択を提供する構造遺伝子である。その遺伝子は、細胞毒性物質、たとえば抗生物質、重金属、毒素、等に対する耐性、栄養要求宿主に原栄養性を提供する相補性、ウィルス免疫性又は同様のものを提供することができる。異なった宿主種の数に依存して、発現構造体又はその成分が導入され、１又は複数のマーカーが使用され得、この際、選択のための異なった条件がその異なった宿主のために使用される。 DNAコードの縮重は、アミノ酸配列のいづれかの対応する変性を伴わないでDNA 配列のいくつかのコドンの置換が許容されることを提供することが注目される。上記のように、DNA構造体が植物宿主中に導入される方法は本発明に臨界的ではない。効果的な形質転換を提供するいづれかの方法が使用され得る。植物細胞の形質転換のための種々の方法は、Ti−又はRi−プラスミド、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、DNA粒子衝撃、リポソーム融合、DNA衝撃又は同様のものを包含する。多くの場合、特に左及び右のボーダー、より特定には左のボーダーを有する、Ｔ−DNAにより１つの又は両側に隣接している構造体を有することが所望されるであろう。これは、Ｔ−DNA ボーダーは形質転換の他の態様を使用するけれども、構造体が形質転換のための態様としてＡ．ツメファシエンス(A.tumefaciens)又はＡ．リゾゲネス（A.rhizogenes）を用いる場合、特に有用である。アグロバクテリウムが植物細胞形質転換のために使用される場合、アグロバクテリウム宿主に存在するＴ−DNA又はTi−又はRi−プラスミドによる相同組換えのためにアグロバクテリウム宿主中に導入され得るベクターが使用され得る。組換えのためにＴ−DNAを含むTi又はRi−プラスミドは武装され（嬰瘤（gall）形成を引き起こすことができる）、又は非武装され（嬰瘤形成を引き起こすことができない）、後者は、vir遺伝子が形質転換されたアグロバクテリウム宿主に存在する限り許容される。武装されたプラスミドは正常な植物細胞及び嬰瘤の混合物を付与することができる。アグロバクテリウムが植物細胞を形質転換するためのビークルとして使用される場合、Ｔ−DNAボーダーにより隣接される発現構造体は、広い宿主範囲のベクター中に挿入され、文献に記載される広い宿主範囲のベクターが存在する。pRK ２又はその誘導体が通常使用される。たとえば、Ditta et al.，PNAS USA（1980 ）77：7347−7351及びEPA0120515を参照のこと。発現構造体及びＴ−DNAは１又は複数のマーカーを含み、これは形質転換されたアグロバクテリウム及び形質転換された植物細胞の選択を可能にする、多くのマーカー、たとえばクロラムフェニコールに対する耐性、アミノグリコシドＧ418、ヒグロマイシン又は同様のものが、植物細胞との使用のために開発されて来た。使用される特定のマーカーは本発明には不可決ではなく、１又は複数のマーカーが特定の宿主及び構成の態様に依存して、好ましい。アグロバクテリウムを用いての植物細胞の形質転換のためには、外植片が組合され、そして形質転換のために十分な時間、形質転換されたアグロバクテリウムと共にインキュベートされ、細菌が殺害され、そして植物細胞が適切な選択培地において培養される。カルスが形成した後すぐに、菌条の形成が既知の方法に従って、適切な植物ホルモンを用いることによって促進され、そして菌条は植物の再生のために根づかせのための培地に移される。次に、植物は種子に成長せしめられ、そしてその種子がくり返しての再生を確立するために及び植物油の単離のために使用される。一旦、修飾された脂肪酸組成を有する種子を生成できるトランスジェニック植物が得られると、変異誘発法を包含する従来の植物育成技法がその脂肪酸組成をさらに操作するために使用され得る。他方、追加の外来性脂肪酸変性DNA配列が、その脂肪酸組成をさらに操作するために遺伝子技法により導入され得る。形質転換の方法は本発明においては臨界的ではないことが注目される。しかしながら、遺伝子構築性植物形質転換法、すなわち１つの所望するDNA配列を挿入する力の使用は臨界的である。これまでは、植物油の脂肪酸組成を変性する能力は植物交雑の間、性的に移行される特性又は変異誘発により生成される効果的に機能する特性の導入に限定された。種間遺伝子情報の導入を可能にする遺伝子工学技法の使用及び内因性遺伝子の組織特異性発現を調節する手段を通して、変性された脂肪酸組成を有する植物種子油の生成のための新規方法が利用できる。さらに、本明細書に記載される手段の適用に基づいて新規植物種子油の開発のための可能性が存在する。植物宿主細胞における植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼの発現と協調して対象の１又は複数の他の配列の転写、又は転写及び翻訳を提供するために選択できる。特に、植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼの発現と組合してのステアロイル−ACPデサチュラーゼの減じられた発現がいくつかの用途において好ましい。対象の１つ以上の核酸配列の組合された効果のために形質転換された植物を供給することを所望する場合、典型的には、別々の核酸構造体が個々のために供給されるであろう。上記のような構造体は転写、又は転写及び翻訳調節制御Ｐ領域を含む。当業者はそれぞれの発現又はアンチセンス構造体に関して示される上記原理に従って最終生成物に適切な所望するタイミング及び組織特異性を提供するために調節配列を決定できるであろう。複数の構造体が使用される予定である場合、それらが同じ脂肪酸変性配列又は異なった脂肪酸変性配列に両者とも関連しているかどうかについては、異なった調節配列が配列間の自発的な相同組換えを減じるために個々のカセットに使用されることが所望される。その構造体は、得られる生成物がそのゲノム中に組込まれる両特性を有する植物である限り、同じか又は異なった方法、たとえば従来の植物育成法を通してトランスゲニック植物を交雑することによってのそのような特性の導入により宿主細胞中に導入され得る。本発明の植物ステアロイル−ACPデサチュラーゼは、植物宿主細胞、すなわちインビボにおいて、又は植物細胞様環境、すなわちインビトロにおいて脂肪アシル−ACP成分中への第１の二重結合の挿入を触媒できる植物源から得られる、アミノ酸、たとえばタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドフラグメントのいづれかの配列を含む。“植物細胞様環境”とは、いづれかの必要な条件が、酵素の機能を可能にする環境（すなわち温度、pH、阻害物質の欠乏のような要因）において利用できることを意味する。特に、本発明は脂肪アシル−ACP鎖の９番目の炭素位置でそのような第１の二重結合を付加する酵素に関する。異なった特異性を有する本発明の類似する植物デサチュラーゼ酵素、たとえばニンジンのΔ−12デサチュラーゼが存在する。デサチュラーゼの量を減じることによって、飽和脂肪酸の高められた百分率が提供される。アンチセンス、トランスイッチ、リボザイム又はいくつかの他のステアロイル−ACPデサチュラーゼ低下技法を用いて、植物細胞に利用できるデサチュラーゼの量の低下が生成され、高い百分率の飽和物、たとえば１又は複数のラウレート（Ｃ12：０）、ミリステート（Ｃ14：０）、パルミテート（Ｃ16：０）、ステアレート（Ｃ18：０）、アラキデート（Ｃ20：０）、ベヘメート（Ｃ22 ：０）及びリグノセレート（Ｃ24：０）がもたらされる。ナタネ種子においては、減じられたデサチュラーゼは高められたステアレートレベル及び合計の飽和物をもたらす。高められたレベルのパルミテート又はパルミテート及びステアレートを有するトリグリセリドの生成が特に興味の対象である。さらに、種々の範囲のそのような飽和物の生成が所望される。従って、低い及び高いレベルのパルミテート又はパルミテート及びステアレート脂肪酸を有する植物細胞が企画されている。たとえば、10％レベルのパルミテート及びステアレートを有する、油を含む脂肪酸組成物及び約60％レベルまでのパルミテート及びステアレートを有するように企画された組成物、又は他のそのような変性脂肪酸組成物が企画されている。高められた百分率のパルミテート又はパルミテート及びステアレートを有する油が所望される。天然源から25倍までの範囲での高められたステアレート百分率（重量による）が記載されている。DNA構造体（たとえばプロモーターの選択、コピーの数、等）及び従来の育成法の種々の観点の操作により、当業者はステアレートのさらに高いレベルを達成できる。種子組織における植物パルミトイル− ACPチオエステラーゼの発現と組合しての植物デサチュラーゼ配列の組合せにより、高められた百分率のパルミテート及びステアレートがナタネ種子及び他の植物種において達成され得る。Ｃ．チンクトリウム（C.tinctorius）のデサチュラーゼ遺伝子のDNA配列、並びにリシナス（Ricinus）、ブラシカ（Brassica）及びシモンドシア（Simmondsi a ）植物からのデサチュラーゼ遺伝子のDNA配列が、1992年９月21日に出願された継続中のUSSN07／949,102に見出される。本発明は現在一般的に記載されており、例示目的であり、本発明を限定するものではない次の例により一層容易に理解されるであろう。実施例実施例１チオエステラーゼ遺伝子配列Ａ．マンゴ（Mango）マンゴのcDNAバンクを、Stratagene Zap cDNA Synthesis キット（Stratagene ：La Jolla，CA）に記載されるような方法を用いて用意する。マンゴの胚を、食料雑貨屋から購入されたグリーン（成熟しているが、柔らかくはない）マンゴから集める。合計のRNAを、Webb and Knapp(Plan＋Mol．Biol。Reporter(1990)８：180−195)のDNA単離法を変性することによって前記胚から単離する。緩衝液は次のものである： REC：50mMのトリスcl pH9，0.7MのNacl,10mMのETDA pH 8, 0.5％のCTAB。 REC＋：使用のすぐ前でβ−メルカプトエタノールを加えて１％にしている。 RECP：50mMのトリスcl pH9，10mMのEDTA pH８，及び0.5％ CTAB。 RECP＋：使用のすぐ前でβ−メルカプトエタノールを加えて１％にしている。組織１ｇの抽出のために、10mlのREC＋及びPVPP 0.5ｇを、液体窒素において砕かれ、そして均質化されている組織に添加する。その均質化された材料を1200 rpmで10分間、遠心分離する。その上清液を３mlの冷クロロホルム上にミラクロスを通して注ぎ、そして再び均質化する。12,000RPMで10分間の遠心分離の後、上部相を取り、そしてその体積を決定する。等体積のRECP＋を添加し、そしてその混合物を室温で20分間静置する。その材料を10,000rpmで20分間、２度遠心分離し、そして上清液を個々の回転の後、捨てる。ペレットを１μのNacl(DEPC)0. 4mlに溶解し、そして等体積のフェノール／クロロホルムにより抽出する。エタノール沈殿に続いて、ペレットをDEPC水１mlに溶解する。手短に言えば、cDNA合成のためのクローニング方法は次の通りである。第１の鎖cDNA合成は、Robinson，et al．(Methods in Molecalar and Cellular Biolog y(1992)３：118−127)によるいくらかの修正を伴ってのStatagene Instruction Manualに従ってである。特に、30μｇのLicl沈殿化された合計RNAが、５μｇのポリ（Ａ）＋RNAの代わりに使用され、そしてその反応は37℃よりもむしろ45℃ で１時間インキュベートされる。スクリーニングのため約300,000個のプラークを供給するために、0.9％のNZY 上部アガロースにおいて150mmのNZYプレート当たりLE392 Ｅ．コリ細胞上に約15 000pfuでプレートすることによって、前記ライブラリーをスクリーンする。プラークをColony／Plague Screen(NEN)上に持ち上げ、そして変、中和及びベーキングをStratagoneに記載されているようにして行なった。フィルターを、フィルター間にテフロンスクリーンを有するプラスチック製箱において、50％のホルムアミド、５×のSSC、10×のDenharts、0.1％（ｗ／ｖ） SDS、５mMのNa₂EDTA、0.1mg／mlの変性されたサケ精子DNA（２時間〜一晩）において室温で再ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、添加される10％（ｗ／ｖ）のデキストランスルフェート及びプローブを伴って上記と同じ緩衝液において室温で行なわれる。使用されるプローブは、図11に示される配列のヌクレオチド27-1191を含むブラシカクラスエチオエステラーゼのフラグメントである。フィルターを１×SSC／0.1％SDSにより２分間、そして0.1×SSC／0.1％SD Sによりそれぞれ20分間２度洗浄する。フィルターをＸ−線フィルムに一晩暴露する。26個のハイブリダイズするプラークを同定する。プラーク精製及びファーゲミド(phagemid)切断を、Stratagene Zap cDNA Synthesis Kitの指示に記載されているようにして行なう。分析された25個の精製されたファーゲミドのうち、２種のクラスからのチオエステラーゼクローンを、DNA配列分析により同定した。９個のクローンがクラスＩチオエステラーゼをコードし、そして16個がクラスIIチオエステラーゼをコードする。個々のクラスの最長メンバーの配列は、図１（クラスＩ）及び図２（クラスII）に示される。マンゴのライブラリーを追加のチオエステラーゼクローンのために再スクリーンした。ファージ（147200pfu）を、上記のようにして16個のNZYプレート（9200pfu／プレート）上にプレートする。個々のプレートのために、約9 200個ファージを600μｌのLE392細胞（１ 0.D.，10mMのMgSO₄における）と共に混合し、そして37℃で20分間インキュベートする。次に細胞を、0.9％のNZY上部アガロース（55℃）６mlを添加することによってプレートし、そして37℃に暖められたNZYプレート上に直接的に注ぐ。プレートを37℃で一晩インキュベートする。プラークをColony／Plague Screen(NEN)上に持ち上げ、そして変性及び中和を上記のようにして（Stratagene）行なう。フィルターを一晩、空気乾燥せしめ、プレハイブリダイズし、そして上記のようにしてハイブリダイズせしめる。マンゴクラスIIチオエステラーゼのPCRフラグメント（図２）をプローブとして使用する。プローブを、次のプライマーを用いてPCR鋳型としてpCGN5214プラスミドから調製する：次のPCR条件が使用される：Perkin−Elmer GeneAmp PCR System 9600サーモサイクラーにおいて30サイクルの間、94℃で15秒、50℃で30秒、72℃で30秒。約12 00個の得られる塩基対のPCRフラグメントを、Stratagene“Prime-itII Random P rime Labeling Kit”を用いて放射性ラベルする。ラベルされたDNAフラグメントをSephadex−Ｇ50回転カラムに達し、組込まれていないdHTPを分離する。ラベルされたプローブをハイブリダイゼーション溶液に添加する。この溶液において室温で一晩のインキュベーションの後、膜を１×SSC＋0.1％のSDSにより室温で15 分間１度洗浄し、続いて同じ条件下で0.1×SSC＋0.1％のSDSにより２度洗浄する。膜をＸ線フィルムに３日間、露光する。合計28個の陽性シグナルがＸ線フィルム上に見出され、そしてその対応するクローンを追加のスクリーニングのために取る。DNA配列分析により、17個のクローンを、アシル−ACPチオエステラーゼをコードするものとして同定した。28個の陽性シグナルを除くすべてが、図２に提供されるマンゴのクラスIIクローンと同一であった。他のクローン、すなわち前のマンゴのクラスIIチオエステラーゼクローンに密接に関連するＭ４−23が図 12に示されている。Ｂ．ニラ（Leek）マンゴのチオエステラーゼ配列の単離についての上記方法と同じようにして、 λZAP(Stratagene)におけるニラcDNAライブラリーをチオエステラーゼクローンのためにスクリーンする。ファージ(２×10⁵pfu)を、上記のようにして10個のNZ Yプレート上にプレートする（20,000pfu／プレート）。個々のプレートのためには、約20,000個のファージを600μｌのLE392細胞と共に混合し(10mMのMgSO₄において10.D)、そして37℃で15分間インキュベートする。次に細胞を、７mlの0.9％ NZY上部アガロース（55℃）を添加することによってプレートし、そしてNZYプレート上に直接的に注ぐ（上記を参照のこと）。プレートを37℃で一晩インキュベートする。４℃で２時間のインキュベートに続いて、ファージを上記のようにしてクローン／プラークスクリーン膜(New England Nuclear)上に持ち上げる。誤った陽性のシグナルを防ぐために二回の持ち上げを行なう。持ち上げた後、膜を上記のように、変性し、中和し、そしてすすぐ。ファージDNAをUV Stratalinker 2400(Stratagene)を用いて膜へ架橋する。次に膜を、50％ホルムアミド及び５ ×SSCを含むプレハイブリダイゼーション溶液に沈め、そして室温で２時間インキュベートする（振盪を伴う）。３種のチオエステラーゼDNAフラグメントを、ハイブリダイゼーション反応への使用のために選択する。混合されたプローブは、 (1)月桂樹12：０チオエステラーゼフラグメント（図５に示される月桂樹cDNA のゲル精製された400bpのPstＩフラグメント）； (2)マンゴのクラスIIチオエステラーゼ（図２）及び（３）バラシカのクラスＩチオエステラーゼ（図11）を含んだ。約100ngの個々の精製されたDNAフラグメントを、Pharmacia“Ready-To-Go”DNAラベリングキットを用いて放射性ラベルする。製造業者の指示に従って、50μCiの³²P-dCTPを個々の反応のために使用する。ラベルされたDNAフラグメントをSephadex−Ｇ25回転カラムに通し、組込まれていないdNTPを分離する。３種のラベルされたプローブを混合し、そして75 mlのハイブリダイゼーション溶液（10％のデキストランスルフェートを含むプレハイブリダイゼーション溶液）に添加する。室温でこの溶液における一晩のインキュベーションの後、膜を室温で15分間２度、１×SSC＋0.1％ SDSにより洗浄し、続いて0.1×SSC＋0.1％ SDSにより同じ条件下で２度洗浄する。膜をＸ−線フィルムに一晩露光する。合計28個の陽性シグナルがＸ−線フィルム上に見出された。５個のクローン（ LTE ６−１，８−２，８−３，９−１，９−４として称される）を追加のスクリーニングのために取った。ファージを、200μｌのSM緩衝液にアガロースのコアーをソークすることによって陽性シグナルの部分におけるプレートから溶出する。個々のファージを約100pfu／プレートの力価で上記のようにしてプレートする。ファージDNAを膜に移し、変性し、中和し、そして架橋する。膜を初期スクリーニングに使用される同じプローブによりハイブリダイズせしめ、そして同一の条件下で洗浄する。プラークの大部分がまた、二次スクリーニングにおいても陽性である。十分に単離された陽性プラークを取り、そしてStratageneからのEx assist／SO LRシステムを用いて切断にゆだねる。現在、pBluescriptの二本鎖ファゲミドにおけるクローン化されたDNA挿入体を精製し、そしてABS自動配列決定機を用いて配列決定する。５個の選択されたクローンのDNA配列は、クローン８−２，８−３及び９−４が同一であり、そして９−１及び６−１が同一であるように見え、そして他の３種のクローンと同一でない場合、ひじょうに密接して関連していることを示した。それらのcDNAクローンによりコードされるニラのチオエステラーゼは、クラス IIチオエステラーゼに対して高い相同性を示す。８−２及び９−１の予備の核酸配列及び翻訳されたアミノ酸配列が図３及び４に提供される。Ｃ．クフェア（Cuphea）アシル−ACPチオエステラーゼクローンをクフェア・ホーケリアナ（Cuphea ho okeriana ）からWO94／10288に記載されているようにして単離する。クラスIIＣ．ホーケリアナクローンの配列は図６及び７に提供される。Ｄ．ニレ（Elm）クラスIIアシル−ACPチオエステラーゼクローンを、WO94／10288に記載されているようにしてニレから単離する。このクローンのDNA配列は図８に与えられる。実施例２Ｅ．コリにおけるアシル−ACPチオエステラーゼの発現単離された配列によりコードされるチオエステラーゼの基質選択性を決定するために、Ｅ．コリにおける発現のための組換えDNA構造体を調製する。Ａ．マンゴ pET3a発現ベクター中にマンゴクラスIIチオエステラーゼをコードする配列を挿入するために、マンゴクラスIIチオエステラーゼcD NA，MANI−２をE coRＩにより消化する。線状化されたプラスミドを次のプライマーを用いてPCR鋳型として使用する：次のPCR条件が使用される：Perkin-Elmer GeneAmp PCR System9600サーモサイクラーにおける30サイクルの間、94℃ １分、60℃30秒、72℃ ２分。約1100個の塩基対をもたらすPCRフラグメントは、推定される成熟タンパク質開始コドン（ロイミン112）のすぐ上流にNdeＩ部位を含む。そのフラグメントをTA1000ベクター（Invitrogen）中にクローン化し、pCGN5217を生成する。pCGN5217をNdeＩ及びEcoRＩにより消化し、成熟マンゴチオエステラーゼコード配列の大部分を含むフラグメントを生成する。NdeＩ／EcoRＩフラグメントを、NdeＩ／EcoRＩにより消化されたプラスミド発現ベクターpET3a(Novagen；Madison，WI)中に挿入し、pCGN5218をもたらす。発現の分析のために、pCGN5218を用い、Ｔ７ポリメラーゼ(Novagen)を含むＥ．コリ株BL21（DE３）を形質転換する。異なった成熟タンパク質のＮ−末端候補体（ロイシン８８）を含む追加の構造体を調製する。PCRを、次のPCR条件によりプライマー4466及び4464を用いて行なう：30サイクルのために94℃ １分、60℃ 30秒、72℃ ２分。PCRフラグメントをCloneAmp System（GIBCO BRL）中にクローン化し、そして得られるプラスミドをNdeＩ及びEcoRＩにより消化し、成熟マンゴチオエステラーゼコード配列の大部分を含む約1200塩基対フラグメントを生成する。そのNdeＩ／EcoRＩフラグメントを、NdeＩ／EcoRＩにより消化されたプラスミド発現ベクターpET3a（No vagen）中に挿入する。発現の分析のために、その得られるプラスミドを用いて、Ｔ７ポリメラーゼ(Novagen)を含むＥ．コリ株BL21（DE３）を形質転換する。 lacＺ融合タンパク質としての発現のために、PCRをプライマー4463及び4464により行ない、ロイシン112コドンに向かって５′で挿入されたXbaＩ部位で開始し、そしてヌクレオチド1561で挿入されたEcoRＩ部位で終結する約1100塩基対のXb aＩ／EcoRＩフラグメントを製造する。他方、プライマー4465及び4464を用いて、プロリン81コドンに向かって５′で挿入されたXbaＩ部位で開始し、そしてヌクレオチド1561で挿入されたEcoRＩ部位で終結する約1200塩基対のフラグメントを製造する。PCR条件は次の通りである：30のサイクルのために94℃ １分、60 ℃ 30秒、72℃ ２分。 PCRフラグメントをCloneAmp System(GIBCO BRL)中にクローン化する。そのプラスミドをXbaＩ及びEcoRＩにより消化し、２つの推定される成熟タンパク質Ｎ −末端の１つからの成熟マンゴチオエステラーゼコード配列の大部分を含む約1100又は1200塩基対フラグメントを生成する。XbaＩ／EcoRＩフラグメントを、XbaＩ／EcoRＩにより消化されたプラスミド発現ベクター、たとえばpBCSK（St ratagene）中に挿入する。発現分析のために、そのベクターを用いて、Ｅ．コリ fadD＋細胞（市販の細胞、たとえばBRLからのSURE細胞がまた使用され得る）、又はＥ．コリ変異体、すなわち中間鎖特異的アシル−CoAシンターゼを欠くfadD( Onerath et al.，Eur．J．Biochem(1969)７：559-574)中に挿入する。 lacＺ融合タンパク質としてマンゴＭ４−23（pCGN5234）クラスIIチオエステラーゼコード配列を発現するために、クローンをSphＩ及びHindIIIにより切断する。得られたフラグメントを、Gene CleanIIキット(Bio 101)を用いて0.7％アガロースTBEゲルから単離する。フラグメントを、SphＩ及びHindIIIによりまた消化されたpUC18(Novagen；Madison，WI)中に連結し、pCGN5235を生成する。pCGN5 235をSmaＩ及びHindIIIにより消化し、そしてSmaＩ及びHind IIIによりまた消化されたpBC SK(Stratagene)中にサブクローン化し、pCGN5236 を生成する。 PCRプライマーチオエステラーゼ活性アッセイのために、マンゴのチオエステラーゼ構造体を含むＥ．コリ細胞の培養物20ml及び対照の細胞の類似する培養物を25〜37℃で増殖し、約0.5のOD600にする。チオエステラーゼ発現の誘発を、IPTGを添加し、0. 4mMにし、続いて１〜18時間の追加の増殖により達成することができる。個々の培養物の10mlのアリコートを、次のようにしてＣ10：０−ACP，Ｃ12：０−ACP，Ｃ14：０−ACP，Ｃ16：０−ACP，Ｃ18：０−ACP及びＣ18：１−ACP基質に対する比活性についてアッセイする。細胞を、遠心分離により収穫し、0.4m lのアッセイ緩衝液に再懸濁し、そして高波処理により溶解する。細胞残骸を追加の遠心分離により除去する。上清液を、Ｃ10：０−ACP，Ｃ12：０−ACP，Ｃ14 ：０−ACP，Ｃ16：０−ACP，Ｃ18：０−ACP及びＣ18：１−ACP基質を用いて、Da vies et al.，Arch．Biochem & Biophys.(1991)290：37-45によるチオエステラーゼ活性をアッセイに使用する。脂肪酸組成物の分析のために、上記のようにして増殖され、そして誘発されたＥ．コリ細胞のサンプル4.5mlを、テフロンで裏打ちされたキャップを有する15m lのガラス製バイアル中に移す。Ｃ11：０遊離脂肪酸、Ｃ15：０遊離脂肪酸及び１：１のクロロホルム：メタノール溶液中、Ｃ17：０−TAGをそれぞれml当たり１mg含む１mg／mlの標準溶液100μｌをサンプルに添加し、続いて氷酢酸200μｌ及び１：１のクロロホルム：メタノール溶液10mlを添加する。サンプルを十分に混合し、そして完全な相分離のために10 00rpmで５分間、遠心分離する。低部の相（クロロホルム）を注意して除去し、そして回転蒸発器(Rotovap)への使用のために適切なきれいなフラスコに移す。サンプルを乾燥近くまで蒸発する。中間鎖脂肪酸が、溶媒が除去された後、選択的に蒸発するように見えるので、室温でバイアルを維持するためには十分な加熱を用いることが重要である。乾燥されたサンプルを、メタノール中、５％硫酸溶液１mlを添加し、そのサンプルを５mlのバイアルに移し、90℃の水浴においてサンプルを２時間インキュベートすることによってメタノリシスする。サンプルを冷却し、その後、0.9％Nacl１ml及びヘキサン300μｌを添加する。サンプルを十分に混合し、そして1000rpmで５分間、遠心分離する。上部（ヘキサン）層を注意して除き、そしてガラスコーン挿入物を有するプラスチック製オートサンプラーバイアルに配置し、続いて、クリップシールによりそのバイアルをキャップする。サンプルを、10又はそれよりも少ない炭素を有する成分の分離を高めるための温度プログラムを用いてガス−液体クロマトグラフィー（GC）により分析する。使用される温度プログラムは、３分間、140℃の温度、続いて230℃に達するまで、５℃／分での温度上昇を提供し、そして230℃が11分間維持される。サンプルをHewlett-Packard 5890（Palo Alto，CA）ガスクロマトグラフィー上で分析する。脂肪酸含有率の計算は、内部標準に基づかれている。マンゴＭ４−23クローンを発現するＥ．コリ細胞のチオエステラーゼ活性及び脂肪酸組成分析の結果が下記表IIに示されている。上記結果は、Ｍ４−23マンゴクラスIIチオエステラーゼが16：０−ACP基質に対して特異性を有し、そしてＣ18：１−ACP及びＣ18：０−ACP基質に対していくらかの活性を有することを示す。Ｂ．ニラ PCR反応を、チオエステラーゼcDNAの成熟コード領域の５′中への便利な制限部位の挿入のために使用する。PCRプライマーは、ユニーク制限部位の導入のために企画されている（５′端でSacＩ−NdeＩ及び停止コドンの後の右の３′端で KpnＩ）。末端で前記の記載された制限部位を有するニラのチオエステラーゼの完全な成熟タンパク質コード領域（図４のアミノ酸位置118でのロイシンで始まる）を、PCRにより生成する。得られるDNAフラグメントをpBluescriptクローニングベクター中に挿入し、lacＺ融合構造体を創造し、又は他方、pETプラスミドベクター中に連結し、非融合構造体を製造する。ニラのチオエステラーゼlacＺ融合構造体により形質転換されたＥ．コリ細胞を増殖し、そして上記のようにIPTGにより誘発する。細胞溶解物を、上記のようにしてチオエステラーゼ活性についてアッセイする。９−１及び８−２ニラクローンに関するチオエステラーゼ活性アッセイの結果は、ニラクラスIIチオエステラーゼが16：０−ACP基質に対して高い特異性を有し、そして14：０，18：０及び18：１−ACP基質に対してのいくらかの低い活性が観察されるこを示す。Ｃ．クフェア及びニレＥ．コリにおけるクフェアホーケリアナ（CUPH−１及びCUPH−２）及びニラクラスIIアシル−ACPチオエステラーゼクローンの発現がWO94／10288に記載されている。クフェアCUPH−２クローンは、Ｃ８及びＣ10基質に対して高められた活性を示した。このクローンは、天然のクフェアホーケリアナ種子におけるＣ８及びＣ10脂肪酸の生成を担当するチオエステラーゼ活性を表わすことが決定された。しかしながら、CUPH−１クローンの発現は、Ｃ16：０及びＣ14：０−ACP基質に対して高められた加水分解活性を示した。Ｃ．ホーケリアナ種子はＣ14：０及びＣ16：０−脂肪酸の有意なレベルを含まないので、それらの脂肪酸の生成が CUPH-１発現の直接的な結果であるか又はＥ．コリ細胞自体におけるいくらかの活性の結果であるかどうかは明確ではなかった。 CUPH-１形質転換記載Ｋ27(fad D)の液体培養物の合計脂肪酸分析が下記表III に示される。 14：０，16：０，16：１及び18：１のレベルは、対照に比較して高められる。トランスゲニック植物細胞におけるCUPH−１クローンの発現により本明細書に示されるように、Ｅ．コリ表現型は16：０−ACP基質に対して卓越した活性を有するCUPH−１アシル−ACPチオエステラーゼの結果であり、そして14：０−ACPに対してはいくらかの低い活性を有するものの結果である。ニレアシル−ACPチオエステラーゼの発現はＣ10：０-ACP基質に対して高められた加水分解活性をもたらし、この活性はニレ種子におけるＣ10：０−脂肪酸の有意なレベルを占める。しかしながら、Ｃ16：０基質に対しての高められた活性がまた観察され、そしてニレ種子はＣ16：０脂肪酸の有意なレベルを含まないので予測できない結果が観察される。WO94／10288に提供されるデータは、Ｃ16：０−ACP加水分解活性がニレのチオエステラーゼよりもむしろＥ．コリ細胞に由来したことを示唆した。しかしながら、トランスゲニック植物の種子におけるニレアシル−ACP チオエステラーゼの発現により本明細書に示されるように、Ｅ．コリにおける観察されたＣ16：０活性はＣ16：０−ACPニレチオエステラーゼの実際の加水分解活性によるものでる。実施例３植物におけるパルミトイル−ACPチオエステラーゼの発現Ａ．マンゴ植物種子組織に選択的に発現される遺伝子からの転写開始領域の調節制御下で植物におけるマンゴクラスIIチオエステラーゼクローンの発現のための構造体を次のようにして調製する。Sal±制限部位を、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)における鋳型として図２に示されるマンゴチオエステラーゼcDNA配列を用いてマンゴチオエステラーゼ読み取り枠の開始コドンの上流に導入する。センスPCRプライマー（５′−GCTTGTCGACAAGATGGCTTCTACTG-３′）は、マンゴチオエステラーゼ開始コドン及びSalＩ制限部位を含む。アンチセンスプライマー（５′−GCGTAAG CTTGCATGCTGGTCA−３′）はヌクレオチド421でユニークSphＩ部位を取り囲む配列を含み、そしてSphＩ部位の下流にHindIII制限部位の挿入を提供する。PCR反応の生成物（約300のbp）を、SalＩ及びHindIIIにより消化されたクロラムフェニコール耐性ベクターpBCSK（Stratagene）中にSalＩ及びHindIIIによる消化によりサブクローン化する。マンゴチオエステラーゼ遺伝子を、マンゴクラスII チオエステラーゼコード配列からのSphＩ−EcoRＩフラグメント（ヌクレオチド1 561−1566で翻訳停止コドンの方の３′に位置するEcoRＩ部位を通してのヌクレオチド42 1 SphＩ部位からの約1140bpフラグメント）と約300bpのＮ−末端コード配列とをＮ−末端フラグメント／pBCSK構造体におけるユニークSphＩ及びEcoRＩ部位を用いて組合すことによって再集成する。得られるプラスミドは完全なコード配列、及びSalＩ及びNcoＩ(ヌクレオチド1425-1430)制限部位を両端に有するマンゴチオエステラーゼ遺伝子のいくらかの３′−未翻訳配列を含む。マンゴチオエステラーゼ配列を含むフラグメントを、NcoＩによる消化及びDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントによるブラント末端化、続いてのSalＩによる消化により得る。ブラント末端／Sal Ｉマンゴチオエステラーゼフラグメントを、ナピン発現カセット、すなわちXhoＩにより消化され、ブラント末端化され、そしてS alＩにより消化されているpCGN3223（WO92／20236に記載されている）中に連結する。得られる発現カセットは、ナピン５′−配列及びナピン３′−配列を両端に有するマンゴチオエステラーゼを含む。この発現カセットを、Asp718による消化及びAsp718により消化されたpCGN1557(McBride et al.(1990)Plant Mol．Bi ol．14:269-276)への連結により植物形質転換のための二元ベクター中にクローン化し、pCGN5228をもたらす。たとえば株EHA101(Hood et al.,J．Bacteriol(19 86)168：1291-1301)の構造体により、Holsters et al.(Mol．Gen．Genet.(1978) 163：181-187)の方法に従ってアグロバクテリウム細胞を形質転換する。Ｂ．ニラクローン９−１は、ニラのクラスIIチオエステラーゼの完全な特性ペプチド及び成熟配列を含む。便利な制限消化部位をPCRにより付加し、そして５′端でSal Ｉ部位及び３′端でXhoＩ部位を両端に有し、そして完全なコード領域を含むフラグメントを単離する。このフラグメントを、pCGN3223のSalＩ／XhoＩ部位中に連結する（上記のナピン発現カセット）。次に、ナピン５′／ニラチオエステラーゼ／ナピン３′構造体を、pCGN1558、すなわちアグロバクテリウム／植物形質転換二元プラスミド（McBride et al.前記）中に挿入する。得られる構造体、すなわちpC GN5230を用いて、アグロバクテリウム菌株を形質転換し、そして形質転換された植物を生成する。Ｃ．クフェアクフェアホーケリアナ逆転写cDNA（WO94／10288の図５）のPCR分析は、TAA3 42 CUPH-１クローンの５′領域がWO94／10288の図５に示される配列のヌクレオチド144に続くグアニンヌクレオチド（Ｇ）を欠いていることを示した。〔CMT9 CUPH−１クローン（本明細書における図７）のDNA配列分析は、５′領域における読み取り枠の追加の操作のための必要性を伴わないで、CUPH−１発現構造体の調製のためにも使用され得る。〕従って、Ｇヌクレオチドを、WO94／10288の図５に示される配列の143-145でのATGで開始するコード領域をもたらすPCR指図の変異誘発によりTAA342におけるヌクレオチド144の後に挿入した。修正されたコード配列をSalＩ及びXhoＩ部位を用いて便利なベクター中にクローン化し(PCR反応においても挿入される)、KA２をもたらした。WO94／10288の図５に示される配列のヌクレオチド137-1464（及び上記の挿入されたＧヌクレオチド）を含んで成る、その得られるクローンのSalＩフラグメントを、ナピン発現カセットpCGN322 3中にクローン化した。次に、ナピン／クフェアチオエステラーゼ／ナピン構造体を、HindIIIフラグメントとして切断し、そして二元ベクターpCGN1557(McBr ide and Summerfelt(1990)Plant Mol．Biot．14：269-276)中にクローン化した。得られた構造体pCGN4800を用いてアグロバクテリウムツメファシエンスを形質転換し、そして形質転換された植物を調製した。Ｃ．ニレのアシル−ACPチオエステラーゼ発現構造体ナピン発現カセットを用いての植物種子細胞におけるニレＣ10及びＣ８アシル −ACPチオエステラーゼの発現のための構造体を次のようにして調製する。ニレU LM−１中間鎖アシル−ACPチオエステラーゼcDNAは、完全なチオエステラーゼ遷移性ペプチドをコードするようには見えない。従って、ニレのチオエステラーゼコード領域を次のようにしてクフェアCUPH−１クローンからの遷移性ペプチドコード領域に融合した。pCGN4800（ナピンカセットにおけるCUPH−１）をXbaＩにより消化し、ブラント化し、そしてStaＩにより消化し、CUPH−１構造体の成熟タンパク質コード領域を除去した。StuＩ部位は、WO94／10288の図５に示される CUPH−１配列のヌクレオチド496-501に位置する。XbaＩ部位は、クフェアのチオエステラーゼcDNA配列の末端とナピン３′調節領域との間に位置する。ULM−１成熟タンパク質コード領域を、次のようにしてクフェア成熟タンパク質コード領域の除去に起因するナピン／クフェア遷移性ペプチド主鎖中に挿入する。ULM− １クローンをXbaＩにより消化し、ブラント化し、そしてStaＩにより消化し、ニレのチオエステラーゼ成熟タンパク質コード領域を得る。StuＩ部位は、図８に示される配列のヌクレオチド250-255に位置し、そしてXbaＩ部位部位はヌクレオチド1251-1256、すなわち停止コドンの方の３′側に位置する。ナピン／クフェア遷移性ペプチド主鎖中へのニレStuＩ／XbaＩフラグメントの連結は、ナピン５ ′／クフェア遷移性：ニレ成熟／ナピン３′発現構造体を有するpCGN4802をもたらす。pCGN4803を、pCGN4803、すなわち植物形質転換をもたらすHindIIIフラグメントとしてpCGN1557にトランスファーする。実施例４植物形質転換及び分析Ａ．形質転換法１．アグロバクテリウム−介在の形質転換ブラシカのアグロバクテリウム介在の形質転換のために使用され得る方法は、Radke et al．(Theor．Appl．Genet.(1988)75：685-694；Plant Cell Reports (1992)11：499-505)により記載されている。トランスゲニックアラビドプシスタリアナ（Arabidopsis thaliana）植物を、Valverkens et al.，(Proc．Nat．Acad．Sci.(1988)85：5536-5540)により記載されているようにしてアグロバクテリウム介在の形質転換により得ることができる。２．粒子衝撃対象のDNA配列を、少なくともプロモーター領域、対象の遺伝子及び終結領域を含んで成る発現カセットとして、たとえばヨーロッパ特許出願第332,855号及び継続出願USSN07／225,332号（1988年７月27日に出願されている）に記載されているようにして、粒子衝撃により植物ゲノム中に導入する。手短に言えば、0.5mM〜３mMの範囲のサイズのタングステン又は金粒子を、発現カセットのDNAにより被覆する。このDNAは水性混合物又は乾燥DNA／粒子沈殿物の形で存在する。衝撃のための目的として使用される組織は、子葉外植体、苗条分裂組織、未熟小葉又は葯からであり得る。 DNA被覆の粒子による組織の衝撃は、Biolisticsの粒子ガン（Dupont；Wilming ton，DE）を用いて行なわれる。粒子も、銃身口から１〜14cmの範囲の種々の距離でその銃身に配置される。衝撃を与えられるべき組織は、停止プレートの下部に配置され；試験は20cmまでの距離で組織に対して行なわれる。放出の瞬間で、組織はナイロンネット又はナイロンネットと10mM〜300mMの範囲のメッシュとの組合せにより保護される。衝撃に続いて、植物はAtreya，et al.，(Plant Scienco Letters(1984)34；37 9-383)の方法に従って再生され得る。手短に言えば、胚の軸組織又は子葉断片を、MS培地（Murashige and Skoog，Physio．Plant.(1962)15：473）(子葉断片のためにはMS及び2.0mg／ｌ６−ベンジルアデニン(BA))上に配置し、そして暗室において25±２℃で１週間インキュベートし、そして続いて、連続した冷白色蛍光(6.8ｗ／m²)に移す。培養の10日目、苗を、殺菌した土壌を含むポットに移し、３〜５日間、日陰に維持し、そして最終的に温室に移す。推定上のトランスゲニック苗条が根づく。植物ゲノム中への外来性DNAの組込みは当業者に知られている種々の方法により確認され得る。Ｂ．植物の分析上記のようにしてＣ16：０アシル−ACPチオエステラーゼにより形質転換された植物を分析し、種子における種々の脂肪酸の百分率を決定する。高レベルのＣ 16：０脂肪酸を含む植物を、TAG分子に対する脂肪酸の位置分析を包含する追加の分析のために選択する。 pCGN4800及びpCGN4803構造体（それぞれCUPH−１及びニレアシル−ACPチオエステラーゼを発現する）を含むトランスゲニック植物からの発育性（成熟に近い）種子（10〜20個の種子／サンプル）を、Ｅ．コリ細胞培養物の分析について記載されるようなパラメーターを用いてGCにより分析する。Ｃ16脂肪酸レベルにおける最大上昇を示すpCGN4800及びpCGN4803形質転換出来事からの個々の形質転換体からのそれらの分析の結果が表IVに提供される。 CUPH−１、ニレ及びマンゴ（MANI−２）チオエステラーゼクローンを発現するトランスゲニックブラシカナプス植物(212／86) を分析し、脂肪酸組成を決定する。pCGN4800，pCGN4803及びpCGN5288を含むトランスゲニック植物からの成熟種子（約20個の種子／サンプル）を、Ｅ．コリ細胞培養物の分析について記載されているようなパラメーターを用いてGCにより分析する。 pCGN4800（CUPH−１）により形質転換された植物からの種子においては、高められたレベルのＣ16：０脂肪酸が検出される。pCGN4803（ニレ）形質転換体からの種子においては、有意なレベルのＣ16：０脂肪酸が、Ｃ14：０及びＣ10：０含有率の上昇を伴って検出される。pCGN5288（マンゴMANI−２）により形質転換された植物からの種子においては、高められたレベルのＣ16：０脂肪酸が検出される。本明細書に言及されるすべての出版物及び特許出願は、本発明が関与する当業者の熟練のレベルの表彰である。すべての出版物及び特許出願は、引用により本明細書に組込まれる。これまで、発明を本発明をより明確に理解するために例示的且つ例的に詳細に記載してきたが、一定の変更及び修飾を本発明の範囲内で実施できることは自明である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者クリードル，ジーンアメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, デイビス，リードドライブ 538 (72)発明者ホーキンス，デボラアメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, デイビス，グランドアベニュ 230 (72)発明者ジョーンズ，オーブレイアメリカ合衆国，カリフォルニア 95695, ウッドランド，マッキンレーアベニュ 647

Claims

【特許請求の範囲】１．作用可能な状態で連結された成分として転写の５′から３′方向に、種子特異的プロモーター調節要素、Ｃ16：０−ACP基質に対して活性な植物アシル−A CPチオエステラーゼをコードするDNA配列及び植物細胞内で機能的な転写終結領域調節要素を含んで成るDNA構造体であって、そのチオエステラーゼ配列要素が上記調節要素の中の少なくとも１異種であるようなDNA構造体。２．ニラのパルミトイル−ACPチオエステラーゼコード配列を含んで成る、請求項１に記載の構造体。３．マンゴのパルミトイル−ACPチオエステラーゼコード配列を含んで成る、請求項１に記載の構造体。４．前記種子特異的プロモーター要素がナピン・プロモーターである、請求項１に記載の構造体。５．Ｔ−DNAボーダー要素をさらに含んで成る、請求項１に記載の構造体。６．DNA構造体を含んで成る植物細胞であって、そのDNA構造体が作用可能な状態で連結された成分として転写の５′から３′方向に、種子特異的プロモーター調節要素、Ｃ16：０−ACP基質に対して活性な植物アシル−ACPチオエステラーゼをコードするDNA配列及び植物細胞内で機能的な転写終結領域調節要素を含んで成り、ここでその要素の中の少なくとも１がその植物又はその構造体の他の要素に対して異種であるような植物細胞。７．ニラのパルミトイル−ACPチオエステラーゼコード配列を含んで成る、請求項６に記載の植物細胞。８．マンゴのパルミトイル−ACPチオエステラーゼコード配列を含んで成る、請求項６に記載の植物細胞。９．前記細胞がブラシカ細胞である、請求項８に記載の植物細胞。 10．前記細胞がブラシカナプス（Brassica napus）細胞である請求項８に記載の植物細胞。 11．第１のDNA構造体及び第２のDNA構造体を含んで成る植物細胞であって、その第１のDNA構造体が作用可能な状態で連結された成分として転写の５′から３′方向に、種子特異的プロモーター調節要素、植物パルミトイル−ACPチオエステラーゼをコードするDNA配列及び植物細胞において機能的な転写終結領域調節要素を含んで成り、そしてその第２のDNA構造体が作用可能な状態で連結された成分として転写の５′から３′の方向に、種子特異的プロモーター調節要素、アンチセンス配向に位置する植物ステアロイル−アシルACPデサチュラーゼ要素をコードするDNA配列、及び植物細胞において機能的な転写終結領域調節要素を含んで成り、ここでその植物ステアロイル−アシルACPデサチュラーゼが前記植物細胞の生来のステアロイル −アシルACPデサチュラーゼに対して相補的であることを特徴とする植物細胞。 12．Ｃ16：０−ACP基質に対しての加水分解性質を有する植物アシル−ACPチオエステラーゼをコードするcDNA。 13．前記cDNA配列が図２に示されるマンゴのチオエステラーゼ配列である請求の範囲第12項記載のcDNA。 14．前記cDNA配列が図４に示されるニラのチオエステラーゼ配列である請求の範囲第12項記載のcDNA。 15．Ｃ16：０脂肪アシル基の高められた割合を有する植物種子トリグリセリドの製造方法であって、トランスジェニック植物が種子を生成するように成長せしめることを含んで成り、ここで前記植物が請求の範囲第１項記載の構造体を含んで成ることを特徴とする方法。 16．前記植物がブラシカ植物である、請求項15に記載の方法。 17．前記ブラシカ植物がブラシカナプス植物である請求項16に記載の方法。 18．Ｃ16：０−ACP基質に対して活性的な前記植物アシル−ACPチオエステラーゼがニラ、マンゴ、クフェアホーケリアナ又はニレからである請求項15に記載の方法。 19．貯蔵トリグリセリドに最小８モル％のパルミテートを含んで成るトランスジェニック・ブラシカ・ナプス植物種子。 20．貯蔵トリグリセリドに最小10モル％のパルミテートを含んで成る請求項19 に記載の種子。 21．貯蔵トリグリセリドに最小20モル％のパルミテートを含んで成る、請求項 19に記載の種子。 22．請求の範囲第19項記載の種子に由来する油。