JPS63106561A

JPS63106561A - 免疫分析試薬

Info

Publication number: JPS63106561A
Application number: JP13182587A
Authority: JP
Inventors: Masako Hado; 羽藤　正子; Yoshio Ishimori; 石森　義雄; Masao Koyama; 小山　昌夫
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 1986-05-31
Filing date: 1987-05-29
Publication date: 1988-05-11
Also published as: EP0248621B1; DE3781330D1; DE3781330T2; EP0248621A3; EP0248621A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の目的〕（産業上の利用分野）本発明は試料中に存在する特定の抗原又は抗体を定量分
析するための免疫分析試薬の改良に関する。

（従来の技術）試料中に存在する特定の抗原又は抗体の定量分析には、
例えばラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩＡと記す）が
用いられる。しかし、ＲＩＡでは放射性元素を用いるた
め、専用の機器を設置し、資格を有するオペレータが操
作を行なわなければならず、しかも廃棄物の処理等にも
注意を要するという問題がある。

また、その他の分析方法として、例えば免疫電気泳動が
知られている。しかし免疫電気泳動では測定に長時間を
要するうえ、被検物質がごく微■しか含まれていない場
合には適用することができないという問題がある。

そこで、本発明者らは先に特開昭６０−１１７１５９号
において、表面に親水性の抗体又は抗原を固定化し、内
部に親水性の標識物質を封入したリポソーム試薬を開示
した。この試薬を用いた免疫分析方法は以下のようなも
のである。すなわち、抗原又は抗体が存在する試料中に
前記リポソーム試薬を加え、これと別に補体を加えると
、抗原−抗体反応及びそれに伴なう補体の作用によって
リポソームが破壊され、封入されていた標識物質（例え
ば螢光性化合物）が流出する。この流出した標識物質の
量と、試料中の被検物質の四との間には相関係があるの
で、流出した標識物質を所定の分析方法（例えば螢光分
析）によって定量することにより、被検物質を定量する
ことができる。この試薬を用いれば、ＲＩＡのような問
題が生じることはなく、免疫分析の簡便化が期待できる
。

しかし、このリポソーム試薬を用いて血清やタンパク質
含有試料の分析を行なう場合、原液のままでその分析を
行なうと抗原−抗体反応以外にも反応が起り、このため
、原液のままで、被検物質を精度よく分析することが難
かしかった。このため、従来は血清やタンパク貿含有試
料を希釈して分析を行なっていた。例えば、リポソーム
に抗ヒトα−フェトプロティン抗体（以下、抗ヒトＡＦ
Ｐ抗体と記す）を固定化した試料を用いてヒト血清中の
α−フェトプロティン（以下、ＡＦＰと記す）を分析す
る場合、非特異反応の影響を除去するために、ヒト血清
を１００倍以上希釈していた。

（発明が解決しようとする問題点）ところが、正常人の血清中には、このＡＦＰが１０−８
ｇ／ｍ以下しか含有されていない。したがって、正常人
の血清を１００倍以上希釈すると、ＡＦＰ濃度１０−１
０　ｇ／ｍｌ以下に対応する測定（例えば螢光分析）と
なり、精密な定量が困難となるという問題があった。

本発明は上記問題点を解決するためになされたものであ
り、精密かつ簡便な分析が行なえる免疫分析試薬を提供
することを目的とする。

〔発明の構成〕（問題点を解決するための手段）本発明者らは、抗体もしくは抗体の一部又は抗原をリポ
ソームに固定化した後、残存した固定化用官能基が試料
中のタンパク貿や微量化学物質と反応することにより、
精密な測定・分析を妨げていることを見出し、本発明を
完成するに至った。

すなわち、本発明の免疫分析試薬は、リン脂質及び糖脂
質のうち少なくともいずれか一方を組成とするリポソー
ムと、該リポソーム中に封入された標識物質と、前記リ
ポソームに架橋法により固定化された抗体もしくは抗体
の一部又は抗原とからなる免疫分析試薬において、前記
リポソームに抗体もしくは抗体の一部又は抗原を固定化
した後リポソーム表面に残存した固定化用官能基がブロ
ックされていることを特徴とするこの抗体もしくは抗体
の一部又は抗原を固定化する為の固定化用官能基をブロ
ックするには、例えばＳＨ基含有化学物質アミノ基含有
化学物質等のブロック剤で化学修飾すればよい。

これは具体的には、リポソーム上の残存している固定化
用官能基を、システィンやジチオスレイトールの様な水
溶性還元性物質の１つであるＳＨ基含有物質やグリシン
やへペスの様なアミノ基含有物と適当な条件下で反応さ
せて、この固定化用官能基を置換するものである。

本発明の免疫分析試薬において、リポソームはリン脂質
及び糖脂質のうち少なくともいずれか一方を組成とする
ものであり、単層又は多層のマイクロカプセル状を有し
ている。

そして、必要に応じてリン脂質、糖脂質に対してコレス
テロールを１０〜５００モル％を加えてもよく、これに
よって安定なリポソームを得ることができる。また、リ
ン脂質、糖脂質中の脂肪酸炭素鎖は炭素原子数が１２〜
１８であることが好ましく、更に画数であることがより
好ましい。

本発明の免疫分析試薬において、リポソーム内に封入さ
れる標識物質としては、親水性で、リポソーム外に流出
した際に定量可能な物質が選択される。このような物質
としては、例えば、高濃度では自己消光により螢光を示
さないが、低濃度（１０−３Ｍ以下）で非常に強い螢光
を発するカルボキシフルオレセインのような螢光性物質
；リポソーム外で酸化反応により発光するルミノールや
ルシフェリンのような発光性物質：可視域又は紫外域に
特異的な吸収帯を有する吸光性化合物（水溶性色素等）
：酸化酵素の作用により分解され、酸素消費又は過酸化
水素生成をもたらすグルコース、シュークロース等の糖
類；テトラペンチルアンモニウムのような比較的大きな
イオ゛ン性化合物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（ＮＡＤ）のような補酵素類；メチルビオロゲン等
のラジカル化合物等が挙げられる。これらの化合物は、
検出方法、感度及びリポソームの安定性等の因子を考慮
した上で適宜選択される。

本発明の免疫分析試薬において、リポソーム上に固定化
される抗体もしくは抗体の一部又は抗原は、蛋白質又は
ペプチド、糖タンパクであり、例えば、１８Ｇ、ＩｇＥ
、ＩＦＩＤ、　Ｉｇ　Ａ、Ｉ＃　Ｍ等の免疫グロブリン
：トランスアミナーゼ、乳酸脱水素酵素、クレアチンキ
ナーゼ等の酵素類：ＡＦＰ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）等
の腫瘍マーカ：インスリン、成長ホルモン等のペプチド
ホルモン、その他各種薬物等の低分子物質から測定対象
に応じて任意に選ぶことができる。

本発明の免疫分析試薬において、リポソームに固定化用
官能基を導入するために脂質分子との反応が行なわれる
架橋剤、また必要に応じて抗体もしくは抗体の一部又は
抗原に架橋基を導入するための架橋剤としては、例えば
次のような反応式に基づく物質が適当である。

（イミドエステル　反応）こうした（１）、■、■の反応における架橋剤としては
、例えばジサクシンイミジルスベレイト（ＤＳＳ）、３
．３′−ジチオビス（スルフォサクシンイミジルプロピ
オネート＞（ＤＴＳＳＰ＞　、エチレングリコビス（ス
ルフォサクシンイミジルサクシネート＞（Ｓｕ　Ｉ　ｆ
ｏ−ＥＧＳ）などは０式、Ｎ−サクシイミド基３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などは
０式、ジメチルアジピミデート・２ＨＣＪｌ（ＤＭＡ）
　、ジメチル３，３−−ジチオビスプロピオンイミデー
ト・２Ｈ（ｆｆｌ（ＤＴＢＰ＞などは０式に基づく反応
に代表される架橋剤である。

こられの中で前記５ＰＤＰは、次式、で示され、温和な条件下で反応するチオール化及び分子
間（架橋）共役体生成のためのへテロ−２官能試薬であ
る。

また、この外にもグルタルアルデヒド（ＧＡ）等の脂肪
族ジアルデヒド類やジ酸クロライドなどが挙げられる。

こうした架橋剤を用いてなる本発明に係る免疫分析試薬
では、リポソームに固定化される抗原もしくは抗体の一
部又は抗原は、そのリポソームとの間にピリジル基、四
−置換サクシイミド基等の環状骨格を持たずに結合され
ている。そして、この結合の好ましい形態としては、−
５−Ｓ−１−Ｃ−Ｎ−結合が挙げられる。

本発明の免疫分析試薬は、例えば以下のような方法によ
り製造することができる。

まず、所望の脂質と架橋剤とを溶媒中で反応させること
により、脂質分子に官能基を導入して官能性脂質とする
。この官能基がリポソーム上における抗体もしくは抗体
の一部又は抗原を固定化するための固定化用官能基とし
て作用する。次に、得られた官能性脂質と、必要であれ
ばコレステロール及び他の脂質の適当量をフラスコに入
れ、溶媒を加えて溶解・混合させた後、溶媒を吸引除去
して乾燥する。この結果、フラスコ壁面に脂質薄膜が形
成される。つづいて、フラスコ内に標識物質を含有する
水溶液を加え、密栓して振どうすることにより、リポソ
ームの懸濁液を調製する。

一方、リポソームに固定化される抗体もしくは抗体の一
部又は抗原には、必要ならば架橋剤との反応により架橋
基を導入した後、必要に応じて還元剤で処理して修飾す
る。

次いで、前記リポソーム懸濁液と抗体もしくは抗体の一
部又は抗原とを適当な緩衝液中で反応させて、リポソー
ムに抗体もしくは抗体の一部又は抗原を固定化させる。

更に、リポソームと抗原または抗体もしくは抗体の一部
がサクシイミド基、イミドエステル基。

アルデヒド基、酸クロライド基などのアミノ基と反応す
る様な官能基を介して結合する場合には、リポソーム表
面に残存していると考えられる前述した官能基をブロッ
クする為グリシンやセリン、ヘペスなどのようなアミノ
酸、アルブミンや酵素などのタンパク質などのアミノ基
含有物質と適当な条件下で反応させることによってブロ
ックすればよい。また、ジチオピリジル基などのＳＨ基
と反応する様な官能基を介して結合する場合には、リポ
ソーム表面に残存していると考えられる。ピリジル基を
ブロックするために、第１図に示すようにシスティンや
ジチオスレイトール、メルカプトエタノール等のような
ＳＨ基含有物貿のような水溶性還元性物質と適当な条件
下で反応させればよい。

ここでのブロックの為の適当な反応条件とは、リポソー
ム表面に固定化きれている抗体などを変化させないよう
なＰＨ、イオン、強度、濃度、時間、温度、浸透圧を選
択しなければならない。これは例えばＳＨ基含有物−質
でおるシスティンを含有するへペスー５ａｌｉｎｅ緩衝
液（ＰＨ７，５）でリポソームを洗浄することなどが挙
げられる。

（作　用）この固定化用官能基のブロックの結果、リポソーム上に
残存している固定化用官能基が消滅するので、本発明の
免疫分析試薬では試料中のタンバク質ヤ微量化学物質と
の間に非特異的な反応は生じなくなり、その結果リポソ
ームが崩壊したりして、精密な測定・分析を妨げること
がなくなる。

本発明の免疫分析試薬は、以下のようにして使用される
。すなわち、まず被検物質を含有する試料に本発明の免
疫分析試薬を加え、これと別に補体を加える。なお、こ
の際被検物質に対する第２抗体を加え被検物質を挟みこ
む方法（サンドイッチアッセ４）を用いてもよい。この
結果、被検物質とリポソーム上に固定化された抗体もし
くは抗体の一部又は抗原との抗原−抗体反応及びそれに
伴なう補体の作用により、リポソームが破壊されて封入
されている標識物質（例えば螢光性化合物）が流出する
。この流出した標識物質の量と、試料中の被検物質の量
との間には相関関係があるので、流出した被検物質を適
当な分析方法（例えば螢光分析）によって定量すること
により、被検物質を定すすることができる。

そして、実際の定量分析においては、予め既知の濃度の
被検物質を用いて検量線を作成しておき、これをもとに
して同一条件で未知の濃度の被検物質との反応により流
出した標識物質を測定することにより定ｍ分析を行なう
。

本発明の免疫分析試薬と被検物質との充分な反応に要す
る時間は、被検物質の種類、リポソームの特性、反応条
件、更にはりポソームに固定化された抗体もしくは抗体
の一部又は抗原の種類、純度、固定化形態等によって異
なる。このため、個々の場合に応じて予め特定の濃度に
調製された被検物質と同種の物質を含む試料を用いて予
備測定を行なうことにより、免疫分析試薬と被検物質と
の最適反応時間を設定することが望ましい。

本発明の免疫分析試薬によって定量が可能な被検物質は
、腫瘍マーカー、α−フェトプロティン（ＡＦＰ＞、塩
基性フェトプロティン（ＢＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥ
Ａ）　、膵癌胎児性抗原（ＰＯＡ）、免疫プロプリン（
ＩＩＩＧ、Ｉ＃　Ｅ、Ｉ＄　Ｄ、Ｉ＃ＡＳ　Ｉ＃Ｍ等）
、ペプチドホルモン（インシュリン、成長ホルモン等）
、及び薬物、アミノ酸等が挙げられ、その対象し広範囲
にわたる。

本発明の免疫分析試薬によれば、抗体もしくは抗体の一
部又は抗原を固定化した後リポソーム上に残存している
固定化用官能基が完全にブロックされているので、例え
ば試料となる血清中のタンパク質や微量化学物質との間
に非特異的反応が起ることがない。したがって、被検物
質を含んだ試料の希釈を行なう必要がなく、原液のまま
で、精密な定量分析が可能となり、操作も簡便となる。

（実施例）以下、本発明の詳細な説明する。

実施例１　ヒトＡＦＰの測定本実施例において用いた試料のうち、ジパルミトイルホ
スファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジパルミ
トイルホスファチジルコン（ＤＰＰＣ＞　、コレステロ
ール及びジチオトレイトール（ＤＴＴ＞はシグマ社製の
ものを用いた。また、Ｎ−サクシンイミジル３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及びセフ
ァデックスＧ−２５フアインはファルマシア社製のもの
を用いた。他の試薬は市販品（特級）を精製せずに使用
した。なお、水は全てイオン交換水を用いた。

■官能性リン脂質：　ＤＰＰＥ−ジチオピリジルプロピ
オン酸アミド（ＤＰＰＥ−ＤＴＰ）の調製密栓付三角フ
ラスコにＤ　Ｐ　Ｐ　Ｅ　７０ｍｇを分取し、クロロホ
ルム／メタノール（５：１）混合溶媒２５成に溶解した
。次に、トリエタノールアミン６０μＢ及びＳＰＤＰ５
０ｍｙを添加し、窒素置換した後、室温で１時間反応さ
せてジチオピリジルプロピオン酸アミド（ＤＴＰ）を導
入した。つづいて、ロータリーエバポレータにより溶媒
を除去した。次いで、乾燥物をクロロホルム／メタノー
ル（１０：１）混合溶媒に溶解した後、シリカゲルカラ
ムを用いて精製し、ＤＰＰＥ−ＤＴＰの分画を回収した
。更に、ロータリーエバポレータにより約５ｄまで濃縮
した。ＤＰＰＥ−ＤＴＰの収率は８０〜９５％であった
。これを窒素封入下−２０’Ｃに保存した。

この反応によりＤＰＰＥに導入されたジヂオピリジル基
が固定化用官能基となる。

■リポソームの調製使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロホシム／メ
タノール（２／１　）混合溶媒に溶解した。

５ｍＭのＤＰＰＣ２００μｎ　、　１０ｍＭ（７）：Ｉ
Ｌ／スフ０−／Ｌ、　１００μ、ｊ及び１ｍＭのＤＰＰ
Ｅ−ＤＴＰ（■で得られた官能性リン脂質）５０μρを
１０７容量のナス型フラスコに入れ、更にクロロホルム
２ｄを加えてよく混合した。次に、約４０℃の水浴中で
ロータリーエバポレータにより溶媒を除去した。

再びクロロホルム２ｄを加えて十分に攪拌した後、再度
ロータリーエバポレータにより溶媒を除去した。この操
作を数回繰り返すと、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成さ
れた。つづいて、フラスコをデシケータ中に移して真空
ポンプで約１時間吸引し、溶媒を完全に除去した。

次いで、０．２Ｍのカルボキシフルオレセイン（イース
トマン・コダック社製、ｐＨ７．４：以下、ＣＦと記す
）　　１００μβを添加し、フラスコ内部を窒素で置換
した後、密栓して約６０℃の水浴中に約１分間浸漬した
。つづいて、Ｖｏｒｔｅｘミキサーを用い、フラスコ壁
面の脂質ＮｌｌＪ３が完全に消失するまでフラスコを激
しく振とうした。この操作によりリポソーム懸濁液が調
製された。更にリポソーム懸濁液に０．０１　ＭのＨＥ
ＰＥＳ緩衝液（　０．８５％Ｎａ　ＣＪ２含有、ｐＨ　
７．４５　：以下、ＨＢＳと記す）を少量添加した後、
全て遠心チューブに移し、４℃において１５００Ｏｒｐ
ｍで２０分間遠心する操作を数回繰り返した。最後に１
ｄのＨＢＳＩ，：懸濁させた。

■抗ヒトＡＦＰ抗体の修飾２ｍ！ｊ／ｍｆｌの抗ヒトＡ’ＦＰ抗体２ｄをＨＢＳで
希釈し、１０ｍＭのＳＰＤＰエタノール溶液１０１１１
　ヲ添加して窒素置換した後、室温で３０分間反応させ
、抗ヒトＡＦＰ抗体にジチオピリジル基を導入した。

次に、予め０．１Ｍ酢酸緩衝液（　０．８５％Ｎａ　Ｃ
ｆｌ含有、ｐＨ　４．５）で平衡化したセファデックス
Ｇ−２５フアインカラム（ゲル体積的１５ｄ）を用いた
ゲルろ過により未反応のＳＰＤＰを除去して精製し、タ
ンパク質分画のみを回収した。

次いで、この分画にＤＴＴ約２０ｍｇを加え、窒素置換
後、室温で２０分間反応させ、ジチオピリジル基をＳＨ
基と置換して修飾した。つづいて、ＨＢＳで平衡化した
セファデックスＧ−２５フアインカラムを用いたゲルろ
過により末反応のＤＴＴを除去して精製し、タンパク質
分画のみを回収した。

■抗ヒトＡＦＰ抗体固定化リポソームの調製■で得られ
たリポソーム懸濁液１ｍｌを４　’Ｃにおいて１５００
０ｒｐｍで２０分間遠心したリポソーム沈査と、■で得
られた０．１ｇタンパク質／顧の修飾された抗ヒトＡＦ
Ｐ抗体溶液２ｇとを混合し、窒素置換した後、密栓して
２０℃でゆっくり撮とうじながら１晩反応させた。次に
、ＨＢＳで洗浄して末反応の抗体を除去した。

■固定化用官能基のブロック ■で得られた抗ヒト固定化ＡＦＰ抗体固定化リポソーム
沈査とＨＢＳで希釈した１ｍＭシスティン溶液２ｇとを
混合し、窒素置換した後、密栓して２０°Ｃでゆっくり
振とうしながら、１晩反応させた。つづいて、ＨＢＳ、
ゼラチンベロナール緩衝液（以下、ＧＶＢ−と記す）で
順次洗浄して末反応のシスティンを除去した。

、　この結果、リポソーム表面に残存している固定化用
官能基（ジチオリジル基）とシスティンとが反応して固
定化用官能基がブロックされた。

このようにして得られたリポソーム試薬に、ＧＶＢ−　
２ｄ及び１０％ＮａＮ３２０μＬを添加して十分に攪拌
した後、窒素置換して４°Ｃで保存した。

■抗ヒトＡＦＰ抗体固定化リポソーム試薬によるヒトＡ
ＦＰ１度の検量線作成遊離のウサギ抗ヒトＡＦＰ抗体を用いたサンドイッチア
ッセイにより以下のようにしてヒトＡＦＰａ度を定量し
、検量線を作成した。

０、０１　〜１０００ｎ　９／ｒＩｆｌの範囲で濃度を
変化させタヒトＡ　Ｆ　Ｐ　２ｇｉｚｓμｐ　ニ、予め
ＧＶＢ＋　（ＧＶＢ−に０．５ｍＭのＭＦＩＣｎ２水溶
液及び０．１５ｍＭのＣａＣＪ２２水溶液が含有された
）で３０倍に希釈したリポソーム試薬５μｆを添加し、
３７°Ｃにおいて１０分間反応させた。次に、予めＧＶ
Ｂ＋で２００倍に希釈したウサギ抗ヒトＡＦＰ抗体（［
）ａｋＯ社製）２５μρを添加し、３７°Ｃにおいて５
分間反応させた。つづいて、補体（５０Ｈ５Ｑ）２５μ
βを添加し、３７°Ｃにおいて３０分間反応させた。な
お、ここで用いたＣ　Ｈ　５０はＭ　ａｙｅｒ法に基づ
いて求めたものである。これは、まず至適濃度の溶血素
で感作されたヒツジ赤血球と血清を、至適条件下の緩衝
液中で３７°Ｃ１６０分間反応させる。感作ヒツジ赤血
球は、補体の作用を受けて溶血するので、溶血の程度を
波長５４１ｎｍで比色することにより求められる。この
Ｍａｙｅｒ法によれば、補体の１単位（１Ｃｌ−１５０
単位）とは、至適濃度の溶血素で感作されたヒツジ赤血
球５ｘ１０８個の５０％を、７．５ｄの反応系の中で３
７°Ｃ１６０分間で溶血させるに必要な口と定義される
。次いで、０．０１　ＭのＥＤＴＡ−ベロナール緩衝液
１００μ℃で反応を停止させ、各濃度のヒトＡＦＰ溶液
について、流出したＣＦ量をＭＴＰ−３２螢光分光器（
コロナ電気製）により、励起波長４９０ｎｍ　、螢光波
長５２０ｎｍの条件で測定した。　この測定に基づいて
、抗体固定化リポソームの補体に対する安定性の影響を
除去するために、次式により相対螢光強度を計算した。

Ｆｅ　−Ｆ。

相対螢光強度＝　Ｆａ−ＦＯＸ１００ここで、Ｆｅ　：実測した螢光強度、ＦＯ：抗原を除い
た時（リポソームが全く破壊されていない時）の螢光強
度、Ｆａ：脱イオン水を添加しリポソームを全て破壊し
た時の螢光強度、である。なお、標準値として、１０−
７Ｍ及び１０−８　ＭのＣＦ溶液の螢光強度を用いた。

このようにしてヒトＡＦＰ濃度と相対螢光強度との関係
を示す第２図の検量線を得た。

■ヒトＡＦＰ濃度の実測 ■で予め得られた検量線を用いて、患者血清１０試料（
Ｎα１〜Ｎα１０）についてヒトＡＦＰ濃度を実測した
。この結果を第１表に示す。なお、第１表中、参照例は
ＲＩＡにより測定値である。

比較例１ ■〜■の操作のうち、■の固定化用官能基のブロックの
操作を行なわなかった以外は実施例１と全く同様にして
各操作を行ない、比較例としての免疫分析試薬を調製し
、これを用いてヒトＡＦＰ濃度の検量線を作成し、実施
例１と同一の試料についてヒトＡＦＰ１度を実施した。

その結果を第１表に示す。

第１表から明らかなように、実施例１の免疫分析試薬で
は、ＲＩＡによる測定値とよく一致した測定値が得られ
る。これに対して、比較例１の免疫分析試薬では、測定
不可能な場合がほとんどでめった。これは比較例１の免
疫分析試薬では、試料液中の被検物質以外の物質との間
に非特異反応が生じているためである。

（以下余白）第１表（以下余白）実施例２　ヒトＡＦＰの測定実施例１における■固定化用官能基のブロックを以下の
ように行なった以外は、実施例１と同様にしてリポソー
ムを作成した。

すなわち、抗ヒトＡＦＰ抗体固定化リポソーム沈査と、
０．０１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，７）で希釈した３
ｍＭシスティン溶液２ｇとを混合し、密栓して、２０°
Ｃでゆっくり撮とうしながら、１時間反応させた。つづ
いて、ゼラヂンベロナール緩衝液（以下、ＧＶＢ−と記
す）で順次洗浄して未反応のシスティンを除去した。こ
の結果、リポソーム表面に残存している固定化用官能基
（ジチオピリジル基）とシスティンとが反応してブロッ
クされた。

このようにして得られたリポソーム試薬に、ＣＶＢ−２
ｄ及び１０％ＮａＮ３２０μｋを添加して十分に攪拌し
た後、窒素置換して４℃で保存した。

次に、こうして作成したリポソームを用いて、実施例１
と同様にして検量線を作成した後、患者血清１０試料（
Ｎα１１〜Ｎα２０）について、ヒトＡＦＰ濃度を実測
した。この結果を第２表に示す。なお、第２表中参照例
は、ＲＩＡによる測定値である。

比較例２ ■の固定化用官能基のブロック操作を行なわなかった以
外は実施例２と全く同様にして各操作を行ない、免疫分
析試薬を調製し、ヒトＡＦＰ濃度の検量線を作成し、実
施例２と同一の試料についてヒトＡＦＰ濃度を実測した
。その結果を第２表に示す。

第２表から明らかなように、実施例２の免疫分析試薬で
は、ＲＩＡによる測定値とよく一致した測定値が得られ
る。これに対して、比較例２の免疫分析試薬では、測定
不可能な場合がほとんどであった。これは比較例２の免
疫分析試薬では、試料液中の被検物質以外の物質との間
に非特異反応が生じているためである。

（以下余白）第２表（以下余白）実施例３　ヒトＣＥＡの測定 ■官能性リン脂質の調製及びリポソームの調製実施例１
の■及び■と全く同様な操作を行ないリポソーム懸濁液
を調製した。

■モノクローナル抗ヒトＣＥＡ抗体の修飾モノクローナ
ル抗ヒト抗体を用い、実施例１の■と同様な操作により
ＳＨ基を導入した。

■モノクローナル抗ヒトＣＥＡ抗体固定化すポンームの
調製及び固定化用官能基のブロック上記■で得られたリ
ポソーム懸濁液１ｍｌを４°Ｃにおいて１５００Ｏｒｐ
ｍで２０分間遠心したリボンーム沈査と、上記■で得ら
れた０、１９タンパク貿／ｍ（ｌの修飾されたモノクロ
ーナル抗ヒトＣＥＡ抗体溶液２ｍｌとを混合し、窒素置
換した後、密栓して２０’Ｃでゆっくり振とうしながら
８時間反応させた。

次に、この混合液に最終濃度が１．５ｍＭとなるように
システィンを徐々に添加し、窒素置換した後、密栓して
２０’Ｃでゆっくり娠とうじながら、更に１晩反応させ
てリポソームに残存した固定化用官能基をブロックした
。つづいて、ＨＢＳ及びＧＶＢ−で順次洗浄して未反応
の抗ヒトＣＥＡ抗体及びシスティンを除去した。

このようにして得られたリポソーム試薬に、ＧＶＢ−２
ｄ及び１０％ＮａＮ３２０μｌを添加して十分に攪拌し
た後、窒素置換して４°Ｃで保存した。

■モノクローナル抗ヒトＣＥＡ抗体固定化リポソーム試
薬によるヒトＣＥ　Ａ　濃度の実測遊離のウサギ抗ヒト
ＣＥＡ抗体を用いたサンドイッチアッセイにより実施例
１の■及び■と同様にしてヒトＣＥＡ濃度と相対螢光強
度との関係を調べて検量線を作成し、更にこの検量線を
用いて、患者血清１０試料（Ｎ（１２１〜Ｎα３０）に
ついてヒトＣＥＡ濃度を実施した。この結果を第３表に
示す。なあ、第３表中の参照例はＲＩＡによる測定値で
ある。

比較例３上述した■〜■の操作のうち、■の固定化用官能基のブ
ロックの操作を行なわなかった以外は実施例３と全く同
様にして各操作を行ない、免疫分析試薬を調製し、ヒト
ＣＥＡａ度の検量線を作成成し、実施例３と同一の試料
についてヒトＣＥＡ濃度を実測した。その結果を第３表
に示す。

第３表から明らかなように、実施例３の免疫分析試薬で
は、ＲＩＡによる測定値とよく一致した測定値が得られ
る。これに対して、比較例３の免疫分析試薬では、測定
不可能な場合がほとんどでめった。これは比較例３の免
疫分析試薬では、試料液中の被検物質以外の物質との間
に非特異反応が生じているためである。

（以下余白）第３表（以下余白〉実施例４　ヒトＩＣＩＧの測定 ■リポソームの調製及び固定化用官能基の導入５ｍＭの
ＤＰＰＣ２００μｎ　、１０ｍＭ）ＩＬ、ｚステロール
１００μｎ及び１ｍＭのＤＰＰＥ５０．１２を用い、実
施例１の■と同様にしてＣＦが封入されたリポソーム懸
濁液を調製した。次に、ＨＢＳで希釈した０、０５％グ
ルタルアルデヒド溶液をリポソーム懸濁液と同量添加し
、４°Ｃにおいて１晩反応させてアルデヒド基を導入し
たリポソーム懸濁液を調製した。未反応のグルタルアル
デヒドは、４°Ｃにおいて１５０００ｒｐｍで２０分間
遠心する操作を数回繰り返して除去した。リポソームは
調製時の′？、度で再懸濁させた。

■抗ヒトＩｇＧ抗体固定化リポソームの調製及び固定化
用官能基のブロック上記■で得られたリポソーム懸濁液１ｍｌを４°Ｃにお
いて１５０００ｒｐｍで２０分間遠心したリポソーム沈
査と、０．２ｇタンパク貿／成の抗ヒトＩＣＩＧ抗体溶
液１−とを混合し、窒素買換した後、密栓して２０’Ｃ
でゆっくり（辰とうしながら５時間反応させた。

次に、０．５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８，０）を用い４
°Ｃにおいて１５０００ｒｌ）ｍで２０分間遠心する操
作を行なって洗浄した。更に０．５Ｍグリシン緩衝液に
リポソームを懸濁したまま、２０’Ｃで１晩ゆっくり１
辰とうしながら反応させた。この反応により、グリシン
とアルデヒド基とが結合して、抗ヒトＩｑＧ抗体固定化
リポソーム表面に残存している固定化用官能基がブロッ
クされた。このリポソームをＧＶＢ−に再懸濁して試薬
とした。

■抗ヒトＩＱＧ抗体固定化リポソーム試薬によるヒトＩ
ｇＧ１度の実測０．１〜２０７７１ｇ／ｄの範囲で濃度を変化させたヒ
トＩｇＧ１度２５μｆに、予めＧＶＢ＋で１０倍に希釈
したリポソーム試薬５μρと補体（５ＣＨ５０）２５μ
Ｂとを添加し、３７°Ｃにおいて１時間反応させた。

次に、０．０１　ＭのＥＤＴＡ−ベロナール緩衝液１０
０μｍで反応を停止させ、実施例１の■と同様にして螢
光強度を測定し、更にヒトＩｇＧ濃度と相対螢光強度と
の関係を示す検量線を得た。このようにして得られた検
量線を用いて、患者血清７（Ｎ（１３１〜Ｎｏ、４０＞
についてヒトＩｇＧ１度を実測した。この結果を第４表
に示す。なお、第４表中、参照例はラテックス凝集法に
よる測定値である。

比較例４上述した■〜■の操作のうち、■の固定化用官能基のブ
ロックの操作を行なわなかった以外は実施例４と全く同
様にして各操作を行ない、免疫分析試薬を調製し、実施
例４と同一の試料についてヒトＩｇＧ１度を実測した。

その結果を第４表に示す。

第４表から明らかなように、実施例４の免疫分析試薬で
は、ラテックス凝集法による測定値とよく一致した測定
値が得られる。これに対して、比較例４の免疫分析試薬
では、ラテックス凝集法による測定値と大きくずれる場
合がおる。これは、比較例４の免疫分析試薬では、試料
液中の被検物質以外の物質との間に非特異反応が生じて
いるためである。（以下余白）第４表（以下余白〉実施例５　ヒトＩｑＧの測定 ■リポソームの調製及び固定化用官能基の導入５ｍＭの
Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｃ２００μｎ　、　１０ｍＭのコレステロ
−／Ｌ／　１００ｕｆｌ及び１ｍＭのＤＰＰＥを用い、
実施例１の■と同様にしてＣＦが封入されたリポソーム
懸濁液を調製した。次に０．０１　Ｍホウ酸緩衝液（ｐ
）Ｉ　８．０）　テ希釈した１ｍＭのＤ丁ＢＰ（ピアス
社）溶液をリポソーム懸濁液と同量添加し、２０°Ｃに
おいて３時間反応させてイミドエステルを調製した。未
反応のＤＴＢＰ＠ＨＢＳで遠心を繰り返すことによって
洗浄した。

■抗ヒトＩＣＩＧ抗体固定化リポソームの調製及び残存
固定化用官能基のブロック上記■で得られたりポンーム懸濁液１ｄを４°Ｃにおい
て１５０００ｐｐｍで２０分間遠心したリポソーム沈査
と、０．２ｇタンパク貿／ｄの抗ヒトＩＣＩＧ抗体溶液
１ｍｌとを混合し、窒素置換した後、密栓して２０’Ｃ
でゆっくり娠とうしながら５時間反応させた。

次に、０．５Ｍグリシン緩衝液（ｔ）Ｈ８，０）をを用
い４°Ｃにおいて１５０００ｒｐｍで２０分間遠心する
操作を３回行なって洗浄した。このグリシン緩衝液での
洗浄によって残存する固定化用官能基（イミドエステル
）がブロックされた。このリポソームをＧＶＢ−に再懸
濁して試薬とした。

■抗ヒトＩＱＧ抗体固定化リポソーム試薬によるヒトＩ
ｇＧ濃度の実測０．１〜２０１ｎ（ｊ／ｄｉの範囲で濃度を変化させた
ヒトＩｇＧ濃度２５μρに、予めＧＶＢ＋で１０倍に希
釈したリポソーム試薬５μＢと補体（５ＣＨ５０）２５
μ℃とを添加し、３７°Ｃにおいて１時間反応させた。

次に、０．０１　ＭのＥＤＴＡ−ベロナール緩衝液１０
０μでで反応を停止させ、実施例１の■と同様にして螢
光強度を測定し、更にヒトＩｇＧ濃度と相対螢光強度と
の関係を示す検量線を得た。このようにして得られた検
ｍ線を用いて、患者血清１０試利（ＮＱ４１〜Ｎα５０
）についてヒトＩｇＧ濃度を実施した。この結果を第５
表に示す。なお、第５表中、参照例はラテックス凝集法
による測定値である。

比較例５ ■〜■の操作のうち、■の固定化用官能基のブロックの
操作を行なわなかった以外は実施例５と全く同様にして
各操作を行ない、免疫分析試薬を調製し、実施例５と同
一の試料についてヒトＩＣ１０１度を実測した。その結
果を第５表に示す。

第５表から明らかなように、実施例５の免疫分析試薬で
は、ラテックス凝集法による測定値とよく一致した測定
値が得られる。これに対して、比較例５の免疫分析試薬
では、ラテックス凝集法による測定値と大きくずれる場
合がある。これは、比較例５の免疫分析試薬では、試料
液中の被検物質以外の物質との間に非特異反応が生じて
いるためである。（以下余白）第５表（以下余白）実施例６　ヒトフェリチンの測定 ■官能性リン脂質の調製及びリポソームの調製実施例１
の■及び■と全く同様な操作を行ない、リポソーム懸濁
液を調製した。

■抗ヒトフェリチン抗体の修飾抗ヒトフェリチン抗体を用い、実施例１の■と同様な操
作によりＳＨ基を導入した。

■抗ヒトフェリチン抗体固定化リポソームの調製及び固
定化用官能基のブロック上記■で得られたリポソーム懸濁液１艷を４°Ｃにおい
て１５００Ｏｒｐｍで２０分間遠心したリポソーム沈査
と、上記■で得られた０、１ｇタンパク貿／成の修飾さ
れた抗ヒトフェリチン抗体溶液２瀬とを混合し、窒素置
換した後、密栓して２０℃でゆっくり撮とうしながら８
時間反応させた。

次に、ＧＶＢ−で洗浄して未反応の抗体を除去した。残
存固定化用官能基を消滅させる為にＨａＳ　（１）Ｈ７
，８）で希釈した。１ｍＭシスティン溶液２誦とリポソ
ーム沈査０．１９を混合し、Ａｒ置換して、密栓して２
０’Ｃでゆっくり振とうしながら、６時間反応させた。

つづいて、ＧＶＢ−でリポソームを洗浄して未反応のシ
スティンを除去した。

このようにして得られたリポソーム試薬に、ＧＶＢ−２
ｄ及び１０％ＮａＮ３２０μ℃を添加して十分に攪拌し
た後、窒素置換して４°Ｃで保存した。

■抗ヒトフェリチン抗体固定化リポソーム試薬によるヒ
トフェリチン濃度の実測遊離のウサギ抗ヒトフエリヂン抗体を用いたサンドイッ
チアッセイにより実施例１の■及び■と同様にしてヒト
フェリチン濃度と相対螢光強度との関係を調べて検量線
を作成し、更にこの検量線を用いて、患者血清１０　（
Ｎα６１〜Ｎα７０）試料についてヒトＣＥＡ濃度を実
施した。この結果を第６表に示す。なお、第６表中の参
照例もＲＩＡによる測定値である。

比較例６ ■〜■の操作のうち、■の固定化用官能基の叱飾操作を
行なわなかった以外は実施例６と全く同様にして各操作
を行ない、免疫分析試薬を調製し、ヒトフエ・リチン濃
度の検量線を作成し、実施例６と同一の試料についてヒ
トＣＥΔ濃度を実測した。

その結果を第６表に示す。

第６表から明らかなように、実施例６の免疫分析試薬で
は、ＲＩＡによる測定値とよく一致した測定値が得られ
る。これに対して、比較例６の免疫分析試薬では、測定
不可能であった。これは比較例６の免疫分析試薬では、
非特異反応が生じているためである。

（以下余白）第６表（以下余白）（発明の効果）本発明の免疫分析試薬によれば、被検物質を含む血清等
の試料を原液のまま分析することができ、精密かつ簡便
に被検物質を定量できる等顕著な効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、リポソームの残存固定化用官能基のＳＨ含有
物質（システィン）によるブロックの様子を示した模式
図、第２図は、本発明によるリポソームのヒトＡＦＰに
対する検量線を示した特性図である。代理人　弁理士　則　近　憲　佑同　　松山光之／−一−へ＼８　エミ　エＵ−Ｕ−Ｕ−の

Claims

【特許請求の範囲】

（１）リン脂質及び糖脂質のうち少なくともいずれか一
方を組成とするリポソームと、該リポソーム中に封入さ
れた標識物質と、前記リポソームに架橋法により固定化
された抗体もしくは抗体の一部又は抗原とからなる免疫
分析試薬において、前記リポソームに抗体もしくは抗体
の一部又は抗原の固定化した後にリポソーム表面に残存
した固定化用官能基がブロックされていることを特徴と
する免疫分析試薬。
（２）前記固定化用官能基がブロッキング剤で化学修飾
されることによりブロックされていることを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の免疫分析試薬。
（３）前記ブロッキング剤がＳＨ基含有化学物質又はア
ミノ基含有化学物質であることを特徴とする特許請求の
範囲第２項記載の免疫分析試薬。
（４）前記リポソームがリン脂質及び糖脂質のうち少な
くともいずれか一方とコレステロールとからなることを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫分析試薬。
（５）前記架橋剤が、Ｎ−サクシンイミジル３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオネート、ジサクシンイミジル
スベレイト、３，３′−ジチオビス（スルフォサクシン
イミジルプロピオネート）、エチレングリコールビス（
スルフォサクシンイミジルサクシネート）、ジメチルア
ジピミデート・２Ｈｃｌ、ジメチル３，３′−ジチオビ
スプロピオンイミデート・２ＨＣｌ、脂肪族ジアルデヒ
ド類、ジサンクロライドから成る群から選ばれたもので
あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫
分析試薬。
（６）前記標識物質が、螢光性化合物、発光性化合物、
吸光性化合物、糖類、イオン性化合物、酵素、補酵素、
ラジカル化合物から成る群から選ばれたものであること
を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫分析試薬
。
（７）前記抗体もしくは抗体の一部又は抗原が、蛋白質
、ペプチド、糖タンパクから成る群より選ばれたことを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫分析試薬。
（８）前記架橋剤と反応してリン脂質及び／又は糖脂質
の量が０．０１〜３０モル％であることを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載の免疫分析試薬。
（９）脂質換算で０．５ｍＭのリポソームに対して固定
化される抗体もしくは抗体の一部又は抗原の固定化濃度
が０．０１〜２０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載の免疫分析試薬。
（１０）前記リポソームを構成するリン脂質及び／又は
糖脂質並びにコレステロールのうち前記コレステロール
が前記リン脂質及び／又は糖脂質に対し、０．１〜５．
０倍の比率で含有されていることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の免疫分析試薬。