JP2565788B2 - 高比重リポ蛋白コレステロールの定量方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生物体液、例えば全血を試料として用い
て、生物体液中の被検成分（アナライト）である高比重
リポ蛋白コレステロールの含有量を一体型多層分析要素
を用いて乾式化学分析法により定量分析する方法に関す
る。

［従来技術とその欠点］ 血液中に存在する脂質は、遊離脂肪酸がアルブミンと
結合している以外はリポ蛋白の構造の中に組み込まれて
いて、カイロミクロン（CHM）、超低比重リポ蛋白（VLD
L）、低比重リポ蛋白（LDL）、高比重リポ蛋白（HDL）
等として存在し、その内コレステロールは特にVLDL、LD
L、HDLに分布している。HDLは動脈硬化による心疾患の
予防因子とされており、従ってHDLの代わりに高比重リ
ポ蛋白コレステロール（HDL−コレステロール）を測定
することは臨床的により重要な意義を有している。

現在HDLコレステロール測定方法としては、超遠心
法、電気泳動法、沈澱法が広く知られている。

超遠心法は分離操作に長時間必要なのと機器そのもの
が高価で安価な測定が望めない点など日常検査には不向
きであり、電気泳動法は電気泳動支持媒体の違いにより
分離能が異なり使用条件や使用される検出試薬によって
差異が生じるなど定量面で問題が残っている。従って現
在日常検査としては沈澱法が広く使用されている。

沈澱法は沈澱試薬としてポリアニオンと２価金属イオ
ンの組合せ等を使用してCHM、LDL、VLDLを沈澱させ、上
澄中に残るHDL中のコレステロール、すなわちHDL−コレ
ステロールを化学試薬又は酵素を使用して測定する方法
である。沈澱試薬としては、中井継彦 著『HDL−代謝
・測定・臨床（HDL−Metabolism.Assay Methods andCli
nical Application）』（中外医学社,1986年）、諸種の
文献・教科書により1960年代初めより周知の硫酸多糖類
−アルカリ土類金属イオン又はアルカリ土類以外の２価
金属イオンの組合せ系、無機ポリアニオン塩系、ポリエ
チレングリコール等が広く利用されている。沈澱試薬の
具体例としては、ヘパリン−カルシウム系試薬、デキス
トラン硫酸−マグネシウム系試薬、燐タングステン酸−
マグネシウム系試薬等がある。

これらの沈澱法では血清と沈澱試薬を混合し、一定時
間放置し、約3000回転／分にて遠心分離させた後、上澄
部分を一定量分別し、化学反応又は酵素反応を行いHDL
−コレステロールを定着する方法である。

沈澱法においては、沈澱試薬にもとづく問題点や遠心
分離操作による問題点などがある。そのため、沈澱効率
を高めるためにの沈澱剤の改良としては、特開昭55−78
254,特開昭55−93065,特開昭61−253467、特開昭62−19
768、特公平１−39553等に諸種の方法が記載されてい
る。

また、従来の沈澱法の大きな欠点は、トリグリセリド
が多い試料の場合には遠心分離後に沈澱物が一部浮遊す
ることがある。そのため遠心条件の調整などが必要で問
題点が大きい。また、燐タングステン酸塩マグネシウム
イオンを用いる方法では、溶液のpHにより沈澱性がバラ
つくことがある。そのためpHの厳密な調整などが必要と
いう問題点がある。

また、遠心分離液の上澄液を分別する際、特に液量が
少ない場合は、沈澱物の境界領域が目視で判別しにくい
ため再現性、精度上問題が発生したり、個人差が発生し
たりして定量分析精度が低下することがある。これらの
遠心操作に伴う欠点を改善することが求められている。

一方、乾式化学分析、すなわち実質的に乾燥状態の分
析要素、例えば、試験片や多層分析要素中に、分析試薬
系を保持した臨床分析法が知られている。乾式化学分析
は湿式法による化学分析（すなわち、溶液中に試薬を用
いる方法）より、例えば使用上の簡易性、経済上の節約
及び分析の迅速さなどの点で優れている。乾式多層分析
要素は、微量の液体試料で、精度の高い検査を迅速に行
うことができる分析手段として、開発された。乾式多層
分析要素は、例えば、特公昭53−21677、特開昭55−164
356、特開昭60−222769等で知られている。乾式多層分
析要素の一例を挙げれば、透明支持体、試薬層、光反射
層、展開層から構成されている。透明支持体は、例えば
下塗り処理を施した薄い有機ポリマーシートである。透
明支持体の上に塗布された試薬層には、液体試料中に含
まれる被検成分と反応し、その成分量に応じた光学濃度
に発色する試薬が含まれる。光反射層は、試薬層に入射
した光が展開層に達するのを防ぎ、試薬層の光学測定の
際展開層に点着した液体試料の光学的影響を受けないよ
うにする役割を持つ。展開層は、点着された液体試料を
一様（均一）に、液の量にほぼ比例する面積に広げる。
このような乾式分析要素を用いて定量分析するには、液
体試料、例えば全血を展開層の表面に一定量点着する。
展開層で展開された血液は、光反射層を通って試薬層に
達し、ここで試薬と反応し、発色する。点着後、化学分
析スライドを適当な時間、一定温度に保って（インクベ
ーション）発色反応を充分に進行させた後、透明支持体
側から照明光を試薬層に照射し、特定波長域で反射光量
を測定して反射光学濃度を求め、予め求めておいた検量
線に基づいて定量分析を行う。

本発明のHDL−コレステロール定量分析法において
は、前記のような乾式分析要素（一体型多層分析要素）
にさらに凝集体分離機能を有する多孔性層を配置した乾
式分析要素を用いて実施される。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明の目的は、沈澱剤を用いるHDL−コレステロー
ルを定量分析する方法において、乾式多層分析要素を用
いて、上澄液を沈澱物から分別するための遠心分離操作
が不要な測定方法を提供することである。

［技術的課題の解決手段］ 前記課題は、 液体試料に高比重リポ蛋白以外のリポ蛋白を沈澱させ
る沈澱試薬含有溶液を混合し、沈澱物を生じさせ、 前記沈澱物を含む液体試料を、沈澱物と高比重リポ蛋
白コレステロールを含む液状成分とに分離させ、 前記の分離した液状成分中のコレステロールの含有量
を比色法により定量することにより、液体試料中の高比
重リポ蛋白コレステロールの含有量を定量する方法にお
いて、 沈澱物と高比重リポ蛋白コレステロールを含む液状成分
とに分離させる過程が、沈澱物を分離しうる多孔性層を
有する一体型多層分析要素内でおこなわれることを特徴
とする高比重リポ蛋白コレステロールの定量方法、によ
り解決された。

前記課題の解決方法の実施態様として、 （１）前記分析要素が、水不透過性光透過性支持体の上
に、少なくとも３層の多孔性層が一体に積層されてお
り、前記多孔性層がそれぞれ隣接する面の間で、液体の
均一透過が実質的に妨げられない微少貫通部が形成され
るよう、部分的に配置された接着剤により実質的に密着
して接着され一体化されている一体型多層分析要素であ
って、前記少なくとも３層の多孔性層は前記支持体側か
ら、第１の多孔性層、非繊維質多孔性層、最上層をなす
繊維質多孔性層がこの順に積層されており、前記３層の
多孔性層のうちの少なくとも１層が前記の沈澱物を分離
しうる多孔性層をなし、かつ被検成分の存在下に検出し
得る光学的変化を生ずる試薬組成物が前記３層の多孔性
層の少なくとも１つに含まれることを特徴とする一体型
多層分析要素である前記定量方法、及び、 （２）前記分析要素が、水不透過性光透過性支持体と、
その上に一体に積層された、少なくとも３層の多孔性層
を有し、前記多孔性層がそれぞれ隣接する面の間で、液
体の均一透過が実質的に妨げられない微少貫通部が形成
されるよう、部分的に配置された接着剤により実質的に
密着して接着され一体化されている一体型多層分析要素
であって、支持体の上に親水性ポリマーをバインダーと
する実質的に無孔性の試薬層を有し、前記３層の多孔性
層のうちの少なくとも１層が前記の沈澱物を分離しうる
多孔性層をなし、かつ前記少なくとも３層の多孔性層
は、支持体の上に前記無孔性試薬層を介して、第１の多
孔性層、非繊維質多孔性層、最上層をなす繊維質多孔性
層がこの順に一体に積層されており、被検成分の存在下
に検出し得る光学的変化を生ずる試薬組成物が少なくと
も前記無孔性試薬層に含まれることを特徴とする一体型
多層分析要素である前記定量方法、がある。

前記の態様において、前記試薬組成物は、第１の多孔
性層に含まれてもよいし、無孔性試薬層と第１の多孔性
層との両方に含まれてもよいし、全部又は大部分が無孔
性試薬層に含まれてもよい。

［発明の具体的構成の詳細］ 本発明のHDL−コレステロール定量分析法い用いられ
る乾式多層分析要素（一体型多層分析要素）について説
明する。非繊維多孔性層として、特公昭53−21677、米
国特許1 421 341等に記載のセルロースエステル類、例
えば、セルロースアセテート、セルロースアセテートブ
チレート、硝酸セルロースからなるブラッシュポリマー
の層が好ましい。６−ナイロン、6,6−ナイロン等のポ
リアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン等の微多孔性
膜、特開昭62−27006に記載のポリスルホンからなる微
多孔性膜も好ましい。特公昭53−21677、特開昭55−908
59等に記載のポリマー小粒子、ガラス粒子、珪藻土等が
親水性又は非吸水性ポリマーで結合された連続空隙をも
つ微多孔性層も用いることができる。

非繊維多孔性層の有効孔径は0.8μｍから30μｍであ
ることが好ましい。本発明で非繊維多孔性層の有効孔径
は、ASTM F316−70に準拠した限界泡圧法（バブルポイ
ント法）により測定した孔径で示す。非繊維多孔性層が
相分離法により作られたいわゆるブラッシュ・ポリマー
から成るメンブランフィルターである場合、厚さ方向の
液体通過経路は、膜の製造の際の自由表面側（光沢面）
で最も狭くなっているのが普通で、液体通過経路の断面
を円に近似したときの孔径は、自由表面の近くで最も小
さくなっている。単位の通過経路における厚さ方向に関
する最小孔径は、さらにメンブランフィルターの面方向
について分布を持っており、その最大値が粒子に対する
瀘過性能を決定する。通常、それは限界泡圧法で測定さ
れる。

上に述べたように、相分離法により作られたブラッシ
ュ・ポリマーから成るメンブランフィルターでは、厚さ
方向の液体通過経路は膜の製造の際の自由表面側（光沢
面）で最も狭くなっている。本発明の分析要素の非繊維
多孔性層としてこの種の膜を用いる場合には、支持体に
近い側に面する側にメンブランフィルターの光沢面を向
けることが好ましい。

繊維質多孔性層を構成する材料としては、濾紙、不織
布、織物布地（例えば平織物布地）、編物布地（例えば
トリコット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いること
ができる。これらのうち織物布地、編物布地が好まし
い。布地等は特開昭57−66359に記載のようなグロー放
電処理等の物理化学的活性化処理をしてもよい。

非繊維多孔性層を繊維質多孔性層の上に又は繊維質多
孔性層を非繊維質多孔性層の上に固定する方法として
は、接着剤を用いることができるが、液体の均一（一
様）透過が実質的に妨げられないようにする必要があ
る。そのためには、接着剤を部分的に配置し、接着剤が
存在しない部分に微少貫通部が形成されるようにする。
その方法として特開昭62−138756に記載の、２つの多孔
性層を網点印刷法（例、グラビア印刷法、スクリーン印
刷法）を利用した部分接着法により接着一体化する方法
が有効である。グラビア印刷法を利用した部分接着法の
代表的な例は、高温に加熱し溶融状態のホットメルト型
接着剤を、繊維質多孔性層か非繊維質多孔性層のどちら
か一方の表面に、グラビアローラーからの転写によりド
ット状に付着させた直後に両者を重ねてラミネートロー
ラーの間を通すことで接着一体化する方法である。

最上層をなす繊維質多孔性層は、液体試料の展開層と
して機能するので、液体計量作用を有する層であること
が好ましい。液体計量作用とは、層の表面に点着供給さ
れた液体試料を、その中に含有する成分を実質的に偏在
させることなく、層の面方向に単位面積当りほぼ一定量
の割合で広げる作用である。展開層には、展開面積、展
開速度等を調節するために、特開昭60−222770、特開昭
63−219397、特開昭63−112999、特開昭62−182652に記
載のような親水性高分子又は界面活性剤を含有すること
ができる。

最上層をなす繊維質多孔性層を非繊維質多孔性層の上
に固定する方法としても、接着剤を用いることができる
が、液体の均一（一様）透過が実質的に妨げられないよ
うにする必要がある。そのためには、接着剤を部分的に
配置し、接着剤が存在しない部分に微少貫通部が形成さ
れるようにする。その方法として特開昭62−138756に記
載の、２つの多孔性層を網点印刷法（例、グラビア印刷
法、スクリーン印刷法）を利用した部分接着法により接
着一体化する方法が有効である。

第１の多孔性層としては、前記の繊維質多孔性層と同
様な繊維質多孔性層及び前記の非繊維質多孔性層と同様
な非繊維質多孔性層のうちから適宜選択して用いること
ができる。

中間の非繊維質多孔性層と最上層をなす繊維質多孔性
層の空隙体積（単位面積当たり；以下同じ）は同じでも
異なってもよい。

本発明の分析法に用いられる多層分析要素は種々の構
成（層の配置）をとることができる。例えば、米国特許
3 992 158、特開昭55−164356、特開昭62−138756、特
開昭62−138757、特開昭62−138758の記載を参考にでき
る。実用的には例えば、 （１）支持体の上に、第１の多孔性層、非繊維多孔性
層、最上層をなす繊維質多孔性層をこの順に、 （２）支持体の上に、接着層（又は吸水層）、第１の多
孔性層、非繊維多孔性層、最上層をなす繊維質多孔性層
を、この順に、 （３）支持体の上に、検出層、第１の多孔性層、非繊維
多孔性層、最上層をなす繊維質多孔性層を、この順に、 （４）支持体の上に、試薬層、第１の多孔性層、非繊維
多孔性層、最上層をなす繊維質多孔性層を、この順に、 （５）支持体の上に、検出層、試薬層、第１の多孔性
層、非繊維多孔性層、最上層をなす繊維質多孔性層を、
この順に、 それぞれ有するものが、有用である。支持体は下塗り層
を有していてもよい。検出層は、一般に、被検成分の存
在下で生成した色素等が拡散し、光透過性支持体を通し
て光学的に検出され得る層で、親水性ポリマーにより構
成することができる。媒染剤、例えばアニオン性色素に
対してカチオン性ポリマーを、含んでもよい。吸水層
は、一般に、被検成分の存在下で生成する色素が実質的
に拡散しないような層を言い、膨潤しやすい親水性ポリ
マーにより構成することができる。

試薬層と第１の多孔性層との間、又は検出層と第１の
多孔性層との間に、妨害物除去層、光反射層等を設けて
もよい。

光透過性水不透過性支持体（透明支持体）の材料とし
て好ましいものはポリエチレンテレフタレート、ポリス
チレン、セルローストリアセテート等のセルロースエス
テル類である。親水性層の吸水層、検出層、実質的に無
孔性の試薬層等を支持体に強固に接着させるために、通
常、支持体に下塗り層を設けるか、親水化処理を施す。

本発明の定量方法に用いられる多層分析要素に配合さ
れるコレステロール測定用試薬組成物と光学的変化を生
じる試薬組成物について説明する。

コレステロール測定用試薬組成物 コレステロール測定用試薬組成物はコレステロールエ
ステラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素（以下CH
Eと略記する）とコレステロールオキシダーゼを含む試
薬組成物である。

コレステロールエステルから遊離コレステロールを得
るために用いるコレステロールエステラーゼ活性を有す
る酵素としては、例えば、米国特許3,925,164、同4,27
5,151等に製法が記載されたコレステロールエステラー
ゼをはじめ、市販のコレステロールエステラーゼを選択
して用いることができる。コレステロールエステラーゼ
は動物臓器起源のものでも、微生物起源のものでもよ
い。特公昭56−19240に記載のように、コレステロール
エステラーゼとともにリポプロテインリパーゼを併用し
てもよい。

遊離したコレステロールの定量には、コレステロール
オキシダーゼを用いて酸化し、生成する過酸化水素を定
量する方法を用いることができる。コレステロールオキ
シダーゼとして、例えば、特開昭49−47582、特公昭57
−28552、特公昭57−44318等に製法が記載された酵素を
用いることができる。

光学的変化を生じる試薬組成物 試薬組成物には、生成した過酸化水素を、光学的に検
出し得る物質、例えば色素（又は染料）を生成し得る組
成物である。好ましくはペルオキシダーゼ、及び過酸化
水素の存在下に発色、変色、蛍光発生又は化学発光等の
検出し得る光学的変化を生ずる試薬組成物である。過酸
化水素を光学的に検出し定量する試薬組成物は種々のも
のが良く知られており、当業者はそれらの中から選択し
て採用することができる。例えば、 ペルオキシダーゼと特開昭50−137192（米国特許3 983
005）に記載の４−アミノアンチピリン（色原体化合物
又は水素供与体化合物）とフェノール類又はナフトール
類（カプラー）との組み合わせ、特開昭57−142562に記
載のペルオキシダーゼ、色原体化合物（水素供与体化合
物）、N,N−ジ置換アニリンとの組み合わせ、 ロイコ色素の酸化により染料を生成する試薬組成物、例
えば、ペルオキシダーゼと特公昭57−5519（米国特許4
089 747）に記載のトリアリールイミダゾールロイコ色
素との組み合わせ、ペルオキシダーゼと特開昭59−1933
52号等に記載のジアリールイミダゾールロイコ色素との
組み合わせ、 還元型補酵素（NAD又はNADP）と電子伝達剤の存在下で
染料を生成することのできる染料前駆体化合物との組み
合わせ、 等が有用である。

コレステノンを検出するには、ヒドラジン類、例えば
ヒドラジン、2,4−ジニトロヒドラジン等を試薬として
用いることができる。

遊離したコレステロールの定量にはまた、NAD（又はN
ADP）依存コレステロールデヒドロゲナーゼを試薬とし
て用いて、生成するコレステノン又はNADH（又はNADP
H）を定量する方法を用いることもできる。

光学的変化を生じる試薬組成物は試薬層、第１の多孔
性層、又は中間に配置される非繊維多孔性層に含むこと
ができる。

これら全てを多孔性試薬層に含んでもよいし、その一
部を多孔性試薬層以外の水浸透性層に含んでもよい。例
えば、CHEとコレステロールオキシダーゼを多孔性試薬
層に含み、ペルオキシダーゼと過酸化水素検出試薬組成
物を親水性ポリマーから成る層に含んでもよい。上記諸
成分の一部、例えばCHEを、沈澱物を分離しうる多孔性
層に含んでもよい。

被検成分の存在下に光学的変化を生じる試薬組成物を
前記３層の多孔性層の少なくとも１層に含有させるに
は、試薬組成物の適当な溶液又は分散液を予め含浸又は
塗布した多孔性層を、他の水浸透性層、例えば試薬層の
上に接着一体化する方法で接着させる方法が有用であ
る。適用しうる接着方法の例として、特開昭55−164356
に記載のように、親水性ポリマーバインダーを含む層
（接着層又は試薬層）の表面全面を水又は界面活性剤含
有水でほぼ一様に湿潤させておき、その表面に多孔性層
を重ねあわせ軽く一様に圧力をかけて接着一体化する方
法がある。また、多孔性層を他の水浸透性層（例、下塗
り層、接着層、吸水層）の上に特開昭55−164356に記載
のような方法で接着させた後、試薬組成物の溶液又は分
散液を多孔性層に塗布してもよい。

多孔性層に試薬組成物を含浸又は塗布するには公知の
方法を利用できる。塗布には、例えば、ディップ塗布、
押し出し塗布、ドクター塗布、ホッパー塗布、カーテン
塗布等を適宜選択して用いることができる。

試薬組成物は総てを一つの多孔性層、例えば第１の多
孔性層に含んでもよく、複数の多孔性層に分けて含有さ
せてもよい。試薬組成物の一部又は全部を、多孔性層よ
り支持体に近く設けられた親水性ポリマーを結合剤とす
る実質的に一様な無孔性の層（無孔性試薬層）に含ませ
てもよい。親水性ポリマーとして、例えば、ゼラチン及
びこれらの誘導体（例、フタル化ゼラチン）、セルロー
ス誘導体（例、ヒドロキシプロピルセルロース）、アガ
ロース、アクリルアミド重合体、メタアクリルアミド重
合体、アクリルアミド又はメタアクリルアミドと各種ビ
ニル性モノマーとの共重合体等が利用できる。

親水性ポリマーを結合剤とし試薬組成物を含む均一な
無孔性の層を塗布した後、試薬組成物を含まない多孔性
層を特開昭55−164356に記載のように、親水性ポリマー
を含む試薬層の表面を水で一様に湿潤させておき、その
上に多孔性層を重ねて軽くほぼ一様に圧力をかけて接着
させる方法で接着させることによっても、試薬組成物を
第１の多孔性層に実質的に含有させることができる。

試薬組成物には、必要に応じ、活性化剤、pH緩衝剤、
架橋剤（硬膜剤又は硬化剤）、界面活性剤等を含有させ
ることができる。本発明の分析法に用いられる分析要素
の試薬層又は試薬層と液体接触しうる層に含有させるこ
とができるpH緩衝剤の例としては、炭酸塩、硼酸塩、燐
酸塩や『Biochemistry』５巻（２号）、467−477頁（19
66年）に記載のGoodのpH緩衝剤などがある。これらのpH
緩衝剤は『蛋白質・酵素の基礎実験法』（堀尾武一ほか
著、南江堂、1981年）、『Biochemistry』５巻等の文献
の記載を参考にして選択することができる。

第１の多孔性層を接着し積層するための接着層を、支
持体、下塗り層、吸水層、検出層等の層の上に設けても
よい。接着層は水で膨潤したときに多孔性層を接着する
ことができるような親水性ポリマー、例えば、ゼラチ
ン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等から
なることが好ましい。

第１の多孔性層は、検出層、試薬層等に生じた検出可
能な変化（色変化、発色等）を透明支持体側から反対測
光する際に、全血中の赤血球のヘモグロビンの赤色を遮
蔽するとともに、光反射層又は背景層として機能する。
第１の多孔性層に親水性ポリマーをバインダーとして分
散された二酸化チタン、硫酸バリウム等の光反射性微粒
子を含有させてもよい。バインダーとしてはゼラチン、
ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい。

本発明の定量分析方法に用いられる沈澱試薬の主成分
としては、中井継彦著『HDL−代謝・測定・臨床−（HDL
−Metabolism.Assay Methods and Clinical Applicatio
n）』（中外医学社,1986年）、諸種の文献・教科書によ
り1960年代初めより周知の硫酸多糖類−アルカリ土類金
属イオン又はアルカル土類以外の２価金属イオンの組合
せ系、無機ポリアニオン塩系、ポリエチレングリコール
等を用いることができる。

これらの沈澱試薬のうちで、硫酸多糖類−金属イオン
の組合せ系としては、 『Journal of Laboratoryand Clinical Medicine』82巻
473頁以降（1973年）に記載のデキストラン硫酸−カル
シウム（２＋）イオンの組合せ、 『J.Lipid Res.』11巻583−595頁（1970年）、『Clin.C
hem.』24巻931−933頁（1978年）等に記載のデキストラ
ン硫酸−マグネシウム（２＋）イオン複合体、 『J.Lipid Res.』11巻583−595頁（1970年）、『Manual
of Lipidoperations.Lipid Research Clinics Progra
m.Volume I』Pub.No.（NIH）75−628（1978年）等に記
載のヘパリン単独、ヘパリンナトリウム−マンガンイオ
ンの組合せ、 特開昭55−51359に記載のヘパリン−カルシウムイオン
−ニッケル（＋２）イオンの組合せ等の沈澱試薬が好ま
しい。

無機ポリアニオン塩系沈澱試薬としては、 『J.Lipid Res.』11巻583−595頁（1970年）、『Clin.C
hem.』23巻882−884頁（1977年）、『Clin.Chem.』25巻
939−942頁（1979年）、米国特許4 226 713、特公昭63
−27659（米国特許4 215 993）、特開平01−39553（米
国特許4 251 519）等に記載の燐タングステン酸（塩）
−マグネシウム（２＋）イオンの組合せが好ましい。

沈澱試薬は前記の主成分を含む適当な溶媒の溶液とし
て用いる。本発明の方法に好ましい沈澱試薬である燐タ
ングステン酸（塩）−マグネシウムイオンの組合せを例
として説明するが、本発明の方法においては沈澱試薬は
燐タングステン酸（塩）−マグネシウムイオンの組合せ
に限定されるわけではない。

燐タングステン酸（塩）は適当な溶媒、通常は水に約
200mg/L〜約3.0g/L、好ましくは約250mg/L〜約2.0g/Lの
範囲、マグネシウム（２＋）イオンは約２ミリモル/L以
上、好ましくは約４ミリモル/L〜約25ミリモル/Lの範囲
を含む溶液として用いられる。燐タングステン酸はナト
リウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩のいずれかが好
ましい。マグネシウム（２＋）イオンは塩化マグネシウ
ム・6H₂O、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウムのいず
れかが好ましい。燐タングステン酸−マグネシウムイオ
ン水溶液はpH約2.0〜約8.0、好ましくはpH約6.1〜約7.6
の範囲である。沈澱試薬水溶液は、燐タングステン酸
（塩）とマグネシウムイオンを含む１液として用いても
よいし、燐タングステン酸（塩）水溶液とマグネシウム
イオン水溶液の２液として用いてもよい。燐タングステ
ン酸（塩）−マグネシウムイオン沈澱試薬水溶液及び他
の沈澱試薬水溶液は、いずれも前記の文献や特許明細書
に記載の方法に従って用いることができる。

燐タングステン酸−マグネシウムイオン系沈澱試薬を
例として使い方を説明する。

２液型沈澱試薬の場合： 検体（全血、血漿、又は血清）液に下記の割合が一般的
である。

全血試料 1000μＬ 燐タングステン酸ナトリウム塩水溶液 （40g/L.NaOH水溶液を加えてpH6.1〜7.6に調整） 100μＬ 塩化マグネシウム・6H₂O水溶液 （２モル/L） 25μＬ 検体液に燐タングステン酸ナトリウム塩水溶液と塩化マ
グネシウム・6H₂O水溶液をこの順又は逆の順に添加す
る。

１液型沈澱試薬の場合： 検体（全血、血漿、又は血清）液に下記の割合が一般的
である。

全血試料 1000μＬ 沈澱試薬水溶液 100μＬ 燐タングステン酸ナトリウム塩 2.0〜10.0％ 塩化マグネシウム・6H₂O 250〜750ミリモル （NaOH水溶液を加えてpH6.1〜7.6、好ましくはpH6.8
〜7.2に調整） 検体液に沈澱試薬溶液を添加する。

本発明の高比重リポ蛋白コレステロールの定量方法の
特徴は、前記の操作で生成した高比重リポ蛋白以外のリ
ポ蛋白の凝集物（沈澱物）が生成した検体液を充分に撹
拌し、沈澱した成分を懸濁させ、次いで凝集物を分離す
る機能を有する前記の多層分析要素の最上層をなす繊維
質多孔性層にそのまま点着供給することにある。点着さ
れた検体液は凝集物を分離する機能を有する多孔性層に
より補捉され多孔性層内部にとどまり、高比重リポ蛋白
コレステロールを含む液体が下側のコレステロール分析
試薬組成物を含む層に到達する。コレステロール分析試
薬組成物を含む層において、高比重リポ蛋白コレステロ
ールからコレステロールが分離され、分離されたコレス
テロールは試薬成分と反応し、分解生成物（多くの場合
過酸化水素）はついで呈色試薬成分と反応して、含有さ
れていたコレステロール濃度に対応した発色又は色変化
が生じる。生じた発色又は色変化を測光し、周知の比色
反応の原理により、コレステロール濃度が求められる。
求められたコレステロール濃度は高比重リポ蛋白コレス
テロール濃度である。

［発明の効果］ 本発明の分析法は、従来のHDL−コレステロール測定
に用いられる沈澱剤を用いて、凝集物を形成させたの
ち、凝集物を分離する機能を有する乾式分析要素を用い
て、沈澱試薬水溶液を添加した血液試料（全血、血漿、
血清）を多層分析要素に点着し、従来の沈澱法の大きな
欠点である、遠心条件の調整と繁雑な遠心分離と上澄液
の沈澱物からの分取の操作なしに、HDL−コレステロー
ル含有量について、高い精度で分析することができる。

［実施例１］ 総コレステロール定量用一体型多層分析要素１−１ロイ
コ色素分散液の調整 ロイコ色素溶液 下記組成のロイコ色素溶液を調製した。

２−（４−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフェニル）−
４−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−フェネ
チルイミダゾール 酢酸塩 5.7g ２−（４−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフェニル）−
４−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−フェネ
チルイミダゾール 塩酸塩 0.8g N,N−ジエチルラウリルアミド 104g ゼラチン水溶液 下記組成のゼラチン水溶液を作成した。

アルカリ処理ゼラチン 300g 水 1900g ビス［（ビニルスルホニルメチルカルボニル）−アミ
ノ］メタン 3.0g ロイコ色素乳化液の調製 ゼラチン水溶液をTKオートホモミキサー（特殊機械工
業社製 乳化器）で約5700回転／分で撹拌しながらロイ
コ色素溶液を添加し、約30分間分散して、ロイコ色素乳
化液を調製した。

１−２発色試薬層の塗布 上記の工程で得られた乳化液を、ゼラチン下塗りさ
れている厚さ180μｍで平滑な表面の無色透明ポリエチ
レンテレフタレート（PET）シート（支持体）の上に１m
²当たり150gの割合で塗布し、乾燥させて、無孔性の発
色試薬層（乾燥厚さ約20μｍ、被覆量約26g/m²）を形成
した。

１−３第１の多孔性層の積層と処理 上記発色試薬層の表面を約25℃の水で一様に湿らせ
（約30g/m²の割合）、50デニール相当のPET紡績糸を36
ゲージ編みしたトリコット編物布地（厚さ約250μｍ）
を重ね合わせ、乾燥させて発色試薬層に布地を接着させ
た。

次にこのトリコット編物布地の上から、下記の試薬組
成物水溶液を、布地１m²当り下記の成分被覆量になるよ
うに塗布し、乾燥させて、第１の多孔性層（繊維質多孔
性層）とした。試薬組成物の成分被覆量（１m²当り） メチルセルロース 3.0g 二酸化チタン微粒子（平均粒子径0.3μｍ） 24g リポプロテインリパーゼ 2000IU コレステロールエステラーゼ 2500IU コレステロールオキシダーゼ 2500IU ペルオキシダーゼ 2500IU 燐酸二水素カリウム 7.3g フェロシアン化カリウム 700mg （IUは酵素国際単位） １−４最上層をなす繊維質多孔性層の含浸処理 50デニール相当のPET紡績糸を36ゲージ編みしたトリ
コット編物布地（厚さ約250μｍ）を下記組成の水溶液
に浸潰し、空隙に液を満たした後、取り出して乾燥させ
た。

ポリエチレングリコール（分子量約５万） 2.0g 四硼酸ナトリウム 2.0g 精製水 96g １−５最上層をなす繊維質多孔性層と非繊維質多孔性層
の積層（部分接着による一体化） 次に含浸処理剤みのトリコット編物布地を温度80℃に
予熱した表面に、温度130℃に加熱して溶解したホット
メルト型接着剤を、グラビア印刷法を利用してグラビア
ローラーからの転写により、点状に付着させた。グラビ
アローラーは円形のドットの直径0.3mm、ドット中心間
距離0.6mm、ドット面積率約20％のものを用いた。付着
した固形成分の量は約3g/m²であった。

接着剤が転写された直後の高温の布地の表面に、有効
孔径３μｍ、厚さ140μｍ、空隙率約80％のセルロース
アセテートメンプランフィルター（富士写真フイルム
（株）製ミクロフィルターFM300）の非光沢面とを向か
い合わせてラミネートローラーの間を通し、両者をラミ
ネート（接着一体化）した。トリコット編物布地が最上
層をなす繊維質多孔性層、メンブランフィルターが中間
に配置される非繊維質多孔性層（展開層としても機能す
る）である。

１−６一体型多層分析要素の完成 この積層物（非繊維質多孔性層（展開層）と最上層を
なす多孔質層）を前記と同じ点状接着法により第１多孔
性層の面の上に接着し、一体化させた。すなわち前記の
積層物のメンブランフィルター面に、加熱したホットメ
ルト型接着剤を、グラビア印刷法を利用してグラビアロ
ーラーからの転写により、点状に付着させた後、直ちに
第１の多孔性層（支持体及び発色試薬層の上にある）の
面と向かい合わせ、両者をラミネートローラーの間を通
し、ラミネート（接着一体化）した。

こうして完成した総コレステロール定量用多層分析要
素は、支持体、実質的に無孔性の発色試薬層、第１の多
孔性層（繊維質多孔性層）、非繊維質多孔性層、最上層
をなす繊維質多孔性層の順に一体に積層されている。最
上層をなす繊維質多孔性層と中間に配置された非繊維質
多孔性層とは協同して沈澱物の濾過分別層として作用
し、第１の多孔性層にHDL−コレステロールを供給す
る。第１の多孔性層は、HDL−コレステロールの存在下
に第２鉄イオンを生成する反応層として作用する。発色
試薬層は、HDL−コレステロールの存在下に第１の多孔
性層で生成した第２鉄イオンにより色素を形成し、色素
は透明支持体を通して光学的に検出される。

１−６分析スライドの製作 得られた総コレステロール定量分析用多層分析要素を
一辺15mmの正方形チップに裁断し、特開昭57−63452に
記載のスライド枠に収めてHDL−コレステロール定量用
生化学分析スライドを完成した。

被検液の調製とHDL−コレステロールの測定 総コレステロール値がほぼ等しく、HDL−コレステロ
ール値が異なるヒト血清を５サンプル選び、試験管に、
選んだヒト血清それぞれ100μＬと、燐タングステン酸
と塩化マグネシウムを含む沈澱試薬（和光純薬（株）
製）100μＬをとり、試験管ミキサーでよく混和し、室
温で約10分間放置して凝集状態で白濁した検液試料を得
た。調製した検液を分析スライドの最上層に20μＬずつ
点着し、37℃で６分インクベーションした後、中心波長
640nmの可視光でPET透明支持体側から反射測光により、
分析スライドの発色光学濃度を測定した。

一方、HDL−コレステロールの含有量は従来の標準分
析法（沈澱の遠心分離後の湿式分析法）により求めた。
前記の凝集状態で白濁した検液試料の一部を遠心分離管
に分け取り、常温で遠心分離機にかけ、3000rpmで10分
遠心分離した。分離した上澄液を取り出し、日立705自
動分析機を用いてHDL−コレステロール含有量を測定
し、標準値とする含有量を求めた。

日立705自動分析機を用いて測定したHDL−コレステロ
ール含有量を横軸に、本発明の方法により測定して得ら
れた発色光学濃度を縦軸にとり、プロットして第１図の
グラフ（検量線）を得た。

第１図の検量線から本発明の分析法により沈澱物の遠
心分離を行わずに白濁した状態の検液試料を乾式多層分
析要素に点着することにより、HDL−コレステロールを
精度良く定量できることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト血清に含まれるHDL−コレステロール含有
量と本発明実施例１の多層分析要素の発色の反射光学濃
度との関係を示すグラフ（検量線）である。

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】液体試料に高比重リポ蛋白以外のリポ蛋
   白を沈澱させる沈澱試薬含有溶液を混合し、沈澱物を生
   じさせ、 前記沈澱物を含む液体試料を、沈澱物と高比重リポ蛋
   白コレステロールを含む液状成分とに分離させ、 前記の分離した液状成分中のコレステロールの含有量
   を比色法により定量することにより、液体試料中の高比
   重リポ蛋白コレステロールの含有量を定量する方法にお
   いて、 沈澱物と高比重リポ蛋白コレステロールを含む液状成分
   とに分離させる過程が、沈澱物を分離しうる多孔性層を
   有する一体型多層分析要素内でおこなわれることを特徴
   とする高比重リポ蛋白コレステロールの定量方法。
2. 【請求項２】前記分析要素が、水不透過性光透過性支持
   体の上に、少なくとも３層の多孔性層が一体に積層され
   ており、前記多孔性層がそれぞれ隣接する面の間で、液
   体の均一透過が実質的に妨げられない微少貫通部が形成
   されるよう、部分的に配置された接着剤により実質的に
   密着して接着され一体化されている一体型多層分析要素
   であって、前記少なくとも３層の多孔性層は前記支持体
   側から、第１の多孔性層、非繊維質多孔性層、最上層を
   なす繊維質多孔性層がこの順に積層されており、前記３
   層の多孔性層のうちの少なくとも１層が前記の沈澱物を
   分離しうる多孔性層をなし、かつ被検成分の存在下に検
   出し得る光学的変化を生ずる試薬組成物が前記３層の多
   孔性層の少なくとも１層に含まれることを特徴とする一
   体型多層分析要素である請求項１に記載の定量方法。
3. 【請求項３】前記分析要素において試薬組成物が第１の
   多孔性層に含まれるものである請求項２に記載の定量方
   法。
4. 【請求項４】前記分析要素が、水不透過性光透過性支持
   体と、その上に一体に積層された、少なくとも３層の多
   孔性層を有し、前記多孔性層がそれぞれ隣接する面の間
   で、液体の均一透過が実質的に妨げられない微少貫通部
   が形成されるよう、部分的に配置された接着剤により実
   質的に密着して接着され一体化されている一体型多層分
   析要素であって、かつ支持体の上に親水性ポリマーをバ
   インダーとする実質的に無孔性の試薬層を有し、前記３
   層の多孔性層のうちの少なくとも１層が前記の沈澱物を
   分離しうる多孔性層をなし、かつ前記少なくとも３層の
   多孔性層は、支持体の上に前記無孔性試薬層を介して、
   第１の多孔性層、非繊維質多孔性層、最上層をなす繊維
   質多孔性層がこの順に一体に積層されており、被検成分
   の存在下に検出し得る光学的変化を生ずる試薬組成物が
   少なくとも前記無孔性試薬層に含まれることを特徴とす
   る一体型多層分析要素である請求項１に記載の定量方
   法。
5. 【請求項５】前記分析要素において前記試薬組成物が前
   記無孔性試薬層及び第１の多孔性層に含まれるものであ
   る請求項４に記載の定量方法。
6. 【請求項６】前記分析要素において前記試薬組成物が前
   記無孔性試薬層に含まれるものである請求項３に記載の
   定量方法。