JP2598024B2 - シグナルペプチドをコードしているｄｎａ - Google Patents
シグナルペプチドをコードしているｄｎａInfo
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- JP2598024B2 JP2598024B2 JP18178087A JP18178087A JP2598024B2 JP 2598024 B2 JP2598024 B2 JP 2598024B2 JP 18178087 A JP18178087 A JP 18178087A JP 18178087 A JP18178087 A JP 18178087A JP 2598024 B2 JP2598024 B2 JP 2598024B2
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- JP
- Japan
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- signal peptide
- amino acid
- human lysozyme
- lysozyme
- amino acids
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、改良されたタンパク質分泌促進能を有する
シグナルペプチド、およびそれをコードしているDNAに
関する。
シグナルペプチド、およびそれをコードしているDNAに
関する。
周知の如く、動物細胞のある種の分泌タンパク質は、
そのアミノ末端に、細胞膜を通過する機構に関与する約
15〜30個のペプチド、即ちシグナルペプチドを伴った形
で生合成される。このシグナルペプチドが、どの様な機
構で分泌タンパク質の膜通過を可能ならしめているかは
未だ完全には解明されていないが、信頼するに足る種々
の仮説が提出されている。それらによれば、シグナルペ
プチド中に含まれている極く少数の非疎水性アミノ酸が
まず細胞膜に付着し、残余の疎水性アミノ酸で構成され
るペプチド鎖が細胞膜内に侵入し、次いで膜を貫通して
突出し、次いでその突出部に連結している分泌タンパク
質が順次膜を通過するものと考えられている。全ての分
泌タンパク質が膜を通過した後、膜内に存在する酸素に
よってシグナルペプチドと分泌タンパク質の結合部が切
断され、成熟タンパク質が完成する。
そのアミノ末端に、細胞膜を通過する機構に関与する約
15〜30個のペプチド、即ちシグナルペプチドを伴った形
で生合成される。このシグナルペプチドが、どの様な機
構で分泌タンパク質の膜通過を可能ならしめているかは
未だ完全には解明されていないが、信頼するに足る種々
の仮説が提出されている。それらによれば、シグナルペ
プチド中に含まれている極く少数の非疎水性アミノ酸が
まず細胞膜に付着し、残余の疎水性アミノ酸で構成され
るペプチド鎖が細胞膜内に侵入し、次いで膜を貫通して
突出し、次いでその突出部に連結している分泌タンパク
質が順次膜を通過するものと考えられている。全ての分
泌タンパク質が膜を通過した後、膜内に存在する酸素に
よってシグナルペプチドと分泌タンパク質の結合部が切
断され、成熟タンパク質が完成する。
遺伝子操作により、所望のタンパク質を細胞培養で製
造しようとする場合、シグナルペプチドが欠失していた
り、その機能が十分でないと、発現されたタンパク質が
細胞内に蓄積し、細胞内酸素で分解を受けたり、不溶化
したりして、これを純粋な形で回収することが極めて困
難になることがある。
造しようとする場合、シグナルペプチドが欠失していた
り、その機能が十分でないと、発現されたタンパク質が
細胞内に蓄積し、細胞内酸素で分解を受けたり、不溶化
したりして、これを純粋な形で回収することが極めて困
難になることがある。
この様に、生体内においても、また細胞培養によって
所望のタンパク質を生産する生命工学の分野において
も、シグナルペプチドは極めて重要な役割を果たしてい
ることが理解されよう。
所望のタンパク質を生産する生命工学の分野において
も、シグナルペプチドは極めて重要な役割を果たしてい
ることが理解されよう。
一方、遺伝子工学の進歩によって、所望のタンパク質
を微生物を使って製造することが可能となってから、各
種の関連技術に著しい発展があり、初期の技術に全ゆる
面からの改良が加えられている。しかしながら、新たに
デザインしたシグナルペプチドを使用して分泌効率を高
め、所望のタンパク質の回収率を改善しようとする試み
はほとんどなされていない。本発明者らは、卵白リゾチ
ームのシグナルペプチドをコードしているDNAとヒトリ
ゾチームをコードしているDNAを連結し、これを適当な
プラスミドに組み込んだ後、このプラスミドを酵母に導
入してヒトリゾチームを発現させる研究を行っている過
程で、18個のアミノ酸配列からなる卵白のリゾチームの
シグナルペプチドの内、特定のアミノ酸を除いた残りの
大部分を他の疎水性アミノ酸、特にロイシン（Ｌ）に変
換したものが、ヒトリゾチームの分泌を著しく促進する
ことを発見し、これを特許出願した（特願昭62−069764
号 昭和62年３月23日出願）。
を微生物を使って製造することが可能となってから、各
種の関連技術に著しい発展があり、初期の技術に全ゆる
面からの改良が加えられている。しかしながら、新たに
デザインしたシグナルペプチドを使用して分泌効率を高
め、所望のタンパク質の回収率を改善しようとする試み
はほとんどなされていない。本発明者らは、卵白リゾチ
ームのシグナルペプチドをコードしているDNAとヒトリ
ゾチームをコードしているDNAを連結し、これを適当な
プラスミドに組み込んだ後、このプラスミドを酵母に導
入してヒトリゾチームを発現させる研究を行っている過
程で、18個のアミノ酸配列からなる卵白のリゾチームの
シグナルペプチドの内、特定のアミノ酸を除いた残りの
大部分を他の疎水性アミノ酸、特にロイシン（Ｌ）に変
換したものが、ヒトリゾチームの分泌を著しく促進する
ことを発見し、これを特許出願した（特願昭62−069764
号 昭和62年３月23日出願）。
本発明者らは、上記の知見に基づき、更に研究を進め
た結果、18個のアミノ酸配列の大部分を疎水性アミノ酸
に変換するばかりではなく、シグナルペプチドのアミノ
酸配列の長さ自体を18個から16個に減らしたものが更に
強力な分泌促進作用を有することを見いだした。本発明
はかかる知見に基づいて完成されたものである。
た結果、18個のアミノ酸配列の大部分を疎水性アミノ酸
に変換するばかりではなく、シグナルペプチドのアミノ
酸配列の長さ自体を18個から16個に減らしたものが更に
強力な分泌促進作用を有することを見いだした。本発明
はかかる知見に基づいて完成されたものである。
本発明をより具体的に説明するために、卵白リゾチー
ムの天然のシグナルペプチドを構成している18個のアミ
ノ酸配列を以下に示し、分泌を促進させるための本発明
に係るアミノ酸配列のデザインについてより詳細に説明
する。
ムの天然のシグナルペプチドを構成している18個のアミ
ノ酸配列を以下に示し、分泌を促進させるための本発明
に係るアミノ酸配列のデザインについてより詳細に説明
する。
上記のアミノ酸配列式で理解される様に、本明細書に
おいては、アミノ酸は、主としてIUPAC−IUB生化学命名
委員会確認規則に基づく一文字記号による表記法に従っ
て記載した。以下にこの表記法によって表わされる代表
的アミノ酸を例示する。
おいては、アミノ酸は、主としてIUPAC−IUB生化学命名
委員会確認規則に基づく一文字記号による表記法に従っ
て記載した。以下にこの表記法によって表わされる代表
的アミノ酸を例示する。
Ｍ…メチオニン Ｒ……アルギニン Ｓ…セリン Ｌ…ロイシン Ｉ…イソロイシン Ｖ…バリン Ｃ…システイン Ｐ…プロリン Ａ…アラニン Ｇグリシン Ｆ…フェニルアリニン Ｔ…スレオニン 上記のアミノ酸配列に基づき新たなシグナル配列をデ
ザインするに当り、第１および第２番目のアミノ酸（Ｍ
およびＲ）並びに第16〜18番目のアミノ酸（Ａ、Ｌおよ
びＧ）は、それぞれ細胞膜への付着およびタンパク質分
泌後の切断（プロセシング）に必要と思われるので、こ
れらを改変することは望ましくないと考えられる。13番
目のアミノ酸（Ｐ）を他の疎水性アミノ酸で置換するこ
とについては多少疑問点があり、かかる置換が望ましい
とは断言できない。しかしながら、以上の２点を除け
ば、このシグナルペプチドのアミノ酸配列の少なくとも
大部分を１種の疎水性アミノ酸、特にロイシンで置換し
たものが著しい分泌促進作用を有することが、既述した
先の発明によってわかった。この事実に基づき本発明者
らは、この疎水性領域の長さを短縮することにより、す
なわちロイシンの数を２個減らすことによって作製した
シグナルペプチドの分泌促進活性が、極めて強力である
ことを見いだした。従って、このシグナルペプチドをコ
ードする様にDNAを合成し、これを所望のタンパク質、
特に分泌タンパク質をコードしている遺伝子に連結し、
適当な発現ベクターに組み込んで宿主を形質転換すれ
ば、極めて回収の容易なタンパク質を得ることができ
る。本発明は、かかる知見に基づき完成されたものであ
り、16個のアミノ酸からなるシグナルペプチドであっ
て、第１、第２、第14および第16番目のアミノ酸Ｍ、
Ｒ、ＡおよびＧを除く全て、または少なくとも大部分の
アミノ酸が１種の疎水性アミノ酸で構成されているシグ
ナルペプチドを提供するものである。なおこのシグナル
ペプチドにおいて14番目のアミノ酸はセリン、バリン、
システイン、スレオニン、また16番目のアミノ酸はアラ
ニン、セリン、システインであってもよい。本発明はま
た、かかるシグナルペプチドコをコードしているDNAを
提供するものである。本発明はさらに、かかるシグナル
ペプチドを利用して、目的とするタンパク質を効率よく
培養細胞外に分泌させる方法を提供するものである。
ザインするに当り、第１および第２番目のアミノ酸（Ｍ
およびＲ）並びに第16〜18番目のアミノ酸（Ａ、Ｌおよ
びＧ）は、それぞれ細胞膜への付着およびタンパク質分
泌後の切断（プロセシング）に必要と思われるので、こ
れらを改変することは望ましくないと考えられる。13番
目のアミノ酸（Ｐ）を他の疎水性アミノ酸で置換するこ
とについては多少疑問点があり、かかる置換が望ましい
とは断言できない。しかしながら、以上の２点を除け
ば、このシグナルペプチドのアミノ酸配列の少なくとも
大部分を１種の疎水性アミノ酸、特にロイシンで置換し
たものが著しい分泌促進作用を有することが、既述した
先の発明によってわかった。この事実に基づき本発明者
らは、この疎水性領域の長さを短縮することにより、す
なわちロイシンの数を２個減らすことによって作製した
シグナルペプチドの分泌促進活性が、極めて強力である
ことを見いだした。従って、このシグナルペプチドをコ
ードする様にDNAを合成し、これを所望のタンパク質、
特に分泌タンパク質をコードしている遺伝子に連結し、
適当な発現ベクターに組み込んで宿主を形質転換すれ
ば、極めて回収の容易なタンパク質を得ることができ
る。本発明は、かかる知見に基づき完成されたものであ
り、16個のアミノ酸からなるシグナルペプチドであっ
て、第１、第２、第14および第16番目のアミノ酸Ｍ、
Ｒ、ＡおよびＧを除く全て、または少なくとも大部分の
アミノ酸が１種の疎水性アミノ酸で構成されているシグ
ナルペプチドを提供するものである。なおこのシグナル
ペプチドにおいて14番目のアミノ酸はセリン、バリン、
システイン、スレオニン、また16番目のアミノ酸はアラ
ニン、セリン、システインであってもよい。本発明はま
た、かかるシグナルペプチドコをコードしているDNAを
提供するものである。本発明はさらに、かかるシグナル
ペプチドを利用して、目的とするタンパク質を効率よく
培養細胞外に分泌させる方法を提供するものである。
本発明の係るシグナルペプチドのアミノ酸配列の一例
を以下に示す： 上に示したシグナルペプチドを、簡略化のため、以下
「短縮Ｌ−変換体」という。
を以下に示す： 上に示したシグナルペプチドを、簡略化のため、以下
「短縮Ｌ−変換体」という。
以下に、分泌されるタンパク質をヒトリゾチームと
し、そのシグナルペプチドとして、上記の短縮Ｌ−変換
体を用いた場合を例にとって本発明を更に詳細に説明す
る。
し、そのシグナルペプチドとして、上記の短縮Ｌ−変換
体を用いた場合を例にとって本発明を更に詳細に説明す
る。
上記の改良されたシグナルペプチドをコードするDNA
は、化学合成したヌクレオチド断片を連結することによ
り得ることができる。このDNAは、酵母内で機能するシ
グナルペプチドとして発現されるものであればいかなる
DNAでもよいが、酵母を用いた発現では、酵母において
高頻度に使用されるコドンを使用するのが好ましい。な
お、コドンの使用頻度については「ザ・ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリィ（The Journal of B
iological Chemistry）、257、3026〜3031（1982）」に
報告されている。
は、化学合成したヌクレオチド断片を連結することによ
り得ることができる。このDNAは、酵母内で機能するシ
グナルペプチドとして発現されるものであればいかなる
DNAでもよいが、酵母を用いた発現では、酵母において
高頻度に使用されるコドンを使用するのが好ましい。な
お、コドンの使用頻度については「ザ・ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリィ（The Journal of B
iological Chemistry）、257、3026〜3031（1982）」に
報告されている。
ヒトリゾチーム遺伝子の合成はすでに公表されており
［ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブリテ
ン（Chem.Pharm.Bull.）、34、2202（1986）］、それに
従ってヒトリゾチーム合成遺伝子を得た。ただし、本発
明者等は、シグナルペプチドとの連結を考えて、ヒトリ
ゾチームの３番目のアミノ酸Ｆの位置にTaq Iサイト
を、また、終止コドンのうしろにXho Iサイトをもっ
た、Ｎ末端を一部欠いたヒトリゾチームをコードするDN
A（Taq I−Xho I）を合成した。このようにして得られ
た合成遺伝子を量的に増やすためには、まず適当なベク
ターに組み込みサブクローニングする必要がある。クロ
ーニングベクターとしては、該遺伝子を組み込むことが
できればいかなるものであってもよいが、具体的には大
腸菌ベクターpBR322のBal IサイトをXho Iサイトに変換
したpBR322Xを使用した。
［ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブリテ
ン（Chem.Pharm.Bull.）、34、2202（1986）］、それに
従ってヒトリゾチーム合成遺伝子を得た。ただし、本発
明者等は、シグナルペプチドとの連結を考えて、ヒトリ
ゾチームの３番目のアミノ酸Ｆの位置にTaq Iサイト
を、また、終止コドンのうしろにXho Iサイトをもっ
た、Ｎ末端を一部欠いたヒトリゾチームをコードするDN
A（Taq I−Xho I）を合成した。このようにして得られ
た合成遺伝子を量的に増やすためには、まず適当なベク
ターに組み込みサブクローニングする必要がある。クロ
ーニングベクターとしては、該遺伝子を組み込むことが
できればいかなるものであってもよいが、具体的には大
腸菌ベクターpBR322のBal IサイトをXho Iサイトに変換
したpBR322Xを使用した。
常法に従い、合成リゾチーム遺伝子をpBR322Xに組み
込む。このようにして得られた合成遺伝子含有ベクター
を用いて大腸菌を形質転換する。大腸菌の形質転換の方
法それ自体は公知であり、例えばCohenらの方法［Cohe
n,S.N.ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A）、69、2110（1972）］によって行うことができる。
込む。このようにして得られた合成遺伝子含有ベクター
を用いて大腸菌を形質転換する。大腸菌の形質転換の方
法それ自体は公知であり、例えばCohenらの方法［Cohe
n,S.N.ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A）、69、2110（1972）］によって行うことができる。
宿主としてはE.coli294、E.coli DH1、E.coli W311
0、E.coli C600などを用いることができる。
0、E.coli C600などを用いることができる。
次に、該遺伝子が挿入されたプラスミドDNAをたとえ
ばアルカリ抽出法［Birnboim,H.C.およびDoly,J.、ヌク
レイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）
７、1513（1979）］によって形質転換体から単離する。
得られるプラスミドDNAを適当な制限酸素で処理するこ
とによって、挿入された該遺伝子を切り出し、例えばア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミド電気
泳動によってこれを単離することができる。これら一連
の操作は公知であり、文献、例えば「モレキュラー・ク
ローニング（Molecular Cloning）（1982）、Cold Spri
ng Harbor Laboratoy」に詳しく記載されている。単離
された該遺伝子を適当な発現ベクターのプロモーターお
よびシグナルペプチドコード領域の下流にプロモーター
と順方向に連結し、発現プラスミドを構築する。
ばアルカリ抽出法［Birnboim,H.C.およびDoly,J.、ヌク
レイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）
７、1513（1979）］によって形質転換体から単離する。
得られるプラスミドDNAを適当な制限酸素で処理するこ
とによって、挿入された該遺伝子を切り出し、例えばア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミド電気
泳動によってこれを単離することができる。これら一連
の操作は公知であり、文献、例えば「モレキュラー・ク
ローニング（Molecular Cloning）（1982）、Cold Spri
ng Harbor Laboratoy」に詳しく記載されている。単離
された該遺伝子を適当な発現ベクターのプロモーターお
よびシグナルペプチドコード領域の下流にプロモーター
と順方向に連結し、発現プラスミドを構築する。
シグナルペプチドおよびヒトリゾチームをコードする
DNAの合成には、酵母のコドン使用頻度の高いものを用
いればよいが、制限酸素認識部位などの作成のため、後
順位のコドンを使用してもよい。
DNAの合成には、酵母のコドン使用頻度の高いものを用
いればよいが、制限酸素認識部位などの作成のため、後
順位のコドンを使用してもよい。
またDNAの化学合成は、たとえばCreaらの方法［Crea,
R.ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、
75、5765（1978）］などに従って行うことができる。
R.ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、
75、5765（1978）］などに従って行うことができる。
発現ベクターとしてはすでに多くのものが知られてお
り、該遺伝子の発現に実際に利用できるものであればい
かなるものであってもよい。具体的にはpPHO17、pGLD90
6−１、pcDX［Okayama,HおよびBerg,P、モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）、
３、280（1983）］、およびpKSV−10（ファルマシア社
製）などが挙げられる。
り、該遺伝子の発現に実際に利用できるものであればい
かなるものであってもよい。具体的にはpPHO17、pGLD90
6−１、pcDX［Okayama,HおよびBerg,P、モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）、
３、280（1983）］、およびpKSV−10（ファルマシア社
製）などが挙げられる。
すなわち、宿主として酵母を用いた場合には、プロモ
ーターとして例えばPHO5プロモーター、GLDプロモータ
ー、PGKプロモーター、ADHプロモーター、PHO18プロモ
ーターなどが、宿主として動物細胞を用いた場合には、
プロモーターとして例えばSV40初期遺伝子プロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプ
ロモーターなどがそれぞれ利用できる。
ーターとして例えばPHO5プロモーター、GLDプロモータ
ー、PGKプロモーター、ADHプロモーター、PHO18プロモ
ーターなどが、宿主として動物細胞を用いた場合には、
プロモーターとして例えばSV40初期遺伝子プロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプ
ロモーターなどがそれぞれ利用できる。
なお、発現にエンハンサーを利用することも効果的で
ある。
ある。
なお、発現に利用される宿主としては、サッカロマイ
セス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）のよ
うな酵母、およびマウスＬ細胞、チャイニーズハムスタ
ー卵母細胞（CHO）などが挙げられるが、他の真核生物
細胞も利用することができる。
セス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）のよ
うな酵母、およびマウスＬ細胞、チャイニーズハムスタ
ー卵母細胞（CHO）などが挙げられるが、他の真核生物
細胞も利用することができる。
宿主として酵母を用いる場合には、例えばHinnenらの
方法［プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、
75、1927（1978）］によって形質転換を行うことができ
る。
方法［プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、
75、1927（1978）］によって形質転換を行うことができ
る。
動物細胞などの真核細胞の形質転換法はそれ自体公知
であり、例えば「蛋白質・核酸・酸素、28巻、1983年、
“組換え遺伝子の細胞への導入と発現”（共立出版）」
の記載に従って行われる。
であり、例えば「蛋白質・核酸・酸素、28巻、1983年、
“組換え遺伝子の細胞への導入と発現”（共立出版）」
の記載に従って行われる。
得られた分泌発現プラスミドで宿主細胞を形質転換
し、目的とする組み換え体を得る。このようにして得ら
れた形質転換体を自体公知の方法で培養する。
し、目的とする組み換え体を得る。このようにして得ら
れた形質転換体を自体公知の方法で培養する。
酵母を使用する場合、培地としては、例えばBurkhold
er最小培地［Bostian,K.L.ら、プロシージング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA）、77、4505（1980）］が挙げら
れる。培養は通常15℃〜40℃、好ましくは24℃〜37℃で
10〜144時間、好ましくは24〜96時間行い、必要に応じ
て通気や撹拌を加えることもできる。
er最小培地［Bostian,K.L.ら、プロシージング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA）、77、4505（1980）］が挙げら
れる。培養は通常15℃〜40℃、好ましくは24℃〜37℃で
10〜144時間、好ましくは24〜96時間行い、必要に応じ
て通気や撹拌を加えることもできる。
動物細胞などの真核生物細胞を宿主とした形質転換体
を使用する場合には、培地として例えばEagleのMEM［H.
Eagle、サイエンス（Science）、130、432（1959）］、
DulbeccoのModified Eagle's Medium［Oigad Laubおよ
びWilliam J.Rutter、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、258、6043（198
3）］などが挙げられる。培養は通常30〜42℃、好まし
くは35℃〜37℃で約１〜10日間行う。
を使用する場合には、培地として例えばEagleのMEM［H.
Eagle、サイエンス（Science）、130、432（1959）］、
DulbeccoのModified Eagle's Medium［Oigad Laubおよ
びWilliam J.Rutter、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、258、6043（198
3）］などが挙げられる。培養は通常30〜42℃、好まし
くは35℃〜37℃で約１〜10日間行う。
培養終了後、自体公知の方法で細胞と上清とを分離す
る。細胞内に残存するヒトリゾチームは、当分野におけ
る通常の方法、例えば超音波破砕法、フレンチプレスな
どを利用した破砕法、摩砕などの機械的破砕法、細胞溶
解酸素による破砕法などにより細胞を破砕した後抽出す
る。さらに必要ならば、トリトン−X100、デオキシコー
レートなどの界面活性剤を加え、産生されたヒトリゾチ
ームを抽出する。このようにして得られた培養上清およ
び細胞内に含まれるヒトリゾチームを別々に定量し、両
者の比率を比較する。なお、得られたヒトリゾチーム
は、通常のタンパク質精製法、例えば塩析、等電点沈
澱、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィー（HPLC、FPLC等）などに従って精
製することができる。
る。細胞内に残存するヒトリゾチームは、当分野におけ
る通常の方法、例えば超音波破砕法、フレンチプレスな
どを利用した破砕法、摩砕などの機械的破砕法、細胞溶
解酸素による破砕法などにより細胞を破砕した後抽出す
る。さらに必要ならば、トリトン−X100、デオキシコー
レートなどの界面活性剤を加え、産生されたヒトリゾチ
ームを抽出する。このようにして得られた培養上清およ
び細胞内に含まれるヒトリゾチームを別々に定量し、両
者の比率を比較する。なお、得られたヒトリゾチーム
は、通常のタンパク質精製法、例えば塩析、等電点沈
澱、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィー（HPLC、FPLC等）などに従って精
製することができる。
以下に実施例を示して本発明を具体的に例示するが、
実施例に示したジグナル配列はきわめて一般化されてい
るため、分泌の対象となる蛋白質は単にヒトリゾチーム
に限られるものではない。
実施例に示したジグナル配列はきわめて一般化されてい
るため、分泌の対象となる蛋白質は単にヒトリゾチーム
に限られるものではない。
実施例１ クローニングベクターpBR322Xの作製 大腸菌ベクターpBR322（５μｇ）に制限酸素Bal I
（1.5ユニット）を加え、40μの反応液［10mM Tris−
HCl（pH7.5）、10mM MgCl2、1mM dithiothreitol］中で
37℃、５時間反応させた後、常法通りフェノール抽出
し、次いでDNAをエタノール沈澱させた。このDNAにリン
酸化したXho Iリンカーｄ［pCCTCGAGG］（New England
Biolabs製）50ngを加え、常法にしたがってT4DNAリガー
ゼで両者を結合させた。
（1.5ユニット）を加え、40μの反応液［10mM Tris−
HCl（pH7.5）、10mM MgCl2、1mM dithiothreitol］中で
37℃、５時間反応させた後、常法通りフェノール抽出
し、次いでDNAをエタノール沈澱させた。このDNAにリン
酸化したXho Iリンカーｄ［pCCTCGAGG］（New England
Biolabs製）50ngを加え、常法にしたがってT4DNAリガー
ゼで両者を結合させた。
この反応液で大腸菌DH1株を形質転換し、得られたア
ンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性のコロニーから
アルカリ抽出法（前出）でプラスミドを抽出し、Bal I
サイトがXho Iサイトに変換されたプラスミドpBR322Xを
得た。
ンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性のコロニーから
アルカリ抽出法（前出）でプラスミドを抽出し、Bal I
サイトがXho Iサイトに変換されたプラスミドpBR322Xを
得た。
実施例２ ヒトリゾチームのＮ末端近傍にTaq Iサイトを有するヒ
トリゾチーム遺伝子断片の作製 遺伝子の合成はIkeharaらの報告（前出）に従った。
ただし、Ikeharaらの報告におけるヌクレオチド断片、U
2（TTGAGAGATGCGAAT）の代わりにU2′（CGAGAGATGCGAA
T）をL2（TCTGGCTAATTCGCATC）の代わりにL2′（TCTGGC
TAATTCGCATCTCT）を合成してU2′,U3〜U26,U2′,L3〜L2
6のフラグメントを連結させた。
トリゾチーム遺伝子断片の作製 遺伝子の合成はIkeharaらの報告（前出）に従った。
ただし、Ikeharaらの報告におけるヌクレオチド断片、U
2（TTGAGAGATGCGAAT）の代わりにU2′（CGAGAGATGCGAA
T）をL2（TCTGGCTAATTCGCATC）の代わりにL2′（TCTGGC
TAATTCGCATCTCT）を合成してU2′,U3〜U26,U2′,L3〜L2
6のフラグメントを連結させた。
その結果、３番目のアミノ酸であるフェニルアラニン
（Ｆ）に対するコドンTTTがTTCになり、Ikeharaらの報
告とは違って、その部分に新しくTaq Iサイトを有し
た、５′末端の一部欠けた遺伝子が得られた（第１
図）。
（Ｆ）に対するコドンTTTがTTCになり、Ikeharaらの報
告とは違って、その部分に新しくTaq Iサイトを有し
た、５′末端の一部欠けた遺伝子が得られた（第１
図）。
実施例３ Taq Iサイトを有するヒトリゾチーム遺伝子断片のサブ
クローニング 実施例１で構築したプラスミドpBR322X2.6μｇに６ユ
ニットの制限酸素Xho Iと６ユニットの制限酸素Cla Iと
を35μの反応液［33mM酢酸緩衝液pH7.9、66mM酢酸カ
リウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mMジチオトレイト
ール、0.01％BSA］中で37℃、１時間作用させた後、フ
ェノールで除蛋白し、冷エタノールで沈澱させた。該DN
A（200ng）を実施例２で調製したヒトリゾチーム遺伝子
断片100ngと混合し、10μの反応液［66mM Tris−HCl
（pH7.6）、10mM ATP、10mMスペルメジン、100mM MgC
l2、150mM DTT、2mg/mlBSA、５ユニットのT4DNAリガー
ゼ］中、14℃で一夜作用させてDNAを結合させた。この
反応液を用いて大腸菌DH1株を前記Cohenらの方法にした
がって形質転換した。得られた形質変換体からアルカリ
抽出法（前出）によってプラスミドを単離し、分子量お
よび制限酸素による分解パターンを調べ、ヒトリゾチー
ム遺伝子断片が挿入されたpLYS221を得た。pLYS221のEc
oR I−Xho I断片を分離し、ジオキシヌクレオチド合成
鎖停止法によってその塩基配列を決定したところ、第１
図に示したように、予想通りヒトリゾチーム遺伝子Taq
I−Xho I断片が得られた。
クローニング 実施例１で構築したプラスミドpBR322X2.6μｇに６ユ
ニットの制限酸素Xho Iと６ユニットの制限酸素Cla Iと
を35μの反応液［33mM酢酸緩衝液pH7.9、66mM酢酸カ
リウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mMジチオトレイト
ール、0.01％BSA］中で37℃、１時間作用させた後、フ
ェノールで除蛋白し、冷エタノールで沈澱させた。該DN
A（200ng）を実施例２で調製したヒトリゾチーム遺伝子
断片100ngと混合し、10μの反応液［66mM Tris−HCl
（pH7.6）、10mM ATP、10mMスペルメジン、100mM MgC
l2、150mM DTT、2mg/mlBSA、５ユニットのT4DNAリガー
ゼ］中、14℃で一夜作用させてDNAを結合させた。この
反応液を用いて大腸菌DH1株を前記Cohenらの方法にした
がって形質転換した。得られた形質変換体からアルカリ
抽出法（前出）によってプラスミドを単離し、分子量お
よび制限酸素による分解パターンを調べ、ヒトリゾチー
ム遺伝子断片が挿入されたpLYS221を得た。pLYS221のEc
oR I−Xho I断片を分離し、ジオキシヌクレオチド合成
鎖停止法によってその塩基配列を決定したところ、第１
図に示したように、予想通りヒトリゾチーム遺伝子Taq
I−Xho I断片が得られた。
この配列はヒトリゾチームのアミノ酸配列のうち４番
目のGluから130番目のValまでをコードしている。
目のGluから130番目のValまでをコードしている。
実施例４ 短縮Ｌ−変換体をコードするDNAの調製 ヒトリゾチームを培地中へ分泌させるためのシグナル
配列として、前記短縮Ｌ−変換体をコードするDNAを調
製した。合成したヌクレオチド配列を第２図に示した
が、５′末端にXho Iサイトが、３′末端にはヒトリゾ
チームのコード領域を含むTaq Iサイトがそれぞれ設け
られている。全配列は８個のオリゴヌクレオチド（＃１
〜＃８）から成り、それらの合成はホスフォアミダイド
法［Caruthers,M.H.ら、テトラヘドロン・レターズ（Te
trahedron Letters）、22、1859（1981）］に従って行
った。
配列として、前記短縮Ｌ−変換体をコードするDNAを調
製した。合成したヌクレオチド配列を第２図に示した
が、５′末端にXho Iサイトが、３′末端にはヒトリゾ
チームのコード領域を含むTaq Iサイトがそれぞれ設け
られている。全配列は８個のオリゴヌクレオチド（＃１
〜＃８）から成り、それらの合成はホスフォアミダイド
法［Caruthers,M.H.ら、テトラヘドロン・レターズ（Te
trahedron Letters）、22、1859（1981）］に従って行
った。
まず、第２図に示したフラグメント＃２〜＃７をそれ
ぞれ10μ（５μｇ）づつ混合し、これに10倍濃度のキ
ナーゼ緩衝液［0.5M Tris−HCl、0.1M MgCl2、0.1M メ
ルカプトエタノールpH7.6］20μ、10mM ATP20μ、T
4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）20μ（50
u）、蒸溜水80μを加えて37℃で２時間反応させた
後、65℃で20分間処理して反応をとめた。この反応液に
フラグメント＃１と＃８をそれぞれ10μ（５μｇ）づ
つ加え、T4リガーゼ（NEB社製）10μを加えて14℃で
一夜反応させた。反応液を10％ポリアクリルアミド電気
泳動にかけ、70bpのフラグメントを切り出したのち、電
気泳動溶出によってゲルから抽出した。これを45μの
蒸留水に溶解し、これに10倍濃度のキナーゼ緩衝液（前
出）６μ、10mM ATP6μ、T4ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（前出）２μ（5u）を加え、37℃で１時間反応さ
せた後、−20℃で保存した。
ぞれ10μ（５μｇ）づつ混合し、これに10倍濃度のキ
ナーゼ緩衝液［0.5M Tris−HCl、0.1M MgCl2、0.1M メ
ルカプトエタノールpH7.6］20μ、10mM ATP20μ、T
4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）20μ（50
u）、蒸溜水80μを加えて37℃で２時間反応させた
後、65℃で20分間処理して反応をとめた。この反応液に
フラグメント＃１と＃８をそれぞれ10μ（５μｇ）づ
つ加え、T4リガーゼ（NEB社製）10μを加えて14℃で
一夜反応させた。反応液を10％ポリアクリルアミド電気
泳動にかけ、70bpのフラグメントを切り出したのち、電
気泳動溶出によってゲルから抽出した。これを45μの
蒸留水に溶解し、これに10倍濃度のキナーゼ緩衝液（前
出）６μ、10mM ATP6μ、T4ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（前出）２μ（5u）を加え、37℃で１時間反応さ
せた後、−20℃で保存した。
実施例５ 分泌発現プラスミドの構築 実施例３で得たpLYS221（236μｇ）をEcoR I（ニツポ
ンジーン社製）120uおよびXho I（ニツポンジーン社
製）120uで37℃、２時間処理し、ヒトリゾチームコード
領域を切り出した。このフラグメントをさらにTaq I
（ニツポンジーン社）26uで65℃、１時間処理し、Ｎ末
端を一部欠いたヒトリゾチームコード領域を切り出し
た。
ンジーン社製）120uおよびXho I（ニツポンジーン社
製）120uで37℃、２時間処理し、ヒトリゾチームコード
領域を切り出した。このフラグメントをさらにTaq I
（ニツポンジーン社）26uで65℃、１時間処理し、Ｎ末
端を一部欠いたヒトリゾチームコード領域を切り出し
た。
このフラグメント約１μｇに実施例４で得た短縮Ｌ−
変換体シグナル配列をコードするDNA0.5μｇを混合し、
T4−リガーゼ（前出）800uの存在下で16℃、16時間反応
させたのち、Xho I（42u）で処理した。
変換体シグナル配列をコードするDNA0.5μｇを混合し、
T4−リガーゼ（前出）800uの存在下で16℃、16時間反応
させたのち、Xho I（42u）で処理した。
得られたXho Iフラグメント10ngと、酵母の発現ベク
ターpGLD906−１（特開昭61−43991）をXho Iで処理し
たベクター1ngとを混合し、この両者をT4リガーゼの存
在下で結合させた。
ターpGLD906−１（特開昭61−43991）をXho Iで処理し
たベクター1ngとを混合し、この両者をT4リガーゼの存
在下で結合させた。
この反応液でE.coli DH1を前述の方法で形質変換し、
GLDプロモーターの下流にシグナル配列コード領域およ
びヒトリゾチーム遺伝子がプロモーターと同一方向に挿
入されたプラスミドを多数得た。そのうちの１つをpGE
L.L8（第３図参照）と命名して以下の実験に供した。
GLDプロモーターの下流にシグナル配列コード領域およ
びヒトリゾチーム遺伝子がプロモーターと同一方向に挿
入されたプラスミドを多数得た。そのうちの１つをpGE
L.L8（第３図参照）と命名して以下の実験に供した。
実施例６ 酵母形質転換体の調製 実施例５で得た発現プラスミドpGEL.L8でSaccharomyc
es cerevisiae AH22R-をHinnenらの方法（前出）で形質
転換させ、形質転換体Saccharomyces cerevisiae AH22R
-/pGEL・L8を得た。この菌株は、工業技術院微生物工業
技術研究所に受託番号FERM P−9426で寄託されている
（寄託日：昭和62年６月20日）。
es cerevisiae AH22R-をHinnenらの方法（前出）で形質
転換させ、形質転換体Saccharomyces cerevisiae AH22R
-/pGEL・L8を得た。この菌株は、工業技術院微生物工業
技術研究所に受託番号FERM P−9426で寄託されている
（寄託日：昭和62年６月20日）。
実施例７ 形質転換体の培養 実施例６で得た形質転換体Saccharomyces cerevisiae
AH22R-/pGEL・L8をBurkholder［アメリカン・ジャーナ
ル・オブ・ボタニー（Amer.J.Bot.）30、206（1943）］
の改変培地III（１当りKH2PO40.4g、グルコース10g、
アスパラギン5g、シュークロース80gとした）5mlを含む
試験管に接種し、30℃で３日間振盪培養した。得られた
培養液の1mlをそれぞれ上記培地III4mlを含む試験管へ
移し、30℃で１日振盪培養した。この培養液2mlを上記
培地III18mlを含む200ml容三角フラスコに移し、30℃で
振盪培養し、48、72、96および120時間後にアッセイ用
試料を調製した。
AH22R-/pGEL・L8をBurkholder［アメリカン・ジャーナ
ル・オブ・ボタニー（Amer.J.Bot.）30、206（1943）］
の改変培地III（１当りKH2PO40.4g、グルコース10g、
アスパラギン5g、シュークロース80gとした）5mlを含む
試験管に接種し、30℃で３日間振盪培養した。得られた
培養液の1mlをそれぞれ上記培地III4mlを含む試験管へ
移し、30℃で１日振盪培養した。この培養液2mlを上記
培地III18mlを含む200ml容三角フラスコに移し、30℃で
振盪培養し、48、72、96および120時間後にアッセイ用
試料を調製した。
実施例８ アッセイ試料の調製 実施例７で得た培養液を遠心分離機にかけ、上清と菌
体を分離した。上清はアッセイに供し、菌体は1.2Mシュ
ークロースを含む50mMリン酸バッファー（pH7.0）で洗
浄した後、菌体を、Zymolyase［生化学工業（株）製］
を0.5mg/mlになるように加えた同バッファーに懸濁し、
室温で２時間反応させた。この反応液に４倍量の50mMリ
ン酸ブッファー（pH7.0）［10mM EDTA、1mM PMSFを含
む］を加え、室温で１時間反応させたのち、上清を集め
て菌体抽出液とした。
体を分離した。上清はアッセイに供し、菌体は1.2Mシュ
ークロースを含む50mMリン酸バッファー（pH7.0）で洗
浄した後、菌体を、Zymolyase［生化学工業（株）製］
を0.5mg/mlになるように加えた同バッファーに懸濁し、
室温で２時間反応させた。この反応液に４倍量の50mMリ
ン酸ブッファー（pH7.0）［10mM EDTA、1mM PMSFを含
む］を加え、室温で１時間反応させたのち、上清を集め
て菌体抽出液とした。
実施例９ ヒトリゾチーム産生量の測定 実施例８で得た上清と菌体抽出液とをヒトリゾチーム
のアッセイに供した。
のアッセイに供した。
ヒトリゾチーム活性の測定は、ほぼワーシントン・エ
ンザイム・マニュアル（Worthigton Enzyme Manual、p1
00、Worthigton Biochemical Corporation,USA、1972）
によった。標準ヒトリゾチームとしてはSigma社製を使
用した。１単位は、0.1Mリン酸バッファー（pH6.9）中
でマイクロコッカス・ルテウス（Micrococcusluteus）
（生化学工業社製）を基質として25℃で１分間反応さ
せ、450mμの吸収を0.001減少させるに必要な酸素量と
した。同様の実験を３回行って得たヒトリゾチームの産
生量は、以下の表１に示す通りであった。なお、卵白リ
ゾチームのシグナル配列を使用して上記と同様の実験を
行った結果を対象として示した。
ンザイム・マニュアル（Worthigton Enzyme Manual、p1
00、Worthigton Biochemical Corporation,USA、1972）
によった。標準ヒトリゾチームとしてはSigma社製を使
用した。１単位は、0.1Mリン酸バッファー（pH6.9）中
でマイクロコッカス・ルテウス（Micrococcusluteus）
（生化学工業社製）を基質として25℃で１分間反応さ
せ、450mμの吸収を0.001減少させるに必要な酸素量と
した。同様の実験を３回行って得たヒトリゾチームの産
生量は、以下の表１に示す通りであった。なお、卵白リ
ゾチームのシグナル配列を使用して上記と同様の実験を
行った結果を対象として示した。
表１から明らかな様に、短縮Ｌ−変換体を使用した場
合、卵白リゾチームのシグナル配列を使用した場合に比
べて多量のヒトリゾチームが菌外に分泌された。菌体内
および菌体外のリゾチーム総生産量においても顕著な差
がみられた。
合、卵白リゾチームのシグナル配列を使用した場合に比
べて多量のヒトリゾチームが菌外に分泌された。菌体内
および菌体外のリゾチーム総生産量においても顕著な差
がみられた。
実施例10 分泌されたリゾチームの精製 実施例６で得た形質転換体Saccharomyces cerevisiae
AH22R-/pGEL・L8を実施例７に示した培地5mlを含む試
験管３本に接種し、30℃で３日間振盪培養した。上記培
地18mlを含む200ml容三角フラスコを５本用意し、その
各々に、上の培養液2mlを移し、30℃で１日振盪培養し
た。次に上記培地200mlを含む１容三角フラスコを５
本用意し、その各々にこの培養液20mlを移し、30℃で４
日間培養した。この培養液を遠心分離決にかけ、上清と
菌体を分離した。この上清（約１）を50mMリン酸ナト
リウム緩衝液（pH6.5）で平衡化した陽イオン交換樹脂
（CM−Toyopearl 650C）カラム（1.6cm×36cm）に吸着
させ、同緩衝液500mlで洗浄後、0.5M NaClを含む同緩衝
液で溶出した。溶出液は5mlずつ分取し、各フラクショ
ンについて実施例９に従ってリゾチーム活性を測定し
た。リゾチーム活性が最大となるフラクションより200
μを取り、逆相高速液体クロマトグラフィー（TSKgel
ODS120Tカラム）により、さらに精製した。このとき溶
出は、0.1％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの
０〜100％の30分間の直線濃度勾配により行い、280nmの
吸収ピークを分取した。この分取液の溶媒を減圧により
蒸発させ、乾燥粉末としてヒトリゾチームの精製標品を
得た。
AH22R-/pGEL・L8を実施例７に示した培地5mlを含む試
験管３本に接種し、30℃で３日間振盪培養した。上記培
地18mlを含む200ml容三角フラスコを５本用意し、その
各々に、上の培養液2mlを移し、30℃で１日振盪培養し
た。次に上記培地200mlを含む１容三角フラスコを５
本用意し、その各々にこの培養液20mlを移し、30℃で４
日間培養した。この培養液を遠心分離決にかけ、上清と
菌体を分離した。この上清（約１）を50mMリン酸ナト
リウム緩衝液（pH6.5）で平衡化した陽イオン交換樹脂
（CM−Toyopearl 650C）カラム（1.6cm×36cm）に吸着
させ、同緩衝液500mlで洗浄後、0.5M NaClを含む同緩衝
液で溶出した。溶出液は5mlずつ分取し、各フラクショ
ンについて実施例９に従ってリゾチーム活性を測定し
た。リゾチーム活性が最大となるフラクションより200
μを取り、逆相高速液体クロマトグラフィー（TSKgel
ODS120Tカラム）により、さらに精製した。このとき溶
出は、0.1％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの
０〜100％の30分間の直線濃度勾配により行い、280nmの
吸収ピークを分取した。この分取液の溶媒を減圧により
蒸発させ、乾燥粉末としてヒトリゾチームの精製標品を
得た。
実施例11 精製リゾチームの分析 上の方法で精製したヒトリゾチーム精製標品について
Ｎ末端10残基のアミノ酸配列の決定、及びアミノ酸分析
を行った。Ｎ末端配列の決定は、精製標品７μｇを用
い、プロテイン・シーケンサー（Applied Biosystems
社、477A）により自動的に行った。アミノ酸分析は精製
標品20μｇを0.2mlの6N HClで110℃、24時間処理し加水
分解した後、反応液を減圧乾固し、これを0.5mlの0.02N
HClに溶解して自動アミノ酸分析計（日立・835）によ
り行った。またシステイン残基の定量をするために、別
に精製標品20μｇを過ギ酸0.1ml中で０℃、2.5時間処理
し、減圧乾固後上と同様に処理してアミノ酸分析を行っ
た。
Ｎ末端10残基のアミノ酸配列の決定、及びアミノ酸分析
を行った。Ｎ末端配列の決定は、精製標品７μｇを用
い、プロテイン・シーケンサー（Applied Biosystems
社、477A）により自動的に行った。アミノ酸分析は精製
標品20μｇを0.2mlの6N HClで110℃、24時間処理し加水
分解した後、反応液を減圧乾固し、これを0.5mlの0.02N
HClに溶解して自動アミノ酸分析計（日立・835）によ
り行った。またシステイン残基の定量をするために、別
に精製標品20μｇを過ギ酸0.1ml中で０℃、2.5時間処理
し、減圧乾固後上と同様に処理してアミノ酸分析を行っ
た。
（Ａ）Ｎ末端配列の決定 以下の表２に示す様な結果を得た。
（Ｂ）アミノ酸の組成分析 以下の表３に示す様な結果を得た。
以上の結果から、短縮Ｌ−変換体が正常に機能して成
熟型ヒトリゾチームが分泌されていることが明らかにな
った。
熟型ヒトリゾチームが分泌されていることが明らかにな
った。
第１図は、ヒトリゾチームをコードしているDNA配列の
５′末端を一部欠失させた配列を示す模式図であり、第
２図は短縮Ｌ−変換体シグナルペプチドと、対応するDN
A配列を示す模式図であり、第３図はヒトリゾチーム分
泌発現プラスミドpGEL・L8の構築図である。
５′末端を一部欠失させた配列を示す模式図であり、第
２図は短縮Ｌ−変換体シグナルペプチドと、対応するDN
A配列を示す模式図であり、第３図はヒトリゾチーム分
泌発現プラスミドpGEL・L8の構築図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (5)
- 【請求項１】16個のアミノ酸からなり、第１、第２、第
14および第16番目のアミノ酸Ｍ、Ｒ、ＡおよびＧを除く
全て、または少なくとも大部分のアミノ酸がＬで構成さ
れているシグナルペプチド（ただし第14番目のアミノ酸
はＳ、Ｖ、ＣまたはＴであってもよく、第16番目のアミ
ノ酸はＡ、ＳまたはＣであってもよい）。 - 【請求項２】式： Ｍ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｐ−Ｌ−Ａ
−Ａ−Ｌ−Ｇ で示されるアミノ酸配列からなる第１項に記載のシグナ
ルペプチド。 - 【請求項３】16個のアミノ酸からなり、第１、第２、第
14および第16番目のアミノ酸Ｍ、Ｒ、ＡおよびＧを除く
全て、または少なくとも大部分のアミノ酸がＬで構成さ
れているシグナルペプチド（ただし第14番目のアミノ酸
は、Ｓ、Ｖ、ＣまたはＴであってもよく、第16番目のア
ミノ酸はＡ、ＳまたはＣであってもよい）をコードして
いるDNA。 - 【請求項４】式： Ｍ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｐ−Ｌ−Ａ
−Ａ−Ｌ−Ｇ で示されるアミノ酸配列をコードしている第３項に記載
のDNA。 - 【請求項５】式： で示される第４項に記載のDNA。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18178087A JP2598024B2 (ja) | 1987-07-21 | 1987-07-21 | シグナルペプチドをコードしているｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18178087A JP2598024B2 (ja) | 1987-07-21 | 1987-07-21 | シグナルペプチドをコードしているｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6427494A JPS6427494A (en) | 1989-01-30 |
| JP2598024B2 true JP2598024B2 (ja) | 1997-04-09 |
Family
ID=16106754
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18178087A Expired - Lifetime JP2598024B2 (ja) | 1987-07-21 | 1987-07-21 | シグナルペプチドをコードしているｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2598024B2 (ja) |
-
1987
- 1987-07-21 JP JP18178087A patent/JP2598024B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6427494A (en) | 1989-01-30 |
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